Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural

Treball de Fi de Grau Enginyeria Química Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural MEMÒRIA Autor: Meritxell Ballester Armengol Director/s: Maria Pilar Almajano Convocatòria: Juny 2016 Escola Tècnica Superior d’Enginyeria Industrial de Barcelona Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 1 Resum En aquest treball s’analitza la capacitat antioxidant de les fulles del noni (Morinda Citrifolia) en diversos food models. La mostra amb la que es realitzen tots els experiments es originaria de Sud Amèrica. Primerament es quantifica l’activitat antiradicalària a partir de diversos mètodes (contingut de polifenols, en front del radical AAPH pel mètode ORAC i dels radical ABTS i DPPH) de les fulles obtingudes tant de Veneçuela com de Mèxic. La mostra obtinguda de Veneçuela ha estat àmpliament analitzada. La determinació de l’oxidació primària es realitza pel mètode del valor peròxid i la de l’oxidació secundària pel mètode del Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS). També s’ha posat a punt el grau d’oxidació a través de la espectroscòpia infraroja. En tots els experiments s’ha complert que la protecció a l’oxidació es proporcional a les concentracions dels antioxidants afegits. En les emulsions o/w, l’extracte de noni al 5,8% protegeix 3 vegades més de l’oxidació que la mostra control. En l’experiment amb carn de vedella, el film de gelatina fabricat amb noni liofilitzat mostra més efectivitat que el film de PLA també amb noni liofilitzat. El film de gelatina-noni així com els films de PEBD (Polietilè de baixa densitat) activat amb un concentrat de noni, protegeixen 1,7 vegades més de l’oxidació que la mostra control. Hi ha un comportament similar en l’experiment amb peix, on el noni afegit directament en un percentatge del 5%protegeixen 6 vegades més de l’oxidació que la mostra control. L’anàlisi amb espectroscòpia infraroja mostra també com el noni protegeix la mostra front l’oxidació mitjançant l’estudi de les bandes específiques de l’espectre disminució de la banda de èster i increment de la banda de carboxil. Aquest treball demostra per tant que les fulles del noni poden ser un bon substitut dels antioxidants sintètics en la industria alimentària. Pàg. 2 Memòria Sumari RESUM ........................................................................................................................................ 1 SUMARI ....................................................................................................................................... 2 1 GLOSSARI .......................................................................................................................... 5 2 OBJECTIUS ........................................................................................................................ 6 3 INTRODUCCIÓ ................................................................................................................... 7 3.1 Contextualització del problema ................................................................................ 7 3.2 Antioxidants ................................................................................................................. 8 3.2.1 L’autooxidació ..................................................................................................... 8 3.2.2 Inhibició de l’oxidació dels greixos ................................................................... 8 3.2.3 Factors que intervenen en l’oxidació dels lípids ............................................ 9 3.2.4 Classificació dels antioxidants .......................................................................... 9 3.3 Descripció dels antecedents ................................................................................... 11 3.4 Quantificació de l’activitat antioxidant ................................................................... 14 3.4.1 Mètode de Folin-Ciocalteau ............................................................................ 14 3.4.2 Mètode del ABTS .............................................................................................. 14 3.4.3 Assaig ORAC .................................................................................................... 15 3.4.4 Assaig DPPH ..................................................................................................... 16 3.5 Noni (Morinda Citrifolia) ........................................................................................... 17 3.5.1 Descripció de la planta .................................................................................... 17 3.5.2 Composició química ......................................................................................... 17 3.5.3 Contingut d’aigua .............................................................................................. 17 3.6 Mètodes per determinar el grau d’oxidació .......................................................... 18 3.6.1 Valor de peròxid ................................................................................................ 18 3.6.2 TBARS ............................................................................................................... 18 3.6.3 Espectroscòpia IR ............................................................................................ 18 3.6.3.1 Equips d’espectroscòpia IR ............................................................................... 19 3.6.3.2 Freqüències estudiades ..................................................................................... 22 4. MATERIAL I MÈTODES .................................................................................................. 23 4.1 Material i reactius...................................................................................................... 23 4.1.1 Aparells i material ............................................................................................. 23 4.1.2 Reactius ............................................................................................................. 23 4.2 Planta ......................................................................................................................... 23 Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 3 4.3 Aliments ..................................................................................................................... 23 4.4 Preparació d’extractes ............................................................................................. 23 4.5 Fabricació dels films ................................................................................................. 24 4.5.1 Film de PLA ....................................................................................................... 24 4.5.2 Film de gelatina-Noni ....................................................................................... 24 4.6 Mètode de Folin-Ciocalteau .................................................................................... 24 4.7 Mètode del ABTS...................................................................................................... 25 4.8 Assaig ORAC ............................................................................................................ 25 4.9 Assaig DPPH ............................................................................................................. 26 4.10 Eliminació d’antioxidants naturals de l’oli de gira-sol .......................................... 26 4.11 Valor de peròxid ........................................................................................................ 27 4.12 Condicionament de les meat-burg ......................................................................... 27 4.13 TBARS per a les meat-burg i fish-burg ................................................................. 28 4.14 Espectroscòpia IR .................................................................................................... 28 4.14.1 Extracció del greix de les sardines ................................................................ 28 4.14.2 Espectrofotòmetre d'infraroig FTIR amb ATR .............................................. 29 5. RESULTATS I DISCUSSIÓ ............................................................................................ 30 5.1 Esquema global dels experiments ......................................................................... 30 5.2 Estudi previ de l’extracte ......................................................................................... 31 5.2.1 Prova del TPC ................................................................................................... 31 5.2.2 Prova del ORAC ............................................................................................... 31 5.2.3 Prova del ABTS ................................................................................................ 32 5.2.4 Prova del DPPH ................................................................................................ 32 5.2.5 Correlació entre els diferents mètodes d’activitat antiradicalària .............. 33 5.3 Experiments ............................................................................................................... 34 5.3.1 EXPERIMENT nº1, previ: Films de PLA i Gelatina en meat-burg ................ 35 5.3.1.1 Resultats ........................................................................................................ 35 5.3.1.2 Millores ........................................................................................................... 35 5.3.2 EXPERIMENT nº2: Films de Gelatina i PEBD en meat-burg ........................ 36 5.3.2.1 Condicions de l’experiment ......................................................................... 36 5.3.2.2 Resultats ........................................................................................................ 36 5.3.2.3 Canvis en el color ......................................................................................... 37 5.3.3 EXPERIMENT nº3: Emulsions o/w .................................................................... 38 5.3.3.1 Resultats VP .................................................................................................. 38 Pàg. 4 Memòria 5.3.3.2 Evolució del pH ............................................................................................. 39 5.3.3.3 Anàlisi estadístic ........................................................................................... 39 5.3.4 EXPERIMENT nº4: Pols de noni en fish-burg .................................................. 40 5.3.4.1 Condicions de l’experiment ......................................................................... 40 5.3.4.2 Resultats ........................................................................................................ 40 5.3.5 EXPERIMENT nº5: Espectroscòpia IR del greix de sardines ....................... 42 5.3.5.1 Resultats ........................................................................................................ 42 6. COST DEL PROJECTE .................................................................................................. 45 6.1 Reactius........................................................................................................................... 45 6.2 Aliments ........................................................................................................................... 45 6.3 Material ............................................................................................................................ 46 6.4 Amortització aparells ..................................................................................................... 46 6.5 Personal .......................................................................................................................... 47 6.6 Total ................................................................................................................................. 47 7. IMPACTE AMBIENTAL ................................................................................................... 48 8. DESENVOLUPAMENT TEMPORAL DEL TREBALL ................................................. 49 CONCLUSIONS ....................................................................................................................... 50 AGRAÏMENTS .......................................................................................................................... 51 BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 52 Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 5 1 Glossari AAO: Activitat antioxidant ABTS: 2’2-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulonic acid APPH: 2,2-Azobis (2-metilpropinamida) dihidroclorur BHA: Butilhidroxianisol BHT: Butilhidroxitoluè DAD: Diode Array DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidracil EDTA: Etilè Diamina Tetra Acetat MC: Moisture Content MDA: Malondialdehid Milli-Q: Aigua bidestil·lada MIR: Middle InfraRed NIR: Near InfraRed ORAC: Oxigen Radical Antioxidant Capacity PEBD: Polietilè de baixa densitat RSA: Radical Scavenging Activity TBA: Àcid tiobarbituric TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances TBHQ: Terbutil hidroquinona TCA: Àcid tricloroacètic TPC: Total Phenolic Content VP: Valor Peròxid Pàg. 6 Memòria 2 Objectius L’objectiu d’aquest projecte és avaluar la capacitat antioxidant de les fulles de noni tant “in vitro” com en diferents aliments. En aquest projecte hi ha els següents objectius parcials: - Extreure els compostos bioactius de les fulles de noni i preparar un liofilitzat. - Preparar diferents tipus de film “actiu” amb l’extracte hidroetanòlic. - Mesurar l’endarreriment de l’oxidació en hamburgueses de carn quan es cobreixen amb films de gelatina de noni. - Analitzar la capacitat antioxidant de l’extracte de noni en emulsions d’o/w. - Mesurar la protecció a l’oxidació del pols de noni en sardines triturades. - Avaluar el procés oxidatiu de les hamburgueses de peix amb la espectroscòpia IR. Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 7 3 Introducció 3.1 Contextualització del problema Hi ha diverses maneres de deteriorament dels aliments segons les causes que provoquen dites alteracions. Les més importants són les causes químiques i biològiques. Són de gran importància no solament per la freqüència amb la que intervenen en els processos de deteriorament dels aliments, sinó també, i particularment, perquè els processos d’alteració que provoquen impliquen, en pràcticament la majoria dels casos, la destrucció de tot el producte. Dins les causes biològiques, les més importants són les produïdes pels enzims naturals dels aliments i les causades pels microorganismes. Dins les causes químiques, existeixen dues particularment importants: l’enfosquiment no enzimàtic (provocat per certs processos tecnològics o per l’emmagatzematge dels aliments) i l’enranciment oxidatiu dels greixos, problemàtica que és l’objecte d’estudi d’aquest treball [1]. L’oxidació dels greixos és una de les principals causes de deteriorament químic dels aliments. La seva conseqüència organolèptica més important és l’aparició d’olors i sabors desagradables, fent que l’aliment sigui inacceptable pel consumidor i reduint o limitant la seva vida útil. A més l’oxidació dels greixos pot reduir el valor nutritiu dels aliments i fins i tot, alguns dels productes de l’oxidació són potencialment tòxics [1],[2]. L’oxidació dels greixos és un procés complex que implica nombroses reaccions que donen lloc a una gran varietat de canvis físics i químics. Tot i que sembla que les reaccions segueixin un model ordenat, la majoria de les vegades es produeixen simultàniament i de manera competitiva. Per estudiar aquestes reaccions es divideixen en tres etapes: iniciació, propagació i finalització [3]. Els antioxidants són compostos que endarrereixen el fenomen de la oxidació dels greixos. N’hi ha de naturals i de sintètics. Els sintètics són molt utilitzats per les industries alimentaries degut a la seva estabilitat, eficàcia i avantatge econòmica però son objecte d’estudi perquè podrien tractar-se de compostos poc beneficiosos per a la salut humana. És per això que els antioxidants naturals podrien esdevenir-ne la solució i es treballa en la substitució dels sintètics pels naturals. Els antioxidants naturals provenen sovint de les diferents parts de les plantes: fulles, flor, llavor o fruit. D’aquests se n’aprofiten les parts no consumides com aliment les quals també són riques en compostos antioxidants i s’afegeixen als aliments com additius. Les emulsions i els experiments amb carn i peix són food models molt acceptats per avaluar el poder antioxidant dels residus vegetals i avaluar el procés d’oxidació al llarg del temps. D’altres tècniques com ara l’espectroscòpia IR també permeten veure l’evolució de l’oxidació en el temps. Aquest projecte es centrarà en l’avaluació del poder antioxidant del Noni mitjançant els food models i l’espectroscòpia IR [4]. Pàg. 8 Memòria 3.2 Antioxidants 3.2.1 L’autooxidació Les reaccions d’autooxidació o oxidació dels greixos segueixen el mecanisme de reacció següent: - Iniciació: En la primera fase es formen els radicals lliures R• a partir dels àcids grassos insaturats (RH) per combinació amb l’oxigen. Aquests radicals lliures R• amb l’excés d’oxigen atmosfèric reaccionen donant lloc a radicals peròxids ROO•. RH + O2 → R• R• + O2 → ROO• - Propagació (reacció encadenada): Es van acumulant peròxids. Els radicals lliures R• segueixen reaccionant amb l’oxigen produint radicals peròxid ROO• i aquests a la seva vegada reaccionen amb els lípids insaturats RH donant lloc a hidroperòxids i radicals lliures. R• + O2 → ROO• ROO• + RH → ROOH + R• - Terminació: Els radicals lliures R• procedents de la descomposició dels radicals peròxid es combinen entre ells donant lloc a altres compostos com ara aldehids, cetones o àcids grassos de cadena curta que donen l’olor a ranci. En aquestes condicions la reacció acaba [3]. R• + R• → R-R R• + ROO• → ROOR R• + RO• → ROR 3.2.2 Inhibició de l’oxidació dels greixos Els antioxidants són capaços de competir amb els àcids grassos pels radicals peròxids cedint el seu hidrogen del seu grup hidroxil. D’aquesta manera bloquegen el radical peròxid i es forma un nou radical més estable ja que l’electró està deslocalitzat en l’anell benzènic de l’antioxidant. És així com són capaços d’aturar temporalment la reacció en cadena de la propagació. ROO• + A-OH → ROOH + AO• Una acció característica dels antioxidants es que provoquen un període de latència o període d’inducció (PI) el qual es habitualment d’una duració proporcional a la concentració d’antioxidant i es manté fins que el 90% de l’antioxidant ha estat destruït. Durant aquest període de latència la peroxidació dels àcids grassos es produeix a una velocitat molt lenta, però finalment progressa a una velocitat igual o inclús superior a la dels lípids no protegits [3]. Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 15 Imatge 5. Reacció del radical ABTS amb l’antioxidant [15] 3.4.3 Assaig ORAC L’assaig ORAC (Oxigen Radical Antioxidant Capacity) es realitza seguint el procediment descrit per Y.C.Blanco (2007) [16]. Aquest consisteix en la quantificació de la capacitat antiradicalària mitjançant la inhibició de l’atac a la fluoresceïna per part del radical AAPH (Adriana Barbosa Costa, 2013). Els valors obtinguts són les àrees de sota les corbes de fluoresceïna, aproximades pel mètode de trapezis. Figura 1. Corva característica de l’assaig ORAC per una mostra amb i sense extracte 0,00E+00 5,00E+04 1,00E+05 1,50E+05 2,00E+05 2,50E+05 3,00E+05 020 40 60 80 Fluorescencia relativa Temps (min) Amb extracte 0,05% Blank Pàg. 16 Memòria 3.4.4 Assaig DPPH La capacitat de captació de radicals lliures es va mesurar utilitzant el radical lliure 2,2- difenil-1-picrilhidracil (DPPH) segons el mètode proposat prèviament per B.Williams (1995) [17]. Per al càlcul de la capacitat de captació de radicals lliures es troba el percentatge d’inhibició del DPPH. Aquest es calcula: % 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó 𝐷𝑃𝑃𝐻 = 𝐴𝑏𝑠 (𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 0)− 𝐴𝑏𝑠(𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 𝑎𝑐𝑡𝑢𝑎𝑙) 𝐴𝑏𝑠 (𝑡𝑒𝑚𝑝𝑠 0) .100 A més temps major és la inhibició del radical DPPH ja que ha reaccionat més radical. A més concentració d’antioxidant major també és la inhibició d’aquest radical ja que més H provinents de l’antioxidant hauran reaccionat amb el radical lliure DPPH. Imatge 6. Reacció entre el radical DPPH i l’antioxidant [15] Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 17 3.5 Noni (Morinda Citrifolia) El noni es una fruita originaria del sud-est asiàtic i es cultiva en zones de clima tropical com ara la Polinèsia, la Índia, el Carib, Mèxic, Amèrica Central i part d’Amèrica del Sud. Les mostres concretament són de Veneçuela i Veracruz. El noni s’utilitza tant en aliments com en fàrmacs. Normalment se’n consumeix el suc de la fruita però també s’utilitzen les fulles, les flors i l’arrel. És coneguda com una planta amb alt potencial antioxidant [5]. 3.5.1 Descripció de la planta És un arbust de 3 a 10 m d’altura amb abundants fulles amples el·líptiques. El fruit és ovalat de color blanc quan es cull amb una closca i protuberàncies amb llavors. El fruit madur desprèn una olor forta a ranci i la polpa és sucosa i amarga, de color groc opac o blanc i aspecte gelatinós la qual presenta nombroses cavitats triangulars de color marró-roig que contenen quatre llavors. 3.5.2 Composició química S’han identificat aproximadament 140 compostos en la planta del Noni. Els principals són compostos fenòlics, àcids orgànics i alcaloides. Imatge 7. Detall de la fulla del Noni 3.5.3 Contingut d’aigua Per a saber el contingut d’aigua pesem la fulla a temps zero, quan aquesta està fresca i a temps final quan ja s’ha assecat completament i dóna pes constant. El contingut en aigua es calcula seguint la següent equació: % 𝑴𝑪 = 𝑝𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖.(𝑔)−𝑝𝑒𝑠 𝑓𝑖.(𝑔) 𝑝𝑒𝑠 𝑖𝑛𝑖.(𝑔) ·100 = 6,234−1,221 6,234 ·100 =𝟖𝟎,𝟒% Pàg. 18 Memòria 3.6 Mètodes per determinar el grau d’oxidació Hi ha un gran nombre de mètodes per valorar el grau d’oxidació dels greixos. No obstant, cap d’ells per si sols poden mesurar totes les reaccions d’oxidació alhora ni totes les etapes del procés d’oxidació. En aquest projecte s’ha utilitzat el VP, TBARS i l’espectroscòpia IR que es descriuen a continuació. 3.6.1 Valor de peròxid El valor de peròxid és un mètode químic molt freqüent per mesurar el deteriorament oxidatiu dels greixos en les primeres etapes d’aquesta reacció (oxidació primària). El mètode es basa en la capacitat dels peròxids d’oxidar els ions ferrosos (Fe II) a fèrrics (Fe III). La seva quantificació es realitza per la producció d’un color vermell al formarse un complex entre el tiocianat d’amoni i el Fe III. 3.6.2 TBARS És un mètode molt utilitzat per avaluar el grau d’oxidació dels lípids compostos per àcids grassos amb tres o més dobles enllaços (oxidació secundària). Es basa en l’aparició d’un compost rogenc degut a la presència d’un producte de condensació format per la unió d’una molècula de malondialdehid (MDA) (que es un dels derivats d’alguns dels productes de descomposició dels àcids grassos insaturats oxidats) amb dues molècules d’àcid tiobarbitúric (TBA). Imatge 8. Reacció del TBA amb el MDA. 3.6.3 Espectroscòpia IR L’energia IR produeix vibracions moleculars. Cada tipus d’enllaç químic vibra a una freqüència específica de manera natural. Per això quan la freqüència de la llum IR arriba a la freqüència de vibració de l’enllaç es produeix l’absorció. El conjunt d’absorbàncies IR per una mostra es coneix com el seu espectre IR. L’espectre IR d’una mostra és la quantitat d’energia IR (eix Y) que es absorbida a determinades freqüències (eix X) en la regió IR de l’espectre electromagnètic. Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 19 Taula 6. Correlació número d’ona – tipus d’enllaç en IR Segons la regió que analitza l’espectrofotòmetre existeixen tres regions d’aplicació de l’espectroscòpia infraroja:  Infraroig mig (MIR): és la regió més utilitzada. Va dels 200-4000 cm-1. S’utilitza en anàlisis qualitatius i quantitatius per espectres d’absorció, reflexió i emissió. Serà la utilitzada en l’experiment a realitzar.  Infraroig proper (NIR): Va dels 4000-12800 cm-1. Determinació quantitativa de rutina d’aigua, CO2, sofre, hidrocarburs baix pes molecular, compostos senzills d’interès.  Infraroig llunyà (FIR): Va dels 200-10 cm-1. Estructures d’espècies inorgàniques i organometàl·liques que utilitzen mesures d’absorció. 3.6.3.1 Equips d’espectroscòpia IR Imatge 9. Diagrama de les parts d’un espectrofotòmetre de FTIR Segons l’aparell encarregat de filtrar la senyal:  Espectrofotòmetre amb dispersió: Un monocromador separa la radiació IR en freqüències individuals. Una obertura de sortida aïlla la freqüència específica que arriba a la mostra. Font Selector de senyal Compartiment per la mostra Detector PC Pàg. 20 Memòria Imatge 10. Diagrama d’un espectrofotòmetre amb dispersió [18]  Espectrofotòmetre amb interferòmetre (FTIR): En comptes de registrar els valors variant la freqüència de llum IR monocromàtica es guia la llum a un interferòmetre. La mesura es més ràpida degut a que la informació de totes les freqüències es fan al mateix temps. Així s’obtenen múltiples lectures i se’n fa un promig, aplicant l’operació matemàtica de Transformada de Fourier, augmentant d’aquesta manera la sensibilitat de l’anàlisi. Degut a aquestes avantatges els espectrofotòmetres moderns són per FTIR. Imatge 11. Diagrama d’un espectrofotòmetre amb interferòmetre [18] Segons la mostra analitzar existeixen les següents tècniques:  Mètode de transmissió: Serveix per analitzar mostres transparents de films prims (<50um) o de sòlids comprimits (es premsa una pastilla de KBr amb mostra 100:1). Imatge 12. Diagrama del mètode de transmissió [18] Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 21  ATR (attenuated total reflectance): La radiació infraroja interactua amb la mostra a través d’ones evanescents. Es produeix una ona evanescent cada vegada que el raig IR es reflecteix per la cara interior del cristall. L’ona evanescent penetra la mostra a cada punt de reflexió. El complement ATR és un accessori útil per obtenir espectres IR de mostres que no poden ser col·locades en els suports habituals pel mètode de transmissió o bé que són opaques. L’accessori ATR necessita molt poca o cap preparació per la majoria de mostres i es una tècnica de mostreig molt versàtil. L’espectre resultant d’un ATR-IR s’assembla a un espectre IR convencional però té certes diferències: les posicions de bandes d’absorció són idèntiques en ambdós espectres però les intensitats relatives de les bandes corresponents són diferents sobretot en la zona de 1200-600 cm-1. És el mecanisme emprat en la lectura de l’estudi present. Imatge 13. Diagrama del mètode de ATR [18]  Reflexió especular: La reflexió especular és un mètode per mesures superficials llises i s’utilitza en adhesius i recobriments metàl·lics. Imatge 14. Diagrama del mètode de reflexió especular [18]  Reflexió difusa: S’utilitza en mostres en pols (sense tractament previ) i es basa en una reflexió múltiple [18]. Imatge 15. Diagrama del mètode de la reflexió difusa [18] Pàg. 22 Memòria 3.6.3.2 Freqüències estudiades L’espectroscòpia vibracional, concretament la regió mitja del IR és una tècnica molt útil per caracteritzar el procés de deteriorament lipídic. Els pics específics de l’oxidació dels lípids a estudiar són: - 1742 cm-1: C=O èster. Durant el temps d’emmagatzematge el valor de l’absorbància disminueix ja que s’hidrolitza l’enllaç èster dels triglicèrids i dels fosfolípids. - 1712 cm-1: C=O àcid carboxílic. Durant el temps d’emmagatzematge el valor de l’absorbància creix ja que s’estan formant àcids grassos lliures productes de la hidròlisis dels triglicèrids i dels fosfolípids [19]. Imatge 16. Estructura dels fosfolípids Imatge 17. Estructura dels triglicèrids Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 23 4. Material i mètodes 4.1 Material i reactius 4.1.1 Aparells i material Els aparells i els materials utilitzats van ser: Ultra-Turrax, balança, estufa, espectrofotòmetre, bany d’ultrasó, bany d’aigua, vòrtex, nevera, congelador, material general de vidre i plàstic de laboratori. 4.1.2 Reactius Els reactius utilitzats van ser: TBA (Àcid tiobarbituric), TCA (Àcid tricloroacètic), etanol, àcid clorhídric, clorur de ferro II tetrahidratat i tiocianat d’amoni. L’aigua destil·lada i l’aigua Milli-Q van ser extretes diàriament. 4.2 Planta Les fulles van ser recol·lectades a Veneçuela la primavera del 2015 i a Mèxic la primavera de 2016. Es molen les fulles del Noni, i s’emmagatzemen (en un dessecador) en la foscor a temperatura ambient fins al seu ús. 4.3 Aliments Es treballaran amb dos aliments diferents la carn de vedella i la sardina. La vedella es va adquirir en una empresa càrnica de Terrassa. La sardina es va adquirir durant l’abril-maig de 2016 del mercat de Les Corts, a Barcelona. El peix venia directament del port de Barcelona i l’experiment s’iniciava el mateix matí que s’adquiria el producte per minimitzar l’exposició de l’aliment a l’oxidació. La sardina va ser el peix escollit perquè és un peix blau que es pesca al Mediterrani i a més, és un aliment molt popular i consumit al país el qual es pot trobar a qualsevol mercat local [20]. 4.4 Preparació d’extractes Es pesen 0.25g de les fulles moltes i s’afegeixen 10ml d’etanol aigua al 50%. S’agiten en condicions de refrigeració, dins de la nevera, durant 24 hores. Es centrifuga l’extracte i es retira el sobrenedant. S’identifica l’extracte i es guarda al congelador a - 20°C, fins a la seva utilització. Pàg. 24 Memòria 4.5 Fabricació dels films 4.5.1 Film de PLA El film de PLA es prepara amb un 3% de PLA, 5% d’extracte i un 30% de cloroform. La mostra es va agitar 10min a 1500rev. 4.5.2 Film de gelatina-Noni Es barreja la gelatina comercial amb l’aigua destil·lada escalfant-ho al bany maria. S’agita el contingut fins dissoldre completament la gelatina. Es treu del bany el vas i s’afegeix glicerol i un volum d’extracte de Noni. Un cop dissolt i agitat, estirem el film damunt una safata coberta amb plàstic de polietilè. Es deixa assecar 24h en estufa a 30ºC. Imatge 18. Film de gelatina-Noni 4.6 Mètode de Folin-Ciocalteau Es preparen dues dissolucions. La dissolució amb el reactiu Folin amb una concentració de 13% i una dissolució de carbonat al 36%. A la microplaca s’afegeixen 20 ul de mostra de l’extracte i es barregen amb 80 ul de Folin, 80ul de carbonat i 80ul d’aigua destil·lada. Es deixa a la foscor durant 60 min i es fa la lectura a 765 nm en front el blanc [13]. Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 31 5.2 Estudi previ de l’extracte 5.2.1 Prova del TPC El contingut de polifenols totals (TPC) de cada mostra expressats en equivalents d’àcid gàl·lic per gram de mostra seca es mostren a la taula següent. Taula 7. Valors del TPC expressats com la mitjana ± desviació estàndard d’anàlisis triplicats Mostra Milimols equivalents d’àcid gàl·lic/g mostra seca Fulla Veneçuela 34,591 ± 0,069a Fulla Mèxic 43,692 ± 0,148a Fulla Mèxic fermentada 6,289 ± 0,006b Noni [22] 92,39 ± 111,81 (fulla) Te Verd [21] 245-837 Els valors amb la mateixa lletra al superíndex no són significativament diferents. 5.2.2 Prova del ORAC L’activitat antiradicalaria amb el radical APPH expressada en milimols equivalents de Trolox per gram de mostra (pes sec) es mostren a la taula següent. Taula 8. Valors de l’ORAC expressats com la mitjana i la desviació estàndard d’anàlisis triplicats Mostra Milimols equivalents de Trolox/g mostra seca Fulla Veneçuela 27,822 ± 1,538a Fulla Mèxic 24,779 ± 0,143a Fulla Fermentada 3,702 ± 0,878b Noni [16] 6,8-9,4 (polpa) Te Verd [21] 2,4-29 Els valors amb la mateixa lletra al superíndex no són significativament diferents. Pàg. 32 Memòria 5.2.3 Prova del ABTS L’activitat antiradicalaria amb el radical catiònic ABTS expressada en milimols equivalents de Trolox per gram de mostra seca es mostren a la taula següent. Taula 9. Valors de l’ABTS expressats com la mitjana i la desviació estàndard d’anàlisis triplicats Mostra Milimols quivalents de Trolox/g mostra seca Fulla Veneçuela 1,244 ± 0,032a Fulla Mèxic 1,423 ± 0,012b Fulla Fermentada 0,161 ± 0,002c Noni [13][17] 0,22-1,67 (polpa) Te Verd [21] 1,87-15,3 Els valors amb la mateixa lletra al superíndex no són significativament diferents. Totes tres mostres són significativament diferents. 5.2.4 Prova del DPPH L’activitat antiradicalaria amb el radical DPPH es mostra al gràfic següent. Figura 2. Gràfic de l’activitat antiradicalaria amb el radical DPPH. A temps 0 quasi no hi ha variació entre concentracions ja que la reacció entre el radical DPPH i la mostra s’està iniciant. A partir dels 30 minuts s’observa una y = -41,664x2 + 35,865x + 6,0949 R² = 0,9472 y = 57,43x + 1,9227 R² = 0,9258 y = 52,292x + 3,2956 R² = 0,9834 y = 64,437x + 1,8273 R² = 0,9859 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 0,2 0,4 0,6 0,8 % Inhibibió Concentració (g/ml) t=0 t=30 t=45 t=75 Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 33 tendència lineal i proporcional entre les concentracions i el valor d’inhibició del radical DPPH. Expressem el IC50 que es el valor de concentració de la mostra necessària per inhibir un 50% el radical DPPH. Aquest valor es calcula a partir de la recta de regressió donant un valor de concentració de 0,748 g/ml d’extracte. La mostra de fulla de Mèxic com la fermentada no s’han representat gràficament ja que els resultats obtinguts no són coherents (valors negatius). Aquest fet es pot deure a l’existència de reaccions paral·leles entre algun dels components de la mostra estudiada i el reactiu DPPH. 5.2.5 Correlació entre els diferents mètodes d’activitat antiradicalària Figura 3. Correlació lineal entre els mètodes ABTS i TPC Figura 4. Correlació lineal entre els mètodes ORAC i TPC y = 0,0325x + 0,0339 R² = 0,9658 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 010 20 30 40 50 60 ABTS-TPC y = 0,6433x + 1,7436 R² = 0,9001 0 5 10 15 20 25 30 35 010 20 30 40 50 60 ORAC-TPC Pàg. 34 Memòria Tant els valors de la fulla de Veneçuela com els de la fulla de Mèxic estan dins del rang admissible i per tant sí tenen poder antioxidant. Els valors de la fulla de Mèxic d’aspecte fermentat són coherents amb el que s’esperava ja que són les que tenen un TPC més baix. Aquest fet es pot deure a la pèrdua de polifenols durant la fermentació [7]. En les figures 2 i 3 s’han representat la correlació existent entre els mètodes antiradicalaris i el TPC i s’aprecia una forta correlació positiva entre mètodes (valor de coeficient de correlació R2 superior a 0,9). Aquests resultats són similars a alguns trobats a la bibliografia [7]. Els valors obtinguts a cada mètode es poden veure afectats per factors externs com ara l’estat del terra on creix la planta estudiada, l’època de l’any en que s’ha recol·lectat, el mètode d’extracció utilitzat així com la part de la planta que s’estudia [4]. Tots aquests factors alteren el valor final de les mesures tot i així els resultats obtinguts demostren que les fulles del noni estudiades sí tenen capacitat antioxidant. 5.3 Experiments Es realitzen diversos experiments per veure la capacitat antioxidant del noni a partir de la mesura de l’oxidació de les mostres. Figura 5. Diagrama de l’evolució del projecte Exp nº1 •Films de PLA i Gelatina en meat-burg Exp nº2 •Films de Gelatina i PEBD en meat-burg Exp nº3 •Emulsions o/w Exp nº4 •Pols de noni en fish-burg Exp nº5 •Espectroscòpia IR del greix de sardines Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 35 5.3.1 EXPERIMENT nº1, previ: Films de PLA i Gelatina en meat-burg 5.3.1.1 Resultats Figura 6. Gràfic de l’evolució del valor TBARS dels films al llarg del temps En aquest cas s’analitzarà la oxidació secundaria mesurant el TBARS. S’analitzarà film de PLA amb extracte de noni, film de gelatina amb extracte de noni, com a control positiu s’utilitzaran els films de PEBD (polietilè de baixa densitat) tractat amb te verd i com control negatiu sol amb carn de vedella i un film no activat per veure la protecció front la oxidació en el temps de cadascun. La carn utilitzada és carn de vedella. La gràfica 6 recull l’evolució de l’oxidació secundària de les mostres durant un temps de 8 dies. En aquest experiment la mostra Control film és la que s’oxida més ràpidament per tant es la que menys protegeix la mostra front l’oxidació. Segueix un comportament similar al PLA noni. La mostra de Gelatin Noni 0,375% s’oxida però més lentament que la resta de films. Per tant presenta més protecció enfront de l’oxidació que la resta de films. La de Control Tea no presenta oxidació al llarg del temps. Compleix la funció de control positiu per poder comparar les mostres amb l’antioxidant natural. Els resultats estan dins del que cabia esperar: l’ordre de protecció front l’oxidació de les diferents mostres en ordenació de protecció creixent són: Control film < PLA noni < Gelatin Noni < Control Tea. 5.3.1.2 Millores Els resultats mostren que el film de noni més adient per protegir enfront l’oxidació és el de gelatina tot i que no està funcionant amb la capacitat antioxidant que s’espera. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0123456789 Valor de TBARS (mg MDA/kg) Temps (dies) CONTROL FILM GELATIN NONI PLA NONI CONTROL TEA Pàg. 36 Memòria Per tant s’haurà de plantejar l’opció de refer el film duplicant la concentració de extracte o reduint a la meitat el volum del dissolvent etanol-aigua 50%. A més es posarà film per les dues cares de la mostra de carn. 5.3.2 EXPERIMENT nº2: Films de Gelatina i PEBD en meat-burg 5.3.2.1 Condicions de l’experiment En el segon experiment es decideix fer sols el film de gelatina amb Noni. En aquest cas s’analitzarà la oxidació secundaria mesurant el TBARS. Com control positiu s’utilitzaran els films de PEBD (polietilè de baixa densitat) tractat amb te verd (en dos concentracions diferents) els quals són films activats adquirits en una empresa externa i com control negatiu sol amb carn per veure la protecció front la oxidació en el temps de cadascun. No s’ha fet un control solament amb film de gelatina (sense afegir extracte) ja que anteriorment s’ha fet i es va veure que el comportament és molt similar al control sol amb carn. 5.3.2.2 Resultats Figura 7. Gràfic de l’evolució del valor TBARS del film NONI al llarg del temps. La gràfica 7 recull l’evolució de l’oxidació secundària de les mostres durant un temps de 9 dies. En aquest experiment la mostra control sols carn és la que s’oxida més ràpidament per tant és la que menys protegeix la mostra enfront l’oxidació. La mostra de noni film gelatina s’oxida però més lentament que la control. Per tant presenta més protecció enfront de l’oxidació que la mostra sense film. La de 0,25% PEBD presenta menys oxidació al llarg del temps que la noni film gelatina i la mostra 0,5% PEBD encara hi protegeix més. Tal i com era d’esperar el grau d’oxidació és menor quan més alta és la concentració d’antioxidant. L’ordre de protecció enfront l’oxidació de les diferents mostres en ordre de protecció creixent són: control < gelatin noni < PEBD 0,25% < PEBD 0,5%. 0,0 0,5 1,0 1,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Valor de TBARS (mg MDA/kg ) Temps (dies) CONTROL SOLO CARNE NONI FILM GELATINA PEBD tractat amb te verd 0,25% PEBD tractat amb te verd 0,50% Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 37 Taula 10. Valors de TBARS (mg MDA/kg) del dia 4 d’experiment Control 0,81690 ± 0,01229a Film de gelatina-Noni 0,5009 ± 0,0245b PEBD tractat amb te verd 0,25% 0,2548 ± 0,0157c PEBD tractat amb te verd 0,5% 0,19091 ± 0,00235c S’ha realitzat un anàlisi estadístic dels valors de TBARS en un dia intermig de l’experiment. Les dades són la mitjana ± desviació estàndard dels valors de TBARS del dia 4 d’experiment. Els valors amb la mateixa lletra al superíndex no són significativament diferents (α<0,05). Tots els valors són estadísticament diferents entre ells tret dels dos films de PEBD els quals no presenten diferències significatives. 5.3.2.3 Canvis en el color Els valors de color obtinguts amb el programa CIELab es mostren a la taula . El valor de a* (redness o vermellor) és el paràmetre de color més important quan s’avalua l’oxidació de la carn ja que el decreixement de la vermellor fa de la carn un producte no acceptable per als consumidors. En totes les mostres la vermellor (valor de a*) decreix a mesura que l’emmagatzematge en el temps progressa. Al final de l’experiment (dia 9), la intensitat del paràmetre vermellor es inferior al mesurat al dia 0 d’experiment com a resultat del procés oxidatiu donant així un canvi en el color. És fa notar que els efectes protectors dels extractes en la pèrdua del color no són tant pronunciats com l’efecte protector en front de la oxidació lipídica (prova del TBARS). Taula 11. Valors de vermellor (a*) de les mostres analitzades durant l’experiment CARACTERÍTICA DIA CONTROL FILM GELATINANONI FILM PEBD 0,25% FILM PEBD 0,5% Redness (a*) 0 57,42 57,00 57,00 57,00 2 49,17 43,83 50,00 43,27 3 50,00 42,16 43,32 37,47 4 50,66 41,70 45,96 38,24 6 26,84 35,00 32,89 34,41 7 16,91 30,18 22,00 25,70 9 10,00 22,05 19,68 22,97 Pàg. 38 Memòria 5.3.3 EXPERIMENT nº3: Emulsions o/w Les emulsions són un food-model molt acceptat per avaluar la capacitat antioxidant dels residus vegetals. Les emulsions utilitzades seran oli-aigua-tween20 amb la mostra. En aquest experiment es reflexa l’oxidació primària amb el mètode del valor peròxid. La protecció a l’oxidació és proporcional a la concentració d’antioxidants afegits, però una concentració massa elevada pot tenir l’efecte contrari, ser prooxidant. 5.3.3.1 Resultats VP Figura 8. Gràfic de l’evolució del VP de les emulsions de noni al llarg del temps La gràfica 8 recull l’evolució de l’oxidació primària de les mostres durant un temps de 22 dies. En aquest experiment la mostra Control és la que s’oxida més ràpidament, al sisè dia d’experiment ja pateix una forta oxidació que s’aprecia al gràfic amb una pujada brusca i continua al llarg del temps del seu valor de VP. La mostra de Noni 1,5% presenta més resistència a l’oxidació al llarg del temps que la mostra control als inicis de l’experiment. Però aquesta a partir del dia 8 comença a pujar de valor VP i a oxidar-se. La de Noni 5,8% no presenta oxidació al llarg del temps i per tant és l’emulsió més vàlida en quan a termes de protegir en front l’oxidació. Comença a oxidar-se a partir del dia 17 d’experiment. L’ordre de protecció enfront l’oxidació de les diferents mostres en ordre de protecció creixent són: Control < Noni 1,5% < Noni 5,8%. 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 0 5 10 15 20 25 meq hidroperòxids/kg emulsió Temps (dies) Control Noni 1,5% Noni 5,8% Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 39 5.3.3.2 Evolució del pH En la taula següent es mostren els valors de pH de les emulsions durant l’emmagatzematge de 23 dies. Els valors de pH de totes les mostres decreix amb el pas del temps. Aquest canvi de pH es pot deure a l’aciditat que produeixen la formació d’hidroperòxids al llarg del temps. Taula 12. Canvi en el pH durant l’experiment CARACTERÍSTICA DIA CONTROL NONI 1,5% NONI 5,8% pH 2 3,52 ± 003 3,48 ± 0,05 3,81 ± 0,08 7 3,19 ± 0,07 3,40 ± 0,01 3,67 ± 0,03 9 3,89 ± 0,08 3,65 ± 0,04 3,70 ± 0,04 14 2,85 ± 0,15 3,17 ± 0,07 3,66 ± 0,07 16 2,76 ± 0,11 3,05 ± 0,04 3,41 ± 0,16 5.3.3.3 Anàlisi estadístic Per poder realitzar l’anàlisi estadístic s’han agafat les dades de valor peròxid de cadascuna de les mostres a analitzar utilitzant el temps que triga en arribar a un valor determinat. S’ha calculat el temps que triguen en arribar a un valor d’hidroperòxids igual a 10meq/kg d’emulsió (valor màxim permès en olis segons la legislació) a 20meq/kg i a 30meq/kg. Figura 9. Temps de les mostres en arribar a diferents valors de peròxid. 0 100 200 300 400 10 20 30 Temps (h) VP (meq/kg) Noni 5,8% Noni 1,5% Control Pàg. 40 Memòria La figura 9 recull els temps que triguen cada una de les mostres en arribar a certs valors VP. És una representació més clara del que s’ha extret del gràfic anterior on s’aprecia que l’emulsió de noni 1,5% endarrereix l’oxidació de l’emulsió dues vegades més que si no duu extracte i per la de noni 5,8% es fins a tres vegades més lent en el temps que el control. Amb el programa Minitab es realitza una ANOVA (anàlisi de variància) d’un factor. Les dades obtingudes es resumeixen a la taula 10. Taula 13. Temps mig de les mostres. VP10 VP20 VP30 Control 30,350 ± 0,965c 55,66 ± 9,66c 74,1 ± 19,8b Noni 1,5% 89,94 ± 9,99b 141,0 ± 18,5b 169,09 ± 14,47b Noni 5,8% 285,5 ± 34,9a 366,4 ± 34,1a 410,8 ± 61,7a Les dades són la mitjana ± desviació estàndard del temps. Els valors amb la mateixa lletra al superíndex no són significativament diferents (α<0,05). 5.3.4 EXPERIMENT nº4: Pols de noni en fish-burg 5.3.4.1 Condicions de l’experiment Es tracten 500 g de sardina fresca del mercat local. El peix es neteja i es pela obtenint dos filets per sardina. Després s’embolica amb paper film i es deixa en a -18 ºC. Es pica tota la massa de sardina per homogeneïtzar la mostra i es fan les fish-burg. Es fan 3 parts: a. Sense res (control) b. Amb 5% de té verd (control positiu) c. Amb 5% de noni 5.3.4.2 Resultats Figura 10. Gràfic de l’evolució del valor de TBARS de les fish-BURG al llarg del temps 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 1 2 3 4 5 Valor de TBARS (mg MDA/kg) Temps (dies) CONTROL SOLO FISH TEA 5% NONI 5% Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 47 6.5 Personal Per al càlcul de cost de personal s’ha de tenir en compte les hores treballades, el sou del treballador (SB) i el cost que té l’empresa de seguretat social (SS) de cada treballador. Per tant el cost de personal es calcula mitjançant l’expressió següent: 𝑪𝒐𝒔𝒕 𝒅𝒆 𝒑𝒆𝒓𝒔𝒐𝒏𝒂𝒍 (€)={𝑹𝑯 (𝒉𝒐𝒓𝒆𝒔·𝒑𝒆𝒓𝒔𝒐𝒏𝒂)· 𝑺𝑩 (𝒆𝒖𝒓𝒐𝒔 𝒉𝒐𝒓𝒂)} + 𝑺𝑺 (𝒆𝒖𝒓𝒐𝒔) Taula 22. Cost total del personal [25]. GRUP PROFESSIONAL PERS. RH (H/PERS.) SB (€/H) SB (€) SS (€) [32% SB] COST TOTAL (€) Projectista 1 600 12,10 7.260 2.323,2 9.583,20 Professor 1 100 17,21 1.721 550,72 2.271,72 TOTAL 11.854,92 6.6 Total Taula 23. Cost total del projecte IMPORT (€) Reactius 35,61 Aliments 17,47 Material 10,82 Aparells 121,96 Personal 11.854,92 TOTAL 12.040,78 Per tant, el cost total del projecte és de 12.040,78€ Pàg. 48 Memòria 7. Impacte ambiental Un dels valors afegits que tenen els antioxidants naturals vers els sintètics es que minimitzen l’impacte ambiental ja que provenen del reaprofitament de residus naturals i s’evita el cost de fabricació i d’energia en el cas dels sintètics. En la realització dels diferents experiments es generen residus ja que s’utilitzen reactius perjudicials pel medi ambient. En la taula 24 s’indica el nom del residu, l’experiment en que s’utilitza i al grup de residus al qual pertany. Un cop separats en els seus respectius dipòsits la universitat els envia a una planta de tractament de residus. Taula 24. Separació residus generats. RESIDU EXPERIMENT GRUP DE RESIDUS Etanol VP Dissolvents orgànics no halogenats Ferrocianur Reactiu VP Dissolvents orgànics amb metalls Àcid clorhídric Reactiu VP i TBARS Dissolucions àcides Àcid tiobarbitúric Reactiu TBARS Dissolucions àcides Àcid tricloroacètic Reactiu TBARS Dissolucions àcides Alúmina Eliminació antioxidants oli Residus olis Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 49 8. Desenvolupament temporal del treball Taula 25. Diagrama de Gantt del treball Pàg. 50 Memòria Conclusions En tots els experiments s’ha complert que la protecció de l’oxidació és proporcional a les concentracions dels antioxidants afegits. En la quantificació de l’activitat antioxidant, l’extracte de fulla de noni de Veneçuela i el de Mèxic analitzats tenen una correlació entre els mètodes antiradicalaris i la determinació de polifenols totals. L’extracte de fulla fermentada presenta la quantitat inferior d’antioxidants en aquests mètodes, resultats que concorden amb la bibliografia. En les emulsions o/w, l’extracte de noni al 5,8% protegeix 3 vegades més de l’oxidació que l’extracte de noni 1,5% i que la mostra control. En l’experiment en carn, el film de gelatina mostra més efectivitat que el de PLA quan se li afegeix extracte de noni. El film de gelatina-noni així com els films de PEBD protegeixen 1,7 vegades més de l’oxidació que la mostra control. Hi ha un comportament similar en l’experiment amb peix, on el noni 5% i el te verd 5% protegeixen 6 vegades més de l’oxidació que la mostra control. L’anàlisi amb espectroscòpia infraroja demostra també com el noni protegeix la mostra front l’oxidació mitjançant l’estudi de les bandes específiques de l’espectre. El decreixement i creixement d’aquestes bandes dóna també suport a l’estudi. Les recomanacions futures per a seguir amb aquest estudi són: Degut a que actualment la investigació científica s’està especificant en l’estudi de la cura de les malalties fóra interessant, en el cas de continuar estudiant els efectes beneficiosos de la fulla del noni, incloure un estudi de la capacitat de l’extracte per protegir les cèl·lules del nostre organisme. Per a dur-ho a terme s’analitzaria l’activitat anticancerígena de l’extracte de fulla de noni. El mètode a seguir consistiria en afegir aquest extracte a un cultiu de cèl·lules canceroses i mesurar per citometria posterior la viabilitat de les cèl·lules. La hipòtesi a verificar seria que en presència de l’extracte la mortalitat de les cèl·lules canceroses seria major. Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 51 Agraïments Agraeixo a Maria Pilar Almajano, la meva tutora, per donar-me l’oportunitat per poder realitzar aquest projecte de fi de Grau amb ella. Gràcies per ajudar-me i ensenyar-me durant la realització dels diferents experiments i durant els dubtes i millores que han anat sorgint. Especialment agrair el fet que he pogut aprendre la feina en un laboratori i de la dedicació i esforç que es necessita. Gràcies als meus companys de laboratori Gaby, Manel, Àngels, Camila i Martín, que durant aquests mesos sempre m’han ajudat quan he necessitat un cop de mà en el projecte. A la meva família per donar-me suport durant tota la carrera i creure en mi durant aquesta llarga etapa. A les meves amigues i companys de carrera per estar a prop meu en tot moment amb els quals he estudiat, rigut i passat molts bons moments. Pàg. 52 Memòria Bibliografia [1] E. CONDE, M.GORDON, A.MOURE, H. DOMINGUEZ (2011). Effects of caffeic acid and bovine serum albumin in reducing the rate of developent of rancidity in oilin-water and wáter-in-oil emulsions [2] M.G.GALLEGO, M.H.GORDON, F.J.SEGOVIA, M.P.ALMAJANO (2015). Caesalpinia decapetala Extracts as inhibitors of lipid oxidation in beef patties [3] JAN POKORNY, NELLY YANISHLIEVA, MICHAEL H. GORDON (2001). Antioxidants in food. Elsevier. [4] A.DECKER, K.WARNER, P.RICHARDS, F.SHAHIDI (2005). Measuring Antioxidant Effectiveness in food [5] TORRE, A. D. (2004). Noni, El árbol de la vida. [6] M. LAGUERRE, J. LECOMTE, P.VILLENEUVE (2007). Evaluation of the ability of antioxidants to counteract lipid oxidation: Existing methods, new trends and challenges [7] J. YANG *, R. P.-S. (2006). Free-radical-scavenging activity and total phenols of noni (Morinda Citrifolia). [8] SHENGMIN SANG, X. C. (2001). Flavonol Glycosides and Novel Iridoid Glycoside from the Leaves of Morinda Citrifolia. [9] KOHEI KAMIYA, Y. T. (2004). Chemical Constituents of Morinda citrifolia Fruits Inhibit Copper-Induced Low-Density Lipoprotein Oxidation. [10] YIN YIN THOO, S. K. (2009). Effects of binary solvent extraction system, extraction time and extraction temperature on phenolic antioxidants and antioxidant capacity from mengkudu (Morinda citrifolia). [11] Z. MOHD ZIN, A. A.-H. (2001). Antioxidative activity of extracts from Mengkudu (Morinda citrifolia L.) root, fruit and leaf. [12] Z. MOHD ZIN, A. A. (2004). Antioxidative activities of chromatographic fractions obtained from root, fruit and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia L.). [13] V.ROGINSKY, E.A.LISSI (2004). Review of methods to determine chainbreaking antioxidant activity in food. [14] ADRIANA BARBOSA COSTA, A. M. (2013). Atividade antioxidante da polpa, casca e sementes do noni (Morinda citrifolia L). [15] J.T.DEL RIO (2013). Determinación de la actividad antioxidante por dpph y abts de 30 plantas recolectadas en la ecoregion cafetera Les fulles de Morinda Citrifolia com antioxidant natural Pàg. 53 [16] YANINE CHAN-BLANCO, F. V. (2007). The ripening and aging of noni fruits (Morinda citrifolia L.): microbiological flora and antioxidant compounds. [17] BRAND-WILLIAMS W, C. M. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. [18] Espectroscopia infrarroja [data de consulta: 18/04/2016] www.upct.es/~minaeees/espectroscopia_infrarroja.pdf [19] ISABEL SÁNCHEZ-ALONSO, P. C. (2011). Vibrational spectroscopic analysis of hake lipids during frozen storage. [20] La Sardina [data de consulta: 04/05/2016] (juny 2016) DONNA10 La revista de Terrassa I Matadepera [21] MARÍA DE LA LUZ CÁDIZ-GURREA, S. F. (2014). Pine Bark and Green Tea Concentrated Extracts: Antioxidant acitvity and characterization of bioactive Compounds by HPLC. [22] M.S.PAK-DEK, A.OSMAN, N.G.SAHIB, N.SAARI (2011). Effects of extraction techniques on phenolic components and antioxidant activity of mengkudu (Morinda Critrifolia L.) leaf extracts [23] PANREAC. [data de consulta: 21/03/2016] www.panreac.es [24] Catàleg de productes químics [data de consulta: 21/03/2016] www.labbox.com/es/productos/ [25] Federación Empresarial de la Industria Química Española [data de consulta: 21/03/2016] http://www.feique.org/