Desarrollo de nuevos sistemas poliméricos para regeneración tisular

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Desarrollo de nuevos sistemas poliméricos para regeneración tisular. Autor: Tomás Sánchez Gutiérrez Tutor/es: Dra. Alessandra Girotti Dr. Javier Arias Vallejo Dra. Raquel Muñoz Martínez Resumen 2 1. RESUMEN ............................................................................................................................. 4 2. INTRODUCCIÓN. ................................................................................................................ 5 2.1 INGENIERÍA GENÉTICA. ............................................................................................. 5 2.1.1 Enzimas de restricción. ............................................................................................. 7 2.1.2 Clonación de DNA. ................................................................................................... 8 2.2 ELASTINA, RECOMBINÁMEROS DE TIPO ELASTINA Y APLICACIONES. ..... 14 2.2.1 Estructura secundaria de la Elastina. ....................................................................... 14 2.2.2 Recombinámeros tipo elastina (ELRs). ................................................................... 16 2.2.3 Aplicaciones de los ELRs. ...................................................................................... 18 2.3. REGENERACIÓN NEURONAL PERIFÉRICO. ........................................................ 20 3. OBJETIVOS. ........................................................................................................................ 22 4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 23 4.1 MATERIALES. .............................................................................................................. 23 4.1.1 Reactivos químicos. ................................................................................................ 23 4.1.2 Materiales biológicos. ............................................................................................. 24 4.1.3 Proteínas. ................................................................................................................. 25 4.1.4 Vectores. .................................................................................................................. 27 4.1.5 Oligómeros sintéticos usados en la síntesis del polímero final. .............................. 28 4.1.6 Kits de extracción y purificación de DNA. ............................................................. 30 4.2 MÉTODOS. .................................................................................................................... 30 4.2.1 Electroforesis de DNA. ........................................................................................... 30 4.2.2 Determinación de la concentración de DNA. .......................................................... 33 4.2.3 Purificación de plásmidos. ...................................................................................... 33 4.2.4 Digestión de DNA con enzimas de restricción. ...................................................... 35 4.2.5 Tratamiento de DNA con enzimas de defosforilación. ........................................... 35 4.2.6 Reacciones de ligación. ........................................................................................... 36 4.2.7 Transformación de cepas bacterianas. ..................................................................... 36 4.2.8 Bioproducción de polímeros recombinantes. .......................................................... 38 4.2.9 Purificación de polímeros recombinantes. .............................................................. 40 4.2.10 Caracterización física de polímeros recombinantes. ............................................. 41 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 44 5.1 DISEÑO DE POLIMEROS Y ESQUEMAS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS. ...................................................................................................................... 44 5.1.1 Diseño del polímero 1. .......................................................................................... 44 5.1.2 Diseño del polímero 2. .......................................................................................... 45 5.1.3 Diseño del polímero 3. .......................................................................................... 47 Resumen 3 5.2 SÍNTESIS DE PLÁSMIDOS. ........................................................................................ 48 5.2.1 Síntesis del plásmido que codifica al polímero 1. ................................................... 48 5.2.2 Síntesis del plásmido que codifica el polímero 2. ................................................... 55 5.2.3 Síntesis del plásmido que codifica al polímero 3. ................................................... 63 5.3 BIOPRODUCCIÓN. ...................................................................................................... 67 5.4 CARACTERIZACIÓN DE POLÍMEROS. ................................................................... 69 5.4.1 Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................................. 69 5.4.2 Resonancia magnética nuclear (RMN).................................................................... 70 5.4.3 Espectroscopía de Masas. ........................................................................................ 72 6. CONCLUSIÓN. ................................................................................................................... 73 7. BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................. 74 8. ABREVIATURAS ............................................................................................................... 79 Resumen 4 1. RESUMEN El creciente interés de la sociedad en los biomateriales se debe principalmente a dos factores: el gran número de población que está directamente afectada a su necesidad y el hecho de que la esperanza de vida haya aumentado de forma considerable. Hasta hoy todavía la medicina recurre a biomateriales nacidos como materiales industriales. El desarrollo de nuevos biomateriales poliméricos empleados en ingeniería tisular y medicina regenerativa requiere alcanzar grados de gran complejidad ya que deben ser capaces de restablecer las propiedades y funcionalidades de los tejidos que se quieren regenerar. En este estudio diseñamos y sintetizamos una cadena polimérica proteínica con secuencia, estructura y propiedades derivadas desde proteínas naturales estructurales como la elastina y la seda; además dos secuencias bioactivas para interactuar con las células del paciente y promover la regeneración neuronal. Su síntesis se lleva a cabo mediante las técnicas de ingeniería genética usando la bacteria Escherichia coli tanto en las fases de clonación como como en la expresión de los genes que codifican para nuestros materiales. Construimos un gen quimérico usando determinadas metodologías de ADN recombinante y lo subclonamos en 2 plásmidos, primero uno de clonación y posteriormente con uno de expresión. Se ha comprobado en cada paso de clonación tanto el peso molecular como la secuencia de la cadena de DNA. Una vez obtenido el gen codificante se ha biosintetizado el biopolímero que fue sucesivamente purificado y caracterizado para determinar el grado de pureza y la correspondencia con su diseño mediante RMN (Resonancia Magnética Nuclear), DSC (Calorimetría Diferencial de Barrido) y espectroscopía de Masas. La eficacia del diseño del nuevo material para aplicaciones tisulares neuronales y la biofuncionalidad alcanzada tendrán que ser comprobadas mediante ensayos celulares in vitro, que posteriormente serán trasladados en ex vivo e in vivo. 1. ABSTRACT The growing interest of society in biomaterials is mainly due to two factors: the large number of population that is directly affected to their need and the fact that life expectancy has increased considerably. Until now, medicine still uses biomaterials born as industrial materials. The development of new polymeric bio-materials, used in tissue engineering and regenerative medicine, needs to reach complex grades, as those materials should be able to restore the features and functions that the tissues to be regenerated have. During this research, we do design and synthetize a protein polymeric chain, which sequence, structure and feature derived from natural structural proteins like elastin and silk in addition two bioactive sequences to interact with the patient's cells and promote a neuronal regeneration effect. This synthesis was developed by genetic engineering techniques, using the Escherichia coli bacteria, as a heterologous host, in both, DNA cloning steps, and expression of our materials. We develop a chimeric genes using certain recombinant DNA methodologies and we sub-cloning them in two kind of plasmids; firstly, in specific cloning procedures one, and in a second step in an expression vector. Both the molecular weight and the sequence of the DNA chain have been verified in each cloning step. Once the coding gene was obtained, the biopolymer was produce in bioreactor and successively purified and characterized to determine the degree of purity and the correspondence with its design by means of NMR, DSC and Masses spectroscopy. The effectiveness of the design of the new material for neuronal tissue applications and achieved biofunctionality will have to be proven by in vitro cell culture and subsequently demostrated in ex vivo and in vivo assays. Introducción 5 2. INTRODUCCIÓN. 2.1 INGENIERÍA GENÉTICA. Cuando se comprendió la estructura de los genes y cómo la información que éstos portaban se traducía en proteínas, que conferían funciones o características celulares, comenzó una nueva etapa cuyo fin era buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y transferirlos de un organismo a otro, para conferirle nuevas propiedades/ventajas, o simplemente inducir una sobreexpresión proteica particular. Justamente, de eso trata la ingeniería genética, un conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro (clonación), y como consecuencia, obtener las proteínas recombinantes (heterólogas) de interés1. En las últimas décadas, la ingeniería genética ha revolucionado la biología permitiendo el gran desarrollo de la biología molecular. El campo de la medicina es, por ejemplo, uno de los más beneficiados con el desarrollo de esta ciencia, haciendo posible un diagnóstico clínico precoz, la identificación genética de individuos, o la terapia génica. Sin embargo, las aplicaciones derivadas del conocimiento de los genes no sólo se limitan a este campo. Existe la posibilidad de obtener compuestos específicos, gracias a la combinación de los conocimientos y técnicas de la bioquímica, la microbiología, la química y la ingeniería química, aprovechando las propiedades de los microorganismos y los cultivos celulares2. De este modo, es posible producir gran número de sustancias y compuestos altamente puros y monodispersos, a partir de recursos renovables y disponibles. Así, se han producido fármacos recombinantes, como la insulina3, tanto en bacterias como en animales transgénicos; o se han mejorado cultivos mediante producción de plantas transgénicas resistentes a enfermedades4, etc. Cabe destacar, como la ingeniería genética ha propiciado un gran avance en el desarrollo de nuevos biomateriales, para ser empleados en aplicaciones biomédicas como la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, destacando los materiales basados en proteínas, pues su producción recombinante proporciona la capacidad de afinar el diseño de su secuencia de aminoácidos, obteniendo las propiedades mecánicas, funcionales y miméticas de interés5 y 6. Introducción 6 Los biomateriales se definen como sustancias naturales o sintéticas que están incluidos en sistemas terapéuticos o diagnósticos7; o como componentes de origen biológico que no se relacionan con sus aplicaciones8, y que no se les considera nutrientes o fármacos. La medicina y la cirugía recurren de manera creciente a biomateriales nacidos como materiales industriales ajenos al organismo, con la finalidad de encontrar un remedio, definitivo o temporal, al déficit de una función fisiológica. Los biomateriales sintéticos o industriales son aquellos en el que su materia prima es de origen artificial. Estos materiales poseen la capacidad de sustituir total o parcialmente las funciones de un organismo vivo y por lo tanto deben cumplir el requisito de la biocompatibilidad, es decir no interactuar de forma perjudicial con el organismo. El grado de biocompatibilidad de un material depende de su forma, estructura, composición química y de sus propiedades químicas, físicas, mecánicas y eléctricas. Otro requisito muy importante de un biomaterial es su duración, es decir la capacidad de mantener sus prestaciones durante el tiempo necesario, ya sea en un implante provisional o definitivo. Actualmente se pueden encontrar en la literatura numerosas clasificaciones de los biomateriales. En la Tabla 1 se presenta una clasificación según varios aspectos importantes que se deben tener en cuenta cuando se diseñan nuevos dispositivos. En este trabajo se trabajará con biomateriales poliméricos, estos son polímeros producidos por organismos vivientes desarrollados para aplicaciones médicas. Clasificación de los Biomateriales En base a los efectos producidos en el material En base a la interacción material/organismo En base a la naturaleza química Bioestables Biodegradables Biotóxicos Bioactivos Bioinertes Poliméricos Metálicos Cerámicos Composite De derivación biológica Tabla 1: Clasificación de los biomateriales en base a sus diferentes propiedades32. Introducción 7 El aumento del interés en los biomateriales se debe a dos factores: la gran cantidad de población que se encuentra afectada directamente a problemas asociados a su utilización, y al aumento considerable de la esperanza de vida. Este último factor tiene implicaciones específicas relacionadas con el mantenimiento de la calidad de vida. Por ello, los implantes biomédicos tendrán mayor importancia y relevancia, y deberán evolucionar para garantizar prestaciones siempre superiores. Los propósitos que la ciencia de biomateriales tendrá que alcanzar están relacionados con la mejoría de su biocompatibilidad, la identificación de las propiedades furtivas, es decir las características que dotan al material de las capacidades para pasar desapercibido, por el sistema inmune al organismo receptor, e íntegro hasta sus dianas, y la creación de nuevos biomateriales cuyas propiedades puedan ser controladas y cambiadas según las necesidades, los llamados “materiales inteligentes9 y 10. Estos últimos, son materiales que pueden autorepararse o adaptarse autónomamente a determinadas condiciones ambientales. Entre ellos se encuentran los geles que responden a estímulos físico-químicos como cambios de temperatura o de pH y que pueden ser muy interesantes en la obtención de matrices para la liberación controlada de medicamentos, los polímeros fotosensibles, los polímeros superconductores usados en la fabricación de "microchips", fibras, filamentos o los súper-absorbentes expansibles que retienen agua y aumentan su tamaño hasta en 500 veces su volumen original11. Por último, la aportación de la emergente nanotecnología será también determinante. El rápido progreso en los últimos años de estos biomateriales y, de hecho, su propia existencia, es el resultado de utilizar unas pocas técnicas de biología molecular e ingeniería genética que se describen a continuación, permitiendo su producción recombinante de una manera extremadamente versátil y controlada. 2.1.1 Enzimas de restricción. Para el desarrollo de las técnicas de biología molecular en ingeniería genética fue esencial el descubrimiento de las enzimas de restricción que han permitido a los investigadores manipular segmentos específicos de DNA. Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, reconocen secuencias de bases nucleotídicas específicas en el DNA de doble hélice y cortan ambas hebras del dúplex en lugares concretos. Su función Introducción 8 biológica en los organismos procariontes consiste en eliminar DNA foráneo que pudiera ingresar en ellos, como por ejemplo el de bacteriófagos (virus que infectan a bacterias). Cada enzima de restricción va a reconocer una secuencia específica (sitio de restricción) en el DNA de entre 4 a 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de la región reconocida. Una característica notable de estos sitios de corte es que en muchos casos son palíndromos y están dispuestos simétricamente (Figura 1). Los cortes con estas enzimas pueden ocurrir dejando lo que se conoce como extremos “cohesivos” si el corte ocurre corrido en una hebra respecto la otra, dejando en este caso un fragmento de hebra simple, o pueden obtenerse extremos “romos”, con DNA doble cadena (Figura 1). Figura 1: Cortes de enzimas de restricción generando extremos cohesivos y romos Lab Basics: Corte y pega (diseña tu propio clon). Es importante destacar que a medida que el sitio de restricción de una enzima tenga mayor número de pares de bases, la frecuencia de corte será menor, ya que es menos probable que se encuentre esta secuencia de reconocimiento en una molécula de DNA12. 2.1.2 Clonación de DNA. La generación de sitios específicos de corte en el DNA gracias a la actuación de los enzimas de restricción permitió llevar a cabo el proceso de clonación del DNA. Este proceso consiste en que un fragmento de DNA obtenido a partir de un organismo (DNA foráneo) es insertado enzimáticamente en un plásmido o vector, obteniéndose un plásmido recombinante. Un plásmido es una molécula de DNA extracromosómico circular capaz de replicarse y transcribirse de forma independiente del DNA cromosómico. A diferencia del cromosómico, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad de la célula bacteriana; sin embargo, algunos contienen genes que resultan útiles para la célula hospedadora (como los que Introducción 9 confieren resistencia a antibióticos). El plásmido recombinante obtenido es insertado en células hospedadoras. A medida que la célula hospedadora se divide en dos células hijas, además de replicar su propio DNA, también replica el DNA del vector, el cual incluye el DNA foráneo. El proceso mediante el cual se introduce un vector a una bacteria se denomina transformación (Figura 2). Figura 2: Esquema de la clonación de DNA 39 con modif. Las células hospedadoras suelen ser bacterias, ya que presentan ventajas incomparables: organización celular sencilla, el genoma pequeño, fáciles de cultivar, alta eficiencia de incorporación del gen exógeno y proliferación rápida, entre otras. Cada plásmido o vector que se emplea para la inserción de DNA foráneo y para la transformación bacteriana tiene, por lo menos, una secuencia de DNA que sirve como origen de replicación, es decir, un punto de partida para la réplica del DNA. Estos vectores poseen Introducción 16 esta transición se le ha denominado transición inversa, y a la temperatura a la cual ocurre, la denominamos temperatura de transición (Tt) 22. Esta característica peculiar de la elastina ha sido, junto con sus propiedades mecánicas y su biocompatibilidad, las responsables de que dicha proteína haya despertado un gran interés en la comunidad científica. Los esfuerzos investigadores más importantes se han centrado en el estudio de la estructura de las fases ordenada y desordenada de la cadena polipeptídica, para aportar luz en la comprensión de las causas que producen esta singular transición de fase, elucidando así la relación estructura-propiedades23. Dicho interés ha dado como resultado el desarrollo de un amplio abanico de polímeros tipo elastina, utilizados para un número en constante crecimiento de aplicaciones biotecnológicas24. 2.2.2 Recombinámeros tipo elastina (ELRs). Las características particulares de estos recombinámeros han despertado interés en disolución acuosa y por debajo de su temperatura de transición (Tt), las cadenas de polímero se encuentran desordenadas y completamente hidratadas, hidrofóbicamente, las moléculas de agua se encuentran formando a su alrededor una estructura ordenada tipo clatrato (Figura 8) que protege los extremos apolares del polímero constituidos por aminoácidos, tales como valinas, con una cadena lateral hidrocarbonada, lo que les hace ser especialmente hidrofóbicas, impidiendo de esta forma la formación de enlaces entre los aminoácidos. En cambio, por encima de su Tt, las moléculas de agua que rodean los restos apolares del polímero, pierden la conformación tipo clatrato debido a la agitación térmica. La cadena polipeptídica se pliega hidrofóbicamente, y las cadenas hidrocarbonadas en los extremos apolares mencionadas antes, sí que se ensamblan mediante enlaces amino y puentes de hidrógeno entre los diferentes aminoácidos dando lugar a una estructura regular llamada espiral β (Figura 8) constituida por una sucesión de horquillas β. En este caso la hidratación se reduce pero se mantiene en un 25% de agua. Introducción 17 Figura 8: Esquema del cambio conformacional que sufren ELR al estar por encima o debajo de su Tt40. La mayoria de las proteínas presentan un comportamiento contrario, es decir, el aumento de la temperatura provoca su desplegamiento y su desnaturalización, por lo que a esta transición se le denomina Transición Inversa con la Temperatura (ITT)25. Es necesario explicar este proceso desde un punto de vista termodinámico haciendo uso de la ecuación de la Energía Libre de Gibbs: Siendo: ΔG=energía libre de reacción ΔH=variación de entalpía del sistema T=temperatura ΔS= variación de entropía del sistema. Durante el calentamiento, el polímero se pliega y se rompe la estructura tipo clatrato que formaban las moléculas de agua, esto provoca un mayor desorden en el medio y como consecuencia un aumento del valor entrópico (ΔS>0↑↑) en el entorno. Por lo tanto, el aumento de la entropía es el causante de que la energía libre de Gibbs sea menor que cero (ΔG<0) y que el plegamiento del polímero sea un proceso espontáneo26. Al igual que a cambios de temperatura, los ELRs también responden a cambios de luz o de pH. Son capaces de percibir las condiciones ambientales y sufrir cambios en respuesta a Introducción 18 ellas, convirtiéndolos en unos compuestos muy atractivos en investigación biomédica y biotecnológica por lo que se les califica como “polímeros inteligentes”27. 2.2.3 Aplicaciones de los ELRs. El grado de conocimiento alcanzado en relación a la estructura y propiedades de estos materiales hace que nuevas aplicaciones estén apareciendo continuamente. El conocimiento de los mecanismos ΔTt descritos hasta el momento hace que los sistemas diseñados puedan variar entre dos estados gracias a sistemas estímulo-respuesta que produzcan diferentes transformaciones energéticas, estos pueden ser desde estímulos térmicos26, respuestas a una variación de pH e incluso a estímulos luminosos, mientras que el avance en la biosíntesis hace que se puedan obtener, independientemente de la complejidad, casi cualquier polímero deseado. Podemos diseñar, por tanto, estos materiales, de acuerdo a las exigencias de una determinada aplicación. La extraordinaria biocompatibilidad de estos materiales hace del campo de la biomedicina una de las áreas donde más aceptación están teniendo. El poli (VPGVG) ha sido el péptido más estudiado hasta la fecha, constituyendo una gran parte de cadenas polipeptídicas, y formando parte del polímero usado en este estudio. El poli (VPGVG) ha sido expuesto a la batería completa de pruebas recomendadas por la ASTM (American Society for Testing Materials) para materiales y dispositivos en contacto con tejidos, fluidos tisulares y sangre27. El grado de biocompatibilidad es excepcional y supera el que presentan biomateriales ya clásicos como la silicona o los poliuretanos. A pesar de la naturaleza polipeptídica de estos polímeros, no ha sido posible obtener anticuerpos monoclonales frente a la mayoría de ellos. Esto puede ser debido a que el sistema inmune ignora estos polímeros ya que no los puede distinguir de la elastina natural. Además, los productos secundarios derivados de la biodegradación de estos polímeros son aminoácidos naturales28. Por tanto, la biocompatibilidad de estos polímeros, unida a las propiedades de autoensamblaje y la posibilidad de producir polímeros a la carta gracias a la ingeniería genética, hacen de estos polímeros un producto muy atractivo para su utilización en biomedicina. Introducción 19 2.2.3.1. Matrices de adhesión celular y reconstrucción tisular. En ensayos con cultivos celulares se comprobó que las matrices de poli (VPGVG) presentan una adhesión celular prácticamente inexistente29, es posible la obtención de matrices que tengan un comportamiento totalmente opuesto gracias a la incorporación de grupos funcionales intercalados que promuevan una clara adhesión. El primer diseño de estos materiales para ingeniería de tejidos es el que incluye la secuencia de adhesión celular RGD (Asp-Gly-Asn). Experimentos con la matriz polimérica poli (n (VPGVG), (GRGDSP)) han demostrado una gran eficiencia de este material para promover la adhesión celular30. Desde este material inicial, estos polímeros han ido evolucionando con la incorporación de más funcionalidades que tienen como propósito la imitación de la matriz extracelular. Por ejemplo, la Figura 9 muestra la secuencia de un polímero tipo elastina que incluye varias funcionalidades como son la de adhesión celular con la secuencia REDV (Arg-Glu-Asp-Val) que es específica para células endoteliales (representada en verde en la figura), una secuencia para entrecruzamiento químico (en rojo), una base de pentapéptidos tipo elastina (azul) y un hexapéptido diana de proteasas (rosa) y que sirve para dirigir al reabsorción del polímero cuando éste ya no es necesario31. Figura 9: Representación esquemática de la secuencia y estructura del monómero REDV, los cuatro bloques funcionales han sido representados con diferentes formas y colores32. La idea de los materiales para ingeniería de tejidos ya no es solo la creación de un material biocompatible y con ciertas propiedades mecánicas que reemplace enteramente al tejido dañado del organismo, sino la de un material que interactúe con el organismo, por ejemplo promoviendo la proliferación celular. Además sería deseable que el material se encuentre en el organismo solo durante un cierto tiempo, a modo de andamiaje, para ir siendo reemplazado paulatinamente por tejido natural que crece centro del andamiaje a la vez que el material sintético se reabsorbe y se elimina31 y 33. Introducción 20 2.3. REGENERACIÓN NEURONAL PERIFÉRICO. Las lesiones nerviosas son parte de una patología clínica muy frecuente, generalmente secundarias a traumatismos en accidentes de tráfico o deportivos y poseen un rango de lesión muy variable, desde lesiones microscópicas a nivel metabólico en la neurita, hasta alteraciones macroscópicas con disrupción completa de la anatomía nerviosa, lo que provoca secuelas muy variables desde lesiones en el nervio óptico hasta lesiones en la médula, alcanzando en algunos casos tasas de discapacidad muy elevadas34. La regeneración nerviosa es un proceso coordinado y complejo en el que participa tanto la neurona, las células acompañantes de Schwann (Figura 10) y todas las demás células y matriz extracelular que forman el tejido nervioso lesionado. Existen dos características básicas para obtener un resultado óptimo de regeneración nerviosa que son, una alineación correcta de las fibras nerviosas; y una tensión mínima en el punto de coaptación, es decir una tensión mínima en la zona donde se ha producido la lesión34. Figura 10: Estructura de la neuronaWordPress. En las últimas décadas, multitud de estudios se han puesto en marcha buscando mejorar la tasa de regeneración nerviosa, aunque resulta necesario continuar con la búsqueda Introducción 21 de nuevas alternativas con un mayor éxito regenerativo ya que hasta ahora los resultados siguen siendo todavía discretos. Una de las posibles estrategias para la regeneración nerviosa en la que se orienta este trabajo es el uso de exoenzimas que permitan el crecimiento de la neurona a través del uso de señales extracelulares con su aplicación en ciertas condiciones, aquí entra la Clostridium botulinum. Clostridium botulinum produce el prototipo de C3 transferasas que ribosilan ADP (C3bot), se dirigen a proteínas de la familia Rho de GTPasas: RhoA, B y C inactivandolas. Por lo tanto, las C3 transferasas representan una herramienta común para estudiar funciones celulares dependientes de Rho. En la investigación neurocientífica previa, se ha demostrado que la C3bot transferasa podía promover el crecimiento axonal en un cultivo neuronal primario, en modelos de lesión del nervio óptico y lesión de la médula espinal experimental. Durante el crecimiento de la neurita, se producen conos de crecimiento detectan señales extracelulares que les sirven de guía. Con la experimentación, se han acumulado pruebas de que C3bot no sólo actúa como una enzima, además es capaz de promover el crecimiento de la neurita en un modo de acción no enzimático, es decir opera como una de estas señales extracelulares sirviendo de guía de crecimiento de la neurita. En la aplicación de C3bot deficiente de enzima, cuyo aminoácido catalítico (glutamato) había sido eliminado, se obtuvo el efecto de facilitar el crecimiento de neuronas del hipocampo. El estudio posterior determinó la longitud mínima del fragmento de aminoácidos (29 aminoácidos) que todavía es capaz de inducir la ramificación en un cultivo primario neuronal y en el crecimiento axonal y dendrítico. Además, se observaron efectos beneficiosos sobre la regeneración axonal y la recuperación funcional de la lesión de la médula espinal en ratones cuando este péptido deficiente en enzima se aplicó en el sitio de la lesión. Todo esto demuestra que la C3bot transferasa tiene un enorme potencial en la aplicación biológica in vivo35 y 36. Materiales y Métodos 22 3. OBJETIVOS. Este trabajo se centra en el diseño y la síntesis de nuevos materiales proteicos de tipo elastina (ELR) diseñado para generar un sistema con aplicación terapéutica que permitan su utilización terapéutica en lesiones agudas y crónicas de médula espinal por la combinación de un efecto estructural, anti-inflamatorio y regenerador. Las herramientas de la biología molecular nos permiten combinar bloques génicos para poder producir los polímeros proteicos recombinantes. Para poder producir una matriz sintética en forma de hidrogel, se propone la combinación de diferentes secuencias estructurales (elastina con proteína de seda) y bioactivas (secuencia RGD de la fibronectina, péptido biomimético pm26TGF-β1 y C3bot). La síntesis y producción de estos biomateriales proteicos se lleva a cabo de manera biotecnológica en la bacteria Escherichia coli. El péptido C3bot estará ligado al ELR mediante una secuencia sensible a metaloproteasas (CM2) para que sólo sea activo tras su liberación, una vez llegue el cono de crecimiento axonal. El C3bot por su especificidad neuronal sería más interesante para fases subagudas o crónicas dirigidas a promover la regeneración axonal. La posible sustitución del péptido C3bot por otros péptidos con actividad antiinflamatoria o neuroprotectora permitirían el desarrollo de hidrogeles más orientados a la fase aguda post-lesión. Se propone el diseño de tres polímeros específicos a sintetizar la construcción de sus genes sintéticos: a. ELR 1: pm26TGF-β1, péptido biomimético de TGF β, en el extremo amino separado por la secuencia de reconocimiento de las metaloproteasas (CM2) del esqueleto del polímero. Se obtendría la liberación controlada de pm26TGF-β1, con el objetivo de promover una cicatrización temprana no inhibitoria, se evitaría la eventual inducción de fibrosis excesiva en el sitio de la lesión. b. ELR 2: fragmentos C3bot situados a ambos extremos de la cadena proteica, para poder incrementar la cantidad de péptido bioactivo que se libera. c. ELR 3: fragmento C3bot en el extremo amino. Esta versión no será sensible a metaloproteasas, es posible que su actividad biológica disminuya en esta versión fundida pero se considera que se mantendrá disponible durante las diferentes etapas de la regeneración. Para finalizar se realizarán pruebas de caracterización químico-físicas de un polímero ya producido: Pentasilk-CM2-C3bot (PCC). Materiales y Métodos 23 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 MATERIALES. 4.1.1 Reactivos químicos. Todos los reactivos empleados en la realización de este trabajo son: - Agarosa Seakem. (Cambrex) - Agarosa MetaPhor. (Cambrex) - Ampicilina. (Apollo Scientific) - Butanol: uso bioquímico. (Merck) - Dimetilsulfóxido (DMSO). - Etanol: uso bioquímico. (Merck) - Glucosa. (Sigma Aldrich) - Ácido clorhídrico. (Merck) - Isopropanol: uso bioquímico. (Merck) - Kanamicina. (Apollo Scientific) - Metanol: uso bioquímico. (Merck) - DNA Marker: 1 kb plus DNA Ladder. (Invitrogen) - EDTA. (Sigma Aldrich) - Simply Safe. (EURX) - Sulfato amónico. (Merck) - Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS). (Sigma Aldrich) - PMSF. (Sigma Aldrich) · Soluciones químicas preparadas. - DNA Loading Buffer 5x: 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 60 mM EDTA, 0.03% bromphenol blue, 60% glycerol. - TAE 1x: Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM pH 8. - PBS (pH 7,4): Tampón fosfato 5mM, NaCl 140mM. - Tampón de sonicación (10mM Tris-base pH 8, 1mM EDTA, 1mM PMSF). Materiales y Métodos 24 El material de laboratorio se usa estéril o se esteriliza en autoclave a 121º durante 2 horas y a 1 atmósfera de presión. Las disoluciones se preparan usando agua desionizada tipo ultrapura. 4.1.2 Materiales biológicos. 4.1.2.1 Cepas bacterianas. Se usa la bacteria Escherichia coli (E. coli) como clonadora y productora del plásmido recombinante. Las cepas usadas en este trabajo son: - XL1-Blue COMPETENT GRADE (Stratagene, Eficiencia (cfu/μg de pUC18 DNA) ≥ 108). - XL1-Blue SUBCLONING GRADE (Stratagene, Eficiencia (cfu/μg de pUC18 DNA) ≥ 106). 4.1.2.2 Medios de Cultivo. Los medios usados en el crecimiento y transformaciones de las cepas bacterianas son: -Luria-Bertani (LB): 25 g/L (10 g de NaCl, 10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura, Pronadisa). Se esteriliza en autoclave (120°C, 20 minutos). Suplementado con los antibióticos correspondientes o glucosa a la concentración de uso. -LB-agar (placas de cultivo): medio LB (25 g/L) con bacto-agar 1,5% (p/V) (Fluka). Se esteriliza en autoclave (120°C, 2 horas). Suplementado con los antibióticos correspondientes y glucosa a la concentración de uso en los casos necesarios. -SOC Broth (Super Optimal Catobolite repression) (Sigma Aldrich): usado para transformaciones bacterianas. -Terrific Broth (TB): 47 g/L (glicerol 4 mL/L). Se esteriliza en autoclave (120ºC, 20 minutos). Suplementado con los antibióticos correspondientes. Medio usado para la expresión y producción del polímero una vez aislado el DNA. Materiales y Métodos 25 4.1.3 Proteínas. Códigos de representación de las bases nitrogenadas: A= adenina, C= citosina, G= guanina y T= timina. 4.1.3.1 Enzimas de Restricción: Las enzimas de restricción empleadas en el trabajo son: - FastDigest DpnI, EamI 104I (EarlI), FastDigest EcoRI, LgulI (SapI), FastDigest XbaI. (Thermo Fisher). Todas las enzimas se han utilizado según el protocolo del fabricante y con el tampón adecuado. Entre estos tipos de enzimas se deben diferenciar en dos tipos: - Enzimas usadas para diagnóstico del gen por electroforesis. - FastDigest DpnI: enzima de restricción que reconoce los sitios de corte. Sitio de reconocimiento Resultado del corte 5'GATC 3’CTAG 5'---GA TC---3' 3'---CT AG---5’ Usada para diagnosticar la transformación con el vector de expresión pET7. - FastDigest EcoRI: enzima de restricción que reconoce: Sitio de reconocimiento Resultado del corte 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5’ Usada para diagnosticar la transformación con el vector de expresión pDA. Materiales y Métodos 32 pocillos del gel, los geles se someten a un voltaje fijo comprendido entre 2 y 7 V/cm que distan los electrodos. La electroforesis se desarrolla atendiendo a lo que hayan recorrido los colorantes de referencia. Para finalizar, el gel se tiñe entre 10 y 20 minutos en una solución de Simply SafeTM en TAE 1x, y las bandas de DNA se visualizan en un transiluminador de luz UV Gel DocTM EZ Imager. Como patrón de tamaño se emplea el marcador DNA 1kb Plus Ladder. - Electroforesis de DNA en gel de agarosa Metaphor. Este tipo de agarosa de alta resolución es utilizada para separar y resolver fragmentos de DNA de tamaño menor, entre 20 y 1000 pares de bases, tal como se indica en la Tabla 2. Se ha usado MetaPhor® Agarose para separar y recuperar fragmentos que difieren en tamaños tan solo del 2%. Puede ser usada tanto para la preparación de geles analíticos como preparativos. Tamaño de fragmentos en pares de bases (pb) % Final de agarosa 150-800 2 100-600 3 50-250 4 20-130 5 Tabla 3: Porcentaje (%) de Agarosa Metaphor óptimo para separar fragmentos de DNA con diferentes longitudes (pb de DNA). Los geles se preparan de la misma manera que las agarosas convencionales, pero teniendo precaución de extender los tiempos de hidratación y de controlar la ebullición en el momento de fundir la agarosa para que no forme mucha espuma. Las condiciones de la electroforesis así como a la tinción y a la visualización son sustancialmente los mismos que para las agarosas convencionales. Materiales y Métodos 33 - Evaluación de los fragmentos de DNA. La evaluación del tamaño aproximado de los fragmentos de DNA se realiza comparándolos con el patrón comercial de DNA, 1kb Plus DNA Ladder, cuyas bandas corresponden a longitudes de DNA (pb) definidas. 4.2.2 Determinación de la concentración de DNA. El DNA es cuantificado y evaluada su pureza mediante un Nanodrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific). La pureza se evalúa a través del rango de absorbancias A260/280, siendo cuanto más cercano a 2 más puro el plásmido. Si el DNA no es empleado de forma inmediata, se almacena a 4ºC o 20ºC. 4.2.3 Purificación de plásmidos. En este trabajo se han realizado 2 tipos purificaciones de un plásmido: - Purificación de un vector producido en bacterias: esta purificación se ha realizado a través de la utilización de dos kits mencionados previamente (4.1.6) y siguiendo el protocolo establecido por las casas comerciales. El Kit NucleoSpin Plasmid, para purificar cantidades pequeñas de DNA, y el Kit Quantum Prep Plasmid Midiprep, para cantidades más grandes. Los dos Kits requieren los mismos pasos, representados den la Figura 14 y se explican a continuación: El primer paso es añadir al cultivo bacteriano el reactivo A1 que contiene RNAsa, enzima que cataliza la hidrólisis del RNA ya que no es de interés y puede interferir en la purificación del DNA, este reactivo se almacena a 4ºC para que la RNAsa no se degrade. El siguiente reactivo que se añade es el A2 que contiene SDS (dodecilsulfato sódico) en condiciones alcalinas para separar el DNA genómico del DNA plasmídico, que es el de interés, se continua con el reactivo A3 que contiene ácido acético y se utiliza para neutralizar la reacción. Después de este paso se introduce la solución con ambos tipos de DNA en una microcolumna de extracción donde el DNA queda adsorbido y seguidamente se realizan una serie de lavados con el buffer de lavado para eliminar todo aquello que no se ha ligado a la columna, antes de proceder a la elución del DNA plasmídico purificado. Materiales y Métodos 34 Figura 14: Esquema del proceso de purificación de DNA plasmídico Bioké-webshop. - Purificación de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa: Se realiza con una electroforesis preparativa. El DNA de interés, se separa de otras moléculas de DNA de una mezcla, a través de una electroforesis en un gel de agarosa de concentración apropiada y se visualiza con Simply SafeTM (punto 4.2.1). Posteriormente a la electroforesis, se realiza una incisión con un bisturí alrededor de la banda de DNA de interés, procurando extraer la mínima cantidad posible de agarosa y se procede a su purificación. La purificación del fragmento de DNA se ha llevado a cabo mediante el sistema antes mencionado (punto 4.1.6) PureLink Quick Gel Extraction Kit INVITROGEN (Life Technologies). En primer lugar se añade el reactivo L3 que permite disolver el gel, por cada volumen de gel cortado se le añade 3 del reactivo y se incuba a 50ºC con agitación para facilitar la disolución de la agarosa, luego se añade 1 volumen de isopropanol y se transfiere a una columna de extracción, se realizan varios lavados con buffer de lavado que contiene etanol, el uso de estos dos alcoholes se debe a que precipitan el DNA, se utiliza isopropanol debido a que se tiene un gran volumen de muestra, después se realiza con etanol ya que tras todo el proceso de purificación el volumen ha disminuido. La concentración de DNA eluído es cuantificada y evaluada su pureza (punto 4.2.2). Materiales y Métodos 35 4.2.4 Digestión de DNA con enzimas de restricción. Las reacciones de restricción se realizan bajo las condiciones indicadas por las casas comerciales que suministran las enzimas (temperatura, concentración, buffer, tiempo de reacción, condiciones en las dobles digestiones, etc.). Se realizan dos tipos de digestiones con enzimas de restricción: la digestión de diagnóstico y la preparativa. La digestión de diagnóstico se usa para comprobar el éxito de una clonación o sus etapas previas, en cambio la preparativa se utiliza para “digerir” una cadena de DNA por el sitio de interés para luego realizar una clonación. De forma general, las digestiones de diagnóstico que hemos realizado para las que se emplean los enzimas FastDigest EcoRI, DpnI y XbaI, se llevan a cabo en un volumen total de reacción de 5 µL, se añade 300 ng de DNA (1 µL de media) con 0,5 µL del buffer 10x de la enzima correspondiente (Green Buffer Fast Digest), 1 unidad de la enzima y 3,35 µL de agua ultrapura para llegar a un volumen total de 5 µL, la digestión se incuba durante 20-30 minutos a 37ºC. Para digestiones preparativas (con EarI y SapI) se emplea 1 µg de DNA con la cantidad de enzima y buffer (Tango Buffer) indicada por la casa comercial (1 volumen de Buffer por cada 10 de reacción) en 20 µL totales, esta digestión se realiza a 37ºC durante 1621 horas. El alcance de la digestión se comprueba mediante electroforesis de DNA en un gel analítico (punto 4.2.1). 4.2.5 Tratamiento de DNA con enzimas de defosforilación. La reacción de defosforilación se requiere para eliminar, mediante una hidrólisis, los grupos fosfato de las extremidades cohesivas de DNA linearizado con SapI para su posterior utilización en una reacción de ligación de DNA. Se realiza bajo las condiciones indicadas por las casas comerciales que suministran las enzimas (temperatura, concentración, buffer, tiempo de reacción, inactivación, etc.). La defosforilación completa de los plásmidos se ha obtenido utilizando consecutivamente 2 enzimas fosfatasas distintas (FastAP y SAP), la primera se incuba a 37ºC durante 15 minutos y se inactiva 5 minutos a 75ºC, para la segunda se aumentan los tiempos de incubación hasta 60 minutos a 37ºC e inactivando 15 minutos a 80ºC. El control de la defosforilación de las extremidades cohesivas se realizó mediante la transformación del plásmido según el protocolo habitual (punto 4.2.7), después de una reacción de ligación sin inserto. Materiales y Métodos 36 4.2.6 Reacciones de ligación. Las reacciones de ligación realizadas, en los procesos de clonación, a lo largo de este trabajo se han llevado a cabo en un volumen total variable, que va desde las 10 µL a los 20 µL. La cantidad de vector usada es de 20-100 ng, se añade el inserto en una proporción molar desde 1:1 hasta 5:1 con el vector y el enzima T4 DNA ligasa (5 U/µL). La reacción se realiza a 22ºC desde los 15 minutos, o hasta 16-21 horas a 4ºC. Posteriormente se lleva a cabo la transformación bacteriana. 4.2.7 Transformación de cepas bacterianas. Se emplean alícuotas de bacterias competentes almacenadas a -80ºC. Se descongelan en hielo, en el momento de su uso, siendo esta etapa crítica para la viabilidad. La transformación en estas cepas bacterianas se realiza siguiendo el protocolo especificado por el suministrador. En este estudio se ha trabajado con una cepa de E. coli de dos tipos diferentes de competencia y cada una tiene su tratamiento: - Transformación con XL1-BLUE Competent Grade: Usadas para clonaciones ya que tienen una eficiencia transformación de 108 transformantes (unidad de colonias formantes por microgramo de DNA de plásmido añadido). Una vez descongeladas en hielo, se añade 50 µL de las células y 5 µL de la estrategia de ligación en un tubo de polipropileno de 15 mL especial para transformaciones (Falcon 2550). Esta mezcla se deja durante 30 minutos en hielo. Posteriormente, se realiza un choque térmico de 42 segundos a 42ºC, para permeabilizar la membrana celular de la bacteria, y que se introduzca el DNA plasmídico en la célula. Después del choque se atempera unos minutos en hielo y se añaden 450 µL de un medio enriquecido (SOC Broth), y se introduce a la incubadora durante 60 minutos a 37ºC con agitación a 250 rpm (revoluciones por minuto) para que el cultivo pueda recuperarse sin tener tiempo suficiente para dividirse. Finalmente se siembran 50-200 µL de la transformación en placas de LBagar/antibióticos con una concentración adecuada del antibiótico, Ampicilina si se ha realizado con el vector pET 7, o bien Ampicilina y Kanamicina en el caso de haber utilizado Materiales y Métodos 37 el vector pDrive ALL en una proporción 1:1000 volúmenes, 20 µL de antibiótico por cada 20 mL de medio. Las bacterias adquieren resistencia a dichos antibióticos por la inserción del plásmido. Las placas se incuban a 37ºC hasta la aparición de colonias aisladas (16-21 horas). En el caso de no ser usadas en el momento se almacenan a 4ºC. Se almacenan boca abajo para evitar la pérdida de las colonias bacterianas en el caso de que se produzcan condensaciones en las placas. Figura 15: Placas de LB-Agar-Ampicilina con colonias aisladas de E. coli. -Transformación con XL1-BLUE Subcloning Grade: Este tipo de cepa se usa para realizar subclonaciones, es decir cuando se quiere amplificar o expresar en otra cepa un plásmido entero ya secuenciado. Presenta una eficiencia de 106 transformantes por microgramo de DNA. Para su transformación se sigue el mismo procedimiento que para la cepa descrita anteriormente, variando únicamente la relación entre los volúmenes de plásmido (estrategia de ligación secuenciada) y células y los tiempos de incubación. Se usan 10 µL de células y 0,5 µL de plásmido en el mismo tipo de tubo de propileno. La mezcla se incuba 20 minutos en hielo y a continuación se realiza el shock térmico a 42ºC durante 30 segundos, y se vuelve a atemperar en hielo. Se añaden 180 µL del medio de cultivo SOC Broth y se deja incubar 30 minutos a 37ºC y con una agitación de 250 rpm. Se siembran 20 µL de la transformación en placas de LB-agar como se describe en el apartado anterior. Materiales y Métodos 38 Una vez crecidas las colonias en las placas se deben escoger las colonias que se encuentren lo más aisladas posibles sin que presenten satélites (pequeñas colonias bacterianas que se encuentran alrededor de la bacteria transformante y que pueden poseer una información genética diferente a la de interés) alrededor (Figura 15). Estas colonias se inoculan en medio líquido para su crecimiento, la operación se realiza en campana de flujo laminar, inoculando una colonia en un tubo Falcon de 50 mL que contiene 5-10 mL medio LB o TB (dependiendo del tipo de estudio que se quiere realizar) con los antibióticos correspondientes. Los tubos se incuban a 37ºC con agitación de 250 rpm durante 16-21 horas. Una vez que se verifica el crecimiento bacteriano se realiza la purificación del DNA (punto 4.2.3). En el caso de ser una producción a mayor escala, en vez de usarse de recipiente un Falcon de 50 mL se usa un matraz Erlenmeyer (autoclavado) de 250 mL y se usa 50 mL de medio de cultivo. 4.2.8 Bioproducción de polímeros recombinantes. El primer paso en la producción de un polímero recombinante tipo elastina (ELR) consiste en la transformación bacteriana del plásmido de interés con un vector de expresión con una cepa BLR de E. coli, las bacterias BLR son las más utilizadas en expresión de proteínas de tipo elastina. Las bacterias BLR transformadas se siembran en una placa de LBagar con los antibióticos necesarios y glucosa (1%). Se incuban durante 12-16 horas a 37ºC para permitir el crecimiento de colonias. Seguidamente se inoculan de forma separada, en un Falcon 50mL, 8 colonias aisladas aleatorias y en medio líquido TB y se incuban durante 1216 horas a 37ºC y con agitación orbital a 250 rpm (Figura16). Se analiza el contenido proteico total de cada uno de los cultivos de las 8 colonias, en un gel de acrilamida, con el fin de seleccionar la colonia que presenta mayor producción de proteína recombinante. Materiales y Métodos 39 Figura 16: Incubadora con agitación orbital. Una vez escogida la colonia, se prepara un inóculo, para lo cual se siembra pinchando la colonia en 5 mL de medio (LB con glucosa y con los antibióticos adecuados) y se incuba durante 12-16 horas a 37ºC con agitación (250 rpm). Seguidamente se recogen 100 µL del inóculo, se siembran en 30 mL de medio incubando durante 5 horas en las mismas condiciones. Así se obtiene el segundo inóculo. Posteriormente se introducen 15 mL de este inóculo a dos Erlenmeyer de 2 litros que contienen 500 mL de medio cada uno, se incuban a 37ºC y 250 rpm durante 2-3 horas. Este tercer inóculo se añade a un fermentador de 15 litros. De esos 15 litros, 14 Litros son de medio TB y el litro restante el inóculo. Se conecta el fermentador siguiendo un protocolo definido. El fermentador realiza una producción bacteriana semejante a la realizada en un Erlenmeyer, pero se lleva acabo con un control más exhaustivo, no solo controlamos la temperatura y la potencia de la agitación, también el pH (pH óptimo 7,1), el flujo de aire que entra al fermentador (20 L/minuto) y por ende la concentración de oxígeno. El fermentador se deja trabajando durante 16 horas. Pasadas las 16 horas se comprueba si el cultivo ha alcanzado una fase estática de crecimiento (se ha superado la fase exponencial de crecimiento). Esa comprobación se realiza midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm a través un espectrofotómetro. Se recoge una muestra del fermentado y se realiza una dilución 1-20 en medio TB, se mide primero un blanco (medio TB) para ajustar el espectrofotómetro a cero, y luego la muestra, y el valor de la absorbancia se multiplica por 20, que es la dilución de la muestra. Esta medida Materiales y Métodos 40 de la absorbancia se vuelve a realizar 30 minutos después, y si se mantiene constante o disminuye se puede dar por finalizada la fermentación. 4.2.9 Purificación de polímeros recombinantes. Una vez llevada a cabo la producción de polímeros recombinantes comienza el proceso de purificación del polímero. Cada polímero ELR tiene un proceso de purificado parecido aunque sí adaptado a sus propiedades, la propiedad que se usa siempre es la transición inversa con la temperatura de cada polímero. Aquí se describe el proceso de purificado tipo de un (EIS)2RGD6 (Pentasilk), que consiste en los pasos descritos a continuación. Primeramente, se lava 3 veces la biomasa fermentada con tampón de lavado (20 mM Tris-base pH 8, 140 mM NaCl) y se recolecta mediante centrifugación en una centrífuga Sorvall RC12BP a 4200 rpm de 25 minutos. Las bacterias se lisan suspendiéndolas en el tampón de sonicación (10mM Tris-base pH 8, 1mM EDTA, 1mM PMSF) y haciéndolas atravesar por un disruptor (TS 0.75KW Constant Systems Limited) tres veces a 1200 bares de presión. El objetivo de esta lisis por presión es romper la pared celular de las bacterias, de forma que liberen todo su contenido. Posteriormente, se centrifuga la mezcla a 4ºC a 14000 rpm durante 30 minutos. El sedimento contiene la fracción insoluble total y el sobrenadante constituye la fracción soluble total con las proteínas de interés. El sobrenadante se acidifica en frío con HCl hasta alcanzar el pH 3,5, se deja en agitación 2 horas a 4ºC. Esta etapa conlleva la desnaturalización de la mayoría de las proteínas bacterianas, mientras que los ELR siguen solubles. Después de las 2 horas se centrifuga a 4ºC a 13000 rpm durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante, y se le añade un 12,5% de Sulfato Amónico. Se incuba en hielo 30 minutos y se vuelve a centrifugar a 4ºC a 13000 rpm durante 30 minutos. Se descarta el sobrenadante y el precipitado, que contiene el polímero de interés, se resuspende con 200 mL de agua ultrapura y se deja con agitación a 4ºC 12-16 horas, se vuelve a centrifugar a 4ºC a 13000 rpm durante 30 minutos. Finalmente, el precipitado frío se descarta y al sobrenadante se le vuelve a hacer el proceso de añadir Sulfato Amónico, y el precipitado se resuspende en 50 mL de agua ultrapura y se realiza una diálisis para ajustar el pH a neutro, se filtra a vacío y se deja Materiales y Métodos 41 liofilizando una semana para que elimine todas las moléculas de agua obteniéndose el polímero puro. 4.2.10 Caracterización física de polímeros recombinantes. Para la caracterización física de uno de los polímeros diseñados en este trabajo se han empleado las siguientes técnicas: 4.2.10.1 Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). La calorimetría de barrido diferencial (DSC) es una técnica termoanalítica en la que la diferencia de calor entre una muestra y una referencia es medida como una función de la temperatura. En nuestro caso buscamos saber a qué Temperatura se produce el cambio de fase de nuestro polímero, es decir cuál es la Temperatura de transición (Tt). El equipo usado es un calorímetro Mettler Toledo 822e equipado con un sistema de refrigeración con nitrógeno líquido. La celda, tal como se muestra en la Figura 17, tiene espacio para dos crisoles, uno para la muestra que se analiza y otro para el crisol de referencia (disolvente en el que se ha disuelto el polímero). Figura 17: Celda del calorímetro Mettler Toledo 822e donde se coloca la muestra y la referencia. Primero se prepara una disolución con el polímero purificado, a una concentración de 50 mg/mL en PBS 1x (punto 4.1.1). Se deja disolver toda la noche en la cámara fría a 4ºC. El polímero rompe el tampón de PBS teniendo un pH 5,38. El experimento consiste en un barrido de temperatura, donde la muestra y la referencia son calentadas desde 0ºC hasta 55ºC Resultados y discusión. 48 Para obtener el polímero se plantea la siguiente estrategia de clonación: Se comienza digiriendo el pDA Pentasilk con Sapl (vector) y el pDA C3bot con Earl (inserto) y se realiza la ligación. Se lleva a cabo la transformación bacteriana y se extrae el plásmido pDA C3botPentasilk (C3botP). Figura 21: Esquema para la construcción del pDA C3botP. 5.2 SÍNTESIS DE PLÁSMIDOS. Como se ha descrito en la introducción (punto 2.2) los ELRs se obtienen por ingeniería genética, es decir tras el diseño de la molécula proteica se construye el gen sintético que la codifica mediante diferentes técnicas, se bioproduce, purifica y caracteriza para obtener productos con las propiedades físicas y mecánicas que nos interesan. 5.2.1 Síntesis del plásmido que codifica al polímero 1. La síntesis del plásmido pDA CM2-Pentasilk, que presenta 8270 pares de bases correspondiendo al polímero 1 con un peso molecular de 124455 MW, se realiza por la estrategia propuesta en el punto 5.1.1. No se tuvieron que realizar digestiones preparativas (punto 4.2.4) ya que se poseían los vectores y los insertos necesarios. La clonación se realiza según las condiciones propuestas en la Tabla 4. El tiempo de incubación de la clonación es 15 minutos a 22ºC. Resultados y discusión. 49 Reacción 1: pDA CM2-Pentasilk Plásmido (pDA Pentasilk) 10,8ng/ µL 3 µL = 32.4 ng Inserto (CM2) 7,4 ng/ µL 1 µL =7,4 ng Agua ultrapura 4,5 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 11 µL Tabla 4: Reacción 1: pDA CM2-Pentasilk. Transcurrido este tiempo, se realiza la transformación bacteriana con la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE (punto 4.2.7). Tras la incubación de 16 horas a 37ºC se observa el crecimiento de colonias aisladas, y se seleccionan aleatoriamente algunas de ellas para analizar el resultado del clonaje. Se realiza la extracción y purificación de DNA plasmídico (punto 4.2.3). El DNA plasmídico se somete a una digestión de diagnóstico para poder evaluar el tamaño del inserto clonado. Se realiza una digestión del DNA purificado con la enzima EcoRI, esta enzima escinde la cadena de DNA separando el vector pDrive All del fragmento de interés (inserto), añadiendo 100 pares de bases al inserto correspondientes al pDrive All, y se realiza una electroforesis analítica para comprobar el resultado de la transformación. Se puede observar en la Figura 22 el resultado positivo de la ligación, en la calle 4 se presenta el pDA Pentasilk digerido con EcoRI, que se usa como referencia para corroborar si el inserto CM2 se ha ligado correctamente. Se puede observar una banda a 4000 pb que corresponde al pDA. La banda correspondiente al plásmido CM2-Pentasilk (4263 pb), en las calles 1, 2 y 3 ha migrado a un número de pares de bases más altas que la de la calle 4, por lo que la ligación ha resultado potencialmente positiva. La banda a 8000 pb se corresponde a una ligación parcial del plásmido al ser digerido con EcoRI. Resultados y discusión. 50 Figura 22: Electroforesis en gel de agarosa 0,5%. Reacción 1 pDA CM2-Pentasilk. Calle 1: DNA de Colonia 2 pDA CM2-Pentasilk digerido con EcoRI. Calle 2: DNA de Colonia 9 pDA CM2-Pentasilk digerido con EcoRI. Calle 3: DNA de Colonia 10 pDA CM2Pentasilk digerido con EcoRI. M: Marker 1kb plus DNA Ladder. Calle 4: pDA Pentasilk digerido con EcoRI. Se secuencia (punto 4.2.10.3) el DNA de clones potencialmente positivos y se corrobora la exactitud de la clonación (Figura 23 y 24). Figura 23: Cromatograma de parte de la secuenciación del pDA CM2-Pentasilk en el punto de unión pDA-CM2. 8000pb 1 2 3 M 4 5000pb 4000pb 3000pb 4500pb 4000pb Resultados y discusión. 51 Figura 24: Cromatograma de parte de la secuenciación del pDA CM2-Pentasilk en el punto de unión CM2-Pentasilk. Como se puede ver en las Figuras 23 y 24 las secuencias son correctas, debido a que en la Figura 23 se puede ver (zona recuadrada) la secuencia de terminación del pDA y acto seguido el comienzo del fragmento CM2 (VGGGGG), y en la Figura 24 se observa la terminación del CM2 (QGGGG) y el comienzo del Pentasilk (VPGVG). Una vez que esta corroborada el carácter positivo del pDA CM2-Pentasilk, se le introduce en un vector de expresión. El vector de expresión que empleamos en este caso ha sido pET7 TGF β (punto 5.1.1). Este vector de expresión contiene 5kbp. Las técnicas de digestión, purificación, defosforilación y la ligación para la clonación en los vectores pET7 es muy parecida a la de vector pDrive ALL (pDA) (punto 4.2.7). La única diferencia a destacar es que los sitios de reconocimiento de SapI de vector pET7 han sido posicionados de forma que serán eliminados tras la digestión con esta enzima. De esto modo en el polímero proteico que se producirá no se insertarán aminoácidos derivados de los sitios de clonaje. Para llevar a cabo el proceso de clonación con el vector pET7 TGF β, primero se produce la digestión con Sapl del vector pET7 (Plásmido), y con Earl la del plásmido CM2-P (Inserto). Una vez procesados, purificados y cuantificados se realiza la reacción de ligación para el pET7 TGF β CM2-Pentasilk siguiendo las condiciones mostradas en la Tabla 5. Resultados y discusión. 52 Reacción 1-1: pET7 TGF β CM2-Pentasilk Plásmido (pET7 TGF β) 30,5 ng/ µL 2 µL = 61 ng Inserto (CM2-Pentasilk) 5,9 ng/ µL 11 µL = 64,9 ng Agua ultrapura 0 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 15 µL Tabla 5: Reacción 1-1: pET7 TGF β CM2-Pentasilk. Se realiza la transformación bacteriana con la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE. Tras la incubación a 37ºC durante 16 horas se obtienen colonias aisladas. Se extrae y purifica el DNA de las colonias y por digestión analítica con Dpnl se realiza una electroforesis de diagnóstico que se muestra en la Figura 25. Figura 25: Electroforesis en gel de agarosa 0,5%. Reacción 1-1: pET7 TGF β CM2Pentasilk. Gel de agarosa 0,5%. Calle 1: pET7 RARE CCPCC no digerido. Calle 2: DNA de Colonia 4 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl. Calle 3: DNA de Colonia 5 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl Calle 4: DNA de Colonia 6 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl. M: Marker 1 kb plus DNA Ladder. Calle 5: pET7 TGF β CM2-P no digerida. Calle 6 y Calle 7: pET7 TGF β digerido por Dpnl. 1 2 3 4 M 5 6 7 4500pb 1000pb 5000pb 4000pb 3000pb Resultados y discusión. 53 En las Calles 2, 3 y 4 se observa el resultado de la digestión diagnostica. Se identifica la banda correspondiente al inserto CM2-Pentasilk de 4500 pb. Este gen no contiene ninguna secuencia reconocida por Dpnl. Por debajo de 1000 pb se observa el producto de la fragmentación del plásmido pET7 TGF β al digerirlo con Dpnl, que podemos compararlo con los resultados obtenido es las calles 6 y 7 en los cuales el inserto contenido no es identificable por tamaño (21 bp). La digestión con la enzima de restricción Dpnl determina en este caso, la fragmentación únicamente del vector. Los clones analizados poseen un plásmido que presenta un resultado potencialmente positivo, por lo que el DNA se envía a secuenciar, se analizan los cromatogramas y se observa que el inserto CM2-Pentasilk no se ha introducido de forma correcta, puede ser debido a que el plásmido pET7 TGF β linearizado con Sapl no se haya defosforilado correctamente, por lo que la unión del inserto CM2-Pentasilk no se ha producido satisfactoriamente. La reacción de defosforilación de los extremos 5’ generados en la digestión es una reacción crítica para determinar una correcta clonación. La defosforilación se realiza para evitar la recirculación del plásmido lineal en los vectores usados y aunque se suelen realizar dos reacciones consecutivas de defosforilación, con enzimas de distintas casas comerciales, el proceso sigue teniendo una baja eficiencia. Se repite por tanto la preparación del plásmido: la digestión del vector con Sapl, defosforilación, purificación y la ligación según la reacción 1-2 de la Tabla 6: Reacción 1-2: pET7 TGF β CM2-Pentasilk Plásmido (pET7 TGF β) 31,9 ng/ µL 2 µL = 63,8 ng Inserto (CM2-Pentasilk) 5,9 ng/ µL 11 µL = 64,9 ng Agua ultrapura 0 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 15 µL Tabla 6: Reacción 1-2: pET7 TGF β CM2-Pentasilk. Se realiza la transformación bacteriana en la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE. Tras la incubación se obtienen colonias aisladas. Se extrae y purifica el DNA de tres colonias, se realiza una digestión con la enzima Dpnl y una electroforesis de diagnóstico que se muestra en la Figura 26. Resultados y discusión. 54 Figura 26: Electroforesis en gel de agarosa 0,7%. Reacción 1-2: pET7 TGF β CM2Pentasilk. Calle 1: DNA de Colonia 1 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl. Calle 2: DNA de Colonia 2 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl. M: Marker 1 kb plus DNA Ladder. Calle 3: DNA de Colonia 3 de pET7 TGF β CM2-P digerido con Dpnl. En las Calles 1, 2, 3 se observa la banda correspondiente al inserto CM2-Pentasilk a 4500 pb. Por debajo de 1000 pb se observa la fragmentación del plásmido pET7 TGF β al digerirlo con Dpnl. Por lo que las colonias presentan un resultado potencialmente positivo, se envían a secuenciar las muestras ya que a simple vista sobre las electroforesis no podemos afirmar la positividad de la transformación. Como se puede observar comparando la Figura 25 y la Figura 26, ambas electroforesis presentan un resultado muy similar, que solo tras el estudio de los cromatogramas (Figura 27 y 28) podemos observar su resultado satisfactorio. Figura 27: Cromatograma de parte de la secuenciación pET7 TGF β CM2-P extremo T7 promotor en el punto de unión pET7-CM2. 1000pb 4500pb 5000pb 4000pb 3000pb 1 2 M 3 Resultados y discusión. 55 Figura 28: Cromatograma de parte de la secuenciación pET7 TGF β CM2-P en el punto de unión de CM2-Pentasilk. En la Figura 27 se puede ver la secuencia del pET7 TGF β y acto seguido el comienzo del fragmento CM2 (VGGGGG), y en la figura 28 se observa la terminación del CM2 (QGGGG) y el comienzo del Pentasilk (VPGVG). Por lo tanto el resultado es que el pET7 TGF β CM2-P presentan extremo p7 terminal y promotor bien codificado, es decir que la secuencia genética que presenta esta cadena de DNA es la que nos interesa, por lo que su resultado es positivo. 5.2.2 Síntesis del plásmido que codifica el polímero 2. La síntesis del gen pDA C3bot-CM2-Pentasilk-CM2-C3bot se realiza, en principio, como se describe en la estrategia 1 (Figura 19). Se escoge este esquema, en detrimento de la estrategia 2 ya que en este caso no es factible relacionar el vector pDA Pentasilk-CM2-C3bot con un tamaño de 8363 pares de bases, con el inserto C3bot-CM2, que presenta 252 pares de bases, para transformar y extraer el pDA CCPCC (Figura 20). Por el contrario la estrategia 1 relaciona un inserto de 4425 pares de bases con un vector de 4190 pares de bases, para obtener un polímero de 4677 pares de bases, con un peso molecular 134739, 8 MW. Para llevar a cabo la primera clonación del pDA C3bot-CM2-Pentasilk-CM2-C3bot (pDA CCPCC) se empezó en primer lugar con la preparación de DNA plasmídico de pDA CM2-C3bot, secuenciada como positiva, que se digiere con SapI (Figura 30) y la preparación del inserto del pDA C3bot-CM2-P que se digiere con Earl (Figura 29). En la Figura 29 se observa como la enzima Sapl se encarga de linearizar el plásmido que vamos a usar, aparte deja los extremos escalonados para que encajen con los generados mediante la digestión con Earl, esta digestión fragmenta el vector pDA (subunidades de 250 pb, 637 pb, 1262 pb y 1742 pb) y libera el inserto C3bot-CM2-P como se puede apreciar en la Figura 29. Resultados y discusión. 56 Figura 29: Electroforesis en gel de agarosa preparativo 0,75%. A) Calle 1: Digestión pDA C3bot-CM2-P con Earl. M: Marker 1kb plus DNA Ladder. Calle 2: Digestión pDA C3bot-CM2-P con Earl. B) Calle 3: Corte del inserto C3bot-CM2-P de la calle 1. Calle 4: Corte del inserto C3bot-CM2-P de la calle 2. Figura 30: Electroforesis en gel de agarosa 0,7%. M: Marker 1kb plus DNA Ladder. Calle 1: Digestión con Sapl de DNA de la colonia 6 correspondiente al vector pDA CM2C3bot. 5000pb 4000pb 3000pb M 1 A B 1 M 2 3 M 4 1742 pb 1262 pb 637 pb 250 pb Resultados y discusión. 57 Una vez preparado el DNA plasmídico y el inserto (punto 4.2.4), se lleva a cabo la clonación según las condiciones de la Tabla 7. Reacción 2 estrategia 1: pDA CCPCC Plásmido (pDA CM2-C3bot) 8,5 ng/ µL 3 µL= 25,5ng Inserto (C3bot-CM2-P) 17 ng/ µL 5 µL = 125 ng Agua ultrapura 0 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 10 µL Tabla 7: Reacción 2 estrategia 1: pDA CCPCC. El tiempo de incubación de la ligación es de 15 minutos a 22ºC. Trascurrido este tiempo, se realiza la transformación bacteriana con la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE (punto 4.2.7). El día siguiente observamos el crecimiento de colonias aisladas, y se eligen algunas de ellas para analizar el resultado del clonaje. Se realiza la extracción y purificación de DNA. Se realiza una digestión del DNA purificado con la enzima EcoRI. El resultado se muestra en Figura 31. Resultados y discusión. 64 Reacción 3: pDA C3bot-Pentasilk Plásmido (pDA Pentasilk) 10,8 ng/ µL 3 µL = 32,4 ng Inserto (C3bot) 5 ng/ µL 0,5 µL = 2,5 ng Agua ultrapura 5 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 11 µL Tabla 10: Reacción 3: pDA C3bot-Pentasilk. Se realiza la transformación bacteriana con la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE. Tras la incubación se obtienen colonias aisladas. Se extrae y purifica el DNA. Se realiza una electroforesis analítica para comprobar la ligación (Figura 36). Figura 36: Electroforesis en gel de agarosa 0,5%. Reacción 3: pDA C3bot-Pentasilk. M: Marker 1 kb plus DNA Ladder. Calle 1: pDA Pentasilk digerido con EcoRI. Calle 2: DNA de Colonia 4 pDA C3bot-Pentasilk digerido con EcoRI. Calle 3: DNA de Colonia 7 pDA C3bot-Pentasilk digerido con EcoRI. Calle 4: DNA de Colonia 11 pDA C3bot-Pentasilk digerido con EcoRI. La banda a 4000 pb representa al pDA. La banda a la altura de 4500 pb corresponde con el inserto, introducido en el vector pDA, C3bot-Pentasilk (4335 pb), ya que migra a mayor número de pares de bases que la de la calle 1 que es el Pentasilk sin el inserto (4173pb). ). El M 1 2 3 4 4500pb 4000pb 5000pb 4000pb 3000pb Resultados y discusión. 65 DNA se envía a secuenciar y los resultados de la secuenciación se muestran en las Figuras 37 y 38. Figura 37: Cromatograma de parte de la secuenciación de pDA C3bot-Pentasilk en el punto de unión pDA-C3bot. Figura 38: Cromatograma de parte de la secuenciación de pDA C3bot-Pentasilk en el punto de unión C3bot-Pentasilk. Los cromatogramas de las Figuras 37 y 38 presentan las secuencias en el punto de unión de los distintos bloques que forman el polímero, se puede observar que las secuencias son correctas por lo que las colonias transformadas presentan un resultado positivo. Una vez que está corroborado el carácter positivo del pDA C3bot-Pentasilk, se le introduce en un vector de expresión. En este caso se clonará el pET7 RARE con el inserto C3bot-Pentasilk (punto 4.1.4). Para llevar a cabo el proceso de clonación primero se produce la digestión con Sapl del vector pET7 RARE y con Earl del plásmido C3bot-Pentasilk. La estrategia de clonación para introducir el inserto en el pET7 RARE se realiza siguiendo las condiciones experimentales mostradas en la Tabla 11. Resultados y discusión. 66 Estrategia 3: pET7 RARE C3bot-Pentasilk Plásmido (pDA pET7 RARE) 4,3 ng/ µL 5 µL = 21,5 ng Inserto (C3bot-Pentasilk) 13,3 ng/ µL 8 ul=106.4 ng Agua ultrapura 0 µL T4 ligase (Thermo scientific) 1 µL Buffer T4 10x 1 µL Volumen total 15 µL Tabla 11: Reacción 3: pET7 RARE C3bot-Pentasilk. La reacción ligación se incuba a 22ºC durante 15 minutos. Se realiza la transformación bacteriana con la cepa de E. coli XL1-Blue COMPETENT GRADE, en este caso las placas de cultivo usadas contienen solo Ampicilina como antibiótico, al contrario que las usadas con el vector pDA que contenían Ampicilina y Kanamicina. Tras la incubación a 37ºC durante 16 horas se obtienen colonias aisladas. Se extrae y purifica el DNA, y por electroforesis analítica (Figura 39) se comprueba si las colonias son positivas. La digestión se realiza con la enzima Dpnl, esta “corta” el plásmido pET7 RARE en distintos fragmentos y lo separa del fragmento que se quiere introducir al plásmido. Figura 39: Electroforesis en gel de agarosa 0,6%. Reacción 3: pET7 RARE C3botPentasilk. M: Marker 1kb plus DNA Ladder. Calle 1: DNA de Colonia 1 pET7 RARE C3botP digerido con Dpnl. Calle 2: DNA de Colonia 3 pET7 RARE C3bot-P digerido con Dpnl. Calle 3: DNA de Colonia 5 pET7 RARE C3bot-P digerido con Dpnl. La Figura 39 muestra una banda sobre 4200 pb que correspondería al fragmento C3bot-Pentasilk. Las bandas por debajo de 700 pb corresponden a los fragmentos del vector M 1 2 3 4200pb 700pb 5000pb 4000pb 3000pb Resultados y discusión. 67 pET7 RARE. Se llega a la conclusión de que todas las colonias son potencialmente positivas. Se envía el DNA de las colonias a secuenciar. Los resultados de la secuenciación se muestran en las Figuras 40 y 41. Figura 40: Cromatograma de parte de la secuenciación de pET7 RARE C3botPentasilk en el extremo T7 promotor. A la izquierda: punto de unión pET7-C3bot; a la derecha: punto de unión C3bot-Pentasilk. Figura 41: Cromatograma de parte de la secuenciación de pET7 RARE C3botPentasilk en el extremo T7 terminal en el dominio RGD. El resultado es que las colonias del pET7 RARE C3bot-Pentasilk si son correctas. El pET7 RARE C3bot-Pentasilk presenta extremo T7 promotor bien codificado, siendo las uniones de los distintos fragmentos (Figura 40: pET7 (MESLLP)-C3bot (VAKGS) y C3bot (RHST)-Pentasilk (VPGVG)) las esperadas, y extremo T7 terminal (Figura 41) correcto con el dominio RGD, es decir que la secuencia genética que presenta esta cadena de DNA es la que nos interesa, por lo que su resultado es positivo. 5.3 BIOPRODUCCIÓN. En este apartado se describe la bioproducción del polímero denominado (EIS)2RGD6-CM2-C3bot (Pentasilk-CM2-C3bot), que es usado para una posterior caracterización. Resultados y discusión. 68 Para el proceso de bioproducción se utilizan dos cepas bacterianas de E. coli: la BL21 y la BLR. Estas dos cepas son las más usadas en la expresión de las proteínas de tipo ELRs. Estas cepas son deficientes de algunas proteasas y sistemas de recombinación de ADN, estabilizando por lo tanto los productos génicos y proteicos. Se introduce el plásmido pET7 RARE Pentasilk-CM2-C3bot en las dos cepas (punto 4.2.8) y las incubamos durante 16-21 horas con los antibióticos correspondientes en placas Petri. Una vez obtenidas las colonias aisladas se realiza un análisis de producción (punto 4.2.8), induciendo la expresión del polímero recombinante, en un volumen reducido de medio líquido TB. El análisis se concluye con una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). El resultado de la electroforesis se muestra en Figura 42. Figura 42: SDS-PAGE del extracto crudo total de las proteínas bacterianas de diferentes colonias. Expresión de proteínas del polímero Pentasilk-CM2-C3bot. A la izquierda: M: Marker proteico. Calle 1: Control negativo de cepa E. coli BL21. Calle 2, 3 y 4: Cepa BL21 con PCC. Al a derecha Calle 5 y 6: Cepa BLR con PCC. En la cepa donde se obtiene más expresión proteica es en la BLR (Figura 42 derecha), ya que por encima de 90 kDa se encuentra la banda correspondiente a nuestro polímero recombinante ELR. Esta banda es la más intensa en la cepa BLR. M 1 2 3 4 M 5 6 90 kDa 127 kDa Resultados y discusión. 69 Una vez que tenemos la cepa y la colonia que más expresión proteica presenta, se procede a la inoculación de las células según el punto 4.2.8, y una vez producida la fermentación se purifica obteniéndose un gel (punto 4.2.9), la proteína se liofiliza y se pesa para calcular cuál ha sido nuestra masa final de producto. En este caso, de los 15 litros (de medio e inóculo) usados en la fermentación, tras la purificación se obtienen 12,600 gramos del polímero Pentasilk-CM2-C3bot. 5.4 CARACTERIZACIÓN DE POLÍMEROS. En este apartado se van a mostrar y discutir los resultados de ciertas pruebas de caracterización de un polímero ya producido y purificado, el Pentasilk-CM2-C3bot (PCC) y los resultados de las pruebas de secuenciación de los polímeros que hemos sintetizado durante este trabajo. 5.4.1 Calorimetría diferencial de barrido (DSC). Figura 43: DSC del polímero Pentasilk-CM2-C3bot en PBS 1x y pH 5,83. En la Figura 43 correspondiente al DSC del polímero Pentasilk-CM2-C3bot se pueden ver 2 posibles transiciones, el punto 1 es un artefacto producido por el comienzo del aumento de la rampa temperatura, ya que el polímero se mantiene un tiempo a 0º para estabilizarse, y en el momento en el que empieza el aumento de la temperatura se produce esa variación de la recta. La variación que nos interesa es el punto 2, este corresponde a la temperatura de 2 1 Resultados y discusión. 70 transición de nuestro polímero, como hemos dicho en el punto 2.2.1, este tipo de polímeros tiene como característica la temperatura de transición inversa (Tt), es decir, que a temperatura baja se encuentran en estado líquido y en este caso a temperatura fisiológica en estado sólido. Por ello la temperatura de transición de nuestro polímero se identifica como el ápice del pico y corresponde a 17,41º C. 5.4.2 Resonancia magnética nuclear (RMN). Figura 44: RMN de protón del polímero Pentasilk-CM2-C3bot. Se realiza un RMN de protón del polímero Pentasilk-CM2-C3bot (Figura 44) para comprobar si el número de 1H que contiene la estructura según sus aminoácidos se corresponde a la señal que nos da el RMN. Resultados y discusión. 71 Este estudio se realiza a través de un contador de aminoácidos que nos da los grupos funcionales de cada aminoácido. Tabla 12: Contador de Aminoácidos. Se utiliza como referencia el primer pico (0,75 ppm), correspondiente a los metilos de la estructura que integra 3204. Con esta referencia se da un valor al resto de las integrales de la Figura 44. Los CH α aparecen a 4,25 ppm e integrando 891,8, si lo comparamos con los CH α que tenemos en el polímero Pentasilk-CM2-C3bot estos concuerdan ya que presenta 920 CH α. El intervalo de picos entre 3,5-4 ppm y 1-2,25ppm corresponde a los CH y CH2, ya que equivalen con la suma de los CH y CH2 calculados por el contador que presenta el polímero Pentasilk-CM2-C3bot. Por último el intervalo de 7,5-8,5 ppm que integra 1311, que en estructuras de pequeño tamaño correspondería a estructuras con carácter aromático, corresponde tanto a aromáticos como a aminas. En este tipo de estructuras que contienen ácidos carboxílicos, estos no suelen aparecer en el RMN. Con esta prueba se observa que la composición del polímero obtenido experimentalmente es bastante similar a la obtenida de forma teórica. Contador de Aminoácidos Nº Aminoácidos CH3 CH α CH CH2 Aromático NH OH Ácido PMolecular 1532 3204 920 508 3402 21 1317 50 28 127503,21 Resultados y discusión. 72 5.4.3 Espectroscopía de Masas. Figura 45: Espectro de masas del polímero Pentasilk-CM2-C3Bot. En la Figura 45 se muestra el Espectro de masas del polímero Pentasilk-CM2-C3Bot. Presenta un pico minoritario a 126030 umas, correspondiente al peso molecular de la primera ionización de nuestro polímero. Aparecen 3 picos correspondientes a la segunda, tercera y cuarta ionización del polímero, uno a 63363 umas, 46997 y 42358 umas, siendo la cuarta ionización la de mayor intensidad. Conclusión 73 6. CONCLUSIÓN. 1. Al fin de obtener nuevos biomateriales con capacidad neuro-regenerativa, se han diseñado polímero proteicos, recombinantes tipo elastina (ELR). Se ha realizado la construcción de los genes recombinantes a partir de genes independientes contenidos en diferentes vectores de clonación pDrive ALL, estos llevan fragmentos de genes que codifican por: i) estructuras moleculares que confieren propiedades mecánicas adecuadas (Pentasilk), ii) secuencia para modular su degradación (CM2) y iii) peptido con capacidad neuroregenerativa (C3bot). Para que el fragmento bioactivo C3bot pueda ser funcional in vivo, se ha interpuesto una secuencia que contiene motivos diana de metaloproteasas específicas del tejido neuronal en la fase aguda de reparación del daño. Los plásmidos obtenidos son pDA C3bot-Pentasilk y pDA CM2-Pentasilk. 2. La construcción del vector pDA C3bot-CM2-Pentasilk-CM2-C3bot no ha sido aislada pese a los intentos realizados y a las estrategias seguidas para su realización, esto es debido: a un mal aislamiento del gen primario para realizar la transformación o a un error de las posibles condiciones de trabajo. 3. Se ha llevado a cabo la introducción de los insertos de DNA C3bot-Pentasilk y CM2Pentasilk, que codifica las proteínas ELRs (recombinámero de tipo elastina), en el vector de expresión pET7 RARE y pET7 TGF β, respectivamente. Estos vectores permiten una mayor transcripción del gen en la célula anfitriona. Obteniendo como genes finales el pET7 RARE C3bot-Pentasilk y el pET7 TGF β CM2-Pentasilk, preparados para su producción, purificación y posterior caracterización. De esta manera se inserta un gen ELR junto a la secuencia TGF β obteniendo un ELR con capacidad antiinflamatoria, promoviendo una cicatrización temprana no inhibitoria. 4. Se han realizado pruebas de caracterización del polímero Pentasilk-CM2-C3bot, corroborando con ellas que el polímero obtenido en la bioproducción de forma experimental, presenta las características de interés que debe tener de forma teórica. Por lo que es un polímero apto para comenzar a observar in vitro su posible funcionalidad.