Respuesta humoral específica y eficacia serológica de la vacuna frente al virus de la Gripe A (H1N1)

1 FACULTAD DE MEDICINA PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA SALUD TESIS DOCTORAL RESPUESTA HUMORAL ESPECÍFICA Y EFICACIA SEROLÓGICA DE LA VACUNA FRENTE A VIRUS DE LA GRIPE A (H1N1) Presentada por: JOSE MANUEL MÉNDEZ LEGAZA para optar al grado de Doctor por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Raúl Ortiz de Lejarazu Leonardo e Iván Sanz Muñoz 2 3 D. Raúl Ortiz de Lejarazu Leonardo, Profesor Titular de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid, Jefe del Servicio de Microbiología e Inmunología del Hospital Clínico Universitario de Valladolid y Director del Centro Nacional de Gripe de Valladolid, y D. Iván Sanz Muñoz, Licenciado en Biología y Doctor en Medicina, Responsable del Centro Nacional de Gripe de Valladolid. Servicio de Microbiología e Inmunología del Hospital Clínico Universitario de Valladolid y área de Microbiología de la Facultad de Medicina. CERTIFICAN QUE: D. Jose Manuel Méndez Legaza ha realizado bajo su dirección el trabajo que presenta para optar al grado de Doctor con el título: “RESPUESTA HUMORAL ESPECÍFICA Y EFICACIA SEROLÓGICA DE LA VACUNA FRENTE A VIRUS DE LA GRIPE A (H1N1)” Examinado dicho trabajo, damos nuestra conformidad para su presentación y defensa como Tesis Doctoral. Y para que así conste y obre a efectos oportunos, firmamos la presente certificación en Valladolid, en Junio de 2019. Fdo. Raúl Ortiz de Lejarazu Leonardo Fdo. Iván Sanz Muñoz 4 5 Agradecimientos 6 7 En primer lugar, me gustaría empezar mencionando a mis directores, el Dr. Raúl Ortiz de Lejarazu Leonardo y el Dr. Iván Sanz Muñoz. Agradecerles profundamente el tesón, la paciencia, la ilusión y el ánimo que me han transmitido desde que iniciamos este proyecto de investigación. A parte de su sabiduría, tienen un don para saber enseñar y fomentar ese interés investigador y científico. Gracias a ambos por guiarme, inspirarme y mostrarme el camino correcto. Dentro del Servicio de Microbiología del Hospital Clínico, son tantas las personas a las me gustaría agradecerles que se hayan interesado porque me fuera bien en este proyecto que no puedo mencionar a todas. No obstante, me gustaría hacer una mención especial tal y como se merecen a mis compañeros Irene, Mario, Silvia y Begoña por estar ahí siempre que lo necesitaba. Siempre estaré en deuda con vosotros. No menos merecido mi agradecimiento a mi “segunda madre” Rosa en estos años difíciles, a Ana Montoya, y como no, gracias a Rocío por ese enorme aguante y grata convivencia que me has dedicado durante las largas tardes de experimentación en el laboratorio. No sabes cómo te lo agradezco. No puedo dejar sin mencionar a la Dra. Mari Fe Muñoz por su ayuda con la estadística. La vida es un camino lleno de obstáculos, pero si te rodeas de la mejor compañía puede ser una gran aventura. Estos últimos años no niego que hayan sido difíciles, pero se han llevado siempre con el mejor de los ánimos gracias a mis fieles compañer@s Cristina, Rebeca, Raquel, Pilar, Belén y Javito. Vosotr@s habéis sabido sacar lo mejor de mí y lo más importante, sé que habéis estado y estaréis siempre ahí. Muchas gracias a mis padres Pepe y Paqui, y a mi hermana Marta, que siempre me animaron a estudiar, que me dieron la libertad de elegir y me han apoyado en cada uno de mis objetivos. Muchas gracias a mi fiel compañero Guille, que has sabido llevado llevarme y me has aguantado tanto en los buenos y malos momentos. Muchas gracias a mis tías y abuelos, en especial a mi abuela Paquita por su apoyo desde el inicio en mi última y nueva etapa. Espero que os sintáis tan orgullosos de esto como yo porque ha sido un esfuerzo común el que ha hecho posible esta tesis. Sin vosotros no hubiese sido posible. He de reconocer que, a pesar de haber requerido mucho esfuerzo y tiempo, ha tenido gran contribución el haber estado rodeado de personas maravillosas, emprendedoras y con ganas de seguir hacia delante. Por todo ello, mi enorme agradecimiento a todos y todas los que en algún momento de esta trayectoria me habéis dado vuestro apoyo. Gracias a todos y todas por ayudarme a convertirme en quién soy ahora. 8 “Ognuno di noi ha un paio di ali ma solo chi sogna impara a volare”. James Douglas Morrison. 9 Índice 16 17 Abreviaturas Acs Anticuerpos Acs anti-HA Anticuerpos inhibidores de hemaglutinina Acs anti-NA Anticuerpos inhibidores de neuraminidasa CDC Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades CPMP Comité de especialidades farmacéuticas DE Desviación estándar ELLA Ensayo enzimático ligado a lectina (Enzyme-Linked Lectin Assay) EMA Agencia Europea del Medicamento GISRS Global Influenza Surveillance and Response System HA Hemaglutinina HAI Anticuerpos inhibidores de hemaglutinina IgA Inmunoglobulinas de tipo IgA IgG Inmunoglobulinas de tipo IgG LAIV Vacunas con virus vivos atenuados de la gripe LAL Líquido alantoideo LAM Líquido amniótico MGT Media geométrica de los títulos de anticuerpos 18 NA Neuraminidasa NAI Anticuerpos inhibidores de neuraminidasa NDEV Número de días entre la administración de la vacuna y la extracción del suero post-vacunal NGIV Nueva generación de vacunas (Next Generation Influenza Vaccines) NIC Centro Nacional de Gripe (National Influenza Centre) OMS Organización Mundial de la Salud OPS Organización Panamericana de la Salud PBS Buffer salino fosfato PNT Protocolo Normalizado de Trabajo PVIG Programa de Vigilancia de la Gripe RCSCyL Red Centinela Sanitaria de Castilla y León RIC Razón de incremento de la media geométrica de los títulos de anticuerpos RIH Reacción de inhibición de hemaglutinación TIV Vacunas inactivadas trivalentes TPV Tasa de seroprotección conferida por la vacuna TS o TSP Tasa de seroprotección TSC Tasa de seroconversión χ 2 Chi-cuadrado de Pearson 19 Introducción 20 21 Introducción Características de los virus de la gripe Los virus gripales se incluyen en la familia Orthomixoviridae, que en la actualidad agrupa cinco géneros (1). Estos cinco géneros comprenden: Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Isavirus y Thogotovirus. Son virus con ARN monocatenario, de tamaño medio y provistos de una envoltura que adopta una forma esférica o filamentosa. Sólo los tres primeros géneros anteriormente citados son causantes de la gripe. El cuarto género está integrado por los Isavirus, de interés veterinario. El quinto género, de descripción más reciente, se ha denominado “virus Togoto”, con un interés reducido en el ámbito clínico. Los virus de la gripe de los tipos B y C (Influenzavirus B e y C) tienen como reservorio exclusivamente el ser humano, habiéndose registrado casos esporádicos por transmisión del hombre a ciertos animales como las focas, perros y cerdos (2–4). Sin embargo, los virus de la gripe A circulan entre un amplio rango de hospedadores salvajes, la mayoría de ellos aves y algunos mamíferos, además del hombre (5). Los virus gripales de tipo A y B constituyen los géneros más importantes. El virus gripal de tipo C constituye un género de escaso interés en patología humana y difiere en determinadas características estructurales y biológicas de los dos géneros anteriores. Principales características de los virus gripales A y B Los virus presentan un diámetro entre los 20 y los 80 nanómetros con una forma esférica o a veces filamentosa (6). Su material genético es ARN monocatenario de polaridad negativa. El genoma de los virus gripales no está formado por un único fragmento de ácido nucleico, sino que en el interior de este virión existen ocho segmentos génicos diferenciados que codifican diez proteínas distintas (7). Entre ellas se encuentran: la nucleoproteína viral (NP), las dos glucoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), tres polimerasas virales RNA dependientes (PB1, PB2 y PA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y dos proteínas virales denominadas 22 no estructurales (NS1 y NS2) aunque la NS2 se encuentra representada con pocas moléculas en la partícula vírica. En la figura 1 se muestra la estructura modelo de un virus de la gripe. Figura 1. Estructura de un virus de la gripe A. Fuente: Ortiz de Lejarazu R. et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2015; 33(7):480-490 (8). En el interior del virión se encuentra la nucleocápside formada por los ocho fragmentos de ARN monocatenario, la NP y el complejo ARN-polimerasa (9). En el exterior de la nucleocápside y por debajo de la membrana de envoltura se sitúa la proteína matriz M1 que confiere estabilidad a la partícula vírica. Los distintos tipos de virus de la gripe tienen porteínas matriz y NP antigénicamente diferentes (10). La nomenclatura de las cepas de virus de la gripe tiene en cuenta el tipo (A, B y C), seguido del lugar de aislamiento, número de referencia del laboratorio, año, y en el caso de virus del tipo A, el tipo de HA y NA que posee (ej: A/California/07/2009 (H1N1pdm), en este caso se añade la acotación “pdm” para diferenciarla de los subtipos clásicos anteriores a éste). La envoltura de virus de la gripe A presenta proyecciones superficiales de glucoproteínas HA y NA. La HA se presenta como un homotrímero compuesto de tres monómeros idénticos (11,12) en forma de espícula, con una cabeza globular que constituye la región HA1 y un tallo (región HA2) (Figura 2). Por otra parte, la NA viral se trata de una prolongación que adopta una forma más 23 achatada o con “forma de seta” compuesta por una proteína tetramérica formada por un conjunto de 4 monómeros idénticos (13–16) (Figura 3). Tanto en la HA como en la NA, los epítopos antigénicos están situados en la parte más externa de la proteína. Figura 2. Esquema de la estructura tridimensional de los dominios membrana y transmembrana de la proteína hemaglutinina (HA). Extraído y modificado de: Ortiz de Lejarazu R. et al. Los virus de la gripe. Pandemias, epidemias y vacunas. 2019 (17). Figura 3. Esquema de la estructura tridimensional de los dominios membrana y transmembrana de la proteína neuraminidasa. Extraído y modificado de: Ortiz de Lejarazu R. Vacunas de la gripe y vacunación gripal. Perspectivas actuales. 2006 (18). 24 La HA es el principal antígeno de los virus de la gripe, constituyendo en torno al 25% de las proteínas víricas (19) y ocupando una situación de inmunodominancia en la partícula vírica, por lo que este componente es uno de los mayores responsables de la respuesta del sistema inmune (20). La función principal de la HA vírica es la fijación del virión a los receptoresde ácido siálico de las glucoproteínas de membrana de las células epiteliales del tracto respiratorio. Esto permite el inicio de la infección gripal de las células huésped (5,11,12). Además, la HA promueve la fusión de la envuelta del virión con el endosoma de la célula para permitir el internamiento de los componentes víricos en el citoplasma. La NA es una proteína homotetramérica que representa el 5% de todas las proteínas del virus (19). La NA es uno de los antígenos principales superficiales del virus de la gripe, aunque su dominancia es algo menor que la de la HA al estar en menor número y relativamente enmascarada por la HA. La función principal de la NA es la liberación del virión de la superficie de las células infectadas. Esto sucede mediante la escisión de los terminales de ácido siálico una vez que se ha formado la progenie de viriones en el interior de la célula huésped (16). No obstante, además de la acción sialidasa de la NA, esta glucoproteína es relevante en diferentes etapas de la infección. En primer lugar, esta proteína es esencial para que el virus pueda llegar a las células del tracto respiratorio, ya que separa los ácidos siálicos de las mucinas de las vías respiratorias para facilitar la entrada del virus gripal a la célula huésped (21,22). En segundo lugar, participa en la fusión de las membranas víricas y celulares (23). En tercer lugar, facilita la salida de los nuevos viriones impidiendo su agregación (23). Además, hay datos que sugieren que la NA amplifica la actividad hemaglutinante de la HA mediante la separación de los residuos de ácido neuramínico terminal de los oligosacáridos que rodean el sitio de unión de los receptores de la HA (24). En definitiva, mediante la acción conjunta de las dos glucoproteínas de superficie, la HA y la NA, el virus de la gripe puede completar su ciclo infeccioso. 25 Variación antigénica del virus de la gripe A La variación antigénica del virus de la gripe A ocurre por dos mecanismos que se describen a continuación, la variación antigénica menor o deriva antigénica, y la variación antigénica mayor o salto antigénico. Una particularidad de los virus de la gripe A es que presentan una gran variabilidad debida fundamentalmente a que las ARN-polimerasas virales tienen poca fidelidad transcriptora y su tasa de introducción de errores al replicar el genoma vírico es elevada (9,10). Además, las ARN-polimerasas de los virus de la gripe no tienen actividad 3´-exonucleasa, por lo que no pueden corregir los errores introducidos (9,10). La acumulación puntual de mutaciones en sus genes puede tener traducción antigénica en ocasiones y la selección de variantes con más fitness replicativa en individuos previamente inmunizados hace que se produzca una deriva antigénica con el tiempo y de lugar a las variaciones menores del virus. Esta deriva antigénica (antigenic drift) sucede sobre todo en las glucoproteínas de superficie HA y NA (25,26), dando lugar a la aparición de una nueva cepa muy similar a la anterior, pero con características diferenciales para las cuales la población susceptible no posee anticuerpos (Acs) específicos. Estas variaciones menores son las responsables de las epidemias estacionales (27). Por otra parte, la segmentación del material genético de los virus de la gripe permite la aparición de variantes antigénicas mayores (antigenic shift) que suceden por fenómenos de reordenamiento genético en un mismo huésped infectado por virus diferentes. En las variaciones mayores, los cambios antigénicos son consecuencia del reordenamiento de genes de distintos virus de la gripe, especialmente el de la HA, que infectan un único hospedador dando lugar a un subtipo de virus de gripe nuevo frente al cual la población no posee inmunidad protectora en una proporción significativa que no produzca inmunidad de grupo (25,28). Las pandemias gripales ocurren como consecuencia de una variación mayor, con la aparición en un nuevo subtipo de virus gripal A (29,30). Los virus de la gripe B experimentan deriva antigénica que da lugar a variantes menores e incluso linajes distintos, pero no tienen potencial pandémico ya que el ser 32 Periodo a partir de 1977: En 1977, el subtipo A (H1N1) reapareció después de 20 años de ausencia siendo los sujetos más vulnerables a la enfermedad los niños y jóvenes, mientras que los adultos y mayores de 65 años lo fueron menos, ya que estaban protegidos parcialmente por previas exposiciones al subtipo A(H1N1) antes de 1957 (40). El análisis de secuencias de cepas A(H1N1) mostraron que había una gran similitud genética entre la HA de la cepa que apareció en 1977 (cepa A/USSR/90/77) y la HA de las cepas A/FM/1/1947 y cepas posteriores como A/Fort Warren/50 (44). Por este motivo, se consideró que esta cepa debía proceder directamente de las gripes observadas en la década de 1950. Sin embargo, hasta el momento no se ha encontrado la explicación por la que un virus ha permanecido genéticamente invariable durante más de dos décadas. Una de las hipótesis más aceptadas es que esta cepa procedió de un espécimen congelado, que probablemente se propagó por un accidente de laboratorio (45). El subtipo A(H1N1) finalmente se reintegró en la circulación epidémica, provocando epidemias estacionales junto con el subtipo A (H3N2) hasta su desaparición en el año 2009 con la emergencia del nuevo subtipo A(H1N1)pdm09 (33,46). Emergencia del nuevo subtipo A(H1N1)pdm09 En el año 2009 se produjo el último caso de salto de barrera de especie que provocó la aparición del nuevo subtipo A(H1N1)pdm09, fruto de un reordenamiento genético entre virus de la gripe procedentes de aves, cerdos (linajes clásico y euroasiático) y humanos en hospedadores porcinos (46). En el caso de la pandemia del 2009, el virus es una variante del subtipo A(H1N1) clásico cuyos genes PB2 y PA procedían de un virus aviar, los genes HA, NP y NS de un virus del linaje porcino clásico, los genes M y NA de un virus porcino del linaje euroasiático importado a Norteamérica, y el gen PB1 procedente de un virus humano (Figura 8). Los datos epidemiológicos indican que un brote similar a la gripe comenzó en el pueblo mexicano de La Gloria, Veracruz, a mediados de febrero de 2009 (47). A principios de abril de ese mismo año, las autoridades sanitarias públicas de México se alertaron por el alto número de casos de neumonía y gripe en esa región, e informaron 33 a la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y a la oficina regional de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de un posible brote de gripe. En los Estados Unidos, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) identificaron cepas gripales distintas a las que circularon anteriormente del subtipo A(H1N1) que habían aparecido en el sur de California a mediados de abril de 2009. El 23 de abril, la Agencia de Salud Pública de Canadá también detectó virus gripales A(H1N1) nuevos en pacientes procedentes de México. El hallazgo de que los casos de México y California fueron causados por virus similares desencadenó la alerta por parte de los CDC y la OMS el 24 de abril de 2009. La gripe A(H1N1)pdm09 se caracterizó por su afectación sobre todo a la población joven-adulta, produciéndose un menor número de casos de lo esperado en el grupo de población envejecida debido a que alrededor de un tercio de las personas mayores de 60 años tenía anticuerpos contra este virus, probablemente debido a una exposición anterior a un virus A(H1N1) (33,46). Aunque esta pandemia afectó principalmente a niños, jóvenes y adultos de mediana edad, el impacto del virus (H1N1) pdm09 en la población mundial en general, fue menos grave que el impacto de pandemias anteriores (46,47). Figura 8. Génesis del virus gripal A(H1N1) pdm09. Extraído y modificado de: Neumann G. et al. Nature 2009, 459(7249):931-9 (33). 34 Epidemiología de los virus de la gripe Los virus de la gripe circulan en forma de epidemias estacionales que suceden de forma diferente en función de la latitud, ocurriendo en los meses fríos y húmedos del hemisferio norte y sur, mientras que en las zonas tropicales no existe un periodo de máxima incidencia sino que la gripe circula durante todo el año (48). En nuestro entorno, estas ondas epidémicas ocurren fundamentalmente entre los meses de diciembre a febrero-marzo (49,50). El periodo de vigilancia de la gripe en el hemisferio norte comprende desde la semana 40 de un año hasta la semana 20 del siguiente. Durante este periodo se da la circulación más intensa del virus pero también puede circular durante todo el año identificándose casos incluso en época estival (51). La gripe es una infección de moderada contagiosidad con un periodo de incubación muy corto de 2 a 4 días, por lo que se transmite con rapidez durante las epidemias estacionales, afectando a un porcentaje relativamente importante de la población general. Las epidemias de gripe duran aproximadamente entre 8 y 12 semanas, infectándose por término medio entre el 5 y el 20 % de la población. Las epidemias anuales causan en todo el mundo unos 3 a 5 millones de casos de enfermedad grave y unas 250.000 a 500.000 muertes. La mortalidad de la gripe epidémica oscila por debajo del 1 % de las personas infectadas, aunque depende de la cepa gripal causante de la epidemia, de la edad y de las características de la población (52). La gripe afecta sobre todo a niños y jóvenes, pero es especialmente grave en personas de edad avanzada y aquellas con fragilidad biológica. La mortalidad de la gripe se concentra en las edades extremas de la vida (niños menores de 2 años y sobre todo mayores de 65 años) y en aquellos con comorbilidades (53). En España, el patrón epidémico típico de la gripe provoca un aumento de casos y de detecciones en laboratorio de estos virus a partir de la segunda o tercera semana del mes de Enero, llegando normalmente al pico de la onda epidémica a comienzos del mes de Febrero y alcanzándose tasas de incidencia de gripe que varían entre 250-300 casos por 100.000 habitantes/semana en función de cada temporada (54) (Figura 9). Los virus de gripe estacional humana del tipo A que circulan en la actualidad son fundamentalmente A(H1N1)pdm09 y A(H3N2). Los virus de tipo B circulantes se separan en dos linajes (B/Yamagata y B/Victoria) (55). Los virus de tipo C se detectan 35 con mucha menos frecuencia y suelen causar infecciones leves de tipo catarral, por lo que su impacto en la salud pública es menor. Desde el punto de vista epidemiológico, los virus gripales del tipo A son los principales causantes de las epidemias estacionales, en circulación mixta o en solitario, y a veces acompañados por virus de gripe B, sobre todo al final de la epidemia. Sin embargo, cada dos o tres años la epidemia es causada mayoritariamente por alguno de los dos linajes de gripe B (56). Figura 9. Perfil epidémico del virus de la gripe medido como tasa de incidencia semanal y número de detecciones virales. Temporada 2018-2019. Fuente: CNESistemas de Vigilancia de la gripe en España (54). Respuesta inmune frente a los virus de la gripe Los virus de la gripe en los humanos causan una infección sistémica con afectación de las vías respiratorias superiores iniciando una cascada de reacciones inmunes que activan tanto la respuesta humoral como la respuesta celular. Las glucoproteínas de superficie de los virus de la gripe (HA y NA) son las de mayor importancia en la respuesta humoral (21,57) y las proteínas internas predominan en la respuesta celular (58,59). Los anticuerpos (Acs) presentes en las mucosas (fundamentalmente inmunoglobulinas de tipo IgA) y en el suero (IgG) generados frente a la HA neutralizan al virus limitando su infectividad. Estos Acs son la primera barrera para evitar la infección. La respuesta de inmunoglobulinas de tipo IgG frente a la HA es específica de 36 cepa, ya que la acumulación de mutaciones puntuales por deriva antigénica de la HA limita la neutralización de otras cepas del mismo subtipo por acción de los anticuerpos específicos. Inmunidad de tipo celular La respuesta inmunitaria de tipo celular juega un importante papel en la patogenia de la infección gripal y en la curación de la enfermedad. En el curso de la infección se observa un incremento de los mecanismos de la inmunidad innata y de algunos mecanismos de la inmunidad celular. La respuesta inmunitaria celular está mediada por células T, quienes tienen como diana principalmente a las proteínas internas de los virus de la gripe. En el ser humano hay dos tipos de células T efectoras: T-CD4+ y TCD8+. Ambos tipos de células contribuyen al aclaramiento de la infección causada por el virus de la gripe (60). La respuesta inmunitaria celular está mediada por células T CD4+, con restricción del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II (CMH II) y son fundamentalmente específicas de subtipo. Estas células CD4+ tienen dos propiedades funcionales. En primer lugar, son células T colaboradoras que ayudan a las células B para la producción de Acs y a los linfocitos T de clase I para su proliferación. En segundo lugar, las CD4+ pueden tener actividad citolítica con un rango de especificidad de antígeno parecida a la de los linfocitos T de clase I (60). Las células T CD8+ con restricción CMH clase I son específicas de tipo, dirigidas preferentemente a los antígenos NP y M. Estos linfocitos T citotóxicos aparecen en individuos infectados o vacunados entre los días 6 y 14 y desaparecen por término medio el día 21 (60). Las células natural killer (células NK) no son específicas frente a los virus, pero en la fase aguda aumenta considerablemente su actividad, incrementándose los niveles de interferón alfa y beta que se correlacionan con la disminución de la carga vírica (61). 37 Inmunidad de tipo humoral Tras la primo-infección natural por los virus de la gripe aparecen Acs en el suero de los pacientes frente a la HA y NA, así como frente a otras proteínas internas del virus. Estos últimos son específicos de tipo y la protección que ofrecen es limitada, pero resultan de utilidad para el análisis de la seroprotección a través de métodos serológicos como la fijación de complemento. Los anticuerpos anti-hemaglutinina (Acs anti-HA) son la base de la inmunidad protectora humoral frente a la gripe; neutralizan la infectividad del virus por bloqueo del dominio de adhesión en la subunidad HA1 (cabeza globular de la hemaglutinina) (62). Los Acs anti-HA son específicos de cepa y algo menos de subtipo. Esta especificidad tan estrecha de los principales Acs protectores explica en gran parte la susceptibilidad a la infección por nuevas cepas variantes de virus de la gripe, incluso del mismo subtipo. Los anticuerpos anti-neuraminidasa (Acs anti-NA) se producen a menor título. El efecto protector de estos Acs se basa en limitar la difusión del virus, ya que bloquean la liberación de los viriones tras el ciclo replicativo del virus en la célula hospedadora. A pesar de que los Acs anti-NA desempeñan un papel importante en la protección frente a la gripe, se ha prestado poca atención al antígeno NA para el diseño de vacunas antigripales. De hecho, la NA viral ha sido recientemente apodada como el "antígeno olvidado" (63). Importancia de la respuesta humoral mediada por Anticuerpos inhibidores de Neuraminidasa (Acs anti-NA). El papel de los Acs anti-NA ha sido reconocido como un posible contribuyente a la protección frente a la gripe. Se ha reconocido que los Acs anti-NA reducen la replicación viral (64). No obstante, debido al papel dominante de los Acs frente a la HA en la protección y al hecho de que la infección o la vacunación pueden a menudo producir Acs contra ambos antígenos, la contribución precisa del anticuerpo frente a la NA ha sido relegada generalmente a un segundo plano. Uno de los principales problemas para analizar la importancia de la respuesta inmune humoral frente a la NA es que los ensayos serológicos frente a este antígeno 38 eran difíciles de realizar y requerían el uso de reactivos tóxicos, lo que limitaba el número de muestras que se analizaban (65). Sin embargo, recientemente se han puesto a punto nuevos protocolos serológicos estandarizados que permiten analizar la presencia de Acs anti-NA en un gran número de sueros. El método más utilizado actualmente es el ensayo ELLA (Enzyme-Lynked Lectin Assay) (66–68). La evidencia científica ha apoyado en numerosas ocasiones que la respuesta inmunológica mediante la producción de Acs anti-NA se ha correlacionado con una reducción en el título viral y una reducción en el desarrollo de los síntomas asociados a la gripe, tanto en modelos animales (69) como en estudios controlados en humanos (70). La correlación entre la reducción en la gravedad de los síntomas de la enfermedad gripal y la presencia de Acs anti-NA está descrita desde 1969 (71), y recientemente se ha demostrado que la presencia de títulos previos de Acs anti-NA en sueros de pacientes se comporta como un factor de protección frente a la infección gripal, independientemente del título de Acs anti-HA en el suero de los mismos (72,73). La respuesta inmune humoral frente a la NA viral puede ser de particular importancia en aquellos años en los que exista un mismatch antigénico de la HA, pero con poca deriva antigénica de la NA (74). De hecho, los resultados de algunos estudios han demostrado que la infección previa frente a la gripe A(H1N1)pdm09 podría proporcionar protección inmunológica contra el virus A(H5N1), ya que la secuencia aminoacídica de la estructura de NA entre estos subtipos está más conservada (75,76). En particular, los Acs dirigidos contra estas regiones conservadas de NA podrían ayudar a proporcionar un nivel significativo de protección frente a la infección gripal (77). Pecado original antigénico Las epidemias estacionales de gripe ocurren cada año producidas por variantes menores de los tipos gripales A y B. Las primeras infecciones por virus de la gripe ocurren generalmente en los primeros años de vida de un individuo, induciendo inmunidad protectora específica frente a la cepa de virus que les infectó. Las exposiciones posteriores a otros virus de la gripe, bien sea por infecciones naturales o 39 por vacunaciones estacionales, producen una respuesta inmune frente a las cepas que han infectado a un individuo, pero también producen un intenso efecto “booster” frente a la primera cepa que le infectó. Esta importancia de las primo-infecciones con virus de la gripe se explica mediante la teoría del Pecado Original Antigénico (78–81), donde los primeros contactos con virus de la gripe en un individuo determinan las interacciones con el resto de virus de la gripe con los que esté en contacto durante toda su vida. Esta teoría fue formulada por Sir Thomas Francis en el año 1960 (78) y ha sido descrita en la respuesta inmune humoral frente a virus de la gripe así como en el estudio de infecciones por otros virus respiratorios (79–82). La “Doctrina del Pecado Original Antigénico” en la gripe explica como un individuo cuando es infectado por una cepa de virus gripal estacional, produce una respuesta específica frente a dicha cepa y al mismo tiempo respuestas de mayor o menor intensidad frente a cepas que han infectado a este individuo a lo largo de su vida. Este fenómeno inmunológico notable que se produce sobre el primer virus que le infectó, tiene sin duda repercusión en la respuesta humoral específica de la gripe, y ha obtenido gran importancia a la hora de entender la respuesta a las vacunas de gripe. Este fenómeno despierta un especial interés en la formulación de vacunas futuras de una respuesta más amplia, e incluso de vacunas universales al estilo de las que disponemos hoy en día contra la Polio y la Rubéola. Vacunación frente a la gripe y tipos de vacunas La medida de control más eficaz frente a la gripe sigue siendo la inmunización anual mediante la vacunación, especialmente en grupos de población considerados de alto riesgo de complicaciones asociadas a la gripe (83). No obstante, los constantes cambios antigénicos de la gripe obligan a una vigilancia virológica y epidemiológica adecuada que permita seleccionar correctamente de las cepas que deben formar parte de la vacuna antigripal cada temporada. Cada año, la OMS a través de la Red Internacional de Vigilancia de la Gripe (GISRS, Global Influenza Surveillance and Response System) analiza las cepas de gripe circulantes en los hemisferios norte y sur 40 para elegir las cepas idóneas para la formulación vacunal, optimizando la efectividad de los programas de vacunación. Tipos de vacunas antigripales Existen dos grandes grupos de vacunas antigripales, las inactivadas y las atenuadas. Las primeras se administran mediante inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica y son las únicas disponibles actualmente en España. Las vacunas atenuadas se administran por vía intranasal, tienen limitada su indicación en personas inmunocompetentes de 2 a 17 años y se han ido introduciendo en programas de vacunación infantil en los Estados Unidos, Finlandia y el Reino Unido, entre otros países. Algunos ensayos clínicos que comparan ambos tipos de vacunas han mostrado una eficacia similar o superior en las vacunas de virus vivos atenuados (84,85). Vacunas inactivadas La mayoría de vacunas que se emplean en países europeos con programas específicos de vacunación, incluida España, son de tipo inactivado en cualquiera de sus formulaciones: pueden contener virus enteros, virus fraccionados o antígenos de superficie (86). Algunos autores han señalado que estas últimas vacunas podrían originar una menor protección (87). En general, todas estas vacunas tienen un rango de edad de utilización desde los 6 meses de vida en adelante, con algunas excepciones. En la figura 10 se representan algunas de las vacunas antigripales comercializadas en España. 41 1Intramuscular (IM); 2Subcutánea (SC); 3Intradérmica (ID) Figura 10. Vacunas antigripales comercializadas en España. Extraído y modificado de: Ortiz de Lejarazu R. et al. Los virus de la gripe. Pandemias, epidemias y vacunas. 2019 (17) o Vacunas inactivadas de virus enteros: Este tipo de vacunas contiene partículas de virus completo de la gripe, inactivado pero con todas las proteínas, lípidos, antígenos (glucoproteínas) y ácido nucleico del virus. Se producen por inoculación de virus de la gripe en huevos embrionados de gallinas. Tras un periodo de incubación de 2-3 días, se recogen las partículas víricas, se purifican y se inactivan. Las primeras vacunas producidas de esta manera fueron eficaces para prevenir la gripe, pero a menudo eran altamente reactógenas. Estas vacunas mostraban una buena inmunogenicidad y una reactogenicidad aceptable. Sin embargo, en niños estas reacciones adversas eran frecuentes, por lo que no era recomendable su uso en este grupo etario. Tras la vacunación con viriones completos inactivados se produce una respuesta humoral y celular frente a los antígenos de superficie e internos del virus similar a lo que ocurre tras una infección natural. La seroprotección alcanzada mediante Tipo de vacuna Nombre comercial Formulación Indicación Vía de administración Laboratorio Afluria ≥5 años IM1, SC2Seqirus Intanza ≥60 años ID3Sanofi Pasteur Mutagrip ≥6 meses IM, SC Sanofi Pasteur Vaxigrip ≥6 meses IM, SC Sanofi Pasteur Vaxigrip Tetra ≥6 meses IM, SC Sanofi Pasteur Fluarix Tetra ≥6 meses IM GSK Chiroflu ≥6 meses IM, SC Seqirus Chiromas (adyuvante MF59C.1) ≥65 años IM Seqirus Influvac ≥6 meses IM, SC Mylan Trivalente Antígenos de superficie (HA y NA) Virus fraccionados inactivados Tetravalente Trivalente 48 A(H5N1), ya que la secuencia aminoacídica de la estructura de NA entre estos subtipos está más conservada (75,76). Por tanto, la respuesta inmunológica frente a la NA viral podría ser de particular importancia durante una pandemia de gripe en la que la mayoría de la población no presentara inmunidad previa frente al nuevo suptipo de HA, pero que pudiera tener inmunidad previa a la NA del virus emergente (74). El estudio de la inmunogenicidad de la proteína NA como antígeno vacunal parece relevante en el diseño de vacunas enfocadas en respuestas universales frente a la gripe. Efectividad y eficacia de las vacunas antigripales La eficacia vacunal se determina fundamentalmente mediante ensayos serológicos clínicos controlados y la efectividad mediante estudios epidemiológicos observacionales. Estos parámetros de la vacunación antigripal son difíciles de evaluar, ya que varían de forma considerable en función de la concordancia (matching) existente entre las cepas vacunales y las circulantes o salvajes, así como de los métodos utilizados para el análsiis, la intensidad de la actividad gripal durante la temporada en que se realiza el estudio, la edad de los pacientes incluidos en el estudio, el número de dosis administradas y la proporción de personas con factores de riesgo en la población en estudio (115). La efectividad vacunal, entendida como la protección conferida a los sujetos vacunados en condiciones de uso habitual de la vacuna, viene determinada por tanto, de:  Características del sujeto: edad, competencia del sistema inmune, factores genéticos que pueden condicionar la respuesta a la vacuna o la historia de exposiciones previas a los distintos virus de la gripe.  Características de la vacuna: - Concordancia o matching de las cepas vacunales con las cepas de virus circulantes. La capacidad de los virus de la gripe de experimentar 49 constantes cambios antigénicos obliga a una adecuada vigilancia virológica y epidemiológica para seleccionar correctamente las cepas vacunales de cada temporada. - Cantidad de antígeno incluida en la vacuna. - Tipo de vacuna (vacuna de virus vivos atenuados, inactivada fraccionada o de subunidades). - Presencia de elementos que potencien la respuesta inmune, como los adyuvantes. - Vías de administración (subcutánea, intradérmica o intranasal). - El origen del virus vacunal, obtenido por cultivo en embrión de pollo o en líneas celulares, puede tener un impacto diferente en la protección conferida por la vacuna. A pesar de que la efectividad de las vacunas antigripales es moderada (116), la medida de control más eficaz de la enfermedad gripal sigue siendo la inmunización anual mediante la vacunación, especialmente en grupos de población considerados de alto riesgo por complicaciones asociadas a la gripe (83,115). Técnicas serológicas para evaluar la eficacia vacunal Las técnicas serológicas que se utilizan habitualmente para cuantificar los Acs específicos de la gripe incluyen:  Reacción de Inhibición de la Hemaglutinina (RIH)  Ensayo de Hemólisis Radial Simple (HRS) Para evaluar la eficacia vacunal se han utilizado tradicionalmente estos dos ensayos serológicos. Para que las vacunas antigripales puedan ser comercializadas, estas deben cumplir con una serie de parámetros de eficacia vacunal que exige la Agencia Europea del Medicamento (EMA), emitidos por el Comité de especialidades farmacéuticas (CPMP). 50 Con estos métodos se pretende hacer una aproximación bastante fiable de la capacidad inmunogénica humoral de las vacunas, aunque actualmente se están incluyendo otros métodos complementarios para mejorar esta medición. Existen otros métodos serológicos más complejos como la microneutralización viral (MN), que permiten analizar la presencia de Acs neutralizantes frente a todas las proteínas del virus. Sin embargo, este método no se usa como método habitual para evaluar la eficacia serológica habitual. Con respecto a la aparición de nuevos métodos serológicos, cabe destacar el ensayo de titulación de anticuerpos frente a la neuraminidasa (Acs anti-NA) mediante el ensayo ELLA (Enzyme-Linked Lectin Assay), que surge de la necesidad de disponer de nuevas herramientas para conocer con mayor detalle los Acs frente a la gripe en muestras serológicas, y más concretamente frente a otras proteínas diferentes a la hemaglutinina que puedan estar implicadas en la respuesta inmune. A continuación, se describe de manera resumida el fundamento de cada uno de los ensayos serológicos citados anteriormente. o Reacción de Inhibición de la Hemaglutinación (RIH): Es el método más utilizado actualmente para detectar y cuantificar Acs frente a la HA de virus de la gripe en muestras serológicas, tanto humanas como animales (117–119). Esta metodología es utilizada en muchos laboratorios para analizar la respuesta humoral a la vacunación, para realizar estudios de eficacia serológica vacunal, así como estudios seroepidemiológicos con el fin de analizar la susceptibilidad de distintas poblaciones frente a la gripe (44,120,121). Esta técnica es también utilizada para realizar la caracterización antigénica de los virus de la gripe utilizando antisueros de animales previamente infectados. o Ensayo de hemólisis radial simple (HRS): La técnica de la hemólisis radial simple (HRS) es la segunda metodología reconocida para evaluar la eficacia serológica de las vacunas estacionales. Está basada en la hemólisis pasiva de los eritrocitos mediada por el complemento e inducida por el complejo antígeno-anticuerpo (119,122,123). Esta hemólisis es fácilmente identificable y 51 su medida es proporcional a la concentración de Acs en el suero. Esta técnica detecta principalmente anticuerpos IgG frente a los virus de la gripe, pero también puede utilizarse para muchos otros virus como los coronavirus, virus Parainfluenza, virus Dengue o virus de la encefalitis japonesa. En esta técnica, un área de hemólisis igual o superior a 25 mm2 es aceptado como correlato de protección humoral. o Ensayo de microneutralización o de neutralización viral El ensayo de neutralización viral es un ensayo altamente sensible y específico para detectar Acs neutralizantes específicos del virus de la gripe en sueros humanos y animales, que puede incluir la detección de anticuerpos humanos contra subtipos de gripe aviar (117,119). Aunque las pruebas de neutralización convencionales para los virus gripales (basadas en la observación del efecto citopático del virus en un cultivo de células MDCK) son laboriosas y bastante lentas, los ensayos de microneutralización utilizan placas de microtitulación en combinación con un ELISA frente a la proteína NP para detectar las células infectadas por el virus, puediendo obtenerse resultados en dos días (124). o Ensayo enzimático ligado a lectina (ELLA) El ensayo ELLA (Enzyme-Linked Lectin Assay) fue inicialmente descrito por Lambré y colaboradores en 1990 (125), pero su uso como un ensayo serológico estandarizado ha sido más reciente, con numerosos laboratorios que realizan el ensayo para medir los títulos de Acs anti-NA en muestras clínicas (66,68,73,126). Uno de los objetivos del Consorcio para la estandarización del estudio seroepidemiológico de virus de la gripe (CONSISEConsortium for the Standarization of Influenza Seroepidemiology) es promover el análisis de la respuesta humoral contra otras proteínas virales como es el caso de la NA viral. La técnica ELLA consiste en un ensayo práctico que actualmente siguen algunos laboratorios para la determinación de Acs anti-NA. 52 Análisis y parámetros de la eficacia vacunal La evaluación de la eficacia vacunal es un paso fundamental para comprobar que el diseño de la vacuna es preciso y útil. Actualmente, la base científica para aprobar las vacunas antigripales comercializadas en Europa y las actualizaciones de las ya existentes son los estudios que evalúan el título de Acs anti-HA tras la vacunación mediante la RIH (117). El análisis RIH puede servir además para conocer la capacidad de las vacunas antigripales para inducir la producción de Acs heterotípicos en la población frente a cepas gripales de reciente aparición dentro de un mismo subtipo gripal (34,127), y de mayor interés frente a subtipos con potencial pandémico, como virus de gripe aviares como los subtipos A(H5N1), A(H7N3) y A(H9N2) (128,129). La Agencia Europea del Medicamento (EMA, European Medicines Agency) determina cuales son los requerimientos que debe tener una vacuna frente a la gripe en términos de protección serológica para que pueda ser comercializada (117,119,130). Estos criterios son emitidos por el Comité de especialidades farmacéuticas (CPMP, Committee for Proprietary Medicinal Products) y están representados en la Tabla 2. Los criterios del CPMP están referidos a dos grupos etarios diferentes: adultos (entre 18 y 60 años) y mayores de 60 años. En esta valoración detallada por la EMA no se han incluido otros grupos de edad que pueden recibir las vacunas antigripales, como por ejemplo, la población pediátrica. Tabla 2. Criterios utilizados por el Comité de especialidades farmacéuticas (CPMP) para la monitorización de la eficacia de la vacuna antigripal y requeridos por la EMA para su comercialización (119). 18-60 años > 60 años Tasa de Seroprotección > 70% Tasa de Seroprotección > 60 % Tasa de Seroconversión > 40% Tasa de Seroconversión > 30% Razón de Incremento > 2,5 Razón de Incremento > 2,0 53 Los criterios para evaluar la eficacia vacunal son los siguientes: o Tasa de Seroprotección (TSP): Es el porcentaje de población evaluada que posee Acs a títulos considerados como protectores. Para la evaluación de este parámetro se considera un título ≥1:40 como correlato de seroprotección frente a la gripe. En definitiva, la TSP es el porcentaje de población que tras la vacunación muestra un título de Acs anti-hemaglutinina ≥1:40. Estudios realizados por algunos autores (62,73,106,121) han demostrado que un título de Acs anti-HA de 1:40 es capaz de evitar el 50% de las infecciones por gripe. o Tasa de Seroconversión (TSC): Es el porcentaje de la población que tras la vacunación antigripal muestra un aumento de al menos cuatro veces el título entre el suero pre-vacunal y post-vacunal. Un ejemplo sería pasar de un título pre-vacunal de 1:10 a un título post-vacunal de 1:40, o de un título 1:40 a 1:160. o Media Geométrica de los títulos de anticuerpos (MGTs): ya que los títulos de Acs son valores que siguen una progresión geométrica y una distribución no normal con cierta asimetría derecha, la media aritmética no es un método adecuado para el cálculo de los valores de tendencia central. Esto provoca que el uso de la media aritmética sobreestime el valor medio del título de Acs. Para evitar esto, se realiza una transformación logarítmica de los títulos para obtener una distribución normal de tipo Gaussiano, siendo el valor de tendencia central la media aritmética de esa transformación. o Razón de incremento entre los títulos pre y post-vacunales: permite estudiar el incremento de títulos que ha experimentado una población como respuesta a la vacunación antigripal, y se define como la división entre las MGTs post-vacunales y las MGTs pre-vacunales. Estos parámetros sirven para evaluar si una vacuna ha sido eficaz o no frente a un subtipo de gripe en una población concreta, debiendo cumplir como mínimo uno de los tres requisitos establecidos por la EMA (119,130). Esto ofrece una información muy relevante para conocer si la elección de cepas para la formulación vacunal en cada año ha sido la correcta, así como para comprender ciertos parámetros de la inmunidad en distintas poblaciones. 54 Sistema de Vigilancia de la Gripe en España (SVGE) En España existe un sistema de vigilancia epidemiológica especial para la gripe mediante redes de médicos centinelas y laboratorios con capacidad de detección y aislamiento del virus de la gripe, denominado Sistema de Vigilancia de Gripe en España (SVGE). En el territorio español existen 20 laboratorios con capacidad de detección y aislamiento de virus gripales. Tres de ellos son Centros Nacionales de Gripe reconocidos por la OMS, que están ubicados en el Hospital Clínico Universitario de Valladolid, el Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III y el Hospital Clínico de Barcelona. El conjunto de estos 20 laboratorios está coordinado por el Centro Nacional de Referencia de Gripe, el Centro Nacional de Microbiología (CNM). El SVGE engloba diferentes fuentes y sistemas de información, entre ellos, un estructurado Sistema centinela de vigilancia de gripe (ScVGE). El ScVGE está formado por redes centinela sanitarias dispuestas por Comunidades Autónomas, cuyo cometido es el conocimiento de la incidencia de la gripe, así como proporcionar datos sociodemográficos de los pacientes afectados y la caracterización de los virus circulantes. En la comunidad de Castilla y León, la vigilancia de la gripe se realiza a través del Centro Nacional de Gripe en Valladolid (NIC Valladolid) y la Red Centinela Sanitaria de Castilla y León (RCSCyL) (131,132). La labor investigadora y de detección de virus gripales pertenecientes al territorio de Castilla y León se realiza en el Servicio de Microbiología e Inmunología del Hospital Clínico Universitario en coordinación con el mencionado NIC Valladolid. La información generada por el NIC de Valladolid y la RCSCyL cada semana es remitida a la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica del Instituto de Salud Carlos III, con el objetivo de elaborar los informes epidemiológicos semanales sobre la gripe (Figura 11). 55 Figura 11. Informe semanal de la Red Centinela Sanitaria de Castilla y León (RCSCyL). Fuente: Informe epidemiológico de la semana 13/05/2019 al 19/05/2019. Programa de Vigilancia de la Gripe (PVIG). 56 Interés del proyecto Las vacunas antigripales más usadas actualmente contienen HA y otros antígenos del virus que no se eliminan durante su elaboración. La HA es el único antígeno vacunal que se estandariza durante la producción de este tipo de vacunas, por lo que en su composición quedan restos de otros antígenos, entre ellos la NA, en cantidades no conocidas o no estandarizadas. La contribución de esta NA no estandarizada en la inmunogenicidad de la vacuna no es conocida, y menos la capacidad de protección serológica que puede implicar. En el presente trabajo, el análisis serológico frente a la HA y NA permitió realizar un estudio comparativo de la respuesta humoral frente a ambos antígenos. El análisis serológico de Acs anti-HA así como de Acs anti-NA fue realizado mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (RIH) y el ensayo enzimático ligado a lectina (ELLA), respectivamente. El uso del protocolo ELLA en distintos laboratorios que trabajan con gripe es reciente (66,126). El consorcio de colaboración CONSISE (Consortium for the Standarization of Influenza Seroepidemiology) ha colaborado junto con distintos laboratorios en la optimización de esta técnica serológica, con el fin de estandarizar los protocolos existentes y buscar una buena reproducibilidad y aceptable variabilidad intra e inter-laboratorio en los resultados (68). Esto ha permitido la publicación de recientes trabajos que evalúan la implicación de la NA en la respuesta inmune humoral frente a la gripe, tanto de forma natural como con la vacunación. El ensayo ELLA es una técnica sólo llevada a cabo actualmente por un grupo reducido de laboratorios en el mundo, entre los que se encuentra el NIC de Valladolid. La realización del presente trabajo de investigación ha puesto a punto este método serológico en este centro, utilizando sueros pre y post-vacunales del programa de Vigilancia seroepidemiológica de la Gripe de la Junta de Castilla y León. La limitada efectividad de las vacunas antigripales actuales estimula el interés por buscar nuevos diseños vacunales que incluyan nuevos antígenos del virus. Por ello, es necesario evaluar la respuesta inmune (tanto humoral como celular) frente a potenciales nuevos antígenos, como la NA, y buscar parámetros de protección serológica específicos frente a cada uno, que sean útiles para evaluar la eficacia serológica frente a dichos antígenos. Así, es necesario comprobar algunos parámetros 57 como: correlatos de seroprotección de la NA para distintos grupos de población; relación de los anticuerpos frente a la NA y los observados frente a la HA; eficacia serológica de la vacuna basada en la medida de anticuerpos anti-NA siguiendo los parámetros de la Agencia Europea del Medicamento (EMA); relación de la respuesta humoral de la NA en función del tipo de vacuna; respuesta heterotípica frente a otras NAs del mismo y diferente clado; entre otros. Como se ha comentado anteriormente, en este trabajo se analizaron los Acs anti-NA y anti-HA previos a la vacunación de la población a estudio, con el fin de conocer su inmunidad previa frente a cepas gripales clásicas y más recientes del subtipo A(H1N1) estacional y de la variante pandémica A(H1N1) pdm09. El motivo por el que se eligió el subtipo A(H1N1) en el estudio se debe a que es el subtipo gripal que más tiempo ha estado circulando en el ser humano desde el siglo XX. Los virus gripales del subtipo A(H1N1) estacional con los que se trabajó para analizar la presencia de Acs antigripales (anti-NA y anti-HA) fueron los siguientes: A/PR/8/1934, A/Weiss/1943, A/FM/1/1947, A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007. Estas cinco cepas gripales fueron escogidas porque representan en orden cronológico algunas de las cepas más relevantes en la historia natural de este subtipo. Las cepas A/PR/8/1934 y A/Weiss/1943 son representantes de los virus gripales que circularon en las décadas de 1930 y 1940, siendo cepas derivadas de la Gripe Española. Dichas cepas fueron además los dos primeros virus que formaron parte de las primeras vacunas antigripales. En concreto, la cepa A/PR/8/1934 (denominada inicialmente como A0 siguiendo la nomenclatura antigua) fue la primera cepa incluida en la primera vacuna monovalente frente a la gripe (133), pero poco después tuvo que incluirse la cepa A/Weiss/1943 pues se comprobó que los virus de la gripe sufrían deriva antigénica, y por tanto era necesario actualizar las vacunas estacionales (17). De esta forma se creó la primera vacuna bivalente, integrada por dos cepas diferentes de un mismo subtipo. Durante la década de los 40 surgió una cepa desligada de las anteriores, la cepa A/FM/1/1947 que se denominó como A-prime o A´). Esta cepa surgió de un drift antigénico mucho mayor a lo esperable tras una epidemia estacional, causando lo que algunos autores denominaron como la pseudo-pandemia de 1947 (40). Por otro lado, 64 65 Material y métodos DISEÑO DEL ESTUDIO Se diseñó un estudio retrospectivo observacional y analítico donde se analizaron sueros pre y post-vacunales de dos grupos diferentes de individuos, una población mayor de 65 años y otra de individuos de edad comprendida entre 15 y 64 años. Estos sueros fueron obtenidos en dos campañas de vacunación consecutivas (2013-2014 y 2014-2015) a través de la RCSCyL, en las que se dispuso tanto del suero pre-vacunal como del suero post-vacunal del mismo individuo. El estudio de la respuesta humoral de la población frente a virus de la gripe se centró en el análisis serológico de la producción de Acs específicos frente a la hemaglutinina y la neuraminidasa de virus de la gripe del subtipo clásico A(H1N1) y del subtipo pandémico A(H1N1)pdm09. MATERIAL Procedencia de las muestras Las muestras serológicas de los dos grupos de población del estudio fueron obtenidas gracias a la RCSCyL. Esta recogida de muestras serológicas se encuentra dentro del proyecto plurianual de la Gerencia Regional de Salud de la Junta de Castilla y León denominado “Vigilancia seroepidemiológica de la gripe en la población Castellana y Leonesa”. Gracias a este proyecto, la RCSCyL recoge muestras de suero previas y posteriores a la vacunación frente a la gripe de individuos que acuden a los centros de salud de la comunidad autónoma de Castilla y León. Esta red es un sistema específico de información orientado a la vigilancia epidemiológica y de la salud que requiere la colaboración voluntaria y activa de distintos profesionales (132,134). Este sistema consta de 30 médicos centinela distribuidos por toda Castilla y León siguiendo criterios de representatividad poblacional, que realizan un muestreo simple aleatorio que asegura la representatividad de toda la población de la comunidad autónoma, tanto en la remisión de frotis faríngeos para la vigilancia de las epidemias de gripe, 66 como en la remisión de los sueros para la vigilancia de la eficacia vacunal. Las muestras son enviadas anualmente al Centro Nacional de Gripe de Valladolid donde son analizadas. Población del estudio Se eligieron dos cohortes de individuos, una población mayor de 65 años y otra de individuos de edad comprendida entre 15-64 años. Ambas cohortes habían sido vacunadas con vacuna trivalente estacional frente a la gripe durante las temporadas 2013-14 y 2014-15.  Criterios de inclusión Se incluyeron aquellos individuos mayores de 65 años y de 15-64 años de las campañas vacunales de las temporadas anteriormente mencionadas que tuvieran una muestra de suero pre y post vacunal extraídas con al menos 28 días de diferencia entre ambas tomas, tomando como día del suero pre-vacunal el día de inoculación de la vacuna. Se estimó que un periodo de 28 días entre la inoculación y la extracción del suero post-vacunal aseguraba una respuesta inmune humoral completa frente a los antígenos presentes en las vacunas administradas.  Criterios de exclusión Se excluyeron aquellos individuos con muestras de suero no pareadas, que no cumplieran el criterio de edad, de tiempo de exposición a la vacuna, y aquellos en los que la recogida de datos hubiera sido deficiente en alguno de los campos relevantes para el estudio como el sexo, edad, fechas de extracción de suero y/o tipo de vacuna utilizada (adyuvada o fraccionada). Finalmente se incluyeron un total de 160 individuos, siguiendo el siguiente esquema: 67 - 40 individuos en la cohorte de individuos 15-64 años de la temporada estacional de gripe 2013-2014. - 40 individuos en la cohorte de individuos ≥65 años de la temporada estacional de gripe 2013-2014. - 40 individuos en la cohorte de individuos 15-64 años de la temporada estacional de gripe 2014-2015. - 40 individuos en la cohorte de individuos ≥65 años de la temporada estacional de gripe 2014-2015. Recogida y almacenamiento de muestras La recogida de muestras serológicas se encuentra dentro del proyecto de “Vigilancia seroepidemiológica de la gripe en la población Castellana y Leonesa”, regulada por la Orden SAN/1593/2006 de 13 de octubre de 2006. Se obtuvo el consentimiento informado y el reclutamiento de los Pacientes se realizó de acuerdo con la Ley Orgánica de Protección de Datos, Derechos y Obligaciones del Paciente en materia de documentación clínica (BOE nº 298 de 14 de diciembre de 1999, Ley 41/2002). El formulario de consentimiento informado está dispuesto como Anexo I en el apartado de Anexos. Las muestras serológicas se obtuvieron a través de los médicos de la RCSCyL y fueron enviadas posteriormente al Centro Nacional de Valladolid (NIC de Valladolid). A su llegada al centro, se realizó una centrifugación de cada muestra a 3.500 rpm durante 10 minutos, y se recogió el suero en un tubo con su correspondiente etiquetado, donde se incluyó la información referente a la campaña vacunal en la que se recogió y un número correlativo según el orden de llegada. Las muestras de suero fueron almacenadas en congeladores de -20ºC hasta su uso. Recogida de datos demográficos Los datos demográficos de los individuos reclutados en el estudio fueron recogidos por los médicos centinelas de la RCSCyL, utilizando el formulario dispuesto para tal fin distribuido por la Consejería de Sanidad de la Junta de Castilla y León (Figura 12 y Anexo II). En el presente formulario se recogió el nombre y apellidos del paciente, 68 edad, sexo, fecha de extracción de los sueros pre y post-vacunales, fecha de inoculación de la vacuna y el tipo de vacuna utilizada. Figura 12. Formulario de recogida de los sueros pre y post-vacunales del programa de vigilancia epidemiológica de la RCSCyL. Vacunas administradas a la población de estudio Los tipos de vacunas, el número de individuos en cada cohorte de población vacunados con cada tipo de vacuna y las cepas de gripales A y B incluidas en las temporadas vacunales anteriormente mencionadas se describen en las tablas 3 y 4. El 69 grupo de individuos de 15-64 años (denominado en este trabajo como grupo de adultos) fue vacunado con dos vacunas diferentes durante las dos temporadas analizadas, recibiendo en la temporada 2013-14 una vacuna inactivada de tipo fraccionada elaborada en cultivo en huevos embrionados, y en la temporada 2014-15 una vacuna inactivada de antígenos de superficie elaborada en cultivo celular. El grupo de mayores de 65 años fue vacunado en sendas temporadas de gripe con vacuna adyuvada inactivada. En la tabla 5 se recogen las cepas utilizadas en la formulación de las vacunas trivalentes anuales administradas a las distintas cohortes de población en las temporadas incluidas en el estudio. Para el análisis de datos comparando ambos grupos de edad, los dos tipos de vacunas administradas a los individuos adultos se manejaron como un solo tipo de vacuna, vacuna de tipo inactivado no adyuvada. Sin embargo, para la comparación de ambos cohortes de población joven-adulta entre las dos temporadas analizadas, las vacunas administradas fueron comparadas según su diferente método de producción como inactivada fraccionada (temporada 2013-14) e inactivada de antígenos de superfície (temporada 2014-15). Tabla 3. Vacunas trivalentes estacionales utilizadas y número de sujetos vacunados con cada tipo de vacuna en la población de estudio. Grupo 15-64 años Grupo ≥ 65 años (nº individuos) (nº individuos) Temporada 2013-14 Vaxigrip® (40) Chiromas® (40) Temporada 2014-15 Optaflu® (40) Chiromas® (40) Tabla 4. Clasificación de las vacunas trivalentes estacionales utilizadas según tipo de vacuna y casa comercial. Tipo de vacuna Nombre comercial Adyuvada Chiromas® Fraccionada Vaxigrip® Antígenos de superficie Optaflu® 70 Tabla 5. Cepas de gripe A y B incluidas en las vacunas trivalentes anuales administradas en las temporadas 2013-14 y 2014-15. Campaña vacunal Cepa vacunal 2013-2014 2014-2015 A(H1N1) A/California/7/2009 A/California/7/2009 H3N2 A/Victoria/361/2011 A/Texas/50/2012 B B/Massachusetts/2/2012 B/Brisbane/60/2008(cuadrivalente) B/Massachusetts/2/2012 B/Brisbane/60/2008(cuadrivalente) Cepas gripales A(H1N1) utilizadas en el estudio Las cepas de gripe A(H1N1) analizadas en este trabajo fueron las siguientes: cinco cepas gripales diferentes del subtipo estacional A(H1N1) y una cepa del subtipo A(H1N1) pandémico. Para la determinación serológica de los Acs anti-gripales se ensayaron todos los sueros recogidos frente a cada una de las seis cepas gripales H1 utilizadas para este estudio, como fueron las siguientes: Cepas del subtipo A(H1N1) - A/Puerto Rico/8/1934 - A/Weiss/1943 - A/Fort Monmouth/1/1947 (A/FM/1/1947) - A/Brazil/11/1978 - A/Brisbane/59/2007 Cepas del subtipo A(H1N1)pdm09 - A/California/7/2009 Estas cepas fueron escogidas por su relevancia en la historia natural del subtipo A (H1N1) desde su aparición en 1918 (36) hasta su extinción en el año 2009 con la aparición del nuevo subtipo pandémico A(H1N1)pdm09 (135). Las cepas A/PR/8/1934, 71 A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947 son tres cepas clásicas que representan la deriva antigénica de la Gripe Española antes de la desaparición del subtipo A(H1N1) en 1957. Estas tres cepas fueron además las primeras cepas de gripe H1 que se incluyeron en las primeras vacunas utilizadas en el ser humano. Tras la reemergencia de este subtipo en el año 1977 hasta su desaparición en el 2009, dos cepas clásicas relevantes del subtipo H1 estacional fueron las cepas A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007. A/Brisbane/59/2007 fue además la última cepa seleccionada como cepa vacunal del subtipo clásico A(H1N1) introducida en la vacuna antes la extinción de este subtipo, y A/California/07/2009 como la primera cepa del subtipo A(H1N1)pdm09. Las diferentes cepas gripales A(H1N1) fueron obtenidas por el Centro Nacional de Gripe de Valladolid a través de distintos organismos:  La cepa A/PR/8/1934 fue suministrada por el National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC, London, UK) donde fue previamente inactivada con beta-propiolactona para su uso en condiciones BSL-II.  Las cepas egg-adapted A/Weiss/1943, A/FM/1/1947 y A/Brazil/11/1978 fueron suministradas por el Francis Crick Institute London WHO Collaboration Centre (London, UK) y propagadas en el NIC de Valladolid.  Las cepas A/Brisbane/59/2007 y A/California/7/2009 fueron obtenidas de los reactivos de identificación de aislamientos de gripe suministrados por el International Reagent Resource (IRR), USA. MÉTODOS Propagación de virus en cultivo en embrión de pollo Todas las cepas gripales comentadas anteriormente, con excepción de A/PR/8/1934, fueron cultivadas en embrión de pollo en el NIC de Valladolid para la obtención de carga viral suficiente para los experimentos, y posteriormente almacenadas a -80ºC en alícuotas hasta su uso. Estas cepas no fueron inactivadas por ningún método previamente a su utilización ya que se trabajó en condiciones de bioseguridad adecuadas. 72 Para la realización del cultivo de virus en embrión de pollo así como de los estudios serológicos se dispuso de un laboratorio de Bioseguridad tipo II (BSL-II) para el manejo de los virus de la gripe utilizados. Este laboratorio está completamente equipado con el material inventariable y fungible necesario para la realización de los ensayos serológicos, así como para el cultivo de los virus que se utilicen en los experimentos. Se realizó cultivo en huevos embrionados de gallina para aquellas cepas de gripe que iban a ser utilizadas en las pruebas serológicas, con la única excepción de A/Puerto Rico/8/1934). Para el cultivo, se seleccionaron huevos embrionados de gallina de 7-9 días de incubación (136). Inicialmente se realizó la observación del embrión en cuarto oscuro y con el fin de obtener un mayor rendimiento, se eliminaron aquellos huevos en los que no se observaba movimiento del embrión ni se apreciaban ramificaciones arteriovenosas como indicadoras de la viabilidad del embrión. Los huevos embrionados fueron lavados previamente a la inoculación del virus con una solución de yodo al 10% para evitar contaminaciones. Con motivo de igualar presiones antes de inocular el virus, se realizaron pequeños orificios en la cámara de aire y en la cavidad alantoidea de cada huevo embrionado. Se inocularon 200 µl del virus diluido al 1/10 mediante una jeringa de 1 ml graduada (136,137). Ésta se introduce de forma recta y aproximadamente las primeras dos terceras partes de la longitud de la aguja con el fin de depositar el virus en la cavidad alantoidea, sellando posteriormente los orificios de inoculación con parafina para mantener las condiciones asépticas del cultivo (Figura 13). Finalmente, los huevos inoculados fueron incubados durante 3 días a 35ºC hasta realizar la recogida o harvesting del líquido alantoideo (LAL). 73 Figura 13. Proceso de inoculación manual de virus de la gripe en huevos embrionados de gallina. Extraído y modificado de: Karakus U. et al. Methods Mol Biol 2018 (1836):59-88 (137). Previamente a la recogida del LAL, los huevos inoculados con el virus fueron almacenados a -20ºC durante 45 minutos con el fin de eutanasiar al embrión siguiendo los principios de Bioética y Bienestar Animal. De este modo, se permite además una recogida más limpia del LAL debido a la retracción capilar que ocurre debido a las bajas temperaturas. Posteriormente se procedió, con ayuda de unas tijeras previamente esterilizadas, a la apertura del cascarón del huevo a través de la cámara de aire, recogiendo el LAL mediante pipetas Pasteur estériles y almacenándolo en tubos estériles de 20 ml (Figura 14). Estos viales fueron almacenados durante 24 horas a 4ºC para permitir la estabilización del título viral, y posteriormente se repitió el proceso de cultivo para realizar un segundo pase en huevo embrionado de gallina para obtener mayor carga viral. Los LAL obtenidos del primer y segundo pase fueron almacenados en tubos eppendorf de 1,5 ml a -80ºC hasta su uso. 80 Preparación de las placas recubiertas de fetuína Para el ensayo ELLA, se requiere recubrir placas de 96 pocillos y fondo plano en el laboratorio con fetuína antes de realizar los experimentos. Se describen a continuación: 1. Preparar una solución tampón mediante la mezcla de 10 ml de tampón de recubrimiento (10x coating buffer) con 90 ml de agua desionizada. 2. Preparar una solución de stock de fetuína a 25 mg/ml en 100 ml de tampón de recubrimiento. Esta solución de stock de fetuína se va a almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C. 3. Inmediatamente antes de cada ensayo serológico, se debe preparar una solución de trabajo de fetuína (25 µg/ml) para revestir las microplacas de 96 pocillos. Para conseguir esa solución trabajo de fetuína, se diluye 1 ml de fetuína a 25 mg/ml (preparada en el paso 2) en 99ml de tampón de recubrimiento. 4. Utilizar una pipeta multicanal para dispensar 100 µl de la solución de trabajo de fetuína en cada uno de los 96 pocillos de cada placa. 5. Cubrir cada placa con un papel transparente y luego colocar las placas en grupos de 10. 6. Colocar las placas en un refrigerador (2-8 ° C) durante al menos 18 h antes de realizar un ensayo. Las placas pueden estar almacenadas con la solución de fetuína a 2-8 ° C durante un máximo de 2 meses antes de realizar los ensayos. Titulación de los virus de la gripe Para poder realizar los ensayos serológicos, es necesario realizar una titulación previa de los virus de la gripe para realizar diluciones homogéneas del virus para los test. Esta titulación fue realizada para cada uno de los distintos virus gripales para los que se realizaron los ensayos serológicos. 81 La titulación de los virus supone un paso en el ensayo que necesita de dos días para su realización. El primer día se preparan las diluciones del virus, que se transfieren a una placa revestida de fetuína y se deja incubar de 16 a 18 horas a 37°C. Al segundo día se añade el complejo enzimático (enzima y sustrato cromóforo) y se lee la reacción enzimática que nos dará el título del virus, pudiendo calcular posteriormente la dilución estandarizada necesaria para el ensayo ELLA. Este paso de titulación del virus se ha de realizar cada vez que se haga un nuevo ensayo ELLA. Para la titulación de cada uno de los diferentes virus gripales a ensayar se siguieron detalladamente los siguientes pasos: A) Preparación de la dilución del virus (Figura 16): 1. Descongelar un tubo eppendorf del virus y conservar en hielo. No es aconsejable volver a congelar por la posible pérdida de carga viral. 2. Utilizar placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo en “U” para la dilución del virus. 3. Alicuotar 120 μl de diluyente en cada pocillo de la columna 2 a la columna 11. 4. Alicuotar 216 μl de diluyente en cada pocillo de la columna 1. 5. Vortear el vial del virus y añadir 24 μl de virus a la columna 1. Esto da una dilución inicial del virus 1:10 (24 μl virus/240 μl). 6. Realizar diluciones seriadas del virus, transfiriendo 120 μl de la columna 1 hasta la columna 12, desechando los últimos 120 μl. Hasta este paso se realizan las diluciones seriadas del virus en una placa de microtitulación estéril, no revestida de fetuína. A continuación, se transfieren las diluciones seriadas del virus a una placa recubierta de fetuína. 82 Figura 16. Esquema de la preparación de diluciones seriadas del virus para su titulación. Extraído y modificado de: Gao J. et al. J Vis Exp 2016 (115): e54573 (67). B) Transferir las diluciones seriadas del virus a una placa revestida de fetuína: 1. Lavar las placas revestidas de fetuína previamente 3 veces con PBS-Tween. Quitar el exceso del buffer con papel absorbente para eliminar el exceso de las paredes de los pocillos. 2. Añadir 50 μl de diluyente de la columna 1 a la columna 11 en la placa revestida de fetuína. 3. Añadir 100 μl de diluyente a la columna 12 (control negativo). 83 4. Transferir 50 μl de la dilución previa correspondiente del virus (de la placa U estéril) al pocillo correspondiente de la placa con fetuína. Realizar por duplicado. 5. Cubrir cada placa con un adhesivo de aluminio o transparente. 6. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 16-18 horas. C) Medir la actividad enzimática de la neuraminidasa (NA) del virus: 1. Destapar las placas. 2. Lavar 6 veces con el PBS-Tween y eliminar todo el exceso con papel absorbente. 3. Añadir 100 μl del conjugado PNA-HRPO en todos los pocillos. 4. Incubar las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. 5. Preparar el sustrato OPD 15 minutos antes del siguiente paso. 6. Lavar las placas 6 veces con la solución de lavado PBS-T. 7. Añadir 100 μl del sustrato OPD a todos los pocillos. 8. Incubar las placas durante 10 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Durante este tiempo controlar la variación del color. 9. Parar la reacción enzimática con 100 μl de ácido sulfúrico a concentración 1 N. 10. Leer las placas a 490 nm. D) Análisis y selección de la dilución del virus para el ensayo ELLA: 1. Usar el programa Excel para hacer gráfica de los valores de densidad óptica (DO) a 490 nm respecto a las diluciones de virus. 84 2. Observar la curva de titulación del virus, identificando la señal máxima y la mínima (control negativo/no virus) y la relación lineal de la curva de las distintas diluciones del virus. 3. Para mejorar la precisión y sensibilidad, seleccionar una dilución del virus que a 490 nm ofrezca una señal cercana a la máxima, pero dentro de la línea de la meseta. La dilución del virus más apropiada es aquella que corresponda a un 90-95 % de la señal máxima (generalmente 1/60, 1/80…) (Figura 17). Dicha dilución del virus debe usarse para todos los ensayos con el mismo stock del virus. Una vez realizada la titulación de cada virus, se procede al montaje del ensayo ELLA trabajando con los sueros problema y el virus en placas de fetuína. Figura 17. Ejemplo de lectura de la titulación de la cepa A/Weiss/1943. La dilución óptima se encontrará en el 90-95% de la señal máxima, que en este ejemplo se corresponde con una dilución 1/80. Extraído y modificado de: Gao J. et al. J Vis Exp 2016 (115): e54573 (67). 85 Tratamiento previo de los sueros La presencia de inhibidores inespecíficos de la actividad NA en los sueros humanos puede provocar resultados anómalos en el ensayo ELLA, por lo que es necesaria su eliminación previamente a la realización de los experimentos. Estos inhibidores inespecíficos son generalmente termolábiles y destruidos mediante un tratamiento térmico. Con el fin de evitar descongelaciones múltiples, todos los sueros (pre y postvacunales) fueron previamente alicuotados en seis alícuotas destinadas cada una de ellas para el ensayo frente a cada uno de los virus del estudio. Cada alícuota de suero se incubó previamente a cada ensayo en un baño de agua a 56 °C durante 45-60 minutos. Ensayo enzimático ligado a lectina (ELLA) de los sueros A) Preparación de diluciones seriadas de las muestras de suero (Figura 18): 1. Colocar las muestras de suero inactivadas por calor en el hielo. 2. Para un conjunto de 8 sueros a testar por placa, realizar una dilución inicial de 1:10 de los sueros. Para ello, en la columna 2, añadir 216 µl de diluyente y 24 µl de cada muestra de suero. Mezclar la muestra en el pocillo pipeteando arriba y abajo 3 veces para conseguir una dilución de la muestra homogénea. 3. Añadir 120 µl de diluyente a todos los pocillos de las columnas 3-11. 4. Realizar diluciones del suero, transfiriendo 120 μl de la columna 2 hasta la columna 11, desechando los últimos 120 μl. 86 Figura 18. Preparación de diluciones seriadas de las muestras de suero para la realización del ensayo ELLA. Extraído y modificado de: Gao J. et al. J Vis Exp 2016 (115): e54573 (67). B) Preparación de los virus a testar en el ensayo: 1. Descongelar un vial de virus, vortear y resuspender el virus en el diluyente para conseguir la dilución del virus seleccionada previamente en la titulación del virus. 2. Preparar al menos 5 ml de suspensión de virus por cada placa de ensayo. Mantener la dilución del virus en hielo o refrigerada a 5°C hasta que se laven las placas y las muestras de suero se hayan añadido a la placa. C) Adición de las diluciones seriadas de los sueros y suspensión de virus a la placa revestida de fetuína: 1. Decidir sobre el número de placas recubiertas de fetuína que son necesarias para el ensayo (generalmente se ensayan 4 sueros por placa, de modo que cada suero se testa por duplicado). 87 2. Se lavan las placas revestidas de fetuína 3 veces con PBS-Tween. A continuación, se invierten las placas sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de tampón de lavado. 3. Utilizar una pipeta multicanal para transferir 50 µl de cada dilución del suero de la placa de dilución a la placa revestida de fetuína siguiendo la misma disposición de los pocillos (de columna 2 a columna 11). Tener en cuenta que del pocillo de la placa de dilución (con fondo en “U”) se debe transferir dos veces consecutivas a la placa con fetuína para conseguir una transferencia de las diluciones seriadas de cada suero por duplicado (es decir, se utilizan dos filas consecutivas de la placa de fetuína para cada suero). 4. Añadir 50 µl de virus diluido a todos los pocillos excepto en la columna del control negativo (columna 12). 5. Añadir 50 µl de diluyente a todos los pocillos de la columna 12 (control negativo). 6. Cubrir cada placa con un adhesivo de aluminio o transparente. A continuación agitar suavemente las placas de forma manual o mediante la colocación de éstas en un agitador de placas a velocidad moderada durante 10 segundos para conseguir una correcta mezcla de virus y suero en todos los pocillos 7. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 16-18 horas. D) Adición del conjugado enzimático y sustrato para la lectura de placas: 1. Lavar las placas 6 veces con tampón de lavado (PBS-Tween). A continuación, se invierten las placas sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de tampón de lavado. 2. Añadir 100 μl a cada pocillo de la solución PNA-HRPO (a la dilución predeterminada 1:1000). 3. Incubar las placas durante 2 horas a T ambiente. 4. Lavar las placas 3 veces con tampón de lavado (PBS-Tween) y secar con el papel absorbente para eliminar el exceso remanente. 88 5. Añadir 100 μl del sustrato OPD a todos los pocillos. 6. Incubar las placas durante 10 min a T ambiente en oscuridad. Durante este tiempo ir controlando que va variando el color. 7. Parar la reacción enzimática con 100 μl de ácido sulfúrico a concentración 1 N. 8. Leer placas a 490 nm. E) Análisis de los resultados y cálculo del título de Acs anti-NA de los sueros: E.1. Determinar la validez de los resultados del ensayo: 1. Confirmar que los valores del control negativo (sin virus y sin suero) están a menos del 10% del valor de la señal analítica emitida (DO) por el control positivo (virus y no suero). 2. Confirmar que las mediciones de densidad óptica (DO) de los pocillos de control negativo son consistentes (≤20% de diferencia) y que las mediciones de densidad óptica de los pocillos para muestras duplicadas de sueros son consistentes (≤10% de diferencia). 3. Determinar la causa raíz de los resultados no válidos y repetir el ensayo si los criterios enumerados anteriormente no se cumplen. E.2. Cálculo del título de Acs anti-NA de los sueros: 1. Para cada placa de ensayo, se calcula la media de los valores de densidad óptica (DO) de todos los pocillos del control negativo (columna 12). Este valor promedio hace referencia al “ruido de fondo” o “background” de cada lectura de placa. 2. Restar el “ruido de fondo” a todas las lecturas. 3. Calcular el porcentaje de inhibición a cada dilución de suero usando la fórmula: [(DO control de virus - DO suero) / DO control de virus] x 100 89 4. Identificar la más alta dilución del suero que produce al menos un 50% de la inhibición de la máxima señal. Esa dilución de suero seleccionada es la que produce un 50 % de la inhibición de la actividad del virus (Figura 19). 5. Reportar el recíproco de esta dilución, que corresponde con el título de Acs anti-NA en dicho suero frente a la cepa de virus estudiada. Figura 19. Cálculo del título de Acs anti-NA en el suero problema: identificar la dilución más elevada del suero que produce al menos un 50% de la inhibición de la señal máxima. El recíproco de esta dilución corresponde al título de Acs anti-NA del suero problema frente a la cepa de virus estudiada (A/Weiss/1943 en este caso). 96 1. Se realizan 3 diluciones diferentes de cada virus en PBS (1/10, 1/50 y 1/100). Cada una de estas diluciones se realiza por duplicado. La titulación se realiza en placas de micro-titulación de 96 pocillos con fondo “V” debido al uso de sangre de gallina. 2. Se dispensan 50 µl de PBS a cada pocillo en toda la placa, exceptuando en la primera columna (únicamente dilución del virus). 3. Posteriormente se dispensan 50 µl de virus diluido en los pocillos primero y segundo de cada fila según las diluciones previamente descritas. 4. Se realizan diluciones dobles seriadas desde el segundo pocillo hasta el final, traspasando un volumen de 50 µl del contenido de cada pocillo hasta el siguiente. Se descarta el último volumen de la pipeta después de realizar la última dilución doble. 5. Posteriormente se añaden 50 µl de hematíes diluidos al 0.5% en todos los pocillos de la placa y se incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos hasta su lectura. 6. Para asegurar la validez del ensayo, se incluye un control negativo (última fila de la placa de microtitulación) en el que solo se dispensan 50 µl de PBS y 50 µl de la suspensión de hematíes diluidos al 0.5% en cada pocillo. Lectura e interpretación de la titulación del virus hemaglutinante La interpretación de los resultados obtenidos en la prueba de RIH se realizó inclinando la placa de microtitulación a 60-70° sobre una superficie blanca. Se determinó como título hemaglutinante la dilución más alta de virus (pocillo) en la que se observara hemaglutinación completa (figura 22). 97 Figura 22. Esquema de un ensayo de titulación por hemaglutinación de un virus. Esta muestra del virus presenta un título hemaglutinante de 1:80, ya que el pocillo de esta dilución es el último que muestra hemaglutinación completa. Fuente: Caracterización antigénica. CDC (140). Para la correcta interpretación de los resultados, se determinó como título hemaglutinante la dilución más alta en la que se observara hemaglutinación completa, determinada como ausencia de lágrima de sangre en la posición inclinada de la placa de microtitulación a 60-70° (figura 23). Figura 23. Lectura e interpretación de los resultados obtenidos en la reacción de inhibición de hemaglutinación (RIH) en placa de microtitulación. A) hemaglutinación positiva completa; B) hemaglutinación positiva débil; C, D y E) hemaglutinación negativa. Una vez obtenido el título hemaglutinante de cada dilución de virus por duplicado, se debe obtener la media de todas las lecturas para hayar la titulación exacta del antígeno viral. Para ello se realizó una media aritmética de los títulos. Para que el título del virus sea comparable con el resto de resultados, es necesario realizar una normalización del título para obtener 4 unidades hemaglutinantes (4 UH). Para ello, se 98 dividió el título obtenido entre 4, y se comprobó que se tenían 4UH de cada virus antes de cada experimento mediante otra titulación. Ensayo RIH para la titulación de sueros El objetivo de la RIH es conocer el título de anticuerpos hemaglutinantes (Acs antiHA) presentes en los sueros de la población estudiada. Para su realización se utilizaron placas de micro-titulación de 96 pocillos con fondo “V”. El protocolo del ensayo se describe a continuación: 1. Dispensar 50 µl de PBS en todos los pocillos excepto la segunda columna. En esta columna se dispensará únicamente el suero problema, disuelto anteriormente a una dilución 1/10 tras el tratamiento de los sueros (dilución de stock). 2. Dispensar 50 µl de suero en el primer pocillo (control de suero), segundo y tercero. 3. Realizar las diluciones seriadas del suero a partir del tercer pocillo, traspasando un volumen de 50 µl del contenido de cada pocillo hasta el siguiente. 4. Dispensar 25 µl del Ag vírico (previa una concentración comprobada de 4UH) en cada pocillo a excepción de la primera columna (control de suero). 5. Cubrir la placa, agitar ligeramente y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. 6. Tras esta incubación, añadir 50 µl de la suspensión de hematíes al 0,5% en todos los pocillos de la placa de microtitulación. Previo a esto, homogeneizar la suspensión de hematíes para evitar que los hematíes sedimenten. 7. Cubrir las placas con adhesivo, agitar ligeramente y dejar incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. En el ensayo se incluyeron controles positivos (PBS + virus + hematíes) y controles negativos (PBS + hematíes), además de los anteriormente mencionados controles de suero en la primera columna de cada placa. Dichos controles de suero sirven para comprobar que no existen inhibidores inespecíficos en el mismo que supongan una distorsión de los resultados. 99 Lectura e interpretación del ensayo serológico de RIH La interpretación de los resultados en el ensayo RIH de los sueros se realizó inclinando la placa de micro-titulación a 60-70° sobre una superficie blanca. Se tomó como título de Acs anti-HA la última dilución de suero en la que se observó inhibición de hemaglutinación completa como se muestra en la Figura 24. Figura 24. Esquema de un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (RIH). Este ejemplo muestra una titulación del suero problema de 1:1280, ya que a esta dilución se observó inhibición completa de la hemaglutinación. Fuente: Caracterización antigénica. CDC (140). Análisis de los resultados En el análisis e interpretación de los resultados se utilizaron los datos obtenidos mediante los ensayos serológicos ELLA y RIH. Se analizaron además los resultados obtenidos del análisis filogenético del gen completo de la HA y NA de cada una de las cepas gripales usadas en el ensayo serológico. Para estudiar la respuesta serológica humoral previa y tras la vacunación antigripal en la población del estudio, se utilizaronlos criterios establecidos por la Agencia Europea del Medicamento (EMA) y emitidos por el Comité de especialidades farmacéuticas (CPMP) (119,130). Los criterios a evaluar fueron los siguientes:  Tasa de Seroprotección (TSP): Es el porcentaje de población evaluada que posee Acs a títulos considerados como protectores. Para la evaluación de este parámetro se consideró un título ≥1/40 como correlato de seroprotección frente a la gripe. 100  Tasa de Seroconversión (TSC): Es el porcentaje de la población que tras la vacunación antigripal muestra un aumento de al menos cuatro veces el título entre el suero pre-vacunal y post-vacunal. Un ejemplo sería pasar de un título prevacunal de 1/10 a un título post-vacunal de 1/40, o de un título 1/40 a 1/160.  Razón de incremento entre los títulos pre y post-vacunales: permite estudiar el incremento de títulos que ha experimentado una población como respuesta a la vacunación antigripal, y se define como la división entre las MGTs post-vacunales y las MGTs pre-vacunales. Los parámetros descritos anteriormente sirvieron para evaluar si la vacuna antigripal había sido o no eficaz en términos serológicos frente a cada cepa gripal en la población a estudio. La EMA establece como requisito de eficacia vacunal cumplir como mínimo uno de los tres requisitos establecidos (119,130). Sin embargo, en este trabajo hemos considerado la evaluación de los tres parámetros en conjunto para disponer de una conclusión más completa. Además de los tres parámetros anteriormente comentados, se estudió la Tasa de Protección Vacunal (TPV) o tasa de protección debida a la vacuna, definida como el porcentaje de individuos que adquirieron un título ≥1/40 frente a un determinado virus tras la vacunación. Fue un parámetro definido por el autor y directores de este trabajo con el objeto de medir la parte del aumento de la seroprotección que es debida íntegramente a la vacuna. Debido a la falta de consenso por el momento sobre el correlato de seroprotección frente a la neuraminidasa (Acs anti-NA), para el análisis serológico frente a este antígeno se utilizaron los mismos correlatos de protección y parámetros usados para los Acs inhibidores de la hemaglutinina (Acs anti-HA) (73). Es decir, en términos de seroprotección se consideraron aquellos títulos de Acs anti-NA ≥1/40. Estos datos observados de seroprotección para Acs anti-NA se valoraron además en duplicado, considerando como título seroprotecctor un título ≥1/80. 101 Para la interpretación estadística descriptiva de los datos se utilizaron diferentes métodos paramétricos y no paramétricos mediante el programa SPSS V24 (IBM, Armonk, NY, USA). Se consideró una significación estadística del p<0,05. Los test estadísticos empleados para el análisis de los datos fueron los siguientes:  Test Chi-cuadrado de Pearson: El test Chi-cuadrado de Pearson (χ2) se utilizó para comprobar las diferencias existentes en el porcentaje de individuos seroprotegidos (TSP) y que presentaron seroconversión (TSC) en función del grupo etario poblacional.  Test de McNemar para muestras relacionadas: Este test no paramétrico fue utilizado para estudiar el efecto de la vacuna en términos seroconversión (TSC) frente a los distintos virus gripales analizados. Se utilizó además para estudiar las diferencias existentes entre la TSP pre-vacunal y la TSP postvacunal frente a todos los subtipos y cepas de gripe utilizados.  Test T de Student para muestras independientes: El test T de Student para muestras independientes se utilizó para comprobar la existencia de diferencias entre los valores de la MGTs pre-vacunales entre ambos grupos etarios frente a los distintos virus gripales del subtipo A(H1N1) estacional y A(H1N1) pandémico. De igual modo, este mismo análisis se utilizó para comprobar diferencias entre las MGTs post-vacunales en función de la edad de los individuos analizados.  Correlación de Spearman: El test no paramétrico de correlación de Spearman se utilizó para estudiar la correlación existente entre los títulos de Acs anti-HA y anti-NA en la población analizada frente a las cepas gripales incluidas en el estudio.  Correlación de Pearson: Debido a que los títulos de Acs son valores que siguen una progresión geométrica y una distribución no normal, se puede realizar una transformación logarítmica 102 (logaritmo neperiano) de los datos, con el fin de conseguir una distribución Normal de tipo Gaussiano. Con los valores logarítmicos de los títulos de Acs (“normalización de los datos”), se puede aplicar así una prueba paramétrica de correlación (Correlación de Pearson). Este test de correlación se utilizó para estudiar la correlación existente entre los títulos de Acs anti-HA y anti-NA en la población analizada frente a las cepas gripales incluidas en el estudio. Se fijó un nivel de significación de α=0,05.  Área bajo la curva o curva ROC: Mediante la construcción de estas curvas ROC se pretende conocer si existe una relación estadística entre un título 1/40 frente a la HA, considerado como seroprotector frente a este antígeno, y un título concreto frente a la NA. Esa capacidad discriminativa para el estudio de Acs a título protector (Acs ≥1/40) se estudia mediante las curvas ROC, hallándose valores de sensibilidad y especificidad para cada uno de los diferentes títulos de Acs anti-NA observados frente a cada una de las cepas gripales del estudio y en función del grupo etario, con un nivel de significación estadística (p<0,05). 103 Resultados 104 105 Resultados Características demográficas de la población La exposición de los resultados se ha realizado atendiendo a dos grupos de población estudiados en este trabajo, por una parte la población de edad comprendida entre 1564 años y por otro lado, la población ≥65 años. Características demográficas de los individuos ≥65 años Las características demográficas de los individuos ≥65 años del estudio se analizaron de forma global y en función de cada temporada vacunal incluida en el estudio. o Análisis demográfico global El grupo poblacional de individuos ≥65 años estaba compuesto por 80 individuos de dos cohortes de las temporadas de gripe 2013-14 (n1=40), y 2014-15 (n2=40). La media de edad de todo el grupo fue de 78,6 años (IC95%: 76,8-80,5). El 43,8% de los individuos incluidos fueron varones (n1=35) y el 56,2% mujeres (n2=45) (Figura 25). El número medio de días entre la administración de la vacuna y la extracción del suero post-vacunal (NDEV) fue de 33,7 días (IC95%: 31,4-36,2). Figura 25. Distribución porcentual de sexos en el grupo de individuos ≥65 años. 43,8 % 56,2 % Varón Mujer 112 Análisis de la respuesta mediada por Acs anti-NA Análisis de Acs anti-NA previos a la vacunación En este apartado se estudia la presencia de Acs anti-NA pre-vacunales en ambas cohortes de población analizadas (individuos ≥65 años y de 15-64 años) frente a las cepas gripales clásicas del subtipo A(H1N1) estacional y frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo A(H1N1) pandémico. Siguiendo el orden siguiente, se analiza el nivel de Acs anti-NA pre-vacunales por un lado en la población global del estudio, y en segundo lugar, se analiza el nivel de Acs entre las dos cohortes de población estudiadas y en función de cada temporada estacional anual.  Análisis de la presencia de Acs anti-NA pre-vacunales en la población global del estudio. El análisis ELLA demostró presencia de Acs anti-NA a títulos ≥1/10 en prácticamente la totalidad de los sueros pre-vacunales frente a todas las cepas del subtipo A(H1N1) clásico y A(H1N1)pdm09 analizadas en la población estudiada. Únicamente tres sueros pre-vacunales mostraron títulos de Acs <1/10, correspondientes a tres individuos diferentes y frente a las cepas A/PR/8/1934, A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947 respectivamente (Tabla 11). Estos individuos presentaban una edad de 68, 59 y 56 años respectivamente. Los títulos observados de Acs anti-NA ≥1/40 así como títulos ≥1/80 frente a las distintas cepas gripales A(H1N1) en la población global a estudio quedan representados en las Figuras 31 y 32 respectivamente. Estos Acs anti-NA estaban presentes a títulos ≥1/40 en más del 88,8 % y en más del 73,8 % a títulos ≥1/80 en población global analizada. 113 La población estudiada presentó mayor tasa de seroprotección pre-vacunal medida por Acs anti–NA frente a las cepas gripales A/Weiss/1943, A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/ 59/2007 y de ellas A/Weiss/1943 y A/Brazil/11/1978 tuvieron las proporciones más altas de individuos con títulos muy elevados (32,5% y 18,1 % de los individuos presentaron títulos >1/640 respectivamente). Frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo A(H1N1)pdm09, sólo un 2,5% de la población global analizada presentó títulos de Acs anti-NA superiores a 1/640 (Tabla 11). 114 Tabla 11. Distribución global de los títulos de Acs anti-NA pre-vacunales frente a cepas del subtipo A(H1N1) y subtipo A(H1N1)pdm09. N: número de individuos; %: distribución porcentual. A/PR/8/1934 A/Weiss/1943 A/FM/1/1947 A/Brazil/11/1978 A/Brisbane/59/2007 A/California/07/2009 Título N % N % N % N % N % N % <10 1 0,6 1 0,6 1 0,6 0 0,0 0 0,0 0 0,0 10 5 3,1 1 0,6 1 0,6 1 0,6 0 0,0 3 1,9 20 12 7,5 0 0,0 4 2,5 0 0,0 1 0,6 11 6,9 40 14 8,8 2 1,3 7 4,4 7 4,4 8 5,0 28 17,5 80 32 20,0 8 5,0 20 12,5 11 6,9 24 15,0 38 23,8 160 43 26,9 35 21,9 42 26,3 33 20,6 43 26,9 34 21,3 320 30 18,8 36 22,5 35 21,9 42 26,3 47 29,4 29 18,1 640 18 11,3 25 15,6 32 20,0 37 23,1 26 16,3 13 8,1 >640 5 3,1 52 32,5 18 11,3 29 18,1 11 6,9 4 2,5 Títulos ≥ 1/40 142 88,8 158 98,8 154 96,3 159 99,4 159 99,4 146 91,3 115 Figura 31. Tasa de seroprotección (TSP) pre-vacunal global medida como porcentaje de individuos con Acs anti-NA a títulos ≥1/40 frente a cepas del subtipo A(H1N1) y subtipo A(H1N1)pdm09. 116 Figura 32. Tasa de seroprotección (TSP) pre-vacunal global medida como porcentaje de individuos con Acs anti-NA a títulos ≥1/80 frente a cepas del subtipo A(H1N1) y subtipo A(H1N1)pdm09. 117  Análisis de la presencia de Acs anti-NA pre-vacunales en función del grupo etario. El análisis ELLA mostró la presencia de Acs anti-NA en los sueros pre-vacunales frente a todas las cepas del subtipo A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 analizadas en ambos grupos etarios. Estos Acs estaban presentes a títulos ≥1/40 en más del 81,3% y en más del 67,5% a títulos ≥1/80 en ambos grupos etarios (Figura 33). Todos los individuos del grupo de edad ≥65 años mostraron Acs a títulos ≥1/40 frente a las cepas A/Weiss/1943, A/FM/1/1947, A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007. El porcentaje más bajo de individuos ≥65 años con Acs ≥1/40 se observó frente a las cepas A/PR/8/1934 y A/California/07/2009 (n=77; 96,3%), en ambos casos. En el grupo de individuos adultos no se encontró ningún virus frente al cual la totalidad de estos individuos mostrara anticuerpos a títulos ≥1/40. El porcentaje más alto de individuos adultos con títulos de Acs ≥1/40 fue frente a las cepas A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007 (n=79; 98,8% frente a ambas cepas), y el porcentaje más bajo fue frente a la cepa A/PR/8/1934 (n=65; 81,3%). Todos los individuos ≥65 años mostraron títulos ≥1/80 frente a la cepa A/Weiss/1943. El porcentaje más bajo de individuos ≥65 años con Acs a ≥1/80 se observó frente a la cepa A/California/07/2009 (n=64; 80,0%). No se encontró ningún virus frente al cual la totalidad de individuos adultos mostrara anticuerpos a títulos ≥1/80. El porcentaje más alto de individuos adultos con títulos de Acs ≥1/80 fue frente a la cepa A/Brazil/11/1978 (n=78; 97,5%), y el porcentaje más bajo fue frente a la cepa A/California/07/2009 (n=54; 67,5%). 118 Figura 33. Tasa de seroprotección pre-vacunal por grupo de edad (adultos y mayores de 65 años) medida como porcentaje de individuos con Acs anti-NA a títulos ≥ 1/40 y ≥1/80 frente a las cepas de gripe A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09. 119 Tomando como correlato de protección un título ≥1/40, se observaron diferencias estadísticamente significativas en la TSP pre-vacunal entre ambos grupos etarios frente a las cepas A/PR/8/1934, A/FM/1/1947 y A/California/07/2009 (Tabla 12), siendo esta TSP más elevada en ≥ 65 años frente a dichas cepas gripales (χ2 de Pearson; p<0.05). Este mismo análisis tomando como correlato de protección un título de 1/80, mostró diferencias estadísticamente significativas en la TSP pre-vacunal entre ambos grupos etarios frente a las cepas A/PR/8/1934, A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947, siendo esta TSP más elevada en ≥ 65 años frente a dichas cepas gripales (χ2 de Pearson; p<0.05) (Tabla 13). La presencia de Acs anti-NA de los sueros pre-vacunales fue analizada mediante el cálculo de la Media Geométrica de los títulos (MGTs) (Tabla 14). El valor más elevado de las MGTs pre-vacunales en los ≥65 años se observó frente a la cepa A/Weiss/1943 (MGTs=716,0; IC95%:534,0-974,7) y el más bajo frente a la cepa A/California/07/2009 (MGTs=136.9; IC95%:109,2-170,9). En los individuos de 15-64 años la MGTs más elevada se observó frente a la cepa A/Brazil/11/1978 (MGTs=448,5; IC95%:364,5542,9) y la más baja frente a A/California/07/2009 (MGTs=100,2; IC95%:79,3-127,7). La MGTs pre-vacunales fue significativamente más elevada en los ≥65 años que en adultos frente a las cepas A/PR/8/1934, A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947, y significativamente más elevada en los adultos que en los individuos ≥65 frente a la cepa A/Brazil/11/1978 (T-Student; p<0.05). Frente a las cepas A/Brisbane/59/2007 y A/California/07/2009 no se encontraron diferencias significativas en las MGTs entre ambos grupos etarios. 120 Tabla 12. Distribución de individuos con títulos de Acs anti-NA ≥1/40 previos a la vacunación. Valores de significación estadística (p-valor) de la tasa de individuos seroprotegidos frente a los virus gripales analizados. N: número de individuos protegidos antes de la vacunación; % (TSP): Tasa de seroprotección pre-vacunal. Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 15-64 años ≥ 65 años p-valor N % (TSP) N % (TSP) A/PR/8/1934 65 81,3 77 96,3 0,003 A/Weiss/1943 78 97,5 80 100,0 0,155 A/FM/1/1947 74 92,5 80 100,0 0,013 A/Brazil/11/1978 79 98,8 80 100,0 0,316 A/Brisbane/59/2007 79 98,8 80 100,0 0,316 A/California/07/2009 69 86,3 77 96,3 0,025 Tabla 13. Distribución de individuos con títulos de Acs anti-NA ≥1/80 previos a la vacunación. Valores de significación estadística (p-valor) de la tasa de individuos seroprotegidos frente a los virus gripales analizados. N: número de individuos protegidos antes de la vacunación; % (TSP): Tasa de seroprotección pre-vacunal. Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 15-64 años ≥ 65 años p-valor N % (TSP) N % (TSP) A/PR/8/1934 58 72,5 70 87,5 0,018 A/Weiss/1943 76 95 80 100,0 0,043 A/FM/1/1947 70 87,5 77 96,3 0,043 A/Brazil/11/1978 78 97,5 74 92,5 0,147 A/Brisbane/59/2007 74 92,5 77 96,3 0,303 A/California/07/2009 54 67,5 64 80,0 0,072 121 Tabla 14. Media geométrica de los títulos (MGTs) de Acs anti-NA y diferencias entre los valores MGTs de los sueros pre-vacunales frente a las cepas gripales A(H1N1) analizadas. IC95%: intervalo de confianza al 95%; (p<0,05). Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 MGTs Anti-NA (IC95%) pre-vacunales 15-64 años ≥ 65 años p-valor A/PR/8/1934 106,5 (81,2-137,7) 166,6 (131,1-209,9) 0,016 A/Weiss/1943 369,6 (269,9-485,7) 716,0 (534,0-974,7) 0,002 A/FM/1/1947 169,5 (128,3-215,5) 351,9 (283,9-434,4) <0,001 A/Brazil/11/1978 448,5 (364,5-542,9) 269,0 (211,8-336,1) 0,001 A/Brisbane/59/2007 222,3 (179,5-276,4) 251,0 (211,4-296,5) 0,399 A/California/07/2009 100,2 (79,3-127,7) 136,9 (109,2-170,9) 0,066  Análisis de los Acs anti-NA pre-vacunales en función de la temporada de gripe y grupo etario. La TSP pre-vacunal tomando como correlatos de seroprotección los títulos de Acs anti-NA ≥ 1/40 y ≥ 1/80 en función de las temporadas estacionales de gripe y en función del grupo etario, queda reflejada en las Tablas 15 y 16. 128 Figura 35. Tasa de seroprotección pre y post-vacunal utilizando un correlato de seroprotección con un título de Acs anti-NA ≥1/80 frente a cepas gripales A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09. 129 Tabla 20. Resultados globales de la TSP pre y post-vacunal, TPV y TSC frente a cepas gripales A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09, tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA ≥1/40. TSP: tasa de seroprotección; TPV: tasa de seroprotección conferida por la vacuna; TSC: tasa de seroconversión. A/PR/8/ 1934 A/Weiss/ 1943 A/FM/1/ 1947 A/Brazil/11/ 1978 A/Brisbane/59/ 2007 A/California/07/ 2009 Nº total de sueros 160 160 160 160 160 160 Nº pre-protegidos 142 158 154 159 159 146 TSP pre-vacunal (%) 88,8 98,8 96,3 99,4 99,4 91,3 Nº post-protegidos 153 158 158 159 159 159 TSP post-vacunal (%) 95,6 98,8 98,8 99,4 99,4 99,4 TPV (%) 6,9 0,0 2,5 0,0 0,0 8,1 Nº seroconversiones 16 36 27 27 43 86 TSC (%) 10,0 22,5 16,9 16,9 26,9 53,8 130 Figura 36. Valores globales de TSP pre y post-vacunal, TPV y TSC frente a las cepas gripales A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09, , tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA ≥1/40. 131 Tabla 21. Resultados globales de la TSP pre y post-vacunal, TPV y TSC frente a cepas gripales A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09, tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA ≥1/80. TSP: tasa de seroprotección; TPV: tasa de seroprotección conferida por la vacuna; TSC: tasa de seroconversión. A/PR/8/ 1934 A/Weiss/ 1943 A/FM/1/ 1947 A/Brazil/11/ 1978 A/Brisbane/59/ 2007 A/California/07/ 2009 Nº total de sueros 160 160 160 160 160 160 Nº pre-protegidos 142 158 154 159 159 146 TSP pre-vacunal (%) 80,0 97,5 91,9 95,0 94,4 73,8 Nº post-protegidos 153 158 158 159 159 159 TSP post-vacunal (%) 87,5 98,8 96,3 98,8 98,8 95,6 TPV (%) 7,5 1,3 4,4 3,8 4,4 21,8 Nº seroconversiones 16 36 27 27 43 86 TSC (%) 10,0 22,5 16,9 16,9 26,9 53,8 132 Figura 37. Valores globales de TSP pre y post-vacunal, TPV y TSC frente a las cepas gripales A(H1N1) clásicas y A(H1N1)pdm09, , tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA ≥1/80. 133 La vacunación estacional indujo una respuesta humoral homóloga que incrementó el título de Acs anti-NA hasta valores protectores (≥1/40) en un 8,1% (TPV) de la población global analizada frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo A(H1N1)pdm09. Esta TPV permitió pasar de una TSP pre-vacunal del 91,3% a una TSP post-vacunal del 99,4% frente al subtipo pandémico. Por otro lado, tras la vacunación estacional también se observó una respuesta heterológa que incrementó el título de Acs anti-NA hasta títulos protectores (≥1/40) frente a dos de las cepas clásicas del subtipo A(H1N1) estacional incluidas en el estudio (cepas A/PR/8/1934 y A/FM/1/1947). Ninguna de estas cepas estacionales estaba incluida como cepa vacunal en las temporadas vacunales del estudio. Tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA de ≥1/80, la vacunación produjo globalmente una TPV homóloga del 21,8% frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo A(H1N1)pdm09. Esta TPV permitió pasar de una TSP pre-vacunal del 73,8% a una TSP post-vacunal del 95,6% frente al subtipo pandémico. Por otro lado, tras la vacunación estacional también se observó una respuesta heterológa que incrementó el título de Acs anti-NA hasta títulos protectores (≥1/80) frente a todas las cepas clásicas del subtipo A(H1N1) estacional incluidas en el estudio. Esta TPV osciló entre el 1,3% frente a la cepa A/Weiss/1943 y el 7,5% frente a la cepa A/PR/8/1934. Ninguna de estas cepas estacionales estaba incluida como cepa vacunal en las temporadas vacunales del estudio. La vacunación estacional indujo seroconversión homóloga en el 53,8% de la población global frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo pandémico, cepa incluida en la vacuna. La vacunación también indujo seroconversión heteróloga frente a las cepas clásicas del subtipo A(H1N1) estacional, con tasas que oscilaron entre el 10,0% frente a la cepa A/PR/8/1934 y el 26,9% de la población frente a la cepa A/Brisbane/59/2007. 134  Análisis del efecto de la vacuna trivalente estacional sobre la generación de Acs anti-NA en función del grupo etario. El análisis de la producción de Acs anti-NA en función del grupo etario no sólo busca mostrar las diferencias debidas a la edad de los individuos adultos y mayores de 65 años, sino también mostrar las diferencias entre dos conceptos vacunales diferentes. Es necesario recordar que el grupo de mayores de 65 años fue vacunado con una vacuna adyuvada, mientras que los adultos fueron vacunados con vacunas inactivadas sin adyuvante. Por tanto, los resultados mostrados a continuación hacen referencia tanto a las diferencias de edad como a las debidas al uso de un tipo de vacuna diferente en cada grupo. Con el fin de facilitar la redacción de los resultados, se utilizará solo la comparación etaria como referencia de ambos conceptos. Tras la vacunación estacional se observó que la TSP post-vacunal ascendió al 92,5% en los individuos adultos y que fue superior al 98,8% en el grupo ≥65 frente a todas las cepas A(H1N1) y A(H1N1)pdm09, tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA de ≥1/40 (Figura 38). Por otra parte, la TSP post-vacunal (≥1/80) fue superior al 80,0% en los individuos adultos y superior al 95,0% en el grupo ≥65 frente a todas las cepas A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 (Figura 38). La TSP post-vacunal (tanto en títulos de Acs anti-NA ≥1/40 y ≥1/80) fue significativamente mayor que la TSP pre-vacunal en el grupo de adultos frente a las cepas A/PR/8/1934 y A/California/07/2009 (χ2 de Pearson; p<0.05) (Tabla 22). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la TSP pre y post-vacunal (≥1/40) en mayores de 65 años frente a ninguna de las cepas analizadas. Sin embargo, tomando como correlato de seroprotección un título de Acs anti-NA ≥1/80, la TSP post-vacunal fue significativamente superior con respecto a la TSP pre-vacunal en este grupo de mayor edad frente a las cepas A/PR/8/1934 y A/California/07/2009 (Tabla 22). 135 Figura 38. Tasas de Seroprotección post-vacunales (TSP) frente a cepas del subtipo A(H1N1) y subtipo A(H1N1)pdm09 en adultos y mayores de 65 años utilizando como correlatos de seroprotección títulos de Acs anti-NA de 1/40 y 1/80. 136 Tabla 22. Distribución por grupos etarios de individuos con títulos protectores de Acs anti-NA antes y después de la vacunación antigripal utilizando como correlatos de seroprotección títulos de Acs anti-NA de 1/40 y 1/80. Valores de significación estadística (p-valor) de la tasa de individuos seroprotegidos frente a las cepas gripales A(H1N1) analizadas. Grupo 15-64 años (n1=80) Grupo ≥65 años (n2=80) Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Nº preprotegidos (≥1/40) Nº postprotegidos (≥1/40) p-valor Nº preprotegidos (≥1/40) Nº postprotegidos (≥1/40) p-valor A/PR/8/1934 65 74 0,004 77 79 0,500 A/Weiss/1943 78 78 1,000 80 80 1,000 A/FM/1/1947 74 78 0,125 80 80 1,000 A/Brazil/11/1978 79 79 1,000 80 80 1,000 A/Brisbane/59/2007 79 79 1,000 80 80 1,000 A/California/07/2009 69 79 0,002 77 80 0,250 Grupo 15-64 años (n1=80) Grupo ≥65 años (n2=80) Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Nº preprotegidos (≥1/80) Nº postprotegidos (≥1/80) p-valor Nº preprotegidos (≥1/80) Nº postprotegidos (≥1/80) p-valor A/PR/8/1934 58 64 <0,001 70 76 <0,001 A/Weiss/1943 76 78 0,778 80 80 1,000 A/FM/1/1947 70 74 0,254 77 80 0,843 A/Brazil/11/1978 78 79 0,712 74 79 0,283 A/Brisbane/59/2007 74 78 0,369 77 80 0,777 A/California/07/2009 54 75 0,001 64 78 0,004 137 En términos de seroconversión, la vacunación con la cepa A/California/07/2009 (subtipo A(H1N1)pdm09) indujo una respuesta humoral heterotípica significativa frente a la NA de todas las cepas analizadas del subtipo A(H1N1) clásico, tanto en adultos como en ≥65 años (McNemar; p<0.05). La TSC heteróloga más elevada se observó en el grupo de adultos frente a la cepa A/Weiss/1943 (TSC =31,3%) y frente a la cepa A/Brisbane/59/2007 en los ≥65 años (TSC =36,3%) (Tabla 23). La vacuna frente a la cepa A/California/07/2009 produjo seroconversión homóloga en el 52.5% en adultos (n1=42) y en el 55% en ≥65 años (n2=44). Se realizó un test Chi-cuadrado (α=0,05) de variables independientes para comprobar si la seroconversión inducida por la vacunación fue diferente entre ambos grupos etarios frente a cada una de las cepas gripales A(H1N1) (Tabla 24). La TSC heteróloga fue significativamente mayor en ≥65 años (29 seroconversiones) que en adultos (14 seroconversiones) frente a la cepa A/Brisbane/59/2007, y en adultos (25 seroconversiones) que en ≥65 años (11 seroconversiones) frente a la cepa A/Weiss/1943 (χ2 de Pearson; p<0.05). No se encontraron diferencias significativas en la seroconversión homóloga frente a la cepa pandémica A/California/07/2009 (cepa vacunal) entre ambos grupos etarios (X2 Pearson; p<0.05). 144 cepa A/FM/1/1947 en la temporada 2013-14, hasta una TSC del 52,5% en el grupo de adultos frente a A/Weiss/1943 y una misma TSC del 52,5% en el grupo de mayor edad frente a A/Brisbane/59/2007, ambas TSC observadas en la temporada 2014-15. Tabla 29. Número y porcentaje de individuos adultos y mayores de 65 años que seroconvierten tras la vacunación. Los datos se muestran en función de la temporada estacional y grupo etario frente a cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09. Temporada 2013-2014 Temporada 2014-2015 Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 15-64 años ≥ 65 años 15-64 años ≥ 65 años N (%) N (%) N (%) N (%) A/PR/8/1934 7 (17,5) 4 (10,0) 0 (0,0) 5 (12,5) A/Weiss/1943 4 (10,0) 6 (15,0) 21 (52,5) 5 (12,5) A/FM/1/1947 11 (27,5) 2 (5,0) 6 (15,0) 8 (20,0) A/Brazil/11/1978 4 (10,0) 3 (7,5) 8 (20,0) 12 (30,0) A/Brisbane/59/2007 9 (22,5) 8 (20,0) 5 (12,5) 21 (52,5) A/California/07/2009 16 (40,0) 24 (60,0) 26 (65,0) 20 (50,0) Los valores de las MGTs pre y post-vacunales en ambos grupos etarios así como el incremento de estos títulos (RIC) tras la vacunación están expuestos en la Tabla 30. Las MGTs de Acs anti-NA observadas tras la vacunación en ambos grupos etarios aumentaron con respecto a las MGTs pre-vacunales observadas frente a todas las cepas del subtipo A(H1N1) y frente a la cepa del subtipo A(H1N1)pdm09 en ambas temporadas vacunales consideradas. El valor de la RIC observada en ambas temporadas y grupos etarios fue de al menos un 3,0 frente a la cepa del subtipo A(H1N1) pandémico, cepa incluida en la vacuna, mientras que frente a las cepas del subtipo A(H1N1), la RIC tras la vacunación osciló desde un 1,3 a 2,3 en la temporada 2013-14, y desde una RIC de 1,3 hasta 3,4 en la temporada 2014-15. 145 Tabla 30. Valores de la MGTs y RIC de los sueros pre y post-vacunales en ambos grupos etarios frente a cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 en función de la campaña vacunal antigripal. Temporada 2013-2014 Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Grupo etario MGTs pre-vacunales (IC 95%) MGTs post-vacunales (IC 95%) RIC A/PR/8/1934 1564 62 (45,6-84,7) 78,6 (60,6-105,5) 1,3 ≥ 65 122,7 (82,7-169,4) 190,2 (146,0-249,0) 1,6 A/Weiss/1943 1564 444,6 (330,6-606,5) 697,6 (530,9-927,9) 1,6 ≥ 65 1575,1(1104,5-2227,1) 2306,0 (1737,0-3073,7) 1,5 A/FM/1/1947 1564 180,6 (128,7-253,9) 373,9 (269,0-526,1) 2,1 ≥ 65 476,5 (370,2-602,8) 650,9 (522,7-801,2) 1,4 A/Brazil/11/1978 1564 476,5 (371,1-617,9) 617,9 (484,9-788,9) 1,3 ≥ 65 393,8 (319,9-483,4) 538,0 (415,6-672,2) 1,4 A/Brisbane/59/ 1564 269 (211,1-344,7) 476,5 (373,9-604,8) 1,8 2007 ≥ 65 258,5 (212,8-316,5) 596,9 (479,3-747,7) 2,3 A/California/07/ 1564 100,7 (74,6-140,8) 340,3 (253,5-450,4) 3,4 2009 ≥ 65 113,1 (78,7-154,2) 437,0 (319,9-583,2) 3,6 146 Temporada 2014-2015 Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Grupo etario MGTs pre-vacunales (IC 95%) MGTs post-vacunales (IC 95%) RIC A/PR/8/1934 1564 182,8 (133,8-244,2) 246,7 (191,1-325,5) 1,3 ≥ 65 226,2 (168,3-294,5) 337 (247,2-467,5) 1,5 A/Weiss/1943 1564 307,3 (182,9-498,5) 1057,4 (674,8-1593,6) 3,4 ≥ 65 325,5 (244,1-452,4) 444,6 (325,8-597,8) 1,4 A/FM/1/1947 1564 159,1 (109,6-228,4) 293,3 200,6-415,8) 1,8 ≥ 65 259,8 (190,2-361,1) 452,4 (337,4-599,7) 1,7 A/Brazil/11/1978 1564 422,1 (299,9-575,0) 760,8 (517,6-10085,5) 1,8 ≥ 65 183,7 (130,2-269,0) 400,7 (285,0-556,9) 2,2 A/Brisbane/59/ 1564 183,7 (127,7-270,3) 354,9 (245,5-514,4) 1,9 2007 ≥ 65 193,5 (150,6-247,8) 538 (407,7-741,4) 2,8 A/California/07/ 1564 99,7 (69,7-181,0) 345,4 (248,0-490,8) 3,5 2009 ≥ 65 165,6 (120,9-221,2) 484,8 (364,3-650,1) 3,0 147 Como se ha comentado con anterioridad, los dos grupos de adultos comparados en este trabajo se vacunaron con dos vacunas inactivadas distintas mientras que los dos grupos mayores de 65 años fueron vacunados en las dos temporadas analizadas con la misma vacuna adyuvada. Con esta razón, se realizó una comparación estadística de la TSC y RIC entre las dos temporadas estudiadas en las que estaban implicados ambos grupos etarios (Tabla 31 y 32). La TSC de los títulos de Acs anti-NA frente a la cepa del subtipo A(H1N1)pdm09 fue significativamente mayor en el grupo de adultos de la temporada 2014-2015 (TSC: 65,0%) con respecto a la cohorte de la temporada 2013-2014 (TSC: 40,0%). También se encontraron diferencias significativas en la TSC frente a cepas clásicas del subtipo A(H1N1) estacional. Por un lado, la TSC fue significativamente mayor frente a la cepa A/PR/8/1934 en la temporada 2013-2014 (TSC: 17,5%) con respecto a la temporada 2014-2015 (TSC: 0,0%). Por otro lado, la TSC fue significativamente mayor frente a la cepa A/Weiss/1943 en la temporada 2014-2015 (TSC: 52,5%) con respecto a la temporada 2013-2014 (TSC: 10,0%) (Tabla 31). En mayores de 65 años, la TSC observada frente a las cepas A/FM/1/1947, A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007 fue significativamente mayor en la temporada 2014-2015 (TSC de 20,0%, 30,0% y 52,5% respectivamente) con respecto a la cohorte poblacional de la temporada 20132014 (TSC de 5,0%, 7,5% y 20,0% respectivamente) (Tabla 31). Analizando la comparación de la RIC de las medias geométricas de los títulos de Acs anti-NA en ambos grupos etarios en función de las temporadas vacunales, también se observaron diferencias significativas (Tabla 32). En adultos, la RIC frente a la cepa A/Weiss/1943 fue significativamente mayor en la temporada 2014-2015 (RIC: 3,4) con respecto a la RIC observada en la temporada 2013-2014 (RIC: 1,6). En mayores de 65 años, las RIC observadas frente a las cepas A/Brazil/11/1978 y A/Brisbane/59/2007 en la cohorte vacunada en la temporada 2014-2015 fueron significativamente superiores (RIC:2,2 y RIC:2,8 respectivamente) con respecto a la cohorte poblacional de la temporada 2013-2014 (RIC:1,4 y RIC:2,3 respectivamente). 148 Tabla 31. Valores de significación estadística (p-valor) de la tasa de seroconversión (%-TSC) de los títulos de Acs anti-NA frente a cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 en adultos y mayores de 65 años en función de la temporada vacunal considerada (χ 2 de Pearson; p<0,05). Individuos 15-64 años Individuos ≥ 65 años Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Temp. 2013-14 Temp. 2014-15 p-valor Temp. 2013-14 Temp. 2014-15 p-valor n (%-TSC) n (%-TSC) n (%-TSC) n (%-TSC) A/PR/8/1934 7 (17,5) 0 (0,0) 0,006 4 (10,0) 5 (12,5) 0,723 A/Weiss/1943 4 (10,0) 21 (52,5) <0,001 6 (15,0) 5 (12,5) 0,745 A/FM/1/1947 11 (27,5) 6 (15,0) 0,172 2 (5,0) 8 (20,0) 0,053 A/Brazil/11/1978 4 (10,0) 8 (20,0) 0,210 3 (7,5) 12 (30,0) 0,010 A/Brisbane/59/2007 9 (22,5) 5 (12,5) 0,239 8 (20,0) 21 (52,5) 0,002 A/California/07/2009 16 (40,0) 26 (65,0) 0,025 24 (60,0) 20 (50,0) 0,369 Tabla 32. Valores de significación estadística (p-valor) de la razón de incremento (RIC) de las MGTs de Acs anti-NA frente a cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 en adultos y mayores de 65 años en función de la temporada vacunal considerada (T-Student; p<0,05). Individuos 15-64 años Individuos ≥ 65 años Cepas gripales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 Temp. 2013-14 Temp. 2014-15 p-valor Temp. 2013-14 Temp. 2014-15 p-valor RIC RIC RIC RIC A/PR/8/1934 1,3 1,3 0,998 1,6 1,5 0,453 A/Weiss/1943 1,6 3,4 0,001 1,5 1,4 0,933 A/FM/1/1947 2,1 1,8 0,455 1,4 1,7 0,059 A/Brazil/11/1978 1,3 1,8 0,078 1,4 2,2 0,001 A/Brisbane/59/2007 1,8 1,9 0,359 2,3 2,8 0,006 A/California/07/2009 3,4 3,5 0,271 3,6 3,0 0,039 149  Análisis de la eficacia vacunal según los criterios EMA. Para analizar la eficacia serológica de las vacunas utilizadas en la inducción de Acs anti-NA, se analizaron los parámetros determinados por la EMA (TSP, TSC y RIC). Este análisis permite realizar una aproximación sobre la eficacia de la vacuna estacional frente a la NA, utilizando parámetros que son utilizados únicamente frente a la HA. A pesar de que la EMA determina que para que la vacuna estacional sea eficaz serológicamente debe cumplir únicamente con uno de los tres criterios evaluados, en este trabajo hemos considerado necesario evaluar los tres criterios a la vez. El análisis de la eficacia serológica vacunal para Acs frente a la NA se realizó utilizando los dos correlatos serológicos propuestos, 1/40 y 1/80. El análisis de la eficacia vacunal mostró que la TSP post-vacunal, tanto considerando un valor de seroprotección de 1/40 como de 1/80, fue superior al 90,0% tanto en mayores de 65 años como en adultos en ambas temporadas frente a todas las cepas A(H1N1) estacionales y frente a la cepa A/California/07/2009 del subtipo A(H1N1) pandémico (Tabla 33). La única expepción observada a esta consideración fue la TSP post-vacunal en adultos frente a la cepa A/PR/8/1934. La vacunación cumplió los tres criterios EMA de eficacia vacunal tanto en el grupo de adultos como en los individuos mayores de 65 años frente a la cepa pandémica A/California/07/2009 (Tabla 33). Frente a cepas pertenecientes al subtipo A(H1N1) estacional se cumplieron los siguientes criterios (Tabla 33): - Temporada 2013-2014: o Adultos:  A excepción de la TSP post-vacunal, tanto para valores 1/40 como 1/80, no se cumplió ningún criterio más frente a los virus A(H1N1) clásicos. o Mayores de 65 años:  La RIC fue de 2,3 (superior a 2,0) frente a la cepa A/Brisbane/59/2007. A excepción de la TSP post-vacunal tanto 150 para valores 1/40 como 1/80, no se cumplió ningún criterio más frente a los virus A(H1N1) clásicos. - Temporada 2014-2015: o Adultos:  Tanto la TSC como la RIC fueron superiores al 40% (TSC 52,5%) y a 2,5 (RIC 3,4) respectivamente frente a la cepa A/Weiss/1943.  A excepción de la TSP post-vacunal, tanto para valores 1/40 como 1/80, no se cumplió ningún criterio más frente a los virus A(H1N1) clásicos. o Mayores de 65 años:  Tanto la TSC como la RIC fueron superiores al 30% y a 2,0 respectivamente frente a las cepas A/Brazil/11/1978 (TSC 30,0%; RIC 2,2) y A/Brisbane/59/2007 (TSC 52,5%; RIC 2,8).  A excepción de la TSP post-vacunal tanto para valores 1/40 como 1/80, no se cumplió ningún criterio más frente a los virus A(H1N1) clásicos. 151 Tabla 33. Valores de tasa de seroprotección (TSP≥1/40 y ≥1/80), tasa de seroconversión (TSC) y Razón de Incremento (RIC) siguiendo los criterios EMA de eficacia serológica vacunal frente a las cepas de gripe A(H1N1) y cepa A(H1N1) pandémica, distribuidos en los grupos etarios y temporadas vacunales. *Color rojo: Valor superior al cut-off del criterio EMA. Criterio EMA A/PR/8/1934 A/Weiss/1943 A/FM/1/1947 A/Brazil/11/1978 A/Brisbane/59/2007 A/California/07/2009 Temporada 2013-2014 15-64 años TSP≥1/40 87,5 100,0 97,5 100,0 100,0 97,5 TSP≥1/80 62,5 100,0 95,0 100,0 100,0 92,5 TSC 17,5 10,0 27,5 10,0 22,5 40,0 RIC 1,3 1,6 2,1 1,3 1,8 3,4 ≥ 65 años TSP≥1/40 97,5 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 TSP≥1/80 97,5 100,0 100,0 100,0 100,0 97,5 TSC 10,0 15,0 5,0 7,5 20,0 60,0 RIC 1,6 1,5 1,4 1,4 2,3 3,6 Criterio EMA A/PR/8/1934 A/Weiss/1943 A/FM/1/1947 A/Brazil/11/1978 A/Brisbane/59/2007 A/California/07/2009 Temporada 2014-2015 15-64 años TSP≥1/40 97,5 95,0 97,5 97,5 97,5 100,0 TSP≥1/80 97,5 95,0 90,0 97,5 95,0 95,0 TSC 0,0 52,5 15,0 20,0 12,5 65,0 RIC 1,3 3,4 1,8 1,8 1,9 3,5 ≥ 65 años TSP≥1/40 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 TSP≥1/80 92,5 100,0 100,0 97,5 100,0 97,5 TSC 12,5 12,5 20,0 30,0 52,5 50,0 RIC 1,5 1,4 1,7 2,2 2,8 3,0 152 Análisis filogenético del gen de la Neuraminidasa (N1) de las cepas gripales Con el objetivo de conocer la distancia genética y la relación filogenética de las cepas de gripe A(H1N1) utilizadas en los estudios serológicos, se realizó un análisis de las secuencias del gen de la NA de las cepas gripales incluidas en el estudio. Se realizaron dos análisis filogenéticos. En el primero, se incluyó el gen de la NA de las cepas del estudio y además otras cepas de gripe representativas del resto de NAs existentes (Figura 40). El segundo análisis incluyó únicamente las cepas de gripe A(H1N1) que fueron utilizadas en los estudios serológicos (Figura 41). La similitud genética (% de similitud/100) del gen de la NA entre los diferentes virus de la gripe A(H1N1) y A(H1N1) pdm09 analizados se describen en la Tabla 34. La homología genética observada en el gen de la NA entre las cepas del subtipo A(H1N1) clásico fue superior al 85%. La homología genética más elevada se observó entre las cepas A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947 (96,7%) y la más baja entre las cepas A/PR/8/1934 y A/Brisbane/59/2007 (85,6%). La cepa pandémica A/California/07/2009 (subtipo A(H1N1)pdm09) mostró una homología genética con las cepas pertenecientes al subtipo A(H1N1) clásico de entre el 72,1% (A/Brisbane/59/2007) y el 76,4% (A/FM/1/1947). 153 Figura 40. Árbol filogenético del gen de la NA de las cepas gripales A(H1N1) incluidas en el estudio y de cepas pertenecientes al resto de subtipos de NA descritos. 256 se comporta como un factor de protección frente a la infección gripal, independientemente del título de Acs anti-HA en el suero de los mismos (73). Existen trabajos que determinan una correlación entre el título de Acs hemaglutinantes (Acs anti-HA) y el nivel de protección que presenta una persona ante la infección por un virus de la gripe. En relación a ello, se ha considerado tradicionalmente que aquellos títulos de Acs anti-HA por encima del valor 1/40 se consideran un correlato de protección. La evidencia científica de este correlato proviene de un ensayo con virus vivos de gripe realizado en 1972 por Hobson y colaboradores (62) que estableció que un título de Acs anti-HA en suero previo a la inoculación del virus de entre 1/18 y 1/36 estaba asociado con un 50% de protección contra la infección. Un estudio similar demostró una tasa de infección del 29% en aquellos individuos con títulos de Acs de 1/40 a 1/60 (175). Sin embargo, históricamente otros estudios dentro de este ámbito de investigación in vivo mediante la inoculación de virus gripales han sido menos concluyentes (176–178). Por otra parte, cada vez son más los estudios que demuestran que para alcanzar esos niveles de protección se requieren de títulos hemaglutinantes más altos (62,175), e incluso trabajos que justifican que la protección prevista no es completa y que otros correlatos, como el título de Acs anti-NA, pueden ofrecer una información predictiva adicional importante sobre la protección que si se analizan únicamente los títulos de Acs anti-HA (62,114,129). En este trabajo se quiso conocer si la presencia de un título hemaglutinante protector (Acs anti-HA ≥1/40) estaba correlacionado con un mayor título de Acs antiNA en la población analizada. Con este objetivo, se compararon los títulos de Acs antiNA observados entre aquellos individuos que presentaban títulos hemaglutinantes protectores frente a aquellos individuos que presentaban títulos hemaglutinantes no protectores. No se observaron diferencias significativas en la magnitud de los títulos de Acs anti-NA entre ambas categorías en ninguno de los dos grupos etarios analizados, mostrando una vez más la independencia de la seroprotección entre ambos antígenos. Los datos de este trabajo muestran que la protección analizada únicamente mediante la determinación de títulos de Acs hemaglutinantes no es completa y que otros 257 correlatos, como pueden ser los Acs anti-NA, pueden ofrecer una información predictiva adicional. Con relación a la inmunidad basada en la NA, varios autores (64,70,72,73,179) han demostrado que los títulos de Acs anti-NA se correlacionan con la protección frente a la enfermedad gripal en humanos. No obstante, por el momento no se han definido correlatos de protección para los títulos de Acs anti-NA así como actualmente existen para los títulos de Acs hemaglutinantes (62,120,180). Atendiendo a esta consideración, en virtud de los resutados observados en este trabajo, se quiso hacer una aproximación de qué título de Acs anti-NA se podía correlacionar con el correlato de seroprotección aceptado actualmente frente a la HA (≥1/40) frente a cada una de las cepas gripales analizadas. Para ello, en cada grupo etario se segregó la población en aquellos individuos que poseían Acs a títulos protectores frente a la HA y aquellos que no, y se correlacionaron con los Acs anti-NA utilizandoun análisis de curvas ROC (área bajo la curva). Mediante este test se pudo estimar que en el grupo de individuos mayores de 65 años, el título de Acs anti-NA que puede considerarse como seroprotector frente a las cepas A/PR/8/1934 y A/FM/1/1947 es 1/240 y 1/480 respectivamente. No se encontraron correlaciones significativas frente al resto de virus en mayores de 65 años, ni frente a ningún virus en adultos. A tal efecto, de estos resultados se puede inferir que para alcanzar un nivel de seroprotección en términos de Acs anti-NA frente a las cepas A/PR/8/1934 y A/FM/1/1947 en mayores de 65 años, se van a necesitar generalmente títulos de Acs anti-NA muy superiores a aquellos valores requeridos para la HA (tomando como correlato para la HA un título ≥1/40). Como limitación, esta consideración es únicamente una aproximación para conocer a partir de qué nivel de Acs anti-NA, estos títulos pueden considerarse como protectores en la población. No obstante, hasta donde se conoce, es de las primeras aproximaciones en las que se pretende establecer equivalencias entre los títulos de Acs observados frente a la HA y la NA para determinar de forma indirecta los correlatos de protección necesarios para la NA. Por ello, se hacen necesarias futuras investigaciones en este campo con el objeto de comprobar algunos indicadores como son los correlatos de seroprotección de la NA 258 para distintos grupos de población y estudiar en detalle la relación de los Acs frente a la NA y los observados frente a la HA. Este es uno de los primeros trabajos en donde se realiza una aproximación para definir los correlatos de seroprotección para la NA. No obstante, se hacen necesarios además estudios observacionales poblacionales donde se determine la eficacia y efectividad de una hipotética vacuna contra la gripe que contenga una cantidad estandarizada de NA para conseguir de este modo definir qué títulos de Acs anti-NA se correlacionan con la protección. Son necesarias futuras investigaciones en este campo con el objeto de comprobar algunos indicadores como son los correlatos de seroprotección de la NA para distintos grupos de población y estudiar en detalle la relación de los Acs frente a la NA y los observados frente a la HA. En conclusión, la correlación de Acs anti-NA y anti-HA utilizando el correlato de protección Acs ≥1/40 muestra una correspondencia baja, demostrando que la dinámica de producción de Acs anti-NA ocurre de forma independiente de la respuesta a la HA, por lo que se necesita formular un correlato de protección propio para los Acs títulos de Acs anti-NA. Los títulos de HA son inferiores por lo general a los títulos de NA para cualquier correlación que se trate de establecer. No se ha podido encontrar un título de Acs HA que anticipe la presencia de Acs anti-NA a títulos ≥1/40. Análisis comparativo entre los Acs post-vacunales anti-NA y anti-HA Otro de los objetivos del presente trabajo fue comparar la respuesta humoral frente a la HA así como frente a la NA tras la vacunación estacional de la población en función del tipo de vacuna antigripal administrada en la población analizada. El tipo de vacuna que había recibido la población incluida en el estudio fue del tipo de vacuna trivalente inactivada en ambas temporadas vacunales consideradas. Concretamente, en el grupo reclutado de 15-64 años, todos los individuos se vacunaron con vacuna inactivada no adyuvada en las dos campañas vacunales consecutivas. Por otro lado, los mayores de 65 años fueron vacunados con vacuna inactivada de tipo adyuvada. 259 Los resultados de este trabajo muestran que la vacuna sin adyuvante indujo una mayor respuesta de incremento entre los títulos pre y post-vacunales respecto a la vacuna adyuvada frente a las cepas A/Weiss/1943 y A/FM/1/1947. Esta diferencia parece estar vinculada a que la población ≥65 años que recibió la vacuna de tipo adyuvada ya presentaba títulos muy altos de Acs anti-NA previos a la vacunación frente a estas dos cepas, por lo que no se concluye que la vacuna adyuvada presente un menor efecto inductor de Acs frente a HA ni NA que las inactivadas no adyuvadas. Tampoco parece estar implicado en este caso el fenómeno de la inmunosenescencia, ya que considerando que el título pre-vacunal es tan elevado, es muy difícil incrementar sustancialmente el título de Acs. Esto parece haber limitado el aumento de los títulos en este grupo de mayor edad, por lo que no sólo el tipo de vacuna administrada parece relevante en la respuesta de Acs anti-NA tras la vacunación antigripal, sino además la inmunidad previamente adquirida frente a las primeras infecciones durante la vida de un individuo, demostrando de nuevo que el pecado original antigénico está estrechamente relacionado con la respuesta serológica basada en la NA y la HA. En general, los títulos de Acs anti-NA eran más altos frente a aquellos virus que circulaban durante la infancia de los individuos examinados, lo que sostiene la importancia del pecado antigénico original. De este modo, este fenómeno pudo mitigar la respuesta tras la vacunación frente a dichas cepas, independientemente del tipo de vacuna administrada. Será interesante determinar en detalle en estudios futuros, de igual modo que se ha estudiado para los Acs hemaglutinantes, cómo los títulos de Acs anti-NA se generan tras la vacunación con vacunas estandarizadas para la NA, y cómo los adyuvantes influirían en la inmunidad contra la NA incluída en la vacuna. No obstante, incialmente habría que contar con vacunas antigripales diseñadas con un contenido estandarizado de NA vacunal. Comprender las características de la respuesta específica de la NA ayudará a los investigadores a diseñar vacunas que induzcan títulos altos y de reacción cruzada de Acs anti-NA en todos los grupos de edad y contra todos los subtipos. En conclusión, los datos de este trabajo ponen de manifiesto la presencia conjunta de los Acs anti-HA así como de Acs anti-NA en la respuesta humoral homóloga y heteróloga frente a los subtipos de gripe A(H1N1) y A(H1N1)pdm09 tras la vacunación 260 estacional antigripal. No sólo el tipo de vacuna administrada parece relevante en ambos tipos de respuesta de Acs tras la vacunación antigripal, sino además la inmunidad previamente adquirida frente a las primeras infecciones durante la vida de un individuo. Limitaciones del estudio En opinión del autor y directores de este trabajo, se cree conveniente apuntar ciertas limitaciones encontradas durante la realización del presente trabajo y que se piensa que pueden contribuir a una mejor interpretación de los resultados obtenidos, además de servir de ayuda para posibles futuras investigaciones en este campo. Limitaciones con el ensayo serológico ELLA para determinar el título de Acs anti-NA Entre las limitaciones de este estudio, cabe señalar que se han utilizado virus vivos completos (a excepción de la cepa A/PR/8/1934 que se utilizó inactivado con formas nativas de HA y NA de cepas humanas estacionales A(H1N1) y A(H1N1)pdm09. Según algunos autores, la determinación del título de Acs anti-NA en el ensayo ELLA puede ser interferido por Acs anti-HA preexistentes a través de diferentes mecanismos de impedimento estérico entre los Acs anti-HA y la NA (181), aumentando artificialmente los títulos de Acs anti-NA. Por ello, algunos resultados de nuestro estudio pueden sobreestimar los títulos de Acs anti-NA por la posible presencia de Acs contra la hemaglutinina H1 (126). Para solventar esta limitación, el protocolo del ensayo ELLA estandarizado por la iniciativa CONSISE recomienda utilizar virus quiméricos H6Nx para disponer de una hemaglutinina exótica frente a la cual el ser humano no disponga de Acs anti-HA. Sin embargo, a juicio de los autores de esta tesis, el uso de virus quiméricos que contienen hemaglutinina exótica como H6Nx para la evaluación de Acs anti-NA también puede estar limitado por la presencia de Acs heterotípicos en la población analizada. En un trabajo previo del Dr. I. Sanz y colaboradores se demostró que un porcentaje moderado de la población ≥65 años tiene Acs heterotípicos a títulos protectores contra 261 la cabeza globular de la HA de virus de la gripe no estacionales como el H5 y el H9 (141). Estos Acs estaban presentes como resultado de una respuesta cruzada con Acs frente a virus de gripe estacional, como H1 y H2, durante su vida. Estos Acs heterotípicos también han sido observados por otros autores (105). Los subtipos H5 y H9 pertenecen al clado 1 de la HA y presentan una homología genética similar o incluso menor (en el caso del subtipo H9) que el subtipo H6 con respecto a los virus H1 y H2 de la gripe estacional humana. Dado que estos Acs heterotípicos se encuentran comúnmente en poblaciones expuestas y vacunadas, es difícil evaluar el grado de interacción de estos Acs heterotípicos en el ensayo ELLA cuando se utilizan hemaglutininas exóticas y nativas. Debido a esto, se decidió finalmente utilizar los virus nativos completos para evaluar con exactitud que ocurre a nivel serológico frente a los dos antígenos principales de la superficie de los virus de la gripe, la HA y la NA. A pesar de que los Acs anti-HA podrían estar aumentando artificialmente el título de Acs anti-NA en este estudio por impedimento estérico, en opinión del autor y directores de este trabajo, este efecto es limitado. En este sentido, vale la pena comentar algunos aspectos de la arquitectura de la envoltura de los virus de la gripe en relación con la HA y la NA. En primer lugar, algunos autores sugieren que la capacidad de neutralización de los Acs anti-HA específicos del tallo de la hemaglutinina podría verse limitada por la disposición de la HA en la superficie del virus de la gripe, debido al limitado accede estos Acs a ciertos epítopos antigénicos de la HA (13,156). La compactación de las hemaglutininas entre ellas en la superficie del virus gripal puede limitar el acceso de los Acs contra el tallo, hecho que ya ha sido discutido con respecto a la limitación del uso de estos Acs y el diseño de una futura vacuna universal basada en la región conservada del tallo de la HA (182). Este problema también afecta al obstáculo estérico entre la HA y la NA, ya que este efecto puede ser mitigado por el acceso limitado de los Acs al tallo. Por otro lado, el tallo de la HA es menos inmunogénico que la cabeza globular de la HA, por lo que no hay tanta diversidad de Acs como contra la cabeza globular, y su producción no es tan numerosa (183). Mientras que algunos autores demuestran por métodos computacionales que la estructura de la HA en la superficie del virión no limita el acceso de los Acs específicos del tallo a los epítopos próximos a 262 la membrana (172), la subdominancia inmunogénica de la región del tallo de la HA implica una menor producción y variedad de Acs con respecto a la cabeza globular HA. En segundo lugar, la disposición de HA y NA en la superficie del virión se produce en forma de parches, en los que se disponen varias proteínas de la misma clase (HA en un lado y NA en otro). En estos parches hay varias NA juntas y sólo las que forman parte delexterior de un parche son las que pueden sufrir el efecto estérico con las HA que están inmediatamente cerca de NA. De hecho, en algunos casos incluso las NA están situadas cerca de un canal de iones o de proteína M2. Por ello, el efecto estérico producido por los Acs anti-HA presentes en el suero humano sólo se produciría contra las NA situadas fuera de estos parches. Falta de consenso para determinar correlatos de protección referidos a los títulos de Acs anti-NA Otra de las observaciones a destacar en este trabajo es que se han utilizado dos correlatos de seroprotección frente a la NA que no están aceptados actualmente y que dependen de los ya propuestos para la HA. En nuestro trabajo se utilizó un título ≥1/40 como correlato de seroprotección frente a la NA, completando el estudio con un correlato ≥1/80 para verificar títulos más elevados. Existen algunos estudios que han determinado correlaciones de seroprotección equivalentes entre ambas proteínas (73,108,144), por lo que los resultados de este estudio proporcionan información sobre este tipo de comparación con los estudios ya disponibles. El análisis de los Acs anti-NA en un modelo humano previo a la vacunación y los inducidos por la vacuna estacional en este trabajo de investigación, ofrecen un punto de vista interesante sobre cómo se produce la respuesta inmunitaria humoral en un modelo humano y en condiciones realestras la vacunación. La publicación de nuevos estudios como éste permitirá la comparación y el análisis de la respuesta de Acs anti-NA en términos de protección humoral y eficacia serológica de la vacuna. 263 Virus gripales El presente trabajo se ha limitado al estudio de las infecciones por gripe A (H1N1). Sin embargo, los hallazgos deben aplicarse a otras infecciones por el virus de la gripe A y posiblemente a las infecciones por gripe B en humanos. El título de Acs anti-HA ≥1/40 en suero se ha establecido como un correlato de seroprotección frente a todos los virus de la gripe de interés humano, como A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2) y B (108,185,186). Se ha demostrado que los Acs anti-NA en suero predicen la protección frente a la infección y la enfermedad por el virus de la gripe A(H3N2) en estudios con modelos humanos (108). También se ha demostrado que los Acs anti-HA y anti-NA presentes en secreciones nasofaríngeas se correlacionan con la seroprotección a la infección de gripe en personas que se exponen a los virus de la gripe A y B (70,187). 264 La presentación de esta tesis amplía los hallazgos sobre las respuestas de Acs antiHA y anti-NA frente a virus gripales del subtipo clásico A(H1N1) y subtipo pandémico A(H1N1) que se producen tras la vacunación antigripal estacional. Este trabajo añade un valor importante para que los anticuerpos anti-NA puedan considerarse como un predictor independiente de inmunidad humoral cuando éstos están presentes. Esto es interesante porque la proteína NA presenta una tasa de variación antigénica más baja que la HA, de modo que la inmunidad inducida por la NA podría ser de mayor duración y de más amplio espectro (13,16,188). También se ha demostrado en este trabajo que la inmunización con la NA en cantidad no estandarizada presente en las actuales vacunas induce una seroprotección que se extiende a otros virus no incluidos en la vacuna. Por estas razones, es interesante considerar la posibilidad de desarrollar vacunas contra la gripe estandarizadas para el contenido de NA que sean capaces de producir dichos Acs. No sólo ello podría aumentar la protección conferida tras la vacunación en los años en que la HA de las cepas incluidas en la vacuna coincida con los virus circulantes, sino que también existiría la posibilidad de obtener cierta protección en aquellos años en los que exista un mismatch antigénico de la HA, pero con poca deriva antigénica de la NA. 265 Conclusiones 272 273 Rendimiento científico Artículo internacional Título: Heterotypic Neuraminidase antibodies against different A(H1N1) strains are elicited after seasonal influenza vaccination. Autores: Jose Manuel Mendez-Legaza, Raúl Ortiz de Lejarazu, Iván Sanz. Revista: Vaccines 2019, 7(1), 30; https://doi.org/10.3390/vaccines7010030 (ISSN 2076-393X) Indexada en: Science Citation Index Expanded (SCIE) y Scopus. Cuartil: Q1 en la categoría “Enfermedades infecciosas”, Q1 en la categoría “Inmunología”. Índice de impacto (Scopus 2017): 4.94 Artículo en revista académica Título: Epidemia de gripe en la temporada 2016-17. Autores: Raúl Ortiz de Lejarazu Leonardo, Jose Manuel Méndez Legaza. Revista: Revista Clínica 2017 (26), 11-20; https://doi.org/10.24197/cl.26.2017.11-20 (ISSN 0301-0392). Academia de Alumnos Internos de la Facultad de Medicina de Valladolid 274 Comunicaciones a congresos internacionales  Role of antibodies against neuraminidase protein against A/H1N1 influenza viruses. Mendez-Legaza JM, Sanz I, Rojo S, Ortiz de Lejarazu R. XXVIII European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID). Madrid, España. 21 al 24 de abril. 2018.  Heterotypic humoral response against N1 neuraminidase after flu seasonal vaccination. Mendez-Legaza JM, Sanz I, Rojo S, Ortiz de Lejarazu R. XXVIII European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID). Madrid, España. 21 al 24 de abril. 2018.  Neuraminidase-inhibiting antibodies against new and classic A/H1N1 flu strains in adults and elderly. Mendez J, Sanz I, Lopez I, Rojo S, Ortiz de Lejarazu R. WHO Meetings. Ginebra, Suiza. 2017.  Hospitalization caused by laboratory confirmed influenza in the postpandemic period. Sanz I, Rojo S, Mendez-Legaza J, Tamames S, Eiros JM, Ortiz de Lejarazu R. European Scientific Working group of Influenza. Riga, Letonia. 2017. 275 Comunicaciones a congresos nacionales  Estudio de la respuesta de anticuerpos frente a la neuraminidasa en población vacunada con vacuna antigripal fraccionada y adyuvada. J.M. Méndez Legaza, I. Sanz Muñoz, S. Rojo Rello y R. Ortiz de Lejarazu. Presentación oral. XXIII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Madrid, 23-25 de mayo de 2019.  Estudio de la respuesta de anticuerpos frente a hemaglutinina en población vacunada con vacuna antigripal fraccionada y adyuvada. J.M. Méndez Legaza, I. Sanz Muñoz, S. Rojo Rello y R. Ortiz de Lejarazu. XXIII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Madrid, 23-25 de mayo de 2019.  Comparación de la respuesta a la vacuna antigripal mediante el análisis de anticuerpos frente a hemaglutinina y neuraminidasa J.M. Méndez Legaza, I. Sanz Muñoz, S. Rojo Rello y R. Ortiz de Lejarazu. XXIII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Madrid, 23-25 de mayo de 2019. 276  Respuesta humoral específica y heteróloga frente a la neuraminidasa de virus de la gripe A/H1N1 Y A/H1N1pdm09 en individuos vacunados. J.M. Méndez Legaza, I. Sanz Muñoz, S. Rojo Rello y R. Ortiz de Lejarazu. Presentación oral. XXII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 24-26 de mayo de 2018.  Análisis global de la eficacia vacunal frente a gripe A y B medida por seroconversión. M. Justel, R. Almansa, I. Sanz, J.M. Méndez, J.E. Lozano, S. Rojo, M. Cardaba, T. Vega, J.F. Bermejo-Martín y R. Ortiz de Lejarazu. Presentación oral. XXII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 24-26 de mayo de 2018.  Epidemiología de las infecciones por gripe en la temporada 2017-2018. I. Sanz Muñoz, S. Rojo Rello, A. López Cabo, J.M. Méndez Legaza y R. Ortiz de Lejarazu Leonardo. XXII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 24-26 de mayo de 2018.  Análisis de la eficacia vacunal frente a gripe A/H1N1 Y A/H3N2 por seroconversión. M. Justel, R. Almansa, I. Sanz, J.M. Méndez, L. Sánchez, J.E. Lozano, S. Rojo, T. Vega, J.F. Bermejo-Martín y R. Ortiz de Lejarazu. 277 XXII Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 24-26 de mayo de 2018.  Prevalencia de anticuerpos Anti-neuraminidasa frente a virus de la gripe en población adulta y mayor de 65 años. J. M. Méndez Legaza, I. Sanz Muñoz, I. López Ramos, S. Rojo Rello, R. Ortiz de Lejarazu Leonardo. Presentación oral. XXI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 11-13 de mayo de 2017.  Seroprotección frente a gripe A H1N1 pandémico y estacional en Castilla y León en las temporadas gripales 1990-1991 a 2014-2015. M. Justel, I. Sanz, R. Almansa, I. López, J.M. Méndez, M. Martín, J.E. Lozano, S. Rojo, T. Vega, J.F. Bermejo‑Martín y R. Ortiz de Lejarazu. Presentación oral. XXI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 11-13 de mayo de 2017.  Seroprotección frente a gripe A H3N2 en Castilla y León en las temporadas gripales 1990-1991 a 2014-2015. M. Justel, R. Almansa, I. Sanz, I. López, J.M. Méndez, M. Martín, J.E. Lozano, S. Rojo, T. Vega, J.F. Bermejo-Martín y R. Ortiz de Lejarazu. XXI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Málaga, 11-13 de mayo de 2017. 278 279 280 281 288 289 290 291 292 293 Anexos 294 ANEXO I Consentimiento informado para la extracción de una muestra de suero prevacunal y otra post-vacunal con destino al Programa de Vigilancia Integrada de la Gripe La Consejería de Sanidad de la Junta de Castilla y León realiza anualmente el seguimiento y control de la gripe en nuestra Comunidad Autónoma. Entre los estudios que implica este seguimiento se encuentra la determinación del efecto de la vacunación antigripal en la población, cuyos resultados son de extraordinaria importancia para mejorar la eficacia de las campañas de vacunación de cada temporada. Para ello, se seleccionan voluntarios entre aquellas personas que van a ser vacunadas, en las que se extrae una muestra de suero inmediatamente antes de vacunarse y otra entre cuatro y seis semanas después de la vacunación con el fin de medir el efecto alcanzado. Los análisis de sangre, que requerirán su participación voluntaria y que será realizado por personal sanitario en el Centro de Salud, Consultorio Local o el Centro de Residencia, no conllevan ningún tipo de riesgo ni incomodidad para Ud., salvo la toma de la muestra (dolor durante el procedimiento de extracción, pequeña pérdida de sangre y posible aparición de hematoma en el lugar de la punción). Se adoptarán las medidas oportunas para garantizar la intimidad y confidencialidad de todos los datos personales que se obtengan para la realización de este estudio, sometiéndose al régimen de protección establecido en la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de datos de carácter personal y demás normas reglamentarias que la desarrollan. Una vez realizados los análisis en el Centro de Gripe de Valladolid, la muestra sobrante será eliminada. Usted podrá solicitar y obtener gratuitamente información sobre sus datos de carácter personal sometidos a tratamiento, mediante petición o solicitud dirigida a la Dirección General de Salud Pública de la Consejería de Sanidad, formulada por cualquier medio que garantice su identificación y el fichero a consultar. Del mismo modo podrá solicitar la rectificación o cancelación de datos cuando estos fueran inexactos, incompletos, inadecuados o excesivos. ............................................a ...........de.......................de 2016 D/Dña:...................................................................................declaro que he recibido y comprendido la información que me ha sido facilitada sobre el examen clínico que se me va a realizar y los objetivos del mismo, que conozco la posibilidad de revocar en cualquier momento mi consentimiento y que he recibido copia de este documento. Estando de acuerdo con todo lo que se me ha informado y con lo expuesto en este documento, CONSIENTO en la realización del examen y el estudio a realizar. Firma del seleccionado Legislación aplicable: Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal, BOE nº 298 de 14-12-1999; Ley 41/2002, de 14 de noviembre, básica reguladora de la autonomía del paciente y de derechos y obligaciones en materia de información y documentación clínica, BOE nº 274 de 15-11-2002; Ley 8/2003, de 8 de abril, sobre derechos y deberes de las personas en relación con la salud, 295 BOCYL nº 71 de 14-04-2003; Orden SBS/1325/2003, de 3 de septiembre, por la que se publican las Guías de información al usuario, BOCYL nº 205 de 22-10-2003. ANEXO II PROGRAMA DE VIGILANCIA INTEGRADA DE LA GRIPE RED CENTINELA SANITARIA DE CASTILLA Y LEÓN FICHA DE REMISIÓN DE SUEROS PREVACUNALES Y POSTVACUNABLES 2016-2017 ETIQUETA Qué se debe recoger: *5 prevacunales *5 postvacunales, 4 semanas después de la vacunación. IDENTIFICACIÓN: Apellidos: ______________________________ Nombre: ___________________ Edad: ____ Sexo: ____ EXTRACCIÓN: 1. • Prevacunal Fecha: __/__/__ Número código de barras (a etiqueta) 2. • Postvacunal Fecha: __/__/__ Número código de barras (o etiqueta) POBLACIÓN DE RIESGO: 1.• Sano 2.• Embarazada 2.• Patología de riesgo 3.• Otros: especificar ____________________ ____________________ VACUNACIÓN: Fecha: _____/_______/________ Vacuna: _________________________________ Lote: ____________ 296 297 Bibliografía 304 72. Monto AS, Petrie JG, Cross RT, Johnson E, Liu M, Zhong W, et al. Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection. J Infect Dis. 2015;212:1191-9. 73. 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