Análisis de la influencia de diversos aniones en biopolímeros para dosificación de fármacos

FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Química Análisis de la influencia de diversos aniones en biopolímeros para dosificación de fármacos. Autor/a: Daniel Carreño Calzada Tutor/es/as: Dr. Israel González de Torre Dra. Silvia Valverde Bastardo Año 2023 1 ÍNDICE 1. LISTADO DE ABREVIATURAS............................................................................................................. 3 2. RESUMEN DEL TRABAJO .................................................................................................................. 4 RESUMEN ............................................................................................................................................ 4 ABSTRACT ............................................................................................................................................ 4 3. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 6 3.1. Dosificación de fármacos. ........................................................................................................ 6 3.2. Elastina .................................................................................................................................... 7 3.3. Polímeros Tipo Elastina (ELP) .................................................................................................. 7 3.4. La naturaleza termosensible y el comportamiento autoensamblable de los ELR ................... 8 3.5. Polímero de estudio .............................................................................................................. 10 4. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO .................................................................................................... 12 5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 13 5.1. Materiales .............................................................................................................................. 13 5.2. Instrumentos ......................................................................................................................... 15 5.3. Compuestos ........................................................................................................................... 16 5.4. Software ................................................................................................................................ 16 5.5. Métodos ................................................................................................................................ 17 5.5.1. Preparación de las disoluciones ........................................................................................ 17 5.5.2. Turbidimetría ..................................................................................................................... 17 5.5.2.1. Preparación de las muestras ..................................................................................... 18 5.5.2.2. Medida....................................................................................................................... 18 5.5.3. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ......................................................................... 19 5.5.3.1. Preparación de las muestras ..................................................................................... 20 5.5.3.2. Medida....................................................................................................................... 20 5.5.4. Dispersión de la luz electroforética (ELS) y Dispersión de luz dinámica (DLS)................... 20 5.5.4.1. Dispersión de la luz electroforética (ELS) .................................................................. 20 5.5.4.2. Dispersión de luz dinámica (DLS) ............................................................................... 21 5.5.4.3. Preparación de las muestras ..................................................................................... 22 5.5.4.4. Medida....................................................................................................................... 22 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................ 23 6.1. Turbidimetría ......................................................................................................................... 23 6.2. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ............................................................................. 26 6.3. Zetasizer ................................................................................................................................. 29 6.3.1. Tamaño de partícula (DLS) ................................................................................................. 29 6.3.2. Dispersión de la luz electroforética (ELS) .......................................................................... 34 2 7. CONCLUSIONES.............................................................................................................................. 38 8. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 40 9. LISTADO DE TABLAS Y FIGURAS ..................................................................................................... 43 TABLAS ............................................................................................................................................... 43 FIGURAS ............................................................................................................................................. 43 10. ANEXO ........................................................................................................................................... 46 10.1. Turbidimetría ......................................................................................................................... 46 10.2. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ......................................................................... 52 10.3. Zetasizer: DLS ..................................................................................................................... 61 10.4. pH de las muestras. ........................................................................................................... 87 10.5. S50I60 ................................................................................................................................ 87 10.5.1. Tamaño de partícula y Pdi ................................................................................................. 87 10.5.2. Potencial z .......................................................................................................................... 88 3 1. LISTADO DE ABREVIATURAS DLS Dispersión de luz dinámica ELS Dispersión de la luz electroforética DSC Calorimetría diferencial de barrido ELP Elastin Like Polymers ELR Elastin Like Recombinamers Tt Temperatura de transición Pdi Índice de polidispersidad mQ Agua Ultrapura 4 2. RESUMEN DEL TRABAJO RESUMEN Este trabajo, llevado a cabo en las instalaciones del grupo de investigación BIOFORGE, tiene como objetivo observar la variación de la temperatura de transición inversa del recombinámero de elastina S50I60 en distintas impurezas (disoluciones acuosas de distintas sales). Dicho polímero se obtiene mediante un proceso de fermentación con bacterias Escherichia coli ya modificadas genéticamente para introducir el código de ADN que dará lugar al recombinámero tipo elastina (ELR) deseado. Se ha estudiado la temperatura de transición del recombinámero de elastina S50I60 en diversas impurezas mediante distintos métodos: turbidimetría, dispersión de luz dinámica (DLS), dispersión de la luz electroforética (ELS) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). El estudio de la influencia de dichas sales sobre el polímero de interés es muy útil para la dosificación de fármacos, ya que este tipo de polímeros son muy importantes en industria de tejidos, liberación, etc. Con potencial aplicación como es la formación de nanopartículas, hidrogeles o películas. Siendo las nanopartículas especialmente interesantes debido a sus múltiples aplicaciones en biomedicina como nanovacunas, biosensores o administración de fármacos. ABSTRACT This work, carried out at the facilities of the research group BIOFORGE, aims to observe the variation of the inverse transition temperature of the elastin-like recombinamer S50I60 in different impurities (aqueous solutions of different salts). This polymer is obtained through a fermentation process with genetically modified Escherichia coli bacteria to introduce the DNA code that will give rise to the desired Elastin Like Recombinamer (ELR). The transition temperature of the elastin-like recombinamer S50I60 has been studied in various impurities using different methods: turbidimetry, dynamic light scattering (DLS), electrophoretic light scattering (ELS), and differential scanning calorimetry (DSC). Studying the influence of these salts on the polymer of interest is very useful for drug dosing, as these types of polymers are crucial in the tissue industry, drug release, etc. They have 5 potential applications such as the formation of nanoparticles, hydrogels, or films, with nanoparticles being particularly interesting due to their multiple biomedical applications such as nanovaccines, biosensors, or drug delivery. 6 3. INTRODUCCIÓN Los biopolímeros son materiales poliméricos o macromoleculares sintetizados por los seres vivos y, por tanto, presentes en ellos. Los tres biopolímeros principales son: proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. También se clasifican como biopolímeros aquellos materiales sintéticos que son biocompatibles con los seres vivos. [1] En medicina se investigan las aplicaciones de biomateriales derivados de bloques de copolímeros proteicos, en particular los bloques de copolímeros recombinantes de elastina, cuya microestructura se puede modificar y obtener diversas formas como: partículas, películas, geles o fibras [3]. Los nuevos biopolímeros con propiedades innovadoras y avanzadas pueden desempeñar un papel especialmente importante en áreas como la administración controlada de fármacos, la ingeniería de tejidos o en la medicina regenerativa. [4] 3.1. Dosificación de fármacos. Actualmente, los ELR tienen una importancia muy grande en varios campos de la medicina. Gracias a ellos se han desarrollado varias formas de administrar medicamentos en forma de nano/micropartículas, hidrogeles y películas [3]. Las nanopartículas, por ejemplo, han resultado ser una herramienta esencial para muchas aplicaciones como biosensores o nanovacunas, pero sobre todo en la administración de fármacos ya que mejoran el rendimiento del fármaco, su solubilidad y estabilidad [9]. Otra utilidad hoy en día de los ELR es que al fusionarlos con una proteína de interés se pueden utilizar para: transporte de proteínas farmacéuticas activas, direccionamiento específico de la proteína diana (para el tratamiento del cáncer) o construcción de matrices biomiméticas (en el campo de la medicina regenerativa) [7]. En ingeniería de tejidos los ELR tienen un gran interés ya que podrían proporcionar un entorno físico y bioquímico apropiado para mantener la diferenciación de condrocitos y apoyar la síntesis de matriz de cartílago in vitro [9]. Por tanto, en la actualidad la investigación de este tipo de polímeros (ELR) es muy importante ya que pueden llegar a tener muchas utilidades y beneficios. 7 3.2. Elastina La elastina es una proteína distribuida por toda la matriz extracelular animal, como arterias, pulmones, ligamentos elásticos, vejiga y piel [2,5]. Es la principal proteína extensible que permite el estirado reversible de la piel [6]. La elastina está formada por un dominio reticulable hidrofílico rico en residuos de lisina (K) y alanina (A), y un dominio elástico hidrofóbico rico en residuos de valina (V), prolina (P), glicina (G) y alanina. Dicho dominio está formado por una secuencia aminoacídica con regiones gobernadas por motivos repetidos como: VPGG, VPGVG, APGVG y VGVAPG [2,5,7,10]. Estos motivos adquieren una estructura que permite que la elastina se deforme sin que se produzcan rupturas, y una vez desaparezca el estrés ésta recupera su conformación original. Cuando la elastina se encuentra en disolución acuosa es capaz de pasar de un estado enrollado (ordenado) a un estado estirado (desordenado) debido a un aumento de T (ver Figura 1).[7] Figura 1. Mecanismo de estiramiento y relajación de la elastina. 3.3. Polímeros Tipo Elastina (ELP) Los polímeros tipo elastina (ELP, “Elastin Like Polymers”) son polipéptidos artificiales cuya secuencia mimetiza los motivos repetidos presentes en la elastina natural. Los ELP más utilizados consisten en repeticiones de la secuencia de aminoácidos (VPGXG)n donde “X” es cualquier aminoácido excepto prolina, que reduce la capacidad de formar láminas β, y “n” es el número de repeticiones del pentapéptido. [2,7,10] La naturaleza polimérica y recombinante de los ELP producidos biosintéticamente condujo a una nueva nomenclatura: ELR (Elastin Like Recombinamers) [2,7]. Debido a los avances de las 8 técnicas en biología molecular es posible introducir un gen en un microorganismo obteniendo el polímero deseado. Este nombre destaca su similitud con la proteína natural elastina, su obtención recombinante y su carácter polimérico. Además, los ELR presentan similitudes con la elastina en aspectos como las propiedades mecánicas, la biocompatibilidad, la naturaleza termosensible y el comportamiento autoensamblable. [7] 3.4. La naturaleza termosensible y el comportamiento autoensamblable de los ELR Como ya se comentó anteriormente, la elastina y, por tanto, los ELR, sufren cambios reversibles entre dos conformaciones [7,19]. Así, los ELR son solubles en agua por debajo de una temperatura determinada, en la que están en un estado hidratado rodeado de clatratos de agua, pero aún así más desordenada que la estructura que tiene por encima de esa temperatura en la que el ELR pasa a un estado más ordenado excluyendo agua. A esta temperatura se la denomina temperatura de transición (Tt) (ver Figura 2). [7] Figura 2. Estructura clatrato del agua. Por lo que, por encima de esta Tt las estructuras de clatrato dejan de estar unidas a los residuos apolares debido a la agitación térmica, lo que provoca que, al no estar unidos a los clatratos, la cadena polipeptídica se pliegue hidrofóbicamente y pase de una espiral aleatoria a estructuras más cerradas (ver figura 4) que implican giros β de tipo II, es decir, espirales β, constituidas por una sucesión de horquillas β (ver figura 3). [7,9] 15 Figura 13. Fotografía del interior del espectrofotómetro. Figura 12. Fotografía del espectrofotómetro. 5.2. Instrumentos ▪ Balanza XS105 DualRange Mettler Toledo (precisión ± 0,1 mg) Figura 11. Fotografía de la microbalanza. ▪ pHmetro Basic 20+ Crison ▪ Espectrofotómetro Cary 100 UV-Vis Agilent Technologies . ▪ DSC882e Mettler Toledo Figura 14. Fotografía del DSC Figura 15. Fotografía del horno del DSC. 16 ▪ Zetasizer Nano ZSP. Figura 16. Fotografía del Zetasizer Nano. Figura 17. Fotografía de interior del zetasizer Nano. 5.3. Compuestos ▪ Polímero S50I60 (producción de Bioforge). ▪ Cloruro sódico (NaCl) ▪ Carbonato de sodio (Na2CO3) ▪ Bicarbonato de sodio (NaHCO3) ▪ Bifosfato de sodio (NaH2PO4) (Casa comercial: Scharlau) ▪ Fosfato disódico (Na2HPO4) ▪ Fosfato de sodio (Na3PO4) ▪ Agua mQ (El resto de compuesto se adquirieron de la casa comercial: Sigma Aldrich). 5.4. Software ▪ Word ▪ Excel ▪ StatgrapHics ▪ Thermal ▪ METTLER STARe ▪ Zetasizer Software 17 5.5. Métodos 5.5.1. Preparación de las disoluciones Para la preparación de las disoluciones salinas se tuvo en cuenta la presión osmótica a la hora de calcular la concentración de dichas disoluciones. Por tanto, se calculó la presión osmótica a partir de la ecuación: 𝜋 = 𝑖𝑐𝑅𝑇 Donde T es la Tª del cuerpo humano (37º), R la constante de los gases ideales en atm*L/K*mol, i es el número de especies en disolución, c es la concentración y π es la presión osmótica. Se tomó de referencia la concentración del suero salino (9 g/L de NaCl) para calcular la presión osmótica en el cuerpo humano obteniendo: π= 7,829 atm. Una vez calculada la presión osmótica se pudo calcular la concentración de cada disolución y los mg de sal necesarios para hacer una disolución de 10 ml de cada una de ellas. Tabla 2. Datos disoluciones salinas Sal Concentración (mol/L) Mg de sal/10 ml de agua mQ NaCl 0,154 89,998 Na2CO3 0,103 294,590 NaHCO3 0,103 146,219 Na2HPO4 0,154 129,375 NaH2PO4 0,154 212,505 Na3PO4 0,077 126,234 5.5.2. Turbidimetría Un haz de luz, generado por una fuente, incide con una longitud de onda determinada en una cubeta que contiene la sustancia a medir, midiendo la intensidad de la radiación lumínica antes y después de atravesar el medio. Se observa una disminución en la intensidad debido a la dispersión de las partículas que se encuentran en la muestra. [13,20] 18 Figura 18. Esquema turbidimetría y sus componentes. 5.5.2.1. Preparación de las muestras La concentración de las muestras es de 5mg/ml, por lo que se pesa la cantidad necesaria de polímero para alcanzar dicha concentración en aproximadamente 3ml de disolución salina y poder calcular así la media. Las disoluciones preparadas se enfrían en un frigorífico a 4ºC ó 5ºC durante mínimo 1h para que el polímero se disuelva completamente. 5.5.2.2. Medida Se procede a encender el equipo, se configura el software Thermal para que el haz de luz incida en la muestra con una λ=350 nm. La temperatura inicial será 5ºC e irá aumentando hasta una temperatura final de 45ºC a una velocidad de 1ºC/min. Una vez configurado el software, se realiza una medición de cada disolución salina para comprobar que su absorbancia es 0 a esa longitud de onda y no nos interfieren en las medidas. Se comprobó que, efectivamente, no absorbían a esa longitud de onda y, por tanto, el blanco a realizar solo era necesario con agua mQ. A continuación, se introducen 1 ml de cada muestra en una cubeta de 1 ml de capacidad. Se aprecia que la disolución es transparente y a medida que aumente la temperatura se formarán nanopartículas responsables de la dispersión de la luz y al final se observará una disolución que presenta turbidez. Por último, en las gráficas obtenidas se calcula la primera derivada obteniendo así el valor exacto de la Tt de cada muestra. 19 5.5.3. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) En DSC se miden las diferencias en la cantidad de calor aportado a una sustancia y a una referencia en función de la temperatura de la muestra cuando las dos están sometidas a un programa de temperatura controlado [12]. Existen dos tipos de calorimetría diferencial de Barrido: ▪ DSC de potencia compensada: la muestra y el material de referencia se encuentran separados en dos hornos independientes, aunque sus temperaturas se mantienen iguales mientras aumentan linealmente.[12] Figura 19. Soporte de muestra y hornos de un DSC de potencia compensada ▪ DSC de flujo de calor: es el utilizado en este caso y se diferencia del anterior en que la muestra y el material de referencia se encuentran en el mismo horno. El calor fluye tanto hacia la muestra como a la referencia a través de un disco termoeléctrico de constantan calentado eléctricamente. La diferencia entre el flujo de calor hacia la muestra y hacia la referencia se controla mediante unos termopares.[12] Figura 20. Soporte de muestras y horno de un DSC de flujo de calor. 20 5.5.3.1. Preparación de las muestras La concentración de las muestras es de 50 mg/ml, por lo que se pesa la cantidad necesaria de polímero para alcanzar dicha concentración en aproximadamente 200 μL de disolución salina. Las disoluciones preparadas se enfrían en un frigorífico a 4ºC ó 5ºC durante mínimo 1h para que el polímero se disuelva completamente. 5.5.3.2. Medida En primer lugar, se pesan aproximadamente 20 μL de referencia (disolución salina correspondiente en cada caso) en un crisol de aluminio, se apunta el peso exacto y se cierra herméticamente con el cierracrisoles. Después se pesan aproximadamente los mismos mg de muestra y se cierran los crisoles de la misma forma que la referencia. Una vez encendido el equipo se controla mediante un ordenador a través del software METTLER STARe. Se configura de modo que, al introducir la muestra y la referencia, y comenzar la medida, el equipo se mantenga a 0ºC durante 5 min para estabilizar la muestra y, posteriormente, la temperatura aumente de 0ºC a 60ºC a una velocidad de 5ºC/min. Una vez realizada la medida se obtiene un diagrama en el que se observa un pico, se realiza la integral del área del pico y se obtiene así el valor de la temperatura de transición. Se realiza la media de las medidas realizadas obteniendo las Tt de cada muestra. 5.5.4. Dispersión de la luz electroforética (ELS) y Dispersión de luz dinámica (DLS) El instrumento utilizado es el Zetasizer Nano ZSP y se utiliza para mediciones del tamaño, movilidad electroforética de proteínas, potencial zeta de nanopartículas y superficies, y opcionalmente, para microreología de soluciones de proteínas y polímeros. [14] En este caso, se ha empleado para medir el tamaño de partícula (DLS) y el potencial Z de nuestro polímero (ELS). 5.5.4.1. Dispersión de la luz electroforética (ELS) La dispersión de luz electroforética mide la desviación Doppler causada por una partícula que es movida electroforéticamente. [22] Se basa en el principio de la electroforesis: en una celda que contienen dos electrodos se aplica un campo eléctrico que hace que las partículas alcancen una velocidad que se conoce 21 como velocidad electroforética (ecuación 1), que está relacionada con su potencial zeta. [15,22] 𝑈 = 𝜇𝐸 (1) Donde “U” es la velocidad electroforética, “μ” es la movilidad electroforética y “E” el campo eléctrico. La muestra que está entre los electrodos es iluminada con un rayo láser y la dispersión de dicho láser se usa para determinar la desviación Doppler causada por el movimiento de las partículas. Conociendo la desviación Doppler se puede calcular la movilidad electroforética mediante la ecuación 2 y posteriormente, con la aproximación de Smoluchowski se obtiene el potencial zeta (ecuación 3). [15,22] 𝜇 = (λ0/𝑛 sin 𝜃)(1/𝐸)∆𝑣 (2) Donde “λ0” es la longitud de onda del láser, “n” el índice de refracción, “θ” el ángulo al cual la luz dispersada es detectada, “E” el campo eléctrico y “Δv” la desviación de la frecuencia Doppler. [22] ζ = ηµ 𝜀 (3) Donde “ζ” es el potencial zeta, “η” la viscosidad del fluido y “ε” la constante dieléctrica. [22] 5.5.4.2. Dispersión de luz dinámica (DLS) Es una técnica no invasiva que se utiliza para medir el tamaño y la distribución de tamaño de moléculas y partículas normalmente en el intervalo de 10 a 100 nm [16]. Cuando un haz de luz monocromático encuentra una solución que contiene macromoléculas, la luz se dispersa en todas las direcciones en función del tamaño y la forma de las macromoléculas. [21] En definición, la dispersión de luz dinámica, también conocida como espectroscopia de correlación de fotones es una técnica que mide el movimiento browniano de las macromoléculas en una solución, y relaciona este movimiento con el tamaño de las partículas. Dicho movimiento de las macromoléculas depende de su tamaño, temperatura y viscosidad del solvente [21]. Por ejemplo, se puede determinar la distribución del tamaño de partícula debido a que las partículas pequeñas se mueven más rápido que las partículas grandes, y generan fluctuaciones rápidas en la intensidad de la dispersión de luz. [16] 22 Para el tamaño de partícula también se obtiene el índice de polidispersidad (pdi) que nos indica la amplitud de la distribución de los pesos moleculares de un polímero [17,18] y es adimensional [18]. Los valores del índice de polidispersidad próximos a la unidad presentan una gran homogeneidad de pesos moleculares. Por otro lado, si los valores son mucho mayores de la unidad habrá una gran dispersión de pesos moleculares. [17] 5.5.4.3. Preparación de las muestras La concentración de las muestras es de 5mg/ml, por lo que se pesa la cantidad necesaria de polímero para alcanzar dicha concentración en aproximadamente 3ml de disolución salina. Las disoluciones preparadas se enfrían en un frigorífico a 4ºC ó 5ºC durante mínimo 1h para que el polímero se disuelva completamente. Cuando el polímero este completamente disuelto se introducen las muestras durante 1 día en la estufa a 37ºC para que se formen todas las nanopartículas. 5.5.4.4. Medida Las medidas del tamaño de partícula y del potencial z se pueden realizar seguidas para una misma muestra, por lo que se configura el programa para las mediciones de DLS y ELS: se establece la temperatura de medición en 40ºC con una estabilización previa a dicha temperatura de 2 min de duración. Por último, se introduce la muestra en una cubeta de capilar plegado, se introduce en el equipo y se realizan en primer lugar las medidas del tamaño de partícula y seguidamente las de potencial z. 23 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. Turbidimetría Las muestras se analizaron por triplicado y se calculó la media obteniendo así la Tt del polímero en las distintas disoluciones salinas. A continuación, se muestra la representación para la muestra: NaCl + S50I60 (los demás resultados están representados en el anexo 10.1). Figura 21. Representación de las medidas 1, 2 y 3 de la muestra NaCl + S50I60 en turbidimetría. Figura 22. Representación de la primera derivada de la medida 1 de la muestra NaCl + S50I60 en turbidimetría. Como se aprecia en las representaciones la Tt se corresponde con el punto medio de la sigmoide, que es el mismo valor que se obtiene al realizar la primera derivada. En la tabla 3 se representan las medias y las Tt para cada muestra. -0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016 010 20 30 40 50 Abs T (ºC) NaCl+S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -5.00E-04 0.00E+00 5.00E-04 1.00E-03 1.50E-03 2.00E-03 2.50E-03 3.00E-03 3.50E-03 4.00E-03 010 20 30 40 50 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (NaCl+S50I60) 24 Tabla 3. Resultados obtenidos en turbidimetría. Muestra Tt media (ºC) Desviación estandar NaCl + S50I60 22.97 ± 0.00 Na2CO3 + S50I60 16.72 ± 0.48 NaHCO3 + S50I60 21.09 ± 0.08 Na2HPO4 + S50I60 16.25 ± 0.10 NaH2PO4 + S50I60 17.40 ± 0.10 Na3PO4 + S50I60 16.04 ± 0.03 En la figura 23, se representa la Tt media de cada muestra y su desviación estándar: Figura 23. Representación de la media y la desviación estándar de cada muestra. * indica que presentan diferencias significativas. A continuación, se realiza un ANOVA de una vía para comprobar qué condiciones ofrecen una diferencia significativa: Tabla 4. Tabla ANOVA. Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 126.335 5 25.2669 592.58 0 Intra grupos 0.511667 12 0.0426389 Total (Corr.) 126.846 17 Como el valor-P de la prueba-F es menor que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de Tt entre una muestra y otra, con un nivel del 5% de significación. Para comprobar cuales son aquellas medias cuyas diferencias son significativas se realiza la prueba de múltiples rangos. 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Na3PO4 Tt (ºC) Disolución sal+S50I60 * * * NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Na3PO4 * 31 Para comprobar que había dado tiempo a que se formasen todas las partículas se realizó una medida de cada muestra estando durante un día a 37ºC. Se comprobó que los tamaños de partícula sin estar previamente a 37ºC y las calentadas previamente a 37ºC eran muy similares excepto la muestra Na3PO4 + S50I60. Tabla 11. Comparación de tamaño de partículas en el tiempo. Muestra Tamaño de partícula/nm (sin calentar previamente) Tamaño de partícula/nm (calentada 1 día a 37ºC) NaCl + S50I60 43.89 45.54 Na2CO3 + S50I60 26.99 31.78 NaHCO3 + S50I60 26.72 26.59 Na2HPO4 + S50I60 27.40 33.28 NaH2PO4 + S50I60 29.06 28.38 Na3PO4 + S50I60 27.97 110.37 Se observó que el tamaño de partícula de la muestra S50I60 + Na3PO4 seguía aumentando cuanto más tiempo se mantenía a 37ºC. En la tabla 12 se muestra la evolución del tamaño de partícula para dicha muestra hasta su estabilización. Tabla 12. Evolución del tamaño de partícula de la muestra S50I60 + Na3PO4. Días en la estufa 0 1 2 5 7 8 9 10 Tamaño de partícula/nm 27.97 110.37 185.30 254.53 279.13 289.23 293.20 283.97 En las tablas 13 y 14 se encuentran los resultados obtenidos para el tamaño de partícula y el índice de polidispersidad (pdi). Tabla 13. Resultados obtenidos en para el tamaño de partícula. Muestra Tamaño de partícula medio(nm) Desviación estandar NaCl + S50I60 43.89 ± 0.25 Na2CO3 + S50I60 26.99 ± 0.47 NaHCO3 + S50I60 26.72 ± 0.41 Na2HPO4 + S50I60 27.40 ± 0.07 NaH2PO4 + S50I60 29.06 ± 0.55 Na3PO4 + S50I60 293.11 ± 2.20 32 Tabla 14. Índice de polidispersidad de cada muestra. Muestra pdi medio Desviación estandar NaCl + S50I60 0.03 ± 0.02 Na2CO3 + S50I60 0.03 ± 0.01 NaHCO3 + S50I60 0.02 ± 0.01 Na2HPO4 + S50I60 0.03 ± 0.01 NaH2PO4 + S50I60 0.03 ± 0.01 Na3PO4 + S50I60 0.09 ± 0.01 En la tabla 14 podemos comprobar que los pdi de todas las muestras son muy próximos a 0, lo cual indica que las partículas medidas en cada caso son del mismo tamaño. En la figura 31, se representa el tamaño de partícula medio de cada muestra y su desviación estándar: Figura 31. Representación de la media y la desviación estándar de cada muestra. * indica que presentan diferencias significativas. A continuación, se realiza un ANOVA de una vía para comprobar qué tamaños de partícula tienen una diferencia significativa: Tabla 15. Tabla ANOVA. Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 172659 5 34531.8 36919.27 0 Intra grupos 11.224 12 0.935333 Total (Corr.) 172670 17 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Na3PO4 Tamaño de partícula (nm) Disolución sal+S50I60 * * * NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Na3PO4 33 Como el valor-P de la prueba-F es menor que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de Tt entre una muestra y otra, con un nivel del 5% de significación. Para comprobar cuales son aquellas medias cuyas diferencias son significativas se realiza la prueba de múltiples rangos. Tabla 16. Comparación de grupos homogéneos. Sales Casos Media Grupos Homogéneos NaHCO3 3 26.7167 X Na2CO3 3 26.99 X Na2HPO4 3 27.3933 XX NaH2PO4 3 29.06 XX NaCl 3 43.89 X Na3PO4 3 293.113 X Tabla 17. Homogeneidad entre muestras. Contraste Sig. Diferencia +/- Límites Na2CO3 - Na2HPO4 -0.403333 1.72052 Na2CO3 - Na3PO4 * -266.123 1.72052 Na2CO3 - NaCl * -16.9 1.72052 Na2CO3 - NaH2PO4 * -2.07 1.72052 Na2CO3 - NaHCO3 0.273333 1.72052 Na2HPO4 - Na3PO4 * -265.72 1.72052 Na2HPO4 - NaCl * -16.4967 1.72052 Na2HPO4 - NaH2PO4 -1.66667 1.72052 Na2HPO4 - NaHCO3 0.676667 1.72052 Na3PO4 - NaCl * 249.223 1.72052 Na3PO4 - NaH2PO4 * 264.053 1.72052 Na3PO4 - NaHCO3 * 266.397 1.72052 NaCl - NaH2PO4 * 14.83 1.72052 NaCl - NaHCO3 * 17.1733 1.72052 NaH2PO4 - NaHCO3 * 2.34333 1.72052 * indica una diferencia significativa A continuación, se representa el gráfico de medias en el cual también se aprecian estas diferencias. 34 Figura 32. Gráfico de medias. Por tanto, se observa que las muestras con un tamaño de partícula sin diferencias significativas entre sí son: NaHCO3, Na2CO3 y Na2HPO4, por un lado, y Na2HPO4 y NaH2PO4 por el otro. Las muestras en las que el polímero está disuelto en NaCl y en Na3PO4 tienen diferencias significativas respecto a las otras muestras. Como se observa, el polímero disuelto en Na3PO4 forma nanopartículas muy grandes por lo que podrá retener fármacos más grandes, pero a su vez será más difícil que se introduzcan en las células. Por otro lado, el resto de las muestras forman nanopartículas más pequeñas por lo que podrán encapsular fármacos más pequeños, pero será más fácil su introducción en las células. 6.3.2. Dispersión de la luz electroforética (ELS) Se realizan tres medidas a 40ºC y se hace la media obteniendo así el potencial z de cada muestra. En la tabla 18 se muestran los resultados obtenidos excepto para la muestra que contiene la sal NaH2PO4 que se muestra en la tabla 23 ya que se obtenían valores muy distintos. Tabla 18. Resultados obtenidos en ELS (potencial zeta). Muestra Potencial z medio (mV) Desviación estandar NaCl + S50I60 -1736.67 ± 661.67 Na2CO3 + S50I60 -3855.56 ± 393.45 NaHCO3 + S50I60 -5401.11 ± 954.27 Na2HPO4 + S50I60 -3133.33 ± 626.60 Na3PO4 + S50I60 -21377.78 ± 1736.00 Como se observa en la tabla 18, los potenciales z son negativos debido a que los aniones se adhieren a la superficie de las nanopartículas dotándolas de valores negativos. Además, se 35 observa que el potencial z de la muestra Na3PO4 + S50I60 es muy grande, lo cual se debe a su gran tamaño de partícula. La muestra NaH2PO4 + S50I60 dio resultados más diversos respecto al resto de muestras, obteniéndose potenciales tanto negativos como positivos. Por ello, se realizaron varias medidas para comprobar si en algún momento el potencial z era completamente negativo, pero se obtuvieron potenciales diversos en cada medida. En total se realizaron 11 medidas obteniendo como valor medio de potencial z: 34.87 mV; y una desviación estándar: ±420.57. El valor de la desviación estándar es demasiado grande debido a que las medidas obtenidas varían entre valores positivos y negativos. Como se aprecia, el resultado es un potencial bastante pequeño en comparación con el resto de las muestras y más próximo a 0 incluso habiendo alguna de valor positivo, lo que significa que las partículas formadas en este caso tienen menor carga superficial negativa. En la figura 33, se representa el tamaño de partícula medio de cada muestra y su desviación estándar: Figura 33. Representación de la media y la desviación estándar de cada muestra. * indica que presentan diferencias significativas. A continuación, se realiza un ANOVA de una vía para comprobar qué tamaños de partícula tienen una diferencia significativa. -25000.00 -20000.00 -15000.00 -10000.00 -5000.00 0.00 5000.00 Potencial z (mV) Disolución sal+E50I60 * * * NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO NaH2PO4 Na3PO4 * 36 Tabla 19. Tabla ANOVA. Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 1.11E+09 5 2.22E+08 382.62 0 Intra grupos 1.16E+07 20 579397 Total (Corr.) 1.12E+09 25 Como el valor-P de la prueba-F es menor que 0.05, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la media de Tt entre una muestra y otra, con un nivel del 5% de significación. Para comprobar cuales son aquellas medias cuyas diferencias son significativas se realiza la prueba de múltiples rangos. Tabla 20. Comparación de grupos homogéneos. Sales Casos Media Grupos Homogéneos Na3PO4 3 -21377.8 X NaHCO3 3 -5401.11 X Na2CO3 3 -3855.56 X Na2HPO4 3 -3133.33 X NaCl 3 -1736.67 X NaH2PO4 11 34.8727 X Tabla 21. Homogeneidad entre muestras. Contraste Sig. Diferencia +/- Límites Na2CO3 - Na2HPO4 -722.223 1296.43 Na2CO3 - Na3PO4 * 17522.2 1296.43 Na2CO3 - NaCl * -2118.89 1296.43 Na2CO3 - NaH2PO4 * -3890.43 1034.2 Na2CO3 - NaHCO3 * 1545.56 1296.43 Na2HPO4 - Na3PO4 * 18244.4 1296.43 Na2HPO4 - NaCl * -1396.67 1296.43 Na2HPO4 - NaH2PO4 * -3168.21 1034.2 Na2HPO4 - NaHCO3 * 2267.78 1296.43 Na3PO4 - NaCl * -19641.1 1296.43 Na3PO4 - NaH2PO4 * -21412.7 1034.2 Na3PO4 - NaHCO3 * -15976.7 1296.43 NaCl - NaH2PO4 * -1771.54 1034.2 NaCl - NaHCO3 * 3664.45 1296.43 NaH2PO4 - NaHCO3 * 5435.99 1034.2 * indica una diferencia significativa A continuación, se representa el gráfico de medias en el cual también se aprecian estas diferencias. 37 Figura 34. Gráfico de medias. Por tanto, se observa que las muestras con un potencial z sin diferencias significativas son: las muestras con sales NaHCO3 y Na2CO3, por otro lado, Na2CO3 y Na2HPO4 y por último N2HPO4 y NaCl. El potencial de membrana de las células oscila entre -60 y -70 mV, por lo que las muestras al tener potencial z negativo se repelerían con las células, por lo que necesitan un transporte activo para introducirse en la célula. El transporte activo implica el movimiento de moléculas a través de la membrana celular, en contra del gradiente de concentración, desde una región de menor concentración a una región de mayor concentración y requiere energía celular para lograr este movimiento. 38 7. CONCLUSIONES Respecto a la Tt del polímero disuelto en distintas sales, se comprueba que la Tt obtenida varía dependiendo de la sal en la que esté disuelto el polímero, además se aprecia que la Tt es muy similar para las muestras que contienen las sales Na3PO4 y NaH2PO4 (en concentraciones de 5mg/ml) y para las que contienen Na2CO3, Na3PO4 y NaH2PO4 (en concentraciones de 50mg/ml). Figura 35. Comparación de los resultados obtenidos en DLS y ELS. Por otro lado, como se observa en la figura 35, respecto a los valores obtenidos para el tamaño de partícula se observa que todos los tamaños son bastantes similares excepto el tamaño de partícula para la muestra S50I60+Na3PO4 cuyo tamaño de partícula es mucho más grande que el del resto de muestras. Esto puede deberse a que el anión de dicha sal presenta 3 cargas negativas. Por lo que, como se observa en la figura 35, las sales que presentan 1 ó 2 cargas negativas tienen tamaños y potenciales z similares, mientras que a partir de 3 cargas negativas se nota un claro aumento del tamaño y por tanto del potencial. Por lo que en el caso de la sal Na3PO4, cada OH de la serina se une a dicho anión con 3 cargas negativas lo que permite estabilizar nanopartículas más grandes, obteniendo a la vez un potencial z mucho mayor. En la figura 35 también se puede apreciar como la muestra con la sal de NaCl, que es la que menos disminuye la Tt, es la de mayor tamaño respecto a las sales que presentan 1 ó 2 cargas negativas. -25000.00 -20000.00 -15000.00 -10000.00 -5000.00 0.00 5000.00 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Na3PO4 Potencial z (mV) Tamaño de partícula (nm) Disolución sal+S50I60 Tamaño de partícula Potencial z NaCl Na2CO3 NaHCO3 Na2HPO NaH2PO4 Na3PO4 39 Respecto al potencial z, en el anexo 10.5.2 se observa que los valores obtenidos para el polímero S50I60 sin impurezas salinas son valores pequeños respecto a los obtenidos en presencia de impurezas ya que los aniones rodean a las nanopartículas que se forman provocando que sus cargas aumenten. Se obtuvieron medidas distintas entre sí, pero destacaron: la muestra S50I60+Na3PO4 cuyo potencial z es muy grande como consecuencia del tamaño de partícula grande que se comentó anteriormente, ya que, al tener mayor tamaño, mayor cantidad de aniones rodearán a las nanopartículas; también destaca la muestra S50I60+NaH2PO4 cuyos valores de potencial z oscilan entre valores positivos y negativos siendo el resultado final un potencial bastante pequeño en comparación con el resto de las muestras y más próximo a 0, lo que significa que las partículas formadas en este caso tienen menor carga superficial negativa. En conclusión, la utilización del polímero S50I60 disuelto en distintas sales presentes en el cuerpo humano para la dosificación de fármacos, sería posible, pero hay que tener en cuenta los distintos aspectos de cada muestra ya que son en general muy distintas entre sí, exceptuando las muestras disueltas en Na2CO3 y Na2HPO4 que solo difieren en la Tt obtenida mediante turbidimetría. En general, todas las muestras forman nanopartículas cuyo interior es hidrofóbico, por lo que los fármacos que se pretenden encapsular deben ser hidrofóbicos para unirse hidrofóbicamente a dichas partículas. En el caso de que el fármaco prefiera nanopartículas grandes, la mejor opción sería el polímero disuelto en Na3PO4, mientras que si prefiere partículas pequeñas el resto de las sales serían útiles. Si el fármaco fuese hidrofílico y de carga positiva, este se uniría a la superficie externa de las nanopartículas por lo que no sería factible. Si fuese hidrofílico y de carga negativa se repelería con las nanopartículas debido a que presentan un potencial z negativo. Respecto al potencial de membrana, al ser negativo al igual que los potenciales z de las muestras, significa que para introducirse en las células será necesario que se produzca un transporte activo. 40 8. BIBLIOGRAFÍA [1] Macarulla, J.M.; Goñi, F.M. (1987). “Biomoléculas. Lecciones de Bioquímica Estructural”. Reverté. [2] Ibáñez-Fonseca, A., Flora, T., Acosta, S., & Rodríguez-Cabello, J. C. (2019). Trends in the design and use of elastin-like recombinamers as biomaterials. Matrix Biology, 84, 111126. https://doi.org/10.1016/j.matbio.2019.07.003 [3] Kim, W., & Chaikof, E. L. (2010). Recombinant elastin-mimetic biomaterials: Emerging applications in medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. https://doi.org/10.1016/j.addr.2010.04.007 [4] Santos, M., Serrano-Dúcar, S., Gonzalez-Valdivieso, J., Vallejo, R., Girotti, A., Cuadrado, P., & Arias, F. J. (2020). 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Springer Science+Business Media. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-953-2_29 47 ▪ Na2CO3 + S50I60 -0.005 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 010 20 30 40 50 Abs T (ºC) Na2CO3 + S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (Na2CO3 + S50I60) -0.002 -0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 020 40 60 Abs T (ºC) Temperatura de transición Medida 2 (Na2CO3 + S50I60) -0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 020 40 60 Abs T (ºC) Temperatura de transición Medida 3 (Na2CO3 + S50I60) 48 ▪ NaHCO3 + S50I60 -0.005 0 0.005 0.01 0.015 0.02 010 20 30 40 50 Abs T (ºC) NaHCO3 + S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -0.002 0 0.002 0.004 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (NaHCO3 + S50I60) -1.00E-03 0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 2 (NaHCO3 + S50I60) -2.00E-03 0.00E+00 2.00E-03 4.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 3 (NaHCO3 + S50I60) 49 ▪ Na2HPO4 + S50I60 -0.01 -0.005 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 010 20 30 40 50 abs t (ºC) Na2HPO4 + S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -1.00E-03 0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 5.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (Na2HPO4 + S50I60) -1.00E-03 0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 2 (Na2HPO4 + S50I60) -0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 3 (Na2HPO4 + S50I60) 50 ▪ NaH2PO4 + S50I60 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 010 20 30 40 50 Abs T (ºC) NaH2PO4 + S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (NaH2PO4 + S50I60) -2.00E-03 0.00E+00 2.00E-03 4.00E-03 6.00E-03 8.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 2 (NaH2PO4 + S50I60) -0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 3 (NaH2PO4 + S50I60) 51 ▪ Na3PO4 + S50I60 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 010 20 30 40 50 Abs T (ºC) Na3PO4 + S50I60 Medida 1 Medida 2 Medida 3 -1.00E-03 0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 1 (Na3PO4 + S50I60) -0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 020 40 60 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición Medida 2 (Na3PO4 + S50I60) -1.00E-03 0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 5.00E-03 050 Primera derivada T (ºC) Temperatura de transición medida 3 (Na3PO4 + S50I60) 52 10.2. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) ▪ NaCl + S50I60 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Comparación de las 3 medidas Medida 1 Medida 2 Medida 3 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 1 53 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 2 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 3 54 ▪ Na2CO3 + S50I60 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) Título del eje Comparación de las 3 medidas Medida 1 Medida 2 Medida 3 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 1 55 ▪ NaHCO3 + S50I60 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 2 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 3 -2 -1 -1 0 1 1 2 2 3 3 4 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Comparación de las 3 medidas Medida 1 Medida 2 Medida 3 56 -2 -2 -1 -1 0 1 1 2 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 1 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 2 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 -10 010 20 30 40 50 60 70 Potencia (mW) T (ºC) Medida 3 63 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 64 ▪ Na2CO3 + S50I60 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 65 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 66 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 67 ▪ NaHCO3 + S50I60 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 68 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 69 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 70 ▪ Na2HPO4 + S50I60 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 71 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 72 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 79 ▪ S50I60 pH=7,5 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 80 o Medida 3 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 81 o Medida 3 ▪ S50I60 pH=12 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 82 o Medida 3 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 83 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 84 ▪ S50I60 pH=4 ▪ Volumen: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 85 ▪ Intensidad: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 86 ▪ Correlogramas: o Medida 1 o Medida 2 o Medida 3 87 10.4. pH de las muestras. Muestra pH NaCl + S50I60 5.41 Na2CO3 + S50I60 11.00 NaHCO3 + S50I60 8.81 Na2HPO4 + S50I60 8.20 NaH2PO4 + S50I60 4.46 Na3PO4 + S50I60 12.45 S50I60 7.50 10.5. S50I60 10.5.1. Tamaño de partícula y Pdi Muestra Medida Tamaño de partícula (nm) Tamaño de partícula medio (nm) Desviación estandar 1 34.97 S50I60 pH=12 2 35.77 35.58 0.54 3 35.99 1 11.17 S50I60 pH=7,5 2 7.70 9.61 1.76 3 9.97 1 33.70 S50I60 pH=4 2 31.70 32.26 1.25 3 31.39 Muestra Medida Pdi Pdi medio Desviación estandar 1 0.04 S50I60 pH=12 2 0.05 0.04 0.01 3 0.04 1 0.23 S50I60 pH=7,5 2 0.27 0.25 0.02 3 0.24 1 0.07 S50I60 pH=4 2 0.11 0.09 0.02 3 0.10 88 10.5.2. Potencial z Muestra Medida Potencial z (mV) Potencial z medio (mV) Desviación estandar 1 -11.40 S50I60 pH=12 2 -9.56 -11.32 1.72 3 -13.00 1 -11.40 S50I60 pH=7,5 2 -12.90 -11.77 1.00 3 -11.00 1 -6.89 S50I60 pH=4 2 -7.99 -7.72 0.74 3 -8.29