Estabilidad de contaminantes emergentes en la obtención de hidrolizados de biomasa algal

FACULTAD DE CIENCIAS TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Química Estabilidad de contaminantes emergentes en la obtención de hidrolizados de biomasa algal Autora: Zoraida Arnanz Manso Tutores: Juan José Jiménez Sevilla Rebeca López Serna Año 2023 1 ÍNDICE 1 RESUMEN ............................................................................................ 3 2 ABSTRACT ............................................................................................. 4 3 INTRODUCCIÓN .................................................................................... 5 3.1 Contaminantes farmacéuticos en aguas residuales .......................... 5 3.2 Mecanismos de eliminación y transporte de fármacos en sistemas de agua ....................................................................................................... 8 3.2.1 Fotodegradación ......................................................................................... 8 3.2.2 Hidrólisis .................................................................................................... 10 3.2.3 Adsorción y/o desorción ........................................................................... 11 3.2.4 Biodegradación ......................................................................................... 13 3.3 Métodos basados en microalgas para la eliminación de antibióticos en aguas residuales .................................................................................. 14 3.3.1 Inhibición de microalgas en presencia de antibióticos .............................. 15 3.3.2 Factores que afectan al rendimiento de eliminación de antibióticos por microalgas ................................................................................................................ 15 3.4 Mecanismos de eliminación de antibióticos mediante el uso de microalgas ................................................................................................. 18 3.4.1 Adsorción .................................................................................................. 18 3.4.2 Acumulación ............................................................................................. 19 3.4.3 Biodegradación ......................................................................................... 19 3.4.4 Fotodegradación ....................................................................................... 20 3.4.5 Hidrólisis .................................................................................................... 20 3.5 CE en purines .................................................................................. 21 3.5.1 Los productos de medicamentos veterinarios (PVM) y biocidas en el estiércol 21 3.5.2 Antibióticos en dos sistemas de tratamiento de aguas residuales porcinas 29 3.6 Valorización de subproductos ......................................................... 34 3.6.1 Hidrólisis Enzimática ................................................................................. 35 3.7 Métodos de análisis ........................................................................ 38 3.7.1 Extracción sólido-líquido (SLE) .................................................................. 39 2 3.7.2 Extracción en fase sólida (SPE) .................................................................. 39 3.7.3 Análisis Cromatográfico............................................................................. 39 3.8 Compuestos estudiados .................................................................. 40 4 OBJETIVOS ............................................................................................. 47 5 EXPERIMENTAL ...................................................................................... 48 5.1 Materiales, reactivos e instrumentación ......................................... 48 5.2 Preparación de una disolución multipatrón .................................... 49 5.3 Estabilidad durante la hidrólisis ...................................................... 49 5.3.1 Obtención de los hidrolizados enzimáticos ............................................... 49 5.3.2 Obtención de los hidrolizados químicos .................................................... 50 5.3.3 Cuantificación de los contaminantes en los hidrolizados químicos........... 52 5.4 Ensayos de extracción sobre hidrolizados enzimáticos ................... 53 5.4.1 Preparación de muestras de biomasa algal liofilizada ............................... 53 5.4.2 Inyección directa (ID) de las muestras....................................................... 53 5.4.3 Combinación de extracción en fase sólida (SPE) dispersiva con extracción en fase sólida clásica ................................................................................................ 54 5.5 Determinación mediante UHPLC/MS-MS ....................................... 56 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 60 6.1 Estabilidad de contaminantes emergentes ..................................... 60 6.1.1 Estabilidad en hidrolizados enzimáticos .................................................... 60 6.1.2 Estabilidad en hidrolizados químicos ........................................................ 68 6.2 Análisis en presencia de biomasa algal ........................................... 79 7 CONCLUSIONES ..................................................................................... 83 8 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................ 84 9 LISTA DE TABLAS Y FIGURAS .................................................................. 91 9.1 Lista de Tablas ................................................................................. 91 9.2 Lista de Figuras ................................................................................ 92 3 1 RESUMEN En la actualidad, se está experimentando diferentes configuraciones y tipos de fotobiorreactores con biomasa algal para la depuración de aguas residuales urbanas y ganaderas, en particular de granjas porcinas. Para rentabilizar económicamente el tratamiento se está estudiando la obtención de productos de valor añadido (principalmente proteínas y carbohidratos) mediante procesos de hidrólisis a partir de la biomasa algal crecida en los fotobiorreactores. Dado que las aguas residuales contienen antibióticos de uso veterinario, además de otros contaminantes emergentes, es recomendable conocer la estabilidad de los microcontaminantes acumulados en la biomasa durante los procesos de hidrólisis para evaluar la calidad del producto añadido. Así se ha evaluado la estabilidad de 22 microcontaminantes durante un proceso de hidrólisis enzimática mediante agitación ultrasónica, comprobándose después de una prueba estadística que los microcontaminantes son estables. Se han realizado también hidrólisis químicas a elevada temperatura, en medio ácido y básico. En este caso la mayoría de los microcontaminantes fueron totalmente degradados. Sólo compuestos como danofloxacina y sulfatiazol mostraban estabilidad en este medio. Para los compuestos no degradados se ha determinado su concentración residual mediante un calibrado matriz patrón. Todos los ensayos han sido inyectados en un equipo de cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem. 4 2 ABSTRACT Currently, different configurations and types of photobioreactors with algal biomass are being tested for the treatment of urban and livestock wastewater, particularly from pig farms. In order to make the treatment economically profitable, the production of value-added products (mainly proteins and carbohydrates) by hydrolysis processes from the algal biomass grown in the photobioreactors is being studied. Given that wastewater contains antibiotics for veterinary use, as well as other emerging pollutants, it is advisable to know the stability of the micropollutants accumulated in the biomass during the hydrolysis processes in order to evaluate the quality of the added product. Thus, the stability of 22 micropollutants was evaluated during an enzymatic hydrolysis process using ultrasonic agitation, proving after a statistical test that the micropollutants are stable. Chemical hydrolysis has also been carried out at high temperature, in acidic and basic media. In this case most of the micropollutants were completely degraded. Only compounds such as danofloxacin and sulfathiazole showed stability in this medium. For the non-degraded compounds, their residual concentration was determined by matrix standard calibration. All assays were injected in an ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. 5 3 INTRODUCCIÓN Los contaminantes emergentes (CE) son aquellos compuestos que se encuentran en el medio ambiente a nivel de trazas, que generalmente no se controlan pero que se sabe o tienen el potencial de provocar efectos adversos para la salud humana y/o ecológica. (Bexfield et al., 2019). Los CE pueden tener origen natural, como hormonas esteroides (estrógenos y testosterona) o ser sustancias antropogénicas como productos farmacéuticos y de higiene personal (PPCP), esteroides, drogas de abuso, etc. Muchos estudios han demostrado que la presencia de CE es perjudicial al ecosistema, cuyos efectos secundarios incluyen toxicidad, bacterias patógenas resistentes a los antibióticos, genotoxicidad y efectos de alteración endocrina. (Tamura et al., 2017) 3.1 Contaminantes farmacéuticos en aguas residuales Estos contaminantes farmacéuticos (sustancias antropogénicas) son consumidos tanto por los animales como por el ser humano para apoyar la salud diaria y tratar enfermedades. Tras su consumo pueden llegar al medio acuático directamente a través del vertido de aguas residuales sin tratar en masas de agua, o indirectamente a través de aguas residuales tratadas como consecuencia de su eliminación incompleta en las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR). En este tipo de depuradas se controla las condiciones de tratamiento (como puede ser el tiempo de residencia hidráulica y la tasa de carga orgánica) y se tienen en cuenta las ambientales (luz solar, temperatura, condiciones redox y pH). En ellas hay varios procesos que controlan la aparición y el destino de los productos farmacéuticos (PF) en los sistemas de agua, incluida la adsorción, fotodegradación, hidrólisis y biodegradación (Figura 1). Sin embargo, la mayor parte de ellos no se pueden eliminar porque son resistentes a la degradación ambiental y debido a sus propiedades fisicoquímicas a largo plazo incluso a bajas concentraciones puede dañar los organismos acuáticos como bacterias, algas, peces y plantas. Esto desencadena su acumulación en los tejidos e inhibición de la proliferación celular. 6 Figura 1: En este esquema se observa que, las aguas residuales domésticas, las industrias y los hospitales son las principales fuentes de productos farmacéuticos para el sistema de alcantarillado urbano. Una vez que se liberan en el medio ambiente acuático, se someten a una variedad de procesos de transformación y degradación abióticos y bióticos que dan forma al destino de los PF en las aguas. En estos procesos, la fotodegradación, hidrólisis y biodegradación son los mecanismos clave involucrados en la atenuación de estos compuestos (Khan et al., 2020). Además, muchos PF son hidrófobos y tienden a adsorberse en sólidos suspendidos. Por lo tanto, el destino y el transporte de los productos farmacéuticos adsorbidos en los sedimentos están determinados por la dinámica de los sedimentos, incluida la sedimentación, la resuspensión y otros procesos tanto en la infraestructura de alcantarillado como en las aguas naturales. Los sólidos en suspensión, junto con los productos químicos adsorbidos, pueden asentarse en el fondo de alcantarillados o ríos, formando así depósitos de sedimentos contaminados, especialmente durante los periodos de clima seco cuando la velocidad del agua que fluye es baja. La simulación del comportamiento de los PF en aguas ambientales es la base de la evaluación de riesgos ambientales en escalas espaciales más grandes. Actualmente se han desarrollado modelos lineales simples de PF en sistemas de agua, que asignan factores de producción y reducción para estimar los flujos másicos en la EDAR. Sin embargo, estos modelos no logran reproducir la dinámica ambiental. Coutu et al., 7 2016 desarrolló un modelo estocástico integrado utilizando la tasa de excreción de masa específica de compuesto con un modelo de calidad/transporte de agua para describir su movimiento a través de una red de alcantarillado hasta la entrada de una EDAR. El ciclo de vida de los PF en aguas ambientales, que a menudo incluye ríos con un largo recorridos o alcantarillas urbanas, se puede dividir en una serie de reactores acoplados y completamente mixtos que presentan un modelo de cascada (Chapra, 2008) (Figura 2). De esta manera, las concentraciones de los productos farmacéuticos en cada reactor de alcance (en una serie de reactores se clasifican en C0, C1, …, Ci, …,Cnorte) se puede representar en función del caudal del río. (Chen et al., 2020) Figura 2:Esquema del modelo farmacéutico en aguas ambientales vistas como una serie de reactores acoplados completamente bien mezclados. Para cualquier reactor, la ecuación de balance de masa se expresa como (Chapra, 2008; Droppo et al., 2011; Yin et al., 2016): 𝑉𝑖𝑑𝐶𝑖 𝑑𝑡 =𝑄𝑖−1,𝐶𝑖−1 −𝑄𝑖−1,𝐶𝑖−(𝑘𝑝𝑖 +𝑘𝑏𝑖 +𝑘ℎ𝑖)𝑉𝑖𝐶𝑖−𝑣𝑠𝑖𝐹𝑝𝑖𝐶𝑖𝐴𝑖 Donde 𝐶𝑖 es la concentración farmacéutica desconocida del reactor expresado en mg/L, 𝐶𝑖−1 es la concentración conocida en la entrada (influente) del flujo del reactor vecino en mg/L, Vi es el volumen del reactor en m3, Ai es el área del interfaz aguasedimento del reactor i en m2, t es tiempo en s, 𝑄𝑖−1 es la constante de entrada del 8 reactor en m3/s, vsi es la constante de sedimentación que representa la transferencia de masa desde el agua suprayacente a los sedimentos del fondo en el reactor en m/s, kpi, kbi and khi representa la constante de fotodegradación del primer orden, la constante de biodegradación y constante de hidrólisis en el reactor i y Fpi es la fracción del contaminante total que se encuentra en forma de partículas, que se puede determinar mediante la siguiente expresión: 𝐹𝑝𝑖 =𝑘𝑑𝑖𝑚𝑖 1+𝑘𝑑𝑖𝑚𝑖 Donde 𝑘𝑑𝑖 es el coeficiente de reparto entre las partículas y el agua asociado con los procesos de sorción farmacéutica en el reactor en L/mg y 𝑚𝑖 es la concentración de sedimentos en suspensión en el reactor en mg/L. 3.2 Mecanismos de eliminación y transporte de fármacos en sistemas de agua 3.2.1 Fotodegradación La fotodegradación es un importante proceso de degradación abiótica de los PF impulsado por la radiación solar en el medio ambiente acuático. Estos pueden contener uno o más grupos funcionales químicos, como anillos aromáticos, sistemas pconjugados, heteroátomos y grupo nitro, fenólicos y naftilo, que pueden absorber la radiación solar (290-800 nm) y son susceptibles a la degradación fotolítica (FattaKassinos et al., 2011). La radiación solar transforma un PF original en otras moléculas al romper los enlaces covalentes, típicamente, la reacción da como resultado compuestos más biodegradables e hidrolizables (Wilkinson et al., 2017). Se puede clasificar en fotodegradación directa (que se produce por la adsorción directa de la radiación solar) y la fotodegradación indirecta (que se produce por la adsorción indirecta de la radiación solar) a través de reacciones con productos intermedios reactivos producidos fotoquímicamente (PPRI) Los PF pueden degradarse tanto por fotodegradación directa como indirecta. Cualquier cambio en la calidad fisicoquímica del agua afecta a las constantes cinéticas de los procesos fotoquímicos y la eliminación final de los microcontaminantes. 15 3.3.1 Inhibición de microalgas en presencia de antibióticos La inhibición de microalgas inducida por antibióticos juega un papel importante. Estos pueden alterar el crecimiento de las algas mediante la inhibición de la síntesis de sustancias químicas como la clorofila-a y los pigmentos y las actividades de enzimas como la catalasa y el superóxido dismutasa. Este efecto se puede cuantificar comúnmente a través de la concentración efectiva máxima EC50, que se define como la concentración de antibiótico a la que se inhibe el 50% del crecimiento de algas. La mayoría poseen valores más altos que las concentraciones en aguas residuales, lo que denota que las microalgas naturalmente poseen buena resistencia. Por ejemplo, las concentraciones de ciprofloxacina y tetraciclina son próximas a 1μg/L en aguas residuales, mientras que los valores para EC50 son 65 mg/L (para C. mexicana) y 3,31 mg/L (para P. subcapitata) (Tabla 5) respectivamente (Välitalo et al., 2017, Xiong et al., 2018) dependiendo del antibiótico específico y de la especie de la microalga. Tabla 5:Concentraciones de antibióticos comúnmente presentes en los efluentes de las EDAR y los valores EC50 para esos antibióticos de las especies específicas de algas Antibióticos Concentraciones de antibióticos en efluentes de EDAR municipales (mg/L) (ref.) Valores de EC50 (mg/L),tiempo,especies (ref.) Ciprofloxacina 1,05(Välitalo et al., 2017) 65,96 h; C.mexicana (Xiong et al., 2018) 113;72h; P. subcapitata (Välitalo et al., 2017) Enrofloxacina 0,27 (Välitalo et al., 2017) 18,7; 72h; P. subcapitata (Välitalo et al., 2017) 5,57; 72h; D. subcapicatus (Välitalo et al., 2017) Tetraciclina 1,40 (Välitalo et al., 2017) 3,31; 72h; P. subcapitata (Välitalo et al., 2017) Trimetoprima 1,15 (Välitalo et al., 2017) 80,3; 72h; P.subcapitata (Välitalo et al., 2017) 3.3.2 Factores que afectan al rendimiento de eliminación de antibióticos por microalgas 3.3.2.1 Efecto de las especies de algas La tasa de eliminación de los antibióticos depende en gran medida de las especies de algas. El Chlorella es muy eficaz para la eliminación de muchos antibióticos. Dentro de este grupo localizamos C. vulgaris el cuál fue más vigoroso para eliminar la enrofloxacina que S.obliquus, Chlamydomonas mexicana, Ourococcus multisporus y Micractinium resseri (Xiong et al., 2017b). Sin embargo, la eliminación de ciprofloxacina 16 por Chlamydomonas mexicana se limitó al 13% como se observa también en la trimetropina por Nannochloris sp. reducida en un rango del 0 al 10% (Bai & Acharya 2016,2017) (Tabla 6). 3.3.2.2 Efecto de las clases y concentraciones de antibióticos La eliminación de antibióticos basada en microalgas afecta a la concentración de ellos. Por esta razón, presentan inhibiciones sobre el crecimiento de algas cuando la concentración es cercana o superior al nivel tolerable por las algas. Se esperarían bajas tasas en el momento que las concentraciones estudiadas se expresan en magnitud de varios mg/L a cientos μg/L puedan ser comparables o incluso superiores a las EC50 (Tabla 5). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el aumento de la concentración de antibiótico dentro de un cierto rango puede tener poca influencia en su eliminación cuando la concentración está dentro del nivel tolerable por las algas. De igual modo, afecta en gran medida a las clases de los antibióticos. Sus diferentes tipos, incluso a un nivel de concentración similar, pueden dar como resultado eficiencias de eliminación notablemente anómalo. 3.3.2.3 Efectos de las condiciones de crecimiento de algas Las condiciones de crecimiento de las microalgas, incluido los nutrientes, el pH, la iluminación, la temperatura, el CO2, la concentración, la salinidad, el diseño del fotobiorreactor, el oxígeno disuelto y los inhibidores del crecimiento de algas son fundamentales para la eficacia de la eliminación de antibióticos. (Norvill et al., 2016). Estas son mayoritariamente favorables y además la adicción de nutrientes apropiados puede promover el metabolismo para el crecimiento seguido de un mejor rendimiento en la eliminación de los antibióticos. Por ejemplo, la adicción de 4g/L de acetato de sodio a Chlamydomonas mexicana aumentó el triple la eliminación de ciprofloxacina. Adicionalmente el pH puede mediar en la hidrólisis de algunos antibióticos iónicos como ocurre en la Tetraciclina y Trimetoprima. 17 Tabla 6:Eliminación de antibióticos mediante tecnología basada en microalgas y mecanismos de eliminación Antibiotico Tecnología basada en microalgas Concentración inicial de antibiótico y tasa de eliminación, tiempo de retención hidráulica Categoría de aguas residuales Mecanismos de eliminación Referencia Ciprofloxacina Chlamydomonas mexicana 2 mg/L y 13%, 11días Bold´s Basal Medium Biodegradación, acumulación y adsorción Xiong et al., 2017b C. pitschmannii 2 mg/L y 1,6%, 11días Ourococcus multisporus 2 mg/L y 2%, 11días C.vulgaris 2 mg/L y 0, 11días Chlamydomonas mexicana 2 mg/L y 56%, 11días Bold´s Basal Medium + Acetato de sodio (4g/L) Biodegradación > acumulación y adsorción Nannochloris sp. 57 ng/L y 100%, 7días Water from Las Vegas Wash Fotólisis directa Bai & Acharya, 2017 Mezcla de consorcios de algas y bacterias en HRAP 1,31 mg/L y 20,1%, 24h (8h luz solar/16h de oscuridad) Aguas residuales domésticas reales Fotodegradación durante el día y adsorción durante la noche Hom-Diaz et al., 2017 Mezcla de consorcios de algas y bacterias en HRAP de 1L 1,11 mg/L y 83,8%, 24h Fotodegradación Enrofloxacina S.obliquus 1 mg/L y 23%, 11días Bold´s Basal Medium Biodegradación > acumulación y adsorción Xiong et al., 2017a Chlamydomonas mexicana 1 mg/L y 25%, 11días C.vulgaris 1 mg/L y 26%, 11días Ourococcus multisporus 1 mg/L y 18%, 11días Micractinium resseri 1 mg/L y 20%, 11días Consorcios de microalgas de las cinco especies anterioes 1 mg/L y 26%, 11días Aguas residuales domésticas reales Tetraciclina Algas con lodos activados 2 mg/L y 97%, 24h (12h luz y 12h osuridad) Water from Las Vegas Wash Fotodegradación, biodegradación, adsorción e hidrólisis Norvill et al., 2017 Trimetoprima Nannochloris sp. 1,6 ng/L y 11%, 350h F/2 medium Biodegradación, fotólisis Bai & Acharya, 2017 Nannochloris sp. 10 μg/L y 0, 14días Bai & Acharya, 2016 18 3.4 Mecanismos de eliminación de antibióticos mediante el uso de microalgas 3.4.1 Adsorción Es el proceso de eliminación de contaminantes mediante la unión pasiva de estos a un material sólido. (Bai & Acharya, 2016) Se emplea como adsorbentes el biocarbón, carbón activo y nanomateriales siendo las microalgas lo más eficiente. Se puede lograr mediante los grupos funcionales y ensamblajes de polímeros (similares a la celulosa, hemicelulosas y proteínas, etc) en las paredes celulares como un proceso extracelular. Su eficacia viene dada mediante el uso de biomasa de algas muertas para adsorber antibióticos y el rendimiento varía significativamente según su funcionalidad, estructuras e hidrofilicidad. Generalmente, es deseable cuando el antibiótico es más hidrofóbico que hidrofílico y lleva una carga eléctrica opuesta a la microalga como ocurre en la tetraciclina. Este proceso se logra principalmente a través de enlaces de hidrógeno, atracción electrostática, partición y efecto hidrofóbico. Figura 3:Posibles mecanismos durante la adsorción de antibióticos 19 3.4.2 Acumulación A diferencia de la adsorción, este proceso es intracelular. (Bai & Acharya, 2016). Algunos antibióticos pueden atravesar las membranas celulares de las algas y posteriormente ser asimilados por las células. Estos pueden extraerse mediante sonicación junto con una mezcla de diclorometano/metanol (v:v=1:2) (Song et al., 2019). Dentro de este grupo destacan la trimetoprima y doxiciclina. Otros antibióticos pueden inducir la producción de especies reactivas de oxígeno, que es esencial para controlar el metabolismo celular en concentraciones normales, pero que provocan daños graves en células o finalmente la muerte si se encuentran en exceso (Xiong et al., 2018). 3.4.3 Biodegradación Describe el proceso de descomposición de los antibióticos por parte de las algas dentro o fuera de las células. Se diferencia los mecanismos intra y extracelulares mediante el análisis de los productos intermedios/finales de los antibióticos en el medio y en la biomasa o mediante el uso de enzimas extraídas de las algas. Se puede clasificar el metabolismo de las algas en degradación co-metabólica y en patrones de degradación metabólica. La degradación co-metabólica utiliza enzimas no específicas para degradar los antibióticos con aporte adicional de carbono y energía, mientras que, en el proceso de degradación metabólica, las algas utilizan antibióticos como únicas fuentes de carbono y energía con enzimas específicas. En particular, durante el co-metabolismo aumentaron la adición de sustratos orgánicos tales como el metanol o el acetato de sodio para promover la biodegradación de la ciprofloxacina. (Xiong et al., 2017b). Con base en las funcionalidades enzimáticas, la biodegradación de antibióticos puede tratarse como un proceso de catálisis enzimática de dos fases. En la primera fase, estos pueden hidrolizarse, oxidarse o reducirse enzimáticamente a compuestos más hidrófilos pueden ser catalizados por otro grupo de enzimas como las glutatión-Stransferasas para producir moléculas más pequeñas y con menor toxicidad, siendo su 20 resultado la apertura del anillo epóxido de los antibióticos para proteger contra el daño oxidativo a las células de algas. (Ding et al., 2017) Independientemente de los diferentes mecanismos de eliminación de antibióticos discutidos anteriormente, la hidrólisis, la ruptura de la cadena lateral, la hidroxilación, la escisión del anillo, la desmetilación, la descarboxilación y la deshidroxilación pueden tener lugar cuando se biodegradan los antibióticos. (Xiong et al., 2018) 3.4.4 Fotodegradación Incluye la fotodegradación directa de los antibióticos aportada por la luz y su fotodegradación indirecta la cuál es inducida por los compuestos reactivos producidos por las algas en presencia de la luz. La mayoría de los antibióticos residuales en el agua natural se degradan en la fotodegradación indirecta debido a sus peligros potenciales, efectos tóxicos y persistencia. Además, las algas juegan un papel importante en este proceso ya que actúan como fotosensibilizadores, por lo que secretan materia orgánica extracelular (EOM) e inducen la generación de especies activas. (Figura 4). Figura 4:Esquema del mecanismo de degradación de antibióticos en agua que contiene algas con irradiación 3.4.5 Hidrólisis La descomposición de los antibióticos también se puede lograr por hidrólisis en el medio de crecimiento de las microalgas. Estas reacciones aumentaron la polaridad y la hidrofilicidad de los antibióticos, y, por lo tanto, facilitaron la solubilización de ellos y su posterior biodegradación por parte de las microalgas (Wang et al., 2018). 21 Figura 5:Mecanismos de degradación y desintoxicación de antibióticos por microalgas 3.5 CE en purines 3.5.1 Los productos de medicamentos veterinarios (PVM) y biocidas en el estiércol La difusión de medicamentos veterinarios (PVM) y biocidas a través del estiércol en áreas agrícolas es perjudicial al medio ambiente ya que contiene materia orgánica, nitrógeno, fósforo inorgánico y metales. Por lo tanto, estos compuestos pueden llegar a ser ingeridos por el ser humano a través de la cadena alimentaria y el ciclo del agua. Los productos de medicamentos veterinarios (PVM) son excretados por los animales tratados en forma de sustancias originales inalteradas y compuestos metabolizados. Estos excrementos se recogen y se almacenan principalmente como estiércol líquido o sólido en lagunas o se aplica como fertilizantes/abonos en tierras de cultivo y prados (pastizal). En cambio, las biocidas, se utilizan para la desinfección de los establos. Teniendo en cuenta las condiciones del entorno como puede ser la temperatura de almacenamiento, el contenido de materia seca, el valor del pH, la microbiología basándome en las condiciones aeróbicas o anaeróbicas y la alimentación de los animales, los PVM y los biocidas pueden interferir más o menos en la transformación en el estiércol líquido. La transformación bajo condiciones aeróbicas suele ser más dinámico que en condiciones anaeróbicas, al igual que, la alta temperatura favorece la degradación. 22 Además, puede ocurrir otros procesos como la volatilización, la sorción y la formación de residuos no extraíbles (NER) que ayudan a la disipación de los principios activos. Se llevó a cabo un estudio donde se recolectaron datos de PVM y se evaluaron con respecto al origen, las características del estiércol, las concentraciones máximas y mínimas encontradas y el porcentaje de compuestos identificados. Se analizaron muestras de estiércol y se encontraron principios activos, metabolitos y productos de transformación de PVM. La mayoría de las veces, las muestras se analizaron en busca de sulfonamidas, tetraciclinas y fluoroquinolonas. Para la sulfadiazina y la clortetraciclina, se encontraron concentraciones que excedieron las concentraciones ambientales pronosticadas. Sin embargo, en las biocidas se ha trabajado sin obtener aún resultado. Los análisis se realizaron en América del Norte (Canadá), en Europa (Austria, República Checa, Dinamarca, Alemania, Italia, Suiza) y en Asia (China, Japón). Se calcula las concentraciones ambientales previstas (PEC) evaluando el riesgo ambiental de los PVM (prescindiendo de las concentraciones ambientales medidas (MEC)). Se relaciona con el peso húmedo que se expresa en mg/kg ww estiércol y el contenido de nitrógeno. Viene dado de la siguiente forma: 𝑃𝐸𝐶𝑤𝑤 𝑒𝑠𝑡𝑖é𝑟𝑐𝑜𝑙 [𝑚𝑔 𝑘𝑔]=𝐷×𝐴𝑑×𝐵𝑤×𝐹ℎ 𝑁𝑠 ×𝑁𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 1000 Siendo D la dosis diaria del principio activo (mg/kgpeso corporal día), Ad el número de días del tratamiento (día), Bw el peso corporal del animal (kg peso corporal), Fh la fracción de rebaño tratado (valor entre 0 y 1), Ns el nitrógeno producido durante el tiempo de almacenamiento (kg N) y Ntotal el contenido de nitrógeno del estiércol específico (kgN/kg estiércol húmedo). Los valores predeterminados para Bw, Fh y Ns se conceden en la guía de la EMA, con respecto al tipo del animal (ternera, vaca lechera, bovino de 0 a 1, o más de 2, cerdo destetado, cerdo de engorde, cerda). Lamentablemente, no se puede deducir el tipo del animal exacto, por lo que introducimos para el Bw/N valores del mínimo y del máximo simplificados. Para el ganado, los valores mínimos y máximos de Bw/Ns son 28,33 y 56 kgpeso corporal/ (kg N), respectivamente. En cambio, para los cerdos, estos valores se encuentran entre 34,21 y 37,88 kgpeso corporal/ (kg N). Los valores 23 predeterminados para D y Ad se indican en el resumen de las características del producto (RCP). El estiércol vacuno líquido posee un Ntotal entre 3,2 y 4,7 g/L, mientras que el porcino oscila entre 2,8 y 6,5 g/L. Los datos se muestran en la Tabla 7. 24 Tabla 7: Sulfonamidas, Tetraciclinas, Fluoroquinolonas y otros medicamentos veterinarios y sus metabolitos y productos de transformación encontrados en el estiércol Sustancia Referencia Matriz Origen Mínimo Máximo Unidad Comentarios o cita del contenido de materia seca n n positivo % positivo Sulfadiazina Engels, 2004 estiércol porcino Alemania (NI) 0,7 235,1 mg/kg (ww) 0,5-16,8% (mean 5%) 344 100 29 Hamscher et al., 2005 estiércol porcino Alemania 3,5 11,3 mg/kg (dw) 9,6-9,8% 3 2 67 Hamscher et al., 2002 estiércol porcino Alemania (BY) 0,1 5 mg/kg (ww) 0,2-17.3% (mean 3,7%) 380 19 5 Luo & Zhou, 2010 estiércol porcino y aviar China 0,16 0,78 mg/kg (dw) ¨Estiércol porcino liquido¨ (ns) 6 2 33 Jacobsen & HallingSørensen, 2006 estiércol porcino Dinamarca 0,63 2,1 mg/kg (dw) 2,8-13,4% 6 2 33 Pfeifer et al., 2002 (ns) Alemania 0,011 0,08 mg/kg (ns) ¨Estiércol líquido¨(ns) 4 2 50 Wohde et al., 2016 estiércol porcino y vacuno Alemania (NW) - 0,65 mg/kg (dw) ¨Estiércol líquido y estable¨(ns) 34 5 15 Wohde et al., 2016 estiércol porcino Alemania 0,7 35,3 mg/kg (ww) 0,7-16,11% 176 86 49 Zhao et al., 2010 estiércol porcino, vacuno y aviar China 0,02 3,12 mg/kg (dw) (ns) 143 14 10 Sulfadimidina Martínez-Carballo et al., 2007 estiércol porcino Austria - <20 mg/kg (dw) ¨Estiércol líquido¨(ns) 30 18 60 Aust et al., 2008 estiércol vacuno Canada - 9,99 mg/kg (dw) 24,4-44,4% (mean 37%) 6 4 67 Burkhardt et al., 2005 estiércol porcino Suiza - 14,4 mg/kg (ww) ¨En el sobrenadante¨(fase acuosa) (ns) 1 1 100 Christian et al., 2003 estiércol porcino Alemania 1 1,1 mg/kg (ww) (ns) 2 2 100 Christian et al., 2003 estiércol vacuno Alemania <0,1 <0,1 mg/kg (ww) (ns) 2 2 100 Engels, 2004 estiércol porcino Alemania(NI) 0,7 167 mg/kg (ww) 0,5-16,8% (mean 5%) 344 183 53 Hamscher et al., 2005 estiércol porcino Alemania - 7,2 mg/kg (dw) 9,6-9,8% 3 1 33 31 Figura 6: La ocurrencia y el destino de varios antibióticos en dos sistemas de tratamiento de aguas residuales de granjas porcinas a gran escala (Granja A: digestor anaeróbico-A2/O-laguna; Granja B: manto de lodo anaeróbico de flujo ascendente (USAB)-(A/O)2 – laguna) En la actualidad, se está experimentando con diferentes configuraciones y tipos de fotobiorreactores, que implica el cultivo de biomasa algal para la depuración de aguas residuales agrícolas y urbanas y así eliminar los micro contaminantes peligrosos. 3.5.2.1 Descripción de los diferentes tipos de fotobiorreactores (PBR) Los fotobiorreactores cerrados (PBR, photo-bioreactors) son una clase de reactores los cuales no interaccionan con el entorno circundante. Estos están disponibles en varios diseños, por ejemplo, elevador de aire, columna de burbujas, placa plana, tanque agitado y tubular. El PBR tubular consta de tubos lineales de vidrio/plástico dentro del biorreactor, mientras que los PBR planos están formados por contenedores rectangulares transparentes. El diseño reciente de los PBR proporciona un cultivo fácil, exposición a la luz y alta producción. El airlift PBR es útil para la producción de biomasa de algas y el tratamiento eficiente de los contaminantes de las aguas residuales. El burbujeo de gas mezcla el cultivo al permitir que el cultivo se mueva entre la parte ascendente y la parte inferior del PBR. A diferencia de los sistemas de estanques 32 abiertos, los estanques cerrados brindan una mejor regulación sobre los parámetros del sistema (pH, temperatura, aireación, agitación e intensidad de la luz solar), mayor CO2, eficiencia de transferencia y densidad de cultivo. Hasta la fecha, los PBR se han empleado eficazmente para eliminar varios contaminantes, incluidos nutrientes, antibióticos, micro contaminantes y metales pesados a escala de laboratorio y piloto; sin embargo, los gastos de construcción y mantenimiento de los PBR han restringido su uso a gran escala. El tratamiento basado en biorreactor algal resultó efectivo para los contaminantes de las aguas residuales. (Singh & Sharma, 2012) Figura 7: Funcionamiento de un PBR tubular horizontal 3.5.2.2 Nuevas estrategias para eliminar los micro contaminantes peligrosos Para comprobar la capacidad de supresión de microcontaminantes, se está llevando a cabo un estudio analítico de los residuos influentes y efluentes en los reactores (LópezSerna et al., 2019). Además, la biomasa se utilizará como biofertilizante, alimento para animales o para la producción de productos de valor agregado como carbohidratos y proteínas, para lo cual es recomendable determinar las concentraciones de fármacos en la biomasa. En cuanto a la determinación de microcontaminantes orgánicos en algas (algas, plancton y microalgas), se ha descrito la extracción de compuestos organoclorados, éteres de difenilo polibromados e hidrocarburos de petróleo con una mezcla nhexano/acetona y otros disolventes de baja polaridad. Asimismo, se han determinado algunos productos farmacéuticos bioacumulados en algas sometiendo la muestra a hidrólisis con NaOH o después del tratamiento con diclorometano/metanol para lograr la lisis celular (proceso de ruptura de la membrana celular de bacterias o células que provoca la salida del material biológico). Por lo contrario, los productos farmacéuticos, 33 especialmente los antibióticos, son compuestos con una polaridad relativamente alta, de ahí que su extracción a partir de muestras sólidas se suele realizar a través de una agitación con mezclas de disolventes ricas en agua. Por otro lado, la técnica QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) en la preparación de muestras se aplica tanto en las propiedades fisicoquímicas de los analitos diana como en la naturaleza de las muestras con diferente coherencia y complejidad. Esta destaca por la sencillez del procedimiento y su rapidez, así como el mínimo uso de reactivos y disolventes. Se utiliza parámetros como el disolvente de extracción, la relación disolvente/agua y el adsorbente de limpieza correspondiente a cada caso particular para mejorar el rendimiento del procedimiento de extracción. Se ha determinado las concentraciones de medicamentos veterinarios en la biomasa de microalgas de fotobiorreactores diseñados por el tratamiento de aguas residuales de cerdos. (Figura 8). Los resultados sugieren que la acumulación de fármacos en la biomasa alga aumenta, en términos generales, a medida que aumenta la concentración de fármacos en el efluente. De la misma manera, se deduce que las drogas lipofílicas tienden a ser más retenidas por las microalgas. Por esta razón, fármacos como sulfadiazina, sulfadimidina y tilosina se observaron exclusivamente en el efluente de algunos ensayos, debido a que los valores de log P son inferiores a 1, por lo tanto, poseen una mayor afinidad en la fase acuosa. Por lo contrario, en fármacos como ciprofloxacina, enrofloxacina y tiamulina se detectaron exclusivamente en la biomasa de otros ensayos concordando con sus valores altos de log P. (López-Serna et al., 2022) 34 Figura 8: Representación mediante un ajuste lineal las concentraciones encontradas en biomasa frente a: a) concentraciones en el efluente y b) logaritmo del coeficiente de partición, sin considerar los datos encerrados en un círculo. 3.6 Valorización de subproductos Las microalgas son una materia prima de origen biológico y una excelente fuente de carbohidratos, proteínas y lípidos. En la fotosíntesis, las microalgas consumen CO2 como fuente de carbono y aprovechan la luz solar como fuente de energía. En las aguas residuales, su tratamiento y valorización conlleva numerosas ventajas tales como la recuperación de nutrientes y el mantenimiento del equilibrio ecológico en los ecosistemas acuáticos. La valorización de la biomasa algal puede ser integral y fraccionada. Podemos distinguir una valoración fraccionada sólida para los lípidos, proteínas y carbohidratos mientras que para los péptidos y monosacáridos se analizaron las líquidas. Por lo tanto, en la valoración fraccionada de proteínas se distinguen los péptidos empleados como bioestimulantes para aplicaciones agrícolas e 35 industriales o los aminoácidos en la alimentación animal. En la de carbohidratos discernimos los monosacáridos fermentables para la producción de biocombustibles. Y en la lipídica no es rentable debido a que en aguas residuales las microalgas cultivadas poseen un mayor contenido en nutrientes que en lípidos. Los productos obtenidos de la valorización se utilizan para producir biogás y fertilizantes a través de una biometanización (digestión anaeróbica). El primer paso a tener en cuenta en una valorización, denominado pretratamiento, es la disrupción de la pared celular, formada por algas, proteínas y polisacáridos, utilizando como enzimas las proteasas y celulasas. El objetivo de este proceso es maximizar la solubilidad y minimizar la degradación de los componentes. La hidrólisis enzimática es un método de disrupción utilizando como enzimas las proteasas y celulasas. Las proteasas catalizan la ruptura de enlaces péptidos en proteínas y péptidos y se clasifica en función de la posición en la que esté localizada. Podemos distinguir 2 tipos, endo-proteasas y exo-proteasas.Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína, por el contrario, las exoproteasas eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos. (Tacias-Pascacio et al., 2020) 3.6.1 Hidrólisis Enzimática Se han empleado 3 enzimas comerciales proporcionadas por Novozymes A/S: alcalasa 2,4L, protamex y celulasa (Tabla 9) regulada por unas condiciones óptimas del fabricante (Martín Juárez et al., 2016). La enzima alcalasa es una serina endopeptidasa producida a partir de una cepa de Bacillus licheniformis que consiste principalmente en subtilisina A. Ésta es adecuada para la hidrólisis de proteínas y muestra una actividad mínima de 2.4 UA/g. Por su parte, la enzima protamex es una endo y exoproteasa, combinación de cepas de Bacillus licheniformis y Bacillus amyloliquefaciens, que presenta una actividad enzimática de 1,7 UA/g59, también adecuada para la hidrólisis de proteínas. Por último, la enzima celulasa es una preparación enzimática proveniente de una cepa de hongo denominada Trichoderma resei. Es una celulasa que descompone la celulosa en glucosa y tiene una actividad enzimática de 65 FPU/mL. 36 Tabla 9: Tipos de enzimas y condiciones de hidrólisis enzimática. Enzima pH Concentración Tipo Actividad Alcalasa 2,4L 8 5:100 v/w biomasa seca Serina endopeptidasa 2,4 UA-A/g Protamex 6,5 1:100 w/w biomasa seca Serina endopeptidasa 0,8-1,4 AU-n/g Celulasa 1,5L 4,8 10 UFP/g carbohidratos Forma de la celulasa: Trichoderma reesei 65 UFP/mL Para alcanzar el valor óptimo proporcionado de pH por el fabricante, la protamex y Celulasa añade HCl en cambio en alcalasa se añade NaOH. La alcalasa es conocida como endo-proteasas alcalinas de serina con una gran importancia desde el punto de vista industrial (Tacias-Pascacio et al., 2020). Posee una actividad de 2,4 AU-A/g. Por otro lado, protamex es una mezcla de alcalasea y neutrase, un endo-proteasa con una actividad enzimática de 0,8-1,4 AU-N/g. Éste proporciona una distribución de peso molecular de proteína mayor con respecto a las comentadas. Una vez concluida esta etapa, se centrifuga la biomasa a 4 ºC y 10.000 rpm durante 10 min para separar las fracciones sólidas y líquidas. En un diseño experimental de Taguchi se estudió el efecto de 3 parámetros sobre la obtención de productos de valor añadido: tipo de biomasa (A), tipo de enzima (E) y tiempo de hidrólisis (T) considerando también los efectos de interacción entre ellos (ET, EA y TA) (Martín-Juárez et al., 2019) Se programaron utilizando arreglos ortogonales de los diseños de Taguchi los cuáles estiman los efectos de los factores en la media de respuesta y en la variación. Este diseño experimental permitió probar cada parámetro en tres niveles. Para el tipo de enzima se clasificaron en alcalasea 2,4L (E1), protamex (E2) y celulasa 1,5L(E3) en cambio, para el tiempo de hidrólisis en una hora (T1), tres horas (T2) y cinco horas (T3). Sin embargo, el tipo de biomasa solo se ordenó en dos niveles, biomasa bacteriana-microalgal (A1) y biomasa microalgal cultivada en medio sintético (A2). El efecto de los parámetros individuales y sus interacciones sobre las diferentes variables de respuesta se estudió mediante un análisis de varianza multifactorial (ANOVA). Las diferencias significativas entre los rendimientos medios obtenidos por 37 los diferentes niveles se determinaron mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (considerando un nivel de confianza del 95%). No se observó la solubilización de lípidos después de la hidrólisis enzimática en todos los experimentos, por lo que no se valorizarían. Los resultados de solubilización de carbohidratos fueron discretos en todos los experimentos. Cabe destacar que el rendimiento fue mayor para las enzimas celulasas con un % del 23,5 al 38,5 que para las enzimas proteasas con un % del 15,2 al 27,3. En particular, la mayor solubilización de 38,5% se obtuvo en el experimento con la biomasa de bacterias-microalgas (A1), la enzima celulasa (E3) y un tiempo de hidrólisis de cinco horas (T3). Por el contrario, la menor solubilización de carbohidratos del 15,2% se obtuvo con la enzima alcalasa (E1) operando con microalgas cultivadas en medios sintéticos (A2) y un tiempo de hidrólisis de una hora (T1). Este rendimiento mejora ligeramente al aumentar los tiempos de hidrólisis. El análisis ANOVA demostró que todos los parámetros operativos individuales estudiados tuvieron un efecto significativo en la solubilización de carbohidratos (p<0,05), siendo el tipo de alga (A) el parámetro más importante, seguido del tipo de enzima (E) y el tiempo de hidrólisis (T) (con un 31% y 11,7% respectivamente). La prueba de rangos múltiples de Duncan confirmó con un nivel de confianza del 95% que existían diferencias significativas entre las dos biomasas. El mayor rendimiento de recuperación coincidió con el experimento de mayor solubilización (38,5%) denominado biomasa A1, enzima celulasa con un tiempo de hidrólisis de cinco horas. En cuanto a la obtención de proteínas, como cabe esperar las enzimas proteasas obtuvieron resultados con rendimientos mayores con un % del 26,2 al 64,9 que para las enzimas celulasas con un % del 13,1 al 18,8. Gracias al SEM se observó un mayor grado de rugosidad y daño a las paredes celulares en la biomasa de bacteriasmicroalgas (A1) que microalgas cultivadas en medios sintéticos (A2), sin producirse la lisis celular. En particular, la mayor solubilización de 64,9% se obtuvo en el experimento con las microalgas cultivadas en medios sintéticos (A2), la enzima alcalasa (E1) y un tiempo de 38 hidrólisis de cinco horas (T3). Por el contrario, la menor solubilización de proteínas del 13,1% se obtuvo con la enzima celulasa (E3) operando con la biomasa de bacteriasmicroalgas (A1) y un tiempo de hidrólisis de una hora (T1). Estos mayores rendimientos en A2 que en A1 pueden deberse a la estructura de la pared celular y al tipo de proteínas ocasionado por las distintas condiciones de crecimiento. El análisis ANOVA demostró que todos los parámetros operativos individuales estudiados tuvieron un efecto significativo en la solubilización de proteínas (p=0), siendo el tipo de enzima (E) el parámetro más importante, representando el 59,6% de la contribución, seguido del tipo de alga (A) y el tiempo de hidrólisis (T) (con un 15.9% y 5% respectivamente). La prueba de rangos múltiples de Duncan confirmó con un nivel de confianza del 95% que existían diferencias significativas entre las biomasas. La recuperación de los péptidos fue más baja que la solubilidad de las proteínas, esto se debe a una cierta degradación. Para la biomasa de microalgas cultivadas en medios sintéticos (A2) fue de 32,4%, 13,7% y 5,3% a alcalasa (E1), protamex (E2) y celulasa (E3) respectivamente. En cambio, para biomasa de bacterias-microalgas (A1) fue de 34,2%, 19,6% y 6,6% a alcalasa (E1), protamex (E2) y celulasa (E3) respectivamente. Estos resultados mostraron la efectividad de la hidrólisis enzimática con proteasas para la extracción de proteínas con un tratamiento suave ocasionando las perdidas mínimas, incluso en el mayor tiempo cuando se superpone a la biomasa de bacteriasmicroalgas cultivadas en aguas residuales de cerdos (P). (Rojo et al., 2021). 3.7 Métodos de análisis Para la determinación de CE en muestras como el purín, se distingue principalmente dos etapas: el tratamiento de la muestra, el cuál abarca la mayor parte del proceso, seguido del análisis cromatográfico, buscando condiciones que permitan analizar compuestos de distintas propiedades químicas en la misma muestra. En la primera etapa, se diferencia a su vez dos procesos en el caso de muestras sólidas, uno primero de extracción sólido-líquido (SLE) asistida generalmente por 39 ultrasonidos para solubilizar los analitos de interés y a continuación otro proceso de limpieza-concentración a través de una extracción en fase sólida (SPE). (Pérez-Lemus et al., 2019) 3.7.1 Extracción sólido-líquido (SLE) No se debe excluir este proceso inicial del tratamiento de muestra sólidas ya que los analitos que se van a determinar se encuentran generalmente en concentraciones a nivel de trazas en matrices complejas. En el caso de muestras líquidas solo se lleva a cabo la limpieza y concentración de las muestras. 3.7.2 Extracción en fase sólida (SPE) En este proceso se suele usar como sorbente los cartuchos de fase inversa Oasis HLB permitiendo la extracción de compuestos ácidos, básicos y neutros en diferentes matrices. La SPE consta de 5 etapas (Afonso-Olivares et al., 2017): - Activación del cartucho: consiste en la solvatación de los puntos activos con MeOH y equilibración del sorbente con agua ultrapura. - Elución de la muestra: se hace pasar la muestra por los cartuchos para retener los analitos de interés y eliminar los compuestos extraídos de la matriz. - Lavado del cartucho: se eliminan posibles interferentes que hayan podido quedar retenidos junto con los analitos. - Elución: se deposita un disolvente en el cartucho para minimizar la interacción analito-adsorbente y arrastrar los analitos de interés. - Evaporización/preconcentración: se denomina etapa de preconcentración. Consiste en eliminar el eluyente a través de una corriente de gas inerte, seguido de una redisolución con metanol y otra evaporización posterior. 3.7.3 Análisis Cromatográfico 40 Se realiza mediante UHPLC en fase inversa, con columnas de ODS, y con fases móviles H2O/metanol ó H2O/acetonitrilo en modo gradiente. Como detector se utiliza un equipo de espectrometría de masas (MS/MS), generalmente con analizador QqQ. Se emplea UHPLC en vez de HPLC debido a que mejora la eficacia de separación, obteniéndose picos más estrechos y límites de detección ligeramente inferiores. Sin embargo, al aumentar la presión del sistema, se debe utilizar bombas especialmente adaptadas para ello. (Wang et al., 2019). 3.8 Compuestos estudiados En la Tabla 10 se realiza una clasificación de los 25 CE estudiados agrupados por categorías terapéuticas y familias. Además, en esta tabla se muestra su correspondiente fórmula molecular, estructura y peso molecular. Básicamente se trata de antibióticos muy utilizados en la ganadería porcina, y de uso autorizado por la legislación. 47 4 OBJETIVOS ➢ Conocer la estabilidad de determinados principios activos veterinarios durante el proceso de hidrólisis enzimática propuesto para la obtención de proteínas a partir de biomasa algal. ➢ Conocer la estabilidad de determinados principios activos veterinarios durante los procesos de hidrólisis química propuestos para la obtención de proteínas a partir de biomasa algal. ➢ Evaluar la influencia de la matriz del medio enzimático y químico en la cuantificación de los analitos mediante espectrometría de masas ➢ Ensayar nuevos métodos de análisis para determinar los contaminantes emergentes mencionados en hidrolizados enzimáticos de biomasa algal. 48 5 EXPERIMENTAL El tratamiento de muestra se llevó a cabo en los laboratorios del Instituto de Procesos Sostenibles (ISP) en la Universidad de Valladolid. 5.1 Materiales, reactivos e instrumentación Tabla 11: Materiales y reactivos empleados Material Reactivos Agujas estériles para jeringas y evaporador Acetona, Labbox Bala de nitrógeno seco Acetonitrilo pureza HPLC (ACN), Labbox Bomba de vacío Ácido Acético glacial (HAcO),Labbox Capilares volumétricos de 100-200μL Ácido Clorhídrico 2M, Labbox Cartuchos Oasis HLB de 3mL y 60 mg de relleno Ácido Fórmico grado HPLC, Labbox Embudo pesasustancias de borosilicato de vidrio AEDT, sal disódica, Sigma-Aldrich Filtros Captiva de 0,22μm de tamaño de poro Agua miliQ, Waters Filtros de jeringa de 0,22μm y 0,45 µm de tamaño de poro de PTFE hidrófobo, no estériles Agua tipo II, Waters Jeringas desechables de plástico de 2mL Carbón activo en polvo, Labbox Matraces aforados de 10,25,100 y 250 mL Cloruro de sodio, Labbox Micropipetas de 100 Gel de silice,Labbox Pipetas Pasteur de vidrio Hidróxido de sodio,Labbox Tapones roscados para tubos SPE y viales cromatográficos Metanol (MeOH) pureza HPLC, Labbox Tubos Falcon de 50mL de polietileno Nitrógeno seco, Linde-gas PSA, Scharlab Patrones de los contaminantes emergentes,pureza cromatográfica (Sigma-Aldrich) Sodio acetato trihidratado (NaAcO), Labbox En la Tabla 12 se acogen los equipos instrumentales utilizados 49 Tabla 12: Equipos empleados Equipos Purificador de agua ultrapura (MiliQ), Milli-Q Advantage A10 de Merck Millipore de la marca Waters Chromatography Balanza analítica, Mettler Toledo Bomba de vacío Centrífuga, Thermo Cientific Legent RT+ Cromatografía/espectrometría de masas en tándem: - UHPLC ExionLC AD con inyector automático Espectrómetro de masas SCIEX 6500+ Evaporador de nitrógeno, Organomation N-Evap 11250 Manifold de extracción en fase sólida Mezclador Vortex, Thermo Cientific pH-metro, Crison Ultrasonidos, Sonorex Digitex Bandelin 5.2 Preparación de una disolución multipatrón A partir de disoluciones individuales de 1000 mg/L de cada uno de los 25 CE a estudiar, se prepara una disolución de 20 mg/L (ss) tomando 200μL de cada disolución madre y se vierte a un matraz aforado de 10 mL enrasándose con MeOH. Con este multipatrón se dopará las muestras en cada uno de los ensayos y se prepararán las líneas de calibrado. 5.3 Estabilidad durante la hidrólisis 5.3.1 Obtención de los hidrolizados enzimáticos En primer lugar, se prepara el medio, para ello se añade 0,5g de la enzima Promatax previamente pesado en la balanza analítica con la ayuda de un embudo pesasustancias, en un matraz aforado enrasándose con agua miliQ. A continuación, se procede a preparar 3 ensayos enzimáticos, cada uno de ellos con condiciones diferentes, y con una repetividad de n=5. En el primer ensayo, se dopa 5 mL del medio con 400 μL del multipatrón ss, se introduce en un ultrasonido de baño (Figura 9) durante 1hora para simular el proceso 50 de hidrólisis. Se diluye 1:5 en un matraz aforado de 25mL enrasándose con agua miliQ y se congela en un congelador de -20°C hasta el día de inyección. En el segundo ensayo, se procede de forma similar a la anterior, pero sin realizar el proceso de hidrólisis, de esta forma se dispone de los analitos en la matriz de muestra para comparar los resultados de la muestra sin hidrolizar con aquellos de la muestra hidrolizada. En el tercer ensayo, se añade 5 mL de agua miliQ en un matraz aforado de 25mL, sin añadir la enzima, se dopa con 400 μL del multipatrón ss, se diluye 1:5 enrasándose con agua miliQ y se congela hasta el día de inyección en 2 viales de 24,5mL para muestras. De esta forma se podrá estudiar la influencia de la matriz (enzima proteasa) en el análisis. Finalmente, se filtra cada muestra sobre un filtro de 0,22μm de tamaño de poro de PTFE hidrófobo, vertiéndose a los viales cromatográficos ámbar de 2mL para inyectarlos directamente al UHPLC/MS, sin olvidarnos de una previa agitación mediante vortex. Figura 9: Baño de ultrasonidos empleado para la hidrólisis enzimática 5.3.2 Obtención de los hidrolizados químicos En este caso se procede a realizar 5 ensayos distintos para conocer las estabilidades de los contaminantes en los procesos de hidrólisis en medio ácido y básico. Los ensayos se realizan por quintuplicado. En el primer ensayo, se dopa 5 mL de NaOH 2M se dopa con 100 μL del multipatrón ss, se introduce en el AutoClave a 120°C durante 1hora. Posteriormente se vierte en un 51 matraz aforado de 10 mL enrasándose con ácido acético 4M, y finalmente se congela en un congelador de -20°C hasta el día de inyección. En el segundo ensayo, se dopa 5 ml de NaOH 2M con 100 μL del multipatrón ss y se deja reposar a temperatura ambiente 1 hora. Posteriormente se vierte en un matraz aforado de 10 mL enrasándose con ácido acético 4M, y se congela en un congela a - 20°C hasta el día de su análisis. Comparando con los resultados del ensayo anterior se puede conocer la influencia del calentamiento en la estabilidad de los contaminantes. En el tercer y cuarto ensayo se procede de forma similar al primer y segundo ensayo, pero dopando ahora HCl 2 M para simular una hidrólisis en medio ácido y enrasando con acetato sódico 4 M para neutralizar el medio. En el quinto ensayo, se dopa 5mL de agua miliQ con 100 μL del multipatrón ss, y se enrasa con una disolución reguladora HAcO/NaACO 4M y NaCl 2M en un matraz de 10 mL. Se congela en un congelador de -20°C hasta el día de su inyección. Esa disolución servirá para conocer la influencia de la matriz ácida, o alcalina, en el análisis de los contaminantes. Antes de la inyección en UHPLC-MS/MS los ensayos se filtran sobre un filtro de 0,22μm de tamaño de poro de PTFE hidrófobo, vertiéndose a los viales cromatográficos ámbar de 2mL. Figura 10:Autoclave empleado para la hidrólisis química a la alta temperatura y presión que puede soportar el equipo 52 5.3.3 Cuantificación de los contaminantes en los hidrolizados químicos La cuantificación de los contaminantes en las muestras hidrolizadas en el autoclave debe realizarse mediante una línea de calibrado preparada en el mismo medio que las muestras para evitar errores de cuantificación debido al funcionamiento de la fuente de iones electrospray del espectrómetro de masas. Para ello se ha diseñado la siguiente estrategia. Inicialmente, con porciones de las muestras del primer y tercer ensayo (tratamiento con HCl y NaOH 2 M en autoclave) se prepara un composite o mezcla tomando 2,5 mL de cada uno de los ensayos similares. Seguidamente se prepara 11 patrones de calibración a partir de alícuotas de 1 mL del composite y añadiendo un volumen característico del multipatrón ss antes de diluir a un volumen fijo (10 mL) como se observa en la Tabla 13, enrasándose con agua miliQ en matraces aforados de 10mL. Se incluyen también dos blancos en los que no se dopa el composite. Mediante un calibrado adiciones patrón se calcula la concentración de analito en el composite. Tabla 13:Línea de calibrado para los hidrolizados químicos en el primer ensayo y el tercero. Nombre Blanco 1 Blanco 2 Pat 1 Pat 2 Pat 3 Pat 4 Pat 5 Pat 6 Pat 7 Pat 8 Pat 9 Pat 10 Pat 11 Cpat (ppm) - - 2 2 2 2 2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,05 0,05 Vmultipat (μL) - - 600 500 400 300 200 400 300 200 100 200 50 Vcomp (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Vfinal (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Los patrones se guardan a -20°C hasta el día de inyección y como habitualmente se filtra sobre 0,22μm antes del análisis mediante UHPLC/MS-MS. La línea de calibrado en matriz similar a la de las muestras se construye representando el área de pico frente a la concentración total de cada patrón, siendo esta concentración total la suma de la concentración del composite (determinada mediante un método de adiciones patrón con los puntos de la Tabla 13) y la concentración con que se ha dopado cada punto. 53 5.4 Ensayos de extracción sobre hidrolizados enzimáticos Los ensayos de estabilidad descritos se han realizado simulando un proceso de hidrólisis, sin presencia de biomasa algal. El motivo es que los hidrolizados de biomasa liberan cantidades significativas de proteínas/péptidos y carbohidratos que disminuyen considerablemente las áreas de pico de los contaminantes emergentes como consecuencia de su influencia en la interfase electrospray (“efecto matriz”), aumentando los límites de detección y cuantificación hasta cantidades que hacen inviable la aplicación de los métodos de análisis habituales para su determinación en muestras líquidas ensayados en trabajos anteriores (Calvo Tejo, 2021). La precipitación de las proteínas tampoco es una opción viable (Portela Monge, 2023). A continuación, se describen nuevos ensayos para la posible determinación analítica de los contaminantes emergentes considerados en este trabajo en hidrolizados enzimáticos ricos en proteína. 5.4.1 Preparación de muestras de biomasa algal liofilizada Inicialmente, se lleva a cabo una hidrólisis enzimática, para ello se mezclan 5g de una biomasa algal liofilizada (80% humedad), 0,5g de la enzima Protamax y 100 mL de agua miliQ en un vaso precipitado de 250mL. Se introduce en un baño de ultrasonidos (Figura 9) durante 1hora para calentar el medio, mejorar el contacto, y realizar la hidrólisis. Se vierte en 4 tubos Falcon de 50 mL. Se centrifuga la mezcla resultante durante 10 min a 7800 rpm. Se junta el sobrenadante centrifugado y se dopa con 100μL del multipatrón de 2 mg/L obtenido a partir del multipatrón ss con una correspondiente dilución 1:10. Los ensayos se hacen por duplicado. 5.4.2 Inyección directa (ID) de las muestras Estos ensayos se fundamentan en una extracción en fase sólida dispersiva con la que se pretende eliminar la matriz. En los ensayos de inyección directa se mezclan 4 mL de muestra de hidrolizado dopado con 5 mg,10 mg y 20 mg de carbón en polvo, 150 mg y 75 mg de PSA, y 150 mg y 75 mg silica (SiO2) respectivamente, todos ellos con una 54 previa activación, consistente en un calentamiento a 105 °C y a posteriori guardado en el desecador. La mezcla se agita manualmente durante 1 minuto y se filtra con ayuda de un filtro de jeringa de 0,45μm de tamaño de poro de Nylon para separar la fase sólida. La fase líquida se congela hasta el día de la inyección y entonces se filtra con ayuda de un filtro de jeringa de 0,22μm de tamaño de poro de PTFE hidrófobo. 5.4.3 Combinación de extracción en fase sólida (SPE) dispersiva con extracción en fase sólida clásica En este caso se ha realizado una extracción en fase sólida dispersiva mezclando 2 mL de hidrolizado enzimático dopado con diferentes adsorbentes, se ha centrifugado para separar el adsorbente y después se ha realizado una extracción en fase sólida clásica. Los adsorbentes usados han sido carbón activo (5 y 10 mg) y PSA (10 mg). Después de una agitación manual (1 min) se separa la fase líquida mediante filtración sobre un filtro de 0,45μm de tamaño de poro. A continuación, se procede con la etapa de limpieza o ‘clean-up’ mediante SPE (Figura 11). Figura 11:Equipo empleado para la SPE 1) Activación del relleno: se añade 3mL de MeOH a cada cartucho y se deja que el líquido pase a través de cartucho por gravedad (sin vacío). 2) Equilibración del sorbente: se añade 3mL de agua miliQ a cada cartucho, dejando que el líquido pase a través del cartucho por gravedad. 3) Elución de la muestra: 55 Se eluye la muestra después de la SPE dispersiva con la ayuda del sistema de vacío, para retener los analitos de interés sobre el relleno. Lavado del cartucho: se añade 2mL de agua miliQ por las paredes de cada cartucho para que eluya el líquido por gravedad. 4) Secado del cartucho: se conecta el sistema de vacío durante aproximadamente 20 minutos para forzar el paso de aire. 5) Se congela los cartuchos hasta el día que se vayan a eluir los compuestos 6) Elución de los analitos: se añade 2 mL de acetonitrilo ó metanol. El proceso se repite añadiendo otros 2 mL de disolvente. 7) Evaporación del extracto: Se evapora el disolvente recogido sobre tubos de vidrio en un evaporador bajo corriente de nitrógeno (Figura 12) hasta sequedad. Figura 12: Evaporador bajo corriente de nitrógeno 8) Redisolución del extracto con MeOH y transferencia al vial de inyección: se vierte en el tubo de vidrio seco 0,5 mL de MeOH. Con ayuda de una pipeta Pasteur, se recoge el líquido del tubo y se hace resbalar por las paredes de los tubos 6 veces para que se redisuelva todo el contenido. Tras estas 6 redisoluciones, se vierte ese líquido a un vial de inyección de 2 mL. Este proceso se repite dos veces más con otros 0,5 mL de MeOH cada vez. 56 9) Evaporización de los viales: se evapora de nuevo utilizando el mismo procedimiento hasta sequedad. 10) Se congela los viales con los extractos secos hasta el día de la inyección. 11) Redisolución en fase móvil: el día que se inyecten las muestras, se añade 1 mL de fase móvil 95:5 H2O/MeOH. Se agita bien con vortex para la solubilización del residuo seco. Se recoge el contenido del vial con una jeringa acoplada a una aguja, se retira la aguja de jeringa y se coloca un filtro de 0,22μm de tamaño de poro de PTFE. Se hace pasar el líquido a través del filtro y se lleva a un vial ámbar de 2 mL, el cual se inyecta en el UHPLC-MS/MS. Finalmente, se lleva a cabo la determinación cromatográfica de líquidos de ultra-alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS) empleado en el Laboratorio de Técnicas Instrumentales (LTI) de la Universidad de Valladolid: Figura 13: Equipo empleado en la determinación cromatográfica UHPLC-MS/MS 5.5 Determinación mediante UHPLC/MS-MS • Separación cromatográfica: Para determinar la concentración de los analitos a estudiar, se utiliza una columna Phenomenex de octadecilsilano Kinetex EVOC18 (2,1mm×50mm, tamaño de partícula 1,7μm). La fase móvil consiste en una mezcla H2O/MeOH (95:5) al 0,1% en ácido fórmico en modo gradiente para realizar la separación. El porcentaje de MeOH inicial comienza siendo del 5% durante 1 minuto, tras el cual se aumenta hasta un 95% en MeOH durante 2 minutos, y después se mantiene constante durante 3 minutos. Transcurridos estos 5 minutos, se reduce el porcentaje de MeOH al 5%, para reequilibrar el 63 Tabla 15: Hidrolisis enzimática. Resultados obtenidos del ANOVA y de las Prueba de t para cada CE (n=5) Compuesto Área Repetividad (%) ANOVA Prueba t, Efecto Matriz Prueba t, Estabilidad Ciprofloxacina Agua Hidrolizado Matriz Agua Hidrolizado Matriz p p Disminución de señal (%) p % degradación 1 1,9·108 1,99·108 1,94·108 10 9,8 9,4 ** ** 0 ** - 2 1,86·108 1,70·108 2,18·108 3 2,01·108 1,75·108 2,23·108 4 1,53·108 2,16·108 2,24·108 5 1,93·108 1,97·108 1,81·108 Dexametasona 1 1,43·106 1,21·106 1,19·106 5,2 15,9 17,5 ** 0,035 19,3 ** - 2 1,36·106 9,86·105 1,01·106 3 1,33·106 1,45·106 1,06·106 4 1,24·106 1,37·106 1,32·106 5 1,33·106 1,08·106 8,18·105 Doxiciclina 1 5,65·107 5,91·107 5,37·107 9,4 10,9 28,6 ** ** 0 ** - 2 4,86·107 5,26·107 6,80·107 3 5,54·107 5,26·107 6,39·107 4 4,49·107 6,72·107 7,30·107 5 5,34·107 5,43·107 3,11·107 Danofloxacina 1 2,29·108 2,24·108 2,58·108 7,0 9,3 14,8 ** ** 0 ** - 2 2,24·108 2,04·108 2,78·108 3 2,39·108 2,25·108 1,91·108 64 4 1,99·108 2,63·108 2,75·108 5 2,33·108 2,35·108 2,29·108 Fenbendazol 1 4,50·108 3,59·108 3,58·108 3,2 6,2 4,4 <0,0001 <0,0001 23,5 ** - 2 4,51·108 3,68·108 3,25·108 3 4,21·108 3,30·108 3,42·108 4 4,33·108 3,40·108 3,21·108 5 4,54·108 3,86·108 3,41·108 Florfenicol 1 1,43·107 1,13·107 1,14·107 4,7 11,6 10,8 ** 0,030 12,4 ** - 2 1,37·107 1,34·107 1,12·107 3 1,52·107 9,86·107 1,37·107 4 1,36·107 1,24·107 1,39·107 5 1,38·107 1,11·107 1,14·107 Oxitetraciclina 1 5,33·107 4,02·107 4,15·107 3,5 14,7 18,6 0,013 0,026 22,9 ** - 2 5,27·107 3,64·107 5,19·107 3 5,14·107 3,74·107 4,72·107 4 4,89·107 5,17·107 4,68·107 5 5,29·107 4,29·107 3,11·107 Sulfadimidina 1 3,43·108 2,95·108 2,93·108 2,8 6,1 7,9 0,0038 ** 0 ** - 2 3,52·108 2,76·108 3,29·108 3 3,47·108 2,83·108 3,42·108 4 3,34·108 3,22·108 3,41·108 5 3,60·108 3,04·108 2,91·108 Marbofloxacina 1 1,04·108 8,26·107 8,26·107 3,6 13,7 8,5 0,0024 0,0042 14,4 ** - 2 9,70·107 6,61·107 8,45·107 65 3 9,75·107 6,92·107 8,84·107 4 9,51·107 9,24·107 9,40·107 5 1,02·108 7,58·107 7,45·107 Enrofloxacina 1 1,54·108 1,21·108 1,23·108 1,9 6,3 8,3 0,0001 0,0069 14,6 ** - 2 1,52·108 1,19·108 1,40·108 3 1,55·108 1,33·108 1,45·108 4 1,48·108 1,12·108 1,23·108 5 1,56·108 1,22·108 1,23·108 Sulfadiazina 1 1,05·108 8,59·107 7,76·107 5,8 9,5 10,4 0,011 0,012 15,2 ** - 2 9,13·107 7,40·107 8,63·107 3 9,25·107 7,46·107 8,73·107 4 9,83·107 8,78·107 9,19·107 5 1,01·108 9,10·107 7,04·107 Sulfametizol 1 1,65·108 1,26·108 1,28·108 4,7 7,7 13,1 0,012 ** 0 ** - 2 1,49·108 1,20·108 1,50·108 3 1,65·108 1,17·108 1,61·108 4 1,52·108 1,37·108 1,57·108 5 1,55·108 1,38·108 1,18·108 Sulfatiazol 1 1,73·108 1,51·108 1,33·108 4,8 9,0 9,9 0,0065 0,0027 18 ** - 2 1,64·108 1,31·108 1,49·108 3 1,62·108 1,37·108 1,43·108 4 1,52·108 1,64·108 1,19·108 5 1,61·108 1,51·108 1,21·108 Tiamulina 1 1,92·108 1,61·108 1,33·108 6,8 9,4 13,3 0,018 0,011 18,9 ** - 66 2 1,61·108 1,61·108 1,29·108 3 1,61·108 1,61·108 1,50·108 4 1,61·108 1,61·108 1,68·108 5 1,61·108 1,61·108 1,21·108 Trimetoprima 1 4,25·108 3,66·108 3,68·108 3 8 5,6 0,0019 0,0056 9,8 ** - 2 3,99·108 3,25·108 3,56·108 3 4,16·108 3,23·108 3,86·108 4 4,20·108 3,89·108 3,98·108 5 3,99·108 3,44·108 3,48·108 Tetraciclina 1 9,14·107 6,72·107 7,52·107 7,1 14,7 17,3 ** ** 0 ** - 2 8,10·107 6,58·107 8,47·107 3 7,97·107 6,07·107 9,04·107 4 7,93·107 8,78·107 8,85·107 5 9,02·107 7,12·107 5,71·107 Tilosina 1 8,99·106 1,10·107 1,63·107 17,8 15,2 11,5 ** 0,032 -26,6 ** - 2 1,27·107 1,16·107 1,35·107 3 9,48·106 1,27·107 1,32·107 4 1,32·107 1,55·107 1,38·107 5 9,98·106 1,10·107 1,20·107 Acetaminofeno 1 1,84·108 1,52·108 1,30·108 5 8,5 12 0,0011 0,0003 20,8 ** - 2 1,72·108 1,22·108 1,56·108 3 1,66·108 1,52·108 1,45·108 4 1,79·108 1,42·108 1,56·108 5 1,88·108 1,47·108 1,18·108 67 Apramicina 1 6,07·107 5,50·107 4,84·107 5,5 12,5 11 ** ** 0 ** - 2 5,91·107 4,59·107 5,59·107 3 6,32·107 4,50·107 6,26·107 4 5,54·107 5,99·107 5,98·107 5 6,34·107 5,56·107 5,02·107 Ácido Salicílico 1 8,03·107 6,21·107 6,13·107 6 12,9 13,6 0,0022 0,014 17,9 ** - 2 7,46·107 5,44·107 6,09·107 3 7,88·107 5,14·107 7,03·107 4 7,48·107 6,96·107 7,70·107 5 8,61·107 5,39·107 5,46·107 Diclofenaco 1 2,92·107 2,45·107 2,64·107 6,2 6,7 15,1 0,016 ** 0 ** - 2 3,26·107 2,40·107 3,05·107 3 3,22·107 2,28·107 3,01·107 4 2,82·107 2,73·107 2,85·107 5 3,09·107 2,43·107 2,04·107 Estrona 1 2,78·107 1,96·107 1,48·107 6 7,4 17,7 0,0002 ** 0 ** - 2 2,66·107 1,75·107 2,77·107 3 2,44·107 1,80·107 1,94·107 4 2,49·107 1,76·107 2,24·107 5 2,77·107 1,59·107 1,70·107 p: nivel de significación; **: p>0,05 no hay diferencia significativa; -:son estables 68 6.1.2 Estabilidad en hidrolizados químicos Se ha estudiado también la estabilidad de determinados principios activos veterinarios durante el proceso de hidrólisis químico siguiendo el protocolo descrito en el apartado 5.3.2. Se lleva a cabo un procedimiento similar al del apartado anterior. Estos ensayos poseen una concentración de 400 μg/L. En esta Tabla 16 se recoge las áreas integradas para los hidrolizados ácidos y básicos, el análisis de varianza de un factor (ANOVA) para saber si existe una diferencia global entre las áreas de pico de los diferentes ensayos, y los resultados de tres pruebas de t. Mediante las pruebas de t se ha establecido estadísticamente si existe efecto matriz al comparar las áreas de pico de los analitos inyectadas en agua y el medio de referencia (disolución reguladora acético/acetato), si existe degradación en medio ácido (comparación áreas en medio ácido con y medio de referencia sin hidrólisis) y en medio básico (comparación áreas en medio básico con y medio de referencia sin hidrólisis). Cuando se comparan las áreas de pico obtenidas después de la hidrólisis química con las áreas de pico del medio ácido o básico correspondiente, sin hacer la hidrólisis, se comprueba que existen diferencias significativas (p< 0.05) en diversos casos, lo que indica que la hidrólisis degrada esos compuestos. Ocurre esto para fenbendazol, dexametasona, florfenicol, oxitetraciclina, sulfadimidina, marbofloxacina, sulfametizol, tilosina y tetraciclina. Sin embargo, para doxiciclina y tiamulina solo se degrada en medio básico. Por otra parte, se observa también que la matriz de referencia disminuye las áreas de pico de los compuestos con respecto a la inyección de disoluciones de esos compuestos en agua. En este caso, la disminución de la señal por el denominado efecto matriz varía entre 20 y 99%. 69 Tabla 16: Hidrólisis química. Resultados obtenidos del ANOVA y en las pruebas de t para cada CE (n=5) Compuesto Área Repetividad (%) ANOVA Prueba t, Efecto Matriz Prueba t, Estabilidad Agua Matriz Medio Ácido Medio Básico Agua Matriz Medio Ácido Medio Básico p p Disminución de señal % Medio Ácido Medio Básico p % degradación p % degradación Ciprofloxacina 1 1,39·108 8,74·107 5,18·107 6,38·107 8,2 5,2 4,2 8,4 <0,0001 <0,0001 41,2 <0,0001 37,8 <0,0001 27,1 2 1,66·108 9,38·107 5,58·107 6,25·107 3 1,47·108 8,57·107 5,63·107 7,25·107 4 1,36·108 8,90·107 5,60·107 5,79·107 5 1,55·108 8,13·107 5,19·107 6,20·107 Dexametasona 1 1,15·106 3,83·105 - - 13,8 9,4 - - <0,0001 <0,0001 76,4 - 100 - 100 2 1,61·106 3,52·105 - - 3 1,43·106 3,11·105 - - 4 1,31·106 3,13·105 - - 5 1,60·106 3,17·105 - - Doxiciclina 1 - 1,85·107 4,23·106 - - 12,8 29,9 - <0,0001 - 0 <0,0001 72,9 - 100 2 - 5,01·107 6,44·106 - 3 - 1,91·107 3,29·106 - 4 - 1,45·107 3,83·106 - 5 - 1,63·107 6,22·106 - Danofloxacina 1 1,26·108 1,37·108 1,26·108 1,39·108 12,2 7,2 20,6 24,9 ** ** 0 ** - ** - 2 1,55·108 1,52·108 1,50·108 2,13·108 70 3 1,59·108 1,30·108 1,06·108 1,29·108 4 1,49·108 1,28·108 1,59·108 1,28·108 5 1,78·108 1,33·108 9,85·107 1,29·108 Fenbendazol 1 3,31·108 2,67·108 - - 9,3 6,1 - - <0,0001 0,003 20 - 100 - 100 2 4,09·108 2,88·108 - - 3 3,65·108 3,02·108 - - 4 3,32·108 2,86·108 - - 5 3,86·108 3,15·108 - - Florfenicol 1 1,67·107 3,82·106 - - 7,1 6,1 - - <0,0001 <0,0001 75 - 100 - 100 2 1,46·107 4,25·106 - - 3 1,48·107 4,17·106 - - 4 1,70·107 3,65·106 - - 5 1,65·107 4,00·106 - - Oxitetraciclina 1 5,82·107 1,70·107 - - 5,8 5,1 - - <0,0001 <0,0001 71,2 - 100 - 100 2 5,67·107 1,88·107 - - 3 5,71·107 1,69·107 - - 4 6,37·107 1,68·107 - - 5 6,36·107 1,68·107 - - Sulfadimidina 1 3,51·108 9,59·107 - - 4,9 4,1 - - <0,0001 <0,0001 72,8 - 100 - 100 2 3,49·108 9,83·107 - - 3 3,21·108 9,40·107 - - 4 3,60·108 9,80·107 - - 5 3,66·108 8,88·107 - - Marbofloxacina 1 1,16·108 6,17·107 - - 2,5 3,9 - - <0,0001 <0,0001 49,8 - 100 - 100 2 1,22·108 6,40·107 - - 71 3 1,19·108 5,80·107 - - 4 1,22·108 5,94·107 - - 5 1,24·108 5,92·107 - - Enrofloxacina 1 1,34·108 7,29·107 5,96·107 7,22·107 2,6 4,2 4 5,8 <0,0001 <0,0001 42,6 <0,0001 21,6 0,003 12,5 2 1,36·108 8,07·107 6,33·107 6,65·107 3 1,33·108 7,75·107 6,08·107 6,25·107 4 1,27·108 7,72·107 5,92·107 6,38·107 5 1,35·108 7,36·107 5,68·107 6,90·107 Sulfadiazina 1 9,56·107 4,51·107 4,51·106 - 6,7 6,2 4 - <0,0001 <0,0001 52,3 - 87,7 - 100 2 8,91·107 4,85·107 4,85·106 - 3 9,60·107 4,15·107 4,15·106 - 4 1,07·108 4,80·107 4,80·106 - 5 9,55·107 4,74·107 4,74·106 - Sulfametizol 1 1,51·108 2,94·107 - - 5,5 2,5 - - <0,0001 <0,0001 80,1 - 100 - 100 2 1,49·108 3,12·107 - - 3 1,40·108 2,99·107 - - 4 1,60·108 3,09·107 - - 5 1,60·108 2,99·107 - - Tilosina 1 1,04·107 3,07·106 - - 8,6 13 - - <0,0001 <0,0001 65,4 - 100 - 100 2 9,48·106 2,87·106 - - 3 1,04·107 3,36·106 - - 4 9,66·106 4,01·106 - - 5 8,39·106 3,42·106 - - Sulfatiazol 1 1,64·108 2,65·107 2,67·107 2,27·107 7,3 1,9 4,7 10,4 ** <0,0001 84,5 ** - ** - 2 1,68·108 2,69·107 2,69·107 2,86·107 72 3 1,64·108 2,77·107 2,62·107 2,55·107 4 1,84·108 2,73·107 2,45·107 2,44·107 5 1,92·108 2,65·107 2,44·107 2,90·107 Tiamulina 1 9,23·107 7,53·107 3,55·106 - 11,7 3,2 19,8 - <0,0001 0,007 26,9 <0,0001 93,1 - 100 2 9,90·107 7,82·107 4,96·106 - 3 1,02·108 7,58·107 6,07·106 - 4 1,24·108 7,16·107 5,98·106 - 5 9,81·107 7,54·107 5,53·106 - Trimetoprima 1 4,30·108 2,12·108 1,41·108 2,48·108 2,1 3,2 6,4 23,7 0,002 <0,0001 50,8 <0,0001 36,3 ** - 2 4,53·108 2,28·108 1,49·108 2,33·108 3 4,31·108 2,16·108 1,40·108 2,32·108 4 4,42·108 2,14·108 1,34·108 2,40·108 5 4,38·108 2,10·108 1,25·108 1,25·108 Tetraciclina 1 9,55·107 1,42·107 - - 5,3 5,4 - - <0,0001 0,002 84,5 - 100 - 100 2 8,56·107 1,50·107 - - 3 9,55·107 1,47·107 - - 4 9,88·107 1,34·107 - - 5 9,39·107 1,55·107 - - Acetaminofeno 1 4,38·108 1,11·107 - - 3,8 4,4 - - <0,0001 <0,0001 93,2 - 100 - 100 2 4,38·108 1,24·107 - - 3 4,38·108 1,22·107 - - 4 4,38·108 1,16·107 - - 5 4,38·108 1,19·107 - - Apramicina 1 5,79·107 2,02·107 1,16·107 1,81·107 6,2 2,8 1,8 7,7 0,0003 <0,0001 67,1 ** - 0,001 15,9 2 6,61·107 2,15·107 1,13·107 1,78·107 79 6.2 Análisis en presencia de biomasa algal En este capítulo se hacen pruebas rápidas de posibles nuevos métodos de análisis para determinar los contaminantes emergentes mencionados en hidrolizados enzimáticos de biomasa algal basándonos en el protocolo descrito en el apartado 5.4. En las Figuras 20,21 y 22 se muestran las áreas de pico obtenidas de los CE en los ensayos de extracción en fase sólida (SPE), inyección directa después de añadir un adsorbente (ID) y extracción en fase sólida después de añadir un adsorbente (SPE/ID). En la extracción en fase sólida (SPE) se contempla mejores resultados en los ensayos eluidos con ACN que MeOH salvo tiamulina, florfenicol, ácido acetilsalicílico y 17αetinilstradiol. Asimismo, los ensayos de carbón activo para florfenicol y ácido acetilsalicílico son preferibles que para tiamulina, 17-αetinilstradiol y ciprofloxacina. La diferente cantidad de adsorbente no modifica sustancialmente los resultados obtenidos. En la inyección directa (ID), usando C activo como adsorbente se obtienen mejores resultados usando 5 mg para trimetoprima y sulfamidas, y con 20 mg para florfenicol. Con PSA es preferible el uso de 150 mg para ácido acetilsalicílico y de 75 mg para dexametasona. La utilización de sílice es similar a la utilización de PSA. No se puede elegir un adsorbente como el más adecuado. En el caso de la extracción en fase sólida, la elución de los extractos con metanol parece proporcionar áreas de pico algo más pequeñas en general con respecto al uso de acetonitrilo como eluyente. Al añadir un adsorbente para llevar a cabo la extracción en fase sólida dispersiva parece que el PSA mejora la señal de varios compuestos, sin observar tampoco diferencias claras cuando se ensayan diferentes cantidades de adsorbentes. 80 Figura 20: Gráfico de barras donde se observa las áreas resultantes de los CE en la extracción en fase sólida (SPE) 0,00E+00 5,00E+06 1,00E+07 1,50E+07 2,00E+07 2,50E+07 3,00E+07 DOXICICLINA TETRACICLINA SULFADIAZINA SULFATMETIZOL SULFATIAZOL SULFADIMIDINA TIAMULINA TRIMETOPRIMA FLORFENICOL APRAMICINA ÁCIDO ACETILSALICÍLICO 17-αETINILSTRADIOL CIPROFLOXACINA ESTRONA DEXAMETASONA FENBENDAZOL Áreas Contaminantes Emergentes 81 Figura 21: Gráfico de barras donde se observa las áreas resultantes de los CE en la inyección directa (ID) 0,00E+00 2,00E+06 4,00E+06 6,00E+06 8,00E+06 1,00E+07 1,20E+07 1,40E+07 1,60E+07 1,80E+07 DOXICICLINA TETRACICLINA ENROFLOXACINA SULFADIAZINA SULFATMETIZOL SULFATIAZOL SULFADIMIDINA TIAMULINA TRIMETOPRIMA FLORFENICOL APRAMICINA ÁCIDO ACETILSALICÍLICO 17-αETINILSTRADIOL CIPROFLOXACINA ESTRONA DEXAMETASONA FENBENDAZOL Áreas Contaminantes Emergentes 82 Figura 22: Gráfico de barras donde se observa las áreas resultantes de los CE comparando SPE con ID 0,00E+00 5,00E+06 1,00E+07 1,50E+07 2,00E+07 2,50E+07 3,00E+07 DOXICICLINA TETRACICLINA SULFADIAZINA SULFATMETIZOL SULFATIAZOL SULFADIMIDINA TIAMULINA TRIMETOPRIMA FLORFENICOL APRAMICINA ÁCIDO ACETILSALICÍLICO 17-αETINILSTRADIOL CIPROFLOXACINA ESTRONA DEXAMETASONA FENBENDAZOL Áreas Contaminantes emergentes 83 7 CONCLUSIONES ▪ Los contaminantes emergentes son estables durante el proceso de hidrólisis enzimática con la enzima comercial Protamax, calentado el medio con ultrasonidos durante 1 horas. El efecto matriz origina una disminución de la señal que varía entre 9,8 y 35%, excepto para la tilosina, en la que esta origina un aumento de la señal con un 26%. ▪ Fenbendazol, dexametasona, florfenicol, oxitetraciclina, sulfadimidina, marbofloxacina, sulfametizol, tilosina y tetraciclina son degradados completamente mediante una hidrólisis química a 120°C, tanto en medio ácido como básico. Sin embargo, para doxiciclina y tiamulina solo se degrada en medio básico. ▪ En los casos de degradación química parcial, los porcentajes de degradación calculados en función de áreas de pico son básicamente similares a los porcentajes de degradación calculados en función de las concentraciones residuales medidas. ▪ Se ha comprobado que la matriz en que se hacen los análisis disminuye la señal analítica en porcentajes que varían entre 20 y 99% con respecto a la inyección de los compuestos disueltos en agua, por lo que una calibración matriz-patrón es necesaria para su cuantificación. ▪ Los ensayos para analizar los contaminantes emergentes en hidrolizados enzimáticos de biomasa algal mediante su inyección directa después de efectuar una extracción en fase sólida dispersiva no muestran grandes diferencias en función del tipo y cantidad de adsorbente ensayado. ▪ En los ensayos para analizar los contaminantes en hidrolizados enzimáticos mediante una extracción en fase sólida parece recomendable eluir los extractos con acetonitrilo en vez de metanol. En la elución de los extractos con metanol la limpieza previa con PSA parece mejorar las áreas de pico de muchos contaminantes. 84 ▪ En general la extracción en fase sólida parece más recomendable que la inyección directa para el análisis de los contaminantes emergentes en hidrolizados enzimáticos, atendiendo a las mayores áreas de pico. 8 BIBLIOGRAFÍA 1) Afonso-Olivares, C., Čadková, T., Sosa-Ferrera, Z., Santana-Rodríguez, J. J., & Nováková, L. (2017). Simplified solid-phase extraction procedure combined with liquid chromatography tandem–mass spectrometry for multiresidue assessment of pharmaceutical compounds in environmental liquid samples. Journal of Chromatography A, 1487, 54–63. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2017.01.059 2) Álvarez-Esmorís, C., Conde-Cid, M., Fernández-Calviño, D., Fernández-Sanjurjo, M. J., Núñez-Delgado, A., Álvarez-Rodríguez, E., & Arias-Estévez, M. (2020). 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