Introducció in vitro de les espècies Dipladenia sanderi I Nerium oleander

ESCOLA SUPERIOR D’AGRICULTURA DE BARCELONA UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE CATALUNYA TREBALL FINAL DE CARRERA INTRODUCCIÓ IN VITRO DE LES ESPÈCIES Dipladenia sanderi I Nerium oleander Per optar al títol d’Enginyer Tècnic Agrícola Especialitat Hortofruticultura i Jardineria Alumnes: Agustina Ma. Bence Doig i Enric Guerrero Soler Professors ponents: Dra. Núria Cañameras i Ribes i Dr. Francesc Xavier Martínez Farré Castelldefels, Juny de 2011 ESCOLA SUPERIOR D’AGRICULTURA DE BARCELONA UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE CATALUNYA TREBALL FINAL DE CARRERA INTRODUCCIÓ IN VITRO DE LES ESPÈCIES Dipladenia sanderi I Nerium oleander Dirigit per: Dra. Núria Cañameras i Ribes Dr. Francesc Xavier Martínez Farré Autors: Agustina Ma. Bence Doig Enric Guerrero Soler Castelldefels, Juny de 2011 Agraïments AGRAÏMENTS A la Doctora Núria Cañameras i Riba i al Doctor Francesc Xavier Martínez Farré, del Departament d’Enginyeria Agroalimentària i Biotecnologia de la UPC, per la direcció, correcció i observacions d’aquest treball. A l’Olga Gener, Tècnica del Laboratori de l’Escola Superior d’Agricultura de Barcelona, per l’ajut puntual en les tasques al laboratori i a l’hivernacle i les seves recomanacions. A Maite Mas i AMC Verdú per descobrir-nos la gran diversitat en el món de la microbiologia. A Daniel Díaz i Meritxell Aguilar pels consells i l’ajuda prestada en el laboratori. A la empresa Horticultura Aldrofeu per haver-nos facilitat el material vegetal utilitzat en el treball. Per últim, agraïm a les nostres famílies i amistats pel recolzament durant el desenvolupament del nostre Treball Final de Carrera. Resum RESUM INTRODUCCIÓ IN VITRO DE LES ESPÈCIES Dipladenia senderi I Nerium oleander Autors: Bence Doig, Agustina Maria; Guerrero Soler, Enric. Professors ponents: Cañameras i Ribes, Núria; Martínez Farré, Francesc Xavier. El present treball s’emmarca en el context de la multiplicació in vitro dels gèneres Nerium i Dipladenia de la família Apocynaceae, concretament les espècies Nerium oleander i Dipladenia sanderi, dues plantes ornamentals de diferent lloc d’origen: la conca mediterrània i Brasil respectivament. L’estudi pretén la introducció in vitro d’aquestes dues espècies per aconseguir l’establiment d’un protocol que permeti micropropagar-les adequadament. Els medis utilitzats s’han elaborat a partir del medi base de Murashige i Skoog (1962), addicionat amb diferent composicions hormonals. En els assajos realitzats es va avaluar els efectes de les diverses concentracions desinfectants formulades i de les diferents composicions i concentracions hormonals utilitzades. La solució desinfectant més adient és la formulada amb 1,5% de clor actiu durant 45 minuts pels àpexs caulinar de les dues espècies. Per a la iniciació del cultiu, la composició del medi de cultiu que va resultar més eficaç va ser la que complementava el medi MS (Murashige-Skoog) amb una concentració hormonal de 5µM BAP. Paraules claus: in vitro, Nerium oleander, Dipladenia sanderi, micropropagació, àpex caulinar. Resum INTRODUCCIÓN IN VITRO DE LAS ESPÉCIES Dipladenia senderi Y Nerium oleander Autores: Bence Doig, Agustina Maria; Guerrero Soler, Enric. Profesores ponentes: Cañameras i Ribes, Núria; Martínez Farré, Francesc Xavier. El presente trabajo se enmarca en el contexto de la multiplicación in vitro de los géneros Nerium y Dipladenia de la familia Apocynaceae, concretamente las especies Nerium oleander y Dipladenia sanderi, dos plantas ornamentales de diferente lugar de origen: la cuenca mediterránea y Brasil respectivamente. El estudio pretende la introducción in vitro de estas especies para conseguir establecer un protocolo que permita micropropagarlas adecuadamente. Los medios utilizados se han elaborado a partir del medio base de Murashige and Skoog (1962), adicionado con diferentes composiciones hormonales. En los ensayos realizados se evaluaron los efectos de las diversas concentraciones desinfectantes formuladas y de las diferentes composiciones y concentraciones hormonales utilizadas. La solución desinfectante más adecuada es la formulada con 1,5% de cloro activo durante 45 minutos para los ápices caulinares de las dos especies. Para a la iniciación del cultivo, la composición del medio de cultivo que resultó más eficaz fue la que complementaba el medio MS (Murashige-Skoogs) con una concentración hormonal de 5µM BAP. Palabras claves: in vitro, Nerium oleander, Dipladenia sanderi, micropropagación, ápices caulinares. Resum IN VITRO INTRODUCTION OF SPECIES Dipladenia senderi AND Nerium oleander Authors: Bence Doig, Agustina Maria; Guerrero Soler, Enric. Speakers teachers: Cañameras i Ribes, Núria; Martínez Farré, Francesc Xavier. This work is framed in the context of multiplication in vitro of genus Nerium and Dipladenia of the family Apocynaceae, Nerium oleander and Dipladenia sanderi particular species, two ornamental plants of different place of origin: the Mediterranean basin and Brazil respectively. The study aims at the introduction of in vitro of these species are needed to develop a protocol to properly micropropagated. The culture medium used were produced from the basal medium of Murashige and Skoog (1962), supplemented with different hormone compositions. In tests evaluated the effects of various concentrations disinfectants and different compositions and concentrations of hormone used. The best disinfectant solution is formulated with 1.5% active chlorine for 45 minutes from stem apex of the two species. For the initiation of culture, the composition of culture medium that was more effective was the one that complemented the MS medium (Murashige-Skoog) with a hormone concentration of 5μM BAP. Keywords: in vitro, Nerium oleander, Dipladenia sanderi, micropropagation, stem apex. Pròleg PRÒLEG Les plantes del gènere Nerium es cultiven com arbustos per a zones públiques, jardins tant públics com privats i per a repoblació de zones properes a cursos d’aigua; les del gènere Dipladenia es cultiven com a petits arbustos i plantes enfiladisses per a jardins públics i privats. A Espanya, la micropropagació d'espècies vegetals a nivell comercial es centra en la obtenció de material hortofrutícola i planta ornamental. Els assajos realitzats en aquest Treball Final de Carrera s’han desenvolupat mitjançant la tècnica de multiplicació in vitro de material vegetal pel desig personal d’adquirir experiència en la micropropagació i per facilitar un protocol viable del cultiu. La realització d’aquest Treball Final de Carrera és fruit de la relació que manté l'ESAB amb l’empresa Horticultura Aldrofeu, dedicada, entre d’altres, a la micropropagació de plantes ornamentals. L'esmentada empresa va facilitar les plantes mare adultes. Agustina Ma. Bence Doig i Enric Guerrero Soler Castelldefels, Juny 20011 Índex ÍNDEX 1. INTRODUCCIÓ ............................................................................................................................ 9 1.1. Descripció família Apocynaceae ............................................................................................. 9 1.2. Descripció espècies ............................................................................................................... 10 1.2.1. Dipladenia sanderi ............................................................................................................. 10 1.2.2. Nerium oleander ............................................................................................................... 11 1.3. Micropropagació................................................................................................................... 14 1.3.1. Història de la micropropagació .......................................................................................... 14 1.3.2. Característiques, avantatges i desavantatges de la tècnica in vitro ................................ 15 1.3.3. Hormones i reguladors del creixement ............................................................................ 16 1.3.4. Contaminació microbiana ................................................................................................ 19 1.3.4.1. Introducció a la contaminació microbiana ................................................................... 19 1.3.4.2. Fonts de contaminació microbiana ............................................................................... 19 1.3.4.3. Antibiòtics ...................................................................................................................... 22 1.3.5. Condicions d’esterilitat i asèpsia ...................................................................................... 23 1.3.6. Multiplicació in vitro de Dipladenia i Nerium .................................................................. 25 1.3.6.1. Micropropagació de Dipladenia .................................................................................... 25 1.3.6.2. Micropropagació de Nerium ......................................................................................... 27 2. OBJECTIUS ............................................................................................................................... 29 3. MATERIALS I MÈTODES ........................................................................................................... 30 3.1. Material vegetal ................................................................................................................... 30 3.2. Medi de cultiu ...................................................................................................................... 32 3.2.1. Formulació ........................................................................................................................ 32 3.2.2. Esterilització ...................................................................................................................... 34 3.3. Metodologia específica del diferents assajos realitzats ..................................................... 34 3.3.1. Assaig I: Influència de la posició de la gema i del medi de cultiu en la fase de iniciació 34 3.3.2. Assaig II: Modificació de la pauta de desinfecció dels explants de gemma ................... 37 Índex 3.3.3. Assaig III: Modificació del protocol de cultiu a partir d’àpex caulinar ............................ 38 4. RESULTATS I DISCUSSIONS ...................................................................................................... 40 4.1. Assaig I: Influència de la posició de la gema i del medi de cultiu en la fase de iniciació .. 40 4.1.1. Iniciació del cultiu ............................................................................................................. 40 4.1.2. Repicat dels explants viables ............................................................................................ 49 4.2. Assaig II: Modificació de la pauta de desinfecció dels explants de gemma....................... 53 4.3. Assaig III: Modificació del protocol de cultiu a partir d’ àpex caulinar .............................. 53 5. CONCLUSIONS ......................................................................................................................... 55 6. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 56 Introducció 15 Característiques, avantatges i desavantatges de la tècnica in vitro El cultiu de teixits es pot aplicar a: • Estudis bàsics sobre fisiologia, genètica, bioquímica i ciències afins. • Bioconversió i producció de compostos útils. • Increment de la variabilitat genètica. • Obtenció de plantes lliures de microorganismes patògens. • Propagació de plantes. • Conservació i intercanvi de germoplasma. Mitjançant el cultiu de teixits vegetals, es poden estudiar diferents fenòmens morfogenètics que ajuden a entendre quins són els factors fonamentals que intervenen en la morfogènesi i en la diferenciació de parts aïllades de la planta. Les principals avantatges que ofereix el cultiu in vitro es poden resumir en les següents: • Menor temps en l’obtenció de nou material vegetal (propagació). • Obtenció massiva de clons. • Optimització de les condicions ambientals, nutricionals i hormonals. • Estalvi d'espai (hivernacles) i energia. • Facilitar la comercialització ràpida d’una nova varietat. • Propagació de plantes que tenen unes condicions normals de propagació llargues i difícils. • Possibilitat d'obtenir material sanejat. • Obtenció de material de alta qualitat. Per altra banda, la micropropagació també pateix de limitacions • Necessitat d’una planificació molt exhaustiva. • Risc de pèrdua de material vegetal provocat per una contaminació microbiana no detectada a temps .Durant el procés de la micropropagació poden aparèixer alguns problemes com, per exemple, la proliferació de contaminacions microbianes d’origen endogen que no es manifesten fins a un determinat moment del cicle productiu. Introducció 16 • Inestabilitat genètica, especialment si el material ha estat neoformat a partir de cal·lus o bé si es força la taxa de multiplicació. • Enfosquiment dels medis de cultiu per substàncies fenòliques que es polimeritzen i s’oxiden al medi provinents de l’exsudació del mateix material vegetal. • Problemes d’hiperhidricitat. La hiperhidricitat és un fenomen que succeeix sobretot a plantes joves i tendres i pot ser causada per varis motius: desinfecció excessiva, combinació de certes sals en el medi nutritiu o nivells hormonals de citoquinines alts, potencial hídric del medi de cultiu, etc. Els símptomes més habituals que presenta el material vegetal vitrificat són la falta de lignificació dels vasos i la hipertròfia de la tija i de les fulles, que acostumen a ser més amples, translúcides, corbades, arrissades i es trenquen amb més facilitat (Gaspar et al., 1987). 1.3.2. Hormones i reguladors del creixement Les hormones són compostos orgànics que en petites quantitats, estimulen, inhibeixen o modifiquen d’alguna manera qualsevol procés fisiològic en les plantes. El desenvolupament vegetal és el conjunt d’esdeveniments que contribueixen a la progressiva elaboració del cos de la planta i que la capaciten per obtenir aliments, reproduir-se i adaptar-se al seu medi. Aquest desenvolupament comprèn els processos bàsics de creixement i diferenciació i les hormones vegetals coordinen les activitats cel·lulars i els òrgans de la planta. Les hormones vegetals no es sintetitzen en una estructura concreta de la planta, sinó que qualsevol òrgan la pot sintetitzar tot i que algun òrgans i teixits en tenen més capacitats que d’altres. Els principals llocs de biosíntesi són els àpexs caulinar del tija i les arrels, els primordis d’òrgans vegetatius o reproductors i les llavors en desenvolupament. En les plantes resulta difícil definir òrgans, teixits o cèl·lules que actuen específicament com a diana per les hormones, tot i que s’ha de tenir en compte que no existeixen raons teòriques per assumir que una hormona ha d’actuar exclusivament sobre un únic tipus de cèl·lula diana. El control hormonal del desenvolupament ve dictat per canvis en la concentració de la hormona en les cèl·lules diana i per canvis en la sensibilitat de les cèl·lules a les hormones. La major o menor sensibilitat es relaciona amb el número de receptors, l’afinitat d’aquest, o els canvis en la cadena d’esdeveniments subsegüents que condueixen a un efecte bioquímic o fisiològic (capacitat de resposta). Fins ara, ha existit un acord general en classificar com hormones vegetals a: auxines, giberel·lines, citoquinines, etilè i àcid abscísic, que constitueixen els cinc grups hormonals clàssics; però en els últims anys, s’ha anat aïllant una sèrie de substàncies que es poden classificar com a hormones: brasinosteroids, oxilipines, poliamines, salicilats, oligopèptids i òxid nítric, augmentant així a 11 grups hormonals vegetals. Introducció 17 A. Auxines Les auxines es sintetitzen als meristems, embrions i a les fulles verdaderes. Els seus principals efectes són el creixement de les cèl·lules en elongació, la divisió del càmbium, l'afavoriment de la dominància apical i l'arrelament. Les auxines tenen capacitat de transport pel càmbium i estan implicades en molts processos de desenvolupament perquè afecta a la divisió, creixement i diferenciació cel·lular. A la micropropagació es fa servir per a la neoformació de gemmes i per promoure l’arrelament. Existeixen diferents tipus d'auxines de síntesi natural com l'àcid indol acètic (IAA) o de síntesi artificial com l’àcid α-naftalenacètic (NAA) (Figura 8) i d'altres. És important la regulació de la concentració d’aquests reguladors, ja que la seva intensitat de resposta variarà segons l’òrgan sobre el qual es produeixi l’estímul (Figura 9). Figura 9Influència de la concentració d'auxines sobre la resposta de creixement d'arrels, gemmes i talls. Font: Fundamentos de Fisiologia vegetal, J. Azcón-Bieto i M. Talón Figura 8 - Fórmula química del NAA Introducció 18 B. Citoquinines Les citoquinines són purines substituïdes, derivades de la base púrica adenina, totes tenen un substituent isoprenoide o aromàtic en el N-amínic de la posició 6 del anell púric. Aquest grup de reguladors del creixement estimulen la divisió cel·lular en presència d’auxines. Les auxines i algun nutrient participen en el control dels nivells endògens de citoquinines, promovent o reprimint respectivament els nivells cel·lulars de citoquinines. La síntesi d'aquestes són a les arrels i als òrgans aeris. Es transporten a través de xilema i floema. Les citoquinines i les auxines controlen el cicle cel·lular, regulen la neoformació d’òrgans i controlen la dominància apical. Les citoquinines retarden la senescència foliar i promouen l'expansió de les cèl·lules. En in vitro, aquest regulador actua com a divisor cel·lular i mantenidor de la viabilitat de l’explant. Les citoquinines i la llum controlen la germinació, la síntesi de pigments i el desenvolupament dels cloroplasts. Les citoquinines tenen una gran importància econòmica. L'industria de la micropropagació es basa en la capacitat d'aquests reguladors, sols o en combinació amb les auxines, per promoure el rebrot de les gemmes axil·lars i la neoformació de brots adventicis. La capacitat de les citoquinines per reduir la dominància apical també és la base de diversos preparar comercials que incrementen la ramificació de les plantes amb interès fructícola o ornamental. En aquest cas, principalment es fan servir per fer preparats basat en BA o en citoquinines sintètiques. Les citoquinines també s'utilitzen, en combinació amb les giberel·lines, per controlar la forma i la grandària del fruit d'algunes varietats de pomeres. Dins de les citoquinines aromàtiques trobem la BA (benciladenina) o també anomenada BAP (bencilaminopurina), que té la cadena lateral de 7 C estructurals en forma de grup metilbenzè (Figura 10). Figura 10Fórmula química del BAP Introducció 19 1.3.3.Contaminació microbiana 1.3.3.1. Introducció a la contaminació microbiana El fenomen de la contaminació microbiana en cultiu de teixits vegetals ha estat descrit per nombrosos autors com Cassells (1991), Dodd (1992), George (1993), Leifert (1994), Cole (1996) i Herman (1996). Els bacteris, fongs, floridures i llevats són microorganismes comuns contaminants en cultius de teixits. Els microorganismes i les seves estructures reproductives (per exemple, les espores) estan a tot arreu, tot i que la seva abundància relativa pot variar considerablement amb el medi ambient i la temporada (Atlas i Bartha, 1987). Seria excepcional per al creixement de les plantes en la natura estar lliure de microorganismes epífits i endòfits. Mentre que alguns microorganismes poden ser patògens o simbionts, molts microbis epífits i fongs endòfits associats amb les plantes funcionen com sapròfits o paràsits asimptomàtics. (E. Bunn i B. Tan, 2002). Els principals contaminants que afecten les plantes de cultiu de teixits són els bacteris i els fongs. Aquests contaminants són comuns en les plantes però tenen efectes devastadors en les plantes in vitro, ja que el seu creixement és prolífic en condicions d’alta concentració de nutrients, d’aquí la necessitat d'eliminar-los dels explants abans d'entrar en el cicle d’in vitro. La majoria de cultius s'estableixen a partir de branques que són portats de camps o d’hivernacles i que contenen microorganismes, per tant, qualsevol microorganisme present en el material vegetal sembrat in vitro o en el aire que el rodeja pot esdevenir un contaminant potencial i desenvolupar-se en qualsevol moment del procés. Sovint els microorganismes endògens no patògens presents a l’explant són una de les principals causes de contaminació i cal fer una neteja exhaustiva i una desinfecció tant del material vegetal com una esterilització del material del laboratori que s’utilitzarà en el procés. No obstant, cal tenir present que no tots els microorganismes presents en la superfície del material vegetal seran eliminats amb el procés de desinfecció (E. Bunn i B. Tan, 2002). 1.3.3.2. Fonts de contaminació microbiana Els potencials contaminants microbians que apareixen en el cultiu in vitro poden tenir dos orígens diferents: • Origen endogen: estan íntimament associats amb els teixits de les plantes i molt difícils d’eliminar. • Origen exogen: presents en la superfície del material vegetal i en l’ambient del laboratori. Aquests tipus de microorganismes poden ser eliminats seguint un procés de desinfecció del material vegetal i manipulant el mateix amb condicions d’asèpsia (sota cambra de flux laminar)(veure apartat 1.3.5., apartat B). Introducció 20 En general, aquestes contaminacions, especialment les d’origen exogen, solen ser visibles als pocs dies d’haver iniciat el cultiu o de haver-lo repicat. No obstant, el fet que no aparegui cap símptoma de contaminació microbiana no significa que el material micropropagat estigui exempt de contaminacions endògenes. La contaminació de la majoria de fongs apareixen abans de la primera setmana de cultiu, visualitzant-ne el fong filamentós amb miceli. Les bactèries i llevats se solen detectar més tard, ja que són generalment de creixement més lent i s’observen petites colònies discretes pàl·lides o de color. Els llevats es poden distingir dels bacteris per grandària de la cèl·lula (en general enfront dels bacteris), així com per la grandària de les colònies més grans, no transparent i per l’olor de fermentació (mitjà de brutícia). Seguir una pauta de desinfecció correcte del material vegetal, haver esterilitzat els medis de cultiu i treballar sota condicions d’asèpsia amb el material vegetal no representa una garantía plena d’haver aconseguit introduir in vitro un material vegetal lliure de qualsevol tipus de contaminació microbiana exògena. Leifert et al. (1994) van trobar una correlació directa entre les espècies i gèneres de llevats i fongs que es troben en l'entorn d’un laboratori i les que contaminen més endavant els medis de cultiu, el que suggereix que les condicions ambientals de laboratori poden representar una altra font important de contaminació, una vegada el medi ja ha estat autoclavat i aquest s’està manipulant. Sovint resulta dificultosa l’entrada in vitro de material vegetal que ha estat en contacte directa amb el sòl (rizomes, bulbs, etc) degut a la presencia de contaminacions microbianes en ell i que amb facilitat s’adhereixen a la seva superfície. A aquest tipus de material cal sotmetre’l a un pretractament amb un fungicida abans d’iniciar la pauta de desinfecció. En el cas de plantes rastreres es convenient entutorarles per tal d’evitar al màxim el seu contacte amb el sòl. Les plantes de port baix (entrenusos curts) resulta eficient un tractament previ amb d'àcid giberèl·lic. Les plantes que creixen a partir d'una corona (que està en contacte amb el terra, com les maduixes, iris, Hosta, gingebre i Haworthia) i moltes plantes carnívores, són difícils de netejar. Les corones poden ser rentades i conreades en testos estèrils amb perlita, regades des de la part inferior per evitar mullar la regió meristemàtica, i mullant setmanalment amb fungicida. A més, aquest tipus de plantes poden ser conreades en torba de Sphagnum, que té propietats antimicrobianes, a causa del seu baix pH, per inhibir encara més de contaminants de la superfície (Skirvin et al. , 1999). Les plantes piloses són un problema particular, perquè les bombolles d'aire queden atrapats en el explant i eviten un bon contacte amb l'agent de desinfestació. Malgrat l’exaustiu treball i una acurada atenció als procediments, la contaminació encara pot donar lloc a un 100% de pèrdues d’explants. En un estudi de les modalitats de la contaminació en dos laboratoris comercials a Anglaterra, Leifert et al. (1989) va observar un predomini de bacteris Gram-negatius (per exemple, Pseudomonas i Enterobacter) quan els teixits vegetals eren controlats en les primeres etapes de la micropropagació, però va trobar que els Gram-positius (per exemple, Bacillus, Staphylococcus i Micrococcus) tenien més probabilitats d’aparèixer com a contaminants en cultius més antics. En els cultius més antics, la contaminació sol ser fruit d'unes condicions d’asèpsia defectuosa, i els bacteris Gram-positius que es troben en aquests casos se sap que estan associats amb els humans (Weller, 1997) o en entorns de laboratori (Leifert et al. 1994). Introducció 21 També pot ser possible deduir la font més probable de la contaminació mitjançant la identificació del propi contaminant, en el microorganisme i en el nivell genèric (Leifert i Woodford, 1997). Per exemple, la presència de Bacillus spp és una indicació de l'esterilització ineficient dels medi o els instruments. Comunament la floridura gris, negre i verda (per exemple, Botrytis, Aspergillus, Alternaria i Penicillium) i els llevats de color rosa (Rhodotorula spp) indiquen alta contaminació de l'aire del laboratori, el que suggereix uns defectes a les cabines de flux laminar o en errors de l'operador. No obstant això, l'aparició de floridura de Cladosporium suggeriria la insuficient protecció de l'atmosfera del laboratori en la contaminació amb l'aire exterior, ja que les espores d'aquest fong són molt comuns en l'aire a l'exterior. Al laboratori amb pressió positiva d'aire i entrades de doble porta redueixen significativament la contaminació de Cladosporium. (E. Bunn et. B. Tan, 2002). Skirvin et al. (1993) van demostrar que l'emmagatzematge d'aigua pot ser una font de contaminació bacteriana. Per reduir la taxa d'aquestes contaminacions, el material vegetal, abans de la seva utilització com a font d’explantació, no ha de ser emmagatzemat amb aigua més temps del necessari. Com que l'acidesa inhibeix el creixement d'alguns bacteris, ajustar el pH de la solució d'emmagatzematge en el rang àcid pot reduir aquest tipus de contaminació. Una altra possibilitat és l'ús comercial de productes emprats en postcollita ornamental, com Floralife®. Aquests productes contenen sucre, àcid cítric i un bactericida (Staby et al., 1978). També s’ha trobat que l'ajust del pH del medi de cultiu de teixits per al rang àcid (4,5-5,2 davant 5,6-5,8) també redueix la incidència de la contaminació bacteriana (McMeans, 1997). El mecanisme d'aquest efecte és desconegut (Skirvin et al., 1999). En relació a les contaminacions endògenes, més de 30 gèneres de bacteris han estat identificats per estar associats amb les plantes (Bradbury, 1988). En teoria, qualsevol bacteri que s'associa amb el teixit de l’explant com un patogen epífit o endòfit és un contaminant potencial de cultiu de teixits vegetals. Leifert et al. (1994) llisten de més de 40 bacteris diferents que han estat aïllats com a contaminants en cultius de teixits i cèl·lules d'una àmplia gamma d'espècies de plantes. Existeix un predomini de poblacions de bacteris Gram-negatiu epífits en l'entorn natural de creixement de les plantes. Els bacteris Gram-negatius són aquells en que la seva coberta està formada per una bicapa lipídica i una capa proteica seguida d’una segona bicapa lipídica, en canvi, els Gram-positius només tenen una bipaca lipídica seguida de diverses capes proteiques que augmenten considerablement el gruix de la paret. Per exemple, Bacillus spp i Pseudomonas spp estan ben representats entre els Grampositius i Gram-negatius respectivament (Bunn i Tan, 2002). Es pot aconseguir disminuir o eliminar la presencia d’aquests tipus de contaminacions endògenes en el material micropropagat si prèviament a la seva introducció in vitro s’ha sotmès el mateix a un tractament amb antibiòtic o fungicida (veure apartat 1.3.4.3.). Les plantes i els teixits d’aspecte sà poden ser l’habitatge de bacteris endòfits no patògens que normalment estan associats amb les plantes en l’ambient d’in vitro. La contaminació de la planta mare pot ser a través d’obertures naturals (estomes, lenticel·les, ...), de ferides (cicatrius de fulles, ruptures de l’escorça lateral d’arrels...) o de danys tissulars causats per herbívors i plagues d’insectes. La colonització dels bacteris és en general limitada per l’espai i és probablement un factor important per diferenciar els bacteris endofítics de patògens de les plantes. La distribució es limita als espais intercel·lulars o sistèmica en els teixits vasculars tot i que s’han trobat en orquídies d’Austràlia una distribució dels bacteris intracel·lular. Des de la perspectiva de la micropropagació, els bacteris endòfits no s’eliminen amb Introducció 22 tractaments de superfície ja que no estan exposats a la matèria activa esterilitzant durant el tractament. Un explant inicialment pot estar lliure de contaminats endogens, però després pot contaminar-se degut a una procés de manipulació inadequat (Singha et al. 1987). Alguns bacteris endofítics estan latents i no produeixen símptomes visibles en les plantes o en el medi durant molts cicles de cultius. George (1993) atribueix la latència d’aquests bacteris a la seva necessitat d'adaptar-se a les condicions in vitro, ja que no poden multiplicar-se fins que l’explant es transfereix a un mitjà més favorable per al seu creixement. També s'ha suggerit que el creixement de bacteris latents pobres pot ser causa de l'alliberament insuficient de nutrients essencials per l’explant (Gunson i SpencerPhillips, 1993). La latència acaba quan el bacteri es converteix en patogen o quan el creixement de l’explant es retarda indegudament ja que s’observen colònies de la bactèria en teixits morts. Els efectes fisiològics dels bacteris endòfits en teixits de plantes cultivades in vitro semblen dependre de l’espècie hoste, els bacteris, la tensió i l’edat del cultiu. Els efectes poden variar de lleugers a greus, per exemple, els més lleugers poden ser un menor creixement de les plantes, una disminució de la taxa de multiplicació o la reducció d’arrelament. Alguns bacteris endofítics poden conferir efectes beneficiosos en l’hoste en el medi ambient, en un medi estèril in vitro s’especula que estimula el creixement de les plantes indirectament, mitjançant la producció d’antibiòtics induïda per la resistència (Hallmann et al. 1997). El comportament ecològic dels bacteris patògens endòfits pot ser anòmal. Els bacteris que normalment són sapròfits poden ser patògens en cultius de teixits vegetals ("vitropaths"), i els agents patògens coneguts a la natura poden ser sapròfits in vitro (Herman, 1990). Atès que els agents patògens debiliten o maten les plantes per parasitisme directe, els “vitropaths” redueixen el creixement o maten les plantes que creixen in vitro mitjançant la inducció de canvis en el medi de cultiu, en lloc de parasitisme directe dels teixits de l'hoste (Leifert i Waite 1992). Se suposa que el canvi en el comportament dels patògens es produeix per un canvi pronunciat en les condicions ambientals i la fisiologia de les plantes. Per exemple, l'esterilització de la superfície pot haver tret la microflora natural antagònica i permetre així sobreviure als bacteris patògens, que es van mantenir en escac una vegada i poden proliferar en l'ambient in vitro sense la competència. 1.3.3.3.Antibiòtics Els antibiòtics no s'utilitzen normalment en el cultiu de teixits vegetals, i quan ho són, s'utilitzen per tal de prevenir, controlar o eliminar la contaminació bacteriana persistent. Els antibiòtics generalment permeten el control temporal (supressió) en lloc de l'eradicació completa dels contaminants bacterians en els cultius infectats. És estrany que un sol antibiòtic sigui eficaç quan hi ha diversos bacteris contaminants presents. Les exposicions de curta durada del material vegetal al antibiòtic, per exemple en la descontaminació de l’explant, sembla ser l'aplicació més correcta dels antibiòtics en el cultiu de teixits vegetals, per contra, en els casos d’esterilitzants de superfície per si soles no són suficients. Introducció 23 Encara que la sensibilitat d'un contaminant aïllat a un antibiòtic es pot determinar a partir de la seva antibiograma (inhibició del creixement dels cultius de gespa al voltant de discos de paper impregnats amb antibiòtics diferents), l'absorció dels teixits pobres i fitotoxicitat sovint comprometen l'eficàcia antibiòtica. A més, alguns antibiòtics són coneguts per ser fitotòxics i s’han d'utilitzar amb precaució (George, 1993, Leifert et al., 1994). Els bacteris endosporics (Bacillus, per exemple) tendeixen a persistir fins i tot quan l'absorció és sistèmica, com ho demostra la reaparició de la contaminació bacteriana quan els cultius són transferits a un medi sense l'antibiòtic. En teoria, un antibiòtic pot ser aplicat amb fins profilàctics o terapèutics en el cultiu de teixits vegetals. No obstant això, la dependència dels antibiòtics per a la profilaxi, com a alternativa a l'asèpsia, es posa en dubte ja que aquesta pràctica pot estimular el desenvolupament de resistència a antibiòtics en bacteris contaminants (Falkiner 1997). En algunes ocasions s’ha vist que l’addició d’alguns antibiòtics ha interaccionat positivament amb el creixement vegetal, com és el cas de la inducció d'arrels en alguns genotips de Tanarida (Keskitalo et al. 1998). La combinació d’antibiòtics amb un fungicida d'ampli espectre (per exemple, benomil o miconazol) pot ser útil per a la desinfecció dels explants, especialment quan es tracta d’eradicar la presencia de microorganismes de tipus "reincident". George (1993) i Herman (1996, 1997) citen els casos de desinfecció amb èxit amb antibiòtics (per exemple, ampicilina, cefotaxima, rifampicina i la tetraciclina) que s'aplica de manera seqüencial o en una barreja. 1.3.4.Condicions d’esterilitat i asèpsia Durant tots els processos que impliquin la manipulació del material vegetal in vitro caldrà tenir molta cura amb les condicions de treball. Cal protegir al màxim els explants i els propàguls obtinguts de tot tipus de contaminacions exògenes. Al ser els medis de cultiu emprats molt adients pel desenvolupament de microorganismes, fa que en el cas de que pateixin alguna contaminació, al cap de pocs dies la colònia que s'haurà format pot arribar a inhabilitar el desenvolupament del material vegetal ubicat en el mateix. Existeixen quatre fonts d'infecció principals: material vegetal (tant endògena com exògena), el medi de cultiu, l'aire i la manipulació. A) Equips i eines de treball: La cambra de flux laminar és un receptacle de treball on poder manipular el material vegetal en condicions d'asèpsia. La cambra pren l’aire de la sala on està ubicada i el fa passar per un prefiltre de tipus tèxtil (on s'hi dipositen les partícules més grolleres), a continuació aquest és conduit a través d'un microfiltre (porositat molt fina) abans que arribi a la zona de treball . L'aire és impulsat en forma de flux laminar constant per evitar l’entrada d’aire extern. Aquest sistema de filtrat assegura que l’aire que va a Introducció 24 parar sobre la taula és inicialment estèril. Per a mantenir aquesta esterilitat sovint cal netejar la superfície de treball amb alcohol del 70%. La sala on hi ha instal·lada aquesta cambra s’ha de mantenir en bones condicions higièniques, cal evitar introduir material infectat i el pas de personal aliè, entre d’altres mesures. L’esterilització del medi de cultiu es pot fer per dos mètodes: destrucció física dels microorganismes mitjançant aire sec i calent, vapor o irradiació o; destrucció química utilitzant compostos esterilitzants o antibiòtics. El mètode més emprat és la utilització de l’autoclau. L’autoclau és un aparell que esterilitza mitjançant vapor d'aigua. Unes bones condicions d'esterilització, tot i que dependrà de la distribució volumètrica que s'hagi fet del medi de cultiu, es donen si es manté durant 20 minuts a 121ºC amb vapor saturat (1 kg/cm 2 de sobrepressió). Cal tenir en compte que durant el procés d'autoclavatje comportat: • el pH del medi baixa 0,3 - 0,5 unitats • una temperatura elevada pot caramel·litzar els sucres creant toxicitat • un excés de temps d'esterilització pot provocar precipitacions de sals i despolimeritzar l'agar • desnaturalització de certs productes orgànics • les substancies volàtils poden ser destruïdes Altres tipus d'esterilització dels medis nutritius com l'esterilització per radiació de raigs gamma (excessivament cara i sense avantatges sobre l'autoclau) i l'esterilització per filtració (filtres de membrana que retenen fins i tot els virus, té avantatges sobre substancies termolàbils que es descomponen a l'autoclau, com per exemple l'àcid giberèl·lic). Per a l'esterilització de la resta de materials necessaris per a la micropropagació com poden ser les pinces, els bisturís, el paper de filtre (sobre el que es treballarà), el més aconsellable són els mètodes físics com l'autoclau. B) Material vegetal: La preparació prèvia del material vegetal abans de ser desinfectar és molt importat per tal d'aconseguir posteriorment un procés exitós. El primer pas és retirar qualsevol part de terra, zones mortes, etc, de la part de la planta amb la que es treballarà. Seguidament es convenient fer un rentat sota aigua corrent i raspallar el material. Posteriorment es pot sotmetre al material vegetal a un pretractament que consisteix en una immersió amb alcohol del 70%, perquè entre d’altres s’ha demostrat que és capaç d'eliminar les ceres dels teixits i facilita la millor acció del desinfectant que s’utilitzarà posteriorment. El temps d’immersió es reduït, normalment inferior a un minut degut a la seva elevada fitoxicitat. Material i mètodes 31 Figura 13Gemmes G2 de Dipladenia sanderi. Figura 14Gemmes G3 i M de Dipladenia sanderi. Figura 15Gemmes G2 de Nerium oleander. Material i mètodes 32 Figura 16Gemmes G3 i M de Nerium oleander. 3.2. Medi de cultiu 3.2.1. Formulació Per a formular el medi base emprat (Taula 1) en els diferents assajos d’aquest treball es van utilitzar les sals proposades per Murashige i Skoog (1962), addicionades amb vitamines, hidrats de carboni i agar com agent solidificant. Les diferencies entre els medis realitzats van ser donades per les concentracions de diferents reguladors de creixement (Taula 2). Les solucions mares de les matèries actives utilitzades en les preparacions dels medis de cultiu s’emmagatzemaven a la nevera (4ºC) per la qual cosa abans de la seva utilització per a la formulació dels medis calia que aquestes reposessin un determinat període de temps a temperatura ambient. Per aconseguir una bona dissolució de totes les sals utilitzades s’utilitzava un agitador de la marca KCH-MAGRCT i un altre de la marca P Selecte Agimatic-S a 300-400 rpm. El pH de tots els medis utilitzats estava comprès entre 5.7 i 5.8, per aconseguir-ho es va fer servir NaOH (0,4 N), ja que els medis obtinguts abans de l’ajust presentaven un pH eminentment àcid, per sota de 5. El pHmetre emprat era de la marca CRISON. Posteriorment, calia escalfar les solucions fins a 70ºC (microones), moment en el qual s’afegia 10,0 g d’Agar-agar (de la marca comercial Becton, Dickinson and Company) i es barrejava bé. Es tornava a col·locar en la font de calor per a pujar la temperatura fins a 90-95ºC, moment en el qual s’aconseguia la dissolució del agar en el medi. A continuació es repartia el medi en tubs d’assaig (150 x 21 mm de pyrex) mitjançant un dispensador graduat (Seripettor, de la marca Brand) i es tapaven amb taps d’alumini (Serotaps). La quantitat de medi incorporat per tub fou de 16 ml. Material i mètodes 33 Taula 1Components i concentracions del medi Murashige i Skoog. PRODUCTE QUANTITAT PER 1L DE MEDI NH 4 NO 3 1650 mg KNO 3 19 00 mg Micronutrients H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CoCl2·6H2O 6.2 mg 0.83 mg 0.25 mg 0.025 mg KH 2 PO 4 1 7 0 mg CaCl 2 ·2H 2 O 44 0 mg MgSO 4 ·7H 2 O 37 0 mg M icroelementos MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O CuSO4·5H2O 22.3 mg 8.6 mg 0.025 mg FeNa 2 EDTA Na2EDTA FeSO4·7H2O 37.3 mg 27.8 mg Tiamina 0.5 mg Piridoxina 0. 5 mg Ácid nicotínic 0. 5 m g Glicocola 2 m g Inositol 100 mg Sacarosa 30000 mg Agar - agar 10000 mg Taula 2Medis formulats. MEDI BAP NAA Medi 1 1 µM 0 µM Medi 2 5 µM 0 µM Medi 3 1 µM 0.2 µM M edi 4 5 µM 0.2 µM Material i mètodes 34 3.2.2. Esterilització L’esterilització del medi es va fer per procés d’autoclavatge mitjançant una autoclau de la marca P Selecta (Figura 17). Les condicions d’esterilització s’aconseguien mitjançant una sobrepressió de 1 kg de vapor d’aigua/m 2 durant 20 minuts a una temperatura de 121ºC. El medi abans de la seva utilització s’emmagatzemà en fred (4ºC) per un període màxim de 48 hores. Figura 17Autoclau P Selecta del laboratori de Producció Vegetal de l'ESAB. 3.3. Metodologia específica del diferents assajos realitzats 3.3.1. Assaig I: Influència de la posició de la gema i del medi de cultiu en la fase de iniciació Els explants utilitzats són gemmes preses de diferents posicions en les plantes mares (veure apartat 2.1.). Els tipus de gemmes utilitzades són: G1, G2, G3 i M d’ambdues espècies . La posta en cultiu es va fer entre els dies 24 i 26 de novembre del passat any 2010. La pauta de desinfecció seguida va ser la mateixa per a cada espècie: 1r. Rentar els fragments de material vegetal d’ambdues especies amb raspall i aigua corrent. 2n. Immersió del material vegetal en 300 ml d’una solució desinfectant, durant 30 minuts amb agitador (Figura 18), formulada amb hipoclorit sòdic al 1% de clor actiu, addicionada amb 2-3 Material i mètodes 35 gotes de Tween-20 i en condicions de flux laminar (Figura 19). El hipoclorit sòdic provenia de lleixiu comercial de la marca Floquet que conté 40 g de clor actiu/L de producte comercial. 3r. Rentar 3 vegades amb aigua destil·lada esterilitzada sota condicions de flux laminar. Dos cops amb agitació manual i durant uns 30 segons, i un últim rentat de 5 minuts en l’agitador. Figura 18Agitador a la cambra de flux laminar amb material per desinfectar. Figura 19Cambra de flux laminar del laboratori de l'ESAB. Els medis formulats difereixen en les concentracions de BAP i la presència o absència de NAA (Taula 2). El medi de cultiu es va preparar tal com està descrit a l’apartat 2.2.1. El nombre de gemmes sembrades en cada tractament fou de 20 (Figura 20, 21 i 22) i en el cas de la introducció dàpex caulinar el nombre de repliques fou de 16 (Taula 3). En total el nombre de tubs controlats en l’assaig fou de 608 (304 per a cada espècie). Material i mètodes 36 Taula 3Nombre i tipus d’explants sembrats en cadascun dels medis a l'assaig I. Figura 20Explant d'una gemma G2 de Nerium oleander. Figura 21Explant d'una gemma G3 de Nerium oleander. Dipladenia Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 TOTAL M 16 16 16 16 64 G3 20 20 20 20 80 G2 20 20 20 20 80 G1 20 20 20 20 80 TOTAL (tubs) 76 76 76 76 304 Nerium Medi 1 Me di 2 Medi 3 Medi 4 TOTAL M 16 16 16 16 64 G3 20 20 20 20 80 G2 20 20 20 20 80 G1 20 20 20 20 80 TOTAL (tubs) 76 76 76 76 304 Material i mètodes 37 Figura 22Explant d'una gemma G3 de Dipladenia sanderi. Al cap de dos mesos els explants supervivents es van repicar en medi 2 eliminant, si n’hi havien, les parts necrosades i els cal·lus. A més, es va seguir el creixements dels propàguls. 3.3.2.Assaig II: Modificació de la pauta de desinfecció dels explants de gemma A l’assaig I es va observar un altíssim grau de contaminació dels explants de gemma, fos quina fos la seva posició en la planta mare, tal com es comentarà a l’apartat de resultats (apartat 4.1.1.). Atès l’anterior, en aquest assaig es va estudiar l’eficàcia d’una pauta de desinfecció més forta (Etanol 70%, 2,5% Clor actiu). Per tal d’esbrinar el seu efecte sense d’altres factors que hi poguessin influir, aquesta pauta es va assajar amb un únic tipus de gemma i un únic medi de cultiu. Els explants utilitzats van ser gemmes del tipus G2, és a dir, procedents del terç mig de les tiges de les plantes mares. La pauta de desinfecció seguida és la mateixa per a cada espècie: 1r. Rentar els fragments de material vegetal d’ambdues especies amb raspall i aigua corrent. 2n. Durant 30 segons, submergir en una solució del 70% d’alcohol (etanol absolut parcialment desnaturalitzat) 3r. Immersió del material vegetal en 300 ml d’una solució desinfectant, durant 40 minuts amb agitador, formulada amb hipoclorit sòdic al 2,5% de clor actiu, addicionada amb 2-3 gotes de Tween-20 i en condicions de flux laminar. El hipoclorit sòdic provenia de lleixiu comercial de la marca Floquet que conté 40 g de clor actiu/L de producte comercial. 4r. Rentar 3 vegades amb aigua destil·lada esterilitzada a la cambra de flux laminar. Dos cops amb agitació manual i durant uns 30 segons, i un últim rentat de 5 minuts en l’agitador. Material i mètodes 38 El medi de cultiu es preparà tal com està descrit en el apartat 2.2.1. En aquest cas només es va fer servir el Medi 2 (Taula 2). El nombre de gemmes sembrades en cada tractament fou de 10 (Taula 4). En total el nombre de tubs controlats en l’assaig fou de 20. Taula 4Sembra de les gemmes de l'assaig II. 3.3.3. Assaig III: Modificació del protocol de cultiu a partir d’àpex caulinar Atès que la modificació de la pauta de desinfecció de l’assaig II tampoc va aconseguir eliminar les contaminacions en els tubs tal com es veurà en l’apartat 4.2. de resultats, es va dur a terme un tercer assaig utilitzant com explant els àpex caulinar apicals que a l’assaig I ja havien mostrat una incidència de contaminació molt menor que les gemmes. Els explants utilitzats van ser únicament àpex caulinar d’ambdues espècies sota condicions de flux laminar. La pauta de desinfecció seguida és la mateixa per a cada espècie: 1r. Rentar els fragments de material vegetal d’ambdues especies amb raspall i aigua corrent 2n. Immersió del material vegetal en 300 ml d’una solució desinfectant, durant quaranta-cinc minuts amb agitador, formulada amb hipoclorit sòdic al 1,5% de clor actiu, addicionada amb 2-3 gotes de Tween-20 i en condicions de flux laminar. El hipoclorit sòdic provenia de lleixiu comercial de la marca Floquet que conté 40 g de clor actiu/L de producte comercial. 3r. Rentar 3 vegades amb aigua destil·lada esterilitzada. Dos cops amb agitació manual i durant uns 30 segons, i un últim rentat de 5 minuts en l’agitador. El medi de cultiu es preparà tal com està descrit en el apartat 2.2.1. i es va fer servir el de tipus 2. En la introducció d’ àpex caulinar el nombre de repliques fou de 30 per a cada espècie (Taula 5). En total el nombre de tubs controlats en l’assaig fou de 60. Dipladenia Medi 2 TOTAL G2 10 10 TOTAL (tubs) 10 10 Nerium Medi 2 TOTAL G2 10 10 TOTAL (tubs) 10 10 Material i mètodes 39 Taula 5Sembra dels àpex caulinar de l'assaig III. Dipladenia Medi 2 TOT AL M 30 30 TOTAL (tubs) 30 30 Nerium Medi 2 TOTAL M 30 30 TOTAL (tubs) 30 30 Resultats i discussions 40 4. RESULTATS I DISCUSSIONS 4.1. Assaig I: Influència de la posició de la gema i del medi de cultiu en la fase de iniciació 4.1.1. Iniciació del cultiu La sembra va ser severament atacada per microorganismes exògens provocant la mort o la inviabilitat dels explants. A la taula 6 queden representades les dades de les contaminacions microbianes produïdes durant els dos següents mesos per a les dues especies del treball i el nombre de supervivents. Taula 6Efectes del tipus d’explant i del medi de cultiu en la viabilitat dels explants. BLAU: Medi 1 (1 µM BAP, 0 µM NAA); GROC: Medi 2 (5 µM BAP, 0 µM NAA); GRIS: Madi 3 (1 µM BAP, 0,2 µM NAA); TARONJA: Medi 4 (5 µM BAP, 0,2 µM NAA). Nerium Dipladenia Tipus nº Morts per contaminació Necrosats Viables Tipus nº Morts per contaminació Necrosats Viables d’explant d'explants microbiana als 70dies d’explant d'explants microbiana als 70 dies G1 20 20 0 0 G1 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 G2 20 20 0 0 G2 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 G3 20 20 0 0 G3 20 11 5 4 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 20 20 0 0 M 16 11 0 5 M 16 16 0 0 16 10 0 6 16 4 3 9 16 6 0 10 16 4 6 6 16 10 0 6 16 3 3 10 Total 27 Total 29 Per tant, als 70 dies de la sembra, el recompte sobre els 304 tubs de Nerium oleander era de 27 explants vius i aparentment sans que provenien tots ells de la sembra d’ápex caulinar, repartits en: 5 explants del medi M1, 6 del medi M2, 10 del medi M3 i 6 del medi M4. La totalitat dels explants procedents de gemmes (G1, G2 i G3) mostrava una forta contaminació microbiana que comportà una viabilitat nul·la. En el cas de la Dipladenia sanderi, els 29 explants vius (sobre els 304 totals) van quedar distribuïts en 4 gemmes G3 del medi M1 i, respecte els ápex caulinar, en 9 del medi M2, 6 del medi M3 i 10 del medi M4. Resultats i discussions 47 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 % Morts per contaminació microbiana % Necrosats % Viables Figura 31Resultats en percentatge dels explants d’àpex caulinar segons el medi. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 % Morts per contaminació microbiana % Necrosats % Viables Figura 32Resultats en percentatge dels explants d’àpex caulinar de Nerium segons el medi. Resultats i discussions 48 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 % Morts per contaminació microbiana % Necrosats % Viables Figura 33- - Resultats en percentatge dels explants d’àpex caulinar de Dipladenia segons el medi. Per finalitzar la fase d’iniciació del cultiu es va fer una avaluació del creixement dels explants viables i aparentment sans. Com es pot veure en la taula següent (taula 9), el creixement dels àpex caulinar de Nerium van quedar repartits en: 15 explants de valor 1, 8 de valor 2 i 4 de valor 3, sense trobar cap explant amb un creixement superior als 8 mm. Per als àpex caulinar de Dipladenia, es van classificar en: 3 explants de valor 1, 13 de valor 2, 6 de valor 3 i 3 de valor 4. I per a les gemmes G3, els 4 explants tenien un valor 4. Taula 9Creixement dels meristems i les gemmes abans del repicat. Valor 1: <2mm de longitud; valor 2: 2-4 mm de longitud; valor 3: 4-8 mm de longitud; valor 4: >8 mm de longitud. BLAU: Medi 1 (1 µM BAP, 0 µM NAA); GROC: Medi 2 (5 µM BAP, 0 µM NAA); GRIS: Madi 3 (1 µM BAP, 0,2 µM NAA); TARONJA: Medi 4 (5 µM BAP, 0,2 µM NAA). Creixement dels àpexs caulinar abans resembra Valor 1 2 3 4 Total medi Nerium 3 2 - - 5 3 1 2 - 6 6 3 1 - 10 3 2 1 - 6 Total valor 15 8 4 0 27 Dipladenia - - - - 0 1 5 2 1 9 1 5 - - 6 1 3 4 2 10 Total valor 3 13 6 3 25 Creixement dels les gemmes G3 Valor 1 2 3 4 Total medi Dipladenia - - - 4 4 Resultats i discussions 49 Per detectar si hi ha una influencia entre el medi i el creixement dels explants viables, s'ha calculat el producte dels individus de cada tipus pel valor donat del tipus de creixement ,[(n x 1) + (n x 2) + (n x 3) + (n x 4)]/∑n, obtenint els resultats que es representen a la taula 10 per a ambdues especies (Taula 10). Taula 10Creixements en valors absoluts. Medi 1 (1 µM BAP, 0 µM NAA); Medi 2 (5 µM BAP, 0 µM NAA); Madi 3 (1 µM BAP, 0,2 µM NAA); Medi 4 (5 µM BAP, 0,2 µM NAA). Creixement en valors absoluts Espècie Nerium Dipladenia Medi 1 1,40 0 Medi 2 1,83 2,33 Medi 3 1,50 1,83 Medi 4 1,67 2,70 El medi M1 és el que propicia un menor creixement en ambdues especies. En el cas de Dipladenia els medis que contenen 5 µM (M2 i M4) propicien un major creixement dels explants observant-se un millor resultat amb el medi 4 amb 5 µM BAP i 0,2 µM NAA. En el cas del Nerium, les diferencies són més petites. El valor màxim absolut s'observa al medi M2 que contè 5 µM de BAP i 0 µM de NAA, tot i que com anteriorment s’ha contemplant, aquest medi no es el que va tenir una major supervivencia. Pel que fa a la multiplicació, no es van observar propàguls neoformats en cap dels explants a excepció feta d’un de Dipladenia que provenia d’un meristem amb creixement superior a 8 mm i del que es va poder extreure un únic propàgul. 4.1.2. Repicat dels explants viables Els explants aparentment sans i viables de la primera part del cultiu es van repicar desprès de l’avaluació del creixement en un únic medi (M2). Desprès de fer el subcultiu, es van controlar els explants respecte al seu creixement i a l’aparició de contaminacions microbianes i/o necrosis. Pel que fa al creixement, la primera avaluació correspon a l’obtinguda dels explants al final de l’iniciació del cultiu, es a dir, abans del repicat. Al llarg dels tres següents mesos es va anar fent controls periòdics sobre la viabilitat observant problemes de contaminacions microbianes sobretot a les tres primeres setmanes amb unes pèrdues de 7 tubs de Nerium sobre els 27 repicats i 6 tubs de Dipladenia sobre els 30 repicats (Taula 11). Resultats i discussions 50 Una altra dada important va ser la quantitat d’explants amb teixit necrosat que són inviables observada a les dues primeres setmanes on es van perdre 8 dels 27 tubs de Nerium i 12 dels 30 tubs de Dipladenia. Pel que fa a l'evolució dels explants segons el valor de creixement observat abans del repicat, en Nerium queda patent l'elevada sensibilitat dels explants amb valor 1 que van sofrir una important davallada per necrosis dels teixits, mentre que en Dipladenia aquestes pèrdues es van repartir bastant homogèniament per tots els valors. Aquestes dades també es poden obserbar gràficament en les figures 34, 35 i 36. Així atenent a la taula 12 sobre percentatges es pot observar com en el transcurs dels quasi tres mesos, només el 40% dels tubs de Nerium es van mantenir aparentment sans i viables mentre que els tubs de Dipladenia es quedaven en un 30% (figura 26). Del 60% de pèrdues obtingudes en Nerium, justament la meitat van ser a causa de contaminants microbians i l'altra meitat degut a la necrosis del explant. En el cas del 70% de pèrdues de la Dipladenia, el 43% va ser degut a les contaminacions per microorganismes mentre que el 57% van perdre la viabilitat degut al necrosament (Taula 12). Una observació que es pot fer d'aquestes ultimes dades junt amb les dades inicials de la primera sembra és que la gran majoria de tubs necrosats s'han trobat en l'especie Dipladenia sanderi, possiblement per ser un material vegetal més dèbil i més sensible a la manipulació i la seva dessecació. Taula 11Evolució del creixement dels explants d’àpex meristemàtic desprès del repicat. Valor 1: <2mm de longitud; valor 2: 2-4 mm de longitud; valor 3: 4-8 mm de longitud; valor 4: >8 mm de longitud. GROC: Medi 2 (5 µM BAP, 0 µM NAA). Evolució del creixement dels àpexs caulinar després del repicat (en M2) Valor Dia 0 Dia 6 Dia 16 Dia 23 Dia 34 Dia 55 Dia 69 Dia 85 Nerium 1 15 14 8 4 4 4 4 3 2 8 8 6 6 6 6 6 6 3 4 4 3 2 2 2 2 2 4 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 27 26 17 12 12 12 12 11 Morts per 0 1 1 5 0 0 0 1 contaminació microbiana Necrosats 0 0 8 0 0 0 0 0 Dipladenia 1 4 3 2 1 0 0 0 0 2 13 8 5 3 3 3 2 2 3 6 3 2 2 2 2 2 2 4 7 6 6 6 6 5 5 5 Total 30 20 15 12 11 10 9 9 Morts per 0 1 2 3 1 1 1 0 contaminació microbiana Necrosats 0 9 3 0 0 0 0 0 Resultats i discussions 51 Taula 12Evolució en percentatges dels explants d’àpex caulinar desprès del repicat. Percentatge de viabilitat desprès del repicat % Dia 0 Dia 6 Dia 16 Dia 23 Dia 34 Dia 55 Dia 69 Dia 85 Nerium Viables 100 96,3 63 44,4 44,4 44,4 44,4 40,7 Morts per 0 3,7 7,4 25,9 25,9 25,9 25,9 29,6 contaminacions 0 0 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 29,6 microbianes Necrosats Dipladenia Viables 100 66,7 50 40 36,7 33,3 30 30 Morts per 0 3,3 10 20 23,3 26,7 30 30 contaminacions 0 30 40 40 40 40 40 40 microbianes Necrosats 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dia 0 Dia 6 Dia 16 Dia 23 Dia 34 Dia 55 Dia 69 Dia 85 Valor1 Valor 2 Valor 3 Figura 34Resultats en percentatge del cultiu de Nerium segons el creixement. Resultats i discussions 52 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dia 0 Dia 6 Dia 16 Dia 23 Dia 34 Dia 55 Dia 69 Dia 85 Valor1 Valor 2 Valor 3 Valor 4 Figura 35Resultats en percentatge del cultiu de Dipladenia segons el creixement. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dia 0 Dia 6 Dia 16 Dia 23 Dia 34 Dia 55 Dia 69 Dia 85 Nerium Dipladenia Figura 36Resultats en percentatge del cultiu de les especies d’estudi. Resultats i discussions 53 4.2.Assaig II: Modificació de la pauta de desinfecció dels explants de gemma El control de l’estudi va ser durant les dues setmanes següents a la sembra on es van obtenir els resultats que indiquen que el percentatge de contaminació va ser del 80% i el percentatge d’explants necrosats va ser d’un 20% sense tenir en compte diferencies entre especies. Però observant les especies separadament es trobava una dada molt rellevant: els explants necrosats només eren presents a Dipadenia, per la qual cosa els tubs contaminats per microorganismes representaven el 60% malgrat tot, al final es seguia mantenint una viabilitat nul·la però el mètode de desinfecció va tenir un èxit del 40% en Dipladenia en quant a eliminar microorganismes (taula 11). Taula 13Resultats assaig II Resultats assaig II Nerium Dipladenia nº explants % nº explants % Morts per 10 100 6 60 contaminacions microbianes Necrosats 0 0 4 40 Viables 0 0 0 0 Total 10 10 4.3. Assaig III: Modificació del protocol de cultiu a partir d’ àpex caulinar Els trenta àpex caulinar de cada espècie sembrats es van mantenir aparentment sans i viables com demostra la taula 12 fins als nou dies de la sembra. Els explants de Nerium continuaven aparentment sans i viables mentre que quatre dels explants de Dipladenia presentaven contaminacions microbianes. Al cap de vint dies de l’inici del cultiu s’obtingué nou tubs de Nerium contaminats per microorganismes i tres necrosats, per tant en queda un 60% d’ àpex caulinar aparentment sans i viables. En cas de la Dipladenia, es trobà amb nou tubs amb contaminacions microbianes i quatre explants necrosats, cosa que fa disminuir el percentatge a 43% dels explants viables. El percentatge d’ àpex caulinar necrosats en ambdues espècies va ser relativament baix, al voltant del 10% mentre que el de la contaminació microbiana assolí unes pèrdues del 30% dels explants sembrats al cap de vint dies. Als quaranta-un dies de la sembra dels àpex caulinar no es va trobar cap explant necrosat, però sí cinc explants de Nerium i dos de Dipladenia amb contaminacions microbianes. Als catorze dies de l’anterior control (55 dies des de la sembra) tots els explants de Dipladenia eren aparentment sans i viables mentre que en el cas del Nerium es contaminà tres tubs i es trobà un amb teixit vegetal necrosat. En acabar el seguiment als 71 dies de la posta del cultiu es detectà només dues contaminacions microbianes en explants de Dipladenia. Els resultats són inferiors als aconseguits en l’assaig I però amb una variació d’aproximadament 10%. En aquest assaig els explants aparentment sans i viables fou un 30% en ambdues espècies. Resultats i discussions 54 Taula 14Evolució de la segona sembra de meristems en medi 2 Evolució 2ª sembra de meristems en M2 Dia 0 Dia 2 Dia 9 Dia 20 Dia 41 Dia 55 Dia 71 Nerium Viables 30 30 30 18 13 9 9 Contaminats 0 0 0 9 5 3 0 Necrosats 0 0 0 3 0 1 0 Dipladenia Viables 30 30 26 13 11 11 9 Contaminats 0 0 4 9 2 0 2 Necrosats 0 0 0 4 0 0 0 Conclusions 55 5. CONCLUSIONS Dels resultats obtinguts en aquest treball i sota les condicions experimentals que s’imposen se’n poden extreure les següents conclusions: • Les pautes de desinfecció assajades no han estat eficients per tal d’obtenir material vegetal asèptic i viable en la fase d’iniciació de Nerium oleander i Dipladenia sanderi quan s’utilitzen gemmes de diferent posició en les plantes mares com a font d’explantació. • La quasi totalitat de les gemmes sembrades han mostrat una elevadíssima contaminació microbiana constituïda principalment per fongs i llevats i com a mínim s’ha detectat la presència d’un bacteri. Aquesta incidència ha comportat la inviabilitat del desenvolupament dels propàguls. • En utilitzar àpexs caulinars com a explant els resultats de la fase d’iniciació han estat mitjanament acceptables obtenint en la primera posta en cultiu un 42% i un 39% de propàguls viables de Nerium olenader i de Dipladenia sanderi respectivament. • La inviabilitat de la resta de propàguls procedents d’àpexs meristemàtics es atribuïble a la necrosi tissular o a les contaminacions microbianes • No s’ha observat cap efecte de la composició hormonal del medi de cultiu (BAP, 1 i 5 µM; ANA, 0 i 0,2 µM) en la viabilitat i el creixement dels propàguls. • En treballs posteriors s’hauria d’intentar: 1. millorar l’estat sanitari i fisiològic de les plantes mares mitjançant tècniques de cultiu en hivernacle amb estricte control fitosanitari i actuacions de rejoveniment del material vegetal. 2. perfeccionar la tècnica de posta en cultiu d’àpexs meristemàtics que permetés obtenir un percentatge de viabilitat superior al 80%. Bibliografia 56 6. BIBLIOGRAFIA Alonso, J.R., Tratado de Fitofármacos y nutracéuticos. 2a. ed. Ed. Corpus. Buenos Aires, 2004. ISBN 9789872029234. Atlas RM, Bartha R (1987) Microbial ecology: fundamentals and applications. (Benjamin/Cummings Publishers: Menlo Park). Auderset, G. et al. Simulation of root formation in difficult-to-root woody cuttings by dithiothereitol (1997). Augé, R.; Beauchesme, G.; Boccon-Gibod, J.; L. Decourtye, B. Digat, R. Jalouzot, R. Minier, J.-CL Morand, J.P. Reynoird, D. G. Strullu, H. Vidalie. La culture “in vitro” et ses Applications hortícoles. Ed. J.b. baillière, 1989. ISBN: 2-85206-504-5. Azcón-Bieto, J.; M. Talón. Fundamentos de Fisiologia Vegetal. Edicions Universitat de Barcelona, 2001. ISBN: 84-8338-182-6. (pàg. 301-360). Biondo R. et al. Direct organogenesis of Mandevilla illustris (Vell) Woodson and effects of its aqueous extrat on the enzymatic and toxic activities of Crotalus durissus terrificus snake venon. 2004. Bolòs, O.; Vigo, J., Flora dels Països Catalans. Ed. Barcino. Barcelona, 1984. ISBN 9788472265974. Bradbury JF (1988) Identification of cultivable bacteria from plants and plant tissue cultures by use of simple classical methods. Acta Horticulturae 225, 27–37. Bruneton, J., Plantas tóxicas: vegetales peligrosos para el hombre y los animales. Editorial Acribia. Zaragoza., 2000. ISBN 9788420009353. Capdevielle, F.; Castillo, A., AR-VITRO®: un sistema de apoyo para el sector agrobiotecnológico de Uruguay, junio 2004. I Seminario de Arándanos y Frambuesas, Uruguay. Cassells, A. C., Problems in tissue culture: culture contamination. In (Eds PC Debergh and RH Zimmerman). ‘Micropropagation technology and application.’ pp. 31–44. (Kluwer Academic Publishers Dordrecht) (1991). Christoph Köchel: Oleander. Ulmer, Stuttgart 2000, ISBN 3-8001-6653-4. Cole M (1996) Microbial contaminants and aseptic techniques in plant tissue culture. In ‘Tissue culture of Australian plants.’ (Eds A Taji and R Williams) pp. 204–239. (University of New England Press: Armidale, Australia). Cubero J I, Introducción a la mejora genètica vegetal. Ed. Mundi-Prensa, 2003. (Capitulo 16). Cuenca F, Nuevas plantas de flor en el mercado. El cultivo de Dipladenia sanderi. 1995. Davies, P. J., Plant hormones and their role in plant growth and development. Ed. Kluwer Academic Publishers, 1988. De Jesus A. et al., Propagacion in vitro y aclimatación de Mandevilla blanca, 2009.