Parámetros cinéticos de Escherichia coli en zumo comercial de frutas del bosque

PARÁMETROS CINÉTICOS DE ESCHERICHIA COLI EN ZUMO COMERCIAL DE FRUTAS DEL BOSQUE Trabajo de Fin de Grado Grado de Nutrición Humana y Dietética Facultad de Medicina Curso académico 2018/2019 Presentado por: Celia Álvarez Blanco Tutorizado por: Emiliano José Quinto Fernández Dr. Emiliano José Quinto Fernández, Profesor Titular del Área de Nutrición y Bromatología en la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid, Hace constar: Que Dña. Celia Álvarez Blanco ha realizado, bajo su dirección, el Trabajo de Fin de Grado titulado “Parámetros cinéticos de Escherichia coli en zumo comercial de frutas del bosque”, que presenta, tras su autorización, para optar al Grado en Nutrición Humana y Dietética. Y, para que conste donde corresponda, firmo la presente en Valladolid a once de Junio de dos mil diecinueve. Dr. Emiliano J. Quinto Fernández Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco ABREVIATURAS OMS: Organización Mundial de la Salud ETEC: Escherichia coli enterotoxigénicas EPEC: Escherichia coli enteropatógenas EAEC: Escherichia coli enteroagregativa EHEC: Escherichia coli hemorrágicas EIEC: Escherichia coli enteroinvasivas LT: Toxina termolábil ST: Toxina termoestable CFA: Factores de colonización AAF: Fimbrias de adherencia y agregación SHU: Síndrome hemolítico urémico BMR: Bacterias multirresistentes SP: Salud pública GLASS: Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos de la Organización Mundial de la Salud AECOSAN: Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición EDA: Enfermedad diarreica aguda UFC: Unidad formadora de colonias CDC: Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (Centers for Disease Control and Prevention) SEIMC: Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica BFP: Fimbrias formadoras de haces (bundle-forming pilus) Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco RESUMEN Introducción. Los brotes producidos por Escherichia coli son un riesgo para la salud pública, siendo los zumos de frutas una fuente crítica de esta bacteria. Dado que la mencionada infección se puede prevenir gracias a unas buenas prácticas de manipulación, es importante conocer la etiopatogenia de esta enfermedad, así como su propagación y prevención. Además, es necesario conocer las definiciones y límites legales que regulan la presencia de E. coli en los zumos de frutas. Objetivo. Estudiar el crecimiento de diferentes cepas de E. coli en un zumo de frutas del bosque comercial a diferentes pH, presencia y ausencia de luz, presencia y ausencia de oxígeno y a diferentes temperaturas. Material y métodos. De una parte, estudio descriptivo transversal, basado en una revisión bibliográfica sobre E. coli y el contexto legal de los zumos de frutas. Se excluyeron las investigaciones realizadas solamente sobre plantas, los brotes producidos por vehículos diferentes al agua y alimentos, y los artículos en idiomas diferentes al español, inglés, italiano y francés. De otra parte, estudio analítico. Se analizaron, utilizando para ello el programa ComBase, datos recogidos por el Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de los Alimentos de la Universidad Autónoma de Barcelona, relativos al crecimiento de tres cepas de E. coli a diferentes condiciones de pH, luz, temperatura y oxígeno. Se compararon los resultados obtenidos entre sí y con la bibliografía correspondiente. Resultados. El mayor tiempo de latencia observado correspondió a 20ºC, pH 5, E. coli no patógeno, sin oxígeno y con luz; el mínimo, a 30oC, pH 7 y E. coli O157:H7 con oxígeno y con luz. La máxima velocidad de crecimiento alcanzada se observó a 37oC, pH 7, en E. coli O157:H7 con oxígeno y sin luz; la mínima, a 20oC, pH 3.09, en E. coli O157:H7 sin oxígeno y sin luz. En cuanto a la máxima población alcanzada por los microorganismos, el máximo fue observado a 37oC y pH 7, en E. coli no patógeno con oxígeno y con luz; y el mínimo a 20oC y pH 3.09, en E. coli no patógeno con oxígeno y sin luz. Conclusiones. E. coli se adaptó más rápidamente en presencia de oxígeno. E. coli no patógeno fue la cepa que más tardó en adaptarse al medio. El crecimiento fue más rápido a pH 7. La máxima población alcanzada fue observada en presencia de luz. A 37oC, E. coli creció a la velocidad máxima y alcanzó la máxima población. A 20oC, se observaron el máximo tiempo de latencia y la mínima velocidad de crecimiento y Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco población alcanzada. E. coli se adaptó más lentamente al medio a temperaturas alejadas de sus óptimas, así como en ausencia de oxígeno. Creció más lentamente a temperaturas y pH alejados de sus óptimos; y cuando dichos parámetros se acercaron a su ideal, alcanzó la máxima población. Su crecimiento fue más rápido en presencia de oxígeno y alcanzó la máxima población en presencia de luz. Se adaptó relativamente rápido a pH ácidos. Es un importante riesgo para la salud pública; se debe tener en cuenta y realizar una prevención basada en la educación. Palabras claves. Escherichia coli; Escherichia coli O157:H7; zumo de frutas; pH; oxígeno; luz; temperatura. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 1 1.1. Epidemiología e importancia en salud pública .................................................... 4 1.2. Cómo se adhesiona E. coli, patogenicidad y factores de virulencia .................... 5 1.3. Qué sintomatología causa E. coli O157:H7 ........................................................ 7 1.4. Cómo se propaga E. coli .................................................................................... 7 1.5. Prevención de la infección por E. coli ................................................................. 9 1.6. Diagnóstico y tratamiento de la infección por E. coli O157:H7 ............................ 9 1.7. Zumos de frutas ................................................................................................. 9 1.8. Brotes producidos por E. coli ............................................................................ 11 2. OBJETIVO .............................................................................................................. 12 3. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................ 13 3.1. Diseño .............................................................................................................. 13 3.2. Metodología ..................................................................................................... 13 3.3. Tratamiento de los datos .................................................................................. 14 4. RESULTADOS ....................................................................................................... 15 4.1. Resultados a 37oC ............................................................................................ 15 4.2. Resultados a 30oC ............................................................................................ 17 4.3. Resultados a 20oC ............................................................................................ 19 4.4. Resultados a 20, 30 y 37oC .............................................................................. 21 5. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 22 6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 26 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 27 8. ANEXO ................................................................................................................... 31 8.1. Gráficas correspondientes a los resultados obtenidos. .................................... 31 Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 1 1. INTRODUCCIÓN Escherichia coli es una enterobacteria Gram negativa, con forma bacilar, móvil (gracias a poseer flagelos perítricos), no esporógeno y anaerobia facultativa (es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa, con producción de gas). Por ser Gram negativa, posee dos membranas y, entre ellas, un espacio periplásmico formado por péptido-glucano, que le confiere su forma y rigidez, gracias al cual puede soportar presiones osmóticas elevadas (Adams & Moss, 1997; Ahmad, Drew, Lagunoff, Pottinger, Reller & Sterling, 2017; De la Rosa, 1997). Respecto a la temperatura, E. coli es una bacteria mesófila. E. coli productora de toxina Shiga es capaz de crecer a temperaturas entre 7-50oC, siendo su temperatura óptima de crecimiento los 37oC. Un mantenimiento correcto de la cadena de frío evita el crecimiento de E. coli. La congelación no garantiza la inocuidad (ya que no elimina a E. coli en caso de que estuviera previamente presente en el alimento, sino que solo frena su crecimiento); sin embargo, temperaturas superiores a los 70oC, sí (pasteurizar la leche, zumos… garantiza eliminar a E. coli) (Adams & Moss, 1997; OMS, 2018a). El tiempo de supervivencia (se contabiliza a partir de que se alcanza el máximo de población) de E. coli es mayor a temperatura de refrigeración que a temperatura ambiente. Esto es debido a que a temperaturas en torno a los 4-7oC, su crecimiento es prácticamente nulo. De esta forma, a dichas temperaturas, tarda mucho más tiempo en alcanzar el máximo de población, y su posterior fase de muerte (Adams & Moss, 1997). Figura 1. Gráfica de crecimiento bacteriano. Reproducida de Crecimiento bacteriano. Modelos predictivos de ComBase. Recuperado de http://coli.usal.es/web/demo_alteracion/FactoresCrecimiento/FactoresCrecimiento.html Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 2 No solamente afecta la temperatura al crecimiento de E. coli, sino que el pH y la actividad de agua (aw) son otros dos parámetros muy importantes a tener en cuenta. El pH óptimo de crecimiento de E. coli es 7.2. Algunas cepas son capaces de proliferar en alimentos ácidos, incluso en pH de 4.4. Normalmente, un pH fuera del rango 3.89.5 detiene el crecimiento de E. coli (Adams & Moss, 1997; OMS, 2018a). Su aw óptima es 0.99. Algunas cepas son capaces de crecer en alimentos con una aw de incluso 0.95; sin embargo, cuando este parámetro alcanza valores <0.94, se detiene el crecimiento de E. coli (Adams & Moss, 1997; OMS, 2018a). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2018a): “E. coli O157:H7 es el serotipo de E. coli productora de toxina Shiga más importante por su impacto en la salud pública, pero hay también otros serotipos frecuentemente implicados en brotes y casos esporádicos”. E. coli es una bacteria habitual en el intestino de las personas y de los animales sanos. Habitualmente, esta bacteria es responsable de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas, además de contribuir en la síntesis de diversas vitaminas (vitaminas B y K). Solamente una minoría de cepas de E. coli es capaz de causar enfermedad en el hombre. La mayoría de los tipos de E. coli son inofensivas y no causan problemas, o éstos suponen solamente breves diarreas; sin embargo, existen variedades de esta bacteria que sí dañan seriamente la integridad física del ser humano (CDC, 2006; CDC, 2017; Foodsafety.goy, 2019; Mayo Clinic, 2019; MedlinePlus, 2019; OMS, 2018a). Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 3 Las variedades de Escherichia coli que producen gastroenteritis en el hombre se pueden encuadrar en cinco categorías. Se nombran en la tabla a continuación, clasificadas en función de la clínica que causan y de sus factores de patogenicidad: E. coli Mecanismo de acción Clínica Factores de virulencia Población afectada Enterotoxigénicas (ETEC) Produce toxinas que activan la adenil-ciclasa y otros factores de permeabilidad celular. Diarrea acuosa. Fimbrias, toxinas LT y ST, a veces asociadas a CFA. Típico en niños en países en vías de desarrollo y viajeros. Enteropatógenas (EPEC) Adherencia al epitelio intestinal y destrucción de las microvellosidades. El enterocito pierde su capacidad de absorción. Diarrea acuosa. Adherenciaacortamiento microvellosidades.. Niños en países en vías de desarrollo y niños <2 años (frecuentes brotes en guarderías). Enteroagregativas (EAEC) Biofilm que recubre el epitelio, borrado de microvellosidades. Diarrea acuosa. Fimbrias (AAF y Bfp), enterotoxina (EAST-1), ¿otras toxinas? Niños y adultos de países en vías de desarrollo. Enterohemorrágicas (EHEC) *Aquí se incluye el serotipo O157: H7 Produce una toxina con efecto citotóxico. Diarrea acuosa. Colitis hemorrágica (SHU). Fimbrias, citotoxinas (VT-1 o VT-2). *Toxina Shiga. Países desarrollados. Enteroinvasivas (EIEC) Coloniza y destruye la mucosa intestinal, el epitelio del colon. Diarrea invasiva (disentería). Plásmido (genes codifican proteínas de invasión). Países desarrollados y en vías de desarrollo. Tabla 1. Categorías principales de E. coli que producen gastroenteritis en el hombre. Nota: ETEC: Escherichia coli enterotoxigénicas. EPEC: Escherichia coli enteropatógenas. EAEC: Escherichia coli enteroagregativa. EHEC: Escherichia coli hemorrágicas. EIEC: Escherichia coli enteroinvasivas. LT: toxina termolábil. ST: toxina termoestable. CFA: factores de colonización. AAF: Fimbrias de adherencia y agregación. SHU: síndrome hemolítico urémico (Álvarez, Buesa, Castillo & Vila, 2008; Farfán-García, Ariza-Rojas, Vargas-Cárdenas & Vargas-Remolina, 2016; Sack, 2011). Entre ellas, se encuentra E. coli enterohemorrágica (EHEC). Causa una clínica variada, pudiendo ocasionar desde una leve diarrea hasta una colitis hemorrágica (es una enfermedad aguda, causada por el serotipo O157: H7), que puede evolucionar hacia un síndrome hemolítico urémico (SHU) (Kaper & O´Brien, 2014) (se da en el 10% de los casos, y presenta una tasa de mortalidad del 5-10%) en niños y ancianos, o hacia una púrpura trombocitopénica en adultos (es un trastorno de la sangre que causa formación de coágulos de sangre en los pequeños vasos) (Foodsafety.goy, 2019; OMS, 2018a; Wasey & Salen, 2019). Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 10 de zumos de frutas y de puré de frutas en la producción del zumo de frutas. (Real Decreto 781/2013, de 11 de octubre de 2013, por el que se establecen normas relativas a la elaboracin, composicin, etiquetado, presentacin y publicidad de los zumos de frutas y otros productos similares destinados a la alimentacin humana.) Se define criterio microbiolgico como “criterio que define la aceptabilidad de un producto o lote de productos alimenticios o un proceso basándose en la ausencia, presencia o número de microorganismos, y/o en la cantidad de sus toxinas/metabolitos, por unidad de masa, volumen, superficie o lote.” (REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIÓN, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios.) Categoría de comida Microorganismos Plan de muestreo Límites Método analítico de referencia Etapa donde se aplica el criterio Acción en caso de resultados no satisfactorios n c m M Zumos de frutas y verduras no pasteurizados (preparados para comer) E. coli 5 2 100 UFC/g 1000 UFC/g ISO 166491 o 2 Proceso de manufactura. Mejoras en la higiene de la producción, selección de materias primas. Tabla 2. Límites para E. coli en zumos de frutas. Nota: UFC: unidad formadora de colonias. Método analítico de referencia: se utilizará la edición más reciente de la norma. n: número de unidades de que se compone la muestra. c: número de unidades de la muestra cuyo número de bacterias podrá situarse entre m y M. m: valor umbral del número de bacterias. M: valor límite del número de bacterias. Interpretación de los resultados de la prueba: los límites dados se refieren a cada unidad de muestra analizada. Los resultados de la prueba demuestran la calidad microbiológica del proceso probado. E. coli en zumos de frutas y verduras sin pasteurizar (listas para comer): satisfactorio (si todos los valores observados son ≤m) / aceptable (si un máximo de valores c/n está entre m y M, y el resto de los valores observados son ≤m) / insatisfactorio (si uno o más de los valores observados son >M o más que los valores de c/n están entre m y M). Traducido de: Commission Regulation (EC) No 1441/2007 of 5 December 2007 amending Regulation (EC) No 2073/2005 on microbiological criteria for foodstuffs. L 322/12. Recuperado de https://eurlex.europa.eu/eli/reg/2007/1441/oj La OMS (2018a) ofrece controles sobre la presencia de E. coli productora de toxina Shiga en los alimentos. La Comisión del Codex Alimentarius utiliza estas evaluaciones como base para redactar normas, directrices y recomendaciones internacionales sobre los diferentes alimentos. Además, la OMS (2018a) promueve buenas prácticas de manipulación de alimentos. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 11 1.8. Brotes producidos por E. coli A continuación se muestran los brotes y las consecuencias producidos por E. coli en EEUU, a través de agua y alimentos, obtenidos de la base de datos de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, 2018). Nº de brotes 643 Nº de enfermos 14080 Nº hospitalizaciones 2308 Nº muertes 40 Tabla 3. Brotes producidos por E. coli en EEUU a través de agua y alimentos. Nota: Los datos de brotes de transmisión alimentaria se proporcionan para los años 1998-2017; el resto de tipos de brotes para 2009-2017. Los gráficos del tablero de NORS (National Outbreak Reporting System) muestran un recuento de “0” para los años cuyos datos no se incluyen en los datos de NORS; este valor no significa necesariamente que no se produjeran brotes o no se reportaran antes de 2009. Recuperado y traducido de (CDC, 2018). Cabe destacar además que los brotes fueron más frecuentes en el mes de julio, seguido por los meses de septiembre, agosto y junio (CDC, 2018). De los datos presentados en la tabla previa, una parte considerable se asoció al consumo de zumo de manzana en EEUU. Se muestran los datos a continuación. Nº de brotes 29 Nº de enfermos 352 Nº hospitalizaciones 52 Nº muertes 1 Tabla 4. Brotes producidos por E. coli en EEUU asociados a la ingesta de zumo de manzana. Nota: Datos proporcionados para los años 2009-2017. Los gráficos del tablero de NORS (National Outbreak Reporting System) muestran un recuento de “0” para los años cuyos datos no se incluyen en los datos de NORS; este valor no significa necesariamente que no se produjeran brotes o no se reportaran antes de 2009. Recuperado y traducido de (CDC, 2018). Los brotes reportados en asociación al consumo de zumo de manzana fueron mucho más frecuentes en el año 2011; la única muerte reportada se produjo en noviembre de 2010. El número de brotes, enfermos y hospitalizados fue mucho mayor en los meses de junio y julio (CDC, 2018). Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 12 2. OBJETIVO  Estudiar el crecimiento de diferentes cepas de E. coli en un zumo de frutas del bosque comercial a diferentes pH, presencia y ausencia de luz, presencia y ausencia de oxígeno y a diferentes temperaturas. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 13 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Diseño El diseño de este Trabajo de Fin de Grado se estructuró en dos partes. Por un lado, se realizó un estudio descriptivo transversal, basado en una revisión bibliográfica, sobre la bacteria Escherichia coli (su importancia en salud pública, patogenicidad, factores de virulencia y propagación, además de describir la sintomatología causada por su infección, prevención, diagnóstico y tratamiento), y sobre los zumos de frutas (definición legal y establecimiento de límites a cumplir en base a los criterios microbiológicos). Por otra parte, se realizó un estudio analítico. Se estudiaron tres cepas de bacterias pertenecientes a la especie E. coli: E. coli no patógeno CECT 516 (EC), E. coli O157:H7 CECT 4076 (ECO1) y E. coli O157:H7 CECT 4267 (ECO2)). Para ello, se trabajó con datos que fueron obtenidos previamente en el Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de los Alimentos de la Universidad Autónoma de Barcelona, relativos al crecimiento de estas cepas en diferentes condiciones de pH, luz, oxígeno y temperatura. Dichos datos fueron introducidos de forma manual en el programa de software de hoja de cálculo Excel. 3.2. Metodología Para llevar a cabo esta revisión bibliográfica, se aplicaron varios criterios de inclusión y exclusión:  Se incluyeron artículos científicos, además de informes de organismos oficiales y reglamentaciones legales vigentes en la actualidad sobre los temas mencionados previamente respecto a E. coli y los zumos de frutas.  Se excluyó la información relativa a investigaciones realizadas solamente sobre plantas, a brotes producidos por vehículos diferentes al agua y alimentos, además de los artículos en idiomas diferentes al español, inglés, italiano y francés. Para la revisión bibliográfica, los datos se obtuvieron a partir de una búsqueda en Internet en diferentes bases de datos (MEDLINE, PubMed, GOOGLE Académico…), empleando términos libres y vocabulario controlado en inglés y español. También se Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 14 consultaron publicaciones de organismos oficiales (OMS, AECOSAN, CDC…), libros de texto, revistas científicas electrónicas y textos legales (BOE…). 3.3. Tratamiento de los datos De los artículos encontrados, se seleccionaron aquellos considerados pertinentes para el estudio. El programa elegido para analizar los datos del laboratorio fue ComBase. Este programa consta de una amplia base de datos con miles de curvas de crecimiento y supervivencia microbiana, recogidos en centros de investigación y publicaciones. Además, permite establecer determinadas variables y a partir de ellas predecir el crecimiento o la inactivación de los microorganismos. En esta ocasión, se utilizó el programa Online DMFit (incluido dentro del navegador ComBase) y se fueron introduciendo los datos de tiempo (en horas) y concentración de E. coli (en logaritmo del número de bacterias), para las diferentes condiciones de pH, luz y temperatura. El programa transformó dichos datos en gráficas, además de calcular a partir de ellas los valores de las variables objeto de estudio:  Coeficiente de determinación (R2): varía entre 0 y 1, habiendo mayor ajuste del modelo a la variable cuanto más se aproxime el valor a 1. Se busca que sea lo más próximo a 1 posible.  SE of Fit (SE): error estándar. Se busca que sea lo menor posible.  Initial value (N0): población inicial del cultivo. Se expresará como log UFC/ml.  Lag/shoulder (Lag): tiempo de latencia; es decir, el tiempo que tarda la bacteria en comenzar su crecimiento exponencial. Se expresará en horas (h).  Maximun Rate (Rate): velocidad máxima alcanzada. Se expresará en h-1.  Final Value (Max): población máxima alcanzada. Se expresará como log UFC/ml. Se recogieron los valores obtenidos de estos parámetros para cada gráfica (con sus condiciones ambientales concretas) y se compararon entre sí y con la bibliografía correspondiente. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 15 4. RESULTADOS 4.1. Resultados a 37oC EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.926 0.915 0.952 0.689 0.921 0.916 0.870 0.999 0.843 0.999 0.886 0.907 SE 0.106 0.096 0.144 0.086 0.137 0.119 0.225 0.024 0.321 0.023 0.229 0.222 N0 7.768 7.634 7.564 7.559 7.721 7.729 7.665 7.749 7.474 7.562 7.700 7.692 Lag 1.173 2.788 0.625 0.887 0.856 0.940 1.132 1.034 - 1.927 0.544 0.742 Rate 0.333 0.352 0.384 0.087 0.337 0.250 0.402 0.421 0.479 0.915 0.434 0.578 Max 8.629 8.472 9.298 7.864 8.916 8.658 9.894 9.449 9.452 9.656 9.397 9.359 Tabla 5*. Valores para E. coli a 37oC y pH 7. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.962 0.136 0.182 0.906 0.920 0.295 0.774 0.945 0.955 0.915 0.962 1.000 SE 0.096 0.243 0.069 0.053 0.087 0.219 0.139 0.089 0.069 0.052 0.059 0.003 N0 7.815 7.629 7.682 7.806 7.747 7.897 7.722 7.693 7.809 7.559 7.762 7.739 Lag 2.152 0.872 - 0.646 1.942 1.712 0.988 3.542 2.541 0.707 2.078 2.639 Rate 0.416 0.114 -0.024 0.099 0.240 0.150 0.420 0.633 0.313 0.105 0.52 0.206 Max 9.043 8.160 7.597 8.278 8.519 8.522 8.317 8.622 8.623 8.010 8.351 8.419 Tabla 6*. Valores para E. coli a 37oC y pH 5. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.695 0.979 0.793 0.933 0.992 0.986 0.894 0.986 0.899 0.951 0.848 0.974 SE 0.046 0.008 0.018 0.012 0.002 0.005 0.023 0.010 0.008 0.003 0.023 0.006 N0 7.621 7.629 7.616 7.608 7.797 7.802 7.637 7.573 7.667 7.667 7.817 7.763 Lag 0.488 2.934 - - 0.496 1.915 1.993 0.906 2.608 0.381 2.409 - Rate 0.044 0.098 0.022 0.023 0.018 0.064 0.055 0.105 0.025 0.008 0.053 0.024 Max 7.798 7.736 7.715 7.733 7.860 7.893 7.783 7.746 7.722 7.700 7.937 7.856 Tabla 7*. Valores para E. coli a 37oC y pH 3.09. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 16 Para 37oC y un pH de 7, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en EC sin oxígeno ni luz, con un valor de 2.788 h (R2: 0.915, y SE: 0.096); por el contrario, el menor correspondió a ECO2 con oxígeno y con luz, con un valor de 0.544 h (R2: 0.886, y SE: 0.229). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.915 h-1 (R2: 0.999, y SE: 0.023), en ECO1 con oxígeno y sin luz; y el menor fue 0.087 h-1 (R2: 0.689, y SE: 0.086), en ECO1 sin oxígeno ni luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en EC con oxígeno y con luz, con un valor de 9.894 log UFC/ml (R2: 0.870, y SE: 0.225); y el mínimo correspondió a ECO1 sin oxígeno y sin luz, con un valor de 7.864 log UFC/ml (R2: 0.689, y SE: 0.086). Para 37oC y un pH de 5, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en EC con oxígeno sin luz, con un valor de 3.542 h (R2: 0.945, y SE: 0.089); por el contrario, el menor correspondió a ECO1 sin oxígeno ni luz, con un valor de 0.646 h (R2: 0.906, y SE: 0.053). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.633 h-1 (R2: 0.945, y SE: 0.089), en EC con oxígeno y sin luz; y el menor fue -0.024 h-1 (R2: 0.182, y SE: 0.069), en ECO1 sin oxígeno y con luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en EC sin oxígeno y con luz, con un valor de 9.043 log UFC/ml (R2: 0.962, y SE: 0.096); y el mínimo correspondió a ECO1 sin oxígeno y con luz, con un valor de 7.597 log UFC/ml (R2: 0.182, y SE: 0.069). Para 37oC y un pH de 3.09, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en EC sin oxígeno ni luz, con un valor de 2.934 h (R2: 0.979, y SE: 0.008); por el contrario, el menor correspondió a ECO1 con oxígeno y sin luz, con un valor de 0.381 h (R2: 0.951, y SE: 0.003). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.105 h-1 (R2: 0.986, y SE: 0.010), en EC con oxígeno y sin luz; y el menor fue 0.008 h-1 (R2: 0.951, y SE: 0.003), en ECO1 con oxígeno y sin luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en ECO2 con oxígeno y con luz, con un valor de 7.937 log UFC/ml (R2: 0.848, y SE: 0.023); y el mínimo correspondió a ECO1 con oxígeno y sin luz, con un valor de 7.700 log UFC/ml (R2: 0.951, y SE: 0.003). Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 17 4.2. Resultados a 30oC EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.906 0.953 0.905 0.951 0.870 0.876 0.945 0.917 0.892 0.976 0.957 0.969 SE 0.048 0.015 0.039 0.054 0.046 0.058 0.067 0.091 0.108 0.068 0.074 0.069 N0 7.689 7.584 7.577 7.571 7.810 7.826 7.623 7.749 7.648 7.617 7.727 7.798 Lag 0.970 1.287 1.475 1.554 2.693 2.735 0.907 3.826 1.866 1.611 0.363 1.888 Rate 0.095 0.060 0.087 0.174 0.129 0.170 0.175 0.656 0.495 0.441 0.201 0.633 Max 8.111 7.736 7.892 8.038 8.105 8.206 8.362 8.519 8.296 8.552 8.687 8.570 Tabla 8*. Valores para E. coli a 30oC y pH 7. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.822 0.650 1.000 0.738 0.905 0.987 0.884 0.955 0.937 0.982 0.989 0.978 SE 0.014 0.034 0.001 0.055 0.034 0.008 0.115 0.033 0.073 0.050 0.040 0.049 N0 7.564 7.557 7.655 7.654 7.826 7.817 7.655 7.618 7.601 7.616 7.778 7.763 Lag - - 2.499 - 2.215 - 1.553 1.721 1.254 0.674 1.929 0.711 Rate 0.032 0.116 0.165 0.204 0.093 0.168 0.233 0.113 0.191 0.218 0.370 0.202 Max 7.642 7.683 7.853 7.902 8.067 7.985 8.441 7.974 8.332 8.926 8.607 8.764 Tabla 9*. Valores para E. coli a 30oC y pH 5. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.549 0.316 0.140 0.071 0.237 0.810 0.195 0.753 0.286 0.181 0.222 0.399 SE 0.041 0.060 0.039 0.042 0.049 0.013 0.029 0.023 0.074 0.104 0.064 0.028 N0 7.586 7.635 7.700 7.749 7.820 7.865 7.663 7.684 7.664 7.783 7.747 7.786 Lag 2.014 - 1.998 - 1.558 - - - - 2.053 - - Rate 0.008 0.019 0.023 -0.017 0.031 -0.053 0.018 -0.068 0.018 -0.073 0.040 0.014 Max 7.597 7.693 7.787 7.690 7.911 7.794 7.721 7.577 7.751 7.615 7.877 7.861 Tabla 10*. Valores para E. coli a 30oC y pH 3.09. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 18 Para 30oC y un pH de 7, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en EC con oxígeno y sin luz, con un valor de 3.826 h (R2: 0.917, y SE: 0.091); por el contrario, el menor correspondió a ECO2 con oxígeno y con luz, con un valor de 0.363 h (R2: 0.957, y SE: 0.074). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.656 h-1 (R2: 0.917, y SE: 0.091), en EC con oxígeno y sin luz; y el menor fue 0.060 h-1 (R2: 0.953, y SE: 0.015), en EC sin oxígeno y sin luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en ECO2 con oxígeno y con luz, con un valor de 8.687 log UFC/ml (R2: 0.957, y SE: 0.074); y el mínimo correspondió a EC sin oxígeno ni luz, con un valor de 7.736 log UFC/ml (R2: 0.953, y SE: 0.015). Para 30oC y un pH de 5, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en ECO1 sin oxígeno y con luz, con un valor de 2.499 h (R2: 1.000, y SE: 0.001); por el contrario, el menor correspondió a ECO1 con oxígeno y sin luz, con un valor de 0.674 h (R2: 0.982, y SE: 0.050). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.370 h-1 (R2: 0.989, y SE: 0.040), en ECO2 con oxígeno y con luz; y el menor fue 0.032 h-1 (R2: 0.822, y SE: 0.014), en EC sin oxígeno y con luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en ECO1 con oxígeno y sin luz, con un valor de 8.926 log UFC/ml (R2: 0.982, y SE: 0.050); y el mínimo correspondió a EC sin oxígeno y con luz, con un valor de 7.642 log UFC/ml (R2: 0.822, y SE: 0.014). Para 30oC y un pH de 3.09, el mayor tiempo de latencia (Lag) observado fue en ECO1 con oxígeno y sin luz, con un valor de 2.053 h (R2: 0.181, y SE: 0.104); por el contrario, el menor correspondió a ECO2 sin oxígeno y con luz, con un valor de 1.558 h (R2: 0.237, y SE: 0.049). El valor máximo observado para la velocidad máxima alcanzada (Rate) fue 0.040 h-1 (R2: 0.222, y SE: 0.064), en ECO2 con oxígeno y con luz; y el menor fue -0.073 h-1 (R2: 0.181, y SE: 0.104), en ECO1 con oxígeno y sin luz. Con respecto a la máxima población alcanzada (Max), el máximo fue observado en ECO2 sin oxígeno y con luz, con un valor de 7.911 log UFC/ml (R2: 0.237, y SE: 0.049); y el mínimo correspondió a EC con oxígeno y sin luz, con un valor de 7.577 log UFC/ml (R2: 0.753, y SE: 0.023). Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 19 4.3. Resultados a 20oC EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.620 0.987 0.997 0.987 0.919 0.862 0.985 0.910 0.922 0.815 0.999 0.986 SE 0.025 0.010 0.010 0.017 0.032 0.041 0.005 0.022 0.052 0.087 0.004 0.013 N0 7.570 7.572 7.758 7.697 7.803 7.863 7.607 7.625 7.700 7.726 7.814 7.801 Lag 1.322 0.528 3.880 2.776 1.721 3.719 4.096 0.803 3.852 2.955 3.701 2.151 Rate 0.077 0.049 0.415 0.169 0.083 0.207 0.115 0.043 0.397 0.225 0.263 0.090 Max 7.647 7.802 8.223 8.111 8.100 8.1282 7.712 7.820 8.156 8.223 8.156 8.062 Tabla 11*. Valores para E. coli a 20oC y pH 7. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.654 0.858 0.082 0.936 0.348 0.903 0.013 0.995 0.092 0.953 0.964 0.989 SE 0.028 0.030 0.090 0.023 0.042 0.008 0.053 0.006 0.035 0.030 0.001 0.004 N0 7.581 7.616 7.602 7.618 7.754 7.787 7.588 7.643 7.629 7.693 7.816 7.821 Lag 4.216 3.847 - 2.598 - 1.623 - 3.198 - 3.829 3.788 3.426 Rate 0.131 0.162 0.026 0.089 0.019 0.018 0.012 0.114 -0.006 0.285 0.005 0.062 Max 7.684 7.802 7.855 7.837 7.904 7.850 7.718 7.850 7.613 8.027 7.823 7.919 Tabla 12*. Valores para E. coli a 20oC y pH 5. EC (sin O2) ECO1 (sin O2) ECO2 (sin O2) EC (con O2) ECO1 (con O2) ECO2 (con O2) LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ LUZ SIN LUZ R2 0.325 0.164 0.484 0.064 0.635 0.812 0.682 0.124 0.611 0.432 0.919 0.944 SE 0.060 0.063 0.052 0.056 0.043 0.022 0.034 0.076 0.032 0.065 0.014 0.012 N0 7.696 7.695 7.714 7.743 7.903 7.875 7.684 7.720 7.724 7.739 7.876 7.870 Lag 1.867 - 1.662 - 1.124 4.074 2.168 - - 3.015 0.405 3.430 Rate -0.046 -0.008 -0.046 -0.011 -0.042 -0.126 -0.089 -0.012 -0.036 -0.088 -0.087 -0.077 Max 7.578 7.583 7.580 7.624 7.778 7.758 7.571 7.563 7.615 7.591 7.765 7.750 Tabla 13*. Valores para E. coli a 20oC y pH 3.09. *Nota: EC: E. coli no patógeno CECT 516. ECO1: E. coli O157:H7 CECT 4076. ECO2: E. coli O157:H7 CECT 4267. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 26 6. CONCLUSIONES  E. coli se adaptó más rápidamente al medio en presencia de oxígeno, mostrando así una menor fase de latencia.  E. coli no patógeno fue la cepa estudiada que más tardó en adaptarse al medio, mostrando los máximos tiempos de latencia para todas las temperaturas; sin embargo, una vez adaptada, no presentó ninguno de los mínimos valores de velocidad de crecimiento.  A pH 7, E. coli creció más rápidamente.  La luz no condicionó ni el tiempo de latencia ni la velocidad de crecimiento, pero E. coli alcanzó el máximo de población en presencia de luz.  Las máximas velocidades y poblaciones alcanzadas se observaron a 37oC, temperatura coincidente con la óptima de E. coli. Por el contrario, a la temperatura estudiada más alejada de su óptima (20oC), se observaron el máximo tiempo de latencia y la mínima velocidad y población máxima alcanzada. Esto se explica porque a esta temperatura E. coli se adapta más lentamente al medio y además presenta un ritmo de crecimiento menor una vez adaptada.  Al alejarse de sus óptimos de temperatura y no tener oxígeno, E. coli se adaptó más lentamente al medio. Además, creció más lentamente a temperaturas y pH alejados de sus óptimos; por otro lado, cuando dichos parámetros se acercaron a su ideal, E. coli alcanzó la máxima población. Creció más rápidamente en presencia de oxígeno y alcanzó la máxima población en presencia de luz.  E. coli se adaptó relativamente rápido a pH ácidos.  E. coli es un importante riesgo para la salud pública, especialmente si no se cumplen los límites establecidos por los criterios microbiológicos. Se siguen presenciando brotes por E. coli, siendo los zumos de frutas una fuente crítica.  Es necesario llevar a cabo una prevención basada en la educación, así como monitorizar estrictamente toda la cadena alimenticia para garantizar el cumplimiento de dichos criterios. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 27 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS  Adams, M.R., & Moss, M.O (1997). Microbiología de los alimentos. Capítulo 7: 7.7 Escherichia coli. pp. 227-233. ISBN-84-200-0830-3. Zaragoza, España: ACRIBIA, S.A.  Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (2019). Herramienta interactiva para la visualización de los datos de antibiorresistencias correspondientes a 2017 en la Unión Europea. Recuperado de http://www.aecosan.msssi.gob.es/AECOSAN/web/noticias_y_actualizaciones/n oticias/2019/herramienta_interactiva.htm  Ahmad, N., Drew, W.L., Lagunoff, M., Pottinger, P., Reller, L.B., & Sterling, C.R. (2017). En: Ryan, K.J., & Ray, C.G.; Editores. 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Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 3*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 4*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 5*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 6*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 7*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 32 Figura 8*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 9*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 10*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 11*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 12*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Figura 13*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 37ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 33 Figura 14*. Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 15*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 16*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 17*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 18*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 19*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 34 Figura 20*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 21*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 22*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 23*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 24*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Figura 25*. Concentración de ECO2 sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 37ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 35 Figura 26*. Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Figura 27*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Figura 28*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Figura 29*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Figura 30*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Figura 31*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 37ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 42 Figura 68*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Figura 69*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Figura 70*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Figura 71*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Figura 72*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Figura 73*. Concentración de ECO2 sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 30ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 43 Figura 74*. Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 75*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 76*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 77*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 78*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 79*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 44 Figura 80*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 81*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 82*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 83*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 84*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Figura 85*. Concentración de ECO2 sin luz, con oxígeno, a pH 7 y 20ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 45 Figura 86*. Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 87*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 88*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 89*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 90*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 91*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 46 Figura 92*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 93*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 94*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 95*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 96*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Figura 97*. Concentración de ECO2 sin luz, con oxígeno, a pH 5 y 20ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 47 Figura 98*. Concentración de EC con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 99*. Concentración de ECO1 con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 100*. Concentración de ECO2 con luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 101*. Concentración de EC con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 102*. Concentración de ECO1 con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 103*. Concentración de ECO2 con luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Trabajo de Fin de Grado de NHyD Celia Álvarez Blanco 48 Figura 104*. Concentración de EC sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 105*. Concentración de ECO1 sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 106*. Concentración de ECO2 sin luz, sin oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC.a Figura 107*. Concentración de EC sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 108*. Concentración de ECO1 sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. Figura 109*. Concentración de ECO2 sin luz, con oxígeno, a pH 3.09 y 20ºC. *Nota: EC: E. coli no patógeno CECT 516. ECO1: E. coli O157:H7 CECT 4076. ECO2: E. coli O157:H7 CECT 4267.