Circulación renal en un modelo murino de hipertensión esencial

Director de trabajo: José Ramón López López Valladolid, Septiembre de 2019. Universidad de Valladolid Instituto de Biología y Genética Molecular Máster en Investigación Biomédica Memoria de Trabajo Fin de Máster Jorge Rojo Mencía Jorge Rojo Mencía 1 Índice Glosario de Abreviaturas .................................................................................... 2 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 3 1.1. Hipertensión ........................................................................................... 3 1.2. Presión Arterial ....................................................................................... 4 1.3. Regulación del tono vascular .................................................................. 5 1.4. Canales iónicos ...................................................................................... 7 1.5. Familia TRP ............................................................................................ 8 1.6. TRPM3 ................................................................................................. 10 1.7. Modelo de estudio ................................................................................ 11 2. OBJETIVOS ................................................................................................ 13 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................ 14 3.1. Diseño del equipo de medida de flujo renal ex vivo .............................. 14 3.2. Diseño experimental ............................................................................. 17 3.3. Extracción de RNA y PCR cuantitativa ................................................. 18 3.4. Análisis de los datos de flujo ................................................................ 19 3.5. Análisis estadístico ............................................................................... 19 4. RESULTADOS ............................................................................................ 20 4.1. Expresión de TRPM3 en riñón .............................................................. 20 4.2. Curvas Dosis-Respuesta frente a Phe y Ang II .................................... 21 4.3. Activación de TRPM3 mediante PS ...................................................... 23 5. DISCUSIÓN ................................................................................................ 25 6. CONCLUSIONES ....................................................................................... 27 7. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 28 Jorge Rojo Mencía 2 Glosario de Abreviaturas • ACE: enzima convertidora de angiotensina (“Angiotensin-Converting Enzyme”). • Ang II: angiotensina II. • BPH: cepa de ratones hipertensos (“Blood-Pressure High”). • BPN: cepa control de ratones normotensos (“Blood-Pressure Normal”). • GPCR: receptor acoplado a proteínas G (“G-Protein Coupled Receptor”). • KO: gen inactivado (“Knock-Out.”). • PCR: reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction”). • Phe: fenilefrina (“phenylephrine”). • PS: sulfato de pregnenolona (“Pregnenolone Sulfate”). • RAAS: sistema renina-angiotensina-aldosterona (“Renin-AngiotensinAldosterone System”). • RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (“quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction”). • TRP: receptor de potencial transitorio (“Transient Receptor Potential”). • TRPM3: receptor de potencial transitorio tipo melastina 3 (“Transient Receptor Potential Melastin-like 3”). • VDCC: canales de Ca 2+ dependientes de voltaje (“Voltage-Dependent Calcium Channels”). • VSMC: células de músculo liso vascular (“Vascular Smooth Muscle Cells”): • WT: genotipo salvaje (“Wild Type”). Jorge Rojo Mencía 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Hipertensión La hipertensión o presión arterial elevada es el principal factor de riesgo en las enfermedades cardiovasculares, que causan unos 17 millones de muertes al año, aproximadamente un tercio de las muertes totales en el mundo. De éstas, 9.4 millones son debidas directamente a complicaciones derivadas de la hipertensión, siendo la principal causa en el 45% de las cardiopatías y el 51% de los accidentes cerebrovasculares (OMS, 2013). De media, el 40% de los adultos mayores de 25 años es diagnosticado de hipertensión en todo el mundo, afectando en mayor medida a hombres que mujeres (Figura 1). Si bien la prevalencia de la enfermedad está siendo controlada y reducida en los países más desarrollados gracias al seguimiento de los pacientes, el uso de medicamentos y a la concienciación en el estilo de vida, en países de ingresos medios y bajos este número está en aumento junto con el incremento de la población y la adquisición de hábitos de vida no saludables (sedentarismo, mala alimentación, tabaquismo y consumo de alcohol) (OMS, 2013). Figura 1. Prevalencia de la hipertensión en adultos mayores de 25 años, estandarizado por edades, según regiones de la Organización Mundial de la Salud. (Modificado de OMS, 2010). La tensión arterial se valora mediante la medida de dos parámetros, la presión arterial sistólica y presión arterial diastólica. Se considera tensión arterial normal en un adulto a una presión sistólica de 120 mmHg y una presión diastólica de 80 mmHg. Valores por encima de 140 y 90 mmHg respectivamente son calificados como hipertensión. La hipertensión se clasifica en primaria o esencial, que incluye al 90% de los casos, y secundaria, donde encontramos el 10% restante. La hipertensión esencial aparece a Jorge Rojo Mencía 4 mediana y avanzada edad, es asintomática y no está provocada por una patología determinada, sino por la combinación de factores genéticos y ambientales, como obesidad, sedentarismo, alcoholismo, consumo excesivo de sal y otro hábitos de vida no saludables (Poulter et al., 2015; Álvarez Miguel, 2019). En contraste, la hipertensión secundaria aparece normalmente antes de los 40 años, sin antecedentes familiares, y es desencadenada por una patología identificable, como un desorden renal o endocrino o el uso de determinados fármacos (Poulter et al., 2015). 1.2. Presión arterial Fisiológicamente es más útil emplear los conceptos de presión arterial media y presión de pulso. La presión de pulso (P P ) es la diferencia entre la presión arterial sistólica (P S ) y la presión arterial diastólica (P D ), es decir, la variación de presión que experimenta la arteria durante el ciclo cardiaco. Debido que la diástole ocupa una mayor parte del ciclo cardiaco la presión arterial media () se calcula como la suma de la presión diastólica y un tercio de la presión de pulso:                 La presión arterial media es directamente proporcional al flujo o gasto cardiaco (GC) y a la suma de las resistencias periféricas (RPT):      En la hipertensión esencial el gasto cardiaco se mantiene normal, siendo ocasionada por un aumento en las resistencias periféricas, que dependen principalmente del estado contráctil de los vasos. Los vasos de resistencia, pequeñas arterias y arteriolas con un diámetro inferior a 300 µm, son las encargadas de regular el flujo (Q) y la presión (∆P) que llega a cada órgano mediante la regulación de la resistencia vascular (R) (Ley de Darcy):   ∆  Este control se consigue mediante la variación de su diámetro a través de la contracción o relajación de su capa media muscular, ya que de acuerdo con la Ley de Jorge Rojo Mencía 5 Poiseuille, la resistencia del vaso es inversamente proporcional al radio de éste elevado a la cuarta potencia (Touyz et al., 2018).     L: longitud; η: viscosidad; r: radio. De esta forma, pequeños cambios en el lumen o diámetro del vaso provocan grandes modificaciones en la resistencia y por lo tanto en el flujo que llega a un determinado órgano, regulando así el flujo sanguíneo según los requerimientos del organismo de cada momento. 1.3. Regulación del tono vascular El mantenimiento del estado de contracción (tono vascular) adecuado por parte de las células del músculo liso vascular (VSMCs) es un proceso altamente regulado por multitud de factores extrínsecos e intrínsecos. Estos procesos son dependientes de la entrada de calcio al citosol por medio de la apertura de canales de Ca 2+ regulada por cascadas de señalización intracelulares (Te Riet et al., 2015; Touyz et al., 2018; Liu y Khalil, 2018). La activación de estas vías comienza por la unión de un agonista a su receptor de membrana, un receptor acoplado a proteínas G (GPCRs). La activación de estos GPCRs libera la subunidad α de la proteína G q y ésta activa la fosfolipasa C (PLC), que convierte fosfatidil inositol (PI) en inositol trifosfato (IP 3 ) y diacilglicerol (DAG). IP 3 se une a sus receptores en el retículo sarcoplásmico produciendo la liberación de calcio desde este compartimento intracelular al citosol. El DAG activa la proteína quinasa C (PKC), la cual fosforila una serie de proteínas que participan directa o indirectamente en la contracción muscular induciendo la despolarización de la membrana de las VSMCs a través del cambio en el estado de apertura de diversos canales iónicos. El cierre de canales de K + induce la despolarización de la membrana, lo cual es sensado por canales de Ca 2+ voltaje-dependientes (VDCCs) provocando su apertura e incrementando la concentración de Ca 2+ citosólico, promoviendo la contracción de las células de músculo liso y con ello el incremento de la resistencia vascular y de la presión sanguínea (Figura 2) (Nilius et al., 2007; Chen y Coffman 2015; Patel et al., 2017). Jorge Rojo Mencía 6 Figura 2. Regulación del tono vascular en función del estado hiperpolarizado/despolarizado de la membrana celular. El cierre de canales de K + produce la despolarización que activa la entrada de Ca 2+ al citosol a través de canales de calcio dependientes de voltaje promoviendo la contracción del vaso. (Modificada de Jackson, 2000). Dos de los importantes mecanismos (extrínsecos) de activación de estas vías son el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) y el sistema nervioso simpático. El sistema RAAS juega un papel primordial en la regulación de la presión sanguínea regulando el tono vascular y el nivel de líquido extracelular en el organismo. Una caída en la presión arterial, bajos niveles de sodio y la actividad del sistema nervioso simpático vía activación de receptores β1 adrenérgicos promueven la síntesis y liberación de renina por las células granulares del riñón. La renina hidroliza la proteína α-2-globulina o angiotensinógeno, liberada por el hígado, formando angiotensina I, que viaja por el torrente sanguíneo hasta tejidos diana como los capilares pulmonares o células epiteliales renales y es captada por la enzima convertidora de angiotensina (ACE, “Angiotensin-Converting Enzyme”). ACE se encuentra anclada a la membrana de las células endoteliales de los vasos sanguíneos y actúa eliminando dos aminoácidos carboxilo-terminales del precursor de 10 aminoácidos angiotensina I y liberando el octapéptido funcional, la angiotensina II (Patel et al., 2017) (Figura 3). Jorge Rojo Mencía 7 Figura 3. Mecanismo de actuación y regulación del sistema RAAS. (Tomado de Patel et al., 2017). La angiotensina II tiene un papel vasopresor al inducir la contracción de las células de músculo liso vascular mediante la unión a diversos GPCRs, siendo el más importante AT 1 . Cuando la angiotensina II se une a AT 1 se activa la cascada de señalización intracelular antes explicada desencadenando la entrada de calcio al interior celular que lleva a la contracción de las fibras musculares (Chen y Coffman, 2015; Patel et al., 2017). Complementado esta vía, la Ang II estimula la secreción de aldosterona en la corteza suprarrenal que actúa promoviendo la reabsorción de sodio en la nefrona y el aumento del líquido extracelular (Constanzo, 2018). Aunque este es el esquema central del funcionamiento de RAAS, se trata de un sistema altamente complejo que es regulado por multitud de otros factores en todos sus puntos y que actúa sobre una gran variedad de procesos fisiológicos, como se muestra en la figura 3 (Te Riet et al., 2015; Patel et al., 2017). La estimulación de la vasoconstricción por parte del sistema nervioso simpático ocurre a través de receptores α1-adrenérgicos, GPCRs activados por las catecolaminas endógenas adrenalina y noradrenalina, liberadas por la glándula adrenal y las terminaciones de los nervios del sistema nervioso simpáticos, respectivamente (O’Connell et al. 2014). 1.4. Canales iónicos Las células de músculo liso vascular expresan una gran variedad de canales iónicos implicados en la regulación de su estado contráctil y el tono vascular. Las familias más Jorge Rojo Mencía 8 relevantes son: canales de K + (voltaje-dependientes, K v ; activados por Ca 2+ , K Ca ; rectificadores anómalos, K ir ; y dependientes de ATP, K ATP ), canales de Ca 2+ (L-type, Ttype, N-type, P/Q-type y R-type), canales operados por receptor (ROCs, “ReceptorOperated Channels”), canales mecanosensitivos (SOCs, “Stretch-Operated Channels”), donde se incluye la familia de los TRPs (“Transient Receptor Potential”), y canales de Cl - (Tykocki et al., 2017; Álvarez Miguel, 2019). En los últimos años se está produciendo un gran avance en el conocimiento de la familia de canales TRP. Han sido encontrados participando en multitud de procesos fisiológicos y fisiopatológicos en diferentes tejidos y su estudio está ampliando horizontes en el entendimiento de diversas enfermedades y abriendo nuevas vías para el desarrollo de tratamientos, entre ellas la hipertensión (Nilius et al., 2007). 1.5. Familia TRP La familia de proteínas TRP (“Transient Receptor Potential”) comprende un grupo diverso de canales catiónicos que juegan un papel importante en la señalización y homeostasis del Ca 2+ . Consta de 28 miembros divididos en 6 subfamilias según su homología de secuencia (Figura 4): 7 TRPC (Canónicos), 6 TRPV (“Vanilloid-like”), 8 TRPM (“Meslastin-like”), 1 TRPA (“Ankyrin”), 3 TRPP (“Polycystin-like) y 3 TRPML (“Mucolipin-like”) (Nilius et al., 2007; Benemei et al., 2015). Figura 4. Árbol filogenético de la familia de canales TRP en mamíferos. (Modificado de Nilius et al., 2007). Jorge Rojo Mencía 15 Figura 7. Variación de la presión a lo largo del lecho vascular renal, donde se observa que la caída de la presión se produce a lo largo de las arteriolas aferente y eferente del glomérulo. (Tomado de Boron y Boulpaep, 2012). Para obtener estos registros el equipo cuenta con un medidor de flujo que utiliza un sistema de tecnología CMOSens® (Sensirion AG Switzerland, 2019), capaz de medir la velocidad a la que discurre un fluido gracias a pequeñas diferencias de temperatura. El fluido pasa por un capilar y el sistema aplica una minúscula cantidad de calor en un punto. Dos sensores de temperatura, situados de forma equidistante antes y después de la fuente de calor, miden las pequeñas diferencias de temperatura entre ambos puntos, las cuales son directamente proporcionales a la velocidad del flujo (Figura 8). Estos sensores están asociados a un microchip que amplifica la señal analógica, la digitaliza y la envía al ordenador para ser analizada. Figura 8. Esquema del funcionamiento del medidor de flujo. (Tomada de Sensirion AG Switzerland, 2019). Jorge Rojo Mencía 16 El equipo consta de las siguientes partes: • Bomba • Placa calefactora • Soluciones • Llaves • Medidor de flujo • Cámara • Aspirador • Soluciones auxiliares El funcionamiento del equipo durante el experimento seguiría el siguiente esquema (Figura 9): la bomba suministra la presión deseada de forma contante a las botellas que contienen las soluciones experimentales, las cuales reposan sobre la placa calefactora manteniéndolas a 37ºC. De cada botella parte un tubo que pasa por una llave. Éstas permiten abrir o cerrar el flujo de cada tubo de manera individual, seleccionando qué solución pasa por el sistema en cada momento y llega al tubo colector, donde convergen todos, continuando hacia el medidor de flujo, que recoge los datos en tiempo real. La solución sale del medidor de flujo hacia la cámara, pasando antes por una llave de paso de 3 vías que permite purgar el sistema, y acaba en una fina cánula. En la cámara, acoplada a una placa calefactora a 37ºC, se coloca el riñón con la arteria renal canulada y sujeta mediante hilo. Para la colocación del riñón en su posición es necesario que la cámara se encuentre bajo la lupa. A la cámara llega por otra entrada la solución de lavado, que constituirá el baño en el que se encuentre el riñón durante el desarrollo del experimento y será renovada de forma constante, lavando así las soluciones experimentales que salen por la vena después de recorrer la circulación renal. La cámara se mantiene limpia y a un volumen constante gracias a una bomba aspiradora que retira el exceso de soluciones acumulado. Jorge Rojo Mencía 17 Figura 9. Arriba: esquema de los elementos del equipo de perfusión renal y su disposición. Abajo: fotografía del equipo de perfusión renal durante la realización de un experimento. 3.2. Diseño experimental El procedimiento experimental consta de 3 fases: 1. Cirugía: a. Sedación y sacrificio del animal por dislocación cervical. b. Extracción de los riñones manteniendo la integridad de los vasos que lo acompañan. c. Limpieza y eliminación de la grasa visceral circundante. 2. Montaje: a. Preparación de las soluciones con los agonistas. b. Purgado del equipo. c. Canulación del riñón por la arteria renal en la cámara. Jorge Rojo Mencía 18 d. Lavado interno del riñón, eliminación de la sangre. e. Incremento de la presión hasta la seleccionada para la realización del experimento y reposo. 3. Experimento: a. Curva dosis-respuesta frente a agonistas (fenilefrina o angiotensina II) con lavado entre cada punto. Se realizan 4 puntos por experimento. Durante la aplicación de una dosis intermedia (cercana a la E 0.5 ) se prueba el efecto del PS (10 µM). 3.3. Extracción de RNA y PCR cuantitativa Los riñones fueron extraídos y diseccionados para separar la corteza de la médula renal, bajo la lupa, bañados en solución SMDS (“Smooth Muscle Dissociation Solution”), a 4ºC, las muestras se conservan en RNALater hasta la extracción del RNA. Las muestras son homogeneizadas en reactivo TRIZOL (Invitrogen) en un tubo con bolas cerámicas de dos tamaños diferentes (kit CK14 y CK28 Precellys®) en un homogeneizador de tejido Precellys (Bertin Instruments) y después se aísla el RNA total a partir de la capa acuosa resultante tras añadir cloroformo y centrifugar. El RNA se precipita primero con isopropanol, después con etanol al 70% y tras lavar se resuspende el pellet en agua desionizada. El RNA se conserva a -80ºC hasta su utilización. Tras sintetizar el cDNA (First Strand cDNA Synthesis Kit, ThermoFisher) se llevó a cabo la PCR cuantitativa, se utilizó el gen que codifica para RPL18 como de control endógeno. El ensayo TaqMan para el control endógeno RPL18 consta de los siguientes elementos: • Primer Forward: 5'-AAGACTGCCGTGGTTGTGG-3’ • Primer Reverse: 5'-AGCCTTGAGGATGCGACTC-3' • Sonda: 5'-FAM-TTCCCAAGCTGAAGGTGTGTGCA-BHQ1-3' El ensayo para detectar el gen que codifica para TRPM3 es comercial (Mm01210379_m1, Applied Biosystems, ThermoFisher). Para cada muestra se realizó la reacción por triplicado. En cada experimento se realizó un control NTC (“NonTemplate Control”) por duplicado. Jorge Rojo Mencía 19 Los valores de Ct para Trpm3 se normalizan frente a los obtenidos para L18. Los datos se expresan como diferencia de expresión relativa o “Fold Increase” de las muestras de ratones hipertensos frente a los normotensos, es decir 2 -ΔΔCt , donde ΔΔCt=ΔCt hipertensos -ΔCt normotensos o como abundancia relativa, es decir como 2 -ΔCt , donde ΔCt=Ct Trpm3 -Ct L18 , que representa la expresión del gen diana en las muestras de ratones normotensos e hipertensos normalizada respecto a L18. 3.4. Análisis de los datos de flujo El medidor de flujo toma datos con una frecuencia de 3.125 Hz, de manera que para dar un valor de tiempo en minutos a cada dato se divide el número de cada dato entre la frecuencia y 60 segundos. De esta manera podemos construir una gráfica donde veamos cómo evoluciona el flujo a lo largo del tiempo durante el experimento. Debido a que las soluciones experimentales tienen que recorrer el espacio del sistema que separa el tubo colector del riñón (volumen muerto), que corresponde a un volumen de 600 µl, se genera un retardo entre que se aplica un estímulo y que éste llega realmente al riñón. Para corregir este defecto es necesario el tratamiento de los datos, realizando la integral del flujo y dividiéndola entre el volumen muerto de forma que podemos representar el flujo acumulado medido en unidades de volumen muerto. Ahora podemos corregir el dato de tiempo en que se aplica cada estímulo, sumándole el tiempo que ha tardado en recorrer una unidad de volumen muerto, es decir, el tiempo transcurrido desde la apertura de la llave, registrada por el programa, hasta que la solución experimental llega realmente al riñón, y poder así determinar el momento en el que es aplicado y retirado cada agonista. 3.5. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó con el programa Microsoft Excel. Los resultados mostrados en las gráficas de barras se representan como la media ± error estándar de la media (SEM). Se utiliza la prueba t de Student para comprobar si las diferencias entre dos grupos son significativas, se consideran diferencias significativas cuando p<0,05 *, p<0,01 ** y p<0,001 ***. Jorge Rojo Mencía 20 4. RESULTADOS 4.1. Expresión de TRPM3 en riñón Estudios anteriores muestran una alta expresión de TRPM3 en el riñón (Grimm et al., 2003). Para localizar estás diferencias de expresión a lo largo de las diferentes capas del órgano se diseccionó el órgano y se analizó por separado muestras de corteza y médula renal de ratones BPN y BPH machos y hembras. Los resultados de PCR cuantitativa mostraron una expresión mucho mayor en corteza de ratones BPH, tanto machos como hembras, y una clara diferencia a nivel de la médula, donde los datos de expresión entre machos normotensos e hipertensos son semejantes, mientras que en hembras hipertensas se ve aumentada la presencia de mRNA TRPM3 respecto a sus controles normotensas (Figura 10). Figura 10. Análisis de la distribución de la expresión de TRPM3 mRNA en corteza y médula renal de ratones BPN y BPH machos y hembras. También se analizaron las diferencias en el órgano completo entre ratones con fenotipo normotenso e hipertenso, donde se observa que existen claras diferencias en la expresión del canal, presentando los ratones BPH cerca del doble de mRNA de TRPM3 que sus controles BPN (Figura 11). Debido a la disponibilidad de los animales, los análisis del riñón completo solo pudieron ser realizados en machos. Jorge Rojo Mencía 21 Figura 11. Diferencias de expresión de TRPM3 mRNA entre ratones machos BPN y BPH cuantificadas por el método de Fold Increase (2 -ΔΔCt ). 4.2. Curvas Dosis-Respuesta frente a Phe y Ang II Para medir el efecto sobre la circulación renal de la activación de las cascadas de señalización mediadas por agonistas de GPCRs, en ratones normotensos e hipertensos se llevaron a cabo experimentos de perfusión renal con el diseño experimental antes indicado. Se midió la respuesta contráctil frente a dos agonistas: la angiotensina II (Figura 12) y la fenilefrina (Figura 13), análogo de noradrenalina activador de receptores α1-adrenérgicos. La respuesta frente a ambos agonistas (Figura 14) se ajusta a una función del tipo E(%)=E max /{(E 0.5 /[Agonista])+1}, donde E(%) es la respuesta expresada en decrecimiento del flujo, E max es el efecto máximo alcanzable a dosis saturantes y E 0.5 es la dosis en la que se logra un 50% de respuesta. Tanto ratones normotensos como hipertensos presentan una mayor sensibilidad frente a angiotensina II, pero ésta produce un efecto moderado aun a concentraciones saturantes, mientas que son menos sensibles a fenilefrina, pero ésta es capaz de cerrar casi por completo la circulación renal a dosis elevadas (Tabla 1). BPN BPH 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 2- ∆∆ Ct *** Jorge Rojo Mencía 22 Figura 12. Ejemplos de la variación del flujo a lo largo de un experimento de perfusión renal frente a la aplicación de diferentes dosis de angiotensina II (0.01, 0.1, 0.5 y 5 nM) en ratones BPN y BPH. Figura 13. Ejemplos de la variación del flujo a lo largo de un experimento de perfusión renal frente a la aplicación de diferentes dosis de fenilefrina II (0.01, 0.1, 1 y 5 µM) en ratones BPN y BPH. Figura 14. Curvas dosis-respuesta frente a angiotensina II (izquierda) y fenilefrina (derecha). 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 0 20 40 60 80 100 10 -12 10 -11 10 -10 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 0 20 40 60 80 100 [Phenylephrine] M BPN BPH Flow Decrease (%) [Angiotensin II] M Jorge Rojo Mencía 23 BPN BPH Ang II Phe Ang II Phe E max 29.63 ± 2.97 100 30.45 ± 2.64 100 E 0.5 88.04 pM ± 38.70 0.31 µM ± 0.29 97.90 pM ± 38.60 0.51 µM ± 0.74 Tabla 1. Valores de ajuste a la ecuación E(%)=E max /{(E 0.5 /[Agonista])+1} para los agonistas angiotensina y fenilefrina en ratones BPN y BPH. E(%): respuesta expresada en decrecimiento del flujo, E max : efecto máximo, E 0.5 : dosis al 50% de respuesta. 4.3. Activación de TRPM3 mediante PS Con el fin de estudiar el papel de TRPM3 en la contracción de las células de músculo liso vascular se activa el canal con sulfato de pregnenolona (PS). Se realiza un experimento de perfusión renal precontrayendo los vasos con un estímulo de fenilefrina o angiotensina cercano a su E 0.5 (Figura 15). La activación TRPM3 produce una reducción similar del efecto vasoconstrictor de la fenilefrina en ratones BPN y BPH. Por el contrario, cuando se activa TRPM3 durante un estímulo de angiotensina en riñones de ratón normotenso se produce una potenciación del efecto vasoconstrictor y con ello una reducción aún más acentuada del flujo renal, mientras que en ratones hipertensos produce una disminución de efecto vasoconstrictor de la angiotensina, restituyendo parte del flujo basal (Figuras 15 y 16). Jorge Rojo Mencía 24 Figura 15. Ejemplos de 4 experimentos donde se estudia el efecto en de la activación de TRPM3 con PS durante un estímulo contráctil de fenilefrina (izquierda) y angiotensina II (derecha) en el flujo renal en BPN (arriba) y BPH (abajo). Figura 16. Gráfico de barras que muestra las medias de la variación del efecto vasocontrictor de la fenilefrina y la angiotensina tras la activación del canal TRMP3 con PS.