Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables

Trabajo de Fin de Grado Ingeniería Química Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. MEMORIA Autor: Alberto Cejudo Carsi Director: Carlos Enrique Alemán Llanso Convocatòria: Junio 2017 Escola Tècnica Superior d’Enginyeria Industrial de Barcelona Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 2 RESUMEN Este trabajo revisa la aplicación de polímeros intrínsecamente conductores (ICP) en la administración de fármacos. Los ICP son polímeros orgánicos con propiedades eléctricas, magnéticas y ópticas usualmente asociadas con metales, manteniendo propiedades mecánicas ventajosas y facilitación de procesamiento usualmente asociadas con polímeros. Debido a las propiedades inherentes de estos materiales únicos, la estimulación eléctrica puede utilizar para alterar el estado redox de los ICPs, que a su vez puede modificar la velocidad de liberación del fármaco. La liberación controlada de fármacos de los ICP ha sido investigada desde los años ochenta. El PEDOT y sus derivados son miembros relativamente nuevos de la familia ICP, y están entre los polímeros conjugados más exitosos y útiles debido a su alta estabilidad, banda baja, alta conductividad y excelente transparencia en su estado dopado. El PEDOT, en común con otros polímeros conductores, es intratable cuando se polimeriza por una ruta química convencional. Este trabajo proporciona una visión general de la síntesis y las propiedades del PEDOT cargado con un fármaco denominado curcumina. La técnica de electrospinning ha sido ampliamente estudiada durante los últimos años gracias a la posibilidad de crear fibras en escala micro y nanométrica para una gran variedad de aplicaciones biomédicas. Esta técnica aporta a los elementos desarrollados diversas características como: amplia superficie por unidad de área, porosidad y una serie de propiedades mecánicas, siendo atractiva a nivel biotecnológico. La técnica es versátil y de fácil ensamble lo que ha permitido procesar una gran variedad de polímeros, integrando en los últimos años otras clases de materiales. Sin embargo, durante el desarrollo del proceso existen una serie de variables que influyen en las características de los elementos obtenidos, ya sea porque están ligadas a las características del material base o porque su desempeño está relacionado con otros parámetros dentro del proceso. El objetivo de esta revisión es clarificar la influencia e interrelación de algunas variables en el proceso, así como dar a conocer los más importantes avances en el desarrollo de la técnica y en lo referente a liberación de fármacos. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 3 Índice RESUMEN……………………………………………………………………....2 1. GLOSARIO……………………...…………………………………………...5 2. PREFACIO…………………………………………………………………...7 2.1. Origen del proyecto………………………………………...…………………….7 2.2. Objetivos del proyecto……………………………………………………………7 2.3 Alcance del proyecto…………………………………...…………………………8 3. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………9 3.1 Breve historia………………………………………………………………………9 3.2 Heterociclos……………………………………...……………………………….10 3.3 El tiofeno como monómero……………………………………………..………11 3.4 Poli-3,4-etilendioxitiofeno, PEDOT………………………………………...…..12 3.5 Síntesis de los polímeros intrínsicamente conductores (ICP)…………..….13 3.6 DBSA como surfactante y alcohol como disolvente…………………...…….14 3.7 Conductividad eléctrica………………………………………………………….14 3.7 Fármaco: Curcumina…………………………………………………………….15 4 MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………………………...18 4.1 Materias primas…………………………………………...……………………..17 4.2 Material de laboratorio……………………………………...…………………...19 4.3 Síntesis y caracterización de las nanopartículas de PEDOT cargadas con curcumina……………………………………………………………………………..20 4.4 FTIR…………………...…………………………………………………………..23 4.5 UV-Vis………………………………………...…………………………………..26 4.6 Curva de calibrado………………………………...…………………………….27 4.7 Absorción……………………………………………………………………..…..29 4.8 Dispersión Dinámica de Luz, DLS……………………………………………..29 4.9 Microscopía electrónica de barrido, SEM……………………………………..32 4.10 Liberación por difusión de curcumina en las NP de PEDOT……………..33 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 4 4.11 Electrospinning o electrohilado…………………………...…………………33 4.12 Microscopio óptico……………………………………………..………………38 4.13 Liberación por difusión de fibras con NP de PEDOT y CUR………………38 4.14 Liberación electroestimulada de fibras con NP de PEDOT y CUR……....39 5 RESULTADOS……………………………………………………………...43 5.1 FTIR……………………………………………...………………………………..43 5.2 Curva de calibrado………………………...…………………………………….46 5.3 Características espectrales UV-Vis…………………………………...……….48 5.4 Dispersión dinámica de luz, DLS………………………………………...…….49 5.5 Microscopía electrónica de barrido Scanner, SEM…………………..……...54 5.6 Liberación del fármaco……………………...…………………………………..61 6 CONCLUSIONES…………………………………………………………..66 7 ESTUDIO DE LA SOSTENIBILIDAD…………………………………….67 7.1 Impacto ambiental………………………………………...……………………..67 7.2 Evaluación económica……………………………..…………………………...68 AGRADECIMIENTOS………………………………………………………..72 BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………….73 Referencias bibliográficas……………………………………………...……………73 Bibliografía complementaria………………………………...………………………76 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 5 1. GLOSARIO Para las referencias se ha seguido la siguiente notación: Título de la revista., Año, volumen, editorial, página. Además, se han utilizado las siguientes abreviaturas y acrónimos: AB Anchura de la banda de valencia AE Afinidad electrónica APS Persulfato de Amonio BC Banda de conducción BV Banda de valencia CUR Curcumina DBSA Dodecil ácido benceno sulfónico DDS Sistema de administración de fármacos DLS Dispersión dinámica de luz ECP Polímero conductor electroactivo EDOT 3,4-Etilendioxitiofeno Ef Energía de Fermi Eg Energía de Gap ETOH Etanol FTIR Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier H2O mQ Agua mili Q ICP Polímero intrínsecamente conductor LED Diodo emisor de Luz Mw Peso molecular medio en peso NPs Nanopartículas PBS Phosphate Buffered Saline PCL Policaprolactona Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 6 PEDOT Poli (3,4-etilendioxitiofeno) PSS Ácido poliestireno sulfónico PI Potencial de ionización PPy Polipirrol SEM Microscopio electrónico Scanner UV Ultravioleta VIS Visible Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 7 2. PREFACIO 2.1 Origen del proyecto El presente proyecto tiene su origen en el grupo de investigación de Grup d’Innovació en Materials i Enginyeria Molecular (IMEM) del Departamento de Ingeniería Química de la ETSEIB (Escuela Técnica Superior de Ingeniería Industrial de Barcelona) de la UPC (Universidad Politécnica de Cataluña). Una de las principales áreas de investigación recae en la investigación de materiales poliméricos biodegradables. Por ello, en el IMEM se han realizado diversos trabajos de conformado de poliésteres, poliesteramidas y poliureas mediante la técnica de electrohilado (electrospinning), obteniéndose matrices de fibras de escala micro y/o nanométricas. Además, la técnica de electrospinning ha permitido obtener fibras cargadas con moléculas bioactivas tales como fármacos antimicrobianos, drogas antitumorales y antiinflamatorios. El actual trabajo ha sido diseñado en la línea de la preparación de estos sistemas de liberación basados en matrices de micro/nanofibras. En este trabajo se ha estudiado el comportamiento de matrices de fibras que han sido cargadas con una droga o fármaco puro. Concretamente, se ha estudiado el comportamiento del polímero poli 3,4-etilendioxitiofeno (PEDOT) cargado con el fármaco denominado curcumina con fibras de policaprolactona. 2.2 Objetivos del proyecto El presente proyecto tiene como objetivo general estudiar las propiedades físicas y electroquímicas de las nanopartículas de PEDOT cargadas con la droga antitumoral curcumina. Luego, estas nanoparticulas fueron encapsuladas en microfibras del poliéster policaprolactona con la finalidad de estudiar la liberación electro-estimulada de la curcumina. Para alcanzar este objetivo general, se han propuesto los siguientes objetivos específicos:  Sintetizar químicamente nanoparticulas de PEDOT y PEDOT cargado con diferentes concentraciones de curcumina.  Caracterizar las nanoparticulas sintetizadas. La morfología de las nanoparticulas fue estudiada por microscopía electrónica de barrido (SEM), su diámetro hidrodinámico fue estudiado por dispersión de luz (dynamic light Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 8 scattering, DLS) y el potencial-Z fue usado para determinar la carga electrostática de las nanoparticulas.  Estudiar las nanopartículas sintetizadas como sistemas liberadores de drogas.  Encapsular las nanoparticulas sintetizadas en microfibras del poliéster caprolactona. Para ello, se preparó una suspensión homogénea de las nanoparticulas de PEDOT en una disolución de policaprolactona, y luego fue electrospineada. Para este estudio, también fueron preparadas fibras de policaprolactona cargadas con curcumina como controles.  Caracterizar morfológicamente las matrices de microfibras preparadas. Este estudio fue realizado por microscopia electrónica de barrido.  Estudiar las microfibras preparadas como sistemas liberadores de drogas. Para ello, se estudió la liberación de la curcumina por difusión, y finalmente, se estudió la liberación de la curcumina por electro-estimulación de las matrices de microfibras. 2.3 Alcance del proyecto Teniendo en cuenta la gran cantidad de posibilidades, las NPs de los polímero conductores electroactivos (ECP) sin duda jugarán un papel decisivo en todas las disciplinas de ciencias que requieren la entrega programada de compuestos. En algunos estudios recientes pero todavía escasos, las NP de polipirrol (PPy), que es probablemente la ECP no tóxica más estudiada ha sido utilizada para desencadenar una dosis controlada para la liberación de fármacos. La estructura, la superficie morfológica y la porosidad de PEDOT y los PPy discutidos anteriormente son completamente diferentes, ya que el primero está formado exclusivamente por enlaces α, mientras que el último está altamente reticulado. En consecuencia, tanto las respuestas electroquímicas como eléctricas de PEDOT son muy superiores a los de PPy. A pesar de estas ventajas, la carga de fármacos en las NPs de PEDOT para la liberación no es muy demandada y sigue estando prácticamente no estudiada. En este trabajo se ha cargado un fármaco neutro e hidrófobo en las NP de PEDOT, junto con su síntesis por polimerización en emulsión en agua. Este fármaco es la curcumina (CUR). La liberación del fármaco de las NPs de ECP se ha investigado sin y con electroestimulación. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 9 3. INTRODUCCIÓN 3.1 Breve historia En 1977 Shirakawa informó que mediante dopaje de poliacetileno, el polímero orgánico podría ser alterado para exhibir metal como propiedades [1]. A partir de este descubrimiento, muchos materiales fueron desarrollados y denominados polímeros intrínsecamente conductores (ICP). Los ICP son polímeros orgánicos con propiedades eléctricas, magnéticas y ópticas usualmente asociadas con metales, sin embargo mantienen sus propiedades mecánicas y la facilidad de procesamiento usualmente asociadas con polímeros. Este trabajo revisa la aplicación de polímeros intrínsecamente conductores (ICP) en la administración de fármacos. Los ICPs se aplican en una amplia variedad de áreas, como por ejemplo en diodos emisores de luz (LEDs), circuitos integrados, blindajes electromagnéticos, inhibidores de corrosión, recubrimientos antiestáticos, electroluminiscentes, displays, transistores de efecto de campo y en varios dispositivos de detección [2]. Debido a las propiedades inherentes de estos materiales únicos, la estimulación eléctrica se puede utilizar para alterar el estado redox de los ICPs, que a su vez puede modificar la velocidad de liberación del fármaco. Se ha estudiado la liberación controlada de fármacos de los ICP desde los años ochenta. Una limitación adicional de tecnologías implantables de liberación controlada actual es que la frecuencia del fármaco disminuye con el tiempo. La liberación controlada de moléculas bioactivas de ICP ha sido investigada desde la década de 1980s. Gran parte de la investigación estaba en la prueba experimental del concepto, mientras que en la década de 1990s, se realizaron más trabajos con mediciones precisas y mejoras. [3] Durante la última década, los investigadores han encontrado una gama más amplia de métodos para lograr la liberación controlada, la capacidad de aumentar los niveles de carga de fármacos y ampliar la gama de fármacos que pueden utilizarse con los ICP. [4] El polipirrol (PPY) es el ICP más ampliamente explorado para la administración de fármacos, aunque el poli-(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT) y el N-metil pirrol también se han utilizado. Este trabajo pretende investigar muestras con PEDOT, la formación de nanoesferas poliméricas según la cantidad de curcumina que se incorpora al ICP y el estudio de las diferentes aplicaciones que puede tener una vez es liberado a través de estímulos eléctricos. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 16 Figura 4. Bandas de valencia (BV) y de conducción (BC) y propiedades intramoleculares en una cadena polimérica [21] En general los polímeros tienen la banda de valencia llena y la de conducción vacía, lo que hace que tengan buenas propiedades aislantes ya que es muy complicado que se cree movilidad de electrones. Esto se debe al gran salto de energía (Eg) que hay que superar para que el electrón que se encuentra en un nivel de energía más alto de la banda de valencia (con una energía Ef) alcance la banda de conducción. La anchura de la banda de valencia (AB) está relacionada con el mayor o el menor grado de conjugación de los electrones p. Como ya se ha visto, en los polímeros conductores existe una elevada conjugación, lo cual implica una deslocalización de electrones, y por tanto una cierta movilidad de los mismos [21]. 3.8 Fármaco: Curcumina La curcumina (1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-diona (CUR), cuya fórmula química se muestra en la Figura 5, es un derivado fenólico de origen natural de color amarillo anaranjado obtenido a partir del rizoma de cúrcuma (Curcuma longa L) [12][13] . La CUR es ampliamente conocida por sus propiedades antitumorales, antiinflamatorias, anticoagulantes, antivirales, antibacterianas y antioxidantes. Se requieren concentraciones bajas para que sus efectos antitumorales actúen por vía tópica a partir de fibras electrohiladas. En las células tumorales, la CUR puede inhibir las vías de señalización mediada por un factor de crecimiento, incluyendo los acoplados a quinasas extracelulares reguladas y proteína quinasa C. [22] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 17 Figura 5. Fórmula química de la Curcumina Es inestable en condiciones alcalinas, a los tratamientos térmicos y a la luz. Presenta baja solubilidad en agua pero se puede disolver en disolventes orgánicos como etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), acetona o dimetilformamida. Por todas sus propiedades farmacológicas y físico-químicas es ampliamente utilizada en los cosméticos, la medicina tradicional china y en productos farmacéuticos. [23] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 18 4. MATERIALES Y MÉTODOS En este apartado se explica el procedimiento experimental para sintetizar las nanopartículas de polímero conductor. Posteriormente se detalla la aplicación de las nanopartículas a un recubrimiento de curcumina. Se describe el proceso completo para sintetizar las nanopartículas de PEDOT y su aplicación, indicando en cada paso los reactivos y la instrumentación necesarios. Posteriormente, se explican las distintas técnicas de caracterización, como FTIR, DLS, SEM, Absorción y electrospinning, que se han empleado para estudiar la morfología y composición de las NPs, así como la identificación de los grupos funcionales presentes. 4.1 Materias primas A continuación se describen los principales reactivos y materiales empleados en el este proyecto: EDOT: Como se ha estudiado previamente, el monómero estudiado en este trabajo es el 3,4-etilendioxitiofeno (EDOT) (Figura 6). El EDOT utilizado en el laboratorio es puro al 97%, densidad 1,33 g/ml y masa molecular de 142,18 g/mol. [24] APS: El persulfato amónico es un compuesto inorgánico de fórmula (NH4)2S2O8, son las sales de amonio del ácido peroxisulfúrico, es un agente oxidante fuerte, se presenta en forma de cristales o polvo de color blanco, cuenta con muy buena solubilidad en agua. Se utilizará para iniciar la polimerización del mónomero EDOT. Consta de una masa molecular de 228,2 g/mol. [25] DBSA: Como se ha estudiado previamente, el ácido dodecilbencensulfónico se utiliza como surfactante. Consta de una masa molecular de 326,49 g/mol, 70% en isopropanol y una densidad de 0,992 g/ml. [26] Figura 6. Composición química del monómero 3,4-etilendioxitiofeno EDOT [13] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 19 Curcumina: En la carga de nanopartículas poliméricas se ha llevado a cabo un método de polimerización con la carga de un fármaco, que se disuelve después de la formación del co-polímero. [27] Policaprolactona: La policaprolactona (PCL) es un poliéster alifático biodegradable con un bajo punto de fusión de alrededor de 60°C y una temperatura de transición vítrea de alrededor de -60°C. Se ha utilizado para realizar las pruebas de electrospinning junto con las nanopartículas de PEDOT con la diferente carga de curcumina. [28] 4.2 Material de laboratorio  Tubos de ensayo de plástico  Balanza de precisión  Papel de filtro  Papel de aluminio  Jeringas de plástico (5 mL)  Agujas  Tubos Eppendorf  Agitador tipo Vortex  Placa calefactora  Cubre objetos vidrio  Porta objetos vidrio  Micropipetas regulables (10μL, 20μL, 100μL, 500μL y 1000µL)  Parafilm  Espátula  Pinzas de precisión  Guantes de nitrilo  Gafas homologadas  Bata de laboratorio Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 20 4.3 Síntesis y caracterización de las nanopartículas de PEDOT cargadas con curcumina En este proceso se determinará la cantidad formada de PEDOT dopado según la concentración del fármaco curcumina. Para ello, primero de todo, se tiene que preparar una solución de etanol con el fármaco curcumina con una concentración de 10 mg/ml. Partiendo de la base que se utilizarán 5 ml de etanol y con el fin de analizar qué cantidad de curcumina es necesaria para obtener dicha concentración, se precisa el siguiente cálculo: Por lo tanto, se pesan 50 mg de curcumina y se añaden a los 5 ml de etanol, así se obtiene la concentración deseada. Una vez se tiene lista la muestra, se preparan 4 tubos de ensayo y se les añade 3,999 ml de agua mili Q junto con 0,016 g de dodecilbenzeno sulfónico (DBSA). Ya que la muestra de DBSA se encuentra en estado líquido, es necesario realizar el siguiente cálculo para determinar qué cantidad es necesaria añadir a las muestras: Por consiguiente, se pipetean 0,0239 ml de DBSA y se añaden a los 4 tubos de ensayo que se habían preparado previamente. Más adelante, se deja agitando con un imán las 4 muestras durante 1 hora a una velocidad de 750 rpm. Una vez transcurrido el tiempo de agitación, se le añaden 0,0236 g de EDOT a cada tubo de ensayo. Para saber cuánto se ha de pipetear es necesario hacer el siguiente cálculo EDOT Nuevamente, se deja transcurrir una hora para que la agitación prosiga correctamente. Transcurrido el tiempo, es necesario añadir 0,0912g de persulfato de amonio (APS)[23] en 0,5 ml para cada tubo. Se prepararán 3 ml, ya que si se tienen 4 tubos, es necesario más volumen. Por lo tanto, mediante el siguiente cálculo se determinará la cantidad necesaria para que la concentración sea la misma. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 21 Una vez calculado los gramos necesarios de APS, se añaden en 3 ml de agua mili Q y, posteriormente, se vierten 0,5 ml de la mezcla obtenida en cada tubo. Como se ha explicado al inicio del trabajo, se desea analizar muestras con diferentes concentraciones de curcumina. En este caso, las muestras estudiadas serán de 0 mg/ml cur, 0,25 mg/ml cur, 0,5 mg/ml cur y 1 mg/ml cur. Para obtener las diferentes concentraciones, es necesario utilizar la solución inicial de 10 mg/ml de curcumina con una dilución 10 veces de la muestra inicial. Para ello es necesario distinguir la cantidad de concentración que se busca y es necesario realizar el cálculo siguiente (Ecuación 1): ; Ecuación 1. Ecuación para calcular la concentración de curcumina de cada muestra. Donde: P= concentración de curcumina que se quiere obtener C= volumen necesario de la solución de curcumina para obtener la concentración buscada. X= volumen necesario de etanol para obtener la concentración buscada. Como se puede ver en las ecuaciones anteriores, depende de la concentración que se busque se añade un cierto volumen de curcumina y de etanol en los diferentes tubos. Por ejemplo, para la muestra de concentración de 1 mg/ml cur, se añaden 0,5 ml de la solución de curcumina que se ha preparado inicialmente. Con este método, ya se ha conseguido pasar de una concentración de 10 mg/ml cur a 1 mg/ml cur. Para obtener el resto de concentraciones deseadas, se añade a los demás tubos sus respectivos volúmenes de la solución inicial de curcumina con etanol. Gracias a la Ecuación 1, se puede determinar el volumen que se quiere dependiendo de la concentración final que se desea. Por lo tanto, para la concentración de 0,5 mg/ml cur, se añadirá 0,25ml de la muestra inicial con 0,25ml de etanol. Seguidamente, para la de 0,25 mg/ml cur, serán necesarios 0,125ml de la solución inicial con 0,375 ml de etanol y, por último, para obtener la concentración de 0 mg/ml, lógicamente, serán necesarios 0,5 ml de etanol sin utilizar la solución inicial, ya que tiene curcumina y no se desea nada de concentración en esta muestra. Una vez preparadas las cuatro muestras, se prepara un espacio suficiente con agua destilada para mantener los tubos a una temperatura de 30 ºC. Se deja agitar a esta temperatura y a 750 rpm durante 20h. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 22 En la Figura 7 se aprecia un diferente color según la concentración de curcumina. En este caso, la muestra más clara es la que tiene más concentración (1 mg/ml cur), mientras que la más oscura es la que no contiene curcumina. Una vez obtenidos los 4 tubos con sus respectivas concentraciones, es hora de determinar la cantidad de PEDOT que se ha formado. Para ello, se divide cada muestra en 5 tubos de microcentrifugadora (eppendorfs), pipeteando 1 ml de cada muestra en cada uno de ellos para poderlos centrifugar. Es recomendable, antes de centrifugar, pasar las muestras a una máquina de ultrasonidos con agua destilada a una temperatura de 40 ºC durante 15 minutos. Así se consigue una muestra mejor suspendida y más fácil de separar en la centrifugadora. También es recomendable pasar cada eppendorf por la máquina Vortex durante unos segundos. Estos 20 eppendorfs pasan a centrifugarse con una fuerza de 17.000g y un tiempo de 5 minutos. Una vez transcurridos, se puede observar las muestras con un líquido amarillento y una parte sólida al fondo. Como el objetivo es determinar la cantidad de PEDOT que se ha formado, se tendrá que suspender las partículas para que se pueda separar bien. Para separar correctamente la parte líquida del PEDOT formado, se pipetea la parte amarillenta y se deja la máxima parte de PEDOT. A continuación, a cada uno de ellos se le añade agua mili Q hasta 1 ml y se vuelve a centrifugar con las mismas condiciones. Como se ha dicho previamente, es recomendable, antes de cada Figura 7. Tubos ensayo con diferente concentración de curcumina. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 23 centrifugado, pasar las muestras por la máquina de ultrasonidos o por Vortex. Este proceso se repite 3 veces. Una vez se ha extraído el agua mili Q de las muestras, se deja secar al vacío durante 20 horas para, una vez seco, determinar la cantidad de PEDOT que se ha formado mediante una báscula. 4.4 FTIR 4.4.1 Breve introducción La espectroscopia infrarroja es una técnica analítica que se utiliza para identificar enlaces químicos en compuestos orgánicos. Un espectro infrarrojo representa una huella digital de una muestra con picos de absorción que corresponden a las frecuencias de las vibraciones entre los enlaces químicos de los átomos que componen el material. Debido a que cada material diferente es una combinación única de átomos, no existen dos compuestos que puedan dar origen a un mismo espectro. Por un lado, se trata de un método de análisis cualitativo, ya que se pueden identificar materias primas de compuestos orgánicos. Sin embargo, también puede ser una técnica cuantitativa cuando se determina, por ejemplo, la composición de copolímeros, grado de ramificación y estudio de las interacciones específicas en mezclas de polímeros. Entre sus aplicaciones destacan la caracterización de moléculas orgánicas, materiales poliméricos, materiales cerámicos, detección de especies absorbidas sobre sustratos de metal, la detección de contaminantes de la superficie, residuos, monocapas de materiales orgánicos o inorgánicos, entre otros. Por lo tanto, la técnica de espectroscopia infrarroja resulta útil para la comprobación de la identidad de materias primas en preparaciones orgánicas a gran escala y para el control de procesos de producción continuos. [27] En este proyecto se utilizó un equipo que pertenece al Departamento de Ingeniería Química de la EEBE. Es un espectrofotómetro modelo “Jasco FTIR-4100” (Figura 8). Este equipo está formado por un accesorio de control térmico y un dispositivo de cristal de diamante (Golden Gate Heated Single Reflection Diamond ATR, SpecacTeknoKroma) para registrar los espectros por reflexión en el caso de muestras translúcidas y opacas. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 24 Figura 8. Espectrofotómetro modelo Jasco FTIR-4100. Con este equipo se han analizado cualitativamente las muestras obtenidas con la técnica de síntesis para determinar los grupos funcionales que las componen. Gracias a estos accesorios los espectros se pueden adquirir sin necesidad de preparar las muestras en pastillas. 4.4.2 FTIR teóricos de PEDOT y curcumina Como ya se ha explicado previamente, el objetivo es ver si se ha formado PEDOT en la muestra y qué diferencias hay según las diferentes concentraciones de curcumina. Por lo tanto, es necesario repasar los espectros teóricos tanto de la molécula de PEDOT como la de curcumina. En la Figura 9 se puede comprobar el espectro IR teórico de la molécula de EDOT, que más adelante se comparará con los IR obtenidos en este trabajo dependiendo de la carga de curcumina que contenga la muestra. Figura 9. Espectro IR de la molécula de EDOT [30] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 25 En la Figura 10 se puede contemplar el espectro IR de la molécula de la curcumina. Más adelante se comentará y se comparará los espectros obtenidos con las muestras para determinar cómo afecta la concentración de curcumina en las muestras de PEDOT. Figura 10. Espectro IR de la molécula de curcumina [31] 4.4.3 Metodología Para obtener los espectros FTIR de las matrices de nanopartículas se procedió de la siguiente forma: 1) Poner en marcha el ordenador y el equipo de IR. 2) Abrir el ATR siguiendo las instrucciones y limpiar con un poco de acetona el cristal de zafiro y el soporte de diamante por la existencia de posibles residuos. 3) Abrir el programa Spectra-measurement, poner las condiciones en las que queremos trabajar y hacer una línea base (background). Rutinariamente, los espectros FTIR son recogidos en el rango de 4000 a 600 cm-1, y cada espectro corresponde al espectro promedio de 32 barridos. 4) Si la línea base es correcta procedemos a poner la muestra entre el soporte y el cristal y obtener el espectro. Si no es correcta repetimos desde el punto 2 en adelante. 5) Repetimos el punto 4 para cada muestra. Una vez las muestras están secas, con la ayuda del programa Spectra Manager se podrá obtener los espectros IR. Gracias a ello, se podrá determinar si se ha formado PEDOT en las muestras y como varían los espectros según la concentración de Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 32 Por lo tanto, se pesan 3 mg de KCl y se vierten en 40 ml de H2O mQ para tener la solución deseada. 4.9 Microscopía electrónica de barrido, SEM 4.9.1 Breve introducción y metodología El microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscopy), utiliza un haz de electrones para formar una imagen ampliada de la superficie de una muestra. Es un instrumento que permite la observación y caracterización superficial de sólidos inorgánicos y orgánicos. Su funcionamiento consiste en la construcción de imágenes gracias a la emisión de electrones de una muestra cuando sobre la misma incide un haz enfocado de electrones de alta energía (electrones primarios) en condiciones de alto vació (10-5 mbar) con un potencial de trabajo de entre 0-50kV y una intensidad de corriente típica de 100 pA. Los electrones emitidos por la interacción del haz incidente y la muestra (electrones secundarios) son recolectados por los correspondientes detectores para producir una señal eléctrica que incide en la pantalla de tubo de rayos catódicos que finalmente reproduce la imagen. [38] En la realización de este proyecto se ha utilizado un microscopio Zeiss Neon 40 perteneciente al CrnE de la UPC (Figura 16). Las imágenes dan información acerca del tamaño de las NPs sintetizadas. Figura 16. Microscopio electrónico de barrido (SEM/EDS) Zeiss Neon 40. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 33 4.10 Liberación por difusión de curcumina en las NP de PEDOT 4.10.1 Metodología El estudio de liberación fue realizado con las matrices cargadas que se describen en las siguientes secciones de este proyecto. El medio utilizado para la liberación fue PBS (Phosphate Buffered Saline) con 70% de etanol. Se ha evaluado una matriz de 0,2 ml de la muestra de 0,5 mg/ ml CUR envuelta en una membrana. Esta muestra de matriz fue colocada en un tubo de 40 mL y se añadieron 20 mL de medio de liberación. Los tubos fueron mantenidos en agitación a 120 rpm y 25 ºC. En los tiempos determinados, el procedimiento a seguir fue extraer 1 mL de cada tubo y pipetearlos en un eppendorf para más adelante cuantificarlo, y seguidamente añadir 1mL de medio de liberación (PBS-ETOH 70%), con la finalidad de mantener constante el volumen a lo largo de todo el experimento. Al finalizar el experimento, la cantidad de extracto que quedó retenido en las muestras (extracto no liberado) fue cuantificado. El valor de absorbancia en una longitud de onda característica del extracto fue usado para la cuantificación. Los resultados fueron analizados como porcentajes de liberación en función del tiempo. 4.11 Electrospinning o electrohilado 4.11.1 Introducción a la técnica El proceso de electrospinning permite obtener fibras por medio de estiramiento coaxial de una solución visco elástica [39], estas fibras poseen diámetros que van de las sub micras a los nanómetros rangos en los que es posible encontrar características únicas, entre las que se encuentra: un área superficial muy grande en relación al volumen [40] (en el caso de las nanofibras, esta relación puede ser un aproximado de 103 veces más que una microfibra), flexibilidad en la superficie , alta porosidad, poros interconectados, y un rendimiento mecánico superior comparado con otras formas ya conocidas del material, estas características hacen que las nanofibras sean óptimas candidatas para una variedad de aplicaciones, entre ellas: ingeniería de tejidos, textiles, elementos para cubrir heridas, medios de filtración, membranas especiales y diversas aplicaciones medicas tales como reemplazo de huesos, implantes dentales, sistemas de liberación de fármacos, injertos vasculares, vasos sanguíneos artificiales entre otros [41]. La técnica consiste en hacer girar soluciones de polímero a través de altos campos eléctricos, se basa en aplicar suficientes fuerzas eléctricas que superen las fuerzas de la tensión superficial en la solución de polímero cargado, de esta forma a un voltaje Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 34 determinado, finos chorros de solución son expulsados desde el capilar hasta el plato colector. Posteriormente el chorro se mueve en la dirección del campo eléctrico, enlongándose de acuerdo a las fuerzas externas e internas. El disolvente se evapora y los segmentos de fibras son depositados al azar en un sustrato. [42] 4.11.2 Breve historia La técnica del electrospinning es una técnica antigua, su origen se remonta a más de 60 años. Fue observada por Rayleigh en 1897, quien evaluó el efecto de inducir cargas eléctricas en chorros de agua, así como la inestabilidad asimétrica del flujo del jet. Estudiada en detalle por Zeleny en 1914, a través del análisis del comportamiento de las gotas de solución en el extremo de un capilar y el inicio del proceso de modelamiento matemático del comportamiento de los fluidos bajo las fuerzas electroestáticas y patentada por Cooley, Morton y Formhals. Fue Formhals quien en 1934 logró describir de forma explícita el proceso, para ello trabajó con acetato de celulosa en su primera patente, para su segundo desarrollo ensambló un nuevo sistema con un mayor control de la distancia entre el capilar y el colector, con el cual redujo de forma considerable los problemas observados en sus primeras investigaciones. Más adelante investigadores como Reneker 1994-1995 profundizaron en la técnica. Solo hasta hace pocos años debido a la demanda de materiales con dimensiones en escala nanométrica, la técnica de electrospinning se ha convertido en un proceso más atractivo gracias a su capacidad de transformar una amplia variedad de materiales poliméricos en forma de micro / nanofibras a bajo costo y con relativa facilidad. [43] 4.11.3 Funcionamiento y montaje El típico montaje para ejecutar la técnica de electrospinning se muestra en la Figura 17, consta de un capilar metálico a través del cual debe ser expulsada la solución polimérica; una fuente de alto voltaje que posee dos electrodos, uno de ellos debe conectarse al capilar metálico, y otro directamente al plato colector donde se depositarán las fibras que anteriormente deben evaporar el disolvente durante su tránsito desde el capilar al colector. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 35 La técnica puede ser desarrollada de forma horizontal o vertical según se desee. El principal inconveniente al trabajar en posición vertical es la posible salida de gotas de disolución desde el capilar hacia el plato colector debido a la inestabilidad del campo electrostático, pero también puede ocurrir por un descontrol del flujo de la disolución del polímero. Este goteo de la disolución del polímero, al caer sobre las fibras depositadas genera matrices defectuosas debido a la redisolución de las fibras previamente depositadas en el colector. En la actualidad, existen diversos sistemas de electrohilado. El más sencillo, es la extensión del uso de un capilar a varios de ellos y corresponde al electrospinning multi-jet; este sistema tiene por finalidad reducir el tiempo de electrohilado. Por mencionar algunos otros, se tiene el sistema de coelectrospinning también llamado electrospinning dual, en el cual diferentes disoluciones de diferentes polímeros pueden ser electrohiladas de manera simultánea, permitiendo conformar matrices híbridas con polímeros de diferentes características. También se han obtenido fibras coaxiales las cuales quedan conformadas con un dominio central o nuclear llamado core y capas o cubiertas (llamada shell) alrededor del core, para lograr este tipo de fibras se disponen de capilares coaxiales. Las disoluciones que originan cada dominio en la fibra coaxial pueden ser operadas de manera independiente en su flujo. Finalmente, se han conseguido matrices con fibras alineadas, lo cual depende del sistema colector, por ejemplo se puede utilizar un plato giratorio o un tambor rotatorio, en ambos casos se obtienen fibras alineadas longitudinalmente. El uso de aplicar un campo pulsante en el plato colector permite obtener fibras ordenadas ortogonalmente. [43] Figura 17. Representación esquemática de un sistema simple de electrohilado Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 36 4.11.4 Parámetros del proceso Voltaje El voltaje es uno de los parámetros más importantes dentro del proceso de electrospinning, algunos autores afirman que aplicar voltajes altos hace que más fluido se transporte en el chorro lo que resulta en fibras con mayores diámetros, otros afirman que un incremento en la aplicación del voltaje decrece el diámetro de las nanofibras y aumenta la probabilidad de obtener fibras con defectos (beads), lo cierto es que en la mayoría de los casos un voltaje alto permite un mayor estiramiento de la solución debido a la presencia de mayor fuerza de coulomb en el chorro y un fuerte campo eléctrico, todos estos factores promueven una reducción en el diámetro de las fibras. La influencia del voltaje depende además de las propiedades viscoelásticas del material base, por ello es importante analizar el comportamiento para cada polímero con su respectivo disolvente. [43] Flujo de salida Un flujo de salida menor podría ser benéfico ya que el disolvente tendría más tiempo para evaporarse evitando la formación de defectos en las fibras. Cuando el flujo de salida se incrementa ocurre un incremento en el diámetro de las fibras y posiblemente en el tamaño de los defectos. Un mínimo valor de volumen de solución a la salida del capilar debería ser mantenido para obtener un cono de Taylor estable, el flujo de salida determina la cantidad de solución disponible para el proceso de electrospinning. [43] Distancia entre la punta de la aguja y el plato colector Dependiendo de las propiedades de la solución el efecto de la variación de la distancia puede o no, tener efecto en la morfología de las fibras. Al trabajar con distancias muy grandes las fibras electrohiladas podrían romperse debido a su propio peso, especialmente si la fibras son de diámetro pequeño. Una mínima distancia es requerida para dar a las fibras el tiempo suficiente para que el disolvente se evapore antes de alcanzar el plato colector, con distancias muy grandes o demasiado pequeñas se ha observado la aparición de beads o fibras húmedas que promueven la obtención de fibras aplanadas o con forma de cintas. La mayoría de los autores coinciden en que con mayores distancias la solución tendrá mayor tiempo de vuelo lo que promoverá un mayor estiramiento de las fibras antes de depositarse en el plato colector. [43] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 37 4.11.5 Metodología Para realizar el electrospinning, primero es necesario determinar qué tipo de fibras se utilizará. En este trabajo se han utilizado fibras de policaprolactona (PCL) con las diferentes muestras de PEDOT que se han sintetizado previamente. Para tener una concentración ideal de PCL, se pesan 5,5 gr de PCL en 10 ml de CHCl3 (cloroformo) con acetona (2:1). Como serán necesarias varias muestras, se pesan 27,5 gr de PCL en 50 ml de cloroformo con acetona. Para obtener el volumen de 50 ml, en una relación 2:1 de cloroformo con acetona, se pipetean 33,33 ml de cloroformo con 16,66 ml de acetona. Gracias a estos volúmenes, se puede conseguir una relación 2:1. Una vez se han mezclado los 27,5 gr de PCL con los 50 ml de la solución, es necesario agitarla durante 24h a 100 rpm a una temperatura de 30ºC para que las fibras se disuelvan bien. Una vez transcurrido el tiempo de preparación de las fibras, el siguiente paso es preparar las diferentes muestras que se quieren estudiar. Para mezclar las fibras con las muestras de NP de PEDOT, se utilizarán 5 ml de la solución de fibras con 0,5 ml de las NP disuelta en H2O mQ. En este trabajo se han estudiado las siguientes muestras: - PCL CONTROL - PCL 0 NPpedot - PCL 0,25 CUR - PCL 0,25 NPpedot CUR - PCL 0,5 CUR - PCL 0,5 NPpedot CUR Las características estudiadas han sido: - Potencial de 15 kV - 15 cm - Flujo de 10 ml/h. En cada operación de electrospinning, se ha depositado fibra sobre papel de carbono para poder mirarlas y analizarlas en el microscopio electrónico (SEM) para ver cómo se han formado las fibras. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 38 Por último, se han recogido muestras de fibra con pequeños placas metálicas conductoras para hacer un análisis con electrodos. Es importante pesar en una balanza electrónica precisa las placas metálicas antes y después del electrospinning, para cuantificar la cantidad de fibra que ha quedado retenida en cada placa. Con este método resultará más sencillo cuantificar la cantidad liberada en la fase electroestimulada que se explicará más adelante. Una vez se tienen las muestras, se pasará a calcular la liberación con dos métodos experimentales diferentes. Uno se basa en la liberación por difusión, tal y como se hizo previamente con las muestras de NP de PEDOT con CUR. Por otra banda, se calculará la liberación por electroestimulación, la cual serán útiles las placas metálicas con las fibras incorporadas. 4.12 Microscopio óptico El microscopio óptico Carl Zeiss Standar 20, se ha utilizado para observar las muestras recogidas en el cubreobjetos obtenidas mediante la técnica del electrospinning. Un microscopio óptico consta de un sistema de iluminación regulable, un sistema óptico que aumenta el tamaño de la imagen de la muestra y un sistema mecánico mediante el cual se consigue graduar el enfoque de la imagen aumentada. El microscopio óptico se sirve de la luz visible para formar una imagen aumentada de la muestra mediante un sistema de lentes. Si se mira a través del ocular se observa una imagen virtual aumentada respecto de la imagen real. [44] Para el electrohilado es una herramienta indispensable, porque la evaluación de las fibras obtenidas de manera rápida (casi en línea) permite tomar decisiones para cambiar los parámetros operacionales del proceso. 4.13 Liberación por difusión de fibras con NP de PEDOT y CUR 4.13.1 Metodología Una vez se ha obtenido las diferentes fibras con la técnica del electrospinning, es necesario volver a realizar una liberación por difusión para poder determinar cómo se libera la curcumina en las fibras en este medio. En este experimento se estudiarán las siguientes muestras: Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 39 - PCL 50% + 0,25 NPpedot CUR - PCL 50% + 0,5 NPpedot CUR - PCL 50% + 0,5 CUR Para realizar una prueba más precisa, se ha decidido estudiar cada muestra por triplicado, así es más sencillo de tener unos resultados más exactos. El medio utilizado para la liberación de las fibras volverá a ser PBS (Phosphate Buffered Saline) con 70% de etanol. Se ha evaluado una matriz de 20 mg de fibra de las diferentes muestras comentadas anteriormente. Esta muestra de matriz de fibra fue colocada en un tubo de 40 mL y se añadieron 20 mL de medio de liberación. Los tubos fueron mantenidos en agitación a 100 rpm y 25 ºC. En los tiempos determinados, el procedimiento a seguir fue extraer 1 mL de cada tubo y pipetearlos en un tubo eppendorf para más adelante cuantificarlo, y seguidamente añadir 1mL de medio de liberación (PBS-ETOH 70%), con la finalidad de mantener constante el volumen a lo largo de todo el experimento. Al finalizar el experimento, la cantidad de extracto que quedo retenido en las muestras (extracto no liberado) fue cuantificado. Para ello, se procedió a aspirar el medio de liberación de los tubos, y las muestras fueron secadas en una estufa a 37 ºC durante toda la noche. Luego, se colocaron las muestras a un eppendorf diferente. A cada tubo se añadieron 100 μl de cloroformo y se agitó bien para que la matriz se disuelva. A continuación se añade 1,2 ml de PBS-ETOH 70% para que se produzca la precipitación del polímero, y los componentes del extracto queden retenidos en la fase etanólica. Finalmente, los eppendorfs fueron centrifugados a 10000 rpm durante 3 minutos. Para cuantificar la cantidad de extracto liberado desde las matrices y la parte retenida, se realizaron barridos UV-Vis en modo absorbancia. El valor de absorbancia en una longitud de onda característica del extracto fue usado para la cuantificación. Los resultados fueron analizados nuevamente como porcentajes de liberación en función del tiempo. 4.14 Liberación electroestimulada de fibras con NP de PEDOT y CUR 4.14.1 Breve introducción Un potenciostato-galvanostato (PGSTAT) controla con precisión el potencial del electrodo contador (CE) contra el electrodo de trabajo (WE), de modo que la diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo (WE) y el electrodo de referencia están bien definidos, y corresponden al valor especificado por el usuario. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 40 E flujo de corriente entre el WE y el CE es controlado. La diferencia de potencial entre el RE y WE y la corriente que fluye entre el CE y el WE se monitorean continuamente. Mediante el uso de PGSTAT, el valor especificado por el usuario (es decir, el potencial aplicado o la corriente) se controla con precisión, en cualquier momento durante la medición utilizando un mecanismo de realimentación negativa. Como puede verse en la Figura 18, el CE está conectado a la salida de un bloque electrónico que se llama amplificador de control (CA). Éste fuerza la corriente a fluir a través de la celda. El valor de la corriente se mide con un seguidor de corriente (LowCF) o un shunt (HighCR), para corrientes bajas y altas, respectivamente. La diferencia de potencial se mide siempre entre el RE y S con un amplificador diferencial. Dependiendo del modo en que se utilice el instrumento (potenciostático o galvanostatico), el interruptor PSTAT / GSTAT se ajusta en consecuencia. La señal se introduce entonces en el punto de suma (Σ) que, junto con la forma de onda ajustada por el convertidor digital-analógico (Ein), se utilizará como entrada para el amplificador de control. Los cables celulares del Autolab PGSTAT (Figura 19) tienen un total de cinco conectores: WE, CE, RE, S y tierra. El potencial siempre se mide entre el RE (azul) y el S (rojo) y la corriente siempre se mide entre el WE (rojo) y el CE (negro). El conector de tierra (verde) se puede utilizar para conectar dispositivos externos a la misma tierra de la PGSTAT. [44] Figura 18. Diagrama del funcionamiento del potenciostato galvanostato [44] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 41 Figura 19. Las conexiones disponibles en los cables de la célula de Autolab PGSTAT y el código de color utilizado [44] 4.14.2 Metodología En esta parte del trabajo se ha decidido trabajar con PBS ácido con un PH=7,4 mezclado con un 0,05% de detergente iónico Tween 20. Para ello se pipetean 10 ml de la disolución comentada y se vierte en la celda junto con las placas metálicas con las fibras obtenidas del electrospinning cogidas por una pinza. Previamente, a las placas metálicas se les ha de enganchar un trozo de cinta kapton a la parte trasera de la placa, ya que así se asegura que la conducción del potencial por las fibras. También es recomendable rodear la pinza con cinta aislante para prevenir la corriente por la pinza. Una vez esté todo montado se introduce la celda y se conectan los cables con sus respectivos electrodos. Cuando está todo conectado, se enciende el aparato Autolab PGSTAT y se determina los parámetros en los cuales se va a trabajar. En este proyecto se ha decidido trabajar a 1 V con diferentes pulsos para determinar la liberación del fármaco a través del tiempo. Para ello, se determinará las absorbancias medidas en 1 pulso de 60 segundos, en 3 pulsos (120 segundos más) y, por último, 5 pulsos (120 segundos más). Cada vez que se finalice el tiempo que se quiere determinar, se pipetea 1 ml de la disolución y se traspasa a un eppendorf para, más adelante, pasar 0,1 ml a una placa para determinar su absorbancia. Una vez traspasado 1 ml de la disolución, se vuelve a pipetear 1 ml de PBS con 0,05% de detergente iónico Tween 20 para tener un volumen constante en la celda de 10 ml. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 48 Figura 24 . Relación de la masa del fármaco respecto la masa total Para la parte del porcentaje en peso de curcumina en las NPs de polímero se ve claramente una tendencia a la alza. Es lógico que el gráfico muestre esta tendencia a, ya que a medida que se aumenta la carga de fármaco en el polímero conductor, la relación mg cur/mg total tendría que ser mayor cada vez, tal y como se muestra en los resultados obtenidos. 5.3 Características espectrales UV-Vis En general, los espectros UV-Vis de las moléculas pueden ser utilizados para su identificación puesto que estos pueden ser considerados como “finger-printing” o huellas moleculares características y se corresponden a estados vibracionales propios de la distribución electrónica en las moléculas. Así, los espectros de absorción UV-Vis son aplicados con fines cualitativos y cuantitativos. Los espectros UV-Vis de los extractos fueron registrados con la finalidad de obtener sus bandas de absorción características. A continuación se muestra los espectros conjuntos según la concentración de fármaco que tiene el polímero conductor. En la Figura 25, se puede apreciar que el pico más destacado aparece a una longitud de onda (λ) de 425 nm. También se puede apreciar un pico menos intenso a 263 nm. 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 0,25 0,5 1 Encapsulation efficiency (%) Wt (%) [CUR]i (mg/mL) mg cur/mgtot Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 49 Figura 25. Espectros de absorción de los extractos con bandas características en el espectro visible y UV PEDOT cargado con curcumina. Por lo tanto, para todos los cálculos siguientes se ha utilizado un número de onda de 450 nm(dónde el lector de placas del laboratorio puede operar), ya que resultará muy óptimo trabajar cerca del pico máximo comentado. 5.4 Dispersión dinámica de luz, DLS En este apartado se evaluará tanto los diámetros efectivos como los potenciales Zeta obtenidos en las muestras del polímero conductor cargados con el fármaco. Para ello se han realizado diferentes pruebas para la misma muestra y así tener más precisión a la hora de evaluar los datos. 5.4.1 Diámetro efectivo Primero de todo, se pasará a realizar una serie de cálculos para intentar sacar una conclusión de la tendencia de los diámetros efectivos de las nanopartículas cargadas con la diferente concentración del fármaco. A la hora de calcular los diámetros efectivos, se ha realizado la media de todas las pruebas con su desviación estándar. También se ha tenido en cuenta el valor de la polidispersidad, ya que siempre tiene que ser inferior a 0,3. Cuando más grande es el valor, mayor es el número de poblaciones de tamaños en la muestra. En el caso que el valor diese superior, el dato no sería idóneo y se tendría que excluir de los cálculos. 200 300 400 500 600 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 =263 nm Absorbance Wavelength (nm) =425 nm Curcumin [mg/mL] Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 50 En la Tabla 1 están mostradas los promedios de las medidas tomadas en las diferentes muestras. Tabla 1. Resultados de los diámetros efectivos, desviación estándar y polidispersidad de las muestras de polímero conductor. Muestras Diám. efectivo (nm) Desv. Estándar (nm) Polidispersidad PEDOT 157,00 0,986 0,12 PEDOT_0.25CUR 305,43 0,430 0,15 PEDOT_0.5CUR 289,57 16,425 0,20 PEDOT_1CUR 404,95 10,704 0,26 A continuación, se mostrará las diferencias de diámetro efectivo de las diferentes muestras con sus respectivas desviaciones estándar en un diagrama de barras, para poder apreciar como varían los diámetros del polímero conductor según la concentración de fármaco que contenga. Con la ayuda de la Figura 26 se puede observar una tendencia a la alza de los diámetros de las nanopartículas de polímero conductor a medida que hay más concentración de fármaco. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 51 Figura 26. Promedio diámetro efectivo dependiendo la concentración del fármaco en las muestras de polímero conductor. Para empezar, los diámetros de las nanopartículas que no están cargadas con el fármaco son mucho menores que el resto, de alrededor de los 160 nm, tal y como se puede observar en la Tabla 1. Seguidamente, si se observa atentamente al gráfico, se puede apreciar que los diámetros cargados con una concentración de 0,25 mg/ml cur son ligeramente superiores a los de 0,5 mg/ml cur. En cambio, si se tiene en cuenta el factor de la desviación estándar, se puede considerar de diámetro iguales, ya que el p-valor entre ellas es inferior a 0,05. Eso quiere decir que la muestra es más polidispersa, lo cual está de acuerdo con los valores de polidispersidad obtenidos con la DLS. Por último, se puede apreciar que los diámetros con más carga de fármaco son superiores al resto, de un valor aproximadamente de unos 400 nm. Por lo tanto, se puede concluir que a medida que hay más concentración en el polímero conductor, los diámetros de las esferas de las nanopartículas se hacen más grandes. 0 0.25 0.5 1.0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 *p <0.05 *p <0.05 Effective Diameter (nm) Curcumin (mg/mL) Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 52 5.4.2 Potencial Zeta En este apartado se evaluará el valor del potencial Zeta de las diferentes muestras de polímero conductor dependiendo de la concentración de fármaco que esté cargado. A la hora de calcular el potencial Zeta de cada muestra, se ha realizado la media de todas las pruebas con su desviación estándar. También se ha tenido en cuenta el valor del error estándar, ya que según el manual de la máquina NanoBrook 90Plus Zeta se han de excluir aquellas medidas que sean superiores o inferiores a 3 veces el error estándar. A continuación, se mostrará una tabla con las medias obtenidas, las desviaciones estándar y los errores estándar para las diferentes pruebas con las muestras estudiadas, una vez excluidos los valores que daban 3 valores superiores o inferiores al error estándar de la media. En la Tabla 2 están mostradas los promedios de las medidas tomadas en las diferentes muestras. Teniendo en cuenta que ha habido algunas muestras superiores o inferiores a 3 veces el error estándar, se ha tenido que excluirlas de los cálculos, ya que no son buenas medidas. Tabla 2 Resultados de las medias de potencial zeta, desviación estándar y error estándar. Muestras Potencial Zeta (mV) Desv Estándar (mV) Error Estándar PEDOT -24,48 2,39 1,29 PEDOT_0.25 CUR -19,65 1,93 1,27 PEDOT_0.5 CUR -29,91 1,13 0,75 PEDOT_1 CUR -32,41 0,91 0,50 A continuación, se mostrará las diferencias de potencial zeta de las diferentes muestras con sus respectivas desviaciones estándar en un diagrama de barras, para poder apreciar como varían los potenciales del polímero conductor según la concentración de fármaco que contenga. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 53 Con la ayuda de la Figura se puede observar una tendencia clara de los potenciales zeta de las nanopartículas de polímero conductor. Figura 27. Diagrama de las medias de potenciales Zeta con su desviación estándar de las diferentes muestras. Para empezar, los potenciales de las nanopartículas que no están cargadas con el fármaco presentan un potencial ligeramente superiores en valor absoluto a las cargadas con una concentración de 0,25 mg/ml cur. Teniendo en cuenta el valor de la desviación estándar, se puede concluir que tienen el mismo valor de potencial Zeta, ya que el p-valor es inferior a 0,05. Seguidamente, si se observa atentamente al gráfico comentado, se puede apreciar un crecimiento considerable en el valor absoluto del potencial a medida que se aumenta la carga del fármaco en el polímero conductor. Por lo tanto, se llega a la conclusión que a medida que se carga con más concentración el polímero conductor PEDOT, se podría conseguir potenciales más altos en valor absoluto, esto ayudaría a incrementar la repulsión entre las partículas, es decir, que haya más dispersión en la muestra. 0 0.25 0.5 1.0 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -Potential (mV) Curcumin (mg/mL) *p <0.05 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 54 5.5 Microscopía electrónica de barrido, SEM En este apartado se estudiarán las micrografías realizadas con el microscopio electrónico de barrido con el objetivo de analizar el tamaño en diámetro de las muestras obtenidas y así compararlas con el diámetro efectivo que se ha visto con la DLS. Además, se estudiará el diámetro de las fibras obtenidas después de haber realizado el electrospinning con la solución de caprolactona en cloroformo y acetona (proporción 2:1 en volumen) y cómo afecta la adición de las nanopartículas a este. 5.5.1 Diámetros obtenidos Primero de todo, se repasará las diferentes microfotografías mostradas con el microscopio electrónico de barrido y, seguidamente, se determinará la media del tamaño de diámetro de cada muestra. Más adelante, se procederá a comparar los resultados obtenidos con los que se han explicado anteriormente en el apartado 5.4.1, en el cual se ha explicado la tendencia de las muestras del diámetro efectivo. Primero de todo, se empezará a analizar los diámetros obtenidos de la muestra de NP de PEDOT sin carga de fármaco. Para analizar los diferentes diámetros de las fotografías obtenidas se ha utilizado el programa “SmartTiff”, el cual va asociado al microscopio electrónico y resulta bastante preciso a la hora de analizar la medida de los diámetros obtenidos. Como se puede apreciar en la Figura 28, para las partículas de PEDOT (Figura 28a), los diámetros obtenidos son bastante similares de aproximadamente unos 100 nm por esfera. Como se puede comprobar en el gráfico de la derecha de la fotografía de la muestra, la media de los diámetros ronda los 100 nm con una desviación estándar de 20.83 nm. Como ya dicho anteriormente, los diámetros son bastante parecidos unos con otros. Por lo tanto, la normal de Gauss parece bien definida con el diagrama de barras mostrado. El tamaño de la nanoparticulas de PEDOT cargadas con 0.25%-wt de curcumina se muestra en la Figura 33b, se puede apreciar un crecimiento del diámetro respecto la muestra observada anteriormente. En la parte derecha se observa el diagrama de barras con su normal de Gauss correspondiente con las medias de los diámetros analizados en esta muestra. Se observa que la media del diámetro obtenido es el doble de la muestra estudiada sin carga de fármaco. Si se analiza la normal de Gauss, se ha de considerar bastante bien definida con respecto el diagrama de barras. Por lo tanto, parece que las medidas están bien tomadas respecto las fotografías obtenidas por el microscopio electrónico. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 55 050 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 50 60 Relative Frequency (%) Diameter (nm) 99 21 nm 050 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 50 60 208 22 nm Relative Frequency (%) Diameter (nm) 050 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 50 60 158 29 nm Relative Frequency (%) Diameter (nm) 050 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 50 60 248 45 nm Relative Frequency (%) Diameter (nm) a) b) c) d) Figura 28. a) NPs de PEDOT; b) NPs de PEDOT con una carga de 0,25 mg/ml cur; c) NPs de PEDOT con una carga de 0,5 mg/ml cur; d) NPs de PEDOT con una carga de 1 mg/ml cur Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 56 En la imagen de la Figura 28c que corresponde a las nanopartículas de PEDOT con carga de 0.5%-wt de curcumina, se puede apreciar un conjunto de diámetros muy diferentes unos respecto otros. En la parte derecha, se representa el diagrama de barras con su normal de Gauss correspondiente con las medias de los diámetros analizados. En esta muestra el valor del diámetro es ligeramente inferior al de la muestra observada anteriormente con una carga de 0,25 mg/ml del fármaco, tal y como pasa en la medida de los diámetros efectivos. Si se tiene en cuenta el valor de la desviación estándar de ambos, se concluye que pueden tener el mismo diámetro de esferas de las nanopartículas. Por último, se pasará al estudio de la muestra de PEDOT con una carga de 1 mg/ml de curcumina (Figura 28d). Una vez obtenidas las medias de las esferas correspondientes, se estudiará la tendencia que tiene la medida de los diámetros y se comprobará si es similar a la del diámetro efectivo calculada con DLS. En la imagen de la Figura 28d se aprecia un conjunto de diámetros muy diferentes unos respecto otros. Por lo tanto, se espera una desviación estándar superior al resto de muestras observadas anteriormente. En la parte derecha, se representa el diagrama de barras con su normal de Gauss correspondiente con las medias de los diámetros analizados. En esta muestra el valor del diámetro es superior al resto de muestras estudiadas, tal y como pasa en la medida de los diámetros efectivos. .A continuación, se pasará a estudiar la comparación entre la tendencia de las fotografías estudiadas en este apartado junto con los análisis estudiados con el diámetro efectivo. Tabla 3 Resumen de las medias de diámetros analizados Muestras Medias (nm) Desv. Std (nm) PEDOT 99 21 PEDOT_0,25CUR 208 22 PEDOT_0,5CUR 158 29 PEDOT_1CUR 248 45 Como se puede apreciar en el estudio anterior, los diámetros obtenidos por el microscopio electrónico (a manera de resumen, ver Figura 29) son muy inferiores a los comentados en el DLS (ver Figura 26). Esto es consecuencia a que el DLS obtiene los diámetros hidrodinámicos y, como se ha explicado en el apartado 0, es lógico que den estos resultados, ya que siempre el diámetro hidrodinámico será más grande que el visto en el SEM, debido a la capa eléctrica dipolar a su superficie. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 57 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 Relative Frequency (%) Diameter Fiber (m) 3.74 0.81 m Figura 29. Representación de las medias de los diámetros analizados por SEM 5.5.2 Tamaño fibras después del proceso de electrospinning En este apartado se estudiará el tamaño de las fibras de las diferentes muestras estudiadas. Como se ha explicado anteriormente en el proceso experimental del electrohilado, se ha utilizado fibras de policaprolactona disueltas en cloroformo y acetona (2:1 en proporción de volumen) y, a estas fibras, se les ha añadido las diferentes muestras estudiadas en este trabajo. A continuación, se compararán los diferentes tamaños de fibra en las siguientes muestras: - PCL - PCL + PEDOT NP 0 mg/ml CUR - PCL + PEDOT NP 0,25 mg/ml CUR - PCL + PEDOT NP 0,5 mg/ml CUR - PCL CON 0,5% CUR Si se agrupan de esta manera, se podrá comparar el comportamiento y la tendencia de las medidas de las fibras de caprolactona con o sin nanopartículas de polímero conductor (Figura 30). a) 0 0.25 0.5 1.0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Diameter (nm) Curcumin (mg/mL) *p <0.05 *p <0.05 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 64 Por otra banda, la muestra de PCL con NP de PEDOT con una concentración de 0,25 mg/ml cur tarda aproximadamente 48h en alcanzar el 50% de su liberación, cosa que hace reflexionar que su liberación tarda más que el resto, tal y como se ha comentado previamente. A continuación, se examinará el comportamiento de la liberación del fármaco a través de impulsos eléctricos mediante un potenciostato-galvanostato, tal y como se ha explicado en el apartado 4.14. 5.6.2 Liberación electroestimulada del fármaco Curva de calibrado con PBS-Tween 20 al 0,05%: Para realizar el experimento de la liberación del fármaco a través de estímulos eléctricos, se ha utilizado el medio de liberación de PBS-Tween 20 al 0,05%. Por ello, es necesario realizar una curva de calibrado para estudiar la relación entre la absorbancia y la concentración de fármaco que hay en la muestra. Con esta recta se conseguirá calcular la concentración de cada muestra obtenida a través de los diferentes impulsos eléctricos. Una vez obtenidas las diferentes concentraciones, se podrá determinar el porcentaje de liberación de las muestras. Como se observa en la Figura 34, se ha obtenido una relación entre la absorbancia y la concentración de fármaco de cualquier muestra obtenida a través este medio de liberación. Figura 34. Recta de calibrado PBS-Tween 20 al 0,05% 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 y = 1.46x r2 = 0.9916 Absorbance mg/mL Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 65 Liberación electroestimulada del fármaco en las fibras: En este apartado se estudiará el comportamiento de la liberación del fármaco cuando está sometido a un potencial de 1 V mediante impulsos de 60 segundos, 180 segundos (3 pulsos) y 300 segundos (5 pulsos). Para ello, se ha representado una gráfica explicando la cantidad liberada del fármaco (en porcentaje, %) a través del tiempo, tal y como se ha analizado en los anteriores apartados. Como se muestra en la Figura 35, se aprecia una tendencia al aumento de liberación a medida que se aumenta los impulsos eléctricos. Es decir, se puede contemplar que el fármaco se libera más a medida que se aumenta los impulsos eléctricos recibidos. Figura 35. Liberación del fármaco con diferentes pulsos eléctricos en las diferentes muestras. Se ha observado que las muestras con una carga de fármaco de 0,25 y 0,5 mg/ml cur tienen prácticamente el mismo comportamiento a la hora de la liberación de éste. Se concluye que las NPs de polímero conductor atribuyen a la liberación del fármaco, ya que la cantidad liberada es muy superior respecto a las muestras que sólo contienen curcumina con PCL. 0.25 Cur 0.5 Cur 0.25 NP/Cur 0.5 NP/Cur 0 10 20 30 40 50 Fibers loaded y=0.37+0.51x r2=0.9690 y=0.99+0.88x r2=0.9359 y=11.80+2.88x r2=0.8722 Release (%) 1 Pulse 3 Pulse 5 Pulse y=2.69+5.43x r2=0.9978 Fibers loaded Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 66 6. CONCLUSIONES En este trabajo se ha procedido a estudiar las nanopartículas de PEDOT cargadas con un fármaco antitumoral denominado curcumina. Luego, estas nanopartículas fueron encapsuladas en microfibras de policaprolactona. Las conclusiones que ha derivado del estudio son: [1] Se han preparado con éxito nanopartículas de PEDOT cargadas con el fármaco antitumoral curcumina a diferentes concentraciones de fármaco. Además, la curcumina puede ser libera por difusión de las nanopartículas. [2] Las nanopartículas de PEDOT cargadas con curcumina fueron encapsuladas en microfibras del poliéster policaprolactona mediante la técnica de electrospinning a partir de la suspensión homogénea de las nanoparticulas en la disolución del poliester. [3] La curcumina requiere un tiempo prolongado de varios días (3-4 días) para sus liberación por difusión desde las nanoparticulas de PEDOT encapsuladas en las microfibras de policaprolactona. [4] Los experimentos de electroestimulación han demostrado que la curcumina puede ser liberada desde las nanoparticulas de PEDOT encapsuladas en las matrices de microfibras de policaprolactona. Para ello, se requiere aplicar carga positiva como electroestimulo, considerando la carga negativa de las nanoparticulas de PEDOT es posible suponer que la liberación de la droga se debe a la interacción de cargas del electroestimulo con las cargas de la nanopartícula. [6] La liberación de droga mediante electroestimulación fue directamente proporcional al número de pulsos eléctricos aplicados sobre las matrices de fibras que contienen encapsuladas las nanopartículas cargadas con la droga. [7] Es interesante indicar, que la droga cargada en las fibras de caprolactona (control) no es liberada por electroestimulación. Este resultado soporta el rol del PEDOT como mediador para producir liberación electroestimulada. [8] En este estudio se ha demostrado la liberación electroestimulada de la droga antitumoral curcumina. Como un trabajo a futuro se debe comprobar la actividad funcional de la droga liberada. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 67 7. ESTUDIO DE LA SOSTENIBILIDAD 7.1 Impacto ambiental Se realizará un análisis del peligro que comportan algunas de las sustancias que se han utilizado durante la realización de este proyecto. Para ello, se seguirá la normativa de la Unión Europea vigente. Dicha normativa está sujeta a las normas REACH que engloba el marco reglamentario de gestión de las sustancias químicas. El Reglamento (CE) nº 1907/2006 (en adelante denominado REACH, acrónimo de Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de sustancias y mezclas químicas) entró en vigor el 1 de junio de 2007 y tiene como objetivo principal mejorar la protección para la salud humana y el medio ambiente frente al riesgo que puede conllevar la fabricación, comercialización y uso de las sustancias y mezclas químicas. En principio el REACH es de aplicación para todas las sustancias químicas presentes en la vida diaria ya sea como tales, en forma de mezclas o contenidas en artículos, siendo, por tanto, de aplicación en sectores económicos de índole diversa. Para cumplir con las disposiciones del REACH las empresas deben identificar y gestionar los riesgos asociados a las sustancias que fabrican y comercializan en la Unión Europea. Deben demostrar cómo usar dichas sustancias de manera segura y comunicar toda aquella información relativa a las medidas de gestión de riesgos a las partes implicadas. De acuerdo con este reglamento actual se presentan en la Tabla 5 las sustancias utilizadas que son clasificadas como peligrosas y sus pictogramas y en la tabla 7 sus indicaciones (Hazard Statements) según el código establecido. Tabla 5 Clasificación de las sustancias peligrosas utilizadas en el proyecto. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 68 Tabla 6 Significado de los Hazard Statements de las sustancias de la tabla 5 Los residuos de PCL se han depositado en un recipiente para polímeros sólidos y las mezclas de disolventes (CHCl3, acetona y ETOH) en un recipiente para disolventes clorados dada la presencia del CHCl3. Los residuos generados durante el estudio con fármacos, se han depositado en un contenedor especial destinado a disolventes no clorados. 7.2 Evaluación económica En este apartado se hace una aproximación de lo que costaría el proyecto teniendo en cuenta factores como el tiempo, el equipo y el precio unitario por hora para cada determinado equipo. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 69 Tabla 7 Coste equipamiento Equipo Tiempo (h) Precio (€/h) Coste (€) Electrospinning 5 200 1000 Espectrofotómetro IR 2 50 100 Espectrofotómetro UV-Vis 2 50 100 Lector ELISA 5 50 250 Microscopio óptico 2 50 100 SEM 5 200 1000 DLS 1 50 50 Electroestimulación 15 100 1500 Otros 10 50 500 Total Equipos 4600 En la Tabla 7 se puede observar que el precio que costaría utilizar toda la maquinaria para realizar este proyecto es de 4600€. A continuación, se estudiará el coste de los productos utilizados a lo largo del proyecto. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 70 Tabla 8 Coste productos Producto Precio Cantidad Coste (€) Acetona 8,5 €/L 0,075 L 0,64 Cloroformo 28 €/L 0,15 L 4,2 Curcumina 332 €/Kg 0,015 Kg 4,98 Etanol 20 €/L 0,5 L 10 DBSA 120 €/g 0,547 g 65,64 PEDOT 300 €/g 0,4 120 PCL 10 €/kg 0,05 Kg 0,5 SUBTOTAL 205,96 Otros (+15%) 30,894 Total Productos 442,814 En la tabla siguiente se puede ver el coste de personal teniendo en cuenta el total de horas dedicadas al proyecto: Tabla 9 Coste personal Función Precio (€/h) Tiempo (h) Coste (€) Estudio previo y documentación 10 90 900 Experimentación 15 500 7500 Análisis de resultados 20 150 3000 Total Personal 11400 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 71 Por último en la siguiente tabla podemos ver el coste final del proyecto: Tabla 10 Coste total del proyecto Concepto Total (€) Coste productos 442,81 Coste equipos 4600 Coste personal 11400 Subtotal 16442,81 Gastos generales(10%subtotal) 1644,28 Coste operacional (21%subtotal) 3452,99 TOTAL 21540,08 Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 72 AGRADECIMIENTOS En primer lugar agradecer a mi tutor Dr. Carlos Alemán Llanso la implicación, dedicación, paciencia y conocimientos transmitidos para la realización de este proyecto. Gracias a toda la ayuda que me ha brindado, todos sus consejos y directrices, ha hecho posible la realización de esta memoria, que ha seguido muy de cerca, orientándome día tras día con sus explicaciones y correcciones. Debo agradecer los conocimientos que he adquirido a lo largo de este proyecto, gracias a su constante apoyo y perseverancia. También quisiera agradecer a la Sta Anna Puiggalí y al Dr. Luis Del Valle, por darme la oportunidad de realizar mi TFG en el grupo de investigación de IMEM y por su interés mostrado durante la evolución del proyecto. Asimismo a todos los miembros del Grup d’Innovació en Materials i Enginyeria Molecular (IMEM) del Departamento de Ingeniería Química de la Universitat Politècnica de Catalunya. Especialmente quisiera dar las gracias a Eduard y Roberto, unas personas que han compartido cinco años de mi vida, cinco largos años de carrera, que me han apoyado incondicionalmente en todo momento y que me han transmitido fuerza y positivismo cuando lo he necesitado. Sin ellos no habría sido lo mismo. Agradecer también a mi gran amigo Juan Pablo por tantos años de amistad, su ayuda y apoyo en todo momento en la realización de este trabajo, así como en toda la carrera. Por último, y no menos importante, quisiera dedicar a este proyecto a mis padres Arturo y Anna y a mi hermano Artur, que me han brindado su apoyo y su paciencia en todo momento, haciendo posible no solo que haya podido terminar con éxito este trabajo, sino también mis estudios universitarios. Integración de nanopartículas para la liberación de fármacos por electroestimulación en andamios poliméricos biodegradables. Pág. 73 BIBLIOGRAFÍA Referencias bibliográficas [1] [http://www.ehu.eus/reviberpol/pdf/publicados/choy.pdf, 17 de marzo de 2017]*. *[URL, fecha de consulta] [2] [https://es.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero_conductor#Aplicaciones_2, 17 de marzo de 2017]*. *[URL, fecha de consulta]. [3] [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022072898002460, 20 de marzo de 2017]*. *[URL, fecha de consulta]. 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