Evaluación del potencial nutracéutico de extractos de mora (Morus alba)

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL EVALUACIÓN DEL POTENCIAL NUTRACÉUTICO DE EXTRACTOS DE MORA (Mo us alba) TRABAJO FIN DE GRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ALUMNO: JAVIER CERVERA MARCH DIRECTORA: EVA GARCÍA MARTÍNEZ Cu so Académico: 2015-2016 VALÈNCIA, JULIO 2016 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL NUTRACÉUTICO DE EXTRACTOS DE MORA (Mo us alba) RESUMEN Man ene una alimen ación adecuada y a iada esul a más que con enien e dado que son nume osos los es udios y ecomendaciones que elacionan una die a equilib ada con una ida más saludable y la p e ención de en e medades. En es e sen ido, las u as juegan un papel undamen al debido a que poseen g an can idad de compues os an ioxidan es, los cuales es án elacionados con la p e ención de pa ologías impo an es. Den o de las u as des acan las conocidas como “ u as del bosque”, den o de cuya amilia se encuen a la mo a. Es a u a iene una la ga adición en la cul u a china po sus p opiedades medicinales debido a su al o con enido en compues os i oquímicos. Sin emba go, su p oducción es es acional y su es abilidad en esco es muy limi ada, solamen e un pequeño po cen aje de mo as alcanza el me cado pa a consumo en esco, la mayo ía son congeladas o u ilizadas en conse as. Po ello, esul a ía in e esan e diseña un nu acéu ico a pa i de ex ac os mo a, pa a lo cual pa i de mo a lio ilizada pod ía esul a adecuado. Sin emba go, la iabilidad y es abilidad del nu acéu ico depende de muchos ac o es, dado que los compues os bioac i os pueden su i dis in as eacciones de deg adación, como la oxidación. El obje i o de es e abajo ue es udia la aplicación de la lio ilización y la adición de un agen e encapsulan e (goma a ábiga) en la composición en bioac i os y ac i idad an ioxidan e de ex ac os de mo a. Pa a ello se han ealizado ex acciones con dis in os disol en es pa a ob ene la mayo can idad de compues os bioac i os hid osolubles (compues os enólicos y i amina C) y liposolubles (ca o enoides) y se ha e aluado la ac i idad an ioxidan e po los mé odos DPPH, FRAP y ABTS. Po o a pa e, se han secado los di e en es ex ac os ob enidos y se ha e aluado la in luencia del p oceso de ob ención de los ex ac os sob e los mismos pa áme os analizados en los ex ac os en disolución. Se ha is o que la lio ilización aumen ó el endimien o de la ex acción de compues os enólicos y ca o enoides, pe o disminuyó el con enido de i amina C y la ac i idad an ioxidan e de los ex ac os. La ac i idad an ioxidan e e aluada en los ex ac os hid o ílicos ue mayo que en el ex ac o lipo ílico, siendo la i amina C la que mejo se co elacionó con es a p opiedad. La deshid a ación de los ex ac os disminuyó los compues os enólicos un 4% y un 9% la i amina C. En gene al, la adición de goma a ábiga a o eció la es abilidad de los i oquímicos es udiados. Palab as cla e: mo a, lio ilización, encapsulación, goma a ábiga, enoles, ca o enoides, i amina C, ex acción, ac i idad an ioxidan e. Alumno: Ja ie Ce e a Ma ch Tu o a Académica: P o . Dña. E a Ga cía Ma ínez Tu o expe imen al: Albe o Yus e del Ca men València, Julio de 2016 EVALUATION OF THE NUTRACEUTICAL POTENTIAL OF MULBERRY EXTRACTS (Mo us alba) ABSTRACT An adequa e and a ied die is impo an since nume ous s udies and ecommenda ions ela e a balanced die wi h a heal hie li es yle and disease p e en ion. In his sense, ui s play a ole because hey ha e la ge amoun s o an ioxidan compounds, which a e ela ed o he p e en ion o signi ican pa hologies. Mulbe y belongs o he so called amily o " o es ui s". This ui has a long adi ion in Chinese cul u e o i s medicinal p ope ies due o i s high con en o phy ochemicals. Howe e , i s p oduc ion is seasonal and i s s abili y is e y limi ed, only a small pe cen age o mulbe ies eaches he esh ma ke , mos a e ozen o canned. The e o e, i would be in e es ing o design a nu aceu ical om mulbe y ex ac s, o which eeze d ied mulbe y may be app op ia ed. Howe e , he iabili y and s abili y o he nu aceu ical depends on many ac o s, since he bioac i e compounds may unde go di e en deg ada ion eac ions such as oxida ion. The aim o his wo k was o s udy he applica ion o eeze d ying echnology and gum a abic addi ion as encapsulan in he bioac i e composi ion and an ioxidan ac i i y o mulbe y ex ac s. To his pu pose di e en ex ac ions we e pe o med wi h di e en sol en s, in o de o ob ain a p oduc ich in wa e -soluble (phenolics and i amin C) and liposoluble (ca o enoids) compounds. Fu he mo e an ioxidan ac i i y o he ex ac s was e alua ed by DPPH, FRAP and ABTS me hods. These ex ac s we e d ied and he in luence o he p ocess was assessed in he same pa ame e s analyzed in ex ac s in solu ion. I has been ound ha eeze d ying inc eased he ex ac ion yield o phenolic compounds and ca o enoids, bu dec eased he con en o i amin C and he an ioxidan ac i i y o he ex ac s. The an ioxidan ac i i y e alua ed in he hyd ophilic ex ac s was g ea e han in he lipophilic one. Vi amin C was he bioac i e ha be e co ela ed wi h an ioxidan capaci y. Ex ac dehyd a ion s ep dec eased phenolic compounds 4% and i amin C 9%. In gene al, he addi ion o gum a abic a ou ed he s abili y o he phy ochemicals s udied. Keywo ds: mulbe y, lyophiliza ion, encapsula ion, gum a abic, phenols, ca o enoids, i amin C, ex ac ion, an ioxidan ac i i y. S uden : Ja ie Ce e a Ma ch Academic u o : P o . Dña. E a Ga cía Ma ínez Co-Tu o : Albe o Yus e del Ca men València, July o 2016 AVALUACIÓ DEL POTENCIAL NUTRACÈUTIC D'EXTRACTES DE MORA (Mo us alba) RESUM Man ind e una alimen ació adequada i a iada esul a més que con enien a ès que són nomb osos els es udis i ecomanacions que elacionen una die a equilib ada amb una ida més saludable i la p e enció de impo an s malal ies. En aques sen i , les ui es juguen un pape onamen al pel e que posseeixen g ans quan i a s de compos os an ioxidan s, els quals es an elaciona s amb la p e enció de pa ologies impo an s. Dins de les ui es des aquen les conegudes com " ui es del bosc", amília en la que es oba la mo a. Aques a ui a é una lla ga adició en la cul u a xinesa pe les se es p opie a s medicinals a causa del seu al con ingu en compos os i oquímics. No obs an això, la se a p oducció és es acional i la se a es abili a en esc és mol limi ada, doncs només un pe i pe cen a ge de mo es a iba al me ca en esc, la majo ia són congelades o u ili zades en conse es. Pe això, esul a ia in e essan dissenya un nu acèu ic a pa i d'ex ac es mo a, pe la qual cosa, pa i de mo a lio ili zada pod ia esul a adequa . No obs an això, la iabili a i es abili a del nu acèu ic depèn de mol s ac o s, a ès que els compos os bioac ius poden pa i di e en s eaccions de deg adació, com l'oxidació. L'objec iu d'aques eball a se es udia l'aplicació de la lio ili zació i l'adició d'un agen encapsulan (goma a àbiga) en la composició en bioac ius i ac i i a an ioxidan d'ex ac es de mo a. Pe a això s'han eali za ex accions amb di e en s dissol en s pe ob eni la majo quan i a de compos os bioac ius hid osolubles (compos os enòlics i i amina C) i liposolubles (ca o enoides) i s'ha a alua l'ac i i a an ioxidan pels mè odes DPPH, FRAP i ABTS. D'al a banda, s'han asseca els di e en s ex ac es ob ingu s i s'ha a alua la in luència del p océs d'ob enció dels ex ac es sob e els ma eixos pa àme es anali za s en els ex ac es en dissolució. S'ha is que la lio ili zació augmen a el endimen de l'ex acció de compos os enòlics i ca o enoides, pe ò a disminui el con ingu de i amina C i l'ac i i a an ioxidan dels ex ac es. L'ac i i a an ioxidan a aluada en els ex ac es hid o ílics a se més g an que en l'ex ac e lipo ílic, sen la i amina C la que millo es a co elaciona amb aques a p opie a . La deshid a ació dels ex ac es disminui els compos os enòlics un 4% i un 9% la i amina C. En gene al, l'addició de goma a àbiga a a a o i l'es abili a dels i oquímics es udia s. Pa aules clau: mo a, lio ili zació, encapsulació, goma a àbiga, enols, ca o enoides, i amina C, ex acció, ac i i a an ioxidan . Alumne: Ja ie Ce e a Ma ch Tu o a Acadèmica: P o . Dña. E a Ga cía Ma ínez Tu o expe imen al: Albe o Yus e del Ca men València, Juliol de 2016 AGRADECIMIENTOS En p ime luga , que ía da le las g acias a mi u o a E a Ma ía Ga cía Ma ínez po pe mi i me ealiza es e abajo con ella, po ene paciencia y con ianza en mí y po ayuda me a ealiza es e abajo con ilusión. También que ía da le las g acias a mi compañe a du an e los expe imen os y es udian e de doc o ado Ma ga e h da Sil a Ribei o, po ayuda me en los expe imen os y cálculos y po hace más en e enidos los días en el labo a o io. A Albe o Yus e del Ca men quie o da le las g acias po ene paciencia conmigo y enseña me a hace las cosas bien en el labo a o io. A mi compañe a en el labo a o io And ea Rod íguez Company quie o ag adece le su ayuda en los expe imen os y en las consul as mu uas sob e las dudas que hemos podido ene a lo la go de odo el abajo. A mis compañe as de clase, Ma ía, Belén y Me i xell, quie o da les las g acias po los momen os i idos y eco e jun os el iaje que han sido es os cua o años de ca e a. Pe o sob e odo, quie o ag adece a mi amilia el hecho de pode habe ealizado es a ca e a y ayuda me, apoya me y sopo a me en los buenos y los malos momen os en es os cua o años. Muchas g acias a odos. ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………………………………….1 2. OBJETIVO ……………………………………………………………………………………………………………..5 3. MATERIAL Y MÉTODOS ……………………………………………………………….……………………5 3.1 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS ………………………………………………………………………..5 3.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS ……………………………………………………………………….6 3.2.1 Ex acción de compues os enólicos…………………………………………………….…………….6 3.2.2 Ex acción de compues os liposolubles………………………………………………………………6 3.2.3 Ex acción de i amina C…………………………………………………………………………………….6 3.2.4 Ob ención de ex ac os secos………………………………………………..…………………………..6 3.3 ANÁLISIS …………………………………………………………………………………………….………………..7 3.3.1 De e minación de la humedad……………………………………………………………………………7 3.3.2 De e minación de compues os bioac i os………………………… ………………………………7 3.3.2.1 Fenoles o ales ……………………………………………………………………………………………………7 3.3.2.2 Ca o enoides o ales .…………………………………………………………………….……………………8 3.3.2.3 Vi amina C …………………………………………………………………………………………….……………8 3.3.3 De e minación de la ac i idad an ioxidan e………………………………………………………8 3.3.3.1 Mé odo DPPH …………………………………………………………………..………………………….…….8 3.3.3.2 Mé odo FRAP ………………………………………………………………….………………………….………9 3.3.3.3 Mé odo ABTS ……………………………………………………………………………………….…….………9 3.4 EFICACIA ENCAPSULANTE ………………………………………………………………………….………9 3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ……………………………………………………………………………….…….10 4. RESULTADOS ………………………………………………….………………………………………………….10 4.1 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA LIOFILIZACIÓN Y DE LA ADICIÓN DE GOMA ARÁBIGA …………………………………………………………………………………………………………….…….10 4.1.1 E ec o en el con enido de humedad………………………………………….…..………..……….10 4.1.2 E ec o en el con enido de compues os bioac i os……………………………..…………….11 4.1.2.1 E aluación del con enido en compues os enólicos …………………………….…..………..…11 4.1.2.2 E aluación del con enido en ca o enoides …..…………………………………….…..………..…12 4.1.2.3 E aluación del con enido de i amina C …………………………………………….…..………..…13 4.1.3 E aluación de la ac i idad an ioxidan e….…..………………………………….…..………..…13 4.1.3.1 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o enólico ….………………………………….…..………..….14 4.1.3.2 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o lipo ílico …………………………………….…..………..…15 4.1.3.3 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o de i amina C ……………………………………….…..…16 4.2 EFECTO DEL DISOLVENTE EMPLEADO EN LA EXTRACCIÓN EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ………………….…………………………………………………………………………….………17 4.3 CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS SECOS. EVALUACIÓN DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE …………………………………18 4.4 ESTUDIO DE LA RELACIÓN ENTRE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS Y LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS …………………………..…………………….20 4.5 ESTUDIO DE LA EFICACIA DE LA ENCAPSULACIÓN ………………………………………..21 5. CONCLUSIONES ……….…………………………………………….…..………..………….…..…………..21 6. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………….…..………..………….…..…………22 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Nomencla u a u ilizada en el abajo pa a denomina a las di e en es mues as………………………………………………………………….......…………………………………………………………5 Tabla 2. Valo es medios de con enido de agua (x w ) y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en g de agua po 100 g de mues a…………………………………….10 Tabla 3. Valo es medios del con enido de compues os enólicos y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg de ácido gálico po 100 g de sólidos de mo a………………………………………………………………………………………………………..……………11 Tabla 4. Valo es medios del con enido de ca o enoides y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg β-Ca o eno po 100 g de sólidos de mo a.……………………………………………………………………………………………..…………………......................12 Tabla 5. Valo es medios del con enido de i amina C y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg de ácido ascó bico po 100 g de sólidos de mo a………………………………………………………………………………………………………………………………………13 Tabla 6. Disol en es u ilizados en cada ex acción y nomencla u a de los ex ac os………………………………………………………………………………………………..………………………………17 Tabla 7. Valo es medios del con enido de compues os bioac i os de los ex ac os secos y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis)………………………………………………………18 Tabla 8. Valo es medios de la ac i idad an ioxidan e de los ex ac os secos y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis)…………………………..…………………………19 Tabla 9. Coe icien es de co elación de Pea son en e la ac i idad an ioxidan e po el mé odo FRAP, ABTS y DPPH, y los enoles, ca o enoides y i amina C de la mo a………………………………..…………………………………………………..……………………………..……...…………20 ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1. Ejemplo de ex ac os liposolubles de ML y MLG…………………………………….………………..6 Figu a 2. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado (DPPH, FRAP, ABTS) en el ex ac o enólico de las mues as de mo a, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a……………………………………………….…………………………………….………………………….……14 Figu a 3. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado en el ex ac o lipo ílico, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a…………………………………………….…….15 Figu a 4. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado en el ex ac o con ácido oxálico, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a…………………………………….16 Figu a 5. E ec o del disol en e u ilizado en la ac i idad an ioxidan e (AAO) en %..................17 7 enólicos, de ca o enoides y i amina C secos de cada una de las mues as. Pa a ello, en el caso de los ex ac os enólicos, el sob enadan e ob enido se secó en o a apo du an e 20 minu os a empe a u a de 50℃ pa a elimina el me anol. Pos e io men e, el ex ac o acuoso ob enido se congeló (48h a -40℃) y se lio ilizó (48h en las mismas condiciones desc i as que en 3.1). De la misma mane a en el ex ac o lipo ílico se eliminó el disol en e empleando el o a apo (20 minu os a empe a u a de 50℃). En el caso del ex ac o de la i amina C, és e se congeló (48h a -40℃) y se lio ilizó (48h) igual que pa a el ex ac o enólico y en las mismas condiciones desc i as que en el apa ado 3.1. Pa a el análisis de los ex ac os secos, es os ue on econs i uidos p e iamen e con el disol en e empleado en su ex acción. Los ex ac os secos se denomina án como “Ex ac o seco de…” según el compues o del que se a e. 3.3 ANÁLISIS. 3.3.1 De e minación de la humedad. A las mues as M, ML y MLG se les de e minó el con enido en humedad, pa a lo cual se siguió el mé odo 20.013 AOAC (1990) pa a alimen os icos en azúca es. Es a de e minación se basa en la pé dida de peso de la mues a bajo condiciones especí icas de empe a u a y p esión (60°C ± 5°C, a una p esión in e io a 100 mm Hg) has a alcanza peso cons an e. Los esul ados se exp esa on en g agua po 100 g de mues a. 3.3.2 De e minación de compues os bioac i os. Pa a cada mues a M, ML y MLG, en cada ipo de ex ac o (me anol/agua, hexano/ace ona/e anol y ácido oxálico) y an o en disolución como secos, se de e minó, po iplicado, un ipo de compues o bioac i o. En el ex ac o hid o ílico de me anol/agua se de e minó el con enido de enoles, en el ex ac o hid o ílico de ácido oxálico, el con enido de i amina C, y en los ex ac os liposolubles se de e minó el con enido de ca o enoides. Se calculó la media y la des iación es ánda . En is a de es anda iza los esul ados y pode compa a los, odos los esul ados se exp esa on e e idos a 100 g de sólidos de u a. 3.3.2.1 Fenoles o ales. La de e minación de los enoles o ales p esen es en las mues as se lle ó a cabo a a és del ensayo Folin-Ciocal eu, siguiendo los es udios de Benzie y S ain (1999) y Sel end an y Ryden (1990). El mé odo de Folin-Ciocal eu se basa en la capacidad de los enoles pa a eacciona con agen es oxidan es. El eac i o de Folin-Ciocal eu con iene molibda o y ungs a o sódico, los cuales eaccionan con cualquie ipo de enol, o mando complejos os omolíbdico- os o úngs icos. A pH básico los complejos o mados se educen dando como esul ado un colo azul in enso capaz de se medido po espec o o ome ía. Pa a su de e minación, se añadie on 0,25 mL de ex ac o hid o ílico jun o con 15 mL de agua bides ilada. Después se le añadie on 1,25 mL de eac i o de Folin-Ciocal eu, mezclándose y eposando du an e ocho minu os en oscu idad. T anscu idos los ocho minu os, se añadie on 3,75 mL de ca bona o de sodio al 7,5% (p/ ) y se en asa on con agua bides ilada a 25 mL. Se man u ie on en oscu idad du an e dos ho as y se p ocedió a medi la abso bancia a 765 nm en un espec o o óme o UV- isible (The mo Elec on Co po a ion USA). Los esul ados se exp esa on como mg de ácido gálico (AG) po 100 g de sólidos de mo a. 8 3.3.2.2 Ca o enoides o ales. La de e minación del con enido de ca o enoides se ealizó basándose en los es udios de Oli es e al. (2006), Shim y Kim (2002) y Wang e al. (2007). Se le añadió 1,5 mL de agua bides ilada al sob enadan e del ex ac o liposuble (a azón de 15 mL de agua po 100 mL de disol en e), agi ándose manualmen e du an e 2 minu os. Cuando se sepa a on las ases, se ex aje on 600 μL de la pa e supe io , lle ándose és a a sequedad con ni ógeno. El p oduc o esul an e ue econs i uido con una disolución de e ahid o u ano:ace oni ilo:me anol (15:30:55, / / ). Se midió la abso bancia a 446 nm en un espec o o óme o UV- isible (The mo Elec on Co po a ion, USA). Los esul ados se exp esa on como mg de β-ca o eno po 100 g de sólidos de mo a. 3.3.2.3 Vi amina C. La de e minación del con enido de ácido ascó bico o i amina C se ealizó siguiendo la me odología desc i a po AOAC (1980) pa a u as y ege ales, Pea son (1998) y Ma issek e al., (1998). Consis e en un análisis olumé ico en el que se emplea ácido me a os ó ico pa a inac i a la enzima asco ba o oxidasa. El ácido ascó bico se de e mina po su acción educ o a sob e el colo an e azul 2,6 diclo o enol-indo enol. El mé odo básicamen e consis e en oma 0,5 mL de ex ac o, adiciona 5 mL de disolución acuosa de ácido me a os ó ico al 25% y en asa a 25 mL con agua des ilada y he ida. T as agi a y il a , se alo an 10 mL del il ado con el indicado has a alcanza osa pe sis en e du an e 30 segundos. El esul ado se exp esó en mg de ácido ascó bico po 100 g de sólidos de mo a. 3.3.3 De e minación de la ac i idad an ioxidan e. La ac i idad an ioxidan e de los ex ac os líquidos y secos ob enidos ue de e minada po es mé odos: DPPH, FRAP y ABTS. Los expe imen os ue on ealizados como mínimo po iplicado. 3.3.3.1 Mé odo DPPH. El mé odo DPPH se basa en la educción del adical DPPH (1,1-di enil-2-p ic ilhid azil) a DPPH-H. El adical DPPH es es able y p esen a una in ensa colo ación iole a. Además, p esen a abso bancia a 517 nm, po lo que su concen ación puede de e mina se con mé odos espec o o omé icos. Se siguió la me odología desc i a po (Puupponen-Pimiä e al., 2003). En una cube a se coloca on 3 mL de eac i o DPPH y se le adiciona on 30 μL de ex ac o. Se midió la abso bancia a iempo ce o y a los 2,5 minu os, cuando la eacción se es abilizó (Espec o o óme o UV- isible The mo Elec on Co po a ion, USA). Pa a calcula el po cen aje de DPPH se u ilizó la siguien e ecuación: % = ()  100 (1) Siendo: Abs con ol: abso bancia a iempo ce o minu os. Abs mues a: abso bancia a iempo 2,5 minu os. 9 Pa a de e mina cuan i a i amen e el g ado de inhibición del DPPH se ealizó una ec a de calib ado con T olox, exp esándose el esul ado en milimoles equi alen es de T olox po 100 g de sólidos de mo a. 3.3.3.2 Mé odo FRAP. El mé odo FRAP se basa en la educción del Fe 3+ p esen e en el compues o TPTZ (2,4,6- ipi idil-s- iazina) a Fe 2+ . La ac i idad an ioxidan e p esen e en la mues a puede elaciona se con la can idad de Fe 3+ que ha sido educido. El complejo educido posee una colo ación azul in ensa que p esen a su máxima abso ción a 593 nm. Se siguió la me odología desc i a po Benzie y S ain (1996), Pulido e al. (2000) y Thaipong e al. (2006). En una cube a de 2,5 mL se mezcla on 900 μL de eac i o FRAP con 30 μL de agua bides ilada y 30 μL de ex ac o o de blanco (disol en e de ex acción). La abso bancia se midió a 593 nm (Espec o o óme o UV- isible The mo Elec on Co po a ion, USA) as man ene la mezcla 30 minu os incubada a 37℃. El esul ado inal es a á exp esado en milimoles equi alen es de T olox po 100 g de sólidos de mo a. 3.3.3.3 Mé odo ABTS. Pa a la ealización del mé odo se siguió la me odología desc i a po Re a al. (1999), A nao e al. (2001) y Thaipong e al. (2006). Se p epa ó una disolución de ABTS 7 mM y pe sul a o de po asio 2,45 mM (1:0,5, / ), el cual se man u o en e ige ación y oscu idad du an e 12-16 ho as, el iempo necesa io pa a la o mación del adical ca iónico ABTS·+. El adical o mado es educido po las sus ancias an ioxidan es de la mues a y es a educción puede se medida po mé odos espec o o omé icos. An es de inicia la lec u a de la abso bancia, se ealizó una dilución de la solución en e anol has a ob ene un alo de abso bancia de 0,7 nm. En una cube a se adiciona on 1 mL de eac i o y 10 μL de ex ac o, leyéndose la abso bancia a 734 nm (Espec o o óme o UV- isible The mo Elec on Co po a ion, USA) a iempo ce o y a iempo 1 minu o. El esul ado inal es a á exp esado en milimoles equi alen es de T olox po 100 g de sólidos de mo a. 3.4 EFICACIA ENCAPSULANTE. La E icacia encapsulan e indica la capacidad que iene el agen e encapsulan e, en es e caso goma a ábiga, pa a encapsula las moléculas de compues os bioac i os. Según dis in os au o es que emplean la écnica de lio ilización jun o la adición de un solu o encapsulan e (goma a ábiga, mal odex ina) pa a encapsula los compues os bioac i os sensibles y los a omas, y mejo a la es abilidad de los p oduc os en pol o ob enidos (Dib Taxi e al.,2003; Righe o y Ne o, 2005 y Mu ali e al., 2014) la E icacia encapsulan e puede calcula se basándose en la can idad de bioac i o inicial en la u a an es y después de la encapsulación, según mé odo suge ido po Risch y Reineccius (1988) (ecuación 2): (/ !!) "#(/ !!) 100 (2) Donde los compues os se miden en mg del mismo po 100 g de sólidos de mo a y el esul ado se exp esa en %. 10 3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Pa a es udia las posibles di e encias signi ica i as en e las mues as se ealiza on análisis de la a ianza uni ac o iales (ANOVA), a un ni el de con ianza del 95% (p<0,05). También se ealiza on co elaciones de Pea son en e la ac i idad an ioxidan e y los compues os bioac i os. Pa a lle a a cabo dichos análisis se u ilizó el p og ama S a g aphics Cen u ion XV. 4. RESULTADOS. 4.1 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA LIOFILIZACIÓN Y DE LA ADICIÓN DE GOMA ARÁBIGA. En el p esen e apa ado se analiza á el e ec o que p oduce el p oceso de la lio ilización y la adición de goma a ábiga en el con enido de humedad, compues os bioac i os mayo i a ios y ac i idad an ioxidan e (AAO) de la mo a. 4.1.1 E ec o en el con enido de humedad. En la siguien e abla (Tabla 2) se mues an la media y la des iación es ánda , la cual se encuen a en e pa én esis, de los alo es de humedad ob enidos (x w ) en las di e en es mues as analizadas. Tabla 2. Valo es medios de con enido de agua (x w ) y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en g de agua po 100 g de mues a. Mues a x w Mo a (M) 81,65 (0,45) Mo a lio ilizada (ML) 1,53 (0,14) b Mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG) 1,12 (0,18) a a-b: Valo es con dis in a le a en supe índice p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05) en e las mues as lio ilizadas. El con enido medio de agua en la mues a de mo a (M) ue de 81,65 g po 100 g de p oduc o, alo muy pa ecido al desc i o en o os es udios de es a u a (Dimi o a e al., 2015; Im an e al., 2010). O os es udios de ca ac e ización de dis in os geno ipos de Mo us Nig a (E cisli y O han, 2007) y Mo us Alba (Bu e al., 2008) mos a on alo es de humedad meno es. Los cambios en la composición isicoquímica de la u a pueden debe se a múl iples ac o es como la di e en e a iedad, la dis in a madu ez, la di e en e zona geog á ica de p ocedencia ó el clima (E cisli y O han, 2007; Dimi o a e al., 2015). T as la lio ilización se consiguió un p oduc o en pol o con unos alo es de humedad del o den de los suge idos po o os au o es pa a alimen os lio ilizados (Fellows, 2000). Así, los con enidos medios de agua ue on 1,53 g po 100 g de p oduc o y de 1,12 g po 100 g de p oduc o pa a ML y MLG, espec i amen e. Se obse a on di e encias signi ica i as (p<0,05) en e el con enido de humedad en la mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG) y la mo a lio ilizada sin es e solu o (ML). Según un es udio de Mosque a (2010), la adición de polisacá idos de al o peso molecula como la goma a ábiga a o ece la eliminación del agua en el pos e io p oceso de lio ilización, lo que pod ía es a elacionado con un aumen o del agua 11 congelable de la mues a. Además, la adición de solu os p o oca una disminución de las p opiedades hig oscópicas de la mues a, dando mayo es abilidad a los p oduc os en pol o ob enidos y disminuyendo los enómenos de pegajosidad y apelmazamien o ípicos de es e ipo de p oduc os de u a deshid a ados (Roos, 1995). 4.1.2 E ec o en el con enido de compues os bioac i os. 4.1.2.1 E aluación del con enido en compues os enólicos. Los compues os enólicos p esen an en los ege ales, y pa icula men e en las u as, cie as p opiedades químicas que pa icipan en el sabo , colo y en sus e ec os posi i os en la salud humana (Gundogdu e al., 2011), como ya se ha comen ado en de alle en el apa ado de In oducción. En la siguien e abla (Tabla 3) se desc iben la media y la des iación es ánda , la cual se encuen a en e pa én esis, del con enido de compues os enólicos o ales de las di e en es mues as de mo a analizadas. Tabla 3. Valo es medios del con enido de compues os enólicos y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg de ácido gálico po 100 g de sólidos de mo a. Mues a Fenoles (mg ác. gálico/100 g sólidos de mo a) Mo a (M) 1792,10 (56,59) a Mo a lio ilizada (ML) 2258,31 (25,95) b Mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG) 2377,46 (23,21) c a-b-c: Valo es con dis in a le a en supe índice p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). El con enido medio de compues os enólicos en la mo a esca (M) ue de 1792,1 mg de ácido gálico po 100 g de sólidos de mo a. Dada la impo ancia de es e g upo de i oquímicos y su abundancia en es a u a, nume osos es udios han medido el con enido o al de compues os enólicos en Mo us alba y en especies semejan es (Mo us nig a y Mo us ub a), an o en las hojas como en los u os (E cisli y O han, 2007; Gundogdu e al., 2011; Iqbal e al., 2012). Es os es udios mues an no ables di e encias en cuan o a la can idad de compues os enólicos p esen es en es a u a, siendo in e io es en dis in os casos al esul ado ob enido en el p esen e es udio (E cisli y O han, 2007; Dimi o a e al., 2015) o supe io es (Im an e al., 2010; Sánchez-Salcedo e al., 2015a). La a iabilidad del con enido de compues os enólicos en los u os depende de muchos ac o es, como el g ado de madu ación du an e la cosecha, di e encias en e a iedades, p ác icas cul u ales o ac o es medioambien ales ( empe a u a, humedad, luz, e c.) du an e el desa ollo del u o (Zade nowski e al., 2005; Gundogdu e al., 2011). En cuan o a los compues os enólicos especí icos, ambién a ían según la especie de Mo us spp. Así en la mo a neg a (Mo us nig a) des aca el ácido clo ogénico, y en la mo a blanca (Mo us alba) y oja (Mo us ub a) la u ina (Gundogdu e al., 2011). O os es udios especí icos de u as del g upo de las bayas epo a on que sob e odo son el geno ipo (Scalzo e al., 2005), la localización del cul i o y la écnica de cul i o (Hakkinen y To onen, 2000) los ac o es que más a ec an al con enido en enoles o ales de la mo a. Además, el di e en e disol en e empleado y la écnica de ex acción de los compues os enólicos u ilizada ambién a ec a a la a iabilidad de los esul ados p esen ados en di e en es es udios (Ga au e al., 2007). El análisis es adís ico ANOVA en e los es ipos de mues a (M, ML y MLG) mos ó que exis e una di e encia signi ica i a (p<0,05) en el con enido de es e compues o en e las mues as (Tabla 3). El con enido medio de compues os enólicos en la mo a lio ilizada (ML: 2258,31 mg de ácido gálico po 100 g de sólidos de mo a y MLG: 2377,46 mg de ácido gálico po 100 g de sólidos de mo a) ue signi ica i amen e (p<0,05) mayo que en la u a con ol (M), 12 conc e amen e se obse ó una ganancia en enoles del 22% y del 28%, en ML y MLG, espec i amen e, espec o a M. El aumen o en compues os enólicos debido al p oceso de lio ilización ha sido obse ado en o os es udios. La lio ilización, écnica de deshid a ación que, como ya se ha comen ado, equie e la congelación p e ia de las mues as y emplea cambios de p esión pa a elimina el agua lib e de las mues as (Oe jen y Haseley, 2004), p o oca up u a en las es uc u as celula es que pueden acili a la en ada del disol en e, lo cual pe mi e una mayo ex acción de compues os enólicos. Po o a pa e, ambién se obse a on di e encias signi ica i as (p<0,05) en e el con enido de enoles o ales de la mo a lio ilizada (ML) y de la mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG). Es a di e encia puede debe se al e ec o p o ec o de la goma a ábiga añadida a la ma iz de la u a, dado que és e y o os polisacá idos ac úan como encapsulan es de los compues os enólicos. La p o ección de los compues os enólicos po la adición de goma a ábiga pe mi ió una mejo a del endimien o de dichos compues os en es udios con mues as lio ilizadas de o as u as (Youse i e al., 2011). 4.1.2.2 E aluación del con enido en ca o enoides. En gene al, las u as de la amilia de las bayas p esen an pequeñas can idades de ca o enoides (Ma ino a e al., 2007). Aunque la mo a no pueda conside a se una uen e die é ica ica de es os compues os, con iene α-ca o eno, β-ca o eno y el complejo lu eína - zeaxan ina (Heinonen e al., 1989). En la siguien e abla (Tabla 4) se desc iben la media y la des iación es ánda , la cual se encuen a en e pa én esis, del con enido de ca o enoides o ales en las di e en es mues as analizadas. Tabla 4. Valo es medios del con enido de ca o enoides y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg β-Ca o eno po 100 g de sólidos de mo a. Mues a Ca o enoides (mg β-Ca o eno/100 g sólidos de mo a) Mo a (M) 13,39 (0,01) a Mo a lio ilizada (ML) 16,2 (0,9) b Mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG) 17,2 (0,9) b a-b: Valo es con dis in a le a en supe índice p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). El con enido medio de ca o enoides en la mo a (M) ue de 13,39 mg de β-Ca o eno po 100 g de sólidos de mo a. En es e caso ambién se obse ó un aumen o signi ica i o (p<0,05) en es os compues os causado po la lio ilización. Se ob u ie on alo es de 16,25 y 17,19 mg de β- Ca o eno po 100 g de sólidos de mo a en ML y MLG, espec i amen e. En algunos ege ales, los ca o enoides se encuen an den o de cie os o gánulos celula es, y en algunos u os pueden encon a se ag upados en o mas c is alinas den o de memb anas p o eicas (Canene- Adams y E dman, 2009). Como ya se ha comen ado, la lio ilización al e a ía las es uc u as celula es p o ocando la libe ación de los ca o enoides, los cuales pod ían solubiliza se más ácilmen e en el disol en e de ex acción y aumen a el con enido de ca o enoides disponibles. Respec o a la adición de goma a ábiga, el análisis es adís ico no ha de ec ado di e encias signi ica i as (p>0,05) en cuan o a su adición o no a la mues a, pudiendo deno a que la goma a ábiga no in e acciona su icien emen e con los ca o enoides, no eje ciendo su e ec o encapsulan e y p o ec o . 13 4.1.2.3 E aluación del con enido de i amina C. En la siguien e abla (Tabla 5) se desc iben la media y la des iación es ánda , la cual se encuen a en e pa én esis, del con enido en i amina C en las di e en es mues as analizadas. Tabla 5. Valo es medios del con enido de i amina C y su co espondien e des iación es ánda (en e pa én esis), exp esados en mg de ácido ascó bico po 100 g de sólidos de mo a. Mues a Vi amina C (mg ác. ascó bico/100 g sólidos de mo a) Mo a (M) 37,18 (0,43) b Mo a lio ilizada (ML) 32,36 (0,63) a Mo a lio ilizada con goma (MLG) 33,36 (0,81) a a-b: Valo es con dis in a le a en supe índice p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). El con enido medio de ácido ascó bico o i amina C en la mo a (M) ue de 37,18 mg de ácido ascó bico po 100 g de sólidos de mo a. En compa ación con o os es udios (Im an e al., 2010; E cisli y O han, 2007, Bu e al., 2008 y Gundogdu e al., 2011), el con enido medio de ácido ascó bico de la mues a con ol (M) ue in e io , lo cual puede debe se al iempo que ha es ado la mues a en congelación (Poiana e al., 2010) o a la di e en e especie de mo a es udiada. Es ema cable que las especies de mo a de colo cla o ienen mayo con enido en i amina C que las oscu as (Gundogdu e al., 2011) como es el caso de es e es udio. Al igual que ocu e con los compues os enólicos, el con enido en i amina C de la mo a a a depende de nume osos ac o es, además de la especie y a iedad, del clima, del es ado de madu ación, de las condiciones de cul i o, como el suelo o la localización geog á ica, de las condiciones de almacenamien o, e c. (Szajdek y Bo owska, 2008). Según Poiana e al., (2010), las pé didas de ácido ascó bico du an e la congelación de dis in os ipos de bayas ue on ce canas al 20% en seis meses y has a el 40% en diez meses. Además, se sugie e que es as pé didas son debidas a la ac i idad enzimá ica del agua no congelada de las mues as, la cual puede ep esen a un 11% del agua o al a una empe a u a de -18℃. La lio ilización disminuyó signi ica i amen e (p<0,05) el con enido en i amina C, ob eniéndose alo es de 32,36 y 33,36 mg de ácido ascó bico po 100 g sólidos de mo a pa a las mues as lio ilizadas ML y MLG, espec i amen e. El ácido ascó bico es una i amina hid osoluble que se oxida en poco iempo y es muy e molábil, lo que p oduce que su con enido disminuya ápidamen e (Klimczak e al., 2007). Además ambién puede con ibui el e ec o deg ada i o del oxigeno, dada su mayo accesibilidad en la es uc u a po osa que se o ma como consecuencia de la lio ilización. Algunos es udios mues an que la deg adación de la i amina C en p oduc os ege ales lio ilizados du an e el almacenamien o es más len a que en los p oduc os en esco (Sha iu e al., 2015). Po lo que en es e sen ido, aunque la lio ilización p o oca pé didas iniciales en el con enido de i amina C, mejo a ía pos e io men e su es abilidad en los p oduc os en pol o du an e mayo iempo. Po o o lado, no pa ece que la adición de goma a ábiga, en la concen ación empleada en es e es udio, es é eje ciendo de mane a signi ica i a un papel p o ec o sob e la i amina C. 4.1.3 E aluación de la ac i idad an ioxidan e. En las Figu as 2 a 4 se p esen an los alo es medios, con sus des iaciones es ánda , de la ac i idad an ioxidan e analizada, po los es mé odos empleados, en los ex ac os en disolución de enoles o ales, ca o enoides o ales y i amina C, espec i amen e, de las mues as de mo a. Cada igu a mues a los esul ados de ac i idad an ioxidan e ag upados pa a un mismo mé odo (DPPH, FRAP y ABTS) pa a las mues as analizadas. Pues o que cada mé odo es á basado en un undamen o dis in o, no pueden compa a se esul ados en e 14 di e en es mé odos (Pé ez-Jiménez e al., 2008). El obje i o de las igu as es mos a las di e encias ocasionadas po la lio ilización y la adición de goma a ábiga, pa a cada mé odo de análisis y en cada ex ac o conc e o. 4.1.3.1 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o enólico. En la siguien e igu a se mues an los esul ados de ac i idad an ioxidan e en el ex ac o enólico pa a las mues as: mo a (M), mo a lio ilizada (ML) y mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG). Figu a 2. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado (DPPH, FRAP, ABTS) en el ex ac o enólico de las mues as de mo a, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a. a-b-c: Columnas con dis in a le a den o de un mismo mé odo p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). En la igu a supe io (Figu a 2) se ap ecian dos aspec os: p ime o, en odos los mé odos de de e minación de ac i idad an ioxidan e u ilizados, la mo a lio ilizada (ML) siemp e p esen ó alo es signi ica i amen e (p<0,05) meno es que la mo a (M) y la mues a lio ilizada con goma a ábiga (MLG). La lio ilización ocasionó pé didas en la AAO de la mues a ML del o den del 10 % pa a DPPH, 29 % pa a FRAP y 14 % pa a ABTS; en segundo luga , sal o en el mé odo de FRAP, no se p oduje on di e encias es adís icamen e signi ica i as (p>0,05) en e mues as de mo a y mo a lio ilizada con goma (M y MLG). De cualquie mane a, en es e caso se obse a on pé didas en la AAO del 20 % en MLG, in e io es a las obse adas pa a ML, lo cual e idenció el papel p o ec o de es e solu o sob e los compues os bioac i os, p opo cionando en gene al una mayo es abilidad de es os componen es du an e la lio ilización. O os abajos han llegado a conclusiones pa ecidas u ilizando solu os de al o peso molecula simila es, como la mal odex ina (Laine e al., 2008). Po o a pa e, es udios de Mon eneg o e al., (2012) han pues o de mani ies o que la goma a ábiga es capaz de apo a ac i idad an ioxidan e, mejo ando la AAO del p oduc o inal. La e olución de la AAO con el a amien o de lio ilización no siguió la misma endencia que la obse ada pa a los compues os enólicos. El di e en e compo amien o, en e los enoles b c b aa a bb b 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 DPPH FRAP ABTS mMol T olox/100 g u a seca Mé odo AAO del ex ac o enólico M ML MLG 15 o ales y la ac i idad an ioxidan e del ex ac o enólico, puede se debido a que en la ex acción con la disolución me anol:agua se pod ían habe ex aído o os compues os hid osolubles, como po ejemplo la i amina C que, como ya se ha is o, se pie de du an e el p oceso de lio ilización, con ibuyendo a la disminución obse ada de la ac i idad an ioxidan e debido a es e p oceso (Huang e al., 2005; Cas añeda e al., 2010). 4.1.3.2 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o lipo ílico. En la siguien e igu a se mues an los esul ados de ac i idad an ioxidan e en el ex ac o lipo ílico donde se cuan i ica on los ca o enoides o ales de las mues as: mo a (M), mo a lio ilizada (ML) y mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG). Figu a 3. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado en el ex ac o lipo ílico, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a. a-b-c: Columnas con dis in a le a den o de un mismo mé odo p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). En gene al, los alo es de ac i idad an ioxidan e del ex ac o lipo ílico ue on in e io es a los ob enidos en el ex ac o enólico, al y como han obse ado o os au o es (Pé ez-Jiménez e al., 2008). Es o pa ece lógico, po que ambién el con enido en enoles en la mo a ue mucho mayo que el con enido en ca o enoides. En el ex ac o lipo ílico se ep oduje on a g andes asgos las mismas endencias desc i as en el ex ac o enólico, es deci , la mo a lio ilizada (ML) p esen ó meno (p<0,05) ac i idad an ioxidan e que la mo a (M), con pé didas del 29 % pa a DPPH, 51 % pa a FRAP y 12 % pa a ABTS, y la adición de goma a ábiga (MLG) mejo ó la capacidad an ioxidan e espec o a ML. En es e caso, la e olución de la AAO con el a amien o de lio ilización no siguió la misma endencia que la obse ada pa a los ca o enoides. Con la ex acción ealizada de compues os lipo ílicos con hexano:ace ona:e anol, han podido ex ae se o os i onu ien es lipo ílicos p esen es en la mo a como la i amina E, no analizadas en es e es udio, sensibles al p ocesado y que pueden es a siendo con abilizadas al e alua la capacidad an ioxidan e de es e ex ac o (Mülle e al., 2011). Es udios de Singhal e al. (2010) mos a on que la mo a esca enía un c b a a aa b a a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 DPPH FRAP ABTS mMol T olox/100 g u a seca Mé odo AAO del ex ac o de ca o enoides M ML MLG 16 con enido en i amina E de 0,87 mg α oco e ol po 100 g de base seca, mien as que as se lio ilizada se ob u o un alo de 0,32 mg α oco e ol po 100 g de base seca. 4.1.3.3 Ac i idad an ioxidan e del ex ac o de i amina C. En la siguien e igu a se mues an los esul ados de ac i idad an ioxidan e en el ex ac o donde se cuan i icó la i amina C, empleando ácido oxálico como disol en e en las mues as: mo a (M), mo a lio ilizada (ML) y mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG). Figu a 4. Ac i idad an ioxidan e de cada mues a según el mé odo empleado en el ex ac o con ácido oxálico, en mMol de T olox po 100 g de sólidos de u a. a-b-c: Columnas con dis in a le a den o de un mismo mé odo p esen an di e encias es adís icamen e signi ica i as (p<0,05). Pa a el ex ac o de i amina C se obse ó la misma endencia obse ada en la ac i idad an ioxidan e e aluada en los ex ac os enólico y lipo ílico, espec o al e ec o ocasionado po el p oceso de lio ilización y po la adición de goma a ábiga. Además es cong uen e con el compo amien o desc i o pa a la i amina C (Figu a 4). Las pé didas de AAO de la mo a lio ilizada (ML) espec o a la mo a esca (M) ue on del 44 % en DPPH y del 40 % en ABTS. En la mo a lio ilizada con goma a ábiga (MLG) ambién se p oduje on pé didas, aunque meno es que en la mo a lio ilizada sin goma (ML), del 25 % en DPPH y del 35 % en ABTS. Sin emba go, el mé odo FRAP pa ece menos sensible pues o que no encon ó di e encias signi ica i as (p>0,05) en e la AAO de las es mues as (Figu a 4). Tampoco el mé odo ABTS encuen a di e encias en e la mo a lio ilizada (ML) y la mo a lio ilizada con goma (MLG). c a a a a bb a b 0 2 4 6 8 10 12 14 16 DPPH FRAP ABTS mMol T olox/100 g u a seca Mé odo AAO del ex ac o oxálico M ML MLG 23 ARABSHAHI-DELOUEE, S. & UROOJ, A., 2007. An ioxidan p ope ies o a ious sol en ex ac s o mulbe y (Mo us indica L.) lea es. Food Chemis y, 102: 1233-1240. ARNAO, M.B.; CANO, A; ACOSTA, M., 2001. The hyd ophilic and lipophilic con ibu ion o o al an ioxidan ac i i y. Food chemes y, 73: 239-244. ARUOMA, O. I., 1998. F ee adicals, oxida i e s ess, and an ioxidan s in human heal h and disease. 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