Biosensado de mutaciones localizadas en el oncogen KRAS en pacientes con cáncer de colón basado en la amplificación bloqueada

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Biosensado de las mu aciones en el oncogen KRAS en pacien es con cánce de colón basado en la ampli icación bloqueada TRABAJO FIN DE GRADO BIOTECNOLOGÍA ALUMNO: Ca los Sole del Valle TUTOR: Luis An onio To ajada Gena o Cu so Académico: 2015/2016 Valencia, Julio 2016 ii Da os pe sonales Da os del abajo in de g ado Resumen Palab as cla e Nomb e y apellidos: Ca los Sole del Valle Tí ulo: Biosensado de las mu aciones en el oncogen KRAS en pacien es con cánce de colón basado en la ampli icación bloqueada. Ti ulación: G ado en Bio ecnología Tu o /a (académico): Luis An onio To ajada Gena o Fecha de lec u a: Julio 2016 La p esencia de mu aciones somá icas en cie os genes se asocia a una esis encia a los a amien os con an icue pos monoclonales di igidos con a el ecep o de c ecimien o epide mal (EGFR), implicado en el desa ollo del cánce del colon. En e el 35 a 42% de los adenomas ienen una mu ación en el oncogén KRAS, siendo el análisis mu acional c í ico pa a la selección de pacien es candida os a ecibi e apias basadas en inhibido es de EGFR. Sin emba go, no odos los cen os hospi ala ios disponen de ecnologías pa a su análisis debido a su ele ado cos e y complejidad. El obje i o de es e p oyec o es con ibui en el desa ollo de mé odos de análisis mu acional basado en una ecnología de biosensado al e na i a, que p esen e unas al as p es aciones de abajo y una ácil implan ación en los labo a o ios clínicos. Se selecciona on las mu aciones en el exón 2 codón 12: c.34G>C (p.G12R), c.34G>T (p.G12C) y c.34G>A (p- G12S), debido a sus ele adas ecuencias. Se es udió el empleo de un agen e bloquean e du an e la ampli icación pa a el en iquecimien o de los alelos mu ados espec o al na i o en las mues as a analiza . Pa a la de ección de los p oduc os o mados ADN genómico p oceden es de ejidos imp egnados en pa a ina y ijados en o malina, se es udia on dos ecnologías de hib idación/de ección (placas polies i eno/lec o de placas y discos DVD/lec o DVD). El mé odo p opues o pe mi ió disminui selec i amen e la ampli icación de los alelos na i os y pe mi ió es ablece un lími e de asignación pa a clasi ica al pacien e en es udio en el g upo poblacional asociado. Las p es aciones analí icas alcanzadas mos a on el po encial del mé odo desa ollado pa a su uso en la p ác ica clínica como he amien a de apoyo en la medicina pe sonalizada. Oncogen KRAS, análisis mu acional, biosenso es, cánce de colon, ejido biopsiado iii Abs ac Key wo ds The p esence o soma ic mu a ions in ce ain genes is associa ed wi h esis ance o ea men wi h monoclonal an ibodies di ec ed agains epide mal g ow h ecep o (EGFR), in ol ed in he de elopmen o colon cance . Be ween 35-42% o adenomas ha e a mu a ion in he oncogene KRAS mu a ional analysis, being c i ical o he selec ion o pa ien s eligible o EGFR inhibi o s based he apies. Howe e , no all hospi als a e able o a o d echnologies equi ed due o i s high cos s and specializa ions. The goal o his p ojec is o con ibu e in he de elopmen o mu a ional analysis me hods based on biosensing echnologies al e na i es, which show high pe o mance and a e easy o be implemen ed in clinical labo a o ies. Mu a ions in exon 2 codon 12 we e selec ed: c.34G>C (p.G12R), c.34G>T (p.G12C) y c.34G>A (p.G12S), due o i s highe equencies. The use o a blocking eagen was s udied du ing ampli ica ion o en ichmen o he mu a ed alleles ela i e o wild- ype alleles. To de ec he p oduc o med, wo hyb ida ion/de ec ion echnologies we e s udied (polys y ene pla es/pla e de ec o and DVD disk/DVD de ec o ). The p oposed me hod achie ed o en ich mu an alleles and allowed o es ablish a disc imina ion limi o classi y pa ien s in hei popula ion g oup associa ed. The analy ical pe o mance achie ed showed he po en ial o he me hod de eloped o use in clinical p ac ice as a suppo ool in pe sonalized medicine. Oncogene KRAS, mu a ional analysis, biosenso s, colon cance , biopsy issue i Ag adecimien os En p ime luga , ag adece a Ángel Maquiei a po mi inco po ación al Depa amen o de Química, y un especial ag adecimien o pa a Luis An onio To ajada Gena o, po habe con iado en mí, habe me dado la opo unidad de desa olla un abajo de g an in e és pa a mí y, sob e odo, po su dedicación al p oyec o. Po o o lado, quisie a ag adece a odos los in eg an es del Depa amen o de Química po su amabilidad y el ambien e que han o ecido en odo momen o en el labo a o io. En conc e o, ag adece la especial a ención que ha enido E ic, g acias po ayuda me en odos los momen os que e he necesi ado y po apoya me en aquellos momen os malos. Finalmen e ag adece , cómo no, a mi amilia po la opo unidad que me han dado, po c ee siemp e en mí, po el apoyo que me han o ecido y po se una amilia ma a illosa. No acaban aquí mis ag adecimien os sin menciona al apoyo más g ande. G acias po habe me comp endido, po los sac i icios que haces po mí, pe o e es a é e e namen e ag adecido po se como e es. Sabes que sin i no hubie a conseguido nada de es o, mil g acias ca iño. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 I.I. ¿QUÉ ES EL CÁNCER COLORRECTAL?--------------------------------------------------------------------------------- 1 I.II. BIOMARCADORES EN CÁNCER COLORRECTAL ---------------------------------------------------------------------- 1 I.III. MUTACIONES EN EL GEN KRAS ------------------------------------------------------------------------------------- 2 a) Tipos y ecuencias de las mu aciones----------------------------------------------------------------------- 2 b) Implicaciones clínicas ------------------------------------------------------------------------------------------ 3 I.IV. TECNOLOGÍAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO DE KRAS ----------------------------------------------------------- 4 a) Secuenciación ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 b) HRM ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 c) SSCP/DGGE ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 5 d) SNAPsho ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 e) Digi al PCR ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 ) Mic oma ices ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 6 g) Mé odos de en iquecimien o de alelos mu an es ---------------------------------------------------------- 6 h) Compa ación de los mé odos de análisis ------------------------------------------------------------------- 8 I.VI. IMPLEMENTACIÓN EN LABORATORIOS CLÍNICOS ------------------------------------------------------------------ 9 a) Mé odos come ciales -------------------------------------------------------------------------------------------- 9 b) Mé odo al e na i o ---------------------------------------------------------------------------------------------- 10 II. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 III. MATERIALES Y MÉTODOS -------------------------------------------------------------------------------- 13 III.I. RECLUTAMIENTO DE MUESTRAS ------------------------------------------------------------------------------------ 13 III.II. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO -------------------------------------------------------------------------------- 13 III.III. AMPLIFICACIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 13 III.IV. CONDICIONES DE INMOVILIZACIÓN ------------------------------------------------------------------------------ 14 III.V. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ---------------------------------------------------------------------------------- 14 III.VI. DETECCIÓN EN PLACA --------------------------------------------------------------------------------------------- 15 III.VII. DETECCIÓN EN DVD --------------------------------------------------------------------------------------------- 15 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------------------------ 16 IV.I. OPTIMIZACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN KRAS --------------------------------------------------------- 16 IV.II. EVALUACIÓN DEL AGENTE BLOQUEANTE ------------------------------------------------------------------------ 17 a) E aluación del solapamien o --------------------------------------------------------------------------------- 17 b) E ec o de la concen ación ------------------------------------------------------------------------------------ 20 IV.III. COMPARACIÓN DE FORMATOS DE ANÁLISIS DEL GEN KRAS ------------------------------------------------- 22 IV.IV. PUESTA A PUNTO DEL ENSAYO BASADO EN HIBRIDACIÓN ----------------------------------------------------- 24 a) Condiciones de hib idación selec i a ----------------------------------------------------------------------- 24 b) P es aciones analí icas ---------------------------------------------------------------------------------------- 26 IV.V. APLICACIÓN CLÍNICA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 27 a) Análisis de mues as de pacien es --------------------------------------------------------------------------- 27 b) Compa ación con o as ecnologías ------------------------------------------------------------------------ 28 V. CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 VI. REFERENCIAS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 32 i ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1. Nue os casos de cánce en Es ados Unidos. Figu a elabo ada a pa i de los da os de ob enidos de Siegel, Mille , & Jemal, 2016. ------------------------------------------------------------------------------------ 1 Figu a 2. Esquema de ac uación de la p o eínas KRAS a a és de la señalización mediada po el ecep o del ac o de c ecimien o epide mal (EGFR) (No manno e al., 2009). P: phospha e; GRB2: g ow h ac o ecep o -bound p o ein 2; SHC: s c homology 2 domain con aining; SOS: son o se enless; GTP: guanine nucleo ide iphospha e; GDP: guanine nucleo ide diphospha e; GAPs: GTPase Ac i a ing P o ein; GNEFs: guanine nucleo ide exchange ac o . ------------------------------------------- 2 Figu a 3. Rep esen ación de las mu aciones sin sen ido ocu en es en el exón 2 posición 34 con espec o al o al de mu aciones simples (38.169) pa a 191.656 mues as es adas (da os ob enidos de COSMIC). A: adenina, A g: a ginina, C: ci osina, Cys: cis eína, Gly: glicina, Se : se ina, T: imina.3 Figu a 4. Esquema de bloqueo de la egión ex acelula de EGFR po pa e de ce uximab y pani umumab (No manno e al., 2009).----------------------------------------------------------------------------------------------- 4 Figu a 5. Esquema gene al de las es a egias de bloqueo, pe mi iendo la ampli icación selec i a de los alelos mu ados ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7 Figu a 6. Esquema del p ocedimien o de la me odología p opues a. --------------------------------------------- 11 Figu a 7. Señal de luo escencia de la ampli icación a iando la empe a u a de anillamien o (3 éplicas). ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16 Figu a 8. Señal de luo escencia de la ampli icación pa a dis in as concen aciones de los cebado es di ec o y e e so (3 éplicas). ---------------------------------------------------------------------------------------- 17 Figu a 9. Esquema del mé odo de en iquecimien o de los alelos mu an es. a) alelo na i o b) alelo mu an e (c.34G>T). E apas: 1) Ape u a del ADN molde. 2) anillamien o de cebado es y agen e bloquean e. 3) e apa de elongación du an e PCR. CD: cebado di ec o, CR: cebado e e so, AB: agen e bloquean e. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 Figu a 10. Esquema de la ampli icación median e la di e en e combinación de cebado es. 1) zona de anillamien o de cada cebado . 2) solapamien o exis en e en 2 nucleó idos en e el cebado CDi y el agen e bloquean e. 3) di e en es p oduc os de ampli icación gene ados según la combinación de cebado es (a-d). La inco po ación de agen e bloquean e impedi ía la o mación de los p oduc os c y d como consecuencia del solapamien o con el cebado CDi. CDi: cebado di ec o in e no, CDe: cebado di ec o ex e no, CRi: cebado e e so in e no, CRe: cebado e e so ex e no, n : nucleó ido. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18 Figu a 11. Señal de luo escencia de la ampli icación pa a dis in as combinaciones de cebado es, sin y con adición de agen e bloquean e (2 éplicas). ------------------------------------------------------------------ 19 Figu a 12. Gel de elec o o esis pa a dis in os p oduc os de ampli icación, con y sin adición de agen e bloquean e (100 nM). Pocillo 1: ma cado de pesos molecula es. Pocillos 2 y 3: con ol nega i o y p oduc o 175 pb. Pocillos 4, 5 y 6: con ol nega i o, p oduc o 178 pb (con bloquean e) y p oduc o 178 pb. Pocillos 7, 8 y 9: con ol nega i o, p oduc o 107 pb (con bloquean e) y p oduc o 107 pb. Pocillos 10, 11 y 12: con ol nega i o, p oduc o 124 pb (con bloquean e) y p oduc o 124 pb. Pocillos 13, 14 y 15: con ol nega i o, p oduc o 161 bp (con bloquean e) y p oduc o 161 pb. ------- 19 Figu a 13. Señal de luo escencia de la ampli icación pa a dis in as concen aciones de agen e bloquean e (5 éplicas). -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20 Figu a 14. Cocien es de la señal de luo escencia de la ampli icación de alelo mu an e espec o al alelo na i o pa a dis in as concen aciones de agen e bloquean e (2 éplicas). ---------------------------------- 21 Figu a 15. Gel de elec o o esis en aga osa pa a p oduc os de ampli icación de alelo na i o y mu an e. Pocillo 1: ma cado de pesos molecula es Pocillos 2 y 3: alelo na i o (100 nM), 4 y 5: alelo mu an e (100 nM), 6 y 7: alelo na i o (0 nM), 8 y 9: alelo mu an e (0 nM). Alelo na i o-Pacien e 1 (c.34G). Alelo mu an e-Pacien e (c.34G>T). -------------------------------------------------------------------------------- 21 Figu a 16. Fo ma os de hib idación p opues os pa a el análisis mu acional del gen KRAS. a) o ma o placa con lec u a po abso bancia. b) o ma o DVD con lec u a po e lexión. -------------------------- 23 Figu a 17. Tecnología basada en DVD desa ollada po el ins i u o de in es igación IDM. ---------------- 23 ii Figu a 18. Respues as egis adas pa a el análisis del gen COMT ( e e encia) y gen KRAS a dis in os iempos. A) pla a o ma placa. B) pla a o ma DVD (SNR: cocien e señal- uido). ----------------------- 24 Figu a 19. Cocien e de las señales co espondien es a las sondas del geno ipo na i o (c.34G) y geno ipo mu an e (c.34G>C; c.34G>A; c.34G>T). a) Di e en es concen aciones de SSC ( o mamida 5 %; 3 éplicas). b) Di e en es concen aciones de o mamida (SSC 3 X; 3 éplicas) --------------------------- 24 Figu a 20. Cocien e de las señales co espondien es a las sondas del geno ipo na i o (c.34G) y geno ipo mu an e (c.34G>C; c.34G>A; c.34G>T) pa a di e en es concen aciones de an icue po secunda io (2 éplicas). ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25 Figu a 21. Imagen cap u ada del ensayo en DVD pa a un olun a io na i o. a) Sin inco po ación de agen e bloquean e. b) Con inco po ación de agen e bloquean e (100 nM). CH: con ol de hib idación. CE: con ol endógeno. CN: con ol nega i o. --------------------------------------------------- 26 Figu a 22. Señales ob enidas pa a cada sonda as la hib idación de ex ac os de 7 pacien es na i os. Concen ación de agen e bloquean e 100 nM (3 éplicas). ---------------------------------------------------- 26 Figu a 23. Señal ob enida pa a la sonda c.34G, as la hib idación de di e en es diluciones del p oduc o de ampli icación de un indi iduo na i o (4 éplicas). ---------------------------------------------------------- 27 Figu a 24. Fac o es de disc iminación ob enidos a pa i de las mues as de los pacien es. ----------------- 28 iii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Desc ipción de las mu aciones en la p ime a base del codón 12 (da os ob enidos de COSMIC). Las ecuencias es án basadas espec o a la can idad o al de mues as de ca cinoma de colon y ec o que poseen mu ación. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Tabla 2. Compa ación de los p incipales mé odos empleados pa a el análisis de KRAS. --------------------- 8 Tabla 3. Compa ación de los p incipales mé odos de en iquecimien o de alelos mu an es. ------------------ 9 Tabla 4. Compa ación de los p incipales mé odos pa a el análisis KRAS ap obados y disponibles en Eu opa (Van K ieken e al., 2015).---------------------------------------------------------------------------------- 9 Tabla 5. Reac i os u ilizados en la eacción de ampli icación. ----------------------------------------------------- 14 Tabla 6. Sondas empleadas como eac i os pa a su inmo ilización median e es ep a idina. -------------- 14 Tabla 8. Núme o de copias ob enidas as el mé odo de en iquecimien o median e agen e bloquean e (100 nM). ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 22 Tabla 9. Es imación del iempo de análisis de la me odología p opues a. --------------------------------------- 27 Tabla 10. Compa ación de écnicas de análisis mu acional pa a el gen KRAS con la me odología p opues a. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 ix ÍNDICE DE ABREVIATURAS ADN: ácido desoxi ibonucleico. CEL I: Cele y ex ac I. Ex ac o de Cele y I. COMT: Ca ecol-O-me il ans e asa. dUTP: desoxiu idín i os a o. EGFR: epide mal g ow h ac o ecep o . Recep o del ac o de c ecimien o epide mal. EndoV: Endonuclease V. Endonucleasa V. GDP: guanosín di os a o. GTP: guanosín i os a o. KRAS: Ki s en a sa coma i al oncogene. Homólogo del oncogén i al del sa coma de la a a Ki s en. LB: loading bu e . Tampón de ca ga. Mu S: Mu a o S. Mu ado S. Mu Y: Mu a o Y. Mu ado Y. PBST: phospha e bu e ed saline wi h 0,05 % ( / ) Tween 20. Tampón os a o salino con 0,05 % ( / ) Tween 20. PCR: polyme ase chain eac ion. Reacción en cadena de la polime asa. ppm: pa es po millón. PspGI: Py ococcus sp. GI-H. SNAPsho : single nucleo ide p ime ex ension. Ex ensión del cebado de un único nucléo ido. SNR: cocien e señal- uido. SSC: saline sodium ci a e. Ci a o de sodio salino. TAQ polyme ase: The mococcus aqua icus polime asa. TBE: T is Bo a e EDTA. T is Bo a o EDTA. TDG: he mos able hymine DNA glycosylase. Timina e moes able ADN glicosilasa. TMB: 3,3’,5,5’ e ame ilbenzidina. I. In oducción 7 Figu a 5. Esquema gene al de las es a egias de bloqueo, pe mi iendo la ampli icación selec i a de los alelos mu ados El empleo de enzimas como he amien as pa a en iquece alelos mu an es ha enido una g an aplicabilidad. Un cla o ejemplo es el empleo de enzimas de es icción e moes ables que co an selec i amen e las mues as de ADN na i o du an e la PCR, mos ando una g an sencillez y bajo cos e en su aplicación así como una g an selec i idad pa a el en iquecimien o de mu aciones conocidas. La selec i idad de es as es a egias es de la de ección de un alelo mu an e en e 2,5 x 103 alelos na i os, alcanzando el o den de 108 al ealiza más de una onda de en iquecimien o. No obs an e, es as enzimas de es icción se pueden emplea bajo un en oque con a io, digi iendo selec i amen e los alelos mu an es pa a su pos e io ampli icación, aunque mues an una ecuencia de de ección in e io de alelos mu an es en un ondo de 1,6 x 106 de alelos na i os. Además del uso de enzimas de es icción, se han usado enzimas que de ec an desajus es como Mu S, Mu Y, TDG, EndoV o CEL I. La sensibilidad de es as écnicas depende mucho de la selec i idad y e iciencia de las enzimas usadas. En compa ación con las endonucleasas de es icción, la selec i idad de es e ipo de enzimas es mucho meno (MILBURY e al., 2009). La combinación de uno de es os mé odos que emplean enzimas con PCR a iempo eal, posee la capacidad de de ec a un mu an e en un ondo de 2x103 alelos na i os, pudiendo alcanza un mu an e en 103 alelos na i os (MILBURY e al., 2009). Una nue a ecnología pa a el en iquecimien o muy p ome edo a es COLD-PCR (coampli icación a baja empe a u a de desna u alización- eacción en cadena de la polime asa). Es a ecnología se basa en la obse ación de que a empe a u as p óximas a la empe a u a de desna u alización, el po cen aje de desna u alización es sensible a la secuencia exac a de ADN en la cual mu aciones pun uales gene an di e encias sus anciales. COLD-PCR pe mi e la ampli icación median e PCR de los alelos mu ados de has a 100 eces mayo al na i o. Además es una écnica de simple uso, no equie e p o ocolos ex ensos o el uso de cebado es alelo especí icos, sondas o enzimas. Po el con a io, posee a ias des en ajas: es necesa io un con ol p eciso de la empe a u a de desna u alización du an e la PCR (den o de +- 0.3ºC), es á es ingida al análisis de secuencias co as de ap oximadamen e 200 bp, es ulne able a e o es de la polime asa y la a iabilidad del en iquecimien o de la mu ación depende de su posición en el ADN y del ipo de sus i ución nucleo ídica (LI e al., 2008). Los ensayos de bloqueo alelo especí ico en PCR, han sido ampliamen e u ilizados pa a la de ección de a ian es gené icas. Un mé odo que o ece al a selec i idad se basa en el uso combinado de la polime ización ac i ada po pi o os a os (PAP) y ASA (ampli icación especí ica de alelo). PAP-ASA, u iliza oligonucléo idos alelo especí icos (P*), los cuales son ac i ados po pi o os o olisis ampli icando el ADN du an e la PCR. Es e mé odo es capaz de de ec a un alelo mu an e desde 106 a 109 alelos na i os. Sin emba go, es a es a egia no o ece los esul ados eó icos en la p ác ica, en la cual mos aba esul ados de un mu an e en 104 alelos na i o (MILBURY e al., 2009). Po o o lado, exis en écnicas que u ilizan como agen es bloquean es oligonucleó idos 3’ e minal modi icados sin ac i ación po pi o os o olisis. El I. In oducción 8 diseño de es os agen es puede coincidi con el diseño del cebado , es a egia denominada AS- NEPB-PCR (bloqueo median e cebado es no ex endibles, especí ico de alelo- eacción en cadena de la polime asa) o di e i . Bajo es a ap oximación se han alcanzado sensibilidades del 0,1 % con un 100 % de especi icidad, haciéndolo adecuado pa a la de ección de mu aciones de baja ecuencia, como las que encon amos pa a el análisis de KRAS (MILBURY e al., 2009; WANG e al., 2013). h) Compa ación de los mé odos de análisis Los mé odos empleados pa a el análisis mu acional del gen KRAS se basan en di e en es p incipios, pe o odos ellos ienen como obje i o la de ección de las mu aciones p esen es en las células umo ales que se encuen an en las mues as embebidas en pa a ina. Es os análisis deben se ápidos, con el obje i o de clasi ica al pacien e en el meno iempo posible, y ba a os pa a su implan ación en la mayo pa e de labo a o ios clínicos. Una de las ecnologías más desa olladas pa a es e análisis es la de secuenciación. Sin emba go, p esen a ele ados iempos pa a el análisis, así como equie e la p esencia de una g an can idad de alelos mu an es p esen es pa a su de ección. Es as di icul ades se pueden supe a con las ecnologías de HRM, SSCP y DGGE, las cuales pueden ob ene los esul ados en menos de 24 ho as y equie en de una meno can idad de alelos mu an es p esen es en las mues as. No obs an e, es as ecnologías no o ecen la posibilidad de analiza a ias mues as en pa alelo y equie en de la con i mación de sus esul ados median e secuenciación. La capacidad de es a di e en es mues as en pa alelo se pueden alcanza con las écnicas de digi al PCR y mic oma ices. El análisis basado en digi al PCR, aunque o ece un g an mul iplexado, equie e de e mociclado es especiales de g an cos e, mien as que los análisis basados en mic oma ices, no sólo o ecen una g an capacidad de mul iplexado, sino que pe mi en la iden i icación de la base mu ada ( abla 2). Tabla 2. Compa ación de los p incipales mé odos empleados pa a el análisis de KRAS. Técnicas de geno ipado Sensibilidad (% mu ado) Ca ac e ís icas Re e encia Mé odo Sange 15-50 Requie e mayo can idad de ADN mu ado pa a su de ección. De ec a cualquie PINTO e al., 2011; SHACKELFORD e al., 2012 Pi osecuenciación 1,25-6 Requie e equipamien o especial (pi osecuenciado ). P oblema de lec u a de homopolíme os de más de 5 nucleó idos. SHACKELFORD e al., 2012 HRM 1(3)-10 P ecisa equipamien o especí ico. Requie e expe iencia en biología molecula PINTO e al., 2011; SHACKELFORD e al., 2012 SSCP/DGGE 1 Requie e equipamien o especial. P ecisa expe iencia en HPLC. SHACKELFORD e al., 2012 SNAPsho 5 Al a p ecisión en los esul ados. Flexible a o as mu aciones. PINTO e al., 2011 Digi al PCR 0,1-10-3 Requie e uso de e mociclado es especiales. MILBURY e al., 2009 Mic oma ices <0,01 Bajo cos e. Sensibilidad adecuada pa a diagnós ico médico. Resul ados ápidos No de ec a mu aciones que no son conocidas. GALBIATI e al., 2013; MILBURY e al., 2009; SHACKELFORD e al., 2012 I. In oducción 9 Las ecnologías exis en es a an de de ec a las mu aciones p esen es a pa i de mues as embebidas en pa a ina y ijadas en o malina. Sin emba go, la baja p esencia de alelos mu an es con espec o a alelos na i os en es as mues as equie e de una al a selec i idad no alcanzada po las ecnologías ecogidas en la abla 2. Los mé odos de en iquecimien o de alelos mu an es ( abla 3), pe mi en ob ene una mayo selec i idad, de ec ando la p esencia de mu aciones en un g an ondo de alelos na i os. Tabla 3. Compa ación de los p incipales mé odos de en iquecimien o de alelos mu an es. Técnicas de geno ipado Sensibilidad (% mu ado) Ca ac e ís icas Re e encia Enzimas 4x10-4- 1,6x10-6 Sólo de ec a mu aciones que gene an luga de es icción (enzimas de es icción). Sólo de ec a mu aciones econocidas po las enzimas (enzimas que de ec an desajus es). MILBURY e al., 2009 PCR iempo eal 5x10-4 No hay ki come cial. Requie e e mociclado de iempo eal. MILBURY e al., 2009 COLD-PCR 1-0,1 Sólo de ec a mu aciones especí icas. Requie e amplia expe iencia en biología molecula . Se puede asocia con écnicas de secuenciación y pi osecuenciación. MILBURY e al., 2009 PAP-ASA 10-4 Sensibilidad eal meno que la eó ica. MILBURY e al., 2009 Agen e bloquean e sin ac i ación 0,1 Sólo de ec a mu aciones conocidas Ensayo simple. Adecuado pa a abaja en pa alelo con a ios ensayos de mu aciones. MILBURY e al., 2009; WANG e al., 2013 I.VI. Implemen ación en labo a o ios clínicos a) Mé odos come ciales La en aja de los mé odos come ciales es el p oceso de alidación a los que han sido some idos (es án egulados po la Di ec i a Eu opea 98/78/CE), po lo que no es necesa ia la ealización de p uebas adicionales de calidad. Los mé odos pa a el análisis de KRAS, que se encuen an ap obados po la Comisión Eu opea se mues an en la abla 4. Tabla 4. Compa ación de los p incipales mé odos pa a el análisis KRAS ap obados y disponibles en Eu opa (VAN KRIEKEN e al., 2015). Mé odo de diagnós ico in i o Mé odo de de ección Sensibilidad (% mu ado) CRC RAScan™ (SURVEYOR®/WAVE®) C oma og a ía 2-5 CRC RASseq™ Secuenciación Sange 5-10 The asc een® KRAS and NRAS Py o Pi osecuenciación 1-7 Agenad OncoCa a™ Espec ome ía de masas 5-10 Ligh Mix® NRAS ex2–4 KRAS ex4 HRM 1 The asc een® KRAS RGQ PCR PCR iempo eal 1-6 cobas KRAS mu a ion es PCR iempo eal 5 Randox biochip a ay Hib idación 1 INFINITI® KRAS Hib idación - KRAS S ipAssay® Hib idación 1 En e oGen® KRAS PCR iempo eal <1 Ligh Mix® KRAS codon 12/13 HRM 1 PNAClamp™ PCR iempo eal <1 RealQuali y RI-KRASMuST PCR iempo eal 1 I. In oducción 10 Los mé odos que o ecen una mayo selec i idad, po debajo del 1 % de mu ado, son En e oGen® KRAS o PNAClamp™. No obs an e, es a selec i idad es insu icien e pa a la can idad de ADN mu an e p esen e en las mues as embebidas en pa a ina. b) Mé odo al e na i o La g an mayo ía de las écnicas poseen amplias di icul ades pa a su aplicación clínica, ya sea po un lími e de de ección insu icien e pa a las mues as empleadas en la clínica o sus ele ados cos es limi an solamen e a labo a o ios de g andes hospi ales. Po o o lado, los esquemas de E aluación Ex e na de la Calidad (EQA), ecomiendan la ob ención de los esul ados del análisis de KRAS en no más de diez días labo ables (VAN KRIEKEN e al., 2013), consiguiendo que los pacien es se bene icien de la mejo es a egia de a amien o. Es os plazos no son alcanzables po algunas es a egias an e io men e plan eadas debido a los ex ensos p o ocolos empleados y la baja en abilidad de analiza pocas mues as. Exis e una cla a necesidad de desa olla es a egias que puedan o ece los esul ados en poco iempo pa a que los pacien es se puedan bene icia del a amien o más adecuado pa a cada uno de ellos. Además, es necesa io implan a que la écnica sea de ácil acceso sin necesidad de adqui i ins umen ación cos osa y de g an amaño. Po o a pa e, el análisis mu acional del gen KRAS se ealiza a pa i de mues as de ejido embebidas en pa a ina y ijadas en o malina. Es as mues as, pese a que un expe o pa ólogo secciona la egión umo al, poseen una mayo can idad de ADN pe enecien e a alelos na i os espec o a alelos mu an es. Es a mayo p esencia de alelos na i os hace que cie as écnicas ac uales den luga a alsos nega i os, po su baja sensibilidad. Po úl imo, la mayo ía de écnicas p esen an baja mul iplexidad, es deci , analizan una única mu ación po ensayo. Sin emba go, las guías ac uales obligan al análisis de a ias mu aciones, e incluso las in es igaciones ecien es ecomiendan aumen a es e núme o. Se p opone, como ecnología al e na i a, un mé odo de biosensado basado en hib idación as un en iquecimien o de los alelos mu an es median e el empleo de un agen e bloquean e ( igu a 6). Es a me odología cumpli ía odos los equisi os demandados pa a la p ác ica clínica. Consis e en ex ae el ADN de mues as de ejido biopsiadas embebidas en pa a ina y ealiza una écnica de en iquecimien o de los alelos mu an es median e el empleo de un agen e bloquean e 3’ modi icado en la ampli icación, pa a supe a el p oblema de la baja p opo ción de alelos mu an es. Una ez se aumen a la p opo ción de alelos mu an es, los p oduc os ampli icados se de ec an median e sondas de ADN, que pe mi en iden i ica odas las mu aciones posibles en un único ensayo y clasi ica al pacien e en el g upo poblacional co espondien e pa a ealiza el a amien o pe sonalizado. I. In oducción 11 Figu a 6. Esquema del p ocedimien o de la me odología p opues a. II. Obje i os 12 II. Obje i os En es e abajo in de g ado se p e ende pone a pun o una écnica pa a el análisis gené ico del gen KRAS con el obje i o de clasi ica pacien es en unción del es ado mu acional del p ime nucleó ido del exón 2, codón 12. El abajo se cen a p incipalmen e en el empleo de un agen e bloquean e de la ampli icación de los alelos na i os como mé odo de en iquecimien o de los alelos mu an es, pa a la pos e io de e minación de las mu aciones po un ensayo selec i o de hib idación. Pa a la consecución de es e obje i o p incipal se ijan los siguien es obje i os pa ciales: - Log a la ampli icación de la egión en es udio - Op imiza la secuencia y concen ación del agen e bloquean e. - Selecciona el o ma o de hib idación pa a ealiza el análisis gené ico. - Pone a pun o las condiciones que pe mi an la asignación del es ado mu acional - Analiza mues as de indi iduos olun a ios y pacien es con cánce colo ec al. III. Ma e iales y mé odos 13 III. MATERIALES Y MÉTODOS III.I. Reclu amien o de mues as La ob ención de mues as de alelos na i os se ealizó a pa i de di e en es olun a ios con su co espondien e consen imien o, como egula la decla ación de Helsinki ("Wo ld Medical Associa ion Decla a ion o Helsinki: E hical p inciples o medical esea ch in ol ing human subjec s", 2014). Mien as que las mues as de alelos mu an es se ob u ie on del hospi al La Fe a pa i de di e en es pacien es que su en de cánce colo ec al a los cuales se les ha ealizado una biopsia y se ha ijado la mues a en pa a ina. Es e es udio se ha ealizado en el con ex o del p oyec o ONCOMARKER (MINECO RTC-2015-3625-1). III.II. Ex acción de ADN genómico La ex acción de ADN a pa i de las mues as imp egnadas en pa a ina se ealizó en el hospi al median e QIAamp DNA In es iga o Ki (Qiagen), ob eniéndose la ex acción de ADN di ec amen e. Pa a lle a a cabo la ex acción de ADN de los olun a ios (alelos na i os), se empleó la se ie Pu eLink Genomic DNA ki s (In i ogen). Se p ocedió a segui el p o ocolo de ex acción de ADN a pa i de la lisis de células humanas bucales ob enidas median e hisopos. Al o is bucal se añadie on 500 L de PBS (1 X) y 20 L de P o einasa K. Pos e io men e se añadie on 20 L de RNAsa, man eniendo la solución a empe a u a ambien e du an e 2 minu os. Se añadió el mismo olumen de ampón de lisado. Es a disolución se incubó a 55 ºC du an e 20 minu os agi ando cada 5 minu os. Los es os de lisado se ecupe a on median e cen i ugación y añadiendo 500 L de e anol (96-100 %). Se añadie on 640 L del lisado ecupe ado a la columna (Pu eLink Spin Column), y se cen i ugó a 10000 xg du an e 1 minu o. Se añadie on 500 L de ampón de la ado 1 y se cen i ugó como an e io men e. Se añadie on 500 L de ampón de la ado 2 y se cen i ugó a máxima elocidad du an e 3 minu os. Finalmen e se añadie on 25-200 L de ampón de elución, se dejó incuba du an e 1 minu o y se ecupe ó el ADN po cen i ugación. Se ob u o la concen ación de ADN (ng/l), u ilizando un espec o o óme o (NANODROP 2000, The mo Scien i ic) a pa i de la abso bancia a 260 nm. III.III. Ampli icación Se ealizó la ampli icación a pa i de las mues as de ADN genómico de acue do a las condiciones desc i as en la abla 5. La eacción se ealizó en un e mociclado (UNO, VWR®) bajo las siguien es condiciones: un ciclo de desna u alización inicial de 95 ºC du an e 5 minu os, 35 ciclos de desna u alización a 95 ºC du an e 30 segundos, anillamien o a 57 ºC du an e 30 segundos y elongación a 72 ºC du an e 60 segundos, inalmen e un ciclo de ex ensión inal du an e 5 minu os. El empleo de agen e bloquean e quedó es ingido a las eacciones en las cuales se equi ió el bloqueo de la ampli icación de la mues a na i a. III. Ma e iales y mé odos 14 Tabla 5. Reac i os u ilizados en la eacción de ampli icación. Reac i os Concen ación Tampón 10 X 1 X MgCl2 50 mM 3 mM dNTPs 10 mM 200 M Digoxigenina-dUTPs 100 M 10 M Cebado di ec o 10 M 300 nM Cebado e e so10 M 300 nM Bloquean e 10 M* 100 nM Taq 1 U/L 0,5 U ADN 4 ng/L 4 ng El endimien o de la ampli icación se de e minó median e luo escencia, u ilizando el lu ó o o SYBR (in e calan e del ADN), diluyendo el p oduc o de ampli icación (1:100) en 100 L. La lec u a se ealizó median e un lec o de placas mul ipocillo (Wallac, model Vic o 1420 mul ilabel coun e , Finland). Se de e minó la p esencia de p oduc o de ampli icación deseado median e gel de aga osa (3 %). La elec o o esis se lle ó a cabo en medio ampón TBE (0,5 X), y los p oduc os de ampli icación ue on diluidos (1:2) en ampón de ca ga. El gel se e eló median e SYBR (2 X). III.IV. Condiciones de inmo ilización La inmo ilización sob e la placa de polies i eno de 96 pocillos (Co ning® 96 well pla es, Sigma-Ald ich) se ealizó median e incubación (100 L) de 0,2 ppm de es ep a idina y 20 nM de sonda, du an e 12 ho as a 37 ºC. Finalmen e, se la ó con PBST ( ampón os a o salino (PBS) 1X que con iene 0,05 % ( / ) ween 20, pH 7,4) y agua. La inmo ilización de las sondas sob e el DVD se ealizó en o ma o de mic oma iz (50 nL, 4 ilas × 7 columnas, 4 éplicas/sonda, 20 mic oma ices) median e un dispensado de bajo olumen y sin con ac o (AD-1500, Biodo , I ine, CA). Las condiciones de imp esión ( ampón ca bona o; glice ol (2 %); es ep a idina (10 ppm); sonda (100 nM)), a ia on pa a la sonda del con ol posi i o ( ampón ca bona o; glice ol (2 %); es ep a idina (5 ppm); sonda (10 nM)) pues o que gene aba una señal muy in ensa. Una ez ealizada la imp esión, el disco se dejó incubando 12 ho as (4 ºC) y se la ó con PBST y agua. III.V. Diseño de oligonucleó idos Las sondas u ilizadas como eac i os se ecogen en la abla 6, odas ellas se encuen an bio iniladas en el ex emo 3’ pa a su inmo ilización median e es ep a idina. Tabla 6. Sondas empleadas como eac i os pa a su inmo ilización median e es ep a idina. Nomb e Secuencia Mu ación Con ol hib idación BIOTINA-TG-TTTTTTTTTTGAACCTTTCGCTTCACCGGCCGATC CTTGGAAAGCGAAGTGGCCGGCTAGGTTTGTCCCTTCTCTAT-DIG - Con ol endógeno BIOTINA-TG-TTTTTTTTTTAAGACAGCCGACTGCGTGTGAT - c.34G BIOTINA-TG-TTTTTTTTTT-GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGC WT c.34G>T BIOTINA-TG-TTTTTTTTTT-AGTTGGAGCTTGTGGCGTAGG p.G12C c.34G>A BIOTINA-TG-TTTTTTTTTT-AGTTGGAGCTAGTGGCGTAGG p.G12S c.34G>C BIOTINA-TG-TTTTTTTTTT-AGTTGGAGCTCGTGGCGTAGG p.G12R Con ol nega i o BIOTINA-TG-TTTTTTTTTT-GCAGTCCCTCCATGATCACGGCCATCA - A g: a ginina; Cys: cis eína ;DIG: digoxigenina;Gly: glicina; Se : se ina; WT: na i o III. Ma e iales y mé odos 15 III.VI. De ección en placa La placa se la ó 3 eces con PBST más agua des ilada. Los p oduc os ampli icados (1 L) se mezcla on con 99 L de ampón de hib idación 5 X (SSC, 1 X ampón salino sodio ci a o: NaCl 150 mM, ci a o de sodio 15 mM, pH 7) y se calen a on a 95 ºC du an e 5 minu os pa a consegui la desna u alización en heb as monoca ena ias. Los p oduc os desna u alizados se dispensa on en cada pocillo de la placa y se incuba on du an e 45 minu os a 37 ºC. T as la incubación y el pos e io la ado median e SSC 0,1 X y SSC 0,01 X, se dispensa on 100 L po pocillo de an icue po p ima io de o eja an i-digoxigenina (Sigma-Ald ich, 1 ppm) y un an icue po de conejo an i-an icue pos de o eja acoplado a HRP (pe oxidasa de ábano) como secunda io (Sigma-Ald ich, 1,75 ppm) en PBST (1:2000) y se dejó incuba du an e 25 minu os a empe a u a ambien e. T as el consiguien e la ado median e PBST y agua des ilada, se dispensa on 100 L de la solución TMB (0,25 g L−1 de 3,3’,5,5’ e ame ilbenzidina, Sigma- Ald ich) y 0,002 M de pe óxido de hid ógeno (Scha lab, 35 %) en ampón ci a o (pH 5,5) y se incubó a empe a u a ambien e du an e 10 minu os. T as la incubación median e TMB, ue necesa io pa a la eacción añadiendo 50 L de 2,5 M ácido sul ú ico (Scha lab, 90 %). Finalmen e, la eacción se midió po abso bancia a 450 nm (longi ud de onda de e e encia: 650 nm) con un lec o de placas mul ipocillo (Wallac, model Vic o 1420 mul ilabel coun e , Finland). III.VII. De ección en DVD Se ealizó un p ime la ado median e PBST y agua, pa a elimina el exceso de es ep a idina. Se p epa a on las disoluciones (50 L) pa a cada p oduc o de ampli icación (1:10) en ampón de hib idación SSC 3 X con o mamida (Scha lab, 25 %) y Denha d ’s (Sigma-Ald ich, 2,5 X). Se incuba on a 95 ºC du an e 10 minu os y se dispensa on en las mic oma ices incubándose du an e 1 ho a a 37 ºC. A con inuación se ealizó un la ado con SSC (0,1 X) y SSC (0,01 X). Pa a el e elado se empleó un an icue po p ima io de o eja an i-digoxigenina (2 ppm) y un an icue po de conejo an i-an icue pos de o eja acoplado a HRP (pe oxidasa de ábano) como secunda io (2,5 ppm) en PBST (800 L), y se dejó incuba du an e 30 minu os a empe a u a ambien e. Se ealizó un la ado, median e PBST y agua. Se dispensa on 800 L del eac i o TMB y se pa ó la eacción median e agua anscu idos 1,5 min. La lec u a de los esul ados se ealizó median e un lec o de discos digi ales óp icos (Lab-Playe ), en modo e lexión. U ilizando el p og ama desa ollado en el g upo de in es igación, se p ocesa on las imágenes de las mic oma ices pa a ob ene las in ensidades de cada pun o co egidas espec o del ondo. IV. Resul ados y discusión 16 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.I. Op imización de la ampli icación del gen KRAS En la p ác ica clínica ac ual, las p uebas del es ado mu acional del gen KRAS se lle an a cabo a pa i de mues as de ejido imp egnadas en pa a ina y ijadas en o malina. En es as mues as, an o en su conse ación como en el p oceso de ex acción de ADN, se deg ada una g an pa e de los ácidos nucleicos que con iene, po lo que es c í ica una buena ampli icación pa a pode de ec a las mu aciones p esen es. Se usó el gen COMT (Ca ecol-O- me il ans e asa), que se encuen a exp esado cons i u i amen e, como con ol endógeno del ensayo. Se ealiza on expe imen os p elimina es en la ampli icación del gen con ol y del gen diana. Además se ensaya on dos cebado es delan e os (ex e no e in e no) y dos cebado es ase os (ex e no e in e no) pa a el gen KRAS. La sepa ación elec o o é ica de los p oduc os esul an es o igina on bandas de amaño 175 pb pa a el gen COMT y de 178, 161, 124 y 107 pb pa a las di e en es combinaciones de cebado es del gen KRAS. Con el obje i o de alcanza el mayo núme o de copias posible, se ampli icó el gen KRAS a iando la empe a u a de anillamien o ( igu a 7) y, a iando las concen aciones de ambos cebado es, an o del di ec o como del e e so ( igu a 8). Figu a 7. Señal de luo escencia de la ampli icación a iando la empe a u a de anillamien o (3 éplicas). Como se puede obse a en la igu a 8, a empe a u as supe io es a 62 ºC no exis ía ampli icación alguna. Es e e ec o se puede explica como consecuencia de la ausencia de anillamien o de los cebado es debido a que a es as empe a u as hacen e modinámicamen e ines able la hib idación. A empe a u as in e io es a 60 ºC exis ía una g an di e encia en e la ampli icación del gen diana y la eacción de ampli icación nega i a (con ol nega i o), siendo la empe a u a óp ima la de 57 ºC, dado que o ecía el endimien o máximo y bajos endimien os nega i os. IV. Resul ados y discusión 23 Figu a 16. Fo ma os de hib idación p opues os pa a el análisis mu acional del gen KRAS. a) o ma o placa con lec u a po abso bancia. b) o ma o DVD con lec u a po e lexión. La ealización de ensayos de hib idación en pla a o mas de la placa polies i eno de 96 pocillos (ampliamen e u ilizada pa a ELISA) pe mi e una de ección en ase homogénea acoplada a un lec o de placas (abso bancia a 450 nm). La supe icie bionalí ica es g ande, po que es posible inmo iliza sondas en el ondo y en las pa edes del pocillo. Respec o a la ecnología de medida, es un equipo es ánda en los labo a o ios clínicos lo que pe mi ía una implemen ación ápida en la p ác ica u ina ia. La ecnología de disco compac o DVD ( igu a 17) se basa en la inmo ilización de las sondas de ADN en el sus a o de polica bona o de los discos, pa a pos e io men e cap u a los esul ados median e un lec o de discos (Lab-Playe ) capaz de ob ene los esul ados de odo el disco a pa i de la e lexión del haz de un láse (=650 nm, NA=0,6). Es a ecnología o ece una al a po abilidad de los esul ados, ya que el de ec o Lab-Playe se puede anspo a de o ma ácil y sencilla debido a su pequeño amaño. La ecnología p esen a una g an obus ez, pudiéndose ob ene los esul ados en cualquie labo a o io, además es una ecnología muy lexible, ya que pe mi e la posibilidad de adap ación a cualquie ipo de ensayo. En compa ación con la pla a o ma de placa de polies i eno, pe mi e un mayo mul iplexado de las mues as y, más aún, o ece un g an aho o en cuan o al consumo de eac i os (1-50 nL/pun o po los 200 L/pocillo de la placa ELISA). Figu a 17. Tecnología basada en DVD desa ollada po el ins i u o de in es igación IDM. IV. Resul ados y discusión 24 Se compa a on ambos o ma os, ealizando ensayos eplicados du an e 4 semanas ( igu a 18). Sin emba go, los esul ados ob enidos en placa p esen aban una al a i ep oducibilidad (s=0,112; RSD=33,35 %), muy supe io a las p es aciones ma cadas pa a el ensayo. Es as a iaciones se a ibuye on a un p oceso de inmo ilización de la es ep a idina sob e la supe icie de polies i eno no óp imo. Los alo es egis ados pa a el o ma o de disco DVD ue on sa is ac o ios. Figu a 18. Respues as egis adas pa a el análisis del gen COMT ( e e encia) y gen KRAS a dis in os iempos. A) pla a o ma placa. B) pla a o ma DVD (SNR: cocien e señal- uido). IV.IV. Pues a a pun o del ensayo basado en hib idación a) Condiciones de hib idación selec i a La hib idación especí ica en e la sonda y el p oduc o de ampli icación iene luga bajo unas de e minadas condiciones expe imen ales. Se seleccionó ampón SSC po que p opo ciona un pH de 7 y una ue za iónica adecuada pa a la o mación de la doble heb a en e los p oduc os ampli icados desna u alizados y las sondas de ADN inmo ilizadas. No obs an e, nues o obje i o es el de di e encia en e p oduc os de ampli icación que a ían en un único nucleó ido, po lo que la hib idación selec i a de cada sonda con su p oduc o es cla e. Po ello se inco po ó o mamida a la mezcla de hib idación, ya que és a in e acciona con las heb as de ADN, acili ando que el p oduc o solamen e hib ide con la sonda o almen e complemen a ia. Con el obje i o de de e mina la condición óp ima pa a que ocu a la hib idación en e la sonda co espondien e al p oduc o ampli icado, se es udió el e ec o de la concen ación de ampón de hib idación y la concen ación de o mamida ( igu a 19). Figu a 19. Cocien e de las señales co espondien es a las sondas del geno ipo na i o (c.34G) y geno ipo mu an e (c.34G>C; c.34G>A; c.34G>T). a) Di e en es concen aciones de SSC ( o mamida 5 %; 3 éplicas). b) Di e en es concen aciones de o mamida (SSC 3 X; 3 éplicas) IV. Resul ados y discusión 25 En condiciones de baja o mamida (5 %), el p oduc o ampli icado hib idaba inespecí icamen e, independien emen e de la concen ación de SSC, o iginando cocien es en e la señal de la sonda na i a con espec o a las sondas mu an es ce canos a 1 ( igu a 19a). El análisis es adís ico (ANOVA) mos ó que no exis ían di e encias signi ica i as en e las espues as pa a las dis in as sondas: c.34G/c.34G>C (p=0,0653); c.34G/c.34G>A (p=0,0772); c.34G/c.34G>T (p=0,0727). En condiciones es ingen es de ampón (SSC 3 X), el aumen o de la concen ación de o mamida, los cocien es ue on más a o ables ( igu a 19b). Las di e encias de señales ue on signi ica i as: c.34G/c.34G>C (p=0,0001); c.34G/c.34G>A (p=0,0005); c.34G/c.34G>T (p=0,0211). La mayo di e encia en e cocien es se alcanzó pa a SSC 3 X y o mamida 15 %. La e apa de inmuno e elado de los p oduc os hib idados ue es udiada. El e elado se basa en el sis ema digoxigenina/an icue po de o eja an i-digoxigenina/an icue po de conejo an i-an icue pos de o eja acoplado a HRP (pe oxidasa de ábano)/TMB desc i o en To ajada- Gena o e al., 2012. Se e isó la concen ación de an icue po secunda io pa a minimiza una in e acción inespecí ica ( igu a 20). A una concen ación de 0,8 ppm, las señales de las sondas no complemen a ias disminuye on, siendo el cocien e de señales de 6, mejo ando las condiciones es ánda (2,5 ppm). Figu a 20. Cocien e de las señales co espondien es a las sondas del geno ipo na i o (c.34G) y geno ipo mu an e (c.34G>C; c.34G>A; c.34G>T) pa a di e en es concen aciones de an icue po secunda io (2 éplicas). Se es udió el e ec o de la p esencia del agen e bloquean e en el ensayo de hib idación, egis ando las señales pa a los p oduc os de ampli icación, con y sin p esencia de agen e bloquean e, de 7 pacien es con la a ian e na i a. Se egis a on las imágenes de las mic oma ices ( igu a 21) y se midie on las in ensidades de cada pun o ( igu a 22). Un análisis de la a ianza (ANOVA) mos ó que la inco po ación de agen e bloquean e (100 nM) en la ampli icación, disminuía la señal del alelo na i o de o ma signi ica i a siendo compa ables a las señales de las sondas no diana ( alo p=0,0100). Es os esul ados con i ma on que la inco po ación de agen e bloquean e en la ampli icación impedía la elongación del gen KRAS na i o de o ma su icien e pa a o igina una espues a nega i a en un ensayo de hib idación. IV. Resul ados y discusión 26 Figu a 21. Imagen cap u ada del ensayo en DVD pa a un olun a io na i o. a) Sin inco po ación de agen e bloquean e. b) Con inco po ación de agen e bloquean e (100 nM). CH: con ol de hib idación. CE: con ol endógeno. CN: con ol nega i o. Figu a 22. Señales ob enidas pa a cada sonda as la hib idación de ex ac os de 7 pacien es na i os. Concen ación de agen e bloquean e 100 nM (3 éplicas). b) P es aciones analí icas Se ealizó una es imación de la capacidad de de ección de la écnica de hib idación a pa i de una dilución se iada del p oduc o de ampli icación ( igu a 23). SNR po debajo de 3 se conside an como espues as nega i as, po lo que el mínimo núme o de copias que pod íamos de ec a median e es a me odología es a ía po debajo de 4,31x105. Teniendo en cuen a el núme o de copias medido a a és del endimien o de ampli icación, el ADN de alelo mu an e gene a ían señales de 19,1 (1,90x108), y el ADN de alelo na i o gene a ían un SNR po debajo de 6 (1,73x104). A pa i de es a es imación eó ica, se pod ía disc imina la p esencia de mu aciones median e es a écnica. IV. Resul ados y discusión 27 Figu a 23. Señal ob enida pa a la sonda c.34G, as la hib idación de di e en es diluciones del p oduc o de ampli icación de un indi iduo na i o (4 éplicas). Además, se es imó la ep oducibilidad de la me odología de de ección a pa i de las des iaciones de las señales ob enidas pa a un indi iduo en di e en es ensayos eplicados. La écnica demos ó una al a ep oducibilidad in a-ma iz, es deci señales en e dis in os pun os de una mic oma iz (s=0,695, RSD=3,34 %) e in a-disco, en e dis in as mic oma ices de un mismo disco (s=0,829, RSD=3,96 %). Además, la ep oducibilidad in e -disco, señales ob enidas de dis in os discos, ue adecuada (s=0,910, RSD=4,25 %). Po o o lado, se e aluó el iempo eque ido pa a cada una de las e apas del ensayo ( abla 9). El iempo o al de análisis se ía de 10 ho as, es un iempo que se encuen a holgadamen e en los lími es es ablecidos po los esquemas de E aluación Ex e na de la Calidad pa a el análisis y clasi icación de los pacien es con cánce colo ec al. Además es in e io a la mayo ía de me odologías del me cado pa a el análisis mu acional del gen KRAS, que necesi an más de 24 ho as. Tabla 8. Es imación del iempo de análisis de la me odología p opues a. P o ocolo Tiempo (minu os) Ex acción ADN 180 Ampli icación 120 Imp esión/disco 20 Inmo ilización sondas 480/60 Hib idación 180 Lec u a 20 T a ado de los da os 20 To al 1020/600 IV.V. Aplicación clínica a) Análisis de mues as de pacien es Se p ocedió a aplica el mé odo desa ollado pa a el análisis mu acional de di e en es ex ac os de ADN de pacien es na i os. Se calculó un ac o de disc iminación (Fd,i) pa a cada sonda: 𝐹𝑑.𝑖 =𝑆𝑖 ∑𝑆𝑡 Donde Si es la señal de la sonda a e alua y Ʃ S es el suma o io de odas las señales (c.34G; c.34G>T; c.34G>A; c.34G>C). IV. Resul ados y discusión 28 La Figu a 24 mues a los ac o es ob enidos pa a los pacien es. Se obse ó que la sonda na i a o iginaba ac o es en el in e alo 0,37-0,52, mien as que las sondas mu an es en el in e alo 0,23-0,13. Po lo an o, se es ableció el lími e de Fd.i > 0,3 pa a asigna a dicho pacien e en el g upo población asociado (c.34G; c.34G>T; c.34G>A; c.34G>C). Figu a 24. Fac o es de disc iminación ob enidos a pa i de las mues as de los pacien es. Demos ado el p incipio analizando un conjun o de pacien e na i os, los siguien es pasos, ue a del alcance del p esen e TFG, implica ían un análisis de un conjun o de mues as de alidación pa a la asignación de los dis in os geno ipos mu an es. b) Compa ación con o as ecnologías Con las condiciones alcanzadas del ensayo, las p es aciones ue on con as adas con las co espondien es ecnologías implemen adas en labo a o ios de in es igación y clínicos ( abla 10). Se compa a la ecnología HRM, la cual se basa en la desna u alización de la doble cadena de ADN con una de ección de en e 3-10 % de alelos mu ados, y la ecnología COBAS®, la cual se basa en PCR a iempo eal con una de ección de al ededo del 5 % de alelos mu ados. En el p ime caso se u ilizan ins umen os de qPCR de al a gama y en el segundo un ins umen o especí ico pa a es a aplicación. La ecnología COBAS® se encuen a implemen ada en el hospi al La Fe, siendo e aluada du an e una es ancia en el labo a o io de Biología Molecula . Las mayo es di e encias son el cos e y la capacidad de analiza a ios pacien es en pa alelo. Las écnica de COBAS® (cobas z 480 eal- ime PCR analyze ; al ededo de 18.000€) y de HRM (Applied Biosys ems High Resolu ion Mel Module o ViiA™, 15.000€) equie en de una ins umen ación más cos osa que el mé odo p opues o (Lab-Playe ; 300 €) y mucho más oluminosa. La capacidad de analiza un g an can idad de pacien es en pa alelo alcanzada po la ecnología de es e abajo in de g ado ( ein e pacien es/lec u a) no la alcanzan ni la me odología de HRM (un pacien e/lec u a) ni ecnología COBAS® (ocho pacien es/lec u a). Po o o lado, la écnica de HRM sólo pe mi e disce ni si la mues a posee mu ación o no, sin emba go, an o la écnica de COBAS® como el mé odo p opues o, pe mi en de ec a mu aciones en di e en es posiciones siendo muy impo an e pues o que la úl ima ac ualización (ALLEGRA e al., 2015) hace obliga o ia la comp obación del es ado mu acional de di e en es posiciones en el gen KRAS (exón 2: codón 12, codon13; exón 3: codón 59, codón 61; exón 4: codón 117, codón 146). No obs an e, el mé odo p opues o pe mi e iden i ica el cambio nucleo ídico de odas las posiciones, mien as que COBAS®, al se una ecnología muy ce ada, sólo iden i ica la mu ación en di e sas posiciones, po ejemplo, las mu ación del p ime IV. Resul ados y discusión 29 nucleó ido del exón 2 codón 12 se encuen an en la misma mix de PCR de ec ando solamen e si exis e mu ación sin iden i ica el cambio. Tabla 9. Compa ación de écnicas de análisis mu acional pa a el gen KRAS con la me odología p opues a. P opiedad Mé odo p opues o HRM COBAS® De ec o Tiempo de análisis +++ ++ +++ Cos e +++ ++ + Sencillez +++ ++ +++ Rep oducibilidad ++ +++ +++ Can idad de mues a +++ ++ +++ Selec i idad +++* ++ +++ Mul iplexicidad +++ + + In o mación mu acional +++ + + +: Acep able, ++: buena, +++: muy buena, *: es imado V. Conclusiones 31 V. CONCLUSIONES Es e abajo in de g ado ha pe mi ido es ablece la bases expe imen ales pa a desa olla un ensayo pa a analiza el es ado mu acional del p ime nucleó ido del exón 2 codón 12 del gen KRAS. Los esul ados más des acables ob enidos en es e abajo son: - La adición de un agen e bloquean e, complemen a io al alelo na i o y solapan e al cebado di ec o, en la mezcla de eacción de la PCR minimiza especí icamen e la ampli icación de los alelos na i os ( ac o bloqueo= 23900), en iqueciendo los alelos mu an es p esen es. - La pla a o ma basada en la ecnología DVD pa a el análisis mu acional del gen KRAS o ece mejo es esul ados que la pla a o ma basada en el uso de una placa de polies i eno de 96 pocillos. - Las p es aciones analí icas alcanzadas y de análisis de mues as mues an el po encial del mé odo desa ollado. F en e a las écnicas ac ualmen e come cializadas, el mé odo p opues o es una cla a al e na i a más ba a a, sencilla y e sá il que pe mi i ía su implemen ación no sólo en labo a o ios cen alizados. Aunque es necesa io a anza en el desa ollo, los esul ados son ealmen e p ome edo es pa a acili a el acceso de los a ances de la medicina pe sonaliza de mane a uni e sal. Lo que inalmen e se aduce en con ibui en la mejo a de la calidad de ida de los pacien es con cánce colo ec al. VI. Re e encias 32 VI. REFERENCIAS ALLEGRA, C., RUMBLE, R., HAMILTON, S., MANGU, P., ROACH, N., HANTEL, A., & SCHILSKY, R. (2015). Ex ended RAS Gene Mu a ion Tes ing in Me as a ic Colo ec al Ca cinoma o P edic Response o An i-Epide mal G ow h Fac o Recep o Monoclonal An ibody The apy: Ame ican Socie y o Clinical Oncology P o isional Clinical Opinion Upda e 2015. Jou nal O Clinical Oncology, 34(2), 179-185. AMADO, R. G., WOLF, M., PEETERS, M., VAN CUTSEM, E., SIENA, S., FREEMAN, D. J., ... & PATTERSON, S. D. (2008). Wild- ype KRAS is equi ed o pani umumab e icacy in pa ien s wi h me as a ic colo ec al cance . Jou nal o Clinical Oncology, 26(10), 1626-1634. AUSCH, C., BUXHOFER-AUSCH, V., OBERKANINS, C., HOLZER, B., MINAI-POUR, M., JAHN, S., ... & KRIEGSHÄUSER, G. (2009). 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