Manejo de una colección preliminar de líneas de introgresión de Solanum peruvianum en el fondo genético del tomate cultivado

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Manejo de una colección p elimina de líneas de in og esión de Solanum pe u ianum en el ondo gené ico del oma e cul i ado T abajo in de g ado en Bio ecnología Au o : An onio Calabuig Se na Tu o a: Ana Mª Pé ez de Cas o Co u o a: Mª José Te esa de Jesús Díez Niclós Cu so académico 2015-2016 València, Julio de 2016 Licencia C ea i e Commons “Reconocimien o No Come cial-Sin Ob a De i ada” Tí ulo: Manejo de una colección p elimina de líneas de in og esión de Solanum pe u ianum en el ondo gené ico del oma e cul i ado. Resumen: La en ada PI 126944 de Solanum pe u ianum esul a de in e és po p esen a esis encia dis in as plagas y en e medades. En el “Ins i u o de Conse ación y Mejo a de la Ag odi e sidad Valenciana” (COMAV) se dispone de gene aciones a anzadas desa olladas a pa i de un c uce inicial en e la en ada PI 126944 y el oma e cul i ado. En conc e o, los ma e iales más a anzados cons i uyen el e ce e oc uce hacia oma e de gene aciones pseudo-F5 desa olladas a pa i del c uce in e especí ico inicial. Po o a pa e, se han iden i icado ma cado es molecula es polimó icos ipo CAPS (Clea ed Ampli ied Polymo phic Sequences), mic osa éli es (Simple Sequence Repea , SSR) y SCARs (Sequence Cha ac e ized Ampli ied Regions) en e los pa en ales de es as gene aciones. El obje i o de es e abajo es el a ance en el desa ollo de la colección de líneas de in og esión (in og ession lines, ILs) de S. pe u ianum PI 126944 en el ondo gené ico del oma e cul i ado. Pa a ello, po una pa e, se p e endía ob ene semilla de au o ecundación de los ma e iales disponibles. Además, se a anza ía en el geno ipado de las gene aciones disponibles has a el momen o. El abajo se ealizó empleando un conjun o de plan as de gene aciones a anzadas de i adas de PI 126944. Se eno ipa on po ca ac e es ep oduc i os un o al de 263 geno ipos. Los mayo es po cen ajes de geno ipos con p esencia de lo es no males, u os cuajados y p oducción de semilla iable se obse a on en la gene ación pseudo-F5-BC3, con i mando que a medida que se ecupe a ondo gené ico del pa en al cul i ado disminuye la se e idad de las ba e as de incompa ibilidad en e ambas especies. En el geno ipado de los pa en ales de las gene aciones más a anzadas (“F4”-BC2, “F5”-BC2, “F5”-BC3 y “F6”-BC2) pa a las que se ob u o semilla de au o ecundación se obse ó el alelo de S. pe u ianum en al menos uno de los pa en ales geno ipados a excepción de algunas egiones del c omosoma 8 y la o alidad del 10, po lo que g an pa e del genoma de la especie sil es e pa ece es a ep esen ada. Los descendien es del pa en al 12.2 P1 o man pa e de la gene ación más a anzada que se dispone. Los 63 descendien es de dicho pa en al se geno ipa on con los 14 ma cado es molecula es que esul a on he e ocigo os pa a el pa en al 12.2 P1. Se obse ó una dis o sión de la seg egación a a o del alelo de oma e en dos de ellos, localizados en los c omosomas 3 y 6 espec i amen e. Las egiones de los c omosomas 8 y 9 analizadas esul a on homocigo as pa a el alelo de oma e. Po úl imo, ue on iden i icados ma cado es SNPs en e los pa en ales de la población y uno de los híb idos que pe mi i án el diseño de una pla a o ma de secuenciación masi a que acele e el a ance en el desa ollo de la colección de ILs. Palab as cla e: oma e, Solanum pe u ianum, líneas de in og esión, CAPS, SNPs Tì ol: Maneig d’un conjun p elimina de línies d’in og essió de Solanum pe u ianum en el ons genè ic de la omaca cul i ada. Resum: L’en ada PI 126944 de Solanum pe u ianum esul a d’in e és pe p esen a di e ses esis ències a plagues i malal ies. A l’ ”Ins i u de Conse ació i Millo a de l’Ag odi e si a Valenciana” es disposa de gene acions a ançades desen olupades a pa i d’un enc euamen inicial en e l’en ada PI 126944 i la omaca cul i ada. Conc e amen , els ma e ials més a ança s cons i ueixen el e ce e oenc euamen cap a la omaca de gene acions pseudo-F5 desen olupades a pa i de l’enc euamen in e especí ic inicial. D’al a banda, s’han iden i ica ma cado s molecula s polimò ics CAPS (Clea ed Ampli ied Polymo phic Sequences), mic osa éli es (Simple Sequence Repea , SSR) y SCARs (Sequence Cha ac e ized Ampli ied Regions) en e els pa en als d’es es gene acions. L’objec iu d’es e eball és l’a anç en el desen olupamen de la col·lecció de línies d’in og essió (in og ession lines, ILs) de S. Pe u ianum PI 126944 en el ons genè ic de la omaca cul i ada. A al e ec e, d’una banda es p e enia ob eni lla o d’au o ecundació dels ma e ials disponibles. D’al a banda, s’a ança ia en el geno ipa de les gene acions disponibles ins al momen . El eball es a eali za usan un conjun de plan es de gene acions a ançades de i ades de PI 126944. Es an eno ipa en base a ca àc e s ep oduc ius un o al de 263 geno ips. Els majo s pe cen a ges de geno ips amb lo s no mals, ui s qualla s i p oducció de lla o iable es an obse a en la gene ació pseudo-F5-BC3, con i man que a mesu a que es ecupe a el ons genè ic del pa en al cul i a disminueix la se e i a de les ba e es d’incompa ibili a en e ambdues espècies. En el geno ipa dels pa en als de les gene acions més a ançades (“F4”-BC2, “F5”-BC2, “F5”-BC3 y “F6”- BC2) pe a les quals es a ob ind é lla o d’au o ecundació es a obse a l’al·lel de S. pe u ianum en almenys un dels pa en als geno ipa s a excepció d’algunes egions del c omosoma 8 i la o ali a del 10, pe la qual cosa g an pa del genoma de l’espècie sil es e sembla es a ep esen ada. Els descenden s del pa en al 12.2 P1 o men pa de la gene ació més a ançada disponible. Els 63 descenden s es an geno ipa mi jançan 14 ma cado s molecula s que an esul a he e ozigo s pe al pa en al 12.2 P1. Es a obse a una dis o sió de la seg egació a a o de l’al·lel de omaca en dos d’ells, locali za s als c omosomes 3 y 6 espec i amen . Les egions dels c omosomes 8 i 9 anali zades an esul a homozigo es pe a l’al·lel de omaca. Pe úl im, an se iden i ica s ma cado s SNPs en e els pa en als de la població i un dels híb ids que pe me an el disseny d’una pla a o ma de seqüenciació massi a que accele e l’a anç en el desen olupamen de la col·lecció d’ILs. Pa aules clau: omaca, Solanum pe u ianum, línies d’in og essió, CAPS, SNPs Ti le: Managemen o a p elimina y se o in og ession lines o Solanum pe u ianum in he gene ic backg ound o cul i a ed oma o. Abs ac : The in e es o accession S. pe u ianum PI 126944 lies on i s esis ance o di e en pes s and diseases. Ad anced gene a ions de i ed om an ini ial c oss be ween PI 126944 and cul i a ed oma o a e a ailable a he “Ins i u o de Conse ación y Mejo a de la Ag odi e sidad Valenciana” (COMAV). Conc e ely, he mos ad anced plan ma e ials co espond o he hi d backc oss o oma o o pseudo-F5 gene a ions de i ed om he ini ial in e speci ic c oss. On he o he hand, CAPS (clea ed ampli ied polymo phic sequences), SSR (simple sequence epea ) and SCARs (sequence cha ac e ized ampli ied egions) ma ke s polymo phic be ween he pa en s o hese gene a ions ha e been iden i ied. The objec i e o his wo k is he ad ance in he de elopmen o he se o in og ession lines (ILs) o S. pe u ianum PI 126944 in he oma o gene ic backg ound. Fo his pu pose, seeds om sel - pollina ion o he a ailable ma e ials we e ob ained. Fu he mo e, he geno yping o he a ailable gene a ions was ca ied ou . The wo k was pe o med by using a se o plan s om he mos ad anced gene a ions de i ed om PI 126944. 263 geno ypes we e pheno yped acco ding o ep oduc i e cha ac e s. The highes pe cen ages o geno ypes exhibi ing no mal lowe s, se ui s and iable seeds we e obse ed in pseudo-F5-BC3 gene a ion, con i ming he idea ha he mo e p opo ion o oma o gene ic backg ound is acqui ed he less se e i y o incompa ibili y ba ie s be ween bo h species is shown. The pa en als o he mos ad anced gene a ions (“F4”-BC2, “F5”-BC2, “F5”-BC3 y “F6”-BC2) which p oduced iable seed we e geno yped and he S. pe u ianum allele was obse ed a leas in one pa en al, wi h he excep ion o some egions o ch omosome 8 and he en i e ch omosome 10. Consequen ly, he majo pa o he wild species genome seems o be ep esen ed. The descendan s o pa en al 12.2 P1 belong o he mos ad anced gene a ion a ailable. 63 descendan s we e geno yped wi h he 14 molecula ma ke s ha u ned ou o be he e ozygous o he 12.2 P1 pa en al. A seg ega ion dis o ion owa ds oma o allele was obse ed in wo o hem, localized in ch omosomes 3 and 6 espec i ely. Analyzed egions o ch omosomes 8 and 9 we e homozygous o oma o allele. Finally, SNPs ma ke s we e iden i ied be ween he popula ion pa en als and one o he hyb ids, which will allow he design o a massi e sequencing pla o m o accele a e he de elopmen o he ILs se . Key wo ds: oma o, Solanum pe u ianum, in og ession lines, CAPS, SNPs Au o : An onio Calabuig Se na Tu o a académica: D a. Dña. Ana Mª Pé ez de Cas o Co u o a: D a. Dña. Mª José Díez Niclós Localidad y echa: València, Julio 2016 Luga de ealización: Ins i u o Uni e si a io de Conse ación y Mejo a de la Ag odi e sidad Valenciana (COMAV) Tipo de licencia de au o ización de acceso y di usión del TFG: Licencia C ea i e Commons “Reconocimien o No Come cial-Sin ob a de i ada” G àcies a Ana i Mª José pe ha e -me dona l’opo uni a de conèixe la millo a genè ica ege al de més a p op, una ciència que cada dia m’ag ada més, i g àcies pe o a la seua ajuda i paciència en es e eball. G àcies ambé a Gabi i en especial a Pa i, pe ha e sigu una men o a i companya de labo a o i immillo able. Pe úl im, g àcies a o es les pe sones que con ibueixen a millo a la quali a de l’educació pública, g àcies a la qual sóc qui sóc. I ÍNDICE DE CONTENIDOS Página 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. TAXONOMÍA DEL TOMATE Y DE LAS ESPECIES SILVESTRES RELACIONADAS 1 1.2. RELACIONES DE CRUZABILIDAD ENTRE EL TOMATE Y LAS ESPECIES RELACIONADAS 2 1.3. SOLANUM PERUVIANUM 3 1.4. POBLACIONES DE PREMEJORA 4 1.4.1. Líneas ecombinan es consanguíneas 5 1.4.2. Re oc uces a anzados con au o ecundación 5 1.4.3. Líneas de in og esión 6 1.4.4. Poblaciones de p emejo a desa olladas con las especies sil es es elacionadas con el oma e 7 2. OBJETIVOS 10 3. MATERIALES Y MÉTODOS 11 3.1. MATERIAL VEGETAL 11 3.2. MÉTODOS 12 3.2.1. Feno ipado po ca ac e es ep oduc i os 12 3.2.1.1. Aclima ación de las plan as man enidas in i o 12 3.2.1.2. Ca ac e ización de las plan as aclima adas 12 3.2.2. Geno ipado median e ma cado es molecula es 13 3.2.2.1. Ex acción de DNA 13 3.2.2.2. Cuan i icación del DNA 14 3.2.2.3. Ma cado es molecula es 15 3.2.3. Geno ipado po secuenciación 19 3.2.3.1. Ex acción del DNA 19 3.2.3.2. Cuan i icación del DNA 19 3.2.3.3. Geno ipado 19 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20 4.1. FENOTIPADO POR CARACTERES REPRODUCTIVOS 20 4.2. GENOTIPADO 23 II ÍNDICE DE CONTENIDOS Página 4.2.1. Geno ipado de los pa en ales de las gene aciones más a anzadas 23 4.2.2. Geno ipado de los descendien es “F5”-BC3 26 4.3. GENOTIPADO POR SECUENCIACIÓN 29 5. CONCLUSIONES 31 6. BIBLIOGRAFÍA 32 7. ANEXOS 36 III ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Clasi icación de las especies sil es es elacionadas con el oma e (Pe al a e al. 2008). 2 Tabla 2. Componen es de la PCR pa a ma cado es u ilizados. 15 Tabla 3. Pe il é mico de la eacción de ampli icación pa a los ma cado es CAPS. 16 Tabla 4. Ma cado es u ilizados en el geno ipado de las plan as seleccionadas en es e abajo. Somb eados se indican los ma cado es u ilizados en el geno ipado de las plan as de la gene ación F5-BC3. 17 y 18 Tabla 5. Reac i os de la diges ión enzimá ica pa a ma cado es CAPS. 19 Tabla 6. Ca ac e ís icas ep oduc i as de las plan as e aluadas de las gene aciones más a anzadas disponibles. 20 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figu a 1. Esquema ep esen a i o del desa ollo de una población de ILs. 6 Figu a 2. Híb ido in e especí ico F1-E. Feno ipo ca ac e ís ico, con en enudos co os y hojas pequeñas. 13 Figu a 3. Ma cado “Lambda DNA/HindIII” (Fe men as). 14 Figu a 4. Flo es con desa ollo no mal en descendien es de 179 PI 4 (A). Flo es con desa ollo ano mal en descendien es de 124 C M3 (B y C). 21 Figu a 5. F u os de los descendien es del pa en al 12.2 P1. 22 Figu a 6. F u os de los descendien es del pa en al 70 P1. 23 Figu a 7. Rep esen ación g á ica del con enido del genoma de los pa en ales de las plan as con semilla de au o ecundación. En blanco ep esen adas las egiones homocigo as pa a oma e, en g is las he e ocigo as y en neg o las homocigo as pa a S. pe u ianum. El símbolo “-“ indica ausencia de da o. 24 Figu a 8. Rep esen ación g á ica del con enido del genoma de los descendien es del pa en al 12.2 P1. En blanco ep esen adas las egiones homocigo as pa a oma e y en g is las he e ocigo as. El símbolo ‘-‘ indica ausencia de da o. 28 6 sil es e en el ondo gené ico del pa en al cul i ado son más pequeños po lo que la de ección y el mapeado de QTLs esul a más e icien e (Ramsay e al., 1996; Mon o e y Tanksley, 2000). 1.4.3. Líneas de in og esión El obje i o ideal del desa ollo de un conjun o de líneas de in og esión (In og ession lines, ILs) es consegui una población cuyas líneas posean un único agmen o c omosómico del pa en al sil es e en homocigosis, es deci , que cada indi iduo con enga in og esado en el ondo gené ico del pa en al cul i ado un agmen o conc e o del genoma del pa en al donan e y dis in o al que han in og esado los demás. Es o se consigue median e e oc uces sucesi os más a anzados que en el caso de las RILs y que en el de los e oc uces a anzados con au o ecundación. Finalmen e, la au o ecundación pe mi e ija el agmen o in og esado en homocigosis (Zami , 2001) (Figu a 1). Cada una de las ILs así ob enidas cons i uye una línea casi isogénica (Nea isogenic line, NIL) con espec o al pa en al ecu en e. El la go p oceso de ob ención de es as poblaciones de p emejo a cons i uye su p incipal incon enien e. Figu a 1. Esquema ep esen a i o del desa ollo de una población de ILs. Respec o a las en ajas, las ILs pe mi en de ec a QTLs de o ma muy e icien e, ya que las di e encias obse adas en e el pa en al ecu en e y cada línea casi isogénica deben se consecuencia del agmen o de genoma del pa en al sil es e in og esado. Además, es a 7 disección del genoma del pa en al sil es e en el ondo gené ico del cul i ado pe mi e e i a in e acciones en e QTLs dis in os y, a su ez, es udia dichas in e acciones median e c uzamien os en e las dis in as ILs (Lippman e al., 2007). 1.4.4. Poblaciones de p emejo a desa olladas con las especies sil es es elacionadas con el oma e Uno de los obje i os p incipales en la mejo a del oma e es el ap o echamien o e icaz de la a iabilidad gené ica de las especies sil es es elacionadas con el oma e, es deci , la búsqueda de nue os genes que apo en ca ac e ís icas ag onómicas de in e és al oma e cul i ado. En es e sen ido, las poblaciones de p emejo a desa olladas a pa i de en adas sil es es de S. pennellii, S. pimpinelli olium y S. hab ochai es en e o as han cons i uido una he amien a de g an in e és pa a el mapeo de genes y QTLs (Foolad, 2007; Passam e al., 2007). Eshed y Zami (1995) desa olla on un conjun o de 50 ILs a pa i de la en ada de S. pennellii LA 716 que cub ían el 100% del genoma de la especie sil es e. Es a población de líneas de in og esión ha sido usada pa a mapea QTLs elacionados con di e sas ca ac e ís icas como el peso del u o (Alpe y Tanksley, 1996), el colo y la o mación de β-ca o enos (Ronen e al., 2000) o el descub imien o de la elación en e el g ado de exe ción del es igma y el g ado de au opolinización (Chen y Tanksley, 2004). Pos e io men e se han desa ollado di e en es poblaciones de sub-ILs con la inalidad de log a un mapeo más ino de los QTLs, es as han pe mi ido iden i ica has a 2795 QTLs dis in os. Además, han acili ado el es udio de cie os ca ac e es que se exp esan en la descendencia pese a no es a p esen es en los pa en ales, debido a in e acciones en e los alelos de la especie sil es e y la cul i ada (Tanksley, 1993; Lippman e al., 2007). Con es as poblaciones ambién se han lle ado a cabo es udios sob e la he e osis y la elación de la p esencia de loci supe dominan es en las líneas y su capacidad ep oduc i a (Semel e al., 2006). En el caso de S. pimpinelli olium se ha desa ollado una población de 196 líneas p o enien es de e oc uces a anzados con au o ecundación de las cuales 100 son su icien es pa a ep esen a po comple o el genoma de la especie sil es e. Median e es a nue a población ha sido posible mapea 71 nue os QTLs, 34 de ellos elacionados con la p esencia de algún alelo sil es e que a ec a a ca ac e ís icas ag onómicas de in e és como el endimien o o la o ma del u o (Doganla e al., 2002). Además, con la inalidad de acili a el mapeo de o as secuencias elacionadas con ca ac e es in e esan es en la mejo a se ha desa ollado una población de RILs que ha pe mi ido es udia esis encias a es eses bió icos y abió icos y 8 con enido en licopeno de los u os (Ash a i e al., 2009). Más ecien emen e se ha ob enido o a población de ILs a pa i de una en ada di e en e de S. pimpinelli olium que ha pe mi ido la de ección de o os QTLs elacionados con o os ca ac e es (Ba an es e al., 2014). Respec o a S. hab ochai es, se ob u o una población BC3 de más de 200 líneas que si ió pa a de ec a 121 QTLs elacionados con ca ac e es de ele ancia ag onómica. Además, se obse ó que en 25 de es os QTLs la p esencia del alelo sil es e de e minaba eno ipos a o ables pese a no es a es e ca ác e p esen e en la en ada del pa en al donan e o iginal (Be nacchi e al., 1998). También se han desa ollado poblaciones de e oc uces a anzados con au o ecundación esis en es a Cla ibac e michiganensis subsp. michiganensis a pa i de la en ada esis en e LA407 de S. hab ochai es. En es e caso se han llegado a de ec a líneas que man ienen dicha esis encia y además poseen más del 87% del ondo gené ico del oma e cul i ado, lo que las con ie e en candida as pa a su uso di ec o en p og amas de mejo a (F ancis e al., 2001). A pesa de las ba e as de c uzabilidad que p esen an o as especies sil es es más alejadas ilogené icamen e con el oma e cul i ado se han desa ollado a pa i de las mismas o as poblaciones de p emejo a. A pa i de la en ada LA2951 de S. lycope sicoides se ob u o un conjun o de 56 líneas de in og esión en el ondo gené ico de S. lycope sicum. Más a de se desa olló un subconjun o de 34 líneas con el obje i o de consegui mayo esolución en el mapeo de loci de in e és (Canady e al., 2005). En el caso conc e o de S. pe u ianum se han desa ollado poblaciones BC3 y BC4 a pa i de la en ada sil es e LA1706, aunque debido a las ba e as de incompa ibilidad exis en es las semillas ob enidas ue on escasas. No obs an e, a pesa de la dis ancia gené ica en e ambos pa en ales, el alo de ecombinación que se ob u o (muy p óximo al alo espe ado) sugi ió un al o ni el de homología en e ambos genomas (Ful on e al., 1997a; Ful on e al., 1997b). Las 241 líneas de la gene ación BC3 ue on analizadas median e 177 ma cado es molecula es del ipo RFLPs (Res ic ion F agmen Leng h Polymo phism) y o os basados en ampli icación po PCR. A pa i del geno ipado de la población ob enida se consiguió un mapa de ligamien o que cub ía el 67% del genoma del pa en al sil es e. Pa e de la acción del genoma no ep esen ado co espondía a egiones elacionadas con es e ilidad. La al a de ep esen ación de o as egiones se asoció con el limi ado amaño de la gene ación BC1 (Ful on e al., 1997a). Las 220 amilias de la gene ación BC4 ue on analizadas pa a la de ección de QTLs elacionados con 35 ca ac e es ag onómicos de in e és, inalmen e se iden i ica on 166 QTLs ligados a 29 de es os ca ac e es. Pa a algunos de los ca ac e es cuan i a i os es udiados como el con enido en 9 sólidos solubles, el peso del u o o el endimien o, al menos uno de los QTLs de ec ados p esen ó mejo as desde el pun o de is a ag onómico si el alelo sil es e es aba p esen e. Po an o, la gene ación BC4 cons i uye un ecu so impo an e pa a la mejo a del oma e cul i ado, ya que has a su ob ención únicamen e se habían in og esado en S. lycope sicum p oceden es de S. pe u ianum genes de esis encia. Además, el es udio ea i mó la idea de que los alelos sil es es en el ondo gené ico del oma e pueden con ibui a un ca ác e a o able pese a no se es e eno ípicamen e de ec able en el pa en al donan e (Ful on e al., 1997b). 10 2. Obje i os La en ada PI 126944 de Solanum pe u ianum esul a de in e és po p esen a esis encia a dis in as plagas y en e medades. En el “Ins i u o de Conse ación y Mejo a de la Ag odi e sidad Valenciana” (COMAV) se dispone de gene aciones a anzadas desa olladas a pa i de un c uce inicial en e la en ada PI 126944 y el oma e cul i ado. En conc e o, los ma e iales más a anzados cons i uyen gene aciones de segundo o e ce e oc uce hacia oma e de dis in as gene aciones “F4”, “F5” y “F6”. Po o a pa e, se han iden i icado ma cado es molecula es polimó icos de ipo CAPS (Clea ed Am li ied Polimo phic Sequence), mic osa éli es (Simple Sequence Repea , SSR) y SCARs (Sequence Cha ac e ized Ampli ied Regions) en e los pa en ales de es as gene aciones. Dada la di icul ad encon ada en la in og esión de agmen os de PI 126944 en oma e, esul a de in e és ap o echa las gene aciones disponibles pa a el desa ollo de una colección de líneas de in og esión (In og ession Lines, ILs) que ep esen en odo el genoma de es a en ada en el ondo gené ico de la especie cul i ada. En es e con ex o, el obje i o del abajo es el a ance en el desa ollo de la colección de ILs de S. pe u ianum PI 126944 en el ondo gené ico del oma e cul i ado. Los obje i os conc e os de es e abajo inal de g ado son: - Ca ac e ización eno ípica po ca ac e ís icas ep oduc i as de los ma e iales más a anzados aclima ados y cul i ados en in e nade o. - Ob ención de semilla de au o ecundación de los ma e iales é iles y au ocompa ibles. - Con i mación de la p esencia de agmen os de la especie sil es e en los ma e iales median e el geno ipado con ma cado es molecula es de ipo CAPS (Clea ed Ampli ied Polymo phic Sequence), mic osa éli es (Simple Sequence Repea , SSR) y SCARs (Sequence Cha ac e ized Ampli ied Regions) polimó icos en e oma e y S. pe u ianum. - Iden i icación median e geno ipado po secuenciación (Geno yping by Sequencing, GBS) de ma cado es SNPs (Single Nucleo ide Polymo phism) en e los pa en ales de la colección. 11 3. Ma e iales y mé odos 3.1. Ma e ial ege al En abajos an e io es del g upo se desa olla on es híb idos a pa i del c uzamien o en e la línea NE-1 de S. lycope sicum y la en ada de S. pe u ianum PI 126944. Dichos híb idos, F1-B, F1-E y F1-A, ue on ob enidos a pa i del cul i o de semillas inmadu as y esul a on se au oincompa ibles (Picó e al., 2002). Pos e io men e, se ob u ie on nue as gene aciones median e es e oc uces sucesi os hacia la línea Fo una C (FC) de S. lycope sicum. En los e oc uces BC1 y BC2 ue necesa io el esca e de emb iones pa a ob ene la p ogenie mien as que en el e ce e oc uce BC3 se consiguió semilla iable sin ecu i a es a écnica. El núme o de plan as ob enidas a pa i de cada e oc uce ue bas an e educido po lo que la p obabilidad de ob ene el genoma de S. pe u ianum o almen e ep esen ado en los ma e iales ob enidos e a baja, po ello se lle a on a cabo c uzamien os adicionales. Pues o que los híb idos F1-B, F1-E y F1-A e an au oincompa ibles no ue posible ob ene la gene ación F2 de dichos indi iduos median e au o ecundación. En su luga , se c uza on los híb idos F1-B y F1-E pa a desa olla una pseudo-F2 (“F2”), es deci , una gene ación F2 que no p ocede de la au o ecundación de los indi iduos F1 si no del c uce en e indi iduos di e en es de la F1. Pues o que las gene aciones ob enidas seguían mos ando au oincompa ibilidad se siguió es e mismo esquema de c uzamien os has a ob ene la gene ación pseudo-F6 (“F6”). Además, median e la écnica de esca e de emb iones se consiguie on desa olla gene aciones “F3”-BC2 y “F2”-BC1 e oc uzando pseudo-F3 y pseudo-F2 hacia FC (Picó e al., 2002; Pé ez de Cas o e al., 2008; Julián e al., 2013). Pos e io men e, median e la écnica de cul i o de semillas inmadu as, el g upo ha ob enido las gene aciones “F4”-BC1, “F5”-BC1, “F5”-BC2 y “F6”-BC1, así como el siguien e e oc uce de odas ellas hacia oma e cul i ado. Un conjun o de plan as pe enecien es a las gene aciones más a anzadas han sido las empleadas en el p esen e abajo. En conc e o, los ma e iales u ilizados se desc iben a con inuación. En p ime luga , del conjun o de plan as de las gene aciones más a anzadas, ue posible aclima a en in e nade o un o al de 291 plan as, habiéndose podido eno ipa po ca ac e es ep oduc i os 263 de ellas (Tabla 6). En cuan o a las plan as seleccionadas pa a su geno ipado median e ma cado es molecula es, se a a, en p ime luga , de 21 de los pa en ales empleados pa a la ob ención de las gene aciones más a anzadas. En conc e o se selecciona on aquellos pa en ales de los que de i aban ma e iales a pa i de los cuales se ob u ie on descendien es que die on luga a 12 u os con semillas iables (apa ado 4.2.1.). Además, se geno ipa on los descendien es ob enidos a pa i del c uce del oma e cul i ado (FC) como pa en al emenino con el pa en al masculino 12.2 P1, pe enecien e a la gene ación “F5”-BC2. Po úl imo, pa a el geno ipado po secuenciación se u iliza on seis mues as: dos de PI 126944, dos de FC, una de NE-1 y una del híb ido F1-A. Excep o pa a el caso del híb ido, las mues as p ocedían de una mezcla de ex acción de DNA de cinco plan as de cada uno de los geno ipos co espondien es. 3.2. Mé odos 3.2.1. Feno ipado po ca ac e es ep oduc i os 3.2.1.1. Aclima ación de las plan as man enidas in i o Las plan as disponibles p oceden es del esca e de semillas inmadu as de ensayos an e io es (apa ado 3.1) se man u ie on en cul i o in i o en bo es con eniendo medio base 4,414 g/L de sales de Mu ashige y Skoog (MS) + Vi aminas Gambo g B5; 20 g/L de saca osa; 0,8% de aga y el pH ajus ado a 5,7. Las plan as se subcul i a on a medio esco a medida que se desa ollaban. En el momen o en el que se disponía de cua o copias de una plan a, se seleccionó una de las mismas pa a se aclima ada y ans e ida a in e nade o. Pa a ello, se ex ajo la plan a, limpiando la aíz con obje o de elimina los es os de medio de cul i o, pa a a con inuación ans e i la a mace a pequeña (7x7x8 cm) con sus a o. Las plan as se man u ie on du an e una semana cubie as con un aso de plás ico en cáma a de cul i o con condiciones de luz y empe a u a con olada (24-26oC con luz luo escen e, 50 μmol o ones/m2s, du an e 16 h al día). T ascu ido es e iempo, las plan as ue on ans e idas a mace a de 20 L en in e nade o, con condiciones de luz y empe a u a con oladas. 3.2.1.2. Ca ac e ización de las plan as aclima adas Una ez las plan as aclima adas comenza on a desa olla se en el in e nade o, se lle ó a cabo la ca ac e ización de las mismas po ca ac e es ep oduc i os. Se ealiza on con oles semanales ano ando de cada plan a: la p esencia de lo es no males, la p esencia de lo es ano males (pequeñas, con in lo escencias abo adas, con escaso desa ollo de las an e as) y el cuajado de u os. Algunas de las plan as p esen a on un eno ipo ca ac e ís ico, consis en e en en enudos co os y hojas muy pequeñas, lo que daba a la plan a un aspec o achapa ado. Es e eno ipo es el que p esen ó el híb ido in e especí ico F1-E, uno de los que de i an los ma e iales empleados en es e abajo (Figu a 2). 13 Figu a 2. Híb ido in e especí ico F1-E. Feno ipo ca ac e ís ico, con en enudos co os y hojas pequeñas. En aquellos casos en los que se ob u ie on u os cuajados, se ecolec a on de las plan as y se ex aje on las semillas de aquellos que con enían semillas iables. 3.2.2. Geno ipado median e ma cado es molecula es El geno ipado de las plan as se lle ó a cabo median e es ipos de ma cado es molecula es: CAPS (Clea ed Am li ied Polimo phic Sequence), mic osa éli es (Simple Sequence Repea , SSR) y SCARs (Sequence Cha ac e ized Ampli ied Regions). El polimo ismo en es os ma cado es pa a las en adas FC de S. lycope sicum y PI 126944 de S. pe u ianum ue comp obado an e io men e (Julián e al., 2013). A con inuación se desc ibe el p oceso seguido pa a el geno ipado de las plan as. 3.2.2.1. Ex acción de DNA El DNA se ex ajo a pa i de hojas jó enes siguiendo el p o ocolo de Doyle y Doyle (1990) con algunas modi icaciones: 1- Recoge 75 mg de ma e ial ege al en un mic o ubo de 1.5 ml. 2- In oduci los ubos en ni ógeno líquido. 3- T i u a el ma e ial ege al con un mo e o de plás ico. 4- Añadi 500 μl de ampón de ex acción CTAB (Anexo I). Mezcla el con enido del ubo median e agi ación. 5- Incuba el ubo a 65oC du an e 30 minu os. 6- Añadi 450 μl de clo o o mo-isoamílico (24:1). Agi a la mezcla has a ob ene una emulsión e dosa. 14 7- Cen i uga du an e 10 minu os a 15.700 xg. 8- Recupe a la ase acuosa con eniendo el DNA (400 μl ap oximadamen e) y ans e i a un ubo nue o. 9- Añadi un olumen de isop opanol ío. 10- Man ene 5 minu os en hielo. 11- Cen i uga 10 minu os a 15.700 xg. 12- Elimina el sob enadan e y añadi 100 μl de e anol al 70% pa a la a el p ecipi ado. 13- Cen i uga du an e 5 minu os a 15.700 xg. Elimina el e anol y deja seca el p ecipi ado 5 minu os. 14- Resuspende el p ecipi ado en 50 μl de ampón TE (Anexo I) al que se ha añadido RNasa y conse a a -20o C. 3.2.2.2. Cuan i icación del DNA Con la inalidad de comp oba la in eg idad del DNA se cuan i ica on las mues as ex aídas median e elec o o esis en gel de aga osa al 1% en ampón TBE (Anexo II). Pa a ello se ca gó 1 μl de ex acción en 9 μl de agua y 2 μl de ampón LB 6X (Anexo II). El ol aje aplicado pa a la sepa ación ue de 143 V en cube a de elec o o esis TBE 1X. La cuan i icación del DNA se lle ó a cabo usando el ma cado “Lambda DNA/HindIII” (Figu a 3). Figu a 3. Ma cado “Lambda DNA/HindIII” (Fe men as). 15 La disolución ca gada en el gel es aba compues a po 0,5 μl de ma cado , 9,5 μl de agua milliQ y 2 μl de ampón LB 6X. El gel se iñó du an e 20 minu os en una disolución de b omu o de e idio a una concen ación de 0,5 μg/ml. 3.2.2.3. Ma cado es molecula es Pa a el geno ipado de las plan as se u iliza on es ipos de ma cado es molecula es. Los ma cado es CAPS o secuencias polimó icas ampli icadas y co adas se basan en el uso de enzimas de es icción pa a la diges ión de una secuencia conc e a p e iamen e ampli icada median e PCR. El polimo ismo en dicha secuencia es gene ado en el caso de que es é p esen e o no el si io de es icción pa a la enzima u ilizada. Po o o lado, los ma cado es SCARs son egiones ampli icadas de una secuencia ca ac e izada median e cebado es especí icos. El polimo ismo se basa en las di e encias de longi ud de las secuencias ampli icadas. Po úl imo, los ma cado es SSR son secuencias co as de nucleó idos (en e 2 y 6 pb) que se epi en en ándem. El polimo ismo no se gene a debido al amaño de dicha secuencia si no al dis in o núme o de epe iciones de la misma. Po an o, el geno ipado cons ó de una eacción de ampli icación po PCR y en el caso de los CAPS, de la pos e io diges ión del p oduc o de PCR con la enzima de es icción que e elaba el polimo ismo. Finalmen e se sepa ó el p oduc o de la PCR o de la diges ión (según el caso) median e elec o o esis en gel de aga osa. PCR La eacción de PCR pa a los ma cado es se lle ó a cabo en un olumen o al de 25 µl (Tabla 2). Tabla 2. Componen es de la PCR pa a ma cado es u ilizados. Reac i o Concen aciones del s ock Volumen (µl) Concen ación inal Agua Milli-Q - 17,34 - Tampón 10X 2,5 1X MgCl225 mM 1 1 mM Desoxinucleó idos i os a o (dNTPs) 10 mM 1 0,4 mM Cebado di ec o 10 µM 1 0,4 mM Cebado e e so 10 µM 1 0,4 mM Taq polime asa 5 U/µl 0,16 0,8 U/25 µl DNA molde 40-100 ng/µl 1 40-100 ng/25 µl 22 Tan o en el caso del po cen aje de plan as con u os cuajados como en el de plan as con semilla iable los alo es más ele ados se ob u ie on en la gene ación pseudo-F5-BC3. Ap oximadamen e un 65% de la plan as de es a gene ación mos ó u os cuajados y el 27% desa olló semillas, lo que supone que al ededo del 40% de los geno ipos de es a gene ación en los que se ob u ie on u os p oduje on semillas. Los alo es in e io es en cuan o a cuajado y p oducción de semillas que se ob u ie on en las gene aciones menos a anzadas con i ma el hecho de que la se e idad de las ba e as de incompa ibilidad en e ambas especies disminuye a medida que se ecupe a el ondo gené ico del pa en al cul i ado. El meno po cen aje de plan as con el eno ipo E ob enido ue del 23% en la gene ación pseudo-F5-BC3, seguida de la gene ación pseudo-F4-BC2 con ap oximadamen e un 42%. Resul a ambién lógico que la educción en el po cen aje del genoma de S. pe u ianum eduzca la p obabilidad de que se p esen en las ca ac e ís icas asociadas a es e eno ipo. Como ya se ha comen ado, exis e g an a iabilidad en e los di e en es geno ipos de una misma gene ación debido en pa e a las di e encias en e el núme o de plan as e aluadas, no obs an e cabe des aca las di e encias exis en es en e los po cen ajes ob enidos en los dos geno ipos que con o man la gene ación pseudo-F5-BC3 (Tabla 6). Como ejemplo, en el caso de las plan as ob enidas a pa i del pa en al 70 P1 al ededo de un 91% desa olla on lo es no males mien as que de las ob enidas a pa i del pa en al 12.2 P1 lo hicie on ap oximadamen e un 60%. Es a endencia de mayo simili ud con el pa en al cul i ado de las plan as p oceden es del pa en al 70 P1 se man u o pa a odas las ca ac e ís icas e aluadas (Figu as 5 y 6). Es as di e encias en e las descendencias de ambos pa en ales pod ían debe se al hecho de que el pa en al 70 P1 p ocedie a de una au o ecundación acciden al de FC y no de un e oc uce al y como e a espe able. Sin emba go, la p esencia de un po cen aje de plan as con lo es ano males o con eno ipo E pa ece suge i que en es os ma e iales exis e genoma de S. pe u ianum. En es e sen ido se ía necesa io el análisis con una ele ada densidad de ma cado es a ni el de geno ipo del pa en al 70 P1 pa a de e mina si ha exis ido un posible e o expe imen al y es a plan a p ocede de au o ecundación. Figu a 5. F u os de los descendien es del pa en al 12.2 P1. 23 Figu a 6. F u os de los descendien es del pa en al 70 P1. La p esencia de de e minados agmen os del genoma del pa en al de S. pe u ianum debe es a condicionando la es e ilidad a dis in os ni eles en algunos de los geno ipos e aluados. De hecho, las p ime as poblaciones desa olladas a pa i de S. pe u ianum, cub ían únicamen e el 67% del genoma de es a especie, debido en pa e a que las egiones asociadas a au oincompa ibilidad, c ecimien o de e minado y es e ilidad del híb ido no pudie on es a ep esen adas (Ful on e al., 1997a). En abajos an e io es desa ollados po el g upo se ha con i mado que en las gene aciones de las que de i an los ma e iales aquí empleados es á p ác icamen e ep esen ada la o alidad del genoma de la especie sil es e (Julián e al., 2013). El geno ipado de los pa en ales de los que de i an las plan as de las que se ha ob enido descendencia po au o ecundación ha pe mi ido de e mina si alguna de las egiones no se encuen a ep esen ada en los ma e iales más a anzados ( e apa ado 4.2). 4.2. Geno ipado 4.2.1. Geno ipado de los pa en ales de las gene aciones más a anzadas En los abajos an e io es lle ados a cabo po el g upo de in es igación se iden i icó un conjun o de 105 ma cado es polimó icos en e oma e y PI 126944 (Julián e al., 2013). De es os ma cado es, 15 e an CAPS o SCARs, mien as que los 90 es an es e an SSRs. Algunos de los SSRs enían amaños de los alelos en ambos pa en ales que pe mi ían su disc iminación en aga osa. Po simplicidad en su de ección, es os SSRs, además de los CAPS y SCARs, son los que se emplean de o ma u ina ia en el labo a o io pa a el geno ipado de las gene aciones más a anzadas. Po o a pa e, ap o echando que se disponía de ma cado es CAPS y SCARs polimó icos en e oma e y S. lycope sicoides, y que muchos de es os ma cado es habían sido desc i os como polimó icos en e oma e y a ias especies de Solanáceas (Pei ó e al., 2015), se comp obó que un po cen aje ele ado de los mismos e an ambién polimó icos en e oma e y S. pe u ianum (da os no publicados). Todos es os ma cado es son los que se han empleado en el geno ipado de las gene aciones más a anzadas. En conc e o, se decidió 24 geno ipa los pa en ales de las gene aciones “F4”-BC2, “F5”-BC2, “F5”-BC3 y “F6”-BC2 a pa i de cuyos hijos se había ob enido semilla de au o ecundación (Tabla 6, Figu a 7). Figu a 7. Rep esen ación g á ica del con enido del genoma de los pa en ales de las plan as con semilla de au o ecundación. En blanco ep esen adas las egiones homocigo as pa a oma e, en g is las he e ocigo as y en neg o las homocigo as pa a S. pe u ianum. El símbolo “-“ indica ausencia de da o. Ma cado 304 M2 PLANTA 1 381 M3 46 A SSR92 - - - - - - - - - - - SSR1/18,5 - - - - - - - - - SSR75 - - - - - - - - - TG460 - SSR222 - - - - - - - - - SSR156 - - - - - - - - - CT190 - - - TG608 - - SSR356 - C2_A 4g04955 TAHINA-2-139,5b - - C2_A 3g26900 - - - - - - - - - SSR3/0 - C2_A 1g28530 SSR111 - - - - - - - - - C2_A 5g62390 - C2_A 5g08050 SSR601 - - - - - - - - - - - - - - - - SSR310 - - - - - - - - - SSR43 - C2_A 3g17040 - SSR306 - - - - - - - - - CT188 SSR146 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSR293 - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSR188 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSR5/0 - SSR325 - SSR115 - - - - - - - - - - - - - - - - SSR5/44 - - - - - - - - - - - - - - - SSR162 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C2-9 SSR48 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSR128 - - - - - - - - - - - - C2_A 1g21640 - - TAHINA-6-69 - SSR350 - - - - - - - - - - - - - - SSR241 - - - - - - - - - - SSR286 - - - - - SSR304 - - - - - - - - - - - - C2_A 1g02180 - - - - - - - - - - - - - - CD40 - - SSR15 - - - - - - - - - - - - - - - SSR8/30 - - - - - SSR63 - TG510 - - - - - - - - - - - - - - - - TAHINA-8-71b - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSRB105694 - TG254 TG18 - SSR73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C2_A 1g07310 TAHINA-9-90 SSR599 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TG230 - - - TG303 - - - - - - SSR248 - - - - - - - - - - - - - - - C2A 3g08760 - SSR80 - - - - - - - - - - - - - - - - C2_A 5g16630 - - SSR76 - - - - - - - - - - - - - SSR46 -- - - C2_A 2g28490 -- TAHINA-12-39 - g394 CT99 - c 239 - SSR345 - - - - - - - - - - - - - - SSR12/97c - - - C2_A 5g21170 - C omosoma 10 C omosoma 11 C omosoma 12 C omosoma 2 C omosoma 3 C omosoma 4 C omosoma 5 C omosoma 6 C omosoma 7 C omosoma 8 C omosoma 9 C omosoma 1 265 M2 231 C M2 PLANTA 1 272 M2 70 P1 179 PI-4 265 M2 45A M2 102 A M2 124 C M2 215 C M3P L1 230 C M2 240 M3 124 C M3 292 C M2 PLANTA 1 369 M2 385 M3 97 M2 12.2 P1 25 Todas las plan as analizadas excep o la 179 PI-4 co espondían a un e oc uce hacia oma e, de o ma que pa a odas las egiones analizadas el geno ipo pod ía se bien homocigo o pa a el alelo de oma e bien he e ocigo o. En el caso del geno ipo 179 PI-4 ambién se de ec a on egiones homocigo as pa a el alelo de S. pe u ianum. Pa a odos los ma cado es analizados al menos una de las plan as p esen ó el alelo de S. pe u ianum, excep o pa a la egión inal del c omosoma 8 y la o alidad del c omosoma 10. En cualquie caso, po la cobe u a del genoma que p opo ciona el conjun o de ma cado es empleado, hay cie as egiones pa a las que no se dispone de in o mación (Figu a 7). En los abajos an e io es del g upo de in es igación se habían geno ipado dis in as plan as de las gene aciones “F4” y “F5” de las que de i an los ma e iales empleados en es e abajo (Julián e al., 2013). En el conjun o de las plan as “F4” analizadas es u o ep esen ada la p ác ica o alidad del genoma de S. pe u ianum, con la excepción de la egión dis al del c omosoma 8. En cuan o a las plan as “F5”, con enían en conjun o odo el genoma de la especie sil es e, con la excepción de un agmen o del c omosoma 8 y o o del c omosoma 9. E a po an o de espe a que en el conjun o de plan as de las gene aciones “F4”-BC1, “F5”-BC1 apa eciese p ác icamen e ep esen ado el genoma de S. pe u ianum. En abajos an e io es ealizados po el g upo se geno ipa on las gene aciones p e ias a las empleadas en es e abajo (“F4”, “F5” y “F6”) u ilizando al ededo de 64 ma cado es (da os no mos ados). En es as gene aciones, se comp obó que se p oducía an o una disminución de la acción del genoma in og esada como una educción en el amaño de los agmen os de S. pe u ianum in og esados a medida que se lle aban a cabo gene aciones de e oc uzamien o (Julián e al. 2013). Es a educción se con i mó ambién en las nue as gene aciones ob enidas en es e abajo. Como ejemplo, el pa en al 12.2 P1 de i a de la plan a 215 C M3 pl. 1, y pa a pa e de los c omosomas se obse ó que los agmen os in og esados en 12.2 P1 se habían educido como consecuencia de la ecombinación (Figu a 7). O os au o es han ob enido esul ados simila es as gene aciones de e oc uzamien o o au o ecundación en poblaciones de i adas de dis in as especies sil es es elacionadas con el oma e (Eshed e al., 1992; Tanksley e al., 1996; Ful on e al., 1997a). Es a educción en el amaño de los agmen os indica que es posible in og esa de o ma e icien e el genoma de S. pe u ianum en el ondo gené ico de S. lycope sicum pa a la cons ucción de la población de ILs, a pesa de la dis ancia gené ica en e ambas especies. Se dispone de in o mación ace ca del geno ipo del pa en al 70 P1 pa a 42 ma cado es. Has a el momen o no se ha iden i icado el alelo de S. pe u ianum pa a ninguno de ellos. Es a plan a es un descendien e del e oc uce hacia oma e de la plan a 102 A M2, ambién geno ipada en 26 es e abajo (Figu a 7). Conside ando la p opo ción del genoma de S. pe u ianum que conse a la plan a 102 A M2, esul a muy poco p obable que un descendien e suyo po e oc uzamien o haya pe dido odos los agmen os de la especie sil es e. Po an o, es posible que 70 P1 p oceda en ealidad de una au o ecundación acciden al de FC y no de un e oc uce. Sin emba go, al y como se ha comen ado p e iamen e (apa ado 4.1.) algunos de los descendien es p oceden es de 70 P1 p esen an ca ac e ís icas p opias de S. pe u ianum. Además, po el p ocedimien o empleado pa a ealiza las polinizaciones, no esul a ácil que se p oduzcan au o ecundaciones acciden ales. Dado que 70 P1 no ha sido oda ía geno ipada con odos los ma cado es disponibles, pod ía encon a se alguna egión de S. pe u ianum ep esen ada que con i mase que se a a de un e oc uce. 4.2.2. Geno ipado de los descendien es “F5”-BC3 Las gene aciones más a anzadas de las que se dispone has a el momen o son las plan as “F5”- BC3, es deci , los descendien es de los pa en ales 12.2 P1 y 70 P1. Dado que se ha comp obado que la incompa ibilidad se a educiendo a medida que se inc emen a el núme o de e oc uces, se ía de in e és pode a anza en el desa ollo de las líneas de in og esión con es os ma e iales más a anzados. Es o pe mi i ía e i a la necesidad de ecu i al esca e de emb iones o el cul i o de semillas inmadu as pa a ob ene los sucesi os e oc uces. Con obje o de de e mina la acción del genoma de S. pe u ianum ep esen ada en es os ma e iales más a anzados, se decidió geno ipa los descendien es del pa en al 12.2 P1. Como se ha comen ado p e iamen e (apa ado 4.2.1., Figu a 7), en el caso del pa en al 70 P1 no se han iden i icado in og esiones de la especie sil es e, de o ma que po el momen o no se han geno ipado sus descendien es. Po lo an o, se han geno ipado los 63 descendien es disponibles del pa en al 12.2 P1. El pa en al 12.2 P1 había sido geno ipado con 39 ma cado es, si bien es os no se encon aban igualmen e dis ibuidos a lo la go de los 12 c omosomas (Figu a 7). Como ejemplo, no se disponía de in o mación pa a ningún ma cado del c omosoma 7, mien as que en el c omosoma 12 se habían u ilizado 6 ma cado es. Pa a 25 de los ma cado es, 12.2 P1 esul ó homocigo o pa a el alelo de oma e, de o ma que pa a ob ene ep esen ación del genoma de la especie sil es e pa a las egiones co espondien es a es os ma cado es se á necesa io ecu i a o as gene aciones menos a anzadas (Figu a 8). Los 14 ma cado es es an es, aquellos pa a los que el pa en al 12.2 P1 esul ó he e ocigo o, ue on los que se emplea on pa a el geno ipado de los 63 descendien es (Figu a 8). Se analizó la seg egación ob enida pa a los 14 ma cado es, comp obándose que pa a 12 de ellos se ajus aba a una seg egación mendeliana. Sin emba go, pa a dos de es os ma cado es se 27 obse ó una dis o sión de la seg egación a a o del alelo de oma e. Se a a de los ma cado es C2_A 5g62390 (χ2=4,58 > χ21gl. p=0,05=3,84) y C2-9 (χ2=5,73 > χ21gl. p=0,05=3,84), localizados en los c omosomas 3 y 6, espec i amen e. Ful on e al. (1997a) ob u ie on dis o sión de la seg egación hacia los alelos de S. pe u ianum pa a una egión del c omosoma 9, p óxima a un locus game e p omo e cuyo alelo de la especie sil es e se he eda p e e encialmen e sob e el alelo de oma e (Pelham, 1968). En el pa en al 12.2 P1 los ma cado es es udiados del c omosoma 9 es aban ijados pa a los alelos de oma e, de o ma que no se ha podido es udia la dis o sión de la seg egación pa a es a egión. Se dispone de in o mación del eno ipado pa a ca ac e es ep oduc i os de 39 de los descendien es de 12.2 P1 geno ipados. Se a ó de elaciona la p esencia de alguna egión de S. pe u ianum con la es e ilidad o con la p esencia de incompa ibilidad en las plan as de las que no se ob u o semilla, o bien la ausencia de egiones de la especie sil es e en las plan as de las que no se ob u o semilla. No se iden i icó ninguna asociación en e el geno ipo y alguna de es as ca ac e ís icas. O os au o es han iden i icado egiones asociadas con es e ilidad en poblaciones de i adas de S. pe u ianum. Como ejemplo, Ful on e al. (1997a) al analiza plan as de la gene ación BC1 ob enida a pa i de la en ada LA1708 de S. pe u ianum localiza on una egión asociada a es e ilidad en el c omosoma 1, p óxima al gen S de au oincompa ibilidad. En cualquie caso, las gene aciones es udiadas en es e abajo son gene aciones a anzadas, de o ma que es p obable que de e minadas egiones asociadas a es e ilidad ya no es én p esen es y es én ijadas pa a los alelos de oma e. 28 Figu a 8. Rep esen ación g á ica del con enido del genoma de los descendien es del pa en al 12.2 P1. En blanco ep esen adas las egiones homocigo as pa a oma e y en g is las he e ocigo as. El símbolo ‘-‘ indica ausencia de da o. Ma cado C omosoma SSR1/18,5 TG460 CT190 TG608 SSR356 C2_A 4g04955 TAHINA-2-139,5b SSR3/0 C2_A 1g28530 C2_A 5g62390 C2_A 5g08050 SSR43 C2_A 3g17040 CT188 SSR5/0 SSR325 C2-9 C2_A 1g21640 TAHINA-6-69 CD40 SSR15 SSR8/30 SSR63 SSRB105694 TG254 TG18 C2_A 1g07310 TAHINA-9-90 TG230 C2A 3g08760 C2_A 5g16630 SSR46 C2_A 2g28490 TAHINA-12-39 g394 CT99 c 239 C2_A 4g31150 C2_A 5g21170 1170 C P2 1170 C P4 1172 C P1 1172 C P3 1058 C P2 1058.1 A P2 1058.1 C P1 12.2 1104 A P1 1104 A P2 1030 A P1 1058 A P1 1058 A P2 1058 C P1 1169 C P1 1169 C P2 1169 C P3 1169 C P4 1169 C P5 1168 C P4 1168 A P1 1168.1 A C1 1168.1 C P1 1168.1 C P2 1172.1 A P1 1173 C P1 1230 C C1 1231 C P1 1170 A P1 - 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 Ma cado C omosoma 1255 C P1 SSR1/18,5 TG460 CT190 TG608 SSR356 C2_A 4g04955 TAHINA-2-139,5b SSR3/0 C2_A 1g28530 C2_A 5g62390 C2_A 5g08050 SSR43 C2_A 3g17040 CT188 SSR5/0 SSR325 C2-9 C2_A 1g21640 TAHINA-6-69 CD40 SSR15 SSR8/30 SSR63 SSRB105694 TG254 TG18 C2_A 1g07310 TAHINA-9-90 TG230 C2A 3g08760 C2_A 5g16630 SSR46 C2_A 2g28490 TAHINA-12-39 g394 CT99 c 239 C2_A 4g31150 C2_A 5g21170 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 1172.1 C P1 1058 A P3 1058.1 A P3 1058.1 C P2 1168 A C1 1168.1 A P1 1170 A P2 1170 C P1 1171 C P2 1172 A P1 1172 C P4 1173 A C1 1173 C P2 1173 C P3 1173 C P4 1227 A P1 1253 C P1 1104 A C2 1104 A P3 1104 C C1 1104 C P1 1104 C P2 1104 C P3 1104.1 A P1 1104.1 C C1 1168 A P2 1168 A P4 1168 C P2 1169 A C1 1169 A P1 1171 A C1 1171 C P1 1172 A P2 1172 A P4 29 4.3. Geno ipado po secuenciación Has a el momen o, du an e el p oceso de desa ollo de la colección de ILs de i adas de PI 126944, el ac o limi an e pa a el a ance ha sido la ob ención de plan as po e oc uzamien o a pa i de las gene aciones disponibles. En es e sen ido, el geno ipado de los ma e iales que se ob enían e a abo dable median e ma cado es ipo CAPS, SSRs o SCARs, al y como se enía haciendo en el labo a o io. Ac ualmen e, el g upo se encuen a en disposición de ob ene g an can idad de ma e iales. Po una pa e, se ha op imizado el p o ocolo pa a la ob ención de plan as median e cul i o de semillas inmadu as (Campos e al., 2016), de mane a que en caso de necesi a ecu i al e oc uce de plan as de las gene aciones an e io es, la e iciencia del p oceso pe mi i ía gene a muchos descendien es. Po o a pa e, al y como se ha comen ado en los apa ados an e io es, en las gene aciones más a anzadas disponibles se ha encido en pa e la incompa ibilidad, de mane a que ha sido posible ob ene descendencia po au o ecundación de pa e de los ma e iales. En es e sen ido, esul a necesa io dispone de un sis ema de geno ipado a g an escala que pe mi a geno ipa g an can idad de ma e iales en poco iempo. Además, se á posible de es a o ma inc emen a la densidad de ma cado es po c omosoma. En es e con ex o se decidió abo da la iden i icación de ma cado es SNP polimó icos en e los pa en ales de la población de ILs: FC y NE-1 como pa en ales de oma e y PI 126944 como pa en al de S. pe u ianum (se incluyó además el híb ido F1-A, apa ado 3.1.). El sis ema empleado ue el geno ipado po secuenciación o GBS. Una ez seleccionados los SNPs, el sis ema que se emplea á pa a el geno ipado masi o de los ma e iales ob enidos se á la pla a o ma Sequenom. Se ob u ie on lec u as en al menos uno de los geno ipos incluidos en el análisis pa a una media de 105.872 secuencias po c omosoma. Pa a la selección de los posibles SNPs se eligie on aquellas secuencias en las que se disponía de in o mación su icien e pa a iden i ica el polimo ismo, es deci , in o mación al menos de un pa en al de oma e y de PI 126944, o bien de un pa en al de al menos alguna de las especies y del híb ido F1-A. Po una pa e, los pa en ales debían se homocigo os pa a el SNP. Po o a pa e, el geno ipo de FC y NE-1 debía di e i del geno ipo de PI 126944. Po úl imo, en el caso de dispone in o mación pa a el híb ido F1-A, es e debía se he e ocigo o y sus alelos coincidi con el de los pa en ales de cada especie, espec i amen e. Tal y como se ha comen ado, el sis ema de geno ipado masi o que se a a emplea se á la pla a o ma Sequenom. El geno ipado po Sequenom se basa en la ealización de una PCR mul iplex, seguida de una eacción de ex ensión que u iliza como cebado un único oligo que pe mi e de ec a el SNP. Los p oduc os así ob enidos se analizan median e espec ome ía de 30 masas (Ma ix-Assis ed Lase Deso p ion/Ioniza ion-Time o Fligh Mass Spec ome y, MALDI- TOF MS). Es e sis ema pe mi e dis ingui los geno ipos en unción de las masas molecula es de los p oduc os de ex ensión (Ragoussis, 2009). En conc e o, se lle a á a cabo en el se icio “Labo a o io de Epigené ica y Geno ipado (Pla a o ma Sequenom)” de la Unidad Cen al de In es igación de Medicina de la Uni e si a de València. Pa a ap o echa la capacidad de una placa de Sequenom se decidió en un p ime ensayo inclui pa a su alidación SNPs de los c omosomas 1 y 2 (al ededo de unos 30 pa a cada c omosoma), lo que pe mi i á el geno ipado con es os ma cado es de 192 plan as. Se p esen an a con inuación los esul ados del GBS pa a los c omosomas 1 y 2 y se desc iben los c i e ios empleados pa a la selección de los SNPs. En el c omosoma 1 se han iden i icado 6.833 SNPs polimó icos en e los pa en ales, siendo 4.725 de ellos SNPs simples. Es os co esponde a una densidad media de 1 SNP simple cada 20.855 pb. En el caso del c omosoma 2, se han iden i icado 5.217 SNPs polimó icos, 3.648 de ellos simples. La densidad en es e caso es de 1 SNP simple cada 12.168 pb. Del conjun o de SNPs ob enidos se selecciona án, al y como se ha comen ado p e iamen e, al ededo de 30 po c omosoma. Pa a la elección se p io iza á que se a e de un SNP e dade o y no un indel (inse ción/deleción). Se e i a án ambién los SNPs de posiciones hipe a iables, con más de 4 a ian es en 100 pb, además de los SNPs que se encuen en a menos de 60 bases de o o SNP (Blanca e al., 2011). 31 5. Conclusiones 1. Se han eno ipado po ca ac e es ep oduc i os un o al de 263 geno ipos descendien es de las gene aciones “F4”-BC1, “F5”-BC1, “F5”-BC2 y “F6”-BC1 de i adas del c uce en e oma e y S. pe u ianum PI 126944. De ellos, 134 han esul ado é iles y a pa i de 50 de los mismos ha sido posible ob ene semilla iable de au o ecundación. Los mayo es po cen ajes de geno ipos con p esencia de lo es no males, u os cuajados y p oducción de semilla iable se obse a on en la gene ación pseudo-F5-BC3. Es os esul ados con i man que a medida que se ecupe a ondo gené ico del pa en al cul i ado disminuye la se e idad de las ba e as de incompa ibilidad en e ambas especies. Es o acili a á en g an medida el a ance en la cons ucción de la población de líneas de in og esión (ILs). 2. Se han geno ipado los pa en ales de las gene aciones más a anzadas (“F4”-BC2, “F5”-BC2, “F5”-BC3 y “F6”-BC2) a pa i de los cuales se han ob enido semillas de au o ecundación. Pa a la mayo ía de ma cado es se obse ó el alelo de S. pe u ianum en al menos uno de los pa en ales geno ipados a excepción de algunas egiones del c omosoma 8 y la o alidad del 10. Po an o, la mayo pa e del genoma de la especie sil es e pa ece es a ep esen ada en los ma e iales más a anzados de los que se dispone. Únicamen e se á necesa io ecu i a gene aciones an e io es pa a las egiones que no es án cubie as en es os ma e iales. 3. Los descendien es del pa en al 12.2 P1 o man pa e de la gene ación más a anzada de la que se dispone. Un o al de 63 de los descendien es ob enidos a pa i de 12.2 P1 se geno ipa on con los 14 ma cado es molecula es que esul a on he e ocigo os pa a es e pa en al. Se obse ó una dis o sión de la seg egación a a o del alelo de oma e en dos de ellos localizados en los c omosomas 3 y 6 espec i amen e. Las egiones de los c omosomas 8 y 9 analizadas esul a on homocigo as pa a el alelo de oma e. A pa i de 7 de es as plan as ha sido posible ob ene semilla de au o ecundación. Es os descendien es esul an de in e és pa a el a ance en el desa ollo de la colección de ILs. 4. Se ha ealizado un geno ipado po secuenciación de los pa en ales de la población y de uno de los híb idos in e especí icos en e ellos. Los SNPs iden i icados pe mi i án el diseño de una pla a o ma de secuenciación masi a que acele e el a ance en el desa ollo de la colección de ILs y que inc emen e la densidad de ma cado es disponibles pa a el geno ipado.