Estudio sobre la variabilidad de niveles de prolina en plantas situadas en los saladares del Paraje Natural Municipal Clot de Galvany, en las Partidas rurales de El Altet y los Balsares, en el término municipal de Elche de la comarca del Bajo Vinalopo de la provincia de Alicante

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA E S C U E L A P O L I TE CN I C A S U P E R I OR DE GANDIA In geni e rí a Té c n i c a F o r e s tal “ Estudio sobre la variabilidad de niveles de prolina en plantas situadas en los saladares del Paraje Natural Municipal Clot de Galvany, en las Partidas rurales de El Altet y los Balsares, en el término municipal de Elche de la comarca del Bajo Vinalopo de la Provincia de Alicante ” TRABAJO FINAL DE CARRERA Autor/es: Eduardo López Pérez Director/es: Monica Teresa Boscaiu Neagu Oscar Vicente Meana GANDIA, 2011 3 Índice 1. Resumen................................................................................................ 5 2. Introducción .......................................................................................... 8 3. Descripción de la zona de estudio....................................................... 10 3.1 Ecosistema.........................................................................................................................11 3.2 Instrumentos de conservación y protección.....................................................................11 3.3 Ecología .............................................................................................................................11 3.4 Biogeografía ......................................................................................................................12 3.5 Bioclimatología..................................................................................................................13 3.6 Plano de localización.........................................................................................................15 4. Objetivos del proyecto ........................................................................ 16 5. Revisión de literatura .......................................................................... 18 5.1 Introducción ......................................................................................................................19 5.2 Ambientes estresantes......................................................................................................20 5.3 Respuesta celular ..............................................................................................................20 5.4 Relaciones hídricas............................................................................................................20 5.5 Estrés hídrico.....................................................................................................................21 5.6 Osmorregulación. Relaciones metabólicas .......................................................................22 5.7 Conceptos sobre salinidad ................................................................................................23 5.8 Los aminoácidos................................................................................................................29 6. Flora..................................................................................................... 31 6.1 Juncus maritimus...............................................................................................................32 6.2 Juncus acutus ....................................................................................................................34 6.3 Sarcocornia fructicosa.......................................................................................................36 6.4 Limonium sp.pl.................................................................................................................. 38 4 6.5 Arthrocnemum macrostachyum.......................................................................................40 6.6 Inula crithmoides...............................................................................................................42 7. Climatología......................................................................................... 44 8. Métodos y plan de trabajo ................................................................. 48 8.1 Introducción ......................................................................................................................49 8.2 Trabajo de campo..............................................................................................................50 8.3 Trabajo de laboratorio ......................................................................................................53 8.4 Cálculos .............................................................................................................................56 9. Tablas................................................................................................... 58 9.1 Datos verano .....................................................................................................................59 9.2 Cálculos verano .................................................................................................................62 9.3 Prolina verano...................................................................................................................66 9.4 Datos otoño.......................................................................................................................68 9.5 Cálculos otoño...................................................................................................................71 9.6 Prolina verano-otoño ........................................................................................................75 10. Resultados y discusión....................................................................... 81 11. Conclusiones...................................................................................... 85 12. Bibliografía......................................................................................... 87 5 1. Resumen 6 El siguiente trabajo es parte integrante de un proyecto de investigación llevado a cabo en los Institutos de biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP) y el Instituto Agroforestal Mediterráneo (IAM) de la Universidad Politécnica de Valencia, el cual se estudia la importancia de los mecanismos de respuesta de las plantas frente al estrés abiótico (como la elevada salinidad, la aridez, la diferencia de temperatura en verano e invierno, etc..), que experimentan ciertas especies por encontrarse en hábitats específicos. En los últimos años los cambios globales atmosféricos así como el efecto antrópico incontrolable, ha provocado un incremento sustancial en la desertificación de la tierra, razón por la cual se hace indispensable profundizar en los posibles mecanismos adaptatívos de los cultivos de interés económico, a las condiciones estresantes del hábitat con características salinas. Este tipo de estudio, es de gran interés para conseguir en un futuro próximo, un aumento en el rendimiento de las cosechas en lugares con condiciones abióticas desfavorables para las plantas, haciendo posible problemas tan importantes como la reducción del hambre, el aumento de economía en países con pocos recursos, así como evitar pérdidas de biodiversidad a través de estrategias de conservación y/o restauración de estos ecosistemas. La novedad de este estudio es la utilización de plantas silvestres tolerantes a estrés en sus ambientes naturales, así como el carácter multidisciplinar del proyecto para poder contribuir al avance del conocimiento sobre los mecanismos de respuesta al estrés. Se propone que los mecanismos de respuesta de las plantas a condiciones de estrés en la naturaleza son más eficaces que de las plantas sin estas condiciones adversas. El estudio pretende abordar los mecanismos de tolerancia a estrés abiótico en seis especies en particular, elegidas a criterio justificado de un tipo de hábitat natural sometido a unas condiciones de estrés ambiental en concreto, como es el caso del saladar del Clot de Galvany (Elche). Se determinarán los niveles de marcadores bióquímicos como la prolina, que se acumula en plantas como respuesta al estrés abiótico. Todos los resultados obtenidos se correlacionarán con datos climatológicos y los derivados de análisis edafológicos, realizados en muestras tomadas simultáneamente con las del material vegetal. 7 El presente trabajo tiene como objetivo principal conocer la variabilidad de prolina en las distintas especies elegidas, teniendo en cuenta la relación ambiental y edáfica existente en la campaña 2010, en las cuatro parcelas experimentales dispersas por las partidas rurales de El Altet y los Basares, en el termino municipal de Elche, la recogida de muestras será una en Verano y otra en Otoño. El porque de cuantificar la variabilidad de la prolina, es debido a la importancia de este aminoácido y a su metabolismo en los procesos de resistencia al estrés abiótico. La cuantificación de la prolina se realizará en las mismas especies existentes en las parcelas de estudio en dos estaciones distintas para obtener resultados que se puedan correlacionar con la influencia de la temperatura, radiación solar y precipitación sobre este proceso metabólico. 8 2. Introducción 9 Mi estudio final de carrera, se centra en una zona de la Comunidad Valenciana, en concreto en el término municipal de Elche. El estudio se basa en el comportamiento de las comunidades vegetales en la zona del saladar del Parque Natural Municipal Clot de Galvany (Elche), en donde se desarrolla un hábitat natural sometido a un estrés ambiental, con las características edáficas del lugar. Se pretende obtener datos de interés a nivel botánico e ecológico, con posibles aplicaciones a nivel agrícola y forestal, con el estudio de los mecanismos de tolerancia a estrés abiótico de las especies seleccionadas para el estudio, mediante la determinación de los niveles de varios marcadores bioquímicos y enzimáticos, característicos de distintos mecanismos de respuesta a estrés en plantas. Con este estudio, cuya idea es obtener unos datos cuantificativos de la prolina, los cuales nos darán una visión de la importancia de su síntesis en diferentes estaciones e especies, en medios ambientes poco aptos para la mayoría de plantas, será una documentación adicional para facilitar el propósito de la Legislación de la Unión Europea para la protección y conservación de hábitats de especial interés (Hábitats naturales (Natura 2000)). 10 3. Descripción de la zona de estudio 17 El estudio a la respuesta de las plantas al estrés abiótico, es de interés académico y práctica a nivel forestal e agrícola. Por lo general todas las plantas utilizan los mismos mecanismos de respuesta frente a condiciones ambientales adversas (regulación del balance osmótico, síntesis de metabolitos y proteínas protectoras, activación de sistemas antioxidantes, etc.). Cabe destacar que estos mecanismos son más eficaces en especies tolerantes a distintos tipos de estrés abiótico, ya sea por que su hábitat habitual sean zonas límites para otras especies o sea por una muy buena adaptación al lugar, como pueden ser las plantas halófilas, gipsófilas, xerófilas, por mencionar las más predominantes en estos lugares. El estudio se centra en cuantificar los niveles de prolina que sintetizan las plantas en la zona de estudio, como sistema de respuesta a las condiciones de estrés que experimentan a consecuencia de las claras diferencias que existen en las dos épocas propuestas (VeranoOtoño), y que están condicionadas por las propiedades edafológicas y climáticas. El estudio de los mecanismos de tolerancia en especies de hábitats sometidos a condiciones específicas de estrés, y su correlación con datos climatológicos y edafológicos, puede contribuir al avance del conocimiento en este campo, proporcionando información de interés, complementaria a la obtenida en sistemas modelo y con otros abordajes experimentales. Esta asociación entre los requisitos edáficos de especies de interés y sus mecanismos de adaptación al estrés en sus hábitats naturales, junto con estudios detallados de la estructura y comportamiento de las comunidades vegetales en cada una de las zonas seleccionadas, permitirá obtener datos adicionales con implicaciones para el mantenimiento de la biodiversidad vegetal, ayudando a establecer estrategias de conservación y de restauración de estos ecosistemas, sumamente amenazados o, en muchos casos, ya degradados. 18 5. Revisión de literatura 19 5.1 Introducción Las plantas están sujetas constantemente a condiciones adversas tales como: sequía, inundación, temperaturas extremas, sales excesivas, metales pesados, irradiación de alta intensidad e infecciones por agentes patógenos. Dada su inmovilidad, deben ajustarse en forma necesaria, tanto estructural como metabólicamente, para poder responder a las condiciones de estrés y cambios estacionales, por lo que utiliza mecanismos de ajuste. La primera reacción de las plantas, es la inhibición del crecimiento vegetativo y del desarrollo reproductivo, ya que desvían todos sus recursos (energía, precursores metabólicos, etc.) para sobrevivir a las condiciones adversas (Serrano and Gaxiola 1994; Zhu, 2001). Sin embargo, existen plantas adaptadas de forma natural a condiciones de estrés, como las presentes en los ecosistemas objeto de este estudio: halófitas (tolerantes a sal) siendo este hábitat pobre en nutrientes. Lo cierto es que se sabe muy poco sobre las bases moleculares de los mecanismos de tolerancia a estrés en estas plantas silvestres, ya que la mayoría de los estudios sobre las respuestas a estrés en plantas se han llevado a cabo en especies modelo no tolerantes, como la Arabidopsis thaliana, o especies cultivadas (Sanders, 2000; Zhu, 2000, 2001), que a priori no parecen ser las más apropiadas para este tipo de investigaciones. Las plantas en su conjunto utilizan los mismos mecanismos básicos de respuesta a los cambios abióticos. Estos mecanismos generalmente son: o Control de la homeostasis iónica y del balance osmótico celular (transporte de agua a la célula). o Síntesis de moléculas protectoras: osmolitos compatibles (azúcares, polialcoholes, aminoácidos o derivados) y proteínas específicas. o Activación de sistemas antioxidantes, químicos o enzimáticos. (Zhu, 2001; Munns, 2002; Wang et al. 2003, Vinocur and Altman, 2005; Umezawa et al. 2006). De todos modos, la tolerancia a la sequía, a la sal, a la temperatura elevada, etc., no son comparables con las plantas silvestres y adaptadas a unas condiciones poco favorables. Los mecanismos de tolerancia en las plantas silvestres son mucho más eficaces ya que pueden contrarrestar el estrés hídrico, térmico y salino; desde adaptaciones estructurales, fisiológicas, hasta bioquímicas y moleculares. 20 5.2 Ambientes estresantes Los estreses medioambientales se pueden clasificar en tres: o Estrés físico, donde se encuentra el déficit hídrico, la salinidad, el frío, el calor, la irradiación luminosa, la anaerobiosis, el estrés mecánico. o Estrés químico, producido por los metales pesados, la salinidad, los contaminantes atmosféricos, los herbicidas, así como la carencia de determinados elementos químicos. Estos dos factores son los que engloban los estreses abióticos. o Por último esta el estrés biológico o biótico, causado por la acción de seres vivos. 5.3 Respuesta celular La secuencia celular a la respuesta al estrés de la planta se divide en tres etapas, las cuales son: o En primer lugar la percepción por la planta del estímulo estresante. o En segundo lugar el procesamiento de la señal de estrés percibida, cuyos factores que constituyen las rutas de transmisión intracelular de la señal de estrés incluye las fitohormonas, los cambios en el nivel de (Ca) intracelular y la actividad de las proteínas. o Y por último la regulación de la expresión génica, implicando tanto la activación como la represión de la transición. 5.4 Relaciones hídricas El potencial hídrico es afectado por los factores abióticos como el agua del suelo, el clima, el índice de estrés y el estado de desarrollo del cultivo. Azcón-Bieto y Talón (1993) expresan que el estado hídrico se puede describir cuantitativa y adecuadamente mediante el potencial hídrico, el cual controla el movimiento del agua en el sistema suelo-planta-atmósfera, así como a nivel de células, tejidos y órganos. Un ejemplo de acoplamiento entre relaciones hídricas y procesos metabólicos son las adaptaciones a los déficits hídricos, salinidad y temperaturas bajas. 21 Se considera que hormonas tales como el ABA desempeñan un papel importante en estos aspectos, pero no se conocen bien los mecanismos precisos de su acción. Existen pruebas de que una señal hidráulica, tal como la turgencia, se puede transformar directamente en cambios en el transporte activo a través de las membranas celulares, mediante un sensor situado a nivel de membrana. Las raíces responden a la sequía edáfica produciendo una alta concentración de ácido abscísico (ABA), el cual se transporta al vástago ocasionando el cierre estomático (Davies y Zhang, 1987; Zhang y Davies, 1990). Algunas especies, incluyendo las adaptadas a hábitats áridos acumulan sustancias durante un periodo de déficit hídrico, las cuales son constituyentes normales de las células, particularmente aminoácidos libres como Prolina (Barnett y Naylor, 1966; Waldren y Teare, 1974; Aspinall y Paleg, 1981), Betaína (Wyn Jones y Storey, 1981) y toda una serie de metabolitos secundarios de los cuales ABA es uno de los más importantes (Walton, et al. 1976; Trejo y Davies, 1991). La comunicación entre la raíz y el vástago puede ser un componente importante de los mecanismos de respuesta de las plantas que crecen bajo condiciones de sequía. Lo anterior pone de manifiesto la importancia que tiene determinar los mecanismos de regulación fisiológica que presentan las plantas como respuesta a las condiciones de humedad en el suelo; principalmente todos aquellos relacionados con la regulación de intercambio gaseoso. 5.5 Estrés hídrico Es considerado como condición adversa a la vida, produciendo cambios reversibles a la planta si estos no son de larga duración. Se produce en la planta cuando la absorción de agua del sistema radicular es insuficiente para satisfacer la demanda evaporativa atmosférica. Esto afecta a procesos fisiológicos y reproductivos, consiguientemente a la disminución de la producción (Lin y Kao, 1995; Acevedo et al., 1998). 22 El primer efecto es la pérdida de turgencia, la que afecta la elongación del tallo, la expansión foliar, la apertura estomática y finalmente una reducción en la tasa de crecimiento (Hale et al., 1987). Este déficit de suministro de agua a nivel molecular, produce cambios fisiológicos muy importantes, en respuesta: o Se inhibe la expansión celular, generalmente seguida por una reducción de la síntesis de pared celular. o Se inhibe la división celular. o Se produce un incremento en los niveles de ácido abscísico. o Surgen cambios en la osmolaridad celular. o Los estomas comienzan a cerrarse, provocando una reducción de la transpiración y de la fotosíntesis. o La síntesis proteica es sensible, (disociación de ribosomas). o La actividad enzimática sufre cambios. o Se produce la biosíntesis de metabolitos secundarios. o Surgen cambios en el desarrollo y/o reproducción de las plantas. o Se activa simultáneamente la síntesis de proteínas específicas denominadas de estrés. Además, se incrementa el contenido de prolina libre que actúa como osmolito en el ajuste osmótico, como respuesta fisiológica de la planta como uno de los primeros mecanismos al estrés hídrico generado por un ambiente árido. Una respuesta de las plantas al bajo potencial hídrico del suelo, ocasionado por el incremento de sales, es la acumulación de solutos osmóticamente compatibles. Dentro de éstos, prolina es un componente importante. La concentración de prolina y el contenido relativo de agua (CRA), se ha tenido en cuenta su relación a la hora de sacar las conclusiones, ya que cuando el (CRA) disminuye aumenta la concentración de NaCl. 5.6 Osmorregulación. Relaciones metabólicas Un aspecto de gran relevancia en la respuesta de los cultivos a las sales es el ajuste osmótico, es decir, el incremento neto en la cantidad de solutos osmoticamente activos en los tejidos. El ajuste osmótico se alcanza mediante la acumulación de iones inorgánicos, o a través de la síntesis de solutos orgánicos, entre los cuales la prolina es uno de los osmolitos más ampliamente distribuidos en plantas superiores. 23 Los iones inorgánicos son determinantes en el ajuste osmótico y se acumulan preferentemente en vacuolas. Muchas plantas que toleran los diversos tipos de estrés hídrico lo hacen sintetizando en el citoplasma, compuestos que pueden existir en concentraciones elevadas sin desnaturalizar las enzimas que son esenciales para los procesos metabólicos propios de la vida. A estos compuestos se les denomina solutos compatibles, y son de naturaleza muy variable, como la prolina, glicina, betaina, sacarosa, manitol. Estos compuestos pueden existir en el citoplasma a concentraciones relativamente elevadas, sin dañar las enzimas que ahí se encuentran. Familias de plantas específicas tienden a usar uno o dos de estos compuestos en preferencia a otros; la cantidad de (C) usado para la síntesis de estos solutos orgánicos puede ser grande (aprox. 10% del peso de la planta), y aunque en vegetación natural este hecho no afecta, en cultivos agrícolas puede reducir las producciones. La acumulación de carbohidratos en los tejidos de plantas estresadas, es un reflejo de cómo los solutos compatibles son necesarios para la osmorregulación. Iyer y Kaplan (1998) plantean que muchas plantas acumulan altos niveles de prolina libre en respuesta al estrés osmótico; este aminoácido es ampliamente relacionado a las funciones como un protector o estabilizador de enzimas o estructuras de membranas que son sensibles a la deshidratación o al inducido iónicamente. Estudios de prolina en otras especies: • Camara et al. (2000) estudiaron el efecto del estrés salino y la prolina exógena en callos de dos genotipos de maíz. La adición de prolina mejoró el crecimiento de los callos en ambos genotipos en el tratamiento control y redujo los efectos negativos en los altos niveles salinos. La diferencia en la tasa de crecimiento entre ambos genotipos fue debido, probablemente en parte, a la alta acumulación de prolina y el mantenimiento del metabolismo de poliamina en dichos callos. 5.7 Conceptos sobre salinidad El aumento de sales en los suelos es una de las más serias amenazas medioambientales para la supervivencia de las plantas. También, constituye uno de los mayores problemas para el crecimiento y desarrollo de las plantas cultivadas; repercutiendo en la producción exitosa de las cosechas (Munns et al., 2002). 24 Un gran porcentaje de suelos dedicados a la agricultura en el mundo, son naturalmente salinos (21 %) o pueden ser salinizados (19.5 %) por prácticas inadecuadas de irrigación (Chinnusamy & Zhu, 2003, FAO, 2005). En este sentido, el efecto del estrés ocasionado por sales en plantas, viene siendo estudiado extensivamente. El exceso de sales puede ejercer un efecto osmótico, toxicidad iónica, así como disturbios en la toma y translocación de iones necesarios para la nutrición de las plantas (Misra & Dwivedi, 2004), lo cual, puede afectar adversamente el crecimiento de las plantas. En muchas plantas cultivadas, se ha observado que los primeros estadios de su vida son más sensitivos a los estreses medioambientales, entre ellos, la salinidad (Sivritepe et al., 2003). El NaCl es una sal que se encuentra frecuentemente en terrenos de cultivo, por eso, muchos estudios han sido orientados al entendimiento de los mecanismos involucrados en sus sistemas de transporte y mecanismos regulatorios que median la homeostasis de Na+ en las plantas (Zhu, 2002, Rus et al., 2004). El desequilibrio de Na+ es una consecuencia primaria de la alta concentración de NaCl y afecta la división, crecimiento y supervivencia celular (Zhu, 2003). El exceso de iones Na+ y Clpuede conducir a cambios en la estructura de las proteínas, mientras que el efecto osmótico llevar a la pérdida de turgencia celular (Chinnusamy & Zhu, 2003). Si bien los mecanismos involucrados en el estrés salino no son entendidos completamente, debido a la participación de muchos genes en la resistencia a este estrés (Parida & Das, 2005; Ning Liu et al., 2007); las plantas han involucrado procesos para operar adicionalmente y asegurar su supervivencia. Entre ellos, la exclusión de iones Na+ y Cldel citoplasma y su compartimentalización en la vacuola. (Munns, 2002). Al aumentar estos iones en la vacuola, para soportar el efecto osmótico, un gran número de plantas han involucrado en su metabolismo la capacidad para sintetizar y acumular solutos compatibles u osmoprotectores en el citoplasma (Hasegawa et al., 2000; Chinnusamy & Zhu, 2003; Attipalli et al., 2004; Azevedo, et al., 2004; Parida & Das, 2005). 25 Estos solutos son acumulados a niveles osmoticamente significativos sin alterar el metabolismo de la planta, con la función de mantener la turgencia de los tejidos para así mantener la función celular (Ramanjulu & Sudhakar, 2000). Compuestos de diversa naturaleza química se encuentran agrupados dentro de los solutos compatibles: aminoácidos (prolina), compuesto cuaternarios de nitrógeno (glicina betaina), polioles (manitol), azúcares (trehalosa, sacarosa, fructanos) (Nuccio et al., 1999). La prolina es un aminoácido que se encuentra en pequeñas cantidades en las plantas, cuando éstas crecen en condiciones óptimas. En condiciones de estrés, se ha encontrado que el contenido de Prolina aumenta para actuar como un agente osmótico, protegiendo a la planta de la deshidratación. Muchas especies de plantas acumulan Prolina libre en respuesta a la salinidad (Jiménez-Bremont et al., 2006; Tajdoost et al., 2007), sequia (Avendaño et al., 2005) y frio ( Konstantinova et al., 2002). Se ha sugerido que la prolina participa en múltiples roles en la tolerancia de las plantas al estrés: o Actuando como un mediador del ajuste osmótico (Delauney & Verma 1993; Kavi Kishor et al. 1995; Yoshiba et al. 1997). o Estabilizador de proteínas y membranas. o Inductor de genes relacionados a estrés osmótico (Iyer & Caplan 1998). o Fuente de carbono y nitrógeno fácilmente disponible en la rehidratación celular (Brugière et al. 1999). o Fuente de equivalentes de reducción (del catabolismo de prolina) para sostenerla fosforilación oxidativa. o Generación de ATP durante la recuperación del estrés (Hare & Cress 1997; Hare et al., 1998). o Ayuda al control de la acidosis del citosol y puede mantener la relación NADH/NAD+ a valores compatibles con el metabolismo (Hare & Cress 1997). o Ayuda en la detoxificación del exceso de NH4+. o Ayuda a las células a superar la tensión oxidativa (cosechador de especies reactivas de oxígeno). (Ramanjulu & Sudhakar, 2000; Harsh, 2003). La salinidad del suelo es una medida de la cantidad total de las sales solubles en el suelo. Como los niveles de salinidad incrementan, las plantas extraen menos fácilmente el agua del suelo, agravando las condiciones de estrés hídrico. 26 La alta salinidad del suelo, puede también causar desbalances de nutrientes, resultando en la acumulación de elementos tóxicos en las plantas y reduce la infiltración de agua si el nivel de un elemento salino (Na) es alto. Las plantas afectadas por sales son achaparradas con hojas verdes opacas, las cuales, en algunos casos, son delgadas y más suculentas que lo normal. La tolerancia a la salinidad está influenciada por varios factores (planta, suelo, ambiente) así como sus interrelaciones. Generalmente, las frutas, vegetales y ornamentales son más sensibles a las sales que las cosechas de campo y forrajeras. Ciertas variedades y cultivares, pueden tolerar altos niveles de sales que otras. Aunque la mayoría de las plantas son más sensibles a la alta salinidad durante los estadios de plántulas, inmediatamente después del trasplante y cuando son sujetos a otros estreses (por ej. enfermedades, insectos, nutrientes). El clima y el riego también influyen en la tolerancia a la salinidad. En consecuencia, los problemas salinos son más severos bajo calor, condiciones de sequía, que bajo frío y humedad. La salinidad del suelo es determinada por medida de la conductividad eléctrica de la solución extraída a partir de una pasta de suelo saturada de agua. La salinidad es abreviada como Ece (conductividad eléctrica del extracto) con unidades de decisiemens por metro (dS/m) o milimhos por centímetro (mmhos/cm). Bajo condiciones salinas, muchas plantas son capaces de compensarse parcialmente por bajo potencial osmótico del agua del suelo por incrementos del contenido de solutos internos. Esto se logra por absorción iónica a partir de la solución del suelo y por síntesis de osmolitos orgánicos. Ambas reacciones reducen el impacto del potencial osmótico. Sin embargo, la síntesis de osmolitos orgánicos requiere el gasto de energía metabólica. En consecuencia, el crecimiento de la planta es frecuentemente reducido bajo condiciones salinas. La reducción del crecimiento de las plantas en algunas ocasiones se debe, adicionalmente, al cierre estomático. Otros impactos de las sales en el suelo incluye la toxicidad directa del Na y Cl y las deficiencias de nutrientes inducida. Todas las plantas no responden a la salinidad de la misma manera; algunos cultivos pueden producir rendimientos aceptables a mayores niveles de salinidad en el suelo que otros. Esto es debido a que algunos cultivos son más capaces para lograr el 33 rizomatosa y porque la inflorescencia es muy laxa, en lugar de ser densamente compacta como en la otra especie. Descripción: Planta perenne de color verdoso, de 50 – 100 cm. Tiene un rizoma horizontal de 2 – 8 mm de grosor, lo que la hace laxamente cespitosa. El tallo, de 1,5 – 2 mm de diámetro, es liso o estríado una vez seco, providto de 2 – 5 vainas pardas, áfilas, terminadas en un mucrón. Tiene 2 – 4 hojas punzantes cilíndricas. Las flores aparecen reunidas en una inflorescencia de 2 – 25 mm de longitud, laxa aunque puede aparecer contraída. Florece de junio a octubre. La primera bráctea, la inferior, semeja una continuación del tallo, tan larga como una como la inflorescencia y es punzante, siendo la segunda bráctea mas corta. Las flores tienen una tonalidad pajiza y son solitarias o en pequeños grupos fascículos de 2 – 3 flores, pudiendo llegar a 7. Los segmentos del perianto son desiguales, los externos ovados, agudos, cortamente mucronados, mientras que los internos son mas cortos, estrechamente elípticos, y sin aurículas. Hay 6 estambres, que miden dos tercios del periantio, con anteras el doble de longitud que los filamentos. El fruto es una cápsula trilocular de forma trígona – ovoide, obtusa, mucronada, tan larga o algo más que las piezas del periantio. Difusión y hábitat: Aparece en praderas juncales halófilas desarrollado sobre suelos permanentemente húmedos. Vive en comunidades de la clase Salicornietea fruticosae en la que neófitos, hemicriptófitos y caméfitos halófilos dominan en suelos salobres en mayor menor grado y que son de humedad variable. Ecológicos: No soporta la sombra Requiere calor, no soporta heladas tardías ni temperaturas extremas Piso colino principalmente, suboceánico Suelos húmedos, ricos en bases y poco pobre o ligeramente rico en suelos fertilizados. Distribución: Presente en Europa occidental y central, en la zona mediterránea, norte de África y oeste de Asia. En la Península aparece en todo el litoral e incluso también en lagunas saladas interiores. 34 6.2 Juncus acutus Clasificación científica: Reino:…...Plantae División:..Magnoliophyta Clase:…....Liliopsida Orden:..…Poales Familia:….Juncaceae Género:...Juncos Especie:...Juncus acutus Nombre común: Junco redondo. Distribución por provincias: Alicante Valencia, Cataluña, Islas Baleares Distribución general: Pluriregional Época de floración: Mayo - Julio. Formas vitales: Caméfito. Hábitat: Zonas húmedas y pantanosas. Categoría IUCN: Poco preocupante Descripción: Mata grande densas con las hojas y tallos punzantes. Lo diferenciamos de Juncus maritimus por su inflorescencia compacta con frutos capsulares claramente más grandes que los sépalos (alerta con la subsp. tommasinii que tiene las cápsulas pequeñas). Es rizomatoso y normalmente forma céspedes, siendo su inflorescencia laxa. 35 Especie perenne y de un grueso y corto rizoma, que posee tallos de hasta 2 m de longitud. Éstos están rodeados en su parte inferior por varias vainas, donde tienen de 2 a 5 hojas basales. Es una planta cespitosa perenne de color verde oscuro que forma matas de 1,52 m. Alcanzando una altura entre los 75 y los 200 centímetros. Las láminas y los culmos son cilíndricas y pungentes, característica que le da nombre a la especie. La inflorescencia es compuesta de flores hermafroditas diminutas de color pardo rojizo. Brácteas muy pinchudas entre los meses de abril y agosto en el hemisferio norte. Fruto cápsula de unos 4-5,5 mm de tamaño y de forma ovoide color bruno rosado. Sus semillas son muy pequeñas, de 1,2-1,7 mm. Los frutos maduros permanecen largo tiempo en la planta. El periodo de floración va de abril a julio. Difusión y hábitat: Es una planta cosmopolita, ya que se encuentra difundida en toda el área Mediterránea y Canarias encontrándose hasta en Sudáfrica, California y América del Sur. Su hábitat ideal es zona húmeda de alta tasa de salinidad, suelos con capa freática superficial, arenales costeros, bordes de laguna, humedales, arroyos y terrenos encharcados. Ecología: Crece en los pisos termomediterráneo, mesomediterráneo y supramediterráneo. Se desarrolla en suelos hidromorfos , en marjales salinos o más o menos salobres, tanto de la costa como del interior. Distribución: Aparece en la Región Mediterránea y en las Canarias. En la Península Ibérica, se extiende por casi todo el territorio, siendo más frecuente en la zona litoral, tanto levantina como en las costas del norte, estando presente también en Baleares. En Portugal aparece en la zona del Algarve. En la Región de Murcia aparece extendida por todo el territorio, creciendo en juncales tanto de aguas dulces como en aguas salobres. 36 6.3 Sarcocornia fructicosa Clasificación científica: Reino:…...Plantae División:..Magnoliophyta Clase:…….Magnoliopsida Orden:….Caryophyllales Familia:...Amaranthaceae Género:…Sarcocornia Especie:...Sarcocornia fruticosa Nombre común: Sosa alacranera. Distribución por provincias: Islas Baleares. Distribución general: Pluriregional. Época de floración: Floración en verano. Formas vitales: Nanofanerófito. Hábitat: Saladares abundantes en agua. Costa rocosa. Categoría IUCN: Poco preocupante. Descripción: Arbustillo perennifolio, hermafrodita de hasta 1,5 m, siempre erguido, muy ramoso. Ramillas opuestas; las fértiles herbáceas, también opuestas, articuladas, cilíndricas, con todos los artejos cilíndricos, verdes y glabras, en apariencia desprovistas de hojas. Se caracteriza porque los tallos jóvenes son carnosos y están articulados en nudos y entrenudos, estos tallos son verdes o adquieren coloraciones rojizas. 37 Las hojas están reunidas en pequeñas escamas poco visibles, soldadas entre sí sobre el ápice de los artejos o segmentos, formando una especie de delgado anillo hialino. La inflorescencia es una espiga cilíndrica y articulada. Las flores se agrupan de tres en tres a cada lado de los nudos de las ramas fértiles, que son las más superiores y por tanto sobresalen por encima del perfil general de la planta. Estas flores son muy pequeñas y poco aparentes, de hecho ocupan, cada una de ellas, una cavidad de los tallos. El fruto es un aquenio incluido dentro del periantio. Semilla parda o pardogrisácea. Esta especie se confunde con Arthrocnemum macrostachyum, que tiene una morfología extremadamente parecida y que vive en los mismos ambientes; esta especie desarrolla las ramas fértiles sin que sobresalgan del perfil general de la planta. Sarcocornia perennis también puede provocar confusiones, esta especie se diferencia por desarrollar ramas postradas que enraízan en el suelo, mientras que Arthrocnemum fruticosa no enraíza en las ramas que tocan el suelo. Florece a finales de primavera hasta el otoño. Difusión y Hábitat: Terrenos salados abundantes en humedad, de suelos salinos, tanto en las marismas como en la costa rocosa. Vive en suelos húmedos salobres en el supraestero de la marisma externa halófila, que no son inundados más que por las pleamares. Pertenece principalmente a comunidades de la clase Salicornietea fruticosae en la que neófitos, hemicriptófitos y caméfito halófilos dominan en suelos salobres en mayor o menor grado y que son se humedad variable. Ecología: Crece a plena luz aunque soporta sombra y requiere calor. El piso es colino principalmente. Es una especie continental, soportando variaciones de temperatura. Requiere suelos húmedos débilmente ácidos y ricos en nutrientes. Distribución: Amplia distribución mundial: Eurasia, norte de África, Polinesia, América central y Suramérica. 38 6.4 Limonium sp.pl. Clasificación científica: Reino:…….Plantae División:..Magnoliophyta Clase:…....Magnoliopsida Orden:…..Caryophyllales Familia:....Plumbaginaceae Género:…Limonium Especie:…Limonium sp. Nombre común: Limonio. Siempreviva. Distribución por provincias: Islas Baleares. Valencia. Distribución general: Mediterránea-occidental. Época de floración: Agosto - Octubre. Formas vitales: Caméfito. Hábitat: Saladares y litorales rocosos. Categoría IUCN: Vulnerable Descripción: Género formado por más de 400 especies, más de 100 en España, con un centro de diversificación en el oeste del Mediterráneo. Habitan en zonas salobres costeras, acantilados marítimos, orillas de lagunas saladas y zonas margosas del interior muy áridas. 39 Se trata de un género de gran complejidad taxonómica y que plantea grandes problemas de identificación, debido al elevado grado de especiación que presenta. A veces una comarca, una laguna o una playa determinada presenta su propia especie. La hibridación que en ocasiones se produce entre los propios híbridos y sus progenitores es frecuente. Las hojas se distribuyen formando una roseta basal, aunque también de forma helicoidal. La mayoría carecen de melosidad. La inflorescencia, presenta ramas floríferas o estériles. La cantidad, longitud y disposición de estas últimas, en caso de que las haya, tiene gran interés taxonómico. Las flores de color violáceas y en menores medidas blancas o rosáceas, las cuales están reunidas en espiguillas formadas por la reunión de dos o más flores. Estas espiguillas están rodeadas de tres brácteas: externa, media e interna. La externa es ancha y triangular con un margen escarioso más o menos ancho. La bráctea interna es mayor y también posee un margen escarioso. Las espiguillas están reunidas en ramillas o espigas de modo más o menos denso, dando lugar a agrupaciones muy densas o más laxas. Difusión y hábitat: Se distribuye por la zona occidental de la Región Mediterránea. En la Península Ibérica aparece principalmente en la Comunidad Valenciana, Región de Murcia y Almería. También la encontramos en las Islas Baleares. Ecología: Aparece en los pisos termomediterráneo y mesomediterráneo, con un ombroclima semiárido. Suelen encontrarse en hábitats hostiles que otras plantas no pueden soportar como acantilados marítimos, suelos ricos en yeso, lagunas saladas, saladares y en general en suelos fuertemente salinos. Distribución: La mayoría tiene una distribución geográfica reducida, son pocas las de amplia distribución continental. A veces sólo una comarca o un término municipal. 40 6.5 Arthrocnemum macrostachyum Clasificación científica: Reino:….. Plantae División:..Magnoliophyta Clase:…… Magnoliopsida Orden:…..Caryophyllales Familia:….Amaranthaceae Género:…Arthrocnemum Especie:…Arthocnemum macrostachyum Nombre común: Alacranera. Almajo. Garbancillo. Sapina. Solicuernos. Distribución por provincias: Alicante, Valencia, Cataluña, Islas Baleares. Distribución general: Mediterránea. Época de floración: Abril - Octubre. Formas vitales: Nanofanerófito. Hábitat: Suelos salinos arcillosos y húmedos. Costas rocosas. Categoría IUCN: Poco preocupante. Descripción: Arbustillo perennifolio, hermafrodita, generalmente erguido, de hasta 1,5 m de altura, muy ramoso. Vive en suelos arcillosos y salinos, puede resistir inundaciones esporádicas. Hojas opuestas, sésiles y reducidas a pequeñas escamas, formando un anillo hialino que rodea el artejo o segmento en el ápice. 41 Las ramillas fértiles, herbáceas, nacen opuestas y son articuladas, cilíndricas, verdes y glabras, aparentemente sin hojas. Primer artejo de las ramillas más o menos aplanado y anguloso, los siguientes más o menos cilíndricos. Tiene los tallos carnosos y articulados. La inflorescencia es una espiga cilíndrica y articulada. Las flores aparecen en cimas trifloras situadas en la base de los artejos o segmentos. La flor central siempre es ligeramente mayor que las laterales; periantio de una sola pieza (en realidad, 4 tépalos soldados de sección circular); anteras amarillas. Al desprenderse las flores dejan una cavidad única, no tabicada por paredes membranosas. El fruto es un aquenio con una semilla negra verrugosa. Florece desde la primavera hasta el otoño. Fructifica desde la primavera hasta el otoño. Se puede confundir muy fácilmente con Sarcocornia fruticosa con la que convive en muchas zonas húmedas, se reconoce porque hace las inflorescencias sobre las ramas de dos años, quedando escondidas dentro de la mata, al contrario Arthrocnemum macrostachyum hace las inflorescencias sobre ramas jóvenes y quedan expuestas en la parte superior de la mata. Difusión y hábitat: Terrenos salados, con abundante humedad, salinas costeras y lechos limosos de río y torrentes del interior. Ecología: Saladares Distribución: Región mediterránea y zonas limítrofes. En el norte de África resulta común, siendo especie dominante en grandes humedales salados, desde el Mediterráneo al Sahara y desde el Atlántico hasta Asia Menor. 42 6.6 Inula crithmoides Clasificación científica: Reino:…....Plantae División:...Magnoliophyta Clase:….….Magnoliopsida Orden:…...Asterales Familia:....Asteraceae Género:… Inula Especie:….I. crithmoides Nombre común: Salsona. Distribución por provincias: Comunidad Valenciana, Cataluña, Islas Baleares. Distribución general: Pluriregional. Época de floración: Agosto - Octubre. Formas vitales: Caméfito. Hábitat: Zonas litorales de suelos salinos. Categoría IUCN: Poco preocupante. Descripción: Caméfito de hasta 100 cm de altura, glabro, raramente glanduloso. Mata leñosa, con hojas simples y alternas, lineares, carnosas, de margen entero. Inflorescencias en capítulos solitarios o formando corimbos o panículas, hemisféricos. Brácteas dispuestas en varias filas, imbricadas, formando un involucro, 49 8.1 Introducción La delimitación de las parcelas experimentales y de los puntos de control y áreas de muestreo se han decido teniendo en cuenta, entre otros factores, la vegetación existente y la presencia de suficientes individuos de las especies de interés seleccionadas para los análisis bioquímicos y enzimáticos. El proyecto se desarrollará en una zona sometida a estrés salino y por esto se han elegido las parcelas en función de un gradiente en salinidad. En cuanto a la toma de muestras, el número de especies que seleccionaremos para realizar la determinación de distintos marcadores bioquímicos y enzimáticos será limitado, dado el gran número de ensayos a realizar, con un número elevado de muestras. La selección de las especies ha sido que por cada parcela de estudio, se elijan no más de 6 táxones. En lo posible se incluirán taxones representados en las cuatro parcelas. Los taxones elegidos serán: Juncus maritimus, Juncus acutus, Limonium sp. pl. , Sarcocornia fruticosa, Arthrocnemum macrostachyum, e Inula crithmoides., teniendo en cuenta la presencia de suficientes ejemplares en las parcelas de muestreo. La identificación de las especies vegetales en campo se realiza siguiendo la clave de especies de Mateo & Crespo (2001) “Manual para la identificación de la flora valenciana.” (2ª edición). De cada uno de dichos táxones se tomarán muestras, en cada área, de tres a cinco individuos para realizar un mínimo tratamiento estadístico de los datos de los ensayos bioquímicos (determinación de distintos metabolitos). En las muestras de material vegetal recolectadas, se realizarán medidas de la Prolina, determinándose por el método clásico de Bates et al. (1973). En cada parcela de muestreo se tomarán tres muestras compuestas de suelo de unos 15 cm superficiales. Los muestreos se realizarán en verano y otoño del 2010 del año del proyecto y serán analizadas por los edafólogos implicados en el proyecto de investigación 50 8.2 Trabajo de campo Toma de muestras: El equipo de investigación realiza el diseño de la toma de muestras a partir de datos bioquímicos, edafológicos y botánicos, en relación con los objetivos principales del estudio. Se toma las muestras con un mínimo de materia pero representativa para el análisis en el laboratorio. Se seguirá los procedimientos de recogida de muestras anteriores a este estudio para permitir correlaciones. Teniendo en cuenta los objetivos del estudio, la toma de muestras se realiza de forma selectiva o dirigida, basada en criterios no probabilísticos. Por tanto, la elección de los individuos y la recolección de muestras se ejecutan basándose en un juicio previo. La variabilidad temporal de los datos será a consecuencia de realizar los muestreos en dos estaciones diferentes, una en verano y la otra en otoño. La posibilidad de realizar un muestreo en invierno se descarta debido a la falta o baja existencia de material. Así pues, obtenemos un seguimiento anual de la cuantificación de prolina en diferentes especies vegetales. La zonificación viene dada por la elección de una zona salina, con cuatro parcelas de estudio separadas y las cuales son representativas de la zona. En cada una de las cuatro parcelas se realiza el mismo procedimiento. Una vez establecidas las coordenadas UTM de cada parcela, se marca mediante una estaca de referencia para posteriores muestreos. Dicha estaca señala la coordenada de origen (0,0) a partir de la cual, y mediante el uso de jalones y cinta métrica, se crea una parcela de dimensiones 10x10 con las direcciones X e Y establecidas y registradas. Esta cuadriculación tiene como objetivo, la obtención de datos edafológicos mediante sondas y la ubicación del material vegetal para posteriores recogidas. Dicho trabajo ya fue realizado por el equipo del proyecto global, por lo que las muestras recogidas y estudiadas en este proyecto es la continuación del global. La parcela 1 es la mas alejada de las otras sitúa en el borde de un viejo río, el cual suele ir vacío, y es, por tanto, la de menor contenido en sales. La parcela 2 y 3 se 51 hallan muy próximas y son las que se encuentran en una pequeña precipitación del terreno, y la parcela 4 se encuentra de forma intermedia entre las restantes parcelas. Los diferentes contenidos en sales se realizan a través de los datos obtenidos con un conductímetro de campo. Como resultado, diferenciamos la parcela 1 con salinidad baja, la parcela 2 con salinidad media y las parcela 3 y 4 con salinidad alta. Recogida de material vegetal: Se procede a la recogida del material vegetal previamente identificado como especies de interés para el estudio. En los casos en que la existencia de individuos y el volumen de su masa lo permitan, se recogen muestras de entre 5 y 50 gramos de cinco individuos de la misma especie, eligiendo siempre los tallos y las hojas verdes que presenten un estado óptimo. Cuando el volumen de la planta no permite recoger un mínimo de 5 gramos sin producir daños importantes, se recogerá varios individuos de una misma especie y se mezclarán. Es de vital importancia recolectar en cantidades suficientes para el análisis, pero siempre sin producir daños irreversibles en los individuos, ya que estos deben llegar a la siguiente toma de muestras con un nivel de estrés natural, no inducido por el muestreo y por la propia conservación de la zona para el disfrute y posibles estudios posteriores. Una vez recolectado el material, se señala cada individuo con un alambre de color y se registra su ubicación en la parcela para facilitar posteriores muestreos. El transporte de las muestras del campo al laboratorio de análisis, se realiza de forma inmediata tras el muestreo, y mediante neveras que garanticen su estabilidad en condiciones de altas temperaturas. Pre tratamiento del material vegetal: El pre tratamiento del material vegetal en el laboratorio, se realiza de forma continua a la toma de muestras con el fin de evitar posibles alteraciones. Primero se realiza una selección de tallos y hojas verdes, desechando todo material seco. La selección se pesa en una balanza de precisión recogiendo los pesos, los cuales serán divididos en dos paquetes. Uno de ellos será el “material fresco”, y el otro, tras pasar por la estufa, constituirá el “material seco”. 52 Se toma registro de los pesos: peso total, peso del material con destino a la estufa y peso del material fresco. A continuación, se almacenan los paquetes de “material fresco” en un congelador a -80ºC para su conservación hasta el análisis del marcador bioquímicos (Prolina). Los paquetes de “material destino estufa” se depositan en una estufa de 65ºC durante un mínimo de 72 horas, hasta observar que su peso es constante. Tras ello, se pesan de nuevo dejando constancia en el registro de su nuevo peso (peso seco) y se almacenan a temperatura ambiente. Con los datos obtenidos de peso del material con destino a la estufa y peso seco, de cada muestra, se calcula el porcentaje de materia seca de cada muestra mediante la formula: Los resultados servirán para la comparación de los niveles de prolina entre especies de diferentes contenidos hídricos. 53 8.3 Trabajo de laboratorio Cuantificación de Prolina: La cuantificación de prolina se ha realizado en las muestras en estado fresco, siguiendo la metodología descrita por Bates et. al (1973) modificada. o Material: Micropipetas de 10 ml, 5ml, 1000µl, 200 µl y 20 µl. Baño. Centrífuga Espectofotometro. Tubos de ensayo de 10 ml. Tubos Eppendorf de 2ml. Morteros Embudos de cristal Lana de vidrio. Balanza de precisión. Vortex. Nitrógeno liquido. Hielo o Reactivos de derivación: Ácido 5-sulfosalicílico (Sigma, CAS 5965-83-3) L-prolina (Sigma, CAS 147-85-3) Ácido orto-fosfórico 85% (Panreac, CAS 66-64-38-2) Tolueno (CAS Panreac, 108-88-3) Ácido acético glacial (Panreac, CAS 64-19-7) Ninhidrina (Sigma, CAS 485-47-2) o Preparación de los reactivos - El Tolueno y el Ácido acético glacial (AAG), con compuestos ya preparados. - Ácido ortofosforico 6M: Se echa 24 ml de Ac. Ortof. 15M (85%) con 36 ml de agua destilada para conseguir 60 ml de Ac.ortof 6M. - Prolina 2mM: Se pesa 0,575 gr de L-prolina 1M y se mezcla con 50 ml de agua destilada para coseguir 100mM. De estos 100mM de prolina se coge un 1ml y se mezcla con 9 ml de agua destilada para conseguir 10 ml de prolina 54 10mM. De estos 10mM de prolina se coge 2ml y se mezcla con 8 ml de agua destilada para conseguir 10ml de prolina 2mM, que es la disolución deseada para realizar el método. - Ácido sulfosalicilico 3%: Se mezcla 3gr de Ácido 5-sulfosalicílico y se enrasa a 100ml con agua destilada. - Compuesto: Se diluye la Ninhidrina en Ácido acético glacial calentando en el baño a 60ºC y agitando en el vortex hasta su completa disolución. Posteriormente se le añade ácido ortofosforico 6M. Se guarda en nevera a 4ºC hasta su uso. Se mantiene estable durante 24 horas, por lo que se ha de preparar cada día que se vaya a realizar el método. o Procedimiento experimental: - Primero se prepara el acido-ninhidrina. - En segundo lugar se rellena los 7 tubos de ensayo de 10 ml, para realizar la curva patrón, los cuales contendrán las cantidades reflejadas en la siguiente tabla, una vez que ya contienen la prolina 2mM y el Ac.sulfosalicilico se les añade 1ml de Ac. Ninhidrina y 1ml de Ac. Acetico glacial. Se tapan, se agitan en el vortex y se reservan. - Curva estándar de prolina en 7 tubos de ensayo de 10 ml se vierten: Nº tubo Prol.2mM (ml) Ac.sulfosalicilico (ml) 1 0 1000 2 5 995 3 12,5 987.5 4 25 975 5 37,5 962.5 6 50 950 7 75 925 - En tercer lugar se procede a la extracción de la prolina en las especies a estudiar, de modo que lo primero que se hace es pesar 0,25g 55 aproximadamente de tejido foliar en la balanza analítica, recogiendo el peso para cálculos posteriores. - La muestra se tritura en un mortero y con la ayuda de nitrógeno líquido se consigue una pulverización del material. A este se le introduce 2ml de ac. sulfosalicilico 3% alternos para conseguir una buena homogenización del material. Seguidamente se vierte el contenido del mortero en un eppendorf de 2ml y cuando se tiene todas las muestras se introducen en la centrifugadora a 133,5 rpm a 25 ºC durante 15 minutos. - Transcurrido el tiempo se filtra el material por un embudo con lana de vidrio a un tubo de plástico, asegurándose de obtener 1 ml de extracto. A este tubo se le ha añadir 1ml de ninhidrina y otro de ac. acético glacial, y una vez preparada la mezcla se agita y se introduce con una gradilla todas las muestras al baño durante 1 hora a 100 ºC. - Trascurrido el tiempo se detiene la reacción depositando los tubos en hielo durante 10 minutos. - Verter a cada tubo 2 ml de tolueno y agitar en vortex durante 20 segundos, una vez parada la reacción. - El derivado de la ninhidrina se extrae con tolueno aspirandose 1 ml de la fase superior, y se analiza por absorbancia en el espectofotometro a 520 nm. Usar para el calibrado el cero de prolina (tubo numero 1). 56 8.4 Cálculos En el anexo I del apartado (Tablas), la última columna es el porcentaje de materia seca que interesa saber para la realización de los datos para el cálculo de la cantidad de prolina. En el anexo II, a través de la aplicación de Excel y con los datos obtenidos de las muestras en el espectrofotómetro se calcula la ecuación de la recta de regresión, con su representación gráfica. Con la ecuación obtenida se separa (X) que es la representa la concentración de prolina, y sustituyendo (Y) con los valores obtenidos en la absorbancia en el espectrofotometro se consigue la cantidad de prolina de la muestra. El siguiente paso y cuya cuarta columna representa en la cuadricula del anexo II, es obtener la cantidad de prolina en micromoles de la muestra de estudio. Dado que hemos extraído la prolina de la muestra en 2 ml de ASS y cogido 1 ml, se ha multiplicar por los dos μmoles/ml. Al extraer 1 ml de los 2ml donde se recoge la prolina, la cual se encuentra en el tolueno, también se ha de multiplicar por 2, por lo que se ha multiplicares por 4 los μmoles/ml de prolina obtenidos de la curva patrón para obtener los μmoles de prolina que hay en la muestra. Sin embargo, al utilizar las medidas de μmoles/ml de prolina 10mM, en vez de los μmoles/ml de prolina 2 mM utilizadas en el ensayo, simplificamos los cálculos multiplicando directamente por 2 en vez de multiplicar por 4 y dividir por dos, cuya ecuación queda de esta forma: Dividiendo los μmoles por los gramos de la muestra, se obtiene los μmoles/gr que hay en la especie en peso fresco, con la siguiente formula: Y sabiendo el porcentaje de materia seca y que toda la prolina presente esta en el peso seco, los μmoles/gr se dividen por el porcentaje de materia seca y se multiplican por dicho porcentaje, obteniéndose los μmoles/gr de prolina en peso seco presentes en la especie. El siguiente cálculo es dividir la prolina (micromoles) por el peso de la muestra para obtener la cantidad de prolina de peso fresco por gramo. 57 Después se divide la cantidad de prolina de peso fresco por gramo por el porcentaje de peso seco partido peso fresco, dato obtenido por los cálculos en el anexo I. Por último se saca la media de la prolina de peso seco por gramo de la especie en estudio. Con este dato se confecciona las tablas que representarán las diferentes cantidades de prolina existentes en las especies de estudio para sacar unas conclusiones. 58 9. Tablas 65 In1 0,280 0,0457 0,0913 0,2530 0,3609 23,2558 1,5518 2,2303 1,1385 In2 0,290 0,0473 0,0946 0,2550 0,3708 23,2558 1,5945 In3 0,640 0,1043 0,2086 0,2530 0,8244 23,2558 3,5448 Zona4 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Ja1 0,610 0,0994 0,1988 0,2570 0,7735 55,1486 1,4026 1,1098 0,3216 Ja2 0,280 0,0457 0,0913 0,2500 0,3652 54,0695 0,6754 Ja3 0,350 0,0571 0,1141 0,2500 0,4564 53,0677 0,8601 Ja4 0,560 0,0913 0,1825 0,2520 0,7242 54,8660 1,3200 Ja5 0,520 0,0847 0,1695 0,2510 0,6752 52,3096 1,2908 Lim1 0,280 0,0457 0,0913 0,2510 0,3638 52,7368 0,6897 0,7009 0,2818 Lim2 0,190 0,0310 0,0620 0,2550 0,2431 52,6316 0,4619 Lim3 0,180 0,0294 0,0587 0,2530 0,2321 51,2500 0,4529 Lim4 0,310 0,0505 0,1011 0,2500 0,4043 53,4530 0,7564 Lim5 0,470 0,0766 0,1532 0,2530 0,6055 52,9500 1,1435 Sf1 0,078 0,0128 0,0255 0,2580 0,0989 25,7315 0,3842 0,4305 0,1061 Sf2 0,110 0,0180 0,0359 0,2540 0,1414 35,2793 0,4009 Sf3 0,130 0,0212 0,0424 0,2540 0,1671 27,4114 0,6096 Sf4 0,110 0,0180 0,0359 0,2500 0,1437 43,4487 0,3308 Sf5 0,110 0,0180 0,0359 0,2530 0,1420 33,2665 0,4269 Am1 0,100 0,0163 0,0327 0,2510 0,1302 27,4038 0,4750 0,4888 0,1210 Am2 0,090 0,0147 0,0294 0,2550 0,1153 26,7565 0,4311 Am3 0,081 0,0132 0,0265 0,2520 0,1051 27,1605 0,3869 Am4 0,140 0,0228 0,0457 0,2520 0,1813 27,3901 0,6621 Tabla 2: Cálculos para la obtención del contenido medio de prolina de las especies en las diferentes zonas de estudio en el periodo de verano. Leyenda: m: muestra. Abs: Absorbancia. Prol: Prolina (micromol/ml). Proli. esp: Prolina (micromol/ml) en la especie. P.m: Peso muestra. Prol Pf/gr: Prolina en la muestra seca por gramo. % Ps/ Pf: Porcentaje de peso seco de lamuestra por el peso fresco. M: Media del contenido de la concentración de prolina. D: Desviación de la media. 66 9.3 Prolina verano Alicante Verano 15/07/2010 ZONA 1 Muestra Verano Ja 1,1044 Sf 0,6205 Jm 1,0359 LimI 0,8212 Fig 4. Valor medio del contenido de prolina en las especies muestreadas de la zona 1 en el periodo de verano. ZONA 2 Muestra Verano Sf 0,6936 Jm 1,3511 Am 0,3717 Fig 5. Valor medio del contenido de prolina en las especies muestreadas de la zona 2 en el periodo de verano. 67 ZONA 3 Muestra Verano Sf 0,3650 Jm 1,3448 Lim 1,0583 Am 0,3632 In 2,2303 Fig 6. Valor medio del contenido de prolina en las especies muestreadas de la zona 3 en el periodo de verano. ZONA 4 Muestra Verano Ja1 1,1098 Sf1 0,4305 Lim1 0,7009 Am1 0,4888 Fig 7. Valor medio del contenido de prolina en las especies muestreadas de la zona 4 en el periodo de verano. 68 9.4 Datos otoño Lugar Almacen Zona Especie P. total P.f.a secar P.s+papel P.s+papel.estufa %P.s/P.f Torre 12-Caja3 A Z1 Ja1 67,340 33,420 35,670 14,870 41,688 Torre 12-Caja3 A Z1 Ja2 45,900 23,350 25,360 10,720 42,271 Torre 12-Caja3 A Z1 Ja3 40,320 21,350 23,310 10,320 44,273 Torre 12-Caja3 A Z1 Ja4 32,330 17,720 19,730 8,400 42,575 Torre 12-Caja3 A Z1 Ja5 40,180 20,600 22,810 9,920 43,490 Torre 12-Caja3 A Z1 Sf1 25,450 12,600 14,640 3,810 26,025 Torre 12-Caja3 A Z1 Sf2 60,000 30,100 32,210 6,220 19,311 Torre 12-Caja3 A Z1 Sf3 24,830 12,350 14,340 3,640 25,384 Torre 12-Caja3 A Z1 Sf5 48,720 25,730 27,800 4,780 17,194 Torre 12-Caja4 A Z1 Jm1 35,720 17,900 19,900 9,180 46,131 Torre 12-Caja4 A Z1 Jm2 28,570 15,400 17,600 8,390 47,670 Torre 12-Caja4 A Z1 Jm3 18,980 10,500 12,770 6,520 51,057 Torre 12-Caja4 A Z1 Jm4 31,550 16,360 18,560 8,800 47,414 Torre 12-Caja4 A Z1 Jm5 36,070 18,870 21,080 9,640 45,731 Torre 12-Caja4 A Z1 Lim 1 16,850 9,400 11,620 4,300 37,005 Torre 12-Caja4 A Z1 Lim 2 12,600 8,500 10,400 3,800 36,538 Torre 12-Caja4 A Z2 Am1 37,600 22,600 24,690 7,330 29,688 Torre 12-Caja4 A Z2 Am2 42,670 19,250 21,080 6,080 28,843 Torre 12-Caja4 A Z2 Am3 28,990 15,030 16,890 5,160 30,551 Torre 12-Caja4 A Z2 Am4 29,510 15,950 17,840 5,380 30,157 Torre 12-Caja4 A Z2 Am5 21,310 9,970 11,770 4,040 34,325 Torre 12-Caja4 A Z2 Am6 32,210 16,000 18,000 5,600 31,111 Torre 12-Caja6 A Z2 Sf1 30,050 16,130 17,830 4,150 23,275 Torre 12-Caja6 A Z2 Sf2 51,550 25,900 27,640 5,630 20,369 Torre 12-Caja6 A Z2 Sf3 36,270 16,860 18,670 4,590 24,585 Torre 12-Caja6 A Z2 Sf4 26,720 14,300 15,900 3,980 25,031 Torre 12-Caja6 A Z2 Sf5 23,370 11,700 13,620 3,840 28,194 Torre 12-Caja5 A Z2 Jm1 16,380 9,700 11,330 5,600 49,426 Torre 12-Caja5 A Z2 Jm2+3a 19,650 9,960 11,650 5,650 48,498 Torre 12-Caja5 A Z2 Jm2+3b 19,650 9,960 11,650 5,650 48,498 Torre 12-Caja5 A Z2 Jm4 16,650 8,650 10,620 5,340 50,282 Torre 12-Caja5 A Z2 Jm5 15,300 8,810 11,040 5,690 51,540 Torre 12-Caja5 A Z3 Am1 57,040 27,180 29,220 7,210 24,675 Torre 12-Caja5 A Z3 Am2 53,530 24,300 27,460 6,950 25,310 Torre 12-Caja5 A Z3 Am3 66,410 33,770 35,780 8,900 24,874 Torre 12-Caja5 A Z3 Am4 63,040 31,890 33,900 8,080 23,835 Torre 12-Caja5 A Z3 Am5 65,360 33,250 35,270 8,690 24,639 69 Torre 12-Caja5 A Z3 Sf1 56,380 27,150 29,360 7,330 24,966 Torre 12-Caja5 A Z3 Sf2 78,950 34,740 36,930 7,600 20,579 Torre 12-Caja5 A Z3 Sf3 60,620 30,500 32,610 7,040 21,588 Torre 12-Caja5 A Z3 Sf4 57,770 27,400 29,590 6,230 21,054 Torre 12-Caja5 A Z3 Sf5 73,130 35,250 37,310 7,230 19,378 Torre 12-Caja6 A Z3 Jm1 36,190 21,500 23,540 10,330 43,883 Torre 12-Caja6 A Z3 Jm2 18,820 9,520 11,580 5,760 49,741 Torre 12-Caja6 A Z3 Jm3 13,700 9,080 11,090 5,590 50,406 Torre 12-Caja6 A Z3 Jm4 15,270 9,280 11,350 5,690 50,132 Torre 12-Caja6 A Z3 Jm5 13,500 7,260 9,340 4,800 51,392 Torre 12-Caja6 A Z3 Ic1 19,260 11,320 13,310 3,160 23,742 Torre 12-Caja6 A Z3 Ic2 34,180 16,300 18,530 4,030 21,749 Torre 12-Caja6 A Z3 Lim 73,480 33,000 35,160 9,640 27,418 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf1 28,200 13,860 15,770 4,530 28,725 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf2 28,400 13,660 15,660 4,010 25,607 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf3+6a 36,930 18,800 20,640 5,070 24,564 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf3+6b 36,930 18,800 20,640 5,070 24,564 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf4 27,070 15,160 17,130 5,010 29,247 Torre 12-Caja8 A Z4 Sf5 37,060 18,320 20,040 4,620 23,054 Torre 12-Caja8 A Z4 Am1+3a 27,490 14,000 16,890 4,580 27,117 Torre 12-Caja8 A Z4 Am1+3b 27,490 14,000 16,890 4,580 27,117 Torre 12-Caja8 A Z4 Am2 24,520 12,330 14,370 4,880 33,960 Torre 12-Caja8 A Z4 Am4 34,570 17,770 20,000 5,140 25,700 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja1 28,030 14,500 16,480 8,260 50,121 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja2 20,300 10,560 12,860 6,910 53,733 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja3+4a 28,000 14,470 16,860 8,980 53,262 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja3+4b 28,000 14,470 16,860 8,980 53,262 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja5 34,930 17,300 19,100 9,540 49,948 Torre 12-Caja8 A Z4 Ja6 20,230 10,450 12,750 6,800 53,333 Torre 12-Caja8 A Z4 Lim 19,300 10,900 12,810 5,420 42,311 Tabla 3. Pesos recogidos de las muestras de estudio en el periodo de otoño con los porcentajes de Ps/ Pf para el calculo de la concentración de prolina. Leyendas: Lugar: Representa el lugar de almacenamiento del material vegetal en el congelador. Zona: Zona de estudio de donde ha sido extraído el material. Especie: Abreviatura del nombre de la especie. P. total: Peso total de la muestra. P.f. a secar: Peso fresco a secar de la muestra en la estufa. P.s+papel: Peso fresco a secar de la muestra en la estufa con el papel como recipiente. 70 P.s+papel estufa: peso seco como resultado de la seca. %P.s/P.f: ((P.s+papel estufa) dividido por (P.s+papel)) por 100. T: Torre ; C: Caja ; Z: Zona ; A: Alicante ; P: Peso Ja: Juncus acutus ; Lm: LimoniumI ; Sf: Sarcocornia fructicosa; Am: Arthrocremum macros; Ic: Inula crithomoides ; Jm: Juncus maritimus . 71 9.5 Cálculos otoño Alicante-Otoño Ecuación 1: Prolina Nº.tubos (μmoles/ml) Abs (520nm) 1 0,000 0,000 2 0,010 0,040 3 0,025 0,100 4 0,050 0,240 5 0,075 0,450 6 0,100 0,580 7 0,150 0,900 Fig 8. Ecuación de la recta de regresión de la zona 1 y parte de la 2ª zona en el periodo de otoño Zona1 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Ja1 0,200 0,0374 0,0748 0,2510 0,2978 41,6877 0,7144 0,8684 0,1741 Ja2 0,340 0,0602 0,1204 0,2590 0,4649 42,2713 1,0997 Ja3 0,230 0,0423 0,0845 0,2560 0,3302 44,2728 0,7459 Ja4 0,230 0,0423 0,0845 0,2570 0,3289 42,5748 0,7726 Ja5 0,310 0,0553 0,1106 0,2520 0,4390 43,4897 1,0093 Sf1 0,023 0,0085 0,0171 0,2540 0,0671 26,0246 0,2579 0,2646 0,0223 Sf2 0,010 0,0064 0,0128 0,2570 0,0499 19,3108 0,2582 Sf3 0,020 0,0080 0,0161 0,2580 0,0623 25,3835 0,2454 Sf5 0,010 0,0064 0,0128 0,2510 0,0510 17,1942 0,2969 Jm1 0,990 0,1662 0,6646 0,2510 2,6479 46,1307 5,7399 5,9206 3,9496 Jm2 0,420 0,0732 0,2930 0,2520 1,1625 47,6705 2,4387 Jm3 0,960 0,1613 0,6451 0,2540 2,5396 51,0572 4,9740 Jm4 0,680 0,1156 0,4625 0,2550 1,8137 47,4138 3,8252 Jm5 0,990 0,1662 1,4954 0,2590 5,7737 45,7306 12,6254 Lim1-A 0,460 0,0798 0,1595 0,2520 0,6330 37,0052 1,7106 1,3301 0,4618 Lim1-B 0,470 0,0814 0,1628 0,2520 0,6459 37,0052 1,7456 Lim2-A 0,220 0,0406 0,0813 0,2530 0,3212 36,5385 0,8792 Lim2-B 0,250 0,0455 0,0911 0,2530 0,3599 36,5385 0,9850 Zona2 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Am1 0,330 0,0586 0,1171 0,2550 0,4594 29,6881 1,5473 1,1803 0,4430 Am2 0,300 0,0537 0,1074 0,2560 0,4194 28,8425 1,4540 Am3 0,130 0,0260 0,0519 0,2530 0,2053 30,5506 0,6719 Am4 0,100 0,0211 0,0422 0,2520 0,1673 30,1570 0,5547 72 Am5 0,350 0,0618 0,1237 0,2520 0,4907 34,3246 1,4296 Am6 0,320 0,0569 0,1139 0,2570 0,4431 31,1111 1,4243 Sf1 0,630 0,1075 0,2149 0,2530 0,8496 23,2754 3,6501 1,6703 1,3048 Sf2 0,100 0,0211 0,0422 0,2530 0,1666 20,3690 0,8180 Sf3 0,280 0,0504 0,1008 0,2570 0,3924 24,5849 1,5959 Sf4 0,370 0,0651 0,1302 0,2550 0,5105 25,0314 2,0394 Sf5 0,025 0,0089 0,0177 0,2530 0,0700 28,1938 0,2482 Ecuación 2: Prolina Nº.tubos (μmoles/ml) Abs (520nm) 1 0,000 0,000 2 0,010 0,066 3 0,025 0,130 4 0,050 0,260 5 0,075 0,420 6 0,100 0,580 7 0,150 0,880 Fig 8. Ecuación de la recta de regresión de la zona 1 y parte de la 2ª zona en el periodo de otoño. Zona2 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Jm1 0,690 0,1194 0,3581 0,2540 1,4099 49,4263 2,8525 1,7276 0,9271 Jm2+3a 0,360 0,0631 0,1261 0,2530 0,4985 48,4979 1,0278 Jm2+3b 0,730 0,1262 0,2524 0,2580 0,9783 48,4979 2,0171 Jm4 0,810 0,1398 0,2797 0,2540 1,1012 50,2825 2,1899 Jm5 0,200 0,0358 0,0715 0,2520 0,2837 51,5399 0,5505 Zona3 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Am1 0,140 0,0255 0,0510 0,2530 0,2017 24,6749 0,8173 1,0027 0,2927 Am2 0,230 0,0409 0,0817 0,2550 0,3206 25,3095 1,2665 Am3 0,230 0,0409 0,0817 0,2550 0,3206 24,8742 1,2887 Am4 0,100 0,0187 0,0374 0,2580 0,1449 23,8348 0,6077 Am5 0,180 0,0323 0,0647 0,2540 0,2546 24,6385 1,0335 Sf1 0,072 0,0139 0,0278 0,2530 0,1099 24,9659 0,4404 0,6454 0,2268 Sf2 0,120 0,0221 0,0442 0,2570 0,1720 20,5795 0,8357 Sf3 0,100 0,0187 0,0374 0,2530 0,1477 21,5885 0,6842 Sf4 0,050 0,0102 0,0203 0,2520 0,0806 21,0544 0,3827 Sf5 0,120 0,0221 0,0442 0,2580 0,1713 19,3782 0,8840 Jm1 0,860 0,1484 0,5935 0,2520 2,3552 43,8828 5,3671 3,2930 1,9256 Jm2 0,800 0,1381 0,5526 0,2560 2,1584 49,7409 4,3394 73 Jm3 0,480 0,0835 0,2506 0,2540 0,9866 50,4058 1,9573 Jm4 0,760 0,1313 0,5253 0,2530 2,0761 50,1322 4,1413 Jm5 0,240 0,0426 0,0852 0,2510 0,3393 51,3919 0,6601 Ecuación 3: Prolina Nº.tubos (μmoles/ml) Abs (520nm) 1 0,000 0,000 2 0,010 0,066 3 0,025 0,150 4 0,050 0,290 5 0,075 0,420 6 0,100 0,640 7 0,150 0,980 Fig 8. Ecuación de la recta de regresión de la zona 1 y parte de la 2ª zona en el periodo de otoño Zona3 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Ic1 0,150 0,0256 0,0512 0,2560 0,1999 23,7415 0,8418 0,9243 0,3192 Ic2A 0,100 0,0179 0,0357 0,2510 0,1423 21,7485 0,6544 Ic2B 0,210 0,0348 0,0697 0,2510 0,2777 21,7485 1,2766 Lim A 0,930 0,1460 0,8760 0,2540 3,4489 27,4175 12,5793 9,1623 5,9320 Lim B 0,510 0,0812 0,1623 0,2560 0,6341 27,4175 2,3127 Lim C 0,920 0,1445 0,8668 0,2510 3,4532 27,4175 12,5950 Zona4 M Abs Prol Prol. esp P. m ProlPf/gr %P.s/P.f Prol Ps/gr M D Sf1 0,700 0,1105 0,3315 0,2560 1,2949 28,7254 4,5077 1,4503 1,5213 Sf2 0,190 0,0318 0,0635 0,2540 0,2501 25,6066 0,9765 Sf3+6a 0,100 0,0179 0,0357 0,2580 0,1385 24,5640 0,5637 Sf3+6b 0,250 0,0410 0,0820 0,2580 0,3180 24,5640 1,2945 Sf4 0,140 0,0240 0,0481 0,2520 0,1908 29,2469 0,6523 Sf5 0,120 0,0210 0,0419 0,2570 0,1630 23,0539 0,7072 Am1+3a 0,150 0,0256 0,0512 0,2510 0,2038 27,1166 0,7517 0,9563 0,4024 Am1+3b 0,100 0,0179 0,0357 0,2530 0,1412 27,1166 0,5207 Am2 0,380 0,0611 0,1222 0,2510 0,4868 33,9596 1,4334 Am4 0,220 0,0364 0,0728 0,2530 0,2877 25,7000 1,1193 Ja1 0,380 0,0611 0,1222 0,2530 0,4829 50,1214 0,9635 3,6247 3,7296 Ja2 0,610 0,0966 0,1932 0,2530 0,7636 53,7325 1,4212 Ja3+4a 0,990 0,1553 1,2421 0,2530 4,9097 53,2622 9,2179 Ja3+4b 0,810 0,1275 1,0198 0,2550 3,9993 53,2622 7,5087 74 Ja5 0,740 0,1167 0,2333 0,2500 0,9334 49,9476 1,8687 Ja6 0,320 0,0518 0,1037 0,2530 0,4097 53,3333 0,7682 Lim A 0,220 0,0364 0,0728 0,2530 0,2877 42,3107 0,6799 0,5919 0,1303 Lim B 0,140 0,0240 0,0481 0,2570 0,1871 42,3107 0,4421 Lim C 0,210 0,0348 0,0697 0,2520 0,2766 42,3107 0,6536 Tabla 4: Cálculos para la obtención del contenido medio de prolina de las especies en las diferentes zonas de estudio en el periodo de otoño. Leyenda: m: muestra. Abs: Absorbancia. Prol: Prolina (micromol/ml). Proli. esp: Prolina (micromol/ml) en la especie. P.m: Peso muestra. Prol Pf/gr: Prolina en la muestra seca por gramo. % Ps/ Pf: Porcentaje de peso seco de lamuestra por el peso fresco. M: Media del contenido de la concentración de prolina. D: Desviación de la media. 81 10. Resultados y discusión 82 En Juncus acutus,se observa una diferencia muy notable entre las muestras correspondientes a la zona 1 y la zona 4, ya que en la zona 1 existe una disminución de prolina del 0.236 μmoles/g en relación a las muestras recogidas en verano-otoño. Sin embargo en la zona 4 existe un aumento del 2.515 μmoles/g. En Sarcocornia fruticosa existe una clara diferencia entre la zona 1 y la zona 3, ya que en la zona 1 se aprecia una disminución del 0.619 μmoles/g en prolina entre el periodo de estudio, mientras que en las demás zonas existe un aumento en prolina del 0.976 μmoles/g, 0.280 μmoles/g, 1.020 μmoles/g respectivamente, observándose que en la zona 4 es la que recoge un mayor aumento. En Juncus maritimus, los datos obtenidos nos indican que en las zonas de estudio con este material vegetal existe un aumento generalizado, siendo en la zona 1 la que mas cantidad de prolina se mide con 4.885 μmoles/g respecto a las demás zonas con cantidades del 0.378 μmoles/g y 1.948 μmoles/g respectivamente. En Limonium, existe aumento durante los periodos de estudio tanto en la zona 1 como en la zona 2, experimentando un considerable aumento en la zona 3 con valores de 8.104 μmoles/g, cuyo valor representa la mayor cantidad de prolina obtenida en todas las zonas de estudio. Por lo contrario en la zona 4 se observa una pequeña disminución de prolina del 0.121 μmoles/g. En Arthrocnemum macrostachyum se observa que es bastante regular en el aumento de la concentración de prolina durante el periodo de estudio en las diferentes zonas, ya que recoge un aumento del 0.843 μmoles/g, 0.640 μmoles/g, 0.467 μmoles/g respectivamente de las zonas 2, 3, Y 4. En Inula crithmoides, no se puede decir mucho ya que solo se tiene los datos de la zona 3, cuya cantidad nos indica una disminución en la concentración de prolina del 1.306 μmoles/g en el periodo de verano-otoño. La prolina se acumula en las plantas durante la adaptación a varios tipos de estrés ambiental (Claussen, 2005). El aumento de la radiación solar y la temperatura al final de verano desencadena una serie de mecanismos de defensa antioxidante contra el estrés, incluyendo la acumulación de solutos compatibles como la prolina. Por lo tanto la respuesta de las plantas es cualquier alteración tanto estructural como funcional que se producen en los vegetales como consecuencia de un estrés. Siendo la resistencia y tolerancia al estrés la capacidad de la planta para sobreponerse a condiciones medioambientales desfavorables. 83 Los efectos causados por los diferentes factores de estrés aparecen como respuesta no inmediata, demorándose durante algún tiempo después del comienzo del estímulo ambiental. Lo cual demuestra nuestros datos obtenidos con el incremento de la concentración de prolina en la segunda toma de material realizada en otoño. Los resultados obtenidos en este trabajo, muestran un aumento significativo en el contenido de prolina en hojas, cuando las plantas fueron sometidas a concentraciones de NaCl, alcanzándose los valores más altos en el periodo de otoño. La acumulación de prolina bajo condiciones de estrés se puede producir por la inducción o la activación de las enzimas de biosíntesis de la prolina (P5CS u OAT), por la reducción de la oxidación de prolina a glutamato (PDH), por un bajo uso de prolina en la síntesis de proteínas, o por un aumento de la degradación de proteínas (Claussen, 2005). La acumulación de prolina también depende de su degradación, catalizada por la enzima mitocondrial PDH, que transforma la L-prolina en Q1-pirrolin-2-carboxilato (P5C) mediante consumo de O2 y producción de H2 (Hare et al., 1999). En general, ante ciertos tipos de estrés (deshidratación y estrés salino) se produce una inhibición drástica de la actividad PDH donde la prolina podría actuar como un compuesto osmorregulador (Claussen, 2005). Existen numerosos datos en la bibliografía sobre la acumulación de prolina en condiciones de estrés. Mencionamos brevemente algunos de estos estudios: o En plantas transgénicas de tabaco se ha producido una mayor cantidad de prolina, mejorando así su tolerancia a las sales. Sin embargo, también se han obtenido evidencias de una mayor acumulación de este aminoácido en genotipos sensibles a sales, lo que sugiere que la respuesta en cuanto a la acumulación de prolina es compleja y en algunos casos, más que una causa de tolerancia a sales, podría ser un sensor del grado de estrés al que está sometido la planta. o Varios autores han informado de incrementos en el contenido de prolina en las plantas cuando se dejan de regar, en comparación con plantas bajo riego (Barnetty Naylor, 1966; Hanson y Tully, 1979). Esta acumulación, según Aspinall y Paleg (1981), Barnett y Naylor, (1966) Singh et al. (1973a) y Andrade et al. (1995) se inicia por una reducción en el potencial de agua en los tejidos de las 84 células, como respuesta a la adaptación de las plantas cuando son sometidas a estrés hídrico. o Muchas especies vegetales cuando son cultivadas en sustratos con diferentes niveles de salinidad aumentan el contenido de prolina en sus tejidos. El aumento de sales en la solución del suelo ocasiona disminución de los potenciales hídrico y osmótico del suelo, lo cual se refleja en el estado hídrico de la planta; es decir, la planta tiende a perder agua, por lo que la planta debe mantener un potencial hídrico más negativo que el sustrato para asegurar la absorción de agua (Buchanan et al., 2000). También ante esta situación, esta bien establecido la inducción de una señal (ABA) en la raíz la cual alcanza las hojas gracias a la transpiración para inducir el cierre de estomas (Wilkinson & Davies, 2002), reduciéndose así la pérdida de agua. De hecho, el estado hídrico foliar interactúa con la conductancia estomática y transpiración bajo deficiencia hídrica y una buena correlación ha sido a menudo observada entre potencial hídrico foliar y conductancia estomática (Medrano et al, 2002). 85 11. conclusiones 86 Los beneficios inmediatos del estudio se centran, en principio, en contribuir al avance del conocimiento sobre los mecanismos de tolerancia a estrés abiótico de las plantas, por otro, en ecosistemas naturales sometidos a diversas condiciones de estrés ambiental. El estudios correlacionará los datos obtenidos con las características edafoclimáticas del hábitat y con los cambios espacio-temporales en dichas características. Nuestros datos pueden contribuir a establecer estrategias de conservación o restauración apropiadas para ecosistemas amenazados, y por tanto a evitar la pérdida de biodiversidad. Los resultados relativos a los mecanismos de respuesta a estrés en táxones tolerantes en sus hábitats naturales pueden proporcionar información útil para seleccionar alguna de estas especies halófilas, para profundizar, en un futuro, en el estudio de los mecanismos de respuesta a estrés a nivel molecular. Por otra parte, y en línea con nuestra idea de que las plantas silvestres adaptadas a condiciones específicas de estrés constituyen un recurso genético infrautilizado, a partir de ellas podrían aislarse genes de tolerancia a estrés, y sus promotores, para ser utilizados como herramientas biotecnológicas para la mejora genética molecular de la tolerancia a estrés abiótico en plantas cultivadas. En resumen, estas plantas silvestres podrían utilizarse como modelos alternativos (o, más correctamente, complementarios) al de Arabidopsis thaliana, para investigaciones en este tema concreto. 87 12. Bibliografía 88 Andrade, J.L., LarquéSaavedra, A.; Trejo López, C. 1995. Proline accumulation in leaves of four cultivars of Phaseolus vulgaris L. with different drought resistance. Fyton 57(2): 149 157. Arshi, A., M.Z. Abdin, M. Iqbal 2005.Ameliorative effects of CaCl2 on growth, ionic relations and praline content of Senna under salinity stress. Plant Nutr. 28: 101-125. Aspinall, D. and L. G. Paleg. 1981. Proline accumulation: physiological aspects. In: Paleg, L. G Y D. Aspinall (eds.). The Physiology and Biochemistry of Drought Resistance in Plantas. Academic Press, Australia. pp. 205-241. Attipalli R.R., V.C. Kolluru, V. Munusamy 2004. Drought-induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. J. Plant Physiol. 161: 1189-1202. Avendaño C.H., C. Trejo, C. López, J. D. Molina, A. Santacruz, F. Castillo 2005. Comparación de la tolerancia a la sequía de cuatro variedades de maíz (Zea mays L.) y su relación con la acumulación de prolina. INCI 9: 560-564. Azcón-Bieto, J. y M. Talón. 1993. Fisiología y bioquímica vegetal. Editorial McGraw-Hill Interamericana, Nueva York. pp. 285-326. Azevedo A.D., J. Tarquinio, J. Enéas-Filho, C. Feitosa, J. Vieira, P.H. Alves, E. Gomes-Filho 2004. Effects of salt stress on plant growth, stomatal response and solute acumulation of different maize genotypes. Braz. J. Plant Physiol.1: 31-38. Barnett, N. M. & Naylor, A. W. (1966). Amino acid and protein metabolism in Bermuda grass durung water stress. Plant Physiology, 41, 1222. Bates L.S. 1973. Rapid determination of free proline for waterstress studies. Plant Soil 39: 205–207. Brugière N., F., Dubois, A.M., Limami, M., Lelandais, Y., Roux, R.S., Sangwan, B., Hirel. 1999. Glutamine synthetase in the phloem plays a major role in controlling proline production. Plant Cell 11: 1995–2011. Buchanan B.B., W. Gruissem, R.L. Jones 2000. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. Rockville, Maryland. USA. 1367 p. Camara, B. (1993) Plant phytoene synthase complex: component enzymes, immunology, and biogenesis. Methods Enzymol. 214: 352-365. Chinnusamy, V., and J.-K. Zhu. 2003. Plant salt tolerance. Topics. Curr. Genet. 4:241– 270. Crespo, M. B. & M. D. LLedó (1998). El género Limonium en la Comunidad Valenciana. Generalitat Valenciana. Conselleria de Medi Ambient. València. 89 Delauney A.J., D.P.S., Verma 1993. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant Journal 4: 215–223. E. Fintan Walton and John R. Pringle. Effect of growth temperature upon heat sensitivity in Saccharomyces cerevisiae. Volume 124, Numbers 2-3, 285-287. Epstein and Mills. (2005). Climate change and Human health. N Engl J Med 353: 1433–1436. Flora Ibérica. Plantas vasculares de la Península Ibérica y Baleares. Real Jardín Botánico de Madrid. Hanson Ad. Re Tully 1979 Light stimulation of proline synthesis in water-stressed barley leaves. Planta 145: 45-51. Hare P.D., W.A. Cress 1997. Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regulation 21: 79-102. Hare P.D., W.A. Cress, L. Van Ataden 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Envir. 21: 535-553. Hare, M. D, T. Hummasaeng, K., Suriyajantratong, W., Wongpichet, K., Saenghum, M., Tatsapong, P., Kaewkunya, C. and Boonchareen. 1999a. Pasture grass and legume evaluation on seasonally waterlogged and seasonally dry soils in north-east Thailand. Tropical Grasslands, 33, 65–74. Harsh, N. 2003. Accumulation of osmolytes and osmotic adjustment in water-stressed wheat (Triticum aestivum) and maize (Zea mays) as affected by calcium and its antagonists. Envirronmental and Experimental Botany 50: 253-264. Hasegawa, P.M., R.A., Bressan, J-K, Zhu, H.J., Bohnert. 2000. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 463499. Herbario Virtual del Mediterráneo Occidental. Àrea de Botànica, Departament de Biologia, Universitat de les Illes Balears. Iyer, S., A. Caplan 1998. Products of proline catabolism can induce osmotically regulated genes. Plant Physiology 116: 203-211. Jackson, R.B., and Caldwell, M.M. 1993. The scale of nutrient heterogeneity around individual plants and its quantification with geostatistics. Ecology, 74: 612-614. Jiménez-Bremont,J. F. A.Becerra-Flora, E. Hernández-Lucero, M. Rodríguez-Kessler, J. A. Acosta-Gallegos and J. G. Ramírez-Pimentel. 2006. Proline accumulation in two bean cultivars under salt stress and the effect of polyamines and ornithine. Biologia Plantarum 50: 763-766. 90 Kavi Kishor P.B., S. Sangam, R.N. Amrutha, P. Sri Laxmi, K.R. Naidu, K.R.S.S. Rao, Sreenath Rao, K.J. Reddy, P.Theriappan and N. Screenivasulu 2005. Regulation of proline biosynthesis, degradation,uptake and transport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Current Science 88 (3): 424438. Kavi Kishor P.B., Z. Hong, G.H. Miao, C.A.A. Hu, D.P.S. Verma. 1995. Overexpression of "1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiology 108: 1387–1394. Konstantinova, T., D. Parvanova, A. Atanassov, D. Djilianov. 2002. Freezing tolerant tobacco, transformed to accumulate osmoprotectants. Plant Science. 163: 157-164. Kleb, H.R. & Wilson, S.D. (1997). Vegetation effects on soil resource heterogeneity in prairie and forest. American Naturalist 150: 283–298. Lacerda, C.F. 2004. Changes in growth and in solute concentrations in sorghum leaves and roots during salt stress recovery. Environmental and Experimental Botany 54: 6976. Laguna E et al. (1998). Flora endémica, rara o amenazada de la Comunidad Valenciana. Ed. Gen. Valenciana. Consejería de Medio Ambiente. Laguna E et al. (2003). Hábitats prioritarios de la Comunidad Valenciana. Ed. Generalitat Valenciana. Conselleria de Territori i Habitatge. Larcher, W. 1977. Ecofisiología Vegetal. Ed.Omega, 305 pp. Lin y Kao, 1995. Cell wall peroxidase activity, hydrogen peroxide level and NaClinhibited root growth of rice seedlings . Volume 230, Number 1: 135-143. Martínez Sánchez, J.J., Conesa, E., Vicente, M.J. , Jiménez, A. , Franco, J.A. (2006). Germination responses of Juncus acutus (Juncaceae) and Schoenus nigricans (Cyperaceae) to light and temperature. Journal of Arid Environments, 66: 187–19. Mateo, G & M. B. Crespo (2001). Manual para la determinación de la flora valenciana. 2ª ed. Valencia. Medrano, H., J.M. Escalona, J. Bota, J. Gulias, J. Flexas 2002. Regulation of photosynthesis of C3 plants in response to progressive drought stomatal conductance as a reference parameter. Annals of Botany 89: 895-905. Misra N., Dwivedi UN. 2004. Genotypi difference in salinity tolerance of green gram cultivars. Plant Sci. 166: 1135-1142. Munn, I.A., S.A. Barlow, D.L. Evans, and D. Cleaves. 2002. Urbanization's impact on timber harvesting in the south central United States. Journal of Environmental Management 64:65-76.