Efectos de los cationes calcio y magnesio sobre la germinación de semillas de Juncus en condiciones de estrés salino

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA ESCUELA POLITECNICA SUPERIOR DE GANDIA LI C E N C I A D A E N C I E N C I A S A M B I E N T A L E S “Efectos de los cationes calcio y magnesio sobre la germinación de semillas de Juncus en condiciones de estrés salino” TRABAJO FINAL DE CARRERA Autor/es: Elena Sarria Perea Director/es: Mónica Bosaciu Neagu Óscar Vicente Meana GANDIA, 2010 Dedicado a mi tutora, familia, amigos y a todas aquellas personas que con su apoyo han hecho posible la realización de este proyecto. A todos gracias ÍNDICE Índice 4 ÍNDICE.............................................................................................................................4 INTRODUCCIÓN............................................................................................................4 1. La Albufera y su Devesa.......................................................................................5 2. Plantas halófitas ..................................................................................................14 3. Características de las especies estudiadas...........................................................17 4. Efectos de las sales NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 sobre las plantas................................22 4.1. Efectos del NaCl. .............................................................................................22 4.2. Efectos del CaCl 2 .............................................................................................23 4.3. Efectos del MgCl 2. ...........................................................................................23 Sobre los efectos que el cloruro de magnesio puede causar en la germinación de las plantas halófilas no se encuentra apenas información, se puede decir que es una gran desconocida. No obstante, está comprobado que todas las sales producen efectos inhibitorios sobre este tipo de plantas, si bien es cierto que no todas actúan con la misma intensidad........................................................................................................................23 OBJETIVOS...................................................................................................................25 MATERIAL Y METODOS............................................................................................28 1. Material.......................................................................................................................29 1.1. Material biológico............................................................................................29 1.2. Material de laboratorio.....................................................................................29 2. Métodos ..................................................................................................................30 2.1. Germinación de las semillas. ...........................................................................30 2.2. Análisis de los datos. .......................................................................................33 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................34 1. FASE 1: Ensayos previos. ......................................................................................35 4.1.1. Efecto del NaCl.............................................................................................35 1.2. Efecto DE CaCl 2 .............................................................................................36 1.3. Efectos de MgCl 2 .............................................................................................38 2. Fase 2: Estudio sobre la influencia de los cationes Ca 2+ y Mg 2+ en la germinación de semillas de juncos en condiciones de estrés salino. ................40 CONCLUSIONES..........................................................................................................51 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................55 INTRODUCCIÓN Introducción 5 1. La Albufera y su Devesa. A lo largo de la historia tanto del lago de la Albufera como de la Devesa fueron, durante siglos, propiedad real. Posteriormente pasaron a formar parte del patrimonio estatal hasta que en 1927 fueron “cedidos” al Ayuntamiento de Valencia. La larga pertenencia a la corona española y las restricciones en la explotación para los ciudadanos, explican que estos espacios naturales mantuvieran un estado de conservación aceptable a pesar de estar cerca de núcleos densamente poblados e intensamente desarrollados. A finales de los años 60, en pleno “boom” del turismo español, se inicia un proceso de urbanización en la Devesa que altera gravemente los ecosistemas, situación que se repite en todo el litoral mediterráneo español. El cordón dunar exterior fue arrasado casi en su totalidad, las depresiones interdunares rellenadas con arena y repobladas por eucaliptos y la alineación dunar interior fue fragmentada con la construcción de carreteras, edificios y estructuras hidráulicas y eléctricas. A finales de los años 70 la presión popular frenó la destrucción de este espacio y en 1983 el ayuntamiento de Valencia aprobó el Plan Especial de Protección y Reforma Interior del Monte de la Devesa de El Saler que constituyó el instrumento jurídico base en el principio de la recuperación de los ecosistemas. Hoy en día y desde 1986, la Devesa forma parte del Parque Natural de la Albufera de Valencia. En 1981 con la finalidad de conservar y recuperar, desde su ámbito competencial el conjunto natural constituido por la Devesa, la Albufera y el arrozal, el Ayuntamiento de Valencia crea la Oficina Técnica Devesa-Albufera (OTDA). Dependiente de esta y con objeto de producir la planta autóctona necesaria para recuperar estos espacios naturales, se crean los Viveros Municipales del Saler, pineros en estas características en toda España. El Espacio Natural formado por el lago de la Albufera y su entorno fue declarado Parque Natural el 8 de julio de 1.986. Cuenta con una superficie de 21.000 hectáreas repartidas en trece términos municipales: Valencia, Alfafar, Catarroja, Silla, Sueca, Sollana, Massanassa, Sedaví, Albal, Albalat de la Ribera, Cullera, Beniparrell y Algemesí. Introducción 6 Figura 1: Localización del Parque natural de la Albufera El Parque de la Abufera diferencia cuatro habitats característicos por su flora y fauna, los cuales se describen a continuación: -La Devesa de la Albufera es una estrecha franja litoral que forma parte de la restinga, que separa el lago del mar Mediterráneo, orientada NNO a SSE, de una longitud aproximada de 12 Km y de anchura variable, que oscila entre 1 y 1.5 Km, la cual cerró el golfo de Valencia convirtiéndolo en Albufera. De origen aluvial cuaternario, la Devesa se localiza a 9Km al sur de Valencia capital y tiene una superficie de 850ha. En ella se conjugan una serie de factores climáticos y edáficos tan variados que dan lugar a una diversidad de ecosistemas de gran valor, entre los cuales se diferencian, el ecosistema dunar, el bosque estabilizado y las depresiones interdunares que reciben el nombre de malladas. Introducción 7 Es en la actualidad uno de los fenómenos litorales más interesantes de la Península Ibérica, tanto por su extensión como por ser uno de los pocos medios sedimentarios palustres todavía funcionales. - Marjal: tierras que anteriormente formaban parte del lago y que ahora están dedicadas al cultivo del arroz. Sus cerca de 14.000 hectáreas son la área más extensa del Parque, representando las zonas llanas inundables y formando un paisaje agrario con gran significado histórico en el contexto valenciano. Aunque se trata de un medio antropizado y sometido a un régimen de explotación intensiva, el arrozal constituye un hábitat imprescindible para el funcionamiento del sistema ecológico de la Albufera y una actividad económica tradicional de la población de la zona. El arrozal confiere una clara estacionalidad a todo el sistema, con las alternancias de inundación/desecación de los campos y el crecimiento de la planta, que hacen variar considerablemente la extensión y características de la superficie inundada. - Lago: tiene una superficie media de 2800 Ha, de las cuales 350 son de vegetación palustre. En él hay que diferenciar, de una parte, las aguas libres y, por otra, las orillas y matas, cuya conjunción posibilita el desarrollo de su característica diversidad de comunidades vegetales y animales. La profundidad del lago es escasa, con una media inferior a los 80 cm, aunque en algunos puntos llega a alcanzar los 2 metros. El lecho del lago se compone, por lo general, de finos limos con un elevado contenido en materia orgánica. - Monte: las zonas de montaña están escasamente representadas, únicamente cabe nombrar los relieves de origen cretácico situados en el término de Cullera (Cabeçol) y en el término de Sueca (relieve calcáreo dels Sants de la Pedra). Las parcelas 2 y 3 de nuestra zona de estudio se encuentran dentro de la Devesa o restinga del Parque Natural de la Albufera. Más concretamente los juncales que existen en la Devesa los encontramos en las llamadas “malladas”. Introducción 8 Figura 2: Reconstrucción de las unidades geomorfológicas de la Devesa . Dentro de los cuatro habitat mencionados anteriormente, se prestará especial interés a la Devesa, ya que en ella se encuentran las formaciones conocidas con el nombre de “malladas”, en las cuales se hallan las especies estudiadas. Se trata de pequeñas cuencas endorreicas situadas entre los cordones dunares. Estas depresiones se caracterizan por la proximidad del nivel freático y la existencia de una capa impermeable de naturaleza limosa en su base, lo que permite su encharcamiento temporal, coincidiendo con la época de lluvias. Originariamente las malladas ocupaban un extenso territorio en las costas valencianas. Esta superficie se vio disminuida por una serie de actuaciones realizadas sobre todo a partir de la década de los años cincuenta que han conducido a la casi total desaparición de las mismas, aunque en la actualidad se han llevado a cabo programas de recuperación de estos espacios (sobre todo a partir del año 1987) que consisten en el vaciado mecánico. Las zonas de malladas se encuentran generalmente recubiertas de una delgada capa de limos y arcillas. En el subsuelo, las arenas continúan hasta una profundidad de unos 15 m y bajo ellas se ha detectado una capa continua de limos. En la Comunidad valenciana, las malladas de la Devesa del Saler son las mejor estudiadas desde el punto hidrogeológico, edafológico y fitosociológico. Las aguas almacenadas en el subsuelo de la Devesa proceden de las lluvias y de las infiltraciones laterales desde el Lago de la Albufera. Como se ha mencionado anteriormente, el límite inferior del acuífero lo constituye una capa de limos, que por presentar una permeabilidad mucho más baja que la de las arenas impide o retrasa enormemente el descenso de las aguas a mayor profundidad. Introducción 15 del suelo tiende a aumentar junto con los potenciales osmóticos. Además la germinación de las semillas en regiones áridas y semiáridas y concretamente en la zona mediterránea donde se encuentran la gran mayoría de las especies de halófilas en España, por lo general ocurre después de las lluvias por que es cuando la salinidad del suelo disminuye y tiene lugar para la época de otoño y primavera. La germinación de halófilas podría ser inhibida en condiciones de salinidad debido a; 1) una inhibición completa de la germinación por superar el límite de tolerancia a la salinidad de la especie, 2) el retraso de la germinación de semillas en las salinidades que causan alguna tensión a estas, 3) pueden causar la pérdida de variabilidad de semillas debido a la alta salinidad y la temperatura y 4) el trastornando del equilibrio regulador del crecimiento en el embrión. Hay muchos otros factores aparte de la salinidad que también afectan a la germinación como son la humedad, la luz, aumento de temperaturas y sus interacciones. (Khan & Weber, 2008). Entre los diferentes factores que afectan a las plantas halófilas uno de los más relevantes es el estrés salino, el cual es producido por la elevada concentración de iones El estrés salino tiene dos componentes que afectan negativamente al crecimiento de vegetal: - Componente osmótico: La elevada concentración salina provoca un descenso del potencial hídrico del suelo, es decir, se hace más negativo aunque aumenta el valor absoluto, lo cual induce estrés hídrico en las plantas. - Componente iónico: Son los efectos tóxicos provocados por altas concentraciones de iones. Caben destacar el Cl - y Na + ya que son de los más abundantes y tóxicos para las plantas, aunque existen otros que también pueden ocasionar problemas(García Ortola, 2002). Con el paso del tiempo las plantas halófitas, como todo ser vivo, han ido adaptándose a las condiciones hostiles que caracterizan a su entorno(habitat), mediante de una serie de mecanismos entre los que se encuentran: - ELIMINACIÓN DE SALES (excreción): quizás es el comportamiento de auto-protección más inmediatamente observable. Este ajuste está caracterizado por la secreción de sales a través de poros epidérmicos, glándulas y cámaras localizadas en las raíces, brotes y hojas de las plantas. Los mecanismos de transporte intercelular movilizan el exceso de iones salinos desde las células de la superficie hacia el Introducción 16 exterior de la hoja o tallo dejando unos depósitos de cristales visibles una vez se ha evaporado el agua. Las halófitas más evolucionadas utilizan este mecanismo a menudo para desalinizar sus fluidos internos excretando iones de sodio y cloro en los periodos más críticos de su desarrollo (García Ortola, 2001). - COMPARTIMENTACIÓN: la acumulación o compartimentación del exceso de sales en ciertos órganos de la planta es otro método de exclusión que predomina en el nivel radicular. Como resultado del cierre de los estomas y tasas de transpiración reducidas, muchas halófitas son capaces de confinar el exceso de sales en su extenso sistema radicular y en las partes más bajas del brote con el objetivo de restringir la translocación hacia el resto de la planta. - SELECTIVIDAD IÓNICA: virtualmente, todas las halófitas y algunas glicófitas son capaces de excluir los iones sodio y cloro de su corriente de nutrientes absorbidos. La exclusión de las sales por parte de las raíces se describe habitualmente en términos de sustitución elemental o de selección iónica preferente por el potasio sobre el sodio. Además, las halófitas verdaderas son conocidas por tener raíces con una capa protectora externa y una membrana interna con ceras que filtra las sales efectivamente mientras permite pasar las sales. - OSMORREGULACIÓN: el mantenimiento del equilibrio osmótico requiere la síntesis y acumulación en el citoplasma de osmolitos (compuestos solubles compatibles), que son metabólicamente inactivos y no tóxicos, incluso a concentraciones elevadas. Estos compuestos orgánicos son principalmente azúcares (trehalosa, sacarosa), polialcoholes (glicerol, sorbitol, manitol) y algunos aminoácidos y derivados (prolina, glicina betaina). Además de mantener el equilibrio osmótico en condiciones de estrés salino, los osmolitos actúan como sustancias osmoprotectoras, estabilizando directamente proteínas y membranas celulares en condiciones de deshidratación, y protegiendo a las células del estrés oxidativo, al inactivar “especies reactivas de oxigeno” (GENO). Introducción 17 - DILUCIÓN: Como respuesta al estrés salino algunas halófilas acumulan agua en las vacuolas de las células de sus tallos y hoja, que les confiere aspecto crasuláceo. El aumento del volumen de vacuola permite una mayor acumulación de iones tóxicos. 3. Características de las especies estudiadas Las dos especies estudiadas en el proyecto pertenecen a la familia de las Juncáceas o Juncaceae, dentro de la cual se distinguen el género LUZULA y el género JUNCUS (Mateo Sanz & Crespo Villalba). En general, las plantas del género Juncus son herbáceas, anuales o perennes (estas rizomatosas en la mayoría de las especies), siempre glabras. Tallos erectos o ascendentes, a veces radicantes en los nudos (en ocasiones parcialmente sumergidos), cilíndricos o ligeramente comprimidos, lisos o estriados. Hojas todas basales o basales y caulinares; vainas foliares provistas en general de márgenes escariosos, los cuales en muchos casos se prolongan en dos aurícula; limbos foliares planos, canaliculados, convolutos, semicilíndricos, cauliformes, o cilíndricos septado nudosos. Inflorescencia pauciflora o multiflora frecuentemente en antela compuesta, formando a veces las ramas terminales cimas drepaniformes, fascículos o glomérulos (Fernández-Carvajal, 1981). TAXONOMIA Delimitación de los subgéneros: en la revisión del género Juncus en la Península Ibérica (Fernández-Carvajal, 1981) se adopta el sistema propuesto por Buchenau (1906) de separación del género Juncus en subgéneros, basándose fundamentalmente en la diferenciación de estos en caracteres foliares (estructura, disposición). El autor describe ocho subgéneros: I. Juncus subgen. Juncus II. Juncus subgen. Genuini Buchenau III. Juncus subgen. Subulati Buchenau Introducción 18 IV. Juncus subgen. Pseudotenageia Krecz. & Gontsch. in Komarov V. Juncus subgen. Poliophylli Buchenau VI. Juncus subgen. Juncinella (Fourr.) Krecz. & Gontsch. in Komarov VII. Juncus subgen. Septati Buchenau VIII. Juncus subgen. Alpini Buchenau Las dos especies estudiadas pertenecen al subgénero Juncus que presenta las características que se describen a continuación (según Fernández-Carvajal, 1982): Plantas perennes, erectas, fuertes, punzantes, en general densamente cespitosas. Hojas todas basales, cilíndricas, no septadas, con vainas no auriculadas. Médula de los tallos y hojas continua, constituida por células parenquimatosas, redondeadas o redondeado-poliédricas. Inflorescencia terminal o pseudolateral, antelada. Flores originalmente reunidas en número de 2-5 en fascículos o glomérulos, sin bracteolas involucrales. Anteras más largas que los filamentos. Semillas apendiculadas por prolongación de la testa. Especie tipo: Juncus acutus L. Distribución general: por todo el mundo, aunque principalmente áreas templadas y subtropicales. Representación en la Península Ibérica por las especies: J. maritimus Lam. , J. acutus L. y J. littoralis C.A.Meyer.(GENO). ESPECIES ESTUDIADAS JUNCUS ACUTUS. L. Nombre común: Junco silvestre, junquera. Descripción: Hierba perenne dé (25-)40-180(-200) cm de alto, densamente cespitosa, con un grueso y breve rizoma. Tallos muy fuertes, erguidos, cilindricos, (l,5-)2-4 mm diámetro, ligeramente estriados en seco. Vainas básales de color avellana o castaño, brillantes, algunas afilas y 2-5 provistas de limbo cilindrico, muy fuerte, similar al tallo Introducción 19 y ordinariamente menor que éste, punzante; aurículas ausentes. Inflorescencia antelada, multiflora, 3-20(-28) cm de longitud pudiendo presentarse desde compacta, globosa hasta alargada, laxa. Bráctea inferior pareciendo continuación del tallo, 3-28 (-42) cm largo, con una amplia vaina; la superior casi siempre más corta que la inflorescencia, raramente igualándola; ambas punzantes. Flores solitarias o agrupadas en glomérulos, en número de 2-5. Tépalos iguales o subiguales, oblongos, 2,4-3,5(-4) mm largo, rígidos, de color castaño al menos superiormente; los externos subcimbiformes obtusos o subagudos, mucronados, con estrechos márgenes escariosos; los internos obtusos, mucronados, provistos de amplias aurículas escarioso-hialinas. Estambres en número de 6, poco más cortos que los segmentos periánticos; anteras de (1-) 1,3-1,8 mm, aproximadamente 3-4 veces más largas que los filamentos. Estilo 0,5-0,8 mm largo; estigmas 1,5-2 mm largo. Cápsula ferruginea o castaña, brillante, incompletamente trilocular, ovoide-subesferoidea, apicalmente cónica, brevemente mucronada, 4-5,5(-6) mm largo, alcanzando por tanto, 1,5-2 veces la longitud del perianto. Semillas ferrugíneas, oblicuamente ovoides, con estriación longitudinal apenas marcada, (1-) 1,21,7 mm incluyendo los apéndices escarioso-hialinos (iguales o subiguales) que forman la testa, generalmente en número superior a 80. Ecología. Convive con J. maritimus formando parte de las praderas-juncales salinas del litoral e interior, sobre suelos que permanecen húmedos prácticamente durante todo el año. También es frecuente formando amplios rodales en las dunas próximas a las desembocaduras de corrientes de agua dulce . Corología: mediterraneo-atlantica Distribución general: Europa occidental; región mediterránea; Islas Canarias; Madeira; este de Norteamérica; zonas cálido-templadas de Sudamérica; sur de África; Australia; Nueva Zelanda. Tipo biológico: hemicriptófito, cespitoso Fenología: mayojulio. Abundancia: media Introducción 20 Foto 1: J. acutus (herbário virtual) Foto 2: J. acutus en habitat dunar. JUNCUS MARITIMUS. Lam. Nombre común: Junco marino. Descripción: Planta verde-pajiza, perenne, con una altura de 4-15 dm aunque en muchas ocasiones puede sobrepasar 1 m de altura, con un grueso rizoma horizontal de 2,5-8 mm de diámetro y entrenudos de longitud muy variable. Tallos erectos, cilindricos de (1-) 1,5-2,5 (-3,5) mm de diámetro, lisos o suavemente estriados en seco, rodeados inferiormente de 2-5 vainas de color pardo, brillantes, afilas, mucronadas. Hojas todas básales, en número de 2-4, con el limbo cilindrico, punzantes, casi siempre más cortas que el tallo y, como éste, provistas de médula continua. Inflorescencia antelada, multiflora de 2,5-25(-42) cm de largo, ordinariamente laxa, aunque en ocasiones se presenta más o menos contraída. Bráctea inferior apareciendo como continuación del Introducción 21 tallo, punzante, igualando, no alcanzando o superando la longitud de la inflorescencia; bráctea superior también punzante pero mucho más breve y delgada que la anterior. Flores ordinariamente pajizas o verde-amarillentas, solitarias o en fascículos de 2-3(-7); segmentos del perianto desiguales, con anchos márgenes escarioso-hialinos, los externos ovados, cimbiformes, agudos, brevemente mucronados, (2,5-)3-3,6(-4) mm de largo; los internos más cortos (2,l-)2,5-3(-3,5) mm, estrechamente elípticos, obtusos. Seis estambres (raramente 3) alcanzando casi los 2/3 de la longitud del perianto; anteras de 0,8-l,5(-l,8) mm, aproximadamente (l,5-)2(-2,5) veces más largas que los filamentos (0,4-0,7 mm). Estilo 1,2-1,5 mm; estigmas cortos. Cápsula trilocular 2,5-4 mm de longitud, trígono-ovoide, obtusa o subaguda, mucronada, igualando o excediendo ligeramente el perianto, de color amarillento a pardo claro, poco brillante. Semillas oblicuamente ovoideas, apendiculadas por prolongación de la testa, de 0,7-1,2 mm de largo, longitudinalmente estriadas, pardas. Ecología. Entra a formar parte de las praderas-juncales, típicamente halófilas, que se desarrollan sobre suelos permanentemente húmedos, ricos en cloruros— especialmente cloruro sódico — y con carbonatos alcalino-térreos (juncales calizosubsalinos). Dichas agrupaciones son incluibles en la alianza Junción maritimi Br.-Bl. 1931 — Juncetalia maritimi Br.-Bl. 1931 Juncetea maritimi Br.-Bl. (1931) Corología: subcosmpolita. Distribución general: Europa occidental y central; región mediterránea; África septentrional; Asia occidental; introducida en Norteamérica, aunque, según SNOGERUP (NlLSSON & SNOGERUP, 1972:208), ahora se ha extinguido. SNOGERUP (1971:4) señala que existen muchas citas incorrectas de otras áreas. Tipo biológico: neófito, rizomatoso. Fenología: julio-septiembre. Abundancia: abundancia media. Introducción 22 Foto 3: J. maritimus (hebario virtual) Foto 4: J. maritimus 4. Efectos de las sales NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 sobre las plantas 4.1. Efectos del NaCl. El ión más tóxico en suelos salinos es el catión Na+ aunque esto no significa que otros iones no lo puedan ser. ¿Cómo daña la presencia de Na+ al metabolismo de la planta? - (1) Las proteínas que proporcionan una estructura óptima a la planta necesitan de un ambiente iónico adecuado, si se incrementa la concentración de sales cambiamos la configuración de estas proteínas ya que disminuyen los enlaces electrostáticos y aumentan los enlaces hidrofóbicos, pudiendo cambiar la función de la proteína lo cual afecta al metabolismo. Introducción 23 - (2) La presencia elevada de iones también afecta a las membranas. El efecto más espectacular lo vemos cuando pasamos una planta de baja a alta concentración iónica, la planta halófita presentará síntomas de schock salino y se da un flujo de iones K+ hacia el medio exterior y la consiguiente desecación de la planta.. Si realizamos el cambio más paulatinamente a un ambiente con más fuerza iónica también tendremos efectos en las membranas pero no tan drásticos, serán efectos más tardíos, se produce un incremento en la absorción de K+ y consecuentemente semanas después daños en la mb. - (3) Debido a la competencia entre iones nutritivos y el NaCl, por ejemplo inhibición competitiva del K+ por el Na+ , interacciones en la absorción de Ca y Mg y también déficit de P aunque no por inhibición competitiva del K+ por el Na+, sinó más bien por un menor crecimiento radicular, menor eficacia para captarlo del suelo con aumento del flujo de masa de Ca2+. 4.2. Efectos del CaCl 2 . Para crecer, las plantas necesitan un suministro adecuado de calcio, el cual entra en la planta disuelto en el agua que las raíces absorben del suelo circundante. A medida que el agua circula a través de la planta, el calcio es fijado donde sea necesario para aportar a las células vegetales su rigidez estructural. Los suministros de calcio que entran en la planta oscilan en el transcurso del día, cayendo a un mínimo en la noche. El calcio es un regulador clave de las funciones fisiológicas vitales tanto en los vegetales como en los animales. Las plantas sometidas a estrés salino debido a la toxicidad ejercida por los iónes de Na + y Cl se ven afectadas negativamente. En algunos estudios se ha observado que cuando se les añade calcio, la funcionalidad se reestablece en parte, ya que el CaCl 2 protege a la membrana de los efectos adversos de la salinidad proporcionándole más estabilidad. 4.3. Efectos del MgCl 2. Sobre los efectos que el cloruro de magnesio puede causar en la germinación de las plantas halófilas no se encuentra apenas información, se puede decir que es una gran desconocida. No obstante, está comprobado que todas las sales producen efectos Introducción 24 inhibitorios sobre este tipo de plantas, si bien es cierto que no todas actúan con la misma intensidad Material y métodos cada uno de los sectores de cada placa Petri. Es decir, se ponen dos placas con cuatro replicas y un total de 100 semillas para cada tratamiento y por especie. 4. Las placas se incuban en la cámara de germinación a 25ºC 5. Se hace un recuento de las semillas germinadas durante un mes, en las distintas condiciones ensayadas. 6. Finalmente, en función de los resultados obtenidos, se deciden las concentraciones de las diferentes sales que se utilizarán en el procedimiento experimental. Fase 2: Estudio sobre la influencia de los cationes Ca 2+ y Mg 2+ en la germinación de semillas de juncos en condiciones de estrés salino. Esta es la fase en la que se procede al experimento como tal. Se realiza durante un mes, entre los meses de enero y febrero de 2009, concretamente desde el 13-01-2009 al 15-2-2009 Las concentraciones elegidas han sido: 150 mM para el cloruro sódico, ya que a esta concentración de sal la germinación de las semillas de las dos especies se ve afectada, aunque el efecto no es tan negativo como para llegar a la completa inhibición de la germinación10 mM y 20 mM para el cloruro de calcio y el cloruro de magnesio, concentraciones a las que se aprecia un ligero efecto inhibitorio de la germinación, para ambas sales. A fin de establecer el posible efecto de los iones Ca2+ y Mg2+ sobre la inhibición de la germinación de semillas en condiciones de estrés salino (i.e., en presencia de NaCl), se realizaron los siguientes tratamientos de las semillas, en los ensayos de germinación: 1) Control (sin sal) 2) NaCl 150 mM. 3) NaCl 150 mM + CaCl 2 10 mM 4) NaCl 150 mM + MgCl 2 10 mM 5) NaCl 150 mM + CaCl 2 20 mM 6) NaCl 150 mM + MgCl 2 20 mM Material y métodos 7) NaCl 150 mM + CaCl 2 10 mM + MgCl 2 10 mM 8) NaCl 150 mM + CaCl 2 20 mM + MgCl 2 20 mM PROCEDIMIENTO Igual que el descrito en la fase anterior. Foto 6 : Procedimiento en el laboratorio Foto 7 : Estufa Material y métodos 2.2. Análisis de los datos. El método estadístico con el que se ha llevado a cabo el análisis de los datos utilizados en el estudio, del efecto de los cationes calcio y magnesio sobre la germinación de semillas de Juncus en condiciones de estrés salino, ha sido el ANOVA. Para ello, previamente se necesita una conversión de los datos, que consiste en realizar el arcoseno del porcentaje medio de la germinación obtenida. Una vez normalizados los datos ya se procede a realizar el ANOVA de un factor con un nivel de confianza del 95%, tanto para Juncus acutus como Juncus maritimus, mediante el cual se pretende determinar si existen o no diferencias significativas entre los tratamientos. Las pruebas post-hoc ( el test de Tukey) se aplica para distinguir las diferencias entre todos los tratamientos por pares. Posteriormente se ha realizado un ANOVA de dos factores al igual que el anterior con un nivel de confianza del 95%, donde un factor son los tratamientos y el otro las especies, cuyo fin es averiguar si existen o no diferencias significativas entre las especies y entre los tratamientos RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y Discusión 35 1. FASE 1: Ensayos previos. La primera fase del trabajo se realiza con el objeto de estudiar el efecto de las sales por separado, en cada una de las dos especies estudiadas, con el fin de escoger las concentraciones más adecuadas para lo que sería el propio experimento en si. 4.1.1. Efecto del NaCl El cloruro sódico tiene un efecto inhibidor sobre la germinación en las dos especies. Tanto J.acutus cómo J. maritimus germinan mejor en condiciones sin sal es decir, en los tratamientos control. Conforme aumenta la concentración de la salinidad, la germinación en las dos especies disminuye de forma gradual. En la Figura 4 se presentan los porcentajes finales de germinación para la especie Juncus acutus. En ella se observa un descenso desde un 82% en el control hasta un 1% en 200 mM NaCl y una completa inhibición de la germinación en el tratamiento de 300mM de cloruro sódico. J. acutus 0 20 40 60 80 100 120 140 0mM 50mM 100mM 150mM 200mM 300mM TRATAMIENTOS % GERMINACIÓN Figura 4: Efecto del NaCl en la germinación de Juncus acutus. En la Figura 5 se observa que la respuesta del Juncus maritimus al cloruro sódico es parecida a la anterior si bien se aprecia una tolerancia a sal de la germinación ligeramente mayor; por ejemplo, las semillas de J. maritimus germinan incluso en Resultados y Discusión 36 presencia de 300 mM NaCl, aunque en un porcentaje muy bajo. Los resultados obtenidos concuerdan con los datos previos publicados sobre estas especies (Boscaiu, 2009 y con el comportamiento general de las plantas halófilas. La gran mayoría de halófilas germinan mejor en ausencia de estrés salino, siendo la germinación y el establecimiento de las plántulas el momento más critico del ciclo biológico de estas plantas (Flowers et al., 2008). Muchas plantas halófilas de las zonas mediterráneas germinan en otoño o primavera, cuando el estrés salino en su ambiente es reducido debido al aumento de precipitaciones. El hecho de que las semillas de J. maritimus germinan a mayor concentración de sal concuerda con la ecología de esta planta, siendo una planta aparentemente más tolerante a sal que J. acutus. J. maritimus 0 20 40 60 80 100 120 140 0mM 50mM 100mM 150mM 200mM 300mM TRATAMIENTOS % GERMINACIÓN Figura 5: Efecto del NaCl en la germinación de Juncus maritimus. 1.2. Efecto DE CaCl 2 El efecto del CaCl 2 es bastante conocido en plantas. Hasta ciertas concentraciones tiene un efecto positivo para el desarrollo de las plantas, existiendo incluso fertilizantes agrícolas que contienen esta sustancia. También hay datos a nivel Resultados y Discusión 37 de germinación, conociéndose su efecto paliativo en condiciones de estrés salino (Gul & Khan, 2008). Sin embargo, si la concentración de cloruro de calcio sobrepasa cierto umbral, el efecto sobre las plantas (incluyendo la germinación) es perjudicial. Por este motivo, se han testado una serie de concentraciones desde 1mM hasta 100mM CaCl 2 . Cómo se observa en la Figura 6. no surge ningún efecto que se pudiera considerar significativo hasta la concentración de 10mM CaCl 2 , en la cual el porcentaje de germinación es algo mayor que en el control. A partir de la concentración de 20 mM CaCl 2 se observa una reducción de la germinación, llegando a mermar la germinación hasta la mitad en el tratamiento de 100mM CaCl 2 . El cloruro de calcio, como se puede apreciar en la Figura 3, a altas concentraciones resulta tóxico, y por esta razón la germinación va remitiendo conforme aumenta la concentración de la sal. J. acutus 0 20 40 60 80 100 0mM 10mM 20mM 50mM 75mM 100mM TRATAMIENTOS % GERMINACIÓN Figura 6: Efecto del CaCl2 en la germinación de Juncus acutus. En la Figura 7 se observa que para el J. maritimus esta sal resulta más perjudicial que para la especie anterior. El mayor porcentaje de germinación se registra en el control y llegando a unas condiciones de 75-100mM CaCl 2 , la germinación decrece alcanzando valores de menos del 20%. Resultados y Discusión 38 Figura 7: Efecto del CaCl2 en la germinación de Juncus maritimus. 1.3. Efectos de MgCl 2 Así cómo el efecto del CaCl2 es más estudiado, no hay mucha información sobre el efecto que el magnesio puede causar en la germinación de las semillas y posterior crecimiento de las plantasLos efectos del magnesio sobre plantas sometidas a estrés no han sido apenas estudiados y, que sepamos, nuestra hipótesis no ha sido planteada con anterioridad. Sin embargo, está de acuerdo con datos previos del laboratorio (Boscaiu et al., 2009): En Juncus acutus, los dos cationes divalentes, Ca 2+ y Mg 2+ , se acumulan cuando las plantas se tratan con concentraciones crecientes de NaCl (unas dos veces, comparando las plantas tratadas con 500 mM NaCl y los controles crecidos en ausencia de sal). En Juncus maritimus, que es más tolerante a sal, los niveles de Ca 2+ y Mg 2+ , en ausencia de sal, son de dos a tres veces superiores a los medidos en J. acutus (aunque no aumentan significativamente al ser tratadas con sal). Por este motivo, se comprueba el efecto a distintas concentraciones de cloruro de magnesio en la germinación de las dos especies. J. maritimus 0 20 40 60 80 100 0mM 10mM 20mM 50mM 75mM 100mM TRATAMIENTOS % GERMINACIÓN Resultados y Discusión 39 En el caso de esta sal, las concentraciones testadas han sido menores (de 1 a 50 mM), justamente debido a su toxicidad para plantas. Se observa que concentraciones menores de 50 mM , prácticamente no tienen efecto sobre la germinación en J. acutus (Figura 5). Los porcentajes de germinación son muy parecidos a los obtenidos en el control de aproximadamente 80 % y solamente en una concentración de 50mM se puede notar una reducción del 50% en presencia de concentraciones de 50 mM de cloruro de magnesio. Figura 8: Efecto del MgCl2 en la germinación de Juncus acutus. En la Figura 9 se ve que en J. maritimus, al igual que para la otra especie tampoco hay mucha diferencia con el control (sin sal), el efecto inhibidor del magnesio se manifiesta ya en la concentración de 30mM, que surge una disminución drástica de la geminación. J. acutus 0 20 40 60 80 100 120 140 0mM 1mM 2mM 5mM 10mM 20mM 30mM 40mM 50mM TRATAMIENTOS % GERMINACIÓN Resultados y Discusión 40 J. maritimus 0 20 40 60 80 100 0mM 10mM 20mM 30mM 40mM 50mM TRATAMIENTOS % DE GERMINACION Figura 9: Efecto del MgCl2 en la geminación de Juncus maritimus 2. Fase 2: Estudio sobre la influencia de los cationes Ca 2+ y Mg 2+ en la germinación de semillas de juncos en condiciones de estrés salino. La concentración de NaCl elegida en base a los resultados previos ha sido la de 150mM. Se ha optado por esta concentración, porque se percibe un claro efecto negativo sobre la germinación, pero sin llegar a inhibir completamente este proceso. Las concentraciones de CaCl 2 y MgCl 2 seleccionas han sido de 10 y 20 mM, ya que una concentración mayor sería perjudicial para la germinación de las semillas. En los ensayos de germinación para la segunda fase, se ha incluido siempre un control positivo solamente de agua destilada, y un control negativo con NaCl. En la Figura 10 se observa que el porcentaje de germinación es muy elevado en el control sin sal exactamente de un 94 %, claramente distinto de los demás tratamientos según ANOVA de un factor (Tabla 1). El porcentaje de germinación en presencia de NaCl es muy bajo tan sólo un 4 %, incluso más bajo que el obtenido en el tratamiento Resultados y Discusión 47 La significación (P value) estimada en la siguiente tabla es menor al 0,05, lo cual indica que existen diferencias significativas entre los grupos (tratamientos) para el Juncus maritimus. Tabla 3: ANOVA para Juncus maritimus. ANOVAa Trans Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig. Inter-grupos 2,089 7 ,298 58,702 ,000 Intra-grupos ,122 24 ,005 Total 2,211 31 a. Especie = 2 En el test de comparaciones múltiples o pruebas post-hoc se observa, con un nivel de confianza del 95% , que existen tres grupos distintos entre sí. El tratamiento control sin sal es distinto a todos los demás. En el segundo se incluyen los tratamientos 2 (150mM de NaCl) , 5 (150mM NaCl + 20mM CaCl 2 ), 6 (150mM NaCl + 20mM MgCl 2 ) y 8(150mM NaCl + 20mM CaCl 2 + 20mM MgCl 2 ), y por último el tercer grupo lo forman los tratamientos 3(150mM NaCl + 10mM CaCl 2 ),4 (150mM NaCl + 10mM MgCl 2 )y 7 (150mM NaCl + 20mM CaCl 2 + 10mM MgCl 2 ). Este último grupo de tratamientos, en los cuales se nota el efecto paliativo del CaCl 2 y MgCl 2 con respecto al NaCl, son los de menor concentración (10mM). Tabla 4: Pruebas post-hoc ( comparaciones multiples) para Juncus maritimus. Comparaciones múltiplesa Trans DMS Resultados y Discusión 48 Intervalo de confianza al 95% (I) Tratami ento (J) Tratami ento Diferen cia de medias (I-J) Error típico Sig. Límite inferior Límite superior 2 ,79962* ,05041 ,000 ,6956 ,9037 3 ,50547* ,05041 ,000 ,4014 ,6095 4 ,49102* ,05041 ,000 ,3870 ,5951 5 ,79962* ,05041 ,000 ,6956 ,9037 6 ,79962* ,05041 ,000 ,6956 ,9037 7 ,59877* ,05041 ,000 ,4947 ,7028 1 8 ,74903* ,05041 ,000 ,6450 ,8531 1 -,79962* ,05041 ,000 -,9037 -,6956 3 -,29415* ,05041 ,000 -,3982 -,1901 4 -,30860* ,05041 ,000 -,4126 -,2046 5 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 6 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 7 -,20085* ,05041 ,001 -,3049 -,0968 2 8 -,05060 ,05041 ,326 -,1546 ,0535 1 -,50547* ,05041 ,000 -,6095 -,4014 2 ,29415* ,05041 ,000 ,1901 ,3982 4 -,01444 ,05041 ,777 -,1185 ,0896 5 ,29415* ,05041 ,000 ,1901 ,3982 6 ,29415* ,05041 ,000 ,1901 ,3982 7 ,09330 ,05041 ,077 -,0107 ,1974 3 8 ,24356* ,05041 ,000 ,1395 ,3476 1 -,49102* ,05041 ,000 -,5951 -,3870 2 ,30860* ,05041 ,000 ,2046 ,4126 3 ,01444 ,05041 ,777 -,0896 ,1185 5 ,30860* ,05041 ,000 ,2046 ,4126 6 ,30860* ,05041 ,000 ,2046 ,4126 7 ,10775* ,05041 ,043 ,0037 ,2118 4 8 ,25800* ,05041 ,000 ,1540 ,3621 1 -,79962* ,05041 ,000 -,9037 -,6956 2 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 3 -,29415* ,05041 ,000 -,3982 -,1901 4 -,30860* ,05041 ,000 -,4126 -,2046 6 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 7 -,20085* ,05041 ,001 -,3049 -,0968 5 8 -,05060 ,05041 ,326 -,1546 ,0535 Resultados y Discusión 49 1 -,79962* ,05041 ,000 -,9037 -,6956 2 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 3 -,29415* ,05041 ,000 -,3982 -,1901 4 -,30860* ,05041 ,000 -,4126 -,2046 5 ,00000 ,05041 1,000 -,1040 ,1040 7 -,20085* ,05041 ,001 -,3049 -,0968 6 8 -,05060 ,05041 ,326 -,1546 ,0535 1 -,59877* ,05041 ,000 -,7028 -,4947 2 ,20085* ,05041 ,001 ,0968 ,3049 3 -,09330 ,05041 ,077 -,1974 ,0107 4 -,10775* ,05041 ,043 -,2118 -,0037 5 ,20085* ,05041 ,001 ,0968 ,3049 6 ,20085* ,05041 ,001 ,0968 ,3049 7 8 ,15026* ,05041 ,006 ,0462 ,2543 1 -,74903* ,05041 ,000 -,8531 -,6450 2 ,05060 ,05041 ,326 -,0535 ,1546 3 -,24356* ,05041 ,000 -,3476 -,1395 4 -,25800* ,05041 ,000 -,3621 -,1540 5 ,05060 ,05041 ,326 -,0535 ,1546 6 ,05060 ,05041 ,326 -,0535 ,1546 8 7 -,15026* ,05041 ,006 -,2543 -,0462 *. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05. a. Especie = 2 Finalmente, se han completado los resultados del estudio con la realización del ANOVA de dos factores, el cual se ha aplicado para comprobar si existen diferencias significativas entre las dos especies frente a las diferentes condiciones impuestas por los tratamientos. La significación es menor a 0,05, con un nivel de confianza del 95%: esto indica que la respuesta a los tratamientos es distinta en las dos especies. Estos resultados son bastante lógicos si se tiene en cuenta que una de las especies, concretamente Juncus maritimus es más tolerante a la salinidad que la otra, el Juncus acutus, asíque es normal encontrar diferencias entre ellas. Resultados y Discusión 50 Tabla 5. Resultados de ANOVA de dos factores (un factor el tratamiento y el otro la especie). Pruebas de los efectos inter-sujetos Variable dependiente:Trans Fuente Suma de cuadrados tipo III gl Media cuadrática F Significación Modelo corregido 6,148a 15 ,410 62,795 ,000 Intersección 8,944 1 8,944 1370,311 ,000 Especie ,287 1 ,287 43,935 ,000 Tratamiento 5,275 7 ,754 115,463 ,000 Especie * Tratamiento ,586 7 ,084 12,822 ,000 Error ,313 48 ,007 Total 15,405 64 Total corregida 6,461 63 a. R cuadrado = ,952 (R cuadrado corregida = ,936) CONCLUSIONES Conclusiones 52 Los resultados obtenidos se pueden resumir de la siguiente manera: Efectos de NaCl (150 mM) El NaCl ejerce una inhibición de la germinación en las dos especies. Los mayores porcentajes de germinación se registran en las dos especies en los tratamientos control sin sal, reduciéndose de forma gradual en los de 100, 150 y 200 mM, hasta una completa inhibición en el tratamiento de 300 mM NaCl en Juncus acutus, y un escaso 1% de germinación en J. maritimus. A partir de estos resultados se selecciona una concentración de 150 mM NaCl para la segunda fase del trabajo, por tener un claro efecto, pero sin llegar a una inhibición completa de la germinación. Efectos del CaCl 2 Se comprueba el efecto del CaCl 2 en un rango de cinco concentraciones de 10 mM, 20 mM, 50 mM, 75 mM y 100 mM, junto con los correspondientes controles (germinación en ausencia de sal). En J. acutus se observa una estimulación de la germinación al menos de 10% hasta concentraciones de 10 mM y a partir de 20 mM Ca 2+ una inhibición de la germinación (~ 10%). En J. maritimus se observa una inhibición de la germinación, mayor a10% en la concentración de 10 mM Ca 2+ y a partir de20 mM Ca 2+ una inhibición de la germinación de hasta 20%. Se eligen las concentraciones de 10 y 20mM CaCl 2 para seguir la germinación en presencia de 150 mM NaCl. Conclusiones 53 Efectos del CaCl 2 + NaCl En J. acutus se registra una ligera estimulación de la germinación, dependiente de la concentración, más marcada en el tratamiento de 20 mM CaCl2. En J. maritimus, en la concentración de 10 mM Ca 2+ se registra una estimulación de la germinación hasta > 15% (sobre 0% con NaCl solo) y en el tratamiento de 20 mM Ca 2+ no se ve efecto. Efectos del MgCl 2 Se comprueba el efecto del MgCl 2 en ocho concentraciones de MgCl 2 (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM), junto con los correspondientes controles (germinación en ausencia de sal). En J. acutus la concentración de 10 mM Mg 2+ o 20 mM Mg 2+ no tienen ningún efecto sobre la germinación de semillas y concentraciones superiores ejercen un efecto inhibitorio. En J. maritimus la concentración de 10 mM Mg 2+ no afecta la germinación, pero la de 20 mM Ca 2+ produce una ligera inhibición (~ 10%) Se eligen las concentraciones de 10 y 20mM MgCl 2 para seguir la germinación en presencia de 150 mM NaCl. Efectos del MgCl 2 + NaCl En J. acutus se nota una ligera estimulación de la germinación (sobre el 5% de NaCl solo), dependiente de la concentración (20 mM > 10 mM). En J. maritimus la concentración de 10 mM Ca 2+ induce la estimulación de la germinación hasta > 15% (sobre 0% con NaCl solo), mientras que a una concentración de 20 mM Mg 2+ no se ve efecto. El efecto producido por el magnesio es el mismo que el observado en presencia de calcio. Conclusiones 54 Efectos del MgCl 2 + CaCl 2 + NaCl Se ve el mismo efecto de estimulación de la germinación que con cada uno de los cationes por separado, o ligeramente superior, pero no parece haber un efecto aditivo Parece que el CaCl 2 contrarresta ligeramente la inhibición de la germinación causada por el NaCl. Esto está de acuerdo con el efecto protector del calcio en condiciones de estrés salino, que es bien conocido (Rengel, 1992; Bressan et al., 1998; Gul & Khan, 2008): - El Mg 2+ parece tener el mismo efecto que el Ca 2+ , estimulando la germinación de semillas en condiciones de estrés salino, como se muestra en este trabajo Proponemos que el magnesio, al igual que el calcio, tiene un efecto protector frente al estrés salino en plantas. Tanto el calcio como el magnesio podrían actuar en mecanismos de respuesta contra el estrés salino, que serían constitutivos en J. maritimus e inducibles en J. acutus, que es menos tolerante a sal. La inhibición en presencia de NaCl de diversas actividades enzimáticas (uno de los efectos tóxicos de la sal) se debe al desplazamiento del magnesio, que actúa como cofactor, del centro activo del enzima. Esto se ha comprobado experimentalmente, por ejemplo, en el caso de la enzima Hal2p de levadura, que es inhibida por sodio y litio (Albert et al. 2000). BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 56 ALBERT A, YENUSH L, Gil-MASCARELL MR, RODRÍGUEZ PL, PATEL S, MARTÍNEZRIPOLL M, BLUNDELL TL, SERRANO R. (2000). X-ray structure of yeast Hal2p, a major target of lithium and sodium toxicity, and identification of framework interactions determining cation sensitivity. J Mol Biol 295: 927-938. BALLESTEROS AMAT, G (). Respuestas al estrés salino en dos especies del género Juncus. BOSCAIU, M., BALLESTEROS, G. NARANJO, M.A., VICENTE, O. y BOIRA, H. (2009). Responses to salt stress in Juncus acutus and J. maritimus. Plant Biosystems (en prensa). BRESSAN RA, HASEGAWA PM, PARDO JM. (1998). 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