Efecto de la salinidad y de la temperatura en la germinación de semillas de Limonium mansanetianum

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA ESCUELA POLITECNICA SUPERIOR DE GANDIA Licenciado en Ciencias Ambientales “Efecto de la salinidad y de la temperatura en la germinación de semillas de Limonium mansanetianum” TRABAJO FINAL DE CARRERA Autor/es: Lorena Alfonso Martí Director/es: Dr. Mariano Fos Causera Dr. Emilo Laguna Lumbreras GANDIA, 2010 i ÍNDICE 1 INTRODUCCIÓN ....................................................................... 2 1.1 GERMINACIÓN DE LA SEMILLA ............................................................. 2 1.2 BIODIVERSIDAD VEGETAL DE ESPAÑA Y DE LA COMUNIDAD VALENCIANA ..................................................................................................... 4 1.3 MEDIDAS DE CONSERVACIÓN DE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA ....... 7 1.4 CATEGORIAS DE LA LISRA ROJA DE LA UICN .................................. 10 1.5 EL GENERO Limonium .......................................................................... 13 1.6 Limonium mansanetianum .................................................................... 14 1.6.1 Descripción ............................................................................................ 14 1.6.2 Hábitat y Localización ............................................................................ 16 1.6.3 Amenazas y catalogación ...................................................................... 20 1.7 OBJETIVOS ............................................................................................. 22 2 MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................ 26 2.1 ENSAYOS DE GERMINACIÓN ............................................................... 26 2.1.1 Material vegetal ..................................................................................... 26 2.1.2 Ensayos de germinación en condiciones controladas ............................ 27 2.1.3 Control de la germinación ...................................................................... 29 2.2 ENSAYO DE LAS SEMILLAS NO GERMINADAS EN CONDICIONES SALINAS. .......................................................................................................... 30 2.2.1 Control de la recuperación ..................................................................... 30 2.3 ENSAYO DE RESISTENCIA DE LAS SEMILLAS A CONDICIONES DE HIPERSALINIDAD ............................................................................................. 30 2.3.1 Control de la recuperación ..................................................................... 31 2.3.2 Determinación de la velocidad de germinación ...................................... 31 2.4 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Y GRÁFICO DE LOS DATOS ............. 32 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................ 34 3.1 ESTIMACIÓN DEL CUAJADO ................................................................ 34 3.2 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y LA SALINIDAD SOBRE LA CAPACIDAD GERMINATIVA DE Limonium mansanetianum: ...................... 36 3.3 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y SALINIDAD SOBRE LA VELOCIDAD DE GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum ................. 40 3.4 RECUPERACIÓN DE LA CAPACIDAD GERMINATIVA TRAS LA INCUBACIÓN EN SOLUCIONES SALINAS: .................................................... 45 3.5 EFECTO DE DISOLUCIONES HIPERSALINAS (4% Y 8%) SOBRE LA GERMINACIÓN FINAL DE Limonium mansanetianum: ............................... 50 4 RESUMEN Y CONCLUSIONES .............................................. 56 5 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................... 60 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Datos de superficie, número de especies de flora vascular y de especies endémicas exclusivas de diversos territorios administrativos de la Unión Europea. .................................................................................................. 5 Tabla 2: Clasificación de los endemismos vegetales presentes en la Comunidad Valenciana ...................................................................................... 6 Tabla 3: Censo y datos de las diferentes poblaciones realizado en 2007 ....... 18 Tabla 4: Semillas viables para cada lote .......................................................... 35 Tabla 5: Porcentajes medios de la germinación final agrupados por concentraciones salinas. .................................................................................. 36 Tabla 6: Porcentajes medios de la germinación final agrupados por temperaturas. ................................................................................................... 39 Tabla 7: Velocidad de germinación en días (T50) agrupada por temperaturas. 41 Tabla 8: Día inicial de la germinación i final de la germinación de las semillas por temperaturas y concentraciones de NaCl .................................................. 44 Tabla 9: Porcentajes medios de la germinación final agrupados por concentraciones salinas, que posteriormente fueron transferidas a agua destilada. .......................................................................................................... 45 Tabla 10: Velocidad de germinación en días (T50) agrupada por concentraciones salinas tras ser transferidas a agua destilada. ..................... 48 Tabla 11: Porcentajes medios de la germinación final de las semillas germinadas a diferentes concentraciones hipersalinas y a diferentes temperaturas. ................................................................................................... 50 Tabla 12: Velocidad de germinación (T50) agrupada por concentraciones salinas, y en función de la temperatura (en días) ............................................. 52 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Criterios de la UICN para catalogar las especies ............................. 12 Figura 2: Esquema de las partes del Limonium mansanetianum .................... 15 Figura 3: Planta adulta de Limonium mansanetianum ..................................... 15 Figura 4: Plantación de Limonium mansanetianum en la Font Amarga .......... 16 Figura 5: Localización de la población de Limonium mansanetianum ............. 17 Figura 6: Área de ocupación del Limonium mansanetianum en la Font Amarga ......................................................................................................................... 19 Figura 7: Marcas del tráfico rodado, principal amenaza para el Limonium mansanetianum. ............................................................................................... 20 Figura 8: Semilla y espiguilla ........................................................................... 27 Figura 9: Cámara de germinación ................................................................... 28 Figura 10: Esquema para cada cámara de germinación ................................. 28 Figura 11: Semillas germinadas ...................................................................... 29 Figura 12: Efecto de la temperatura según la salinidad en el porcentaje de germinación final de la semilla de Limonium mansanetianum.......................... 37 Figura 13: Efecto de la salinidad según la temperatura en el porcentaje de germinación final de las semillas de Limonium mansanetianum. ..................... 39 Figura 14: Velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50 expresado en días) a diferentes concentraciones y en función de la temperatura. ........... 41 Figura 15: Velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50 expresado en días) a diferentes temperaturas y en función de la concentración salina. ... 43 Figura 16: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad a 10°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. .......................... 46 Figura 17: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad para a 15°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. .......................... 46 Figura 18: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad para a 20°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. .......................... 47 Figura 19: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad a 25/20°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. ..................... 47 Figura 20: Porcentajes medios de la germinación final de semillas recuperadas tras la incubación a concentraciones hipersalinas y según las diferentes temperaturas. ................................................................................................... 50 Figura 21: Porcentajes medios de la germinación final de semillas recuperadas tras la incubación a concentraciones hipersalinas. ......................................... 51 Figura 22: Velocidad de la germinación (T50) según las concentraciones hipersalinas a diferentes temperaturas. .......................................................... 53 Figura 23: Porcentaje Velocidad de germinación (T50) según las temperaturas y a diferentes concentraciones hipersalinas. ...................................................... 54 INTRODUCCIÓN EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 2 1 INTRODUCCIÓN 1.1 GERMINACIÓN DE LA SEMILLA La semilla es la unidad de reproducción y dispersión de las plantas superiores y tienen la función de multiplicar, perpetuar y dispersar la especie a la que pertenecen. Para que la semilla cumpla con su objetivo es necesario que el embrión se transforme en una plántula, la cual será capaz de valerse por sí misma y, finalmente convertirse en una planta adulta. Todo ello comprende una serie de procesos metabólicos y morfogenéticos conocidos como germinación. En éste proceso una semilla en dormición o latencia recupera su actividad y origina una nueva planta (Azcón-Bieto y Talón (2008)). La mayoría de las plantas experimentan en algún momento de su ciclo vital periodos durante los cuales su crecimiento queda temporalmente suspendido o por lo menos retardado. Éste fenómeno se conoce con el nombre de dormición o latencia y se manifiesta generalmente en yemas, semillas y tubérculos (Raven et al., (1992)). En algunas especies esta interrupción se debe a la presencia de condiciones ambientales desfavorables de humedad, oxígeno y temperatura. En tales casos hablamos de una dormición impuesta o quiescencia. En otros casos, no son las condiciones desfavorables la causa directa de la dormición. Hay semillas que son incapaces de germinar aunque se las coloque en condiciones óptimas para la germinación, en estos casos, la dormición parece estar causada por condiciones adversas dentro del propio órgano que entra en esta fase de dormición, hablándose entonces de dormición innata o espontánea (Barceló et al., (2001) y Díaz de la Guarda (2004)). Para que el proceso de germinación, es decir, la recuperación de la actividad biológica por parte de la semilla, tenga lugar, es necesario que se den una serie de condiciones ambientales favorables como son: un sustrato húmedo, suficiente disponibilidad de oxígeno que permita la respiración y una temperatura adecuada para los distintos procesos metabólicos y el desarrollo de la plántula. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 9 Sociales: Los programas de recuperación de especies amenazadas y las estrategias de conservación de flora tienen pocas garantías de éxito si no se complementan con medida sociales de tipo formativo, educativo e informativo. Estas medidas están especialmente destinadas a generar una conciencia popular de apoyo a las actividades descritas anteriormente (Aguilella et al., 2009). EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 10 1.4 CATEGORIAS DE LA LISRA ROJA DE LA UICN Las listas rojas producidas por la Unión Mundial para la Naturaleza (UICN) se han utilizado durante los últimos 30 años, a continuación enumeramos las diferentes categorías: 1. Extinto (EX): Un taxón está Extinto cuando no queda duda alguna que el último individuo ha muerto. Se presume que un taxón está Extinto cuando prospecciones exhaustivas de sus hábitats, conocidos y/o esperados, en los momentos apropiados (diarios, estacionales, anuales), y a lo largo de su área de distribución histórica, no han podido detectar un solo individuo. Las búsquedas deberán ser realizadas en periodos de tiempo apropiados al ciclo de vida y formas de vida del taxón. 2. Críticamente amenazado (CR): Un taxón está En peligro crítico cuando la mejor evidencia disponible indica que cumple cualquiera de los criterios A - E para En peligro crítico (Figura 1). Por consiguiente, se considera que se está enfrentando a un riesgo extremadamente alto de extinción en estado silvestre. 3. En peligro (EN): Un taxón está En peligro cuando la mejor evidencia disponible indica que cumple cualquiera de los criterios A - E para En peligro (Figura 1). Por lo cual, se considera que se está enfrentando a un riesgo muy alto de extinción en estado silvestre. 4. Vulnerable (VU): Un taxón está en la categoría de Vulnerable cuando cumple cualquiera de los criterios A - E para Vulnerable (Figura 1). 5. Casi amenazado (NT): Un taxón está en la categoría de Casi amenazado, cuando ha sido evaluado según los criterios y no satisface, actualmente, los criterios para En peligro crítico, En peligro o Vulnerable, pero está cercano a satisfacer los criterios, o posiblemente los satisfaga en un futuro cercano. 6. Preocupación menor (LC): Un taxón está en la categoría de Preocupación menor cuando habiendo sido evaluado, no cumple ninguno de los criterios que definen las categorías En peligro critico, En peligro, Vulnerable o Casi amenazado. Se incluyen en esta categoría taxones abundantes y de amplia distribución. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 11 7. Datos insuficientes (DD): Un taxón pertenece a la categoría Datos insuficientes cuando no hay información adecuada para hacer una evaluación, directa o indirecta, de su riesgo de extinción, con base en la distribución y/o el estado de la población. Un taxón en esta categoría puede estar bien estudiado y su biología ser bien conocida, pero carecer de datos apropiados sobre su abundancia y/o distribución. Datos insuficientes no es por tanto una categoría de amenaza. Al incluir un taxón en esta categoría se indica que se requiere más información y se reconoce la posibilidad de que investigaciones futuras demuestren que una clasificación de amenaza pudiera ser apropiada. Es importante hacer un uso efectivo de cualquier información disponible. En muchos casos habrá que tener mucho cuidado en elegir entre datos insuficientes y una condición de amenaza. Si se sospecha que la distribución de un taxón está relativamente circunscrita si ha transcurrido un período considerable de tiempo desde el último registro del taxón, entonces la condición de amenazado puede estar bien justificada. 8. No evaluado (NE): Un taxón se considera No evaluado cuando todavía no ha sido clasificado en relación a estos criterios EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 12 La UICN utiliza diversos criterios y subcriterios para catalogar una especie: Figura 1: Criterios de la UICN para catalogar las especies EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 13 1.5 EL GENERO Limonium El género Limonium Mill. pertenece a la familia Plumbaginaceae y la mayor parte de las especies son plantas perennes con rosetas cortamente ramificadas (hemicriptófitos rosulados) que emiten tallos floríferos de desarrollo estacional, escapos florales. Más raramente son plantas perennes con tallos robustos portadores de hojas helicoidalmente esparcidas, que a veces se elevan unos decímetros (caméfitos) como el Limonium estevei incluso alcanzan casi tres metros (fanerófitos), como el endemismo canario L. dendroides. Finalmente, se pueden encontrar plantas anuales de ciclo estacional (terófitos) como L. echiooides. Entre los representantes valencianos solamente aparecen los hemicriptófitos y terófitos. Según Kubitzky (1993), este género incluye unas 400 especies con una presencia de al menos 107 en la Península Ibérica e Islas Baleares. Con un total de 87 taxones de carácter endémico (Crespo y Lledó, 1998). Se puede considerar como el género con un mayor número de táxones amenazados en España. En la lista roja de la flora vascular española de 2008, considerando las especies canarias, se incluyen un total de 73 taxones amenazados, de ellos 32 en peligro crítico (CR), 17 en peligro (EN) y 24 como vulnerables (VU) (Moreno, 2008). Por lo que respeta a la Comunidad Valenciana existen un total de 26 especies y 7 híbridos. De todos estos taxones, el 42% se encuentran protegidos por el Decreto 70/2009 por el cual se crea y se regula el Catàleg Valencià d’Espècies de Flora Amenaçades: 23% de especies y subespecies están catalogadas como en peligro de extinción (anexo I), 4% como especies protegidas pero no catalogadas (anexo II) y el 15% en especies vigiladas (anexo III). La mayoría de las especies del género Limonium se han venido considerando tradicionalmente como halófitos estrictos, que colonizan ambientes altamente salinos y frecuentemente húmedos. No obstante, dado que crecen con igual vitalidad en suelos ricos no estrictamente salinos, puede decirse que han desarrollado la habilidad de combinar la resistencia a ambientes muy secos con la halotolerancia (Llorens et al., 1992). EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 14 La mayor parte de los táxones se distribuyen en las regiones mediterráneas y macaronesica. Este género quizá sea uno de los más ricos microendemismos (endemismos de área muy reducida y normalmente escasa diferenciación morfológica) ya que cada saladar o acantilado presenta sus propios limoniums exclusivos (Crespo y Lledo, 1998). Las especies de Limonium son frecuentes y hasta dominantes en acantilados costeros (Limonium dufourii y L. scopulorum), a su vez, los podemos encontrar en saladares litorales y continentales (L. caesium y L. cavanillesii). También habitan terrenos yesosos y margosos de áreas semiáridas o muy secas, con alto contenido de sales en la superficie debido a fuertes procesos de evaporación (L. sucronicum y L. thiniense). 1.6 Limonium mansanetianum 1.6.1 Descripción El Limonium mansanetianum M. B. Crespo & M. D. Lledó, Gen. Limonium Com. Valenciana: 97 (1998) [sp. Nov.] es una planta perenne, de tallos escasos o numerosos, más o menos densamente papilosa en todas sus partes. Posee una roseta basal ramificada de 1-5 cm de longitud, densa o escasamente ramificadas y con abundantes hojas en su parte superior. En cuanto a las hojas de la roseta basal son verdes en la floración o en parte marchitas. Y las hojas caulinares inferiores son escuamiformes, parduscas, de 2-5 mm de longitud y con forma triangular-acuminadas. Los escapos florales son papilosos en toda su longitud, más o menos robustos, con una longitud de 20-50(70) cm, erectos, ramificados en su mitad o tres cuartos superiores. Las ramas están dispuestas dísticamente, de hasta 20 cm. Tiene una inflorescencia paniculada de forma rómbica. Y las espigas tienen un tamaño de 15-60 mm de longitud generalmente secundas. A su vez las espiguillas son de 4’5-5’5 mm, con 2-3 flores y laxamente dispuestas. Los pétalos tienen un color violáceo pálido. Y la floración se da entre los meses de julio y septiembre (Crespo y Lledó, 1998). EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 15 Figura 2: Esquema de las partes del Limonium mansanetianum Figura 3: Planta adulta de Limonium mansanetianum EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 16 1.6.2 Hábitat y Localización El Limonium mansanetianum habita sobre arcillas rojas yesíferas del Keuper y otros sustratos yesosos, sobre suelos con apreciable humedad edáfica. Tiene preferencia por zonas muy soleadas y generalmente terrenos o laderas poco inclinadas. Su óptimo se encuentra en formaciones vegetales de albardinares gipsícolas de Lygeo-Stipetea tenacissimae, acompañado por Lygeum spartum, Dactylis hispanica, Ononis tridentata, Atractylis gummifera, Anthyllis cytisoides o Hyparrhenia sinaica, entre otras. Esta especie la encontramos instalada bajo el ombroclima seco y dentro del piso termomediterráneo (Laguna et al., 1998). Figura 4: Plantación de Limonium mansanetianum en la Font Amarga Dicha especie se localiza únicamente en una pequeña extensión del sudeste de la provincia de Valencia, concretamente en los términos municipales de Xàtiva, Manuel y Villanueva de Castellón (Ver situación en la Figura 5) EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 17 Figura 5: Localización de la población de Limonium mansanetianum Se conocen siete núcleos poblacionales, los datos de los cuales los podemos observar en la Tabla 3, que por su cercanía y conexión geográfica probablemente correspondan a una única población biológica donde apenas alcanzan un kilómetro cuadrado de extensión con un total de 37720 individuos (Navarro et al., 2007). En la Figura 6 podemos observar el área de ocupación del Limonium mansanetianum en el paraje de La Font Amarga (Villanueva de Castellón). EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum INTRODUCCIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 18 Tabla 3: Censo y datos de las diferentes poblaciones realizado en 2007 Localidad Municipio UTM 1x1 Km Censo 2007 Área de ocupación (m2) Font Amarga Villanueva de Castellón YJ1525 YJ1524 17.325 15.546 Les Salines Manuel YJ1625 7.244 1.260 Barranc Llarg A Barranc Llarg B Barranc Llarg C Xàtiva YJ1524 YJ1524 YJ1624 67 606 2.085 142 9.383 1.290 Casa de Tena A Casa de Tena B Xàtiva YJ1624 YJ1624 372 135 309 98 El Pol Xàtiva YJ1424 YJ1423 9.886 6.708 Total 37.720 34.736 MATERIAL Y MÉTODOS EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 26 2 MATERIAL Y MÉTODOS 2.1 ENSAYOS DE GERMINACIÓN 2.1.1 Material vegetal Para el presente estudio de germinación se han utilizado semillas de Limonium mansanetianum, proporcionadas por el Centro para la Investigación y la Experimentación Forestal (CIEF), Conselleria de Medi Ambient, Aigua, Urbanisme i Habitatge de la Generalitat Valenciana. Se han utilizado semillas recolectadas en diferentes años: 2004, 2007, 2008 y 2009 del paraje natural Les Salines (Manuel) y de La Font Amarga (Villanueva de Castellón). Estas semillas fueron conservadas en el Banc de Llavors Forestals del CIEF, el cual posee una colección de accesiones de germoplasma de plantas amenazadas, desde que estas fueron recolectadas hasta su utilización. La técnica de conservación, consiste en el mantenimiento de semillas con bajos niveles de humedad en recipientes herméticos, a temperaturas comprendidas entre 4 y 5°C. Para la realización de dicho estudio se tuvo que hacer una limpieza previa del material proporcionado por el CIEF, y así obtener semillas viables para los ensayos. La limpieza consistía en poner en la palma de la mano unas cuantas espiguillas (alrededor de 30-40) y con los dedos de la otra mano realizar movimientos circulares suaves, para evitar posibles daños sobre las semillas, así obtener directamente semillas limpias y espiguillas de las cuales se había desprendido la parte más externa. Éstas últimas las observábamos con una lupa y con la ayuda de unas pinzas y una lanceta quitábamos las envolturas obteniendo finalmente la semilla. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 27 En todas las espiguillas no aparecen semillas y realizamos una estimación del cuajado para ver el porcentaje de semillas existente en cada lote. Para obtener el número de semillas necesario (3700) se han utilizado 4 lotes diferentes, pero no se ha tenido en cuenta las semilla a que lote pertenecían. Los datos obtenidos los podemos observar en el capítulo de resultados. Figura 8: Semilla y espiguilla 2.1.2 Ensayos de germinación en condiciones controladas Para evaluar la respuesta germinativa de las semillas de Limonium mansanetianum se han ensayado seis concentraciones diferentes de NaCl: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3% (p/v). Y un ensayo control con agua destilada. En cada uno de los tratamientos se han utilizado cuatro repeticiones con veinticinco semillas en cada placa Petri, que posteriormente se dispusieron en cuatro cámaras de germinación bajo condiciones de temperaturas controladas de 10°C, 15°C, 20°C y 20/25°C. Figura 4: Preparación de las placas Figura 5: Placa Petri con 25 semillas EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 28 Figura 9: Cámara de germinación Por tanto, en cada cámara de germinación teníamos los siete ensayos, el control y las diferentes concentraciones salinas. Y para cada tratamiento 4 réplicas con 25 semillas por placa. Figura 10: Esquema para cada cámara de germinación EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 29 Y el número total de semillas utilizado es de 2800 semillas, repartidas en 4 (temperaturas) x 7 (ensayos) x 4 (réplicas) x 25 (semillas por placa). Las siembras se realizaron en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar. Se distribuyeron las semillas homogéneamente sobre el disco de papel de filtro en la placa Petri, después se le añadió 6 ml de agua destilada para el control o la misma cantidad para los ensayos con distintas concentraciones de NaCl (0.5-3%), consiguiendo así que la semilla estuviera en contacto con el agua pero no sumergida. Posteriormente se sellaron las placas con parafilm, para evitar la desecación del filtro y se dispusieron en cada una de las cuatro cámaras de germinación los siete ensayos con sus cuatro réplicas. Con el fin de evitar el posible estrés hídrico por desecación, las placas se humedecían con agua destilada, para no modificar las concentraciones salinas iniciales, hasta el punto de saturación cuando se apreciaba que el papel de filtro se secaba. 2.1.3 Control de la germinación El control de la germinación se realizó durante 35 días. El conteo de las semillas germinadas se efectuó diariamente, tomando como criterio de germinación la aparición de la radícula de tamaño 2 mm de longitud (I.S.T.A., 1985; Pérez-García y Durán, 1989; Suszka et al., 1994), en ese momento se retiraban de la placa para su posterior cultivo. Figura 11: Semillas germinadas EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 30 2.2 ENSAYO DE LAS SEMILLAS NO GERMINADAS EN CONDICIONES SALINAS. Las semillas que no habían germinado del ensayo de germinación inicial para concentraciones salinas iguales o superiores a 1.5%, se trasladaron a nuevas placas Petri con el filtro humedecido de agua destilada. La nueva siembra consistía en trasladar las semillas no germinadas a partir de la concentración salina de 1.5% a nuevas placas, manteniendo las condiciones de temperatura de los ensayos iniciales y referenciándolas con la concentración salina y número de réplica del primer ensayo. 2.2.1 Control de la recuperación El seguimiento de la germinación fue diario, contando como día uno el día en el cual se trasladaron las semillas a las nuevas condiciones; Como criterio de germinación se consideró que una semilla había germinado cuando su radícula era superior a los 2 mm de longitud y en ese momento se retiraban de la placa para su posterior cultivo. 2.3 ENSAYO DE RESISTENCIA DE LAS SEMILLAS A CONDICIONES DE HIPERSALINIDAD Se realizó un último ensayo de germinación con semillas que habían estado previamente a temperatura de 4°C bajo condiciones hipersalinas y durante dos meses, completamente cubiertas con papel de aluminio para evitar que pudieran germinar. Se realizaron dos ensayos diferentes con soluciones al 4% y al 8% de NaCl, cada uno con 9 réplicas y 25 semillas, que se dispusieron en una nevera EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 31 a 4°C durante dos meses en oscuridad total. Pasado este tiempo, se trasladaron las semillas a nuevas placas Petri con agua destilada que posteriormente se introdujeron en cámaras germinadoras a 10°C y a 15°C. En cada cámara germinadora había 4 réplicas del tratamiento a 4% de solución salina y otras 4 para la solución de 8 % con 25 semillas en cada una. 2.3.1 Control de la recuperación El seguimiento de la germinación fue diario, contando como día uno el día en el cual se trasladaron las semillas a las nuevas condiciones. Como criterio de germinación se consideró que una semilla había germinado cuando su radícula era superior a los 2 mm de longitud y en ese momento se retiraban de la placa para su posterior cultivo. 2.3.2 Determinación de la velocidad de germinación El T50 es el parámetro más utilizado para determinar la velocidad de germinación. Se calcula en número entero de días y corresponde al tiempo necesario para obtener el 50% de la capacidad germinativa del lote (Côme, 1970). Tal valor se puede calcular por interpolación linear según la fórmula de Coolbear et al., (1980), ligeramente modificada según la definición ofrecida por Thanos y Doussi (1995): Donde: N= porcentaje final de semillas germinadas EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum MATERIAL Y MÉTODOS PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 32 N1= porcentaje de semillas germinadas por debajo de N/2 N2= porcentaje de semillas germinadas por encima de N/2 T1= número de días que corresponden a N1 T2= número de días que corresponden a N2 2.4 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO Y GRÁFICO DE LOS DATOS Los datos de germinación obtenidos de las diferentes experiencias se trataron mediante Microsoft Office Excel (2007) y estadísticamente mediante el programa Statgraphics (versión 4.1). Como parámetros se calcularon:  La media aritmética de las cuatro réplicas para cada concentración y para cada una de las temperaturas.  El T50 para los diferentes ensayos.  El error estándar de la media y del T50.  ANOVA factorial. Todos los datos obtenidos se representaron en tablas y gráficos para facilitar su lectura. RESULTADOS Y DISCUSIÓN EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 34 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para obtener la mayor cantidad de información acerca de la germinación del Limonium mansanetianum se realizaron diversos ensayos con el fin de determinar:  El porcentaje de semillas germinadas medio acumulado para cada concentración y temperatura. Cruzando ambas variables entre sí.  El efecto de la temperatura y la salinidad en la velocidad de germinación del Limonium mansanetianum mediante el parámetro del T50. Estos resultados se complementan con los datos mostrados en las tablas donde se incluye el día de inicio de la germinación (día en que se observan las primeras semillas germinadas) y el día final (día en que germinó la última semilla).  El porcentaje de semillas germinadas medio después de haber estado sometidas a diversas concentraciones salinas (1.5, 2, 2.5 y 3%) y en condiciones de hipersalinidad (4% y 8%). A lo largo de este capítulo, los resultados se han expresado como media del porcentaje de germinación de las cuatro repeticiones de 25 semillas por placa. Se expresan en función de las distintas concentraciones y temperaturas. Así como el promedio de las cuatro réplicas del T50 para cada tratamiento. Los resultados se presentan gráficamente, mostrando los porcentajes finales para cada tratamiento y temperaturas. También se representa la evolución en el tiempo de los distintos ensayos. 3.1 ESTIMACIÓN DEL CUAJADO Para la realización de los ensayos de germinación a partir del material recolectado que incluye espiguillas se procedía a la limpieza para la obtención de las semillas. El número de semillas obtenido a partir del número de espiguillas se EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 41 Tabla 7: Velocidad de germinación en días (T50) agrupada por temperaturas. CONCENTRACIÓN DE NaCl (%) TEMPERATURA (°C) 25/20 20 15 10 0 2±0,1 a 1,7±0,1 a 2,4±0,1 a 6,0±0,5 a 0,5 4,7±0,6 a 5,5±0,4 ab 4,4±0,2 ab 9,7±0,5 a 1 13,7±4,6 ab 13,2±4,1 bc 10,1±1,8 abc 22,1±1,2 b 1,5 12,1±4,2 ab 13,0±3,4 bc 17,1±3,8 bc 22,0±2,9 b 2 12,4±3,9 ab 17,1±3,8 bc 13,5±2,7 bc 24,17±2,7 b 2,5 12,2±1,8 bc 10,8±2,2 cd 13,0±3,5 c 30,12±1,4 c 3 23,9±5,9 c 23±4,1 d 16,1±6,9 c 0,0±0,0 En la siguiente figura (Figura 14) aparece la velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50) a diferentes concentraciones salinas y en función de la temperatura. Se representan los datos de la Tabla 7 en días, acompañados de su correspondiente error estándar. Figura 14: Velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50 expresado en días) a diferentes concentraciones y en función de la temperatura. 0 5 10 15 20 25 30 35 25/20 20 15 10 Días Temperaturas (°C) T 50 Control 0,5% NaCl 1% NaCl 1,5% NaCl 2% NaCl 2,5% NaCl 3% NaCl EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 42 En la Figura 14 podemos observar por temperaturas, que en conjunto existen dentro de cada una de ellas tres grupos. El primero incluiría al control y la concentración salina 0,5%, que no difiere significativamente del control, en el cual la velocidad es menor, oscilando el T50 entre 2 y 10 días. El siguiente grupo engloba las concentraciones de NaCl desde 1% al 2,5% donde no existen diferencias significativas dentro de cada temperatura, sus valores del T50 se sitúan entre 10 y 17 días, excepto para la temperatura de 10°C con valores superiores a 22 días (a temperaturas bajas las reacciones se ralentizan, disminuyendo así la velocidad). Y el tercer grupo que consta de la concentración de 3% de NaCl, que para las temperaturas de 20°C y 25/20°C, tienen valores altos que si comparamos con el control existe un diferencia de 20 días. En la temperatura de 10°C la velocidad de germinación es menor que para el resto, independientemente de la concentración a la cual han sido germinadas las semillas, para la concentración de 2,5% su valor es superior a 30 días, duplicando el número de días a la misma concentración para el resto de temperaturas, estos es debido a la ralentización de las reacciones enzimáticas (Tabla 7). Y en la temperatura de 15°C, excepto para el primer grupo, la velocidad de germinación es similar para todas las concentraciones incluso para la del 3%. No siendo el número de días superior a 17 (Tabla 7). EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 43 En la Figura 15 aparece la velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50) a diferentes temperaturas y en función de las concentraciones salinas. Se representan los datos de la Tabla 7 en días, acompañados de su correspondiente error estándar. Figura 15: Velocidad de germinación (evaluada por el parámetro T50 expresado en días) a diferentes temperaturas y en función de la concentración salina. En la Figura 15 se observa que al aumentar la concentración de NaCl disminuye la velocidad de germinación en general, este mismo efecto se observó en el estudio de la germinación de tres halófitos amenazados en Castilla-La Mancha en condiciones de estrés salino para las especies Arthrocnemum macrostachyum, Senecio auricula y Lepidium cardamine (Herranz, 2004). Asimismo, e independientemente de la concentración salina también se produce una disminución de la velocidad al disminuir la temperatura. También destacar, que para todos los tratamientos excepto para la concentración salina del 3% (a la temperatura de 15°C) los valores del parámetro T50 son similares para las temperaturas de 15, 20 y 25/20°C. Si comparamos el control con la concentración en NaCl al 3% la diferencia en la velocidad germinativa es de 20 días. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Días Concentraciones de NaCl (%) T 50 25/20°C 20°C 15°C 10°C EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 44 Por tanto, se deduce de estos ensayos de la velocidad de germinación que los mejores valores se obtienen a las temperaturas de 15, 20 y 25/20°C, y con bajas salinidades (al 0.5% en NaCl los resultados son muy similares al control), este comportamiento coincide con lo expresado por Mujica et al., (2001) para Chenopodium quínoa. En la Tabla 8 aparecen la media de los días en los cuales germinaron la primera y última semilla para cada ensayo y temperatura. Tabla 8: Día inicial de la germinación i final de la germinación de las semillas por temperaturas y concentraciones de NaCl TEMPERATURA (°C) CONCENTRACIÓN DE NaCl (%) 25/20 25/20 20 20 15 15 10 10 Día₀ Díaf Día₀ Díaf Día₀ Díaf Día₀ Díaf 0 2 5 2 4 2 5 5 10 0,5 2 12 3 12 2 9 6 20 1 3 25 3 28 5 24 9 29 1,5 5 25 3 28 6 29 16 27 2 7 23 13 28 8 27 25 25 2,5 9 22 10 13 11 19 27 30 3 14 24 15 26 12 12 6 6 Día₀: Día inicial de la germinación Díaf: Día final de la germinación Podemos observar en la Tabla 8 que tanto a medida que aumenta la concentración salina como disminuye la temperatura, aumentan el número de días iniciales y finales en general. Esto es debido a que el periodo de latencia depende en gran medida de la temperatura. Existen días iniciales y finales que coinciden, esto se debe a que el número de semillas germinadas a estas concentraciones y temperaturas son muy bajas, en el caso del 3% en NaCl a 10°C solamente germinó 1. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 45 3.4 RECUPERACIÓN DE LA CAPACIDAD GERMINATIVA TRAS LA INCUBACIÓN EN SOLUCIONES SALINAS: En la Tabla 9, aparecen los porcentajes medios de germinación acumulados de las concentraciones salinas de 1,5, 2, 2,5 y 3% a las distintas temperaturas de incubación para las semillas Limonium mansanetianum. Y los porcentajes medios de germinación acumulados tras ser transferidas a agua destilada las semillas que no habían germinado después de haber estado 35 días incubando a las concentraciones salinas indicadas. Tabla 9: Porcentajes medios de la germinación final agrupados por concentraciones salinas, que posteriormente fueron transferidas a agua destilada. Porcentajes de germinación antes del paso a agua destilada TEMPERATURA (°C) Porcentajes de germinación tras la transferencia a agua destilada 1,5 % NaCl 2% NaCl 2,5% NaCl 3% NaCl 1,5% NaCl 2% NaCl 2,5% NaCl 3% NaCl 21,8 18,4 20,1 19,1 25/20 100 98,5 97,7 88,3 37,7 19,7 9,6 13,1 20 100 96,1 97,1 94,1 41,8 26,2 12,0 12,1 15 100 100 100 91 17,2 3,5 4,0 0 10 100 98,9 94,7 96,8 Los datos de la Tabla 9 están representados en las siguientes figuras (Figuras 16, 17, 18 y 19), donde los números negativos son los días en los cuales las semillas han sido incubadas en concentraciones salinas, antes de ser transferidos a agua destilada que se inicia el día 0. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 46 Figura 16: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad a 10°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. Figura 17: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad para a 15°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. 0 20 40 60 80 100 -36-34-32-30-28-26-24-22-20-18-16-14-12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 % Semillas germinadas Días Temperatura 10°C [1,5%] [2%] [2,5%] [3%] Control 0 20 40 60 80 100 -36-34-32-30-28-26-24-22-20-18-16-14-12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 % Semillas germinadas Días Temperatura 15°C [1,5%] [2%] [2,5%] [3%] Control EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 47 Figura 18: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad para a 20°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. Figura 19: Porcentaje de semillas germinadas en función de la salinidad a 25/20°C. Antes y después de ser transferidas a agua destilada. Podemos observar en las Figuras 16, 17, 18 y 19 que después de transferir las semillas a agua destilada mantienen el poder germinativo, ya que alcanzan porcentajes de germinación superiores al 88%, estos resultados indican que la incubación de las semillas en un medio salino impide que germinen pero no altera su capacidad de germinación, ya que al poner las semillas en condiciones 0 20 40 60 80 100 -36-34-32-30-28-26-24-22-20-18-16-14-12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 % Semillas germinadas Días Temperatura 20°C [1,5%] [2%] [2,5%] [3%] Control 0 20 40 60 80 100 -36-34-32-30-28-26-24-22-20-18-16-14-12-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 % Semillas germinadas Días Temperatura 25/20°C [1,5%] [2%] [2,5%] [3%] Control EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 48 idóneas éstas recuperan las actividades necesarias para desarrollarse y germinar. Se pasan de porcentajes de semillas germinadas del 1% a valores del 97% (a 10°C), en el mejor de los casos. Y por el contrario, de valores del 42% al 100% (a 15°C), aún así siendo valores muy diferentes. Éste mismo comportamiento fue observado por Woodell (1985) sobre el Limonium bellidifolium, donde al transferir las semillas de disoluciones salinas a agua destilada la germinación pasó del 3% al 97%. Concentraciones salinas elevadas (3%) disminuye ligeramente el poder de recuperación de las semillas de Limonium mansanetianum, pero hay que tener en cuenta que un 3% en NaCl es prácticamente la concentración del agua de mar. En la Tabla 10, aparece la velocidad de germinación (parámetro T50) de las concentraciones de 1.5, 2, 2.5 y 3% a las distintas temperaturas de incubación para las semillas Limonium mansanetianum. Y a la parte derecha de tabla, encontramos las velocidades de germinación tras ser transferidas a agua destilada las semillas que no habían germinado después de haber estado 35 días incubando a las concentraciones indicadas. Tabla 10: Velocidad de germinación en días (T50) agrupada por concentraciones salinas tras ser transferidas a agua destilada. Porcentajes de germinación tras la transferencia a agua destilada Control Temperatura (°C) 1,5% NaCl 2% NaCl 2,5% NaCl 3% NaCl 2,0 25/20 0,6 0,5 0,5 0,8 1,8 20 0,8 0,5 0,5 0,5 2,4 15 0,5 0,5 0,5 0,6 6,0 10 0,5 0,5 0,5 0,5 Si comparamos los resultados con el control para cada temperatura específica, se observa que las semillas germinan en menor tiempo (menos de 1 día) después de haber estado 35 días a diferentes concentraciones salinas, ya que durante este tiempo se han ido hidratando pero no han conseguido alcanzar EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 49 las condiciones adecuadas para germinar. Los valores alcanzados durante la recuperación son en general similares a los controles, a diferencia de la concentración del 3% en NaCl que son ligeramente inferiores, siendo la recuperación superior al 88%. EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESULTADOS Y DISCUSIÓN PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 50 3.5 EFECTO DE DISOLUCIONES HIPERSALINAS (4% Y 8%) SOBRE LA GERMINACIÓN FINAL DE Limonium mansanetianum: En la Tabla 11 aparecen los resultados de la germinación de semillas de Limonium mansanetianum tras ser incubadas durante dos meses a concentraciones hipersalinas, 4 y 8%, en oscuridad total a una temperatura de 4°C y que posteriormente se transfirieron a agua destilada y puestas a germinar a 10 y 15°C. Tabla 11: Porcentajes medios de la germinación final de las semillas germinadas a diferentes concentraciones hipersalinas y a diferentes temperaturas. CONCENTRACIONES NaCl (%) TEMPERATURA (°C) 0 4 8 10 96,9 77 61 15 100 85 64 Figura 20: Porcentajes medios de la germinación final de semillas recuperadas tras la incubación a concentraciones hipersalinas y según las diferentes temperaturas. 0 20 40 60 80 100 10 °C 15 °C % semillas germinadas Temperatura (°C) Germinación en medio hipersalino Control [4% NaCL] [8%NaCl] EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum RESUMEN Y CONCLUSIONES PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 57 7. Las condiciones óptimas para la germinación de Limonium mansanetianum oscilarían entre los 15 y 20°C de temperatura e incubadas en agua dulce, aún siendo ésta una especie halófita. BIBLIOGRAFÍA EFECTO DE LA SALINIDAD Y TEMPERATURA EN LA GERMINACIÓN DE Limonium mansanetianum BIBLIOGRAFÍA PROYECTO FINAL DE CARRERA LORENA ALFONSO MARTÍ 60 5 BIBLIOGRAFÍA AGUILELLA, A.; S. FOS Y E. LAGUNA (Eds.) (2009). Catálogo Valenciano de Especies de Flora Amenazadas. 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