Papel del fragmento N-terminal (1-15) de la Galanina en depresión: interacciones con la Fluoxetina

Papel del agmen o N- e minal (1-15) de la Galanina en dep esión: In e acciones con la Fluoxe ina TESIS DOCTORAL An onio Flo es Bu gess Uni e sidad de Málaga Facul ad de Psicología y Logopedia P og ama de doc o ado de Psicología Di ec o es: P o . D a. Dña. Zaida Díaz Cabiale P o . D . D. Luis Ja ie San ín Núñez Uni e sidad de Málaga, Facul ad de Psicología y Logopedia P og ama de Doc o ado de Psicología TESIS DOCTORAL Papel del agmen o N- e minal (1-15) de la Galanina en dep esión: In e acciones con la Fluoxe ina Role o he N- e minal agmen (1-15) o Galanin in dep ession: In e ac ions wi h Fluoxe ine Di ec o es: P o . D a. Dña. Zaida Díaz Cabiale P o . D . D. Luis Ja ie San ín Núñez Memo ia p esen ada po D. An onio Flo es Bu gess pa a op a al g ado de Doc o po la Uni e sidad de Málaga. Málaga, Ma zo 2019. ! AUTOR: An onio Flo es Bu gess h p://o cid.o g/0000-0001-9155-5674! EDITA: Publicaciones y Di ulgación Cien í ica. Uni e sidad de Málaga  Es a ob a es á bajo una licencia de C ea i e Commons Reconocimien o-NoCome cial- SinOb aDe i ada 4.0 In e nacional:! h p://c ea i ecommons.o g/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode! Cualquie pa e de es a ob a se puede ep oduci sin au o ización ! pe o con el econocimien o y a ibución de los au o es.! No se puede hace uso come cial de la ob a y no se puede al e a , ans o ma o hace ob as de i adas.! Es a Tesis Doc o al es á deposi ada en el Reposi o io Ins i ucional de la Uni e sidad de Málaga (RIUMA): iuma.uma.es Dña. ZAIDA DÍAZ CABIALE, Doc o a en Fisiología y Ca ed á ica del Depa amen o de Fisiología Humana, His ología Humana, Ana omía Pa ológica y Educación Física Depo i a de la Uni e sidad de Málaga y D. LUIS JAVIER SANTÍN NÚÑEZ Doc o en Psicología y Ca ed á ico del Depa amen o de Psicobiología y Me odología de las Ciencias del Compo amien o de la Uni e sidad de Málaga. CERTIFICAN: Que D. ANTONIO FLORES BURGESS ha ealizado bajo nues a di ección el abajo ecogido en la p esen e Memo ia i ulada “Papel del agmen o N- e minal (1-15) de la Galanina en dep esión: In e acciones con la Fluoxe ina " pa a la ob ención del Tí ulo de Doc o po la Uni e sidad de Málaga. Re isado el abajo, conside amos que la p esen e memo ia eúne odo el igo cien í ico y los equisi os necesa ios pa a se some ida a juicio de la Comisión co espondien e. Y pa a que así cons e y su a los e ec os opo unos, i mamos la p esen e en Málaga a 1 de Ma zo de 2019. Fdo. Dña. Zaida Díaz Cabiale Fdo. D. Luis Ja ie San ín Núñez Ag adecimien os Quisie a dedica es as líneas pa a la di ícil a ea de esumi la g a i ud que sien o hacia odas aquellas pe sonas que de alguna o ma u o a han hecho posible la ealización de es e abajo. A Zaida Díaz Cabiale mi más since o ag adecimien o y espe o. Solo ella me dio la opo unidad de empeza es e camino incie o en un momen o de cambio adical en mi ida. Tu in eligencia, sen ido común y amo po la ciencia son las que me han hecho llega has a aquí, c eciendo pe sonal y p o esionalmen e. A Luis San ín quie o ag adece le su dedicación, la pasión po su abajo y el ene siemp e las pue as abie as a colabo a . En e los dos habéis hecho posible algo que no es aba p e is o, es a esis es an ues a como mía. Sois un ejemplo de p o esionalidad y é ica que espe o copia en el u u o y espe o ambién pode segui abajando y ap endiendo an o de oso os en las p óximas e apas como en es a que aho a acaba, y po supues o celeb a lo que haga al a. Quie o ag adece ambién a Ma io an de S el la opo unidad de pode ealiza una es ancia p edoc o al en el Ins i u o de Química de Leiden. Fue on es meses de a en u a cons an e donde me hicie on sen i como en casa y ap endí muchísimo. Es a esis se ha ges ado en e dos depa amen os y quie o, po lo menos menciona , a odos con los que he compa ido los momen os i idos du an e es os años y que eco da é siemp e con ca iño. Empiezo con Fisiología Humana y po Ca melo Millón, son muchas las ho as, ideas, cán icos y isas, y espe o que sean muchas más, muchas g acias po odo. Especial mención a José Ángel Na áez y a Manuel Na áez con los que ambién empecé es a a en u a hace ya unos pocos de años, y a Belén Gago. Y po supues o a odo el es o del depa amen o a D. Sal ado , Ma ía, Es ella, Pablo La a, Ma c S e an, Ál a o Milán, Miguel Ángel Ba bancho, Manuel Víc o , Amelia a odo el á ea de Fisiología del Depo e y a las nue as inco po aciones Noelia y Lau a. Quie o hace una mención apa e a José Ángel Agui e, siemp e lo eco da é con una son isa, me hubie a gus ado que ie a es e esis e minada. También quie o ag adece a las p o eso as del depa amen o de Psicobiología oda la ayuda ecibida du an e la ges ación de es a esis. Especialmen e a Me cedes, Ma ía y A aceli po su ines imable ayuda a la ho a de impa i docencia y los buenos momen os de ocio. También a Da id, Román, Emma, Es ela, And ea y Sa a con las que he compa ido la gas ho as en el es abula io y momen os muy di e idos en los cong esos. No quie o ol ida me de oda la gen e de los se icios del scai y el es abula io, sin su calidad humana y p o esional las ho as hubie an sido mucho más la gas y el abajo expe imen al hubie a sido imposible. Y de o ma más pe sonal quie o ag adece a odos mis amigos el apoyo que me han dado en los momen os de ince idumb e, que como buena esis no han sido pocos, son demasiados pa a nomb a los. Y po úl imo lo mejo . A mi amilia. Lo sois odo. A mi mad e y a mi pad e, a mi he mana y a Edu y a los dos nue os ichajes que se han inco po ado en el anscu so de es a esis, Nicolás y Guille mo dos au én icos gigan es que no llegan al me o. Y a Ma i Paz, mi compañe a, que se ha apun ado a es e iaje aunque a eces me de po a opella ga zas. Os quie o. A mi mad e, a mi amilia, a Ma i Paz. ¿Es oda una expe iencia i i con miedo e dad?, eso es lo que signi ica se escla o. Blade Runne , 1982. Así es como lo conseguí, jamás me ese é nada pa a la uel a. Ga aca, 1997. FLX: Fluoxe ina. FST: Tes de na ación o zada. GABA: Ácido gamma-aminobu í ico. GAL: Galanina. GAL(1-15): agmen o N- e minal de la Galanina. GALP: Pép ido simila a Galanina. GALR1: Recep o Galaniné gico ipo I. GALR2: Recep o Galaniné gico ipo II. GALR3: Recep o Galaniné gico ipo III. GAPDH: Glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa. gcl: Capa g anula . GD: Gi o den ado. GIRK: Canales ec i icado es de po asio acoplados a p o eína G. Glu: Glu amina. GMAP: Pép ido mensaje o asociado a Galanina. GPCR: Supe amilia de ecep o es acoplados a p o eína G. h: Ho as. HHA: Eje hipo álamo-hipo isa io-ad enal. His: His idina. HP: Hipocampo. i.c. .: In ace eb o en icula . IL: In e leucinas. Ile: Isoleucina. IMAOs: Inhibido es de las monooxigenasas. INF: In e e ón. IRSN: Inhibido es selec i os de la ecap ación de se o onina-no ad enalina. ISRS: Inhibido es selec i os de la ecap ación de se o onina. Kd: Cons an e de disociación. LC: Locus Coe uleus. LCRa: Líquido ce alo aquídeo a i icial. i.p.: In ape i oneal. MAP: Mi ogen-Ac i a ed P o ein. ml: Capa molecula . min: Minu os. NA: No ad enalina. NAc: Núcleo acumbens. NMDA: N-me il-D-aspa a o. NPY: Neu opép ido Y. NTS: Núcleo del ac o soli a io. OB: Bulbo ol a o io. OF: Tes del campo abie o. PAF: Pa a o maldehído. PB: Tampón os a o. PBS: Tampón os a o salino. PCPA: p-clo o enilalanina. PDB: "P o ein da a bank". Phe: Fenilalanina. PLA: Ensayo de ligamien o po p oximidad. pl: Capa polimó ica. pyl: Capa de células pi amidales. qPCR- : Reacción en cadena de la polime asa cuan i a i a a iempo eal. RISC: Complejo silenciado inducido po ARN. RD: Núcleo a e do sal. RMSD: Des iación cuad á ica media de la aíz. s: Segundos. s.c.: Subcu ánea. SDM: Simulaciones dinámicas molecula es. SDS: Dodecil sul a o sódico. sl: Es a o lucidum. slm: Es a o lacunosum-molecula . siGalR1: Modelo de a as knockdown GALR1. siGalR2: Modelo de a as knockdown GALR1. siRNA-GALR1: eac i o come cial Acell siRNA pa a GALR1. SNC: Sis ema Ne ioso Cen al SNPs: Polimo ismos de un solo nucleó ido. so: Es a o o iens. s : Es a o adia um. Sub: Subiculum. TDM: T as o no dep esi o mayo . TM: Dominio ansmemb ana. TNF-α: Fac o de nec osis umo al al a. Ty : Ti osina. OMS: O ganización Mundial de la Salud. Veh.: Vehículo. INTRODUCCIÓN 1- El T as o no Dep esi o Mayo ......................................................................3 2- E iología del TDM...........................................................................................6 3- Pa o isiología del TDM...................................................................................7 3.1- Al e aciones en sis emas monoaminé gicos..............................................8 3.2- Al e aciones en el eje HHA.....................................................................10 3.3- Al e aciones Neu oinmunes.....................................................................12 3.4- Al e aciones Neu ogénicas y de Neu oplas icidad..................................14 4- Fa maco e apia..............................................................................................15 5- Sis ema Se o oniné gico................................................................................19 5.1- Recep o es Se o oniné gicos en el TDM.................................................22 5.2- FLX, 5-HTT y 5-HT1A...........................................................................26 6- Galanina.........................................................................................................32 6.1- Galanina en la egulación de la ansiedad y el TDM................................34 6.2- GAL(1-15)...............................................................................................38 6.3- GAL(1-15) en la egulación de la ansiedad y el TDM............................40 7- Modelización de Recep o es.........................................................................43 OBJETIVOS.......................................................................................................49 MATERIAL Y MÉTODOS..............................................................................55 Diseño y g upos expe imen ales 1- Papel del agmen o GAL(1-15) en ansiedad y dep esión. Desa ollo de modelos de homología de los ecep o es GALR1 y GALR2..........................57 1.1- Es udio de los e ec os de la adminis ación cen al del agmen o GAL(1-15) en p uebas conduc uales de ansiedad y dep esión................57 1.2- Desa ollo de modelos de homología de GALR1 y GALR2............59 2- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es GALR1 y GALR2.......................................................62 2.1- Es udia la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST y de e mina si es a in e acción es exclusi a del agmen o o se da ambién con la GAL.................................................................................62 2.2- E alua el papel de los ecep o es GALR2 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico M871 y un modelo de silenciamien o génico pa a GALR2 (siGalR2)....................................................................................65 2.3- E alua el papel de los ecep o es GALR1 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando un modelo de silenciamien o génico pa a GALR1 (siGalR1)...................................67 3- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel del ecep o se o oniné gico 5-HT1A............................71 3.1- E alua el papel del 5-HT1AR en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico Way100635..............................................................................................71 3.2- Es udia el e ec o de la coadminis ación de GAL(1-15) y FLX sob e las ca ac e ís icas uncionales y la exp esión del ARNm del 5-HT1AR en el RD y el hipocampo do sal median e au o adiog a ía e hib idación in si u............................................................................................................72 Me odología Gene al 4- Animales de expe imen ación................................................................. 74 5- Ci ugía es e eo áxica................................................................................74 6- Adminis ación de sus ancias..................................................................77 7- Tes de Compo amien o Animal........................................................... 78 7.1- Condiciones de la sala y manipulación de animales..........................78 7.2- Tes de Suspensión de la Cola............................................................79 7.3- Tes de Luz/Oscu idad.......................................................................80 7.4- Tes de Na ación Fo zada...................................................................81 8- P ocedimien os con Tejido Ce eb al.......................................................83 8.1- P ocesamien o de ejido ce eb al........................................................83 8.1.1- Pe usión in aca diaca.............................................................83 8.1.2- P ocesamien o de ejido ce eb al pe undido...........................84 8.1.3- Eu anasia po decapi ación.......................................................85 8.1.4- P ocesamien o de ejido ce eb al congelado............................86 8.2- P o ocolo de Hib idación In Si u........................................................87 8.3- P o ocolo de Au o adiog a ía: cu a de sa u ación...........................88 8.4- Análisis de ilms.................................................................................90 9- Desa ollo de a as siGalR1...................................................................90 9.1- qPCR- ...............................................................................................92 9.2- P o ocolo de Inmunohis oquímica......................................................95 10- Análisis es adís icos................................................................................97 RESULTADOS..................................................................................................99 1- Papel del agmen o GAL(1-15) en ansiedad y dep esión. Desa ollo de modelos de homología de los ecep o es GALR1 y GALR2........................101 1.1- E ec os de la adminis ación cen al del agmen o GAL(1-15) en las p uebas conduc uales de ansiedad y dep esión.............................................101 1.2- Desa ollo de los modelos de homología de GALR1 y GALR2..........101 2- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es GALR1 y GALR2.....................................................110 2.1- Es udio de la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST y compa ación de la in e acción GAL(1-15)-FLX con GAL-FLX.......110 2.2- E aluación del papel de los ecep o es GALR2 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico M871 y un modelo de silenciamien o génico siGalR2................116 2.3- E aluación del papel de los ecep o es GALR1 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando un modelo de silenciamien o génico siGalR1......................................................................120 3- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es se o oniné gicos 5-HT1A.........................................125 3.1- E aluación del papel del 5-HT1AR en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico Way100635...................................................................................................125 3.2- Es udio del e ec o de la coadminis ación de GAL(1-15) y FLX sob e las ca ac e ís icas uncionales y la exp esión del ARNm del 5-HT1AR en el RD y el hipocampo do sal...................................................................................127 DISCUSIÓN.....................................................................................................131 CONCLUSIONES...........................................................................................165 SUMMARY......................................................................................................169 BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................191 ANEXO: Publicaciones y pa en e...................................................................211 INTRODUCCIÓN In oducción ! ! 3! 1- El T as o no Dep esi o Mayo Los deso denes dep esi os se engloban den o de un conjun o de en e medades denominadas as o nos del es ado de ánimo. Los c i e ios diagnós icos más empleados en la p ác ica clínica pa a de ec a dichos as o nos se encuen an ecogidos has a la echa en la quin a edición del Manual Diagnós ico y Es adís ico de as o nos men ales (DSM-V) de la Asociación Es adounidense de Psiquia ía y en la décima edición de la Clasi icación Es adís ica In e nacional de En e medades y P oblemas Relacionados con la Salud (CIE-10) desa ollado po la O ganización Mundial de la Salud (OMS) (DSM-V, 2013; CIE-10, 1992). El as o no dep esi o mayo (TDM) es un é mino desc i o en el DSM-V que ep esen a la condición clásica de la dep esión den o del g upo de deso denes dep esi os. Se ca ac e iza po al menos un episodio de dos semanas de du ación como mínimo donde se iden i ican 5 o más de los siguien es sín omas: Es ado de ánimo dep esi o, ma cada pe dida de in e és o place en las ac i idades dia ias (anhedonia), conside able pé dida o ganancia de peso y/o ape i o, insomnio o hipe somnia, a iga o pe dida de ene gía y de la ac i idad locomo o a, sen imien os de inu ilidad y culpa ecu en es, incapacidad de pensa e indecisión, pensamien os ecu en es sob e la mue e e ideación suicida con o sin plan de ac uación. Es os episodios se ca alogan en unción de la can idad e in ensidad de los sín omas como le es, mode ados o se e os (DSM-V, 2013). Además del diagnos ico y e aluación de la in ensidad y du ación de los episodios dep esi os, en el DSM-V ambién se de inen una se ie de especi icado es que comple an el diagnós ico del TDM. Es in e esan e des aca el especi icado de la angus ia ansiosa que se diagnos ica po la p esencia de los siguien es sín omas: sen i se ne ioso, inusualmen e inquie o, ene di icul ad pa a concen a se debido a la p eocupación, emo de que algo ho ible pueda sucede , emo a pe de el con ol de sí mismo (DSM-V, 2013). La angus ia ansiosa en el TDM se ha asociado con un mayo iesgo de suicidio, una mayo du ación de la en e medad y una mayo p obabilidad de al a de espues a al In oducción ! ! 10! a amien os con an idep esi os pueden al e a la ac i idad de las neu onas del ATV. Es o indica además una posible in e conexión en e el sis ema se o oniné gico y el dopaminé gico dado que las neu onas dopaminé gicas del ATV exp esan ecep o es se o oniné gicos (Nes le and Ca lezone, 2006). Además de las al e aciones indicadas, pa ece cla o que los sis emas monoaminé gicos juegan un papel impo an e en la ecupe ación del TDM. Los mecanismos de acción de los p incipales an idep esi os usados en la clínica, de los que habla emos pos e io men e, ac úan sob e es os sis emas monoaminé gicos, especialmen e la se o onina, ele ando los ni eles de es e neu o ansmiso en el espacio sináp ico. No obs an e, dicha ele ación se ob iene solo ho as después del a amien o y muchos an idep esi os necesi an de pe iodos de acción de semanas pa a ene e ec os clínicos. Po an o, o os cambios pueden es a de ás de los e ec os an idep esi os (Wong and Licinio, 2004). Aunque se han ealizado miles de in es igaciones cen adas en las al e aciones de los sis emas monoaminé gicos pa a pode en ende la pa ogenia del TDM, la complejidad de la en e medad equie e amplia el oco a o os sis emas neu oquímicos que mues an al e aciones asociadas con la en e medad (Wong and Licinio, 2004). Aunque como e emos, muchos de es os sis emas se encuen an in e conec ados con los sis emas monoaminé gicos de algún modo. 3.2- Al e aciones en el eje HHA Además de en los sis emas monoaminé gicos, se conoce desde hace iempo que pacien es con TDM p esen an al e aciones en el eje HHA. En los años 60 del siglo pasado se descub ió que un ele ado po cen aje de pacien es diagnos icados con TDM mos aban una hipe sec eción de co isol y sucesi os es udios clínicos con i ma on que a ias ho monas in eg an es del eje HHA ambién se encon aban en ni eles al e ados en es a en e medad (Pa ke e al., 2003). El eje HHA es un sis ema cen al en la egulación de la homeos asis y la espues a al es és y pa icipan a ias ho monas y pép idos en su egulación. El núcleo In oducción ! ! 11! pa a en icula del hipo álamao sin e iza y sec e a los pép idos asop esina y la ho mona libe ado a de co ico opina (CRH). Ambos es imulan a la pi ui a ia pa a que sec e e la ho mona ad enoco ico opa (ACTH) y a su ez, la ACTH ac úa sob e la glándula ad enal p oduc o a de glucoco icoides, como el co isol (co icos e ona en oedo es). Los glucoco icoides inhiben la p oducción de CRH y ACTH ce ando un ci cui o de e oalimen ación nega i a (de Kloe e al., 2005). La espues a isiológica al es és implica la ac i ación del sis ema ne ioso simpá ico y el eje HHA pa a p epa a al o ganismos a una espues a adecuada, es imulando cambios me abólicos y neu onales. La ac i ación de es os sis emas implica cambios homeos á icos que son con abalanceados pa a e i a posibles daños en la espues a al es és a co o plazo. No obs an e, la exposición a un es és p olongado pueda de i a en cambios compo amen ales y isiológicos ad e sos (Wege and Sandi, 2018). Son nume osos los abajos en di e en es modelos humanos y animales, incluidos los p ima es, que indican como ac o de iesgo pa a desa olla pa ologías como deso denes de ansiedad y dep esi os una hipe eac i idad al es és (Wege and Sandi, 2018). Al e aciones del sis ema HHA se han co elacionado con íc imas de suicidio que su ie on abusos en la in ancia. Po ejemplo, se ha obse ado un descenso de la exp esión en el ecep o hipocampal de glucoco icoides NR3C1. Además, es as ic imas mos a on una me ilación inc emen ada en egiones del p omo o del ecep o NR3C1 (McGowan e al., 2009). Es udios ecien es indican que el inc emen o de co isol en pacien es con TDM es un asgo ca ac e ís ico de episodios se e os que pueden acompaña se con sín omas psicó icos como alucinaciones. La e apia con an agonis as de glucoco icoides mues a algún e ec o e apéu ico en es os pacien es (K ishnan and Nes le , 2008). In oducción ! ! 12! En expe imen os con oedo es se ha is o como la adminis ación c ónica de glucoco icoides pueden p o oca algunos sín omas dep esi os (Gou ley e al., 2008). Además, el exceso de co icoides puede educi la p oli e ación celula en egiones del hipocampo, lo que pod ía con ibui a la educción del olumen hipocampal (K ishnan and Nes le , 2008). O os es udios indican la impo ancia de los ecep o es de glucoco icoides en la egulación del sis ema HHA. En animales que ienen educida la exp esión de es os ecep o es se p oduce un inc emen o de la ac i idad del sis ema HHA en si uaciones basales y es esan es. Y po el con a io, la sob eexp esión del ecep o de glucoco icoides es a asociada con una mayo capacidad de amo iguación al es és del sis ema HHA (McGowan e al., 2009). Algunos au o es ambién sugie en un ínculo en e las al e aciones del sis ema límbico-HHA y el sis ema se o oniné gico, ya que a amien os con an idep esi os icíclicos e ISRSs se han asociados a una educción en los ni eles de CRH en el liquido ce alo aquídeo (McKay and Zakzanis, 2010). 3.3- Al e aciones Neu oinmunes O o conjun o de al e aciones de ec adas más ecien emen e y elacionadas con la e iología del TDM son las elacionadas con el eje neu oinmune. Desde inales de los 80 del siglo pasado se conoce que las e apias con in e e ón (INF) en pacien es de hepa i is C podían de i a en la apa ición de TDM (Renaul e al., 1987; Ko acs e al., 2016). El sis ema inmune es a o mado po un conjun o de células ci culan es (lin oci os T y B, mac ó agos, neu ó ilos, e c...) que se coo dinan en e ellas sec e ando una se ie de compues os químicos pa a ealiza una adecuada espues a inmune. Es as moléculas son las ci okinas y se di iden po sus e ec os en p o-in lama o ias y an i- in lama o ias (Fu ado and Ka zman, 2015). In oducción ! ! 13! Los as o nos de los es ados de ánimo ienen una ue e co elación con las ci okinas p o-in lama o ias. Pacien es con TDM mues an ni eles ele ados de p os aglandina E2, la p o eína C eac i a, el ac o de nec osis umo al al a (TNF-α) y las in e leucinas 2, 6 y 1β (IL-2, IL-6, IL-1β) an o en sang e ci culan e como en el líquido ce alo aquídeo (Rosenbla e al., 2014). También se ha desc i o en modelos animales de dep esión pe iles inc emen ados de ci okinas como IL-6, IL-1β y el TNF-α (Hodes e al., 2015). Exis en a ias e idencias que indican que las ci okinas in lama o ias se elacionan con el TDM po sus e ec os sob e el eje HHA y sob e el sis ema se o oniné gico. La IL-1, IL-6, TNF-α y el IFN inc emen an la p oducción de co isol al inc emen a los ni eles de CRH y ACTH y aunque los glucoco icoides engan e ec os an i- in lama o ios es posible que simul áneamen e se induzca un descenso en los ni eles de los ecep o es de glucoco icoides (Pos al and Appenzelle , 2014; Rosenbla e al., 2014). Po o a pa e, an o el IL-2 como el INF inc emen an la ac i idad de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa que ca aliza la con e sión de ip ó ano en kinu enina, dejando menos ip ó ano disponible pa a la p oducción de se o onina. De o ma pa ecida, se ha is o que el IL-6 y el TNF-α acili an la con e sión de se o onina en ácido 5-hid oxiindolacé ico, con ibuyendo a educi los ni eles de se o onina. Po o o lado, in es igaciones ealizadas en líneas celula es de i adas del núcleo del a e de a as han mos ado que el TNF-α es imula la ecap ación de se o onina (Pos al and Appenzelle , 2014; Rosenbla e al., 2014). También en pacien es con TDM esis en es an o a los ISRSs como a los IRNS (inhibido es de la ecap ación de se o onina y no ad enalina) se han obse ado ele ados ni eles en plasma de IL-6 pudiendo se es a ci okina un ma cado de la esis encia a es os á macos (Yoshimu a e al., 2009). In oducción ! ! 14! 3.4- Al e aciones Neu oplás icas El ce eb o es una es uc u a con una g an plas icidad, capaz de c ea y elimina sinapsis modi icando la uncionalidad de ci cui os neu onales elacionados con la adap ación y el ap endizaje (Dean and Kesha an, 2017). Algunos pacien es con TDM mues an un olumen disminuido del hipocampo y o as egiones del ce eb o que egulan las emociones y la memo ia, indicando una meno capacidad de neu ogénesis y neu oplas icidad asociada con es a en e medad. Fac o es neu o ó icos como el ac o neu o ó ico de i ado del ce eb o (BDNF) y su ecep o T kB pa ecen ene un papel en la ecupe ación y/o en la e iología del TDM (K ishnnan and Nes le , 2008; Ca én and Ran amaki, 2010). Es udios pos -mo en en humanos con TDM mues an una educida exp esión del BDNF y el ecep o T kB en el hipocampo. Un me a-análisis ealizado ecien emen e con i ma que, además de en zonas del ce eb o elacionadas con las emociones, en los pacien es con TDM se de ec an ni eles educidos del BDNF ci culan e que se no malizan as el a amien o con an idep esi os (Molendijk e al., 2014). Exis en es udios que indican que es a disminución se debe a la incapacidad de las plaque as de libe a el BDNF al sue o. Es in e esan e señala que las plaque as poseen ecap ado es especí icos de la se o onina median e los cuales in e nalizan la se o onina ci culan e y que los an idep esi os impiden es a ecap ación (Ca én and Ran amaki, 2009). Algunos au o es han señalado el po encial del BDNF como un p edic o de la e icacia de los a amien os an idep esi os (Molendijk e al., 2014). En modelos animales las in es igaciones ambién apun an a que al e aciones en los ni eles de BDNF es án elacionadas con el TDM. Se ha obse ado que el silenciamien o po medio de la ecnología de ARN in e e en e del BDNF en egiones especi icas del hipocampo de a as educe la neu ogénesis y p oduce compo amien os dep esi os (Taliaz e al., 2010). Po o o lado, la adminis ación de an idep esi os como la Fluoxe ina (FLX) inc emen a la exp esión del ARN mensaje o de BDNF an o en el gi o den ado del hipocampo como en el ATV y el núcleo acumbens, egiones ambas in eg adas en el ci cui o de ecompensa y In oducción ! ! 15! elacionadas con los sín omas de anhedonia del TDM (Dean and Kesha an, 2017; Ca én and Ran amaki, 2010). También se ha obse ado como el inc emen o en los ni eles de BDNF con el a amien o con an idep esi os mues a un e aso en su apa ición, al igual que los e ec os de los an idep esi os, pudiendo se una explicación de es e e aso en el e ec o de los an idep esi os la necesidad del c ecimien o de nue as conexiones neu onales y la eo ganización de las edes neu onales (Ca én and Ran amaki, 2010). Po an o, pa ece que el BDNF juega un papel en el mecanismo de acción de los an idep esi os pe o no es á cla a su implicación en la e iología de la en e medad (Ca én and Ran amaki, 2010). 4- Fa maco e apia A pesa de las nume osas al e aciones desc i as en elación con el TDM y como se ha mencionado an e io men e, la mayo ía de los á macos desa ollados pa a es a en e medad ienen como p incipal mecanismo de acción sob e los sis emas monoaminé gicos, especialmen e la se o onina (Wong and Licinio, 2004). Los an idep esi os icíclicos son la clase más an igua de an idep esi os descubie os y debido a la g an can idad de e ec os secunda ios y al conocimien o de los mecanismos de acción subyacen es se desa olló la segunda gene ación de an idep esi os, los inhibido es selec i os de la ecap ación de se o onina y/o no ad enalina (ISRS, IRSN) (Khun e al., 2017). Desde su descub imien o han su gido muchos an idep esi os de dis in as clases, siendo los del ipo ISRSs, como la se alina, el ci alopam o el esci alop am, los que p esen an mejo es pe iles de segu idad (Khun e al., 2017). A pesa del desa ollo de una g an gama de á macos dis in os, el an idep esi o de p ime a elección en muchos casos clínicos con inúa siendo uno de los p ime os ISRS en descub i se, la FLX (Wong e al., 1974), debido a su al a e ec i idad, su al a ole ancia po los pacien es y las al as asas de adhesión al a amien o (I uela e al., 2009; Bone de Luna e al., 2011). In oducción ! ! 16! No obs an e, pa a que es e ipo de an idep esi os sean e ec i os, se equie e de un pe iodo como mínimo de dos semanas de a amien o, pudiendo inc emen a se la dosis en semanas sucesi as si no se consiguen los e ec os deseados an es de in en a cambia a o o ipo de medicación (Khun e al., 2017). Además de es e e aso en la apa ición de los e ec os, se puede p oduci un ag a amien o de los sín omas al inicio del a amien o que inc emen a el iesgo de au olisis de los pacien es (Al a ez and Viñas, 2010). Debido a las limi aciones del a amien o con los ISRSs, nume osas in es igaciones se han cen ado en descub i o as dianas e apéu icas al ma gen de los sis emas monoaminé gicos pa a a a el TDM. Po ejemplo, neu o ansmiso es de ipo aminoácido, neu opép idos o ac o es neu o ó icos (Ma hew e al., 2008). Es des acable la apa ición de modulado es de los sis emas glu ama é gicos y GABAé gicos. El glu ama o es el p incipal neu o ansmiso exci ado y ce ca del 60% de las sinapsis son glu ama é gicas. Los cambios en los ni eles de glu ama o ex acelula iene amplias implicaciones en di e sas unciones biológicas como la egulación de los ac o es neu o ó icos. El glu ama o media sus acciones, en pa e, a a és de los ecep o es AMPA y NMDA, muy implicados en la modulación de la plas icidad sináp ica (Ma hew e al., 2008). La ke amina, un anes ésico an agonis a de los ecep o es NMDA ha ecibido especial a ención en los úl imos años al mos a e ec os an idep esi os muy ápidos y du ade os con dosis subanes ésicas. En a as se ha obse ado que el papel de los ecep o es AMPA ambién es undamen al pa a los e ec os de la ke amina (Ma hew e al., 2008). Las limi aciones del uso de la ke amina como an idep esi o lo cons i uyen sus e ec os disocia i os y su po encial uso abusi o, las in es igaciones p eclínicas se cen an en descub i los mecanismos de acción subyacen es asociados con los e ec os an idep esi os de la ke amina pa a pode encon a nue as dianas e apéu icas (Zanos and Gould, 2018). A día de hoy oda ía exis en neu o ansmiso es y neu opép idos que no han sido es udiados en p o undidad y que pod ían cons i ui nue as dianas e apéu icas pa a el a amien o del TDM, como el Neu opep ido Y, la Soma os a ina o la Sus ancia P. El es udio de los he e odíme os es o a á ea de in e és pa a abo da nue as es a egias con las que diseña an idep esi os más e icaces (Machado-Viei a e al., 2017). Sin In oducción ! ! 17! emba go, es impo an e des aca que a pesa de las nue as dianas e apéu icas, ela i amen e pocos á macos no basados en la al e ación del sis ema monoaminé gico han sido ap obados po la FDA (“Ame ican Food and D ug Adminsi a ion”) has a la echa (Ma hew e al., 2008) y en el in o me de uso de medicamen os publicado po la agencia española de medicamen os y p oduc os sani a ios publicado en 2015 se señala a los an idep esi os de ipo ISRS, incluido la Fluoxe ina, como los más consumidos. Un ac o cla e a conside a en el desa ollo de nue os á macos lo cons i uye el ele ado núme o de pacien es, en o no al 30%, que no esponden adecuadamen e a los a amien os o no ole an sus e ec os ad e sos (T a edi e al., 2006; Zhou e al., 2015). Aunque no exis e una de inición uni e salmen e acep ada, se conside a que es os pacien es su en dep esión esis en e al a amien o (DRT). Pa a algunos au o es la DRT es una o ma de TDM que no esponde al menos a un an idep esi o y en los casos en que los pacien es no esponden a un segundo a amien o, las opo unidades de ecupe ación se educen conside ablemen e (Fa a and Da idson, 1996; Shel on e al., 2010). Los abo dajes a macológicos pa a in en a sol en a la DRT implican a ias es a egias: es a egias de op imización, sus i ución y combinación o po enciación (Shel on e al., 2010; Zhou e al., 2015). Den o de las es a egias a macológicas pa a abo da los casos donde el pacien e no mues a sín omas de mejo a as la oma de an idep esi os, el p ime abo daje implica un aumen o o ajus e de la dosis o un inc emen o del iempo de adminis ación del á maco con un seguimien o de la e olución de los sín omas (Shel on e al,. 2010). Las es a egias de sus i ución, como su nomb e indican, implican un cambio del p ime an idep esi o po o o, a se posible den o de la misma clase, siendo los an idep esi os del ipo ISRS, como la FLX, los p ime os ecomendados pa a a a el TDM. Es e abo daje iene la en aja de e i a la polimedicación y la apa ición de más e ec os secunda ios. Aunque se ha is o que es a es a egia iene ambién una e ec i idad muy limi ada (Shel on e al., 2010). In oducción ! ! 18! Las e apias de combinación, po su pa e, han enido mejo es esul ados y consis en en la coadminis ación de dos an idep esi os de la misma o dis in a clase (Shel on e al., 2010). Po úl imo exis en e apias de po enciación en las que se coadminis a un an idep esi o con un agen e po enciado que no es un an idep esi o. Se incluyen en es e g upo, po ejemplo, agen es de po enciación como el li io u ho monas i oideas. También se han p obado en combinación con ISRSs be a bloquean es como el Pindolol que además es un agonis a pa cial del ecep o 5-HT1A se o oniné gico (A igas e al., 1994). La Olanzapina, un an ipsicó ico con a inidad po el ecep o es 5HT2 se o oniné gico y el D2 dopaminé gico, ambién se ha p obado en combinación con la FLX ob eniéndose buenos esul ados en pacien es con DRT (Shel on e al., 2010; Zhou e al., 2015). Po odo lo expues o, descub i un mecanismo molecula que acele e la acción an idep esi a de los ISRSs se ía impo an e pa a pode es ablece es a egias e apeú ica más ápidas y e icaces que pe mi an educi la dosis del a amien o y/o el iempo en el que se consiguen los e ec os deseados. Desde poco después de su descub imien o en 1983 (Ta emo o e al., 1983), son a ios los es udios, incluidos los de nues o g upo de in es igación, que han mos ado in e acciones en e el sis ema se o oniné gico y el neu opép ido Galanina (Fuxe e al., 1988, 1998b; Razani e al., 2000; Ku ee a e al., 2008; Millón e al., 2016). Tan o la Galanina como su agmen o N- e minal [GAL(1-15)], como se de alla más adelan e, son pép idos con di e sas unciones en el SNC, en e ellas, la de egula el es ado de ánimo. Una de las in e acciones desc i as más ele an es y que a ec an al es ado de ánimo, se p oduce en e los ecep o es 5-HT1A de la se o onina y GAL(1-15) (Millón e al., 2016). Al se la FLX un á maco del ipo ISRS que ha mos ado e icacia en es a egias de combinación y po enciación pa a el a amien o del DRT y que, como desc ibi emos a con inuación, g an pa e de sus e ec os es án mediados po el ecep o 5-HT1A. En In oducción ! ! 19! la p esen e esis es udiamos la posible po enciación de los e ec os an idep esi os de la FLX po pa e de la GAL(1-15) en a a como una nue a es a egia a macológica de po enciación. 5- Sis ema Se o oniné gico La se o onina en el ce eb o es a implicada en mul i ud de unciones como la egulación del ciclo ci cadiano, ape i o, ag esión, ac i idad senso iomo o a, compo amien o sexual, ap endizaje, pe cepción, cognición, memo ia y po supues o la egulación del es ado de ánimo. Du an e el desa ollo, la se o onina es el p ime neu o ansmiso en apa ece y modula p ocesos como la neu ogénesis, apop osis, la mig ación celula y la plas icidad sináp ica (Smy hies, 2005). Las neu onas se o oniné gicas se localizan en un conjun o de núcleos he e ogéneos localizados en el onco ce eb al denominados núcleos del a e y la mayo población de es as neu onas se ag upa en un conjun o de núcleos que con o man el núcleo a e do sal (RD). El RD se localiza en e el ce eb o medio y el puen e, con la mayo ía de las células localizadas en la egión en al de la sus ancia g is pe iaquiduc al. En humanos se es ima que el RD con iene un cua o de millón de neu onas de las cuales un 70% son se o oniné gicas. La mo ología del a e do sal en a a ue desc i a en 1964 po Dahls öm y Fuxe (Dahls öm and Fuxe, 1964) y se es ima que es a o mado po unas 35000 neu onas de las que un e cio son se o oniné gicas (Michelsen e al., 2008). Las p oyecciones del RD mues an una o ganización opog á ica, ya que las neu onas si uadas en egiones os ales del RD ine an a egiones más os ales del ce eb o. Las neu onas se o oniné gicas p oyec an sus axones a a és de ib as axonales ami icadas a egiones que es án uncionalmen e elacionados (Michelsen e al., 2008). Es as ami icaciones cons i uyen la mayo ed neu oquímica del SNC en el ce eb o después del glu ama o, con una a bo ización axonal que supe a el millón de e minales po mm3 en el neoco ex de a a (A igas, 2013). In oducción ! ! 26! años ambién se es á es udiando el papel de es os ecep o es en la acción de los an idep esi os (A igas, 2013). 5.2- FLX, 5-HTT y 5-HT1AR La FLX es un á maco desa ollado po la compañía Eli Lilly en los años 70 y ap obado po la FDA en 1987 pa a su uso clínico con el nomb e de P ozac (Wong e al., 1974; Pe ez-Caballe o e al., 2014). Es uno de los á macos más u ilizados de su clase, los ISRSs, siendo el an idep esi o de p ime a elección en muchos casos clínicos pa a el a amien o con a el TDM (I uela e al., 2009). Además la FLX ambién se u iliza pa a a a o os as o nos como el as o no obsesi o-compulsi o, bulimia y as o no de pánico (Sghendo and Mi sud, 2012). P esen a una biodisponibilida en o no al 70% y as su inges a es ápidamen e me abolizada po el hígado en No luoxe ina. Tan o FLX como No luoxe ina ienen la capacidad de bloquea al 5-HTT. En humanos, la FLX es eliminada del plasma en un plazo de 3 días mien as que la No FLX puede du a has a 15 días. (Qu e al., 2009; Sghendo and Mi sud, 2011; Pe ez-Caballe o e al., 2014). Figu a 3: Es uc u a química de la FLX, (RS)-N-Me il-3- enil-3-(4- i luo ome il enoxi)p opilamina, (Wong e al., 1974) Ensayos compe i i os han mos ado que la FLX iene una ue e a inidad po el 5- HTT y débil a inidad po o os ecap ado es monoaminé gicos. Además, la FLX p esen a una a inidad ela i amen e débil po algunos sub ipos de ecep o es se o oniné gicos y ambién po ecep o es dopaminé gicos, ad ené gicos y el ecep o H1 de la his amina. Es e pe il de a inidad es compa a i amen e mucho In oducción ! ! 27! meno que los que p esen an la an e io gene ación de an idep esi os icíclicos que poseían un mayo núme o de e ec os secunda ios. No obs an e, la FLX puede p o oca ambién nauseas, pé dida de ape i o, dis unción sexual, insomnio y ansiedad (Sghendo and Mi sud, 2011; Pe ez-Caballe o e al., 2014). La diana a macológica de la FLX es el 5-HTT, una p o eína de memb ana pe enecien e a la amilia de anspo ado es dependien es de Na+/Cl- SLC6. El 5- HTT es una p o eína de 630 aminoácidos con 12 pasos ansmemb ana con los ex emos N- y C- e minales dispues os en el lado ci osólico y un g an bucle ex acelula en e los dominios ansmemb ana 3 y 4 ( igu a 4). En el caso pa icula del 5-HTT ambién es necesa ia la pa icipación del K+ pa a pode anspo a la se o onina desde el espacio ex acelula hacia el in e io de las neu onas. Va ias líneas expe imen ales señalan que el 5-HTT necesi a o ma complejos oligomé icos pa a su co ec o uncionamien o. Median e expe imen os de mu agénesis di igida se han iden i icado nume osos dominios y esiduos imp escindibles pa a su uncionamien o (Chen e al., 2004; Lau e al., 2008). Figu a 4: Rep esen ación de la es uc u a del 5-HTT pe enecien e a la amilia de anspo ado es SCL6 (SLC64A), conocido ambién po sus siglas en inglés SERT, donde se señalan algunos de los aminoácidos undamen ales en su in e acción con di e en es sus ancias (Chen e al., 2004). In oducción ! ! 28! El 5-HTT se encuen a ampliamen e dis ibuido an o en ejidos pe i é icos como en el SNC y ha sido implicado en una amplia a iedad de unciones como la egulación del es ado de ánimo, ape i o, sueño, cognición y ac i idad mo o a (Chen e al., 2004; Hagan e al., 2012). En cuan o a su egulación, el 5-HTT se encuen a o mando un complejo con la p o eína os a asa A2. T as la ac i ación de la p o eín kinasa C, el 5-HTT se disocia de la os a asa y se in e naliza. Además el ecep o 5-HT1B ambién iene capacidad de modula al 5-HTT. Se ha is o que los an agonis as del 5-HT1B p o ocan una pé dida de ac i idad del anspo ado y, po el con a io, agonis as del ecep o inc emen an la capacidad de ecap ación del anspo ado (Chen e al., 2004; Hagan e al., 2012). Los es udios de los e ec os de los ISRSs sob e las ca ac e ís icas de unión del 5-HTT a sus ligandos y de los ni eles de su ARN mensaje o en animales han mos ado esul ados con adic o ios (Benmansou e al., 1999; Desca ies and Riad, 2012). Hay que conside a que la a iedad de esul ados ob enidos se debe al uso de di e en es ISRSs con p opiedades a macológicas dis in as que son adminis ados po ías y a dosis di e en es (Benmansou e al., 1999; Sghendo and Mi sud, 2011). La acción de los ISRSs sob e los 5-HTT es muy ápida, ele ando en poco iempo los ni eles de se o onina. Pe o los e ec os an idep esi os de la FLX a dan unas dos semanas en p oduci se, e idenciándose que o os mecanismos a más la go plazo se ienen que p oduci pa a ob ene los esul ados deseados (Benmansou e al., 1999; Lau e al., 2011). El 5-HTT no se in e naliza con la adminis ación aguda de FLX, pe o los a amien os c ónicos p oducen una educción en los ni eles del 5-HTT en memb ana del 50% en el RD y del 70% en el hipocampo (Desca ies and Riad, 2012). Es udios más ecien es empleando ARN in e e en e pa a educi los ni eles de 5-HTT, mues an como es a educción p o oca po en es e ec os an idep esi os en di e en es p uebas de compo amien o en a ones. En es os es udios, la educción del In oducción ! ! 29! 5-HTT p oduce además un conjun o de cambios pa ecidos a los del a amien o c ónico con ISRSs, como la pe dida de unción del 5-HT1AR p esináp ico y el inc emen o de ac o es de c ecimien o, del á bol dend í ico y la plas icidad sináp ica en el hipocampo (Fe és-Coy e al., 2016). Aunque la diana a macológica de la FLX sea el 5-HTT, exis en nume osas e idencias que señalan que el papel del 5-HT1AR, an o en su dis ibución p esináp ica como pos sináp ica, es undamen al pa a ob ene los e ec os an idep esi os. Va ios es udios de compo amien o con oedo es mues an que los e ec os an idep esi os inducidos po la FLX se bloquean cuando se coadminis a la FLX con el an agonis a del 5-HT1AR Way100635, señalando el papel undamen al del 5- HT1AR en la mediación de los e ec os compo amen ales de la FLX (De ke e al., 1997; De V y e al., 2004; Es ada-Cama ena e al., 2006). Como se ha mencionado an e io men e, el 5-HT1AR juega un papel inhibi o io impidiendo la libe ación de se o onina en su localización p esináp ica. En es udios de mic oscopía elec ónica e inmunohis oqímica ealizados con ejido de a a se obse a como la adminis ación aguda del agonis a 8-OH-DPAT o de la FLX p o ocan la in e nalización del 5-HT1AR p esináp ico. Sin emba go, sólo as la adminis ación c ónica de la FLX, dichos ecep o es dejan de in e naliza se (Desca ies and Riad, 2012). En expe imen os donde se educe la exp esión especí ica de los 5-HT1AR p esináp icos en a ones, po medio de ARN in e e en es, se obse a un compo amien o an idep esi o en la p ueba del FST, así como un inc emen o en los ni eles de se o onina en la co eza p e on al inducidos po la adminis ación de FLX en es os a ones (Bo olozzi e al., 2012). En es udios uncionales en a a se obse a además que, aunque la adminis ación c ónica de FLX no al e a la densidad de los 5-HT1AR ni en el RD ni en el In oducción ! ! 30! hipocampo, aunque si se de ec an educciones en los ni eles de p o eína G acoplada a 5-HT1AR en el RD, jun o con una pé dida de uncionalidad de los au o ecep o es (Cas o e al., 2008). En abajos ecien es y empleando la écnica de hib idación in si u ambién se ha comp obado que la exp esión del 5-HT1AR no se e modi icada po la adminis ación c ónica de FLX en a a (Volle e al., 2018). Todos es os da os abundan en la idea de la pe dida de uncionalidad del 5-HT1AR en el RD como uno de los e ec os del a amien o con FLX. Po el con a io, la uncionalidad de los 5-HT1AR en el hipocampo pa ece inc emen a se con la adminis ación c ónica de FLX. Además es os e ec os ambién se en bloqueados cuando se adminis a conjun amen e la FLX con el an agonis a del 5-HT1AR Way100635 (Cas o e al., 2008). En es udios elec o isiológicos con dis in os ISRSs adminis ados c ónicamen e, se obse a una mejo a en la ac i ación ónica de los 5- HT1AR pos sináp icos del hipocampo (Haddje i e al., 1998). Es in e esan e señala que la desensibilización de los 5-HT1AR ambién se ha obse ado en egiones hipo alámicas as la adminis ación c ónica con FLX, donde los 5-HT1AR ienen una dis ibución pos sináp ica. Es a desensibilización ambién se asocia con una g adual pé dida en los ni eles de p o eína G. En o as egiones sin emba go, como la co eza p e on al, no se obse an dichos cambios en los 5- HT1AR pos sináp icos (Li e al., 1996; Se es e al., 2000). Va ios es udios se han cen ado en el hipocampo como egión donde la FLX p oduce muchos de los cambios asociados a su e ec o e apéu ico. En el hipocampo la adminis ación c ónica de FLX inc emen a la neu ogénesis en la egión subg anula del GD en a as. El bloqueo de es a p oli e ación es capaz de bloquea ambién las espues as compo amen ales de los an idep esi os (Malbe g e al., 2000; San a elli e al., 2003). Po o a pa e, expe imen os ealizados en a as o a iec omizadas mues an como la adminis ación c ónica de FLX es capaz de inc emen a la densidad de las sinapsis en las espinas dend í icas de las neu onas pi amidales de las egiones hipocampales CA1 y CA3 (Hajszan e al., 2005). In oducción ! ! 31! Expe imen os más ecien es con a ones que ca ecen de 5-HT1AR en las células g anula es adul as del GD, mues an como la adminis ación c ónica de FLX no induce e ec os an idep esi os en el FST. De igual o ma, la adminis ación c ónica de FLX en es e modelo animal p oduce un descenso muy no able en la neu ogénesis espec o a los animales con ol así como un descenso en los ni eles de BDNF y del Fac o de c ecimien o endo elial ascula , que al igual que el BDNF, se ha asociado ecien emen e con los e ec os e apéu icos de los an idep esi os (Samuels e al., 2015). Como acabamos de e , el papel de los 5-HT1AR an o p esináp icos, como pos sináp icos es undamen al como mediado de los e ec os e apéu icos de la FLX. La adminis ación aguda de FLX p o oca un inc emen o de los ni eles de se o onina ex acelula en el RD, lo que ac i a a los au o ecep o es 5-HT1A e inhibe los dispa os celula es hacia las zonas de p oyección de las neu onas se o oniné gicas. Solo con un a amien o p olongado se induce la desensibilización de los 5-HT1AR p esináp icos, e i ando el mecanismo de e oalimen ación nega i a e inc emen ando los ni eles de se o onina en el ce eb o en las egiones de p oyección (Bo olozzi e al., 2012; A igas, 2013; Nau iyal and Hen, 2017). Los 5-HT1AR pos sináp icos, especialmen e en el hipocampo, ambién pa ecen undamen ales en la mediación de los e ec os an idep esi os de la FLX ya que su uncionalidad se e inc emen ada po el a amien o y po el con a io su ausencia inhibe las acciones an idep esi as en el FST (Cas o e al., 2008; Samuels e al., 2015). Es e papel di e encial de los 5-HT1AR según su localización sea p e o pos sináp ica ha abie o la pue a al uso sus ancias que bloqueen la ac i ación del au o ecep o 5- HT1A como una e apia adyu an e en el uso de ISRSs. Po ejemplo, agonis as pa ciales del 5-HT1AR, como el pindolol (A igas e al., 1994) y, más ecien emen e, la ilazodona, han demos ado se adyu an es e icaces de los ISRS en los es udios clínicos (Nau iyal and Hen, 2017). El desa ollo de agonis as con p e e encia po los 5-HT1AR pos sináp icos ambién pod ía cons i ui una he amien a ú il pa a el a amien o del TDM (Newman-Tanc edi e al., 2008; Nau iyal and Hen, 2017). In oducción ! ! 32! Además del desa ollo de á macos con pe iles a macológicos adecuados hay que conside a la capacidad de los GPCRs de o ma oligóme os en e sí y con o o ipo de ecep o es. Muchos á macos adicionales ienen como diana los si ios de unión con el ligando endógeno, sin emba go los GPCRs pueden se modulados de o ma alos é ica (Ch is opoulos and Kenakin, 2002; Nickols and Conn, 2014). Los con ac os que se p oducen en e GPCRs den o de un mosaico de ecep o es p opo cionan la es uc u a po la que á macos que no son econocidos di ec amen e po un ecep o pueden modula su ac i idad (Ch is opoulos and Kenakin, 2002; Nickols and Conn, 2014). Va ios es udios han mos ado como los ecep o es se o oniné gicos ienen la capacidad de o man oligóme os. Po ejemplo en e los ecep o es, 5-HT1A-GALR1, 5-HT1A-5-HT2A, 5-HT1A-5-HT7 (Bo o o-Escuela e al., 2010, 2017; Renne e al., 2012) e incluso o mando íme os con ecep o es galaniné gicos 5-HT1A-GALR1-GALR2 (Millón e al., 2016). La capacidad del 5- HT1AR de o ma oligóme os pod ía cons i ui un mecanismo molecula con el que diseña nue as es a egias con a el TDM. 6- Galanina La Galanina es un pép ido descubie o en 1980 en el in es ino del ce do (Ta emo o e al., 1983) que cons a de 29 aminoácido, 30 en humanos, con una secuencia al amen e conse ada en e especies, sob e odo en el ex emo N- e minal (Wiczk e al., 1996). La Galanina se encuen a ampliamen e dis ibuida en el SNC, localizándose en e o as egiones en la co eza ce eb al, el hipocampo y en el onco ence álico, donde colocaliza con neu onas no ad ené gicas del LC y neu onas se o oniné gicas del RD (Melande e al., 1986; Sko i sch and Jacobowi z, 1985; Jacobowi z e al., 2004). La Galanina se asocia con a ias unciones isiológicas. Es á implicada en el con ol cen al de la inges a, inges a de alcohol, con ol del umb al del dolo , endimien o cogni i o, unciones ca dio ascula es, homeos asis ene gé ica, unciones neu oendoc inas, egulación de p ocesos in lama o ios y egulación del es ado de ánimo (Mi sukawa e al., 2008; Diaz-Cabiale e al., 2010; Fang e al., 2015; Lang e al., 2015). In oducción ! ! 33! La Galanina pe enece a una amilia de 4 pép idos que es án codi icados po dos genes di e en es. Del p ocesado de la p ep ogalanina se ob ienen los pép idos Galanina y GMAP a pa i de un gen y median e el splicing al e na i o de o o gen se ob ienen los pép idos GALP y Ala ina (Lang e al., 2007). Se conocen es ipos de ecep o es po los cuales la Galanina media su ac i idad biológica, GALR1, GALR2 y GALR3, odos ellos pe enecien es a la amilia de GPCRs (B anchek e al., 2000). Los ecep o es GALR1 y GALR2 p esen an una a inidad simila po la Galanina mien as que el ecep o GALR3 ienen una a inidad un poco meno . Pa a el es o de pép idos de la amilia de la Galanina no hay ecep o es conocidos (Lang e al., 2007; Ihna ko and Theodo sson, 2017). Median e écnicas inmunohis iquímicas y es udios de hib idación in si u, se ha de e minado que los ecep o es de Galanina es án ampliamen e ex endidos en el SNC, en muchos casos de o ma solapada (O´Donnell e al., 2003), y en egiones implicadas en el TDM como la co eza p e on al, el hipocampo y el RD, odas ellas á eas de p oyección de las neu onas no ad ené gicas y se o oniné gicas (Jacobowi z e al., 2004). Los ecep o es galaniné gicos de un de e minado sub ipo mues an una ele ada conse ación de su secuencia en e especies, mien as que en e los es ipos de ecep o es de una de e minada especie p esen an una baja simila idad de secuencias (Lang e al., 2007). El ecep o GALR1 se encuen a acoplado a la p o eína Gi/0 y su ac i ación inhibe a la adenila o ciclasa y es imula la ía de señalización de las MAP kinasas y, al igual que los ecep o es GALR3, p oduce la hipe pola ización de las células median e la ape u a de los canales ec i icado es de po asio. El ecep o GALR2 se ha desc i o acoplado a a ias clases de p o eína G, siendo la más común la p o eína Gq/11 que ac i a la ía de señalización in acelula mediada po os olipasa C que inc emen a el Ca2+ in acelula y la ac i ación de canales de Cl- dependien es de calcio. Aunque ambién se ha desc i o la ac i ación de p o eínas Gi/0 a a és del GALR2, po lo que el e ec o de es e ecep o puede se an o inhibi o io como exci a o io dependiendo de a que ipo de p o eína G es é acoplado ( igu a5) (Lang e al., 2007). In oducción ! ! 34! Figu a 5: Rep esen ación esquemá ica de las cascadas de señalización in acelula ac i adas po los ecep o es galaniné gicos (Lang e al., 2007). La po ción N- e minal de la Galanina, conc e amen e los p ime os 15 aminoácidos, iene una secuencia común en e especies y es undamen al pa a el econocimien o del pép ido po sus ecep o es y pa a sus unciones biológicas en el SNC. Sin emba go, la po ción C- e minal pa ece no ene ac i idad biológica en el SNC (Diaz- Cabiale e al., 1998; Hedlund e al., 1992). Muchos de los agonis as y an agonis as especí icos pa a un sub ipo de ecep o galaniné gico se han ob enido gene ando compues os quimé icos que incluyen la secuencia de los p ime os aminoácidos de la Galanina (Lang e al., 2007). Po ejemplo, en el agonis a especí ico de GALR1 M617 se incluyen los 13 p ime os aminoácidos de la Galanina (Lunds om e al., 2005) y en el an agonis a especí ico de GALR2 M871 los aminoácidos del 2 al 13 (Sollenbe g e al., 2006). 6.1- Galanina en la egulación de la ansiedad y el TDM Desde poco después de su descub imien o en 1983 se sabe que la Galanina se sin e iza jun o con la NA en neu onas del LC (Melande e al., 1986), así como en neu onas de egiones implicadas en la espues a de la ansiedad como la amígdala (Melande e al., 1988). Los e ec os de la Galanina sob e la ansiedad son complejos y en oedo es a ían dependiendo del núcleo ce eb al donde se adminis a. Po ejemplo, la Galanina adminis ada po ía in ace eb o en icula (i.c. .) p oduce un e ec o ansiolí ico en el es de con lic o de Vogel (Bing e al., 1993), pe o cuando se In oducción ! ! 35! adminis a di ec amen e en la amígdala p oduce un e ec o ansiogénico en la misma p ueba (Mölle e al., 1999). En elación con la ansiedad, la Galanina ambién se coexp esa en el hipo álamo en neu onas que sec e an CRF y asop esina, pép idos implicados en la egulación del eje HHA (Mazzocchi e al., 1992). Al adminis a di ec amen e Galanina en el hipo álamo se p oduce un descenso de ac i ación del eje HHA en espues a al es és (Hooi e al., 1990) y además, se ha comp obado que el es és inc emen a los ni eles de p ep ogalanina en el LC, amígdala e hipo álamo (Holmes and Piccio o, 2006; Ka lsson and Holmes, 2006). En es udios elec o isiológicos se ha is o como la Galanina inhibe la ecuencia de dispa o de las neu onas del LC, p esumiblemen e median e la ac i ación de los ecep o es GALR1 o GLAR3 y la ape u a de los canales ec i icado es de po asio (GIRK) (Pie ibone e al., 1995; Ma e al., 2001). Al emplea concen aciones más bajas, se obse ó que la Galanina po encia el e ec o inhibi o io de la no ad enalina mediado po los au o ecep o es α2 (Ma e al., 2001). La adminis ación i.c. . de Galanina ambién p o ocaba una educción de los ni eles de no ad enalina en el hipocampo en al (Yoshi ake e al., 2003). Recien emen e, se ha desc i o ambién que la GAL adminis ada a bajas dosis (0.3 nmol) en la egión caudal y no en la os al del RD iene e ec os ansiogénicos en la p ueba del labe in o ele ado en T (Silo e e al., 2013), siendo es os e ec os eplicados con el agonis a de GALR1 M617 a dosis mayo es y no con el agonis a de GALR2 AR-M186 (Mo ais e al., 2016). De o ma simila , la adminis ación de GAL en la egión del hipocampo do sal ambién p oduce un e ec o ansiogénico en el labe in o ele ado en c uz, mien as que el an agonis a de GALR2 M871 induce po si mismo e ec os ansiolí icos en la misma p ueba (Funck e al., 2018). Pa e de la complejidad obse ada en los e ec os conduc uales de la Galanina ela i os a la ansiedad posiblemen e se deba al hecho de que los ecep o es galaniné gicos ienen una acción an o ac i ado a como inhibido a (B anchek e al., 2000; O´Donnell e al. 2003). Además, la in e p e ación de los esul ados se e obs aculizada po el limi ado conocimien o de la a macociné ica y las In oducción ! ! 42! GALR1-GALR2 p e alece la señalización de GALR1 sob e la de GALR2 (Millón e al., 2015; Bo o o-Escuela e al., 2014). Todos es os esul ados con i man el papel uncional di e encial de GAL(1-15) espec o de la Galanina, mos ando que el agmen o GAL(1-15) iene un e ec o ansiogénico y p o-dep esi o mayo que la Galanina. Po o a pa e, ambién se ha con i mado que los mecanismos molecula es que median en es os e ec os son di e en es, implicando la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2 en la mediación de los e ec os de GAL(1-15) (Millón e al., 2015). Recien emen e en nues o g upo de in es igación ambién hemos demos ado in e acciones en e la GAL(1-15) y el 5-HT1AR. En expe imen os de compo amien o con a as empleando el FST se obse a como el agmen o GAL(1- 15), adminis ado en dosis subumb ales (1nmol), p oduce una po enciación del e ec o an idep esi o del agonis a del 5-HT1AR 8-OH-DPAT, siendo es a po enciación mayo que la que p oduce la coadminis ación de 8-OH-DPAT y una dosis subumb al de Galanina (Millón e al., 2016). Además, el agmen o GAL(1-15) a una dosis de 3nmol adminis ado po ía i.c. . se ha is o que es capaz de modi ica las ca ac e ís icas uncionales del 5-HT1AR en las egiones CA1 y GD del hipocampo, educiendo la a inidad (inc emen o de Kd) y aumen ando la densidad de los 5-HT1AR (Bmax) a los 10 minu os después de la inyección, siendo es os e ec os bloqueados po el an agonis a de GALR2 M871. Es as modi icaciones inducidas po GAL(1-15) se han man enido has a 2h después de la inyección y en el GD un inc emen o signi ica i o de la Bmax se man iene has a 5h después. En el RD, sin emba go, la GAL(1-15) no modi ica la a inidad del 5- HT1AR pe o si p oduce un descenso en el alo de Bmax solo a las dos ho as as la adminis ación (Millón e al., 2016). GAL(1-15) ambién modi ica los ni eles de exp esión del ARN mensaje o de 5- HT1AR, inc emen ando los ni eles en el GD y en el CA1 del hipocampo a las 2h In oducción ! ! 43! después de la adminis ación i.c. . de GAL(1-15) y po el con a io, en el RD p oduce un descenso de su exp esión (Millón e al., 2016). Es udios con la écnica del PLA indica on ambién la p oximidad en e los ecep o es GALR1-5-HT1AR y GALR2-5-HT1AR an o en el hipocampo como en el RD. Además, en la línea celula del a e RN33B la incubación con GAL(1-15) p oduce un descenso en la inmuno eac i idad del 5-HT1AR y de la señal c-Fos más in ensa que las que p oduce la Galanina (Millón e al., 2016). Pa ece cla o que an o la Galanina como la GAL(1-15) in e accionan con el 5- HT1AR se o oniné gico, pe o en el caso de GAL(1-15) se ha is o que es capaz de po encia de o ma no able los e ec os an idep esi os del agonis a del 5-HT1AR y además es capaz de modi ica la exp esión del ecep o así como sus ca ac e ís icas uncionales an o en el RD como en el hipocampo, ambas egiones cla e en el TDM y pa a la acción de los an idep esi os ISRSs como la FLX (Millón e al., 2016). Dado que GAL(1-15) media sus acciones a a és del he e odíme o GALR1- GALR2, con la in e acción GAL(1-15)-5-HT1AR hemos pos ulado la exis encia de complejos he e o imé icos GALR1-GALR-5-HT1AR en el RD y el hipocampo. Es in e esan e esal a que la exp esión y uncionalidad del 5-HT1AR se e a ec ada de di e en e mane a po GAL(1-15) en ambas egiones. Es o puede explica se po di e encias en las p o eínas adap ado as o sub ipos de p o eína G exis en es en e ambas egiones que pueden a ec a a las in e acciones alos é icas de los es ecep o es y a su ez, modi ica la ac i ación ansc ipcional o la uncionalidad de los ecep o es según la zona. En cualquie caso los e ec os de GAL(1-15) sob e el 5- HT1AR pueden se la base pa a el desa ollo de nue as es a egias con a el TDM (Millón e al., 2016). 7- Modelización de Recep o es Como acabamos de e , la o mación de oligóme os en e los ecep o es galaniné gicos y se o oniné gicos iene un papel impo an e en la egulación mu ua In oducción ! ! 44! de las unciones biológicas de las espec i as moléculas (Bo o o-Escuela e al., 2010; Millón e al., 2016). Además, el agmen o GAL(1-15) ac úa a a és de la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2 (Fuxe e al., 2012; Bo o o-Escuela e al., 2014; Millón e al., 2015). Dado que no se conoce la es uc u a comple a de los ecep o es galaniné gicos implicados en la o mación de es os complejos de ecep o es, la de e minación es uc u al de los mismos po mé odos compu acionales puede se de g an ele ancia pa a la in es igación y desa ollo de nue os á macos (Pie ce e al., 2002; O e ing on e al., 2006; Cons anzi and Wang, 2014), así como pa a p o undiza en los mecanismos molecula es que es én implicados en la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2. La ca ac e ización es uc u al de los GPCRs, como los ecep o es galaniné gicos, ha sido un p oblema du an e muchos años, aunque en la úl ima década, y g acias a los a ances en las écnicas de esolución de las es uc u as idimensionales como la di acción de los ayos-X o la esonancia magné ica nuclea , la de e minación es uc u al de p o eínas miemb os de la supe amilia de GPCRs se ha inc emen ado de o ma exponencial (Cons anzi and Wang, 2014). No obs an e, la complejidad a la ho a de pode de e mina la es uc u a de GPCRs ha hecho que en el e eno de la modelización de p o eínas po mé odos compu acionales se hayan ealizado g andes es ue zos pa a gene a p o ocolos y algo i mos que ayuden a gene a es uc u as idimensional de p o eínas a pa i de es uc u as ya conocidas. Hoy en día, la es uc u a de una p o eína desconocida se puede gene a a pa i de p o eínas con es uc u as homólogas conocidas que si en como plan illas. Es o se debe a que en p o eínas homólogas, la es uc u a es a más conse ada que la secuencia. Así, en gene al, las p o eínas homólogas con una iden idad de secuencia supe io al 35% ienen una es uc u a idimensional simila . En el caso de los GPCRs, debido a su es uc u a común, con iden idades de secuencias del 20% o menos, exis e una ue e conse ación es uc u al (Gonzalez e al., 2014). La supe amilia de ecep o es acoplados a p o eína G (GPCRs) son p o eínas in eg ales de memb ana cons i uidas po una sola cadena de aminoácidos que In oducción ! ! 45! compa en una es uc u a común, con 7 dominios ansmemb ana (TM1-TM7) en con o mación hélice α, in e conec ados en e sí po 3 bucles in acelula es (IL) y 3 bucles ex acelula es (EL). El ex emo N- e minal se dispone hacia el ex e io celula y el ex emo C- e minal hacia el ci osol. En muchos casos el ex emo C- e minal adop a una con o mación de α-hélice, conocida como hélice 8, pa alela a la memb ana plasmá ica po su na u aleza hid ó oba y que pa ece ene un papel undamen al en la ac i idad de los ecep o es ( igu a 7) (Huynh e al., 2009; Con anzi and Wang, 2014; Sensoy e al., 2014). Figu a 7: Rep esen ación bidimensional esquemá ica de la es uc u a común de los GPCRs (Con anzi and Wang, 2014). Además de pode de e mina la es uc u a de un de e minado GPCR po mé odos compu acionales, se pueden p edeci los compo amien os dinámicos de es as p o eínas en a ias si uaciones po medio de simulaciones dinámicas molecula es (SDM) gene adas po o denado . Con las SDM se puede analiza el mecanismo molecula y los aminoácidos implicados du an e la o mación de un complejo he e odíme ico o en la in e acción de un ligando con su ecep o (Hui e al., 2016; Filizola e al., 2006; Simpson e al., 2010; Johns on e al., 2012; Go inski e al., 2012). La hipó esis que subyace a la gene ación de modelos de homología y las SDM es que el compo amien o dinámico de los modelos in o ma izados puede desc ibi se en é minos de los p incipios ísicos básicos que igen las in e acciones y mo imien os In oducción ! ! 46! de sus cons i uyen es a ómicos elemen ales (B ooks e al., 2009). La elación en e es uc u a y ene gía es un elemen o esencial de muchos es udios compu acionales basados en modelos a ómicos de allados. Pa a!calcula la ene gía po encial de un sis ema a pa i del conjun o de coo denadas a ómicas co espondien es a la es uc u a o con o mación, se u iliza una unción de ene gía po encial conocida como campo de ue zas o “ o ce ield” ( igu a 8). En es a unción se incluyen las ene gías necesa ias pa a es i a el enlace en e dos á omos, la ene gía necesa ia pa a dobla el ángulo en e dos á omos enlazados, la ene gía de o sión pa a la o ación al ededo de un enlace, la ene gía elec os á ica (in e acciones en e á omos debidas a la dis ibución de los elec ones) y la ene gía Van de Waals (B ooks e al., 2009). De es a o ma el campo de ue zas pa ame iza las di e en es ca ac e ís icas de cada á omo, así como el conjun o de ue zas que incide sob e él y que o man pa e de un de e minado sis ema. Es e sis ema puede es a compues o po p o eínas, lípidos, ácidos nucleicos o una combinación de di e en es mac omoléculas, po ejemplo, GPCRs embebidos en memb anas. El campo de ue zas es la unción que ha pe mi ido el desa ollo p og amas como CHARMM (“Chemis y a HAR a d Molecula Mechanics”) que incluye múl iples he amien as en e las que se incluyen la gene ación de SMD, ealiza minimizaciones molecula es o cons ui de modelos de homología. (Eswa e al., 2007). Figu a 8: Rep esen ación esquemá ica de las di e en es ue zas que pueden apa ece en e dos á omos den o de un modelo compu acional de mac omoléculas. Todas es as ue zas se incluyen en la unción de ene gía po encial que de e mina á el mo imien o de los á omos. De izquie da a de echa: ue za pa a es i a enlaces co alen es, pa a dobla el ángulo del enlace en e dos á omos, pa a la o ación de enlaces, e in e acciones en e á omos no enlazados (in e acciones elec os á icas y ue zas de Van de Walls). Adap ado de B ooks e al., 2009. Las SDM se u ilizan pa a e alua las p opiedades es uc u ales, e modinámicas y dinámicas de los sis emas biomolecula es. Dichas simulaciones equie en la in eg ación de las ecuaciones de mo imien o de New on, que de e minan las In oducción ! ! 47! coo denadas de cada á omo de un sis ema en unción del iempo (B ooks e al., 2009). La minimización es un p o ocolo i e a i o, que busca el mínimo de una unción ene gé ica po encial de e minada. Cuando se ealiza un modelo de homología o se cons uye un sis ema con a ias mac omoléculas dis in as, al aplica el campo de ue zas se gene an ensiones con o macionales e in e acciones de i adas de es as cons ucciones que hacen que el sis ema enga una al a ene gía po encial. En el p oceso de minimización, se ealizan a ios ciclos en los que se ecalculan las posiciones a ómicas de o ma que se minimiza es a unción de ene gía. De o ma que a lo la go del iempo se busca llega al mínimo de ene gía que es ablece la unción del campo de ue zas en cada ciclo has a encon a la con igu ación más es able (B ooks e al., 2003). A día de hoy exis en modelos de homología con la es uc u a de los ecep o es GALR1 y GALR2 desa ollados pa a analiza la in e acción en e dis in os ligandos con dichos ecep o es, pe o es os modelos no incluyen los aminoácidos de los ex emos N y C- e minales (Hui e al., 2016; Ju kowski e al., 2013). Va ios abajos compu acionales sob e la in e acción en e los GPCRs apun an al posible papel del ex emo C- e minal en dicha in e acción (Filizola e al., 2006; Simpson e al., 2010; Go inski e al., 2012; Johnson e al., 2012). Dado que el ex emo C- e minal es á implicado en los mecanismos de señalización in acelula (Sensoy e al., 2014) y que en la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2 se p oducen cambios en las ías de señalización in acelula (Millón e al., 2015; Bo o o-Escuela e al., 2014), conside amos undamen al gene a modelos de homología con la secuencia in eg a de los ecep o es GALR1 y GALR2 pa a pode es udia el posible papel de los ex emos N y C- e minales en la o mación del he e odíme o además de los dominios TM. In oducción ! ! 48! OBJETIVOS Obje i os ! ! 51! Como se ha desc i o p e iamen e, la GAL mues a e ec os ansiogénicos o ansiolí icos en dis in os es de compo amien o dependiendo del luga de adminis ación y del es ado de es és p e io del animal (Bing e al. 1993; Mölle e al. 1999; Khoshbouei e al 2002; Ba e a e al. 2006). En elación con sus e ec os en la dep esión, la GAL induce un e ec o p o-dep esi o en el es de na ación o zada en oedo es (Weiss e al., 1998; Ku ee a e al., 2008) que es a mediado po los ecep o es GALR1 y GALR3 (Swanson e al 2005; Ku ee a e al 2008b), mien as que la ac i ación del ecep o GALR2 induce e ec os an idep esi os en es e mismo es (Ku ee a e al. 2008b). Además, la GAL in e acciona con la se o onina a ni el de compo amien o y a ni el de ecep o p oduciendo una inhibición de los ecep o es 5-HT1A (Fuxe e al. 1988; Fuxe e al. 1990; Razani e al., 2000; Ku ee a e al., 2008; Bo o o-Escuela e al., 2010). No sólo la GAL sino ambién su agmen o N- e minal, GAL(1-15), desempeña un papel ele an e en nume osas unciones ce eb ales con e ec os di e en es a los de la molécula comple a e implicando, además, mecanismos de acción di e en es (Hedlund e al., 1992; Diaz-Cabiale e al., 1998; Diaz-Cabiale e al., 2005; Diaz- Cabiale e al., 2010; Ihna ko e al., 2017). En es e sen ido, en abajos ecien es de nues o g upo de in es igación, hemos desc i o como la adminis ación cen al del agmen o GAL(1-15) en a as p oduce e ec os p o-dep esi os y ansiogénicos más po en es que los que p oduce la molécula comple a (Millón e al., 2015). Además, hemos demos ado que el mecanismo de acción po el que ac úa el agmen o GAL(1-15) depende de los ecep o es GALR1 y GALR2 que pa icipan en la o mación de un complejo he e odimé ico GALR1-GALR2 (Bo o o-Escuela e al., 2014; Millón e al., 2015). Sin emba go, se hace necesa io p o undiza en el papel del agmen o GAL(1-15) en la ansiedad y la dep esión y en la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2 como mecanismo de acción del agmen o. Recien emen e ambién hemos is o como GAL(1-15) in e acciona con el sis ema se o oniné gico, po enciando los e ec os an idep esi os del agonis a del ecep o 5- HT1A 8-OH-DPAT de o ma más in ensa que como lo hace la GAL. El agmen o GAL(1-15) es capaz de modi ica ambién la a inidad y exp esión del ecep o 5- Ma e ial y Mé odos ! ! 58! 15minu os (min) después ealiza on el es de suspensión de la cola o el es de luz/oscu idad ( igu a 1). Figu a 1: Esquema de los p ocedimien os ealizados en el expe imen o pa a es udia el e ec o de GAL(1-15) en el es de suspensión de la cola y del es luz/oscu idad. En el p ime expe imen o empleamos el es de suspensión de la cola (S e u e al., 1985), p ueba ampliamen e u ilizada pa a e alua la conduc a dep esi a en oedo es. Pa a es udia el e ec o ansiogénico de GAL(1-15), ealizamos un segundo expe imen o empleando el es de luz/oscu idad (C awley and Goodwin, 1980), que es una de la p uebas más ecuen emen e empleadas en modelos animales de ansiedad incondicionada. Tabla 1: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a ealiza el es de suspensión de la cola G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .) 8 GAL(1-15)(3nmol) GAL(1-15)(3nmol) (i.c. .) 6 Tabla 2: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a ealiza del es de Luz/Oscu idad G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .) 5 GAL(1-15)(3nmol) GAL(1-15)(3nmol) (i.c. .) 6 Ma e ial y Mé odos ! ! 59! 1.2- Desa ollo de modelos de homología de GALR1 y GALR2 Pa a p o undiza en los mecanismos molecula es implicados en la o mación del he e odíme o GALR1-GALR2, necesa io pa a la acción de GAL(1-15), desa ollamos modelos de homología pa a los ecep o es GALR1 y GALR2, empleando el so wa e Disco e yS udio (Accel ys, San Diego, EEUU) ins alado en una es ación de abajo Dell p ecisión T5500. El so wa e Disco e yS udio incluye odas las he amien as y p og amas necesa ios pa a gene a los modelos de homología (BLAST, MODELLER, CHARMm). La mayo ía de mé odos pa a ealiza modelos de homología de p o eínas incluyen 5 pasos secuenciales (Eswa e al., 2007) (Fise , 2010): A- Búsqueda de p o eínas con es uc u as 3D conocidas elacionadas con la secuencia diana (alineamien o). B- Selección de las es uc u as que se u iliza án como plan illas C- Alineamien o de las es uc u as molde con la secuencia obje i o. D- Ensamblaje del modelo de homología. E- E aluación del modelo y e inamien o. Figu a 2: Esquema de los p ocedimien os seguidos pa a ob ene los modelos de homología de GALR1 y GALR2. Modi icado de Eswa e al., 2007. Ma e ial y Mé odos ! ! 60! A) Búsqueda de secuencias po alineamien o: P ime o ob u imos la secuencia de aminoácidos de los ecep o es GALR1 (Q62805) y GALR2 (O08726) en o ma o FASTA en la base de da os UniP o (h p://www.unip o .o g/). A pa i de es os a chi os el so wa e ealizó múl iples alineamien os con las secuencias de p o eínas disponibles en la base de da os “p o ein da a bank” (PDB) (h ps://www. csb.o g/pdb/home/home.do), donde se almacenan odas las p o eínas con es uc u a idimensional conocida, incluidos los GPCRs. Es e alineamien o se ealizó median e un BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool) (Al schul e al., 1990; 1997). B) Selección de plan illas: Una ez ob enido el lis ado de p o eínas que se alinea on con la secuencia de nues a p o eína obje i o, seleccionamos las más adecuadas pa a la ase de modelización. Es a selección se ealizó conside ando un índice “bi sco e” en el alineamien o mayo de 60 y además que dicho alineamien o enga luga a lo la go de oda la secuencia molde de aminoácidos pa a los ecep o es GALR1 y GALR2. “Bi sco e” es un pa áme o no malizado que indica un mejo alineamien o cuan o mayo sea. C) Alineamien o de las es uc u as moldes con la secuencia obje i o: Una ez seleccionadas las p o eínas molde que empleamos pa a c ea los modelos de homología, usamos la he amien a “alinea secuencias a la plan illa” del so wa e Disco e yS udio. Con es a he amien a se p epa a on a las p o eínas molde seleccionadas del paso an e io como plan illas pa a cons ui los modelos de homología a pa i de la secuencia obje i o, en es e caso la de GALR1 o GALR2. Pa a ello empleamos el algo i mo de alineación de es uc u as de MODELER (Eswa d e al., 2007), de o ma que las di e en es plan illas se alinea on en unción de una simili ud es uc u al, y después se alineó la secuencia obje i o, GALR1 o GALR2, con el pe il es uc u al ob enido u ilizando el p og ama Align123 (Thompson e al., 1994). La alineación es uc u al ealizada po MODELLER implicó la supe imposición de las di e en es es uc u as idimensionales de las p o eínas que se usa on como Ma e ial y Mé odos ! ! 61! plan illa. MODELLER mide la simili ud en e las coo denadas a ómicas supe pues as como la des iación cuad á ica media de la aíz (RMSD) (Ku a e a and Abagyan, 2012) que esencialmen e es una medida de la dis ancia media en e los á omos que ocupan una misma posición. D) Ensamblaje de los modelo de homología: El siguien e paso consis ió en la cons ucción en sí de los modelos de homología de GALR1 y GALR2. Usando de nue o MODELLER, Disco e yS udio gene ó has a 20 modelos di e en es a pa i de las plan illas supe impues a en el paso “alinea secuencias a la plan illa” desc i o an e io men e. E) E aluación del modelo y e inamien o: Una ez gene ado los di e en es modelos de homología, usamos o a he amien a del so wa e, “Ve i y p o ein”, pa a calcula el pa áme o DOPE (Ene gía disc e a op imizada de la p o eína) de cada modelo gene ado. Los alo es más bajos de es e pa áme o nos indica on cuál ue el mejo modelo gene ado. DOPE es un pa áme o que se basa en el es udio de pe iles ene gé icos que adop an las p o eínas con es uc u a conocida, de o ma que, bajo la p emisa de que las p o eínas en su es ado na i os adop an las con o maciones de mínima ene gía, se puede es ablece una unción que indica cuán lejos es á una es uc u a modelizada de su mínimo ene gé ico (Shen and Sali, 2006), siendo el modelo con alo más bajo de DOPE el que indica una con o mación ene gé icamen e más óp ima. Ma e ial y Mé odos ! ! 62! 2- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es GALR1 y GALR2. 2.1- Es udia la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST y de e mina si es a in e acción es exclusi a del agmen o o se da ambién con la GAL. Pa a e alua la in e acción en e GAL(1-15) y FLX a ni el de compo amien o empleamos el es de na ación o zada (FST) (Po sol e al., 1977) que es uno de los es de e e encia pa a e alua los e ec os clínicos de sus ancias an idep esi as (Bogdano a e al., 2013). Realizamos 3 expe imen os di e en es. En odos ellos, a los animales se les implan ó una cánula ija en el en ículo la e al y as una semana de pos ope a o io, los animales se habi ua on a las condiciones de la sala y a la manipulación po pa e del in es igado . El esquema gene al de los p ocedimien os seguidos pa a ealiza es os expe imen os se ep esen a en la igu a 3 y los g upos expe imen ales con los a amien os a macológicos pa a cada expe imen o se de allan en las ablas 3, 4 y 5. Figu a 3: Esquema de los p ocedimien os ealizados en los expe imen os pa a e alua la in e acción GAL(1-15)- FLX en el FST. Ma e ial y Mé odos ! ! 63! P ime o ealizamos un expe imen o pa a de e mina las dosis subumb ales y e ec i a de FLX. La FLX se adminis ó po ía subcu ánea (s.c.) con un pa ón de inyección subc ónico en e las ases de p e- es y es del FST, adminis ando a cada animal es inyecciones a 23, 5 y 1 ho a an es del es (De ke e al., 1997; Es ada-Cama ena e al., 2003). Tabla 3: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a de e mina la dosis e ec i a y subumb al de FLX en el FST G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 9 FLX(2,5mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX 2,5mg/Kg (s.c.) 6 FLX(10mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX 10mg/Kg (s.c.) 8 En el segundo expe imen o, pa a e alua la in e acción en e GAL(1-15) y FLX, coadminis amos una dosis subumb al de FLX(2,5mg/Kg) de e minada en el expe imen o an e io jun o con una dosis subumb al de GAL(1-15)(1nmol), de e minada en es udios p e ios de nues o g upo de in es igación (Millón e al., 2015). La FLX se adminis ó siguiendo el p ocedimien o p e iamen e desc i o y la GAL(1-15) se adminis ó ía i.c. . 15min an es de la p ueba. Tabla 4: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a es udia la in e acción GAL(1-15)-FLX con dosis subumb ales en el FST. G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 9 GAL(1-15)(1nmol) GAL(1-15)(1nmol) (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 8 FLX(2,5mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX 2,5mg/Kg (s.c.) 7 FLX(2,5mg/Kg) + GAL(1-15)(1nmol) GAL(1-15)(1nmol) (i.c. .)+ FLX 2,5mg/Kg (s.c.) 8 Ma e ial y Mé odos ! ! 64! En el e ce expe imen o es udiamos si la dosis subumb al de GAL(1-15) e a capaz de modula una dosis e ec i a de FLX. Además, analizamos si la molécula comple a de Galanina podía modula ambién los e ec os de la FLX. Pa a ello, compa amos los e ec os de coadminis a GAL(1-15) con una dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg) con los e ec os de coadminis a la Galanina comple a con una dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg). La FLX se adminis ó como en el p ime expe imen o con un pa ón subc ónico y la GAL(1-15) o Galanina se adminis a on 15min an es de la p ueba po ía i.c. . a una dosis de 1nmol. Tabla 5: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a es udia la in e acción GAL(1-15)-FLX con dosis e ec i as de FLX en el FST y compa a i a con los e ec os de la coadminis ación con Galanina y FLX. G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 9 FLX(10mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX 10mg/Kg (s.c.) 7 FLX(10mg/Kg)+ GAL(1-15)(1nmol) GAL(1-15)(1nmol) (i.c. .)+ FLX 10mg/Kg (s.c.) 8 FLX(10mg/Kg) + Galanina(1nmol) Galanina(1nmol) (i.c. .)+ FLX 10mg/Kg (s.c.) 8 Ma e ial y Mé odos ! ! 65! 2.2- E alua el papel de los ecep o es GALR2 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico M871 y un modelo de silenciamien o génico siGalR2. Pa a es udia el papel de los ecep o es GALR2 en la in e acción GAL(1-15)-FLX en el FST ealizamos dos expe imen os di e en es. En el p ime o empleamos el an agonis a especí ico de GALR2 M871 y en el segundo usamos un modelo de silenciamien o génico gene ado en nues o labo a o io de a as knockdown GALR2 (Millón e al., 2015). Pa a de e mina el papel del ecep o GALR2 usando el an agonis a M871 en la in e acción en e GAL(1-15)-FLX en el FST, ealizamos los mismos p ocedimien os que en los expe imen os an e io men e desc i os empleando el FST ( igu a 3). A odos los animales se les implan ó una cánula ija median e ci ugía es e eo áxica en el en ículo la e al y as una semana de pos ope a o io y dos días de habi uación y manipulación se les adminis a on los di e en es a amien os a macológicos especi icados en la abla 6. La FLX(10mg/Kg) o el Veh. se adminsi a on po ía s.c. con un pa ón subc ónico, mien as que el LCRa, el GAL(1-15) y/o el M871 se adminis a on po ìa i.c. . 15min an es del es . Tabla 6: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales empleados pa a es udia el papel del ecep o GALR2 usando el an agonis a M871 en la in e acción en e GAL(1-15)-FLX en el FST. G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) Con oles LCRa (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 9 FLX(10mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX10mg/Kg (s.c.) 8 FLX(10mg/Kg)+ GAL(1-15)(1nmol) GAL(1-15)(1nmol) (i.c. .)+ FLX10mg/Kg (s.c.) 8 FLX(10mg/Kg)+[GAL(1- 15)(1nmol)+M871(3nmol)] [GAL(1-15)(1nmol)+M871(3nmol)](i.c. .)+ FLX10mg/Kg (s.c.) 7 M871(3nmol) M871(3nmol)(i.c. .)+ Veh.(s.c.) 7 Ma e ial y Mé odos ! ! 66! Pa a gene a el modelo siGalR2, empleamos la ecnología del ARN in e e en e. Po medio de una única inyección i.c. . de un eac i o come cial, Acell siRNA (Dha macon, La aye e, EEUU), conseguimos educi los ni eles de ARN mensaje o y la inmuno eac i idad del ecep o GALR2 a los 8 días después de la inyección has a en un 40% (Nakajima e al., 2012; Millón e al., 2015). Es e eac i o es a o mado po 4 oligonucleó idos complemen a ios a la secuencia diana, en es e caso el ARN mensaje o de GALR2, modi icados químicamen e pa a pode inclui se especí icamen e en neu onas sin se deg adados (Baskin e al., 2008; Nakajima e al., 2012). Pa a de e mina el papel de GALR2 en la in e acción GAL(1-15)-FLX empleando el modelo siGalR2, a odos los animales se les inyec ó po ía i.c. . el día de la implan ación de la cánula ija 5µl de eac i o come cial Acell siRNA diseñado pa a in e e i con el ARN mensaje o de GALR2. El iempo de pos ope a o io jun o con los días de habi uación y manipulación ue el p e iamen e de e minado pa a hace coincidi los días de mínima exp esión del ecep o GALR2 con la p ueba del FST ( igu a 4). Figu a 4: Esquema de los p ocedimien os seguidos pa a ealiza el expe imen o con animales siGalR2 en el es de na ación o zada. Ma e ial y Mé odos ! ! 67! En es e expe imen o empleamos 3 g upos expe imen ales ( abla 7). La FLX(10mg/Kg) o el Veh. se adminsi a on po ía s.c. con un pa ón de inyección subc ónico, mien as que el LCRa o el GAL(1-15) se adminis a on po ía i.c. . 15min an es del es . Tabla 7: G upos expe imen ales y a amien os a macológicos adminis ados a los animales siGalR2 empleados pa a es udia el papel del ecep o GALR2 en la in e acción en e GAL(1-15)- FLX en el FST. G upos T a amien o Nº animales (n expe imen al) siGalR2-Con oles LCRa (i.c. .)+ Veh. (s.c.) 9 siGalR2-FLX(10mg/Kg) LCRa (i.c. .)+ FLX10mg/Kg (s.c.) 6 siGalR2-FLX(10mg/Kg) +GAL(1-15)(1nmol) GAL(1-15)(1nmol) (i.c. .)+ FLX10mg/Kg (s.c.) 8 2.3- E alua el papel de los ecep o es GALR1 en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando un modelo de silenciamien o génico siGalR1. Pa a pode de e mina el papel del ecep o GALR1 y dado que no se conocen an agonis as especí icos de es e ecep o , p ime o gene amos el modelo de a a siGalR1 con un p ocedimien o equi alen e al ealizado pa a desa olla el modelo siGalR2 (Millón e al., 2015). Pa a ello, e ec uamos una se ie de expe imen os diseñados pa a de e mina la educción de los ni eles de exp esión de GALR1 empleando las écnicas de qPCR- e inmunohis oquímica. Los p o ocolos expe imen ales seguidos pa a la consecución de es os expe imen os se de allan más adelan e en los co espondien es apa ados de es a esis. Ma e ial y Mé odos ! ! 74! Me odología Gene al 4- Animales de expe imen ación Pa a la ealización de los abajos desc i os en la p esen e esis doc o al se emplea on a as macho de la cepa Sp ague-Dawley, suminis adas po Cha les Ri e Labs. (CRIFFA, Ba celona). Los animales se ecibie on en el cen o de expe imen ación animal pe enecien e a los se icios cen ales de la Uni e sidad de Málaga con un peso de 200-275 g y una edad de unos 50 días ap oximadamen e. T as una semana de cua en ena, con olando su es ado sani a io, los animales se es abula on en g upos de 4-6 animales en jaulas de 55x33x20cm has a su uso en los di e en es expe imen os. La empe a u a media del es abula io ue de 23±1ºC con una humedad del 60-70% y un o ope iodo de 12/12 ho as de luz/oscu idad, iniciándose el pe iodo de luz a las 7:00 AM ho a local. Los animales u ie on acceso ad libi um a comida y bebida con una die a es ánda de man enimien o a ón/ a a (CRIFFA, Ba celona) y agua de la ed gene al de abas ecimien o, excep o en las 24h pos e io es a la ci ugía es e eo áxica. El cuidado y man enimien o de los animales de expe imen ación así como odos los p ocedimien os empleados se ealiza on siguiendo la no ma i a igen e, según la di ec i a de la Comunidad Eu opea 86/609/EEC y las ecomendaciones que se es ablecen en la Ley 6/2013, de 11 de junio, de modi icación de la Ley 32/2007, de 7 de no iemb e y en el Real Dec e o 53/2013, de 1 de eb e o del es ado Español. Los p ocedimien os empleados en los es udios empleados en es a esis ue on ap obados po el comi é é ico de la Uni e sidad de Málaga (nº expedien e CEUMA: 2-2016-A). 5- Ci ugía es e eo áxica En los expe imen os donde se equi ió la implan ación de una cánula guía la e al ija, pa a la pos e io adminis ación de sus ancias po ía i.c. ., los animales se ope a on en las salas de ci ugía en la unidad de expe imen ación animal de la Uni e sidad de Ma e ial y Mé odos ! ! 75! Málaga. El ma e ial qui ú gico necesa io pa a el p ocedimien o ue es e ilizado p e iamen e. Los animales se anes esia on con una inyección in ape i oneal del coc el anes ésico Equi esina con una dosis inicial de a aque de 3.3ml/Kg. La composición de la Equi esina es la siguien e: Pen oba bi al Sódico 0.97% (Sigma-Ald ich, San Luis, EEUU), E anol Absolu o 11.5% , Hid a o de Clo al 4.25%, P opie ilenglicol 42.8%, Sul a o de Magnesio 2.1% y Agua Des ilada 47.7%. Todos los eac i os excep o el Pen oba bi al ue on adqui idos en Pan eac Química S.A., Ba celona, España. La equi esina pe mi e la ecupe ación del es ado no mal isiológico del animal ápidamen e sin in e e i signi ica i amen e en el desa ollo de los es udios compo amen ales pos e io es. Además, dado su amplio ma gen de segu idad, la equi esina ha sido empleada en nume osos p ocedimien os expe imen ales (Nielsen and Moo e, 1982; Deacon and Rawlins, 1996). An es de inicia el p oceso qui ú gico se comp obó el plano anes ésico de los animales median e el pinzamien o palma y de la cola po si p esen aban e lejo podal y/o caudal, en al caso, se les adminis a on nue as dosis de anes ésico de 0,6ml/Kg pa a consegui el plano anes ésico adecuado. Du an e la ci ugía se e aluó en odo momen o el es ado de los animales, adminis ándoles nue as dosis de e ue zo cuando e a necesa io. Una ez que los animales es u ie on comple amen e anes esiados, se asu ó la zona de la ope ación con una maquina de a ei a y se ijó la cabeza al apa a o de es e eo áxia (Kop ins umen s, Tujunga, EEUU) (Figu a 9). P ime o ajus amos los conduc os audi i os a las ba as la e ales del apa a o pa a impedi mo imien os la e ales. Después, colocamos los incisi os en la ba a an e io impidiendo mo imien os ascenden es o descenden es de la cabeza du an e la ci ugía, p ocu ando no daña la lengua y sacándola la e almen e pa a e i a la as ixia del animal. A con inuación, se ajus ó la al u a de la ba a an e io de o ma los pun os c aneomé icos B egma y Lambda queda on alineados en un plano ho izon al. Ma e ial y Mé odos ! ! 76! Figu a 9: Fo og a ías del apa o de es e eo áxia y ma e ial qui ú gico empleado du an e la ci ugía. A la de echa de alle de las cánulas guía y de inyección así como de los o nillos empleados du an e la ci ugía. Con la cabeza del animal inmó il en el apa a o de es e eo áxia, ealizamos una incisión con un bis u í desde la comisu a an e io de los ojos has a la pa e pos e io de la cabeza, e i amos la piel y ealizamos una segunda incisión en el pe ios io que se e i ó ambién con ayuda del bis u í dejando al descubie o la calo a. Tan o la piel como el pe ios io se ija on con pinzas o ceps con la pun a cu ada pa a acili a el abajo. Con unos hisopos limpiamos y secamos la calo a y localizamos el pun o B egma, donde se unen los huesos pa ie ales y on ales, que usamos como pun o de e e encia pa a implan a la cánula guía en el en ículo la e al según las coo denadas es e eo áxicas: An e o-Pos e io , -1mm. La e al, 1.4mm Ve ical, 3.6mm de p o undidad desde la du amad e. En el apa a o de es e eo áxia ijamos las coo denadas an e o-pos e io y la e al adecuadas y ma camos la calo a sua emen e. La longi ud de la cánula guía es la adecuada pa a alcanza la coo denada e ical. Con un alad o y las b ocas adecuadas ealizamos es aguje os sin oca la du amad e, dos pa a la implan ación de o nillos y un e ce o de diáme o más es echo (0,8mm) adecuado al g oso de la cánula guía en el luga donde se encuen a la ma ca de la calo a. Los aguje os de los o nillos se ealiza on en una zona donde no en o pecie an la implan ación de la cánula guía. Ma e ial y Mé odos ! ! 77! Realizados los aguje os y limpiado el á ea de abajo, implan amos los o nillos con cuidado de no ebasa el g oso del c áneo y pos e io men e implan amos la cánula guía C313G/Spc Guide 22GA (Plas ic One, Roanoke, EEUU). Pa a ija la cánula guía y los o nillos colocamos una pequeño cilind o de plás ico y lo ellenamos con cemen o den al Den alon® (He aeus, Hanau, Alemania) sin que llegase a cub i la cánula guía. Espe amos has a que el cemen o se secó comple amen e y su u amos con hilo de seda dejando lib e el cilind o de plás ico que con enía la cánula guía ija. Una ez e minada la ope ación, los animales se e i a on del apa a o de es e eo áxia y se coloca on en una man a é mica pa a con a es a el e ec o de bajada de empe a u a de la equi esina. Pos e io men e los animales se coloca on en jaulas indi iduales (36x22x20cm) y se de ol ie on a la sala de es abulación sin comida du an e 24h y con agua pa a e i a deshid a ación po pé dida de sang e y líquidos. Todos los animales pasa on un pos ope a o io de una semana de du ación. 6- Adminis ación de sus ancias Las dis in as sus ancias empleadas du an e la ealización de los expe imen os de allados an e io men e se adminis a on po dos ías: subcu ánea (s.c.) e in ace eb o en icula (i.c. .) Pa a adminis a sus ancias po ía s.c., los animales se inmo iliza on sua emen e cogiendo un pliegue de piel de la pa e an e io de la espalda po donde se inyec a on los di e en es a amien os a macológicos. Pos e io men e se comp obó de o ma manual la dis ibución subcu ánea de la dosis ecién inyec ada. El p oceso se ealizó ápidamen e con el in de minimiza el es és del animal. Todas las sus ancias adminis adas po es a ía se ajus a on a una concen ación al que el olumen de inyección ue de 2ml/Kg usando como diluyen e agua des ilada. La adminis ación de sus ancias po ía i.c. . se ealizó con animales p e iamen e manipulados pa a disminui el es és del animal du an e la adminis ación de sus ancias ya que el p oceso equie e de la inmo ilización del mismo. Empleamos Ma e ial y Mé odos ! ! 78! una je inguilla Hamil on de 10µL de olumen unida a un ubo de polip opileno (P10) de unos 10cm en cuyo ex emo ajus amos una cánula de inyección de ace o inoxidable C313I/Spc 28GA (Plas ic One, Roanoke, EEUU) con una longi ud de 0.3mm mayo que la cánula guía pa a e i a la e odi usión de las sus ancias. Todas las sus ancias adminis adas po es a ía se ajus a on a una concen ación adecuada pa a que el olumen de la inyección ue a siemp e de 5µL, empleando pa a su disolución líquido ce alo aquídeo a i icial (LCRa) ajus ado a un pH de 7.4. La composición del LCRa es la siguien e: Clo u o sódico 120nM, Ca bona o monosódico 20mM, Clo u o Po ásico 2mM, Fos a o monopo ásico 0.5mM, Clo u o cálcico 1,2mM, Clo u o magnésico 1.8mM, Sul a o bisódico 0.5mM, D-glucosa 5.8mM. Todas las sus ancias ue on adqui idas a Pan eac Química S.A., Ba celona, España. Con el animal inmó il in oducimos comple amen e la cánula de inyección a a és de la cánula guía y manualmen e ealizamos la mic oinyección de o ma sua e y cons an e pa a e i a la e odi usión de la sus ancia. La adminis ación se ealizó ap oximadamen e du an e 2min y pos e io men e se dejó que la sus ancia di undie a du an e 1min más. Re i amos la cánula de inyección y el animal ue de uel o a su jaula pa a con inua con el p ocedimien o expe imen al. 7- Tes de Compo amien o Animal 7.1- Condiciones de la sala y manipulación de animales Las di e en es p uebas de compo amien o empleadas en la p esen e esis doc o al se e ec ua on en salas especí icamen e diseñadas pa a al in en la unidad de expe imen ación animal de la Uni e sidad de Málaga. Pa a e i a el es és de i ado del cambio de habi ación, los animales se habi ua on dos días an es de las p uebas de compo amien o du an e una ho a a las condiciones expe imen ales de la sala de compo amien o. Además, en esos días an e io es a las p uebas de compo amien o, Ma e ial y Mé odos ! ! 79! ambién se p ocedió a la manipulación del animal po pa e del in es igado que ealizó dichas p uebas. Las condiciones de las salas donde se ealiza on las p uebas de compo amien o e an las adecuadas pa a no in e e i en el pa ón conduc ual de los animales (G iebel e al., 1993; Koka e e al., 2005). La empe a u a ambien e ue de 23±1ºC y la humedad del 60-70%. Las condiciones lumínicas se ija on en 100lux de in ensidad. Además las habi aciones de compo amien o cuen an con un sis ema de p esión posi i a que e i a la en ada de olo es y se encuen an en zonas adecuadas de las ins alaciones pa a minimiza los uidos ex e nos. Las p uebas de compo amien o se ealiza on siemp e en e las 14:00h y las 17:00h pa a e i a in e e encias del ciclo ci cadiano. 7.2- Tes de Suspensión de la Cola El es de suspensión de la cola es a diseñado pa a e alua las conduc as dep esi as y an idep esi as en oedo es. El es se basa en la conduc a de inde ensión ap endida donde, an e una si uación a e si a y sin escapa o ia, los animales adop an compo amien os pasi os (S e u e al., 1985; Che ma e al., 1986). La me odología del es implica idea un disposi i o median e el cual se puedan colga a los animales de la cola. Du an e el es los animales al e nan compo amien os de inmo ilidad y agi ación. El inc emen o en el iempo de inmo ilidad en es e es se co elaciona con e ec os p o-dep esi os en es e es (S e u e al., 1985; Che ma e al., 1986). En nues os expe imen os, pa a la ealización de es e es , suje amos una cue da con cin a adhesi a a la cola de los animales y se colga on de una a mella a una al u a de 60cm ( igu a 10). De o ma indi idual, se g abó el compo amien o de los animales du an e 6min con una ideocáma a y pos e io men e los ideos se analiza on con el p og ama in o má ico E hoVision XT7 (Noldus, Wageningen, Holanda) pa a cuan i ica el iempo de la conduc a de inmo ilidad. Se conside ó al animal inmó il cuando no ealizaba ningún mo imien o de lucha, in en o de mo de la cin a adhesi a, o siones del cue po o i ones (Hinojosa e al., 2006; Yan e al., 2014). Ma e ial y Mé odos ! ! 80! Figu a 10: Imagen esquemá ica ep esen a i a del es de suspensión de la cola. A la izquie da un animal cuelga comple amen e inmó il, a la de echa un animal in en ando alcanza se la cola. Modi icado de Abelai a e al., 2013 7.3- Tes de Luz/Oscu idad El es de luz/oscu idad se enma ca den o de los modelos de ansiedad incondicionada y es a diseñado pa a e alua la conduc a de la ansiedad (C awley and Goodwin, 1980). Es e es es á basado en la a e sión de los oedo es po los espacios in ensamen e iluminados y su inclinación na u al a la explo ación. El apa a o usado pa a es e es pe mi e al animal desa olla ambas conduc as siendo su es ado de ansiedad lo que de e mina que conduc a p e alece (Hascoe and Bou in, 1998). Pa a ealiza nues os expe imen os con es e es adap amos una caja de e i ación pasi a de o ma que los pa áme os de in e és se egis aban median e el p og ama in o má ico Shu A oid (Panlab S.L., Co nella de Llob ega , España). Es e es cons a de dos compa imen os de dimensiones 26x25x27cm unidos longi udinalmen e y conec ados en e ellos po una pue a abie a po donde los animales pueden pasa sin di icul ad. Uno de los compa imen os es á pin ado de neg o y el o o es á pin ado de blanco e iluminado po una bombilla de 40W po una ape u a en el echo ( igu a 11). Los animales de o ma indi idual se dispusie on en el cen o del compa imen o iluminado y se les pe mi ió explo a lib emen e du an e 5min mien as se g ababa su Ma e ial y Mé odos ! ! 81! compo amien o. Regis amos las siguien es a iables dependien es: - La encia de en ada a cáma a oscu a (s): Se de ine como el iempo que a dó el animal en en a po p ime a ez desde la cáma a iluminada a la oscu a con las cua o pa as. - Tiempo en cáma a iluminada (s): Tiempo o al que el animal pasó en la cáma a iluminada du an e los 5min del es . - La encia de e o no (s): Se de ine como el iempo que a dó el animal en ol e po p ime a ez desde la cáma a oscu a a la iluminada. Un descenso en el iempo de la encia de en ada a la cáma a oscu a y del iempo en la cáma a iluminada, así como un inc emen o en el iempo de la la encia de e- en ada se in e p e a en es e es con un e ec o ansiogénico (Hascoe and Bou in, 1998). Figu a 11: Imagen esquemá ica ep esen a i a del es de luz/oscu idad. Imagen adap ada de E-phy- science,Sophia An ipolis, F ancia. 7.4- Tes de Na ación Fo zada El FST es la p ueba de compo amien o más ampliamen e usada pa a ensaya la conduc a dep esi a y an idep esi a en oedo es así como pa a e alua la e icacia clínica de los an idep esi os (Po sol e al., 1977; De ke and Lucki, 1996; Bogdano a e al., 2013). Como en el es de suspensión de la cola, la ealización del es supone Ma e ial y Mé odos ! ! 82! un es eso pa a los animales que les lle a a adop a compo amien os pasi os indica i os del g ado de desespe anza (Wes , 1990). Pa a la ealización de es a p ueba empleamos un ubo de me ac ila o de 50cm de al u a con un diáme o de 20cm que se llena on de agua co ien e a 25±1ºC has a una al u a de 30cm ( igu a 12) (De ke and Lucki, 1996). La p ueba cons ó de dos sesiones (Po lso e al., 1977). En la p ime a sesión o p e- es , los animales, de o ma indi idual, ue on in oducidos sua emen e en el agua y se les pe mi ió nada lib emen e du an e 15min. 24h después se ealizó el es , donde los animales ue on nue amen e in oducidos en el agua en las mismas condiciones que du an e el p e- es . Su ac i idad ue egis ada con una ideocáma a du an e 5min. El compo amien o de cada animal ue e aluado con pos e io idad con la ayuda del p og ama in o má ico E hoVision XT7 (Noldus, Wageningen, Holanda) pa a la cuan i icación del iempo de cada conduc a de in e és. Se de inie on es conduc as di e en es medidas odas en segundos (Ku ee a e al., 2007): - Inmo ilidad: El animal ealizó sólo mo imien os que le pe mi ie on man ene la cabeza ue a del agua pe maneciendo undamen almen e inmó il y lo ando de o ma pasi a. - Na ación: El animal nadó de o ma mode ada, mo iendo las cua o pa as y pudiendo ealiza cí culos al ededo del ubo. - Escalada: El animal ealizó mo imien os igo osos de o ma ho izon al, habi ualmen e con a las pa edes del ubo. - Los e ec os p o-dep esi os en es e es se co elacionan con inc emen os en el iempo de inmo ilidad del animal y la disminución en el iempo de escalada. Po el con a io, educciones en el iempo de inmo ilidad y/o inc emen os en el iempo de na ación y escalada se co elacionan con e ec os an idep esi os. (Po lso e al., 1977; Ku ee a e al., 2007; Bogdano a e al., 2013). Ma e ial y Mé odos ! ! 83! Figu a 12: Imagen esquemá ica del FST. Se ep esen an las conduc as de escalada a la izquie da e inmo ilidad a la de echa. Modi icado de Abelai a e al., 2013 8- P ocedimien os con Tejido Ce eb al 8.1- P ocesamien o de ejido ce eb al Pa a la ealización en es a esis de los expe imen os de au o adiog a ía, hib idación in si u, inmunohis oquímica y qPCR- , cuyos p o ocolos se de allan a con inuación, ue necesa io ealiza una se ie de p ocedimien os p e ios pa a p ocesa el ma e ial biológico. 8.1.1- Pe usión in aca diaca P e iamen e a la ealización de los expe imen os de inmunohis oquímica se ijó el ejido ce eb al con una solución de Pa a o maldehido (Sigma-Ald ich, San Luis, EEUU) al 4% en ampón os a o salino (PBS) 0.1M pH 7.4 (PAF 4%) median e pe usión in aca diaca pa a conse a la es uc u a his ológica del ejido ce eb al. Ma e ial y Mé odos ! ! 90! 8.4- Análisis de ilms Tan o pa a los es udios de au o adiog a ía como pa a los de hib idación in si u los ilms ob enidos se analiza on con el p og ama ImageJ (Na ional Ins i u es o Heal h, NIH, EEUU), ob eniéndose medidas de densidades óp icas de las egiones del hipocampo do sal y del a e do sal ( igu a 13). En el caso de los es udios au o adiog á icos, las densidades óp icas se ans o ma on pos e io men e en unidades de mol/mg de p o eína median e es ánda es p e ab icados con políme os ma cados con H3 (Ame sham Mic oscale, Bucks, Reino Unido) y se ob u ie on cu as de sa u ación que pe mi ie on el cálculo de los pa áme os Kd (cons an e de disociación) y Bmax (núme o de si ios de unión) median e el so wa e es adís ico G aphPad P ism 6.0 (G aphPad So wa e, San Diego, EEUU). Figu a 13: Esquema de las secciones co onales de ce eb o de a a indicando las egiones de análisis en los ilms de au o adiog a ía e hib idación in si u. A la izquie da el a e do sal (0,09 mm2) y la de echa el GD (0,8 mm2) y CA1 (0,4 mm2) del hipocampo do sal. Modi icado del A las de Paxinos y Wa son, 1997. 9- Desa ollo de a as siGalR1 En la ealización de algunos expe imen os de es a esis doc o al hemos empleado modelos siGalR1 y siGalR2 en p uebas de compo amien o. En es e apa ado desc ibimos en de alle el p oceso de ob ención de es e modelo animal y las écnicas empleadas pa a comp oba la educción de los ni eles de ARN mensaje o y ni eles Ma e ial y Mé odos ! ! 91! de p o eína de GALR1. La ob ención y comp obación del modelo siGalR2 ya ha sido p e iamen e desc i o en abajos de nues o g upo de in es igación (Millón e al., 2015). La ob ención de es os modelos animales se basa en el enómeno de in e e encia del ARN según el cual pequeñas moléculas de ARN, de unos 20 nucleó idos, ienen la capacidad de uni se po complemen a iedad a moléculas de ARN mensaje o y ac i a mecanismos molecula es (RISC) que deg adan los ARNs de doble cadena en el ci oplasma ( igu a 14) (Akh a and Ben e , 2007; Kole e al., 2012). Figu a 14: Esquema del mecanismo molecula de in e e encia de ARN donde pequeños oligonucleó idos p o ocan la deg adación de ARN mensaje os ac i ando mecanismos molecula es de deg adación in acelula . (Flo es-Bu gess e al., 2018) Siguiendo p ocedimien os ya desc i os (Nakajima e al., 2012; Millón e al, 2015), la educción del ecep o GALR1 se consiguió inyec ando un eac i o come cial, el siRNA-GALR1 (Dha macon, La aye e, EEUU), po ía i.c. . Dicho eac i o consis ía en una mezcla de 4 secuencias co as de ARN complemen a ias a la secuencia del ARN mensaje o del ecep o GALR1. La adminis ación i.c. . de los oligonucleó idos se ealizó como se ha desc i o p e iamen e en apa ados an e io es de es a esis du an e el p ocedimien o de implan ación de la cánula ija. Una ez Ma e ial y Mé odos ! ! 92! e minado el p ocedimien o qui ú gico y con el animal aún anes esiado se inyec ó 5µg (0.35nmol) de siRNA-GALR1 (Dha macon, La aye e, EEUU), u ilizando como Veh. el medio de cul i o Acell siRNA Deli e y Media (DM) (Dha macon, La aye e, EEUU). El sis ema Acell p esen a una se ie de modi icaciones químicas que pe mi e a los oligonucleó idos en a en neu onas madu as sin se deg adados po las endonucleasas, pudiendo alcanza así a los ARN mensaje os obje i os (Baskin e al., 2008; Nakajima e al., 2012). Los 4 oligonucleó idos enían como diana las siguien es secuencias del ecep o GALR1: 1-UCUGCAAGUUUAUACACUA. 2-GCACUUUCGUCUUUGGUUA. 3-UGUUUGGCCUUAUUUUCGC. 4-UGCUCAUCUGCUUUUGCUA. Pa a la comp obación en la educción de los ni eles de ARN mensaje o y ni eles de p o eína en animales siGalR1 ealizamos expe imen os de qPCR- e inmunohis oquímica que desc ibimos a con inuación. Además, pa a comp oba que el sis ema de in e e encia pa a GALR1 no a ec aba a los ni eles de exp esión de GALR2 ambién medimos los ni eles de ARN mensaje o de es e ecep o median e qPCR- . 9.1- qPCR- Se inyec a on animales con siRNA-GALR1 po ía i.c. . y al cua o, sex o y oc a o día después de la inyección ue on sac i icados po decapi ación. Inmedia amen e después se ealizó la disección de los ce eb os pa a aisla el hipocampo do sal lo más ápidamen e posible y e i a la deg adación del ARN po pa e de las ibonucleasas (Figu a 15). Los ejidos ue on gua dados en eppendo s y congelados ápidamen e en hielo seco, almacenándose a -80ºC has a su uso. Ma e ial y Mé odos ! ! 93! Figu a 15: Imágenes del p oceso de disección manual del hipocampo de ce eb o de a a. Las lechas neg as indican la localización del hipocampo du an e la disección. La ob ención del ARN de las dis in as mues as se ob u o median e el empleo del ki de pu i icación "RNeasy Lipid Tissue Ki Mini Ki " (Qiagen, Hilde, Alemania) siguiendo las ins ucciones del ab ican e y con especial cuidado de que las mues as es u ie an siemp e a 4ºC pa a e i a la deg adación del ARN. La pu eza y can idad del ARN ob enido se de e minó con un espec o o óme o Nanod op (The mo Scien i ic, Wal ham, EEUU) median e la medida de los a io de abso bancia a 260/280nm y 260/230nm. El ARN ue alicuo ado y almacenado a -80ºC has a su uso. Pos e io men e, gene amos el cDNA que si ió de molde du an e la qPCR- . Empleamos pa a ello el ki de e o ansc ipción Re e se T ansc ip ase Co e ki (Eu ogen ec, Lieja, Bélgica) siguiendo las ins ucciones del ab ican e y con un e mociclado ABI 2720 (Applied Biosys em, Cali o nia, EEUU) p og amado con la siguien e secuencia de iempos y empe a u as: 10min a 25ºC pa a la hib idación de las sondas, 30min a 48ºC pa a la ac uación de la e o ansc ip asa y 5min a 95ºC pa a la inac i ación enzimá ica. La qPCR- se ealizó en un e mociclado 7500 Real Time PCR sys em (Applied Biosys ems, Cali o nia, EEUU) disponible en los se icios cen alizados de apoyo a la in es igación de la Uni e sidad de Málaga. En placas de 96 pocillos medimos po iplicado los ni eles de exp esión en cada mues a biológica del ARN mensaje o de GALR1, GALR2 o de GAPDH como gen de e e encia. La can idad inicial de cDNA Ma e ial y Mé odos ! ! 94! po pocillo ue de 40ng y el olumen inal de 25µl. Empleamos el ki come cial Powe SYBR G een PCR Mas e Mix (Applied Biosys ems, Cali o nia, EEUU) pa a de ec a los ni eles de ampli icación del cDNA en cada ciclo de la PCR. El p o ocolo de ampli icación ue el siguien e: 2min a 50ºC y 10min a 95ºC. 40 ciclos de 15s a 95ºC y 1 minu o a 60ºC. Al e mina los 40 ciclos se ob u o una cu a de usión pa a comp oba que la p esencia de un solo p oduc o de ampli icación po pocillo y que la empe a u a de usión de los p oduc os ampli icados co espondían a la empe a u a eó ica del agmen o de cDNA ampli icado. En cada placa ambién se ealiza on dos ipos de con oles. Un con ol sin cDNA pa a desca a con aminaciones del ki Mas e Mix y posible empa ejamien os no deseados de los p ime s y un con ol con mues as de ARN p e ias al paso de e o ansc ipción pa a desca a la con aminación de ADN genómico. Los da os se analiza on con el p og ama in o má ico 7500 SDS 1.4.1 (Applied Biosys ems, Cali o nia, EEUU) po el mé odo compa a i o de C (ΔΔC ), ealizando una cu a de cuan i icación ela i a de los ni eles de exp esión de los genes GALR1 o GALR2 espec o del gen de e e encia GAPDH en los días 4, 6 y 8 as la inyección del siRNA-GALR1 y no malizando las medidas a la exp esión de GALR1 o GALR2 en animales a ados con Veh. Las secuencias de p ime s empleadas pa a es e expe imen o ue on las siguien es: -GALR1 Sen ido: 5´-AAAACTGGACAAAACTTAG -GALR1 An isen ido: 5´-GGATACCTTTGTCTTTGCTC -GALR2 Sen ido: 5 !-AACAGGAATCCACAGACC -GALR2 An isen ido: 5 !-CCCTTTGGTCCTTTAACAAG -GAPDH Sen ido: 5 !-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTC -GAPDH An isen ido: 5 !-GAGGCTGGCACTGCACA Ma e ial y Mé odos ! ! 95! 9.2- P o ocolo de Inmunohis oquímica Animales inyec ados po ía i.c. . con siRNA-GALR1 o DM se pe undie on a los 8 días as la inyección y el ejido ce eb al ue p ocesado y co ado como se explica en apa ados an e io es. Seleccionamos el oc a o día po se el de meno exp esión en el expe imen o de qPCR- . Seleccionamos secciones co onales del hipocampo do sal, ya que es la egión donde es udiamos los ni eles de ARN mensaje o, a ni el de - 3.6mm espec o B egma (Paxinos y Wa son, 1997). El p o ocolo de inmunohis oquímica seguido y los an icue pos usados han sido p e iamen e empleados en abajos de nues o g upo de in es igación (Millón e al., 2016). Las secciones co onales de ejido y los ampones, se a empe a on du an e media ho a. P ime o se ealizó un paso de ecupe ación an ígenos, calen ando los co es du an e 30min a 80ºC en ampón ci a o a pH 6. Luego, con PBS 0.01M a pH 7.4 los co es se la a on 3 eces du an e 10min en agi ación con inua. Pos e io men e, los ejidos se a a on con H2O2 al 0.6% en agua des ilada du an e 20min en oscu idad pa a inac i a las pe oxidasas endógenas. Se ealiza on dos la ados más de 10min con PBS y an es de la incubación con el an icue po p ima io se ealizó una p eincubación de 10min con una dilución de T i ón al 0.3% y albúmina sé ica bo ina al 2% en PBS (PBS*) con obje o de pe meabiliza el ejido y bloquea posibles uniones inespecí icas. Pos e io men e se incuba on las dis in as secciones con un an icue po p ima io an i-GALR1 p oducido en cab a (San a C uz Bio ecnology, USA), a una concen ación 1/250 en PBS* du an e 1h a empe a u a ambien e y en agi ación. Las mues as con el an icue po se deja on oda la noche a 4ºC en la ne e a. Al día siguien e se a empe a on las secciones de ejido en agi ación con el an icue po p ima io así como los ampones du an e 1h. Luego se ealiza on 3 la ados de 10min con PBS. Después de una p eincubación 10min con PBS*, se ealizó la incubación con el an icue po secunda io, an i-goa bio inilado (Vec o labo a o ies, Cali o nia, EEUU), diluido a una concen ación de 1/200 en PBS* du an e 1h en agi ación y a Ma e ial y Mé odos ! ! 96! empe a u a ambien e. Luego se ealiza on 2 nue os la ados de 10min con PBS. T as p e-incuba los ejidos du an e 10min mcon PBS*, se a a on las secciones du an e 1h con un complejo A idina-Bio ina unido a Pe oxidasa (ABC) (The mo Scien i ic, Wal ham, EEUU) ambién diluido en PBS* a 1/200. Después, se la a on los co es 3 eces 10min con PBS y se p ocedió al e elado, pa a lo cual se añadió a cada ubo 500µl de una solución de 3-3´Diaminobenzidina (DAB) al 0.03% y H2O2 al 30% en PBS0.01M pH 7.4. En el e elado, la pe oxidasa unida al complejo ABC eacciona con los compues os de la solución y la DAB p ecipi a, dándole una onalidad ma ón a las células. Es a eacción se man u o du an e 5min y se de u o al añadi 2ml de PBS. Po úl imo, se la a on los ejidos 3 eces en PBS du an e 10min. Las secciones ce eb ales se coloca on sob e po as a ados con enien emen e o ulados y se deshid a a on po inme sión du an e 3min en la siguien e ba e ía de líquidos: agua des ilada, e anol al 60%, e anol al 90%, dos pasos de e anol absolu o y un úl imo paso de xileno. Una ez deshid a ado los ejidos se usó medio de mon aje DPX (Pan eac Química S.A., Ba celona, España) y un cub eobje os pa a p ese a las p epa aciones inmunohis oquímicas has a su es udio. El análisis de inmuno eac i idad de GALR1 se ealizó sob e o og a ías de dis in as secciones de ejido cap u adas con un mic oscopio óp ico (Nikon Op ipho -2) do ado de una cáma a de ideo Olympus UC30. La inmuno eac i idad se cuan i icó po densidad óp ica u ilizando el so wa e ImageJ (Na ional Ins i u es o Heal h, NIH, EEUU). Ma e ial y Mé odos ! ! 97! 10- Análisis es adís icos Cuando se compa a on dos g upos expe imen ales se u ilizó el es de la de S uden de una cola, conside ando los g ados de signi icación de p<0.05, p<0.01 y p<0.001. En el caso de que en un expe imen o se comp a on es o más g upos expe imen ales se u ilizó un análisis de la a ianza de una ía (ANOVA), seguida del es pos hoc de Newman-Keuls (nk), es ableciéndose ambién los g ados de signi icación es adís ica en p<0.05, p<0.01 y p<0.001. Los da os ob enidos en los expe imen os de sa u ación de au o adiog a ía se analiza on gene ando una cu a de eg esión no lineal pa a de e mina la cons an e de disociación (Kd) y el núme o o al de si ios de unión (Bmax) po cada a amien o. Pos e io men e los alo es de Kd y Bmax se analizan con un ANOVA seguido del es Newman-Keuls como pos hoc. Todos es os análisis se ealiza on usando del so wa e de G aphPad PRISM 6.0. (G aphPad So wa e, Cali o nia, EEUU). Ma e ial y Mé odos ! ! 98! RESULTADOS ! ! Resul ados! ! ! 106! Pun uaciones DOPE de los modelos gene ados El úl imo p oceso consis ió en la cons ucción de a ios modelos de homología. En las ablas 5 y 6 se mues an los esul ados de pun uación DOPE ob enidos en los 20 modelos gene ados de GALR1 y GALR2 espec i amen e. Tabla 5: Resul ados de la pun uación DOPE ob enido en cada uno de los 20 modelos de GALR1 gene ados en Disco e yS udio. El modelo seleccionado ue el que u o la meno pun uación DOPE (-40087.08). Tabla 6: Resul ados de la pun uación DOPE ob enida en cada uno de los 20 modelos de GALR2 gene ados en Disco e yS udio. El modelo seleccionado ue el que u o la meno pun uación DOPE (-38181.08). ! ! Resul ados! ! ! 107! Modelos de homología GALR1 y GALR2 T as el e inamien o de los modelos seleccionados median e la ionización de esiduos y la aplicación del p o ocolo de minimización ob u imos dos a chi os en o ma o pdb con las es uc u as idimensionales de los ecep o es GALR1 ( igu a 5) y GALR2 ( igu a 6). Además pa a con ola la calidad de los modelos, inspeccionamos isualmen e los modelos gene ados pa a comp oba si los esiduos especí icos de los ecep o es GALR1 y GALR2 implicados en la unión de la GAL se disponían o ien ándose de o ma que u ie an acceso a la ca idad del hipo é ico si io de unión en e la GAL y los ecep o es. La implicación de es os esiduos en la in e acción en e GAL y ecep o han sido p e iamen e de e minados en es udios de mu agénesis. Pa a GALR1 es os esiduos son: Fenilalanina (Phe) 114, Phe 184, Phe 280; His idina (His) 262, His 265, Glu amina (Glu) 269 (Kask e al., 1998; Be hold e al., 1997; Chu ch e al., 2002) Pa a GALR2 los esiduos son: His 252, His 253, Ile 256, Phe 264, Ty 271 (Lunds om e al., 2007). En el caso de GALR2 ambién se señala la o mación de un puen e disul u o en el bucle ex acelula 2 (EL2) que en nues o caso se gene ó en el p oceso de modelado de o ma au omá ica (Hui e al., 2016). ! ! Resul ados! ! ! 108! Figu a 5: Imágenes del modelo de homología de GALR1 ob enido en Disco e yS udio. A: is a desde el plano de la memb ana, C: is a desde el ex emo N- e minal y D: is a desde el ex emo C- e minal. B: ep esen ación donde se esal an los Aa implicados en la in e acción con GAL. ! ! Resul ados! ! ! 109! Figu a 6: Imágenes del modelo de homología de GALR2 ob enido en Disco e yS udio. A: is a desde el plano de la memb ana, C: is a desde el ex emo N- e minal y D: is a desde el ex emo C- e minal. B: ep esen ación donde se esal an los Aa implicados en la in e acción con GAL. ! ! Resul ados! ! ! 110! 2- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es GALR1 y GALR2 2.1- Es udio de la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST y compa ación de la in e acción GAL(1-15)-FLX con GAL-FLX. P ime o se de e minó las dosis e ec i a y subumb al de FLX en el FST. La FLX se adminis ó po ía s.c. 23, 5 y 1h an es de la ealización del es y LCRa po ía i.c. . 15min an es de la p ueba. Al g upo con ol se le adminis ó ehículo (Veh.) y LCRa a los iempos indicados. Es os pa ones de adminis ación de sus ancias, an o po ía s.c. como i.c. ., se u iliza on en odos los expe imen os de compo amien o p esen ados en es a esis. Aco de con los esul ados de es udios p e ios en el FST (Es ada-Cama ena e al., 2003), se obse ó como la dosis de FLX(10mg/Kg) p odujo una educción es adís icamen e signi ica i a en el iempo de inmo ilidad (F2,20=4.628, p<0.05) y un inc emen o en el iempo de na ación (F2,20=7.044, p<0.01) en compa ación con el es o de g upos (pos hoc Newman-Keuls (nk): p<0.05) sin a ec a al iempo de escalada (F2,20=2.569, p=0.102) ( igu a 7). La dosis de FLX(2.5mg/Kg) no p odujo ningún e ec o en los es pa áme os analizados en compa ación con el g upo con ol. Según es os esul ados se conside ó a la dosis de FLX(10mg/Kg) como e ec i a y la de FLX(2.5mg/Kg) como subumb al en el es de na ación o zada con es e pa ón de inyecciones. ! ! Resul ados! ! ! 111! Figu a 7: Rep esen ación g á ica de los pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada analizados en el FST as la adminis ación s.c. de una dosis no e ec i a de FLX(2,5mg/Kg), una dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg) o Veh. a las 23, 5 y 1h an es de ealiza el es de 5min. A odos los g upos se les adminis ó LCRa po ía i.c. . 15min an es del es . Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05 en e al es o de g upos, **p<0.05 en e a FLX(2,5mg/Kg) y p<0.01 en e a Con ol según un ANOVA de una ía seguido del es de Newman-Keuls pa a las compa aciones a pos e io i n= 6-9 a as po g upo. ! ! Resul ados! ! ! 112! Pos e io men e, y pa a de e mina la exis encia de una in e acción en e el agmen o GAL(1-15) y la FLX, coadminis amos GAL(1-15)(1nmol) y FLX(2.5mg/Kg) y compa amos los e ec os de la coadminis ación con los e ec os de ambas sus ancias de o ma aislada. La FLX o el Veh. se adminis a on con el pa ón de inyecciones p e iamen e desc i o y la GAL(1-15) o el LCRa se inyec ó po ía i.c. . 15min an es del es . Los esul ados ep esen ados en la igu a 8 mues an como la coadminis ación de FLX(2.5mg/Kg) con GAL(1-15)(1nmol) p odujo una educción de casi un 30% en el iempo de inmo ilidad (F3,27= 3.973, p<0.05) espec o a los demás g upos (nk: p<0.05), y un inc emen o en el iempo de na ación del 40% (F3,28=4.137, p<0.05; nk: p<0.05), sin modi ica el iempo de escalada (F3,28=4.137, p=0.83). Según es os esul ados la coadminis ación de ambas sus ancias p odujo un po en e e ec o an i-dep esi o. Dado que la adminis ación i.c. . del agmen o GAL(1-15) induce e ec os p o-dep esi os podemos suge i que exis e una in e acción en e GAL(1-15) y FLX en la que se a o ecen los e ec os de la FLX. ! ! Resul ados! ! ! 113! Figu a 8: Rep esen ación g á ica de los pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada analizados en el FST as la coadminis ación de una dosis no e ec i a de FLX(2,5mg/Kg) y una dosis subumb al de GAL(1- 15)(1nmol). La FLX o el Veh. se adminis a on po ía s.c. median e un pa ón de inyección subagudo a las 23, 5 y 1h an es de ealiza el es de 5min y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 15min an es del es . El g upo de Veh.+ LCRa ue usado como con ol. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05 en e al es o de g upos, a: p<0.05 en e a Con ol y GAL(1-15)(1nmol) según un ANOVA de una ía seguido del es de Newman-Keuls pa a las compa aciones a pos e io i n= 7-9 a as po g upo. ! ! Resul ados! ! ! 114! Una ez de e minada la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX, es udiamos si la misma dosis de GAL(1-15) e a capaz de modi ica los e ec os de la FLX a una dosis e ec i a. En es e expe imen o ambién compa amos los e ec os en animales de la coadminis ación de GAL(1-15) y FLX a dosis e ec i as con animales coadminis ados con Galanina(1nmol) y FLX ambién a dosis e ec i a pa a de e mina si la in e acción e a exclusi a del agmen o. G upos de animales ecibie on la dosis subumb al de GAL(1-15)(1nmol), la dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg) o la combinación de ambas sus ancias y, además, a un g upo de animales ue adminis ado con Galanina(1nmol) po ía i.c. . jun o con FLX(10mg/Kg). En la igu a 9 se ep esen a como la coadminis ación de FLX(10mg/Kg)+GAL(1- 15)(1nmol) indujo un ue e descenso de más del 50% en el iempo de inmo ilidad (F3,28=10.96, p<0.01; nk: p<0.05) así como un inc emen o del 40% en el iempo de na ación (F3,28=16.46, p<0.01; nk: p<0.01) compa ado con el g upo inyec ado sólo con FLX(10mg/Kg), sin p oduci se ninguna modi icación en el iempo de escalada (F3,27=0.7554, p=0.5289). Es os e ec os ponen de mani ies o la in ensidad de es a in e acción po enciando el e ec o de la FLX a dosis e ec i as. En la igu a 9 ambién se obse a los e ec os del g upo de animales a los que se les adminis ó Galanina(1nmol) po ía i.c. . en ez de GAL(1-15) pa a de e mina si la in e acción con la FLX es exclusi a del agmen o o ambién se p oduce con la molécula comple a. Se obse ó como la Galanina(1nmol) no modi icó ningún pa áme o analizado en compa ación con el g upo de FLX(10mg/Kg). Es os esul ados con i man el e ec o de po enciación de la GAL(1-15) ambién sob e una dosis e ec i a de FLX y además, indican que la in e acción es exclusi a del agmen o. ! ! Resul ados! ! ! 115! Figu a 9: Rep esen ación g á ica de los pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada analizados en el FST as la coadminis ación de una dosis de FLX(10mg/Kg) y una dosis de GAL(1-15)(1nmol) o Galanina(1nmol). La FLX o el Veh. se adminis a on po ía s.c. a las 23, 5 y 1h an es del es de 5min y la GAL(1-15), Galanina o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 15min an es. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05, **p<0.01 en e al es o de g upos; #p<0.05, ##p<0.01 en e a Con ol y GAL(1- 15)(1nmol) según un ANOVA de una ía seguido del es de Newman-Keuls pa a las compa aciones a pos e io i. n= 7-8 a as po g upo. ! ! Resul ados! ! ! 122! Los esul ados ob enidos en los expe imen os de qPCR- e inmunohis oquímica indica on que al oc a o día as la adminis ación del siRNA-GALR1 se obse aba la máxima educción en la exp esión del ecep o GALR1. Figu a 13: A) Rep esen ación g á ica de la exp esión del ecep o GALR1 en las egiones CA1 y GD del hipocampo do sal es imada median e la cuan i icación de la densidad óp ica (D.O.) de la señal ob enida po inmunohis oquímica a los 4, 6 y 8 días as la inyección i.c. . de 5µg siRNA-GALR1. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media *p<0.05 según es de T-S uden espec o al g upo con ol. n= 7-8 animales po g upo. Mic o o og a ías de las egiones de CA1 B) y el GD C) ep esen a i as de la inmunohis oquímica ealizada en animales inyec ados con Veh. y animales 8 días después de la inyección i.c. . de siRNA-GALR1. ! ! Resul ados! ! ! 123! Pa a pode es udia el papel de GALR1 en la in e acción GAL(1-15)-FLX empleamos animales siGalR1 ob enidos como se desc ibe en apa ados an e io es. En la igu a 14 se mues an los e ec os de la adminis ación de A) FLX(10mg/Kg) y B) de la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) jun o con GAL(1-15)(1nmol) en animales siGalR1. En p ime luga se obse ó como la adminis ación de FLX(10mg/Kg) en a as siGalR1 p odujo un descenso en el iempo de inmo ilidad ( 16=2.778, p<0.01) y un inc emen o en el iempo de na ación ( 16=2.041, p<0.05) en elación con el g upo con ol de a as siGalR1. Es os esul ados indican que la educción del ecep o GALR1 no a ec a a la acción an idep esi a de la FLX en el FST. Sin emba go, en los animales siGalR1, el agmen o GAL(1-15)(1nmol) coadminis ado jun o con FLX(10mg/Kg) no p odujo di e encias signi ica i as en ninguno de los pa áme os es udiados en compa ación con la FLX(10mg/Kg). Es os esul ados indican que en el modelo de a as siGalR1 la FLX conse a el e ec o an idep esi o en el es de na ación o zada, pe o el agmen o GAL(1-15) deja de ene un e ec o po enciado sob e el e ec o de la FLX, sugi iendo un papel undamen al del ecep o GALR1 en la in e acción de GAL(1-15)-FLX. ! ! Resul ados! ! ! 124! Figu a 14: Rep esen ación g á ica de los pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada en a as siGalR1 as la adminis ación de A) una dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg) o Veh. B) una dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg) sola o con GAL(1-15)(1nmol). La FLX o el Veh. se adminis a on po ía s.c. median e un pa ón de inyección subagudo a las 23, 5 y 1h an es de ealiza el es de 5min y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 15min an es del es . Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05, **p<0.01 según es de T-S uden espec o a con ol. n= 7-9 a as po g upo. ! ! Resul ados! ! ! 125! 3- In e acción en e el agmen o GAL(1-15) y el an idep esi o luoxe ina: papel de los ecep o es se o oniné gicos 5-HT1A 3.1- E aluación del papel del 5-HT1AR en la in e acción a macológica en e GAL(1-15) y FLX en el FST, empleando el an agonis a especí ico Way100635. Pa a es udia la implicación de 5-HT1AR en la in e acción GAL(1-15)-FLX empleamos el an agonis a del 5-HT1AR Way100635. Los pa ones de inyección ue on iguales a los desc i os en expe imen os an e io es. El Way100635, el agmen o GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on solos o en combinación po ía i.c. . 15min an es del es . En la igu a 15 se mues a como la adminis ación i.c. . de Way100635 a una dosis de 6 nmol bloquea el e ec o po enciado de GAL(1- 15)(1nmol) sob e la FLX(10mg/Kg). Se obse ó como la adminis ación con FLX(10mg/Kg) y GAL(1-15)(1nmol) + Way100635(6nmol) p odujo un bloqueo del e ec o po enciado de GAL(1-15) sob e la FLX, ya que indujo un descenso en el iempo de inmo ilidad (F3,30=4.243, p<0.05; nk: p<0.05) y un inc emen o en el iempo de na ación (F3,29=16.83, p<0.01; nk: p<0.01) compa ado con el g upo a ado con FLX(10mg/Kg) y GAL(1-15)(1nmol). La p esencia de Way100635(6nmol) no modi icó la acción de la FLX(10mg/Kg) en ninguno de los pa áme os obse ados, lo que sugie e que el an agonis a del 5- HT1AR Way100635, con es e pa ón de adminis ación, no in e ie e en los e ec os de la FLX. En la abla 8 se mues an los esul ados del e ec o del an agonis a Way100635(6nmol) compa ados con un g upo con ol. El Way100635 indujo un descenso en el iempo de inmo ilidad ( 13=2.671, p<0.01) y un inc emen o en el iempo de escalada ( 13=2.2, p<0.05) compa ado con el g upo con ol, sin a ec a al iempo de na ación ( 13=0.213, p=0.4171). ! ! Resul ados! ! ! 126! En conjun o los esul ados ob enidos sugie en la pa icipación del 5-HT1AR en la po enciación del e ec o de GAL(1-15) sob e la FLX. Además, aunque el an agonis a Way100635 pa ece ene un e ec o en el compo amien o pe se, no pa ece que in e ie a en el e ec o de la FLX adminis ada a la dosis y iempos indicados. Figu a 15: Rep esen ación g á ica de los pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada as la adminis ación de FLX(10mg/Kg) sola o en combinación con Way100635(6nmol) y la adminis ación de FLX(10mg/Kg) con GAL(1-15)(1nmol) o GAL(1-15)(1nmol)+Way100635(6nmol). La FLX se adminis ó po ía s.c. a las 23, 5 y 1h an es de ealiza el es de 5min. La GAL(1-15) y/o el Way100635 o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 15min an es del es . Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05, **p<0.01 en e al es o de g upos según un ANOVA de una ía seguido del es de Newman-Keuls pa a las compa aciones a pos e io i n= 7-9 a as po g upo. ! ! Resul ados! ! ! 127! Tabla 8: Pa áme os de inmo ilidad, na ación y escalada analizados en el FST as la adminis ación de Way100635(6nmol). Inmo ilidad Na ación Escalada Con ol 130±4 (seg) 84±9 (seg) 67±8 (seg) Way100635(6nmol) 101±12 (seg)** 87±5 (seg) 95±10 (seg)* El Way100635 o LCRa se adminis ó po ía i.c. . 15min an es del es . Todos los animales ecibie on inyecciones s.c. de Veh. a las 23, 5 y 1h an es del es . Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. *p<0.05, **p<0.01 según es de T-S uden espec o con oles. n= 7-8 animales po g upo. 3.2- Es udio del e ec o de la coadminis ación de GAL(1-15) y FLX sob e las ca ac e ís icas uncionales y la exp esión del ARNm del 5-HT1AR en el RD y el hipocampo do sal. Pa a es udia si la in e acción obse ada en los expe imen os de compo amien o p oducía alguna modi icación en las ca ac e ís icas del 5-HT1AR, analizamos la a inidad (Kd) y el núme o de si ios de unión (Bmax) del 5-HT1AR en el GD, en la egión CA1 del hipocampo do sal y en el RD median e un expe imen o de sa u ación empleando el agonis a del 5-HT1AR 8-OH-DPAT ma cado con 3H. La FLX se adminis ó po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 30min an es del sac i icio. En la igu a 16 se obse a que, en la egión del GD del hipocampo, la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) con GAL(1-15)(1nmol) p odujo un descenso de en o no al 30% en el alo de la Kd ( 9=2.916, p<0.01) y de un 15% en la Bmax ( 9=2.277, p<0.05) compa ado con el g upo de animales inyec ados con la dosis e ec i a de FLX(10mg/Kg). En la igu a 16 ambién se mues an imágenes ep esen a i as de los au o adiog ama ob enidos en el expe imen o de au o adiog a ía con secciones de ejido incubadas con [3H]-8-OH-DPAT a una concen ación de 1nM. Sin emba go, en el es o de egiones analizadas, la egión CA1 del hipocampo y el RD ( abla 9), la adminis ación de FLX(10mg/Kg) con GAL(1-15)(1nmol) no ! ! Resul ados! ! ! 128! p odujo ningún e ec o signi ica i o ni en la Kd ni en la Bmax compa ado con el g upo de animales inyec ados solo con FLX(10mg/Kg). Los esul ados sugie en que la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) con GAL(1- 15)(1nmol) modi icó los pa áme os Kd y la Bmax del 5-HT1AR especí icamen e en la egión del GD del hipocampo. Figu a 16: A) Rep esen ación g á ica de la Kd (a inidad) y la Bmax (densidad) de los 5-HT1AR en el GD as la adminis ación de FLX(10mg/Kg) sola o jun o con GAL(1-15)(1nmol). La FLX se adminis ó po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 30min an es. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media *p<0.05, **p<0.01 según el es de T-S uden espec o a FLX(10mg/Kg). n= 6 animales po g upo. B) Au o adiog amas ep esen a i os del aumen o de a inidad del 5-HT1AR po el adioligando [3H]-8-OH-DPAT (1nM) ob enido en el GD po la coadminis ación de FLX con GAL(1-15). ! ! Resul ados! ! ! 129! Tabla 9: Resul ados ob enidos en la Kd y Bmax en el RD y en CA1 as la adminis ación de FLX(10mg/Kg) sola o jun o con GAL(1-15)(1nmol). RD CA1 Kd(nM) Bmax ( m/mg p o ) Kd(nM) Bmax ( m/mg p o ) FLX(10mg/Kg) +LCRa 4940±1240 14,5±6 438,8±17 1,4±0,2 FLX(10mg/Kg)+ GAL(1-15)(1nmol) 7781±2794 29,1 455,2±26 1,4±0,2 La FLX se adminis ó po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 30min an es. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de la media. No se obse a ningún e ec o es adís icamen e signi ica i o según es de T-S uden . n= 6 animales po g upo. Además de es udia las posibles modi icaciones de las ca ac e ís icas del 5-HT1AR en la in e acción GAL(1-15)-FLX, analizamos la exp esión del ARN mensaje o del 5-HT1AR en las mismas egiones median e un expe imen o de hib idación in si u. La FLX se adminis ó po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el LCRa se adminis a on po ía i.c. . 30min an es del sac i icio. En la igu a 17 se obse a que la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) con GAL(1- 15)(1nmol) indujo un inc emen o signi ica i o de los ni eles de ARN mensaje o del 5-HT1AR en las egiones del GD (F3,17=5.033, p<0.05; nk: p<0.05) y del CA1 (F3,18=8.803, p<0.01; nk: p<0.05) del hipocampo do sal en compa ación con el es o de g upos. Es e e ec o no se obse ó en el RD ( abla 10). Los esul ados sugie en que la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) jun o con GAL(1-15)(1nmol) induce un aumen o de la exp esión del ARN mensaje o del 5- HT1AR en las egiones del CA1 y del GD en el hipocampo do sal y no en el RD as la adminis ación de las sus ancias con el pa ón de inyecciones desc i o. ! ! Resul ados! ! ! 130! Figu a 13: A) Rep esen ación g á ica de los ni eles de exp esión del ARN mensaje o del 5-HT1AR en las egiones del hipocampo do sal del GD y CA1 as la adminis ación de FLX(10mg/Kg) sola o jun o con GAL(1- 15)(1nmol). La FLX o el Veh. se adminis a on po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el Veh. se adminis a on po ía i.c. . 30min an es. Los esul ados se mues an como la media ± e o es ánda de la media de densidades óp icas exp esadas en po cen aje espec o con ol. *p<0.05 en e al es o de g upos según un ANOVA de una ía seguido del es de Newman-Keuls pa a las compa aciones a pos e io i. n=6 a as po g upo. B) Au o adiog amas ep esen a i os del GD mos ando el aumen o en los ni eles de exp esión de ARN mensaje o pa a 5-HT1AR as la coadminis ación de FLX(10mg/Kg) y GAL(1- 15)(1nmol). Tabla 10: Resul ado de los ni eles de exp esión del ARN mensaje o del 5-HT1AR en el a e do sal as la adminis ación de FLX(10mg/Kg) sola o jun o con GAL(1-15)(1nmol). Con ol GAL(1-15) (1nmol) FLX (10mg/Kg) GAL(1-15)(1nmol) +FLX(10mg/Kg) 5-HT1AR mRNA le els (% espec o con ol) 100±4 95,7±5 98,2±5 108,3±7 La FLX o el Veh. se adminis a on po ía s.c. a las 23, 5 y 1,25h an es de sac i ica los animales y la GAL(1-15) o el Veh. se adminis a on po ía i.c. . 30min an es. Los esul ados se exp esan como la media ± e o es ánda de po cen ajes espec o con ol. No se obse a ningún e ec o es adís icamen e signi ica i o (F3,19=0,4128; p=0,98), n= 6 animales po g upo, según un ANOVA de una ía. n= 6 animales po g upo. DISCUSIÓN