Análisis genético del dimorfismo secual en el eje de folatos-homocisteína en una población tratada con ácido fólico

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE ESPECIALIDADES QUIRÚRGICAS, BIOQUÍMICA E INMUNOLOGÍA ANÁLISIS GENÉTICO DEL DIMORFISMO SEXUAL EN EL EJE DE FOLATOS-HOMOCISTEÍNA EN UNA POBLACIÓN TRATADA CON ÁCIDO FÓLICO ANA MARÍA LENDÍNEZ RAMÍREZ Málaga, 2015 AUTOR: Ana María Lendínez Ramírez http://orcid.org/0000-0003-3644-6736 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Departamento de Especialidades Quirúrgicas, Bioquímica e Inmunología FACULTAD DE MEDICINA D. ARMANDO REYES ENGEL Prof Titular de Bioquímica y Biología Molecular D. MAXIMILIANO RUIZ GALDÓN Prof Titular de Bioquímica y Biología Molecular CERTIFICAN que la Tesis Doctoral que presenta Dª Ana Mª Lendínez Ramírez, Licenciada en Farmacia, ha sido realizada bajo su dirección, con el título “Análisis genético del dimorfismo sexual en el eje de folatoshomocisteína en una población tratada con ácido fólico” para su lectura y defensa ante el Tribunal designado por la Comisión de Doctorado de la Universidad de Málaga. Una vez redactado el presente trabajo, ha sido revisado encontrándose conforme para ser defendido y aspirar al grado de Doctor. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, se expide el presente certificado. Lo que se firma en Málaga en Noviembre de 2015 Fdo: Armado Reyes Engel Maximiliano Ruiz Galdón A mi familia AGRADECIMIENTOS Al departamento de Departamento de Especialidades Quirúrgicas, Bioquímica e Inmunología por abrirme las puertas a la investigación y permitirme realizar esta tesis doctoral en sus instalaciones. Al profesor Armando Reyes Engel por ser el impulsor y artífice de este proyecto, por su tutela y todas las enseñanzas que me ha brindado. Por confiar siempre en mi capacidad y animarme a no decaer. Gracias a sus críticas, siempre constructivas, que me han hecho crecer y aprender que sólo hay que proponérselo y trabajar para conseguir algo en ciencia. Al profesor Maximiliano Ruiz Galdón, la primera persona que conocí en un laboratorio. Es para mí un ejemplo a seguir como profesional en el Laboratorio Clínico, como docente e investigador. Gracias por su apoyo y por darme la oportunidad de unirme a su grupo de trabajo. A mis compañeros doctorandos Arturo Reyes Palomares y Beatriz Pérez Nevot, por todas las experiencias que hemos compartido, dentro y fuera del laboratorio. Por haber empezado juntos esta andadura, son las personas que mejor pueden entender lo vivido en cada etapa. A Irene Gónzalez por su colaboración incondicional y desinteresada en todo aquello que he necesitado, no sólo como técnico de laboratorio sino también como compañera cercana que nunca cesó de decirme que no me perdiera y así he llegado al final. Gracias a mis compañeros analistas del Hospital Costa del Sol. A Marisa Hortas por darme el empujón necesario para finalizar el trabajo empezado y marcarme la meta. A Eva Martín y Gonzalo Callejón por sus compartir conmigo sus experiencias, por sus consejos y por los ánimos diarios que durante meses me han dado. A Miguel Cantero por su empatía y gran ayuda en los trámites de presentación de esta tesis. A mis padres por inculcarme el sentido de la responsabilidad, por darme la oportunidad de dedicarme siempre a lo que me ha gustado. A ellos les debo todo lo que soy. Por último pero más especial e importante, quiero dar las gracias a la persona que día a día ha estado a mi lado, mi marido, Francisco Vázquez Medina. Sin su apoyo incondicional, dedicación y sacrificio nunca hubiera podido conseguirlo. Gracias, Neno. PUBLICACIONES DERIVADAS DE ESTE TRABAJO COMUNICACIONES A CONGRESOS - Sexual dimorphism in folate metabolism. Presentada como comunicación escrita en el 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine-19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine-8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Berlín, Mayo 2011. Clin Chem Lab Med 2011; 49, S1:S874 ARTÍCULOS - Lendinez AM, Palomares AR, Perez-Nevot B, Cortés Rodríguez M, Ruiz-Galdón M, Reyes-Engel A. Differential Behavior of Serum and Red Blood Cell Folate During a Treatment with Levofolinic Acid. Gender Differences. Clin. Lab. 2014;60:1579-1584 4. RESULTADOS 79 4.1. FOLATO INTRAERITROCITARIO 81 4.1.1. Estadística descriptiva de niveles de folato intraeritrocitario 81 4.1.2. Estadística inferencial de folato intraeritrocitario 81 4.2. FOLATO SÉRICO 83 4.2.1. Estadística descriptiva de niveles de folato sérico 83 4.2.2. Estadística inferencial de folato sérico 83 4.3. HOMOCISTEÍNA PLASMÁTICA 85 4.3.1. Estadística descriptiva de niveles de homocisteína plasmática 85 4.3.2. Estadística inferencial de homocisteína plasmática 86 4.4. VITAMINA B12 SÉRICA 87 4.5. EVOLUCIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS EN AMBOS SEXOS 88 4.5.1. Correlación de los niveles de Hcy y folatos 89 4.5.2. Ratios Folatos/Hcy 90 4.6. ANÁLISIS POBLACIONAL DE LOS POLIMORFISMOS ESTUDIADOS 92 4.7. ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS BIOQUÍMICOS SEGÚN EL GENOTIPO 94 4.7.1. ATIC (rs2372536, c.347C>G) 94 4.7.2. BMHT (rs3733890, c.716G>A) 96 4.7.3. ESR1 98 4.7.3.1. ESR1 rs2234693 (PvuII, c.453-397 T>C) 98 4.7.3.2. ESR1 rs9340799 (XbaI, c.453-351 A>G) 100 4.7.3.3. Análisis de los haplotipos 102 4.7.4. MTHFD1 rs2236225 (c. 1958G>A) 105 4.7.5. MTHFR 107 4.7.5.1. rs1801131 (1298 A>C) 107 4.7.5.2. rs1801133 (677C>T) 109 4.7.5.3. Estudio de Haplotipos y genotipos dobles del rs1801133 (677C>T) y rs1801131 (1298 A>C) 111 4.7.5.4. Comparación de los parámetros bioquímicos en función del número de mutaciones 114 4.7.6. MTRR rs1801394 (c.66A>G) 118 4.7.7. RFC1 rs1051266 (c.80A>G) 120 4.7.8. TCN2 rs1801198 (c.776C>G) 122 4.7.9. TYMS rs2853542 (C>G, 28bp VNTR 3R) 123 5. DISCUSIÓN 127 5.1. Sobre el grupo de estudio 130 5.2. Sobre el tratamiento 130 5.3. Influencia del tratamiento en los niveles sérico e intraeritrocitario de folato 130 5.3.1. Población de estudio 131 5.3.2. Influencia del sexo 132 5.3.3. Efecto de los polimorfismos genéticos en los niveles de folatos 135 5.3.3.1. ATIC rs2372536 (c.347C>G) 135 5.3.3.2. ESR1: rs9340799 y rs2234693 135 5.3.3.3. MTHFD1 rs2236225 (c.1958G>A) 139 5.3.3.4. MTHFR 139  rs1801131 (A1298C) 140  rs1801133 (677C>T) 141 5.3.3.5. MTRR rs1801394 c.66A>G 143 5.3.3.6. RFC1 rs1051266, c.80A>G 143 5.3.3.7. TCN2776 rs1801198, c.776G>A 146 5.3.3.8. TYMS rs2853542 (C>G, 28bp VNTR 3R) 147 5.4. Influencia del tratamiento en los niveles de homocisteína 148 5.4.1. Población de estudio 148 5.4.2. Influencia del sexo 149 5.4.3. Contribución de los folatos al descenso de Hcy 151 5.4.4. Influencia de los polimorfismos genéticos en Hcy 153 5.4.4.1. BMHT rs3733890 (c.716G>A) 153 6. CONCLUSIONES 155 7. BIBLIOGRAFÍA 159 1 1. INTRODUCCIÓN 2 3 1.1. FOLATOS Bajo el término folatos se agrupan los derivados del ácido fólico, una familia de vitaminas con actividad biológica equivalente que intervienen como cosustratos en las reacciones que movilizan unidades monocarbonadas en diferentes estados de óxidoreducción. 1.1.1. Formas químicas de folatos Los folatos tienen en común la estructura química del ácido pteroilglutámico (PteGlu) formada por una molécula de ácido pteroico conjugado por un enlace tipo amida con una o más unidades de ácido glutámico. El ácido pteroico a su vez está formado por un anillo de pteridina unido por un puente metileno al ácido paraaminobenzoico (PABA). El ácido glutámico unido mediante un enlace peptídico al extremo carboxilo del PABA constituye la molécula de ácido fólico (Figura 1). Ácido pteroico Figura 1: Estructura del Tetrahidrofolato. El anillo de pteridina puede estar parcialmente reducido en las posiciones 7 y 8 como dihidrofolato (DHF, H2PteGlu) o completamente reducido en 5, 6,7 y 8 como 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4 tetrahidrofolato (THF, H4PteGlu). El THF (Figura1) a su vez es aceptor de unidades monocarbonadas en posiciones 5 y 10 o ambas y con diferentes estados de oxidación (Tabla 1). La forma más reducida de THF transporta un grupo metilo en su nitrógeno en posición 5 (N5) y la forma más oxidada transporta un grupo formilo (-CHO-); las formas intermedias transportan metileno, formilo y formimino. Nombre Estructura Abreviatura Ácido fólico, pteroilglutámico PteGlu Dihidrofolato -H en 5 y 6 DHF, H2PteGlu Tetrahidrofolato -H en 5, 6,7 y 8 THF, H4PteGlu 5-formil-tetrahifrofolato (folínico) - CHOen 5 5-formilTHF 10-formil-tetrahifrofolato - CHOen 10 10-formilTHF 5-formimino-tetrahifrofolato - CH=NHen 5 5-formiminoTHF 5, 10-metenil-tetrahifrofolato - CH = en 5 y 10 5, 10-metenilTHF 5-metil-tetrahifrofolato - CH3 en 5 5-metilTHF 5, 10-metilen-tetrahifrofolato - CH2 - en 5,10 5, 10-metilenTHF Tabla 1: Formas de folato Todos los folatos pueden presentar un número variable de glutámicos unidos a la estructura formando monoy poliglutamatos (hasta 7 residuos) (Blakley, 1987). 1.1.1.1. Folatos naturales Los folatos forman parte de las vitaminas hidrosolubles del grupo B. Las células animales no son capaces de sintetizar PABA ni de fijar el primer residuo de ácido glutámico al ácido pteroico, por ello deben ser aportadas a través de la dieta. En la naturaleza, los sintetizan plantas y bacterias. Están presentes en una gran variedad de vegetales, sobre todo de hoja verde. La creencia de que estaban presentes grandes cantidades en las hojas verdes fue lo que dio nombre a estas vitaminas del latín folium, hoja. Están también presentes en frutas, cereales, legumbres, levaduras y frutos secos. 5 Es abundante en hígado de animales, como consecuencia de la transferencia de folatos en la cadena trófica. En los alimentos se encuentran en forma de monoy poliglutamatos (a partir de dos restos de glutámico), siendo de mayor la biodisponibilidad los monoglutamatos (González-Gross et al., 2002). Alrededor del 90% de los folatos alimentarios se encuentran en forma de poliglutamatos. Son inestables por lo que durante su almacenamiento y en la preparación tienden a oxidarse y a la reconjugación a monoglutamatos. 1.1.1.2. Interconversión de folatos En los folatos naturales el anillo de pteridina puede presentar diferente grado de hidrogenación. La forma de folato activa desde el punto de vista biológico es el THF. La clave de su actividad está en la capacidad de interconversión de las diferentes formas de folato en función del estado de óxido reducción de las unidades monocarbonadas del N5 de la pteridina y del N10 del PABA (Figura 1). La versatilidad del THF hace que se puedan interconvertir las unidades monocarbonadas entre sí por medio de las reacciones reversibles catalizadas por la enzima trifuncional Metilentetrahidrofolato-deshidrogenasa-NAD-dependiente (MTHFD1). Además de actividad deshidrogenasa es una ciclohidrolasa y sintetasa de formilTHF. Mediante la MTHFD1 es posible la formación de: - 10 formilTHF, a partir del THF, formiato y ATP. - 5,10-metenilTHF, a partir de 10-FormilTHF con la incorporación de una molécula de agua. -5,10-metilenTHF por reducción de 5,10-metenilTHF con NADH como coenzima. El 5,10-metilenTHF se reduce de manera irreversible a 5-metilTHF por medio de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), flavoproteína citoplasmática compuesta 6 de un homodímero (Goyette et al., 1994). Participa el NADPH como coenzima dador de electrones. Esta enzima es clave en el metabolismo de los folatos ya que una actividad reducida de la misma disminuye la formación de 5-metilTHF y condiciona el funcionamiento del ciclo de los metilos como se explica más adelante. Las reacciones de interconversión de folatos se ilustran en la figura 2 junto con el resto de reacciones en las que están implicados los folatos que se describen al completo en el apartado de funciones bioquímicas y actividad biológica de los folatos. 7 Figura2: Conversiones de los fragmentos monocarbonados unidos al THF Aa: aminoácidos; B12: vitamina B12 o cianocobalamina; DHF: dihidrofolato; DHFR: dihidrofolatorreductasa; dTMP: desoxitimidilato-monofosfato; dUMP: desoxiuridina monofosfato; Hcy: Homocisteína; Met: Metionina; MTHFD1: Metilentetrahidrofolato-deshidrogenasa-ciclohidrolasa-formiltetrahidrofolato-sintetasa, MTHFR: metilentetrahidrofolatoreductasa; MTR: metionina-reductasa, NAD: nicotinamida adenina dinucleótido, NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato; SMHT: Serina-hidroximetil transferasa; THF: tetrahidrofolato; TYMS: timidilato sintetasa; X: sustrato; X-CH3: sustrato metilado Ciclo de los folatos Formiato H2O NADH NAD 5metil THF SAM SAH Serina Glicina DHF DHFR dTMP dUMP MTHFD1 TYMS SHMT MTHFR NADP NADPH Met Hcy X X-CH3 Ciclo de los metilos Síntesis de pirimidinas Síntesis de Aa MTR/MTRR B12 NAD NADP H THF 10-formil THF Síntesis de purinas 5,10-metenilTHF 5,10-metilenTHF 8 1.1.2. Fisiología del folato en el organismo 1.1.2.1. Absorción Los folatos de la dieta se encuentran como poliglutamatos unidos a proteínas. En el intestino por acción de las proteasas digestivas se liberan de las proteínas alimentarias. El paso previo a la absorción intestinal es la hidrólisis de poliglutamatos a monoglutamatos por medio de una conjugasa: la  glutamil-carboxipeptidasa. A nivel del yeyuno proximal y por un transporte activo pH dependiente, los monoglutamatos pasan a través de las células de la mucosa intestinal. Este proceso sigue una cinética de saturación que es estimulada por la presencia de glucosa y sodio con las que se absorbe mediante co-transporte. En torno al 20-30% del folato se absorbe mediante difusión pasiva (mecanismo no saturable). Este último mecanismo es por el que se absorben los folatos sintéticos administrados a altas dosis. Los folatos que ingresan en la célula intestinal son transferidos al plasma sin sufrir transformaciones salvo una pequeña parte que es reducido y metilado para dar lugar a 5-metilTHF. 1.1.2.2. Distribución En sangre, los folatos se dirigen al hígado donde los monoglutamatos son reducidos y metilados a 5-metilTHF, el cual regresa a la circulación donde llegará a todos los tejidos. En el hígado también se conjugan a poliglutamatos que bien se almacenan intracelularmente o pasan a THF. La homeostasis del folato es regulada por un ciclo enterohepático importante: parte de los folatos secretados en la bilis son de nuevo reabsorbidos y de esta forma las reservas hepáticas de folato cubren las necesidades para unos cuatro meses. El 5-metilTHF circula unido a proteínas, sobre todo albúmina y a una proteína de alta afinidad por los folatos, “proteína ligante de folatos”. El contenido de folatos en el organismo se encuentra entre 5 y 10 mg. Los órganos más ricos en folato son el hígado y el cerebro. La concentración intraeritrocitaria es de 10 a 30 veces mayor que la plasmática y en líquido 15 1.1.3.3. Déficit de folato y aborto Thierchs, en 1952 sugirió por primera vez que los abortos espontáneos podrían estar relacionados con la deficiencia de folatos tras lograr la inducción de abortos terapéuticos con el 4-aminopteroilglutámico, antagonista del ácido fólico. Hibbard en 1964, y Martin en 1965, encuentran una asociación entre el aborto espontáneo habitual sin causa aparente y un déficit de folatos en la madre debido a una anomalía en el metabolismo de los folatos. Más adelante, el grupo de Steegers-Theunissen observó que un 25% de las mujeres con abortos espontáneos de repetición o con un abruptio placentae tenían niveles altos de Hcy en sangre, tras descartar la existencia de una mutación en el gen de la cistationina-ß-sintasa (CBS) (Steegers-Theunissen et al., 1992). Estos autores sugirieron que la posible causa de la hiperhomocisteinemia podía ser una disminución de la remetilación de la Hcy debido a una baja concentración de las formas activas de los folatos o de la B12, o a una deficiencia en las enzimas involucradas en la remetilación. También realizaron un estudio de casos y controles para conocer la prevalencia de la hiperhomocisteinemia en las mujeres con abortos recurrentes de causa desconocida (2 o más abortos), observando cómo el 21% tenían niveles altos de Hcy tras la prueba de carga con Metionina (Met) concluyendo que la hiperhomocisteinemia es un factor de riesgo para la pérdida gestacional recurrente. En un estudio posterior se observó un aumento del riesgo relativo para aborto de repetición en aquellas mujeres con niveles elevados de Hcy y disminuidos de folatos (Nelen et al., 2000). Estudios observacionales muestran que la hiperhomocisteinemia moderada y los niveles bajos de folatos son factores de riesgo para el aborto habitual. Para explicar el mecanismo por el cual la elevada concentración de Hcy plasmática puede causar la pérdida de la gestación se han formulado dos hipótesis: que ésta interfiera en el desarrollo embrionario normal ó alterando la función vascular. 16 En múltiples estudios, se ha demostrado la existencia de niveles aumentados de Hcy en mujeres con abortos espontáneos de repetición (Laurence et al., 1981; Stirrat, 1990; Steegers-Theunissen et al., 1992; Wouters et al., 1993; Preston et al., 1996; Nelen et al., 1997; Quere et al., 1998; Obwegeser et al., 1999; Vollset et al., 2000). 1.1.4. Necesidades y recomendaciones dietéticas para folatos La cantidad de folato que ha sido recomendada como la idónea para asegurar niveles adecuados ha variado en los últimos años entre países. Oscila en un rango de 200 a 400 µg/día. Estas diferencias se derivan de la diferente base científica en la que se fundamenta la recomendación formulada. Estados Unidos fue de los primeros países en emitir recomendaciones (400 µg/día) y en tomar medidas obligatorias para la fortificación de alimentos (Institute of Medicine (US) Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and Choline, 1998) y se basaba en las concentraciones de folatos sérico e intraeritrocitario y Hcy. Por otro lado en Reino Unido la recomendación de 200 µg/día se fundamentó en la medida de folato intraeritrocitario y la concentración de folato en tejido hepático (Scientific Advisory Committee on Nutrition (SACN), 1991). Estas recomendaciones dependen de lo que se considere un nivel adecuado ya que no sólo debe estar basado en la ausencia de signos y síntomas del déficit de esta vitamina si no en las concentraciones que se precisan en plasma y hematíes para mantener la salud. Es obligatorio mantener un consumo mínimo pero no basta por sí solo para mantener un estatus normal de folatos (Krawinkel et al., 2014). Además, al estimar los requerimientos de folato deben considerarse otros factores como la variedad de folatos con diferente biodisponibilidad y funcionalidad y la diferenciación entre el ácido fólico sintético y folatos de la dieta, así como las variantes genéticas. Entre las variantes genéticas de las enzimas del ciclo de los folatos destaca el incremento de la de la prevalencia del polimorfismo C677T de la MTHFR (Muñoz-Moran et al., 1998) y 17 por otro lado hay descritos casos familiares con problemas de malabsorción de folatos debido a mutaciones en el gen que codifica el transportador acoplado a protón de la membrana intestinal (proton-coupled folate transporter, PCTF) (Zhao et al., 2007). La relevancia del factor genético en cuanto a las recomendaciones de ingesta de folato no está clara en principio y deberían definirse para cada variedad de folato. Los requerimientos de folato y recomendaciones alimentarios se expresan como equivalentes dietarios de folato (EDF). Tiene en cuenta la mayor disponibilidad del folato sintético que se utiliza en los suplementos y en los alimentos fortificados de manera que se compensa el mayor grado de absorción del ácido fólico en comparación con el folato que se encuentra naturalmente en los alimentos (Bailey, 1998) . En 2014 el grupo de expertos de la Sociedad Alemana de Nutrición tras una amplia revisión sobre este tema concluye reducir los EDF de 400 a 300µg/día en población general y recomienda suplementos periconcepcionales de 400µg de ácido fólico en el primer trimestre, todo ello en base a mantener folatos séricos por encima de 10nmol/L, folato intraeritrocitario ≥340 nmol/L y la Hcy por debajo de 12 µmol/L (Krawinkel et al., 2014). 1.1.5. La controversia del exceso de ácido fólico Desde que se adoptaron políticas de fortificación obligatoria de alimentos en muchos países entre otras medidas para aumentar la ingesta de folato en la dieta no sólo se ha conseguido reducir la incidencia de DTN y del número de abortos sino que también se ha conseguido un descenso de Hcy (riesgo cardiovascular independiente) y una mejora de los trastornos neuropsiquiátricos. Sin embargo, como esta medida ha expuesto a toda la sociedad a mayor cantidad de folato, han comenzado a describirse efectos adversos. La capacidad de absorción y biotransformación del ácido fólico se satura a partir de 400 µg/día. Todo parece indicar que el aumento de ácido fólico sin 18 metabolizar es la clave ya que modula el metabolismo de los folatos. La DHFR es la enzima que convierte el fólico sintético en folato reducido lo que conduce el metabolismo celular de folatos. El ácido fólico para incorporarse al ciclo de los folatos necesita reducirse a THF y lo hace en un primer paso a DHF por medio de la DHFR (con una elevada Km) y a THF después (baja Km de la DHFR). El DHF a su vez modula alostéricamente la MTHFR. La actividad de la DHFR tiene una elevada variación interindividual de hasta 5 veces. Esto es debido a los polimorfismo genéticos descritos en el gen que la codifica DHFR: la inserción/delecion de 19pb, los polimorfismos de una sola base (Single Nucleotide polymorphism, SNP) C238T, A458T. Por tanto, variantes de DHFR de reducida actividad podrían no ser capaces de incorporar todo el ácido fólico sintético que se ingiere y da lugar a un exceso de ácido fólico intacto, sin reducir. 1.1.5.1 Efectos adversos en SNC relacionado con el déficit de vitamina B12 La vitamina B12 actúa como coenzima en la síntesis de Met por la metionina sintasa (MTR). Esta reacción se ha denominado como “la trampa del folato” (ver figura 4). En caso de déficit de B12 se inhibe la reacción y da lugar a la acumulación de 5-metilTHF y Hcy. Las funciones de ambas vitaminas están interrelacionadas a este nivel y por eso los signos y síntomas de ambas deficiencias son iguales. Figura 4: Remetilación de Hcy a Met por acción de la metionina sintasa (MTR) En el SNC la metilación de la Hcy por la MTR es la única vía de sintetizar Met ya que en el tejido nervioso no está activa la vía de la betaína. La administración Hcy Met 5-metilTHF THF MTR B12 19 única de ácido fólico en caso de deficiencia de B12 enmascara la sintomatología. El ácido fólico sintético reducido a THF hace posible la síntesis de purinas y pirimidinas mientras que las lesiones neurológicas debidas a una insuficiente producción de Met progresan. Esto imposibilita un diagnóstico temprano de la anemia megaloblástica por déficit de B12, anemia perniciosa, que deja secuelas irreversibles debidas a desmielinización del SNC. La fortificación alimentaria obligatoria no ha mejorado los niveles de B12 por lo es recomendable monitorizar sus niveles y que haya un balance en los aportes de folato y B12 (Choi et al., 2014). 1.1.5.2. Epilepsia y exceso de ácido fólico Dosis elevadas de folato tienen un potencial excitatorio. El mecanismo por el que sucede no está del todo claro pero en modelos animales se han visto que bloquea la inhibición mediada por el GABA. No obstante la barrera hematoencefálica ejerce un efecto protector ya que impide que el exceso de ácido fólico circulante pase al SNC (Reynolds, 2006). Por otro lado, algunos antiepilépticos reducen el nivel de folato en sangre lo que sería un hecho a tener en cuenta en mujeres en edad fértil en tratamiento con anticonvulsivantes (Krishnamurthy, 2012). 1.1.5.3. Cáncer Existe controversia en cuanto al efecto de los folatos en la carcinogénesis y es determinante su origen natural o sintético. La deficiencia de folato puede contribuir a una síntesis aberrante del DNA y a la carcinogénesis debido a descenso en la disponibilidad de Met que interfiere en la metilación normal del DNA. Existen evidencias biológicas y observacionales que sugieren que un aporte adecuado de folato podría prevenir el cáncer en ciertas poblaciones de riesgo (Giovannucci et al., 1995; Giovannucci et al., 1998; Lewis et al., 2006; Larsson et al., 2007). El beneficio de suplementar con ácido fólico no se 20 ha confirmado mediante ensayos aleatorizados pero sí que se ha visto que podría ser perjudicial en determinados tumores (Cole et al., 2007; Logan et al., 2008; Ebbing et al., 2009; Zhang et al., 2008). La suplementación con ácido fólico da lugar a una mayor cantidad de éste sin metabolizar circulando con el consecuente riesgo de degradarse en productos genotóxicos que sería un efecto adverso en la era post-fortificación (Choi et al., 2014). En la reciente revisión de Choi y colaboradores de 2014 parece que hay más evidencias de que el folato es perjudicial para el cáncer colorrectal por lo que no sería recomendable suplementar con el único propósito de disminuir el riesgo de padecer cáncer. 1.1.5.4. Eficacia de las terapias “antifolato” Los fármacos antifolatos se utilizan en quimioterapia. Debido a su semejanza estructural con las formas de folato ejercen su acción inhibiendo las enzimas del ciclo. El metotrexate por ejemplo inhibe la DHFR e interrumpe la síntesis de purinas y dTMP por lo que actúa inhibiendo la síntesis de DNA y así frena la proliferación celular. La elevación de los niveles de folato en sangre debida a suplementación/fortificación con ácido fólico podría interferir en su mecanismo y en la eficacia de la quimioterapia antifolato (Arabelovic et al., 2007). 1.1.5.5. Influencia de la elevación materna en tejido adiposo e insulina Un estudio llevado a cabo en gestantes indias durante 6 años estableció que concentraciones elevadas de folato en la madre predecía mayor adiposidad e insulinorresistencia en los recién nacidos. La insulinorresistencia era mayor en el grupo de mujeres que tomaron una combinación de folato con B12. Su hipótesis se 21 fundamentaba en que el folato queda atrapado como 5-metilTHF e incrementaba el metilmalonil CoA daba ligar a mayor lipogénesis (Yajnik et al., 2008). 1.1.5.6. Incremento de los embarazos gemelares La suplementación vitamínica periconcepcionales ha revelado en dos cohortes suecas y húngara hasta un 40% más de embarazos gemelares (Czeizel et al., 1994; Ericson et al., 2001). En países como Chile y Estados Unidos, con fortificación obligatoria de alimentos con ácido fólico, se ha incrementado la tasa de embarazo múltiple (Signore et al., 2005; Nazer H et al., 2006). Haggarty y colaboradores asociaron concentraciones elevadas de folato sérico e intraeritrocitario con una mejora el éxito de la fertilización in vitro (Haggarty et al., 2006). Esto es algo controvertido ya que el embarazo múltiple supone un riesgo para la morbilidad y mortalidad materna e infantil. 1.1.5.7. Selección genética Reyes-Engel y colaboradores evidenciaron cómo en los niños nacidos España tras las medidas de suplementación con folatos en la gestación se ha producido una selección genética dado el incremento de alelos mutados de los SNPs de la MTHFR C677T y A1298C. Estas variantes se han asociado a importantes problemas de salud como el riesgo cardiovascular lo que supone una cuestión importante desde el punto de vista de salud pública (Muñoz-Moran et al., 1998; Reyes-Engel et al., 2002). 1.1.5.8. Trastorno del Espectro autista El efecto de los suplementos de fólico en el Trastorno del Espectro autista (TEA) se ha considerado como algo protector. De hecho, se ha evidenciado una elevación 22 plasmática significativa de Hcy, adenosina y SAM en madre con niños con TEA (James et al., 2010). Estudios llevados a cabo en Estados Unidos y Noruega han apoyado este hallazgo con un incremento del TEA del 48 y 49% respectivamente (Schmidt et al., 2012; Surén et al., 2013). Sin embargo hay trabajos recientes que sugieren que la mayor prevalencia de TEA que se viene observando podría estar causada en parte por los suplementos de ácido fólico (Beard et al., 2011; Catherine Desoto, 2011). Para ello se han postulado muchas teorías posibles, entre ellas que el exceso de ácido fólico incrementa el número de niños con el alelo mutado de la MTHFR C677T que en el útero tienen un nivel suficiente de folato pero que no se mantiene tras el nacimiento. Como resultado de esto puede cambiar el patrón de metilación del DNA y elevar la Hcy que incrementaría la incidencia de TEA (Rogers, 2008). Estudios más avanzados han propuesto mecanismos moleculares para este incremento del TEA por el ácido fólico como responsable de la desregulación de la expresión de genes implicados en el desarrollo cerebral (Junaid et al., 2011). 1.2. HOMOCISTEÍNA 1.2.1. Estructura química La Homocisteína (Hcy) es un aminoácido azufrado no esencial (2-amino-4sulfamil-ácido butanoico; HSCH2CH2CHNH2-COOH). No se incorpora a la síntesis de proteínas dado que no está codificada por ningún triplete de bases del código genético, sino que es producto de transformaciones estructurales de las proteínas. La Hcy es un producto intermedio del metabolismo de la Met. La Hcy procedente del metabolismo celular cuando llega al plasma se oxida a forma diversas especies moleculares (figura 5), de forma que solo el 1% de la misma queda como monómeros en forma reducida. Aproximadamente el 20% de la Hcy, se encuentra formando dímeros de Hcy-Cisteína y Hcy-Hcy (homocistina), unidos por puentes disulfuro. Estos dímeros junto con la fracción reducida constituyen la Hcy 23 libre. El 80% de la Hcy restante constituye la Hcy ligada a proteínas, principalmente a la albúmina, mediante puentes disulfuro (Mansoor et al., 1992; Ueland, 1995). Figura 5: Formas plasmáticas de Hcy La determinación de Hcy en plasma/suero incluye el conjunto de todas las moléculas mencionadas y su medida es de interés clínico (Refsum et al., 2004). 1.2.2. Metabolismo de la Homocisteína La Met constituye la única fuente de Hcy en el organismo humano, además, actúa como intermediario en la biosíntesis de cisteína, por la vía de la cistationina. Como hemos mencionado en el apartado 1.1.2 la Met es un aminoácido esencial que además de ser un precursor y componente de péptidos y proteínas, desempeña un papel importante en la transferencia de grupos metilo. El exceso de Met procedente de la dieta o del recambio de las proteínas endógenas que no se incorpora a las proteínas es metabolizado como se describe en la Figura 6 (Córdoba Porras, A et al., 1998). 24 Figura 6: Metabolismo de la homocisteína. Las enzimas están representadas con la siguiente numeración: 1, L-metionina adenosiltransferasa; 2,metiltransferasa; 3, S-adenosilhomocisteina hidrolasa; 4, cistationinaßsintasa; 5, cistationina -liasa; 6, metilen-tetrahidrofolato reductasa; 7, metionina sintasa; 8, betaína-homocisteína metiltransferasa; SAM, S-adenosilmetionina; X, aceptor de metilos; SAH, S-adenosil homocisteína; THF,: tetrahidrofolato. Existen dos reacciones sucesivas en el paso de Met a Hcy: En la primera, se obtiene un metabolito intermedio, la S-adenosilmetionina o “Met. Activa” (SAM), reacción en la que intervienen la L-Metionina adenosiltransferasa como enzima catalizadora de dicha reacción y el ATP (Figura 7). Figura 7. Formación de la S-adenosil metionina B 12 Metionina Homocisteína SAM SAH THF 5Metil-THF 5,10 Metilen-THF Dimetilglicina Betaína Colina Cistationina Cisteína Cetobutirato X CH3-X 1 2 3 4 5 6 7 8 B6 B6 31 al., 2002; Gaustadnes et al., 2002; Kruger et al., 2003). La mayor parte de las mutaciones del gen que codifica para CBS se localizan entre los exones 2 y 12, afectando de forma principal al 3 y al 8. 2) Homocistinuria tipo II: Déficit de la MTHFR La hiperhomocisteinemia causada por la deficiencia grave de la MTHFR suele ser menos severa que la presente en la homocistinuria clásica. Sin embargo, las alteraciones neurológicas incluyendo las convulsiones, neuropatía periférica, alteraciones psiquiátricas y retardo mental, son de más rápida evolución que en la deficiencia de la CBS. Se calcula que la frecuencia de esta deficiencia es la décima parte que la estimada para la CBS (Rosenblatt, D, 1995) El examen post-mortem de los individuos afectados reveló trombosis e infartos en las arterias cerebrales, coronaria o renales, ambos semejantes a los observados en los sujetos con deficiencia de CBS. Probablemente, ésta es la mayor causa de muerte en estos pacientes. La severidad de las manifestaciones clínicas es paralela al grado de deficiencia enzimática. Entre los hallazgos bioquímicos en estos pacientes destaca el aumento de Hcy en sangre y en orina, así como la disminución de Met en sangre. Esto último lo diferencia de la homocistinuria clásica. 3) Homocistinuria tipo III: Errores innatos en el metabolismo de la vitamina B12. En la actualidad se han descrito diez defectos genéticos que afectan al metabolismo de la cobalamina (Cbl), tres de ellos, afectan la absorción y el transporte, y los otros siete la utilización celular y la formación de las coenzimas metilcobalamina o adenosilcobalamina (Fenton, A et al., 1995). Estas últimas han sido denominadas desde la A hasta la F, según el orden cronológico de su descubrimiento. En las mutantes E y G hay una incapacidad para formar la coenzima metilcobalamina y los pacientes presentan homocistinuria, hipometioninemia, anemia megaloblástica, sin acidemia metilmalónica. Estos pacientes responden al tratamiento con cobalamina. 32 Los mutantes C, D y F cursan con homocistinuria y acidemia metilmalónica debido a la incapacidad para formar ambas coenzimas. Los individuos con la mutación C presentan un cuadro clínico más severo respecto a los individuos con las mutantes D y F. En las mutantes C, D, E, F y G hay alteración en la remetilación, y clínicamente muestran retardo psicomotor, letargo, trastorno de la marcha, anemia megaloblástica y tromboembolismos. 1.2.3.2. Hiperhomocisteinemia La principal implicación clínica de la elevación de Hcy en sangre es su contribución al riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular (ECV). Puede deberse a causas genéticas o adquiridas.  Causas genéticas La actividad enzimática disminuida de la MTHFR causada por la sustitución de una citosina por una timina en el nucleótido 677 del gen, que origina un cambio de alanina por valina (Frosst et al., 1995) incrementa la susceptibilidad a desarrollar hiperhomocisteinemia moderada. La elevación de Hcy que se ha observado en individuos con concentración sérica de ácido fólico se sitúa en el límite bajo de la normalidad, aunque no lleguen a padecer deficiencia de esta vitamina. Estudios “in vitro” de estabilidad térmica demostraron una sensibilidad térmica (a 46ºC) que la diferencia claramente de la enzima presente en la mayoría de la población y de la enzima de pacientes con deficiencia severa. Por esta razón a ésta variante se le suele denominar MTHFR termolábil. El hecho que la hiperhomocisteinemia no es un hallazgo consistente en los homocigotos para la variante termolábil sugiere que otros factores adicionales y diferentes a los genéticos (Ej.: folatos séricos disminuido) son 33 necesarios para que la concentración de Hcy en sangre se incremente. Estamos, por tanto, ante un claro ejemplo de interacción genética (variante termolábil) y ambiente (ingesta de fólico), que influencian en la susceptibilidad a padecer hiperhomocisteinemia y, por tanto, ECV.  Causas adquiridas a. Déficit de vitamina B12 En los pacientes con evidencia clínica de deficiencia de esta vitamina, la concentración basal de Hcy está elevada en prácticamente todos los casos. Debido a que el metabolismo de la Hcy es muy sensible a la disminución intracelular de B12, la medición de Hcy en plasma es un buen indicador del estatus intracelular de esta vitamina, aún en casos en los cuales las concentraciones séricas de cobalamina están en el intervalo de la normalidad. b. Déficit de folato La deficiencia de ácido fólico induce hiperhomocisteinemia en un porcentaje altísimo de casos. Incluso cuando la concentración de ácido fólico está ligeramente disminuida (deficiencia subclínica), las probabilidades de desarrollar hiperhomocisteinemia son muy altas. c. Déficit de vitamina B6 La deficiencia de B6 afecta significativamente la velocidad de las reacciones que transforman la Hcy en cisteína al disminuir la actividad de las enzimas CBS y cistationasa--liasa e inducir un aumento de las concentraciones de Hcy en sangre post-metionina. 34  Otros factores a. Situaciones clínicas En los pacientes con insuficiencia renal crónica, la concentración de Hcy en sangre se encuentra aumentada entre 1,95 y 3,6 veces respecto a los controles (Bostom et al., 1996; Vychytil et al., 1998) y se ha relacionado con mayor susceptibilidad a desarrollar enfermedad vascular prematura. Sin embargo, a diferencia de las otras causas de hiperhomocisteinemias adquiridas, la respuesta de los pacientes con insuficiencia renal al tratamiento polivitamínico es muy limitada (Selhub et al., 2000). En el hipertiroidismo, aunque no hay una explicación clara, se produce un aumento moderado de la concentración de Hcy. En cáncer y en algunas enfermedades inflamatorias crónicas puede existir una mayor demanda vitamínica que conduce a la aparición de hiperhomocisteinemia. En enfermedades hepáticas, especialmente en la cirrosis el aumento está relacionado con la disminución de la remetilación.(Blanco Vaca, F. et al., 2002). b. Fármacos Los fármacos como el metotrexate y sus metabolitos hepáticos, los poliglutamatos, inhiben la enzima DHFR. Al interferir en la remetilación de la Hcy inducen hiperhomocisteinemia. Las fenotiazinas, los antidepresivos tricíclicos, los contraceptivos orales, los tuberculostáticos y el trimetoprim pueden actuar por mecanismos similares. Los fármacos antiepilépticos como la fenitoína, el fenobarbital, la primidona, la carbamazepina y el ácido valpróico también influencian negativamente el metabolismo del ácido fólico, disminuyendo su absorción intestinal y alterando algunas de las enzimas involucradas en la transferencia de un átomo de carbono, induciendo por ello deficiencia de folato e hiperhomocisteinemia. 35 El óxido nitroso empleado como anestésico oxida el cobalto de la B12, bloquea el transporte de grupos metilos por la cobalamina, e inactiva irreversiblemente la MTR, por lo que induce hiperhomocisteinemia. El azaribine (triacetato-6-azaurine) empleado en el tratamiento de la psoriasis refractaria interfiere con la síntesis de uridina-5-monofosfato, es un antagonista de la vitamina B6, y por ello inhibe la CBS e induce aumento de la concentración de Hcy en la sangre (especialmente detectado por sobrecarga de Met). La isoniazida, cicloserina, hidralacina, carbamacepina y la teofilina también interfieren con la función de la vitamina B6. c. Hábitos El tabaquismo, consumo excesivo de café o alcohol y el sedentarismo pueden aumentar de forma ligera las concentraciones plasmáticas de Hcy. 1.2.3.3. La homocisteína como factor de riesgo cardiovascular Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son un conjunto de trastornos del corazón y de los vasos sanguíneos. Se clasifican en: - Hipertensión arterial - Cardiopatía coronaria - Enfermedad cerebrovascular - Enfermedad vascular periférica - Insuficiencia cardíaca - Cardiopatía reumática - Cardiopatía congénita - Miocardiopatías (WHO, World Heart Federation, World Stroke Organization, 2011) 36 Las ECV constituyen una de las causas más importantes de discapacidad y muerte prematura en todo el mundo. El problema subyacente es la aterosclerosis, que progresa a lo largo de los años, de modo que cuando aparecen los síntomas, generalmente a mediana edad, suele estar en una fase avanzada. Los episodios coronarios (infarto de miocardio) y cerebrovasculares (ataque apopléjico) agudos se producen de forma repentina y conducen a menudo a la muerte antes de que pueda dispensarse la atención médica requerida. La modificación de los factores de riesgo puede reducir los episodios cardiovasculares y la muerte prematura tanto en las personas con ECV establecida como en aquellas con alto riesgo cardiovascular debido a uno o más factores de riesgo. A pesar de los grandes progresos realizados en los últimos años sobre la prevención de la ECV, ésta sigue teniendo la morbi-mortalidad más alta del mundo. De hecho, las muertes por ECV afectan por igual a ambos sexos, y más del 80% se producen en países con ingresos medios y bajos, principalmente porque no pueden beneficiarse de los programas de prevención. La causa subyacente más frecuente es la aterosclerosis (WHO, World Heart Federation, World Stroke Organization, 2011). El control de los factores de riesgo (FR) que predisponen a sufrir ECV se asocia de forma significativa a una disminución de la morbilidad y mortalidad cardiovascular. El riesgo cardiovascular es la probabilidad de que una persona sufra ECV en un periodo definido en el futuro. Se denominan FR clásicos o mayores al grupo siguiente: - Hipertensión arterial - Alteraciones del metabolismo lipídico - Diabetes - Historia familiar de enfermedad coronaria prematura - Tabaquismo. Muchos de estos factores con frecuencia interaccionan y actúan sinérgicamente, siendo difícil establecer el impacto que cada factor ejerce individualmente sobre el riesgo cardiovascular. Los FR clásicos son capaces de explicar 37 aproximadamente el 80% del riesgo poblacional y su control ha demostrado disminuir el RCV entre un 35-50% en 5 años en población de alto riesgo. No obstante, estos FR clásicos no explican completamente la aparición de la ECV, ya que, en torno al 20% de los accidentes coronarios sucede en individuos en los que no se detecta ninguno de ellos, lo que representa una importante limitación. Para mejorar la evaluación del riesgo de ECV, sin menospreciar la enorme validez de los FR clásicos, emerge la necesidad de identificar nuevos. Las recomendaciones internacionales ya consideran a estas magnitudes y las denominan FR emergentes de ECV, existiendo para algunos de estos factores suficientes evidencias científicas de su contribución a la enfermedad. Sin embargo, solo unos pocos de estos factores han sido validados e incorporados en las recomendaciones científicas (FR emergentes consolidados); este es el caso de las concentraciones plasmáticas de lipoproteína a, Hcy y de proteína C reactiva medida con métodos de elevada sensibilidad (Assmann et al., 2005). Los estudios que han analizado la relación entre hiperhomocisteinemia y ECV en general, y que ya incluyen más de 80 estudios clínicos y epidemiológicos en los que se han estudiado más de 10.000 personas, han demostrado de una forma bastante consistente que un porcentaje notable de los pacientes con diferentes tipos de ECV presentan con frecuencia hiperhomocisteinemia basal y/o post-Met (Klerk et al., 2002). Se considera que la hiperhomocisteinemia es un factor de riesgo vascular independiente, gradual (por cada incremento de 5 µmol/L se calcula un incremento de riesgo de 1,9) y causal (Boushey et al., 1995).  Mecanismos patogénicos Los mecanismos por los que la hiperhomocisteinemia se convierte en un factor de riesgo cardiovascular y contribuye al proceso de la arteriosclerosis no están del todo claros. Estudios en modelos animales han demostrado que el aumento de las concentraciones plasmáticas de Hcy ocasiona un incremento del estrés oxidativo, daño 38 en la función endotelial e incrementa la trombogenicidad, lo que favorece la aterosclerosis (Wierzbicki, 2007). El mecanismo inicial postulado por el cual la hiperhomocisteinemia causa arteriosclerosis y trombosis es una agresión a las células endoteliales provocada por las especies reactivas de oxígeno durante la autooxidación de la Hcy en el plasma, o bien un efecto citotóxico directo de las mismas (Welch and Loscalzo, 1998; Derouiche et al., 2014). La lesión endotelial disminuye la producción de óxido nítrico y ésta, a su vez, provoca una tendencia a la vasoconstricción, una mayor proliferación de células musculares lisas de la pared arterial, alteración de la síntesis de colágeno y depósito de tejido fibroso y matriz glicoproteica en la pared de los vasos con destrucción de fibras elásticas de la pared vascular (McCully, 2007). Otro mecanismo que se ha implicado es el de la oxidación de las LDL por los productos de autooxidación de la Hcy, homocistina y homocisteina-tiolactona, que producen en el hígado agregados de LDL-Hcy que presentan una mayor afinidad por la fibrina cuando alcanzan el torrente sanguíneo, son captados por los macrófagos de la pared arterial que los degrada, liberando colesterol que se deposita en las arterias formando placas de ateroma. Además, la homocisteína-tiolactona, también altera el metabolismo de las células endoteliales, favoreciendo la formación de más radicales libres y produciendo más daño endotelial (McCully, 2009). Por otro lado, como mecanismos patogénicos de la Hcy en la ECV se han descrito: el efecto promotor de la multiplicación de las células musculares lisas, la disminución de la síntesis de DNA en las células endoteliales y el incremento de la agregación plaquetaria mediada por el tromboxano que contribuye a la acción protrombótica y a la lesión endotelial de la Hcy (Seshadri and Robinson, 2000). 1.2.4. Valores de referencia Los valores de referencia poblacionales de Hcy plasmática, calculados estadísticamente según los percentiles 2,5 y 97,5, según la mayor parte de los estudios 39 realizados en los países occidentales, se sitúan entre 5 y 16 μmol/L. El límite superior para ambos sexos casi idéntico siendo más elevado en los varones. En la tabla 2 se recogen los límites superiores de referencia establecidos por Refsum (Refsum et al. 2004) basándose en datos publicados por estudios poblacionales, establece los límites superiores de referencia en individuos presumiblemente sanos con y sin suplemento de folatos. Existe controversia acerca de si los límites de referencia deberían basarse en la medición de la concentración de Hcy en individuos de referencia o solo en aquellos con un estado vitamínico óptimo. En este trabajo concluyen que sin suplementación de folatos, los niños menores de 15 años y las mujeres embarazadas presentan el mismo límite superior de referencia (10 μmol/L), los adultos un 50% más altos (15 μmol/L) y los ancianos un 100% más altos (20 μmol/L). Tabla 2: Límites de referencia superiores de Hcy en ayunas. Se indica concentración en (µmol/L). Adaptado del Documento de consenso de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Molecular 2014: Utilidad clínica y recomendaciones para la medición de la concentración de homocisteína como factor de riesgo cardiovascular (Arrobas Velilla, T. et al., 2015). Desde un punto de vista clínico, teniendo en cuenta la implicación de la Hcy en el riesgo cardiovascular las guías americanas (National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III), 2002) y europeas (Perk et al., 2012), recomiendan utilizar un valor discriminante a partir del cual existe relación con el riesgo de padecer ECV, siendo este valor de 12 μmol/L. Sin embargo, dada la intensidad de la relación entre la concentración plasmática de Hcy y el riesgo cardiovascular, y su carácter Hcy (µmol/L) Con suplementación Sin suplementación Niños <15años 8 10 Adultos 15-65 años 12 15 Mayores 65 años 16 20 Gestantes 8 10 40 gradual y continuo, la guía de práctica clínica de la National Academy of Clinical Biochemistry recomienda una concentración deseable de Hcy no superior a 10 μmol/L en los individuos que ya han presentado manifestaciones clínicas de arteriosclerosis o trombosis venosa. Se consideran intermedias o límites las concentraciones de Hcy entre 10-15 μmol/L, altas entre 15 y 30 μmol/L y muy altas las iguales o superiores a 30 μmol/L (NACB LMPG Committee Members et al., 2009). Las diferencias entre sexos de los niveles de Hcy son conocidas y están ampliamente descritas en la bibliografía (Boers et al., 1983; Blom et al., 1988; Selhub et al., 1993; Lussier-Cacan et al., 1996; Jacques et al., 1999; Fukagawa et al., 2000; Jacques et al., 2001; Ganji et al., 2003; Lindeman et al., 2003; MacFarlane et al., 2011) por lo que es conveniente manejar diferentes rangos de referencia entre sexos (Alfthan et al., 2003). 1.3. TRATAMIENTOS CON FOLATOS Con el objeto de aumentar y/o adecuar la ingesta de ácido fólico en la población, se han llevado a cabo tres estrategias: educación nutricional para aportar más folatos a través de la dieta, suplementación farmacológica; y la fortificación de alimentos obligatoria o voluntaria. Cada una ha sido utilizada, de forma conjunta o individual, con mayor o menor éxito en distintos países. 1.3.1. Formas de administración de folatos: folatos sintéticos El folato sintético más utilizado en fortificación de alimentos y en preparados farmacológicos es el ácido fólico que para tener actividad biológica debe reducirse a THF por medio de la DHFR. Se incorpora al ciclo metabólico como THF. El 5-formilTHF o ácido folínico es un folato natural que se ha conseguido sintetizar y se utiliza como preparado farmacológico. A diferencia del fólico, es un 47  La gestación es otra situación fisiológica en la que los niveles de estradiol se elevan y en la que se ha observado un descenso de Hcy (Kang et al., 1986).  El uso de anticonceptivos orales (etinil estradiol) se ha asociado a menor concentración de Hcy respecto a mujeres que no los toman (Morris et al., 2000) así como la terapia hormonal sustitutiva en la menopausia (Friso et al., 2007). Otro aspecto asociado al metabolismo de los folatos es la utilización de la Met. En mujeres se han descrito mayores tasas de transmetilación de SAM y remetilación de Hcy, lo que indica que la utilización de los metabolitos de la Met y el funcionamiento de la vía metabólica puede diferir entre sexos (Fukagawa et al., 2000). Con el fin de establecer el mecanismo por el cual esto sucede se ha tratado de buscar una regulación de este metabolismo basado en las diferencias hormonales (estradiol y testosterona) entre géneros:  La administración oral de estradiol en mujeres postmenopaúsicas en el trabajo llevado a cabo por Smolders y colaboradores no resultó tener efecto en los niveles de SAM y SAH y el descenso en la Hcy lo atribuyeron en parte al cambio que los estrógenos ejercen en la albúmina (Smolders et al., 2005).  En trabajos de experimentación animal se ha visto por un lado que la extirpación de la hipófisis elimina las diferencias entre sexos en cuanto a la expresión de la glicina-N-metiltransferasa (que regula los niveles de SAM) lo que sugiere un posible efecto de los andrógenos en el ciclo de los metilos (Aida et al., 1997) y en ratones hembras se ha observado mayor remetilación de la Hcy a Met por la vía de la colina-betaína que en machos (Chew et al., 2011).  La regulación de la actividad de la CBS renal por la testoterona ha sido estudiada en ratones (Vitvitsky et al., 2007) bajo la hipótesis de que la Hcy en el género masculino es menor en esta especie debido al efecto regulador de la 48 testosterona en la CBS renal. Vitvitsky y colaboradores detectaron menor expresión y actividad de la CBS renal en ratones castrados y pero no en hembras tras la ovarioectomía. Al contrario que en humanos, las hembras presentan mayor concentración de Hcy. Con ello justifican una elevación de Hcy debido a una menor eliminación de la misma por la vía de la transulfuración. Estos autores sugieren que la testosterona sería determinante en las diferencias de género en cuanto a los niveles de Hcy en humanos debido a la menor actividad renal de la CBS en hombres que determinan en este mismo trabajo en muestras de tejido renal. Estos hallazgos metabólicos trasladados al estudio de una patología concreta podrían resultar en mayor riesgo para un sexo que para el otro. Por ejemplo, en el trabajo de Shrubsole y colaboradores se asocian mayores niveles plasmáticos de SAM y SAH con un menor riesgo de adenoma colorrectal en hombres. Sin embargo el incremento de SAM y SAH en mujeres sería un factor de riesgo para esta patología (Shrubsole et al., 2014). Estos autores explican este efecto de la SAM por su efecto inhibidor alostérico de la MTHFR. Establecen que sería posible que entre los hombres y en el contexto de la amplia disponibilidad de SAM, la actividad de MTHFR se reduzca y que el folato esté más disponible para la síntesis de nucleótidos en lugar de para remetilación de la Hcy. En teoría, esto podría dar lugar a la disponibilidad adecuada de sustratos importantes para la metilación, disminuyendo el riesgo de carcinogénesis. 1.4.2. Dimorfismo sexual en polimorfismos genéticos El comportamiento diferencial de una variante genética según el sexo ha sido tratado en diferentes patologías con desigual presentación entre hombres y mujeres. La actividad de la catecol-O-metiltranferasa (COMT), implicada en el metabolismo de la dopamina, está directamente relacionada con la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Se trata de una enfermedad neurodegenerativa 49 caracterizada por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo. El SNP rs4680, que origina la sustitución de Valina (Val) por Met en posición 158 tiene un efecto de elevada (Val/Val), intermedia (Val/Met) y baja actividad (Met/Met) de la COMT (Lachman et al., 1996). Existe un dimorfismo sexual en este polimorfismo genético ya que en hombres el genotipo de baja actividad enzimática se ha asociado a una aparición más temprana de la enfermedad de Parkinson no hallada en mujeres (Klebe et al., 2013). Otro ejemplo de dimorfismo sexual en un polimorfismo genético es el hallazgo de Verma y colaboradores en trastornos del espectro autista (TEA) y el rs6323 de la Monoamino-oxidasa A (MAOA) (Verma et al., 2014). El genotipo de baja actividad de la MAOA de este SNP resulta en un menor metabolismo de la serotonina, neurotransmisor implicado en el control del comportamiento, humor, memoria, aprendizaje y con funciones endocrinas. El TEA es más frecuente en hombres que en mujeres en una proporción de 4:1 y tiene una base genética no dilucidada por completo. En el gen de la MAOA se ha descrito varios polimorfismos, y en la búsqueda de la combinación de variantes genéticas que puedan estar implicadas en la patogénesis de esta enfermedad, estos autores han encontrado una significación estadística del rs6323 en hombres que no se presenta en mujeres. 1.5. POLIMORFISMOS GENÉTICOS RELACIONADOS CON EL TRANSPORTE, METABOLISMO DE LOS FOLATOS Y CICLO DE LOS METILOS Los folatos actúan como transportadores de metilos y todas las células del organismo precisan de un adecuado nivel de folato para que sean posibles la síntesis de pirimidinas y purinas, las reacciones de metilación y la eliminación de Hcy. Un aporte adecuado de folatos es fundamental para el funcionamiento del ciclo pero hay suficiente evidencia de que la susceptibilidad genética subyacente juega un importante papel pudiendo causar alteraciones en la disponibilidad, metabolismo y distribución de intermediarios en la vía metabólica de los folatos. 50 La asociación de variantes genéticas comunes en las enzimas implicadas en el metabolismo de los folatos y el riesgo de la enfermedad se remonta a 1995, cuando se asoció el primer polimorfismo funcional relacionado con el folato (MTHFR C677T) al riesgo cardiovascular. Desde entonces se han identificado numerosos polimorfismos en los genes relacionados con el ácido fólico y se ha tratado de probar su funcionalidad, bien como un modulador de los niveles de folatos, Hcy ó asociarlos al riesgo de enfermedad (DTN, cáncer, etc). Por otra parte, cada vez hay más investigación sobre la importancia de los derivados monocarbonados de folato y las reacciones de metilación de DNA e histonas. Estas reacciones ejercen un control epigenético fundamental sobre la síntesis de proteínas. Por tanto, los aspectos genéticos del metabolismo del folato son muy variados y pueden tocar eventos tan dispares que van desde la impronta prenatal a la susceptibilidad al cáncer. En la tabla 3 se recoge una descripción de polimorfismos genéticos relacionados con el transporte, metabolismo de los folatos y con el ciclo de los metilos que van a ser estudiados en este trabajo. 1.6. POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS A la principal función de los estrógenos como hormona implicada en la reproducción femenina se suma su contribución a otros procesos fisiológicos como son el metabolismo de la glucosa, la vía de señalización celular de la insulina, la reparación del tejido vascular, la homeostasis de lípidos y el remodelado óseo. Como hormona esteroidea, el estrógeno, mediante una unión de alta afinidad, activa receptores de localización nuclear. Los receptores de estrógenos (ER) regulan la transcripción de genes sensibles a estrógenos. Su activación regula la expresión genética, afecta a la proliferación celular y la diferenciación de los tejidos diana. Actúan como factores de transcripción activando o inhibiendo la síntesis de ARN mensajeros (RNAm) y como consecuencia se traducen a proteínas implicadas en los 51 efectos fisiológicos estrogénicos, importantes para el desarrollo de folículos ováricos normales y la fertilidad femenina. En ambos sexos los ERs se expresan en múltiples tejidos entre los que destacan el músculo liso y esquelético, tejido adiposo, hueso y páncreas. Así, estos receptores no sólo están implicados en la función reproductora sino también en el sistema vascular, inmune, nervioso y en la función hepática. Debido a la diferente prevalencia de ECV entre hombres y mujeres premenopaúsicas y entre prey postmenopaúsicas, se ha sugerido que los estrógenos jueguen un papel importante en su etiología. La expresión de ER en tejidos no reproductivos es similar en hombres y mujeres lo que podría elucidar la patogénesis de la ECV. Hay evidencias de que los estrógenos (o la ausencia de éstos) ejercen una función importante en trastornos fisiológicos y metabólicos que incrementan el riesgo de ECV incluyendo la resistencia a la insulina, dislipemia, hipertensión, exceso de acumulación de tejido graso. Por ello, los genes relacionados con las vías de señalización celular de los estrógenos son objeto de estudio dentro del efecto que ejerce la variabilidad genética como factor de riesgo de ECV (Casazza et al., 2010). Hay 2 subtipos de ER: α y β, codificados por genes diferentes en cromosomas separados. El gen del ER-α (ESR1), considerado el principal receptor en cuanto a la actividad estrogénica, se sitúa en el cromosoma 6q25.1, abarca más de 140 kb y está formado por 8 exones separados por 7 intrones. La unión de los estrógenos a su receptor origina un cambio conformacional que da lugar a la homodimerización del complejo, lo que permite la unión a regiones específicas del genoma de elementos de respuesta a estrógenos y da lugar a la expresión de genes diana relevantes. Además se sabe que este complejo, incluso en ausencia de ligando, puede influir o activar cascadas de señalización celular mediadas por kinasas que resultan en la fosforilación y activación de la óxido nítrico sintasa y otras proteínas ó sistemas enzimáticos relacionados con la función cardiovascular (Herrington, 2003). El principal intermediario implicado en el efecto ateroprotector de los estrógenos es el ER-α (Figtree et al., 2009) de ahí que se hayan estudiado ampliamente las variaciones genéticas del ESR1. Los polimorfismos genéticos del ESR1 se identificaron hace más de 20 años 52 poco después de establecer la organización genómica del cromosoma 6. En la última década se han publicado múltiples estudios de asociación de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) del ESR1 con varias enfermedades como el cáncer, la osteoporosis, enfermedades neurodegenerativas, ECV y obesidad (Casazza et al., 2010). Los dos SNPs del ESR1 más estudiados están situados en el primer intrón del gen, a 397 y 351 pares de bases del exón 2 respectivamente, se identifican también por sus endonucleasas de restricción PvuII y XbaI. El SNP del sitio restricción XbaI cambia una A por una G (rs9340799) y en el PvuII implica un cambio de T por C (rs2234693) (ver tabla 3). Debido a su proximidad física están fuertemente asociados y en desequilibrio de ligamiento. Se han detectado al menos 3 haplotipos: AT, GC y AC, pero la frecuencia de algunos es muy baja (del AC), lo que indica que el desequilibrio no es completo ó que han tenido lugar múltiples cambios en la región del haplotipo que contiene estos dos sitios polimórficos (Gallagher et al., 2007; Koch et al., 2005; Lawlor et al. 2006). Los estudios de asociación de estos haplotipos con factores de riesgo de ECV no han concluido cuales deberían usarse. Respecto al efecto que tienen estos SNPs, se ha comprobado in vitro que el alelo C del rs2234693 produce un aumento en la transcripción génica y el cambio por una G del rs9340799 produce algo similar por lo que tendría un efecto en la expresión de genes y sus mecanismos moleculares. Una señalización de los ER-α menos efectiva puede influir indirectamente en una actividad reducida de los estrógenos sobre sus tejidos diana. En caso de los factores de riesgo de ECV afectaría en las vías de comodulación de factores clave como el receptor de insulina, el factor de crecimiento tipo insulina y el receptor de proliferación activado de peroxisomas. De los estudios de asociación llevados a cabo entre los dos SNPs y factores de riesgo de ECV (índice de masa corporal, respuesta a la insulina, adiposidad, niveles de lípidos) revisados en el trabajo de Casazza y colaboradores (Casazza et al., 2010), podemos deducir la necesidad de estratificar las poblaciones de estudio por sexo y edad a la hora de valorar los efectos en ECV. En el caso de estos polimorfismos, sería fundamental, dado que no sólo tener un alelo u otro puede estar más o menos relacionado con el riesgo de ECV sino también la condición de ser hombre o mujer, 53 derivaría en un efecto u otro en función de los niveles de estrógenos circulantes; que son los que al fin y al cabo activan el ER-α. 54 Tabla 3 (I): Selección de polimorfismos genéticos relacionados con el transporte, metabolismo de los folatos y ciclo de los metilos y del receptor de estrógenos ESR1 Gen Nombre Enzima Locus Función Polimorfismo Variación alélica Cambios en la proteína Efecto Referencia ABCB1 ATP-binding casette transporter subfamilia B, miembro 1 - 7q21.12 Transportador de membrana celular acoplado ATP de xenobióticos rs1045642 c.3435C>T C>T Codon sinónimo Mayor/menor expresión del gen, resultados contradictorios según población estudiada (Wolking et al., 2015) ATIC 5-Aminoimidazol-4carboxamida ribonucleotido formiltransferasa/IMP hidrolasa EC 2.1.2.3 2q35 Cataliza los dos ultimos pasos de la síntesis de novo de purinas: transformilasa-ciclohidrolasa rs2372536 c.347C>G C>G Thr116Ser Modula el efecto catalítico del enzima por un mecanismo desconocido aumentando precursores de las purinas. (Dervieux et al., 2004) BHMT Betaína-Homocisteínametiltransferasa EC 2.1.1.5 5q14.1 Conversión de betaína Hcy y de dimetilglicina a Met rs3733890 c.716G>A G>A Arg239Gln Relacionado con DTN, incremento de Hcy normalizada por folato, enzima menos eficiente (Li et al., 2008) CBS Cistationina-β-sintasa EC 4.2.1.22 21q22.3 Transulfuración: conjugación de Hcy y Ser a Cistationina que se convierte en Cys y alfa cetobutirato, emplea B6 rs5742905 c.833T>C T>C Ile278Thr Mejor funcionamiento de la enzima en paciente con homostinuria repondendores a piridoxina (Shih et al., 1995) cbs844ins68 SL Codón de termina-ción prematuro Enzima no funcionante (Sebastio et al., 1995) DHFR Dihidrofolato-reductasa EC 1.5.1.3 5q14.1 Convierte DHF en THF 19pb del Expresión del gen Cambios en mRNA Bibliografía contradictoria de mayor vs menor expresión del enzima (Kalmbach et al., 2008) ESR1 Receptor de estrógenos alfa 1 6q24-q27 Receptor hormonal nuclear rs9340799 XbaI c.453-351A>G A>G Menor expresión del receptor en haplotipo AT (Sunderman n et al., 2010) rs2234693 PvuII c.453-397T>C T>C 55 Gen Nombre Enzima Locus Función Polimorfismo Variación alélica Cambios en la proteína Efecto Referencia MTHFD1 Metilentetrahidro-folato deshidrogenasaciclohidrolasaformiltetrahidrofolatosintetasa-NADPH EC 1.5.1.5-EC 3.5.4.9-EC 6.3.4.3 14q24 Proteína trifuncional: 5,10-metilenTHF deshidrogenasa, 5,10-metenilTHF ciclohidrolasa, 10 formilTHF sintetasa. Reacciones secuenciales de la interconversion de formas monocarbonados de folatos rs2236225 c.1958G>A G>A Arg653Gln Menor actividad sintetasa (Hol et al., 1998) MTHFR 5,10-metilentetrahidrofolato-reductasa (MTHFR) EC 1.5.1.20 1p36.22 Conversión de 5-10metilenTHF a 5metilTHF, cosustrato para la remetilación de Hcy a Met rs1801131 c.1286A>C (A1298C) A>C Glu429Ala Menor actividad enzimática en homocigosis (van der Put et al., 1998) rs1801133 c.665C>T (C677T) C>T Ala222Val Enzima termolábil con menor actividad-> HiperHcy. (Goyette et al., 1994) MTR 5Metiltetrahidrofolatohomocisteína metiltransferasa /Metionina Sintasa (MTR) EC 2.1.1.13 1q43 Remetilación de Hcy a Met. Coenzima B12 (cobalamina I) rs1805087 c.2753A>G A>G Asp919Gly Cambio conformacional en la estructura secundaria de la proteína (Van Der Put et al., 1997) MTRR 5 Metil tetrahidrofolatohomocisteína metiltransferasa reductasa/MTR reductasa EC 1.16.1.8 5p15.31 Reduce el cofactor de la MTR (cobalamina II a cobalamina I) para que la MTR sea funcional rs1801394 c.66A>G A>G Ile22Met Menor unión a la MTR de la enzima variante , afecta la actividad de MTR (Olteanu et al., 2002) SLC19A1 (RFC1 ) Transportador soluble, familia 19, miembro 1 / Transportador de folato reducido - 21q22.3 Proteína soluble transportadora de folatos. Regula la concentración intracelular de folatos rs1051266 c.80A>G A>G His27Arg Transportador menos eficaz (Chango et al., 2000) Tabla 3 (II) Selección de polimorfismos genéticos relacionados con el transporte, metabolismo de los folatos y ciclo de los metilos y del receptor de estrógenos ESR1 56 Gen Nombre Enzima Locus Función Polimorfismo Variación alélica Cambios en la proteína Efecto Referencia SHMT1 Serina-hidroximetil transferasa (citosólica) EC 2.1.2.1 17p11.2 Conversión de Serina y THF a Glicina y 5,10-metilenTHF rs1979276 c.*66C>T A>G Región 3'UTR - (Wang et al., 2007) rs1979277 c.1303C>T C>T Leu474Phe Proteína modificada se acumula en citoplasma rs643333 C>A Región promotora - c.-373C>A rs638416 C>G Región promotora - c.-309C>G rs3783 c.*47C>G C>G Región 3'UTR - TCN2 Transcobalamina 2 - 22q12.2 Globulina transportadorade Vitamina B12 rs9606756 c.67A>G A>G Ile23Va Cambios en afinidad de la proteína por B12 (Miller et al. 2002) rs1801198 c.776G>A C>G Pro259Arg Cambios en afinidad de la proteína por B12 (Miller et al. 2002) RNAm inestable del alelo con la delecion lo que desciende niveles de TYMS (Kawakami et al., 1999) TYMS Timidilato sintasa EC 2.1.1.45 18p11.32 Síntesis de dTMP a partir de dUMP y 5,10-metilenTHF rs34489327 D/I deleción de 6bp Región 3'UTR Cambios en afinidad de la proteína por B12 (Miller et al. 2002) RNAm inestable del alelo con la delecion lo que desciende niveles de TYMS (Kawakami et al., 1999) rs34743033 2R/3R 28bp VNTR Región 5'UTR Incremento de la transcripción de la enzima (Kawakami et al., 2001) rs2853542 C>G del VNTR 3RC/3RG Región 5'UTR Desciende niveles de TYMS (M.V. Mandola et al., 2003) Tabla3 (III): Selección de polimorfismos genéticos relacionados con el transporte, metabolismo de los folatos y ciclo de los metilos y del receptor de estrógenos ESR1 63 3.1. SUJETOS DE ESTUDIO Los sujetos de este estudio fueron reclutados entre estudiantes universitarios cuyas edades estaban comprendidas entre los 18 y los 25 años que fueron invitados a participar en dicho estudio de forma voluntaria. Tras obtener la aprobación del comité de Ética de la Universidad, informamos a todos los participantes de los objetivos del estudio y solicitamos su consentimiento informado por escrito para la obtención de muestras de sangre. La investigación de este estudio se realizó conforme a los principios señalados en la declaración de Helsinki (World Medical Association, 2004) 3.1.1. Criterios de exclusión Fueron rechazados del estudio todos los sujetos que demostraron haber padecido enfermedades hepáticas, renales, gastrointestinales y cardiovasculares, así como los que informaron de haber recibido tratamiento en los tres meses anteriores al estudio con folatos, vitamina B12 y B6, complejos multivitamínicos, anticonvulsivantes, antipalúdicos o anticonceptivos orales. 3.1.2 Criterios de inclusión En cumplimiento de los criterios básicos de exclusión, fueron elegidos 25 sujetos de sexo masculino y 31 de sexo femenino para participar en el estudio. Después del reclutamiento 2 hombres y 5 mujeres fueron excluidos por no incorporarse al programa de extracción de sangre, en algún momento del estudio. 3.2. TRATAMIENTO El tratamiento consistió en la administración oral de 5 mg/día de ácido levofolinato cálcico (Isovorin®, Pfizer, Nueva York, EE.UU.) durante 30 días. Elegimos el ácido levofolínico ó 5-formilTHF (su sal cálcica, levofolinato cálcico) en base a que la 64 mayoría de las formas de folato medidas en sangre, a diferencia del ácido fólico, se convierten en la forma 5-metilTHF. 3.3. TOMA DE MUESTRAS Las muestras de sangre se obtuvieron de la vena antecubital entre las 8:30 y 9:30 a.m. horas tras el ayuno nocturno. Se realizaron extracciones dos días antes del comienzo del periodo de intervención (día 0) y los días 2, 5, 10 y 30 durante el tratamiento y a los 30 días (día 60) de haber finalizado el tratamiento. 3.4. DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS 3.4.1. Determinación de Homocisteína plasmática La Hcy plasmática se determinó a los sujetos en ayunas, a partir de muestras de sangre recogidas en tubos con EDTA. La separación del plasma se hizo en frío en los primeros 20 minutos desde su extracción y tras centrifugación a 3000 g durante 10 minutos a 4 ºC. El plasma fue congelado a –80 ºC hasta el análisis. La determinación cuantitativa de Hcy se llevó a cabo mediante inmunonefelometría en el autoanalizador BNII® (Siemens, Deerfield,USA). Se trata de un ensayo competitivo en el que la Hcy ligada presente en la muestra se reduce a Hcy libre por la acción del ditiotreitol, y se convierte enzimáticamente en S-adenosilhomocisteína (SAH) en la siguiente fase. La S-adenosilcisteína conjugada (SAC), añadida al comienzo de la reacción, compite con la SAH de la muestra por la unión a anticuerpos anti-SAH unidos a partículas de poliestireno. En presencia de SAH, o no hay agregación o se produce una agregación de partículas muy débil. En ausencia de SAH en la muestra, se produce una agregación de las partículas de poliestireno por la SAC conjugada. Cuanto mayor sea el contenido de SAH de la mezcla de reacción, 65 menor será la señal de luz dispersada. El resultado se evalúa en comparación con un estándar de concentración conocida siendo el rango de medición de la técnica de 2,0 - 64 μmol/L. 3.4.2. Determinación de Vitamina B12 y Folatos Las muestras para la determinación de vitamina B12 y folatos séricos fueron recogidas en tubos sin anticoagulante situadas en hielo y centrifugadas en los primeros 20 minutos tras su extracción a 3000 X g durante 10 minutos a 4º C. El suero fue separado y posteriormente congelado a –80 ºC hasta su análisis. Para la determinación de folato intraeritrocitario se recogió sangre en tubos con EDTA y se lisaron las células mediante una dilución 1:20 con ácido ascórbico al 1% (100 µL de sangre total en 2 mL de solución de ácido ascórbico). Se mezcló en vórtex durante 10 s y se congeló inmediatamente a -80 ºC. Todo el proceso así como el almacenamiento se realizó protegido de la luz, en tubos ámbar. Tanto la determinación de vitamina B12 como los folatos se realizaron mediante un equipo comercial de radioinmunoensayo (RIA) simultáneo con separación en fase sólida sin ebullición (Solid Phase No Boil Dualcount®, DPC, Los Angeles,CA,USA), basado en el método de Chen (Chen et al., 1982). En resumen, se realizaron dos RIAs competitivos en un mismo tubo, usando dos moléculas marcadas con diferentes isótopos, el 57Co vitamina B12 y el 125I ácido fólico 3.5. DETERMINACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS El análisis molecular de los polimorfismos genéticos estudiados se llevó a cabo a partir del ADN genómico extraído de sangre periférica de los sujetos siguiendo el método de precipitación salina descrito por Martínez et al. (Martinez et al., 1998) 66 Los 24 polimorfismos genéticos estudiados se agruparon en tres reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex: dos para polimorfismos de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphism) y un tercer grupo de polimorfismos del tipo deleciones, inserciones, repeticiones en tándem (Tabla 4) MULTIPLEX 1 (SNPs) MULTIPLEX 2 (SNPs) MULTIPLEX 3 (Inserciones, deleciones, repeticiones en tándem) Gen Polimorfismo Gen Polimorfismo Gen Polimorfismo SHMT rs1979276 MTHFR rs1801131 DHFR 19-pb inserción /deleción rs1979277 rs1801133 rs643333 TYMS rs34489327 rs638416 MTR rs1805087 rs34743033 rs3783 ESR1 rs9340799 CBS cbs844ins68 BHMT rs3733890 rs2234693 ATIC rs2372536 ABCB1 rs1045642 RFC1 rs1051266 CBS rs5742905 MTRR rs1801394 TCN2 rs1801198 MTHFD1 rs2236225 TCN2 rs9606756 TYMS rs2853542 Tabla 4. Agrupación en multiplex de los Polimorfismos genéticos seleccionados 3.5.1. SNPs El genotipado de SNPs se llevó a cabo en dos reacciones de mini-secuenciación (del inglés minisequencing) precedidas por dos PCR multiplex de las regiones adyacentes. El método fue descrito por Carvalho and Pena en 2005 (Carvalho y Pena, 2005). Es una reacción similar a la de secuenciación por el método Sanger, con la diferencia de que utiliza entre sus reactivos únicamente didesoxinucleótidos marcados con una molécula fluorescente (ddNTP*s) unidos a flourocromos de 4 colores distintos 67 en función de la base. La mini-secuenciacion consiste en la utilización de un cebador (ó primer) que hibrida con la secuencia inmediatamente adyacente a la posición donde se encuentra el SNP. Se utiliza un cebador por cada SNP a estudio diseñado en un sentido ó en otro. El cebador se ancla al amplificado anterior y cuando actúa la polimerasa incorpora un ddNTP*. Mediante el empleo de didesoxinucleótidos marcados con una molécula fluorescente y una DNA polimerasa, se añade el nucleótido marcado complementario al sitio donde se halla el SNP. Cada ddNTP (ddGTP, ddATP, ddCTP y ddTTP) está marcado con un fluorocromo (*). La reacción de mini-secuenciación se realiza en todos los SNPs de la multiplex a la vez. A continuación, mediante electroforesis capilar se separa cada SNP por tamaño y se identifica según la señal de florescencia en cada secuencia amplificada tal y cómo se ha incorporado en la minisecuenciación (Figura 12) Figura 12. Reacción de minisecuenciación Para el diseño de los cebadores empleamos el software Oligo®7 4.0 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, EE.UU.). Las secuencias de las sondas se muestran en las tablas 5 y 6. Para verificar la validez y fiabilidad de la técnica se analizó cada polimorfismo en una única reacción antes de agruparlas. 68 Tabla 5. Secuencias de cebadores de la Multiplex 1 (F= forward primer; R= reverse primer ; PCR= polymerase chain reaction; dbSNP =database SNP) Nombre del Gen dbSNP Localización Alelo1 Alelo2 Cebadores de las secuencias flanqueantes del SNP Secuencia del cebador de la reacción de minisecuenciación Orientación del cebador en la minisecuenciación Multiplex1 SHMT1 rs1979276 17p11.3 A G F:CTGGCAGGGGATAAGTACCAG R:GTCAACAGTTCCCCTTTGGA CCGGAGGACCCCCAC Forward rs1979277 A G (T)31*-GCCAGGCAGAGGGAAGA Reverse rs643333 A C (T)24*-ACCTGCAGAACTGACCC Reverse rs638416 C G (T)91*-GCAGGGCCTGTTTCTCC Reverse rs3783 C G (T)115*-GGGGTCCTCCGGCAG Reverse TYMS rs2853542 18p11.32 C G F:GTGCCACACCCGTGGCTCC R:GCCACAGGCATGGCGCGG (T)84*-GGGACGGAGGCAGGC Reverse TCN2 rs9606756 22q11.2 A G F: GGAGAAGGCCCTGGTAACG R: CTTCCTTGGTCCCAGCCTG (T)64*-GGCTGTCCATCTCTGGTA Reverse ATIC rs2372536 2q35 C G F: CCTAGATAGCTGTAAACCAC R: GTAATCCCAAAACACAATC (T)18*-CCACAGCCTCCTCAACA Reverse BHMT rs3733890 5q13.1-q13.2 A G F: TGTGAACTGCCACTTTGACC R: ATGGGAATTCTGGGAGATCG ATCAGGTGAGCTTTCAGT Reverse MTHFD1 rs2236225 14q24 C T F: CCCACTTTGAAGCAGGATTG R: CATCCCAATTCCCCTGATG (T)59*-AACAAGCTTGAGTGCGATC Reverse MTRR rs1801394 5p15.3-p15.2 A G F: TTTCAGTTTCACTGTTACATGC R: GTAACGGCTCTAACCTTATCG (T)51*-ACCACAGCTTGCTCACA Reverse RFC1 rs1051266 21q22.3 A G F: TTCCAGGCACAGTGTCACC R: CCGCGTGAAGTTCTTGTCG (T)40*-CCGGTCCTGGCGGC Forward *Cola de poliT en el extremo 5' de cada cebador de SNP 69 Nombre del Gen dbSNP Localización Alelo1 Alelo2 Cebadores de las secuencias flanqueantes del SNP Secuencia del cebador de la reacción de minisecuenciación Orientación del cebador en la minisecuenciación Multiplex2 MTHFR rs1801131 1p36.22 A C F: CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC R: CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG (T)71*-AGGAGCTGACCAGTGAAG Forward rs1801133 C T F: GTGGTCTCTTCATCCCTCG R: GACGGTGCGGTGAGAGTG GAAGGTGTCTGCGGGAG Forward CBS rs5742905 21q22.3 C T R: CTCCGTCTGGTTCAGCTCC (T)42*-GCGCCCTCTGCAGATCA Forward ABCB1 rs1045642 7q21.12 C T F: GCTGAGAACATTGCCTATGG R: TAAGGGTGTGATTTGGTTGC (T)34*-GGTGTCACAGGAAGAGAT Forward MTR rs12749581 1q43 A G F: GCATTGACCATTACTACACC R: TCCAAAGCCTTTTACACTCC AATATGAAGATATTAGACAGG Forward TCN2 rs1801198 22q12.2 C G F: GGGAAAGAGACCCTGGAGC R: GCTGGGAAATCATGAGAGC (T)58*-CCCAGTTCTGCCCCA Forward *Cola de poliT en el extremo 5' de cada primer de SNP Tabla 6. Secuencias de cebadores de la Multiplex 2. (F= forward primer; R= reverse primer ; PCR= polymerase chain reaction; dbSNP =database SNP) 70 Las reacciones multiplex de PCR se realizaron en 10 µL de volumen con: - 100 ng de ADN genómico, - 1XAmplitaq® Buffer(Applied Biosystems), - MgCl2 1.5mM, - dNTPs 0.2mM, - 1 unidad de Amplitaq® DNA Polymerase (Applied Biosystems) - 3µL de la mezcla de cebadores (con concentraciones comprendidas entre 0.1 y 0.6 µM). Para la amplificación utilizamos un 2720 Thermal Cycler®(Applied Biosystems) y el ensayo consistió en una desnaturalización de 94°C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de 30s a 94°C, 30s a 58°C, 30s a 72°C y la extensión final en 7 min a 72°C. El exceso de cebadores y dNTPs se retiraron del producto de PCR mediante digestión con 2 unidades de exonucleasa I de E. coli (Exo I®, Takara) que degrada únicamente DNA monocatenario y 5 unidades de fosfatasa alcalina (CiAP®, Takara) que degrada los dNTPs incubando la mezcla a 37°C durante 60 min. A continuación y mediante calor (80°C, 20 min) se inactivaron ambas enzimas. Las reacciones multiplex de minisecuenciación se realizaron en un volumen final de 11 μL con: - 4 µL del producto de PCR purificado - 6 μL de la mezcla de cebadores de minisecuenciación (2 pM/μL) - 1 μL del kit SNaPshot® (Applied Biosystems) Las condiciones de minisecuenciación fueron: 40 ciclos a 96°C-10s, 50°C-7s, 60°C-30s. Previa a la electroforesis capilar, es necesario eliminar los ddNTP*s que no se han unido al amplificado, para que no interfieran en la señal. Es lo que denominamos “purificar” la muestra con 1 unidad de fosfatasa alcalina (CiAP®, Takara) a 37ºC, 1h e inactivamos la enzima a 80ºC durante 20 min. 71 Para llevar a cabo la electroforesis capilar utilizamos 4 µL del producto de minisecuenciación purificado mezclado con 10 µL de formamida HiDi™ y 0.2 μL de estándar de tamaño GeneScan™120 LIZ® (Applied Biosystems) y desnaturalizamos a 95°C durante 5 min. Los productos marcados con fluorescencia se resolvieron por electroforesis capilar en un Abi Prism® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) durante 17 min con una inyección de 8s. Finalmente, la interpretación de los electroferogramas (ver figura 13) se llevó a cabo con ayuda del software GeneMapper™ 4.0 (Applied Biosystems). Figura 13: Visualización de los electroferogramas de las dos multiplex de minisecuenciación de SNPs en GeneMapper™ 4.0 (Applied Biosystems). 72 3.5.2. Otros polimorfismos Para determinar otros polimorfismos diferentes de los SNPs (deleciones, inserciones, repeticiones en tándem) se llevó a cabo una PCR multiplex con las siguientes condiciones experimentales, en un volumen final de 10 µL: - 100 ng de ADN genómico, - 1X GoTaq® FlexiBuffer (Promega),, - MgCl2 1.5mM, - dNTPs 0.2mM, - 1 unidad of Go Taq® Flexi DNA Polymerase (Promega) - Betaína 50mM - 3µL de la mezcla de cebadores marcados (con concentraciones comprendidas entre 0.1 y 0.6 µM). En la tabla 7 se muestran las secuencias de los cebadores marcados incluidos en la multiplex 3 Multiplex3 Nombre del Gen dbSNP Localización Alelo1 Alelo2 Forward Reverse TYMS rs34489327 3´-UTR I D PETCAAATCTGAGGGAGCTGAGT CAGATAAGTGGCAGTACAGA rs34743033 5´-UTR 2R 3R VICGTGCCACACCCGTGGCTCC GCCACAGGCATGGCGCGG CBS cbs844ins68 INTR/EXON S L 6FAMGTTGTTAACGGCGGTATTGG GTTGTCTGCTCCGTCTGGTT DHFR DHFR19bpdel INTRON + - ACGGTCGGGGTGGCCGACTC 6FAMAAAAGGGGAATCCAGTCGG Tabla 7. Secuencias de cebadores de la Multiplex 3. (F= forward primer; R= reverse primer; PCR= polymerase chain reaction; dbSNP =database SNP) 79 4. RESULTADOS 80 81 4.1. FOLATO INTRAERITROCITARIO 4.1.1. Estadística descriptiva de niveles de folato intraeritrocitario Las concentraciones de folato intraeritrocitario determinadas en nuestro grupo de estudio en el momento basal, a los 2, 5, 10 y 30 días del tratamiento así como al mes de haberlo iniciado se representan en la tabla 9. Las concentraciones ascienden progresivamente hasta el último día en el que se administra el ácido fólínico y descienden al mes de finalizado el tratamiento (día 60). Total Hombres Mujeres Días de intervención Media (nmol/L) DE (nmol/L) n Media (nmol/L) DE (nmol/L) n Media (nmol/L) DE (nmol/L) n 0 671,75 220,76 48 631,69 137,59 21 702,91 266,90 27 2 1168,05 476,97 48 1156,42 471,46 21 1177,10 489,97 27 5 1820,86 473,74 44 1673,47 404,91 20 1943,69 499,51 24 10 2334,35 561,53 40 2149,26 488,01 18 2485,78 582,58 22 30 3425,60 870,30 44 2915,16 582,13 17 3746,99 875,49 27 60 1714,08 544,44 28 1535,51 413,34 8 1785,51 582,65 20 Tabla 9: Concentraciones de Folato intraeritrocitario en el grupo de estudio y según el sexo 4.1.2. Estadística inferencial de folato intraeritrocitario Con objeto de restar el efecto de los niveles basales (variable no controlada), a partir del día 2 de tratamiento, calculamos la variación en porcentaje del ascenso de folato intraeritrocitario respecto al día 0. En el segundo día de tratamiento se detectan 7 sujetos en los que no hubo incremento del folato intraeritrocitario. En los días sucesivos observamos variaciones positivas respecto del nivel basal (Figura 14). 82 Figura 14. Variación porcentual de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal en la población total La comparación del porcentaje de aumento de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal no mostró diferencias estadísticamente significativas entre sexos hasta el día 30, en el que las mujeres alcanzaron mayor variación porcentual respecto de nivel basal de folato intraeritrocitario que los hombres (ver tabla 10). Días de intervención Hombres (Media ± DE%) Mujeres (Media ± DE%) Diferencia IC 95% t p 2 78,24±66,20 80,21±66,00 -1,968 -82,02 - 85,96 0,06 > 0,05 5 169,60±72,07 186,85±76,90 -17,25 -70,26 -104,8 0,51 > 0,05 10 253,96±100,55 262,50±107,26 -8,544 -83,26 - 100,3 0,24 > 0,05 30 384,22±155,79 485,16±196,81 -100,9 12,03 - 189,8 2,95 < 0,05* 60 117,11±65,11 161,89±89,67 -44,78 -76,51 - 166,1 0,96 > 0,05 Tabla 10: Comparación por día de tratamiento entre hombres y mujeres del porcentaje de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal. 0 100 200 300 400 500 600 700 2 5 10 30 60 % Folato intraeritrocitario basal Día de tratamiento 83 4.2. FOLATO SÉRICO 4.2.1. Estadística descriptiva de niveles de folato sérico Las concentraciones de folato sérico determinadas en nuestro grupo de estudio en el momento basal, a los 2, 5, 10 y 30 días del tratamiento así como al mes de haberlo finalizado se indican en tabla 11. La concentración de folato sérico en hombres alcanzó el máximo en el último día del tratamiento (día 30) y en mujeres se produjo antes, en el décimo día de tratamiento (Tabla 11). Total Hombres Mujeres Días de intervención Media (nmol/L) DE (nmol/L) n Media (nmol/L) DE (nmol/L) n Media (nmol/L) DE (nmol/L) n 0 19,39 9,23 34 17,50 7,41 22 21,00 10,40 26 2 40,34 18,31 47 34,09 19,04 21 45,38 16,36 26 5 72,00 30,29 39 58,33 21,58 18 83,71 32,17 21 10 83,98 38,35 44 69,87 33,03 20 95,74 39,13 24 30 86,61 20,83 45 83,64 27,53 19 88,79 14,37 26 60 19,56 4,98 38 17,70 3,69 18 21,23 5,46 20 Tabla 11: Concentraciones de Folato sérico en el grupo de estudio y por sexos 4.2.2. Estadística inferencial de folato sérico A partir del día 2 de tratamiento calculamos la variación en porcentaje del ascenso de folato sérico respecto al día 0. A excepción de 4 sujetos que en el día 2 no presentaron un incremento de folato sérico, todos los individuos mostraron un incremento porcentual del mismo respecto del nivel basal desde el segundo día hasta finalizar el tratamiento. En día 60, el 37.5% (n=18) de la población mostró un descenso de los niveles de folato sérico respecto al inicio de la intervención, el resto mantuvo niveles superiores al basal (Figura 15). 84 Figura 15. Variación porcentual de folato sérico respecto del nivel basal en la población total La comparación entre sexos del porcentaje de aumento de folato sérico respecto del nivel basal no mostró diferencias estadísticamente significativas a lo largo del tratamiento ni al mes de finalizarlo (Tabla 12) Días de intervención Hombres (Media ± DE%) Mujeres (Media ± DE%) Diferencia IC 95% t p 2 109,53±88,22 153,71±108,12 -44,19 -209,70 - 298,10 0,45 > 0,05 5 286,20±167,78 379,09±370,66 -92,89 -185,10 - 370,80 0,87 > 0,05 10 363,48±262,59 510,79±520,98 -147,30 -114,70 - 409,30 1,46 > 0,05 30 450,59±307,85 501,00±607,64 -50,40 -210,80 - 311,60 0,50 > 0,05 60 23,96±76,44 28,06±107,00 -4,10 -277,00 - 285,20 0,04 > 0,05 Tabla 12. Comparación por día de tratamiento entre hombres y mujeres del % del Folato sérico respecto del nivel basal. En el día 10 las mujeres alcanzaron el máximo de incremento porcentual de folato sérico respecto del basal llegando a un dintel máximo que se mantiene hasta el día 30, sin embargo en los hombres el folato sérico sigue aumentando hasta el último día de tratamiento (Figura 16) 0 200 400 600 800 1000 2 5 10 30 60 % Folato Sérico basal Días de tratamiento 85 Figura 16: Representación gráfica de la evolución media del porcentaje de folato sérico respecto del nivel basal en hombres y en mujeres 4.3. HOMOCISTEÍNA PLASMÁTICA 4.3.1. Estadística descriptiva de niveles de homocisteína plasmática Los niveles de Hcy cuantificados en nuestro grupo de estudio en el momento basal, a los 2, 5, 10 y 30 días del tratamiento así como al mes de haberlo iniciado se representan en la tabla 13 Total Hombres Mujeres Días de intervención Media (µmol/L) DE (µmol/L) n Media (µmol/L) DE (µmol/L) n Media (µmol/L) DE (µmol/L) n 0 10,33 3,06 48 11,33 2,87 22 9,48 3,01 26 2 7,46 2,15 48 8,69 2,16 22 6,42 1,53 26 5 6,75 1,47 44 7,68 1,29 21 5,90 1,06 23 10 5,91 1,18 45 6,58 1,12 21 5,33 0,90 24 30 5,43 1,19 45 6,20 1,08 19 4,86 0,93 26 60 7,11 1,90 38 8,30 1,51 18 6,04 1,56 20 Tabla 13. Concentraciones de Hcy en el grupo de estudio y por sexos 0 200 400 600 800 1000 1200 010 20 30 40 50 60 % Folato Sérico basal Días de tratamiento Mujeres Hombres 86 4.3.2. Estadística inferencial de Hcy plasmática A partir del día 2 de tratamiento calculamos la variación en porcentaje de descenso de Hcy plasmática respecto al día 0. Todos los individuos mostraron concentraciones de Hcy inferiores desde el segundo día de tratamiento en adelante y al mes de haber finalizado, sólo un individuo mostró una concentración Hcy plasmática superior a la basal (Figura 17) Figura 17. Variación porcentual de Hcy respecto del nivel basal en la población total El descenso de Hcy plasmática en porcentaje no presentó diferencias estadísticamente significativas entre géneros como se muestra en la tabla 14. Días de intervención Hombres (Media ± DE%) Mujeres (Media ± DE%) Diferencia IC 95% t p 2 -22,88±10,46 -30,21±13,37 7,33 -18,81 - 4,15 1,66 > 0,05 5 -30,64±14,54 -34,33±17,02 3,69 -15,65 - 8,27 0,80 > 0,05 10 -39,44±16,27 -40,88±14,22 1,44 -13,28 - 10,40 0,32 > 0,05 30 -43,97±15,44 -45,51±15,34 1,54 -13,50 - 10,42 0,33 > 0,05 60 -25,54±17,89 -33,11±17,61 7,57 -20,44 - 5,31 1,53 > 0,05 Tabla 14. Comparación por día de tratamiento entre hombres y mujeres del % de Hcy plasmática respecto del nivel basal. -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 2 5 10 30 60 % Hcy basal Días de tratamiento 87 4.4. VITAMINA B12 SÉRICA 4.4.1. Estadística descriptiva de niveles de vitamina B12 sérica Los niveles de vitamina B12 cuantificados en nuestro grupo de estudio en el momento basal, a los 2, 5, 10 y 30 días del tratamiento así como al mes de haberlo iniciado se representan en la tabla 15 Total Hombres Mujeres Días de intervención Media (pmol/L) DE (pmol/L) n Media (pmol/L) DE (pmol/L) n Media (pmol/L) DE (pmol/L) n 0 364,74 164,24 48 322,67 105,29 22 400,33 196,27 26 2 323,89 180,90 45 327,75 239,51 19 321,07 127,55 26 5 327,93 105,05 29 354,60 147,80 8 320,97 94,00 23 10 305,05 121,03 42 255,02 82,43 18 342,57 132,89 24 30 295,16 142,54 45 257,05 133,10 19 323,02 145,24 26 60 308,07 108,55 38 273,50 84,80 18 339,19 119,83 20 Tabla 15: Concentraciones de vitamina B12 en el grupo de estudio y por sexos Los niveles de vitamina B12 no presentaron cambios significativos en nuestra intervención entre los diferentes días por lo que no evaluamos la evolución en porcentaje respecto del nivel basal. 88 4.5. EVOLUCIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS EN AMBOS SEXOS En la figura 18 se muestra cómo evolucionaron las magnitudes bioquímicas en la población diferenciada por sexos a. Hombres b. Mujeres Figura 18. Representación gráfica de la variación porcentual respecto del nivel basal (%Basal) de las 3 magnitudes bioquímicas durante el tratamiento (30 días) y al mes de haberlo finalizado (día 60) en el grupo de hombres (a.) y mujeres (b.) -50 -40 -30 -20 -10 0 -200 -100 0 100 200 300 400 500 600 010 20 30 40 50 60 % Basal Días de tratamiento Fol Ser Fol Intra Hcy -50 -40 -30 -20 -10 0 -200 -100 0 100 200 300 400 500 600 010 20 30 40 50 60 % Basal Días de tratamiento Fol Ser Fol Intra Hcy 95 b. Hombres CC-CG GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 70,28 64,95 14 92,62 94,83 2 -22,34 0,32 > 0,05 5 140,1 44,93 14 224,72 44,14 2 -84,62 1,23 > 0,05 10 218,18 63,32 12 417,08 0 1 -198,9 2,1 > 0,05 30 347,43 159,19 12 446,41 0 1 -98,98 1,04 > 0,05 60 122,38 72,3 6 sFol 2 113,37 92,88 14 69,06 0 1 44,31 0,2 > 0,05 5 268,85 183,7 11 289,6 262,97 2 -20,75 0,13 > 0,05 10 425,26 293 12 290,7 268,57 2 134,6 0,83 > 0,05 30 446,19 292,02 13 171,54 0 1 274,7 1,25 > 0,05 60 31,56 71,66 11 -45,89 0 1 77,45 0,35 > 0,05 Hcy 2 -23,31 8,56 14 -21,54 4,15 2 1,78 0,15 > 0,05 5 -34,3 14,39 14 -14,29 13,36 2 20,02 1,74 > 0,05 10 -40,41 16,82 13 -39,98 2,66 2 0,43 0,04 > 0,05 30 -41,43 17,49 13 -53,83 0 1 -12,4 0,79 > 0,05 60 -26,43 19 11 -7,59 0 1 18,84 1,19 > 0,05 c. Mujeres CC-CG GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 70,82 71,16 16 110,73 60,33 5 -39,91 0,63 > 0,05 5 173,26 88,13 15 247,1 31,96 3 -73,84 0,95 > 0,05 10 248,33 77,86 15 316,15 200,83 3 -67,83 0,87 > 0,05 30 453,53 155,84 16 614,66 329,75 5 -161,1 2,55 > 0,05 60 165,29 76,4 13 207,9 148,27 3 -42,61 0,54 > 0,05 sFol 2 158,4 101,76 16 204,11 110,67 5 -45,7 0,2 > 0,05 5 475 444,65 13 234,67 104,25 3 240,3 0,84 > 0,05 10 530,24 599,9 16 563,2 413,28 4 -32,96 0,13 > 0,05 30 430,39 241,97 16 918,5 1333,33 5 -488,1 2,14 > 0,05 60 10,4 50,02 13 159,74 242,76 3 -149,3 0,52 > 0,05 Hcy 2 -33,33 10,9 16 -23,69 15,55 5 9,64 1,21 > 0,05 5 -35,08 18,5 15 -38,69 16,5 3 -3,61 0,37 > 0,05 10 -41,1 13,94 16 -42,1 19,7 4 -1,01 0,12 > 0,05 30 -44,75 15,31 16 -47,81 18,39 5 -3,06 0,38 > 0,05 60 -35,33 15,24 13 -34,33 22,44 3 1 0,1 > 0,05 Tabla 20. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del polimorfismo ATIC rs2372536, 347C>G en el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína 96 4.7.2. BMHT rs3733890 (c.716G>A) En el grupo no se observó diferente comportamiento de los parámetros bioquímicos según el genotipo de este polimorfismo de la BMHT. Sin embargo, cuando dividimos la población estudiada por sexo, en los hombres AA la Hcy plasmática fue significativamente menor en el día 5 que en los AG-GG. En el grupo de mujeres ni folato sérico e intraeritrocitario ni Hcy mostraron un comportamiento diferente en los genotipos de la BHMT estudiados (Tabla 21). a.Total AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 96,59 57,96 15 73,41 68,41 30 -23,18 0,64 > 0,05 5 167,91 53,04 14 183,29 84,37 28 15,38 0,41 > 0,05 10 237,39 108,96 12 264,13 100,1 25 26,74 0,67 > 0,05 30 500,45 237,59 15 419,65 156,35 26 -80,8 2,18 > 0,05 60 171,07 105,95 8 143,75 77,93 18 -27,32 0,56 > 0,05 sFol 2 157,15 85,96 14 125,36 107,88 30 -31,79 0,29 > 0,05 5 223,56 122,12 11 379,22 342,63 26 155,7 1,28 > 0,05 10 398,79 303,36 14 477,04 493,46 27 78,25 0,7 > 0,05 30 567,97 786,23 15 407,31 244,35 27 -160,7 1,48 > 0,05 60 48,27 125,99 13 8,91 60,29 22 -39,36 0,33 > 0,05 Hcy 2 -27,49 9,99 15 -27,18 13,54 30 0,32 0,06 > 0,05 5 -37,89 15,72 14 -30,44 15,97 28 7,44 1,46 > 0,05 10 -44,81 14,05 14 -37,88 16,03 28 6,93 1,36 > 0,05 30 -47,65 13,4 15 -43,27 16,98 27 4,38 0,87 > 0,05 60 -32,49 14,29 13 -29,44 20,51 22 3,06 0,56 > 0,05 Tabla 21. (continúa en la siguiente página) 97 b. Hombres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 92,65 70,02 8 76,33 63 12 -16,31 0,35 > 0,05 5 155,29 42,64 8 182,19 88,56 12 26,91 0,57 > 0,05 10 218,45 83,41 7 285,02 115,35 10 66,57 1,31 > 0,05 30 425,85 148,22 8 355,29 182,39 8 -70,56 1,37 > 0,05 60 162,86 56,2 2 109,54 69,2 5 -53,32 0,62 > 0,05 sFol 2 126,96 71,73 7 95,03 93,57 12 -31,93 0,35 > 0,05 5 204,73 102,96 5 300,55 177,15 12 95,82 0,94 > 0,05 10 408,85 258,77 8 349,54 275,25 10 -59,31 0,65 > 0,05 30 436,34 270,85 8 382,76 276,25 9 -53,58 0,57 > 0,05 60 22,38 61,15 7 13,86 69,18 9 -8,52 0,09 > 0,05 Hcy 2 -27,08 11,32 10 -24,34 11,35 12 2,74 0,43 > 0,05 5 -41,63 11,63 10 -24,62 13,41 12 17 2,69 < 0,05* 10 -46,79 13,25 9 -34,55 18,14 11 12,24 1,84 > 0,05 30 -51,13 11,01 10 -37,71 17,83 9 13,41 1,98 > 0,05 60 -31,19 13,28 9 -24,41 23,3 9 6,78 0,97 > 0,05 c. Mujeres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 101,09 45,53 7 71,46 73,53 18 -29,64 0,56 > 0,05 5 184,74 64,61 6 184,11 84,03 16 -0,63 0,01 > 0,05 10 263,91 143,89 5 250,19 90,02 15 -13,71 0,22 > 0,05 30 585,71 300,3 7 448,26 139,41 18 -137,5 2,58 > 0,05 60 173,81 122,67 6 156,91 79,57 13 -16,9 0,29 > 0,05 sFol 2 187,34 93,46 7 145,59 114,48 18 -41,76 0,22 > 0,05 5 239,25 143,87 6 446,65 434,27 14 207,4 1,01 > 0,05 10 385,36 380,97 6 552,04 580,47 17 166,7 0,84 > 0,05 30 718,4 1143,4 7 419,59 234,36 18 -298,8 1,6 > 0,05 60 78,47 177,71 6 5,48 56,02 13 -72,99 0,35 > 0,05 Hcy 2 -28,32 7,72 5 -29,07 14,83 18 -0,74 0,09 > 0,05 5 -28,53 22,38 4 -34,81 16,73 16 -6,28 0,69 > 0,05 10 -41,26 16,29 5 -40,04 14,67 17 1,23 0,15 > 0,05 30 -40,68 16,27 5 -46,04 16,33 18 -5,36 0,66 > 0,05 60 -35,43 18,16 4 -32,91 18,49 13 2,51 0,27 > 0,05 Tabla 21. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del polimorfismo BMHT rs3733890, 716G>A en el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína, *p<0.05 98 4.7.3. ESR1 En nuestro estudio hayamos un desequilibrio de ligamiento casi completo entre los polimorfismos rs9340799 y rs2234693 del gen ESR1, como ya ha sido descrito previamente por múltiples autores (Sundermann et al., 2010) (Fox et al., 2005)(Bos et al., 2008). La frecuencia haplotípica que observamos se asemeja a la publicada en otras poblaciones, representado en la tabla 22. rs9340799 rs2234693 Grupo (n=44) Hombres (n=20) Mujeres (n=24) A T 0,55 0,60 0,50 G C 0,34 0,33 0,35 A C 0,11 0,08 0,15 G T 0 0 0 Tabla 22. Frecuencia de haplotipos en la población de estudio El análisis del desequilibrio de ligamiento en nuestra población mostró un desequilibrio casi completo: D’=0.9997, p<0.001. 4.7.3.1. ESR1 rs2234693 (PvuII, c.453-397 T>C) No se observaron diferencias significativas en el folato intraeritrocitario y Hcy plasmática al comparar los sujetos CC (genotipo homocigoto mutado) en los diferentes días de tratamiento. En cambio, el folato sérico el día 30 en los individuos CC presentó un incremento porcentual significativamente mayor respecto del nivel basal respecto de los CT-TT (Tabla 23). Al dividir la población por sexos, en los hombres no se observaron diferencias entre los genotipos en los 3 parámetros bioquímicos estudiados durante todo el tratamiento y al mes de finalizarlo. Sin embargo en las mujeres, el genotipo CC es el que muestra un incremento porcentual significativamente mayor respecto del nivel basal tanto en folato intraeritrocitario como en el sérico el día 30 como se muestra en la tabla 23. 99 a.Total CC CT-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 138,24 38,79 8 68,08 63,19 37 70,16 1,57 > 0,05 5 200,91 62,9 5 175,59 77,81 36 25,32 0,46 > 0,05 10 261,95 56,92 6 253,27 109,81 31 8,68 0,17 > 0,05 30 513,78 301,67 7 436,59 163,07 34 77,2 1,62 > 0,05 60 163,42 130,76 6 142,44 74,07 20 -0,98 0,39 > 0,05 sFol 2 119,76 125,63 8 134,57 98,44 36 -14,81 0,11 > 0,05 5 209,25 93,75 5 354,97 323,54 31 -145,7 0,9 > 0,05 10 337,37 370,22 7 460,35 449,25 35 -123 0,89 > 0,05 30 773,65 1126,02 7 408,54 243,81 35 -365,1 2,63 < 0,05* 60 44,49 162,57 8 15,59 60,18 27 -28,89 0,21 > 0,05 Hcy 2 -29,14 12,47 8 -27,46 12,06 37 1,68 0,28 > 0,05 5 -34,52 20,44 5 -33,16 15,74 36 1,36 0,18 > 0,05 10 -37,42 24,52 7 -41,15 13,25 35 -3,73 0,58 > 0,05 30 -50,32 19,86 7 -44,14 14,8 35 6,19 0,96 > 0,05 60 -31,88 22,89 8 -29,28 16,93 27 2,61 0,42 > 0,05 b. Hombres CC CT-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 120,53 29,89 5 68,55 67,69 15 51,98 0,95 > 0,05 5 196,11 71,56 4 165,81 77,46 15 30,3 0,51 > 0,05 10 241,94 32,37 5 261,74 126,38 12 -19,8 0,35 > 0,05 30 367,92 205,57 4 400,02 157,82 12 -32,09 0,53 > 0,05 60 81,39 51,18 3 125,63 70,67 4 -44,24 0,55 > 0,05 sFol 2 55,41 51,81 5 113,82 90,48 14 -58,41 0,59 > 0,05 5 191,85 98,49 4 299,53 179,93 12 -107,7 0,98 > 0,05 10 204,89 137,62 5 410,9 285,61 14 -206 2,08 > 0,05 30 368,46 219,2 4 435,33 281,4 13 -66,87 0,61 > 0,05 60 -12,08 34,59 5 26,85 74,32 11 -38,93 0,38 > 0,05 Hcy 2 -24,43 12,68 5 -24,79 8,02 15 0,37 0,05 > 0,05 5 -30,85 21,62 4 -31,7 13,64 15 0,85 0,1 > 0,05 10 -32,84 27,84 5 -42,75 10,88 14 9,91 1,24 > 0,05 30 -43,99 25,69 4 -44,84 13,44 13 0,85 0,1 > 0,05 60 -25,42 25,29 5 -24,55 15,3 11 -0,86 0,1 > 0,05 Tabla 23. (continúa en la siguiente página) 100 c. Mujeres CC CT-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 167,75 37,25 3 67,76 61,56 22 100 1,42 > 0,05 5 220,11 84,3 2 182,58 79,2 21 -37,53 0,32 > 0,05 10 361,98 108,12 2 247,92 101,28 19 -114,1 0,97 > 0,05 30 708,26 332,17 3 456,53 166,01 22 -251,7 3,58 <0,01* 60 245,45 141,21 3 146,64 76,52 16 -98,81 1,37 > 0,05 sFol 2 227,01 149,22 3 147,77 103,02 22 -79,24 0,32 > 0,05 5 278,86 263 2 389,99 389,02 19 111,1 0,27 > 0,05 10 668,57 662,91 2 493,32 535,93 21 -175,3 0,59 > 0,05 30 1313,9 1722,08 3 392,71 224,25 22 -921,2 3,74 <0,01* 60 138,77 262,25 3 7,86 49,39 16 -130,9 0,52 > 0,05 Hcy 2 -36,98 8,68 3 -29,28 14,07 22 7,71 0,8 > 0,05 5 -49,19 0 1 -34,2 17,33 21 14,99 0,94 > 0,05 10 -48,87 11,89 2 -40,08 14,77 21 8,79 0,76 > 0,05 30 -58,77 2,38 3 -43,72 15,85 22 15,04 1,57 > 0,05 60 -42,66 16,6 3 -32,52 17,69 16 10,13 1,03 > 0,05 Tabla 23. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del polimorfismo ESR1 rs2234693, PvuII, T>C en el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína, *p<0.05 4.7.3.2. ESR1 rs9340799 (XbaI, c.453-351 A>G) No se observan diferencias significativas en ninguno de los parámetros estudiados al comparar los sujetos AA con los que muestran uno o dos alelos variantes (AG-GG) en los diferentes días de tratamiento. Tampoco existe diferencia en este SNP cuando dividimos la población por género (Tabla 24). 101 a.Total AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 47,06 59,62 18 102,88 59,67 27 -55,82 1,6 > 0,05 5 147,45 57,34 18 203,11 80,72 23 -55,66 1,54 > 0,05 10 238,17 62,62 12 262,6 117,32 25 -24,43 0,61 > 0,05 30 432,79 153,68 16 460,63 213,73 25 -27,85 0,76 > 0,05 60 147,48 86,58 9 147,18 90,76 17 0,3 0,01 > 0,05 sFol 2 145,94 107,6 17 123,02 100,07 27 22,93 0,22 > 0,05 5 451,86 414,81 16 241,03 123,74 20 210,8 1,87 > 0,05 10 553,8 606,16 16 369,73 277,53 26 184,1 1,72 > 0,05 30 495,33 292,41 17 451,75 613,02 25 43,58 0,41 > 0,05 60 34,43 74,36 13 14,97 101,15 22 19,47 0,17 > 0,05 Hcy 2 -29,69 12,95 18 -26,46 11,4 27 -3,23 0,68 > 0,05 5 -32,75 16,51 18 -33,77 16,1 23 1,01 0,21 > 0,05 10 -42,53 13,81 16 -39,29 16,36 26 -3,23 0,65 > 0,05 30 -44,89 16,06 17 -45,36 15,69 25 0,47 0,1 > 0,05 60 -28,95 20,79 13 -30,41 16,84 22 1,46 0,27 > 0,05 b. Hombres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 53,04 59,44 10 110,05 57,55 10 57,01 1,24 > 0,05 5 135,86 49,92 10 212,55 80,6 9 76,7 1,63 > 0,05 10 231,17 55,84 7 273,24 131,35 10 42,07 0,83 > 0,05 30 373,32 142,24 8 410,67 191,48 8 37,35 0,73 > 0,05 60 125,63 70,67 4 81,39 51,18 3 -44,24 0,56 > 0,05 sFol 2 105,23 96,32 9 92,34 77,97 10 -12,89 0,14 > 0,05 5 284,15 202,59 8 261,07 136,57 8 -23,08 0,24 > 0,05 10 370,82 330,64 9 343,96 214,63 10 -26,86 0,3 > 0,05 30 486,69 327,68 9 344,1 152,57 8 -142,6 1,51 > 0,05 60 40,85 84,01 8 -11,49 26,38 8 -52,33 0,54 > 0,05 Hcy 2 -26,35 8,78 10 -23,06 9,4 10 3,29 0,48 > 0,05 5 -32,97 13,45 10 -29,91 17,09 9 3,06 0,43 > 0,05 10 -44 11,41 9 -36,68 20,3 10 7,32 1,04 > 0,05 30 -44,9 15,81 9 -44,35 17,52 8 0,56 0,07 > 0,05 60 -22,41 16,58 8 -27,24 20,3 8 -4,83 0,63 > 0,05 Tabla 24. (continúa en la siguiente página) 102 c. Mujeres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 39,58 63,04 8 98,66 62,23 17 59,08 1,12 > 0,05 5 161,95 65,94 8 197,05 83,24 14 35,1 0,64 > 0,05 10 247,98 76,81 5 255,5 111,22 15 7,53 0,12 > 0,05 30 492,26 149,31 8 484,15 225,04 17 -8,11 0,15 > 0,05 60 164,95 101,91 5 161,28 92,32 14 -3,67 0,06 > 0,05 sFol 2 191,74 106,44 8 141,06 109,18 17 -50,68 0,29 > 0,05 5 619,57 513,2 8 227,67 118,71 12 -391,9 2,09 > 0,05 10 789,06 811,18 7 385,84 316,24 16 -403,2 2,17 > 0,05 30 505,05 269,3 8 502,41 738,23 17 -2,64 0,02 > 0,05 60 24,17 63,43 5 30,09 124,41 14 5,91 0,03 > 0,05 Hcy 2 -33,88 16,49 8 -28,47 12,25 17 5,41 0,79 > 0,05 5 -32,49 20,71 8 -36,24 15,55 14 -3,76 0,53 > 0,05 10 -40,64 17,21 7 -40,93 13,83 16 -0,29 0,04 > 0,05 30 -44,88 17,44 8 -45,84 15,31 17 -0,96 0,14 > 0,05 60 -39,43 24,35 5 -32,23 15,04 14 7,21 0,87 > 0,05 Tabla 24. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del polimorfismo ESR1 rs9340799, XbaI, A>G en el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína 4.7.3.3. Análisis de los haplotipos En los sujetos que portan el alelo G apreciamos una tendencia los días 2, 5 Y 10 a introducir más folato dentro del hematíe ya que las variaciones porcentuales del folato intraeritrocitario fueron superiores respecto a los que son AA y el incremento sérico fue menor. Esta misma apreciación se produjo también al dividir la población por sexos. Para evaluar este efecto del alelo G analizamos la asociación de los haplotipos con los parámetros bioquímicos como respuesta al tratamiento. La significación estadística que hallamos en el haplotipo GC sucedió en el día 2 de tratamiento en el que los sujetos que son GC presentaron más folato intraeritrocitario que los AT y los AC como se puede ver en la tabla 25. 103 rs9340799 rs2234693 Frecuencia Diferencia p A T 0.55 0.00 - G C 0.34 46.48 (17.48 - 75.49) 0.0026* A C 0.11 17.23 (-26.48 - 60.94) 0.44 Tabla 25. Asociación de los haplotipos de los SNPs del ESR1 con la diferencia del porcentaje de folato intraeritrocitario el segundo día de tratamiento en la población de estudio. *p<0.05 Al estudiar los haplotipos por sexo en el segundo día de tratamiento, esta diferencia en el grupo no se observó en los hombres pero sí en las mujeres (Tabla 26). rs9340799 rs2234693 Frecuencia Diferencia p A T 0.50 0.00 - G C 0.35 74.85 (22.9 - 126.79) 0.0079* A C 0.15 52.46 (-9.08 - 114) 0.1 Tabla 26. Asociación de los haplotipos de los SNPs del ESR1 con la diferencia el porcentaje de folato intraeritrocitario el segundo día de tratamiento en mujeres. *p<0.05 Basándonos en el trabajo de Schuit y cols. (Schuit et al., 2005) que hallaron menor concentración de estradiol en un grupo de mujeres postmenopáusicas asociado al haplotipo AT, analizamos el efecto de este haplotipo en el metabolismo de los folatos dividiendo los sujetos por sexo y en función de la duplicidad o no del haplotipo AT de la siguiente manera según los dos SNPs estudiados en el ESR1:  Grupo 0: genotipo AG-CT  Grupo 1: sujetos AA-CT  Grupo 2: portadores de dos copias del haplotipo AA-TT 104 En la tabla 27 se muestra la descriptiva de los parámetros bioquímicos en función de los genotipos de ambos polimorfismos en el grupo de mujeres. En la estadística inferencial comparamos los grupos 0-1, 0-2 y 1-2 con el test de ANOVA y corrección post test de Bonferroni. Las diferencias encontradas se describen a continuación en función del parámetro estudiado: a. Folato intraeritrocitario: En mujeres, la comparación 0-1, 1-2 y 0-2 no mostró diferencias significativas, pero sí una tendencia a la baja en el día 2 ya que las del grupo 0 presentaron una mayor variación de folato intraeritrocitario respecto del nivel que los grupos 1 y 2. Ésta misma apreciación no la pudimos hacer en el grupo de hombres, ya que la n fue muy reducida (datos no mostrados). b. Folato sérico: en el grupo 0 de mujeres la variación de folato sérico respecto del nivel basal fue menor siendo estadísticamente significativa al 5º día frente al grupo 2 y los días 5 y 10 frente al grupo 1. Tampoco hicimos apreciación alguna en el grupo masculino por el bajo tamaño muestral. (datos no mostrados). c. Homocisteína: no hallamos diferencias significativas ni observamos tendencia en función del haplotipo AT entre los grupos en ambos sexos. 111 c. Mujeres CC CT-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 79,32 69,01 8 79,96 68,66 17 0,65 0,01 > 0,05 5 185,18 59,80 8 183,77 88,46 14 -1,4 0,03 > 0,05 10 237,62 131,62 6 260,48 91,22 14 22,86 0,38 > 0,05 30 457,73 184,55 8 500,39 211,9 17 42,66 0,81 > 0,05 60 143,49 94,49 6 170,9 93,39 13 27,41 0,45 > 0,05 sFol 2 187,01 116,71 8 143,29 105,55 17 -43,71 0,24 > 0,05 5 299,51 109,7 7 430,16 464,21 13 130,7 0,66 > 0,05 10 369,63 308,56 6 557,59 591,99 17 188 0,94 > 0,05 30 349,6 136,12 8 575,56 742,46 17 226 1,25 > 0,05 60 2,33 21,78 6 40,62 131,98 13 38,3 0,18 > 0,05 Hcy 2 -27,91 16,16 8 -31,23 12,31 18 -3,32 0,5 > 0,05 5 -32,68 17,99 8 -35,21 17,06 15 -2,53 0,37 > 0,05 10 -40,71 14,58 6 -40,94 14,52 18 -0,23 0,03 > 0,05 30 -42,02 17,43 8 -47,06 14,58 18 -5,05 0,75 > 0,05 60 -30,93 11,63 6 -34,04 19,96 14 -3,11 0,41 > 0,05 Tabla 30. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del MTHFR rs1801133, 677C>Ten el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína, *p<0.05 4.7.5.3. Estudio de Haplotipos y genotipos dobles del rs1801133 (677C>T) y rs1801131 (1298 A>C) Los dos SNPs que estudiamos en la MTHFR deben ser evaluados en su conjunto ya que por su proximidad en el gen y como ha sido publicado en diversos trabajos existe un desequilibrio de ligamiento completo o casi completo entre ambos (Ogino and Wilson, 2003). De hecho en nuestra población no encontramos ningún sujeto con un posible haplotipo TC (CT-CC, TT-AC ni TT-CC) como se refleja en la tabla 31 de genotipos dobles. 112 Grupo Hombres Mujeres Genotipo doble n Frecuencia n Frecuencia n Frecuencia CC-AA 10 0,23 4 0,21 6 0,24 CC-AC 5 0,11 3 0,16 2 0,08 CT-AA 7 0,16 4 0,21 3 0,12 CT-AC 12 0,27 3 0,16 9 0,36 TT-AA 10 0,23 5 0,26 5 0,20 Total 44 1 19 1 25 1 Tabla 31: Genotipos de la MTHFR para los SNPs: rs1801133 y rs1801131 No tienen representación en nuestra población individuos con 3 ni 4 mutaciones. Por otro lado, la frecuencia de haplotipos que hayamos en nuestro grupo de estudio se asemeja a los publicado en el meta-análisis de Ogino y Wilson (Ogino and Wilson, 2003). rs1801133 rs1801131 Grupo (n=44) Hombres (n=19) Mujeres (n=25) T A 0,45 0,45 0,44 C A 0,36 0,39 0,34 C C 0,19 0,16 0,22 T C 0 0 0 Tabla 32. Frecuencia de haplotipos para los SNPs de la MTHFR, rs1801133 y rs1801131 El análisis del equilibrio de ligamiento en nuestra población mostró un desequilibrio de ligamiento: D’= 0.9995, p<0.001. En la tabla 33 se muestra una descriptiva de los parámetros bioquímicos de la población dividida por género y en función de los genotipos para las mutaciones en posición 1298 y 677 de la MTHFR. 113 a. Hombres AA-CC AC-CC AA-CT ACCT AA-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n iFol 2 116,14 62,14 4 95,75 46,44 3 91,61 47,64 4 56,19 58,75 3 70,7 88,95 5 5 217,44 60,71 4 171 55,75 3 214,22 106,43 4 162,41 47,56 2 123,63 60,37 5 10 307,99 95,75 3 258,39 31,35 2 315,74 191,98 4 214,06 7,13 3 209,14 48,6 4 30 330,77 202,91 3 497,95 0 1 474,43 208,18 4 402,99 158,03 3 367,87 133,76 4 60 41,64 0 1 85,75 75,5 2 202,6 0 1 63,4 0 1 144,45 0 1 sFol 2 37,74 46,98 3 73,76 76,86 3 164,41 60,59 4 34,52 47,08 3 121,21 109,51 5 5 214,51 185,94 4 230,63 65,79 3 318,28 69,3 3 235,34 65,38 2 346,58 285,2 4 10 248,27 163,96 4 218,3 160,61 3 592,79 210,5 4 170,32 145,25 3 515,95 375,04 4 30 210,7 175,36 3 192,7 49,67 2 417,99 130,55 4 540,83 88,31 3 651,21 384,46 4 60 -25,65 35,45 3 -23,28 23,85 3 15,11 51,46 4 -16,79 50,54 2 118,74 59,84 3 Hcy 2 -23,88 6,39 4 -27,27 20,04 3 -18,65 4,12 4 -28,16 8,33 3 -26,65 7,14 5 5 -21,58 15,35 4 -14,19 7,17 3 -36,84 10,82 4 -45,52 14,78 2 -40,34 10,45 5 10 -34,91 19,53 4 -23,41 18,6 3 -43,49 10,81 4 -50,52 14,43 3 -46,2 17,6 4 30 -40,36 29,22 3 -30,03 10,13 2 -48,02 10,65 4 -54,63 7,57 3 -46,2 18,16 4 60 -14,13 32,74 3 -10,3 14,07 3 -32,23 10,46 4 -32,91 15,4 2 -33,76 10,55 3 b. Mujeres AA-CC AC-CC AA-CT ACCT AA-TT Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n iFol 2 60,4 70,34 6 136,06 4,12 2 25,54 40,37 3 128,96 41,95 9 24,41 55,14 5 5 170,42 62,66 6 229,46 13,22 2 170,3 12,95 3 182,09 57,54 7 196,83 163,6 4 10 187,12 50,29 5 490,11 0 1 240,83 106,75 3 266,3 75,76 7 265,04 128,42 4 30 402,99 137,84 6 621,95 267,41 2 532,46 217,17 3 532,4 227,71 9 423,55 204,59 5 60 153,08 102,33 5 95,54 0 1 61,29 54,37 2 209,36 87,35 8 141,41 70,05 3 sFol 2 173,94 124,19 6 226,21 118,91 2 197,62 137,3 3 135,15 105,15 9 125,34 101,29 5 5 340,42 86,02 5 197,23 115,44 2 647,66 747,05 3 186,2 95,03 6 632,98 503,67 4 10 401,12 334,03 5 212,15 0 1 1012,49 1298,79 3 471,41 332,02 9 439,77 385,53 5 30 364,63 144,25 6 304,52 142,3 2 580,83 448,15 3 653,64 1003,93 9 431,86 222,02 5 60 -0,21 23,35 5 15 0 1 -18,7 60,82 2 58,87 161,41 8 31,52 80,65 3 Hcy 2 -26,81 16,13 6 -31,23 22,32 2 -42,26 7,49 3 -28,02 12,15 9 -30,55 14,35 5 5 -27,51 18,01 6 -48,2 1,4 2 -31,78 28,82 3 -34,51 11,94 7 -42,26 19,59 4 10 -37,28 13,34 5 -57,82 0 1 -37,91 17,64 3 -39,88 12,94 9 -44,49 19,5 5 30 -37,38 17,88 6 -55,94 3,39 2 -48,82 21,63 3 -47,1 9,91 9 -46,35 21,67 5 60 -31,83 12,77 5 -26,46 0 1 -38,52 31,89 2 -36,55 14,96 8 -31,11 32,18 3 Tabla 33: Parámetros bioquímicos en hombres (a.) y mujeres (b.) según los genotipos dobles de la MTHFR, rs1801133 y rs1801131 114 4.7.5.4. Comparación de los parámetros bioquímicos en función del número de mutaciones En hombres se observó una mayor velocidad de entrada de folato intraeritrocitario en el día 2 en función del número de mutaciones, siendo los de mayor velocidad los de cero mutaciones que disminuyen progresivamente respecto a los de 1 y 2 mutaciones. En cuanto a la evolución del tratamiento ese efecto inicial se vio amortiguado al final del tratamiento no observándose diferencias el día 30. En el sentido contrario sucede con el folato sérico ya que los hombres sin mutaciones presentaron menor respuesta al tratamiento en el día 2, frente a los de 1 y 2 mutaciones, quizás debido a que en ese periodo inicial entra más folato al interior del hematíe. Como efecto significativo de estas tendencias se da un aumento estadísticamente significativo de folato sérico el día 30 en sujetos con 2 mutaciones respecto a los de 0 mutaciones. En la Hcy se observa mayor respuesta de descenso de la misma en los sujetos con más mutaciones aunque no llegamos a alcanzar significación estadística, 1 vs 2 mutaciones (Tabla 34). 115 Hombres 0 mutaciones (AA/CC) vs 1-2 Mutaciones (AA/CT + AC/CC + AC/CT + AA/TT) Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 37,76 -191,8 - 116,3 0,65 > 0,05 5 52,23 -207,4 - 102,9 0,89 > 0,05 10 57,34 -232,7 - 118,0 0,87 > 0,05 30 -92,23 -84,45 - 268,9 1,39 > 0,05 60 -74,75 -225,1 - 374,6 0,66 > 0,05 sFol 2 -68,16 -250,3 - 386,6 0,57 > 0,05 5 -77,47 -213,2 - 368,1 0,70 > 0,05 10 -151,80 -133,7 - 437,2 1,41 > 0,05 30 -272,70 -49,75 - 595,2 2,24 > 0,05 60 51,75 -273,2 - 376,7 0,42 > 0,05 Hcy 2 1,07 -24,19 - 22,05 0,12 > 0,05 5 12,90 -36,19 - 10,39 1,46 > 0,05 10 6,55 -29,85 - 16,74 0,74 > 0,05 30 5,86 -32,17 - 20,46 0,59 > 0,05 60 13,12 -39,64 - 13,40 1,31 > 0,05 0 mutaciones (AA/CC) vs 1 mutación(CT/AA + CC/AC) Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 22,75 -220,4 - 174,9 0,31 > 0,05 5 21,74 -219,4 - 175,9 0,30 > 0,05 10 11,37 -234,3 - 211,6 0,14 > 0,05 30 -148,40 -81,89 - 378,6 1,76 > 0,05 60 -83,06 -281,0 - 447,1 0,62 > 0,05 sFol 2 -87,82 -188,6 - 364,2 0,86 > 0,05 5 -59,95 -198,6 - 318,5 0,63 > 0,05 10 -184,00 -67,02 - 435,1 1,98 > 0,05 30 -132,20 -151,0 - 415,4 1,26 > 0,05 60 -24,31 -252,1 - 300,7 0,24 > 0,05 Hcy 2 -1,53 -27,41 - 30,47 0,14 > 0,05 5 5,55 -34,49 - 23,38 0,52 > 0,05 10 -0,03 -28,91 - 28,97 0,00 > 0,05 30 -1,66 -34,30 - 30,99 0,14 > 0,05 60 8,71 -40,56 - 23,15 0,74 > 0,05 Tabla 34. (continúa en la siguiente página) 116 0 mutaciones (AA/CC) vs 2 mutaciones (AC/CT + AA/TT) Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 50,88 -202,3 - 100,5 0,91 > 0,05 5 82,72 -237,7 - 72,23 1,45 > 0,05 10 96,75 -267,3 - 73,85 1,54 > 0,05 30 -52,15 -118,5 - 222,7 0,83 > 0,05 60 -62,29 -240,5 - 365,1 0,56 > 0,05 sFol 2 -50,96 -333,6 - 435,5 0,36 > 0,05 5 -94,99 -271,7 - 461,7 0,70 > 0,05 10 -119,60 -236,5 - 475,6 0,91 > 0,05 30 -393,20 1,213 - 785,2 2,71 < 0,05* 60 -90,18 -324,7 - 505,0 0,59 > 0,05 Hcy 2 3,34 -28,74 - 22,07 0,35 > 0,05 5 20,25 -46,25 - 5,755 2,10 > 0,05 10 13,14 -39,14 - 12,87 1,36 > 0,05 30 9,45 -38,08 - 19,17 0,89 > 0,05 60 19,30 -49,59 - 11,00 1,72 > 0,05 1 mutación (AA/CT + AC/CC) vs 2 mutaciones (AC/CT + AA/TT) Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 28,13 -166,8 - 110,6 0,54 > 0,05 5 60,98 -204,2 - 82,26 1,14 > 0,05 10 85,38 -234,5 - 63,71 1,54 > 0,05 30 96,22 -253,1 - 60,69 1,64 > 0,05 60 20,78 -265,4 - 223,9 0,23 > 0,05 sFol 2 36,86 -306,4 - 232,7 0,36 > 0,05 5 -35,04 -265,7 - 335,7 0,31 > 0,05 10 64,47 -342,9 - 213,9 0,62 > 0,05 30 -261,00 -28,75 - 550,8 2,40 > 0,05 60 -65,87 -239,1 - 370,8 0,58 > 0,05 Hcy 2 4,87 -23,48 - 13,75 0,70 > 0,05 5 14,69 -33,92 - 4,530 2,04 > 0,05 10 13,16 -32,39 - 6,060 1,82 > 0,05 30 7,80 -27,81 - 12,21 1,04 > 0,05 60 10,59 -31,65 - 10,47 1,34 > 0,05 Tabla 34. (continúa en la siguiente página) 117 1 mutación (AA/CT + AC/CC) Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 -4,14 -287,3 - 279,0 0,04 > 0,05 5 -43,22 -239,9 - 326,4 0,44 > 0,05 10 57,36 -263,7 - 378,4 0,51 > 0,05 30 -23,52 -438,0 - 391,0 0,16 > 0,05 60 116,90 -337,2 - 570,9 0,74 > 0,05 sFol 2 90,64 -149,4 - 330,7 1,06 > 0,05 5 87,65 -169,0 - 344,3 0,96 > 0,05 10 374,50 134,4 - 614,5 4,38 <0,01* 30 225,30 -46,91 - 497,5 2,32 > 0,05 60 38,38 -201,7 - 278,4 0,45 > 0,05 Hcy 2 -8,62 -17,24 - 34,49 0,93 > 0,05 5 22,65 -48,51 - 3,214 2,45 > 0,05 10 20,09 -45,95 - 5,777 2,17 > 0,05 30 17,99 -47,32 - 11,34 1,72 > 0,05 60 21,94 -47,80 - 3,927 2,37 > 0,05 2 mutaciones: AC/CT vs AA/TT Día de tratamiento Diferencia IC 95% t p iFol 2 -14,51 -169,4 - 198,5 0,22 > 0,05 5 38,78 -249,5 - 172,0 0,52 > 0,05 10 4,92 -197,3 - 187,5 0,07 > 0,05 30 35,12 -227,5 - 157,3 0,52 > 0,05 60 81,05 -275,2 - 437,3 0,64 > 0,05 sFol 2 -86,69 -388,1 - 561,5 0,51 > 0,05 5 -111,20 -451,8 - 674,3 0,55 > 0,05 10 -345,60 -150,9 - 842,2 1,95 > 0,05 30 -110,40 -386,2 - 606,9 0,62 > 0,05 60 -135,50 -458,0 - 729,0 0,64 > 0,05 Hcy 2 -1,51 -24,55 - 27,58 0,16 > 0,05 5 -5,18 -24,68 - 35,03 0,48 > 0,05 10 -4,32 -22,94 - 31,58 0,44 > 0,05 30 -8,43 -18,82 - 35,69 0,87 > 0,05 60 0,85 -33,43 - 31,73 0,07 > 0,05 Tabla 34: Comparación de los parámetros bioquímicos en función del número de mutaciones en hombres Las comparaciones llevadas a cabo de los parámetros bioquímicos en mujeres según el número de mutaciones de la MTHFR no mostraron diferencias estadísticamente significativas (datos no mostrados). Las tendencias que observamos 118 en el grupo masculino en las mujeres no existen e incluso parecen estar invertidas. Por tanto podemos decir que observamos un dimorfismo sexual en la respuesta al tratamiento con folatos entre hombres y mujeres siendo el hombre más sensible a los cambios. Este efecto puede estar mediado por el sugerido efecto estrogénico sobre el metabolismo de los folatos principalmente en mujeres. 4.7.6. MTRR rs1801394 (c.66A>G) Los sujetos de genotipo homocigoto salvaje presentaron significativamente menor incremento porcentual de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal el último día de tratamiento. Esta diferencia no se obtuvo entre los géneros (Tabla 35) a.Total AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 84,14 63,23 10 85,55 67,67 30 -1,41 0,03 > 0,05 5 172,18 48,59 10 189,92 83,02 27 -17,75 0,43 > 0,05 10 217,35 55,7 9 285,01 107,92 24 -67,65 1,55 > 0,05 30 362,87 89,3 10 505,92 206,4 27 -143 3,45 <0,01* 60 165,17 83,65 6 150,63 88,71 17 14,54 0,27 > 0,05 sFol 2 131,42 120,9 9 136,08 99,18 30 -4,65 0,04 > 0,05 5 239,55 135,14 8 354,74 352,88 24 -115,2 0,81 > 0,05 10 326,25 279,69 9 476,28 475,98 28 -150 1,13 > 0,05 30 323,93 173,34 10 521,95 591,11 28 -198 1,55 > 0,05 60 -1,74 32,17 9 35,56 103,53 22 -37,3 0,27 > 0,05 Hcy 2 -24,55 11,2 10 -27,15 12,52 30 2,6 0,45 > 0,05 5 -32,33 10,17 10 -32,15 18,5 27 0,18 0,03 > 0,05 10 -41,96 9,53 10 -39,63 17,93 28 -2,34 0,4 > 0,05 30 -43,13 12,74 10 -45,91 16,33 28 2,79 0,48 > 0,05 60 -29,03 16,11 9 -30 19,69 22 0,97 0,15 > 0,05 Tabla 35. (continúa en la siguiente página) 119 b. Hombres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 74,78 69,21 5 99,53 60,94 12 -24,75 0,46 > 0,05 5 167,56 31,45 5 192,51 80,05 12 -24,95 0,46 > 0,05 10 236,28 39,57 4 286,46 114,86 11 -50,18 0,85 > 0,05 30 343,35 76,79 5 452,5 188,89 9 -109,2 1,94 > 0,05 60 190,13 0 1 107,77 71,19 5 82,36 0,75 > 0,05 sFol 2 111,84 125,52 4 81,13 59,98 12 30,71 0,35 > 0,05 5 184,06 105,52 4 235,63 117,44 10 -51,57 0,57 > 0,05 10 270,85 149,7 4 318,83 183,91 12 -47,98 0,55 > 0,05 30 365,65 170,77 5 377,26 273,57 10 -11,61 0,14 > 0,05 60 -2,56 43,66 4 12,59 54,78 10 -15,15 0,17 > 0,05 Hcy 2 -16,34 4,63 5 -26,14 9,8 12 -9,8 1,11 > 0,05 5 -29,95 9,37 5 -31,01 18,14 12 1,06 0,12 > 0,05 10 -42,91 11,91 5 -39,43 20,21 12 -3,48 0,39 > 0,05 30 -45,05 9,76 5 -45,54 19,62 10 0,48 0,05 > 0,05 60 -29,27 18,21 4 -25,66 21,79 10 -3,62 0,37 > 0,05 c. Mujeres AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 93,51 63,13 5 76,23 71,97 18 17,28 0,28 > 0,05 5 176,79 65,34 5 187,86 88,05 15 -11,06 0,18 > 0,05 10 202,21 66,22 5 283,77 106,42 13 -81,56 1,28 > 0,05 30 382,4 105,33 5 532,63 214,7 18 -150,2 2,45 > 0,05 60 160,18 92,52 5 168,49 91,76 12 -8,31 0,13 > 0,05 sFol 2 147,09 129,33 5 172,71 104,41 18 -25,62 0,12 > 0,05 5 295,03 152,53 4 439,82 438,24 14 -144,8 0,59 > 0,05 10 370,56 366,22 5 594,36 590,17 16 -223,8 1,01 > 0,05 30 282,21 184,63 5 602,33 704,39 18 -320,1 1,46 > 0,05 60 -1,09 25,26 5 54,7 130,87 12 -55,79 0,24 > 0,05 Hcy 2 -32,77 9,6 5 -27,82 14,28 18 -4,95 0,62 > 0,05 5 -34,7 11,44 5 -33,06 19,37 15 -1,64 0,2 > 0,05 10 -41,02 7,77 5 -39,78 16,7 16 -1,24 0,15 > 0,05 30 -41,2 16,14 5 -46,12 14,82 18 4,92 0,62 > 0,05 60 -28,84 16,44 5 -33,62 17,9 12 4,78 0,57 > 0,05 Tabla 35. Comparacion de los parámetros bioquímicos en función del rs1801394, 66A>G de la MTRR en el grupo total (a.) en hombres (b.) y mujeres (c.). Abreviaturas: iFol, folato intraeritrocitario; sFol, folato sérico; Hcy: Homocisteína, *p<0.05 120 4.7.7. RFC1 rs1051266 (c.80A>G) Los individuos portadores de uno ó dos alelos variantes mostraron un porcentaje de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal significativamente mayor que homocigotos salvajes. Ésta diferencia se observó el día 30 del tratamiento en el grupo y al dividir la población por sexos, en los hombres. a.Total AA AG-GG Día de tratamiento Media (%basal) DE n Media (%basal) DE n Diferencia t p iFol 2 84,95 76,12 13 79,58 61,78 32 -5,36 0,14 > 0,05 5 182,57 60,87 12 176,4 80,92 30 -6,17 0,16 > 0,05 10 243,15 101,53 12 261,36 104,24 25 18,21 0,46 > 0,05 30 374,66 161,86 12 480,06 196,49 29 105,4 2,7 < 0,05* 60 132,52 112,11 6 158,05 79,5 20 25,53 0,48 > 0,05 sFol 2 116,26 91,12 13 143,54 105,95 31 27,28 0,25 > 0,05 5 284,39 201,79 11 353,48 336,28 26 69,1 0,57 > 0,05 10 395,77 298,07 12 472,89 483,89 29 77,12 0,67 > 0,05 30 295,93 158,81 12 532,19 578,33 30 236,3 2,05 > 0,05 60 -17,4 38,96 8 35,65 98,35 27 53,05 0,39 > 0,05 Hcy 2 -24,01 12,55 13 -28,62 12,21 32 -4,61 0,9 > 0,05 5 -26,57 13,03 12 -35,46 16,69 30 -8,89 1,67 > 0,05 10 -37,66 12,48 12 -41,2 16,74 30 -3,54 0,67 > 0,05 30 -41,46 16,53 12 -46,18 15,53 30 -4,713 0,89 > 0,05 60 -28,52 23,17 8 -31,18 17,05 27 -2,664 0,42 > 0,05 Tabla 36. (continúa en la siguiente página) 127 5. DISCUSIÓN 128 129 El presente trabajo consiste en un estudio sobre el efecto del tratamiento en el metabolismo de los folatos de dos grupos de jóvenes de distinto sexo, homogéneos en edad con una dosis media-alta de folatos. Se pretende, en primer lugar, observar la respuesta al tratamiento con folínico de toda la población en conjunto; en segundo lugar, detectar el comportamiento diferencial del metabolismo de los folatos entre géneros; en tercer lugar, valorar la respuesta al tratamiento de distintos polimorfismos funcionales seleccionados de los genes implicados en el metabolismo de los folatos y en cuarto lugar observar si existe una respuesta diferencial en función del sexo en relación con los mencionados polimorfismos. Todo ello bajo la hipótesis principal de que existe un dimorfismo sexual en el metabolismo de los folatos que se evidencia ante una respuesta diferencial al tratamiento con folatos y que esta respuesta diferencial puede estar modulada por una distinta gestión hormonal-metabólica, determinada por el sexo y los genes implicados en el eje. El tratamiento con ácido folínico busca distinguir tres aspectos básicos: 1. La respuesta inmediata entre los días 2 y 5 después de comenzado el tratamiento. 2. Una perspectiva de la evolución del tratamiento durante los 30 días y 30 días después de haber finalizado. 3. El estado final del metabolismo de los folatos valorado en sus distintos analitos para establecer la influencia de los polimorfismos en un sistema donde se ha eliminado el factor dietético por saturación de folatos. En resumen, este trabajo trata de obviar la edad y los factores de la dieta como coadyuvantes de las variaciones en los niveles de Hcy y folatos, y de esta forma estudiar las diferentes respuestas al tratamiento con ácido folínico entre los dos grupos de jóvenes diferenciados por sexos y el papel de polimorfismos funcionales en el equilibrio final del sistema 130 5.1. Sobre el grupo de estudio Es bien conocido el efecto de la edad aparte de la dieta sobre los niveles de Hcy, calculándose un incremento de 1µmol/L por cada 25 años de edad (Reyes-Engel et al., 2002). La población de estudio seleccionada fue homogénea en edad y sin patología que pueda introducir un sesgo en nuestro trabajo. 5.2. Sobre el efecto del tratamiento Los resultados de las concentraciones basales de los parámetros bioquímicos muestran unas desviaciones y unas concentraciones muy semejantes a las que se han estudiado en poblaciones similares. Sólo se diferencian en que en nuestra población no se observa una carencia de folatos intraeritrocitario en mujeres jóvenes, como concluyen otros estudios en poblaciones europeas (Kluijtmans et al., 2003; Al-Tahan et al., 2006). Por otro lado, cabe mencionar cómo las desviaciones estándar en la Hcy van disminuyendo a medida que el tratamiento va desarrollándose, al contrario de los valores de folatos sérico e intraeritrocitario cuyas desviaciones se hacen mayores. Este hecho abunda en calificar a la Hcy como el marcador funcional del equilibrio del sistema. Estos resultados nos llevan a establecer una buena instalación del tratamiento. A diferencia de la mayoría de trabajos publicados sobre tratamientos con folatos hemos empleado la variación en porcentaje respecto del nivel basal. De esta manera hemos reducido la variabilidad interindividual e igualado a los sujetos ya que no hemos controlado la ingesta de folatos antes del tratamiento. 5.3. Influencia del tratamiento en los niveles sérico e intraeritrocitario de folato En primer lugar se discutirán los resultados obtenidos en los niveles de folato sérico e intraeritrocitario tanto en el conjunto de la población como en la población dividida por sexos y la relación a los diferentes polimorfismos de los genes estudiados 131 5.3.1. Población de estudio En todos los sujetos se observó, como cabía esperar, un incremento del folato sérico durante los días de intervención que se estabilizó en el 10º día de tratamiento y que retornó a niveles basales treinta días después de finalizado el mismo. Sin embargo, cuando se estudian los niveles de folato intraeritrocitario en toda la población, se observa que dichos niveles aumentan progresivamente durante todo el tratamiento y se mantienen aumentados treinta días después de finalizar el mismo. Ya que el folato intraeritrocitario es considerado el depósito de esta vitamina (Lucock et al., 1996; Smulders et al., 2007) y un indicador de las reservas tisulares (Institute of Medicine (US) Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and Choline, 1998), parece ser que el dintel sérico mencionado sería consecuencia de una limitación en la liberación de folatos a la circulación por parte de la célula, más que un problema de absorción o de eliminación metabólica de folatos. En los tejidos periféricos, el 5-metilTHF penetra en el interior de la célula gracias a un sistema de transporte específico. Allí pierde su grupo metilo al cederlo a la Hcy, reacción catalizada por la MTR, enzima que también requiere de la vitamina B12 para su actividad. El THF formado es el sustrato preferente en las reacciones de poliglutamilación en las que la folilpoliglutamato sintasa vuelve a añadir los residuos glutámicos y los folatos quedan retenidos en el interior de la célula, ya que sólo pueden abandonarla si se transforman nuevamente en derivados monoglutámicos (Varela Moreiras, G y Alonso Aperte, E, 2005). Cabe pensar, si bien no disponemos de argumentos suficientes para confirmarlo, que estos niveles máximos de folatos séricos se corresponderían con los valores óptimos para la correcta utilización de los mismos por parte del resto de estirpes celulares, puesto que las concentraciones intraeritrocitarias no dejan de elevarse durante el periodo de tratamiento y sin embargo los valores de los folatos séricos no sobrepasan el dintel determinado a partir del 10º día de tratamiento. Las concentraciones de folato intraeritrocitario ascienden progresivamente hasta el último día en el que se administra el ácido folínico y descienden al mes de 132 finalizado el tratamiento. Este comportamiento nos lleva a deducir que la capacidad de almacenamiento de folatos intracelular supera la capacidad de saturación de la dosis de tratamiento estudiada de 5 mg de ácido folínico. Esta capacidad de almacenamiento se podría explicar desde un punto de vista evolutivo como un mecanismo adaptativo de defensa ante la incapacidad de síntesis de folatos de novo de nuestro organismo y por la abundancia relativa o circunstancial de folatos que el ser humano ha tenido a su disposición a lo largo de la historia. Hay que tener presente que incluso hoy representa la carencia vitamínica más frecuente en la humanidad. 5.3.2. Influencia del sexo La evolución de los folatos sérico e intraeritrocitario en mujeres presenta distintos patrones: el folato sérico alcanza un plateau en el décimo día de tratamiento mientras que el folato intraeritrocitario asciende hasta el último día. No obtuvimos diferencias estadísticamente significativas en folato sérico entre sexos probablemente debido al bajo número de sujetos pero vemos un patrón diferente, como se explica más adelante. Se halló un efecto similar en el primer estudio realizado sobre la cinética del folato (Heseker and Schmitt, 1987), aunque este trabajo no diferenciaba por sexo la población. Respecto al plateau de folato sérico está descrito en la bibliografía y la mayoría de los trabajos consultados se han realizado en mujeres en edad reproductiva en las que se ha ensayado el efecto de las diferentes pautas de suplementación en la prevención del DTN. Además ocurre de una manera dosis-dependiente aunque en diferentes momentos durante el tratamiento (Lamers et al., 2006; Hao et al., 2008). Venn y colaboradores no alcanzaron el plateau de folato sérico probablemente debido a la baja dosis empleada (100µg/día) (B J Venn et al., 2002) . El porcentaje de folato sérico alcanzado respecto del nivel basal se estabiliza en mujeres al décimo día de tratamiento, mientras que en los varones no podemos decir que se llega a un máximo pero sí que se aproxima al nivel alcanzado en mujeres aunque más tarde. Las diferencias de folatos séricos tenderían a igualarse entre sexos al final del tratamiento, como si hubiera un dintel sérico diferente de folatos para 133 ambos. La diferencia entre sexos corresponde al tiempo en el que se alcanza el dintel, y además el descenso de folatos séricos después del tratamiento, es idéntica en ambos sexos. A medida que avanza el tratamiento, las mujeres presentan mayor porcentaje de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal que los hombres al final del tratamiento. Se parte de diferencias no significativas que van incrementándose conforme avanza el tratamiento hasta alcanzar su máxima diferencia al final del mismo. En este estudio no hemos podido alcanzar su punto de almacenamiento máximo ni en hombres ni en mujeres. En el caso de los folatos séricos la regulación debe estar relacionada con la capacidad de almacenamiento tisular y de la liberación intracelular. El folato intraeritrocitario se utiliza en la práctica clínica como marcador del estatus intracelular de folatos. En la bibliografía está aceptado el almacén de folatos en los hematíes como un indicador de reserva tisular (Lucock et al., 1996; Institute of Medicine (US) Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes and its Panel on Folate, Other B Vitamins, and Choline, 1998; Smulders et al. 2007). Hay escasa bibliografía sobre la correlación de los marcadores sanguíneos con los niveles tisulares. Un trabajo que data de 1975 compara folato sérico e intraeritrocitario con los niveles de folato en hígado (Wu et al., 1975), el principal lugar de almacenamiento en el organismo (Shenkin A et al., 2006). En el trabajo de Wu y colaboradores directamente midieron folato en biopsia de hígado de pacientes alcohólicos. Tanto el folato sérico como el intraeritrocitario correlacionaron bien con el folato hepático, si bien el intraeritrocitario presentó mejor rendimiento en cuanto a sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo y positivo. No obstante, se llevó a cabo en un reducido número de sujetos. Muchos autores coinciden en el uso del folato intraeritrocitario como marcador del status de folatos aunque los expertos reconocen no tener el total conocimiento de si es preferible a usar el folato sérico (Yetley et al., 2011). La rápida consecución del plateau de folato sérico en mujeres puede ser debido a la necesidad fisiológica aguda de folatos durante el embarazo, que, en una escala 134 menor, coincide con la rápida reducción de Hcy entre las fases lútea y folicular del ciclo menstrual (J. Tallova et al., 1999). En el trabajo liderado por Winkels en 2008 se atribuye al menor almacenamiento de folatos intraeritrocitarios en hombres a su mayor masa muscular, por tanto, a un mayor consumo (Winkels et al., 2008). No compartimos este argumento y nos inclinamos por los mayores requerimientos de la mujer para cumplir su función reproductiva. En definitiva, en ambos sexos no se presenta el mismo comportamiento, no hemos encontrado en la bibliografía este patrón de comportamiento diferencial de los folatos séricos en hombres. Respecto a la posibilidad de alcanzar un plateau de folatos en el hematíe, el grupo de Lamers no lo consigue tras 24 semanas de tratamiento. Estos autores postulan que a los 120 días de suplementación con folatos los hematíes se regeneran y el contenido de folato intraeritrocitario se incorpora en la siguiente generación de células recién formadas. En los 120 días sucesivos la segunda generación de hematíes se beneficia tanto del suplemento (en su caso el tratamiento duró 168 días) como del folato disponible liberado de la generación anterior (Lamers et al., 2006). Desde el punto de vista farmacocinético se ha visto que el folato intraeritrocitario aumenta lentamente desde que comienza el aporte de folato y podría no alcanzar los niveles de estado estacionario hasta las 35 semanas (Farrell et al., 2013). Por otro lado al mes de haber finalizado el tratamiento, el folato intraeritrocitario permanece por encima del basal al igual que lo hallado por otros autores (Lamers et al., 2006; Hao et al., 2008) que además han comprobado que la tasa de descenso es también dosis dependiente. Es decir, mayor descenso a mayor dosis administrada. 135 5.3.3. Efecto de los polimorfismos genéticos en los niveles de folatos 5.3.3.1. ATIC rs2372536 (c.347C>G) La ATIC cataliza los dos últimos pasos de la síntesis de novo de purinas, tiene doble actividad transformilasa-ciclohidrolasa que utiliza 10-formilTHF. El polimorfismo rs2372536 (347C>G) da lugar a un cambio de serina por treonina en posición 116. No se conoce con exactitud el mecanismo por el que actúa el polimorfismo, por el que se ha observado un descenso en su actividad catalítica de manera que aumenta los precursores de las purinas (Dervieux et al., 2004). Se ha relacionado con más efectividad de metotrexate en monoterapia de artritis reumatoide así como de mayor toxicidad gastrointestinal del fármaco que inhibe la DHFR y la TYMS, disminuyendo la producción de THF (Weisman et al., 2006). En el presente trabajo se observó que los individuos GG, en el último día de tratamiento, mostraron un incremento mayor de folato intraeritrocitario respecto del nivel basal. En el resto de parámetros no obtuvimos diferencias significativas entre los genotipos. Tampoco hubo diferencias para este genotipo al distribuir a la población por sexos. Estos resultados corroboran los referidos anteriormente en los trabajos de Dervieux y Weisman por los que fue seleccionado este polimorfismo bajo la hipótesis de que acumulan más folato intraeritrocitario los GG porque utilizan menos folato para la síntesis de novo de purinas. 5.3.3.2. ESR1: rs9340799 y rs2234693 Este gen codificante del ESRα presenta múltiples polimorfismos de los que hemos seleccionado dos SNPs intrónicos: el rs9340799 reconocido por la endonucleasa de restricción XbaI que resulta de una sustitución A>G y el rs2234693, reconocido por la enzima PvuII, T>C; ambos en desequilibrio de ligamiento. Se han relacionado con mayor actividad estrogénica debido a una mayor transcripción del gen del ESR1 ya que actúan a nivel unión de los factores de transcripción (Herrington et al., 2002; Schuit et al., 2005). La hipótesis que planteamos en el estudio de este receptor es la relación de la actividad estrogénica con el metabolismo de los folatos. Se ha evidenciado en múltiples trabajos que relacionan los niveles de Hcy con los diferentes niveles de 136 estrógenos en el ciclo menstrual (Tallova et al., 1999), tras la menopausia (Mijatovic and van der Mooren, 2001) y en transexuales (Giltay et al., 2013). En este mismo sentido, se han publicado trabajos que asocian un aumento de la actividad estrogénica con una disminución de los niveles de receptores de folatos (receptor α) en tejidos específicos provenientes de cánceres mamarios (Kelley et al., 2003; O’Shannessy et al., 2012). Dada la naturaleza esteroidea del estradiol, su mecanismo de acción se debe a la unión a receptores nucleares y modula de esta manera la expresión génica. Uno de los genes que regula es el de la aromatasa (CYP19). La aromatasa cataliza la conversión de esteroides de 19 carbonos a estrógenos y es esencial para la síntesis de estradiol. A través del ESR1 el estradiol puede modular a su vez la expresión del gen de CYP19 como demostraron Kinoshita y Chen en una línea celular de cáncer de mama (Kinoshita and Chen, 2003). Estos dos polimorfismos se estudian clásicamente de forma individual y por sus reconocidos haplotipos. En trabajos recientes también se han estudiado en función del número de copias AT relacionadas con menor actividad estrogénica (Schuit et al., 2005). Sobre el polimorfismo rs9340799 no se observan diferencias significativas en ninguno de los parámetros estudiados al comparar los sujetos AA con los que muestran uno o dos alelos variantes (AG-GG) en los diferentes días de tratamiento. Tampoco existe diferencia en este SNP cuando dividimos la población por género. En los sujetos que portan el alelo G apreciamos una tendencia no significativa en todos los días del tratamiento a introducir más folato dentro del hematíe ya que las variaciones porcentuales del folato intraeritrocitario fueron superiores respecto a los que son AA y el incremento sérico fue menor. El alelo G está relacionado con un aumento de la actividad del ESR1 (Herrington et al., 2002; Schuit et al., 2005). El folato sérico el día 30 en los individuos CC del polimorfismo rs2234693 presentaba un mayor incremento porcentual respecto del nivel basal frente a los CT-