Utilidad del doble marcador inmunohistoquímico p16/Ki-67 en el tratamiento quirúrgico de lesiones preneoplásicas de cuello uterino

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Medicina Departamento de Fisiología Humana, Histología Humana, Anatomía Patológica y Educación Física y Deportiva TESIS DOCTORAL UTILIDAD DEL DOBLE MARCADOR INMUNOHISTOQUÍMICO p16/Ki-67 EN EL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO DE LESIONES PRENEOPLÁSICAS DE CUELLO UTERINO Isabel María Jurado Navarrete Málaga, 2015 AUTOR: Isabel María Jurado Navarrete http://orcid.org/0000-0001-7667-0586 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Dpto de Fisiología Humana, Histología Humana Anatomía Patológica y Educación Física y Deportiva Facultad de Medicina Universidad de Málaga Dr. D. Miguel Ángel Olalla Herrera, Profesor Asociado Clínico del Departamento de Bioquímica, Cirugía, Obstetricia y Ginecología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga y Coordinador de la Unidad de Patología del Tracto Genital Inferior del Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga. Dra. Dª María Victoria Ortega Jiménez, Facultativo Especialista de la UGC de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga y Profesora Asociada Clínico del Departamento de Fisiología Humana, Histología Humana, Anatomía Patológica y Educación Física Deportiva de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga. Certifican: Que el trabajo de tesis doctoral realizado por Dª Isabel María Jurado Navarrete ha sido ejecutado bajo nuestra dirección y lleva como título “UTILIDAD DEL DOBLE MARCADOR INMUNOHISTOQUÍMICO p16/Ki-67 EN EL TRATAMIENTO QUIRÚRGICO DE LESIONES PRENEOPLÁSICAS DE CUELLO UTERINO”. Que dicho trabajo versa sobre un tema original de investigación y tiene el suficiente rigor científico para que, de acuerdo con la normativa legal vigente, sea presentado en esta Facultad, al objeto de obtener el Grado de Doctor en Medicina y Cirugía. Y para que conste a los efectos legales, expedimos la presente certificación. Fdo. Dr. Miguel Ángel Olalla Herrera Fdo. Dra. Mª Victoria Ortega Jiménez A mi marido y mi hija AGRADECIMIENTOS Esta tesis es un esfuerzo el cual, directa o indirectamente, requiere de la participación y colaboración de un equipo de personas sin las cuales este proyecto no hubiese sido posible. A todas ellas, que invirtieron su tiempo y sus conocimientos, y me ayudaron en este largo y difícil camino quiero agradecerles su apoyo. En primer lugar, me gustaría agradecer a mis directores de tesis el apoyo mostrado:  Al Dr. Miguel Ángel Olalla Herrera, por brindarme esta oportunidad y otras muchas en mi camino laboral y personal, y por transmitirme día a día su entusiasmo, su capacidad de trabajo y su saber. Por su apoyo incondicional, sin su ayuda no hubiera sido posible la realización de este trabajo.  A la Dra. María Victoria Ortega Jiménez, quien me animó y confió en mí para llevar a cabo este proyecto, por transmitirme en todo momento su ilusión y su energía. A la Dra. Martina Álvarez Pérez, Profesora del Dpto. de Histología y Anatomía Patológica de la Facultad de Medicina de Málaga, por sus valiosos consejos, y por demostrarme que con esfuerzo y trabajo se puede alcanzar cualquier meta. Y a otros profesionales del Departamento, como María José Lozano León, por su trabajo en la realización de la técnica inmunohistoquímica. A mi marido, Pepe, pilar fundamental en mi vida, fuente inagotable de energía y optimismo, que está siempre a mi lado, ayudándome a superar las dificultades. Gracias por tu cariño, por estar en los momentos difíciles y convertir los problemas en soluciones. A mi hija, Paloma, por su amor, y llenar mi vida de besos y abrazos. A mis padres, ejemplo y modelo vital, los primeros que inculcaron en mí el espíritu de trabajo y esfuerzo, sin ellos no habría llegado hasta aquí. A mis hermanos, que siempre han creído en mí y desde la distancia me han apoyado en todo. Al Dr. Luis Cóndor Muñoz, primero y al Dr. Agustín Eslava Martín después, directores de la UGC de Obstetricia y Ginecología del Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga, que confiaron en mí y me alentaron en todo momento a lo largo de estos años. A todos/as mis compañeros/as de la UGC de Obstetricia y Ginecología del Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga, por su inestimable ayuda y estímulo prestado y, en especial, a Susana Pérez Rodríguez, por su maravillosa forma de ser y toda la colaboración prestada para conseguir finalizar el proyecto que empezamos juntas. A María Dolores Garcés Chaves, auxiliar de enfermería de la consulta de Patología del TGI de dicho Hospital, por su buena predisposición, ha estado todo este tiempo escuchando los devenires del día a día de esta tesis, siempre apoyando y ayudando en todo lo posible, haciendo más liviano el peso del trabajo. Gracias por tu infinita paciencia y tu sonrisa permanente. Quiero así mismo resaltar las facilidades y apoyo manifestado por los profesionales de la UGC de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen de la Victoria, en la búsqueda de datos, muestras y material utilizados en esta memoria, y en especial al Dr. Carlos González Hermoso y a la Dra. Isabel Hierro Martín. Hago extensivo mi más cordial agradecimiento a todo el Servicio de Documentación Clínica del mismo hospital por su esfuerzo, dedicación y comprensión hacia mi persona para con el cometido de finalizar dicha memoria. Y en última instancia, a todas las personas que han contribuido a que este proyecto haya sido posible, quiero expresarles mi cariño y mi agradecimiento más sincero. GLOSARIO DE ABREVIATURAS ACOG: American College of Obstetrician and Gynecologist ACS: American Cancer Society ADN: Ácido desoxirribonucleico AEPCC: Asociación Española de Patología Cervical y Colposcopia AGUS: Atypical glandular cells of undetermined significance (células glandulares atípicas de significado incierto) ARN: Ácido ribonucleico ASC-H: Atypical squamous cells can not exclude HSIL (células escamosas atípicas de significado incierto sin poder descartar lesión escamosa intraepitelial de alto grado) ASC-US: Atypicall squamous cells of undetermined significance (células escamosas atípicas de significado incierto) CIN: Cervical intraepithelial neoplasia (neoplasia intraepitelial cervical) CIS: Carcinoma in situ CCU: Cáncer de cuello uterino CNE: Centro Nacional de Epidemiología DIU: Dispositivo intrauterino FDA: Food and Drug Administration HC2: Hybrid Capture 2 (Captura Híbrida 2) HE: Hematoxilina-Eosina HSIL: High grade squamous intraepithelial lesion (lesión escamosa intraepitelial de alto grado) HUVVM: Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga IARC: International Agency for Research on Cancer (Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer) IFCPC: International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy LEC: Legrado endocervical LEEP: Loop electrosurgical excision procedure (gran escisión con asa de la zona de transformación) LLETZ: Large loop excision of the transformation zone (gran escisión con asa de la zona de transformación) LSIL: Low grade squamous intraephitelial lesion (lesión escamosa intraepitelial de bajo grado) NS: No significación estadística PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) pRB o pRb: Proteína del retinoblastoma SEAP: Sociedad Española de Anatomía Patológica SEC: Sociedad Española de Citología SEE: Sociedad Española de Epidemiología SEGO: Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia SIL: Squamous intraephitelial lesión (lesión intraepitelial escamosa) SIL-AG: lesión intraepitelial escamosa de alto grado SIL-BG: lesión intraepitelial escamosa de bajo grado TGI: Tracto Genital Inferior UEC: Unión escamocolumnar VHS: Virus del Herpes Simple VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana VPH: Virus del Papiloma Humano VPH-AR: VPH de Alto Riesgo VPH-BR: VPH de Bajo Riesgo VPN: Valor predictivo negativo VPP: Valor predictivo positivo WHO: World Health Organization (OMS: Organización Mundial de la Salud) ZT: Zona de transformación ÍNDICES ÍNDICES viii Figura 47. Localización horaria de las lesiones colposcópicas. ................................................. 113 Figura 48. Localización por cuadrantes de las lesiones colposcópicas. .................................... 114 Figura 49. Lesión que alcanza endocérvix colposcópicamente................................................. 115 Figura 50. Lesión colposcópica que alcanza OCE y lesión histológica. ...................................... 116 Figura 51. Localización de la afectación de los bordes quirúrgicos. ......................................... 117 Figura 52. Grado de lesión histológica y localización del margen quirúrgico afectado. ........... 118 Figura 53. Lesión histológica y afectación glandular. ................................................................ 120 Figura 54. Lesión histológica y legrado endocervical postconización. ...................................... 121 Figura 55. Cirujano responsable de la conización. .................................................................... 122 Figura 56. Ampliación del tratamiento quirúrgico. ................................................................... 123 Figura 57. Persistencia de genotipos del VPH postconización. ................................................. 127 Figura 58. Tiempo de seguimiento. ........................................................................................... 129 Figura 59. Tinción dual y grado de lesión histológica con márgenes afectos. .......................... 131 Figura 60. Tinción dual, persistencia de VPH postcono y grado de lesión histológica cervical. A: SIL-AG. B: SIL-BG. ....................................................................................................................... 135 ÍNDICES ix ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación epidemiológica de los papilomavirus30 ..................................................... 13 Tabla 2. Cofactores de persistencia y progresión (carcinogénesis). ........................................... 26 Tabla 3. Pruebas para la detección de VPH aprobadas por la FDA para su utilización en el cribado poblacional129. ................................................................................................................ 45 Tabla 4. Comportamiento diagnóstico de la tinción dual para CIN2+. ....................................... 52 Tabla 5. Distribución de la muestra del test dual p16/Ki-67 en las conizaciones con bordes afectos. ........................................................................................................................................ 79 Tabla 6. Parámetros descriptivos de la edad. ............................................................................. 83 Tabla 7. Grupos de edad (frecuencia absoluta y relativa)........................................................... 83 Tabla 8. Descriptores de edad media de las pacientes por tipo de lesión. ................................. 84 Tabla 9. Relación entre la edad (grupos etáreos) y lesión histológica. ...................................... 85 Tabla 10. Nacionalidad de las pacientes. .................................................................................... 86 Tabla 11. Relación entre lesión histológica y menopausia. ........................................................ 87 Tabla 12. Parámetros descriptivos de la edad del primer coito. ................................................ 88 Tabla 13. Relación entre la edad de la primera relación sexual y lesión cervical. ...................... 90 Tabla 14. Parámetros descriptivos del número de parejas sexuales. ......................................... 91 Tabla 15. Relación entre lesión histológica y número de parejas sexuales. ............................... 92 Tabla 16. Relación entre el grado de lesión cervical y consumo de tabaco. ............................... 94 Tabla 17. Distribución de frecuencias del número de partos. .................................................... 95 Tabla 18. Relación entre lesión histológica y número de partos. ............................................... 96 Tabla 19. Relación entre el grado de lesión cervical y el uso de anticoncepción hormonal. ..... 98 Tabla 20. Relación entre lesión histológica y estado inmunológico. ........................................ 100 Tabla 21. Diagnóstico citológico. ............................................................................................... 101 Tabla 22. Biopsia cervical dirigida por colposcopia. .................................................................. 102 Tabla 23. Descriptores de infección por VPH ........................................................................... 103 Tabla 24. Descriptores del tipo de infección VPH. .................................................................... 103 ÍNDICES x Tabla 25. Relación entre el grado de lesión histológica y el resultado del riesgo del estudio molecular del VPH. .................................................................................................................... 104 Tabla 26. Genotipos del VPH preconización (frecuencia absoluta y relativa). ......................... 106 Tabla 27. Lesión histológica cervical y genotipo del VPH. ......................................................... 108 Tabla 28. Resultados del examen colposcópico. ....................................................................... 110 Tabla 29. Relación entre el grado de lesión histológica y los hallazgos colposcópicos. ........... 112 Tabla 30. Tamaño de la lesión colposcópica. ............................................................................ 114 Tabla 31. Relación entre lesión colposcópica que alcanza endocérvix y grado de lesión histológica. ................................................................................................................................ 116 Tabla 32. Relación entre la lesión histológica y la localización de la afectación de los márgenes quirúrgicos. ................................................................................................................................ 118 Tabla 33. Relación entre el grado de lesión histológica cervical y afectación glandular. ......... 119 Tabla 34. Relación entre el grado de lesión histológica y legrado endocervical postconización. ................................................................................................................................................... 121 Tabla 35. Descriptores de infección por VPH postconización. .................................................. 124 Tabla 36. Relación entre el grado de lesión histológica y el estudio molecular del VPH postconización........................................................................................................................... 125 Tabla 37. Relación entre la persistencia del VPH postcono y grado de lesión histológica de cérvix. ........................................................................................................................................ 126 Tabla 38. Genotipos del VPH postconización (frecuencia absoluta y relativa). ........................ 127 Tabla 39. Lesión histológica cervical y persistencia de genotipos del VPH postratamiento. .... 128 Tabla 40. Relación entre la tinción dual y el grado de lesión histológica con márgenes afectos. ................................................................................................................................................... 130 Tabla 41. Relación entre la tinción dual y la localización de la afectación de los márgenes quirúrgicos. ................................................................................................................................ 131 Tabla 42. Relación entre la tinción dual y el grado de lesión histológica con márgenes indemnes. .................................................................................................................................. 132 Tabla 43. Relación entre tinción dual y persistencia de VPH postcono. ................................... 133 ÍNDICES xi Tabla 44. Relación entre la tinción dual y el resultado del riesgo del estudio molecular del VPH postconización........................................................................................................................... 134 Tabla 45. Distribución de la expresión de p16/Ki-67 con el grado de lesión histológica cervical y la persistencia del VPH postconización. .................................................................................... 135 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 2 1. CÁNCER DE CUELLO UTERINO Uno de los descubrimientos más importantes en la investigación etiológica del cáncer de los últimos 25 años ha sido la demostración de la relación causal entre la infección persistente por ciertos genotipos del VPH y el posterior desarrollo de cáncer de cuello uterino (CCU). La evidencia científica acumulada a partir de estudios virológicos, moleculares, clínicos y epidemiológicos ha permitido demostrar y describir de forma inequívoca que el CCU es en realidad una secuela a largo plazo de una infección de transmisión sexual no resuelta, por genotipos oncogénicos del VPH1. 1.1. Epidemiología Los programas de screening del cáncer de cérvix han reducido la incidencia y la mortalidad del CCU en aquellos países en los que se han implantado2. A pesar de ello, el cáncer de cérvix representa a nivel mundial el segundo cáncer más frecuente (tras el de mama) en mujeres entre 15 y 44 años, y la tercera causa de mortalidad por cáncer entre las mujeres3. Los casos de incidencia en la población femenina en el año 2010 han sido 585.278 y como causa de muerte se ha asociado a 327.899 mujeres4. Cerca del 83% de los casos se producen en países en vías de desarrollo5, principalmente en Asia, África y Sudamérica, donde el cáncer cervical constituye el 15% del total de los cánceres femeninos. Sin embargo, en los países industrializados el CCU supone alrededor del 3,6% de los nuevos casos de cáncer6. Las tasas de incidencia de CCU varían entre las regiones del mundo (Figura 1)4: las tasas más altas están en las regiones del Este Africano, específicamente en Zimbabwe y Uganda con tasas de incidencia estandarizada por edad (TEE) de 47.3 y 45.8 casos por 100.000 mujeres respectivamente; y en América Latina, donde la ciudad de Trujillo en Perú reporta el nivel más alto en el continente (43.9 por 100.000); mientras que las tasas de incidencia más baja se han encontrado en Israel y en Egipto (2.4 y 2.1 por 100.000)7, 8. INTRODUCCIÓN 3 Figura 1. Tasas de incidencia de cáncer de cuello uterino estandarizadas por edad por 100.000 mujeres. (Fuente: GLOBOCAN 2008)4. Las tasas de incidencia son muy variables entre los distintos países de Europa, así pueden oscilar desde los 4.7 casos/100.000 mujeres en Finlandia y los 27.4 casos por 100.000 mujeres en Serbia y Montenegro3, 9. En general las tasas más bajas se encuentran en los países del Norte de Europa, mientras que las más altas se observan en los países del Sur y Este de Europa, Serbia y Montenegro, Bosnia, Albania, Rumania y Bulgaria. En España la tasa de incidencia estimada es de unos 8.2 casos por 100.000 mujeres, siendo una de las menores dentro de la Unión Europea, después de Finlandia, Malta, Grecia, Holanda e Irlanda. En España los tumores genitales representan alrededor del 16% de los cánceres de la mujer. Y dentro de los mismos, el orden de frecuencia coloca en primer lugar al cáncer de endometrio (6,7%), en series actuales es seguido del cáncer de ovario (4.7%) y del cáncer de cérvix (4.5%). La incidencia de CCU en España se halla en el segmento bajo europeo, con una tasa poblacional media de 7,6 por 100.000/año (Figura 2)10, según los datos comunicados por los registros de cáncer españoles a la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer (IARC) dependiente de la Organización Mundial de la Salud INTRODUCCIÓN 4 (OMS)11, 12. La tasa más alta ha sido comunicada por el registro de Asturias (11.5 por 100.000 mujeres/año; tasa ajustada por edad: 7,1 por 100.000 mujeres/año) y la más baja por el de Zaragoza (6.5 por 100.00 mujeres/año; tasa ajustada por edad: 4.1 por 100.000 mujeres/año). En Andalucía, sólo se dispone del registro de Granada, que ha comunicado a partir de datos obtenidos en el periodo comprendido entre 1998 y 2002 una incidencia de 8.1 por 100.000 mujeres/año (tasa ajustada por edad: 6.0 por 100.000 mujeres/año). Figura 2. Estimación de tasas estandarizadas por edad de incidencia y mortalidad de cáncer de cérvix en España10. INTRODUCCIÓN 5 1.2. Mortalidad Las tasas de mortalidad son sustancialmente inferiores a la incidencia. En todo el mundo, la relación entre mortalidad e incidencia es del 52% (Figura 3)13. El CCU es responsable de unas 280.000 muertes en el mundo y un 85% de ellas ocurren en países en vías de desarrollo. El cáncer de cérvix en Europa es la séptima causa de mortalidad por cáncer, pero en las mujeres de 18 a 45 años, es la segunda causa. En la Unión Europea se estima que este tumor fue responsable de unas 16.000 muertes en el año 200414. Figura 3. Tasas de incidencia y mortalidad de cáncer de cérvix estandarizada por edad (x100.000) (según la población mundial)13. INTRODUCCIÓN 6 En España las tasas de mortalidad por cáncer ajustadas a población europea han sido publicadas por el Centro Nacional de Epidemiología (C.N.E.) en el proyecto Ariadna15. La media española de mortalidad por CCU en el año 2007 fue de 2.1 por 100.000 mujeres. Dentro de España la tasa de mortalidad varía según las Comunidades Autónomas. Melilla tiene una de las mayores tasas (7.11 muertes/100.000 mujeres), seguida de Canarias, Asturias, Baleares y Galicia (3 muertes/100.000 habitantes entre los años 1996 y 2000). La mortalidad por CCU ajustada a la población europea en las provincias andaluzas es la siguiente: Granada (0.97/100.000 mujeres), Córdoba (1.13/100.000 mujeres), Cádiz (1.70/100.000 mujeres), Sevilla (1.70/100.000 mujeres), Málaga (1.76/100.000 mujeres), Almería (2.04/100.000 mujeres), Jaén (2.71/100.000 mujeres) y Huelva (4.49/100.000 mujeres)16. Las tasas de supervivencia son muy variables a nivel mundial. Así en Estados Unidos la tasa de supervivencia a los 5 años se sitúa en torno al 72%2, en Europa en el 63%17 y en África la supervivencia a los 5 años supone sólo el 30.5%18. En Europa la supervivencia es variable entre los diferentes países, siendo significativamente mayor en los países del Norte y por el contrario sensiblemente menor en países como Polonia, Portugal o España17. La revisión de los datos aportados por casi 50 registros, europeos entre los años 1988 y 1999 ha permitido analizar la evolución de la supervivencia a este tumor. Globalmente la supervivencia ha mejorado en toda Europa pasando del 64.8% hasta el 66.1%. Aún así, cabe destacar que en los últimos años se ha producido una ligera disminución debida al incremento del riesgo observado entre las mujeres mayores19. INTRODUCCIÓN 13 Tabla 1. Clasificación epidemiológica de los papilomavirus30 (en función de su riesgo de transformación neoplásica). Clasificación filogenética Clasificación epidemiológica Alto riesgo Bajo riesgo Alto riesgo 16,18, 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 82, 26*, 53*, 66* 70 Bajo riesgo 73 6,11,40,42,43,44, 54,61,72,81, CP6108 *Probable Alto riesgo. Esta clasificación epidemiológica tiene una importante implicación para la puesta en marcha de estrategias de cribado, mediante detección de ADN de VPH sobre todo para los genotipos de alto riesgo. En función de su tropismo se clasifican en cutáneos y mucosos. Los primeros se detectan en lesiones como verrugas cutáneas, en enfermos con epidermoplasia verruciforme y en algunos cánceres de piel no melanoma. En relación con su potencial oncogénico, los mucosos se clasifican de alto (VPH-AR) y de bajo riesgo (VPH-BR). Datos procedentes de 11 estudios de casos y controles realizados en diferentes países han identificado genotipos virales de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82); y de bajo riesgo (6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 61, 70, 72, 81 y 84)31, 32. El 6 y 11 son responsables de verrugas genitales o condilomas acuminados. De los VPH-AR los más comunes son el 16, detectable en el 60% de todos los cánceres, siendo también el más persistente. De otro 10% son responsables el 18, 31 y 45, éste último principalmente responsable de los carcinomas invasivos de presentación temprana, sobre todo en mujeres jóvenes, y otros presentes en lesiones invasivas como son el 33, 35, 52 y 5825. INTRODUCCIÓN 14 2.3. Prevalencia de la infección por el VPH El VPH representa la infección de transmisión sexual más frecuente. Su prevalencia es muy elevada en varones y en mujeres jóvenes sexualmente activos. En la segunda década de la vida se estima una prevalencia del 20-25%, pero en algunos grupos de adolescentes o de mujeres jóvenes la infección llega a afectar hasta un 70% de individuos33. En la tercera década la prevalencia disminuye, y a partir de los 35 años se mantiene estable en unos valores próximos al 5%34. La detección de los tipos de VPH mediante técnicas de PCR presenta una gran variabilidad en la población general, según la edad y la situación geográfica, tal y como se ha puesto de manifiesto en un análisis combinado llevado a cabo por la IARC35, y en un meta-análisis de estudios publicados36. En mujeres asintomáticas de la población general, la prevalencia de infección por VPH oscila entre un 2% y un 44%37. Un meta-análisis reciente ha estimado la prevalencia del VPH en mujeres con resultados normales en la citología de Papanicolaou a partir de datos procedentes de 78 estudios publicados36. La prevalencia total ajustada es del 10.41%, con una variabilidad regional considerable que varía desde un 8.08% en Europa hasta un 22.12% en África. Se estima que alrededor de 105 millones de estas infecciones serán debidas a los tipos 16 o 18. El análisis combinado de la IARC35 utilizó el mismo método de PCR para evaluar muestras recogidas sistemáticamente en todo el mundo y sus resultados corroboran, en general, estas observaciones. Los resultados de otro meta-análisis también ponen de manifiesto que la prevalencia es máxima en mujeres jóvenes y disminuye en los grupos de mediana edad38. Un estudio de prevalencia de infección por VPH en mujeres con resultados citológicos normales, realizado en 5 continentes39, destaca una prevalencia global estimada del 11.7% (Figura 7). INTRODUCCIÓN 15 Figura 7. Prevalencia de la infección por VPH en distintas áreas geográficas en mujeres con citología normal39. Se estima que los tipos 16 y18 son responsables del 70% de casos de CCU en todo el mundo. La prevalencia relativa del VPH 18 es más importante en el adenocarcinoma que en el carcinoma escamoso de cérvix40. En el estudio CLEOPATRE41, diseñado para medir la prevalencia de la infección por VPH, con una muestra de 3.200 mujeres españolas entre 18 y 65 años, se obtuvo una prevalencia global en este grupo de edad del 14%. Si se calcula este porcentaje para el grupo de edad entre 19 y 25 años el valor aumenta a un 25-30%. En Málaga, la prevalencia del VPH en mujeres climatéricas de más de 50 años con citología normal es del 11.43%42-44. El genotipo más frecuente fue el VPH 16 seguido del VPH 58, 51 y 18. Este pico de infección en mujeres alrededor de la menopausia puede ser debido a una reactivación de infecciones latentes, causadas por una pérdida gradual de la inmunidad o por infecciones nuevas que ocurren en el período perimenopáusico. INTRODUCCIÓN 16 La Figura 8 muestra la distribución de los tipos de VPH en mujeres con citología normal, LSIL, HSIL y cáncer de cérvix en España, según el estudio publicado por el ICO HPV Information Centre45 en Marzo de 2015. Figura 8. Distribución de los tipos de VPH en mujeres con citología normal, LSIL, HSIL y cáncer de cérvix en España45. Datos actualizados al 12 Diciembre 2014. High-grade lesions: CIN-2, CIN-3, CIS o HSIL; Low-grade lesions: LSIL o CIN-1. INTRODUCCIÓN 17 2.4. Transmisión de la infección por el VPH. Mecanismo de regulación del ciclo celular El virus se transmite con facilidad por contacto sexual, probablemente a través de erosiones mínimas o imperceptibles de la piel o las mucosas. Aunque la transmisión coital sea probablemente la vía más frecuente de contagio del cuello de útero, en las mujeres con relaciones homosexuales46 se han presentado infecciones del área anogenital y una extensión a partir de ésta, por autoinoculación, a otra localización del epitelio del tracto genital, como el cuello uterino. Es probable que el contacto sexual explique las vías de exposición a una infección por el VPH por contacto y entrada a la zona de transformación47. Por razones desconocidas, se suele iniciar el proceso oncogénico en estas áreas denominadas “zonas de transformación” que corresponden a la zona de transición del epitelio escamoso del exocérvix a epitelio glandular endocervical. La situación anatómica de esta región es dinámica, según la edad, respecto de la posición que ocupa en el canal endocervical. Estas son áreas de epitelio glandular, expuestas a un medio (región exocervical) que no es el habitual, en las que un tipo de epitelio entra en contacto con otro y lo sustituye progresivamente, realizando esta adaptación mediante un proceso de transformación denominado metaplasia. El cuello uterino, el ano y las amígdalas son ejemplos de zonas de transformación susceptibles de carcinogénesis. El virus se introduce en el epitelio a través de varios mecanismos: micro-trauma durante la relación sexual o mediante contacto directo con piel u objetos infectados. En el embarazo y en el período perinatal es posible el paso del VPH de forma ascendente y vertical. El virus infecta a células del estrato basal, algunos virus tienen un estado latente, donde hay poca replicación viral, manteniendo el genoma en estado silente o con poca expresión génica, aprovechando la maduración del epitelio donde el virus se replica de manera masiva (de 50 a100 copias)48. El ciclo vital de los VPHs se encuentra estrechamente ligado al programa de diferenciación de su célula huésped. El epitelio escamoso está formado por 20 o 30 capas de células, de las cuales solamente la capa basal más interna se divide de forma activa. INTRODUCCIÓN 18 Los VPHs al igual que otros virus, aprovechan la dinámica celular para replicarse, y en el cérvix se benefician de la maduración del epitelio metaplásico para poder expresar sus genes de forma secuencial; en primer lugar en las capas basales son los genes tempranos (E1…E7) y después en las capas superficiales más diferenciadas se expresan sus proteínas tardías (L1 y L2), que forman la cápside y permiten el ensamblaje de nuevas partículas virales que se liberan y repiten el ciclo infeccioso. En las capas intermedias, tanto células como virus se replican en tándem, sin haber amplificación de las copias del virus y con poca expresión de los genes anteriores. Tras la infección, el virus se establece en las células basales, en forma de episomas (DNA no integrado), con algunas decenas de copias de genoma viral por célula que se replican coordinadamente con la replicación celular. Cuando las células emigran hacia estratos superiores y se diferencian, la replicación celular cesa, pero en algunas formas de infección, el genoma viral se amplifica en las células escamosas superficiales hasta llegar a varios miles de copias por célula. Además, al llegar a estos estratos altos, y sólo en ellos, se activan los genes tardíos, dando lugar a la producción de proteína de la cápside con aparición de viriones completos (Figura 9)49. Figura 9. Ciclo vital de los VPH-AR en el epitelio cervical49. En las capas superiores, donde el epitelio es diferenciado, el virus se amplifica sin replicación celular, llegando a alcanzar 1.000 copias de genoma viral por célula. En este momento, comienzan a expresarse los genes de las proteínas estructurales (L1 y L2), así como el de la proteína E4, produciéndose el ensamblaje de la cápside del virus. INTRODUCCIÓN 19 Las células superficiales en las que se acumulan numerosos viriones completos muestran características morfológicas peculiares y reciben el nombre de coilocitos. También se admite que el virus puede permanecer latente en las células basales del epitelio50. El virus infecta la célula, produciendo lesiones en un período de tiempo que puede durar de semanas a meses, induciendo una replicación viral sin viremia detectable, ya que las células dianas finales son los queratinocitos diferenciados51. Estas células están destinadas a descamarse en el estrato superficial del epitelio, donde no se producen señales de peligro obvias que alerten al sistema inmune, por lo que las lesiones no van acompañadas de inflamación. Tras la infección, se pueden detectar anticuerpos circulantes contra la proteína viral de la cápside L1, con tendencia decreciente en las 2-3 semanas siguientes, manteniéndose niveles bajos de anticuerpos estables y detectables a lo largo del tiempo. La seroconversión confiere inmunidad tipoespecífica frente a futuras infecciones, habiéndose descrito cierto grado de inmunidad cruzada entre distintos genotipos virales52. En el tracto genital, el VPH se transmite por contacto piel con piel, o mucosa con mucosa, teniendo ciertos genotipos especial tropismo tanto en mujeres como en hombres. Ello da lugar a infecciones subclínicas de la piel en la región genital, las cuales pueden ser detectadas por técnicas que identifiquen la presencia/ausencia de ADN del virus. Una pequeña proporción de estas infecciones pueden manifestarse como enfermedad benigna o maligna. En el tracto genital femenino, puede causar condilomas acuminados, lesiones precancerosas o lesiones cancerosas. El VPH se implica también en la etiología del cáncer anal, vulvar, vaginal, y carcinomas de cabeza y cuello. De los más de 100 genotipos de VPH asociado a infecciones, aproximadamente 40 se asocian a infecciones del tracto genital femenino26, 53. La inmunidad celular contra la infección viral es crítica en el control y aclaramiento del VPH y por tanto, en el desarrollo, persistencia y/o progresión de las lesiones displásicas54. Las células de Langerhans son las encargadas de presentar los antígenos virales a los queratinocitos, produciéndose una respuesta inmune contra la infección55. INTRODUCCIÓN 20 COFACTORES DE ADQUISICIÓN El riesgo de infectarse por el VPH está relacionado con el comportamiento sexual: edad del primer coito, número de compañeros sexuales y relaciones sexuales con compañeros que tienen o han tenido múltiples parejas sexuales.  EDAD DEL PRIMER COITO: las características histológicas de la zona de transformación escamoso-cilíndrica en el exocérvix de las mujeres jóvenes, pueden explicar el mayor riesgo de infección entre las mujeres que inician tempranamente la actividad sexual56. La inmadurez cervical, las deficiencias de flujo cervical protector y la ectopia cervical aumentada pueden conducir a una mayor susceptibilidad para la adquisición de una infección por el VPH en mujeres adolescentes y adultas jóvenes.  NÚMERO DE COMPAÑEROS SEXUALES: la asociación entre el número de parejas sexuales y la probabilidad de detectar ADN del VPH en el tracto genital inferior es consistente. El tiempo que transcurre entre una pareja y otra, es otro factor influyente, ya que existe más riesgo de infección si el lapso de tiempo entre una pareja y otra es corto57.  OTRAS INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL como Chlamydias, herpes, VIH actúan como cofactores en el desarrollo de lesiones preneoplásicas y CCU. El VIH se asocia tanto a la prevalencia, como a la progresión de infecciones por VPH a lesiones neoplásicas del tracto genital inferior (TGI) y del canal anal. Las pacientes portadoras de VIH tienen más riesgo de infección por el VPH (RR: 17) y 9 veces más riesgo de desarrollar cáncer de cérvix. Es debido a las modificaciones que se producen en la inmunidad general y local de estas pacientes.  La CIRCUNCISIÓN MASCULINA actúa como factor protector frente a la infección, se asocia con un menor riesgo de infección por VPH y con menor riesgo de transmisión y progresión a cáncer de cérvix en sus compañeras sexuales58. INTRODUCCIÓN 21  El uso del PRESERVATIVO durante el contacto sexual es una barrera que disminuye la posibilidad de contagio, pero no se previene por completo la transmisión del VPH59.  CONTACTO SEXUAL CON INDIVIDUOS DE RIESGO: prostitutas, parejas que tienen a su vez múltiples compañeras/os sexuales. 2.5. Inmunidad de la infección VPH: interacción virus-huésped La presencia de partículas virales en la superficie del epitelio cervical o del TGI procede del contacto sexual con una pareja infectada. En la mayoría de las ocasiones, estas partículas virales son eliminadas de forma mecánica al ser arrastradas durante la descamación propia del epitelio estratificado, o bien por los agentes de la inmunidad inespecífica como los macrófagos. En ambos casos las partículas virales pasan desapercibidas a los agentes de la vigilancia inmune específica y no provocan efecto citopático ni respuesta inmunológica alguna. El VPH, por ser un patógeno intracelular estricto, requiere internalizarse en la célula huésped para que se considere una infección verdadera. La interrelación entre VPH y huésped es compleja y variada. En el caso del VPH no se ha encontrado un receptor celular específico que permita atajar la infección por bloqueo del mismo. Además, diferentes estudios han demostrado que la molécula de superficie que sirve de unión a los VPH está muy conservada y parece tener otra serie de funciones celulares vitales que hace imposible su utilización como diana para el bloqueo de la infección. Al contrario de lo que ocurre en otras especies virales, no parece que los receptores de superficie estén implicados en la especificidad de tejido y especie ni en el tropismo de los VPHs. Tanto el reconocimiento de la infección viral por la célula huésped como el tropismo específico de cada subtipo viral van a determinar los efectos citopáticos en los tejidos específicos. INTRODUCCIÓN 22 INMUNIDAD CELULAR E INMUNIDAD HUMORAL La inmunidad celular está representada principalmente por los linfocitos T que actúan a nivel del tejido local mediante íntimo contacto célula a célula. La respuesta humoral, por el contrario, viene mediada por las células B bajo la inducción de las células T helper. Los productos biológicamente activos de las células B son los anticuerpos (Ac), quienes serán los efectores de la respuesta inmune. Tanto las células T como los Ac tienen en común su actividad frente a los focos donde un antígeno extraño está presente, las diferencias radican en que, mientras las células T reconocen ese antígeno asociado a moléculas de la superficie celular, HLA (human leukocyte antigen), los Ac lo hacen tanto frente a antígenos presentados en superficie como frente a antígenos en forma soluble, en este último caso con mayor especificidad. A nivel molecular, los receptores de las células T, TCR (T-Cell Receptor) reconocen secuencias específicas de pequeños péptidos asociados o presentados por el propio complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), mientras que los Ac no reconocen secuencias peptídicas sino estructuras estéricas, tridimensionales, con una conformación determinada60. En términos generales, tras la primera infección de las células del epitelio cervical por VPH se desencadenan una serie de respuestas inespecíficas acompañadas de procesos inflamatorios, quimio-atracción de neutrófilos, activación de macrófagos, intervención de células natural killer (NK), de anticuerpos naturales, e incluso del sistema del complemento, que formarán una primera barrera defensiva de inmunidad inespecífica. La prolongación de la respuesta en el tiempo y la protección frente a futuras infecciones requiere mecanismos de inmunidad adaptativa o específica. En el epitelio cervical existen células específicas con capacidad de actuar como presentadoras de antígenos, son las células dendríticas de Langerhans, aunque algunos queratinocitos también desarrollan esta capacidad. Estas células fagocitan las partículas virales para digerirlas en endosomas y comenzar un proceso de activación que incluye la presentación en superficie de cadenas polipeptídicas del antígeno junto con HLA de clase II, CD40 y B7, así como la migración a los ganglios linfáticos locales. Estas células activadas serán reconocidas por linfocitos T CD4+, que serán activados, únicamente, si existe reconocimiento de todas y cada una de las moléculas de superficie implicadas: HLA de clase II a través del propio CD4, el polipéptido viral mediante el TCR, CD40 a través de CD40-ligando y B7 mediante CD28. INTRODUCCIÓN 29 VPH 16 progresan a CIN3 en el 17.2% y los VPH 18 lo hacen en el 13.6%, mientras que las infecciones por otros VPH-AR progresan en el 3% y las VPH negativas desarrollan CIN3 en el 0,8%96. Los genotipos 16, 18 y 45, tienen una integración más efectiva en el genoma celular, por lo que pueden desarrollar de forma más rápida una progresión a lesiones de alto grado97. o VARIANTES DEL VPH: las variantes del VPH 16 muestran diferencias geográficas que se han relacionado con distintos riesgos de cáncer, y las variantes no europeas están asociadas con un mayor riesgo98. Se sugiere que las variantes pueden influir en la historia natural de la infección por dos mecanismos: diferencias en su capacidad funcional o evasión del sistema inmunitario del huésped. Dadas las diferencias geográficas, es posible que su papel en la persistencia y progresión esté relacionado con polimorfismos inmunogenéticos99. o CARGA VIRAL: la carga viral es un marcador de infección persistente. Se ha sugerido que una carga viral elevada indica una mayor posibilidad de integración del ADN viral en el genoma del huésped. Sin embargo, es discutible la utilidad de medir la carga viral para pronosticar la progresión a cáncer. En mujeres con infección por el VPH 16 o 18 y citología normal, una carga viral elevada, determinada por PCR en tiempo real, se asocia con mayor riesgo de progresión a CIN y cáncer100,101. La carga viral medida mediante HC2 muestra un incremento progresivo paralelo a la gravedad de la lesión102. La presencia de cifras superiores a 100 URL se asocia con una lesión cervical en más del 90% de los casos, y esta asociación es prácticamente constante para cifras superiores a 1.000 URL. Por el contrario, un elevado porcentaje de casos con determinaciones inferiores a 10 URL no presentan lesión cervical. Sin embargo, la presencia de una baja carga viral no debe ser excluyente de una lesión grave103. o INTEGRACIÓN VIRAL: la integración del ADN viral en el ADN del huésped parece ser crucial en la transformación maligna. El riesgo de que ocurra aumenta con una elevada carga viral. Sin embargo, algunos autores apoyan la idea de que el VPH 16 es capaz de inducir la transformación maligna sin que haya integración, lo que indica que seguramente intervienen INTRODUCCIÓN 30 otros factores para que ocurra la transformación104. o COINFECCIÓN: es discutible si la coinfección con varios tipos virales aumenta el riesgo de progresión69. Algunos autores han evidenciado que la tasa de aclaramiento es independiente de la coinfección con otros tipos virales, al menos en mujeres inmunocompetentes72. La evidencia más reciente apunta a que los genotipos que coinfectan el cérvix actúan de forma independiente en el desarrollo de las lesiones cervicales.  COFACTORES DEL HUÉSPED: o INMUNOSUPRESIÓN: las mujeres con inmunosupresión secundaria a la infección por VIH o trasplantadas con tratamiento inmunosupresor, tienen mayor riesgo de desarrollar carcinomas anogenitales asociados a VPH105-109. En estas pacientes se ha comprobado a nivel cervical una disminución de linfocitos CD4, así como de células natural killer, que facilitaría la integración de ADN viral del VPH63. o HORMONAS ENDÓGENAS o FACTORES GENÉTICOS: las variaciones genéticas individuales de los genes relacionados con la respuesta inmunitaria innata, humoral y celular pueden influir en la persistencia de la infección por el VPH y su progresión a cáncer. Algunos estudios sugieren un efecto protector para HLA DRB1*130198. Con respecto a los COFACTORES DE INVASIÓN, la progresión de la neoplasia intraepitelial a cáncer invasivo requiere la expresión de factores angiogénicos que estimulan la proliferación de nuevos vasos. La angiogénesis, inducida por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y otras proteínas, como la angiogenina (ANG), es fundamental para el crecimiento del tumor, la invasión del estroma y las metástasis110. INTRODUCCIÓN 31 2.7. Oncogénesis por VPH La transformación tumoral de la célula tiene como base biológica la incapacidad de reparar los errores en la replicación del ADN mediante el bloqueo de proteínas del ciclo celular por los VPH de alto riesgo. La oncogénesis es un proceso de múltiples fases en las que se producen sucesivas alteraciones genéticas, desencadenadas por la desregulación del ciclo celular derivada de la infección por VPH-AR. Una célula no infectada y competente en sus funciones tiene un estricto mecanismo de control que se encarga de iniciar el ciclo celular y reparar el ADN previamente a cada división celular, evitando que los errores genéticos se acumulen en el genoma celular durante el proceso de replicación. Dichos errores son favorecidos por determinados cofactores, como el tabaco. Cada cambio genético es reparado con la mediación de proteínas como p53 y Rb. La presencia de secuencias genómicas de los VPHs de alto riesgo en el ADN de la célula es considerado por el sistema de control del ciclo celular como un evento irreparable y la célula infectada es conducida a la muerte celular por apoptosis. Las proteínas E6 y E7 de los VPH-AR bloquean y degradan a la proteínas del ciclo celular p53 y Rb, respectivamente (Figura 11). Figura 11. Expresión de los oncogenes virales. INTRODUCCIÓN 32 Con estas proteínas degradadas, la célula es incapaz de reparar los errores genéticos derivados de su replicación o de conducir a la célula a la muerte por apoptosis, como consecuencia se produce un estado celular de susceptibilidad a la transformación neoplásica. De la capacidad de expresión de proteínas degradantes E6 y E7 de los VPHs dependerá su capacidad de bloqueo de p53 y Rb, y esta expresión se verá modificada por factores como la carga viral, la integración del genoma viral en el genoma celular o cofactores medioambientales. Algunos experimentos han demostrado que la expresión basal de E6 y E7 en los VPH es muy baja comparado con la proteína E2, debido a la acción reguladora negativa de la región LCR, la cual mantiene prácticamente silenciada la expresión de estos genes. Por ello, en principio el VPH no sería capaz de producir suficiente cantidad de E6 y E7 como para provocar el proceso de defensa o reparación celular. Analizando la biología de la infección por VPH se ha podido demostrar que en ciertos casos y tras un proceso de integración viral en el genoma celular, generalmente por disrupción de la región E2, la región reguladora LCR, se ve afectada e impide la represión de la transcripción de E6 y E7, con la consiguiente sobreexpresión de sus proteínas oncogénicas. Así, una pequeña cantidad de virus podría producir grandes cantidades de proteínas E6 y E7, que bloquearían a p53 y Rb y se establecería el proceso de transformación neoplásica111, 112. Se ha demostrado que la integración de secuencias genómicas del VPH en el ADN huésped, no es un factor necesario para la inducción de la transformación celular, ya que en ausencia de esta integración es posible la transformación por mecanismos distintos de desregulación de la expresión de E6 y E7, e incluso la expresión basal de estas proteínas, en casos de elevadas cargas virales, puede ser suficiente para desencadenar el proceso de transformación neoplásica113. De este modo, sea por procesos de integración o por la intervención de rutas biológicas diferentes, la pérdida de E2, represor de la transcripción viral, da lugar a la expresión de los genes VPH E6 y E7, cuyas proteínas virales se expresan constantemente en los carcinomas cervicales114. INTRODUCCIÓN 33 En los cánceres asociados a VPH-AR, los oncogenes E6 y E7 actúan sobre reguladores críticos de procesos celulares, y por tanto la expresión de estas oncoproteínas ocasiona múltiples cambios celulares oncogénicos115. Las oncoproteínas E6 y E7 contribuyen al desarrollo inicial y progresión del tumor. La E7 bloquea la frenación del ciclo celular G1/S al degradar la proteína supresora retinoblastoma Rb y liberar el factor de transcripción E2F. Esto motiva un inicio aberrante del ciclo que, en condiciones normales, motivaría la activación de la proteína supresora p53 y causaría la muerte celular. Contrariamente, a su vez la E6 degrada la p53 permitiendo que las células experimenten una persistencia de la proliferación aberrante. Para evitar la erosión de la telomerasa, que resultaría de la división celular continuada, la E6 activa asimismo la transcripción de hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase) que causa la inmortalización de las células. Las oncoproteínas E6 y E7 actúan, además, como modificadores de las mitosis, aumentando la probabilidad de adquirir mutaciones celulares adicionales que contribuyen a la progresión carcinogénica durante la división celular. Estas proteínas también se han implicado en la desregulación de otros eventos asociados con la progresión maligna, como la transición del epitelio al estroma y la angiogénesis115. INTRODUCCIÓN 34 3. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN VIRAL 3.1. Métodos de prevención secundaria: cribado poblacional La medicina preventiva establece la prevención secundaria de una enfermedad como su detección precoz o cribado (en inglés: screening), dirigida a identificarla en una fase subclínica y tratarla para evitar su progresión. En Europa se han unificado los criterios para el cribado del cáncer, que se recopilaron en unas Recomendaciones del Consejo de la Unión Europea116. Sólo tres neoplasias reúnen los criterios aceptados: cáncer de cérvix (citología), cáncer de mama (mamografía) y cáncer colo-rectal (sangre oculta en heces-colonoscopia). El test de cribado no está diseñado para realizar un diagnóstico, sino para clasificar a una población asintomática como “probable” o no de tener o poder desarrollar un cáncer. El test ideal debe reunir las siguientes características: sencillo, inocuo, fácil de usar, económico y validado clínicamente. 3.1.1. Citología La prevención secundaria del CCU mediante la citología de Papanicolaou se inició a mediados del siglo pasado con la implementación del cribado citológico periódico. El cribado tiene como objetivo detectar lesiones precursoras en el epitelio cervical que serían el antecedente del cáncer invasor. La larga duración de las lesiones que lo preceden y el hecho de que puedan detectarse mediante la citología y ser tratadas de forma adecuada permiten la prevención del carcinoma invasor. La citología de Papanicolaou consiste en la toma, observación e interpretación de una muestra de células del cérvix (Figura 12). Es fundamental que la toma sea correcta, obteniendo el material directamente del endocérvix y del exocérvix. Esta prueba detecta cambios inflamatorios, infecciosos o la presencia de células anormales y neoplásicas. De la citología cervical no debe esperarse un diagnóstico sino un resultado, normal o anormal. Las citologías anormales detectan mujeres potencialmente afectas de lesiones cervicales. INTRODUCCIÓN 35 Figura 12. Citología cervical. Los programas organizados de cribado poblacional mediante la citología han demostrado su efectividad al disminuir la incidencia y mortalidad por CCU en los países donde se han aplicado de forma masiva. En los últimos 50 años el cribado citológico ha reducido la morbi-mortalidad por cáncer cervical en un 75-80%, en los países donde se ha aplicado con una estrategia poblacional con cobertura suficiente y continuada117. La Unión Europea, la American Cancer Society (ACS)118 y el American College of Obstetrician and Gynecologist (ACOG)119 recomiendan la citología como técnica de cribado para el carcinoma de cérvix, siendo su principal limitación su baja sensibilidad. Las citologías deben ser interpretadas y por lo tanto están sujetas a error. Para hacer más homogénea la lectura, se han propuesto varios sistemas de clasificación. En la actualidad el más usado es la clasificación de Bethesda120 (Figura 13), elaborado en el año 2001 “The Bethesda System-2001” en la que no sólo se clasifican los hallazgos sino que se requiere la valoración de la muestra, es decir, si es o no adecuada. La verdadera innovación de esta clasificación consiste en considerar a las alteraciones celulares por VPH como lesiones intraepiteliales de bajo grado (LSIL), displasia leve o CIN1, además de unificar bajo el término de lesiones intraepiteliales de alto grado (HSIL) a las displasias moderadas y severas, CIN2 y CIN3 o carcinoma in situ. INTRODUCCIÓN 36 Figura 13. Sistema de Clasificación Bethesda120. Sabemos que la sensibilidad de la citología para la detección de CIN2+ se sitúa alrededor del 50%, no superando el 80% en las mejores condiciones de calidad. Esta sensibilidad es alrededor de un 40% inferior a la de las pruebas clínicamente validadas para la detección del VPH121. Esta sensibilidad relativamente baja se debe a la variabilidad del material obtenido en la toma, a la calidad de la extensión citológica y a la preservación de la muestra, así como a la distinta capacidad de detección e interpretación de las características microscópicas por parte de los profesionales. La baja sensibilidad de una única citología ha sido compensada en muchos programas con el aumento de frecuencia de realización de la prueba, facilitado por el relativo bajo coste de la misma. Por otra parte, la especificidad de la citología es elevada, dado que el diagnóstico citológico es un diagnóstico morfológico de la lesión y no de una infección subclínica que puede no comportar alteraciones celulares a la larga. Sin embargo, esta especificidad puede verse afectada en función de la cantidad de diagnósticos indefinidos (atipias de significado indeterminado/ASC-US) que emita cada laboratorio122. INTRODUCCIÓN 37 • Citología en medio líquido Recientemente se han desarrollado técnicas que permiten obtener preparaciones en una sola capa celular (citología en monocapa, capa fina o en medio líquido). El material obtenido es conservado en un medio líquido, normalmente de base alcohólica, que permite su almacenaje y transporte, y la extensión se realiza en el laboratorio. Su principal ventaja es que el material remanente conservado permite realizar técnicas adicionales, como la determinación de VPH o de inmunocitoquímica123. Se ha descrito un discreto incremento de la sensibilidad con este tipo de citología, pero especialmente disminuye los casos inadecuados para diagnóstico. La citología en medio líquido supone un incremento del tiempo de procesamiento técnico, pero una disminución del tiempo de estudio microscópico ya que la interpretación de la morfología celular es más sencilla (menos artefactos como sangre, inflamación, defecto de fijación)124. La mejor calidad de extensión ha permitido la aplicación de nuevos métodos de lectura automatizada de la citología mediante el uso de sistemas basados en análisis de imagen. En definitiva, la mayoría de países industrializados han incorporado la citología en medio líquido en sus laboratorios125 basándose en que: disminuye el número de muestras insatisfactorias, requiere menor tiempo de estudio microscópico, permite realizar pruebas complementarias y permite la lectura automatizada. • Citología con sistemas de lectura automatizada Aplica el análisis de imagen y la morfometría para la medición de la densidad óptica de los núcleos o la relación núcleo/citoplasma, con tal de agilizar y estandarizar el primer cribado de las preparaciones citológicas que realizan los citotécnicos. Actualmente, existen dos sistemas de lectura aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) estadounidense, el BD Focal Point® de Becton Dickinson y el ThinPrep Imager® de Hologic. Estos sistemas localizan las células atípicas durante el proceso de cribado lo que permite centrar la atención en un número limitado de campos microscópicos a estudiar. Se ha destacado una mejor eficiencia pero no hay acuerdo sobre una mayor sensibilidad y especificidad en la detección de lesiones precursoras126, 127. INTRODUCCIÓN 38 GUÍA DE CRIBADO DEL CÁNCER DE CUELLO DE ÚTERO EN ESPAÑA En España, en el año 2006, se alcanzó el consenso para el cribado del cáncer cervical, en el que participaron las Sociedades Españolas de Ginecología y Obstetricia (SEGO), de Citología (SEC), de Anatomía Patológica (SEAP), y la Asociación Española de Patologia Cervical y Colposcopia (AEPCC)95. No obstante, en el año 2010 este protocolo fue modificado87 (Figuras 14 y 15). Figura 14. Recomendaciones de la SEGO 2010 para el cribado poblacional en mujeres no vacunadas. INTRODUCCIÓN 45 La variabilidad observada en cuanto a sensibilidad y reproducibilidad de la citología ha dado lugar a que en los últimos años se haya analizado el papel de la prueba VPH en la prevención secundaria del cáncer de cérvix136,137, ya sea asociado a la citología138 (co-test) o como técnica inicial de cribado. Múltiples ensayos randomizados demuestran que la prueba VPH es más sensible para la detección de CIN3, si bien la especificidad y por tanto el valor predictivo positivo (VPP) demostrado son menores, sobre todo en mujeres jóvenes menores de 30 años, donde la prevalencia de infección transitoria es alta. Una revisión sistemática llevada a cabo recientemente en la que se actualizan los datos disponibles139, objetiva cómo combinando citología y prueba VPH (co-test) como técnica de cribado se incrementa ligeramente la sensibilidad a expensas de una pérdida en especificidad cuando cualquier prueba es positiva y se remite a la paciente a colposcopia, comparado con la realización única de la prueba VPH. La diferencia en el riesgo acumulado de CIN3+ o cáncer utilizando co-test versus prueba VPH sola es baja. Por tanto, la evidencia disponible pone de manifiesto como, en caso de ser realizado con una técnica clínicamente validada, la prueba VPH-AR es más eficaz que la citología en el cribado primario en mujeres mayores de 30 años, y que en los casos en los que la prueba es negativa el intervalo de cribado se puede extender con seguridad a 5 años. En los casos en los que la prueba es positiva se puede utilizar para la selección bien la citología o bien el genotipado para VPH16/18. A continuación se describen más detalladamente los métodos de detección de VPH aprobados por la FDA (Tabla 3) como métodos de cribado del CCU junto con la citología140-142. Tabla 3. Pruebas para la detección de VPH aprobadas por la FDA para su utilización en el cribado poblacional129. INTRODUCCIÓN 46 3.2.1. Métodos en los que no se realiza amplificación • CAPTURA DE HÍBRIDOS La Captura de Híbridos (Hibryd Capture® 2 o HC2) es una técnica de hibridación que utiliza una secuencia complementaria de ARN, en lugar de ADN, lo que le confiere una alta sensibilidad. Este método sólo se aplica sobre células en suspensión no permitiendo su uso en muestras tisulares. Se trata de un método no automatizado que permite detectar la presencia de 5 tipos de VPH-BR (6, 11, 42, 43, 44) y 13 tipos de VPH-AR (16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) sin indicar el genotipo específico. El marcaje de los híbridos se realiza mediante un producto luminiscente, por lo que para la lectura se utiliza un luminómetro. El resultado es por tanto cualitativo (positividad o negatividad para VPH-AR) y también semicuantivo (intensidad de la reacción medida en unidades relativas de luz o URL) lo que significa una estimación de la carga viral o cantidad de virus presente en una muestra determinada102. Este método es muy adecuado para el cribado por su alta sensibilidad clínica. Debido a que es la técnica más contrastada, muchos autores recomiendan utilizar el HC2 como estándar de oro para realizar estudios comparativos de los nuevos métodos de cribado140. Sin embargo es un método relativamente poco reproducible en la llamada “zona gris”, que afecta a los resultados alrededor del punto de corte (positivo/negativo). Parece que esto se debe, al menos en parte, a un número no despreciable de reacciones cruzadas con VPH-BR143 que dan lugar a un pequeño número de falsos positivos. Sin embargo este aspecto parece ser poco importante desde la perspectiva del cribado poblacional143, 144 . • CERVISTA® Es una técnica automatizada de detección del VPH basada en la hibridación, que únicamente permite analizar muestras de citología líquida, de modo que no puede utilizarse en muestras tisulares. Detecta la presencia de 14 tipos de VPH-AR en tres grupos diferentes (Mix 1: 51, 56, 66; Mix 2: 18, 39, 45, 59, 68, y Mix 3: 16, 31, 33, 35, 52, 58). INTRODUCCIÓN 47 Tras la extracción del ADN se aplica el test de Cervista®, que realiza la lectura mediante un método denominado invader, basado en una reacción luminiscente. El resultado informa de la positividad o negatividad para VPH-AR pero no informa de la carga viral. Es muy sensible y adecuado para el cribado. No existe experiencia en lo referente a la llamada zona gris, pero no se conocen reacciones cruzadas con VPH-BR. Para tipificar los VPH presentes debe procederse a una segunda prueba143. 3.2.2. Métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Estos métodos se basan en la amplificación del ADN del virus145 mediante la aplicación de unos cebadores (primers en inglés) complementarios de secuencias del ADN vírico que, en ciclos de altas y bajas temperaturas y gracias a la acción de polimerasas del ADN, permiten obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. Estas técnicas pueden utilizarse en cualquier tipo de muestra, células en suspensión, células sobre portaobjetos o cortes de muestras histológicas146. Estos métodos son extraordinariamente sensibles, pero pueden tener problemas de especificidad, dado que ocasionalmente se detectan secuencias similares pero no exactas al ADN problema (falsos positivos). El método más utilizado es la PCR consenso, en la cual se amplifica una región con secuencia muy similar entre todos los VPHs para, posteriormente, por métodos de hibridación específica, enzimáticos o de secuenciación de ADN, realizar el genotipado específico del virus. El primer cebador que se popularizó fue el que usa como diana de amplificación la región común L1, utilizando los primers MY09 y MY11146. El amplificado generado es de aproximadamente 450 pares de bases. Después se han diseñado variantes como PGMY09/11, GP5/GP6 o su variante GP5+/GP6+, y SPF10. A menor región para amplificar, mayor es la sensibilidad para detectar la presencia del VPH. Un método no reconocido por la FDA para screening es el sistema CLART HPV2147, que consiste en un método semiautomatizado de genotipado viral basado en la amplificación de oligonucleótidos (primers) por acción de la polimerasa, detectando 35 genotipos (20 de alto riesgo y 15 de bajo riesgo). INTRODUCCIÓN 48 • COBAS® 4800 Se trata de un método comercializado de detección del VPH basado en la PCR en tiempo real y disponible para material conservado para citología en medio líquido, no pudiendo utilizarse material histológico procesado en parafina. Es un método automatizado que informa si la muestra es positiva o negativa para VPH-AR y, en casos positivos, indica si está presente el VPH16, el VPH18 u otro de los siguientes VPH-AR (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68). La técnica proporciona información sobre carga viral. En los resultados positivos no se han observado reacciones cruzadas con VPH-BR148. Muestra una elevada sensibilidad clínica, por lo que es adecuada para su utilización en el cribado poblacional. 3.2.3. Métodos de detección de ARN-VPH • APTIMA® Aptima® es un sistema automatizado que permite la detección de 14 tipos de VPH-AR mediante análisis del ARN mensajero viral de las oncoproteínas E6 y E7 en citología en medio líquido. En los estudios publicados el método ha demostrado ser tan sensible como HC2, Cervista® y Cobas® 4800, pero algo más específico. Está aprobado por la FDA y validado en la plataforma Panther como co-test y para la selección de las citologías ASC-US121. 3.3. Marcadores moleculares de proteínas del ciclo celular Actualmente se están investigando y desarrollando otras estrategias que permitan identificar a aquellas pacientes que realmente presentan un alto riesgo de sufrir transformaciones carcinogénicas y desarrollar un cáncer invasivo. Uno de los mejores indicadores de esa capacidad de transformación neoplásica en las muestras cervicales sería la detección de los niveles de proteínas oncogénicas producidas por el VPH. Por eso, se están evaluando biomarcadores que intervengan en las vías moleculares de la carcinogénesis149-152. INTRODUCCIÓN 49  Marcadores de regulación del ciclo celular: p53, p21, bax, pRb, p16INK4a, p27, MCM2 y TOP IIα (ProExTM C)153, ciclina D1, ciclina A, ciclina E.  Marcadores de proliferación celular: PCNA, c-myc, Ki-67 (MIB-1).  Marcadores de apoptosis: telomerasa, survivina.  Marcadores de transcripción: Skn-1, Oct-1, AP-2, NFkappaB.  Marcadores de vías celulares de señalización.  Marcadores de infección VPH: proteína L1 de la cápside. Recientemente se ha evidenciado que algunos biomarcadores pueden ser detectados por métodos inmunohistoquímicos154 y, por tanto, pueden ser evaluados en un examen cito-histológico: 3.3.1. p16INK4a (p16) Es una proteína codificada por el gen supresor CDKN2 (MSTK, INK4) situado en el cromosoma 9p21, inhibidora de las quinasas dependientes de ciclinas (cdk). La proteína del retinoblatoma (pRb) en condiciones normales se une al factor de transcripción E2F, bloqueando la transcripción de los genes que estimulan la progresión del ciclo celular y su proliferación (Figura 20). Tanto en el cáncer de cérvix como en sus lesiones precursoras, la pRb está funcionalmente inactivada desde las fases iniciales de la carcinogénesis cervical como consecuencia de la expresión del gen E7 del VPH que la bloquea. Existe, entonces, una relación inversa entre la expresión de p16INK4a y la presencia de pRb activa. La p16INK4a se detecta cuando la pRb está alterada (mutada, deleccionada o inactivada) y, se reduce o está ausente en células que contienen pRb con actividad normal. Es independiente de la edad de la paciente y del tipo de VPH. La sobreexpresión de p16 es fácilmente detectable en muestras histológicas y citológicas por tinción inmunohistoquímica, siendo un marcador de progresión neoplásica que mejora la especificidad diagnóstica155-158 y soluciona los problemas existentes de variabilidad interobservador. INTRODUCCIÓN 50 Figura 20. Mecanismo molecular de la sobreexpresión de p16. 3.3.2. Ki-67 Ki-67, también conocida como MIB-1, es una proteína que puede ser detectada en el núcleo de células en proliferación, en todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2 y M), pero no en células inactivas ya que está ausente en fase G0. La expresión de Ki-67 sería mayor en las alteraciones de la maduración epitelial que en los epitelios normales. En condiciones normales Ki-67 se expresa en la capa suprabasal del epitelio cervical, aparece en las capas superiores y es más intensa a medida que se incrementa el grado de displasia. Diversos estudios han comprobado que la progresión tumoral se asocia a un aumento de proliferación celular y que la expresión de Ki-67 constituye un potencial indicador pronóstico en las lesiones premalignas del cérvix151, 159. INTRODUCCIÓN 51 3.3.3. Tinción dual p16/Ki-67 La unión de los dos biomarcadores antes mencionados en una misma técnica ha dado lugar a la denominada tinción dual p16/Ki-67, comercializada por Laboratorios Roche como CINtec® PLUS kit, que consiste en un método inmunohistoquímico para determinar cualitativamente y de manera simultánea las proteínas p16INK4a y Ki-67 en estudios cito-histológicos cervicales, y puede ser aplicada tanto en citología convencional como líquida. Se ha propuesto que la detección simultánea de la proteína p16INK4a, marcador de antiproliferación, y la proteína Ki-67, marcador de proliferación, en una misma célula se deberían excluir mutuamente en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, la detección de células cervicales epiteliales individuales coexpresando ambos marcadores puede representar un signo independiente de desregulación del ciclo celular secundaria a la infección transformante por VPH. La principal ventaja de esta tinción dual p16/Ki-67 es que no precisa de interpretación morfológica de las características nucleares, y se considera como positiva para el test cualquier muestra con al menos una célula con positividad dual (tinción marrón citoplasmática para p16 y tinción roja nuclear para Ki-67) (Figura 21). Figura 21. Célula positiva para tinción dual p16/Ki-67. Se han realizado tres ensayos clínicos controlados en Europa con esta técnica: INTRODUCCIÓN 52  Estudio PALMS160: Primary, ASC-US, LSIL Marker Study • Estudio multinacional, multicéntrico, prospectivo y diagnóstico en más de 27.000 mujeres.  Estudio EEMAPS161: European Equivocal or Mildly Abnormal Pap Cytology Study • Unos 200 casos de CIN 2+ confirmadas por biopsia, provenientes de 776 casos de ASC-US y LSIL.  Estudio Wolfsburg162: Subestudio del Wolfsburg Pap/HPV Co-Testing Study • Estudio retrospectivo con más de 4400 mujeres mayores de 30 años. • Estudio retrospectivo con 427 mujeres con citologías negativas y VPH positivo. Los resultados de estos estudios sobre el comportamiento diagnóstico de la tinción dual para CIN2+ se resumen en la Tabla 4. Tabla 4. Comportamiento diagnóstico de la tinción dual para CIN2+. Resultados de los estudios PALMS160, EEMAPS161 y WOLFSBURG162. CINtec® PLUS Sensibilidad Especificidad Cribado160,162 90 - 93% 95 - 97.5% Triaje LSIL160,161 85 - 94% 54 - 68% Triaje ASC-US160,161 92 - 94% 78 - 81% Triaje Citología negativa /VPH-AR positivo162 92% 85% INTRODUCCIÓN 53 La tinción dual p16/Ki-67 en citología constituye, por tanto, una de las pruebas más prometedoras para identificar lesiones cervicales premalignas. En los estudios publicados, a pesar de las notables diferencias en los criterios de inclusión, se observa una sensibilidad y especificidad muy altas (aproximadamente del 90 y del 80%, respectivamente). La sensibilidad es significativamente mejor en las muestras preparadas con ThinPrep® que en extensiones convencionales o preparadas con SurePath®160. Actúa como herramienta de seguridad en el diagnóstico histológico rutinario. Pone de manifiesto focos lesionales de pequeño tamaño, lesiones artefactadas u ocultas que pueden pasar desapercibidas con las técnicas de rutina. Facilita el diagnóstico diferencial entre los simuladores de lesión cervical (metaplasia escamosa inmadura, cambios celulares asociados a atrofia e inflamación) y las verdaderas lesiones intraepiteliales de alto grado. La tinción dual p16/Ki-67 ha demostrado ser particularmente útil en la selección de las pacientes con citología de ASC-US y LSIL, y en casos con prueba de VPH positiva y citología negativa129, 162. La alta sensibilidad y especificidad se observa especialmente en mujeres mayores de 30 años, pero también por debajo de esta edad (a pesar de la elevada frecuencia de infecciones VPH transitorias en este colectivo). Un estudio destaca que la valoración de criterios morfológicos e inmunohistoquímicos incrementa de forma notable la especificidad de la técnica, lo que puede ser especialmente útil en mujeres jóvenes163. En la Guía de cribado del CCU de 2014 se describen las estrategias de actuación clínica en mujeres con prueba de detección del VPH positiva y citología negativa, que incluye la tinción dual (Figura 22)129. INTRODUCCIÓN 54 Figura 22. Algoritmo de actuación clínica en mujeres con prueba de detección del VPH positiva129. 4. TRATAMIENTO DE LA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Existen diversos tipos de tratamiento, los cuales se dividen en:  Destructivos: producen una destrucción física de la lesión y, por tanto, no obtienen tejido para estudio histológico. Son la termocoagulación, electrocoagulación, criocoagulación y vaporización con láser de CO2.  Escisionales: extirpan la lesión, por ello puede realizarse el estudio histológico, que permitirá descartar la presencia de microinvasión o invasión, que está presente en un 6-12% y un 2% respectivamente. Son la conización y la histerectomía. OBJETIVOS 61 1. OBJETIVO PRINCIPAL -Comprobar si la tinción dual p16INK4a/Ki-67, método de diagnóstico inmunohistoquímico, se expresa en los márgenes de los conos afectos de SIL-AG, asociándose con lesiones CIN2+ subyacentes. 2. OBJETIVOS SECUNDARIOS 2.1. Analizar la influencia de los cofactores de riesgo de cáncer de cérvix en nuestras mujeres conizadas por SIL-AG y con afectación de lesión escamosa en sus bordes. 2.2. Establecer si existe relación entre los márgenes afectos por SIL alto grado y la persistencia del VPH-AR tras la conización. 2.3. Investigar la relación entre la tinción dual p16/Ki-67 y la persistencia de VPH-AR en las conizaciones, con márgenes afectos, por SIL-AG confirmados histológicamente. MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 63 1. ÁMBITO DE TRABAJO: POBLACIÓN DE ESTUDIO Nuestro estudio abarca la población femenina de Málaga, que según el Servicio Andaluz de Salud corresponde al Hospital Universitario Virgen de la Victoria y su Centro de Especialidades San José Obrero incluyendo los distritos sanitarios de Málaga Centro-Área metropolitana de Málaga, Málaga Oeste, Torremolinos-Churriana y CoínValle del Guadalhorce. También somos unidad de referencia para patología del TGI del municipio de Benalmádena. Dicha población está integrada por 7 Zonas Básicas, con 33 Centros de Salud y 16 Consultorios Rurales. En cifras absolutas de población vienen a significar aproximadamente 155.877 mujeres con edades comprendidas entre los 20 y los 65 años185, a las que se les ha practicado un cribado mixto (poblacional y oportunista) mediante citología convencional (triple toma de Wied) desde el 1 de Julio del 2008 hasta el 1 de Julio de 2013 (cinco años completos e ininterrumpidos). En nuestra Comunidad Autónoma de Andalucía se está aplicando la siguiente estrategia de cribado: Proceso Asistencial Integrado (PAI) de Cáncer de cérvix-Cáncer de útero de la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía, aprobado en el Hospital Universitario Virgen de la Victoria de Málaga (HUVVM) en noviembre del 2006 e implantado desde enero del 2008, y del cual se ha efectuado una revisión en diciembre del año 201016. -Programa de cribado: oportunista, aunque existen iniciativas para mejorar la captación y adherencia al cribado por parte de los médicos de Atención Primaria. -Población diana: mujeres no histerectomizadas a partir de los 3 años de inicio de las relaciones sexuales y hasta los 65 años. -Prueba e intervalo de cribado: citología trienal después de dos citologías realizadas con intervalo de 1 año, con resultado valorable y negativo. -Aquellas mujeres con 65 años que no se han realizado ninguna citología en los últimos 5 años requieren 2 citologías normales, de intervalo anual, para finalizar el programa de cribado. MATERIAL Y MÉTODOS 64 En nuestro estudio se analizan las citologías de cribado tanto del área de salud asignada a la Unidad de Patología del TGI hospitalaria como de las consultas ginecológicas hospitalarias, y también del Centro de Especialidades San José Obrero. La población femenina asignada es fundamentalmente urbana, ya que la mitad corresponde al municipio de Málaga y la mitad del resto está constituida por zona periurbana o municipios de la Costa de Sol. Del total de la población, nuestro estudio lo centramos en las mujeres que fueron diagnosticadas de anomalías citológicas, compatibles con lesión intraepitelial escamosa de alto grado (HSIL), y que tras el estudio en la Consulta de Patología del TGI fueron sometidas a una conización, y en el análisis anatomopatológico posterior se vio que resultaron con márgenes afectados de enfermedad, y a los que posteriormente se les aplicó el test dual p16/Ki-67. De las 480 conizaciones realizadas en los 5 años del periodo de estudio, nuestra muestra está constituida por 95 mujeres conizadas con el diagnóstico de afectación de los márgenes quirúrgicos (19,8%), que incluye 80 lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (SIL-AG) y 15 de bajo grado (SIL-BG). Al total de esta muestra de mujeres conizadas, que previamente fueron diagnosticadas de alteraciones citológicas (HSIL, ASC-H, AGUS,…), además se les practicó una colposcopia, un estudio molecular para la determinación de ADN-VPH y una biopsia dirigida bajo control colposcópico en la Consulta de Patología del TGI de dicho Centro hospitalario. Todos los casos fueron diagnosticados por el mismo equipo de profesionales que integran la Sección de Citodiagnóstico de la UGC de Anatomía Patológica, y la Unidad de Patología del TGI de la UGC de Obstetricia y Ginecología, del mismo Centro hospitalario. MATERIAL Y MÉTODOS 65 2. METODOLOGÍA DE TRABAJO Se ha realizado un estudio poblacional, de corte transversal, de tipo observacional y descriptivo (retrospectivo). 2.1. Criterios de inclusión Se incluyeron en esta memoria todas las pacientes que reunían los siguientes requisitos: • Mujeres sometidas a una conización cervical, y con resultado histológico de afectación de los bordes del mismo, durante los cinco años que abarca el estudio (1 julio 2008 a 1 julio 2013). • Diagnosticadas previamente con citología de HSIL, ASC-H, AGUS,…; que además se les hubiera practicado una colposcopia, una determinación de ADN-VPH, así como una biopsia dirigida. 2.2. Criterios de exclusión • Mujeres conizadas en las que el estudio de los márgenes de resección resultó dudoso o no valorable, por los patólogos, debido fundamentalmente a artefactos de los mismos. • Aquellos casos con sospecha histológica de microinvasión del estroma. • Pacientes en las que el estudio histológico definitivo del cono fue negativo (cono “en blanco”). MATERIAL Y MÉTODOS 66 3. RECOGIDA DE MUESTRAS La recogida de muestras fue centralizada en la UGC de Anatomía Patológica del HUVVM. A partir de las historias clínicas de las pacientes se obtuvo el número de biopsia correspondiente. Con estos números, se recuperaron las muestras histológicas de las conizaciones, teñidas con Hematoxilina y Eosina (HE), de cada paciente del archivo de Anatomía Patológica. A cada pieza de conización con margen afecto se le asignó un número, de forma correlativa, desde el inicio del período de tiempo comprendido en el estudio hasta el último, en julio del 2013. El estudio se adaptó estrictamente y en todo momento a las leyes de protección de datos y de protección de los derechos de las pacientes. Todos los datos que pudieran afectar a la intimidad de las pacientes se recogieron en una base de datos protegida. No se hizo referencia alguna a sus nombres ni se les identificó en ningún informe o publicación. El análisis de la información se hizo siempre de forma agregada y nunca individual. Los datos personales se desvincularon permanentemente de los datos clínicos con el fin de proteger la identidad de las participantes (método de “anomización” de datos). La base de datos del estudio se encontraba protegida electrónicamente con una clave para limitar el acceso únicamente a los investigadores. La técnica inmunohistoquímica p16/Ki-67, en las muestras seleccionadas, fue aplicada en la Unidad de Apoyo a la Investigación Oncopatológica, ubicada en la Unidad Docente de Anatomía Patológica, en Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga. MATERIAL Y MÉTODOS 67 4. ESTUDIO CITO-HISTOLÓGICO CONVENCIONAL El diagnóstico se realizó mediante la aplicación consecutiva de tres pruebas básicas:  La primera es la citología cervicovaginal, mediante la triple toma de Wied: exocérvix, fondo de saco vaginal y endocérvix, ésta última con cepillo de Stormby endocervical. En el caso de que la paciente presente ya una citología anormal, sólo se repetirá la citología si el intervalo es de tres meses como mínimo (lo contrario, pensamos, solo hace aumentar el número de falsos negativos).  En segundo lugar, la colposcopia permite la localización de la lesión, su extensión tanto en el exocérvix como en la vagina, y si se introduce por el canal endocervical.  La tercera prueba diagnóstica es la biopsia dirigida por colposcopia. Si la zona de transformación no es visible, está situada en el canal cervical, algunas veces, optamos por realizar una cervico-histeroscopia que permite su visualización, o bien en su defecto, realizamos un legrado endocervical, teniendo en cuenta que el material aquí obtenido suele ser escaso y sin relación con el estroma, por lo que el resultado, en muchos casos, será valorado con reservas186. Estudio cito-histológico convencional Las extensiones cervico-vaginales remitidas en portas fijados, desde las consultas de Atención Primaria y de Atención Especializada, fueron registradas en la UGC de Anatomía Patológica según datos de filiación (nombre y apellidos, edad, Nº de Seguridad Social, NUSSA,…). Tras ello se inició el procedimiento de tinción clásica de Papanicolaou en equipo automatizado Leica® y tras el montaje se realizó el screening por dos citotécnicos, con confirmación posterior por el patólogo. El informe anatomopatológico de la citología cervicovaginal se realizó siguiendo la clasificación Bethesda para interpretación de citología cervicovaginal120. MATERIAL Y MÉTODOS 68 Las piezas de biopsia y conización cervical fueron manejadas de la forma convencional para su estudio histopatológico. Se recibieron fijadas en formol marcadas las conizaciones con un hilo de sutura a las 12 horas y tras ser seccionadas por dicho punto en sentido cráneo-caudal, se realizaron cortes seriados en sentido horario y fueron divididas en cuadrantes, comprendidos entre las 0 y 3 horas, entre las 3 y 6, entre las 6 y las 9, y finalmente entre las 9 y las 12 horas. Cada cuadrante fue seccionado en cortes convencionales de un grosor de 2 a 3 mm. Obteniéndose de 3 a 4 cortes de tejido por cada cuadrante, en total de 12 a 16 cortes por cada cono. Los cortes de tejido fueron procesados y teñidos con Hematoxilina y Eosina (HE) para su estudio histopatológico rutinario. Los cortes de tejido al microscopio mostraban una superficie recubierta por epitelio escamoso exocervical en uno de sus extremos y en el opuesto epitelio endocervical con invaginaciones glandulares, presentando en la zona central el área de lesión o CIN. MATERIAL Y MÉTODOS 69 5. DETECCIÓN DEL ADN DEL VPH POR TÉCNICAS DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Extracción de ADN genómico • A partir de tomas citológicas. Se coloca la torunda en 1,5 ml de solución salina (PBS). Se agita la torunda dentro del tubo para que las células pasen al líquido. Se centrifuga a media potencia durante 5 min para que las células decanten al fondo del tubo. Se retira el sobrenadante. • Se realizaron de 1-4 cortes de 10 micras de cada muestra tumoral (según la cantidad de material presente en cada sección). La extracción del ADN se realiza en ambos casos de manera automatizada y siguiendo las instrucciones del Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification kit (Promega®). Reacción de amplificación e identificación del genotipo El ADN extraído y purificado se utilizó como molde para detectar la presencia de ADN del VPH mediante amplificación por PCR usando cebadores Gp5-6 específicos de la región consenso L1. Para la identificación del tipo de virus se empleó el kit VPH-GenoArray, Master Diagnostica® S.L. Granada, que permite la detección de 17 tipos específicos de VPH de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66/68, 73, 82) y 16 de bajo riesgo (6, 11, 40/61, 42, 43/44, 54/55, 70, 57/71, 72, 81, 84/26). Esta identificación se realiza mediante amplificación por PCR de un fragmento de 450 pb de la región consenso L1 e hibridación reversa con sondas específicas para cada tipo (Figura 24). Figura 24. Identificación del genotipo mediante PCR seguida de hibridación en membrana. MATERIAL Y MÉTODOS 70 6. DETECCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA: TINCIÓN DUAL p16INK4a/Ki-67 (CINtec® PLUS) El estudio inmunohistoquímico se ha realizado en muestras histológicas obtenidas a partir de las conizaciones, previamente teñidas con HE. A todas las muestras se les retiró, inicialmente, el cubreobjetos sumergiéndolas en xilol. Tras aproximadamente una semana fueron sometidas a un proceso de doble inmunotinción para la determinación de la inmunoexpresión de las proteínas p16INK4a y Ki-67 con el CINtec® PLUS Kit (Roche-mtm Laboratories, Heidelberg, Germany), de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Figura 25). El anticuerpo utilizado para la determinación de la proteína p16 fue el anticuerpo primario monoclonal de ratón, clon E6H4TM, y un anticuerpo primario monoclonal de conejo, clon 274-11 AC3, frente a la proteína humana Ki-67. Figura 25. Tinción dual p16/Ki-67. Principio del procedimiento. MATERIAL Y MÉTODOS 77  HSIL: proliferación de células escamosas o metaplásicas con características nucleares anormales (aumento de tamaño nuclear, membrana nuclear irregular y aumento de la relación núcleo/citoplásmica, acompañada de figuras de mitosis). Hay poca o nula diferenciación citoplasmática en los tercios medio y superficial del epitelio. Las figuras mitóticas no se limitan al tercio inferior del epitelio y se pueden encontrar en la parte media y/o superficial. Bajo este término se incluyen las lesiones de CIN2 y CIN3 de la clasificación de Richart/OMS 2004. Se acepta que las LSIL/CIN1 son la expresión histológica de una infección productiva y autolimitada por VPH que comparte su misma historia natural y la mayoría de veces regresa espontáneamente. El seguimiento estricto de estas mujeres minimiza el riesgo que supone la falta de detección inicial de lesiones de alto grado. Por otro lado, las HSIL/CIN3 se consideran auténticas neoplasias intraepiteliales con elevado potencial de progresión y constituyen la lesión precursora necesaria del cáncer de cérvix. Contrariamente, el significado biológico de las lesiones de HSIL/CIN2 está mal definido ya que, en su evolución, tanto pueden regresar como progresar. La determinación inmunohistoquímica de p16 permite una mejor categorización de las lesiones frontera entre bajo y alto grado, fundamentalmente clasificadas histológicamente hasta ahora como CIN2 mediante criterios exclusivamente morfológicos. Las lesiones CIN2 p16-positivas se incluyen en la categoria HSIL dado su mayor riesgo de progresión, y las CIN2 p16-negativas se reclasifican como LSIL dado su comportamiento benigno y su bajo riesgo de progresión. La aplicación del marcador p16 para aclarar el significado de una CIN2 se ha estimado que sería necesario aplicarlo en menos del 10% de todas las biopsias. En nuestro estudio los posibles hallazgos encontrados en el estudio anatomopatológico han sido agrupados en dos categorías:  SIL-BG: lesión intraepitelial escamosa de bajo grado que incluye las LSIL/CIN1.  SIL-AG: lesión intraepitelial escamosa de alto grado que agrupa las HSIL/CIN2, CIN3 y carcinoma “in situ”. MATERIAL Y MÉTODOS 78  ESTUDIO DE LOS MÁRGENES DE LA PIEZA: según estuvieran o no afectos y su relación con la lesión histológica.  VARIABLES RELACIONADAS CON EL OPERADORCIRUJANO: MIR, adjunto novel (experiencia < 10 años) o bien adjunto experto (≥ 10 años).  PARÁMETROS DERIVADOS DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO: TEST DUAL p16/Ki-67 La tinción dual se valoró de la siguiente forma:  Positiva cuando se observó al menos una célula con patrón de doble tinción p16/Ki-67.  Negativa en ausencia del patrón de tinción doble. Nuestra memoria se centró en los casos de los conos que mostraban, desde el punto de vista histológico, afectación en cualquiera de los bordes (exocervical, endocervical o ambos) y de cualquier grado de displasia (CIN1, CIN2, CIN3). A este grupo de conos histológicos son a los que posteriormente y de forma retrospectiva les hemos practicado el doble test inmunohistoquímico p16/Ki-67, según la técnica anteriormente descrita. Para la aplicación del doble marcador a los bordes de las piezas de conización seguimos el siguiente guión:  Al 97,9% de los casos en que el informe histológico evidenció afectación positiva de sus bordes, independientemente que fueran lesiones de alto grado (SIL-AG) o de bajo grado (SIL-BG). En el período de estudio se realizaron 480 conizaciones, y el informe mostró afectación de los bordes en 80 SIL-AG y 15 SIL-BG. El test dual se aplicó a 78 SIL-AG y 15 SIL-BG.  Así mismo para comparar con los casos de conizaciones con bordes no afectos (indemnes) se realizó el doble test al 10 % de la muestra (tanto si el informe histológico era de SIL-AG como de SIL-BG). Del total de las 480 conizaciones resultaron 326 casos con bordes libres: 243 SIL-AG y 83 SIL-BG. Se aplicó el doble test a 24 SIL-AG y 10 SIL-BG. MATERIAL Y MÉTODOS 79  Además también se efectuó el doble test a un grupo control, aleatorio, compuesto por 22 cérvix amputados, que habían sido extirpados por otras causas distintas a procesos oncológicos, y con unas características demográficas y epidemiológicas similares al grupo sometido a estudio. Las cifras absolutas y relativas se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Distribución de la muestra del test dual p16/Ki-67 en las conizaciones con bordes afectos. BORDES CONIZACIÓN LESIONES ALTO GRADO LESIONES BAJO GRADO Nº casos Porcentaje % MUESTRA p16/Ki-67 AFECTOS 80 15 95 19.8 93 INDEMNES 243 83 326 67.9 34 NO VALORABLES - - 31 6.5 0 CONOS NEGATIVOS - - 28 5.8 0 TOTAL 323 98 480 100 127 MUESTRA CONTROL - - 100 22 22 D. VARIABLES DE SEGUIMIENTO  ANÁLISIS DE LOS TRATAMIENTOS QUIRÚRGICOS COMPLEMENTARIOS: si la paciente los recibió o no, en función del diagnóstico histológico definitivo del cono y de otros parámetros clínicos o los cofactores. Estos tratamientos fueron: reconización, histerectomía total, simple o ampliada. También se registró el diagnóstico de la estirpe tumoral: escamoso, glandular o ambos, o si la biopsia definitiva fue negativa. MATERIAL Y MÉTODOS 80  INFECCIÓN PERSISTENTE POR VPH-AR EN EL CONTROL POSTOPERATORIO: se estableció dicho control de ADN-VPH a los 6 meses de la conización, y a los 12 meses (si persistía positivo), mediante la técnica de PCR. Si este último PCR continúa positivo, se repite a los 24 meses de la intervención quirúrgica.  SEGUIMIENTO CLÍNICO: expresado en meses, en nuestra Unidad de Patología del TGI, desde la realización de la conización hasta el cierre del trabajo de investigación, el 1 de Julio de 2014. 8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS La valoración de los resultados se ha realizado mediante pruebas estadísticas descriptivas y analíticas o inferenciales. La información se procesó mediante el programa informático para bases de datos Microsoft Excel®, y para el análisis de datos se ha empleado el programa estadístico Statistical Package for the Social Sciencies® (SPSS, versión 22.0) para Windows. 8.1. Estadística Descriptiva Dado que nuestra memoria es un estudio poblacional, de tipo observacional (de corte transversal) para evaluar en primer lugar la prevalencia de afectación de márgenes de nuestras conizaciones, y en segundo lugar, estudiar la aplicación del doble test p16/Ki-67 en dichos márgenes afectos, en mujeres que previamente fueron al médico de familia o al ginecólogo a someterse a una citología para el cribado de cáncer de cérvix, en Málaga, y que resultó patológica, lo cual obligó a la práctica de una conización, es por lo que los resultados que obtengamos del análisis estadístico de esta muestra, no serán extrapolables a la población general. Hemos realizado, en primer lugar y con intención de obtener una valoración global de nuestra serie, un análisis descriptivo del total de variables, en el que se ha procedido de la siguiente manera: • Variables cualitativas: para este conjunto de parámetros se han calculado las tablas de frecuencia con las respectivas frecuencias absolutas y porcentajes. MATERIAL Y MÉTODOS 81 • Variables cuantitativas: para el conjunto de naturaleza numérica se han determinado los estadísticos de tendencia central y dispersión usuales (media, desviación típica, rango, etc.). 8.2. Estadística Analítica o Inferencial Para contrastar las posibles asociaciones entre dos o más variables y la intensidad de esa asociación se ha utilizado el siguiente criterio: • Para el análisis comparativo de una variable numérica entre dos grupos independientes que siguen una distribución normal, se ha utilizado el test tStudent. En todos los casos se ha contemplado la homocedasticidad (igualdad de varianzas). • Cuando hemos tratado de comparar más de dos grupos de una variable cuantitativa, el análisis se ha realizado utilizando el Análisis de la Varianza (ANOVA), en los casos en que la variable ha seguido una distribución normal. En las situaciones en las que las condiciones de normalidad y/u homocedasticidad (igualdad de la varianza) hayan sido violadas, se ha utilizado el test no paramétrico Kruskall-Wallis. • Para el estudio de las relaciones entre variables cualitativas se ha utilizado las tablas de contingencia para su descripción, y el test Chi-cuadrado como test de independencia/homogeneidad. En todos los casos se ha considerado la existencia de significación estadística a aquella con p≤0.05, y el intervalo de confianza se estableció en el 95%. RESULTADOS RESULTADOS 83 1. DESCRIPCIÓN DE LOS DATOS DEMOGRÁFICOS Y SU CORRELACIÓN CON EL GRADO DE LESIÓN HISTOLÓGICA 1.1. Edad La edad media de nuestra muestra, mujeres conizadas con márgenes afectos, fue 41,77 años, con un rango entre 20 y 71 años (Tabla 6 ). Tabla 6. Parámetros descriptivos de la edad. N Mínimo Máximo Media Desv. típ. Edad (años) 95 20 71 41,77 10,44 Hemos agrupado las pacientes de nuestro estudio en grupos de edad de la siguiente forma: 20-30 años, 31-40 años, 41-50 años y >50 años, obteniendo los siguientes resultados (Tabla 7): Tabla 7. Grupos de edad (frecuencia absoluta y relativa). Edad (años) N Porcentaje (%) 20-30 14 14,7 31-40 31 32,6 41-50 32 33,7 >50 18 18,9 Total 95 100,0 Analizando dichas edades de la muestra destaca el aumento de la frecuencia a partir de los 30 años. El 66% de las mujeres pertenecen al grupo de edad que comprende desde los 30 a los 50 años. Así se aprecia una disminución acusada de la misma a partir de los 50 años de edad (Figura 28). RESULTADOS 84 Figura 28. Distribución por edad (grupos etáreos). Lesión histológica y edad En la siguiente tabla se expresan los valores medios de edad de las pacientes de nuestro estudio para cada una de las lesiones intraepiteliales escamosas: bajo grado (SIL-BG) y alto grado (SIL-AG) (Tabla 8). Tabla 8. Descriptores de edad media de las pacientes por tipo de lesión. Lesión N Media (años) p=0,054 Mínimo Máximo Desviación típica SIL-BG 15 46,53 34 65 9,591 SIL-AG 80 40,87 20 71 10,407 Total 95 41,77 20 71 10,442 La Tabla 9 relaciona los distintos grupos de edad con la lesión histológica cervical. 0 5 10 15 20 25 30 35 20-30 31-40 41-50 >50 Frecuencia Edad RESULTADOS 85 Tabla 9. Relación entre la edad (grupos etáreos) y lesión histológica. p=0,07 LESIÓN Total SIL-BG SIL-AG EDAD (años) 20-30 Nº casos 0 14 14 % del total 0,0% 14,7% 14,7% 31-40 Nº casos 5 26 31 % del total 5,3% 27,4% 32,6% 41-50 Nº casos 4 28 32 % del total 4,2% 29,5% 33,7% >50 Nº casos 6 12 18 % del total 6,3% 12,6% 18,9% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% Aunque no se observa significación estadística (p=0,07) de aumento de la edad de las pacientes a medida que aumenta la gravedad de la lesión, ya que el diferencial de edad entre los casos de lesiones de bajo grado y alto grado es 5,6 años, sí se puede apreciar una tendencia por el mayor número de pacientes con SIL-AG entre los 30 y 50 años (Figura 29). Figura 29. Grupos de edad y lesión histológica cervical. 0 5 10 15 20 25 30 20-30 31-40 41-50 >50 Frecuencia Edad (grupos etáreos) SIL-BG SIL-AG RESULTADOS 86 1.2. Nacionalidad de las pacientes Analizando la procedencia de nuestras pacientes, obtenemos que la mayoría, concretamente el 76,8% (n= 73) son de nacionalidad española (Tabla 10). El segundo grupo mayoritario son las pacientes procedentes de América del Sur (9,5%). Tabla 10. Nacionalidad de las pacientes. NACIONALIDAD N Porcentaje (%) ESPAÑOLA 73 76,8 AMÉRICA DEL SUR 9 9,5 RESTO DE EUROPA 8 8,4 RESTO DE CONTINENTES 5 5,3 Total 95 100,0 En el siguiente gráfico se puede observar la distribución de las pacientes en función de su procedencia (Figura 30): Figura 30. Distribución de la nacionalidad de las pacientes. NACIONALIDAD ESPAÑOLA SUDAMÉRICANA RESTO DE EUROPA OTRA RESULTADOS 93 2.2. COFACTORES IMPLICADOS EN LA CARCINOGÉNESIS CERVICAL 2.2.1. Tabaco En el momento del diagnóstico 53 de las 95 pacientes eran fumadoras (55,8 %) frente a 34 (35,8%) que no lo eran, y 8 mujeres (8,4%) que pertenecían al grupo de exfumadoras (≥ 1 año sin fumar) (Figura 35). Figura 35. Consumo de tabaco. Lesión histológica de cuello uterino y consumo de tabaco Hemos encontrado relación estadísticamente significativa entre el hábito tabáquico y el grado de lesión histológica (p=0,013) (Tabla 16). Se observa que en los casos con diagnóstico histológico de SIL-AG el porcentaje de mujeres fumadoras se incrementa casi 10 veces con respecto a los casos con diagnóstico de SIL-BG. En los casos de SIL-AG, puede apreciarse que el porcentaje de mujeres fumadoras representa aproximadamente el doble de las no fumadoras. Mientras que en los casos de SIL-BG los porcentajes de fumadoras, no fumadoras y ex-fumadoras, son muy parecidos (Figura 36). FUMADORAS NO FUMADORAS EX-FUMADORAS RESULTADOS 94 Tabla 16. Relación entre el grado de lesión cervical y consumo de tabaco. p=0,013 Lesión Total SIL-BG SIL-AG FUMADORA SÍ Nº casos 5 48 53 % del total 5,3% 50,5% 55,8% NO Nº casos 6 28 34 % del total 6,3% 29,5% 35,8% EX-FUMADORA Nº casos 4 4 8 % del total 4,2% 4,2% 8,4% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% Figura 36. Hábito tabáquico y lesión histológica cervical. 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% FUMADORAS NO FUMADORAS EX-FUMADORAS Porcentaje Consumo de tabaco SIL-BG SIL-AG RESULTADOS 95 2.2.2. Paridad El número medio de partos por mujer conizada con márgenes afectos fue de 1,64 partos, con un rango entre 0 y 6 partos. En cuanto al número de abortos, previos al diagnóstico, se dieron un total de 35. En relación al total de la muestra obtenemos una media de 0,51 abortos por paciente, cuyo rango abarca de 0 a 4 abortos. La Tabla 17 y la Figura 37 muestran la distribución del número de partos en las mujeres de nuestra muestra. Tabla 17. Distribución de frecuencias del número de partos. N Porcentaje (%) Nº partos 0 25 26,3 1 18 18,9 2 21 22,1 3 13 13,7 4 4 4,2 5 4 4,2 6 1 1,1 Total 86 90,5 Nº cesáreas Total 9 9,5 Total 95 100,0 RESULTADOS 96 Figura 37. Distribución del número de partos. Lesión histológica y paridad Al estudiar la relación entre el número de partos y la lesión cervical, no encontramos una correlación estadísticamente significativa (p=0,562) (Tabla 18). Tabla 18. Relación entre lesión histológica y número de partos. p=0,562 Lesión Total SIL-BG SIL-AG Nº partos 0 Nº casos 4 21 25 % del total 4,7% 24,4% 29,1% 1 Nº casos 2 16 18 % del total 2,3% 18,6% 20,9% 2 Nº casos 4 17 21 % del total 4,7% 19,8% 24,4% 3 Nº casos 3 10 13 % del total 3,5% 11,6% 15,1% ≥4 Nº casos 2 7 9 % del total 2,3% 8,2% 10,5% Total Nº casos 15 71 86 % del total 17,4% 82,6% 100,0% 0 5 10 15 20 25 30 NULIGESTA CESÁREAS PARA 1 PARA 2 PARA 3 PARA ≥4 Frecuencia Número de partos RESULTADOS 97 2.2.3. Anticonceptivos hormonales En nuestra muestra el 25,3% de las mujeres utilizaban anticonceptivos hormonales desde hace 3 años o más, frente al 13,7% que lo usaban desde hace menos de 3 años, y el 61,1% que no lo habían empleado (Figura 38). Figura 38. Utilización de anticoncepción hormonal Lesión cervical y anticoncepción hormonal Aunque no existe relación estadísticamente significativa entre el grado de lesión cervical y el uso de anticoncepción hormonal (p=0,183) (Tabla 19), la utilización de la misma predominaba en las SIL-AG respecto a las SIL-BG, independientemente del tiempo de uso de dicha anticoncepción hormonal. ANTICONCEPTIVOS HORMONALES ≥ DE 3 AÑOS < DE 3 AÑOS NO RESULTADOS 98 Tabla 19. Relación entre el grado de lesión cervical y el uso de anticoncepción hormonal. p=0,183 Lesión Total SIL-BG SIL-AG ACO ≥ 3 años Nº casos 1 23 24 % del total 1,1% 24,2% 25,3% < 3 años Nº casos 3 10 13 % del total 3,2% 10,5% 13,7% NO Nº casos 11 47 58 % del total 11,6% 49,5% 61,1% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% 2.2.4. Estado inmunológico En cuanto al estado inmunológico, en 8 casos (8,5%) presentaban un estado de inmunodepresión, frente al 91,5 % del resto de pacientes de la muestra, que constaban normales. De los 8 casos, 5 mujeres eran portadoras del VIH (5,3%) y una paciente (1,1%) padecía una enfermedad autoinmune en tratamiento con corticoides, de forma crónica mantenida; otras 2 mujeres (2,1%) padecían otros estados de inmunosupresión (Figura 39). RESULTADOS 99 Figura 39. Estado de inmunosupresión. Solo 7 mujeres (7,4%) estaban vacunadas frente al VPH, y 88 (92,6%) no lo estaban. El tipo de vacuna fue la bivalente en 3 casos (3,2%) y la tetravalente en 4 casos (4,2%) (Figura 40). Figura 40. Vacunación frente al VPH. NO VIH ENF. AUTOINMUNE/TT0 CORTICOIDES OTROS INMUNOSUPRESIÓN BIVALENTE TETRAVALENTE NO VACUNADA VACUNACIÓN RESULTADOS 100 Lesión histológica y estado inmunológico No observamos relación con significación estadística entre el estado de inmunodepresión de las pacientes y el grado de lesión histológica cervical (p=0,651) (Tabla 20). Tabla 20. Relación entre lesión histológica y estado inmunológico. p=0,651 Lesión Total SIL-BG SIL-AG Inmunodepresión NO Nº casos 15 72 87 % del total 15,8% 75,8% 91,6% VIH Nº casos 0 5 5 % del total 0,0% 5,3% 5,3% ENF.AUTOINMUNE/ TTO CORTICOIDES Nº casos 0 1 1 % del total 0,0% 1,1% 1,1% OTROS Nº casos 0 2 2 % del total 0,0% 2,1% 2,1% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% RESULTADOS 101 3. DESCRIPCIÓN DE LAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Y SU CORRELACIÓN CON EL GRADO DE LESIÓN HISTOLÓGICA 3.1. Diagnóstico citológico En 75 casos (78,8%) el resultado del cribado fue H-SIL, en 3 casos (3,2%) fue ASC-H. En 14 de ellos (14,7%) fue L-SIL y 1 caso (1,1%) de ASCUS. Hubo 2 casos (2,2%) de falsos negativos citológicos (Tabla 21). Tabla 21. Diagnóstico citológico. N Porcentaje (%) Diagnóstico citológico H-SIL 75 78,8 ASC-H 3 3,2 L-SIL 14 14,7 ASC-US 1 1,1 NORMAL 2 2,2 Total 95 100,0 3.2. Punch biopsia cervical dirigida por colposcopia Los resultados de la biopsia de cérvix dirigida por colposcopia se muestran en la Tabla 22. En 82 casos (86,3%) el diagnóstico fue SIL-AG y en 2 casos (2,1%) el informe fue SIL-BG. RESULTADOS 102 Tabla 22. Biopsia cervical dirigida por colposcopia. N Porcentaje BIOPSIA CÉRVIX NO VALORABLE 10 10,5 SIL-BG 2 2,1 SIL-AG 82 86,3 NEGATIVA 1 1,1 Total 95 100,0 Lesión histológica y biopsia de cérvix De los 82 casos diagnosticados por punch biopsia cervical de SIL-AG, 69 casos (72,6%) coincidieron con el diagnóstico de SIL-AG en el estudio anatomopatológico del cono, y 13 casos (13,7%) fueron SIL-BG (Figura 41). Figura 41. Lesión histológica y biopsia de cérvix. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 SIL-BG SIL-AG Frecuencia Biopsia de cérvix SIL-BG SIL-AG RESULTADOS 109 VPH 33 Nº casos 0 5 5 % del total 0,0% 5,3% 5,3% VPH 39 Nº casos 1 4 5 % del total 1,1% 4,2% 5,3% VPH 51 Nº casos 0 5 5 % del total 0,0% 5,3% 5,3% VPH 52 Nº casos 1 4 5 % del total 1,1% 4,2% 5,3% VPH 53* Nº casos 1 4 5 % del total 1,1% 4,2% 5,3% VPH 66* Nº casos 2 3 5 % del total 2,1% 3,2% 5,3% VPH 35 Nº casos 1 3 4 % del total 1,1% 3,2% 4,2% VPH 73 Nº casos 0 4 4 % del total 0,0% 4,2% 4,2% VPH 56 Nº casos 1 2 3 % del total 1,1% 2,1% 3,2% VPH 59 Nº casos 0 2 2 % del total 0,0% 2,1% 2,1% VPH 82 Recuento 1 1 2 % del total 1,1% 1,1% 2,1% VPH 68 Nº casos 0 1 1 % del total 0,0% 1,1% 1,1% VPH 26* Nº casos 0 0 0 % del total 0,0% 0,0% 0,0% *Probable Alto Riesgo. El VPH 16 se identificó en 40 casos (42,1%) de SIL-AG, analizando desde un punto de vista exclusivamente descriptivo, y en 2 casos (2,1%) de SIL-BG. No se detectó infección por VPH 58, 33, 51, 73, 59, 68 y 26 en ningún caso de SIL-BG. El VPH 26 tampoco se halló en las SIL-AG. RESULTADOS 110 3.4. Diagnóstico colposcópico A. Colposcopia diagnóstica La colposcopia se realizó en 91 casos (95,8%) y no constaba en la historia clínica en 4 casos (4,2%). El examen colposcópico resultó patológico o positivo en 77 casos (84,6%), normal o negativo en 11 casos (12,1%), e inadecuado o unión escamocolumnar no visible en 3 casos (3,3%) (Tabla 28). Tabla 28. Resultados del examen colposcópico. N Porcentaje (%) Colposcopia Positiva 77 84,6 Negativa/Normal 11 12,1 Inadecuada/UEC no visible 3 3,3 Total 91 100,0 Siguiendo la Clasificación de Río de Janeiro de 2011, en 40 casos (44%) los hallazgos colposcópicos eran de Grado 1 o cambios menores, y en 31 casos (34,1%) eran de Grado 2 o cambios mayores. En 6 casos (6,6%) el informe fue sugestivo de cáncer invasor (Figura 45). RESULTADOS 111 Figura 45. Distribución de los hallazgos colposcópicos. Lesión histológica y hallazgos colposcópicos La relación entre el grado de lesión histológica cervical y los hallazgos colposcópicos se muestra en la Figura 46 y Tabla 29. Figura 46. Lesión histológica cervical y colposcopia. GRADO1-CAMBIOS MENORES GRADO 2-CAMBIOS MAYORES SUGESTIVO DE CA INVASOR NORMAL-NEGATIVA INADECUADA/UEC NO VISIBLE COLPOSCOPIA 0 5 10 15 20 25 30 35 G1-cm G2-CM SUGESTIVA DE CA NORMAL UEC NO VISIBLE Frecuencia Colposcopia SIL-BG SIL-AG RESULTADOS 112 Tabla 29. Relación entre el grado de lesión histológica y los hallazgos colposcópicos. NS Lesión Total SIL-BG SIL-AG Hallazgos colposcópicos G1-Cambios menores Nº casos 10 30 40 % del total 11% 33% 44% G2-Cambios mayores Nº casos 0 31 31 % del total 0,0% 34,1% 34,1% Sugestivo de Ca invasor Nº casos 0 6 6 % del total 0,0% 6,6% 6,6% Negativa/Normal Nº casos 3 8 11 % del total 3,3% 8,8% 12,1% Inadecuada/UEC no visible Nº casos 2 1 3 % del total 2,2% 1,1% 3,3% Total Nº casos 15 76 91 % del total 16,5% 83,5% 100,0% En las SIL-AG se observaron un 34,1% de hallazgos Grado 2 o cambios mayores, y un 6,6% de imágenes sugestivas de cáncer invasor. Estos resultados no se aprecian en las SIL-BG. RESULTADOS 113 B. Localización de las lesiones colposcópicas Si nuestra referencia son las agujas de un reloj, del total de las 77 colposcopias patológicas (84,6%), la mayoría de las lesiones se localizaban a las 12 h. y a las 6 h., con 29 casos (30,5%) y 22 casos (23,2%), respectivamente. Le siguen las 9 h. con 8 casos (8,4%), las 3 h. con 7 casos (7,4%), y las 11 h. con 3 casos (3,1%). En orden decreciente están las 2, 7 y 10 horarias con 2 casos (2,1%) cada una. En último lugar, las 5 h. y 8 h, con 1 caso (1,1%). No se registró ningún caso de lesión a las 1 y 4 h (Figura 47). Figura 47. Localización horaria de las lesiones colposcópicas. Esta localización horaria recogida por cuadrantes resultó con las siguiente distribución: en el cuadrante anterior se localizaron 32 casos (33,6%), en el cuadrante posterior 25 casos (26,4%), en el derecho 11 casos (11,6%), y en el izquierdo 9 casos (9,5%) (Figura 48). En 18 casos (18,9%) no constaba dicha localización. COLPOSCOPIA 12 6 9 3 2 7 10 5 8 RESULTADOS 114 Figura 48. Localización por cuadrantes de las lesiones colposcópicas. C. Tamaño de la lesión colposcópica La lesión colposcópica ocupaba un cuadrante en 46 casos (59,7%), 2 cuadrantes en 23 casos (29,9%) y 4 cuadrantes en 8 casos (10,4%). En 18 casos no se pudo conocer la extensión de la lesión (Tabla 30). Tabla 30. Tamaño de la lesión colposcópica. N Porcentaje (%) Tamaño de la lesión colposcópica 1 cuadrante 46 59,7 2 cuadrantes 23 29,9 4 cuadrantes 8 10,4 Total 77 100,0 ANTERIOR 32 casos 33,6% 26,4% 25 casos POSTERIOR DERECHO 11 casos 11,6% IZQUIERDO 9 casos 9,5% RESULTADOS 115 D. Afectación colposcópica del canal endocervical Se observó que la lesión colposcópica penetraba por el orificio cervical externo en 32 casos (33,7%) frente a 59 casos (62,1%) que no se introducía por el canal endocervical. En 4 casos (4,2%) no constaba la colposcopia en la historia clínica (Figura 49). Figura 49. Lesión que alcanza endocérvix colposcópicamente. 0 10 20 30 40 50 60 SI NO LESIÓN COLPOSCÓPICA QUE ALCANZA ENDOCÉRVIX RESULTADOS 116 Lesión histológica y lesión colposcópica que alcanza endocérvix Existe una relación estadísticamente significativa entre la lesión colposcópica que alcanza endocérvix y la gravedad histológica de dicha lesión (p=0,011) (Tabla31). La lesión alcanza el canal endocervical en el 34,1% de los casos de SIL-AG, frente al 1,1% de SIL-BG (Figura 50). Tabla 31. Relación entre lesión colposcópica que alcanza endocérvix y grado de lesión histológica. p=0,011 Lesión Total SIL-BG SIL-AG Lesión colposcópica que alcanza el canal endocervical SÍ Nº casos 1 31 32 % del total 1,1% 34,1% 35,2% NO Nº casos 14 45 59 % del total 15,4% 49,5% 64,8% Total Nº casos 15 76 91 % del total 16,5% 83,5% 100,0% Figura 50. Lesión colposcópica que alcanza OCE y lesión histológica. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 SÍ NO Frecuencia Lesión colposcópica que alcanza endocérvix SIL-BG SIL-AG RESULTADOS 117 3.5. Diagnóstico anatomopatológico del cono A. Margen quirúrgico Nuestra muestra está formada por los 95 casos (100%) de conizaciones con afectación de los márgenes quirúgicos. La localización topográfica de dicha afectación fue el borde endocervical en 55 casos (57,9%), el exocervical en 23 casos (24,2%) y ambos bordes (endo y exocérvix) en 17 casos (17,9%) (Figura 51). Figura 51. Localización de la afectación de los bordes quirúrgicos. Lesión histológica y localización de la afectación de los márgenes quirúrgicos La Tabla 32 muestra la significación estadística (p=0,001) entre el grado de lesión histológica y la localización del margen quirúrgico afectado. En las SIL-AG el borde endocervical está afectado en el 54,7% de los casos, y el exocervical en un 14,7%, frente al 3,2% y 9,5%, respectivamente, en las SIL-BG (Figura 52). LOCALIZACIÓN DE LA AFECTACIÓN DEL BORDE ENDOCERVICAL EXOCERVICAL AMBOS RESULTADOS 118 Tabla 32. Relación entre la lesión histológica y la localización de la afectación de los márgenes quirúrgicos. p=0,001 Lesión Total SIL-BG SIL-AG Localización de la afectación del borde Exocervical Nº casos 9 14 23 % del total 9,5% 14,7% 24,2% Endocervical Nª casos 3 52 55 % del total 3,2% 54,7% 57,9% Ambos Nº casos 3 14 17 % del total 3,2% 14,7% 17,9% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% Figura 52. Grado de lesión histológica y localización del margen quirúrgico afectado. 0 10 20 30 40 50 60 EXOCERVICAL ENDOCERVICAL AMBOS Frecuencia Localización del borde quirúrgico afectado SIL-AG SIL-BG RESULTADOS 125 Lesión histológica e infección por VPH postconización El diagnóstico molecular del VPH, realizado a los 6 meses de la conización, muestra una relación estadísticamente significativa con el grado de lesión histológica (p=0,048). En la historia clínica constaba este test en 42 casos (44,2%) de SIL-AG y en 12 casos (12,6%) de SIL-BG (Tabla 36). Tabla 36. Relación entre el grado de lesión histológica y el estudio molecular del VPH postconización. p=0,048 Lesión Total SIL-BG SIL-AG ESTUDIO MOLECULAR DEL VPH POSTCONIZACIÓN . SÍ Nº casos 12 42 54 % del total 12,6% 44,2% 56,8% NO Nº casos 3 38 41 % del total 3,2% 40,0% 43,2% Total Nº casos 15 80 95 % del total 15,8% 84,2% 100,0% De los 54 casos (56,8%) en los que se realizó el VPH potconización, su resultado fue negativo en 29 casos (53,7%), correspondientes a 25 casos (46,3%) de SIL-AG y 4 casos (7,4%) de SIL-BG. En 25 casos (46,3%) el estudio molecular del VPH postcono fue positivo. La relación del total de persistencia vírica postcono con el grado de lesión histológica cervical se muestra en la Tabla 37. RESULTADOS 126 Tabla 37. Relación entre la persistencia del VPH postcono y grado de lesión histológica de cérvix. NS Lesión Total SIL-BG SIL-AG PERSISTENCIA INFECCIÓN VPH POSTCONO ALTO RIESGO Nº casos 5 9 14 % del total 20,0% 36,0% 56,0% BAJO RIESGO Nº casos 1 4 5 % del total 4,0% 16,0% 20,0% ALTO+BAJO RIESGO Nº casos 2 4 6 % del total 8,0% 16,0% 24,0% Total Nº casos 8 17 25 % del total 32,0% 68,0% 100,0% La persistencia del VPH-AR estaba presente en 20 casos (80%) de los conos afectos, y de éstos en 14 casos (56%) como infección simple y en 6 casos (24%) se asociaba a VPH-BR. El VPH-AR, realizado a los 6 meses de la conización, con márgenes afectos, persistió en 13 casos (52%) de SIL-AG, en 9 casos (36%) de forma simple, frente a 4 casos (16%) en los que aparecía junto a VPH-BR, aunque dicha relación no fue estadísticamente significativa. B. Genotipo del VPH postconización El genotipo que más persistía a los 6 meses tras la conización fue el VPH 16, en 6 casos (6,3%), seguido del VPH 18 y el VPH de riesgo indeterminado, en 4 casos (4,2%). A continuación los VPH 45, 51 y 68 en 3 casos (3,2%), y los VPH 31, 51 y 66 en 2 casos (2,1%). Por último, los VPH 26 y 53 con 1 caso (1,1%) cada uno. También se detectaron 11 casos (11,6%) de persistencia de VPH-BR (Tabla 38 y Figura 57). RESULTADOS 127 Tabla 38. Genotipos del VPH postconización (frecuencia absoluta y relativa). VPH N Porcentaje (%) 16 6 6,3 18 4 4,2 Indeterminado 4 4,2 45, 51, 68 3 3,2 31, 56, 66* 2 2,1 26*, 53* 1 1,1 Bajo Riesgo 11 11,6 33, 35, 39, 52, 58, 59, 82,73 0 0,0 *Probable Alto Riesgo. Figura 57. Persistencia de genotipos del VPH postconización. 16 18, Indeterminado 45, 51, 68 31, 56, 66 26, 53 Bajo Riesgo PERSISTENCIA DE GENOTIPOS DEL VPH POSTCONIZACIÓN RESULTADOS 128 La Tabla 39 describe la persistencia de genotipos del VPH en relación con el grado de lesión histológica del cérvix. El VPH 16 postratamiento estaba presente en 5 casos (5,3%) de SIL-AG y en 1 caso (1,1%) de SIL-BG. Tabla 39. Lesión histológica cervical y persistencia de genotipos del VPH postratamiento. Lesión Total SIL-BG SIL-AG VPH 16 Nº casos 1 5 6 % del total 1,1% 5,3% 6,3% VPH 18 Nº casos 2 2 4 % del total 2,1% 2,1% 4,2% VPH Indeterminado Nº casos 1 3 4 % del total 1,1% 3,2% 4,2% VPH 45 Nº casos 1 2 3 % del total 1,1% 2,1% 3,2% VPH 51 Nº casos 2 1 3 % del total 2,1% 1,1% 3,2% VPH 68 Nº casos 1 2 3 % del total 1,1% 2,1% 3,2% VPH 31 Nº casos 0 2 2 % del total 0,0% 2,1% 2,1% VPH 56 Nº casos 1 1 2 % del total 1,1% 1,1% 2,1% VPH 66* Nº casos 1 1 2 % del total 1,1% 1,1% 2,1% VPH 26* Nº casos 1 0 1 % del total 1,1% 0,0% 1,1% VPH 53* Nº casos 0 1 1 % del total 0,0% 1,1% 1,1% VPH BR Nº casos 3 8 11 % del total 3,2% 8,4% 11,6% *Probable Alto Riesgo. RESULTADOS 129 4.3. Tiempo de seguimiento El tiempo medio de seguimiento postconización, en nuestra Unidad de Patología del TGI hospitalaria, fue de 23,29 meses, con un rango entre 3 y 70 meses (Figura 58), procediéndose a partir de ahí al alta del TGI y seguimiento en Atención Primaria, siguiendo el Proceso Asistencial Integrado (PAI) de Cáncer de cérvix de la Conserjería de Salud de la Junta de Andalucía. Figura 58. Tiempo de seguimiento. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 6 8 10 12 14 16 18 21 24 28 32 35 38 43 46 60 70 Frecuencia Nº meses de seguimiento RESULTADOS 130 5. DESCRIPCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE p16/Ki-67 Y SU CORRELACIÓN CON EL GRADO DE LESIÓN HISTOLÓGICA, Y LA PERSISTENCIA DE LA INFECCIÓN VIRAL La tinción dual p16/Ki-67 se aplicó en un total de 127 casos de márgenes de piezas de conización, con resultado positivo en 87 casos (68,5%), que se distribuyen de la siguiente forma: 5.1. Tinción dual y márgenes afectos En nuestra muestra de 95 conizaciones con márgenes afectos, constituida por 80 SIL-AG y 15 SIL-BG, aplicamos la tinción dual a los bordes de las piezas de conización, en 93 casos (97,9%), concretamente en 78 casos de SIL-AG y 15 casos de SIL-BG. La relación entre los resultados de la tinción dual p16/Ki-67 y el grado de lesión histológica cervical en las conizaciones con afectación de los bordes quirúrgicos se muestra en la Tabla 40, con una clara significación estadística (p=0,000). Tabla 40. Relación entre la tinción dual y el grado de lesión histológica con márgenes afectos. p=0,000 p16/Ki-67 Total POSITIVO NEGATIVO Lesión Margen Afecto SIL-BG Nº casos 2 13 15 % del total 2,2% 14,0% 16,1% SIL-AG Nº casos 72 6 78 % del total 77,4% 6,5% 83,9% Total Nº casos 74 19 93 % del total 79,6% 20,4% 100,0% RESULTADOS 131 El test dual resultó positivo en 72 casos (77,4%) de SIL-AG con márgenes afectos, y en 2 casos (2,2%) de SIL-BG (Figura 59). Figura 59. Tinción dual y grado de lesión histológica con márgenes afectos. También hemos estudiado la relación entre el doble marcador y la localización de la afectación del borde quirúrgico. Los resultados, con significación estadística (p=0,000), se muestran en la Tabla 41. Tabla 41. Relación entre la tinción dual y la localización de la afectación de los márgenes quirúrgicos. p=0,000 p16/Ki-67 Total POSITIVO NEGATIVO Localización de la afectación del borde Exocervical Nº casos 11 12 23 % del total 11,8% 12,9% 24,7% Endocervical Nº casos 48 5 53 % del total 51,6% 5,4% 57,0% Ambos Nº casos 15 2 17 % del total 16,1% 2,2% 18,3% Total Nº casos 74 19 93 % del total 79,6% 20,4% 100,0% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 SIL-BG SIL-AG Frecuencia Márgenes afectos Tinción dual (+) Tinción dual (-) RESULTADOS 132 En caso de afectación del borde endocervical, la tinción dual fue positiva en 48 casos (51,6%), y negativa en 5 casos ((5,4%). Cuando el borde exocervical estaba afectado, el test dual fue positivo en 11 casos (11,8%) y negativo en 12 casos (12,9%). 5.2. Tinción dual y márgenes indemnes Del total de las 480 conizaciones resultaron 326 casos con bordes libres: 243 SIL-AG y 83 SIL-BG. Para aplicar la tinción dual, escogimos una muestra de 34 casos, formada por 24 SIL-AG y 10 SIL-BG. Encontramos significación estadística (p=0,029) entre el test dual p16/Ki-67 y el grado de lesión histológica en las conizaciones con bordes quirúrgicos indemnes. Los resultados se muestran en la Tabla 42. Tabla 42. Relación entre la tinción dual y el grado de lesión histológica con márgenes indemnes. p=0,029 p16/Ki-67 Total POSITIVO NEGATIVO Lesión Margen Indemne SIL-BG Nº casos 1 9 10 % del total 2,9% 26,5% 29,4% SIL-AG Nº casos 12 12 24 % del total 35,3% 35,3% 70,6% Total Nº casos 13 21 34 % del total 38,2% 61,8% 100,0% El doble marcador fue negativo en el 61,8% de las SIL con márgenes indemnes, concretamente en 12 casos (35,3%) de SIL-AG y 9 casos (26,5%) de SIL-BG.  Además se aplicó la tinción dual a una muestra control, aleatoria, compuesta por 22 cérvix amputados, que habían sido intervenidos por otras causas distintas a procesos oncológicos, y el resultado fue negativo en el 100% de los casos. RESULTADOS 133 5.3. Tinción dual y persistencia del VPH-AR postcono Analizamos la relación entre el test dual p16/Ki-67 y la persistencia del VPH en las conizaciones, con márgenes afectos, y no observamos significación estadística (Tabla 43). Tabla 43. Relación entre tinción dual y persistencia de VPH postcono. NS p16/Ki-67 Total POSITIVO NEGATIVO PERSISTENCIA INFECCIÓN VPH POSTCONO SÍ Nº casos 17 7 24 % del total 26,9% 11,1% 38,0% NO Nº casos 31 8 39 % del total 49,3% 12,7% 62,0% Total Nº casos 49 14 63 % del total 76,2% 23,8% 100,0% Del total de 25 casos de persistencia vírica global (AR+BR) postconización, con bordes quirúrgicos positivos para lesión intraepitelial (Tabla 37), la tinción dual se aplicó en 24 casos (38%): el resultado fue positivo en 17 casos (26,9%) y negativo en 7 casos (11,1%). Tampoco observamos relación estadísticamente significativa entre la tinción dual y el resultado del riesgo del estudio molecular del VPH postconización (Tabla 44). El test dual resultó positivo en 13 casos (54,1%) de persistencia del VPH-AR, en 11 casos (45,8%) de forma simple y en 2 casos (8,3%) asociado a VPH-BR. RESULTADOS 134 Tabla 44. Relación entre la tinción dual y el resultado del riesgo del estudio molecular del VPH postconización. NS p16/Ki-67 Total POSITIVO NEGATIVO RIESGO INFECCIÓN VPH POSTCONO ALTO RIESGO Nº casos 11 3 14 % del total 45,8% 12,5% 58,3% BAJO RIESGO Nº casos 4 1 5 % del total 16,7% 4,2% 20,9% ALTO+BAJO RIESGO Nº casos 2 3 5 % del total 8,3% 12,5% 20,8% Total Nº casos 17 7 24 % del total 70,8% 29,2% 100,0% La Tabla 45 muestra la distribución de la expresión de p16/Ki-67 en relación con el grado de lesión histológica cervical y la persistencia de la infección viral postratamiento. En las SIL-AG, el doble marcador fue positivo en 11 casos (45,8%) de persistencia de VPH-AR postcono, en 9 casos (37,5%) de forma aislada y en 2 casos (8,3%) asociado a VPH-BR. Frente a 2 casos (8,3%) de positividad del test dual y persistencia de VPH-AR en las SIL-BG (Figura 60).