Control hormonal del desarrollo del fruto de Fresa Fragaria x ananassa

CONTROL HORMONAL DEL DESARROLLO DEL FRUTO DE FRESA FRAGARIA × ANANASSA Tesis Doctoral 2015 Elizabeth Estrada Johnson Departamento de Biología Molecular y Bioquímica Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga CONTROL HORMONAL DEL DESARROLLO DEL FRUTO DE FRESA FRAGARIA × ANANASSA Tesis Doctoral Elizabeth Estrada Johnson Departamento de Biología Molecular y Bioquímica Facultad de Ciencias Universidad de Málaga, Noviembre 2015 AUTOR: Elizabeth Estrada Johnson http://orcid.org/0000-0002-4207-6746 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOQUÍMICA DR. VICTORIANO VALPUESTA FERNÁNDEZ, Catedrático del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga. DRA. SONIA OSORIO ALGAR Investigadora Ramón y Cajal en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga. INFORMAN: que Dña Elizabeth Estrada Johnson ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo e investigación correspondiente a la elaboración de la presente Memoria de Tesis Doctoral. Y para que así conste, y tenga los efectos que correspondan, en cumplimiento con la legislación vigente, autorizamos la presentación de esta Tesis Doctoral en la Universidad de Málaga. Málaga a 27 de Julio de 2015 Fdo: Dr.Victoriano Valpuesta Fernández Fdo: Dra. Sonia Osorio Algar Este trabajo ha sido subvencionado por el Proyecto BIO2010-15630, beca de Formación del Personal Investigador (FPI) BES-2011-048461, del Ministerio de Economía y Competitividad. A mí Familia Introducción General 5 Introducción General La fresa La fresa cultivada (Fragaria × ananassa) es de los cultivos de pequeñas bayas más consumidos en el mundo. La producción mundial de fresa en el año 2013 fue de más de 7 millones (7 739 622) de toneladas, con un rendimiento de 21 400 Hg/Ha (http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx). España cuenta con una producción de 312 500 toneladas y un rendimiento del 390 625 Hg/Ha en el año 2013, siendo la principal abastecedora de la Unión Europea durante los primeros meses del año. La provincia de la que proviene más del 90 % de la producción de fresa en España es Huelva, que cuenta con una superficie de cultivo que oscila entre 6 000 y 7 000 hectáreas (FAOSTAT; López, 2008). Por las propiedades organolépticas que le aportan su aroma y su sabor característico, convierten a la fresa en la principal baya que se consume popularmente a nivel mundial, no sólo en las formas frescas y congeladas, sino también como productos procesados y derivados, incluyendo yogures, bebidas, mermeladas y jaleas (Giampieri et al., 2015). Son una fuente rica de una amplia variedad de compuestos nutritivos como azúcares, vitaminas (alto contenido en vitamina C) y minerales, así como compuestos bioactivos tales como folatos, flavonoides, antocianinas, ácidos fenólicos y taninos hidrolizables (elagitaninos y galotaninos). En los últimos años se han estudiado los efectos protectores del consumo de fresa y su repercusión en la salud humana, pues participan en una amplia gama de actividades biológicas que ayudan en la prevención de la inflamación, las enfermedades cardiovasculares, la obesidad, el síndrome metabólico, diferentes tipos de cáncer e incluso enfermedades neurológicas (Seeram et al, 2008; Giampieri et al, 2012, Giampieri et al., 2015). La fresa pertenece al orden Rosales, familia Rosaceae, subfamilia Rosoideae y género Fragaria. Hay un número limitado de especies silvestres en el género Fragaria, cercanas a 22, que incluyen desde especies diploides hasta decaploides (RousseauGueutin et al., 2009). Estudios moleculares basados en la historia de este género, revelaron que la poliploidización e hibridación dentro del género Fragaria ayudaron a su evolución. Estudios en el proceso de aloploidización de las especies octoploides F. virginiana, F. chiloensis y la fresa cultivada (F. × ananassa) muestran que comparten Introducción General 6 un genoma común, apoyando que F. vesca y F. mandshurica sean los donantes maternos, mientras que F. iinumae actúe como el donador paterno (Rousseau-Gueutin et al., 2009). Sin embargo, estudios recientes del origen evolutivo y dinámico de la fresa F. × ananassa mediante POLiMAPS (Phylogenetics Of Linkage-Map-Anchored Polyploid Subgenomes) mostraron que, al contrario con el modelo aceptado, sugieren que uno de los cuatro subgenomas se origina con : los donantes diploides F. vesca, F. iinumae, y dos con un antepasado desconocido cerca de F. iinumae (Tennessen et al., 2014). La amplia introgresión unidireccional ha convertido a que los subgenomas de F. iinumae sean más parecidos con F. vesca, pero nunca al revés, ya sea debido a la hibridación homoploide en los ancestros diploides de F. iinumae, o bien otra fuerte selección entre la secuencia de subgenomas de F. vesca mediante el intercambio homólogo (Tennessen et al., 2014). La fresa silvestre también llamada Fragaria vesca es diploide, con una dotación básica de 7 cromosomas, por lo que la hace una especie modelo de la familia Rosaceae, junto con el melocotón y la manzana (Shulaev et al., 2008). La fresa cultivada F. × ananassa es octoploide con 56 cromosomas. El primer híbrido que se conoce, data de mediados de 1700 en el Royal Botanical Garden de Francia (Hancock, 1999). El cruce fue accidental entre dos especies octoploides, F. chiloensis, proveniente de Chile y con un fruto de gran tamaño, y el polen de F. virginiana proveniente de Canadá, cuyo fruto se destaca por su delicado sabor (Hummer et al., 2009). A partir de esta primera generación, se han producido varias hibridaciones entre los parentales y descendientes. Esto ha conferido, a través del tiempo, a F. × ananassa características diversas, que hacen de ella una especie variable y altamente heterocigótica, capaz de adaptarse a diferentes condiciones ambientales. Gracias a esto, la fresa cultivada ha tomado una gran importancia en diversos lugares del mundo (Hancock, 1999). Anatomía y morfología del fruto de fresa La fresa cultivada (F. × ananassa), es una planta angiosperma, dicotiledónea, y presenta un follaje herbáceo, con porte perenne y de bajo crecimiento (Lpez, 2008). Se multiplica vegetativamente a base de estolones, los cuales presentan dos nodos. Las plantas hijas se generan a partir del segundo nodo, mientras que el primero queda en estado latente, o desarrolla otro estolón (Hancock, 1999). La fresa cultivada llega a generar desde 10 hasta 15 estolones produciendo hasta 100 plantas hijas, que llegan a ser independientes después de 2 a 3 semanas (Hancock, 1999; Lpez, 2008). El tallo central, o corona, está cubierto por hojas basales. Los tallos que presentan inflorescencia se les denomina: escapos florales. Estas inflorescencias son tallos Introducción General 7 modificados que en su parte final muestran la floración primaria. La flor típica es hermafrodita aunque también puede fecundarse por polen de flores de otros individuos de la misma especie; tiene 10 sépalos, cinco pétalos (algunas variedades presentan 6), y 20 a 30 estambres (Hancock, 1999). La fecundación de cada óvulo forma el fruto, que es de tipo aquenio. Los aquenios son los verdaderos frutos de la fresa, es por esto que se dice que la fresa en un falso fruto. Lo que se conoce como fruto es en realidad el receptáculo floral (base de la flor) engrosado junto con los aquenios que se encuentran anclados en su superficie. Cuando los aquenios llegan a su estado maduro se pueden distinguir las partes que lo conforman, como son: el pericarpo, la testa, el endospermo y el embrión (Perkins–Veazie, 1995). El receptáculo está conformado por varias partes, una medula ubicada en el centro, un cor ex carnoso, una epidermis, donde se encuentran distribuidos los aquenios y un conjunto de haces vasculares que conectan el receptáculo con los aquenios (Figura 1) (Perkins-Veazie et al., 1995; Hancock, 1999). Figura 1: Morfología del fruto de fresa (adaptado de Hanckok, 1999). Maduración del fruto de fresa En el proceso de desarrollo del fruto de fresa se han establecido diferentes estadios de maduración basados inicialmente en el cambio de pigmentación externa que presenta la fresa. Es muy importante la temperatura, ya que de ella depende el desarrollo del fruto y su maduración, que se produce de 30 a 40 días después de la antesis (Figura 2) (de la Fuente et al., 2006). Los estadios que fueron considerados en la presente Tesis Doctoral fueron: fruto verde (receptáculo verde y aquenio verde, Introducción General 8 aproximadamente 12 días después de la antesis), fruto blanco (receptáculo blanco y aquenio verde-café, aproximadamente 21 días después de la antesis), fruto intermedio (receptáculo blanco-rojo y aquenio café-rojo, aproximadamente 29 días después de la antesis) y fruto rojo (receptáculo y aquenio rojo, aproximadamente 35 días después de la antesis). Figura 2. Estadios de desarrollo y maduración del fruto de la fresa. Frutos de la fresa cv. Camarosa en diferentes estadios, Fc: flor cerrrada: Fa: flor abierta; V: fruto verde; B: fruto blanco; I: fruto intermedio y R: fruto rojo. En el proceso de maduración del fruto de la fresa se suceden diversos cambios celulares y bioquímicos. En el receptáculo,inicialmente se produce la división celular, que ocurre en los primeros 10 a 15 días después de la antesis, seguida de la elongación celular, la cual representa la mayor parte del crecimiento del fruto (de la Fuente et al., 2006). Conforme el receptáculo va madurando, se observan cambios en la textura, asociados con el metabolismo de la pared celular y, cambios metabólicos, como a la acumulación de azúcares, ácidos, polifenoles, pigmentos y compuestos volátiles (Hancock, 2000; Gapper et al., 2013). La concentración de sólidos solubles, que incluyen los azúcares, los ácidos y otros compuestos orgánicos, varía desde un 5 % en el fruto verde, a un 7 % en el fruto maduro. Los azúcares contienen un 80 a 90 % de glucosa y de fructosa, y el resto es fundamentalmente sacarosa (Perkins-Veazie, 1995). El contenido de antocianinas y otros flavonoides va variando durante el proceso de maduracio del fruto: en el estadio blanco empieza la aparición de antocianinas, que siguen incrementándose hasta su mayor contenido en el fruto rojo (Jia et al., 2011). Durante la maduración, también se producen cambios en la producción de volátiles y compuestos nitrogenados (PerkinsVeazie, 1995; Hancock, 2000, Zorrilla-Fontanesi et al., 2012). Introducción General 9 Regulación hormonal en el fruto de fresa Auxina La hormona vegetal llamada auxina (ácido indol-3-acético, IAA) regula prácticamente todos los aspectos del crecimiento de las plantas y el desarrollo. Dependiendo de su localización, la auxina promueve procesos como la organogénesis, la división y elongación celular, así como el crecimiento, desarrollo y maduración de frutos. Sin embargo, los mecanismos por los que la auxina regula estos procesos no se conocen en todos los casos (Teale et al., 2006; Benjamin y Scheres, 2008; Pattison et al., 2014). En los estudios realizados en 1950 por Nitsch, demostraron que el crecimiento del receptáculo de fresa está regulado por la auxina, la cual essintetizada en los aquenios (Nitsch, 1950). Los primeros estudios sobre el contenido de la auxina en los frutos de fresa fueron hechos por Archbold y Dennis (1984), cuyos resultados indicaron que en el estadio de antesis los niveles de IAA ascendían a 6.2 μg/g de peso seco, mientras que en los aquenios a los 14 días después de la antesis este valor se redujo aproximadamente a la mitad (3.1 μg/g de peso seco). Por otro lado, en receptáculo a esta misma edad los niveles son de 2.8 μg/g de peso seco (Archbold y Dennis, 1984). Recientemente. los estudios de Symons et al., (2012), muestran que los niveles de IAA en F. × ananassa fueron bajos durante la floración,aunque estos niveles aumentan rápidamente hasta el máximo nivel en estadio de fruto verde pequeño (12 días después de la antesis), disminuyendo posteriormente a medida que el fruto se desarrolla y madura. Se ha demostrado que hay diversos genes que están relacionados con la maduración del fruto y que pueden estar regulados en su expresión por la auxina. En las investigaciones de Harpster et al. (1998), se mostr que el gen FaCE1, que codifica una endo-1,4-β-glucanasa (EGasa) relacionada con el reblandecimiento de la fresa, tiene una expresión regulada por auxina. La aplicación de auxina sintética, naftalen acético (NAA), produjo una disminución del nivel de ARNmensajero de FaCE1, por el contrario al desaquenizar los frutos el efecto fue el contrario. Por otro lado en este mismo estudio fue la primera vez que se postul{o que la disminución de los niveles de la auxina a lo largo de la maduración correlaciona con la activación de la expresión de algunos genes relacionados con la maduración del fruto (Harpster, 1998). Un ejemplo de ello es el gen que codifica a la proteína pectato liasa (FaPL) ya Introducción General 10 que al eliminar la fuente de auxina (desaquenizado del fruto) se produce un aumento en la expresión de este gen, mientras que la aplicación de NAA, hace que su expresión disminuya (Medina-Escobar et al., 1997). Esta acción de la auxina se ha relacionado con varios procesos que ocurren durante la maduración del fruto, y que están relacionados con defensa, pigmentación, biosíntesis de la pared celular, biosíntesis de compuestos de aroma y con el metabolismo de ácidos grasos. En el año 2002, se hizo un estudio de la expresio por microarrays de múltiples genes, cuyos resultados mostraron que 30 de los 45 genes involucrados en la maduración están regulados con auxinas; siendo 25 de ellos inducidos por auxinas (Aharoni, et al., 2002). Rutas de biosíntesis de auxinas Los mecanismos de percepción y señalización de las auxinas, son importantes en la regulación del desarrollo y maduración de la fresa (F. × ananassa). Es por esto que el estudio de las rutas de biosíntesis de la auxina en la fresa, resulta de gran interés. Basados en estudios bioquímicos, se han descrito dos rutas generales en la biosíntesis de auxina, la ruta independiente de triptófano (Trp) y otra dependiente de triptófano (Normanly et al., 1993). Estudios bioquímicos apoyan la existencia de la ruta Trp-independiente, que se ramifica desde la vía biosintética de L-Trp en el nivel de Indol-3-glicerol fosfato (IGP) (Ouyang et al., 2000). Hay estudios que muestran que en la biosíntesis de Trp tiene lugar en los cloroplastos, donde las enzimas triptófano sintasa α (TSA) y triptfano sintasa β (TSB) forman un complejo y convierten al Indol glicosinolato (IG) a Trp (Ouyang et al., 2000; Wang et al., 2015). Estudios recientes muestran evidencia genética y bioquímica donde la enzima indol sintasa (INS) localizada en el citosol, es un componente clave e iniciador de la ruta de biosíntesis de auxina triptófano-independiente y es fundamental para la formación del eje apicalbasal durante la embriogénesis temprana en Arabidopsis (Wang et al., 2015). Aunque, aún no se conocen por completo estas vías, en Arabidopsis se han propuesto al menos 3 rutas interconectadas de biosíntesis de auxinas triptófano-dependientes, las cuales toma su nombre por el intermediario inmediato después del Trp y son: indol-3acetaldoxima (IAOx), indol-3-acetamida (IAM), y el ácido indol-3-pirúvico (IPA) (Mashiguchi et al., 2011; Brumos et al., 2014; Tivendale et al., 2014). La primera, la ruta IAOx (Indole-3-acetaldoxima)en la que participan las enzimas citocromo P450 monooxigenasas, CYP79B2 y CYP79B3. Anteriormente, se Introducción General 11 sugirió que IAOx era producido a partir de la vía triptamina TAM, teniendo como intermediario a la N-hidroxitriptamina (NHT), sin embargo, Sugawara et al., (2009) y Nonhebel et al., (2011) demostraron que las enzimas CYP79B2/3 eran responsables de la gran mayoría de la producción de IAOx en Arabidopsis. La expresión ectópica de cualquiera de los genes CYP79B2 o CYP79B3 de Arabidopsis en Nicotiana tabacum, resultó en la biosíntesis de IAOx. Los genes superroot 1,2 (SUR1 y SUR2) están involucrados en la producción de glucosinolatos indólicos (IG) a partir de IAOx. Al ser inactivados SUR1 y SUR2, se interrumpe la biosíntesis de IG, provocando la acumulación de IAOx, aumentándose así la producción de IAA (Zhao et al., 2010). Por otro lado, ensayos enzimáticos in vitro, indican que la enzima CYP71A13 es la responsable de la conversión de IAOx a indol-3-acetonitrilo (IAN) (Nafisi et al., 2007). Un mecanismo propuesto en la conversión de IAN a IAA, es mediante las enzimas nitrilasas (NITs) (Bartel y Fink 1994). Sin embargo, hay estudios que muestran que IAN y las NITs no participan en la producción de IAA de una manera significativa, sino que desempeñan un papel predominante en el metabolismo de glucosinolatos, la homeostasis de la camalexina y la desintoxicación de cianuro (Su et al. 2011; Brumos et al., 2014). Diversos estudios indican que la vía IAOx se limita a la Brassicaceae donde podría ser más importante para la producción de los glucosinolatos de indol que IAA (Sugawara et al., 2009). La ruta de IAOx, probablemente no es la más importante para la biosíntesis de IAA en plantas, pues no se ha detectado en monocotiledóneas como arroz y maíz; además no se han identificado ortólogos de CYP79B2/B3 en estas especies (Figura 3) (Zhao, 2010). La segunda ruta IAM (indol-3-acetamida) se pensaba que sólo estaba presente en bacterias, donde la enzima triptófano monooxigenasas (iaaM) convierte el Trp a IAM, mientras que la enzima indol-3-acetamida hidrolasa (iaaH) cataliza la síntesis de IAA a partir de IAM (Lehmann et al., 2010). En el año 2003, Pollmann et al.,(2003) descubrieron la existencia de la ruta IAM en las plantas, lo que apoya a los estudios que han identificado al IAM como un compuesto endógeno en varias plantas (Pollmann et al., 2003; Sugawara et al., 2009). Estudios en Arabidopsis muestran que la producción de IAM, se produce a partir de IAOx, sin embargo, en otras especies como arroz, maíz y tabaco, no parece que sea así, pues carecen de homólogos de la enzima CYP79B2/3 y no cuentan con IAOx endógeno. Por lo tanto, se propone que en las especies distintas de Arabidopsis y sus parientes, el Trp sea convertido a IAM por la acción de las enzimas de tipo iaaM (Figura 3), después son convertidas en IAA por miembros de una familia de enzimas denominadas AMI1 (amidasas1) (Lehmann et al., 2010). Se ha propuesto que la enzima AMI1 en Arabidopsis, y tabaco, sea Introducción General 12 necesaria para la conversio de IAM a IAA (Pollmant et al, 2003). Estudios en semillas de guisante (Pisum sativum L.) han mostrado que el IAM no se convierte en IAA y que el IAM endógeno no es detectable por estar por debajo del límite de detección, (Figura 3) (Tivendale et al ., 2012; Tivendale et al., 2014). Estudios recientes han demostrado que la mayor obtención de IAA en plantas se produce a través de la tercera ruta IPA (indol-3-ácido pirúvico) (Mashiguchi et al., 2011 Stepanova et al., 2011, Won et al., 2011). A través del estudio de mutantes se ha demostrado que TAA1 (triptófano aminotransferasa de Arabidopsis 1) y sus homólogos TAR1 (triptófano aminotransferasa relacionada 1) y TAR2 (triptófano aminotransferasa relacionada 2) catalizan la reacción a partir de triptófano a IPA, jugando un papel importante en la biosíntesis de las auxinas. Figura 3. Rutas de Biosíntesis de la auxina en Arabidopsis. Los compuestos de interés para la síntesis de IAA se muestran en negro. Las flechas continuas indican los pasos bien caracterizados. Las flechas discontinuas señalan los pasos incompletos. Los genes que participan en la ruta Trp-independiente proveniente de IGP (indol-3-glicerol fosfato) se encuentra en verde. Los genes involucrados en la biosíntesis de la auxina Trp-dependientes se encuentran en azul, mientras que los genes bacterianos se muestran en rojo. IAOx (indol-3acetaldoxima), IAM (indol-3-acetamida), IPA (ácido indol-3-pirúvico), TAA1/TARs (triptófanoaminotransferasas), YUCs (genes YUCCA flavin-monooxigenasas), CYP79B2 y CYP79B3 (citocromo P450), CYP71A13 (deshidratasa indoleacetaldoxime), NITs (nitrolasas), AMI1 (indol3-acetamida hidrolasa); CYP83B1 (citocromo P450 monooxigenasas), SUR1 y SUR2 (superroot 1 y 2), UGT74B1 (UDP-glucosa: S-glucosiltransferasa tiohidroximato), iaaM (triptófano monooxigenasa), iaaH (indol-3-acetamida hidrolasa) IG (glucosinolatos de indol), Introducción General 13 CAM (camalexina). (Adaptado de Brumos et al., 2014). Por otro lado, en Arabidopsis se ha mostrado que los genes YUCCA (YUC) tienen un papel clave en la biosíntesis de auxinas (Zhao, 2010), habiéndose identificado homólogos de estos genes en todos los genomas de plantas cuya secuencia es conocida. Por tanto, la ruta YUC est altamente conservada en todo el reino vegetal (Zhao, 2010). Se había propuesto que las proteínas TAA y YUC, requeridas para la biosíntesis de las auxinas durante el desarrollo de las plantas, actuaban en rutas independientes (Zhao, 2010; Lehmann et al., 2010). Sin embargo, estudios recientes demuestran que las proteínas de la familia de TAA producen IPA y que las proteínas de la familia YUC, están involucradas en la conversin de IPA a IAA (Mashiguchi et al., 2011). Simultáneamente, se mostró que los fenotipos de sobreexpresión de YUC dependen de los genes activos de TAA (Won et al., 2011). Los análisis genéticos indicaron que los genes TAA y YUC están involucrados en la misma ruta de biosíntesis de las auxinas, situando a los genes YUC a continuación de los genes TAA. Los mutantes yuc acumulan IPA, y los mutantes taa son parcialmente deficientes de IPA (Won et al., 2011). Estudios recientes sugieren que las reacciones enzimáticas implicadas en la producción de IAA, a través de la ruta IPA, son diferentes de las postuladas anteriormente y que pertenecen a la misma ruta de biosíntesis TAA1-YUC (Figura 3) (Stepanova et al., 2011). Señalización de auxinas La señalización de las auxinas y la comprensión de los diversos procesos, se siguen investigando en la actualidad. Hasta el momento, se conocen tres receptores de las auxinas que son: Auxin Binding Protein 1 (ABP1), S-Phase Kinase-Associated Protein 2A (SKP2A) y el SCFTIR1/AFBs-Aux/IAA (SKP-Cullin-F box [SCF], TIR1/AFB [Transpor Inhibitor Resistant1/Auxin Signaling F-Box], Auxin/Indole Acetic Acid) (Dharmasiri et al, 2005 Jurado et al., 2010; Calderón-Villalobos et al, 2012; Peer 2013; Xu T et al, 2014; Grones et al., 2015). El sistema mejor caracterizado es el SCFTIR1/AFBs-Aux/IAA, el cual regula la transcripción dependiente de la auxina en el núcleo. La subunidad TIR1 está constituido por un dominio N-terminal tipo F-box, una región espaciadora de 40 residuos, 16 repeticiones ricas en leucinas (LRR) y un extremo Cterminal de 70 residuos aproximadamente. El complejo SCF (SKp1/Cullin /F-box) cuenta con 4 subunidades: CDC53 (CUL1), RBX, SKP1 (ASK1 en plantas) y proteínas con dominio F-box (Dharmasiri et al, 2005; Mockaitis and Estelle, 2008). En CUL1 se acoplan las Introducción General 14 subunidades restantes e interaccionan con la proteína SKP1/ASK1 (Sphase kinaseassociated protein 1) que a su vez se une con F-box (Jurado et al., 2010). Entre los seis TIR1/AFB que hay en Arabidopsis, TIR1 y AFB2, mostraron ser los reguladores positivos en la señalización de la auxina, mientras que AFB4 es un regulador negativo; AFB5 se une a la auxina y a la proteína IAA3 Aux/IAA, y por lo tanto, es probable que sea un receptor de la auxina (Dharmasiri et al, 2005; Parry et al., 2009; Greenham et al., 2011; Peer, 2013). La auxina sirve como pegamento molecular entre la subunidad TIR1 del complejo ubiquitina ligasa SCFTIR1/AFBs-Aux/IAA, la cual estimula la ubiquitinación de las proteínas Aux/IAA, para su posterior degradación en el proteosoma 26S (Tan et al, 2007; Lau, 2008; Chapman y Estelle 2009). La degradación de las proteínas Aux/IAA permite la liberación de factores de transcripción con respuesta a la auxina (ARFs), regulando la transcripción de los genes con respuesta a la auxina (Gray, 2001; Benjamin y Scheres, 2008; Pattison et al., 2014). En Arabidopsis hay 29 proteínas Aux/IAA y 23 ARF, de las cuales ARF5-ARF8 y ARF19 son activadores de la transcripción, mientras que ARF2-ARF4 y ARF9 han demostrado ser represores transcripcionales, con el resto de los ARF, se cree que son también represores (Guilfoyle et al., 2007; Peer, 2013). En Arabidopsis, las proteínas Aux/IAA que tienen 4 dominios conservados, el dominio II sufre la ubiquitinación y los dominios III, IV son de dimerización, donde se reconocen los ARF y permiten la interacción entre los miembros de las dos familias de proteínas (Tiwari, et al., 2001; Tiwari et al., 2003). Los ARFs en Arabidopsis, que están compuestos de un dominio Nterminal de unión a DNA (DBD), se une a sitios de unión específicos llamados elementos de respuesta a auxinas. Estos elementos son típicamente representados por la secuencia TGTCTC, que también actúa como sitio de unión de las proteínas ARF (Ulmasov et al., 1997; Guilfoyle y Hagen 2007). Estudios sobre la estructura secundaria de los dominios de III y IV de las proteínas ARF y IAA presentaron como las interacciones entre estos factores de transcripción pueden interactuar entre sí (Guilfoyle y Hagen 2012). Los resultados de este estudio, revelan que las proteínas IAA29, IAA31 y IAA32, así como ARF10, ARF14, ARF15, ARF16, ARF20 y ARF21 en Arabidopsis carecen del dominio PB1 (Dominio Phox y Bem 1) tipo I, pero contienen el dominio PB1 tipo II (tiene una lisina invariante situada en β1). El dominio PB1 tipo II, generalmente contiene residuos básicos adicionales que intervienen en las interacciones con los dominios PB1 tipo I o de tipo I/II, permitiendo que las proteínas ARF y IAA puedan interactuar entre sí (Guilfoyle y Hagen 2012). Recientes análisis en el genoma del tomate (Solanum lycopersicum), sugieren que hay al menos 3 TIR1/AFB, 25 Aux/IAA y 21 genes ARF, que proporcionan múltiples combinaciones posibles de isoformas y que podrían regular la respuesta a Introducción General 21 (Swain y Singh, 2005). Se ha mostrado que en determinados tejidos, la aplicación de giberelina puede inducir un aumento en el contenido de la auxina (Sastry y Muir, 1963), pero, a su vez, la auxina es capaz de estimular la biosíntesis de la giberelina (Koshioka et al., 1994). Estos hechos indican que hay una interacción importante entre estas dos hormonas en diversos procesos fisiológicos (de Jong et al., 2009). En la fresa, se ha mostrado recientemente que las giberelinas están implicadas en la maduracin y desarrollo del fruto (Csukasi, 2010; Csukasi et al., 2011; Csukasi et al., 2012; Vallarino et al., 2015). Su implicación en otros procesos sigue siendo tema de estudio. Síntesis de Giberelinas La biosíntesis y catabolismo de las giberelinas en las plantas, así como la ruta de señalización, se han descrito anteriormente (Thornton et al., 1999). La biosíntesis de la giberelina en las plantas superiores se puede dividir en tres etapas: (1) la producción de ent-kaureno en proplastidos; (2) conversión de ent-kaureno a GA12 a través de la proteína citocromo P450 monooxigenasas; y (3) la formación de C20 y C19-GAs en el citoplasma (Figura 5 ;Hedden y Phillips, 2000; Cheng C et al., 2015). Figura 5. Biosíntesis de giberelina (Cheng et al., 2015). En rectángulo verde: I, primera etapa de la biosíntesis de giberelinas; II, segunda etapa de la biosíntesis de giberelinas; III, tercera etapa de la biosíntesis de giberelina. En rectángulo azul están los intermediarios y en naranja el catabolismo de giberelinas. CDP (ent-copalil difosfato), CPS (ent-copalil difosfato sintasa), GA13ox (GA 13-oxidasa), GA2ox, (GA 2-oxidasa), GA20ox (GA 20-oxidasa), GA3ox (GA 3-oxidasa), KAO (ácido ent-kaurenoico oxidasa), KO (ent-kaureno oxidasa), KS (entkaureno sintasa) (Cheng C et al., 2015) Introducción General 22 Señalización de Giberelinas Después de su biosíntesis, la señalización de las giberelinas en Arabidopsis, se inicia a través de su unión al receptor GA INSENSITIVE DWARF1 (GID1). Esto permite la posterior interacción entre GID1 y las proteínas DELLA. En Arabidopsis se conocen 5 proteínas DELLA que incluyen: GA INSENSITIVE (GAI), REPRESOR O GAI-3 (RGA), RGA-like1/2/3 (RGL1, RGL2, y RGL3). Estas proteinas son represores transcripcionales y cuando no están unidas a GID1, reprimen la expresión de los genes con respuesta a giberelina (Fleet et al., 2005). En presencia de la giberelina, los complejos GID1-GA-DELLA son reconocidos por la proteína F-box SLEEPY1 (SLY1) del complejo SCFSLY1, que se encarga de la ubiquitinización de las proteínas DELLA, provocando su degradación mediante el proteasoma 26 (Figura 6; Shan et al., 2012; Cheng C et al., 2015). Figura 6. Señalización de las giberelinas en Arabidopsis. GA (giberelina), GID1 (GA Insensitive Dwarf1), SLY1 (proteina F-box SLEEPY1) (Cheng C et al., 2015) En relación al desarrollo reproductivo, estudios recientes mostraron que la aplicación de GA3 a inflorescencias de vid, promovieron la apertura de la flor, indujeron la coloracion de los frutos y el aborto de semillas. Estos resultados, junto con el estudio transcriptómico paralelo que se hizo, indicaron que las alteraciones Introducción General 23 morfológicas inducidas por GA3, pueden estar relacionados con el control de la biosíntesis de la hormona, la señalización, la regulación de factores de transcripción, la alteración de los metabolitos secundarios, y la estabilidad de la homeostasis redox (Cheng et al., 2015). En la fresa, la acción de las giberelinas en el desarrollo del fruto presenta resultados dispares. Así, la aplicacio de ac do gibere ico mediante spray a plantas de fresa de la variedad Pusa Dwarf Early (Enano Pusa Temprano), en invierno, provocaron que la cosecha se adelantara y que la produccio aumentara (Singh et al., 1960). Sin embargo, en otro experimento, la aplicacio de giberelina en fresas F. vesca semperflorens variedad Baron Solemacher durante el otoo, mostraron una disminucio en la produccin (Guttridge y Thompson, 1964). En otros estudios, la aplicacio de giberelina (GA3) no estimulo el crecimiento de frutos a los que se haban eliminado los aquenios (Archbold y Dennis, 1985). Por otro lado, la concentración del ácido indolacético libre (IAA) en lo frutos tratados con el ácido naftalenacético (NAA) fue 5 veces mayór que en los controles y 3 veces más que en los frutos tratados con GA4+7 (en 2 % de DMSO más 0.1 % de tween 80), a los 6 días del tratamiento (Archbold y Dennis, 1985). A los 14 días después del tratamiento, los niveles habían disminuido en todo el fruto tratado. La concentración de IAA en el receptáculo de frutos intactos (con aquenios) era casi igual o mayor que la de los aquenios a los 14 días después de la polinización (Archbold y Dennis, 1985). Estudios posteriores mostraron un retraso significativo tanto en la evolucio del color como en las actividades de las enzimas clorofilasa y peroxidasa en los frutos cosechados que haban sido tratados con GA3 En otro estudio, la actividad de la enzima fenilalanina amonio-liasa (PAL), necesaria para la producción de antocianinas en la maduracio de la fresa (Manning, 1994) y, incrementa su actividad durante la maduracio , este incremento se vió retrasado en frutos tratados con GA3 (Martnez et al., 1996). Esta implicacio de las giberelinas en el desarrollo del color del fruto de fresa se volvio a observar al sumergir los pednculos de frutos blancos en una solucio de GA3 durante tres das, producie dose un pequen retraso en la acumulacio de las antocianinas (Bustamante et al., 2009). Estudios de genes relacionados con la percepcio y sealizacio de giberelinas realizados en nuestro grupo de investigacio , han revelado que éstos muestran patrones de expresio muy especficos, que varan con el estadio de maduracio , lo que sugiere una participacio activa de esta hormona en el desarrollo del fruto (Csukasi, 2010; Csukasi et al., 2011). Estos estudios mostraron que la giberelina bioactiva GA4 está involucrada en los procesos de desarrollo, principalmente en la transicio del estadio verde a blanco, y posteriormente al rojo Introducción General 24 (Csukasi et al., 2011). Ademas los resultados muestran que la GA4 se acumula en el receptacu o verde, llegando a un ma imo en el estadio blanco, para su posterior disminucio en el estadio rojo. Los resultados de Csukasi et al. (2011) sugieren que el receptacu o es un órgano donde pueden actuar las giberelinas durante su desarrollo, en coordinacio con las auxinas. Ácido abscísico En las plantas, la fitohormona ácido abscísico (ABA) está implicada en diversos aspectos como el crecimiento de las plantas, el desarrollo, y las respuestas al estrés ambiental (Leung y Giraudat, 1998; Finkelstein y Rock, 2002; Himmelbach et al, 2003;. Hirayama y Shinozaki, 2007). Hay estudios que muestran que la hormona ABA promueve la acumulación de azúcar en los frutos carnosos (Kobashi et al., 1999; Richings et al, 2000; Pan et al., 2005) y juega un papel en la regulación de la maduración de frutos climatéricos y no climatéricos (Giovannoni, 2001;. Rodrigo et al., 2003; Zhang et al., 2009;. Sun et al., 2010). En el tomate, la supresión del gen que cataliza el primer paso en la biosíntesis de ABA (NCED1, 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa), tiene como resultado una disminución de la expresión de algunos genes de pared celular relacionados con la maduración, tales como poligalacturonasa y pectinmetilesterasa, así como un aumento en la firmeza y una vida útil más larga del fruto (Sun et al., 2010). Del mismo modo, la reducción de la expresión NCED, se correlaciona con el retraso de la maduración de la fresa (Jia et al., 2011). En la fresa F. × ananassa, hay diversos estudios donde demuestran que el cido abscsico (ABA), promueve la maduración del fruto. El uso de la técnica de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) en los frutos de la fresa, aplicado al silencimiento del gen 9cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (FaNCED1) provoca una disminución significativa en los niveles de ABA y la detención de la maduración, con la paroducción de frutos sin color (Jia et al., 2011). Estos datos proporcionan evidencia de que ABA es una hormona que promueve la maduración de la fresa (Jia et al.,2011). Brasinoesteroides Se ha descrito que los brasinoesteroides (BR), tienen un papel importante en el desarrollo y maduracio del fruto. Esta hormona se estudio en tomate (climate ico) (Montoya et al., 2005), y en uva (no climateric ) (Symons, 2006). Tanto en el tomate como en la uva, se vio un incremento en la cantidad de BR endgenos en el Introducción General 25 desarrollo. Esto coincide con los estudios donde se ve su relacio con la maduracio del fruto (Symons, 2006). Los estudios en la fresa de Bombarely et al., (2010), mostraron cambios en el receptor de brasinoesteroides FaBRI1, cuya expresión fue mayor en el receptáculo, la cual fue aumentando con la maduración. La expresión de FaBRI1 en el receptáculo rojo sugiere un aumento de la concentración de esta hormona en la última etapa de maduración. La expresio de los genes involucrados en la sealizacio FaBZR/FaBIN2 es alta en los aquenios blancos y baja en el receptacu o blanco (Bombarely et al., 2010). Esta información es preliminar, y si bien apunta a una participación de los brasinosteroides en la maduración del fruto de fresa, merecería seguir estudiando este tema. Jasmonato El ácido jasmónico (JA) y el jasmonato de metilo (MeJA), son importantes reguladores celulares de una amplia gama de procesos, incluyendo la tolerancia al estrés biótico y abiótico, la germinación de semillas y la senescencia foliar. Los JAs también se ha encontrado que desempeñan un papel en la maduración del fruto. En la manzana, una fruta climatérica, la aplicación de MeJA, produce un incrementando en: etileno, biosíntesis de ésteres, el color rojo, en el contenido antocianinas y betacaroteno, así como la acumulación de varios compuestos fenólicos (Fan et al., 1997; Rudell et al., 2002). Los estudios realizados por Concha et al., (2013) sobre el papel de los jasmonatos (JAS) en la maduración de fresa (Fragaria chiloensis) empleando varias concentraciones de jasmonato de metilo (MeJA, 10 y 100 mM) en cultivo in vitro sugiere que MeJA promueve la maduración y los procesos relacionados con defensa. Procesos que principalmente parece estar mediado a través de la regulación del etileno. Los cambios observados fueron cambios en la síntesis de lignina, cambios fisiológicos, como el cambio de color, e incremento en el contenido de la proporción entre sólidos solubles/ácidez titulable (SSC/TA) (Concha et al., 2013). A su vez, los efectos a largo plazo observados a los 9 días después del tratamiento con MeJA, parecen estar relacionados con los procesos de senescencia, la regulación de los genes de la biosíntesis del etileno, acumulación de lignina y degradación de hemicelulosa. Los hallazgos de Concha et al., (2013) sugieren que JAs promueven la maduración de los frutos no climatéricos a través de su participación en la acumulación de antocianinas, la modificación de la pared celular y la biosíntesis del etileno. Sin embargo, se requieren más estudios para aclarar el papel de MeJA en la Introducción General 26 maduración del fruto de la fresa, y sobre todo, la interacción de MeJA con el etileno, las antocianinas y vías de biosíntesis de lignina (Concha et al., 2013). Un estudio reciente, realizó la clonación y caracterización funcional de una S-adenosil-Lmetionina: ácido jasmónico carboxil metiltransferasa (JMT) de F. vesca y F. × ananassa (Preuß et al.,2014). En donde demostraron mediante ensayos bioquímicos y análisis transcriptómico que el gen JMT se ha anotado erróneamente como gen de fusión con una carboxil metiltransferasa (CMT, gen 15184) en la primera secuencia del genoma publicado de F. vesca. Estos estudios también demostraron que el gen JMT parece que juega un papel clave durante las primeras etapas de desarrollo del fruto de la fresa, por la inactivación de la hormona JA de la planta, a través de la conversión a MeJA. Sin embargo, estos estudios sugieren que como los niveles de expresión del gen CMT fueron altos en el receptáculo rojo, este gen puede tener su función en las últimas etapas de la maduración del fruto de fresa (Preuß et al., 2014). Hormonas y regulación transcripcional de la maduración de los frutos de fresa Existe información relativamente abundante sobre la regulación transcripcional de la maduración de los frutos de fresa. Los estudios se basaron en la identificación de cambios de expresión a lo largo del proceso, en pocos casos apoyados por pruebas funcionales. En la mayoría de los casos se identificaron genes responsables de los cambios que ocurren en los frutos de la maduración, como color, composición, aroma, o firmeza (Aragüez et al., 2013a y 2013b; Sánchez–Sevilla et al., 2014). Sin embargo, en relación con los factores de transcripción, el número de estudios es más limitado. Algunos factores de transcripción que codifican genes han sido asociados a la síntesis de flavonoides, tales como FaMYB10 (Medina-Puche et al., 2014) y FaMYB1 (Aharoni et al., 2001), el primero actúa como un activador transcripcional y el segundo como un represor de un subconjunto de genes de la vía. También diferentes componentes del regulador complejo MYB-bHLH-WD40 han sido claramente identificados como de importancia para la biosíntesis de los flavonoides durante el desarrollo del fruto de la fresa (Schaart et al., 2013). Otros factores de transcripción se han asociado a los roles más amplios en todo el desarrollo, como FaMADS9 (Seymour et al., 2011) y FASHP (Daminato et al., 2013). Sin embargo, sólo en muy pocos casos (Merchante et al., 2013a; Daminato et al., 2013; Vallarino et al., 2015), la acción de un factor de transcripción ha sido vinculada a la función de las hormonas. Esta conexión entre la acción hormonal y la regulación de la transcripción en la maduración de los frutos ha Introducción General 27 sido bien estudiada en el caso del tomate (Cara y Giovannoni, 2008; Klee et al., 2011; Osorio et al., 2013; Seymour et al., 2013; Pattison et al., 2014). La extensión de este estudio a la fresa es un desafío y ayudará a conocer mejor la regulación global de este proceso de desarrollo. Objetivos 29 Objetivos -Objetivo general: Profundizar en el estudio de la función de las hormonas auxina y etileno en el proceso de desarrollo y maduración del fruto de fresa (Fragaria × ananassa). -Objetivos particulares:  Identificar y analizar los patrones de expresión de los genes de la ruta del ácido indol pirúvico de la biosíntesis de auxina a lo largo de la maduración del fruto de fresa.  Determinar la actividad triptófano amino transferasa de las proteínas involucradas en el primer paso de la biosíntesis de la auxina (FaTAA1) en frutos de fresa.  Soportar una acción de la auxina en la maduración del fruto de fresa realizando un silenciamiento transitorio por RNAi del gen FaTAR2.  Determinar el efecto de la modificación de la biosíntesis de auxinas en el desarrollo y maduración del fruto de fresa mediante la generación de plantas transgénicas que expresan el gen TAA1 de Arabidopsis bajo el control del promotor 35S.  Profundizar en el papel que desempeña el etileno en la maduración del receptáculo del fruto de fresa, mediante análisis transcriptómico de plantas transgénicas insensibles a esta hormona, en comparación con plantas no transgénicas. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 37 En un volumen final de 50 μL con un ma imo de RNA de 200 ng/μL (de RNA en agua) se aadio 5 μL del tampon de reaccio 10 X Turbo DNase Buffer (incluido en el kit) y 1 μL de Turbo DNasa (2U). Se homogenizo la mezcla, se dio un spin y se incubó 30 minutos a 37 °C. Posteriormente, se inactivó con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y se realizó la precipitación de RNA mediante acetato sódico, 3.2 M pH 5.2 (1/10 v) y etanol 100 % (2.5 volúmenes), durante 2 horas a -20 °C. Se centrifugó a 13000 rpm durante 40 minutos a 4 °C, se recuperó el sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol al 75 %, se dejó secar. Finalmente resuspendió en 20 μL de agua DEPC. Cuantificación de ácidos nucléicos Para conocer la pureza y concentración de los ácidos nucléicos se empleó un espectrofotómetro Uv/Visible ND-1000 (Nanodrop Technologies). La calidad del RNA se determinó a partir del cociente de absorbancias a las longitudes de onda de 260/ 230 nm y 260/ 280 nm, debiendo estos ser  2 en muestras libres de polisacáridos y proteínas, respectivamente. Retrotranscripción del RNA La síntesis de cDNA se realizó mediante el kit comercial iScriptTM cDNA Synthesis de BIO-RAD como se indica en la Tabla 2. Tabla 2. Mezcla de reacción para la síntesis de cDNA. Componentes Volumen por reacción 5 X iScript mix de reacción 4 µL iScript transcriptasa reversa 1 µL Agua libre de nucleasas 15 µL Molde RNA 1 µL Volumen total 20 µL Las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador MyCycler Thermal cycler (BIO-RAD) con el programa que se muestra en la Tabla 3. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 38 Tabla 3. Programa de PCR para síntesis de cDNA Tiempo Temperatura 5 minutos 25 ºC 30 minutos 42 ºC 5 minutos 85 ºC Mantener a 4 ºC (opcional) Reacción en cadena de la polimerasa semicuantitativa (RT-PCR) La PCR semicuantitativa (RT-PCR) se empleó para verificar la integridad y comprobar que la cantidad del cDNA sintetizado fuera similar en todas las muestras. Se añadieron los reactivos que se muestran en la Tabla 4. Los fragmentos amplificados por RT-PCR se visualizaron en geles de agarosa. La semicuantificación se llevó a cabo comparando la intensidad de la banda del gen con la banda correspondiente a FaGAPDH. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) La expresión génica se llevó a cabo mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR), la cual permite obtener una medida cuantitativa del transcrito de interés (Pfaffl, 2001). En las reacciones qRT-PCR se utilizó un kit comercial SsoFastTM EvaGreen® Supermix (BIO-RAD), este emplea un colorante fluorescente de ácidos nucléicos con Tabla 4. Mezcla de reacción de la PCR. Componentes Solución stock Concentraciones finales Volúmenes cDNA molde 1 μL Tampón de PCR 5 X 1 X 5 μL MgCl2 25 mM 2 mM 2 μL dNTPs 10 mM 0.2 mM 0.5 μL Cebador directo 10 μM 0.2 μM 0.5 μL Cebador inverso 10 μM 0.2 μM 0.5 μL Polimerasa (GoTaq de Promega) 5 U/μL 5 U/μL 0.125 μL H2O miliQ Hasta 25 μL Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 39 propiedades espectrales similares a la fluoresceína, llamado EvaGreen dye que se une a todo DNA de doble cadena generado durante la amplificación. La qRT-PCR se llevó a cabo en un MyiQ™ Single-Color Real-Time PCR Detection System de BIO-RAD y se elaboraron conforme las instrucciones del fabricante; el volumen final empleado fue de 20 μL, en las Tablas 5 y 6, se muestra la mezcla de reacción y el programa empleado. Tabla 5. Componente de reacción para qRT-PCR. Componentes Volúmen EvaGreen® Supermix 10 μL Cebador Directo (F) 10 μM 1 μL Cebador Inverso(R) 10 μM 1 μL H2O mili Q 6 μL cDNA molde 2 μL Tabla 6. Programa para qRT-PCR. Ciclos Temperatura ºC Tiempo en segundos Número de Ciclos Activación de la enzima 95 30 1 Desnaturalización 95 5 30-40 Alineamiento/extensión 55-60 10 Curva de Melting 65-95 10 1 Como gen normalizador se empleó el gen gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de fresa (FaGAPDH, número de acesso en el NCBI AB363963.1) (Salvatierra et al., 2010; Merchante et al., 2013a). Fue necesario emplear una curva de eficiencia para cada pareja de cebadores, la cual, empleando diferentes concentraciones del molde a estudiar. Se representó el logaritmo en base 10 (log) de la concentración de DNAg frente a los valores de Ct, resultando una línea recta. La pendiente fue calculada para obtener la eficiencia mediante la siguiente fórmula: Eficiencia (%) = (10 (-1/pendiente) -1) x 100 De esta fórmula se deduce, que la eficiencia del 100 % corresponde a una pendiente de -3.32 (Pfaffl, 2001). Los valores de eficiencia fueron cercanos al 100 % por lo que se decidió emplear para las cuantificaciones el método de Livak (Livak & Schmittgen, 2001), también llamado el 2 delta-delta Ct. Este método indica la relación entre los valores de Ct de la muestra problema y el Ct del gen normalizador (FaGAPDH) en base a la siguiente fórmula: Diferencia de expresión = 2 -∆(∆Ct) Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 40 ∆Ct = Ct (gen de interés) - Ct (gen constitutivo) ∆(∆Ct = ∆Ct (muestra problema) - ∆Ct (muestra control) Diseño de cebadores Los cebadores empleados en las distintas reacciones de PCR, se diseñaron a partir del alineamiento de nucleótidos en ClustalW de los genes de la misma familia, seleccionando la zona específica para cada gen. El diseño de cebadores se realizó con la ayuda de Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), con un tamaño de fragmento inferior a 200 pb (Tabla 7). Tabla 7. Cebadores empleados para los análisis de expresión mediante qRTPCR. Nombre Cebador Secuencia Tm FvTAA1 qRt Fw GGCCAGTGGATGAGCTATGT 64 FvTAA1 qRT Rv CCACCAGGAGAAGTGAGAGC 64 FvTAR2 qRT Fw TGAGGAACTTGCTTGTGCTG 64.2 FvTAR2 qRT Rv TGGACCTCTCTGCTTCTGGT 64.1 FvYUC2 qRT Fw GCCAAGTACGACACTTGTTC C 63 FvYUC2 qRT Rv GAATTCCCACATCCGACAAC 64 FvYUC3 qRT Fw CGATATCGATGGCTTGTGC 63.9 FvYUC3 qRT Rv GGTTGCAGAGGTCAAGAGAGAG 64.1 FvYUC4 qRT Fw CCCAAGATTTTGAGTACATTTC 59 FvYUC4 qRt Rv ATTCCCACACCCAATAACCA 62 FvYUC6 qRt Fw TTGACGATTACGCCACCAAG 63 FvYUC6 qRt Rv TTTCGGACCCTGCAGTTCG 62 FvYUC7 qRT Fw GTGGTACAGTCTTTGCTGTCG 62 FvYUC7 qRT Rv CCA TCCTCTCTCCCTTTTCC 63 FvAux/IAA8a qRT F CCAGGGAGGGAAAGATTGAG 60.2 FvAux/IAA8a qRT R GGCATCAGAGCCCTTCATTATC 62.1 FvAux/IAA11 qRT F TGGTGGTCAGGAGCATGATA 61 FvAux/IAA11 qRT R TTAGCCTCTTCACGGAACTAAGA 60 FvARF6a qRT F TTTGATTGCCGACGTGTTTA 63.9 FvARF6a qRT R CCATCCTCTCTCCCTTTTCC 63.8 FvARF4 qRT F TTGCCAGTTGAGCATGAGTC 60.2 FvARF4 qRT R GCTTTCTCCCTCGGTTTTCT 61 AtTAA1 Fw qRT GAAAGAGAGCGATGCTTTCAC 60 AtTAA1 Rv qRT CAATTCACTTACCAGATCCGTCT 61 GUS qRT Fw GATCGCGAAAACTGTGGAAT 60 GUS qRT RV AAAGACTTCGCGCTGATACC 59 FaGAPDH Fw AGCAGGCAGAACCTTTCCGACAG 60 FaGAPDH Rv TCCATCACTGCCACCCAGAAGACTG 61 Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 41 Minipreparación de plásmido mediante lisis alcalina Este método mediante lisis alcalina es el más empleado para la extracción de DNA plasmídico de E. coli. Para la minipreparación se inoculó una colonia bacteriana transformada con el plásmido de interés en 7 mL de medio LB con el antibiótico adecuado y se creció en agitación toda la noche (también se ha inoculado directamente desde un stock de células en glicerol 50 % a -80 ºC). Tras este periodo se centrifugaron 1.5 mL del cultivo a 6000 rpm y a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante. Proceso que se realizó dos veces en el mismo tubo. El precipitado de células se resuspendió 100 μL de solución I (50 mM glucosa, 25 mM Tris-HCl pH 7.5. 10 mM de ácido etilendiaminotetrácetico (EDTA) pH 8, más 3 μL de RNasa (10 μg/mL) para degradar el RNA bacteriano, se mezcló por inversión. Se añadieron 100 μL de solución II (0.2 M NaOH, 1 % SDS, preparada en el momento) y se mezcló por inversión. Por u timo se aadieron 150 μL de solución III (60 mL acetato potásico 5 M, 11.5 mL de ácido acético y 28.5 mL de agua destilada), y se volvió a mezclar por inversión. Se centrifugó 7 minutos a 13000 rpm a temperatura ambiente, y se recuperó el sobrenadante a un nuevo tubo, donde se añadió 200 µL de isopropanol a temperatura ambiente, para que precipitaran los ácidos nucléicos, y se incubó 5 minutos. Se prosiguió con una centrifugación de 7 minutos a 13000 rpm, se eliminó el sobrenadante y añadió 1 mL de etanol al 70 %. Se centrifugó durante 5 minutos a 7000 rpm y se tiró el sobrenadante con cuidado. Se dejó secar el precipitado hasta que todo el resto de etanol se evaporara. Finalmente, el precipitado se resuspendió en 20 μL de agua destilada. Obtención de células DH5α competentes mediante cloruro de rubidio Las células competentes se prepararon según el siguiente procedimiento: Se crecio una colonia aislada de la estirpe DH5α de E. coli mediante la inoculación de 5 mL de medio LB a 37 ºC y en agitación durante 16 horas. Todo el volumen de este cultivo se inoculó en 1 L de medio LB fresco, y se incubó a 37 ºC en agitación hasta obtener una OD600 de 0.4. Posteriormente se dejó en hielo durante 30-60 minutos, a partir de aquí todo el protocolo se realizó en hielo. El cultivo se transfirió a tubos de centrífuga estériles de 400 mL, y se centrifugó durante 15 minutos a 4 ºC y a 4500 rpm. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 30 % del volumen del cultivo celular inicial con la solución TFB1 (30 mM acetato de potasio, 50 Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 42 mM cloruro de manganeso (MnCl2), 100 mM de cloruro de rubidio (RbCl), 10 mM de cloruro cálcico (CaCl2), con 15 % de glicerol a pH 5.8 esterilizado por filtración). Se incubó 10 minutos en hielo y se centrifugó durante 15 minutos a 4 °C a 4500 rpm. Se eliminó el sobrenadante y las celulás se resuspendieron cuidadosamente con la solución fría TBF2 (10 mM de ácido 3-N-morfolino propanosulfónico (MOPS), 75 mM de cloruro cálcico, 10 mM de cloruro de rubidio, 15 % de glicerol, el medio se debe esterilizar por filtración) y diluirlo 4 % del volumen original. Para almacenar las células, éstas se alicuotaron en fracciones de 100 µL y se pasaron inmediatamente a nitrógeno líquido. Después se almacenaron a una temperatura de -80 ºC. Transformación de E. coli mediante choque térmico Para todas las transformaciones de E. coli se ha utilizado células competentes de la cepa DH5α. Para ello en 100 μL de suspensión de células competentes previamente descongeladas en hielo se le añadieron 15 ng de DNA, o todo el volumen de una reacción de ligación, se incubó 30 minutos en hielo, se les aplicó un choque térmico (60 s a 42 ºC) y se incubó 5 minutos en hielo. Se añadieron 500 μL de medio LB y se incubó 45-60 minutos a 37 ºC en agitación. Transcurrido este tiempo, se sembraron en dos placas de Petri con medio LB-agar suplementado con los antibióticos adecuados, por un lado se sembraron 100 μL de las células transformadas, y por otro lado se sembró el resto del cultivo centrifugado a máxima velocidad durante 1 minuto y resuspendido en 100 μL de LB. Se dejó crecer a 37 ºC toda la noche. Protocolo de obtención de Agrobacterium tumefaciens electrocompetente Las células electrocompetentes de la cepa AGL0 se prepararon según el siguiente procedimiento. Se crecieron colonias de AGL0 mediante la inoculación en 15 mL de LB a 28 ºC, suplementado con rifampicina (50 μg/mL) en agitación toda la noche (16-20 horas). A partir de este cultivo inicial se tomaron 10 mL y se inocularón en 1 L de LB, sin antibióticos, y se creció a 28 ºC en agitación hasta alcanzar una O.D600 de 0.8-1 (aproximadamente 12 horas). El cultivo se enfrío en hielo 15-30 minutos para después centrifugarlo en tubos de 400 mL previamente enfriados durante 7 minutos a 4 °C a 6000rpm. Se retiró el sobrenadante y las células se resuspendierón en 1 L de agua bidestilada estéril y fría. Se centrifugó nuevamente durante 7 minutos a 4 °C a 6000 rpm y se retiró cuidadosamente el sobrenadante, para volver a Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 43 resuspenderlo en 0.5 L de agua bidestilada estéril y fría. Se prosiguió con otra centrifugación durante 7 minutos a 4 °C a 6000rpm y se eliminó el sobrenadante. Posteriormente se resuspendió en 20 mL de tampón frío de sacarosa-glicerol (272 mM sacarosa, 15 % de glicerol) para después centrifugarlo durante 7 minutos a 4 °C a 6000 rpm y quitar el sobrenadante. Finalmente las bacterias se respuspendieron en 4 mL del tampón frío sacarosa-glicerol y se hicieron alícuotas de 100 µL en tubos 1.5 mL estériles, inmediatamente fueron congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a una temperatura de -80 ºC. Transformación de Agrobacterium tumefaciens por electroporación A un tubo de microcentrífuga que contenía 100 μL de células de Agrobacterium electrocompetentes se añadieron unos 70-100 ng de la minipreparación de interés. La mezcla se dejó incubar 10 minutos en hielo. El contenido del tubo se transfirió a una cubeta de electroporación previamente enfriada y se introdujo en el electroporador y se sometio a un choque elect ico (2.5 KV; 25 μF; 400 Ω). Inmediatamente se añadieron 1 mL de LB sin antibióticos y se dejó incubando 1-2 horas a 28ºC en agitación. Transcurrido este tiempo, se sembraron (por un lado 100 μL de las células transformadas y por otro lado el resto del cultivo centrifugado a máxima velocidad durante 1 minuto y resuspendido en 100 μL de LB), en dos placas de Petri con medio LB-agar suplementado con los antibióticos adecuados. Clonación, expresión y purificación de la proteína recombinante GSTFaTAA1 y GST-FaTAR2 Se diseñaron los primers de FvTAA1 y FvTAR2 en F. vesca (www.strawberrygenome.org número de acceso: gene 03586 y el gen 31790 respectivamente) y se amplificó la región codificante en F. × ananassa de ambos genes mediante una reacción de PCR empleando una Taq polimerasa de alta fidelidad (iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase BIO-RAD) a partir de cDNA correspondiente a receptáculo rojo de fruto de fresa, con los cebadores de la Tabla 8. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente de 1300 pb cuya secuencia fue confirmada mediante secuenciación. El fragmento amplificado fue purificado, ligado y clonado en el vector pENTR™/D-TOPO® Cloning Kits (Life Technologies). Se realizó una recombinación Gateway para clonarlo en el vector pDEST15 (Invitrogen). Este vector permite la producción de proteínas nativas recombinantes con la fusión de una etiqueta de Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 44 Glutatión–S-transferasa (GST) en el extremo N-terminal. Posteriormente, este plásmido se transformó en la cepa BL21 Star (DE3) pLysS (Invitrogen) de Escherichia. coli. Para la purificación y expresión de la proteína, la bacteria BL21 transformada con el plásmido pDEST15-FaTAA1 y pDEST15-FaTAR2, se inoculó en 10 mL de LB suplementado con ampicilina (100 µg/mL) y se creció a 37 °C durante toda la noche. Se prosiguió con una inoculación de este cultivo en 500 mL de LB con ampicilina (100 µg/mL), que creció a 37 °C con agitación hasta tener una O.D.600 de entre 0.5 a 1. Para inducir la expresión de la proteína se agregó 0.5 mM de Isopropílico β-D tiogalactopiranósido-1 (IPTG) y se incubó durante 4 horas a 37 °C en agitación, se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm a 4 °C y el precipitado se lavó con agua destilada estéril. El precipitado se resuspendió en 10 mL del tampón fosfato salino PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.2). Se sonicaron las células durante 30 segundos, 5-10 veces, hasta que su aspecto fuera homogéneo y líquido. Se agregó 5 mL de PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.2) se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm a 4 °C. Se añadió tritón (0.1 %) y se agitó por 15 minutos en frío. Posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm, 4 °C, recuperándose el sobrenadante, al cual se le agregó 1 mL de perlas de glutatión-sefarosa (Amersham Pharmacia) previamente equilibradas en PBS según las instrucciones del fabricante (brevemente, se agitó la botella de perlas que estaban en 20 % de etanol, se tomarón 2 mL del compuesto acuoso o la cantidad que se vaya a emplear; se sedimentó por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos, se decantó el sobrenadante y se lavaron las perlas de glutatión sefarosa con 5 mL de PBS por cada 1 mL de perlas glutation sefarosa. Se mezcló por inversión y se centrifugó a 2200 rpm durante 5 minutos, se decantó el sobrenadante y se repitió el lavado y centrifugación una vez mas). Se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en un tubo de 15 mL y se prosiguió con una centrifugación de 5 minutos a 2200 rpm. Se eliminó el sobrenadante, se agregó 500 µL de resuspendiendo el precipitado y se traspasó a tubos de 1.5 mL. Se hicieron lavados agregando 500 µL de PBS y centrifugando a 2200 rpm durante 5 minutos. Estos lavados se repitieron cinco veces. Finalmente se eluyó la proteína con una solución de 10 µM de glutatión en PBS. Las eluciones se guardarón a – 80 °C hasta su uso. El tamaño correcto de la proteína GST-FaTAA1 es de 68 kDa (44 kDa de FaTAA1 + 24 kDa de GST) y para la proteína GST-FaTAR2 el tamaño esperado es de 71 kDa (47 kDa de FaTAR2 + 24 kDa de GST). El tamaño se comprobó mediante gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y teñidas con azul de Coomassie. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 45 Tabla 8. Cebadores empleados para la clonación de la proteína FaTAA1 mediante el sistema Gateway. Nombre del cebador Secuencia Tm ( °C) FaTAA1 GWY Fw CACCATGTGCGGCACTGATCATAAC 62 FaTAA1 GWY Rv GTGCCCATTACTGATGGCTTT 61 FaTAR2 GWY Fw CACCATGAGGAACTTGCTTGTGCTG 60 FaTAR2 GWY Rv TGACTGGATTTTGGACAATCGC 61 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE La electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida usando el sistema Mini Protean II® Electroforesis Cell (BIO-RAD). Los geles utilizados se prepararon con 10 mL de gel separador al 10 % de acrilamida y 5 mL del gel concentrador. Se montó el equipo y se preparó el gel separador como se indica en la Tabla 9, a continuación se vertió entre los cristales (1 mm) hasta ocupar 2/3 de la altura del cristal, se cubrió con etanol a 100 % y se dejó polimerizar. Posteriormente se quitó el etanol y se preparó el gel concentrador el cual se vertió cubriendo toda la altura del cristal, se colocó el peine y se dejó polimerizar. El gel se colocó en la cubeta de electroforesis y se cubrió con el tampón de electroforesis SDS-PAGE (2.5 mM pH 8.3 de Tris-HCl, 250 mM Glicina, 0.1 % SDS; para los geles no desnaturalizantes no se emplea SDS). A las muestras se les agregó 10 μL de tampo de carga (20 mM pH 6.8 de Tris-HCl, 2% v/v de βmercaptoetanol, 20 % de glicerol, 8% SDS, 0.25 % de azul de bromofennol) a 40 μL de proteina purificada (1 mg/mL) y se cargaron 20 μL en el gel. La electroforesis se llevó a cabo a 80 V hasta que las muestras se encontraron en el gel separador, entonces se aumentó hasta 100 V. Una vez terminada la electroforesis, el gel se tiñó con azul de Coomassie o bien se utilizó para ensayo de la actividad enzimática en gel. Tabla 9. Composición de los geles de acrilamida empleados en la electroforesis de proteína. En geles no desnaturalizantes no se agregó SDS. Mezcla de reacción Gel separador Gel concentrador Agua destilada 2.1 mL 3.5 mL Tris-HCl 1 M, pH 8.8 3.75 mL -------- Tris-HCl 1 M, pH 6.8 --------- 0.615 mL SDS 10 % 0.1 mL 50 µL Acrilamida-Bis acrilamida 30% (BIO-RAD) 4 mL 0.8 mL APS 10 % 50 µL 5 µL TEMED 5 µL 30 µL Volúmen Total 10 mL 5 mL Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 46 Tinción con Azul de Coomassie Después de la electroforesis, los geles se sumergieron 45-60 minutos en solución de teñido (50 % agua destilada, 40 % metanol, 10 % de ácido acético glacial, 0.25 % de Coomassie blue-R) con agitación suave. Posteriormente se destiñeron toda la noche en agitación suave en solución de desteñido (16.5 % etanol, 5 % ácido acético) hasta que desapareció el color de fondo y las bandas fueron visibles. Ensayo de actividad aminotransferasa en gel Después de la electroforesis en poliacrilamida no desnaturalizante, se realizaron los ensayos de la actividad aminotransferasa como se describe en Pedraza et al., (2004). Brevemente, la mezcla de reacción consistió en 20 mL de tampón TrisHCl (0.1 M, pH 8.6) que contenía 5.5 mM Trp, 0.2 mM de piridoxal-5-fosfato (PLP), 12.5 mM ácido α-cetoglutárico, 98 µM metosulfato de fenazina (PMS) y 0.6 mM de nitroazul de tetrazolio (NBT). Los geles se incubaron a 37 °C en la oscuridad hasta la aparición de bandas de color azul-negro (30 min). Ensayos de actividad de aminotransferasa por HPLC-MS La cromatografía HPLC-MS, fue realizada en el laboratorio de José M. Alonso en la Universidad de Carolina del Norte NCSU (Estados Unidos de América) siendo las reacciones y metodología tal como describe en Koshiba et al. (1993) y Stepanova et al. (2008). Brevemente, la reacción se llevó a cabo en un volumen de 100 µL de reacción, la cual contenía 0.1 M de tampón borato pH 8, 0.5 mM de ácido αcetoglutárico, 0.2 mM de PLP, 4 mM de EDTA pH 8, 10 µL de la enzima purificada y diferentes concentraciones de Ltriptófano (0 µM, 100 µM, y 1 mM). Esta reacción se incubó a 37°C durante una hora, posteriormente se le agregó 75 µL de metanol, se dejó 25 minutos a 55 °C y añadió 225 µL de metanol frío, se centrifugó durante 5 minutos a 14000 rpm y se recuperaron 100 µL del sobrenadante. Un volumen de 30 µL del sobrenadante fue empleado para inyectarlo en el sistema de HPLC El análisis de HPLC se realizó en un equipo EV Shimadzu LC-MS module system 2010 con una matriz de fotodiodos UV (190 nm a 800 nm) de detección. Se empleó como eluyente una mezcla de ácido acético (grado HPLC) (A) y de acetonitrilo (grado GC-MS) como (B) (VWR). El programa de elución por gradiente consistió en las proporciones de eluyente A a eluyente B: 10: 90 (0-5 minutos), 15: 85 (5-10 minutos), Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 53 Expresión de genes de biosíntesis de auxina a lo largo de la maduración de fresa (Fragaria × ananassa) mediante qRT-PCR Los genes de la familia TAA1/TAR en F. × ananassa fueron estudiados anteriormente en nuestro laboratorio (resultados no mostrados), por lo que se llevó a cabo el estudio de expresión de los genes de la familia YUCCA mediante qRT-PCR en aquenios y receptáculos separadamente, en los estados de crecimiento del fruto identificados como verde, blanco y rojo (Figura 5). Figura 5. Estadios de maduración del fruto de fresa F. × ananassa cv. Camarosa empleado para análisis de expresión. V (estadio verde), B (estadio blanco), I (estadio intermedio), R (estadio rojo). En aquenios la expresión relativa del gen FaYUC2 a lo largo de la maduración, presentó un patrón decreciente a lo largo de maduración, teniendo el mínimo valor en aquenio rojo (Figura 6 A). En receptáculo, la expresión del gen FaYUC2 no mostró diferencias significativas en los tres estados analizados.(Figura 6 A). El gen FaYUC3 mostró una tendencia ascendente a partir de aquenio verde a rojo teniendo su mayor valor en este estadio. La expresión relativa en receptáculos del gen FaYUC3 fue similar de verde a blanco y su menor expresión fue en receptáculo rojo, aunque sin diferencia significativa (Figura 6 B). La expresión relativa en aquenios del gen FaYUC4 mostró su mayor expresión en estadio verde, el cual fue decreciendo de blanco a rojo, teniendo en este último estadio su expresión menor. La expresión relativa en los receptáculos del gen FaYUC4 mostró que su mayor expresión en receptáculo verde, disminuyendo a lo largo de la maduración (Figura 6 C). La expresión relativa en los aquenios del gen FaYUC6 mostró su máxima expresión en estadio blanco, y su minina expresión en V B I R Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 54 aquenio rojo; en receptáculos mostró una expresión mayor en estadio verde, el cual fue disminuyendo hasta su menor valor en estadio rojo, aunque la diferencia no fue significativa (Figura 6 D). En los aquenios del gen FaYUC7 presentó una mayor expresión en verde, el cual fue disminuyendo a lo largo de la maduración; en receptáculos incrementaron sus valores significativamente a lo largo de la maduración teniendo su mayor expresión en estadio rojo (Figura 6 E). Figura 6. Expresión relativa mediante qRT-PCR de los genes FaYUC2, FaYUC3, FaYUC4, FaYUC6 y FaYUC7 en F. × ananassa cv. Camarosa. (A) Expresión relativa del gen FaYUC2. (B) Expresión relativa del gen FaYUC3. (C) Expresión relativa del gen FaYUC4. (D) Expresión relativa del gen FaYUC6. (E) Expresión relativa del gen FaYUC7. Las diferentes letras A B D C E A q u enios Verde Blanco Intermedio Rojo 0 1 2 5 6 0 115 FaY U C 1 FaY U C 2 FaY U C 3 FaY U C 4 FaY U C 5 FaY U C 6 FaY U C 7 FaY U C 10 FaY U C 11 E xp res ión A q u enios Verde Blanco Intermedio Rojo 0 1 2 5 6 0 115 FaY U C 1 FaY U C 2 FaY U C 3 FaY U C 4 FaY U C 5 FaY U C 6 FaY U C 7 FaY U C 10 Fa Y U C 11 E xp res ión Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 55 muestran diferencias significativas, de acuerdo con el método de Fischer (p<0.05). Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statgraphics Centurion XVI Expresión de genes de biosíntesis de auxina mediante RNA-seq a lo largo de la maduración de fresa (Fragaria × ananassa) El análisis del RNA-seq de maduración en Fragaria × ananassa cv. Camarosa, se llevó a cabo en aquenios y receptáculos separadamente en estadios de maduración en verde, blanco, intermedio y rojo, mostrados en la Figura 5 (SánchezSevilla et al., sin publicar). Los datos se alinearon con el genoma de referencia obtenido de la base de datos del genoma para Rosaceae (RDA) de Fragaria vesca, Whole Genome Asamble con la anotación v1.1 (http.: //www.rosaceae.org), empleando el software Top Hat y se procesaron los datos mediante Cufflinks para identificar un transcriptoma conocido o alternantivo que no estuviera pre-escrito en el modelo del genoma. Las lecturas del mapeo fueron visualizados en el programa Integrated Genomics Viewer (IGV; http://www.broadinstitute.org/igv/ ;Sánchez-Sevilla et al., 2014; Sánchez-Sevilla et al., sin publicar). Se analizaron los valores de expresión de los 13 genes involucrados en la ruta IPA de biosíntesis de auxina, tanto los de la familia TAA1/TAR como los de la familia YUCCA. Los valores están expresados como Fragmentos por Kilobase de Exón por Millón de lecturas mapeadas (FPKM). En general los genes TAA1/TAR se expresaron con valores entre 9-46 FPKM en aquenios; en receptáculos, la expresión fue mucho menor llegando a valores muy bajos. Sin embargo, el gen FaTAR2 mostró un valor de 12 FPKM en el último estadio de desarrollo del receptáculo. La expresión gen por gen de esta familia se muestra en la Figura 7. El gen FaTAA1 presenta una expresión mayor significativa en aquenio verde, que fue decreciendo a lo largo de la maduración. En receptáculos la expresión fue baja y aumentó con la maduración, aunque las diferencias no fueron significativas (Figura 7 A). El gen FaTAR1 presentó un patrón en aquenios similar a FaTAA1, su mas alto valor fue en aquenio verde y fue disminuyendo conforme la maduración; en los receptáculos, la expresión fue muy bajo, sin diferencias significativas (Figura 7 B). El gen FaTAR2 mostró un valor mayor de expresión en aquenio verde y fue disminuyendo significativamente hasta su valor más bajo en estadio intermedio. La expresión de receptáculos del gen FaTAR2 se expresó más que otros genes de esta familia, y además presentó un incremento significativo a lo largo de la maduración, Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 56 teniendo la mayor expresión en el estadio rojo (Figura 7 C). El gen FaTAR3 mostró su máximo valor de expresión en aquenio intermedio de forma significativa, y el mínimo en estadio verde; en los receptáculos no tiene una diferencia significativa entre los estadios (Figura 7 D). El patrón de expresión en aquenios y receptáculos de los genes de la familia flavin-monooxigenasa (YUCCA), que actúan en la segunda parte de la ruta IPA en la biosíntesis de auxinas, en general mostraron valores bajos de expresión (Figura 7 EM). En aquenios los genes mas representativos de esta familia fueron, FaYUC10 y FaYUC11 que mostraron patrones de expresión mayores, llegando a sus máximos valores en FPKM de 14 en estadio verde y 111 en estadio intermedio respectivamente (Figura 7 L, M). El gen FaYUC10 mostró su valor menor expresión en aquenio rojo; en receptáculos, presentó una disminución de su expresión a lo largo de los estadios de verde a rojo (Figura 7 L). El gen FaYUC11 mostró en los receptáculos una expresión muy baja, que disminuyó a lo largo de la maduración teniendo el menor valor en el estadio rojo, aunque las diferencias no fueron significativas (Figura 7 M). Los genes FaYUC1 y FaYUC5 mostraron una expresión muy baja en los aquenios y en los receptáculos, sin diferencias significativas entre todos los estadios, siendo algo mayor en el aquenio verde (Figura 7 E y I). Los genes FaYUC2, FaYUC3 y FaYUC7 mostraron todos expresiones muy bajas, con algunas diferencias entre estadios, pero que en ningún caso fue significativa (Figura 7 F, G, K). El gen FaYUC4 mostró una disminución significativa en su expresión al pasar de el aquenio verde al aquenio rojo, pero en los receptáculos la expresión fue muy baja y sin diferencias significativas (Figura 7 H). El gen FaYUC6, también de expresión muy baja, mostró su mayor expresión en el aquenio intermedio, habiendo diferencias significativas en su expresión en los receptáculos (Figura 7 J). Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 57 Figura 7. Expresión de transcritos mediante RNA-seq de los genes de la ruta ácido-indol3-pirúvico (IPA) de biosíntesis de auxina en F. × ananassa. La expresión esta dada en valores de FPKM en aquenios y receptáculos en verde, blanco, intermedio y rojo. (A) Expresión de FaTAA1. (B) Expresión de FaTAR1. (C) Expresión de FaTAR2. (D) Expresión de FaTAR3 A B C G M J D E F H I K L Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 58 (E) Expresión de FaYUC1. (F) Expresión de FaYUC2. (G) Expresión de FaYUC3. (H) Expresión de FaYUC4. (I) Expresión de FaYUC5. (J) Expresión de FaYUC6. (K) Expresión de FaYUC7. (L) Expresión de FaYUC10. (M) Expresión de FaYUC11. Los análisis estadísticos empleados fueron mediante FDR (False Discovery Rate) en el programa cufflinks, y posteriomente se realizó una corrección para múltiples muestras (Benjamini-Hochberg correction). Las letras minúsculas representan las diferencias significativas en aquenios y receptáculos separadamente. Medida de actividad Triptófano-Aminotransferasa en gel para la proteína FaTAA1 in vitro. Se ha realizado previamente el estudio de la actividad aminotransferasa de AtTAA1 de Arabidopsis con el objetivo de confirmar su participación en la conversión de Trp a IPA en esta especie (Stepanova et al., 2008; He et al., 2011). Para confirmar la actividad de las proteínas FaTAA1 y FaTAR2, identificadas y estudiadas en fresa, se decidió medir la actividad amino transferasa in vitro de estas proteínas. Para la expresión in vitro de las proteínas nativas FaTAA1 y FaTAR2, se clonó su región codificante a partir de cDNA completo de receptáculo rojo de F. × ananassa, en el vector pDEST15 (Materiales y Métodos), que contiene la etiqueta de Glutatión–Stransferasa (GST) en el extremo N-terminal. Además incluye la secuencia ShineDalgarno con sitio de unión al ribosoma situado por delante del ATG, lo que asegura la traducción inicial en Escherichia coli. Posteriormente, se transformaron células BL21 (DE3) y pLysS, se indujo la expresión con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). La purificación se hizo por afinidad, basada en la alta afinidad de GST por el ligando de glutatión, mientras que las impurezas se eliminaron con lavados. Este etiquetado de las proteínas permitió una elusión en condiciones suaves, no desnaturalizantes, preservando su estructura y función de las proteínas marcadas con GST. A pesar de varios intentos de expresar y purificar la proteína FaTAR2 en E. coli no logramos obtenerla, por lo tanto solo mostramos resultados de la proteína FaTAA1. La proteína purificada GST-FaTAA1 fue desnaturalizada y separada mediante SDS-PAGE. El tamaño de la proteína GST-FaTAA1 fue de 68 kDa, como se muestra en la Figura 8 A (de los cuales 44 kDa corresponden a FaTAA1 y 24 kDa corresponden a la etiqueta GST). Tras la purificación de la proteína, se prosiguió con la medida de la actividad aminotransferasa en gel, como se detalla en Materiales y Métodos. Esta actividad consiste en donar el grupo amino del triptófano al fosfato de piridoxal (PLP) que actúa como cofactor y lo transporta al ac do α-cetoglutárico, que actúa como receptor. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 59 Para visualizar la actividad se empleó la reducción del colorante nitro azul de tetrazolio (NBT) que tiñó el grupo amino, el color que presentó fue un color azul oscuro Figura 8 B (Pedraza et al., 2004; Stepanova et al., 2008). Figura 8. Purificación de la proteína GST-FaTAA1. (A) Electroforesis en gel desnaturalizante (SDS-PAGE) de la proteína purificada in vitro GST-FaTAA1 (68 kDa) teñido con azul de Coomassie. En la calle uno esta el marcador PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, en la segunda calle la proteína GST-FaTAA1 desnaturalizada. (B) Ensayo de la actividad triptófano aminotransferasa en gel nativo de la enzima GST-FaTAA1. Para confirmar este resultado de actividad en gel, se decidió analizar la reacción aminotransferasa de la proteína purificada, y la detección de la producción de IPA mediante HPLC. Medida de actividad Triptófano-Aminotransferasa mediante HPLC para la proteína FaTAA1 in vitro. Se analizó la conversión triptófano a ácido indol-3-pirúvico, identificado mediante HPLC-MS, de la proteína GST-FaTAA1 (Figura 9). Los componentes de la reacción y la medida en HPLC se describen en el apartado de Materiales y Métodos. La medida de la actividad aminotransferasa se realizó con diferentes concentraciones de sustrato (Trp). La primera reacción se realizó sin sustrato (0 μM de L-triptófano Figura 9 A), donde se observaron picos con tiempos de retención entre 2 y 8 minutos, los cuales corresponden a la mezcla de reactivos, y que se observaron en todos los cromatogramas. La segunda reacción se realizó con 100 μM de Trp (Figura 9 B), donde se detecta triptófano con un tiempo de retención de 18 minutos, y otro pico a los 53 minutos. Este pico a 53 minutos corresponde a la forma enol del IPA. Este compuesto puede existir en dos formas tautoméricas. Estas formas son el tautómero ceto y tautómero enol, y ambos pueden identificarse en el cromatograma de HPLC con un tiempo de retención a los 32-33 minutos y 53 minutos, respectivamente. Se sabe que la forma enol es la más estable de las dos y hay evidencia que esta forma predomina como producto en cromatografías líquidas en fase reversa (Tivendale et al., 2014). A B Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 60 Figura 9. Actividad triptófano aminotransferasa de la proteína purificada in vitro GSTFaTAA1 mediante HPLC-MS. (A) Cromatograma de la reacción enzimática aminotransferasa de la enzima GST-FaTAA1 con una concentración de 0 μM de L-triptófano (Trp). (B) Cromatograma con actividad in vitro de GST-FaTAA1 con una concentración de 100 μM de Trp; ácido inol-3-pirúvico (IPA). (C) Cromatograma de la actividad enzimática in vitro de GSTFaTAA1 con 1 mM de Trp. (D) Cromatograma de GST-FaTAA1 desnaturalizada con 1 mM de Trp. (E) Cromatograma de la proteína flavin-mooxigenasa de Arabidopsis, con una concentración de Trp de 1 mM. En la tercera reacción se empleó a una concentración de 1 mM de L-triptófano, que de igual forma aparece como producto de reacción la forma enol del IPA, a los 53 minutos (Figura 9 C).Para confirmar que el producto de reacción IPA no era el resultado de una aminotransferasa interna de E. coli co-purificada con GST-FaTAA1, sino el resultado de la actividad in vitro de la proteína GST-FaTAA1, se produjo y purificó, por el mismo método, una enzima sin actividad aminotransferasa. En este caso se empleó una enzima de Arabidopsis con actividad flavin-mooxigenasa, la cual fue otorgada por el Laboratorio de José M. Alonso (Universidad Estatal de Carolina del B A C D E Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 61 Norte, NCSU E.U.A.). En esta reacción enzimática se agregaron los reactivos y una concentración de 1 mM de sustrato (Trp) (Figura 9 E). En el cromotagrama de esta reacción, se observaron varios picos, entre ellos el que pertenece a Trp a los 18 minutos de retención, sin mostrar el pico perteneciente al producto de la reacción IPA. Silenciamiento transitorio de genes Triptófano aminotransferasa en F. × ananassa Como se ha mostrado en los apartados anteriores, el receptáculo rojo presentó expresión de algunos de los genes implicados en la biosíntesis de auxina en la ruta IPA. El análisis de los resultados de expresión, realizado por RNA-seq, de los genes triptófano aminotransferasa (FaTAA1 y FaTAR2) mostraron una expresión significativa en los últimos estadios de maduración de este órgano. También se confirmó la actividad in vitro de GST-FaTAA1. Para probar la función de estos genes in vivo se procedió al silenciamiento transitorio mediante ihpRNA (intron encoding self complementary hairpin RNA), técnica optimizada en frutos de fresa por Hoffman et al., (2006). Esta técnica permite silenciar los genes de manera específica, empleando moléculas pequeñas de RNA que al tener regiones autocomplementarias forman una horquilla, que es escindida (por enzimas RNAsa) y procesada por enzimas citoplasmáticas (Dicer) produciendo pequeños RNA de doble cadena (siRNA) de 21 - 23 nucleótidos. Estos siRNA se desaparean y la cadena antisentido se fija al RNA mensajero mediante complementariedad de bases. El complejo resultante es reconocido por una RNAsa, la cual conduce finalmente a su degradación, lo que impide la traducción a proteína (Correa de Adjounian et al., 2007). Este sistema, utilizado en transformación transitoria (Hoffman et al., 2006), permite la degradación del RNA mensajero de interés en el receptáculo de los frutos de fresa, proporcionando una herramienta eficaz para analizar la función de genes involucrados en la maduración de este órgano, en un corto tiempo. Los genes de la familia triptófano aminotransferasa presentaron una alta homología de secuencia, por esto se realizó un alineamiento de nucleótidos y se seleccionó una sección específica de los genes FvTAA1 y FvTAR2 (Figura 10). De esta forma aseguramos el silenciamiento específico de los genes FvTAA1 y FvTAR2 y evitaríamos un co-silenciamiento. Nuevamente se utilizaron las secuencias conocidas de F. vesca para el diseño de la construcción de silenciamiento en F. × ananassa. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 62 Las construcciones de silenciamiento tienen fragmentos de 300pb aproximadamente del gen de interés (FaTAA1 y FaTAR2) en dirección sentido y antisentido, interrumpidos por un intrón (que pertenece al gen quinona oxidoreductasa de fresa, FaQR). Estas construcciones de RNAi las denominamos pBI-FaTAA1i y pBIFaTAR2i (descritas en Materiales y Métodos), las cuales se utilizaron en las transformaciones transitorias utilizando Agrobacterium tumefaciens, tal como se describe en los Materiales y Métodos. Para las infiltraciones de las construcciones RNAi, se usaron frutos de fresa de la variedad Camarosa, que fue la misma variedad empleada en el análisis de expresión (qRT-PCR y RNA-seq de maduración). Los frutos se infiltraron con la solución de A. tumefaciens (como se indica en Materiales y Métodos), que contenían las diferentes construcciones de silenciamiento específicas para cada gen (pBIFaTAA1i y pBI-FaTAR2i). De igual forma se inyectaron frutos con el vector vacío (pBIintrón). Como control positivo se inyectó la construcción pBI-CHSi, la cual es efectiva en el silenciamiento del gen chalcona sintasa, que está relacionado con la producción de antocianinas (Hoffman et al., 2006). Las inyecciones se realizaron en frutos en el estadio verde tardío (Figura 1 A de Materiales y Métodos) y fueron recolectados de 1014 días tras la inyección, cuando el control negativo presentaba una maduración uniforme en todo el fruto (Figura 1 B de Materiales y Métodos). Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 69 Tabla 12. Genes factores con respuesta auxina mediante RNA-seq. Los valores están dados e FPKMA y en receptáculo verde (RV) y rojo (RR). Los genes con negrita fueron elegidos para análisis posteriores. nd: no detectado Gen Numero de Acceso FPKM RV FPKM RR FaARF 1a gene29255-v1.0-hybrid 47.9 26.7 FaARF 1b gene27792-v1.0-hybrid 1.0 0.1 FaARF 2 gene06434-v1.0-hybrid 94.4 32.9 FaARF 3 gene29771-v1.0-hybrid 127.3 51.5 FaARF 4 gene28545-v1.0-hybrid 45.9 10.2 FaARF 5 gene08492-v1.0-hybrid 10.4 4.7 FaARF 6a gene30394-v1.0-hybrid 93.3 275.3 FaARF 6b gene22728-v1.0-hybrid 28.5 29.5 FaARF 8 gene31631-v1.0-hybrid 26.8 39.1 FaARF 9 gene19138-v1.0-hybrid 31.8 1.6 FaARF 11 gene25123-v1.0-hybrid 10.1 6.3 FaARF 15 gene14094-v1.0-hybrid nd nd FaARF 16a gene09733-v1.0-hybrid 30.8 31.0 FaARF 16b gene16844-v1.0-hybrid 6.2 4.0 FaARF 16c gene23280-v1.0-hybrid 2.2 2.9 FaARF 17a gene23072-v1.0-hybrid nd nd FaARF 17b gene02234-v1.0-hybrid 108.1 21.9 FaARF 17c gene16050-v1.0-hybrid nd nd FaARF18 gene 09733-v1.0 hybrid 30.8 31.0 FaARF 19a gene12917-v1.0-hybrid 71.9 26.9 FaARF 19b gene12224-v1.0-hybrid 23.1 18.8 El gen FaARF4, en el fruto RNAi 4 mostró un aumento en la expresión del gen comparado con el control (Figura 13 A). La expresión relativa del gel FaARF6a, disminuyó un 60 % en el fruto RNAi 4 comparado con el control (Figura 13 B). Figura 13. Niveles de expresión de los genes factores de transcripción con respuesta auxina FaARF6a y FaARF4 de frutos silenciados pBI-FaTAR2i mediante qRT-PCR. Análisis de expresión del gen FaARF4 (A) y el gen FaARF6a (B) en el fruto RNAi 4 mediante qRT-PCR, barras negras frutos control (pBI-Intrón), barras grises (frutos silenciados pBIFaARF4 Control RNAi 4 0.0 0.5 1.0 1.5 Expresión relativa FaARF6a Control RNAi 4 0.0 0.5 1.0 1.5 Expresión relativa A B Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 70 FaTAR2i). Se utilizó al gen FaGAPDH como control constitutivo interno. Se muestran dos réplicas técnicas. Generación e identificación de plantas doble transgénicas DR5::GUS 35S:: GFP-AtTAA1 en Fragaria × ananassa En el laboratorio se disponía de plantas transgénicas de F. × ananassa que expresaban el gen β-glucuronidasa (GUS) bajo el control del promotor DR5, el cual contiene un elemento sintético que induce en la respuesta transcripcional a auxina (Ulmasov et al., 1995; Ottenschläger et al., 2003) Estas plantas transgénicas se emplearon para ser transformadas con el gen TAA1 de Arabidopsis, unido a la región codificante de la proteína de fluorescencia verde (GFP) en el extremo amino terminal, bajo el control del promotor 35S. Estudios de sobreexpresión de TAA1 bajo promotor 35S en Arabidopsis han sido útiles para estudiar la acción de la auxina en el desarrollo de la planta (Robert et al., 2013) La construcción 35S::GFP-TAA1 se realizó en el vector pGWB2, que fue otorgado por el Dr. José M. Alonso y trasformada en Agrobacterium. El marcador de selección utilizado en esta segunda transformación fue el de resistencia a higromicina. Se generaron líneas doble transgénicas independientes y se realizó una primera selección en el cultivo in vitro, mediante PCR en DNA extraído de hojas. Se comprobó que las plantas tenían tanto la primera construcción DR5::GUS con el marcador de resistencia a kanamicina (nptII) como la segunda construcción 35S::GFP-AtTAA1 y el marcador de resistencia a higromicina (hph). En total se identificaron 50 líneas con la doble transformación, más el control de regeneración, el cual tiene una única transformación con DR5::GUS (resultados no mostrados). Se realizó una comprobación posterior mediante RT-PCR semicuantitativa de la expresión del gen AtTAA1 empleando como control, la expresión del gen FaGAPDH, que tiene una expresión constitutiva en tejido de hojas, (Figura 14 A). Se seleccionaron las líneas que presentaban un banda con intensidad media y alta 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20 y de la 25 a la 50 (Figura 14 A) para realizar análisis de expresión mediante qRT-PCR. El análisis del gen AtTAA1 mediante qRT-PCR se realizó en dos partes, la primera etapa se evaluaron las 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, y se seleccionaron las líneas 9, 12 y 13 para análisis posteriores por su mayor expresión del gen ectópico AtTAA1 (Figura 14 B izquierda). La segunda parte de la medición del gen AtTAA1 por qRT-PCR se realizó al final de la temporada y se evaluaron las líneas Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 71 25 a 50. En esta segunda parte se seleccionó la línea 34 por su mayor expresión relativa (Figura 10 B derecha) para un análisis posterior en el siguiente año. Se decidió medir la concentración del ácido indolacético (IAA) mediante Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de Masa (GC-MS) en tejido de hojas de aquellas líneas con mayor expresión de AtTAA1. Se realizó en 3 réplicas biológicas de las plantas (9, 12 y 13) y del control de regeneración. Los resultados se muestran en la Tabla 13 . Los resultados de la medición no se encontraron diferencias significativas en la concentración de auxina en las hojas de las líneas doble transgénicas comparadas con el control. Figura 14. Expresión del gen triptófano amino transferasa de Arabidopsis (AtTAA1) en mediante RT-PCR semicuantitativa del gen ectópico AtTAA1 en las hojas de las líneas doble A B C Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 72 transgénicas de la 1 al 50 y el control (C). Se empleó como control constitutivo interno el gen FaGAPDH. En rectángulo verde están las líneas seleccionadas para hacer análisis de expresión relativa. (B) Expresión relativa del gen AtTAA1 en hojas mediante qRT-PCR de las líneas del 1,2,3,5 al 15, 19, 20 y el control. (C) Expresión relativa del gen AtTAA1 en hojas por qRt-PCR de las líneas 25 a 50 y el control . Las flechas verdes indican las líneas seleccionadas para análisis posteriores. Tabla 13. Medida de auxina en tejido de hoja de las plantas DR5::GUS 35S:: GFP-AtTAA1 mediante GC-MS. Para cada muestra se realizaron 3 réplicas biológicas, se muestra el promedio dado en ng/gFW (peso fresco) y la desviación estandar. Muestras ng/gFW Desviación estandar Control de regeneración 6.89 0,67 Línea 9 6.33 0,86 Línea 12 7.26 1,02 Línea 13 7.01 0,76 Generación y caracterización de las plantas doble transgénicas DR5::GUS 35S:: GFP-AtTAA1 A las plantas DR5::GUS 35S:: GFP-AtTAA1 se les realizó un seguimiento, en su primer año . Primeramente se decidió analizar la expresión del gen GUS, para esto fue necesario incluir un control positivo de plantas transformadas con la construcción 35S::GUS, y como control negativo se utilizaron plantas de fresa sin transformar. Se realizó un muestreo de hojas jóvenes y la extracción de RNA (Materiales y Métodos). Se llevó a cabo un análisis mediante una RT-PCR semicuantitativa seguida de una qRT-PCR (Figura 15). En la PCR semicuantitativa, el control CC (control camarosa) sin ninguna transformación, no presentó banda perteneciente al gen de GUS, el control 35S::GUS mostró una banda muy intensa y las bandas de las líneas doble transgénicas mostraron una banda con intensidad media, incluyendo el control de regeneración (Figura 15 A). En la qRT-PCR se observó que la línea 12 y 13 mostraron una expresión menor que el control de regeneración y que el control positivo. La planta 9 mostró una expresión muy parecida al control de regeneración el cual tiene la transformación DR5::GUS (Figura 15 B). Se realizó un seguimiento en la aparición de flores de las plantas doble transgénicas seleccionadas para poder caracterizarlas. Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 73 Figura 15. Expresión del gen GUS en las líneas DR5::GUS 35S:: GFP-AtTAA1. (A) RT-PCR semicuantitativa en hojas de las líneas doble transgénicas (9, 12 y 13). Como control negativo se empleó CC, que es el control Camarosa sin transformar; CR es el control de regeneración de las líneas doble transgénicas y como control positivo (35S) se empleó la línea 35S::GUS. (B) qRt-PCR de las líneas doble transgénicas 9, 12 y 13 (barras grises) y los controles CC, CR, 35S (barras negras). Se empleó a FaGAPDH como gen constitutivo interno. Se muestran los análisis de dos réplicas técnicas. Las diferentes letras indican diferencias significativas deacuerdo al método LSD de Fischer que se realizócon el programa Graph pad Prism 6. Se realizó conteo de flores, abortos y frutos de las plantas 9, 12, 13 y control de regeneración en el primer año de estudio a lo largo de 4 meses. Figura 16. Plantas doble transgénicas DR5::GUS 35S::GFP-AtTAA1 en el primer año de estudio. Las fotografías se realizaron en el mes de abril del primer año de estudio(A) Control de regeneración con la transformación DR5::GUS con frutos. Las plantas doble transgénicas DR5::GUS 35S::GFP-AtTAA1 de las líneas 9 y 12 muestran frutos y la línea 13 no muestra ni frutos ni flores. En general, no se observó un fenotipo especial de las dobles transgénicas en relación al control, más allá de que el número de flores fue mayor en el control de regeneración, en comparación con las líneas doble transgénicas. Las flores producidas por los controles fueron alrededor de 40, mientras que para las líneas transgénicas entre 19-30 (Figura 16). Las flores de las líneas transgénicas 9 y 12 tardaron 5-7 días más en desarrollarse hasta llegar al fruto rojo en comparación con el control. A B GUS CC CR 35S 9 12 13 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Expresión relativa a aa b b Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 74 La línea 13 presentó cerca de 31 flores (Figura 17 A), más que las líneas 9 y 12, sin embargo, fue la que presentó mas abortos florales y al final del cuarto mes (Junio) presentó solo un fruto (Figura 17 B y C). Las plantas control son las que presentaron un mayor número de flores, frutos rojos y menor cantidad de abortos, en comparación con las líneas 9, 12 y 13 (Figura 17). Figura 17. Caracterización de las plantas doble transgénicas DR5::GUS 35S::GFPAtTAA1. El conteo de las flores y seguimiento se realizó a finales de Febrero e inicios del mes de Junio, cada línea es una planta independiente. (A) Conteo de flores en el primer año de las plantas Control de regeneración, 9, 12 y 13. (B) Número de frutos rojos totales de las plantas Control, 9, 12 y 13 (C) Abortos florales de las plantas control, 9, 12 y 13. El conteo se realizó para el control con 3 plantas diferentes y para las líneas doble transgénicas (9,12y 13). A B C Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 75 Discusión de resultados La auxina participa en la regulación de casi todos los aspectos del crecimiento de las plantas y su desarrollo. La identificación de los genes implicados en la biosíntesis de auxina en el fruto de fresa, es de gran interés ya que esta hormona es clave en el desarrollo y maduración de éste. Aunque aún no se conocen por completo todas las vías de biosíntesis de auxina en plantas, la ruta mejor caracterizada hasta el momento es la que tiene como intermediario el ácido indol-pirúvico (IPA) (Mashiguchi et al., 2011; Stepanova et al., 2011). En este trabajo se han caracterizado y estudiado los genes de esta ruta en la maduración del fruto de fresa (F. × ananassa), tanto su actividad como su función. Los datos presentados suponen un paso adicional en la comprensión de la función de estos genes de biosíntesis de auxina en la maduración del fruto de la fresa. Expresión de los genes de biosíntesis de auxina en la fresa F. × ananassa mediante análisis de qRT-PCR y RNA-seq Estudios previos utilizando Arabidopsis sugieren que la vía predominante de la biosíntesis de auxina consiste de una vía lineal de dos pasos donde el triptófano se convierte en ácido indol 3-pirúvico por las enzimas TAA1/TARs y luego a IAA por las enzimas YUCCA (Stepanova et al., 2011, Won et al. 2011). Los estudios de Stepanova et al., (2008) refuerzan la idea de que la biosíntesis de la auxina juega un papel clave en la generación de gradientes de auxina. Un número de estudios en diferentes especies muestran que TAA1/TAR y la expresión génica YUCCA es alta en los tejidos de semillas y se correlaciona con la acumulación de auxina (Gallavotti et al., 2008, LeClere et al., 2010, Bernardi et al., 2012; Pattison et al., 2014), lo que sugiere que esta vía también es dominante en los frutos. En nuestros resultados mediante análisis de expresión por qRT-PCR y RNAseq se observó la expresión de los genes relacionados con la síntesis de auxina, triptófano aminotransferasas (TAA1/TARs) y flavín mooxigenesas YUCs (YUCCA) en frutos de fresa (F. × ananassa) en diferentes estadios de maduración. Estudios recientes de Kang et al., (2013) sobre la biosíntesis de auxina durante el desarrollo de frutos de fresa, muestran que en los diferentes tejidos del aquenio (embrión, ghost Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 76 [que se refiere a la totalidad de la semilla con su embrión eliminado], y la pared del ovario) pueden ser el sitio principal de la biosíntesis de la auxina. Nuestros datos concuerdan con los estudios de Kang, donde muestran una expresión mayor en los aquenios para los genes TAA1/TARs y de los genes YUCCA (Figura 6 y 7), confirmando que la mayor cantidad de biosíntesis de la auxina se produce en los aquenios. En los trabajos de Archbold y Dennis (1984) mostraron que la concentración de IAA libre en el receptáculo, que presentó su mayor valor a los 14 días después o post de la antesis (dpa) disminuyendo a los 17 dpa, no obstante, a partir de los 17 dpa se observó un incremento a lo largo de la maduración hasta los 23 dpa. Por el contrario, en los estudios de Symons et al., mostraron que cuando la fresa cambia a color rojo la concentración de IAA fue disminuyendo (Symons et al., 2012). En nuestros datos de expresión, hay que resaltar que algunos genes como: FaTAA1, FaTAR2, FaYUC2 y FaYUC7 mostraron expresión en las últimas etapas de maduración en el receptáculo, siendo el gen FaTAR2 el que muestra su mayor valor en estadio rojo siendo una observación similar a los estudios de Archbold y Dennis (1984). Nuestros resultados confirman que en la fresa, la mayor expresión de la biosíntesis de auxina es en los aquenios, en las primeras etapas de desarrollo. Sorprendentemente también encontramos que hay expresión en las últimas etapas de desarrollo en los receptáculos, estos nuevos datos no han sido observados en frutos y nos sugieren que podría haber una nueva síntesis de auxina en este estadio de maduración del receptáculo. Las repercusiones que estos cambios tienen en el desarrollo, las trataremos de explorar en este trabajo. La proteína FaTAA1 tiene actividad triptófano aminotransferasa in vitro Para proporcionar evidencia directa de que la proteína aminotransferasa FaTAA1 cataliza la conversión de Trp a IPA, fue necesario realizar un ensayo enzimático utilizando FaTAA1 fusionada a GST en su extremo amino terminal y producida mediante la expresión heteróloga en Escherichia coli. En trabajos anteriores, Stepanova et al., (2008) midieron la actividad enzimática de la proteína fusionada GST-TAA1 de Arabidopsis tanto en gel, como en HPLC y LC-MS, dando como producto de la reacción el IPA, demostrando que la enzima activa de GSTAtTAA1 produce IPA in vitro. En nuestros estudios, logramos la expresión, la Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 77 purificación y la comprobación de la actividad in vitro mediante la metodología de Stepanova et al., y He et al., (2008 y 2011), de la proteína de fusión GST-FaTAA1. Primero, la actividad triptófano-aminotransferasa de nuestra proteína GST-FaTAA1, se comprobó en gel. Posteriormente se confirmó e identificó el producto IPA, que es el resultado de la reacción de la actividad de la enzima GST-FaTAA1, mediante los cromatogramas de HPLC. Los estudios de He et al., (2011) trataron de medir la actividad de las proteínas de Arabidopsis TAA1 y las proteínas relacionadas TAR, lograron purificar y medir la actividad mediante HPLC de la proteína TAR1 la cual mostró actividad in vitro al producir IPA, pero no pudieron purificar GST-TAR2. A pesar de varios intentos, no logramos la expresión de la proteína GST-FaTAR2 por este método, al igual que en He et al., (2011). No tenemos una explicación de esta dificultad de producción y purificación de FaTAR2, pero probablemente está relacionada a las diferencias en su estructura primaria en relación a FaTAA1 y, probablemente, a FaTAR1. La solución debe estar en diseñar fusiones diferentes de GST o fusiones con otros péptidos que permitan su purificación por cromatografía de afinidad. De acuerdo con los patrones de expresión la proteína FaTAA1 se debe producir, en el receptáculo rojo de fresa, quizás a niveles bajos en comparación con otros tejidos/estadios. La proteína GST-FaTAA1, cataliza la conversión de Trp a IPA, dándonos la evidencia de la actividad de la proteína de fresa. Sabemos que en la ruta de biosíntesis de IPA, el intermediario ácido indol 3-pirúvico es el sustrato para producir finalmente IAA, mediante la actividad enzimática de los genes YUCCA. Mashiguchi et al., purificaron la enzima GST-YUC2 de Arabidopsis, y midieron la actividad enzimática mediante HPLC a partir de IPA y el producto resultante de la reacción fue IAA, lo que fue confirmado por LC-ESI-MS/MS, demostrando de esta manera que los genes YUCCA catalizan la conversión de IPA a IAA (Mashiguchi et al., 2011). En nuestros estudios hemos mostrado que dos miembros de la familia FaYUC, FaYUC2 y FaYUC7, tienen expresión en el receptáculo maduro, aunque el nivel de expresión es bajo. También hay que tener en cuenta que hay otras rutas de biosíntesis de la auxina. Estudios en nuestro laboratorio identificaron al gen homólogo de Arabidopsis CYP79B2 en F. vesca, perteneciente a la ruta IAOx, analizando su expresión mediante qRT-PCR en F. × ananassa, dando su mayor valor en el receptáculo rojo (datos no mostrados). La ruta IAOx no se considera que participe como ruta principal en la biosíntesis de auxina, ya que al eliminar por completo a su intermediario IAOx en Capítulo 1: Estudio de la participación de la auxina en el desarrollo de los frutos de fresa Fragaria × ananassa 78 Arabidopsis, se observaron defectos sutiles en el crecimiento de pocas plantas (Won et al., 2011). No obstante, al expresarse en los últimos estadios de maduración del receptáculo, nos indica no se puede excluir que pueda tener importancia en la síntesis de la auxina de la fresa F. × ananassa en este estadio. Silenciamiento transitorio mediante RNAi del gen triptófano aminotransferasa en F. × ananassa El silenciamiento por RNAi es una herramienta que ayuda a conocer la función de genes. Esta herramienta, usada transitoriamente, ha sido probada anteriormente en frutos de fresa (Hoffmann et al., 2006; Muñoz et al., 2012; Casañal, 2014; Vallarino et al., 2015) y tiene en este caso la ventaja de poder limitar temporal y espacialmente el silenciamiento. En nuestro caso, donde el estudio está centrado en el desarrollo y maduración del receptáculo es una herramienta adecuada. Los genes que se seleccionaron para silenciar fueron FaTAA1 y FaTAR2, pues ambos se expresaban en receptáculo y su expresión aumentaba con la maduración, aunque FaTAR2 presentó claramente una mayor expresión que FaTAA1 en el receptáculo maduro. Al inyectar las construcciones pBI-FATAA1i no se logró identificar un silenciamiento de este gen en los frutos inyectados (datos no mostrados). Esto puede deberse bien a que el nivel de expresión es muy bajo lo que dificulta la cuantificación por qRT-PCR, o bien que la secuencia seleccionada para la construcción de silenciamiento correspondiente a F. vesca, tuviera diferencias de nucleótidos con la de F. × ananassa, que no es conocida. Sin embargo, en el caso de la construcción pBI-FaTAR2i, dos de los frutos, de un total de doce, mostraron un silenciamiento parcial, casi un 70%, en el gen FaTAR2 en comparación con los frutos control. La efectividad de este silenciamiento se comprobó también por seguimiento de la expresión de genes que se conoce que son regulados por la auxina. Los primeros pasos en la recepción y señalización por auxinas están relativamente bien conocidos (Salehin et al., 2013). En el caso de las proteínas Aux/IAA se sabe que actúan como represoras de la expresión dependiente de auxina, pero a su vez están transcripcionalmente reguladas por auxina (Benjamin y Scheres, 2008; Pattinson et al., 2014). Así pues, la expresión disminuida de FaAux/IAA8a y FaAux/IAA11 en el receptáculo silenciado es una clara indicación de disminución del nivel de la auxina, aunque esta disminución no pudiera detectarse por medida directa de la auxina. En la Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 85 µg de RNA total para cada réplica. La secuenciación y preparación de las librerías se hizo en Beijin Genome Institute (BGI) (Hong Kong) mediante la plataforma Illumina HiSeq 2000, donde se realizaron 2 lecturas con extremos pareados (pair ends) de 100 pb de tamaño, obteniendose entre 20 a 30 millones de lecturas para cada muestra. Obtención y análisis de los datos de expresión por RNAseq Los datos sin procesar de RNA-seq se introdujeron en el programa CLC Genomics Workbench 7.0. Un primer paso fue la eliminación de adaptadores y lecturas de baja calidad, para ello se estableció un límite de calidad (evaluado por el programa como quality score) de 0.02. El control de calidad de las lecturas se realizó antes y después de este paso previo, mediante el programa FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Las lecturas del RNA-seq con la calidad esperada, fueron mapeadas contra los genes del genoma de referencia de Fragaria vesca v1.1 obtenido de la base de datos de Rosaceae (GDR http://www.rosaceae.org/, Shulaev et.al., 2011). El mapeo de las lecturas en el genoma de referencia se llevó a cabo con los parámetros predeterminados en el programa, donde el número de desajustes permitido fue de 2 (mismatches), el costo de inserción y deleción de 3, fracción mínima de longitud 0.9 (al menos el 90 % de las bases tienen que alinear con la referencia) y número máximo de aciertos (hits) para una lectura de 10. Para normalizar el número de las diferentes lecturas mapeadas entre las muestras, se utilizó la medida de expresión: lecturas por kilobase de exón por millón de lecturas mapeadas RPKM (Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads) (Mortazavi et. al., 2008). El análisis de expresión diferencial se expresó como el ratio de expresión de RPKM, entre las líneas transgénicas respecto al control. El análisis estadístico se realizó mediante la distribución Gaussiana en donde se compararon esencialmente el nivel de expresión media entre grupos (la línea etr1-1 L10 ó L12 y el control) mediante t-test con la corrección de la tasa de descubrimientos de falsos positivos (FDR). Esta tasa de falsos descubrimientos es la proporción de falsos positivos entre todos los declarados positivos. Con esto se obtuvo que del 5% de las características con la corrección FDR los falsos positivos estén por debajo de 0.05 El programa MapMan (Thimm et al., 2004) se empleó para analizar funcionalmente y visualizar los datos de las diferencias de expresión de los genes, mediante diagramas y rutas metabólicas. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 86 Resultados Estudios del gen TAA1 y sus parálogos (TARs) en Arabidópsis, han revelado que en el desarrollo de órganos existe un vínculo entre la producción local de la auxina y los efectos del etileno en tejidos específicos (Stepanova et al., 2011). Es por esto que anteriormente en nuestro laboratorio se realizaron análisis de expresión mediante qRt-PCR de los genes de biosíntesis de las auxinas en fresa (FaTAA1 y FaTAR2) en las líneas transgénica de fresa expresando etr1-1 de Arabidopsis. El estudio mostró que en el receptáculo maduro de los frutos transgénicos tanto FaTAA1 como FaTAR2 tenían aumentada la expresión de ambos genes en comparación con el control (resultados no publicados). Por este motivo se decidió realizar un análisis de expresión por RNA-seq en el estadio intermedio de los frutos etr1-1. Análisis de expresión mediante RNA-seq en frutos transformados con el gen mutado de Arabidopsis etr1-1 Se decidió analizar mediante el método de RNA-seq la expresión en frutos de las líneas transgénicas de fresa F. × ananassa, cv. Chandler, transformadas con el gen mutado del receptor de etileno, etr1-1, de Arabidopsis, generadas anteriormente en nuestro laboratorio (Merchante et. al., 2013a). Se eligió estudiar el receptáculo en estadio intermedio, sin aquenios, para llevar a cabo el análisis de expresión. La selección de este estadio se hizo sobre la hipótesis de que en éste estado de desarrollo de acuerdo a los datos disponibles en la bibliografía indicaban que la producción del etileno era mayor (Merchante et al., 2013a). Para comprobar que los frutos expresaban el gen de Arabidopsis etr1-1, se realizó una RT-PCR semicuantitativa empleando a FaGAPDH como gen constitutivo (Figura 2). En esta Figura se comprueba la expresión del gen etr1-1, en las líneas transgénicas (L10 y L12) en las tres réplicas biológicas respecto a las muestra control (C). Figura 2. Expresión del gen de Arabidopsis etr1-1 en frutos de fresa en estadio intermedio de las líneas transgénicas etr1-1 L10, L12 y control, mediante RT-PCR semicuantitativa. La línea etr1-1 10 tiene tres réplicas biológicas (10.1, 10.2, 10.3), al igual que la línea etr1-1 12 (12.1, 12.2, 12.3) y el control (C1, C2 y C3). Como control positivo se Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 87 empleo cDNA de Arabidopsis (At) y como control constitutivo interno se empleó al gen FaGAPDH. La preparación de las muestras y el análisis bioinformáticos de los resultados del RNA-seq (realizado en el programa CLC Genomics Workbench), se describe en Materiales y Métodos. Un total de 32 831 genes/transcritos fueron identificados en ambas líneas transgénicas etr1-1 L10 y L12, tomando como referencia el genoma de Fragaria vesca v1.1 obtenido de la base de datos de Rosaceae (GDR http://www.rosaceae.org/). Las diferentes lecturas fueron normalizadas mediante la medida de expresión: lecturas por kilobase de exón por millón de lecturas mapeadas RPKM (Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads) (Mortazavi et. al., 2008). El análisis estadístico, se llevó a cabo mediante el método de t-Student estableciendo como límite un p-value de P<0.05 para ambas líneas. Se identificaron 1214 genes con expresión diferencial significativa en relación al control para la línea etr1-1 L12 y para la línea L10, se obtuvieron 685 genes diferencialmente expresados. Un total de 120 genes fueron significativos en ambas líneas (Tabla 1 de Anexos) Identificación del gen etr1-1 de Arabidopsis en datos de RNA-seq Para la identificación la expresión del gen Atetr1-1 en los estudios del RNA-seq en F. × ananassa, se realizó blastx con la secuencia de etr1-1 para identificar los genes homólogos en F. vesca. Los resultados del blastx nos permitieron identificar 4 génes en F.vesca con alta y media identidad en la secuencia de proteínas. Así, se obtuvo una identidad en aminoácidos del 79 % con el gen Fv21106, para el gen Fv11090 la identidad fue del 63 %, y para los genes Fv32532 y Fv16612 casi el 40 % de identidad. El gen Fv21103 mostró una alta identidad casi del 82 % en la secuencia de proteínas, sin embargo, solo tiene en el genoma de F. vesca 144 aminoácidos (435 nucleótidos), mientras que los demás genes homólogos a Atetr1-1, incluido éste, tienen entre 640 y 740 aminoácidos, por lo que se decidió no considerarlo en los siguientes análisis de los resultadso. Estudios de expresión de los genes receptores de etileno en la fresa (FaETR1 y FaETR2), han sido analizados durante la maduración del fruto (Trainotti et al., 2005; Merchante et al., 2013a). Es por esto que los hemos incluido en los siguientes análisis. Se decidió, realizar un dendograma entre las proteínas de los genes Atetr1-1, FaETR1, FaETR2, Fv21106, Fv11090, Fv32532, y Fv16612 para identificar a las proteínas más cercanas del gen de Arabidopsis (Figura 3). En el dendograma Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 88 rectangular, se observó que las proteínas mas cercanas a AtETR1-1 fueron Fv21106, FaETR1 y aunque está más alejado, la proteína Fv11090. Figura 3. Dendograma rectangular de las secuencias de proteínas de los genes homólogos a Atetr1-1 en F. vesca y F. × ananassa. En color verde se encuentra la proteína de Arabidopsis etr1-1. En color rojo, son las proteínas de F. vesca, en rosa la secuencias de proteínas en F.× ananassa. El bootstrap esta dado en porcentaje. El dendograma se generó en el programa en línea http://www.phylogeny.fr (Dereeper et al., 2010). Posteriormente, se realizó un alineamiento de nulceótidos del gene Atetr1-1 y sus homólogos en F. vesca y en F. × ananassa (Figura 4). El alineamiento mostró que las secuencias de nucleótidos que alinean conjuntamente mejor con Atetr1-1, fueron la de los genes FaETR1, Fv21106 y Fv11090, mientras que los genes Fv16612, Fv32532 y FaETR2 mostraron un mejor alineamiento entre ellos. En el alineamiento se muestra una G en rojo en el nucleótido 194 de la secuencia de Atetr1-1, que corresponde a la mutación y que tiene como resultados el cambio de cisteína a tirosina en la secuencia aminoacídica, dando como resultado una mutación dominante que conduce a la insensibilidad a etileno en estos mutantes (Chang C et al., 1993). En los datos de RNA-seq, se buscaron los valores de RPKM de los genes homólogos, a Atetr1-1, sin embargo, ninguno mostró una diferencia significativa. En la Tabla 1 se encuentran todos los genes homólogos, con los valores de RPKM tanto en control, como en las líneas etr1-1 L10 y L12, y se realizó la sumatoria de sus valores de RPKM. En la Tabla 1 se observa en el total una diferencia con valores mayores en la L12 (33.56) con respecto a la sumatoria de los RPKM del control (28.56), sin embargo, en la línea L10 (27.06), presenta valores menores en el total que el control. No se pudo identificar al gen homólogo de Atetr1-1 en los datos de RNA-seq. Lo más probable, sin embargo, es que las secuencias correspondientes a etr1-1 no fueran mapeadas, al menos parcialmente, en el genoma de F. vesca, habida cuenta de las restricciones establecidas por el programa de análisis. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 89 FaETR1 1 ---------------------------ATG---GAGGCCT--GTAACTG---TATCGAGC Fv21106 1 ---------------------------ATG---GAGGCCT--GTAACTG---TATCGAGC Atetr1-1 1 ---------------------------ATG---GAAGTCT--GCAATTG---TATTGAAC Fv11090 1 ---------------------------ATG---GAGTCAT--GTGATTG---TGTTGAGG Fv32532 1 ---------------------------ATGTTAAAAGCATTAGCATCTGGGCTATCGATT FaETR2 1 ---------------------------ATGTTAAAAGCATTAGCATCTGGGCTATCGATT Fv16612 1 ATGGTGAATGATAGTCACTTGGGTGTAATGTTGAGAGCAGTAGCTATTGGGTTGTTAGTT FaETR1 26 CGC-----AATGGC-----------CGGCCGATG-----------------AGCTAC--T Fv21106 26 CGC-----AATGGC-----------CGGCCGATG-----------------AGCTGT--T Atetr1-1 26 CGC-----AATGGC-----------CAGCGGATG-----------------AATTGT--T Fv11090 26 CAC-----AATGGC-----------CCCCTGATG-----------------AACTTC--T Fv32532 34 TCTTTGCTACTGGTGTGTGTTTCGGCGTCTGATGGTGGATTTCCGCGGTGCAATTGTGAC FaETR2 34 TCTTTGCTACTGGTGTGTGTTTCGGCGTCTGATGGTGGATTTCCGCGGTGCAATTGTGAC Fv16612 61 TCCTATCTAGTGGTATCTGTTTCAGCCAATGATAGTGAATTTGCGAGTTGTAATTGTGAT FaETR1 51 CATCA-------------AGTATCAATA-CATTTCGGA------------------CTTT Fv21106 51 GATCA-------------AGTATCAATA-CATTTCGGA------------------CTTT Atetr1-1 51 AATGA-------------AATACCAATA-CATCTCCGA------------------TTTC Fv11090 51 GGTGA-------------AGTATCAGTA-CATATCGGA------------------TGTG Fv32532 94 GACGAGGGAAGCTTCTGGAGCATTGATAGCATACTAGAATGTCAACGAGTGAGCGATTTC FaETR2 94 GACGAGGGAAGCTTCTGGAGCATTGATAGCATACTAGAATGTCAGCGAGTGAGCGATTTC Fv16612 121 GATGAGGG---TTCTTGGAGCATTCAGAGTATTTTGGAGTGTCAGAGACTTAGTGATTTC FaETR1 79 TTTATTGCTCTTGCATATTTTTCAATCCCTCTAGAGTTGATATACTTTGTGAAGAAATCT Fv21106 79 TTTATTGCTATTGCGTATTTTTCAATCCCTCTAGAGTTAATATACTTTGTGAAGAAATCT Atetr1-1 79 TTCATTGCGATTGCGTATTTTTCGATTCCTCTTGAGTTGATTTACTTTGTGAAGAAATCA Fv11090 79 TTTATTGCGTTGGCGTATTTCTCGATTCCATTGGAGCTCATATACTTTGTGCAGAAATCT Fv32532 154 TTGATCGCGGTGGCCTACTTTTCGATCCCCATTGAGCTGCTTTACTTTGTCAGCTGCTCG FaETR2 154 TTGATCGCGGTGGCCTACTTTTCGATCCCCATTGAGCTGCTTTACTTTGTCAGCTGCTCG Fv16612 178 ATGATTGCTATAGCGTATTTTTCGATCCCTATAGAGCTCATTTACTTTGTCAGCTGCTCA FaETR1 139 GCGGTGTTTCCGTATAGATGGGTTCTTGTGCAGTTTGGTGCATTCATTGTGTTGTGCGGC Fv21106 139 GCGGTGTTTCCGTATAGATGGGTGCTTGTGCAGTTTGGTGCATTCATCGTGTTGTGTGGC Atetr1-1 139 GCCGTGTTTCCGTATAGATGGGTACTTGTTCAGTTTGGTGCTTTTATCGTTCTTTGTGGA Fv11090 139 GCTTTCTTCCCATATAGATGGGTGCTTATGCAGTTTGGTGCTTTCATTGTGCTTTGTGGC Fv32532 214 AATG---TACCTTTCAAATGGGTTCTCTTTGAGTTTATTGCCTTCATTGTGCTATGTGGA FaETR2 214 AATG---TACCTTTCAAATGGGTTCTCTTTGAGTTTATTGCCTTCATTGTGCTATGTGGA Fv16612 238 AACT---TTCCATTCAAATGGGTCCTCCTTCAGTTCATCGCGTTTATAGTCCTCTGTGGA FaETR1 199 GCCACGCATCTTATTAACTTGTGGACTT-------TCAACA---------TGCATTCTAG Fv21106 199 GCCACGCATCTCATTAACTTGTGGACTT-------TCAACA---------TGCATTCTAG Atetr1-1 199 GCAACTCATCTTATTAACTTATGGACTT-------TCACTA---------CGCATTCGAG Fv11090 199 GCAACGCATTTCATAAATGTGTGGACAT-------TCTCTA---------TGCACACCAA Fv32532 271 ATGACACATTTGCTGAATGGCTGGACTTAT---GGTCCTCA---------CCCGTTTCAG FaETR2 271 ATGACACATTTGCTGAATGGCTGGACTTAT---GGTCCTCA---------CCCGTTTCAG Fv16612 295 TTGACCCATTTGCTCAATGCCTGGACTTATTATGGCCCTCATACTACTCACTCGTTCCAA FaETR1 243 GACTGTGGCTATAGTTATGACTACTGCCAAGGTTCTGACTGCTGTGGTGTCGTGCGCCAC Fv21106 243 GACTGTGGCTATAGTTATGACTACTGCCAAGGTTCTGACTGCTGTGGTGTCGTGTGCCAC Atetr1-1 243 AACCGTGGCGCTTGTGATGACTACCGCGAAGGTGTTAACCGCTGTTGTCTCGTGTGCTAC Fv11090 243 AACTGTTGCCATCGTGATGACTATTGCAAAGGTCTCCTGTGCTGTTGTGTCGTGTGCAAC Fv32532 319 --TTGATGC--TCGCTCTCACAGTTTTCAAAATTCTCACTGCACTTGTATCATGTGCCAC FaETR2 319 --TTGATGC--TCGCTCTCACAGTTTTCAAAATTCTCACTGCTCTTGTATCATGTGCCAC Fv16612 355 --TTGATGC--TTGCCCTCACCATTACCAAACTCCTCACGGCCTTGGTCTCGTGTGCAAC Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 90 FaETR1 303 GGCATTGATGCTTGTGCATATAATTCCTGACTTGTTGAGTGTTAAGACTAGGGAGTTGTT Fv21106 303 GGCGTTGATGCTTGTGCATATAATTCCTGACTTGTTGAGTGTTAAGACTAGGGAGTTGTT Atetr1-1 303 TGCGTTGATGCTTGTTCATATTATTCCTGATCTTTTGAGTGTTAAGACTCGGGAGCTTTT Fv11090 303 GGCGTTGATGCTTGTTCACATTATTCCGGATTTGTTGTCTGTCAAGACCCGGGAGATCTT Fv32532 375 AGCTATAACGCTCATCACTCTTATTCCTTTGCTTCTCAAAGTGAAAGTGAGAGAATTCAT FaETR2 375 AGCTATAACGCTCATCACTCTTATTCCTTTGCTTCTCAAAGTGAAAGTGAGAGAATTCAT Fv16612 411 TGCAATAACCCTATTAACTCTTTTCCCTCTTATTCTGAAAGTCAAAGTAAGAGAGTTGTT FaETR1 363 TTTGAAGAATAAGGCTGCCGAGCTTGATAGGGAAATGGGGCTGATTAGGACTCAGGAGGA Fv21106 363 TTTGAAGAATAAGGCTGCGGAGCTTGATAGAGAAATGGGGCTGATTAGGACTCAGGAGGA Atetr1-1 363 CTTGAAAAATAAAGCTGCTGAGCTCGATAGAGAAATGGGATTGATTCGAACTCAGGAAGA Fv11090 363 TCTCAAGAATAAGGCTGAAGAGCTTGACAGAGAGATGGGTCTTATTCTAACTCAGGAAGA Fv32532 435 GTTGAAGAAGAAAACTTGGGACCTTGGAAGAGAGGTTGGAATTATAATGAGACAGAAAGA FaETR2 435 GTTGAAGAAGAAAACTTGGGACCTTGGAAGAGAGGTTGGAATTATAATGAGACAGAAAGA Fv16612 471 CTTGAGGCAGAATGTGTTGGAGTTAGACCAAGAGATTGGGATGATGAAGATACAGAAGGA FaETR1 423 AACTGGTCGGCATGTTAGGATGCTGACCCATGAGATCAGGAGTACTCTTGATAGGCATAC Fv21106 423 AACTGGTCGGCATGTTAGGATGCTGACCCATGAGATCAGGAGTACTCTTGATAGGCATAC Atetr1-1 423 AACCGGAAGGCATGTGAGAATGTTGACTCATGAGATTAGAAGCACTTTAGATAGACATAC Fv11090 423 AACAGGAAGGCATGTTAGAATGCTGACACATGAGATTAGAAGCACACTTGACAGAGACAC Fv32532 495 AGCTGGAATGCATGTCCGAATGCTTACCCAAGAGATTCGCAAGTCCCTTGATAGACATAC FaETR2 495 AGCTGGAATGCATGTCCGAATGCTTACCCAAGAGATTCGCAAGTCCCTTGATAGACATAC Fv16612 531 AGCGAGTTGGCATGTTCGAATGCTGACCCAGGAAATTAGGAAGTCACTCGATAAGCATAA FaETR1 483 TATACTGAAAACCACACTGGTTGAGTTAGGTAGGACTTTGGCATTGGAAGAGTGTGCGTT Fv21106 483 TATACTGAAAACCACACTGGTTGAGTTAGGTAGGACTTTGGCGTTGGAAGAGTGTGCGTT Atetr1-1 483 TATTTTAAAGACTACACTTGTTGAGCTTGGTAGGACATTAGCTTTGGAGGAGTGTGCATT Fv11090 483 TATACTGAAAACCACTCTTGTTGAGCTGGGAAGGACTTTAGGCCTTGAGGAATGCGCTTT Fv32532 555 AATATTGTCCACAACCCTTTTTGAGCTATCTGAGACATTGGGTTTGCAGTACTGTGCAGT FaETR2 555 AATATTGTCCACAACCCTTTTTGAGCTATCTGAGACATTGGGTTTGCAGTACTGTGCAGT Fv16612 591 CATTTTGTATACAACGCTGGTTGAGCTTTCAAAGACATTGGACTTGCATAACTGTGCAGT FaETR1 543 GTGGATGCC-CACGCGTACTGCGTTGGAGTTGCAGCTATCGTATACACTCCGTCAGCA-G Fv21106 543 GTGGATGCC-CACACGGACTGCGTTGGAGTTGCAGCTATCGTATACACTCCGTCAGCA-G Atetr1-1 543 GTGGATGCC-TACTAGAACTGGGTTAGAGCTACAGCTTTCTTATACACTTCGTCATCA-A Fv11090 543 GTGGATGCCATGCAGGAGC-GGGATGAACCTTCAACTTTCTCATACTCTCAACTATGA-C Fv32532 615 TTGGATGCC-TAATGAAATTAAAACAGAGATGATCCTGACCCATGAGTTGAAAGGGAAGA FaETR2 615 TTGGATGCC-TAATGAAATTAAAACAGAGATGATCCTGACCCATGAGTTGAAAGGGAAGA Fv16612 651 TTGGATGCC-TAATGAGAACAGGACAGAGTTGAACCTGACTCATGAGTTGAAAGGG---A FaETR1 601 AATCCTGTAGGACATACCGTACCCATACATCTTCCTGTGATCAATC-AAGTGTTTAGTAG Fv21106 601 AATCCTGTAGGACATACCGTACCCATACATCTTCCTGTGATCAATC-AAGTGTTTAGTAG Atetr1-1 601 CATCCCGTGGAGTATACGGTTCCTATTCAATTACCGGTGATTAACC-AAGTGTTTGGTAC Fv11090 601 GCCCAAATTGGGTCTACTGTGCCATTTAGCCTTCCTATAGTTAATG-AAGTTTTCAAGAG Fv32532 674 ACTATTCTAATATGTACAACTTTTCTA----TACCAATTGGCGATCCAGATGTT--GTAC FaETR2 674 ACTATTCTAATATGTACAACTTTTCTA----TACCAATTGGCGATCCAGATGTT--GTAC Fv16612 707 GTTCTTCGAGAAATTATAGTCATTCTA----TTCCAATGAATGACCCAAATGTG--TTGG FaETR1 660 CAACCGTGCTGTGAAGATATCGCCGAATTCCCCGGTGGCAAGACTTAGGCC-ACTTGTGFv21106 660 CAACCGTGCCGTGAAGATATCGCCGAATTCCCCAGTGGCAAGACTTAGGCC-ACTTGTGAtetr1-1 660 TAGTAGGGCTGTAAAAATATCTCCTAATTCTCCTGTGGCTAGGTTGAGACCTGTTTCTGFv11090 660 CTCTCGAGCAATGCGTATACCATATACCTGCCCCTTGGCCCGGATCAGACC-ACTTGTGFv32532 728 TTATTAAAGGGAGTG-ATGGGGTCAACAT--TCTTCGGCCAGATTCAG--C-ACTTGTAT FaETR2 728 TTATTAAAGGGAGTG-ATGGGGTCAACAT--TCTTCGGCCAGATTCAG--C-ACTTGTAT Fv16612 761 AGATCAGAGAGAGCA-ACAGAGTAAGAAT--CCTGAGGCCTGATTCTG--C-ACTTGGAG Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 91 FaETR1 718 --GGAAAGCATA-TG--CCTGGAGAG---------GTTGTTGCAGTTCGCGTCCCTCTCC Fv21106 718 --GGAAAGCATA-TG--CCTGGAGAG---------GTTGTTGCAGTTCGCGTCCCTCTCC Atetr1-1 719 --GGAAA-TATA-TG--CTAGGGGAG---------GTGGTCGCTGTGAGGGTTCCGCTTC Fv11090 718 --GGAAGGTATA-TG--CAACCTGAG---------ATTGTCGCTCTGCGTGTACCGCTGT Fv32532 782 GTGGAAGCAGTGGTGATTCTGGTGAGCCGGGACCAGTAGCTGCAATTCGGATGCCAATGC FaETR2 782 GTGGAAGCAGTGGTGATTCTGGTGAGCCGGGACCAGTAGCTGCAATTCGGATGCCAATGC Fv16612 815 CTGCAAGTTGTGGTGGTTCTAGTGAATGTGGTGCTGTAGCAGCAATCCGGATGCCAATGC FaETR1 764 TGCACCTCTCGAACTTCCAAATCAATGATTGGCCAGAGCTCTCAACTAAACGTTATGCCT Fv21106 764 TGCACCTCTCGAACTTCCAAATCAATGATTGGCCAGAGCTCTCAACTAAACGTTATGCCT Atetr1-1 764 TCCACCTTTCTAATTTTCAGATTAATGACTGGCCTGAGCTTTCAACAAAGAGATATGCTT Fv11090 764 TGGATCATTCAAATTTCCAAATGAACGACTGGCCTGA--TGTC----------TATGCCA Fv32532 842 TTCGGGTTTCCAATTTT-AAAGGGGGGACT--CCTGAGTTGATCCAGACTTGTTATGCGA FaETR2 842 TTCGGGTTTCCAATTTT-AAAGGGGGGACT--CCTGAGTTGATCCAGACTTGTTATGCGA Fv16612 875 TTCGAAATTCAAATTTC-AAAGGGGGTACA--CCACAGTTAGTTGATACTCCTTACGCTA FaETR1 824 TGATGGTTTTGATGCTCCCTTGTGATAGTG-CAAGGCAATGGCATGTGCATGAGTTAGAG Fv21106 824 TGATGGTTTTGATGCTCCCTTGTGACAGTG-CAAGGCAATGGCATGTGCATGAGTTAGAG Atetr1-1 824 TGATGGTTTTGATGCTTCCTTCAGATAGTG-CAAGGCAATGGCATGTCCATGAGTTGGAA Fv11090 812 TCATGGTTCTGATTCTACCAACAGATAGCA-CTAGAAAGTGGCGAGACCATGAACTTGAA Fv32532 899 TATTGGTTCTGGTTCTACCTGGTGG-AGAGCCTAGATCTTGGAGCAGTCAGGAACTTGAG FaETR2 899 TATTGGTTCTGGTTCTACCTGGTGG-AGAGCCTAGATCTTGGAGCAGTCAGGAACTTGAG Fv16612 932 TATTGGTTTTGGTTCT-TCCGATGTCAGATTCTAGAGTTTGGAGCTATCATGAAATGGAG FaETR1 883 CTTGTTGAGGTGGTTGCTGACCAGGTAGCAGTTGCTCTCTCACATGCTGCAATCTTAGAA Fv21106 883 CTTGTTGAGGTGGTTGCTGACCAGGTAGCAGTTGCTCTCTCACATGCTGCGATCTTAGAA Atetr1-1 883 CTCGTTGAAGTCGTCGCTGATCAGGTGGCTGTAGCTCTCTCACATGCTGCGATCCTAGAA Fv11090 871 CTGGTTGATGTTGTTGCAGATCAGGTAGCTGTTGCTCTTTCACATGCTGCTATTGTTGAA Fv32532 958 ATAATTAAGGTGGTTGCTGACCAGGTGGCTGTGGCCTTATCCCATGCTGCAATCCTTGAA FaETR2 958 ATAATTAAGGTGGTTGCTGACCAGGTGGCTGTGGCCTTATCCCATGCTGCAATCCTTGAA Fv16612 991 ATAGTGGAAGTTGTGGCTGACCAGGTTGCAGTGGCACTGTCCCACGCTGCAGTACTTGAA FaETR1 943 GAGTCAAGGAGGGCAAGGGATCTACTAATGGAGCAGAATATTGCACTCGATCTAGCTAGG Fv21106 943 GAGTCAAGGAGGGCAAGGGATCTACTAATGGAGCAGAATATTGCACTCGATCTGGCTAGG Atetr1-1 943 GAGTCGATGCGAGCTAGGGACCTTCTCATGGAGCAGAATGTTGCTCTTGATCTAGCTAGA Fv11090 931 GAGTCCATGCGAGCCAGTGATCAGCTTGTGGAGCAGAATGTTGCTTTAGATTTGGCCCGG Fv32532 1018 GAGTCCCAACTTATGCGGGAACAATTGGCTGAGCAAAACCGGGCCTTGCAACAGGCGAAA FaETR2 1018 GAGTCCCAACTTATGCGGGAACAATTGGCTGAGCAAAACCGGGCCTTGCAACAGGCGAAA Fv16612 1051 GAGTCTCAACTAATGAGAGAGAAACTGAGAGAACAAAATCGTGCACTACAGCAGGCTCAG FaETR1 1003 AGGGAAGCAGAAACAGCGATTCGTGCTCGCAATGATTTCTTGGCAGTAATGAACCATGAA Fv21106 1003 AGGGAAGCAGAAACAGCGATTCGTGCTCGCAACGATTTCTTGGCAGTAATGAACCATGAA Atetr1-1 1003 CGAGAAGCAGAAACAGCAATCCGTGCCCGCAATGATTTCCTAGCGGTTATGAACCATGAA Fv11090 991 AGAGAAGCAGAGCTGGCAATCCGTGCTCGCAATGATTTCCTTGCTGTCCTGAACCATGAA Fv32532 1078 ATGAATGCCATGATGGCAAGCCACGCAAGAAACTCATTCCAAAAGGTGATGAGTGATGGG FaETR2 1078 ATGAATGCCATGATGGCAAGCCATGCAAGAAACTCATTCCAAAAGGTGATGAGTGATGGG Fv16612 1111 AAGAATGCAATGATGGCCAGCCAAGCAAGATACTCATTTCAGAAGGTGATGAGTAATGGA FaETR1 1063 ATGAGAACTCCGATGCACGCAATTATTGCTCTTTCTTCATTGCTGCAGGAAACTGAGCTG Fv21106 1063 ATGAGAACTCCGATGCACGCAATTATTGCTCTTTCTTCATTGCTGCAGGAAACTGAGCTG Atetr1-1 1063 ATGCGAACACCGATGCATGCGATTATTGCACTCTCTTCCTTACTCCAAGAAACGGAACTA Fv11090 1051 ATGAGGACACCAATGCATGCAATAATTGCATTGTCTTCACTTCTCTTAGAAACAGAACTA Fv32532 1138 ATGAGAAGGCCAATGCATTCAGTATTGGGGCTGCTTTCCATGATGCAGGATGAGAGTTTG FaETR2 1138 ATGAGAAGGCCAATGCATTCAGTATTGGGGCTGCTTTCCATGATGCAGGATGAGAGTTTG Fv16612 1171 ATGAGAAGGCCGATGCATTCCATTTTGGGGTTGCTGTCAACATTTCAA---GAGAGTATG Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 92 FaETR1 1123 ACACCGGAGCAGCGTCTAATGGTTGAGACAATATTGAAGAGCAGCAACCTTTTGGCTACT Fv21106 1123 ACACCGGAGCAGCGTCTAATGGTTGAGACAATATTGAAGAGCAGCAACCTTTTGGCTACT Atetr1-1 1123 ACCCCTGAACAAAGACTGATGGTGGAAACAATACTTAAAAGTAGTAACCTTTTGGCAACT Fv11090 1111 ACACCAGACCATAGGGTTATGATAGAATCGGTACTAAAGAATAGCAACCTTTTGGAAACG Fv32532 1198 AATAATGATCAGCGAGTTATTGTTGATGCAATGGTAAGGACAAGCAATGTCTTATCGACG FaETR2 1198 AATAATGATCAGCGAGTTATTGTTGATGCAATGGTAAGGACAAGCAATGTCTTATCGACG Fv16612 1228 AGTTTGAAACAAAGGATTATTGTAGACACTATGGTTAAAACTAGCTATGTTCTCTCCACT FaETR1 1183 CTGATAAATGATGTACTAGACCTTTCAAGACTTGAAGATGGCAGCCTTCAACTTGACATA Fv21106 1183 CTGATAAATGATGTACTAGACCTTTCAAGACTTGAAGATGGCAGCCTTCAACTTGACATA Atetr1-1 1183 TTGATGAATGATGTCTTAGATCTTTCAAGGTTAGAAGATGGAAGTCTTCAACTTGAACTT Fv11090 1171 CTTATTAATGATGTTCTAGATCTTTCTAGACTTGAAGATGGCAGCCTAGACTTGGACATT Fv32532 1258 TTGATAAATGATGCTATGGATAATCCAGCCAAGGATAGTGGAAGATTTCCTTTGGAGATG FaETR2 1258 TTGATAAATGATGCTATGGATAATCCAGCCAAGGATAGTGGAAGATTTCCTTTGGAGATG Fv16612 1288 TTGATAAATGATGTCATGGAGATGTCAGCAAAAGATAATGGAAGGTTCCCTCTGGAGATG FaETR1 1243 GCAACTTTTAACCTCCATTCTGTATTCATAGAGGTTCATAATTTAGTTAA--GCCTGTTG Fv21106 1243 GCAACTTTTAACCTCCATTCTGTATTCATAGAGGTTCATAATTTAGTTAA--GCCTGTTG Atetr1-1 1243 GGGACATTCAATCTTCATACATTATTTAGAGAGGTCCTCAATCTGATAAA--GCCTATAG Fv11090 1231 GGAAAGTTTAACCTTCATGGAGTTTTCAGAGAGGCAATCGATCTGATAAA--GCCTATTG Fv32532 1318 AGGCCTTTCCGGTTACAACCAATGATAAAAGAAGCAGCTTGCCTTGCCAAATGCTTGT-G FaETR2 1318 AGGCCTTTCCGGTTACAACCAATGATAAAAGAAGCAGCTTGCCTTGCCAAATGCTTGT-G Fv16612 1348 AGGCCTTTTCAACTTCACTCCATGATCAAAGAAGCTTCTTGCCTCGCCAAGTGCTTGT-C FaETR1 1301 CATCTGTCAAAAAGTTGTCAGTTACACTAAATTTAGC-AGCAGATTTGCCAGTTTATGCG Fv21106 1301 CATCTGTGAAAAAGTTGTCAGTTACACTAAATTTAGC-AGCAGATTTGCCAGTTTATGCG Atetr1-1 1301 CGGTTGTTAAGAAATTACCCATCACACTAAATCTTGC-ACCAGATTTGCCAGAATTTGTT Fv11090 1289 CTACTGTGAAGAAGTTATCCATGAGTTTGATTCTGGC-CCCGGATGTGCCTGTATGTGCT Fv32532 1377 TGTGTATAGGGGGTTTGGTTTTGCAATTGAGGTTGACAAGTCCAT-AGC-TGATCATGTA FaETR2 1377 TGTGTATAGGGGGTTTGGTTTTGCAATTGAGGTTGACAAGTCCAT-AGC-TGATCATGTA Fv16612 1407 TGTGTATAAAGGCTTTAGGTTTGAAGTTGATGTTCA-GAGCTCAT-TGCCTAATCAGGTG FaETR1 1360 ATTGGTGATGAAAGGCGCCTTCTACAAATTATTCTAAATGTTGTTGGGAATGCTGTCAAG Fv21106 1360 ATTGGTGATGAAAAGCGCCTTCTACAAATTATTCTAAATGTTGTTGGGAATGCTGTCAAG Atetr1-1 1360 GTTGGGGATGAGAAACGGCTAATGCAGATAATATTAAATATAGTTGGTAATGCTGTGAAA Fv11090 1348 GTTGGGGATGAGAACCGGCTTATGCAAACTATCTTAAATGTTGCTGGTAATGCTGTCAAA Fv32532 1435 ATTGGAGATGAAAGAAGGGTTTTTCAGGTGATTTTGCATATGGTTGGTAGC-CTGTTGAA FaETR2 1435 ATTGGAGATGAAAGAAGGGTTTTTCAGGTGATTTTGCATATGGTTGGTAGC-CTGTTGAA Fv16612 1465 ATGGGGGACGAAAGAAGGGCTTTCCAAGTAATCTTGCATATGGTTGGATAT-CTTTTGAG FaETR1 1420 T--TTTCAAAAGAAGGGAGCATCTCAATTACTGCTTTTGTTGCGAAATCAGAATCTCTAA Fv21106 1420 T--TTTCAAAAGAAGGGAGCATCTCAATTACTGCTTTTGTTGCGAAATCAGAATCTCTAA Atetr1-1 1420 T--TCTCCAAACAAGGTAGTATCTCCGTAACCGCTCTTGTCACCAAGTCAGACACACGAFv11090 1408 T--TTACAAAGGATGGTTATGTTTCAGTTATAGCATCTATTGCAAGACCAGAATCTTCAA Fv32532 1494 TGGAAACCAGGGCGGAGGGTTGGTCGTATTTCGGGTTTCTTCAGAGAATGGAAGTCAGGG FaETR2 1494 TGGAAACCAGGGCGGAGGGTTGGTCGTATTTCGGGTTTCTTCAGAGAATGGAAGTCAGGG Fv16612 1524 CACCTATAAGGGAGGAGGAACTGTCATCTTTCGGGCTATTCTAGAGAGTGGTTCTGAGAC FaETR1 1478 GAGATTTCCGTGCTGCTG--ACTTTTTTCCTGTGCAAA----------GTGATAATCACT Fv21106 1478 GAGATTTCCGTGCTGCTG--ACTTTTTTCCTGTGCAAA----------GTGATAATCACT Atetr1-1 1477 -----------GCTGCTG--ACTTTTTTGTCGTGCCAA----------CTGGGAGTCATT Fv11090 1466 GAGATTGGCGACCACCTG--AATTTTATCCAGCGCCAA----------GTGACGGCCATT Fv32532 1554 GAGGAATGATCAAAGATG-GGCTGCT-TGGAGA-CAGA-ACTC---TGATAGTGGTGATG FaETR2 1554 GAGGAATGATCAAAGATG-GGCTGCT-TGGAGA-CAGA-ACTCATCTGATAGTGGTGATG Fv16612 1584 CCCGGATGAT--AAATTGCAACAGATGTGGAGAACAGGTACAC--CAGATGA--GT-ACG Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 93 FaETR1 1526 TTTATCTGCGTGTACAGG---------------------------------TAAAAGATT Fv21106 1526 TTTATCTGCGTGTACAGG---------------------------------TAAAAGATT Atetr1-1 1514 TCTACTTGAGAGTGAAGG---------------------------------TAAAAGACT Fv11090 1514 TTTACTTACGAGTTCAGGGTGTAGACTTTTTAGCTCGACAATCATGTACTGTCAAGGATT Fv32532 1607 TATATATTAGATTTGAGA----------------------------------TTGGGATFaETR2 1610 TATATATTAGATTTGAGA----------------------------------TTGGGATFv16612 1637 TATCTGTGAGGTTCGAAT----------------------------------TGGAGATFaETR1 1553 CAGGATCTGGAATCAATCCCCAGGATCTTCCGAAGTTATTCACCAAATTTGCACA----- Fv21106 1553 CAGGATCTGGAATCAATCCCCAGGATCTTCCGAAGTTATTCACCAAATTTGCACA----- Atetr1-1 1541 CTGGAGCAGGAATAAATCCTCAAGACATTCCAAAGATTTTCACTAAATTTGCTCA----- Fv11090 1574 CTGGCAGTGGTATTCTTCCCCAAGATATTCCTCGTATTTTCACCAAGTTTACTCAGCCCA Fv32532 1632 -AAGCAACGGTGGTTCTCAATCAGATATGACAAGTCCAATTATGCAGCTTGTTGGT---- FaETR2 1635 -AAGCAATGGTGGTTCTCAATCAGATATGACAAGTCCAATTATGCAGCTTGTTGGT---- Fv16612 1662 -TAATGACGGAACTTCTCATTCCAGTGGAGTATCATCGATGATTGATTACGGTGGT---- FaETR1 1608 -AAATCAGTCATTAGCTACTCGCAATTCTGGTGGAAGTGGACTTG-GTCTTGCAATTTGT Fv21106 1608 -AAATCAGTCAGTAGCTACTCGCAATTCTGGTGGAAGTGGACTTG-GTCTTGCAATTTGT Atetr1-1 1596 -AACACAATCTTTAGCGACGAGAAGCTCGGGTGGTAGTGGGCTTG-GCCTCGCCATCTCC Fv11090 1634 GAAATGGATC--CAAT--CGAGTAAAT--GATGGTGCAGGACTTG-GACTTGCCATTTGC Fv32532 1687 -AGCAGATACAACAGTGAAGGA--------GTTGAGGAGAACTTGAGCTTCAACATTTGC FaETR2 1690 -AGCAGATACAACAGTGAAGGA--------GTTGAGGAGAACTTGAGCTTCAACATTTGC Fv16612 1717 -AGGAGGAACAACAGCAGTGAA--------ATAAAGAAGGGCCTGAGCTTCAACATTTGC FaETR1 1666 AAGAGATTTGTAAATCTCATGGAGGGGCATATTTGGAT------TGAAAGTGATGGTCTA Fv21106 1666 AAGAGATTTGTAAATCTTATGGAGGGGCATATTTGGAT------TGAAAGTGATGGTCTG Atetr1-1 1654 AAGAGGTTTGTGAATCTGATGGAGGGTAACATTTGGAT------TGAGAGCGATGGTCTT Fv11090 1687 AAAAGGTTTGTGAATACCATGGGAGGTCATATTTGGAT------CGAGAGTGAGGGCATT Fv32532 1738 AAAAGGCTAGTGCAGTTGATGCAAGGAAACATATGGCCAATTCCTAACCCTCAAGGATTT FaETR2 1741 AAAAGGCTAGTGCAGTTGATGCAAGGAAACATATGGCCAATTCCTAACCCTCAAGGATTT Fv16612 1768 AAAAAGATTGTCCAGATGATGCAAGGCAATATCTGGATA-TCCATGAATCCGATCAATCT FaETR1 1720 G--GCAAGGGATGCACTACTACTTTC-ATTGTGAAACTCGGCTATCCGGAGCGATCAAAT Fv21106 1720 G--GCAAGGGATGCACTTCTACTTTC-ATTGTGAAACTCGGCTATCCGGAGCGATCAAAT Atetr1-1 1708 G--GAAAAGGATGCACGGCTATCTTT-GATGTTAAACTTGGGATCTCAGAACGTTCAAAC Fv11090 1741 G--ACAAGGGA---------ACTCTT-GTTGT---------------------------- Fv32532 1798 C-CTCAAAGCATG-GCACTTGTTCTCCGGTTTCAAACTCGACCATCCATTGCAAT-AGCC FaETR2 1801 C-CTCAAAGCATG-GCACTTGTTCTCCGGTTTCAAACTCGACCATCCATTGCAAT-AGCC Fv16612 1827 CGCAGAAAGCATG-ACACTTGTTCTCAGGTTTCAAATCCTTCCTTCTTTAGGGAG-AG-- FaETR1 1777 GAGTCTAAGCTGCCTTTTGTGCCTAAGATGCACACAACTCATGTTC--AAACAAACTTTC Fv21106 1777 GAGTCTAAGCTGCCTTTTTTGCCTAAGATGCACACAACTCATGTTC--AAACAAACTTTC Atetr1-1 1765 GAATCTAAACAGTCGGGCATACCGAAAGTTCCAGCCATTCCCCGAC--ATTCAAATTTCA Fv11090 1761 --ATTTA-------------------------------TCGT---------CAAA----- Fv32532 1855 ATCTCTGAACCTGGAGGATCATCAGAG--------CACTCGCATTCCAATTCTATATTCA FaETR2 1858 ATCTCTGAACCTGGAGGATCATCAGAG--------CACTCGCATTCCAATTCTATATTCA Fv16612 1883 -------------GAAATCCATTGGAG--------CAACCAAATTCCAACTCAGAGTTCA FaETR1 1835 CAGGGTTGAAAGTTCTTGTCATGGATGATAATGGAGTCAGCAGATCAGTTACAAAGGGAC Fv21106 1835 CAAGGTTGAAAGTTCTTGTCATGGATGATAATGGAGTCAGCAGATCAGTTACGAAGGGAC Atetr1-1 1823 CTGGACTTAAGGTTCTTGTCATGGATGAGAACGGGGTAAGTAGAATGGTGACGAAGGGAC Fv11090 1774 --------------CTCGCGATATGTGACAGTTG---CAGTACAACAATAGC-------- Fv32532 1907 GAGGCTTGCAAGTTCTGTTAACTGATGAAGATGATGTGAATAGGCTTGTGACTCGGAAGC FaETR2 1910 GAGGCTTGCAAGTTCTGTTAACTGATGAAGATGATGTGAATAGGCTTGTGACTCGGAAGC Fv16612 1922 GAGGACTCCGGGTTGTAGTAGCGGACGATGATAATGTAAACAGGACCGTGACCACAAAGC Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 94 FaETR1 1895 TCCTTGAGCACTTGGGATGTGATGTAACAACTGTAAGCTCAAGTGATGAGTTCTTGCAAG Fv21106 1895 TCCTTGAGCACTTGGGATGTGATGTAACAACTGTAAGCTCAAGTGATGAGTTCTTGCAAG Atetr1-1 1883 TTCTTGTACACCTTGGGTGCGAAGTGACCACGGTGAGTTCAAACGAGGAGTGTCTCCGAG Fv11090 1809 -------ACA----------------------------TCAAAC----AGTACCTAAAGG Fv32532 1967 TGCTTGAGAAACTAGGTTGCAATGTAACTGCTGTTTCCTCAGGATTCGAATGCCTTTCTG FaETR2 1970 TGCTTGAGAAACTAGGTTGCAATGTAACCGCTGTTTCCTCAGGATTCGAATGCCTTTCTG Fv16612 1982 TGCTCCAGAAACTTGGCTGTCAAGTCAGTGCTGTTTCTTCGGGGTTTGAATGCCTGAGTA FaETR1 1955 TT----ATTTCACAGGAGCA-----CAAGGTGGTGTTCATGGATGTGTGTATGCCTGGTA Fv21106 1955 TT----ATTTCACAGGAGCA-----CAAGGTGGTGTTCATGGATGTGTGCATGCCTGGCA Atetr1-1 1943 TT----GTGTCCCATGAGCA-----CAAAGTGGTCTTCATGGACGTGTGCATGCCCGGGG Fv11090 1830 -------------AGAGGCA-----AA---------TCACGGAAGTGCAGAT-------- Fv32532 2027 CCATTGGTCCCTCTGGAGCTTCTGTCCAAGTTGTCTTCCTAGATCTCCAAATGACGGAGC FaETR2 2030 CCATTGGTCCCTCTGGAGCTTCTGTCCAAGTTGTCTTCCTAGATCTCCAAATGACGGAGC Fv16612 2042 CCCTTAGTAGTGCCGAAAGTCCTTTCCAGGTTGTTGTTCTGGATCTTCACATGCCTGAAA FaETR1 2006 TAGATGGTTTTGAACTAGCCGTCCAGATTCATGAAAAGTTTACAAAAC---GTCATGAAC Fv21106 2006 TAGATGGTTTTGAACTAGCCATCCAGATTCATGAAAAGTTTACAAAAC---GTCATGAAC Atetr1-1 1994 TCGAAAACTACCAAATCGCTCTCCGTATTCACGAGAAATTCACAAAACAACGCCACCAAC Fv11090 1855 ---------------------------CTCATTGGA----TACAAA-------------- Fv32532 2087 TGGATGGTCTTGAAGTTGCAATG-AGAATTAGAAAA---TTCCGAAGC-----CGCACTT FaETR2 2090 TGGATGGTCTTGAAGTTGCAATG-AGAATTAGAAAA---TTCCGAAGC-----CGCACTT Fv16612 2102 TGGATGGATTCGAAGTGGCAATG-AGAATCAGGAAA---TTCCACAAC-----CCTAGTT FaETR1 2063 GACCAGTATTAGTTGCACTTACTGGAAACATAAACAAGATGACAAAGGAGAGCTGCATGA Fv21106 2063 GACCAGTATTAGTTGCACTTACTGGAAACATAAATAAGATGACAAAGGAGAGCTGCATGA Atetr1-1 2054 GGCCACTACTTGTGGCACTCAGTGGTAACACTGACAAATCCACAAAAGAGAAATGCATGA Fv11090 1870 --CCAGCTTTT-------------------------------------AGAGATG----- Fv32532 2138 GGCCATTGATCATTGCCGTAACTGCCAGTGCAGATGATGATATTTGGGATAGATGCATGC FaETR2 2141 GGCCATTGATCATTGCCGTAACTGCCAGTGCAGATGATGATATTTGGGATAGATGCATGC Fv16612 2153 GGCCGCTGATCATAGCCCTGACCGCAAGTGCGGAGGAAGATGTGTGGGAGAAATGTCTAC FaETR1 2123 GGGTTGGTATGGAAGGAGTTATACTTAAACCTGTTTCAGTTGATAAAATGAGGAGTGTTT Fv21106 2123 GGGTTGGTATGGACGGAGTTATACTCAAACCTGTTTCAGTTGATAAAATGAGGAGTGTTT Atetr1-1 2114 GCTTTGGTCTAGACGGTGTGTTGCTCAAACCCGTATCACTAGACAACATAAGAGATGTTC Fv11090 1886 GTTATGGTTTAG-----------CTTCAAC---------------AAATG-----CACGT Fv32532 2198 AGATTGGGATCAACGGAGTCATCCGAAAACCAGTATTGTTGCAAGGCATTGCCAGTGAGC FaETR2 2201 AGATTGGGATCAACGGAGTCATCCGAAAACCAGTATTGTTGCAAGGCATTGCCAGTGAGC Fv16612 2213 AGATGGGAATGAACGGACTGATCCGAAAACCTGTCATTTTGCAAGGGATGTCAAACGAGC FaETR1 2183 TATCAGAACTACTAGAGCATCGAGTTCTATTTGAGGCCATGTAA Fv21106 2183 TATCAGAACTACTAGAGCATCGAGTTCTATTTGAGGCCATGTAA Atetr1-1 2174 TGTCTGATCTTCTCGAGCCCCGGGTACTGTACGAGGGCATGTAA Fv11090 1915 TATCAAA-------GA------AGTC---TTTGA---------- Fv32532 2258 TTAGACGAGTCCTGGTGC---AGGCA---AACAAAATTGTGTGA FaETR2 2261 TTAGACGAGTCCTGGTGC---AGGCA---AACAAAATTGTGTGA Fv16612 2273 TCCGGAGAGTAATGCAAC---GAGCC---GGTGAAGGTTTGTGA Figura 4. Alineamiento de nucleótidos de genes homólogos a Atetr1-1 en F. vesca y F. × ananassa. Las letras blancas con fondo negro representan nucleótidos conservados en al menos tres de los genes usados en el alineamiento. Número de acceso de los genes en http://www.strawberrygenome.org: Fv21106 (gene 21106), Fv11090 (gene 11090), Fv32532 (gene 32532), Fv16612 (gene 16612); en https://www.arabidopsis.org: Atetr1-1 (AT1G66340.1) y en http://www.ncbi.nlm.nih.gov: los genes FaETR1 (AJ297511 ) y FaETR2 (AJ297513.1). La letra roja G en la posición 194, indica el sitio donde se produce la mutación en Atetr1-1, cambiando ésta por una A .El alineamiento se llevó a cabo empleando el programa ClustalW. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 101 Figura 9. Genes involucrados en el estrés biótico (biotic stress) de la línea etr1-1 L12 visualizados en Mapman. Los genes se representan individualmente por pequeños cuadrados expresados diferencialmente. En verde y rojo están representados los genes con una disminución o aumento respectivamente en comparación con el control en valores de Log2, utilizando la escala de -1.5 a +1.5 Los genes con respuesta al estrés biótico que están involucrados en la señalización, tanto del tipo receptores quinasa, señalización por calcio, proteínas G y en la señalización de nutrientes y azúcar, presentaron 17 genes con un efecto de sobreexpresión y 7 genes, mostraron silenciamiento (2 de ellos con muy poca diferencia en su represión) (Figura 9). Un gen involucrado en la regulación de la transcripción en el RNA, con dominio MYB, presentó sobreexpresión. Los genes que codifican proteínas involucradas en el estrés biótico por choque térmico, presentaron 4 genes sobreexpresados. Los genes involucrados en el metabolismo secundario como flavonoides, fenoles simples y ceras se encontraron 4 genes sobreexpresados y 3 genes ligeramente silenciados. Por último, de los genes relacionados con estrés abiótico, se encontraron 4 de ellos con una mayor expresión respecto al control (Figura 9). En el diagrama de las principales categorías de las enzimas (large enzyme families), se mostraron 30 genes agrupados en diferentes familias (Figura 10). Esta visualización, permite agrupar los genes en varias familias, como en las enzimas tipo citocromo P450, que presentaron 2 genes sobreexpresados y 2 con silenciamiento. En las enzimas de la familia de las glucosidasas solo hay un gen con sobreexpresión, en Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 102 las enzimas peroxidasas se mostraron 2 genes sobreexpresados y uno silenciado, mientras que las oxidasas mostraron un gen sobreexpresado y uno silenciado. La familia de las UDP glicosiltransferasas que mostraron 7 genes sobreexpresados y 4 silenciados. Los genes que codifican a las proteínas glutatión-s-transferasas, presentaron un gen sobreexpresado y 2 silenciados. De la familia beta 1,3 glucano hidrolasas se mostró un gen ligeramente silenciado (Figura 10). Figura 10. Visualización en Mapman de las familias de enzimas (large enzyme families) de la línea etr1-1 12 Los genes se representan individualmente por pequeños cuadrados expresados diferencialmente. En verde y rojo están representados los genes con una disminución o aumento respectivamente en comparación al control en valores de Log2, utilizando la escala de -1.5 a +1.5. En la Figura 11, se visualizaron 17 genes que mostraron cambios tanto de aumento como disminucion en sus valores de expresión comparados con el control en los genes receptores de quinasas. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 103 Los receptores quinasa con repeticiones ricas en leucina (LRR), presentaron 9 genes con una mayor expresión y uno de ellos mostró una expresión ligeramente menor respecto al control. En la categoria, DUF26 (Domain of Unknown Function 26) 2 genes mostraron sobreexpresión. Los receptores quinasa de glicoproteína con Slocus, mostraron 2 genes sobreexpresados (Figura 11). Figura 11. Genes receptores de quinasas (receptor like kinases) de la línea etr1-1 L12 visualizado en Mapman. Los genes se representan por pequeños cuadrados expresados diferencialmente. En verde y rojo están representados los genes con una disminución o aumento respectivamente en comparación al control en valores de Log2, utilizando la escala de -1.5 a +1.5. En la visualización del diagrama de transcripción, Mapman nos mostró 29 genes relacionados (Figura 12), que se dividieron en varias categorías, de acuerdo a su función. Las categorías que mostraron cambios fueron muy diversas, destacándose por su posible relación directa con etileno. La familia de factores de transcripción del tipo AP2/EREBP (APETALA2/Elemento con respuesta a etileno y proteína de unión) que tiene diferentes funciones en los procesos de desarrollo, el cual mostró un gen con ligero silenciamiento. Cabe destacar que los genes correspondientes a factores de transcripción del tipo bHLH (familia Basic Helix-Loop-Helix) con funciones regulatorias en diversos procesos, mostraron 2 genes que fueron sobreexpresados y 2 silenciados. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 104 Los factores de transcripción con motivo CCAAT que están involucrados en los aspectos del crecimiento y desarrollo, mostraron un gen silenciado. Un factor de transcripción con dominio MYB de unión a DNA, aparecía como sobrexpresado. El factor de transcripción tipo WRKY, que está involucrado en varios procesos fisiológicos como mecanismos de defensa contra patógenos y senescencia, mostró un gen ligeramente sobreexpresado. Hay un gen silenciado que pertenece al factor de transcripción de señalización de brasinoesteroides (BRZ). Figura 12. Vista general en Mapman de los genes involucrados en transcripción (transcription) de la línea etr1-1 12. Los genes se representan individualmente por pequeños cuadrados expresados diferencialmente. En verde y rojo están representados los genes con una disminución o aumento respectivamente en comparación con el control en valores de Log2 utilizando la escala de -1.5 a +1.5. Otros genes clasificados como factores de transcripción, mostraron tanto silenciamiento como sobreexpresión, sin embrago el programa no pudo clasificarlos en ninguna categoría (unspecified, Figura 12). Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 105 Discusión de Resultados Análisis de genes seleccionados para RNA-seq de las líneas etr1-1 L10 y L12 En el análisis de RNA-seq, se identificaron 1214 genes con expresión diferencial significativa en relación al control para la línea etr1-1 L12 y para la línea L10 se obtuvieron 685 genes diferencialmente expresados. Sin embargo, solo un total de 120 genes fueron comúnmente significativos en ambas líneas. La diferencia en el número de genes con expresión significativa entre ambas líneas se puede deber a que: A) El nivel de expresión del transgén es diferente para cada línea, lo que determinaría una diferencia en la sensibilidad al etileno para cada línea transgénica, dándonos una diferencia de expresión entre los genes. Hay que tener en cuenta que se trata de un sistema competitivo entre el gen mutado ectópico y el gen endógeno de fresa. B) En nuestro diseño se eligió el fruto en el estadio intermedio, ya que mostraba ser un estadio importante para identificar los cambios del etileno en los frutos transgénicos de cada línea, basándonos en los estudios previos sobre la expresión de los genes de síntesis de etileno. Sin embargo, este estadio quizás no es la etapa adecuada para el análisis, pues este estadio es una mezcla de células en diferentes etapas de desarrollo, lo que hace que las muestras no sean completamente homogéneas. Por esto, se decidió seleccionar los genes mostrando diferencias significativas para al menos una de las líneas, mientras que en la otra se comportara de forma clara con la misma tendencia. Estos genes, un total de 382, fueron analizados con el programa MapMan, que permitía agruparlos por su relación a las diferentes funciones metabólicas. MapMan es una herramienta guiada por el usuario, que muestra grandes conjuntos de datos en diagramas pictóricos que simbólicamente representan áreas de la función biológica en grandes conjuntos de datos en diagramas de las vías metabólicas u otros procesos (Thimm et al ., 2004). Los módulos Scavenger asignan los parámetros medidos a las categorías jerárquicas llamados BINs y subBINs. Una primera generación de TRANSCRIPTSCAVENGER mediante grupos de genes en la matriz de Arabidopsis Affymetrix 22K en más de 200 categorías jerárquicas, proporcionó un desglose del metabolismo central (por varias vías, hasta el nivel de la Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 106 enzima individual), y una visión general de metabolismo secundario y procesos celulares (Thimm et al ., 2004). En los análisis del receptáculo en estadio intermedio de las líneas etr1-1, se observó que el mayor cambio de los genes fue en el estrés biótico y abiótico. Sabemos que la producción de etileno incrementa por diversas perturbaciones o por estrés. Estos disturbios pueden ser inducidos por agentes bióticos (como químicos, temperatura extrema, sequía, hipoxia, daño mecánico, encorvamiento), o biológicos (como enfermedades o daños por patógenos) (Abeles et al., 2012). Estudios de Williamsom demuestran que la producción de etileno fue estimulada por diversos tipos de lesiones en guisantes. La concentración de etileno era más abundante, mientras que la hoja era verde, disminuyó a medida que la hoja se convirtió en amarillo (Williamson, 1950). El etileno es esencial para muchos procesos de desarrollo y es un mediador clave en las respuestas al estrés biótico y abiótico en las plantas (Müller et al., 2015) La vía de señalización de etileno y la respuesta incluye los factores de respuesta a etileno (ERF), que pertenecen a la familia de factores de transcripción AP2/ERF. Es bien sabido que los ERFs regulan la respuesta molecular al ataque de patógenos mediante la unión a la caja de GCC, un elemento que actúa en cis (Müller et al., 2015). Sin embargo, estudios recientes sugieren que varios ERF también se unen a los elementos de respuesta de deshidratación (DRE) y que actúan como un centro regulador clave en la respuesta de las plantas a estreses abióticos. Por lo que Müller sugiere que los ERFs actúan como reguladores clave en la integración del etileno, el ABA, el jasmonato y la señalización redox en la respuesta de la planta a un número de estreses abióticos (Müller et al., 2015). Del análisis global por Mapman se identificaron algunos grupos de genes que se consideraron de especial relevancia para tener una visión de la acción del etileno en el receptáculo de fresa. Estos grupos corresponden a los genes diferencialmente expresados correspondientes a la acción de las hormonas, a factores de transcripción y a genes relacionados con estrés biótico y abiótico. Genes relacionados con las Hormonas Los genes que mostraron cambios en su expresión relacionados con las hormonas fueron los siguientes Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 107 Etileno Relacionado con el etileno es el gen de F. × ananassa con mayor homología al gen de F. vesca (01202); anotado como ácido 1carboxílico-1-aminociclopropano oxidasa, el que mostró un aumento importante en los valores de expresión en el receptáculo de etr1-1 comparado con el control. Este gen corresponde al gen previament identificado como FaACO1 (Trainotti et al., 2005). La expresión de fresa en este gen fue estudiada con anterioridad por nuestro laboratorio en los frutos de fresa F. × ananassa, mostrando la expresión mayor en los receptáculos blanco y rojo en relación al estadío verde (Merchante et al., 2013a). En el genoma de F. vesca se han identificado hasta 14 genes anotados como posibles FvACOs (Shulaev et al., 2010), aunque en el análsis del transcriptoma de los frutos de F. × ananassa se ha comprobado que solo 7 posibles FaACOs se expresan en este órgano (SánchezSevilla et al., sin publicar), pero el que tiene mayor expresión de todos ellos es FaACO1. Este gen en el receptáculo presenta un mínimo valor de expresión en el estadio intermedio en los estudios de expresión por RNAseq (Sánchez-Sevilla et al., sin publicar). Su mayor expresión en el receptáculo de etr1-1 puede reflejar un posible mecanismo feed-back negativo de regulación de la expresión de este gen por el etileno. En los estudios de Bulens et al., (2014) con frutos de una especie de la familia Rosacea, como la manzana, observó el cambio en la biosíntesis de etileno en cuatro condiciones: 1) El enfriamiento de la manzana en condiciones de aire regulares, 2) A baja temperatura cambiando la composición del gas de la atmósfera de almacenamiento en una atmósfera controlada (CA) que consistía en la reducción de O2 y elevado CO2, 3) A baja temperatura cambiando la composición del gas de la atmósfera controlada por aire regular y 4) Con el calentamiento de la fruta a temperatura ambiente. Los rápidos cambios en la producción de etileno que se produjeron durante estos eventos fueron seguidos mediante métodos de detección de etileno en línea continua, lo que les permitió monitorear hasta tener la dinámica de cambios del etileno en tiempo real. También emplearon una aplicación del inhibidor de etileno 1-metilciclopropeno (1-MCP), el cual permitió la discriminación entre los cambios mediados por el etileno y los cambios independientes de etileno. Estudiaron los cambios en expresión y actividad de las dos enzimas de la síntesis de etileno, 1aminociclopropano-1-carboxilato sintasa (ACS) y 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO). Observaron que los cambios en la actividad ACS estaban correlacionados con cambios en la expresión de ACS1, y estaban regulados por el aumento en la producción de etileno inducido por el frío durante la fase de enfriamiento temprano. Sin embargo, la transcripción de ACS3 actuó como etileno Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 108 independiente y se desencadenó tras el calentamiento de las manzanas almacenadas en atmósfera controlada. Por otro lado, el aumento de expresión de ACO1 llevó a un fuerte aumento de la actividad 1-aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO), el cual es necesario para la producción exponencial del etileno durante el sistema 2 (este sistema opera durante la maduración de los frutos climatéricos y durante la senescencia del pétalo, cuando el etileno es auto-estimulado y requiere la inducción tanto de ACS como ACO) . La expresión de ACO2 y ACO3 aumentaba en los tratamientos con 1 -MCP, el cual revelaba una correlación negativa con la producción de etileno (Bulens et al., 2014). Una situación similar pudiera ocurrir con FaACO1 donde el aumento de expresión en el receptáculo de etr1-1 muestra una inhibición feed-back negativa que autorregula la producción de etileno en el proceso de maduración. Auxina El gen 05434 en F. vesca está anotado como PIN1 (pin-formed), el cual está implicado en ell transporte direccional de la auxina. Su homólogo en F. × ananassa en el receptáculo etr1-1 presentó una disminución en su expresión, mostrando el valor más alto de silenciamiento entre los genes relacionados con esta hormona. Sin embargo, otro gen de F. vesca (12312) anotado como PIN2, también está involucrado en el transporte de la auxina, y es un componente del transporte polar de la auxina (PAT) en la raíz, con respuesta gravitrópica, mostró sin embargo, un aumento en su expresión. Ambos genes son componentes del transporte polar de la auxina, se localizan en la membrana plasmática y permiten la distribución de la auxina y su homeostasis intracelular. En Arabidopsis el gen PIN2 es más importante en el mantenimiento del meristemo de la raíz (Li K et al., 2015), mientras que una disminución en la actividad de PIN1 provoca la acumulación de la auxina (Yuan et al. 2013). De cualquier forma, la expresión de estos dos genes de F ×. ananassa es muy baja en el receptáculo del fruto de fresa, inferior a 0.2 FPKM, según los estudios de expresión por RNA-seq (Sánchez-Sevilla et al., sin publicar), a lo largo de la maduración. Así hay otro PIN2 anotado en el genoma de F. vesca (gen 31841) cuyo homólogo en F ×. ananassa presenta en el receptáculo en estado intermedio una expresión de 110 FPKM, y otro PIN1 (gen 09384) cuyo homólogo en F. × ananassa tiene una expresión en el mismo estadío intermedio de 4.6 PFKM (Sánchez-Sevilla et al., sin publicar). La expresión de estos dos últimos genes no muestran diferencias en el receptáculo de las plantas etr1-1 en relación al control. En la bibliografía no hemos encontrado una regulación transcripcional de los genes PIN por etileno. Así pues, el Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 109 significado y relevancia de los resultados obtenidos en nuestro estudio sobre los posibles FaPIN1 y FaPIN2 no está claro, a pesar de que el cambio relativo sobre todo en un posible FaPIN1 es muy alto. El gen de F. × ananassa correspondiente al 09733 en F. vesca (ARF18) mostró una disminución de su expresión en el receptáculo de las plantas etr1-1 en relación al control. Por el contrario el gen 14094 en F. vesca identificado como ARF15 mostró en F. × ananassa un aumento en la expresión. Estos genes pertenecen a la familia de los factores de transcripción que regulan la expresión de genes con respuesta a la auxina (Guilfoyle, 2007). En muchas especies es una familia compleja, con un elevado número de componentes. En el genoma de F. vesca se han identificado hasta 17 miembros (Kang et al., 2013), no siendo estos dos ARFs, los de expresión más elevada en el receptáculo del fruto de fresa (F. × ananassa) (Tabla 12, Capítulo 1). Efectivamente, la expresión de la familia génica en el receptáculo de fresa muestra un patrón variado para cada uno de ellos (Sánchez-Sevilla et al., no publicado), lo que es una muestra de su diversificación e implicación en diferentes procesos. Aunque el dominio de unión a DNA parece conservado y se ha identificado en muchos de sus miembros (Boer et al., 2014), sus dianas están por identificar. Esto se considera esencial para entender la acción específica de la hormona auxina en procesos muy diferentes. El gen de F. × ananassa correspondiente al gen 10566 de F. vesca mostró un aumento en su expresión en las plantas etr1-1. El correspondiente de este gen en F. vesca, está anotado como putative indole-3-acetic acid-amido synthetase GH3. Los miembros de la familia Gretchen Hagen 3 (GH3) pueden catalizar la conjugación dependiente de ATP de aspartato a IAA, lo cual permite controlar los niveles de auxina en la célula (Wang X, et al., 2015). No es el único gen anotado como GH3 en el genoma de F. vesca. Otros siete genes están anotados como putativos GH3 en F. vesca (genes 27740, 18907, 24005, 22838, 03265, 10286, 23026). Todos sus homólogos en F. × ananassa muestran expresión en receptáculo, a niveles similares pero con diferentes patrones de expresión (Sánchez-Sevilla et al., sin publicar). En el caso del homólogo del gen 10566 disminuye la expresión con la maduración. Su mayor expresión en las líneas etr1-1 puede ser una indicación de su inducción por etileno. Esta posibilidad es una información valiosa para desvelar la relación etilenoauxina en el desarrolloo y maduración del receptáculo de fresa. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 110 Hay otros genes que se han descrito como inducidos por la auxina, aunque de funciones muy distintas, que también tienen alterada su expresión en el receptáculo de las plantas etr1-1. Así, el gen de F. vesca 11154, anotado como Auxin-induced protein 5NG4, también mostró un aumento en los valores de Log2 al comparar la expresión de etr1-1 en relación al control. Este gen en Pinus taeda L está fuertemente inducido por la auxina en las raíces e hipocótilos, y participa en la formación de raíces laterales y adventicias (Smolka et al., 2009). También otros dos genes identificados en F. vesca como Indole-3-acetic acid-induced protein ARG7 y ARG2, los genes 10434 y 10617, respectivamente, tienen su expresión en F. × ananassa, aumentada en el receptáculo de las plantas etr1-1. La función de estos genes en el receptáculo de fresa está por conocer, no obstante, en relación a este trabajo soportan la relación etileno-auxina en este proceso de desarrrollo. El gen 16556 se identificó en F. vesca como una Auxin-induced protein PCNT115, mostrando el homólogo de F. × ananassa un aumento de expresión en el receptáculo de las plantas etr1-1. La proteína PCNT115 pertenece a la familia de las aldo-ceto reductasas. En soja mostró una expresión específica en raíz y su expresión fue inducida por auxina y asociada como respuesta a estrés (Yoon-Sun Hur et al., 2009), mientras que en crisantemo se considera la proteína más importante en la formación de nuevas raíces, siendo su expresión opuesta a la de la ACC oxidasa en la formación de raíces adventicias (Liu et al., 2013). En el receptáculo de fresa, su aumento de expresión en receptáculo de etr1-1 refleja una relación opuesta en relación al etileno El conjunto de genes cuya expresión está alterada en el receptáculo de etr1-1 nos indican una relación entre etileno y auxina en este tejido. Nuestro modelo es el de plantas parcialmente insensibles a etileno (Merchante et al., 2013a). Los cambios de expresión asociados a este hecho muestran que la acción del etileno, al menos en parte y a diferentes niveles, es mediatizada por la auxina. Esto está de acuerdo con el aumento de expresión de los genes FaTAA1 y FaTAR2 previamente encontrados en el receptáculo maduro de las plantas etr1-1 en relación a las plantas no transformadas en estudios de expresón por qRT (Vallarino et al., no publicado). En varios estudios sobre la interacción entre la auxina y el etileno se ha mostrado que estas hormonas interactúan entre si, ya sea de forma sinérgica, como Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 117 vesca se han anotado hasta 60 genes anotados como peroxidasas (Kang et al., 2013). En relación al desarrollo del fruto las peroxidasas se han asociado a la síntesis de fenoles y lignina así como en respuestas de defensa a estrés (Wang C et al., 2015). En fresa, se ha propuesta que la peroxidasa FaPOD27 participa en la síntesis de lignina que ocurre en la maduración del fruto, y en respuesta a la infección por Agrobacterium (Yeh et al., 2014) El homólogo al gen 21218 de F. vesca, anotado como codificante de una 23.6 kDa heat shock protein mitocondrial (HSP), mostró en F. × ananassa un aumento en su expresión en el receptáculo de etr1-1. La proteína HSP23.6 pertenece al grupo de las small heat shock proteins (sHSPs) que en las plantas forman una familia compleja y diversa, la mayoría están reguladas por estrés térmico, oxidativo y/o osmótico (Wang et al., 2004). Actúan como chaperonas moleculares (Montfort et al., 2002) y su expresión está también asociada a procesos de desarrollo (Waters et al., 2008). En receptáculo de fresa este gen tiene una expresión baja (2.5-7-5 RPKM) con un mínimo en estadío intermedio y un máximo en estadío rojo (Sánchez-Sevilla et al., no publicado). El gen 18413 en F. vesca está identificado como Metallothionein like protein MEt1 type2 y en su correspondiene en F × ananassa mostró un aumento en receptáculo de etr1-1 en relación al control. Las metalotioneínas son una clase de pequeñas proteínas ricas en cisteína, que se han asociado con una mayor tolerancia al estrés oxidativo y de metales en animales, plantas y hongos (Benatti et al., 2014). En frutos de fresa son una de las proteínas con mayor nivel de expresión (Bombarely et al., 2010). Estudios recientes produjeron unas plantas de Arabidopsis deficientes en cuatro MTs (MT1A/MT2A/MT2b/MT3), mostraron que, son importantes para la homeostasis y distribución del cobre (Cu) en Arabidopsis (R-Benatti et al., 2014). El Cu es necesario para muchos procesos esenciales en plantas, incluyendo la fotosíntesis, la respiración, la percepción de etileno, el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno y las paredes celulares (Penarrubia et al., 2009). La expresión de este gen en el receptáculo de fresa es muy alto (superior a 4.700 RPKM) descendiendo drásticamente hasta 161 RPKM en estadío rojo (Sánchez-Sevilla et al., no publicado). Sus niveles de expresión y su posible regulación por etileno hacen que sea una diana interesante para su estudio. Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 118 El gen 25758 en F. vesca, que fue identificado como ethylene-responsive transcription factor TINY, mostró en su correspondiente en F. × ananassa una disminución en su expresión. En Arabidopsis la expresión de este gen fue activada a un alto nivel por el tratamiento por sequía, frío y etileno (Sun et al., 2008), postulándose que podía jugar un papel en la interconexión de las respuestas de expresión génica a los estreses abiótico y biótico. El nivel de expresión bajo en todos los estadíos de desarrollo del receptáculo (inferior a 1.7 RPKM) (Sánchez-Sevilla et al., no publicado) y la complejidad de la familia génica hacen difícil interpretar este resultado en términos funcionales. El gen de F. vesca 14308 está descrito como una proteína de resistencia RPP13 y el homólogo en F. × ananassa mostró una disminución en su expresión en el receptáculo de las plantas etr1-1. Este gen de resistencia es de los más polimórficos descritos en Arabidopsis (Bakker et al., 2006), siendo esta diversidad alélica asociada a la capacidad de reconocer proteínas de patógenos diferentes (Hall et al., 2009). En el receptáculo de fresa es un gen de expresión baja, con máximo en estadío intermedio (Sánchez-Sevilla et al., no publicado). El homólogo en fresa F. × ananassa del gen 07080, que está anotado como codificante de la proteína alergénica Pru av 1, presenta una disminución en su expresión en el receptáculo de las plantas etr1-1. En fresa este gen corresponde a FaFra1 cuya expresión está asociada a la síntesis de flavonoides (Muñoz et al., 2010). La proteína FaFra1 pertenece a la familia de las proteínas PR10 y su funcionalidad está asociada a la unión específica a catequina (Casañal, 2014). Su función en defensa y desarrollo es objeto de estudio en nuestro laboratorio. El gen de F. vesca 10008, está anotado como codificante de la proteína metionina sulfóxido reductasas (péptido Met O). El correspondiente en F. × ananassa mostró una disminución en los valores de expresión comparado con el control. Las proteínas metioninas sulfoxido reductasas (MSR), catalizan la reducción de las metioninas sulfoxido (Met O) a metionina, protegiendo así a las proteínas contra el estrés oxidativo. Estas formas oxidadas de Met (Met O) pueden alterar la conformación de una proteína y hacerla no funcional. En consecuencia, las MSR se Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 119 han asociado con las respuestas al estrés, enfermedad, y la senescencia en una matriz diversa de organismos (Lee et al., 2014). Se ha identificado el gen Fapmsr (peptide methionine sulphoxide reductase [Met(O)]) en F. × ananassa (López A et al., 2006). En estos estudios, se mostró que la expresión del gen aumentaba después de 4 días al quitar los aquenios en los frutos verdes. Estos resultados indican que la expresión del gen Fapmsr podía estar regulada por auxina (López et al., 2006). Nuevamente, se identifica un gen cuya expresión está relacionada tanto con el etileno, como con la auxina. La expresión de este gen en el receptáculo es significativa y aumenta hasta 5 veces desde el estadío verde al rojo (Sánchez-Sevilla et al., no publicado). Los genes de F. vesca 19212 y 21697, se identificaron como codificantes de proteínas endo-quitinasas. Los genes correspondientes en F. × ananassa mostraron un aumento en su expresión en el receptáculo en comparación con los frutos no transgénicos. Las quitinasas son glicosil hidrolasas, que catalizan la degradación de la quitina, un polímero de N-acetilglucosamina (GlcNAc) encontrado en las paredes celulares de los hongos (Watanabe et al., 1999). Aunque las plantas superiores carecen de quitina, albergan genes de quitinasas que se expresan en respuesta a patógenos, o a señales de desarrollo en los tejidos susceptibles (Collinge et al., 1993). Se ha demostrado que la actividad global quitinasa es inducida en plantas de fresa, a un nivel significativo, cuando en las plantas son dañadas físicamente, o tratados con ácido salicílico, o tratadas con etefón (compuesto que produce un ión fosfato y etileno) (Khan, 2002). Estos resultados destacan la importancia de las quitinasas en la fresa en respuesta a ambos estreses bióticos y abióticos. En la fresa se han clonado tres genes de quitinasa: una quitinasa de clase III de la familia de PR8 (FaChit3-1) (Khan et al. 1999), y dos quitinasas de clase II de la familia de PR3 (FaChi2-1 y FaChi2-2) (Khan y Shih 2004), que corresonden a otros miembros de la familia. El análisis de MapMan de los resultados de RNA-seq de las plantas de fresa insensibles a etileno, muestra que se vieron afectados principalmente los genes de respuesta a estrés biótico y abiótico, al disminuir la sensiblidad a esta hormona. Sabemos que la producción de etileno esta ligado a estos estreses. En los genes afectados por el estrés encontramos varios relacionados con las citoquininas y brasinoesteroides. Las plantas etr1-1 han presentado una sensibilidad a patógenos, principalmente a hongos comparados con el control (datos no mostrados), esto se Capítulo 2: Análisis transcriptómico para el estudio del etileno en plantas de fresa insensibles a esta hormona 120 puede explicar porque algunos de los genes con respuesta a patógenos están alterados. También observamos que están afectados los genes de auxina, como factores de transcripción, transporte, señalización y otros genes inducidos por esta fitohormona mostrando en general un incremento en su expresión. Esto nos pude sugerir que al disminuir la sensibilidad de etileno, la homeostasis de la auxina incremente posiblemente para mantener un adecuado desarrollo de la planta y del fruto, indicándonos que posiblemente la acción de la auxina en la fresa se lleve a cabo primero que el etileno. Sin embargo, esto se debe confirmar y en ello se está en nuestro laboratorio. El etileno, aunque no es clave para la regulación global de la maduración del fruto de fresa, sí que parece estar implicado en algunos procesos específios que tienen lugar durante este proceso, tales como el metabolismo de flavonoides, la estructura de la pared celular, la respuesta a patógenos, la producción de aroma. En su acción, interacciona directa, o indirectamente, con otras hormonas como el ABA o las citoquininas, además de la auxina. El presente trabajo, al igual que muchos otros de estudios sistémicos, no aporta pruebas funcionales contundentes sobre el problema de desarrollo que se estudia. No obstante, sí identifica con algo de nivel de fiabilidad a elementos importantes que deben ser ulteriormente estudiados para obtener información funcional valiosa del proceso objeto de estudio. Conclusiones 121 Conclusiones  La expresión de los genes de biosíntesis de la ruta IPA mostraron un patrón de expresión en aquenios y receptáculo específica para cada uno. Los genes FaTAA1, FaTAR2, FaYUC2 y FaYUC7 mostraron expresión en los últimos estadios de maduración del receptáculo del fruto de fresa, siendo FaTAR2 el que mostró su mayor valor en receptáculo rojo.  La proteína fusionada GST-FaTAA1 producida en Escherichia coli mostró actividad aminotransferasa in vitro, lo que fue comprobado tanto por ensayo de actividad en gel como por detección de productos por HPLC.  El silenciamiento transitorio mediante RNAi del gen FaTAR2 en receptáculo, mostró cambios en la expresión de los genes Aux/IAA 8 y Aux/IAA11 y en los genes de respuesta a auxina (ARF4 y ARF6a), lo que soporta una función de la auxina en la fase final de maduración del receptáculo.  Los resultados del análisis transcriptómico en el receptáculo de fresa en estadio intermedio de las plantas con insensibilidiad a etileno, mostraron cambios en genes involucrados en; el metabolismo de flavonoides, en los cambios de la pared celular, en respuesta a patógenos y, pricipalmente, en las respuestas a diversas hormonas relacionadas con en el estrés biótico y con la maduración del fruto. Esto confirma que el etileno, aunque no es esencial en la maduración de la fresa, interviene en procesos relevantes para el desarrollo del receptáculo y la calidad del fruto. Referencias 123 Referencias Aboles F B,. Morgan P W,. Saltveit M E, Jr (2012). Ethylene in Plant Biology. Academic Press, New York,N Y, ISBN 0-12-0414511. 2nd Edition:83-101 pp Adams DO, Yang SF (1979). Ethylene biosynthesis: Identification of 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of methionine to ethylene. Proc Natl Acad Sci USA 76: 170–4 Aharoni A, Keizer LCP, Van Den Broeck HC, Blanco-Portales R, MunozBlanco J, Bois G, Smit P, De Vos RCH, O  Connell A P (2002). Novel insight into vascular, stress, and auxin-dependent and –independent gene expression programs in strawberry, a non-climacteric fruit. Plant Physiol 129: 1019-1031 An F, Zhao Q, Ji Y, Li W, Jiang Z, Yu X, Zhang C, Han Y, He W, Liu Y, Zhang S, Ecker JR, Guo H (2010). 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The organoleptic properties due to its characteristic aroma and flavor, make the strawberry fruit its privilege position for human conscumption, not only in fresh and frozen forms, but also as processed and derived products, including yogurts, drinks, jams and jellies (Giampieri et al., 2015). In 2013, the production of the strawberry reached about seven million of tons, being Spain the supplier to the European Union (http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx). Unlike other fruits that are the result of the ovary growth, the strawberry is the results of engrossment of the flower receptacle with the true fruits, named achenes, localized on the external surface. The achenes, originated in the base of each pistil, are a combination of seed and ovary tissues, whereas the receptacle develops from the base of the flower to form the fleshy part of the fruit. The receptacle is conected to the achenes by vascular bundles (PerkinsVeazie et al., 1995; Hancock, 1999). Besides its agriculture importance, strawberry fruits have been one of the most utilized models in phisiologycal studies. The strawberry belongs to the Rosaceae family and Fragaria genus. Fragaria vesca is known as the wooland strawberry and is diploid, with a basic complement of seven chromosomes, making it one model of the family Rosaceae species, along with peach and apple (Shulaev et al., 2008). The cultivated strawberry Fragaria × ananassa is octoploid. In the process of strawberry fruit ripening various cellular and biochemical changes occurs. When the receptacle matures, changes in texture, that are associated with the cell wall metabolism, and changes in metabolism, generally associated with the accumulation of sugars, acids, polyphenols, pigments and volatile compounds take place (Hancock, 2000; Gapper et al., 2013). The development of the strawberry fruit is higly affected by variations in hormonal contents during growth and ripening. Studies performed by Nitsch in 1950, demonstrated that the growth of strawberry receptacle at early stages is regulated by the hormone auxin, indole-3-acetic acid (IAA), which is delivered from the achenes. The external application of auxin reestablished the growth of the previously deachened receptacles. It is known that auxin promotes several processes like organogenesis, cell division and elongation, as well as growth,