Colonización Bacteriana Nasofaríngea en Lactantes Hospitalizados por Bronquiolitis Causada por el Virus Respiratorio Sincitial

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y PEDIATRÍA TESIS DOCTORAL “Colonización Bacteriana Nasofaríngea en Lactantes Hospitalizados por Bronquiolitis Causada por el Virus Respiratorio Sincitial” Dña. María del Carmen Suárez Arrabal Directores: Dra. Mª Asunción Mejías Montijano Dr. Francisco Javier Pérez Frías Málaga, noviembre de 2015 AUTOR: María del Carmen Suárez Arrabal http://orcid.org/0000-0002-0387-6978 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es PROF. DR. FRANCISCO JAVIER PÉREZ FRÍAS, CATEDRÁTICO DE PEDIATRÍA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA, Y DRA. Mª ASUNCIÓN MEJÍAS MONTIJANO, PROFESORA ASOCIADA DE OHIO STATE UNIVERSITY, INVESTIGADORA PRINCIPAL DEL CENTRO DE VACUNAS E INMUNOLOGÍA Y MÉDICO ADJUNTO DE LA DIVISIÓN DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS PEDIÁTRICAS EN NATIONWIDE CHILDREN’S HOSPITAL, COLUMBUS, OHIO, ESTADOS UNIDOS. CERTIFICAN: Que el presente trabajo titulado “Colonización bacteriana nasofaríngea en lactantes hospitalizados por bronquiolitis causada por el virus respiratorio sincitial”, y que constituye la Memoria que presenta la Licenciada María del Carmen Suárez Arrabal para optar al grado de Doctor, ha sido realizado en el Departamento de Farmacología y Pediatría de la Universidad de Málaga bajo nuestra dirección. Asimismo, en el marco del proceso de evaluación requerido, autorizamos la presentación de la citada Tesis Doctoral, dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa. Para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Málaga, a 10 de noviembre de 2015. Prof. Dr. Francisco Javier Pérez Frías Dra. Mª Asunción Mejías Montijano “El único verdadero viaje de descubrimiento consiste no en buscar nuevos paisajes, sino en mirar con nuevos ojos”. (Marcel Proust) I AGRADECIMIENTOS Después de varios años entregada a este apasionante proyecto, al fin llega el momento de que su mayor fruto, esta Tesis Doctoral, vea la luz. En este momento me invade una gran emoción y un sentimiento de inmenso agradecimiento a todas las personas que, de una manera u otra, han contribuido a la concepción, desarrollo, evolución y/o desenlace de este trabajo. Esta Tesis Doctoral está dedicada a todas ellas. Creo que educar y enseñar es un acto de amor, y por ello quiero agradecer profundamente a todos los profesores y compañeros de profesión que he tenido durante mi vida, los cuales me transmitieron generosamente lo que sabían y me hicieron llegar hasta donde estoy y ser la persona y médico que soy hoy. Quiero recordar a mis compañeros, residentes y adjuntos, del Servicio de Pediatría del Hospital San Pedro de Logroño, por enseñarme sobre la Pediatría, sobre el trabajo en equipo y sobre la vida. En especial, gracias a las Dras. Marisa Poch, Yolanda Ruiz y Caridad Garijo, por su amistad y por su apoyo. Gracias al Dr. Javier Pérez Frías, director de esta tesis, por haber confiado en mí durante todos estos años, desde que le hablé de mis sueños por ir a EE.UU. y de mi deseo de realizar la Tesis Doctoral, por animarme a ambas cosas y hacer posible la finalización de este proyecto. Gracias de corazón a los Dres. Asunción Mejías y Octavio Ramilo, quienes me dieron la oportunidad de mi estancia y formación en EE.UU., en la que aprendí tantísimo, me apasioné por la investigación y viví una experiencia personal y profesional que me cambiaría para siempre. Al Dr. Octavio Ramilo, porque me hizo el mejor regalo de cumpleaños en octubre de 2009, un papel con un mapa de EE.UU. dibujado por su mano donde me explicaba dónde se encontraba Columbus-Ohio, su dirección de email y una invitación para trabajar con él y su equipo. Gracias por sus palabras inspiradoras, su contagiosa pasión por el trabajo y por apoyar incondicionalmente a los jóvenes infectólogos de Europa. Muy especialmente, gracias a la Dra. Asunción Mejías, mi mentora y directora de esta tesis, quien me acogió VIII 5.5. CITOQUINAS PLASMÁTICAS EN NIÑOS CON BRONQUIOLITIS POR VRS COLONIZADOS POR BACTERIAS POTENCIALMENTE PATÓGENAS............... 90 5.5.1. Características demográficas, clínicas y de laboratorio de los niños en los que se realizó análisis de citoquinas............................................ 91 5.5.2. Concentración de citoquinas plasmáticas en relación al tipo de bacteria potencialmente patógena aislada en la nasofaringe........... 93 5.5.3. Relación citoquinas-densidad bacteriana nasofaríngea.................... 94 5.5.4. Relación citoquinas-gravedad de la bronquiolitis por VRS................ 95 CAPÍTULO 6. DISCUSIÓN........................................................................................ 97 6.1. CARACTERÍSTICAS DE LOS SUJETOS DE LA COHORTE................................. 100 6.2. INFECCIONES BACTERIANAS EN EL CONTEXTO DE LA BRONQUIOLITIS POR VRS.............................................................................................................. 101 6.3. EL TRATAMIENTO CON ANTIBIÓTICOS ES FRECUENTE Y MODIFICA SIGNIFICATIVAMENTE LOS PATRONES DE COLONIZACIÓN NASOFARÍNGEA EN NIÑOS MENORES DE 2 AÑOS CON BRONQUIOLITIS POR VRS............... 105 6.4. COLONIZACIÓN BACTERIANA NASOFARÍNGEA EN LACTANTES INFECTADOS POR EL VRS Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS.............................................. 108 6.4.1. Relación de la colonización bacteriana con la gravedad de la bronquiolitis...................................................................................... 112 6.4.2. Respuesta local y sistémica a la colonización bacteriana.................. 114 6.5. ¿CÓMO DIFERENCIAR COLONIZACIÓN DE INFECCIÓN? EL PAPEL DE LOS BIOMARCADORES....................................................................................... 116 6.5.1. Densidad bacteriana......................................................................... 116 6.5.2. Biomarcadores convencionales........................................................ 117 6.5.3. Nuevos biomarcadores..................................................................... 119 6.6. LIMITACIONES DEL ESTUDIO....................................................................... 121 CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES................................................................................. 125 7.1. CONCLUSIONES........................................................................................... 127 CAPÍTULO 8. APLICACIONES PRÁCTICAS................................................................. 129 8.1. APLICACIONES PRÁCTICAS.......................................................................... 131 CAPÍTULO 9. ANEXOS............................................................................................. 133 ANEXO A. CONSENTIMIENTO INFORMADO DEL ESTUDIO................................. 135 ANEXO B. AUTORIZACIÓN DEL COMITÉ DE ÉTICA.............................................. 141 ANEXO C. COMUNICACIONES A CONGRESOS NACIONALES E IX INTERNACIONALES............................................................................. 142 ANEXO D. ARTÍCULOS PUBLICADOS................................................................... 147 CAPÍTULO 10. BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 159 10.1. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................ 161 X II. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.- Microscopía electrónica de la liberación de un paramyxovirus de la superficie apical de células infectadas…………………………………………………………………….. 7 Figura 2.- Estructura del VRS..……………………………………………………………………………....... 8 Figura 3.- Variabilidad del microbioma nasofaríngeo………………….………………………..... 19 Figura 4A.-Mecanismos a través de los cuales los virus respiratorios favorecen la colonización bacteriana.......................................................................... 21 Figura 4B.-Interacciones virus-bacteria en el epitelio respiratorio en relación con el sistema inmune del huésped..................................................................... 22 Figura 5.- Modelo propuesto de interacciones bacterianas y virales.......................... 23 Figura 6.- El VRS se adhiere directamente a S. pneumoniae mediante la glicoproteína G de superficie.............................................................................................. 24 Figura 7.- Concentraciones de citoquinas y quemocinas secretadas en el sobrenadante del cultivo celular tras 2 horas de exposición de S. pneumoniae a células epiteliales ciliadas humanas infectadas o no previamente con VRS........... 25 Figura 8.- Relación temporal entre el pico estacional (en semanas) de las hospitalizaciones debidas al VRS y las debidas a neumonía neumocócica en diferentes estados de EE.UU....................................................................... 27 Figura 9.- Relación entre la incidencia de infección por el VRS (en azul) y la neumonía neumocócica (en rojo) en niños de California, EE.UU................................. 27 Figura 10.- Identificación, selección y reclutamiento de los participantes: “Porque 2 más 2 no son siempre 4…”........................................................................ 47 Figura 11.- Reclutamiento de los participantes. Gestión del tiempo........................... 47 Figura 12.- Hisopo flexible de nailon utilizado para el estudio.................................... 51 Figura 13.- Realización del frotis nasofaríngeo............................................................ 53 Figura 14.- Sistema de siembra por agotamiento en 4 cuadrantes............................. 55 Figura 15.- Recipiente contenedor de secreciones respiratorias................................. 56 Figura 16.- Esquema resumen del procesamiento de las muestras de lavado nasal... 57 Figura 17.- Hemocitómetro. Esquema del porta y cubreobjetos.................................. 58 Figura 18.- Esquema descriptivo de la retícula grabada de un hemocitómetro.......... 59 Figura 19.- Carga del hemocitómetro con la dilución células-azul tripán.................... 59 Figura 20.- Pacientes visitados: proporción de reclutamiento.................................... 65 Figura 21.- Pacientes reclutados y pacientes incluidos finalmente en el estudio........ 66 XI Figura 22.- Resultados de los frotis nasofaríngeos en el total de pacientes................ 70 Figura 23.- Resultado de los frotis nasofaríngeos según la administración o no de antibióticos antes de la recogida de las muestras................................ 71 Figura 24.- Colonización nasofaríngea única o múltiple según la administración o no de antibióticos antes de la recogida de las muestras..................................... 72 Figura 25.- Tasas de colonización nasofaríngea en niños hospitalizados por bronquiolitis por VRS y controles sanos.................................................... 76 Figura 26.- Tipo y porcentaje de bacterias colonizadoras de la nasofaringe en niños hospitalizados por bronquiolitis por VRS y controles sanos.................... 77 Figura 27.- Proporción de bacterias potencialmente patógenas gram-negativas (BGN) y gram-positivas (BGP), en frotis con una sola bacteria identificada, en pacientes con bronquiolitis por VRS y controles sanos............................ 78 Figura 28.- Tipos de bacterias identificadas en los frotis nasofaríngeos de los pacientes hospitalizados con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras......................................................... 80 Figura 29.- Duración del tratamiento con oxígeno suplementario en niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas gram-positivas (BGP) y colonizados por bacterias potencialmente patógenas gram-negativas (BGN).............................................................. 84 Figura 30.- Porcentaje de neutrófilos en el hemograma de niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según el tipo de colonización nasofaríngea.............................................. 86 Figura 31.- Leucocitos totales en lavado nasal de niños con bronquiolitis por VRS colonizados por flora respiratoria o bacterias potenciamente patógenas (BPP).......................................................................................................... 87 Figura 32.- Puntuación en el score clínico de gravedad de la enfermedad según el patrón radiológico de niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas........................................................ 89 Figura 33.- Concentraciones de citoquinas en plasma de acuerdo con el tipo de la colonización bacteriana de la nasofaringe................................................ 93 Figura 34.- Concentraciones de IL-6 y IL-8 de acuerdo con la densidad nasofaríngea de bacterias potencialmente patógenas........................................................ 95 Figura 35.- Infecciones bacterianas graves en niños menores de 2 años ingresados por bronquiolitis (VRS vs. no-VRS)............................................................ 101 XII Figura 36.- Cultivos de tubo endotraqueal y duración de la hospitalización en niños con bronquiolitis ingresados en la UCIP de Nationwide Children's Hospital (2009–10).................................................................................................. 104 Figura 37.- Comparación de las tasas de colonización por tipo de bacteria potencialmente patógena (BPP) en niños con infección del tracto respiratorio inferior por VRS..................................................................... 112 Figura 38.- Perfiles de expresión genómica del huésped: un nuevo enfoque para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas........................................... 120 XIII III. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.- Valoración clínica de la gravedad de la enfermedad por VRS (Clinical Disease Severity Score; CDSS). .................................................................................. 50 Tabla 2.- Características demográficas en niños con infección por VRS y controles sanos............................................................................................................. 67 Tabla 3.- Parámetros de laboratorio en sangre periférica y muestras respiratorias en niños con infección por VRS y controles sanos............................................. 69 Tabla 4.- Características demográficas y parámetros de laboratorio en niños con bronquiolitis VRS tratados con y sin antibióticos antes de la recogida de las muestras....................................................................................................... 73 Tabla 5.- Determinantes de gravedad de la enfermedad y características radiológicas en niños con bronquiolitis VRS tratados con y sin antibióticos antes de la recogida de las muestras.............................................................................. 74 Tabla 6.- Características demográficas de los niños con bronquiolitis por VRS que no habían recibido antibióticos previos y de los controles sanos....................... 75 Tabla 7.- Combinaciones de bacterias potencialmente patógenas (BPP) en frotis nasofaríngeos polibacterianos de niños ingresados por bronquiolitis por VRS y controles sanos........................................................................................... 79 Tabla 8.- Características demográficas de los niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas....... 81 Tabla 9.- Características clínicas y parámetros de gravedad de los niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas........................................................................... 83 Tabla 10.- Realización de hemograma y recuento diferencial en los niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas.......................................................................... 85 Tabla 11.- Parámetros de laboratorio en muestras de lavado nasal en pacientes que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según la colonización bacteriana.......................................................................... 87 Tabla 12.- Características radiológicas en los niños con bronquiolitis por VRS que no XIV recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas...... 88 Tabla 13.- Características clínicas y determinantes de gravedad según el patrón radiológico de los niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas.......................................................... 90 Tabla 14.- Características demográficas, clínicas, radiológicas y de laboratorio de los pacientes con bronquiolitis por VRS y controles sanos en los que se realizó análisis de citoquinas.................................................................................. 92 Tabla 15.- Estudios sobre el VRS y la neumonía bacteriana en niños con infección respiratoria grave....................................................................................... 103 Tabla 16.- Utilidad de los niveles de procalcitonina en la interpretación de los datos de microbiología clínica en pacientes con infecciones del tracto respiratorio inferior......................................................................................................... 118 XV IV. ABREVIATURAS AAP Academia Americana de Pediatría ARN Ácido ribonucleico BGN Bacterias gram-negativas BGP Bacterias gram-positivas BPP Bacterias potencialmente patógenas CD8+ Células T CD8 positivo CDSS Puntuación clínica de la gravedad de la enfermedad por VRS CO2 Dióxido de carbono EIA Enzimoinmunoanálisis Fig./Figs. Figura/figuras FN Frotis nasofaríngeo FR Flora respiratoria comensal H. influenzae Haemophilus influenzae IFD Inmunofluorescencia directa IFN Interferón Ig Inmunoglobulina IL Interleuquina ITRI Infección del tracto respiratorio inferior ITRS Infección del tracto respiratorio superior IVRB Infección de las vías respiratorias bajas M. catarrhalis Moraxella catarrhalis μl Microlitro NCH Hospital Nationwide Children’s NK Células natural killer nm Nanómetro O2 Oxígeno OMA Otitis media aguda OR Odds ratio PCT Procalcitonina PCR Reacción en cadena de la polimerasa qRT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa RANTES Células T normales expresadas y secretadas por activación XVI RPM Revoluciones por minuto RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real S. aureus Staphylococcus aureus S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae S. pyogenes Streptococcus pyogenes Th1 Linfocitos T colaboradores 1 Th2 Linfocitos T colaboradores 2 Th17 Linfocitos T colaboradores 17 TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa T reg Células T reguladoras UCIP Unidad de cuidados intensivos pediátricos UFC Unidades formadoras de colonias VIH Virus de la inmunodeficiencia humana VRS Virus respiratorio sincitial CAPÍTULO 1. ESTADO DEL ARTE Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 8 Figura 2. Estructura del VRS. A) Genoma del VRS: única cadena de ARN de 15,2 kb en sentido negativo que consta de 10 genes, los cuales codifican 11 proteínas. B) Ilustración de una partícula de VRS filamentoso. La membrana exterior contiene la glicoproteína de superficie G, fuertemente glicosilada, y las proteínas F (de fusión) y SH. La matriz proteica se encuentra dentro de la membrana, rodeando el complejo de ribonucleoproteínas, que consiste en el genoma asociado con las proteínas N, P, y la gran ARN polimerasa dependiente de ARN (L). Modificado de Lambert et al.48 Las proteínas F y G constituyen los determinantes antigénicos más importantes del virus, e inducen la producción de anticuerpos neutralizantes. El VRS presenta escasa heterogeneidad antigénica, estableciéndose dos grupos antigénicos principales, el A, con 11 genotipos en base principalmente a la proteína G (GA1-GA7, SAA1, NA1NA2 y ON1) y el B, con 23 genotipos (GB1-GB4, SAB1-SAB3, SAB4, URU1, URU2, BA1BA12 y THB).2,50-52 Epidemiológicamente, son más frecuentes las infecciones producidas por genotipos del subtipo A, aunque esto puede variar según la temporada, el país, etc.50,53-57 A) B) 1. Introducción 9 1.3.2. Epidemiología de la infección aguda por VRS Se estima que, globalmente, a la edad de 2 años, más del 90% de los niños han sido infectados al menos una vez por el VRS y aproximadamente el 0,5-2% de ellos han precisado hospitalización.7,58-60 La mayor proporción de hospitalizaciones debidas al VRS ocurre en el primer año de edad (tasa estimada de 1,2 a 3,1% de la población menor de 1 año).44,61-63 De hecho, la edad constituye uno de los factores de riesgo principales de desarrollar enfermedad grave.48,64,65 Sólo en EE.UU., la enfermedad por VRS causa de 132.000 a 172.000 ingresos hospitalarios al año en niños menores de 5 años, 60-80% de los cuales ocurren en lactantes menores de 12 meses.3,66 En Europa, el VRS supone aproximadamente el 45% de los ingresos hospitalarios por ITRI en niños menores de 2 años de edad, y se observa una tendencia en los últimos años a que estos pacientes ingresados sean de menor edad y cursen con una evolución clínica más grave.5,63 En nuestro país la mayoría de los datos sobre la incidencia de hospitalización debido al VRS proceden generalmente de centros hospitalarios aislados o de una única comunidad autónoma.67-69 Un estudio realizado entre julio de 1996 y junio del año 2000 en Guipúzcoa, determinó una tasa de ingreso de 3,7% en los lactantes menores de 6 meses y de 2,5% de los lactantes menores de 12 meses.69 Con el fin de determinar la carga asistencial que supone el VRS en España, se publicó recientemente un estudio en el que se determinaron las tasas de hospitalización por VRS en niños menores de 5 años desde 1997 a 2011 a través del Sistema Nacional de Vigilancia. En este estudio, que incluyó más del 98% de los hospitales españoles, se estableció que 286.007 niños menores de 2 años fueron hospitalizados por infección por VRS durante estos 15 años, con una incidencia anual de 2.413 pacientes por cada 100.000 niños. Además, se documentó que las tasas de hospitalización y mortalidad más elevadas ocurrían en el primer año de vida (el 80% de todas las muertes se produjeron en los menores de 12 meses de edad).70 Un metanálisis reciente demostró que el VRS ocasiona anualmente 33,8 millones de episodios nuevos de ITRI en niños menores de 5 años (lo que representa el 22% de todos los episodios de ITRI), de los cuales al menos un 10% necesitan hospitalización y entre 66.000 y 199.000 fallecen cada año por esta enfermedad en Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 10 países subdesarrollados o en vías de desarrollo.71 Otro metanálisis publicado posteriormente analizó la mortalidad específica atribuida al VRS, para lo cual se revisaron las 235 principales causas de mortalidad en 187 países de todo el mundo durante 30 años (desde 1980 a 2010). En este estudio se estableció que el VRS es responsable de 234.000 muertes cada año en niños menores de 5 años, de las cuales el 86% se producen en el grupo de lactantes entre los primeros 28 días de vida y el primer año de edad, donde el VRS representaría el 6,7% de todas las causas de mortalidad en este grupo etario, siendo por tanto el segundo agente infeccioso que se asocia a mayor mortalidad infantil a nivel mundial, sólo por detrás de la malaria. En este estudio, de nuevo, la mayor parte de las muertes debidas a VRS se documentaron en los países en vías de desarrollo.72 En Latinoamérica, la tasa de mortalidad atribuible a la infección por VRS en niños menores de 2 años es del 1,7%.59 En general, la mortalidad asociada a la primoinfección por VRS en países desarrollados en niños previamente sanos es menor del 1%2 aunque puede aumentar hasta un 6% en la población de riesgo.59,73 Las epidemias de VRS ocurren cada año en países de clima templado durante los meses de invierno de forma predecible, sin embargo el VRS puede aislarse durante todo el año en zonas de clima húmedo y muy cálido.74-77 En países de clima templado del hemisferio norte la estación del VRS generalmente comienza entre octubrenoviembre y finaliza en abril-mayo.76,78 No obstante, y aunque en general las epidemias duran de 12 a 20 semanas, hay pequeñas variaciones anuales en el comienzo y duración de estas epidemias.75,79-81 1.3.3. Patogenia de la enfermedad En la patogenia de la infección por VRS, tanto el virus como la respuesta inmune del huésped juegan un papel fundamental, y es el balance entre estos y otros componentes aún por entender los que determinarán la gravedad de las manifestaciones clínicas. El VRS presenta una alta especificidad por la mucosa respiratoria, y la replicación fuera del aparato respiratorio es excepcional82 salvo en ciertas inmunodeficiencias de células T o B.66 La infección viral en la población infantil 1. Introducción 11 produce mayoritariamente afectación del tracto respiratorio superior, aunque hasta un tercio de pacientes desarrollarán infección de las vías respiratorias bajas (IVRB), en forma de bronquiolitis aguda (principalmente) o neumonía.48,83 A nivel anatomopatológico se produce edema, aumento de moco, alteración de los cilios, necrosis celular con descamación de las células epiteliales e infiltración linfocítica peribronquiolar, lo que finalmente conlleva la obstrucción de la vía aérea pequeña y atelectasias pulmonares.66 El periodo de incubación de la bronquiolitis por VRS es de 5 días (2-7 días) y se sabe que el virus se sigue eliminando durante 2-3 semanas tras la infección aguda.84-87 1.3.3.1. Factores virales Los datos existentes en relación a la carga viral y la gravedad clínica de la enfermedad son contradictorios. Mientras que algunos estudios han identificado una asociación directa entre la mayor cantidad de virus en secreciones respiratorias y la peor evolución clínica,40,88-95 otros no han encontrado una clara asociación.96-101 Esto puede ser debido a diferencias en el diseño del estudio, ya que en la mayoría de ellos sólo se obtuvo una muestra de secreciones respiratorias en el momento de inclusión en el estudio sin tener en cuenta la evolución de la enfermedad, a la técnica empleada (cultivo viral, RT-PCR) o a la inclusión de poblaciones heterogéneas de pacientes.40,94,102 En relación con los subtipos y genotipos del VRS se sabe que los subtipos antigénicos A y B suelen co-circular durante las epidemias anuales.50,103,104 En general, el subtipo A se ha asociado a una mayor gravedad de la enfermedad.55,56,103,105-112 La infección natural ocasionada por ambos grupos antigénicos en lactantes se asocia a cargas virales similares, por lo que no parece que la gravedad atribuída al subtipo A sea debido a una mayor carga viral, sino posiblemente a otros factores virales o a diferencias en la capacidad de cada subtipo para inducir en el huésped una respuesta patogénica diferente.102,113,114 En este sentido, algunos estudios sugieren que determinados genotipos podrían asociarse a mayor gravedad clínica.55,114-116 En un estudio reciente realizado en Milán durante 5 temporadas epidémicas de VRS, se observó que los niños menores de 2 años infectados por el genotipo A/NA1 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 12 presentaban significativamente más ITRI y eran ingresados con más frecuencia que aquellos infectados por el genotipo A/ON1,50 recientemente identificado.117,118 Por tanto, aunque el papel del virus es fundamental para el inicio de la infección, aún se desconocen los mecanismos que contribuyen a la gravedad de la enfermedad. 1.3.3.2. La respuesta inmunológica La respuesta inmunológica a la infección primaria por el VRS es pobre e incompleta, lo que explica que las reinfecciones sean frecuentes a lo largo de la vida.48 El VRS activa parcialmente tanto a las células de la inmunidad innata (neutrófilos, monocitos, células NK, etc.) como adaptativa (linfocitos T y B) tanto a nivel sistémico como a nivel de la mucosa respiratoria.5,48,119 La infección desencadena una respuesta inmunitaria en la que se liberan numerosos mediadores inflamatorios como citoquinas Th1 y Th2, quemocinas, leucotrienos, mediadores de activación de las vías neuronales y óxido nítrico, entre otros,2,83 a la vez que induce la producción de moléculas de adhesión celular y migración (CD11B, ICAM-1, E-selectina…), necesarias para el reclutamiento de diferentes poblaciones celulares al lugar de la infección.2,45,120 1.3.3.2.1. Inmunidad innata y citoquinas: La inmunidad innata juega un papel fundamental en la patogénesis de la infeccción por VRS. Durante la infección, el VRS actúa directa e indirectamente sobre distintas poblaciones celulares, como los macrógafos, los monocitos o las células dendríticas, afectando su capacidad de presentar antígenos.121,122 Además, gracias en parte a dos de las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), el VRS tiene también la habilidad de bloquear parcialmente las respuestas del interferón tipo I y II.4,48,120,123 Faden y sus colaboradores124 propusieron que los neutrófilos emigran desde la sangre periférica a la mucosa respiratoria, donde se adhieren a las células infectadas por el virus liberando mediadores inflamatorios, como la interleuquina (IL) 8, que contribuyen al desarrollo de la enfermedad. El papel de los neutrófilos en la patogénesis de la bronquiolitis por VRS ha sido confirmado en estudios más recientes.125-127 Se sabe también que las células dendríticas mieloides y plasmacitoides 1. Introducción 13 son reclutadas a la mucosa del tracto respiratorio superior, el lugar de inicio de la infección.128-130 En niños con infección por el VRS se ha descrito tanto un aumento en la concentración de citoquinas tipo Th1,131 con un efecto generalmente proinflamatorio (IFN-gamma, IL-6, IL-8, CCL5/RANTES, IL-12), como de citoquinas Th2, más relacionadas con respuestas alérgicas (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) y antiinflamatorias (IL10), tanto en plasma100,131,132 como en secreciones respiratorias.84,101,133-135 En algunos casos, los altos niveles de algunas citoquinas, como IL-6 e IL-8, se han propuesto como marcadores de gravedad.132,134,136 No obstante, estudios funcionales han demostrado que sólo los lactantes con formas más graves de la enfermedad ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos (UCIP) presentan una producción disminuida de IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) tras estimular a las células de la inmunidad innata con lipopolisacárido (LPS).100 Esta “inmunoparálisis” relativa se evidenció únicamente al realizar los estudios funcionales, ya que las concentraciones séricas basales de estas citoquinas estaban aumentadas de forma parecida en los lactantes con IVRB por VRS, independientemente de la gravedad. Por tanto, parece que una respuesta débil de la inmunidad innata (en vez de exagerada) se asociaría a formas más graves de la enfermedad. 1.3.3.2.2. Inmunidad adaptativa 1.3.3.2.2.1. Inmunidad celular: Las células CD4+ reguladoras (T regs) son esenciales en las respuestas tempranas a la infección vírica local y favorecen el reclutamiento de otras células de la inmunidad (NK, Th17) en el tejido infectado, a la vez de modular la respuesta inmune para minimizar la lesión tisular y limitar la inflamación.137-139 Aunque la mayoría de los estudios que han perfilado el papel de las células T regs se han realizado en modelos animales, parecen indicar que estas células juegan un papel importante en la infección natural por VRS en humanos.137,139,140 Recientemente también se han implicado en la patogénesis de la enfermedad a las células T colaboradoras Th17.137,141 Estas células favorecen la producción de IL-6, IL-23 e IL-17, esta última con gran capacidad proinflamatoria para reclutar neutrófilos.142 Con respecto a la relevancia de la respuesta inmunitaria Th2 en la patogénesis de la infección, los resultados son contradictorios. Mientras que unos trabajos encuentran una polarización de la respuesta inmunitaria hacia Th2 y la relacionan con la gravedad Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 14 de la enfermedad respiratoria,5,143-145 otros no comparten dicha afirmación.40,41,94,134,139,146 Inicialmente, algunos estudios sugirieron que las manifestaciones clínicas de la infección por VRS se debían en parte a una respuesta inmune “exagerada” (respuesta exacerbada de linfocitos T citotóxicos y citoquinas inflamatorias, polarización de respuestas Th2 sobre Th1, etc.).2,3,48,83,147 Sin embargo, estudios más recientes han demostrado que, en formas graves de la infección, existe una disminución de la producción de citoquinas inflamatorias tanto en el tracto respiratorio como a nivel sistémico, lo que sugiere que en estos casos no se genera una respuesta exagerada sino, por el contrario, ineficiente.100,101,148,149 Mejías et al127 confirmaron esta disregulación inmune inducida por el VRS a nivel transcripcional, en el que se observa la sobreexpresión de genes relacionados con los neutrófilos, la inflamación y el interferón, y la supresión de genes de células T y B. Otros autores han encontrado una asociación entre la enfermedad grave con la ausencia de linfocitos citotóxicos (CD8+) a nivel pulmonar.150,151 Parece, por todo ello, que la expresividad clínica de la infección por el VRS depende en parte del balance entre estas respuestas inmunitarias proy antiinflamatorias, y que la respuesta proinflamatoria podría jugar un rol protector.101 1.3.3.2.2.2. Inmunidad humoral: La infección por el VRS conlleva, finalmente, la producción de anticuerpos específicos con cierta capacidad neutralizante, tanto en suero como a nivel de la mucosa.2,4 Algunos estudios sugieren que la inmunoglobulina (Ig) A secretoria en la mucosa respiratoria limita parcialmente la propagación del virus, mostrando el papel de la respuesta local frente a la infección.5 Por otra parte, la magnitud de la respuesta humoral es pobre en los primeros años de la vida, por lo que la protección generada es incompleta, justificando que las reinfecciones sean frecuentes a lo largo de la vida, incluso ocasionadas por la misma cepa del virus.48 Parece que las reinfecciones producen una intensificación (“booster”) de la respuesta humoral, sobre todo a nivel de la secreción de IgA e IgG, lo que podría explicar que la primoinfección natural por el virus cause una enfermedad más grave que las reinfecciones posteriores.2,4 1. Introducción 15 1.3.4. Factores de riesgo de la infección grave por VRS A pesar de que la infección por VRS en pacientes con enfermedades de base o condiciones especiales conlleva una mayor morbi-mortalidad, el grupo de lactantes con factores de riesgo representa sólo la menor parte de los niños hospitalizados con bronquiolitis por VRS.69 Un 10-20% de todos los pacientes que ingresan precisarán atención en la UCIP.58,100,152,153 Tanto estudios prospectivos como retrospectivos poblacionales demuestran que más de un 70% de los niños ingresados por bronquiolitis por VRS en la planta de hospitalización y aproximadamente el 50% de los lactantes ingresados en la UCIP, son previamente sanos y no presentan ningún factor de riesgo conocido de enfermedad grave.7-10,63,154-156 De ellos, hasta un 7% requerirá ventilación mecánica en algún momento durante el transcurso de su enfermedad.10,42,58,154,157 En un estudio retrospectivo realizado en Noruega en el que se incluyeron 764 pacientes se observó que el 44% de los niños ingresados en la UCIP que precisaron ventilación mecánica no presentaba ningún factor de riesgo para enfermedad por VRS grave.10 A pesar de que se han realizado numerosos estudios para identificar marcadores de riesgo que ayuden a predecir una evolución más grave, como la necesidad de ingreso hospitalario o de ingreso en UCIP, en el momento actual no disponemos de las herramientas necesarias que nos ayuden a clasificar a estos niños de forma precisa y su evolución es impredecible. 1.3.4.1. Determinantes genéticos: Numerosos estudios se han centrado en la identificación de polimorfismos genéticos asociados a formas graves de la enfermedad con resultados que no se han podido reproducir y han variado según la población a estudio.4,158 Específicamente, se han asociado polimorfismos en el receptor toll-like tipo 4 (TLR-4), la IL-4, la IL-8, la IL-13 o el TNF-α con formas más graves de la enfermedad.158-162 Aunque la predisposición genética podría explicar en parte la mayor susceptibilidad a padecer enfermedad grave por VRS en un subgrupo de pacientes, probablemente otros factores (ambientales, virales, desconocidos) contribuyen de forma importante.158 1.3.4.2. Edad y sexo: En general, el pico de máxima incidencia de la bronquiolitis grave por VRS ocurre en el lactante pequeño entre los 2 y 6 meses de Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 16 edad. De hecho se estima que el 70% de los lactantes hospitalizados por bronquiolitis son menores de 6 meses.4,7,64 Se sabe también que el VRS puede ocasionar cuadros graves en pacientes mayores de 65 años.4,48,163-165 Por tanto, la menor edad al comienzo de la temporada anual de VRS o en el momento de la infección (sobre todo los menores de 3 meses) así como la infección en ancianos constituyen factores bien definidos de enfermedad grave.44,61,69,163,164,166 En relación al sexo se observa que los lactantes varones tienen un riesgo 1,5 veces superior de padecer enfermedad grave en comparación con los lactantes de sexo femenino.7,64 1.3.4.3. Patología de base: Numerosos estudios epidemiológicos han identificado diferentes factores de riesgo de enfermedad grave por VRS.3,155,167-171 Los pacientes con historia de prematuridad representan el grupo poblacional de mayor riesgo para infección grave, seguidos por los niños con displasia broncopulmonar y cardiopatía congénita, sobre todo aquellos con repercusión hemodinámica. Se ha demostrado que estos pacientes ingresan más, presentan hospitalizaciones más largas, necesitan cuidados intensivos con más frecuencia y tienen tasas de mortalidad más altas que los niños pertenecientes a otros grupos de riesgo.3,59,157,172 De hecho, en estos pacientes está indicada la administración de anticuerpos monoclonales frente al VRS (palivizumab) durante la estación de invierno, para prevenir el desarrollo de enfermedad grave.60,167,173-175 No obstante, diferentes estudios han identificado otras patologías de base asociadas a una mayor gravedad clínica, incluyendo la fibrosis quística, trisomía 21, trastornos neuromusculares, inmunodeficiencias congénitas o adquiridas (VIH, tumores hematológicos, trasplante de precursores hematopoyéticos u órganos sólidos), anomalías cromosómicas y malformaciones de la vía aérea superior, entre otras.2,3,33,58,167,176 Son de especial mención los pacientes inmunodeprimidos, sobre todo los pacientes con trasplante de pulmón y los trasplantados de médula ósea, en los que la mortalidad se eleva hasta el 80%.177-183 1.3.4.4. Otros factores: Se han descrito otros factores de riesgo sociales, demográficos y ambientales que se han asociado a una mayor gravedad de la enfermedad por VRS, entre los que destacan la asistencia a guardería, la presencia de hermanos pequeños en el entorno familiar, la exposición al humo del tabaco, la historia familiar de asma, el bajo peso al nacimiento o la malnutrición, entre 1. Introducción 17 otros.3,65,184-186 Además, estos factores de riesgo pueden ser diferentes en los lactantes que viven en áreas rurales o en países en vías de desarrollo, como residir a mayor altitud, la presencia de inodoros con cisterna o la exposición a cocinas de carbón o madera.5,187,188 Por último, las coinfecciones virales, presentes en el 11%-44% de los casos,189193 también se han propuesto como un factor que podría influir en la gravedad de los niños hospitalizados con ITRI, aunque su papel causal no es del todo claro.56,190,192,194200 Existen, por tanto, numerosas cuestiones sin resolver: ¿por qué, siendo una enfermedad tan prevalente, hay un subgrupo de lactantes, aparentemente sin riesgo, que evolucionará de forma más grave? ¿Qué propicia que algunos niños desarrollen una ITRI grave por VRS, mientras que la mayoría tendrá signos y síntomas leves de bronquiolitis o incluso sólo una infección del tracto respiratorio superior (ITRS) cuando las cepas circulantes son las mismas? Por estos motivos y dado que los niños sanos representan el objetivo principal de la infección por VRS, cada vez más autores sugieren que es necesario centrar el foco de atención no sólo en los niños con comorbilidades sino también en los niños previamente sanos, profundizar en el estudio de otros factores de riesgo hasta ahora desconocidos, mejorar el conocimiento sobre la patogenia de la enfermedad y diseñar nuevas estrategias terapéuticas y preventivas, que hasta ahora se centraban sólo en los grupos de riesgo clásicos.10,61,201 Es en este contexto donde propusimos la realización del estudio prospectivo que se detalla a continuación, en el que nos planteamos si la colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas podría ser uno de los factores que pudiera influir o determinar de alguna manera una peor evolución de la infección por VRS en los niños previamente sanos. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 24 que uno de ellos se asocia a una mayor expresión de glicoproteínas virales en la superficie celular tras la internalización del virus en el epitelio, las cuales actúan como receptores bacterianos.257 1.4.2.2.1. Estudios experimentales Se ha comprobado, tanto in vitro como en modelos animales, que el VRS puede adherirse directamente a las bacterias a través de las proteínas de la superficie viral, formando un complejo virus-bacteria con mayor capacidad de adhesión a la mucosa respiratoria.224,258,259 En este sentido, datos recientes han demostrado que la glicoproteína G del VRS es capaz de unirse directamente a la proteína de unión a la penicilina (PBP-1a) de S. pneumoniae, aumentando la virulencia bacteriana y respuesta inflamatoria (Fig. 6).259 Figura 6. El VRS se adhiere directamente a S. pneumoniae mediante la glicoproteína G de superficie. A) ELISA que muestra la inhibición de la unión del neumococo a una placa revestida de VRS mediante el previo tratamiento de la placa con un anticuerpo contra la proteína G del VRS (anti-RSV G). B) Imágenes donde se observan neumococos expuestos a albúmina de suero bovino (control), al VRS o a la proteína G del VRS. Las preparaciones bacterianas se tiñeron con un anticuerpo específico para el VRS (verde) y un anticuerpo para la cápsula del neumococo (rojo). Las áreas de colocalización del antígeno se muestran en amarillo (indicado con flechas blancas). Modificado de Smith et al.259 1. Introducción 25 En ese mismo estudio,259 los autores demostraron que las concentraciones de citoquinas y quemocinas en células humanas del epitelio respiratorio in vitro eran significativamente mayores en presencia del VRS y S. pneumoniae de forma conjunta que de cada uno de estos patógenos de forma aislada (Fig. 7). Figura 7. Concentraciones de citoquinas y quemocinas secretadas en el sobrenadante del cultivo celular tras 2 horas de exposición de S. pneumoniae a células epiteliales ciliadas humanas infectadas o no previamente con VRS. Mock: control, células no infectadas con VRS. RSV: células infectadas con VRS. *Infección primaria (durante 72 horas). † Infección secundaria (durante 2 h). Los datos se muestran como mediana y rango intercuartil (entre paréntesis). ‡ Diferencia significativa (p<0,05) entre "Mock-neumococo" (células no infectadas con VRS y posteriormente infectadas con neumococo) y "RSV-neumococo" (células infectadas con VRS y posteriormente infectadas con neumococo). Modificado de Smith et al.259 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 26 Además, la infección por VRS puede aumentar la liberación de moléculas en la membrana de las células del huésped que también pueden actuar como receptores de adhesión bacteriana.246 Otros autores demostraron que el VRS aumenta la expresión de moléculas como el CD14 y CD18, implicadas en la mayor adhesión de Neisseria meningitidis a las células infectadas por el VRS.252 Por otra parte, se ha demostrado que la infección previa por VRS puede atenuar la respuesta inmune innata, como las βdefensinas, lo que favorecería la replicación bacteriana.247 Estudios realizados en ratones demuestran que la infección por el VRS disminuye la eliminación de S. pneumoniae de la mucosa respiratoria, lo que produce aumento de la inflamación pulmonar, con agravamiento de la enfermedad respiratoria y una mayor pérdida de peso y mortalidad de los animales infectados.260,261 1.4.4.2.2. Estudios epidemiológicos Numerosos autores han destacado la contribución del VRS a la patogenia de la infección invasiva por S. pneumoniae en niños.262-266 Ampofo et al264 demostraron, en una cohorte de 435 niños, una asociación clara entre el VRS y la enfermedad invasiva por neumococo, siendo la neumonía el cuadro clínico más frecuente.264 De hecho, el aumento de las tasas de neumonía coincide habitualmente con los períodos de mayor actividad del VRS.237,264,267-270 Recientemente, en un estudio realizado en 36 estados de EE.UU. en el que se analizó la interacción entre el VRS y la neumonía por S. pneumoniae en niños hospitalizados, se observó que el VRS se asociaba al aumento de neumonía neumocócica, sobre todo en los lactantes menores de 2 meses.269 Estos autores también evidenciaron una disminución significativa en las tasas de hospitalización por VRS en lactantes menores de un año tras la introducción de la vacuna antineumocócica heptavalente (Figs. 8 y 9). 1. Introducción 27 Figura 8. Relación temporal entre el pico estacional (en semanas) de las hospitalizaciones debidas al VRS y las debidas a neumonía neumocócica en diferentes estados de EE.UU. Las barras de error representan los intervalos de confianza del 95%. Los colores muestran los diferentes estados, marcados con etiquetas de dos iniciales. Modificado de Weinberger et al.269 Figura 9. Relación entre la incidencia de infección por el VRS (en azul) y la neumonía neumocócica (en rojo) en niños de California, EE.UU. RSV: virus respiratorio sincitial. La línea gris separa los periodos en base a la introducción de la vacuna neumocócica. Modificado de Weinberger et al.269 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 28 La mayoría de los estudios describen una relación unidireccional entre infección viral y colonización bacteriana; sin embargo, es posible que determinadas bacterias puedan crear un ambiente favorable facilitando la invasión viral de manera directa o indirecta.208,262,271 Por ejemplo, los lactantes colonizados por M. catarrhalis o por S. pneumoniae a las 5-9 semanas de vida tienden a presentar más precozmente una primera infección del tracto respiratorio superior o inferior, respectivamente, que los lactantes colonizados por otras especies bacterianas.23 Por otra parte, los propios virus podrían utilizar el microambiente bacteriano para evadir los mecanismos de defensa del huésped, como propugnan los estudios desarrollados por Kane et al272 y Kuss et al.273 Mas aún, datos de un estudio en el que se aleatorizaron más de 36.000 niños (aproximadamente 18.000 en cada brazo del estudio) a la vacuna nonavalente antineumocócica vs. placebo, demostraron que la vacuna, además de disminuir de forma específica la incidencia de las infecciones invasivas por neumococo, también se asoció a una disminución significativa en la incidencia de neumonías virales.262 Por tanto, la idea de que únicamente los virus predisponen a la enfermedad bacteriana secundaria o que existe un solo virus o una sola bacteria para cada infección respiratoria es una visión limitada para la complejidad y dinamismo que exhiben estas infecciones.13,22,198,274 1.4.5. Colonización bacteriana nasofaríngea en el niño con bronquiolitis aguda y sibilancias producidas por virus En general, los datos sobre el impacto de la colonización bacteriana nasofaríngea en las infecciones respiratorias del tracto respiratorio inferior de etiología viral en niños son escasos y existe una gran heterogeneidad en la metodología de los estudios. La mayoría de ellos incluye niños mayores de 2 años, detección de múltiples virus y diferentes definiciones en relación a la infección del tracto respiratorio inferior, lo cual dificulta las comparaciones entre trabajos y la extrapolación de resultados. Bisgaard y sus colaboradores275 siguieron una cohorte de 361 hijos de madres asmáticas desde el nacimiento hasta los 3 años y observaron una asociación significativa entre los episodios de sibilancias agudas y la colonización de la hipofaringe 1. Introducción 29 por bacterias respiratorias (OR 2,9; 95% IC [1,9-4,3]), siendo esta asociación similar, pero independiente, a la que se produce con los virus respiratorios. El mismo grupo de investigadores determinó, en la misma cohorte, que la colonización de neonatos al mes de vida por S. pneumoniae, H. influenzae o M. catarrhalis se relacionaba con una mayor probabilidad de presentar bronquiolitis aguda en los primeros 3 años de vida.276 Resultados muy similares se demostraron en una cohorte de neonatos sanos.277 Por otra parte, en un estudio realizado en Turku (Finlandia), los niños menores de 3 años ingresados con el primer episodio de sibilancias de etiología viral (VRS, rinovirus, bocavirus o infecciones mixtas) colonizados por S. pneumoniae, H. influenzae o M. catarrhalis permanecieron ingresados durante más tiempo y posteriormente presentaron más episodios de sibilancias recurrentes que los niños no colonizados.18 Por otra parte, Yu et al,19 en China, observaron que los niños con bronquiolitis aguda estaban colonizados por al menos una bacteria potencialmente patógena en un 56% de los casos. Además, la colonización era mayor en aquellos niños con sibilancias recurrentes inducidas por virus en comparación con los que presentaban el primer episodio de sibilancias y la presencia de bacterias en la nasofaringe se asociaba con una peor evolución clínica. Hishiki et al278 encontraron que casi la mitad de los niños menores de 5 años ingresados por una infección del tracto respiratorio inferior por VRS estaban colonizados por bacterias respiratorias potencialmente patógenas, siendo las tres más frecuentes H. influenzae (44%), S. pneumoniae (36,6%) y M. catarrhalis (29,3%).278 En un interesante trabajo, Hyde y otros investigadores22 observaron que la presencia específica de Proteobacterias como H. influenzae y M. catarrhalis en la nasofaringe de niños menores de 2 años se asociaba a bronquiolitis producida por VRS o por VRS y rinovirus de forma conjunta, y a sibilancias durante la infección aguda. Por último, en un reciente estudio sobre el microbioma nasofaríngeo durante el primer año de vida se observó que los niños con infección del tracto respiratorio inferior producida por VRS que estaban colonizados por M. catarrhalis experimentaban más fiebre.23 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 30 1.5. COMENTARIOS FINALES A LA INTRODUCCIÓN Por tanto, existe una evidencia creciente que indica que las bacterias potencialmente patógenas del tracto respiratorio superior, fundamentalmente de la nasofaringe, podrían tener un papel en el desarrollo y/o la evolución de las enfermedades respiratorias más importantes de los niños. Sin embargo, se desconoce aún si el hecho de encontrar estas bacterias en la vía aérea superior implica causalidad y/o diferencia entre colonización o enfermedad.18,279 Es indudable que las interacciones microbianas en la nasofaringe son multifactoriales e implican a su vez complejas interacciones entre factores del huésped y las propias características bacterianas, las cuales, en el contexto de la infección por el VRS, son aún más difíciles de evaluar e interpretar y pueden tener consecuencias importantes tanto para la composición y la estabilidad de la propia microbiota como para la susceptibilidad a la enfermedad. En resumen, la infección por el VRS continúa siendo una patología pediátrica líder a nivel mundial, con una enorme repercusión socio-económica y sanitaria, que afecta gravemente y de forma mayoritaria a niños sanos sin que se lleguen a entender completamente los factores que determinan la gravedad de la enfermedad. Al igual que se ha demostrado para otros virus, como el virus influenza, el VRS se relaciona íntimamente con las poblaciones bacterianas del tracto respiratorio, lo que podría predisponer a sobreinfecciones bacterianas y probablemente, en última instancia, a una mayor gravedad de la enfermedad respiratoria. Numerosos estudios sugieren que el origen de esta cascada de eventos podría comenzar a nivel de la nasofaringe, con la interacción de bacterias potencialmente patógenas en la mucosa respiratoria infectada por el VRS. CAPÍTULO 2. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO 2. Justificación del estudio 33 2.1. JUSTIFICACIÓN 1.- La bronquiolitis por VRS constituye la primera causa de hospitalización en niños menores de 2 años a nivel mundial. La mayoría de niños hospitalizados con bronquiolitis por VRS son previamente sanos sin factores de riesgo conocidos; de ellos un 10%-20% precisará ingreso en la UCIP. 2.- Estudios in vitro, modelos experimentales y estudios epidemiológicos sugieren una asociación entre la infección por el VRS y la colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas, específicamente por H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S. aureus. 3.- Aunque se ha empezado a estudiar el papel de la colonización bacteriana nasofaríngea en niños sanos y con infecciones respiratorias, existen pocos estudios que se centren específicamente en la bronquiolitis aguda por VRS y su posible asociación con una mayor gravedad clínica. 4.- En la mayoría de los trabajos realizados, los pacientes con infección por VRS presentan rangos de edades muy amplios. Hasta el momento no se ha examinado en profundidad el impacto de la colonización nasofaríngea en el grupo de edad de más relevancia en la bronquiolitis, los niños menores de 24 meses de edad. 5.- En la actualidad no existe evidencia científica suficiente que demuestre si la presencia de estas bacterias potencialmente patógenas en la nasofaringe de los niños infectados por VRS influye o afecta de alguna manera al desarrollo y la gravedad de la bronquiolitis o modifica la respuesta inflamatoria local (nasal) o sistémica. CAPÍTULO 4. MATERIAL Y MÉTODOS 4. Material y métodos 43 4.1. DISEÑO Y CANDIDATOS DEL ESTUDIO 4.1.1. Descripción y localización del estudio Este estudio consiste en un estudio observacional prospectivo de cohortes en niños previamente sanos menores de 2 años ingresados por bronquiolitis aguda producida por VRS en un único hospital terciario (Hospital Nationwide Children’s de Columbus, Ohio, EE.UU.) durante la temporada anual de bronquiolitis aguda ocurrida entre 2010-2011, para determinar la frecuencia y el impacto de la colonización bacteriana nasofaríngea en relación con la gravedad de la enfermedad. Además, se reclutó una cohorte de controles sanos de edad y sexo semejantes. El campus del hospital Nationwide Children’s (NCH) comprende el Departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ohio State, el hospital Nationwide Children’s, las instalaciones de los Servicios de Investigación Clínica y el Instituto de Investigación. El NCH es un hospital pediátrico de tercer nivel con 552 camas que atiende a una población de más de un millón de niños y adolescentes cada año. En el año 2010 en este hospital se llevaron a cabo 19.020 altas hospitalarias, 19.758 intervenciones quirúrgicas y se documentaron 76.847 visitas al Servicio de Urgencias. Además, el NCH abarca a una gran red de centros de Atención Primaria, en los que en el año 2010 se atendieron a 158.713 pacientes de 0 a 19 años de edad. La investigación clínica se coordina a través de los Servicios de Investigación Clínica del NCH donde se estudia el diseño, desarrollo y viabilidad de los proyectos de investigación. El Instituto de Investigación, con una ocupación de más de 61.000 m2 de edificios con laboratorios y oficinas, ha sido reconocido como uno de los 10 centros pediátricos de investigación de EE.UU. que reciben más financiación del NIH ("National Institutes of Health”) y es uno de los institutos de investigación pediátrica con mayor crecimiento y proyección de los EE.UU. El proyecto que llevamos a cabo se realizó en conjunto con el hospital (NCH), donde se reclutaron los pacientes, y el Centro de Vacunas e Inmunología, que se encuentra en el Edificio II del Instituto de Investigación del NCH, en los laboratorios de los Doctores Mejías y Ramilo. Los laboratorios donde se realizaron los ensayos y análisis de las muestras del estudio constan de 80 m2 y están Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 44 equipados con cuatro campanas de flujo laminar de nivel de contención BL2 (nivel de bioseguridad 2), dos incubadoras para cultivos tisulares, un contador de células, microscopios, frigoríficos, congeladores, centrifugadoras, termocicladores de PCR y otras herramientas de pequeño tamaño. Además, hay cuatro estaciones de trabajo equipadas con SPSS, SAS, Sigma Plot y Graph Pad, exclusivamente dedicadas al análisis estadístico y de microarrays. 4.1.2. Definiciones - Bronquiolitis aguda: Infección aguda del tracto respiratorio inferior caracterizada por aumento del esfuerzo respiratorio (taquipnea y/o uso de musculatura respiratoria accesoria) y sibilancias o crepitantes en la que se sospecha o se identifica un patógeno viral respiratorio en menores de 24 meses.31,280 En la mayoría de los casos durante la época epidémica es ocasionada por el VRS. - Colonización por bacterias potencialmente patógenas: detección mediante cultivo bacteriano convencional en muestras nasofaríngeas de al menos una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes o Neisseria meningitidis.17,206,281 - Fiebre: definida como la temperatura axilar ≥38˚C identificada en al menos una ocasión, desde el primer día de enfermedad y hasta el alta. - Exposición a antibióticos: definida por haber recibido al menos una dosis de antibióticos dentro de la semana antes de la recogida de muestras (momento de inclusión en el estudio). - Citoquinas: proteínas de bajo peso molecular secretadas por diferentes tipos celulares y con función inmunorreguladora. En este estudio se analizaron citoquinas relacionadas con la respuesta inmune innata, específicamente la IL-6, la IL-8 y el TNF-α en el plasma. 4. Material y métodos 45 4.1.3. Pacientes 4.1.3.1. Criterios de inclusión  Niños menores de 2 años, de ambos sexos y cualquier raza/grupo étnico hospitalizados en el NCH.  Previamente sanos.  Hospitalizados con un primer episodio de bronquiolitis aguda producida por VRS. 4.1.3.2. Criterios de exclusión  Edad gestacional < 35 semanas.  Enfermedades crónicas o congénitas: cardiopatía congénita, displasia broncopulmonar, insuficiencia renal crónica, miopatías, etc.  Síndrome de Down y otros síndromes congénitos.  Diagnóstico de bronquiolitis aguda producida por otros virus distintos del VRS (ej. virus parainfluenza, rinovirus, metapneumovirus humano, etc.).  Utilización de inmunomoduladores o corticoides sistémicos (vía oral o intravenosa) en las dos semanas anteriores al ingreso hospitalario.  Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas.  Hospitalización previa por bronquiolitis aguda. 4.1.4. Controles sanos Para identificar las diferencias en la colonización bacteriana nasofaríngea entre controles sanos no infectados y niños con bronquiolitis aguda de edades similares, se reclutó una cohorte de niños sanos menores de 2 años. Los controles sanos fueron reclutados, o bien en el quirófano, cuando acudían a cirugías menores programadas por procedimientos quirúrgicos que no implicaban el tracto respiratorio (ej. hernias), o bien en los centros de salud de Atención Primaria, cuando acudían a citas programadas de atención al niño sano. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 46 4.2. IDENTIFICACIÓN DE LOS PACIENTES Y RECLUTAMIENTO 4.2.1. Proceso de identificación, selección y reclutamiento El estudio se inició el 1 de diciembre de 2010 y finalizó el 31 de julio de 2011 en el hospital Nationwide Children’s de Columbus, Ohio, EE.UU. Para poder cumplir los objetivos mencionados establecimos un protocolo de identificación y selección de los pacientes hospitalizados por bronquiolitis, que no tuvieran ninguna patología de base y que fueran menores de dos años. La identificación de los pacientes se realizó diariamente, de lunes a viernes, revisando las historias clínicas de los pacientes ingresados, según el censo hospitalario, tanto en la planta de hospitalización de Pediatría como en la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos (UCIP), para determinar cuáles cumplían los requisitos para el estudio. La identificación de los controles se realizó de forma similar, según los partes de quirófano y las citas programadas de los niños en el centro de salud. Se aceptaron como posibles candidatos aquellos que cumplían los criterios de inclusión y que no presentaban ningún criterio de exclusión, incluyendo también a aquellos niños con bronquiolitis aguda menores de 2 años en el pico de la temporada epidémica de VRS en los que el índice de sospecha de infección por VRS era elevado pero en el momento del reclutamiento se desconocía el resultado del test respiratorio viral. Una vez identificados los pacientes se informaba del estudio a los padres/tutores legales requiriendo la firma de un consentimiento informado (ANEXO A) en el caso de que accedieran a participar en el estudio (Figs. 10 y 11). 4. Material y métodos 47 Figura 10. Identificación, selección y reclutamiento de los participantes: “Porque 2 más 2 no son siempre 4…”. Figura 11. Reclutamiento de los participantes. Gestión del tiempo. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 48 El diagnóstico de bronquiolitis por VRS se realizó en base al test diagnóstico solicitado por el médico responsable del ingreso del paciente, de acuerdo al protocolo de atención hospitalaria establecido (test rápido antigénico para VRS, EIA; inmunofluorescencia directa, IFD; o panel de virus mediante reacción en cadena de la polimerasa, panel PCR): a) El test rápido antigénico (EIA) para el VRS durante nuestro estudio demostró una sensibilidad del 70%-80%. b) El test de IFD que se realizó de rutina en el momento del estudio permitía la detección de 6 virus diferentes con sensibilidades que oscilan entre 65% y >90% (VRS, >90%; influenza A y B, 80% a 85%; parainfluenza y metapneumovirus, 70% a 80%; adenovirus, 65% a 70%). c) El panel de PCR en tiempo real para virus incluyó PCR individuales para VRS, influenza A y B, metapneumovirus, parainfluenza, adenovirus y rinovirus con una sensibilidad > 98%. En todos los niños reclutados, independientemente de que presentaran al ingreso un resultado positivo para VRS mediante las técnicas anteriormente descritas, y también en los controles sanos se realizó PCR en tiempo real para VRS en secreciones nasofaríngeas para confirmar el diagnóstico de infección por VRS, determinar de forma cuantitativa la carga viral y definir el tipo de infección por VRS, A o B. 4.2.2. Aprobación del Comité de Ética El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Nationwide Children’s (“Institutional Review Board, IRB, at Nationwide Children’s Hospital”) con el número IRB10-00028; (nivel de riesgo 1: “no greater tan minimal risk”; 45 CFR 46.404; 21 CFR 50.51; ANEXO B). La información revelada y obtenida a través de los participantes del estudio es considerada confidencial y fue tratada así en todo momento, tal y como se estipula en el Informe Belmont, el Comité Internacional de la Declaración de Armonización de Buenas Prácticas Clínicas y la Declaración de Helsinki. Los sujetos fueron identificados con un código que protegía su identidad (conocido 4. Material y métodos 49 sólo por los investigadores del estudio) de manera que en caso de publicación de los resultados no se revelara la identidad de los pacientes. Los participantes que habían aceptado su inclusión en el estudio podían revocar el consentimiento en cualquier momento. 4.3. RECOGIDA DE DATOS Después de obtener el consentimiento informado, se recogieron una serie de datos mediante un cuestionario clínico en el momento de la inclusión en el estudio y la revisión al alta de la historia clínica. 4.3.1. Variables del estudio 4.3.1.1. Características demográficas y epidemiológicas: sexo, edad, raza o grupo étnico, edad gestacional, estado vacunal, lactancia materna en el momento del reclutamiento, exposición al humo del tabaco, asistencia a guardería y/o contacto con uno o más hermanos en edad escolar, tratamiento antibiótico recibido en la semana anterior a la inclusión en el estudio y duración del mismo, días de síntomas previos al ingreso incluyendo fiebre. 4.3.1.2. Determinantes de gravedad de la enfermedad: la gravedad de la enfermedad se evaluó mediante la consideración de la duración y la presencia de fiebre, duración de la estancia hospitalaria (definido como un día de calendario pasado en el hospital), mínima saturación basal de oxígeno (O2) al ingreso, necesidad y duración de oxígeno suplementario (definiendo la duración como el número de horas o porción de las mismas en tratamiento con O2, expresado posteriormente en días), necesidad y duración del tratamiento en la UCIP, y necesidad y la duración de intubación o soporte ventilatorio no invasivo. Además, se utilizó una escala estandarizada para determinar la gravedad clínica de la enfermedad (CDSS, “clinical disease severity score”), compuesta por cinco parámetros puntuados individualmente desde 0 (normal) a 3 (grave), con el que se clasificó a los pacientes con enfermedad leve (0-5), moderada (6-10) o grave (11-15) (Tabla 1).100,148,282 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 56 movimiento rotatorio suave. El mismo paso se repite introduciendo el catéter por la otra narina. 3. Se aspiran 2 ml de medio de transporte de virus a través del catéter para poder enjuagar el mismo y extraer las secreciones que pueden haber quedado retenidas en él. 4. Finalmente, se desconectan las tubuladuras de la succión y se cierra el recipiente con el tapón provisto para ello. La muestra se conserva en hielo común, a 4°C, hasta su procesamiento inmediato en el laboratorio. Cada muestra de lavado nasal se procesó y dividió en diferentes alícuotas para realizar el recuento de leucocitos e identificación y cuantificación del VRS (Fig. 16). Figura 15. Recipiente contenedor de secreciones respiratorias (Centurion Medical Products). Tomado de www.medline.com 4. Material y métodos 57 Figura 16. Esquema resumen del procesamiento de las muestras de lavado nasal. PBS: tampón fosfato salino. EDTA2%-PBS: EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 2% en PBS. RTPCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. RPM: revoluciones por minuto. ml: mililitros. μl: microlitros. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 58 4.4.1.2.2. Conteo y descripción de leucocitos en muestras respiratorias Para ello es necesario el procesamiento de la muestra según lo indicado en la figura 16, durante el cual se realizan dos pasos importantes: 4.4.1.2.2.1. Utilización del hemocitómetro El hemocitómetro consta de un portaobjetos especializado en el cual se ha grabado una retícula con láser y sobre el que se coloca un cubreobjetos de cristal (Fig. 17). La rejilla se encuentra compuesta por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (Fig. 18), y se encuentra a una profundidad de 0,1 mm por debajo del cubreobjetos, limitando un volumen determinado de 0,1 mm3 por cada uno de los 9 cuadros de la rejilla. Cada portaobjetos contiene dos rejillas. Después de cargarse con la muestra, el hemocitómetro se coloca bajo el microscopio y se contabilizan las células presentes en cada cuadro, lo que permite calcular la concentración de leucocitos en la muestra estudiada. Figura 17. A) Hemocitómetro. B) Esquema del porta y cubreobjetos. Adaptado de: http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Cell_counts_SPA.pdf 4. Material y métodos 59 Figura 18. Esquema descriptivo de la retícula grabada de un hemocitómetro. Cada cuadro coloreado equivale al volumen (Vol) indicado. Adaptado de: http://www.hausserscientific.com/products/hausser_bright_line.html El test de exclusión de colorante azul tripán es un procedimiento para contar células viables a través de la tinción de las mismas. Este método se basa en el hecho de que las células vivas no incorporan el tinte, mientras que las muertas se tiñen. Para realizar el test, se toma un pequeño volumen de la suspensión celular (10 μl) y se diluye en un volumen determinado de azul tripán ± tampón fosfato salino (PBS), que será mayor conforme mayor sea la concentración celular (diluciones 1/1, 1/10 o 1/20). De la dilución final se toman 10 μl y se carga la cámara del hemocitómetro (Fig. 19). Figura 19. Carga del hemocitómetro con la dilución células-azul tripán Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 60 Cada cuadrado del hemocitómetro representa un volumen total de 0,1 mm3, por lo tanto la concentración celular por ml se calcula como: Concentración (céls/ml) = promedio de células vivas/cuadrado X factor de dilución X 104 Donde el factor de dilución se calcula: Volumen final [vol. céls + (vol. azul tripán ± vol. PBS)] Volumen de células (Ej: si se toman 10 μl de suspensión celular y se diluyen con 10 μl de azul tripán, el volumen final son 20 μl  20 μl/10 μl = factor de dilución de 2). 4.4.1.2.2.2. Contabilización y tinción Tras contabilizar 50.000 células de cada muestra con el hemocitómetro, se diluyen hasta un volumen de 200 μl y se procesan inmediatamente en la citocentrifugadora Thermo ScientificTM CytospinTM 4 (Thermo Fisher Scientific Inc.) durante 5 minutos a 1.000 RPM. La citocentrifugación da lugar a un portaobjetos con una preparación de células en una sola capa, la cual se identifica con el código del sujeto de estudio y se envía al laboratorio de Anatomía Patológica, donde se realiza una tinción de Wright-Giemsa para identificar los leucocitos y la proporción de cada tipo de célula (neutrófilos, linfocitos, monocitos/macrógafos y eosinófilos) en la muestra. 4.4.1.2.3. Identificación y cuantificación del VRS por PCR en tiempo real Para la cuantificación de la carga viral se realizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real en un solo paso, RT-PCR (Qiagen Quantitect) dirigida a la región conservada del gen N del VRS. Se utilizó el secuenciador ABI-7000 (Applied Biosystems) con 5 μl de ADN complementario en un volumen total de 50 μl de 4. Material y métodos 61 mezcla maestra, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.41,286 Para obtener una curva estándar se utilizaron concentraciones conocidas de VRS A y B. Los controles negativos y positivos se sometieron a análisis al mismo tiempo que se analizaba cada una de las muestras de los sujetos a estudio. La secuenciación se efectuó de la siguiente manera: los cebadores de VRS A sentido (5'-AGA TCA ACT TCT GTC ATC CAG CAA) y antisentido (5'-TTC TGC ACA TCA TAA TTA GGA GTA TCA EN cebadores) amplificaron una región de 85 pares de bases que contenía la sonda de 25-mer marcada con FAM (5'-CAC CAT CCA ACG GAG CAC AGG AGA T). De igual manera, los cebadores de VRS B sentido (5'-AAG ATG AAC ATC ATA AAT TCA CAG GA) y antisentido (5'-TGA TAT CCA GCA TCT TTA AGT ATC TTT ATA GTG) también se amplificaron utilizando la sonda de 25-mer marcada con FAM (5'-AGG TAT GTT ATA TGC TAT GTC CAG GTT AGG AAG GGA A). 4.4.2. Muestras de sangre: análisis de citoquinas en plasma En todos los participantes del estudio se intentó obtener una muestra de sangre periférica para la determinación del hemograma con diferencial. Además, en un subgrupo de sujetos fue posible extraer una muestra de sangre periférica extra para realizar análisis de citoquinas. La sangre (0,5-1 ml) se recogió en tubos heparinizados (Vacutainer™, BD, Franklin Lakes, NJ), se mantuvo en frío, en hielo común, y posteriormente se centrifugó durante 5 minutos a 3.000 RPM en la primera hora tras la recogida para la separación del plasma. Después se almacenó el plasma de dichas muestras a -80 °C para la posterior determinación de la concentración de TNF-α, IL-6 e IL-8, utilizando el quimioluminómetro automatizado Immulite® (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles, CA).100,287 El límite de detección del ensayo fue de 5 pg/ml para TNF-α e IL-8 y 2 pg/ml para IL-6, y todas las muestras se realizaron en duplicado. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 62 4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las características basales y demográficas de los sujetos se presentan mediante estadística descriptiva. El análisis descriptivo de las variables cualitativas se estableció mediante frecuencias absolutas y porcentajes. La asunción de la normalidad para las variables continuas se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. En el caso de variables cuantitativas que siguen una distribución normal, el análisis descriptivo se realizó mediante el cálculo de la media y la desviación estándar. Si las variables no seguían una distribución normal se utilizaron la mediana y el rango intercuartílico (percentil 25-percentil 75). La comparación entre variables cualitativas se determinó mediante el test de Chi-cuadrado o el Chi-cuadrado corregido por Yates para frecuencias esperadas menores de 5. Para la comparación de dos grupos de variables cuantitativas con distribución normal se utilizó la prueba T de Student y en el caso de rechazo de la hipótesis de normalidad el test U de Mann-Whitney. En el caso de comparaciones múltiples de variables continuas, se realizó el test de análisis de la varianza (ANOVA) o el test de Kruskal-Wallis ajustado por múltiples comparaciones (Dunn’s o Dunnett test), según la distribución de los datos. Para la estimación del riesgo se empleó la odds ratio (OR) con intervalos de confianza del 95%. En todas las pruebas se consideró significativo un valor de p<0,05 de forma bilateral. Los datos de cada participante se introdujeron en una base de datos Excel (Microsoft Office 2010®). El análisis de los datos se realizó mediante los programas estadísticos SigmaPlot 11.0 (Systas Software, Inc.) o SAS software, versión 9.2. Para la creación de gráficos se utilizó GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) y Power Point 2010 (Microsoft Office 2010®). CAPÍTULO 5. RESULTADOS 5. Resultados 65 5.1. SUJETOS PARTICIPANTES EN EL ESTUDIO 5.1.1. Sujetos reclutados y excluidos Desde diciembre de 2010 hasta julio de 2011 se reclutaron 154 niños con bronquiolitis, además de 23 controles sanos. Con este fin se visitaron 224 pacientes, objetivándose una proporción de éxito de reclutamiento del 70% (Fig. 20). Los pacientes con infección por VRS fueron incluidos de diciembre a abril, y los controles sanos desde el principio de marzo a julio, el 70% de ellos mientras había aún actividad por el VRS. Figura 20. Pacientes visitados: proporción de reclutamiento De los 154 pacientes reclutados, 18 se excluyeron por los siguientes motivos: - Un paciente fue excluido por presentar historia de prematuridad (31 semanas de edad gestacional) y displasia broncopulmonar. - Catorce pacientes por manifestar una ITRI de etiología diferente al VRS (5 infecciones por metapneumovirus humano y 1 por el virus parainfluenza) o desconocida (8 pacientes con test de diagnóstico viral al ingreso y RT-PCR negativos). - Tres pacientes se excluyeron por presentar coinfección por VRS y otro virus (2 coinfecciones por VRS-adenovirus y 1 por VRS-influenza). Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 72 De hecho, observamos que el aislamiento bacteriano disminuyó significativamente tanto de forma aislada como en combinación con otras bacterias potencialmente patógenas con el uso de antibióticos: la administración de antibióticos se asoció con una probabilidad 10 veces menor de aislar bacterias potencialmente patógenas (OR intervalo de confianza del 95%: 9,8 [4,4-21,6]; p<0,001); Figs. 23 y 24. Figura 24. Colonización nasofaríngea única o múltiple según la administración o no de antibióticos antes de la recogida de las muestras. BPP: bacterias potencialmente patógenas. ATBs: antibióticos. Para el análisis se utilizó el test de Chi-cuadrado. 5.3.3. Efecto de los antibióticos sobre la densidad bacteriana Con respecto a la densidad bacteriana, también se observó que la administración de antibióticos se asoció a una probabilidad 3,4 veces mayor de aislar escasas o pocas unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias potencialmente patógenas en los cultivos, en detrimento de los aislamientos moderados o abundantes (OR intervalo de confianza del 95%: 3,4 [1,1-10,4]; p= 0,049). 5. Resultados 73 5.3.4. Características demográficas, clínicas y de laboratorio de los niños tratados o no con antibióticos A la luz de estos hallazgos y para determinar si el grupo de pacientes que recibió antibióticos representaba un fenotipo diferente y se asociaba a una mayor gravedad por VRS, comparamos los parámetros demográficos, de laboratorio y de gravedad clínica entre los niños tratados o no con antibióticos. Las características demográficas y clínicas fueron comparables entre ambos grupos, incluyendo la presencia y duración de la fiebre, la necesidad de oxígeno suplementario, la duración de la hospitalización y la puntuación del score clínico de gravedad. Sin embargo, en los pacientes que recibieron antibióticos se realizó hemograma con más frecuencia, precisaron oxígeno durante más tiempo y presentaban consolidación lobar en base a la radiografía de tórax con más frecuencia que los niños no tratados con antibióticos (Tablas 4 y 5). Tabla 4. Características demográficas y parámetros de laboratorio en niños con bronquiolitis VRS tratados con y sin antibióticos antes de la recogida de las muestras. Se utilizó el test de Mann-Whitney o t-Student para variables continuas y el de Chi-cuadrado para el análisis de datos categóricos. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%] o medias ± desviación típica. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. Hemograma: leucocitos totales en el hemograma de sangre periférica. Pacientes tratados con antibióticos (n=64) Pacientes no tratados con antibióticos (n=72) Valor de p Características demográficas Edad (meses) 2,6 [1,5-5,1] 2,4 [1,5-4] 0,628 Sexo [n (%)] Varón Mujer 39 (61) 25 (39) 45 (62,5) 27 (37,5) 0,852 Raza [n (%)] Blanca Negra Otros 52 (81) 7 (11) 5 (8) 46 (64) 14 (19) 12 (17) 0,077 Parámetros de laboratorio Realización hemograma [n (%)] 54 (84,3) 43 (59,7) 0,002 Hemograma (x103/mm3) 11,2 [9,1-14,6] 11,3 [7,9-12,8] 0,452 Neutrófilos % 28,5 [16,0-39,0] 24,0 [17,0-31,0] 0,195 Linfocitos % 47,8 ± 16,3 58,1 ± 12,9 0,001 Monocitos % 12,0 ± 5,6 10,9 ± 4,8 0,287 Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 74 Tabla 5. Determinantes de gravedad de la enfermedad y características radiológicas en niños con bronquiolitis VRS tratados con y sin antibióticos antes de la recogida de las muestras. CDSS: Clinical Disease Severity Score (Score Clínico de Gravedad). Rx: radiografía. EPB: engrosamiento peribronquial. II: infiltrados intersticiales. Para el análisis se utilizó el test de Mann-Whitney para variables continuas y el de Chi-cuadrado para el análisis de datos categóricos. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%]. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. La realización de cultivos de sangre y de orina fue significativamente mayor en los niños que recibieron antibióticos en comparación con los que no recibieron antibióticos (66% vs. 33%, p<0,001 y 44% vs. 17%, p= 0,046; respectivamente). Todos los cultivos, en ambos grupos, fueron estériles tras 5 días de incubación. Pacientes tratados con antibióticos (n=64) Pacientes no tratados con antibióticos (n=72) Valor de p Determinantes de gravedad Fiebre Presencia [n (%)] Duración (días) 49 (76,5) 2 [1-4] 45 (62,5) 2 [1-3,5] 0,113 0,288 Oxígeno: Necesidad [n (%)] Duración (días) 48 (75) 2,2 [1-4] 56 (78) 1,5 [0,7-2,5] 0,703 0,016 CDSS 5 [3-12] 5 [3-7] 0,340 Duración hospitalización (días) 3 [2-5] 2 [2-3] 0,272 Características radiológicas Realización Rx tórax [n (%)] 55 (86) 58 (80,5) 0,403 Patrón radiológico [n (%)] Normal EPB o hiperinsuflación Atelectasia o II Consolidación lobar 4 (7) 17 (31) 18 (33) 16 (29) 3 (5) 32 (55) 18 (31) 5 (9) 0,013 5. Resultados 75 5.4. COLONIZACIÓN NASOFARÍNGEA Y EVOLUCIÓN CLÍNICA EN NIÑOS CON BRONQUIOLITIS POR VRS NO TRATADOS CON ANTIBIÓTICOS Tras observar que la administración de antibióticos limitaba nuestra capacidad para aislar bacterias potencialmente patógenas, así como el número y la densidad bacteriana de éstas, decidimos estudiar si la frecuencia de colonización y el tipo de bacterias potencialmente patógenas diferían entre los pacientes con infección por VRS y los controles sanos. Para este análisis sólo se incluyó el grupo de niños con bronquiolitis que no habían recibido antibióticos previamente a la toma de muestras (n=72). Las características demográficas fueron comparables entre los niños con infección por VRS que no había recibido antibióticos y los controles sanos (Tabla 6). Controles (n=23) Pacientes VRS sin ATBs (n=72) Valor de p Edad (meses) 3,2 [1,6-8,2] 2,4 [1,5-4] 0,099 Sexo [n (%)] Varón Mujer 15 (65) 8 (35) 45 (62,5) 27 (37,5) 0,990 Edad Gestacional (semanas) 39 [38-40] 40 [38-40] 0,631 Raza [n (%)] Blanca Negra Otros 10 (43,5) 10 (43,5) 3 (13) 46 (64) 14 (19) 12 (17) 0,068 Lactancia materna* 5/20 (25) 21/70 (30) 0,877 Estado vacunal [n (%)] Completo Incompleto Desconocido 20 (87) 1 (4) 2 (9) 59 (82) 6 (8) 7 (10) 0,799 Tabaquismo pasivo* 6/15 (40) 28/54 (52) 0,603 Asistencia a guardería o hermanos en edad escolar* 11/17 (65) 53/66 (80) 0,201 Tabla 6. Características demográficas de los niños con bronquiolitis por VRS que no habían recibido antibióticos previos y de los controles sanos. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%]. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. Se utilizó el test de Mann-Whitney para variables continuas y el de Chicuadrado para el análisis de datos categóricos. *En las variables lactancia materna, tabaquismo pasivo y asistencia a guardería o hermanos en edad escolar, el número de sujetos en los cuales se documentó ese parámetro se incluye en el denominador, y los porcentajes han sido calculados en base a dicho denominador. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 76 5.4.1. Características microbiológicas en niños con bronquiolitis por VRS y controles sanos La proporción de colonización nasofaríngea por al menos una bacteria potencialmente patógena (S. pneumoniae, H. influenzae no tipificable, M. catarrhalis, S. aureus, Streptococcus del grupo B o S. pyogenes) en niños con bronquiolitis por VRS fue de 81% (58/72), en comparación con 65% (15/23) en los controles sanos. Además, la colonización múltiple (dos o más bacterias) fue más frecuente en el grupo de niños con bronquiolitis por VRS que en los niños sanos (32% vs. 4%; p=0,023) (Fig. 25). Bronquiolitis VRS Controles sanos 0 50 100 1 sola BPP  2 BPP No BPP n=35 n=1 n=23 n=14 n=8 n=14 **p=0,023 Porcentaje (%) Figura 25. Tasas de colonización nasofaríngea en niños hospitalizados por bronquiolitis por VRS y controles sanos. BPP: bacterias potencialmente patógenas. En el eje de abcisas (X) se representan el grupo de niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos y el grupo de controles sanos. El eje de ordenadas (Y) muestra el porcentaje de bacterias respiratorias identificadas: 1 sola bacteria potencialmente patógena (1 sola BPP, gris claro); 2 o más bacterias potencialmente patógenas (≥2 BPP, blanco) y no identificación de bacterias potencialmente patógenas (No BPP, gris oscuro). Las bacterias que se identificaron en el grupo denominado “No BPP” correspondían todas a bacterias de la microbiota comensal del tracto respiratorio superior. Para el análisis se utilizó el test de Chi-cuadrado. En números absolutos, la bacteria potencialmente patógena cultivada más frecuentemente de forma aislada tanto en pacientes con VRS como en controles sanos fue el S. aureus. Sin embargo, proporcionalmente, las bacterias gram-positivas se cultivaron con más frecuencia en los controles sanos y las gram-negativas en los 5. Resultados 77 pacientes con VRS (p=0,01). M. catarrhalis y H. influenzae se agrupan en este trabajo bajo la denominación de “bacterias gram-negativas”, mientras que S. aureus, S. pneumoniae y Streptococcus del grupo B están agrupadas bajo la denominación de “bacterias gram-positivas” (Figs. 26 y 27). En los pacientes con VRS, tras la colonización por S. aureus, las bacterias cultivadas con más frecuencia fueron M. catarrhalis, S. pneumoniae e H. influenzae no tipificable, mientras que en los controles sanos fueron S. aureus y S. pneumoniae (Figs. 26 y 27). En pacientes con VRS, Streptococcus del grupo B se identificó en dos ocasiones, una vez de forma aislada, como único potencial patógeno, y otra en combinación con S. aureus y S. pneumoniae. Streptococcus pyogenes sólo se cultivó en una muestra nasofaríngea, en combinación con S. aureus y M. catarrhalis, también en un lactante con VRS. En los controles sanos no se aisló ningún Streptococcus del grupo B o S. pyogenes. Figura 26. Tipo y porcentaje de bacterias colonizadoras de la nasofaringe en niños hospitalizados por bronquiolitis por VRS y controles sanos. SGB: Streptococcus del grupo B. Los gráficos circulares representan el porcentaje de bacterias potencialmente patógenas gramnegativas (M. catarrhalis y H. influenzae no tipificable), gram-positivas (S. aureus, S. pneumoniae y Streptococcus del grupo B), así como el porcentaje de aislamientos con 2 o más bacterias potencialmente patógenas y flora respiratoria comensal en frotis nasofaríngeos de niños hospitalizados con bronquiolitis por VRS (A) y niños sanos (B). Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 78 Figura 27. Proporción de bacterias potencialmente patógenas gram-negativas (BGN) y gram-positivas (BGP), en frotis con una sola bacteria identificada, en pacientes con bronquiolitis por VRS y controles sanos. Para el análisis se utilizó el test exacto de Fisher. El aislamiento de 2 o más bacterias potencialmente patógenas en el frotis nasofaríngeo se documentó en 23 pacientes con bronquiolitis por VRS y en un control sano (Fig. 26). En 18 pacientes se halló una doble colonización, siendo la mayoría (80%) combinaciones de una bacteria gram-negativa (M. catarrhalis o H. influenzae no tipificable) y una bacteria gram-positiva (S. aureus o S. pneumoniae): M. catarrhalis con S. pneumoniae (n=5) o S. aureus (n=3), seguido de H. influenzae no tipificable con S. aureus (n=5) o S. pneumoniae (n=2). Dos pacientes estaban colonizados por 2 bacterias gram-negativas y uno con 2 bacterias gram-positivas. En los 5 pacientes restantes, la colonización nasofaríngea fue triple, y la combinación más frecuente incluía dos bacterias gram-negativas y una gram-positiva. La única combinación identificada en los controles sanos fue H. influenzae no tipificable y S. pneumoniae (Tabla 7). 5. Resultados 79 Tabla 7. Combinaciones de bacterias potencialmente patógenas en frotis nasofaríngeos polibacterianos de niños ingresados por bronquiolitis por VRS y controles sanos. HiNT: Haemophilus influenzae no tipificable; M. cat: Moraxella catarrhalis; SPN: Streptococcus pneumoniae; SA: Staphylococcus aureus; SGA: Streptococcus del grupo A; SGB: Streptococcus del grupo B. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. En relación a la densidad bacteriana, la mayoría de los pacientes con bronquiolitis por VRS colonizados por una sola bacteria (gram-negativa o grampositiva) presentaron un crecimiento bacteriano identificado como moderado o abundante medido por UFC por placa (73% BGN; 75% BGP). Combinaciones de BPP Niños con bronquiolitis por VRS (n=23) HiNT + M. cat HiNT + SPN SPN + SA M. cat + SA M. cat + SPN HiNT + SA SA + M. cat + SGA SGB + SPN + SA SPN + SA + M. cat HiNT + SPN + SA HiNT + M. cat + SPN= 9 2 (8,7) 2 (8,7) 1 (4,3) 3 (13) 5 (21,7) 5 (21,7) 1 (4,3) 1 (4,3) 1 (4,3) 1 (4,3) 1 (4,3) Controles sanos (n=1) HiNT + SPN Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 80 5.4.2. Características de la bronquiolitis por VRS y evolución clínica de la enfermedad en los niños colonizados por bacterias potencialmente patógenas Posteriormente estudiamos si el tipo de bacteria presente en la nasofaringe de los niños con bronquiolitis por VRS influía en la gravedad de la enfermedad. Como hemos comentado anteriormente, todos los análisis se realizaron en el grupo de pacientes que no había recibido antibióticos antes de la recogida de las muestras (n=72). Para ello, se compararon los pacientes con bronquiolitis colonizados por bacterias pertenecientes a la flora respiratoria comensal con aquellos colonizados por bacterias potencialmente patógenas, y éste último grupo de pacientes lo dividimos a su vez en 3 subgrupos, dependiendo del tipo de bacteria aislado en los frotis nasofaríngeos: bacterias gram-negativas (H. influenzae no tipificable o M. catarrhalis); bacterias gram-positivas (S. pneumoniae, S. aureus o Streptococcus del grupo B) o polibacteriano (aislamiento de más de una bacteria) (Fig. 28). Figura 28. Tipo de bacterias identificadas en los frotis nasofaríngeos de los pacientes hospitalizados con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras. FN: frotis nasofaríngeo; BPP: bacterias potencialmente patógenas; BGN: aislamiento de 1 bacteria gramnegativa; BGP: aislamiento de 1 bacteria gram-positiva; ≥2 BPP: aislamiento de 2 o más bacterias potencialmente patógenas. 5. Resultados 81 5.4.2.1. Características demográficas Las características epidemiológicas y demográficas de los 72 niños con infección por VRS, dependiendo de la presencia y tipo de colonización bacteriana, fueron similares, exceptuando que el grupo de pacientes colonizados por al menos una bacteria potencialmente patógena asistían con más frecuencia a la guardería o tenían contacto con hermanos en edad escolar en mayor proporción que los colonizados por flora respiratoria (Tabla 8). Flora Resp.1,2 (n=14) Al menos 1 BPP1 (n=58) BGN2 (n=15) BGP2 (n=20) ≥2 PPB2 (n=23) Valor p1 Valor p2 Edad (meses) 1,8 [1,2-2,8] 2,8 [1,5-4,0] 3,3 [1,8-6,3] 2,2 [1,3-3,7] 2,9 [1,3-4,0] 0,137 0,179 Sexo [n (%)] Varón Mujer 9 (64) 5 (36) 36 (62) 22 (38) 9 (60) 6 (40) 12 (60) 8 (40) 15 (65) 8 (35) 1,000 0,980 Raza [n (%)] Blanca Negra Otro 9 (64) 2 (14) 3 (22) 37 (64) 12 (21) 9 (15) 9 (60) 4 (27) 2 (13) 14 (70) 3 (15) 3 (15) 14 (61) 5 (22) 4 (17) 0,474 0,967 Edad gestacional (semanas) 39 [37-40] 40 [38-40] 40 [38-40] 40 [38-40] 39 [37-40] 0,624 0,584 Lactancia materna* 3/14 (21) 18/56 (32) 3/11 (27) 7/17 (41) 6/17 (35) 0,529 0,666 Estado vacunal [n (%)] Completo Incompleto Desconocido 10 (72) 3 (21) 1 (7) 49 (85) 3 (5) 6 (10) 13 (87) -- 2 (13) 15 (75) 3 (15) 2 (10) 21 (91) -- 2 (9) 0,140 0,235 Tabaquismo pasivo* 7/10 (70) 21/44 (47) 7/13 (54) 6/14 (43) 8/17 (47) 0,297 0,582 Asistencia a guardería o hermanos en edad escolar* 7/12 (58) 46/54 (85) 11/15 (73) 17/19 (90) 18/20 (90) 0,049 0,097 Tabla 8. Características demográficas de los niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%]. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. Flora Resp: flora respiratoria comensal. BPP: bacterias potencialmente Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 88 En relación al tipo de VRS causante de la bronquiolitis aguda (A, B o A+B), encontramos que el tipo A fue el más frecuente en todos los grupos de estudio. Las cargas virales no fueron significativamente diferentes entre los distintos grupos (Tabla 11). 5.4.2.4. Hallazgos radiológicos En el 88% (51/58) de los niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas se obtuvo una radiografía de tórax al ingreso, en comparación con los niños colonizados por flora respiratoria (7/14, 50%; p=0,003). Aunque no hubo diferencias significativas en los patrones radiológicos de ambos grupos, se observó hasta un 10% (5/51) de consolidación lobar en el grupo colonizado por al menos una bacteria potencialmente patógena y ningún caso en el grupo colonizado por flora respiratoria (Tabla 12). Flora Resp.1,2 (n=14) Al menos 1 BPP1 (n=58) BGN2 (n=15) BGP2 (n=20) ≥2 PPB2 (n=23) Valor p1 Valor p2 Realización Rx tórax [n (%)] 7 (50) 51 (88) 13 (87) 19 (95) 19 (83) 0,003 0,015 Patrón radiológico [n (%)] Normal EPB o hiperinsuflación Atelectasia Consolidación lobar -- 4 (57) 3 (43) -- 3 (6) 28 (55) 15 (29) 5 (10) 1 (8) 7 (54) 3 (23) 2 (15) 1 (5) 11 (58) 6 (32) 1 (5) 1 (5) 10 (53) 6 (32) 2 (10) 0,691 0,972 Tabla 12. Características radiológicas en los niños con bronquiolitis por VRS que no recibieron antibióticos antes de la recogida de las muestras, según estuvieran colonizados o no por bacterias potencialmente patógenas. Rx: radiografía. EPB: engrosamiento peribronquial. Flora Resp: flora respiratoria normal. BPP: bacterias potencialmente patógenas. BGP: bacterias gram-positivas (S. pneumoniae, S. aureus y Streptococcus grupo B). BGN: bacterias gram-negativas (M. catarrhalis y H. influenzae no tipificable). Para el análisis se utilizó el test de Chi-cuadrado. p (1): comparación entre pacientes colonizados por flora respiratoria y al menos 1 BPP; p (2): comparación entre pacientes colonizados por flora respiratoria, BGN, BGP y ≥2 BPP. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. 5. Resultados 89 También se observó que, en el grupo de niños colonizados por al menos una bacteria potencialmente patógena, los patrones radiológicos de atelectasia o consolidación lobar se asociaron significativamente con mayores puntuaciones del score clínico de gravedad de la enfermedad (CDSS) (7 [6-8,5] en niños con patrón de atelectasia o consolidación lobar, frente a 4 [2-5] en niños con los otros patrones) (Fig. 32). 0 5 10 15 Normal EPB Hiperinsufl. Atelectasia C. lobar **p<0,001 Puntuación CDSS (n) Figura 32. Puntuación en el score clínico de gravedad de la enfermedad según el patrón radiológico de niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas. EPB: engrosamiento peribronquial. Hiperinsufl: hiperinsuflación. C. lobar: consolidación lobar. En el gráfico de cajas, la línea horizontal dentro de cada caja representa la mediana de los datos y los extremos representan los percentiles 10-90. Para el análisis se utilizó el test de la U de Mann-Whitney. Asimismo, los pacientes colonizados por bacterias potencialmente patógenas con los hallazgos radiológicos de atelectasia o consolidación lobar tendieron a precisar más oxígeno suplementario y durante más tiempo que los pacientes con radiografía normal, engrosamiento peribronquial o hiperinsuflación (Tabla 13). Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 90 Normal, EPB, hiperinsuflación (n=31) Atelectasia o consolidación lobar (n=20) Valor de p Días síntomas previos 4 [3-5] 5 [4-7] 0,034 Fiebre: Presencia [n (%)] Temp. máxima (°C) Duración (días) 22 (71) 38,3 [37,9-38,9] 2 [1-3] 15 (75) 38,3 [37,9-39,1] 2[(1,2-4] 0,995 0,728 0,443 CDSS (n) 4 [2-5] 7 [6-8,5] <0,001 Duración hospitalización (días) 2 [2-3] 2,5 [2-5] 0,137 Oxígeno: Sat O2 basal (%) Necesidad [n (%)] Duración (días) 88 [86-91] 23 (74) 1 [0,3-1,5] 86 [84-88] 19 (95) 1,7 [0,9-3,9] 0,162 0,072 0,083 Tabla 13. Características clínicas y determinantes de gravedad según el patrón radiológico de los niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias potencialmente patógenas. EPB: engrosamiento peribronquial. Hiperinsufl: hiperinsuflación. Temp: temperatura. CDSS: Clinical Disease Severity Score (Score Clínico de Gravedad). Sat O2: saturación de oxígeno. Para el análisis se utilizó el test de Mann-Whitney para variables continuas y el de Chi-cuadrado para el análisis de datos categóricos. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%]. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. 5.5. CITOQUINAS PLASMÁTICAS EN NIÑOS CON BRONQUIOLITIS POR VRS COLONIZADOS POR BACTERIAS POTENCIALMENTE PATÓGENAS Con el fin de determinar si la colonización bacteriana nasofaríngea en pacientes con VRS representaba un fenómeno pasivo o si, por el contrario, inducía respuestas de la inmunidad innata a nivel sistémico, determinamos la concentración plasmática de las citoquinas inflamatorias IL-6, IL-8 y TNF-α en un subgrupo de sujetos de la cohorte principal en los que se obtuvo sangre periférica para dichas mediciones. La muestra, de 44 niños, estaba formada por 34 pacientes con bronquiolitis por VRS (colonizados por flora respiratoria n=7, bacterias gram-negativas n=8 y bacterias gram-positivas n=19) y 10 controles sanos (flora respiratoria n=5, bacterias gram-positivas n=5). 5. Resultados 91 5.5.1. Características demográficas, clínicas y de laboratorio de los niños en los que se realizó análisis de citoquinas Las características demográficas, así como las características radiológicas y clínicas (incluyendo los días de síntomas al ingreso) fueron comparables entre los 4 grupos (Tabla 14). Con respecto a los parámetros de laboratorio, al igual que ocurrió en la cohorte principal de 136 pacientes, los porcentajes de neutrófilos y linfocitos en sangre periférica de los controles sanos fueron significativamente diferentes a los obtenidos en pacientes con infección por VRS. De los 34 pacientes con bronquiolitis, 6 habían recibido antibióticos previamente a la recogida de las muestras (2 en el grupo colonizado por bacterias gram-positivas y 4 en el de niños colonizados por bacterias gram-negativas), por lo que el análisis se realizó con la cohorte total (n=34 pacientes) y también excluyendo a estos pacientes, con resultados similares. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 92 Controles (n=10) Flora resp. (n=7) BGP (n=19) BGN (n=8) Valor p Características demográficas Edad (meses) 5,1 [1,3-7,1] 2,0 [0,9-4,6] 2,3 [1,5-3,6] 2,70 [1,9-11,1] 0,171 Sexo [n (%)] Varón Mujer 7 (70) 3 (30) 4 (57) 3 (43) 12 (63) 7 (37) 4 (50) 4 (50) 0,828 Parámetros de laboratorio y características radiológicas Hemograma (x103/mm3) 8,6 [6,9-9,4] 11,9 [7,2-19] 11,3 [9,2-14,6] 9,9 [7,9-12] 0,234 Neutrófilos % 16,5 [11,5-18,7] 32 [17,2-38,2] 29 [18-34] 30 [30-39] 0,010 Linfocitos % 74 [69,7-77,5] 58 [50-65] 61 [49-67] 54 [46-65] 0,005 Realización Rx tórax [n (%)] NA 4 (57) 18 (95) 6 (75) 0,068 Patrón radiológico [n (%)] EPB o hiperinsuflación Atelectasia o II Consolidación lobar NA 1 (25) 3 (75) -- 10 (55) 7 (39) 1 (6) 3 (50) 3 (50) -- 0,716 Características clínicas Días síntomas previos NA 3 [2-4] 4 [3-5] 3.5 [3-6,7] 0,675 Tratamiento ATB previo [n (%)] -- -- 2 (10) 4 (50) 0,019 CDSS (n) NA 5 [4-7] 4 [3-7] 5,5 [3,2-6,7] 0,988 Unidad ingreso [n (%)] Planta hospitalización UCIP NA 6 (86) 1 (14) 16 (84) 3 (16) 7 (87,5) 1 (12,5) 0,975 Oxígeno: Necesidad [n (%)] Duración (días) NA 6 (86) 2,3 [1,3-3,2] 17 (89) 1,2 [0,3-2,0] 6 (75) 1,5 [0,9-3,1] 0,625 0,271 Duración hospitalización (días) NA 3 [2-5] 2 [2-4.7] 2 [2-3] 0,400 Tabla 14. Características demográficas, clínicas, radiológicas y de laboratorio de los pacientes con bronquiolitis por VRS y controles sanos en los que se realizó análisis de citoquinas. Los datos se expresan como medianas [rango intercuartílico 25%-75%]. Los números entre paréntesis representan el porcentaje de sujetos en cada grupo. Para el análisis se utilizó el test de Kruskal-Wallis para variables continuas y el de Chi-cuadrado para el análisis de datos categóricos. BGP: bacterias gram-positivas (S. pneumoniae, S. aureus y Streptococcus grupo B). BGN: bacterias gram-negativas (M. catarrhalis y H. influenzae no tipificable). Hemograma: leucocitos totales en el hemograma de sangre periférica. EPB: engrosamiento peribronquial. II: infiltrados intersticiales. CDSS: Clinical Disease Severity Score (Score Clínico de Gravedad). 5. Resultados 93 5.5.2. Concentración de citoquinas plasmáticas en relación al tipo de bacteria potencialmente patógena aislada en la nasofaringe Independientemente del tipo de colonización en los controles sanos, las concentraciones de IL-6, IL-8 y TNF-α estuvieron consistentemente por debajo del límite de detección del ensayo. Sin embargo, en lactantes con bronquiolitis por VRS, las concentraciones plasmáticas de IL-6 e IL-8 fueron significativamente mayores sólo en aquellos colonizados por bacterias gram-negativas, y además este efecto se demostró incluso tras excluir a los pacientes que habían recibido antibióticos. En relación a las concentraciones plasmáticas de TNF-α, no hubo diferencias significativas entre los grupos (Fig. 33). Figura 33. Concentraciones de citoquinas en plasma de acuerdo con el tipo de colonización bacteriana de la nasofaringe. Las concentraciones plasmáticas de IL-6 (A&D), IL-8 (B&E) y TNFα (C&F) se midieron en un subconjunto de controles sanos (Ctrl, n=10, color gris claro) y niños con bronquiolitis por VRS colonizados por flora respiratoria (Resp. F; n=7, blanco), bacterias gram-positivas (GPB; n=19, gris oscuro) y bacterias gram-negativas (GNB, n=8, negro). El panel superior (A-C) representa las concentraciones de citoquinas en todos los niños, independientemente de la utilización de antibióticos, y el panel inferior (D-F) el subconjunto de los niños que no recibieron antibióticos. Los gráficos de barras representan la media ± SD. Las comparaciones se realizaron con el test de análisis de la varianza (ANOVA) ajustado con el Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 94 test de Dunnett para comparaciones múltiples. Los asteriscos indican el grupo (GNB) que es significativamente diferente en relación con los controles (p<0,05). No se encontraron diferencias significativas entre los niños colonizados por flora respiratoria o bacterias grampositivas y los controles sanos. 5.5.3. Relación citoquinas-densidad bacteriana nasofaríngea Para determinar si había un efecto dosis-respuesta entre la densidad bacteriana y las concentraciones de citoquinas en plasma en el subgrupo de pacientes en los que se midieron citoquinas, analizamos las diferencias de IL-6 e IL-8 en plasma en base a la densidad bacteriana. De los 27 niños con bronquiolitis por VRS colonizados por bacterias gram-positivas (n=19) o bacterias gram-negativas (n=8), el 26% (7/27) presentaron una densidad bacteriana definida como escasa o poca y el 74% (20/27) una densidad moderada o abundante. Por otra parte, 5 de los 10 controles sanos analizados presentaron un cultivo positivo para bacterias potencialmente patógenas, y en todos ellos se identificó un crecimiento bacteriano moderado o abundante. Se observó que la mayor carga bacteriana nasofaríngea se asoció con un aumento de las concentraciones plasmáticas de IL-6 e IL-8 sólo en pacientes con infección por VRS colonizados por bacterias gram-negativas o bacterias gram-positivas, pero no en los controles sanos (Fig. 34). Este efecto también se demostró al excluir a los pacientes que recibieron antibióticos. No se observó ningún efecto de la carga bacteriana en las concentraciones de TNF-α en ninguno de los grupos de estudio. 5. Resultados 95 Figura 34. Concentraciones plasmáticas de IL-6 e IL-8 de acuerdo con la densidad nasofaríngea de bacterias potencialmente patógenas. Las barras blancas representan las concentraciones de citoquinas en los controles sanos (Ctrls), las barras de color gris claro representan las concentraciones plasmáticas de IL-6 y las barras de color gris oscuro las de IL-8 para aquellos pacientes con infección por VRS (RSV+) en los que se aisló una bacteria gramnegativa o gram-positiva con crecimiento de escasas o pocas colonias bacterianas (representado como +/++) y moderadas o abundantes (representado como ++++). Los gráficos de barras representan la media ± SD. Las comparaciones se realizaron con el test de ANOVA para IL-6 e IL-8 por separado. Los asteriscos indican diferencias significativas entre el crecimiento moderado/abundante en los pacientes con bronquiolitis y los controles sanos (IL6; p=0,01 e IL-8; p=0,003). 5.5.4. Relación citoquinas-gravedad de la bronquiolitis por VRS Por último, las concentraciones plasmáticas de citoquinas no se asociaron a los parámetros de la gravedad de la bronquiolitis en este subgrupo de 34 pacientes estudiados; sin embargo, las concentraciones de IL-6 se correlacionaron positivamente con la duración del tratamiento con oxígeno suplementario (r=0,68; p=0,04), sólo en los niños con infección por VRS colonizados por bacterias gram-negativas. CAPÍTULO 6. DISCUSIÓN Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 104 mostraron que los lactantes intubados con infección por el VRS presentaban significativamente más cultivos endotraqueales positivos que aquellos no infectados por el VRS (80% vs 50%, respectivamente; p=0,03) (datos no publicados). Asimismo, los pacientes (VRS positivo y VRS negativo) con cultivos endotraqueales positivos tenían una estancia en UCIP más prolongada (7,5 vs 6 días, p=0,02) y un aumento de la estancia hospitalaria total (12 vs 9 días, p=0,058) en comparación con aquellos con cultivos negativos (Fig. 36). Haemophilus spp. y/o Moraxella spp. (54%) y S. pneumoniae (19%) fueron los patógenos bacterianos cultivados con más frecuencia. Todos estos datos parecen indicar que las bacterias potencialmente patógenas presentes en el tracto respiratorio inferior de los pacientes intubados con bronquiolitis por VRS podrían contribuir a la gravedad de su enfermedad respiratoria. Figura 36. Cultivos de tubo endotraqueal y duración de la hospitalización en niños con bronquiolitis ingresados en la UCIP de Nationwide Children´s Hospital (2009–10). Modificado de Mella et al.310 Por otra parte, se sabe que, en general, la infección bacteriana más frecuente en el lactante con bronquiolitis es la otitis media aguda (OMA).311-313 Aunque los virus por sí solos pueden causar OMA,281,314 parece, sin embargo, que no todos los virus predisponen de la misma manera a esta enfermedad.311,315 En concreto, el VRS es el virus más frecuentemente asociado a OMA,311,315-318 a la que parece contribuir de 6. Discusión 105 forma independiente,281 y ha demostrado ser un co-patógeno fundamental en el desarrollo de esta enfermedad.35,319 La infección viral en la nasofaringe ocasiona disfunción de la trompa de Eustaquio, lo que conlleva a una reducción de la presión en el oído medio, forzando a las bacterias que colonizan la nasofaringe a adentrarse en el oído medio.207,319,320 Por tanto, el riesgo de OMA varía también en función del número y tipo de bacterias potencialmente patógenas asociadas a OMA (S. pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis) que colonizan la nasofaringe.15,316 Se estima que el 50-70% de los lactantes desarrollan OMA durante la bronquiolitis por VRS o poco después, siendo S. pneumoniae y H. influenzae, seguidas por M. catarrhalis y S. aureus, las bacterias más frecuentemente identificadas.312,313,321-325 Además, se observa que durante los episodios de OMA, las tasas de colonización nasofaríngea y la densidad bacterianas aumentan.15,218,222,281,326-328 Por tanto, si en el contexto de la infección por VRS los episodios de OMA son frecuentes y probablemente asociados a las bacterias potencialmente patógenas presentes en la nasofaringe, ¿por qué dichas bacterias no podrían asociarse también a infecciones del tracto respiratorio inferior? Esta fue una de nuestras preguntas principales y motivo por el que decidimos realizar el estudio presentado. 6.3. EL TRATAMIENTO CON ANTIBIÓTICOS ES FRECUENTE Y MODIFICA SIGNIFICATIVAMENTE LOS PATRONES DE COLONIZACIÓN NASOFARÍNGEA EN NIÑOS MENORES DE 2 AÑOS CON BRONQUIOLITIS POR VRS Numerosos estudios documentan la alta frecuencia de administración de antibióticos en la bronquiolitis y específicamente en la infección por el VRS.32,152,329,330 El porcentaje de niños con bronquiolitis que reciben antibióticos oscila entre 10% y el 50%,331-339 dependiendo de la población de estudio (Servicio de Urgencias vs. pacientes hospitalizados), siendo estas tasas aún mayores en pacientes ingresados en las Unidades de Cuidados Intensivos Pediátricos o Neonatales.32 Nuestros resultados se encuentran en consonancia con estos datos, ya que observamos que el 47% de los pacientes había recibido al menos una dosis de antibiótico antes de su inclusión en el estudio. Además, la administración de antibioterapia fue significativamente mayor en la UCIP, donde el 75% de los niños había recibido antibióticos en comparación con el Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 106 38,5% de los que fueron ingresados en la planta. Varios ensayos clínicos controlados aleatorizados han demostrado que la antibioterapia de rutina no aporta ningún beneficio a los niños con bronquiolitis, sobre todo en aquellos con infección por VRS no complicada.340-343 El principal problema de estos estudios es que se trataron todos los pacientes por igual, sin tener en cuenta el tipo de patógeno que potencialmente podría asociarse a enfermedad más grave o si había indicios de coinfeccción bacteriana. Se necesitan estudios dirigidos con la ayuda de otros biomarcadores para poder identificar si es necesario el uso de antibióticos y si es así que subgrupo de pacientes se podría beneficiar de los mismos. En el año 2006 la Academia Americana de Pediatría (AAP)296 publicó unas guías para el diagnóstico y manejo de la bronquiolitis aguda en las que establecía que “la antibioterapia sólo debe usarse en niños con bronquiolitis que tienen indicaciones específicas de la coexistencia de una infección bacteriana”. En los años posteriores a la publicación de este documento se han realizado estudios observacionales para evaluar el impacto de estas guías y de otros documentos de consenso en el diagnóstico y tratamiento de la bronquiolitis. Estos estudios han mostrado diferencias importantes en los periodos pre y post implementación de las guías; específicamente, tras la implementación de la guías se ha objetivado una disminución de la realización de radiografías de tórax,333-335,338,339,344 de la administración de broncodilatadores (salbutamol/albuterol y adrenalina)333,335,339,344,345 y de corticoides.333-335,339,344 Sin embargo, en general, no se observó una disminución de la administración de antibióticos.333-337,339,346 Más recientemente, la AAP60 ha publicado una actualización de estas guías, cuyas directrices sugieren que los antibióticos deben usarse sólo en los casos de bronquiolitis con coinfección bacteriana documentada por pruebas de cultivo o técnicas moleculares de diagnóstico,347 y en niños con bronquiolitis grave ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos que requieran intubación y ventilación mecánica por fallo respiratorio.306,309,330 Sin embargo, a pesar de estas recomendaciones, los antibióticos se siguen usando en exceso, y los motivos más habituales por los que los lactantes con bronquiolitis reciben tratamiento antibiótico son la presencia de fiebre, la menor edad, el aspecto “tóxico” y la preocupación de los médicos acerca de que no se esté detectando una infección bacteriana secundaria.32,60,152,334,348 Otra de las 6. Discusión 107 recomendaciones de la AAP, muy relacionada con la administración de antibióticos, es que en el momento actual no se aconseja la realización rutinaria de radiografías de tórax en el manejo de la bronquiolitis, debido a su escasa utilidad en el diagnóstico etiológico de la infección del tracto respiratorio inferior y porque se ha comprobado que los niños a los que se les realiza una radiografía de tórax tienen más probabilidad de recibir tratamiento antibiótico.60 En base a la evidencia científica actual, la radiografía inicial debe reservarse para los casos con dificultad respiratoria grave que precisen ingreso en la UCIP o cuando exista una complicación de las vías respiratorias (p.ej. neumotórax).60 Aun así, los datos demuestran que se sigue realizando radiografía de tórax a aproximadamente el 50% de los niños con bronquiolitis.349 Nuestros resultados denotan esta alta frecuencia de estudios radiológicos, ya que en todos los lactantes ingresados en la UCIP y en el 78% de los ingresados en la planta de hospitalización se realizó una radiografía de tórax. Además, en nuestro estudio, los pacientes que recibieron tratamiento antibiótico presentaban más frecuentemente el hallazgo de consolidación lobar que los que no fueron tratados con antibióticos, además de precisar oxigenoterapia durante más tiempo. Estos resultados sugieren, al menos en el estudio que realizamos, que los pacientes que recibieron antibióticos podrían representar de alguna manera un fenotipo más grave de la enfermedad. Con respecto al efecto de los antibióticos sobre la colonización nasofaríngea, observamos que sólo se aislaron bacterias potencialmente patógenas en el 30% de los niños que recibieron tratamiento antibiótico, en comparación con hasta el 81% de los que no lo hicieron (p<0,001). Además, observamos que el tratamiento antibiótico previo a la recogida de los frotis nasofaríngeos reducía significativamente no sólo nuestra capacidad para detectar bacterias potencialmente patógenas (OR 9,8) sino también la densidad (OR 3,4) de las mismas en el cultivo bacteriano convencional. Nuestros hallazgos coinciden con Deng et al,237 quienes señalaron recientemente que la administración de antibióticos disminuía considerablemente la capacidad de aislamiento en los cultivos bacterianos. Además, diversos autores han observado que los antibióticos alteran la microbiota habitual de la nasofaringe, tanto a nivel cuantitativo como cualitativo, aumentando la susceptibilidad de colonización e infección por potenciales patógenos respiratorios.350-352 También se ha demostrado Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 108 que la administración de antibióticos disminuye la colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas, si bien es cierto que esta disminución suele ser incompleta y de corta duración.206,207,271,353-358 Este efecto reductor de la colonización se observa desde los primeros días de tratamiento,359,360 incluso tras recibir una única dosis de antibióticos.361 Además, durante el tratamiento antibiótico o poco después del mismo se produce un rápido reemplazo de cepas, ya sea por sobrecrecimiento de las poblaciones más resistentes que estaban enmascaradas por las poblaciones sensibles o por la adquisición de nuevas cepas.206,353,355,359,362 Debido a que un alto porcentaje de pacientes en nuestra cohorte (47%) recibió tratamiento antibiotico previo y por tanto no pudimos evaluar en esos pacientes el impacto de la colonización bacteriana en relación a los parámetros clínicos o de laboratorio, realizamos los análisis de gravedad y respuesta inflamatoria local y sistémica en el subgrupo de lactantes que no habían estado expuestos a antibióticos desde la semana anterior al momento de la recogida de las muestras. 6.4. COLONIZACIÓN BACTERIANA NASOFARÍNGEA EN LACTANTES INFECTADOS POR EL VRS Y OTROS VIRUS RESPIRATORIOS En general, se sabe que en la infancia la colonización nasofaríngea por potenciales patógenos respiratorios es amplia, entre los que destacan S. aureus, S. pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis por su implicación en las infecciones respiratorias de la infancia.11-13,202,209,363 Además, la colonización por múltiples especies es frecuente en la edad pediátrica.206 En nuestro estudio encontramos que los lactantes previamente sanos ingresados por un primer episodio de bronquiolitis por VRS estaban colonizados más frecuentemente por bacterias potencialmente patógenas que los controles sanos (81% vs 65%, respectivamente) y presentaban una mayor proporción de colonización por más de una bacteria potencialmente patógena (32% vs 4%; p=0,023). Asimismo, observamos que las diferencias de colonización entre los lactantes infectados por el VRS y los controles sanos no eran sólo cuantitativas, sino también cualitativas. Aunque S. aureus fue la bacteria identificada de forma aislada en más ocasiones en ambos grupos, los pacientes con bronquiolitis por VRS estaban 6. Discusión 109 colonizados con una mayor proporción de bacterias gram-negativas (H. influenzae no tipificable y M. catarrhalis) en comparación con los controles sanos (43% vs 7%, respectivamente), los cuales estaban más frecuentemente colonizados por bacterias gram-positivas (S. aureus, S. pneumoniae y Streptococcus del grupo B) (57% en pacientes VRS vs 93% en controles sanos; p=0,01). Puesto que tanto los pacientes como los controles eran previamente sanos sin patología de base y sus características epidemiológicas y socio-económicas eran similares, estos datos nos inducen a pensar si el VRS podría favorecer de alguna manera la virulencia de ciertas especies bacterianas en la nasofaringe de los niños infectados. Se ha demostrado, tanto in vitro como in vivo en modelos animales, que los virus ocasionan una alteración del epitelio respiratorio, aumentando la adherencia bacteriana y facilitando una posterior sobreinfección bacteriana.206,225,246,247,257 Además, numerosos estudios realizados en niños muestran que la colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas aumenta significativamente durante las infecciones virales del tracto respiratorio superior.15,23,222,235,238,364-366 En otros trabajos, las infecciones respiratorias víricas agudas también se han relacionado con un aumento de la densidad bacteriana238,367 y de la colonización por múltiples bacterias o serotipos de la misma especie,364,368 tal y como observamos en nuestro estudio. El riesgo de colonización por S. pneumoniae, H. influenzae y M. catarrhalis parece incrementar en presencia de determinados virus,13,238,239 lo que sugiere que existen interacciones específicas virus-bacteria.22,198,226,240 En el modelo de chinchilla, la infección por VRS se ha relacionado con un aumento de colonización por H. influenzae no tipificable de hasta 100 veces en el tracto respiratorio superior,247 y en el modelo murino con una disminución de la eliminación de S. pneumoniae en el tejido pulmonar de ratones, con el consiguiente aumento de invasividad, gravedad de la enfermedad pulmonar, pérdida de peso y mayor mortalidad.224,260,261 En humanos, quizá el ejemplo más estudiado ha sido la asociación del virus influenza con un riesgo aumentado de colonización por S. aureus y, sobre todo, por S. pneumoniae evidenciado clínicamente durante las epidemias y pandemias de la Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 110 gripe.13,241-243,245,369,370 Otros autores, como Ampofo et al264 o Weinberger et al,269 han destacado la contribución del VRS a la patogenia de la infección invasiva por S. pneumoniae en niños, con especial interés en la neumonía. De hecho, estos y otros estudios epidemiológicos han demostrado una asociación entre el pico de actividad del VRS y el pico de incidencia de infecciones invasivas por neumococo.264,265,267-269,371,372 Sin embargo, poco se conoce sobre el impacto de la colonización nasofaríngea en la población pediátrica en un momento crucial como el contexto de bronquiolitis aguda, sobre todo en la producida por el VRS, ya que la mayoría de estudios incluyen niños mayores de 2 años de edad, lo que no refleja con exactitud el pico de edad y la principal población diana de la infección grave por el VRS. En un estudio realizado en China en niños menores de 30 meses, se observó que los niños con bronquiolitis aguda estaban colonizados por al menos una bacteria potencialmente patógena en un 56% de los casos.19 Resultados muy similares fueron encontrados por Jartti y colaboradores18 en niños menores de 3 años evaluados con un primer episodio de sibilancias producidas por virus, donde se documentó que hasta el 60% de los pacientes estaban colonizados por bacterias potencialmente patógenas, con proporciones de 31% para M. catarrhalis, 25% para S. pneumoniae y 21% para H. influenzae. En una cohorte alemana de niños de 0 a 16 años de edad con infecciones del tracto respiratorio inferior (sibilancias agudas o neumonía) asociadas al VRS en menos del 50% de los casos, también se observaron tasas de colonización bacteriana nasofaríngea alrededor del 66%.17 Las tasas de colonización de nuestro estudio son ligeramente superiores (81%), si bien en estos tres estudios el porcentaje de detección del VRS se encontraba aproximadamente entre el 30-50% de todos los virus identificados. Algunos estudios epidemiológicos han relacionado la infección específica por VRS con un aumento de la colonización bacteriana nasofaríngea. En un estudio publicado en Japón, se observó que el 44% de los niños menores de 5 años ingresados por una infección del tracto respiratorio inferior producida por VRS estaban colonizados por bacterias potencialmente patógenas, siendo las 3 más frecuentes H. influenzae (43,9%), S. pneumoniae (36,6%), and M. catarrhalis (29,3%).278 Dichas tasas de colonización por patógeno respiratorio son bastante similares a las que 6. Discusión 111 encontramos en nuestro estudio (29,3%, 32,7% y 37,9%, respectivamente) (Fig. 37). Hyde y sus colaboradores22 encontraron un aumento de colonización nasofaríngea por H. influenzae y M. catarrhalis en bronquiolitis producidas por VRS o por VRS + rinovirus. Sin embargo, ninguno de los dos trabajos anteriores contaba con un grupo control y el rango de edad estudiado en el primero de ellos era más amplio. En otro estudio realizado en Vietnam en niños menores de 5 años con neumonía, los autores demostraron que la coinfección neumococo-VRS, entre otros virus, aumentaba de forma significativa la densidad bacteriana nasofaríngea, en comparación con los niños sin coinfección viral.367 Resultados similares se encontraron en otro trabajo realizado en Italia,373 donde la neumonía comunitaria de patrón alveolar en niños menores de 5 años con infección por VRS o rinovirus se asoció con una mayor densidad nasofaríngea de S. pneumoniae identificado por técnicas de PCR. Específicamente, estos niños con infección por VRS colonizados por S. pneumoniae y en los que se documentó una neumonía de patrón alveolar presentaban saturaciones de oxígeno más bajas y una tasa de hospitalización mayor que los niños sin este patrón radiológico.373 Por lo tanto, en base a lo que se ha demostrado en estudios previos de investigación básica y en la población pediátrica por otros investigadores, y aunque aún hacen falta estudios mecanísticos que demuestren causalidad, nuestros resultados apoyarían la hipótesis de que, en el contexto de la infección por el VRS, el virus podría facilitar un cambio en el patrón de colonización bacteriana y/o aumentar la virulencia de bacterias potencialmente patógenas en la nasofaringe de los pacientes infectados. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 112 Figura 37. Comparación de las tasas de colonización por tipo de bacteria potencialmente patógena (BPP) en niños con infección del tracto respiratorio inferior por VRS (total de aislamientos de cada bacteria/número de muestras positivas para al menos una BPP). SPN: S. pneumoniae; HI: H. influenzae; MC: M. catarrhalis. Hishiki et al:278 esputo inducido. SuárezArrabal et al:374 frotis nasofaríngeo. 6.4.1. Relación de la colonización bacteriana con la gravedad de la bronquiolitis Los datos sobre el papel de la colonización bacteriana en relación a la gravedad clínica de los niños con bronquiolitis son aún más limitados, en especial los que corresponden a la infección por el VRS. Jartti et al18 demostraron que la colonización bacteriana nasofaríngea (tasa de colonización del 60%, establecida mediante cultivo bacteriano nasofaríngeo positivo) por potenciales patógenos respiratorios (H. influenzae, M. catharralis, y S. pneumoniae) en niños menores de 3 años con un primer episodio de sibilancias se asociaba con una mayor duración de la hospitalización y mayor riesgo de sibilancias recurrentes. En otro trabajo realizado por Yu y sus colaboradores19 en niños menores de 3 años con bronquiolitis (edad media de 7 meses) o sibilancias recurrentes inducidas por virus se observó que las tasas de colonización bacteriana eran elevadas (56% y 82% respectivamente); sin embargo, en este estudio la colonización bacteriana no se asoció a mayor duración de la hospitalización. En ninguno de estos estudios observacionales se tuvo en cuenta la 6. Discusión 113 etiología viral y las poblaciones a estudio eran heterogéneas, lo que hace difícil poder generalizar los resultados. Es por eso que nosotros limitamos la inclusión de niños con bronquiolitis a aquellos con un primer episodio de bronquiolitis por VRS, menores de dos años (mediana de edad 2,5 meses), para definir mejor el impacto de la colonización bacteriana nasofaríngea en la población diana de la infeccción grave por el VRS. En nuestro estudio, aunque el análisis no alcanzó la significación estadística posiblemente por problemas de tamaño muestral, observamos que hasta un 10% de los niños colonizados por al menos una bacteria potencialmente patógena presentaba el hallazgo radiológico de condensación lobar en comparación con ningún caso en el grupo no colonizado por estas bacterias. Tenenbaum y colaboradores17 estudiaron la colonización nasofaríngea de 311 pacientes de entre 0 y 16 años con bronquiolitis o neumonía, y encontraron que aquellos colonizados de forma aislada por H. influenzae, M. catarrhalis o S. pneumoniae eran diagnosticados más frecuentemente de neumonía confirmada por radiología (según los criterios de la OMS)375 que los niños colonizados por S. aureus. Sin embargo, en este trabajo, las infecciones del tracto respiratorio inferior por VRS como único agente viral eran menos del 50%. En nuestro estudio observamos además que los lactantes colonizados por bacterias potencialmente patógenas y con hallazgos radiológicos de atelectasia o condensación alveolar presentaban una enfermedad más grave, definida por una mayor puntuación en el score clínico de gravedad utilizado, además de una tendencia a precisar más oxígeno suplementario y durante más tiempo en comparación con los pacientes que presentaron radiografía de tórax normal, engrosamiento peribronquial o hiperinsuflación. Por último, en nuestro estudio encontramos que los pacientes colonizados específicamente por M. catarrhalis o H. influenzae precisaron oxígeno suplementario durante más tiempo en comparación con aquellos colonizados por S. pneumoniae, S. aureus o Streptococcus del grupo B. Curiosamente, Teo y sus colaboradores, en un reciente estudio sobre el microbioma nasofaríngeo durante el primer año de vida, observaron que los niños con infección del tracto respiratorio inferior producida por VRS que estaban colonizados por M. catarrhalis experimentaban fiebre con mayor Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 120 Figura 38. Perfiles de expresión genómica del huésped: un nuevo enfoque para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. (A) Los diferentes patógenos, al interaccionar de forma específica con los receptores de reconocimiento que se expresan en las células inmunes, desencadenan respuestas inmunitarias específicas y distintas que se pueden medir. (B) Gracias a la tecnología de microarrays, podemos medir las diferencias en los patrones de expresión genómica presentes en las células inmunes de la sangre en respuesta a diversos agentes infecciosos. Los genes que se encuentran activados se muestran en color rojo, y los suprimidos en color azul. Modificado de: Ramilo O y Mejias A.406 En un estudio de Zaas et al403 realizado en un grupo de pacientes con infecciones respiratorias adquiridas en la comunidad, este tipo de tecnología permitió diferenciar con un 100% de precisión a los pacientes con infección por influenza A de los controles sanos, y con un 93% a los pacientes con infecciones respiratorias bacterianas de las virales. Aunque el tamaño muestral fue pequeño, Hu y sus colaboradores402 demostraron que los niños con infección vírica febril presentaban perfiles de expresión genómica diferentes de aquellos niños asintomáticos en los que también se detectaron esos virus. Además, los perfiles transcripcionales consiguieron diferenciar con un 95% de acierto a los niños con fiebre y una infección viral o 6. Discusión 121 bacteriana. Datos más recientes en proceso de publicación han demostrado, por primera vez, en una cohorte de 151 niños menores de 2 años, que los perfiles de expresión genómica en niños asintomáticos en los que se detectó rinovirus fueron completamente diferentes a aquellos identificados en niños del mismo rango de edad pero con enfermedad por rinovirus leve o grave. Por ello, los autores concluyen que las técnicas de estudio del huésped mediante transcriptómica representan una herramienta útil para diferenciar detección de infección.407 Por otra parte, los perfiles de expresión génomica también se han utilizado para generar una puntuación genómica de gravedad (“distancia molecular a la salud”) que permite correlacionar los marcadores clínicos de gravedad con la expresión génomica del huésped de forma objetiva. A este respecto, Mejias et al,127 en una cohorte de 135 niños menores de 2 años con bronquiolitis por VRS, definieron una puntuación de gravedad genómica que se correlacionó significativamente con la puntuación de gravedad clínica, con la duración de la estancia hospitalaria y la duración del tratamiento con oxígeno suplementario. Por tanto, las herramientas que estudian la respuesta del huésped nos proporcionan una valiosa información sobre la respuesta inmune específica que induce cada agente infeccioso y cómo ésta se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. Además, en conjunción con otros métodos microbiológicos, nos permitirían establecer si el patógeno que identificamos en una muestra clínica está produciendo una infección o simplemente es un mero colonizador o espectador. El reto ahora consiste en poder implementar de forma simultánea todas estas herramientas en la práctica clínica para poder dirigir el manejo del paciente de forma más personalizada. 6.6. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Somos conscientes de las limitaciones de nuestro estudio. (A) En primer lugar, un gran porcentaje de niños recibió antibióticos antes de su reclutamiento, lo que disminuyó el aislamiento de bacterias potencialmente patógenas y produjo una disminución del tamaño muestral que limitó algunos de los análisis estadísticos. Además, al excluir a los pacientes expuestos a antibióticos de algunos análisis se podría Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 122 haber introducido un sesgo, ya que, de los pacientes excluidos, muchos pertenecían al grupo ingresado en la UCIP, por lo que no pudimos comparar si los perfiles de colonización bacteriana en lactantes con una enfermedad más grave eran diferentes a los de los pacientes de la planta de hospitalización con enfermedad más leve. Sin embargo, a pesar del relativamente pequeño tamaño muestral de nuestro estudio, analizamos un subconjunto homogéneo de 72 niños no tratados con antibióticos y encontramos que la colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas se asociaba con un aumento del número de células inflamatorias en la mucosa y en el compartimento sistémico, especialmente en aquellos colonizados por bacterias gram-negativas, y también con una mayor gravedad clínica. (B) La identificación bacteriana se realizó por cultivo bacteriano convencional, no por PCR, lo que podría haber disminuido la posibilidad de identificar bacterias potencialmente patógenas así como de medir la densidad de las mismas. Sin embargo, numerosos autores han utilizado los cultivos convencionales para estudiar las poblaciones bacterianas de la nasofaringe,13,17,98,268,281,408 algunos con un rendimiento cercano al 100%.281 Además, las técnicas de secuenciación actuales no distinguen entre bacterias vivas o muertas, lo que también podría introducir un sesgo.409 A este respecto, la identificación mediante cultivo convencional es valiosa porque implica que el paciente tiene una concentración de microorganismos suficientemente alta como para poder detectarse y/o sugiere que existe replicación activa.13,213 Además, aunque la microbiota de la nasofaringe es muy rica y variada y existen bacterias que no crecen en los cultivos convencionales,13 nuestros análisis incluyeron las 4 bacterias patógenas que se consideran más importantes en las infecciones respiratorias de la infancia. (C) Otra limitación de nuestro estudio es que no hemos podido establecer una relación entre la detección de bacterias en el tracto respiratorio superior y el tracto respiratorio inferior, ya que sólo seis pacientes precisaron intubación. Aunque el aislamiento de una bacteria potencialmente patógena en el tracto respiratorio superior no indica que esa misma bacteria se encuentre en el tracto respiratorio inferior,18 varios estudios han demostrado que existe una alta concordancia genotípica de las cepas aisladas en la nasofaringe (mediante lavado nasal o frotis nasofaríngeo) en comparación con aquellas aisladas en el lavado broncoalveolar o esputo.214,410,411 En nuestro estudio, además, encontramos datos indirectos tales como el aumento de marcadores 6. Discusión 123 inflamatorios y patrones radiológicos anormales, los cuales sugieren que la presencia de bacterias potencialmente patógenas en la nasofaringe es más que un fenómeno pasivo. (D) Por último, nuestro estudio analiza la colonización nasofaríngea en un momento determinado, la infección aguda por VRS, por lo que desconocemos si el VRS modificó la composición de las poblaciones bacterianas o si, por el contrario, dichas bacterias ya se encontraban previamente en la nasofaringe, pudiendo determinar una mayor predisposición a la infección por el VRS, aumentando su adhesión o modulando la respuesta inmune para favorecer la infección viral.409 Numerosos estudios han señalado la capacidad de las bacterias presentes en el tracto respiratorio superior para predisponer a infecciones virales e infecciones respiratorias.13,23,208,275-277,409 Por ello creemos que, para esclarecer la secuencia y significación de los eventos observados, serían necesarios estudios longitudinales, con toma de muestras en intervalos de tiempo durante los periodos de salud y enfermedad, además de la caracterización de los perfiles de la respuesta inmune del huésped en dichos hitos temporales. A pesar de estas limitaciones, creemos que nuestro estudio constituye un primer paso para ayudar a entender la complejidad de las interacciones entre las bacterias potencialmente patógenas de la nasofaringe y el VRS en la población más relevante, el lactante pequeño con infección del tracto respiratorio inferior por VRS. Se necesitan estudios longitudinales, con un mayor número de lactantes y representativos del espectro de la enfermedad (casos extrahospitalarios, planta de hospitalización, UCIP) y que utilicen técnicas diagnósticas más sensibles (como la pirosecuenciación o la PCR) en combinación con perfiles de expresión génomica del huésped, para caracterizar en profundidad el papel de la colonización bacteriana nasofaríngea en la evolución clínica de la infección por VRS, lo que podría ayudar a identificar a los pacientes que necesitasen antibioterapia en este contexto y ayudaría al uso racional de antibióticos. CAPÍTULO 7. CONCLUSIONES 7. Conclusiones 127 7.1. CONCLUSIONES Del trabajo realizado y expuesto previamente se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1.- El uso de antibióticos fue frecuente en los lactantes hospitalizados con un primer episodio de bronquiolitis por VRS y se asoció con una menor probabilidad de recuperar bacterias potencialmente patógenas mediante los cultivos convencionales, además de que los pacientes tratados con antibióticos mostraron una mayor gravedad de la enfermedad, definida por parámetros clínicos y hallazgos radiológicos. 2.- Los lactantes hospitalizados con un primer episodio de bronquiolitis por VRS están colonizados por bacterias potencialmente patógenas con más frecuencia y con una mayor proporción de bacterias gram-negativas (H. influenzae no-tipificable y M. catarrhalis) que los controles sanos de edades similares, los cuales mostraban una mayor proporción de bacterias gram-positivas (S. aureus, S. pneumoniae y Streptococcus del grupo B). 3.- La colonización nasofaríngea por bacterias potencialmente patógenas en los lactantes hospitalizados con un primer episodio de bronquiolitis por VRS se asoció con un mayor porcentaje de neutrófilos en sangre periférica y un mayor número de leucocitos en el lavado nasal, especialmente en aquellos colonizados por bacterias gram-negativas. 4.- La colonización nasofaríngea por bacterias gram-negativas en los lactantes hospitalizados con un primer episodio de bronquiolitis por VRS se asoció a una mayor duración de oxígeno suplementario en comparación con la colonización por bacterias gram-positivas. 5.- Los lactantes infectados por el VRS colonizados por bacterias gram-negativas presentaron concentraciones aumentadas de IL-8 e IL-6 en plasma, lo que se correlacionó con mayores necesidades de oxígeno suplementario. Tesis Doctoral. M.C. Suárez Arrabal 128 6.- La densidad bacteriana en la nasofaringe en lactantes con bronquiolitis por VRS se asoció proporcionalmente a las concentraciones plasmáticas de las citoquinas proinflamatorias IL-8 e IL-6, sugiriendo que la colonización bacteriana no es un fenómeno pasivo. CAPÍTULO 8. APLICACIONES PRÁCTICAS