Caracterización de la pared celular de frutos de fresa (Fragaria x ananassa Duch): cambios durante el desarrollo y efectos del silenciamiento de un gen de pectato liasa

Memoria presentada por Nieves Santiago Doménech Nieves Santiago DoménechNieves Santiago Doménech Nieves Santiago Doménech Para optar al grado de Doctora por la Universidad de Málaga Caracterización de la pared celular de frutos de fresa ( Caracterización de la pared celular de frutos de fresa (Caracterización de la pared celular de frutos de fresa ( Caracterización de la pared celular de frutos de fresa ( Fragaria FragariaFragaria Fragaria x x x x ananassa ananassaananassa ananassa Duch DuchDuch Duch. .. .): cambios durante el desarrollo y efectos del ): cambios durante el desarrollo y efectos del ): cambios durante el desarrollo y efectos del ): cambios durante el desarrollo y efectos del silenciamiento de silenciamiento desilenciamiento de silenciamiento de un gen de pectato liasa un gen de pectato liasaun gen de pectato liasa un gen de pectato liasa Directores: Drs. Miguel Ángel Quesada Felice y Antonio Javier Matas Arroyo Departamento de Biología Vegetal Área de Fisiología Vegetal Universidad de Málaga Málaga, 2016 AUTOR: Nieves Santiago Doménech http://orcid.org/0000-0003-2319-1607 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Miguel Ángel Quesada Felice, Catedrático del Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Málaga, y Antonio Javier Matas Arroyo, Investigador “Ramón y Cajal” del Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Málaga INFORMAN: INFORMAN: INFORMAN: INFORMAN: Que, la Licenciada Dª Nieves Santiago Doménech ha realizado bajo nuestra dirección en este Departamento el trabajo titulado “Caracterización de la pared celular de frutos de fresa ( Fragaria x ananassa Duch.): cambios durante el desarrollo y efectos del silenciamiento de un gen de pectato liasa”. La presente memoria recoge los principales resultados obtenidos y se presenta para su defensa pública para aspirar al grado de Doctora Para que conste, y tenga los efectos que correspondan, en cumplimiento de la legislación vigente, extendemos el presente informe autorizando la defensa. En Málaga, a 13 de noviembre de 2015 Dr. Miguel Ángel Quesada Felice Dr. Antonio Javier Matas Arroyo AGRADECIMIENTOS Mucho tiempo ha pasado desde que empecé a trabajar en esta tesis, y por distintas circunstancias se ha ido retrasando, pero al fin está aquí. Son muchas las personas que durante este tiempo he conocido y que de alguna manera me han ayudado y a las que me gustaría agradecer su apoyo y seguramente a alguien se me olvidará nombrar y lo siento. Para empezar me gustaría agradecer a mis directores el ofrecerme esta oportunidad, especialmente a Miguel Ángel Quesada por contar conmigo y ofrecerme la oportunidad de realizar este trabajo, gracias por tu gran ayuda, tu apoyo, tu respaldo y porque no olvidas nunca ese lado más personal. A Antonio Matas porque siempre está dispuesto a ayudar, por ser un pozo de sabiduría con quien siempre se aprende algo, y por ayudarme y enseñarme tantas cosas en esta última etapa. Y como no a José Ángel Mercado, que es parte de este trabajo y aunque por circunstancias no ha podido ser director yo considero que lo es. Gracias José Ángel siempre se puede contar contigo y siempre con buena condición. Muchas gracias a los tres de corazón. A Fernando, quiero agradecer el dejarme practicar el cultivo in vitro con el stock de fresas, a partir de ahí vinieron muchas más oportunidades. Y por contarnos tantas batallitas y proveernos los desayunos. Varias “generaciones” de compañeros estupendos han pasado por el laboratorio desde que empecé en este mundillo. Quiero agradecerle a Lara, amiga desde que despistadas buscábamos a alguien más de vegetal, el que me diera el empujoncillo para venir al departamento, a Gema, Maca, Sabri, Belén, Adolfo y Lourdes con quienes tan buenos momentos he pasado, esta etapa empezó con vosotros y fue muy especial para mí. A Elena, Sara, Sergio, Fatiha, Candelas aunque ya no estáis por aquí, habéis crecido como estupendos científicos y mejores personas, ahí están los resultados; con todos he aprendido algo, gracias por hacer del laboratorio un lugar estupendo donde trabajar y por darme tantos ánimos con la tesis. A Juan Antonio y Rafa que empezamos en Genética y luego coincidimos en Fisio, y con quienes tan buenos momentos he pasado. A Carmen, gracias por esas charlitas rápidas haciendo medio, a ver si es verdad que conseguimos quedar por Málaga… o San Pedro. A las nuevas incorporaciones Isa, Dani, Juan, Pablo y Luis gracias chicos por hacer esto más llevadero y comprenderme estos últimos meses. A José Antonio, Mª Jesús, Bea, Karima, Delia y Caro por compartir el día a día y esos desayunos tan animados. Quiero agradecer especialmente a Lara, Sara, Antonio y Candelas el que me hayan dejado utilizar algunas de sus fotografías y esquemas para ponerlas en la memoria. También a Dani del SCAI por hacerme un hueco en la cámara fría para poder realizar las cromatografías. Al grupo de Eduardo Rodríguez del Departamento de Genética, que me iniciaron en la parte más molecular, especialmente a Gabriel que tanto me enseñó. A Marta gracias por tu apoyo y tus mensajes los fines de semana preguntando qué tal y haber hecho estos últimos meses más llevaderos, los nervios compartidos son menos, ¿verdad? A los vecinos de Fisiología animal: Manolo, Juan, Jesús, Pedro, Marga, Mª Dolores, Silvia, Mar, que con sus risas y su buen humor hacen del trabajo un lugar más agradable. A José Esteban que da mucha alegría cuando viene a vernos, a Mª Dolores por compartir tantos momentos en la facultad y fuera de ella, a Silvia todo alegría y positividad, gracias amiga. A mis compañeros de los laboratorios comunes del Severo Ochoa Emilia, Carlos y Dani y del I+D Ali, Alicia, Carmen, Mª Carmen con quienes tantos ratos he pasado. A Lucía Cruzado, por esas charlas en los pasillos y su ánimo continuado. A mis amigos del parque, que sois mi familia malagueña Paqui, Belén, Mónica, Jose, Francis y Cándido ¡¡vaya panda de amigos tan apañada!! y como no, a mis niños Paula, Samuel, Pablo y Mario. A mis amigas de San Pedro, Luz eres todo un ejemplo de superación, sigue así guapa. A Mª Paz, Esther, Silvia y Cristina por no olvidar un cumple y aunque nos veamos poco siempre os llevo conmigo. Agradecer a mi familia, especialmente a mis padres ya que sin ellos seguramente no me habría dedicado a esto, me han enseñado a no rendirme y a luchar por lo que quiero; gracias por vuestro apoyo incondicional siempre. A mis hermanos Willi, Rocío e Ignacio que sois los mejores y gran apoyo e inspiración, os quiero mucho guapos, a mis sobrinos Isaac, Lola, Mar, Julia y Lorenzo, y a Rafa, Rosa y Sandra. A mi familia ubriqueña Paco, Rocío, Mercedes Mª José y Paco por hacerme sentir parte integrante de esta familia desde el principio y a mis sobrinos Blanca, María, Paco, Cristina, David y Alejandra y a Juan, David y Paco. Por último aunque debería haber empezado por aquí a Irene, mi niña, mi vida y a JoseMa, gracias por estar ahí, comprenderme y quererme. Gracias a todos aquellos que no habéis permitido que olvidara que tenía la tesis pendiente. Gracias!!! FUENTES DE FINANCIACIÓN FUENTES DE FINANCIACIÓNFUENTES DE FINANCIACIÓN FUENTES DE FINANCIACIÓN: :: : El presente trabajo fue parcialmente financiado por los proyectos del Ministerio de Educación y Ciencia y Fondos FEDER EU (AGL2005-08128) y del Ministerio de Economía y Competitividad y Fondos FEDER EU (AGL2014-55784-C2-1-R) además del Plan Propio de la Universidad de Málaga. I Í ÍÍ ÍNDICE NDICENDICE NDICE CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 1 11 1. .. .- -- - Introducción IntroducciónIntroducción Introducción 1 11 1 1.1. 1.1.1.1. 1.1.- -- - Generalidades de la fresa Generalidades de la fresa Generalidades de la fresa Generalidades de la fresa 3 1.2. 1.2.1.2. 1.2.- -- - Importancia del cultivo de Importancia del cultivo de Importancia del cultivo de Importancia del cultivo de fresa fresafresa fresa 4 1.3. 1.3.1.3. 1.3.- -- - Características generales de la planta Características generales de la plantaCaracterísticas generales de la planta Características generales de la planta 5 1.3.1.- Morfología de la planta 5 1.3.2.- Morfología del fruto 8 1.4. 1.4.1.4. 1.4.- -- - Aspectos generales Aspectos generales Aspectos generales Aspectos generales del crecimiento y maduración del fruto de fresa del crecimiento y maduración del fruto de fresa del crecimiento y maduración del fruto de fresa del crecimiento y maduración del fruto de fresa 9 1.5. 1.5.1.5. 1.5.- -- - La La La La p pp pared ared ared ared c cc celular elularelular elular 12 1.5.1.- Composición y estructura de la pared celular primaria 13 1.5.1.1.- Fase microfibrilar 15 1.5.1.2.- Matriz de polisacáridos hemicelulósicos 15 1.5.1.3.- Pectinas 16 1.5.1.4.- Proteínas estructurales 20 1.5.1.5.- Componentes fenólicos 21 1.5.2.- Extracción y análisis de la pared celular en fruto 22 1.5.3.- Papel de la pared celular en los cambios de textura de los frutos 23 1.6. 1.6.1.6. 1.6.- -- - Modificaciones de la Modificaciones de la Modificaciones de la Modificaciones de la p pp pared ared ared ared c cc cel elel elular del fruto de fresa durante la ular del fruto de fresa durante la ular del fruto de fresa durante la ular del fruto de fresa durante la maduración maduraciónmaduración maduración 25 1.7. 1.7.1.7. 1.7.- -- - Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto 28 1.7.1.- Poligalacturonasa (PG) 29 1.7.2.- Pectato liasa (PL) 31 1.7.3.- Pectin metilesterasa (PME) 33 1.7.4.- Endo β 1-4D glucanasa (EGasa) 34 1.7.5.- Expansinas (EXP) 35 1.7.6.- Otros genes de pared 36 1.8. 1.8.1.8. 1.8.- -- - Silenciamiento del gen Silenciamiento del gen Silenciamiento del gen Silenciamiento del gen pectato l pectato lpectato l pectato liasa en fresa iasa en fresa iasa en fresa iasa en fresa 37 CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 2. 2.2. 2.- -- - Objetivos Objetivos Objetivos Objetivos 4 44 41 11 1 II CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 3. 3.3. 3.- -- - Material y métodos Material y métodosMaterial y métodos Material y métodos 45 4545 45 3.1. 3.1.3.1. 3.1.- -- - Material Vegetal Material VegetalMaterial Vegetal Material Vegetal 47 3. 3.3. 3.2. 2.2. 2.- -- - Metodología MetodologíaMetodología Metodología 47 3.2.1.- Extracción de la pared celular 47 3.2.1.1.- Protocolo de extracción de Redgwell 48 3.2.1.2.- Protocolo de Huber 49 3.2.1.3.- Modificación del protocolo de extracción de Huber 51 3.2.2.- Fraccionamiento de la pared celular 53 3.2.3.- Cuantificación de pectinas 55 3.2.4.- Cuantificación de azúcares totales 56 3.2.5.- Cromatografía de filtración en gel 57 3.2.6.- Hinchamiento de la pared celular 58 3.2.7Medida de poliurónidos totales de la pared celular 60 3.2.8.- Medida de antocianinas 60 3.2.9.- Análisis de elementos esenciales 61 3.2.10.- Medida de la dureza de los frutos 62 3.2.11.- Caracterización histológica de frutos de fresa 62 3.2.12.- Análisis estadístico de los datos 63 CAPÍTULO CAPÍTULOCAPÍTULO CAPÍTULO 4. 4.4. 4.- -- - Elecció EleccióElecció Elección y puesta a punto del protocolo de n y puesta a punto del protocolo de n y puesta a punto del protocolo de n y puesta a punto del protocolo de extracción y fraccionamiento de la pared celular extracción y fraccionamiento de la pared celular extracción y fraccionamiento de la pared celular extracción y fraccionamiento de la pared celular 6 66 65 55 5 4.1. 4.1.4.1. 4.1.- -- - Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento 67 4.2. 4.2.4.2. 4.2.- -- -Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos 71 4.3. 4.3.4.3. 4.3.- -- - Contenido de elementos esenciales en las paredes obtenida Contenido de elementos esenciales en las paredes obtenidaContenido de elementos esenciales en las paredes obtenida Contenido de elementos esenciales en las paredes obtenidas s s s 73 4.4. 4.4.4.4. 4.4.- -- - Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular 75 4.4.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y fracción AGUA 76 4.4.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) 79 III 4.5. 4.5.4.5. 4.5.- -- - Muestras de pectinas unidas covalentamente (fracción CARBONATO) Muestras de pectinas unidas covalentamente (fracción CARBONATO)Muestras de pectinas unidas covalentamente (fracción CARBONATO) Muestras de pectinas unidas covalentamente (fracción CARBONATO) 81 4.6. 4.6.4.6. 4.6.- -- - Mejoras ulteriores del protocolo de extracción Mejoras ulteriores del protocolo de extracciónMejoras ulteriores del protocolo de extracción Mejoras ulteriores del protocolo de extracción 84 4.7. 4.7.4.7. 4.7.- -- - Discusión Discusión Discusión Discusión 86 CAPÍTULO CAPÍTULOCAPÍTULO CAPÍTULO 5. 5.5. 5.- -- - Efecto de la maduración en la degradación de las Efecto de la maduración en la degradación de las Efecto de la maduración en la degradación de las Efecto de la maduración en la degradación de las paredes paredesparedes paredes celulares del fruto de fresa celulares del fruto de fresa celulares del fruto de fresa celulares del fruto de fresa 89 8989 89 5 55 5.1. .1..1. .1.- -- - Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento 92 5.2. 5.2.5.2. 5.2.- -- - Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos Cantidad de poliurónidos obtenidos 95 5.2.1.- Medidas de ácidos urónicos 95 5.2.2.- Medidas de azúcares 97 5.3. 5.3.5.3. 5.3.- -- - Elementos esenciales rojo/verde Elementos esenciales rojo/verde Elementos esenciales rojo/verde Elementos esenciales rojo/verde 99 5.4. 5.4.5.4. 5.4.- -- - Hinchamiento Hinchamiento Hinchamiento Hinchamiento in vitro in vitroin vitro in vitro de la pare de la parede la pare de la pared celular d celular d celular d celular 100 5.4.1.- Hinchamiento de la pared durante la maduración 101 5.4.2.- Tratamientos con carbonato, CDTA y calcio 102 5.5. 5.5.5.5. 5.5.- -- - Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular 104 5.5.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y fracción AGUA ) 104 5.5.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) 108 5.5.3.- Perfiles de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO) 110 5.5.4.- Perfiles de hemicelulosa (fracción KOH 4M) 112 5.6. 5.6.5.6. 5.6.- -- - Discusión Discusión Discusión Discusión 114 C CC CAPÍTULO APÍTULOAPÍTULO APÍTULO 6. 6.6. 6.- -- - Efecto de la inhibición por tecnología antisentido Efecto de la inhibición por tecnología antisentido Efecto de la inhibición por tecnología antisentido Efecto de la inhibición por tecnología antisentido de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las pectinas y el reblandecimiento del fruto de fresa pectinas y el reblandecimiento del fruto de fresapectinas y el reblandecimiento del fruto de fresa pectinas y el reblandecimiento del fruto de fresa 119 119119 119 6.1. 6.1.6.1. 6.1.- -- - Introducción Introducción Introducción Introducción 121 IV 6.2. 6.2.6.2. 6.2.- -- - Resultados Resultados Resultados Resultados 124 6.2.1.- Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “más duro” y comparación del estado de maduración de los distintos genotipos estudiados 124 6.2.2.- Extracción y fraccionamiento de la pared celular 126 6.2.3.- Contenido de pectinas y solubilización 128 6.2.4.- Análisis de las fracciones solubles mediante cromatografía de filtración en gel 130 6.2.5.- Análisis de las fracciones unidas a pared celular por cromatografía de filtración en gel 132 6.2.6.- Discusión 139 CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 7 77 7. .. .- -- - Conclusiones Conclusiones Conclusiones Conclusiones 1 11 15 55 53 33 3 CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 8. 8.8. 8.- -- - Bibliografía Bibliografía Bibliografía Bibliografía 1 11 15 55 57 77 7 CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO 9. 9.9. 9.- -- - Anexos Anexos Anexos Anexos 1 11 17 77 79 99 9 CAPÍTULO 1. Introducción IntroducciónIntroducción Introducción Introducción 3 1. 1.1. 1.- -- - Introducción IntroducciónIntroducción Introducción 1. 1.1. 1.1. 1.1. 1.- -- - Generalidades de la fresa Generalidades de la fresaGeneralidades de la fresa Generalidades de la fresa Tanto la fresa cultivada como la silvestre pertenecen al género Fragaria de la familia Rosaceae y son cultivadas por su fruto comestible. El género Fragaria comprende al menos 23 especies (Folta y Davis, 2006), y su número básico de cromosomas es x=7. La fresa cultivada comercialmente o fresón, Fragaria x ananassa Duch. es, en realidad, un híbrido estable octoploide (2n=8x=56) y ha reemplazado a nivel de producción a la especie silvestre, Fragaria vesca, por el mayor tamaño de sus frutos. Las especies de fresa de las que deriva, fueron introducidas en Europa en el siglo XVIII. Este híbrido se produjo por un cruzamiento espontáneo en jardín entre dos especies silvestres, también octoploides, de origen americano: Fragaria virginiana y Fragaria chiloensis . Con la llegada a Europa de la fresa de Virginia se obtuvieron nuevas variedades que ganaron en tamaño pero perdieron en sabor. Más tarde la hibridación entre ésta y la variedad chilena produjo plantas con frutos más grandes y sabrosos. El híbrido Fragaria x ananassa Duch. es hermafrodita y presenta un alto grado de heterocigocidad. Estas características, junto a la posibilidad de cruzamiento entre sus distintas variedades, han facilitado la mejora de caracteres de interés agronómico tales como la productividad, precocidad y el tamaño de fruto (Senanayake y Bringurst, 1967), permitiendo mediante mejora genética tradicional la aparición de numerosos cultivares adaptados a un amplio rango de condiciones ambientales posibilitando que la fresa se cultive a nivel mundial. El fruto de fresa se consume como fruto fresco o como producto procesado en mermeladas y zumos. Las fresas y los fresones no son un elemento esencial de la dieta. Son frutas que aportan pocas calorías y cuyo componente más abundante, después del agua, son los hidratos de carbono (fructosa, glucosa y xilitol), destacando también por el aporte de fibra, como fuente de vitamina C, mayor que la de los cítricos, Capítulo 1 4 ácido elágico y flavonoides, compuestos de gran interés por sus propiedades anticarcinogénicas y preventivas de enfermedades cardiovasculares (Hannum, 2004). Al ser un fruto estacional que marca el comienzo de la primavera y con una disponibilidad limitada, su consumo es más deseable que el de otros frutos a los que se tiene acceso todo el año. Es un fruto muy delicado y con marcado carácter perecedero y hay que cuidar la calidad, aspecto y textura para evitar su depreciación, siendo éste el principal reto para productores y distribuidores. Estas características se encuentran entre los objetivos prioritarios de los programas de mejora de este cultivo (Faedi y col., 2002). 1. 1.1. 1.2. 2.2. 2.- -- - I II Importancia del cultivo de fresa mportancia del cultivo de fresamportancia del cultivo de fresa mportancia del cultivo de fresa La producción mundial de fresa se ha incrementado constantemente desde mediados del siglo pasado. Así, en el periodo 1980-2004, el área cultivada se incrementó un 25% y la producción un 73% (Mercado y col., 2007), y desde esa fecha hasta 2013 la producción ha aumentado un 32%, alcanzando en el año 2013 una producción total de 4,9 millones de toneladas (FAOSTAT, 2013). España, en el año 2013, con un 4% de la producción mundial, es el quinto país productor de fresa tras China (38%), Estados Unidos (17,5%), México (4,9%) y Turquía (4,8%). Según los últimos datos conocidos de 2013, España es el segundo productor europeo de fresa con 312.500 toneladas tras Turquía con 372.498 toneladas, seguido de Polonia con 192.647 y Alemania con casi 155.000 toneladas. Debido a la aparición de nuevos competidores en el cultivo de la fresa, nuestro país está experimentando un retroceso de la superficie cultivada en los últimos años. En el año 2000 había 11.000 hectáreas de fresa cultivadas y en 2014 se han reducido a 8.000 hectáreas (Datos de FAOSTAT consultados en octubre de 2015). Aun así, nuestro país muestra una gran expansión de este cultivo no tanto en términos de superficie como de rendimiento, encontrándose como el tercer país a nivel mundial, después de EEUU y México. Introducción 5 La provincia de Huelva aporta más del 90% de la producción nacional. Desde un punto de vista agronómico, se importó inicialmente tanto la tecnología de cultivo como las variedades desarrolladas en California, principal zona productora de fresa a nivel mundial y también la más activa en cuanto a los programas de mejora para este cultivo (Sjulin, 2003). Esta tecnología se ha ido adaptando a las condiciones bioclimáticas de la zona de Huelva, dando lugar a un sistema de cultivo característico y a un tipo de fruto de gran tamaño que es emblemático en el mercado europeo. La producción de fresa en España se encuentra, como hemos mencionado, principalmente en los campos de la provincia de Huelva, donde ocupa unas 7.000 hectáreas en régimen de monocultivo. Menor importancia, pese a su mayor tradición, tienen los cultivos de la Comunidad Valenciana y otros dispersos por España (Castilla y León, Galicia y Cataluña) (Tello-Marquina, 1996; Bartual y col., 2006). El 80% de la producción española se dedica a exportación, siendo nuestro país el principal abastecedor de fresa en el mercado Europeo durante los meses de invierno. Solamente el 17% de la producción nacional es destinada a su transformación y procesado (Olías y col., 1995). Aunque se carece de estudios detallados, se estima que entre el 5-30% de la producción de fresa para consumo se pierde debido a contaminación fúngica y/o deterioro del producto durante la postcosecha. El rápido deterioro y putrefacción que sufren los frutos es debido, en buena medida, al proceso de reblandecimiento asociado a la maduración. Por ello, la búsqueda de métodos para alargar la vida postcosecha y mejorar la textura del fruto es prioritaria en este cultivo (Faedi y col., 2002; Mercado y col., 2007). 1. 1.1. 1.3. 3.3. 3.- -- - Características generales de la planta Características generales de la plantaCaracterísticas generales de la planta Características generales de la planta 1. 1.1. 1.3.1. 3.1.3.1. 3.1.- -- - Morfología de la planta Morfología de la plantaMorfología de la planta Morfología de la planta La planta de fresa ( Fragaria x ananassa Duch.) es una planta perenne que produce brotes nuevos cada año. Aunque de aspecto herbáceo, es en realidad una Capítulo 1 12 Uno de los factores principales que determinan la calidad de los frutos y, especialmente, la vida media de éstos tras su recolección, es la extensión y rapidez con la que tiene lugar la pérdida de firmeza durante el proceso de maduración. Aunque los cambios de textura mencionados ocurren gradualmente en muchos frutos, el proceso de reblandecimiento tiene lugar muy rápidamente en el caso de la fresa. Está ampliamente aceptado que estos cambios de textura están relacionados principalmente con modificaciones en las características y/o composición de las paredes celulares de los tejidos que componen los frutos (Brummell, 2006; Posé y col., 2012). A continuación se describen la estructura de la pared celular así como su posible relación con los cambios de textura de los frutos. 1. 1.1. 1.5. 5.5. 5.- -- - La p La pLa p La pared ared ared ared c cc celul elulelul elular arar ar La pared celular es un componente celular complejo que, además de ser parte responsable de dar soporte y estructura a los tejidos vegetales, condiciona el crecimiento y desarrollo celular. En general, la forma de las células vegetales viene determinada por su pared celular. Esta estructura funciona como un exoesqueleto, determinando la tasa de crecimiento y su dirección y, por tanto, ejerciendo una profunda influencia en el crecimiento y morfología de la planta. La pared celular está altamente organizada y compuesta por una mezcla compleja y cambiante de diferentes polisacáridos, proteínas y compuestos aromáticos, que son secretados por las células y ensambladas formando una red muy compleja entrelazada por diferentes tipos de enlaces. Estas secreciones se depositan secuencialmente en el exterior celular formando una serie de capas (Brummell, 2006). La pared de las células vegetales está formada por los siguientes componentes estructurales (Buchanan, 2000) (Figura 1.5): . Lámina media Lámina mediaLámina media Lámina media, es la capa más externa de la pared celular y la primera que se origina. Está formada principalmente por pectinas que actúan a modo de capa adhesiva, permitiendo la unión de células entre sí. Introducción 13 . Pared celular primaria Pared celular primariaPared celular primaria Pared celular primaria, presente en todas las células vegetales está formada por una red de microfibrillas de celulosa embebidas en una matriz amorfa constituida por fibrillas de hemicelulosa, pectinas y proteínas estructurales. . Pared celular secundaria, Pared celular secundaria,Pared celular secundaria, Pared celular secundaria, se origina en algunas células especializadas (como las células del xilema) y aparece una vez se ha detenido el crecimiento. A diferencia de la pared primaria contiene, además una alta proporción de celulosa, lignina y/o suberina. MB CIT PC 1aria Célula Célula Célula LM ERP A PC 2aria B LM MB CIT PC 1aria Célula Célula Figura 1.5 Figura 1.5Figura 1.5 Figura 1.5: Esquema de los componentes estructurales de la pared celular. A AA A Pared celular primaria. B BB B Pared celular secundaria. Siendo: LM: Lámina media; ERP: Esquina rica en pectinas; MB CIT: Membrana citoplasmática; PC 1aria: Pared celular primaria; PC 2aria: la pared celular secundaria y Célula: indica el interior celular. En los frutos de fresa, como en la mayoría de los frutos carnosos, la pared celular está constituida por la lámina media y la pared celular primaria, que se describe con más detalle a continuación. 1. 1.1. 1.5.1. 5.1.5.1. 5.1.- -- - Composición Composición Composición Composición y estructura de la pared celular primaria y estructura de la pared celular primariay estructura de la pared celular primaria y estructura de la pared celular primaria La pared celular es un compartimento dinámico que sufre numerosos cambios durante la vida de la célula. En ella se suelen distinguir diferentes componentes en base a distintos criterios, en algunos casos arbitrarios o metodológicos. Desde el punto Capítulo 1 14 de vista de la extracción y en orden de importancia cuantitativa, los polímeros que se obtienen son polímeros pécticos (35% del peso seco), celulosa (30%), hemicelulosa (25%) así como proteínas estructurales (10%). Con menor importancia cuantitativa, pero jugando también un papel estructural importante habría que mencionar la presencia de fenoles esterificados. Por lo general, el componente péctico adquiere una relevancia cuantitativa aún mayor en frutos, pudiendo suponer hasta el 60% del total del peso seco (Redgwell y Fisher, 2001). Fase microfibrilar Fase matriz CELULOSA HEMICELULOSA PECTINAS PROTEINAS ESTRUCTURALES COMPONENTES FENÓLICOS Pared celular primaria A AA A B BB B Figura 1.6 Figura 1.6Figura 1.6 Figura 1.6: :: : Estructura y composición de la pared celular primaria. A AA A: Composición de la pared celular primaria. B: B:B: B: Estructura de la pared celular primaria, situada entre la lámina media y la membrana plasmática. (Fuente: Wikimedia Commons. Obra de dominio público, publicada por LadyofHats). Según Carpita y McCann (2000), la pared celular primaria estaría formada por un esqueleto de celulosa unido por fibrillas de hemicelulosa (xiloglucanos o Introducción 15 glucoarabinoxilanos) adheridos a la superficie de la celulosa mediante puentes de hidrógeno, y todo ello embebido en una matriz de diversos tipos de pectinas y proteínas estructurales (Figura 1.6). Se distinguen dos tipos de pared celular primaria, denominadas Tipo I y Tipo II, en función del tipo de polisacárido que entrecruza las fibrillas de celulosa. El modelo más aceptado de pared primaria Tipo I es el propuesto por Carpita y Gibeaut (1993). Según este modelo, la pared está formada por un esqueleto de microfibrillas de celulosa unidas entre sí a través de xiloglucanos. Este tipo de pared está presente en dicotiledóneas y muchas monocotiledóneas, siendo el modelo de pared aplicable a la mayoría de frutos. En las paredes celulares de Tipo II, típica de la familia Poaceae , los polisacáridos que entrecruzan las fibrillas de celulosa son del tipo glucoarabinoxilanos (Carpita y Gibeaut, 1993; Carpita y McCann, 2000; Redgwel y Fisher, 2002). A continuación se describen con más detalle los componentes estructurales de la pared celular primaria. 1.5.1.1. 1.5.1.1.1.5.1.1. 1.5.1.1.- -- - Fase microfibrilar Fase microfibrilarFase microfibrilar Fase microfibrilar Formada únicamente por microfibrillas de celulosa. Este polímero está formado por cadenas de polisacáridos lineales que contienen unos 8.000 residuos de D-glucosa unidos por enlace β (1→4). Aproximadamente 36 de estas cadenas se unen mediante puentes de hidrógeno para formar una microfibrilla de celulosa (Taylor, 2008). El ancho de las fibrillas es de 5 a 15 nm y están espaciadas entre sí unos 20-40 nm. Las fibrillas son más largas que las cadenas que las forman porque cada cadena comienza y termina en un lugar distinto. La región interna de las microfibrillas es cristalina y excluye el agua, siendo las capas más externas más amorfas, permitiendo la unión de las cadenas de glucanos (Pauly y col., 1999). 1.5.1.2. 1.5.1.2.1.5.1.2. 1.5.1.2.- -- - Matriz d Matriz dMatriz d Matriz de polisacáridos hemicelulósicos e polisacáridos hemicelulósicose polisacáridos hemicelulósicos e polisacáridos hemicelulósicos Se denomina hemicelulosa a los polisacáridos no celulósicos de la pared que se extraen a pH fuertemente alcalino. Los glucanos conocidos como hemicelulosas están Capítulo 1 16 formados predominantemente por azúcares neutros, ya que de forma mayoritaria sus componentes son glucosa, xilosa o manosa y no contienen ácido galacturónico (GalA) (Scheller y Ulvskov, 2010). El Xiloglucano es el polisacárido más abundante de la matriz hemicelulósica y se encuentran en las paredes Tipo I presentes en la mayoría de las plantas. Está formado por cadenas lineales de glucosa unidas por enlace β (1→4), como en la celulosa, pero bastante más corto y con residuos de xilosa unidas por enlace α (1→6). A veces pueden llevar unidas cadenas laterales de disacáridos (xilosa - arabinosa) o trisacáridos (arabinosa - fucosa - galactosa). Los xiloglucanos se unen entre sí y a la superficie de las microfibrillas de celulosa por puentes de hidrógeno, formando una red que engloba a la celulosa. Las cadenas de xiloglucano tienen una longitud de 200 nm de media, suficiente para abarcar la distancia entre dos microfibrillas de celulosa y entrelazarlas (Carpita y Gibeaut, 1993). Otros tipos de hemicelulosas mucho menos abundantes en la paredes de dicotiledóneas son los Glucuronoarabinoxilanos, formados por cadenas lineales de xilosa unidas por enlace β (1→4) con residuos de arabinosa y ácido glucurónico; o los Glucomananos, formados por regiones alternas de β (1→4) glucosa y β (1→4) manosa (Carpita y Gibeaut, 1993; Carpita y McCann, 2000). Esta red formada por las cadenas de celulosa y xiloglucanos está embebida en una matriz de pectinas que controla la porosidad de la pared (Brett y Waldron, 1996). 1.5.1.3 1.5.1.31.5.1.3 1.5.1.3. .. .- -- - Pectinas PectinasPectinas Pectinas Tradicionalmente se consideran pectinas a los polisacáridos de la pared celular en cuya extracción se utilizan agentes quelantes de calcio o soluciones ácidas diluidas, aunque también hay una importante fracción péctica extraíble con carbonato sódico. Así, el término ‘pectinas’ es muy genérico y engloba a un conjunto de polímeros heterogéneos, altamente hidratados y ricos en ácido D-galacturónico. Estos polímeros pécticos son cuantitativamente muy importantes en la pared celular primaria, representando un 30% de la misma. Aún más, como ya hemos comentado, las paredes celulares de muchos frutos normalmente están enriquecidas en pectinas, llegando hasta un 60% en algunas especies (Redgwell y col., 1997a). Introducción 17 La función de la matriz péctica no es sólo estructural, ya que además de controlar el tamaño de poro, proveen a la pared de carga superficial, lo que determina el balance iónico y modula el pH en este compartimento celular. Como se ha mencionado anteriormente, la lámina media está constituida fundamentalmente por pectinas, siendo a este nivel donde se regula la adhesión celular. Además de estas características físico-químicas y funciones estructurales, algunos polisacáridos pécticos de pequeño tamaño actúan como señal en procesos de interacción entre la planta y otros organismos, así como en otros procesos fisiológicos, incluida la maduración del fruto (Carpita y McCann, 2000; Dumville y Fry, 2000). Los dos polímeros pécticos más abundantes en la pared celular son el Homogalacturonano (HGA) y el Ramnogalacturonano I (RGI). 1.5.1.3.1.- Homogalacturonano (HGA) El esqueleto del HGA está compuesto por un homopolímero de ácido galacturónico (GalA) unido por enlaces α (1→4) altamente metil esterificado. Las cadenas suelen tener unas 200 unidades de GalA, lo que origina esqueletos de una longitud aproximada de 100 nm (Figura 1.7). Grupo carboxilo: -COOGrupo hidroxilo: -OH Ácido galacturónico Grupo metil-ester: -COO-CH3 Figura 1.7: Figura 1.7:Figura 1.7: Figura 1.7: Modelo conformacional del homogalacturonano formado por monómeros de ácido galacturónico (GalA) unidos por enlace α(1→4). Estos polímeros se encuentran metil esterificados con relativa frecuencia (Modificado con permiso a partir de Matas y col., 2015). Los HGAs se sintetizan en el aparato de Golgi y son secretados a la pared celular con el 70-80% de los residuos de ácido galacturónico metil-esterificados en el carbono Capítulo 1 18 6-carboxil. Es necesaria la acción de la pectin metilesterasa (PME), una enzima que modifica este componente de la pared celular in situ escindiendo parte de los grupos metilo, para que los grupos carboxilos queden libres y puedan interaccionar iónicamente con el calcio presente en la pared, formando así zonas de unión entre dos cadenas de poligalacturónicos. Estas zonas de unión se conocen como cajas de huevo (egg-box) (Morris y col., 1982) (Figura 1.8). Grupo metilester: -COOCH3 Grupo hidroxilo: -OH Ácido galacturónico Grupo carboxilo: -COOCa2+ Ión calcio Ca2+ Ca2+ Ca2+ Figura 1.8: Figura 1.8:Figura 1.8: Figura 1.8: Modelo caja de huevos “egg-box” de Morris y col. (1982), muestra el nivel máximo de entrecruzamiento entre residuos de ácido poligalacturónico desmetilados (Modificado con permiso a partir de Matas y col., 2015). El tamaño del poro de la pared está determinado por la extensión y frecuencia con que se den estas zonas de unión, el grado de esterificación, y la mayor o menor ocupación de estas zonas por las cadenas laterales que ramifican al esqueleto de RG. Existen dos tipos de modificaciones asociadas a los homogalacturonanos: los Xilogalacturonanos y los Ramnogalacturonanos II (Figura 1.9). Los xilogalacturonanos son HGA modificados en los que aproximadamente la mitad de los monómeros de Introducción 19 ácido galacturónico (GalA) presentan residuos de α-D-Xilosa (Xil). Por su parte, los Ramnogalacturonanos II (RG II) son polímeros pécticos relativamente pequeños y muy conservados con una estructura muy compleja tanto por su composición de azúcares, como por el tipo de enlaces que se dan en él. Su esqueleto básico es de GalA y presentan múltiples ramificaciones. Los monómeros de RG II pueden formar dímeros a través de un éster de borato en el que intervienen los residuos de apiosa. También se pueden encontrar en sus ramificaciones otros azúcares como L-fucosa, D-arabinosa, D-manosa, D-xilosa y el D-ácido galacturónico. Esta estructura compleja está altamente conservada en las paredes celulares de las plantas vasculares (Vincken y col., 2003). 1.5.1.3.2.- Ramnogalacturonano I (RG I) Se trata de un heteropolímero formado a partir de la repetición de un disacárido formado por unidades de α (1→2) -L-Ramnosa -(1→4) -D-GalA (Figura 1.9). Entre un 20 y un 80% de los residuos de las ramnosas del dímero presentan cadenas laterales formadas por varias galactosas o varias arabinosas y, en ocasiones, pueden presentar ramificaciones secundarias (Rose y col., 2003) (Figura 1.9). Así, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos son las cadenas laterales más comunes. Los HGAs se unen covalentemente mediante enlaces glucosídicos a RG I y RG II los cuales, probablemente, también se enlazan entre sí. Algunos autores, sin embargo, consideran que las regiones de HGA son cadenas laterales de RG I (Vincken y col., 2003). Las regiones ricas en RG I se conocen como “hairy pectins” por la cantidad de ramificaciones que presentan, en comparación con las zonas de HGA, denominadas como “smooth pectins”. Capítulo 1 20 Homogalacturonano Xilogalacturonano Ramnogalacturonano I Ramnogalacturonano II B Grupo acetilo XilosaÁcido galacturónico Grupo metilo Galactosa Apiosa Ramnosa Arabinosa BBorato Azúcares minoritarios Figura 1.9 Figura 1.9Figura 1.9 Figura 1.9. Estructura y composición de los polímeros pécticos de la pared celular primaria. 1.5.1.4. 1.5.1.4.1.5.1.4. 1.5.1.4.- -- - Proteínas estructurales Proteínas estructurales Proteínas estructurales Proteínas estructurales Representan alrededor del 10% de la pared celular y se clasifican en 4 familias de proteínas denominadas en base al aminoácido más abundante del polipéptido. Así encontramos glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs), grupo que incluye la extensina, una de las más estudiadas, proteínas ricas en prolina (PRPs), proteínas ricas en glicina (GRPs) y proteoglicanos, grupo identificado en función del carbohidrato al que está asociado, en vez del aminoácido más abundante. Dentro de este grupo destaca el arabinogalactano (AGPs). Estas proteínas tienen una función estructural ya que, al interaccionar con el resto de los elementos de la pared, contribuyen a sus propiedades mecánicas. Su presencia puede inducir un aumento en la rigidez de la pared celular. Además de estas proteínas estructurales, en la pared celular hay otras proteínas con actividad enzimática que realizan muy diversas actividades, algunas de las cuales se describirán más adelante. Introducción 21 1.5.1.5. 1.5.1.5.1.5.1.5. 1.5.1.5.- -- - Componentes fenólicos Componentes fenólicosComponentes fenólicos Componentes fenólicos Entre los componentes fenólicos de la pared celular primaria se encuentran principalmente el ácido felúrico y el ácido p-cumárico. Estos compuestos se pueden encontrar esterificados con residuos de arabinosa y galactosa o embebidos en los polisacáridos pécticos (McNeil y col., 1984). A continuación se muestra, a modo de resumen, un esquema con todos los componentes anteriormente descritos (Figura 1.10). Ricas en prolina Ricas en hidroxiprolina Ricas en glicina Arabinogalactanos prot Gluc Gluc, Xil, Xil, Arab, Ac Gluc GalA GalA, Xil GalA , puede formar dímeros mediante éster de borato Ac Gal, Ramn Xiloglucano Glucuronoarabinoxilano Homogalacturonano Xilogalacturonano Ramnogalacturonano I Ramnogalacturonano II Ácido felúrico Ácido cumárico Fase microfibrilar Fase matriz CELULOSA HEMICELULOSA PECTINAS PROTEINAS ESTRUCTURALES COMPONENTES FENÓLICOS Pared celular primaria Proteoglicanos HPRP PRP GRP AGPs Componentes de la cadena principal Figura 1. Figura 1.Figura 1. Figura 1.10 1010 10: Composición de la pared celular primaria. No todos los componentes de la matriz enumerados se encuentran en todas las paredes celulares vegetales. Siendo: Gluc: glucosa; Xil: xilosa; Arab: arabinosa; Ac Gluc: ácido glucurónico; GalA: ácido galacturónico y Ramn: ramnosa. Según Jarvis y col. (2003) la pared celular primaria estaría formada por HGA, RG I, RG II, glucanos y celulosa, pero la lámina media contendría solamente HGA y algunas proteínas estructurales. Capítulo 1 28 El contenido total de azúcares neutros no cambia significativamente durante la maduración de la fresa (Gross y Sam, 1984; Redgwell y col., 1997b; Koh y Melton, 2002; Figueroa y col., 2010). Los azúcares neutros mayoritarios tanto en fruto inmaduro como maduro de fresa son arabinosa, xilosa y galactosa. Durante la maduración se produce una pérdida de arabinosa y galactosa, mientras que la cantidad de xilosa se incrementa, y la ramnosa, fucosa, manosa y glucosa permanecen inalteradas (Redgwell y col., 1997b). La mayor parte de la galactosa y arabinosa está asociada a polímeros de pectinas que permanecen unidos a la pared celular después de la extracción con KOH 4M (Redgwell y col., 1997b; Koh y Melton, 2002). De acuerdo con Redgwell y col. (1997b) la pérdida de azúcares neutros no se correlaciona con el reblandecimiento. Como resumen, se podría decir que la modificación más característica de la pared celular durante la maduración de la fresa es la solubilización de las pectinas, la cual ocurre supuestamente a expensas de los poliurónidos unidos covalentemente a la pared celular. Varias hipótesis pueden explicar este proceso. Huber (1984) sugirió la idea de que la solubilización podría estar relacionada con la síntesis de pectinas más solubles durante la maduración. Koh y Melton (2002) postularon que la solubilización puede estar asociada con el desenmarañamiento de las pectinas en la pared celular debido a la degradación de cadenas laterales de arabinanos o de rotura de enlaces entre pectinas y hemicelulosa. Finalmente, ante las evidencias de una pequeña despolimerización de estos polímeros, Rosli y col. (2004) indicaron que la solubilización de pectinas podría ser debida a la despolimerización de las pectinas unidas covalentemente. 1. 1.1. 1.7. 7.7. 7.- -- - Enzimas involucradas en l Enzimas involucradas en lEnzimas involucradas en l Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto os cambios de textura del frutoos cambios de textura del fruto os cambios de textura del fruto El desmantelamiento de la pared celular durante la maduración del fruto está mediado por la expresión de genes que codifican enzimas y proteínas capaces de modificar los diferentes polisacáridos de pared, especialmente pectinas y hemicelulosas. Algunas de estas enzimas se encuentran en diversas etapas del Introducción 29 desarrollo del fruto, mientras que otras son específicas de la maduración. En cualquier caso, parece claro que las enzimas hidrolíticas de pared pueden ser buenas indicadoras del estado de maduración del fruto (Huber, 1983; Tucker y Grierson, 1987), aunque, en líneas generales, sus papeles en los cambios que determinan el proceso de reblandecimiento de los frutos están poco definidos. Tradicionalmente, para definir el efecto de las actividades de una serie de enzimas en la maduración del fruto se recurría al uso de inhibidores (Yoshida y col., 1984; Picton y Grierson, 1988), mutantes (Hobson, 1967; Tigchelaar y col., 1978) o variaciones de las condiciones ambientales (Hobson y col., 1984; Yang, 1985; Lincoln y col., 1987; Davies y col., 1988). Actualmente, se puede determinar el efecto de actividades enzimáticas individuales en la degradación de la pared celular durante la maduración del fruto a través de técnicas de ingeniería genética, mediante la transformación de plantas con genes relacionados con el metabolismo de la pared celular. En este apartado, vamos a describir las principales proteínas involucradas en los cambios de la pared celular que tienen lugar durante la maduración de frutos y que son posibles dianas de actuaciones con esta metodología. 1. 1.1. 1.7.1. 7.1.7.1. 7.1.- -- - Poligalacturonasa (PG) Poligalacturonasa (PG)Poligalacturonasa (PG) Poligalacturonasa (PG) Esta enzima β-1,4-D-galacturónico glicanohidrolasa (PG) tiene como principal sustrato la fracción péctica que incluye los homogalacturonanos (Brummell y col., 1999) y cataliza la hidrólisis de las uniones de ácido galacturónico actuando tanto como endoo exo-enzima. La exo-PG (EC 3.2.1.67) elimina las unidades de ácido galacturónico a partir del extremo no reductor de los poliurónidos, mientras que para la endo-PG (EC 3.2.1.15) se ha sugerido que rompe estos polímeros en diferentes posiciones internas. El sustrato de la PG en la pared celular es principalmente el homogalacturonano, el cual es secretado en la pared altamente metil-esterificado y debe ser desesterificado para ser sustrato de esta enzima (Carpita y Gibeaut, 1993). Los cambios en la estructura de las pectinas durante la maduración de muchos frutos se han atribuido a la acción de las poligalacturonasas. Estas enzimas se han Capítulo 1 30 identificado en las zonas de abscisión en plantas de tomate (Tucker y col., 1984) así como en frutos maduros y en granos de polen de distintas especies (Pressey y Reger, 1989). De las PGs identificadas en frutos, se han caracterizado tanto exocomo endopoligalacturonasas (Hadfield y Bennett, 1998). Varios frutos contienen los dos tipos de enzimas, como el melocotón tipo “freestone”, la pera, el pepino y la papaya (Pressey y Avants, 1973; 1975; 1976; McFeeters y col., 1980; Chan y Tam, 1982). Otros, por el contrario, contienen sólo exo-PG, como es el caso de los melocotones tipo “clingstone” (Pressey y Avants, 1973). El incremento de actividad endo-PG durante la maduración se ha correlacionado en distintos frutos con un incremento en las pectinas solubles y un reblandecimiento del fruto. En muchos frutos, como el tomate, la actividad endo-PG induce una solubilización de las pectinas mientras que la actividad exo-PG completa la hidrólisis. En tomate, los niveles de mRNA y proteína PG así como la actividad poligalacturonasa se correlacionan positivamente con la maduración del fruto y el reblandecimiento, sugiriéndose que las PG juegan un papel esencial en la inducción del reblandecimiento del fruto (Bennett y DellaPenna, 1987; Brady, 1987). El fruto de tomate se ha utilizado como modelo para el análisis del papel de enzimas hidrolasas mediante transgénesis. En el caso concreto de la PG, la inhibición de un gen de poligalacturonasa mediante antisentido, inesperadamente, no modificó la firmeza del fruto maduro, y los frutos transgénicos mostraron una menor despolimerización y solubilización de pectinas (Sheehy y col., 1988; Smith y col., 1988). Sin embargo, otras características del fruto como la vida postcosecha de frutos sobremaduros, susceptibilidad a patógenos y viscosidad de la pasta de tomate se vieron modificados por el silenciamiento de la PG (Smith y col., 1990; Kramer y col., 1992; Brummell y Labavitch, 1997). Estos estudios dieron lugar a la hipótesis, ampliamente aceptada, de que el desmantelamiento de las pectinas durante la maduración mediado por enzimas pectinolíticas no era suficiente, ni necesario para producir el reblandecimiento del fruto (Brummell y Harpster, 2001). Gizis (1963) fue el primer investigador que demostró la presencia de endo-PG en fresa, aunque, por lo general, la actividad endo-PG o exo-PG que se ha encontrado en fruto es muy baja (Neal, 1965; Barnes y Patchett, 1976; Archer y Fielding, 1979; Gross Introducción 31 y Sams, 1984; Huber, 1984; Abeles y Takeda, 1990; Nogata y col., 1993; Hadfield y Bennett, 1998). Lefever y col. (2004) observaron un papel importante de la PG en la firmeza del fruto, encontrando una correlación negativa entre dureza de fruto y actividad PG, de tal forma que las variedades de frutos más duros tenían una baja actividad PG. En fresa se han identificado tres genes que codifican PG que se expresan específicamente durante la maduración del fruto (Redondo-Nevado y col., 2001; Salentijn y col., 2003; Villarreal y col., 2008). Quesada y col. (2009) obtuvieron plantas transgénicas con bajos niveles de uno de estos genes, FaPl1, mediante transformación con antisentido. Los frutos maduros de algunas líneas seleccionadas fueron significativamente más duros que los controles, manteniéndose además el incremento en dureza durante la postcosecha del fruto. Por tanto, estos estudios parecen indicar que la PG sí tendría un papel importante en el reblandecimiento de la fresa. 1. 1.1. 1.7.2. 7.2.7.2. 7.2.- -- - Pectato liasa (PL) Pectato liasa (PL)Pectato liasa (PL) Pectato liasa (PL) La enzima pectato liasa (PL, EC 4.2.2.2) ha sido ampliamente estudiada en bacterias fitopatógenas, las cuales la secretan favoreciendo la degradación de las pectinas de la lámina media de la planta infectada para así permitir la entrada del patógeno (Henrissat y col., 1995). La degradación de las pectinas por acción de la PL ocurre por β-eliminación, a diferencia del mecanismo hidrolítico de las PG. Estas enzimas catalizan la rotura de los enlaces α (1-4) entre residuos galacturónicos desmetilados, provocando la despolimerización de las pectinas de la lámina media y de la pared celular primaria de las células vegetales (Henrissat y col., 1995). Tienen, por tanto, una función similar a la de la poligalacturonasa, aunque el mecanismo enzimático de ambas es diferente. En el caso del fruto de fresa, se han descrito 3 genes de pectato liasa. El primer gen de PL específico de frutos (plC) fue descrito por Medina Escobar (1997) en fresa. La expresión de este gen está restringida a frutos en estadio blanco y rojo maduro y se Capítulo 1 32 inhibe por tratamiento con auxina. Posteriormente, se comprobó la existencia de otros dos genes de pectato liasa plA y plB, que presentaban un patrón de expresión similar al anterior (Benítez-Burraco y col., 2003). También se han aislado genes de pectato liasa en frutos como banana (Domínguez-Puigjaner y col., 1997; Pua y col., 2001), uva (Nunan y col., 2001; Ishimaru y Kobayashi, 2002) y en varios tejidos de tomate, expresándose en niveles elevados durante la maduración del fruto (Marín-Rodríguez y col., 2002). Para determinar el papel de los genes de pectato liasa en la maduración de fresa, Jiménez-Bermúdez y col. (2002) obtuvieron plantas transgénicas que contenían una secuencia en antisentido de la región conservada de las tres pectato liasas de fruto. De entre todas las líneas transgénicas obtenidas, se seleccionaron cuatro de ellas en base al grado de inhibición conseguido y a la producción de frutos. Estas líneas dieron frutos con una dureza significativamente superior a la de los frutos control. Tras el análisis de expresión por “Northern Blot” se comprobó que en las líneas seleccionadas los niveles estacionarios de mRNA correspondientes al gen plC en fruto maduro estaban reducidos entre el 70 y el 100% con respecto al testigo sin transformar, dependiendo de la línea. Estas líneas se siguieron cultivando durante varios años consecutivos y en todas ellas se mantuvo el fenotipo de mayor dureza de fruto en estadio rojo. En cuanto al efecto de la inhibición del gen pectato liasa en el desmantelamiento de la pared celular de fresa durante la maduración, en un estudio preliminar se comprobó que las paredes de los frutos transgénicos contenían una menor proporción de pectinas queladas y presentaban un menor grado de hinchamiento cuando se colocaban en agua destilada, lo cual era indicativo de una reducción de la solubilización de estas pectinas de pared durante la maduración (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). A nivel histológico, estos cambios en la pared se traducen en una disminución de los espacios intercelulares y un mayor grado de adhesión celular en los frutos transgénicos maduros. Todo esto sugiere que esta enzima juega un papel muy importante en el reblandecimiento del fruto de fresa durante la maduración. En el apartado 1.8 se describe con más detalle la obtención y caracterización de estas plantas, al ser el objeto de estudio de esta tesis. Introducción 33 1. 1.1. 1.7.3. 7.3.7.3. 7.3.- -- - Pectin PectinPectin Pectin metilesterasa (PME) metilesterasa (PME)metilesterasa (PME) metilesterasa (PME) Los homogalacturonanos son secretados en la pared celular altamente metilesterificados y son parcialmente desesterificados in muro . En el proceso de maduración, el grado de metilesterificación de las paredes celulares disminuye (Koch y Nevins, 1989). La enzima pectin metilesterasa (PME; EC 3.1.1.11) elimina los grupos metilo de la posición 6 de los residuos de ácido galacturónico de las pectinas; esto provoca la liberación de grupos carboxilo, cambiando el pH así como la carga de la pared celular, y permite la unión entre cadenas de poliurónidos por puentes de calcio (Jarvis, 1984; Seymour y col., 1987; Koch y Nevins, 1989; Carpita y Gibeaut, 1993). La actividad de esta enzima es esencial para la actuación de las enzimas pectinolíticas, ya que tanto poligalacturonasa como pectato liasa requieren fragmentos con las cadenas pécticas demetiladas. La PME se encuentra en diversos tejidos vegetales (Tucker y col., 1982). Los efectos de su actividad enzimática en el reblandecimiento no están claros ya que, por un lado, al desmetilar las pectinas favorecen la acción de las PG y PL, y con ello la despolimerización de pectinas mientras que, por otra parte, la liberación de grupos carboxilo promueve la formación de enlaces iónicos en la pared. Los resultados obtenidos con plantas de tomate con PME en antisentido muestran que las pectinas presentaron un menor grado de esterificación (15-40%) que las plantas controles y un menor contenido de pectinas solubles en EDTA (Tieman y col., 1992; Tieman y Handa, 1994), no obstante la dureza de los frutos no se vio afectada. Al igual que en el caso de la PG, los resultados sugieren que esta enzima está involucrada en la degradación de la pared celular pero su supresión no es suficiente para modificar la dureza de los frutos. En frutos de fresa, se ha detectado actividad PME (Gizis, 1963; Neal, 1965; Barnes y Patchett, 1976; Archer, 1979) encontrándose que dicha actividad prácticamente se duplicaba, aproximadamente al pasar del estadio inmaduro al maduro. Posteriormente, la actividad disminuía hasta niveles basales en frutos muy maduros. En fresa se han caracterizado cuatro genes de PME, FaPe1 a FaPe4, de los cuales, el FaPe1, se expresa específicamente en fruto mostrando un incremento de la expresión durante la Capítulo 1 34 maduración alcanzando el máximo en el estadio intermedio de maduración (Castillejo y col., 2004). Mediante líneas transgénicas con una alta actividad PME en fruto, se observó en el análisis de sus paredes celulares una reducción del 20% de la metilación de las pectinas solubles y unidas iónicamente, si bien no se pudo mostrar un aumento en la firmeza ni en la vida postcosecha, sí que mostraron una mejor resistencia a la infección por hongos (Osorio y col., 2008). 1. 1.1. 1.7.4. 7.4.7.4. 7.4.- -- - Endo EndoEndo Endo- -- -β ββ β- -- -1,4 1,41,4 1,4- -- -D DD D- -- -glucanasa (EGasa) glucanasa (EGasa)glucanasa (EGasa) glucanasa (EGasa) La fracción de hemicelulosa de la pared es despolimerizada durante el reblandecimiento del fruto (Huber, 1984; Brummell y col., 1999). Una de las enzimas que se considera responsable de este proceso es la celulasa o glucanasa (EGasa, EC 3.2.1.4). Las EGasas hidrolizan glucanos con uniones β-D-1,4, aunque probablemente no son capaces de degradar la celulosa cristalina (Brummell y col., 1994). Sus sustratos en la pared celular podrían incluir al xiloglucano, regiones no cristalinas de la celulosa y posiblemente glucomananos con suficiente cantidad de β-D-1,4-glucanos para permitir la unión de la enzima al sustrato (Hatfield y Nevins, 1986; Nakamura y Hayashi, 1993; Ohmiya y col., 2000). Se ha encontrado actividad EGasa en todos los frutos examinados (Brummell y col., 1994) pero las cantidades encontradas varían notablemente según la especie considerada. En la mayoría de los frutos se ha descrito la existencia de numerosas isoformas de EGasa durante la maduración (Kanellis y Kalaitzis, 1992). En el caso de la fresa, la enzima endo 1,4-D-glucanasa parece estar involucrada en el reblandecimiento del fruto (Abeles y Takeda, 1990). Barnes y Patchett (1976) detectaron actividad en frutos correspondientes a los estadios maduros y muy maduros. Además, se ha observado un aumento en la actividad de seis veces entre los estadios verde y rojo maduro (Abeles y Takeda, 1990). A pesar de la estrecha relación temporal entre esta actividad celulasa y el reblandecimiento y maduración del fruto, hay pocas evidencias microscópicas de cambios importantes en la matriz de celulosa a lo largo del desarrollo del mismo (Al-Jamali, 1973). A nivel génico, se han Introducción 35 aislado dos genes de celulasa en frutos de fresa (FaEg1 y FaEg3) que muestran alta expresión durante la maduración (Manning, 1998; Llop-Tous y col., 1999; Trainotti y col., 1999). Sin embargo, el papel de estos genes no es todavía conocido (Harrison y col., 2001). Para determinar la posible función de estos genes en el proceso de maduración, Woolley y col. (2001) y Mercado y col. (2010) obtuvieron plantas transgénicas de fresa conteniendo secuencias en antisentido de FaEg1 y de FaEg3, respectivamente. En ambos casos no se observó ninguna diferencia en la dureza de frutos en estadio rojo maduro, entre las líneas transgénicas y el control. Palomer y col. (2006) obtuvieron plantas transgénicas con un silenciamiento parcial de ambos genes y no observaron variaciones ni en la composición de la pared celular ni en la dureza del fruto. Por tanto, los resultados obtenidos con plantas transgénicas no sostienen un papel de estas enzimas en el proceso de reblandecimiento de frutos de fresa. 1. 1.1. 1.7.5. 7.5.7.5. 7.5.- -- - Expansinas (EXP) Expansinas (EXP)Expansinas (EXP) Expansinas (EXP) Las expansinas son proteínas que inducen el “relajamiento” de la estructura de la pared aunque se cree que carecen de actividad hidrolítica y no se las considera enzimas. Se postula que su mecanismo de actuación es a través de la rotura o interrupción de puentes de hidrógeno, considerándose que actúan a nivel de la interacción celulosa-hemicelulosa (MacQueen-Mason y Cosgrove, 1994; 1995; Cosgrove 2000a; 2000b). Son proteínas cuya presencia se ha descrito en numerosos tejidos e, inicialmente, su función se relacionó con procesos de crecimiento (Cosgrove, 2000a; 2000b). La disminución del número de enlaces de hidrógeno entre las microfibrillas de celulosa y las de hemicelulosa posibilitaría una mayor libertad de movimiento y una nueva disposición de los polímeros durante el crecimiento y expansión celular. Más recientemente se han descrito también en frutos, donde se considera que contribuyen a modificar la estructura de la pared incrementando el acceso de las hidrolasas a zonas de la pared celular que de otro modo no podrían alcanzar. Ello se traducirá finalmente en un reblandecimiento del fruto. Capítulo 1 36 En tomate y fresa se han aislado los genes de expansinas cuya expresión coincide con los patrones espacio-temporales de maduración del fruto (Rose y col., 1997; Civello y col., 1999). En fresa, la expresión del gen denominado FaExp1 se detecta en el estadio blanco, momento en el que comienza el reblandecimiento del fruto, manteniéndose los niveles altos durante la maduración del fruto (Civello y col., 1999). Por otro lado, la supresión de la expansina del fruto de tomate (LeExp 1 ) resultó en una reducción del reblandecimiento, mientras que la sobreexpresión de LeExp 1 aumentó el reblandecimiento del fruto (Brummell y col., 1999). Ambos resultados concuerdan con la hipótesis de que la actividad de la expansina contribuye significativamente a la pérdida de firmeza de los frutos. 1. 1.1. 1.7.6. 7.6.7.6. 7.6.- -- - Otros genes de pared Otros genes de paredOtros genes de pared Otros genes de pared Se han identificado otros genes que actúan en la pared celular involucrados en el reblandecimiento del fruto y se ha analizado su expresión en distintos cultivares de fresa. Martínez y col. (2004) clonaron un fragmento de cDNA que codificaba un supuesto gen de xilosidasa (FaXyl) de fruto maduro. Posteriormente se aisló el gen con su secuencia y su región promotora completas (Bustamante y col., 2006; Bustamante y col., 2009). La xilosidasa libera residuos simples de la xilosa contenida en los oligosacáridos. La xilosa está presente en la hemicelulosa (xiloglucanos y principalmente xilanos) y en las pectinas (xilogalacturonanos). La mayoría de la xilosa que aparece en el fruto de fresa se encuentra en la fracción de hemicelulosa (Koh y Melton, 2002). Se han encontrado altos niveles de expresión y de actividad xilosidasa tanto en Camarosa, un cultivar de fruto duro, como en el Toyonaka que es un cultivar de fruto blando (Bustamante y col., 2006). El patrón de expresión de esta enzima durante el desarrollo del fruto y su maduración difiere entre los distintos cultivares estudiados, dificultando la correlación de la expresión de este gen con el reblandecimiento. La galactosa y la arabinosa son los azúcares neutros que más disminuyen durante la maduración del fruto de fresa y se han aislado genes de galactosidasa y Introducción 37 arabinofuranosidasa. La actividad arabinofuranosidasa se ha detectado en todos los estadios de maduración del fruto, excepto en fruto verde pequeño (Rosli y col., 2009). Esta actividad aumenta con la maduración del fruto, alcanzando en frutos de cultivares blandos mayores niveles de expresión que en los cultivares duro. La actividad arabinofuranosidasa se ha detectado en frutos de F. chiloensis aunque, en este caso, se ha observado la mayor actividad en fruto verde grande (Figueroa y col., 2010). Tres genes de arabinofuranosidasa son los responsables de esta actividad (FaAra1, FaAra2 y FaAra3). El análisis de su expresión muestra que se expresan durante el desarrollo completo del fruto, incluyendo todos los estadios de maduración. Aparentemente ninguno está correlacionado con el reblandecimiento aunque, considerando la expresión global de los tres genes FaAra, el cultivar blando muestra una expresión mayor que el cultivar duro (Rosli y col., 2009). La actividad galactosidasa se incrementa durante el desarrollo del fruto manteniéndose elevada durante el estadio maduro, lo cual está de acuerdo con la disminución del contenido de galactosa de la pared celular que se observa (Trainotti y col., 2001; Figueroa y col., 2010). En el trabajo de Trainotti y col. (2001) se indica la identificación de tres secuencias completas de galactosidasa (FaGal1 a FaGal3) que se expresan en fruto maduro. De los tres genes mencionados, sólo FaGal1 muestra un incremento elevado de expresión durante el proceso de maduración. FaGal1 y FaGal2 contienen un dominio que le sirve de anclaje a un azúcar específico. Este dominio podría incrementar la eficiencia en la liberación de residuos de galactosa de los polímeros de la pared celular. 1. 1.1. 1.8. 8.8. 8.- -- - Silenciamiento SilenciamientoSilenciamiento Silenciamiento del gen pectato liasa en fresa del gen pectato liasa en fresadel gen pectato liasa en fresa del gen pectato liasa en fresa Las plantas de fresa con las que hemos trabajado en esta tesis fueron obtenidas por Jiménez Bermúdez (2005). Para la transformación genética de las plantas de fresa se siguió el método desarrollado para el cultivar Chandler por Barceló y col. (1998). La bacteria que se utilizó provenía de la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema y col., 1983) que poseía el plásmido Ti desarmado pAL4404. El T-DNA ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Célula Célula Célula ! ! CAPÍTULO 3. Material y métodos ! Material y Métodos 47 3. 3.3. 3.- -- - Material MaterialMaterial Material y métodos y métodosy métodos y métodos 3.1. 3.1.3.1. 3.1.- -- - Material Vegetal Material VegetalMaterial Vegetal Material Vegetal El trabajo de esta tesis se ha realizado con frutos de plantas de fresa Fragaria x ananasa Duch. cv Chandler. Las plantas de fresa se cultivaron en invernadero, en las instalaciones del IFAPA de Churriana, Málaga. Los frutos fueron recolectados a primera hora de la mañana, transportados al laboratorio en contenedores con placas de hielo para mantener una temperatura baja y posteriormente congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -20ºC. Se ha trabajado con plantas transformadas genéticamente con la secuencia del gen de la pectato liasa en antisentido. En concreto, Apel 14, Apel 23 y Apel 39, tres líneas con el gen silenciado, obtenidas previamente por Jiménez-Bermúdez y col. (2002). Las líneas Apel 23 y Apel 39 mostraban una inhibición total de la expresión del gen pectato liasa mientras que Apel 14 mostraba una inhibición de expresión del 95%. Se ha trabajado con el fruto de estas fresas en dos estadios de maduración: rojo (como fruto en estadio maduro) y verde (como fruto en estadio inmaduro). Estas tres líneas se caracterizaban por tener frutos en estadio rojo significativamente más duros que el control. Estas tres líneas transgénicas fueron cultivadas junto a las plantas control en condiciones confinadas en invernadero. Tanto las plantas control no transgénicas como las líneas transgénicas se propagaban vegetativamente a partir de estolones de plantas madre anualmente. 3.2. 3.2.3.2. 3.2.- -- - Metodología Metodología Metodología Metodología 3.2.1. 3.2.1.3.2.1. 3.2.1.- -- - Extracción de la Pared Celular Extracción de la Pared CelularExtracción de la Pared Celular Extracción de la Pared Celular Debido a la existencia de distintos protocolos de extracción y fraccionamiento de paredes celulares, se probaron inicialmente tres protocolos. Para la extracción de Capítulo 3 48 paredes celulares probamos dos protocolos descritos en la bibliografía: Redgwell y col. (1992) y Huber y col. (1993), así como una modificación de este último. La principal diferencia entre ellos era la manera de desactivar las enzimas pectinolíticas, además de que con el protocolo de Redgwell se obtenía una fracción de pectinas muy solubles que no se conseguían con el protocolo de Huber. Esto nos llevó a probar una modificación del protocolo de Huber con el fin de obtener esa fracción de pectinas más solubles que se obtenían siguiendo el procedimiento de Redgwell y col. (1992). Las extracciones de la pared celular de los frutos se realizaron por triplicado. 3. 3.3. 3.2.1.1. 2.1.1.2.1.1. 2.1.1.- -- - Protocolo de extracción de Redgwell Protocolo de extracción de RedgwellProtocolo de extracción de Redgwell Protocolo de extracción de Redgwell El protocolo de extracción de Redgwell (Redgwell y col., 1992) comenzó con una pulverización de los frutos en mortero con nitrógeno líquido (Figura 3.1). A continuación por cada 20 gramos de fruto triturado se añadieron 40 ml de una solución denominada PAW (fenol:acético:agua en proporción 2:1:1 p/v/v) y se procedió a una homogeneización con el ULTRA-TURRAX ®, con tres pases de 1 minuto, siempre manteniendo todo el material en frío. Tras una centrifugación de 15 minutos a 4.000 g, se filtró el sobrenadante con doble capa de muselina (tejido Miracloth, ref: 475855, Calbiochem), y el precipitado se lavó resuspendiéndolo previamente en 20 ml de agua destilada y volviéndose a centrifugar a 4.000 g durante 15 minutos Este paso de lavado se realizó dos veces. Todos los sobrenadantes obtenidos en los pasos anteriores se unieron en uno solo para proseguir con el protocolo, mientras que al precipitado se le añadió DMSO, para eliminar el almidón de la muestra, como se detalla más adelante. El sobrenadante conjunto se dializó en agua destilada con una membrana de diálisis de 7.000 MWCO (SnakeSkin Pleated Tubing, ref: 68700 de la casa PIERCE) durante una semana y con al menos tres cambios diarios en un volumen 50 veces mayor de agua. A continuación se centrifugó a 23.000 g, se concentró usando un rotavapor y se secó mediante liofilización. La fracción así obtenida se denominó FRACCIÓN SOLUBLE EN PAW. Material y Métodos 49 El precipitado resultante de las centrifugaciones anteriores se incubó toda la noche en 40 ml de DMSO al 90% en agitación suave a temperatura ambiente. Al día siguiente se centrifugó 15 minutos a 4.000 g. El nuevo precipitado se lavó dos veces con 20 ml de agua destilada, descartando los sobrenadantes. Con el DMSO se elimina el almidón de la muestra, por lo que la fracción soluble en DMSO se desechó tras comprobarse que no contenía pectinas de ningún tipo. El precipitado resultante tras este tratamiento, se secó mediante liofilización, obteniendo lo que Redgwell denominó CELL WALL MATERIAL (CWM) O PARED CELULAR (PC). Extrae el almidón Redgwell Pulverización del tejido en N2 líquido Homogenización en PAW Incubación en DMSO Fracción soluble en PAW Fracción soluble en DMSO CWM o Pectinas más solubles PARED CELULAR (PC) Figura 3 Figura 3Figura 3 Figura 3.1 .1.1 .1: Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según el protocolo de Redgwell (Redgwell y col., 1992). 3. 3.3. 3.2.1.2. 2.1.2.2.1.2. 2.1.2.- -- - Protocolo de Huber Protocolo de HuberProtocolo de Huber Protocolo de Huber El protocolo de extracción de Huber (Huber y col., 1993) se detalla a continuación (Figura 3.2): La extracción comenzó con la pulverización de los frutos en mortero con nitrógeno líquido. A 20 gramos del pulverizado de fruto se le añadieron 20 ml de etanol al 80%, Capítulo 3 50 se homogeneizaron con el ULTRA-TURRAX ® con tres pases de 1 minuto y siempre manteniendo todo el material en frío, igual que en el caso anterior. A continuación se realizó un filtrado en doble capa de muselina (tejido Miracloth) y lo que quedó en el filtro se lavó, añadiendo 100 ml de etanol al 80%. El residuo que quedó en el filtro se recogió e introdujo en un tubo de 50 ml y se incubó en 20 ml de TRIS-fenol a pH 7 durante 30 minutos a 23ºC. Se ajustó con etanol al 95% para llevar el volumen final a una concentración de etanol al 80% y se incubó 1 hora a -20ºC. Posteriormente, se filtró con GF/C (filtro de microfibra de vidrio, ref: FVC055, de la casa ALBET) y se lavó con 200 ml de etanol al 95%. Después se continuó con una incubación en 100 ml de cloroformo: metanol (1:1, v/v) durante 30 minutos a 23ºC. Se volvió a filtrar con GF/C y se lavó con 200 ml de acetona. El residuo resultante se dejó secar a 34ºC durante 12 horas para obtener lo que Huber denominó SÓLIDO INSOLUBLE EN ALCOHOL (AIS) o PARED CELULAR (PC). La principal diferencia con el protocolo de extracción de Redgwell es que con éste no se extrae ninguna fracción parecida a la fracción de pectinas más solubles, por eso incluimos una modificación en este protocolo para obtener una fracción parecida a la fracción PAW extraída por Redgwell. Material y Métodos 51 Huber Pulverizar el tejido en N2líquido Homogeneizar en etanol 80% Incubación en Tris-Fenol Ajustar a Etanol 80% Incubación en cloroformo-metanol Filtración AIS o PARED CELULAR (PC) Figura Figura Figura Figura 3.2 3.23.2 3.2: Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según el protocolo de Huber (Huber y col., 1993). 3. 3.3. 3.2.1.3. 2.1.3.2.1.3. 2.1.3.- -- - Modificación del protocolo de extracción de Huber Modificación del protocolo de extracción de HuberModificación del protocolo de extracción de Huber Modificación del protocolo de extracción de Huber El protocolo modificado de Huber comenzó como el protocolo de Huber (Huber y col., 1993) anteriormente mencionado (Figura 3.3). Se pulverizaron los frutos con nitrógeno líquido y se homogeneizaron 20 gramos del pulverizado en 20 ml de etanol al 80%. Se filtró con doble capa de muselina (tejido Miracloth) y se lavó el filtrado con 100 ml de etanol al 80%. Se recogió lo que quedó en el filtro y se incubó en tris-fenol a pH 7 durante 30 minutos a 23ºC. La modificación propuesta se introdujo en este punto. La solución se pasó por un filtro GF/C. El residuo se recogió y se le añadieron 20 ml de agua destilada, se resuspendió y se centrifugó a 4.000 g durante 15 minutos, repitiéndose este paso de lavado otra vez. Todos los sobrenadantes obtenidos se unieron y tras una diálisis, Capítulo 3 52 concentración y liofilizado como anteriormente se ha descrito, para el protocolo de Redgwell y se obtiene una FRACCIÓN EQUIVALENTE a la fracción PAW. El residuo que quedó se ajustó a etanol al 80% y se incubó 1 hora a -20ºC. Los pasos siguientes son iguales a los descritos con anterioridad; filtrado con GF/C seguido de un lavado con 200 ml de etanol al 95%. Se siguió con una incubación en 100 ml de cloroformo: metanol (1:1, v/v) durante 30 minutos a 23ºC. Se realizó otro filtrado con GF/C y posterior lavado con 200 ml de acetona. El residuo se dejó secar a 34ºC durante 12 horas para obtener el SÓLIDO INSOLUBLE EN ALCOHOL (AIS) o PARED CELULAR. Huber modificado PARED CELULAR (PC) Filtración Fracción Equivalente a PAW Pulverizar el tejido en N 2 líquido Homogeneizar en etanol 80% Incubación en Tris-Fenol Ajustar a Etanol 80% Incubación en cloroformo-metanol Filtración AIS o Residuo Figura Figura Figura Figura 3.3 3.33.3 3.3: Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según la modificación propuesta para el protocolo de Huber. Con esta modificación conseguimos una fracción de pectinas solubles, como la que se obtenía con el protocolo de Redgwell junto con el AIS que correspondería a la pared celular. Material y Métodos 53 3. 3.3. 3.2.2. 2.2.2.2. 2.2.- -- - Fraccionamiento de la Pared Fraccionamiento de la Pared Fraccionamiento de la Pared Fraccionamiento de la Pared Celular CelularCelular Celular El fraccionamiento de la pared celular (Brummell y Labavitch, 1997) consistió en una serie de tratamientos secuenciales de la muestra con distintas soluciones. Cada uno de estos tratamientos permitía solubilizar grupos de polisacáridos diferentes, ligados más o menos fuertemente a la pared celular. Las soluciones empleadas para estos tratamientos fueron: • AGUA: se obtienen las pectinas más solubles, las más débilmente unidas a la pared. • CDTA (Ácido trans-1, 2-diamino Ciclohexano N,N,N´,N´ tetraacético monohidrato 50 mM + Acetato potásico 50 mM a pH 6): agente quelante de calcio y solubiliza las pectinas unidas por enlace iónico. • CARBONATO (Carbonato Sódico 100 mM + Sodio Borohidrido (NaBH) 0.1%): rompe enlaces tipo éster y extrae las pectinas unidas por éster covalente. • KOH 1M y KOH 4M (Hidróxido potásico a las concentraciones indicadas con Sodio Borohidrido 0,02M): extrae la hemicelulosa. La fracción KOH 1M es un paso intermedio y puede contener más pectinas que la KOH 4M. El protocolo del fraccionamiento de la pared celular se describe a continuación (Figura 3.4): se incubaron 30 mg de pared celular (CWM de Redgwell o AIS de Huber y Huber modificado) en 15 ml de agua destilada manteniéndolo en agitación suave a temperatura ambiente durante toda la noche. Tras este tiempo se centrifugó a 4.000 g durante 15 minutos, el sobrenadante se guardó a 4ºC y el precipitado se volvió a incubar con otros 15 ml de agua destilada durante toda la noche, volviendo a repetir todo el proceso anterior. Tras la segunda centrifugación ambos sobrenadantes se unieron. El volumen final de unos 30 ml, se filtró con filtro de microfibra de vidrio, GF/C (ref: FVC055, de la casa ALBET), y tras una diálisis frente a agua destilada durante una semana, (en las mismas condiciones descritas en el apartado anterior para la Capítulo 3 60 3. 3.3. 3.2.7 2.72.7 2.7- -- - Medida de poliurónidos totales de la pared celular Medida de poliurónidos totales de la pared celularMedida de poliurónidos totales de la pared celular Medida de poliurónidos totales de la pared celular La cuantificación de la cantidad de pectinas totales que hay en la pared celular se basó en el protocolo de Ahmed y Labavitch (1978). Para ello se pesaron de 6 mg de pared celular y se añadieron 0,83 ml de ácido sulfúrico concentrado y previamente enfriado. Se mantuvo 5 minutos en agitación suave y se le añadieron 0,26 ml de agua destilada se dejó 5 minutos en agitación suave. Este proceso se realizó dos veces. A continuación se añadieron 10 ml de agua destilada y se puso en agitación suave otros 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 g, quedando los poliurónidos en el sobrenadante. Para su cuantificación se realizaron las medidas de azúcares y galacturónicos previamente descritos. 3. 3.3. 3.2.8. 2.8.2.8. 2.8.- -- - Medida de Medida de Medida de Medida de a aa antocianina ntocianinantocianina ntocianinas ss s La medida de antocianinas presentes nos da una estimación del grado de maduración del fruto (Given y col., 1988). La medida de antocianinas realizado está basada en la metodología de Giusti y col. (1999), que se describe a continuación: El fruto se pulverizó en nitrógeno líquido. A 1 gramo de fruto pulverizado se le añadieron 3 ml de etanol con 1% v/v de ácido clorhídrico, y se homogenizó con el ULTRA-TURRAX ® se dieron tres pases de 30 segundos manteniéndolo en frío y se incubó el extracto a 4ºC un mínimo de cuatro horas. Luego se centrifugó 10 minutos a 10.000 g a 4ºC y se midió el volumen del sobrenadante en una probeta de 10 ml. Se midió la absorbancia del sobrenadante a una longitud de onda de 530 nm y de 657 nm. El contenido de antocianinas se estimó como la diferencia entre el valor de absorbancia obtenido a 530 nm y el obtenido a 657 nm. Finalmente las medidas se expresaron como DO x ml extracto/g de peso fresco. Material y Métodos 61 3.2. 3.2.3.2. 3.2.9 99 9. .. .- -- - Análisis de elementos esenciales Análisis de elementos esencialesAnálisis de elementos esenciales Análisis de elementos esenciales El análisis de los elementos esenciales de la pared celular se llevó a cabo en los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Málaga, donde se llevaron las muestras de paredes celulares para su análisis. Se realizaron dos tipos de análisis: análisis elemental cuantitativo y espectrometría atómica, que pasamos a describir someramente. El análisis elemental cuantitativo de muestras sólidas, líquidas viscosas y filtros permite obtener el contenido de C (carbono), H (hidrógeno), N (nitrógeno), S (azufre) y O (oxígeno) medido en porcentaje respecto al peso. La técnica de Análisis Elemental está totalmente automatizada, y se basa en la combustión completa de la muestra, en condiciones óptimas (950 a 1300 ºC y atmósfera de oxígeno puro), para convertir los elementos antes mencionados en gases simples (anhídrido carbónico, nitrógeno, agua y anhídrido sulfuroso). Estos gases, después de ser separados con distintas técnicas (columna cromatográfica, infrarrojos) según el equipo utilizado, son medidos y se procesan teniendo en consideración el peso de la muestra y los datos proporcionados por una muestra patrón obteniéndose de este modo el contenido porcentual de cada elemento en la muestra. La espectrometría atómica, en términos generales, está basada en la medición de los espectros de absorción, emisión o fluorescencia de átomos o iones elementales. Hay dos regiones del espectro que dan información atómica: la ultravioleta/visible y la de rayos X. Por otra parte, los iones cargados pueden ser separados y determinados mediante dispositivos denominados espectrómetros de masas. Los espectros atómicos ultravioleta y visible se obtienen mediante un adecuado tratamiento térmico que convierte los componentes de una muestra en átomos o iones elementales gaseosos. La emisión, absorción o fluorescencia de la mezcla gaseosa resultante sirve a continuación para la determinación cualitativa y cuantitativa de uno o varios de los elementos presentes en la muestra. Capítulo 3 62 3.2.10. 3.2.10.3.2.10. 3.2.10.- -- - Medida de la dureza de los frutos Medida de la dureza de los frutosMedida de la dureza de los frutos Medida de la dureza de los frutos La dureza de los frutos se midió empleando un penetrómetro manual (modelo FT02, Effegi, Italy) (Figura 3.6) que mide la resistencia de un fruto a ser penetrado con una aguja plana. La dureza se midió en frutos recién recolectados. El aparato se colocó siempre de manera perpendicular al fruto haciendo una leve presión hasta que la aguja entraba en el fruto. Estas medidas se realizaron en la zona de mayor diámetro del fruto, a una profundidad aproximada de 0,5 cm. La superficie de las agujas varió dependiendo de los estadios de maduración estudiados, siendo para el fruto verde de 0,78 mm2, para el blanco y el intermedio de 3,14 mm2 y para el fruto rojo de 9,62 mm2. Figura 3.6: Figura 3.6:Figura 3.6: Figura 3.6: Medición de dureza en frutos de fresa con el penetrómetro (autor: Silvia JiménezBermúdez. Fotografía usada con permiso del autor). 3.2.11 3.2.113.2.11 3.2.11. .. .- -- - Caracterización histológica Caracterización histológicaCaracterización histológica Caracterización histológica de frutos de fresa de frutos de fresade frutos de fresa de frutos de fresa La caracterización histológica que se muestra en esta tesis y que aparece como resultado en el capítulo 6: “Efecto de la inhibición por tecnología antisentido de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las pectinas y el reblandecimiento del fruto de fresa”, se corresponde al artículo publicado (anexo I) y sirve para apoyar nuestros resultados. Esta caracterización histológica fue realizada por Silvia JiménezBermúdez. Material y Métodos 63 Las muestras analizadas se cortaron en fragmentos de 0,5 cm de frutos recién recogidos procedentes de diferentes tejidos y de la zona de máximo diámetro, separando los bloques de inclusión en Epidermis-Córtex por un lado y Médula por otro. Los cortes histológicos del fruto se realizaron utilizando el Kit comercial Historesin embedding de Leica. El proceso al que se sometieron los frutos consistió en una inmersión en una solución fijadora comercial Bouin durante 24 horas. Posteriormente se deshidrataron en una serie de etanoles diluidos (primero se colocaron en etanol 70%, 30 minutos 2 veces, luego en etanol 80%, 30 minutos 2 veces y por último etanol 95% 1 hora 2 veces). Posteriormente se pasó a la solución de preinfiltración-infiltración (incluida en el Kit). Como último paso se embebieron en la solución polimerizante Embedding medium que incluía el Kit. Los bloques y la polimerización de la parafina se realizaron a temperatura ambiente. Una vez endurecida la resina, se obtuvieron secciones transversales de 4µm empleando un microtomo de deslizamiento (HN 340 Micro Heidelberg). Se colocaron los cortes en una gota de agua destilada a 37ºC para que se estiraran en el mismo portaobjetos y se dejaban secar en una plancha calefactora a 37ºC. Para teñir las muestras se empleó rojo rutenio para las pectinas, a una concentración 0,2g/l durante dos horas; pasado ese tiempo se enjuagó con agua destilada. Para la tinción de celulosa se utilizó tionina a una concentración de 0,25 g/l durante 1 minuto; pasado ese tiempo, la muestra se enjuagaba con una solución de NaHCO3 (1 g/l). Las muestras se visualizaron mediante microscopio óptico con distintos aumentos. En algunos casos se estimó el área celular mediante el programa informático Visilog 6. 3. 3.3. 3.2. 2.2. 2.12 1212 12. .. .- -- - Análisis estadístico de los datos Análisis estadístico de los datosAnálisis estadístico de los datos Análisis estadístico de los datos. .. . Los datos fueron analizados en SPSS statitics 22 o R (versión 3.1.2) mediante análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias (T de Student y Test HSD de Tukey), según el caso, y previa verificación de la homogeneidad de las varianzas (Test Capítulo 3 64 de Levene) y normalidad (Shajuro-Wilk) o igualdad de varianzas respectivamente. Para la comparación estadística se tomó un intervalo de confianza del 95% y se usaron al menos tres réplicas. Los datos fueron representados gráficamente usando SigmaPlot 11.0 Notebook. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CAPÍTULO 4. Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y fraccionamiento de la pared celular ! ! Elección del protocolo 67 4. 4.4. 4.- -- - Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y fraccionamiento de la pared celular fraccionamiento de la pared celularfraccionamiento de la pared celular fraccionamiento de la pared celular La elección de un protocolo de extracción de pared celular se realizó con frutos de fresón del cultivar Chandler no transgénicos en estadio rojo. Se ensayaron tres protocolos de extracción: dos previamente empleados en distintos frutos, incluida la fresa, a los que denominamos protocolo de Redgwell y protocolo de Huber, y una modificación del método empleado por Huber que consistió en añadir al original un paso previo de extracción (detalles en el capítulo 3 “Material y Métodos”). El objetivo era conocer qué protocolo era más adecuado para frutos de fresa en cuanto a la cantidad de pared celular extraída y su posterior fraccionamiento, ya que en aquellos momentos estaba menos estudiado que otros frutos. Además, también se evaluó a efectos comparativos la cantidad de pectinas y de azúcares de las distintas fracciones, la presencia de distintos elementos esenciales y el comportamiento en cromatografía de filtración en gel de las fracciones. Esta última técnica permite estimar la masa molecular de los principales polímeros presentes en las fracciones y ver posibles diferencias. Durante el fraccionamiento de la pared celular descrito en el capítulo 3 “Material y Métodos”, se obtenían las fracciones denominadas AGUA, CDTA, CARBONATO, KOH 1M y KOH 4M. En la elección del protocolo se tuvieron en cuenta preferentemente las fracciones en las que se solubilizaban de forma mayoritaria las pectinas, en concreto, las fracciones AGUA, CDTA y CARBONATO. Las fracciones solubilizadas con KOH 1M y 4M, ricas en hemicelulosa, también contienen una pequeña proporción de pectinas pero no fueron consideradas a la hora de comparar y elegir protocolo. 4 44 4.1 .1.1 .1. .. .- -- - Extracción de pared celular y f Extracción de pared celular y fExtracción de pared celular y f Extracción de pared celular y fraccionamiento raccionamientoraccionamiento raccionamiento En la Figura 4.1 A se muestra la cantidad de pared celular referida a peso de fruto. Se observó que las cantidades obtenidas mediante el protocolo de extracción de Capítulo 4 68 Redgwell y el de Huber fueron muy similares, en torno a 0,7-0,8 g por 100 g fruto y no se observaron diferencias significativas entre ambos métodos. En el caso de la modificación ensayada del protocolo de Huber se registró una disminución muy significativa de la cantidad de pared celular extraída, con valores alrededor de 0,3 g por cada 100 g de fruto. PC PAW g fracción / 100 g fruto 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 R H HM a a b a a AGUA CDTA CARBONATO g fracción / 100 g fruto 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 R H HM ab a a b aa b b A B Figura FiguraFigura Figura 4. 4.4. 4.1 11 1: Cantidad de pared celular y fraccionamiento obtenido. A AA A: :: : Cantidad de pared celular (PC) y de fracción PAW, expresado en g/ 100 g fruto. B BB B: :: : Fraccionamiento de la pared celular, expresado en g fracción /100 g de fruto. R RR R corresponde al protocolo de Redgwell, H HH H al de Huber y HM HMHM HM, al de Huber modificado. En la comparación de los tres protocolos, para cada fracción, los valores medios no fueron significativamente diferentes si comparten la misma letra, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%. Elección del protocolo 69 También comparamos la cantidad de material que queda solubilizado en el medio de extracción que contiene fenol, acético y agua, (fracción PAW). Se obtuvieron valores en torno a los 0,15 g por 100 g de fruto y esta cantidad fue similar con los protocolos de Redgwell y de Huber modificado. Recordemos que esta fracción no se extraía con el protocolo de Huber. En lo que se refiere al fraccionamiento de la pared celular podemos observar en la Figura 4.1 B las cantidades de fracción soluble en agua, en CDTA y en carbonato referidas también a fruto. Se observó que la cantidad de fracción AGUA de la extracción de Huber fue estadísticamente superior (0,12 ± 0,013 g/100 g fruto) a las obtenidas usando el protocolo de Redgwell (0,04 ± 0,005 g/100 g fruto) y el modificado de Huber (en torno a 0,025 g/100 g fruto). Esto se pudo deber a que con el agua se extraían, en el caso de Huber, más cantidad de polímeros de pared solubles, ya que no se habían solubilizado previamente con el paso de PAW, como en el caso de Redgwell y de Huber modificado. La cantidad más alta de fracción soluble en CDTA se obtuvo usando el protocolo de Redgwell, pero sin llegar a ser estadísticamente distinta a la de Huber. Por el contrario, la cantidad de fracción obtenida con el protocolo modificado de Huber fue significativamente menor que las obtenidas con los otros dos protocolos. De igual forma, en el caso de la fracción CARBONATO, no se apreciaron diferencias entre los protocolos de Redgwell y de Huber en cuanto a cantidad de fracción obtenida, pero esta fracción fue significativamente inferior en la modificación del protocolo de Huber. Al tratarse de un fraccionamiento de la pared celular es conveniente expresar los datos obtenidos del fraccionamiento no solo por peso de fruto, sino también por cantidad de pared celular de partida (Figura 4.2). Capítulo 4 76 4 44 4.4.1 .4.1.4.1 .4.1. .. .- -- - Perfiles cromatográficos de las Perfiles cromatográficos de lasPerfiles cromatográficos de las Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y fracción pectinas solubles (fracción PAW y fracción pectinas solubles (fracción PAW y fracción pectinas solubles (fracción PAW y fracción AGUA AGUAAGUA AGUA) )) ) Los perfiles de pectinas más solubles, los más fácilmente extraíbles de la pared celular, se muestran en la Figura 4.6. Los dos primeros cromatogramas (4.6 A y 4.6 B) corresponden a pectinas extraídas aplicando el protocolo de Redgwell. El primero, en concreto, pertenece a la fracción PAW (Figura 4.6 A) y en él aparecen dos bloques bien definidos de azúcares. El de mayor masa molecular, que eluye entre los 65 y 100 ml, corresponde con un componente péctico, como pone en evidencia su coincidencia con el perfil de ácido galacturónico. Este primer pico contiene polímeros cuya masa molecular hace que se queden en el volumen de vacío de esta columna donde eluye el azul de dextrano de 2.000 KDa. El resto del perfil está constituido por polisacáridos no pécticos que se distribuyen por un amplio rango de la columna. En la fracción AGUA extraída mediante el protocolo de Redgwell (Figura 4.6 B) se observó que las pectinas eluían en un amplio rango de la columna y que el perfil era paralelo al de azúcares totales lo que indican que estos azúcares probablemente son pectinas. El volumen al que eluyen estas pectinas muestran que son de menor masa molecular que las presentes en la fracción PAW, ya que eluyeron entre los 110 y los 180 ml, correspondiendo la zona del pico de esta fracción a una masa molecular próxima a los 12 KDa. La fracción de AGUA extraída mediante el protocolo de Huber (Figura 4.6 C) presentó un bloque de azúcares que se correspondían con pectinas al inicio de la columna; estos polímeros presentaban un pico en torno a los 80 KDa. Al final de la columna se observan azúcares de menor tamaño molecular (entre los 160 y los 180 ml) que no estaban formados por ácido galacturónico. Elección del protocolo 77 A Vol (ml) 40 60 80 100 120 140 160 180 Absorbancia 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 AU AZU B 60 80 100 120 140 160 180 Absorbancia 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 AU AZU C Volumen (ml) 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Absorbancia 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 AU AZU Figura Figura Figura Figura 4. 4.4. 4.6. 6. 6. 6. Perfiles cromatógraficos de las pectinas solubles. A . A. A . A: Perfil cromatográfico de la fracción PAW extraída con el protocolo de Redgwell. B BB B: :: : Perfil de la fracción AGUA extraída mediante el protocolo de Redgwell. C CC C: :: : Cromatografía de la fracción AGUA extraída con el protocolo de Huber En color gris se representan las medidas de azúcares, en color morado y verde las de ácidos urónicos. Las absorbancias de los ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y los azúcares a 450 nm. Las flechas indican el volumen al que eluyeron los estándares de pesos moleculares: azul de 2.000 KDa, rosa de 80 KDa, verde de 12 KDa. Capítulo 4 78 Las diferencias comentadas quedan patentes en una sola figura de forma más clara, representando juntos los perfiles de ácido galacturónico de las fracciones PAW y AGUA extraídas con el protocolo de Redgwell y comparándolos con el de Huber para la fracción AGUA (Figura 4.7). Las tres fracciones se diferencian en sus componentes pécticos de una manera clara. Las pectinas de mayor tamaño se detectan en la fracción PAW (con un pico en torno a los 2.000 KDa) y las más pequeñas proceden de la fracción de AGUA extraída con el protocolo de Redgwell con un pico de masa molecular próxima a los 12 KDa. Las pectinas de la fracción AGUA extraídas con el protocolo de Huber se encontrarían en una zona intermedia, con el pico próximo a una masa molecular de 80 KDa, siendo el perfil bastante más suave y redondeado lo que puede interpretarse como una evidencia de degradación que ha provocado que los polímeros pécticos solubles de mayor tamaño no se detecten con este protocolo porque posiblemente hayan sido parcialmente procesados, desplazando el perfil a la derecha. Volumen (ml) 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Absorbancia (515 nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 PAW-R AGUA-R AGUA-H Fig FigFig Figura uraura ura 4. 4.4. 4.7 77 7: Perfil cromatográfico de las fracciones PAW y AGUA extraídas con el protocolo de Redgwell y Huber. Se representan las medidas de ácidos urónicos (relativizados) (en verde el correspondiente al protocolo de Redgwell y en morado a protocolol de Huber). Las flechas indican las masas moleculares correspondientes a los tres estándares con los que se calibró la columna: azul de 2.000 KDa, rosa de 80 KDa y en verde el de 12 KDa. Elección del protocolo 79 Mediante el protocolo de extracción de Redgwell fue por tanto posible solubilizar pectinas de gran tamaño que se extraían con el PAW y otras más pequeñas y más entremezcladas con la pared, extraídas con el agua. Con el protocolo de Huber, al no tener fracción similar al PAW, se extraían todas esas pectinas con el agua, y lo que se obtenía era un perfil intermedio que parecía ser una mezcla de las pectinas extraídas con Redgwell, pero donde estaban ausentes las pectinas de elevada masa molecular extraídas con el PAW. Este resultado sugiere la posibilidad de una peor preservación de ese componente péctico cuando se usa el procedimiento de Huber. 4 44 4.4.2. .4.2..4.2. .4.2.- -- - Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA)Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) El CDTA es un agente quelante de calcio que acaba retirando este catión de los enlaces iónicos que unen cadenas de pectinas posibilitando una solubilización de éstas, a las que nos referimos como iónicamente unidas a la pared. Se observó en la fracción CDTA extraída con la metodología de Redgwell (Figura 4.8 A) que los perfiles de azúcares y de ácidos urónicos fueron muy similares, por lo que se trataría de una fracción compuesta mayoritariamente por pectinas. Sólo se observó una pequeña fracción de azúcares de pequeño tamaño cuyo perfil no coincidía con el péctico en la zona de bajo peso molecular del cromatograma. Se podría decir que el grueso de esta fracción se corresponde con pectinas mayores de 2.000 KDa que eluyen de la columna entre los 75 ml y los 140 ml. En la fracción CDTA extraída con el protocolo de Huber (Figura 4.8 B) se observó que, al igual que en el caso anterior, que la primera parte del perfil correspondía con polímeros de naturaleza péctica y al final de la columna eluían azúcares de menor masa molecular. La mayoría de las pectinas de esta fracción son pectinas mayores de 2.000 KDa. Capítulo 4 80 Vol (ml) 60 80 100 120 140 160 180 200 Absorbancia 0,05 0,10 0,15 0,20 AU AZU Volumen (ml) 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Absorbancia 0,0 0,1 0,2 0,3 AU AZU B A Fig FigFig Figura uraura ura 4. 4.4. 4.8 88 8: Perfiles cromatográficos de la fracción CDTA. A AA A: Perfil obtenido de la fracción extraída con el protocolo de Redgwell. B BB B: Perfil obtenido con el protocolo de Huber. En línea de color gris se representa el perfil correspondiente a los azúcares y en color morado y verde los ácidos urónicos. En ambos perfiles, la flecha indica el volumen de elución correspondiente al estándar de 2.000 KDa. Las absorbancias de los ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y los azúcares a 450 nm. La representación en el mismo gráfico de los dos perfiles pécticos (Figura 4.9) permite concluir que el perfil correspondiente al protocolo de Redgwell está algo desplazado a la izquierda y, por ello, más enriquecido en polímeros de mayor masa molecular; además el perfil es algo más estrecho. Ambas observaciones pueden indicar una mayor degradación de las pectinas con la extracción de Huber. Elección del protocolo 81 Volumen (ml) 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Absorbancia (515 nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 AU-R AU-H Fig FigFig Figura uraura ura 4. 4.4. 4.9 99 9: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos (relativizados) de la fracción CDTA extraída con el protocolo de Redgwell (AU-R) y Huber (AU-H). Se representan las medidas de ácido urónico (en verde la del protocolo de Redgwell y en morado la de Huber). La flecha indica el volumen de elución correspondiente al estándar de 2.000 KDa. El conjunto de resultados obtenidos hasta aquí, junto al hecho que el protocolo de Redgwell se había utilizado por otros autores en fresa (Redgwell y col., 1997b; Lara y col., 2004) nos llevó a la adopción del protocolo de Redgwell para la extracción de las paredes celulares de nuestros frutos de fresa. 4 44 4.5 .5.5 .5. .. .- -- - Muestras de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO) Muestras de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO) Muestras de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO) Muestras de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO) Inicialmente tuvimos problemas de solubilización de la fracción extraída con carbonato sódico lo que nos impedía separarla mediante cromatografía de filtración en gel. Ensayando distintas posibilidades concluimos que el problema era el pH relativamente bajo del tampón acetato (pH 5,0) y que se conseguiría una buena solubilización a pH superiores. En concreto, con tampón TRIS-HCl (pH 8,4) se consiguió una mejor solubilización de la fracción CARBONATO sin interferir en la medida de los ácidos urónicos presentes en las muestras. La fracción CARBONATO había sido menos estudiada y caracterizada por cromatografía de filtración en gel en Capítulo 4 82 trabajos previos y el hecho de la menor presencia de pectinas en ella también dificultaba su detección al diluirse la muestra en las columnas. Esto nos llevó a tener que optimizar las condiciones de análisis cambiando también el volumen de las columnas. Ensayamos en columnas de 25 ml y se probó su comportamiento con estándares con los dos geles disponibles, usando como tampón de elución TRIS-HCl (pH 8,4). Como estándar se empleo el azul de dextrano de 2.000 KDa. En este caso se mide la absorbancia del azul directamente a 630 nm ya que el dextrano comercial tiene color azul con un pico de absorbancia en esta longitud de onda. Con la Sepharosa Cl-6B se obtuvo el perfil que se muestra en la Figura 4.10 A. Vol (ml) 10 20 30 Absorbancia (630 nm) 0,1 0,2 0,3 0,4 Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia (630 nm) 0,00 0,05 0,10 0,15 B A Figura FiguraFigura Figura 4. 4.4. 4.10 1010 10 Perfiles obtenidos para el azul de dextrano en columnas de 25 ml con el tampón de elución TRIS pH 8,4. La figura A AA A: :: : con el gel de Sepharosa CL6B y la B BB B: :: : con Sepharosa CL2B. Elección del protocolo 83 El azul de dextrano eluyó en un volumen de 14 ml en la columna con Sepharosa CL6B (Figura 4.10 A) y en el caso de la columna de 25 ml con Sepharosa Cl-2B, el estándar de 2.000 KDa salía a los 26,5 ml (Figura 4.10 B). El siguiente paso fue separar por cromatografía las muestras de la fracción CARBONATO en ambas columnas (Figuras 4.11 y 4.12). El perfil en la columna con Sepharosa CL-6B, mostrado en la Figura 4.11, fue muy parecido al obtenido con el estándar de 2.000 KDa e indicaba que los polímeros presentes en esta fracción tenían una masa molecular mayor de 2 millones de Daltons y eluían mayoritariamente en el volumen de vacío de la columna en torno a los 14 ml. Volumen (ml) 10 20 30 40 Absorbancia (515 nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 Figura Figura Figura Figura 4. 4.4. 4.11 1111 11: Perfil cromatográfico en columna de 25 ml con gel de Sepharosa CL6B de los ácidos urónicos de una muestra de CARBONATO. La flecha indica el volumen de elución del estándar de 2.000 KDa. Cuando se utilizó el gel de Sepharosa Cl-2B observamos que gran parte de la muestra eluyó antes del estándar de 2.000 KDa, (Figura 4.12) indicando así, la presencia de polímeros de masa molecular muy superior a los 2.000 KDa, detectándose al menos dos picos anteriores al pico del estándar. Capítulo 4 84 Volumen (ml) 0 10 20 30 40 50 Absorbancia (515 nm) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 Figura Figura Figura Figura 4. 4.4. 4.12 1212 12: Perfil cromatográfico en columna de 25 ml con gel de Sepharosa CL2B de los ácidos urónicos de una muestra de CARBONATO. La flecha indica el volumen de elución del estándar de 2.000 KDa. El buen comportamiento observado en estas columnas de menor tamaño al optimizar las condiciones de análisis de esta fracción nos llevó a probar su uso y generalizarlo al resto de fracciones. Ello supuso un ahorro importante de tiempo, material y cantidad de muestra, además de proporcionar una resolución suficiente para la comparación de las distintas fracciones y muestras. 4 44 4.6 .6.6 .6. .. .- -- - Mejoras ulteriores del protocolo de extracción Mejoras ulteriores del protocolo de extracciónMejoras ulteriores del protocolo de extracción Mejoras ulteriores del protocolo de extracción La aplicación del protocolo de extracción de Redgwell a distintos estadios de desarrollo y la realización posterior de cromatografías puso en evidencia ciertas discrepancias en los resultados obtenidos en las fracciones solubles (PAW y AGUA) difíciles de interpretar. En concreto, se detectó un pico de pectinas presente en la muestra de PAW proveniente de fruto en estadio verde que no aparecía en las muestras de PAW en estadio rojo. En la fracción AGUA del estadio verde también se observó un pico de masa molecular algo inferior. Se realizó una extracción de pared Elección del protocolo 85 celular y posterior fraccionamiento pero evitando con cuidado la presencia de los aquenios del fruto. Al realizar las cromatografías con esta precaución comprobamos que el pico mencionado de la fracción PAW desaparecía (Figura 4.13 A), ocurriendo algo similar también ocurría con la fracción AGUA (Figura 4.13 B). Vol (ml) 10 20 30 40 Absorbancia (515 nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 PAW Sin Aquenios PAW Con Aquenios Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Absorbancia (515 nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 AGUA Sin Aquenios AGUA Con Aquenios A B Figura Figura Figura Figura 4. 4.4. 4.13. 13.13. 13. Perfiles cromatográficos de ácidos urónicos de muestras en estadio verde. A AA A: :: : Cromatografía de ácidos urónicos de la fracción PAW. B BB B: :: : Cromatografía de ácidos urónicos de muestras de la fracción AGUA. En línea continua representa las muestras sin los aquenios y en línea discontinua las muestras con los aquenios. En el resto de fracciones, ni en el estadio verde ni en rojo, se observaron diferencias al comparar cromatogramas de las extracciones con y sin aquenios. De cualquier modo, el hecho de que si se observaran diferencias en las dos fracciones Capítulo 5 92 las paredes y de su componente péctico de frutos en estadio inmaduro con las de frutos maduros. 5.1 5.15.1 5.1 Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Extracción de pared celular y fraccionamiento Los resultados mostraron que el contenido en pared celular disminuye significativamente durante la maduración cuando se compararon los estadios verde y rojo (Figura 5.1 A) con un rendimiento aproximado a 8 g de pared por 100 g de fruto verde y unas ocho veces menos en fruto rojo. A PC g fracción / 100 gfruto 0 2 4 6 8 10 12 FRUTOVERDE FRUTO ROJO * * B PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH 4M g Fracción / 100 g fruto 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * * Figura 5.1 Figura 5.1Figura 5.1 Figura 5.1. Cantidad de fracción expresada en g por 100 g de fruto. A: A:A: A: Gramos de pared celular por 100 g de fruto en estadio verde y en estadio rojo. B: B:B: B: Gramos de fracción por 100 g de fruto. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%. Maduración 93 También se observó que todas las fracciones de pared celular tienden a ser menores en las paredes de fruto rojo (Figura 5.1 B). Así, el rendimiento de la fracción PAW procedente de fruto verde tuvo un valor de 0,3 ± 0,04 g por 100 g de fruto y el de fruto rojo 0,2 ± 0,03 g por 100 g de fruto, sin llegar a ser estas diferencias significativas. La cantidad de la fracción AGUA fue similar en ambos estadios, en fruto verde mostró un valor de 0,14 ± 0,03 y en fruto rojo de 0,13 ± 0,04 g por 100 g de fruto. La fracción más abundante es la fracción CDTA, especialmente en fruto verde, con una valor de 1,09 ± 0,18 g/100 g fruto mientras que en fruto rojo alcanza los 0,29 ± 0,046 g/100 g. En la fracción CARBONATO también se aprecia una disminución significativa, el valor alcanzado en fruto verde es de 0,65 ± 0,24 g/100 g fruto, mientras que en fruto rojo es de 0,13 ± 0,018 g/100 g fruto. Las fracciones solubles en KOH 1M y 4M son las menos abundantes, en fruto rojo la cantidad obtenida se aproxima a los 0,05 g por 100 g fruto en ambos casos. En el fruto verde, la cantidad de fracción obtenida oscila entre los 0,2 g/ 100 g fruto del KOH 1M y los aproximadamente 0,1 g/ 100 g fruto en el caso del la fracción KOH 4M, sin que estas diferencias lleguen a ser estadísticamente significativas. En términos generales, el que la cantidad de las distintas fracciones por peso de fruto sea inferior en fruto rojo es consecuencia directa de la menor cantidad de pared. De hecho, al estimar los rendimientos de las fracciones de pared celular respecto a la cantidad de pared celular inicial se observa un incremento generalizado de las distintas fracciones en el estadio rojo (Figura 5.2). Capítulo 5 94 AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH 4M mg fracción/100 mg PC 0 10 20 30 40 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * * Figura 5.2. Figura 5.2.Figura 5.2. Figura 5.2. Rendimiento en las fracciones de pared celular expresada como mg de fracción por 100 mg de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD deTukey, con un límite de confianza de 95%. La fracción AGUA en fruto verde tiene un valor muy bajo de 1,85 ± 0,39 mg/100 mg de pared celular, siendo estadísticamente inferior que en el estadio rojo en el que alcanzan los 13,33 ± 4,01 mg por 100 mg de pared celular. La fracción CDTA sigue siendo la mayoritaria, observamos en fruto verde un valor de 14,0 ± 2,40 y en fruto rojo prácticamente el doble, 29,26 ± 4,62 mg/100 mg de pared celular, siendo estas diferencias significativas. En las fracciones unidas covalentemente, vemos que en estadio verde se obtienen alrededor de 8 mg /100 mg de pared celular y en el rojo alcanza los 13 mg/100 mg de pared. Las fracciones KOH 1M y 4M son las más escasas, llegando en fruto verde a los 2,5 ± 0,89 y aproximadamente 1 mg/100 mg de pared y en fruto rojo en torno a los 4,4 mg/100 mg de pared celular en ambas fracciones. Las diferencias encontradas en las fracciones CARBONATO, KOH 1M y KOH 4M, no fueron estadísticamente significativas. Se confirma así un aumento en la cantidad de pectinas en las fracciones, AGUA y CDTA en estadio rojo. Además, la fracción CDTA es la más abundante en ambos estadios y las dos fracciones de hemicelulosa las menos abundantes. Maduración 95 5 55 5.2 Cantidad de poliurónidos obtenidos .2 Cantidad de poliurónidos obtenidos.2 Cantidad de poliurónidos obtenidos .2 Cantidad de poliurónidos obtenidos Los protocolos de Van den Hoogen (1998) y Dubois y col. (1956) permitieron estimar la cantidad de ácidos urónicos y de azúcares totales, respectivamente, en las distintas fracciones obtenidas, tal como se describe en el Capítulo 3 “Material y Métodos”. 5 55 5.2.1. .2.1..2.1. .2.1.- -- - Cantidad de ácidos urónicos Cantidad de ácidos urónicosCantidad de ácidos urónicos Cantidad de ácidos urónicos En los frutos en estadio rojo, observamos en todas las fracciones una disminución en la cantidad de pectinas obtenidas referidas a 100 g de fruto, siendo las diferencias estadísticamente significativas en todos los casos. Esto se debe de nuevo a la menor cantidad de pared celular por peso fresco de fruto observada en estadio rojo. Así en la fracción AGUA se produce una disminución de 67,81 ± 7,44 mg AU/100 g de fruto a los 51,24 ± 7,32 mg AU/100 g de fruto que presenta en rojo (Figura 5.3 A). Los mayores descensos son en la fracción CDTA, que pasa de tener en fruto verde alrededor de 150 mg de AU/100 g fruto a sólo 57 mg/100 g fruto en rojo, y en la fracción CARBONATO que baja prácticamente un 75%. Lógicamente el contenido péctico de las fracciones KOH son los menos abundantes pero también encontramos una reducción de pectinas estadísticamente significativa en los frutos rojos. Capítulo 5 96 AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M mg AU / 100 mg PC 0 2 4 6 8 10 FRUTO VERDE FRUTO ROJO AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M mg AU /100 g Fruto 0 50 100 150 200 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * * * ** A * * * B Figura 5.3. Figura 5.3.Figura 5.3. Figura 5.3. Cantidad de ácidos urónicos en las fracciones de pared celular. A: A:A: A: Ácidos urónicos expresados como mg por 100 g de fruto. B: B:B: B: Ácidos urónicos en mg relativizados por 100 mg de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD deTukey, con un límite de confianza de 95%. Al representar los datos de ácidos urónicos referidos a 100 mg de pared celular (Figura 5.3 B) se pone de manifiesto que en estadio maduro todas las fracciones se enriquecen en el componente péctico, siendo la presencia de ácido urónico lógicamente mayor en las fracciones pécticas (AGUA, CDTA y CARBONATO). En la fracción AGUA encontramos un aumento que es estadísticamente significativo durante la maduración del fruto pasando de 0,87 ± 0,09 mg de AU por 100 mg de pared celular en estadio verde a 5,25 ± 2,05 mg de AU /100mg de pared celular del estadio rojo. La misma tendencia se observa en las fracciones CDTA y CARBONATO, con Maduración 97 incrementos en torno al 100% en ambas, pero la variabilidad entre muestras hace que estas diferencias no sean estadísticamente significativas. Las dos fracciones enriquecidas en el componente hemicelulósico, KOH 1M y 4M, también muestran un aumento muy significativo de ácidos urónicos por contenido de pared celular que, prácticamente, en un caso quintuplica y en el otro cuadruplica el contenido observado en fruto verde 5 55 5.2.2. .2.2..2.2. .2.2.- -- - Ca CaCa Cantidad de azúcares totales. ntidad de azúcares totales.ntidad de azúcares totales. ntidad de azúcares totales. Como muestra la figura 5.4 A se observa una disminución generalizada en fruto rojo en la cantidad de azúcares referida a peso de fruto con la maduración del fruto. En la fracción más soluble, (fracción AGUA), se pasa de 180,34 ± 23,46 a unos 55 mg de azúcares por 100 g de fruto tras la maduración. Encontramos también una disminución significativa en las fracciones KOH 1M y 4M, pasando de 231,13 ± 99,53 en paredes del fruto verde a 84,42 ± 13,28 mg de azúcares por 100 g de fruto en rojo en el caso de KOH 1M, mientras que en la fracción KOH 4M disminuye drástica y significativamente; en estadio verde pasa de tener 738,90 ± 315,63 a 60,13 ± 7,96 mg por 100 mg de estadio rojo. Al igual que ocurría con el caso de los ácidos urónicos, esta tendencia generalizada de disminución del contenido de azúcares por peso fresco en las fracciones de fruto rojo se debe al hecho de que la cantidad de pared celular extraída por peso de fruto es muy inferior en el estadio maduro. Capítulo 5 98 AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M mg AZU/100 g Fruto 0 200 400 600 800 1000 1200 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * * * * * A AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M mg AZU / 100g PC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * * B Figura Figura Figura Figura 5. 5.5. 5.4. 4.4. 4. Cantidad de azúcares totales en las distintas fracciones de pared celular. A: A:A: A: Azúcares expresados como mg por 100 g de fruto. B: B:B: B: Azúcares expresados como mg por 100 g de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%. De hecho, cuando se normalizan los datos de medida de azúcares a la cantidad de pared celular inicial, observamos que sólo las fracciones consideradas hemicelulósicas (KOH 1M y 4M) muestran un incremento en estadio rojo frente al verde inmaduro (Figura 5.4 B). En ambas fracciones el contenido de azúcares prácticamente se duplica en fruto rojo. Maduración 99 5 55 5.3 Elementos esenciales rojo/verde .3 Elementos esenciales rojo/verde.3 Elementos esenciales rojo/verde .3 Elementos esenciales rojo/verde El análisis de los elementos esenciales mayoritarios (O, C, H y N) en frutos en estadio verde y rojo no mostró diferencias significativas relativas a la maduración (Figura 5.5 A), así, encontramos que el oxígeno (con un 44%) y el carbono (40%) son los elementos más abundantes en la pared celular y el hidrógeno (7%) y el nitrógeno (1,3%) presentan menor abundancia. B Ca K Mg Na mg/g PC 0 1 2 3 4 5 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * O C H N g / 100g Pared celular 0 10 20 30 40 50 60 FRUTO VERDE FRUTO ROJO A B* ** * Figura 5.5 Figura 5.5Figura 5.5 Figura 5.5: Cantidad de elementos esenciales de la pared celular extraída en fruto rojo y en fruto verde. A: A:A: A: Contenido en C, O, H y N, expresado en g por 100 g de pared celular. B: B:B: B: Contenido en B, Ca, K, Mg y Na, expresado en mg por g de pared celular. Para cada elemento, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de t.Student, con un límite de confianza de 95%. Capítulo 5 100 Por otro lado, en cuanto a los elementos minoritarios (Figura 5.5 B), el boro no fue detectable en fruto verde con la metodología empleada mientras que en fruto rojo, muestra un valor próximo a 0,3 mg por gramo de pared. Algo parecido ocurre con el sodio, siendo la cantidad obtenida prácticamente indetectable en el fruto inmaduro (0,01 mg por gramo de pared celular) alcanzando en fruto maduro los 0,32 ± 0,01 mg por gramo de pared celular. Tanto el potasio como el magnesio tienen mayor representación en fruto verde que en fruto rojo, mostrando el potasio un valor de 0,45 ± 0,02 mg de potasio por g de pared en fruto verde y de 0,29 ± 0,02 mg por gramo de pared celular en el rojo. En lo que se refiere al magnesio, presenta unos 0,25 mg en fruto verde y 0,13 ± 0,01 mg por gramo en fruto rojo. En todos los casos las diferencias encontradas entre ambos estadios fueron estadísticamente significativas. El elemento más abundante en este grupo fue el calcio, en fruto verde su contenido se aproxima a los 4 mg de calcio por gramo de pared celular y en fruto rojo se reduce hasta prácticamente la mitad. 5.4. 5.4.5.4. 5.4.- -- - Hinchamiento Hinchamiento Hinchamiento Hinchamiento in vitro in vitroin vitro in vitro de la pared durante la maduración de la pared durante la maduraciónde la pared durante la maduración de la pared durante la maduración Recordamos que para estudiar el hinchamiento in vitro de la pared hay que hidratarla (Capítulo 3: “Material y Métodos”), para ello se añade agua en unos viales de cristal de diámetro reducido, se mezcla bien y se deja reposar. La pared va sedimentando a la vez que se hidrata, al estabilizarse esta sedimentación la altura a la que queda la columna de pared hidratada se toma como medida del hinchamiento. La Figura 5.6 muestra como quedaría la pared hinchada una vez estabilizada, transcurrido el tiempo de hidratación. Maduración 101 FRUTO ROJO FRUTO VERDE FRUTO VERDEFRUTO ROJO Tratamiento con CDTA Hinchamiento con agua A B Figura 5.6 Figura 5.6Figura 5.6 Figura 5.6: Hinchamiento de fruto rojo y fruto verde una vez estabilizada la altura. A: A:A: A: Hinchamiento con agua. B: B:B: B: Hinchamiento de la pared tras uno de los tratamientos. 5.4.1. 5.4.1.5.4.1. 5.4.1.- -- - Hinchamiento de la pared durante la maduración Hinchamiento de la pared durante la maduraciónHinchamiento de la pared durante la maduración Hinchamiento de la pared durante la maduración Se obtuvieron diferencias significativas al comparar el hinchamiento de la fracción pared celular en los estadios verde y rojo del fruto (Figura 5.7). Altura del sedimento (mm) 0 5 10 15 20 25 FRUTO VERDE FRUTO ROJO * Figura 5.7. Figura 5.7. Figura 5.7. Figura 5.7. Medida (en mm) de la altura de la columna de pared celular hidratada de fruto verde y fruto rojo. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%. Capítulo 5 108 5.5.2. 5.5.2.5.5.2. 5.5.2.- -- - Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA)Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) Los cromatogramas de la fracción soluble en CDTA, representados en la Figura 5.11 A, muestran como los perfiles de azúcares y ácidos urónicos del estadio verde coinciden prácticamente durante toda la columna. Se observa, a groso modo, una curva más o menos redondeada distribuida por todo el perfil que se corresponde con un tamaño de polímeros mayor de 2.000 KDa. Por su parte, el perfil de ácidos urónicos presenta una pequeña subida sin poder considerarse un pico, en torno a los 13 ml que se corresponden con polímeros de gran tamaño. El perfil de azúcares muestra también un pico a los 15 ml. En las muestras provenientes de fruto rojo (Figura 5.11 B), los cromatogramas de la fracción CDTA muestran que también ambos perfiles de azúcares y ácidos urónicos están solapados; se observa un único pico que está más cercano al estándar de 2.000 KDa con respecto al observado en estadio verde, indicando que son polímeros de menor peso molecular. En esta fracción vemos que, tanto en el estadio verde como en el rojo, los perfiles de azúcares coinciden casi en su totalidad con los de ácidos urónicos. Se podría decir que la fracción soluble en CDTA está formada mayoritariamente por pectinas. Comparando los perfiles de ácidos urónicos en la misma gráfica (Figura 5.12) observamos que ambos perfiles prácticamente están solapados con alguna pequeña diferencia. La curva que se corresponde con el estadio verde asoma en la zona de la izquierda de la gráfica y en el estadio rojo por la derecha. Esto sugiere que las pectinas en estadio verde podrían ser de tamaño ligeramente mayor que en el estadio rojo. Maduración 109 B Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Y Data 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 AU AZU A Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 AU AZU Figura 5.11 Figura 5.11Figura 5.11 Figura 5.11: Perfiles cromatográficos de la fracción CDTA. A: A:A: A: Perfil cromatográfico de la fracción CDTA en estadio verde. B: B:B: B: Perfil cromatográfico de la fracción CDTA en estadio rojo. En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos urónicos y en color gris las de azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia (515nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 CDTA-V CDTA-R Figura 5.12: Figura 5.12:Figura 5.12: Figura 5.12: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción CDTA. En color verde los ácidos urónicos del estadio verde y en color rojo los ácidos urónicos del estadio rojo. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Capítulo 5 110 Estos resultados parecen indicar que durante la maduración ocurre una ligera degradación de pectinas en la fracción de pectinas unidas iónicamente y coincide con resultados anteriores (Redgwell y col., 1997b). 5.5.3. 5.5.3.5.5.3. 5.5.3.- -- - Perfiles de Perfiles de Perfiles de Perfiles de pectinas unidas Covalentemente (fracción CARBONATO). pectinas unidas Covalentemente (fracción CARBONATO).pectinas unidas Covalentemente (fracción CARBONATO). pectinas unidas Covalentemente (fracción CARBONATO). La fracción CARBONATO se muestra en la Figura 5.13. Los cromatogramas de la fracción CARBONATO en estadio verde se representan en la Figura 5.13 A. Vemos que tanto el perfil de azúcares como el de los ácidos urónicos presentan dos picos bien definidos. Los azúcares muestran un pico al principio de la columna de gran tamaño molecular que eluye a los 13 ml, que es muy abundante, y otro que se corresponde con polímeros de menor tamaño que eluye entre los 23 y 25 ml. Por su parte, el perfil de ácidos urónicos muestra dos picos que coinciden en el volumen de elución con los del perfil de azúcares. Las abundancias relativas, estimadas por los valores de absorbancia, sugieren que el pico de azúcares de menor masa molecular estaría formado principalmente por pectinas. B Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Y Data 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 AU AZU A Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 Absorbancia 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 AU AZU Figura 5.14 Figura 5.14Figura 5.14 Figura 5.14: Perfiles cromatográficos de la fracción CARBONATO. A: A:A: A: Perfil cromatográfico de la fracción CARBONATO en estadio verde. B: B:B: B: Perfil cromatográfico de la fracción CARBONATO en estadio rojo. En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos urónicos y en color gris las de azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Maduración 111 En el cromatograma de la fracción CARBONATO en estadio rojo (Figura 5.14 B) el perfil de pectinas muestra dos picos bien definidos, al igual que ocurría en el estadio verde. El de mayor peso molecular eluye a los 10 ml y el otro, de menor masa molecular, lo hace entre los 22 y 24 ml aproximadamente. El perfil de azúcares obtenido muestra tres picos diferenciados que eluyen a los 13, a los 17 y, el de menor masa molecular, a los 26 ml coincidiendo con el estándar de 2.000 KDa. Observamos que esta fracción, además de pectinas, tiene una gran proporción de otro tipo de azúcares. Parece que el pico de alto peso molecular en el perfil de azúcares del estadio verde, al degradarse durante la maduración, dando lugar a todos los picos de azúcares más pequeños que aparecen en el estadio rojo. Al comparar los perfiles de ácido galacturónico de la fracción covalente (Figura 5.15) vemos que ambos perfiles tienen dos picos muy bien definidos. Uno de mayor masa molecular que aparece a los 11 ml en el caso del estadio verde y en torno a los 13 ml en el caso del estadio rojo. El otro pico se registra en torno a los 24 ml y está prácticamente solapado en los dos estadios. Volumen (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia (515nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 CARBONATO-V CARBONATO-R Figura 5.15: Figura 5.15:Figura 5.15: Figura 5.15: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción CARBONATO. En color verde los ácidos urónicos del estadio verde y en color rojo los ácidos urónicos del estadio rojo. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Capítulo 5 112 La principal diferencia entre ambos perfiles la encontramos en la zona de las moléculas de mayor tamaño. Observamos que el perfil de los ácidos urónicos en el estadio verde empieza en un volumen anterior al del estadio rojo, unos 2 ml antes. Esto, unido al desplazamiento del primer pico que hemos mencionado antes de mayor tamaño, puede ser indicativo de una despolimerización de las pectinas unidas covalentemente durante la maduración del fruto. 5.5.4. 5.5.4.5.5.4. 5.5.4.- -- - Perfiles de HE Perfiles de HEPerfiles de HE Perfiles de HEMICELULOSA (fracción KOH 4M) MICELULOSA (fracción KOH 4M)MICELULOSA (fracción KOH 4M) MICELULOSA (fracción KOH 4M) Se espera que el contenido de las fracciones KOH 1M y 4M se corresponda principalmente con la hemicelulosa y donde las pectinas deberían tener muy baja representación, por eso al representar los perfiles de ácidos urónicos y de azúcares obtenidos de la cromatografía (Figura 5.16), se observa como la cantidad de ácidos urónicos es muy baja en comparación a la de azúcares, por lo que se empleará el perfil de azúcares para representar esta fracción. La extracción con KOH 1M es un paso intermedio y presenta un comportamiento intermedio por lo que se usará la fracción KOH 4M como más característica del componente hemicelulósico y en ella el componente péctico es prácticamente residual. Los perfiles de los azúcares de la fracción KOH 4M en estadio rojo y en verde (Figura 5.17) presentan ambos dos picos bien definidos; uno de azúcares de menor masa molecular, próximo a los 2.000 KDa que se solapa en ambos perfiles y eluye a los 25 ml, y otro pico de mayor masa molecular y menos abundancia en ambos casos pero con marcadas diferencias. Mientras que el pico de mayor masa molecular correspondiente al estadio verde se sitúa en los 8 ml, el del estadio rojo no aparece hasta los 11 ml. Maduración 113 Vol (ml) 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 AZU-R AU-R B Vol (ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Absorbancia 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 AZU-V AU-V A Figura 5.16: Figura 5.16:Figura 5.16: Figura 5.16: Perfiles cromatográficos de la fracción KOH 4M. A: A:A: A: Perfil cromatográfico de la fracción KOH 4M en estadio verde. B: B:B: B: Perfil cromatográfico de la fracción KOH 4M en estadio rojo. En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos urónicos y en color gris las de azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Volumen (ml) 10 20 30 40 Absorbancia (450nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 KOH 4M-V KOH 4M-R Figura 5.17: Figura 5.17:Figura 5.17: Figura 5.17: Perfil cromatográfico de los azúcares de la fracción KOH 4M. En color verde los azúcares del estadio verde y en color rojo los azúcares del estadio rojo. Las absorbancias de azúcares se miden a una longitud de onda de 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa. Capítulo 5 114 Este desplazamiento de picos al comparar el estadio verde con el rojo es probablemente debido a una despolimerización de las hemicelulosas durante la maduración del fruto. Esta despolimerización en la hemicelulosa también ha sido observada por otros autores anteriormente (Rose y col., 2004; Brummell, 2006). 5.6 Discusión 5.6 Discusión5.6 Discusión 5.6 Discusión La comparación entre fruto verde y rojo que hemos realizado en este trabajo pone de manifiesto importantes cambios cuantitativos y cualitativos en las paredes celulares de los frutos de fresa entre estos dos estadios de desarrollo. Desde el punto de vista cuantitativo, el contenido de pared celular por peso de fruto fresco disminuye drásticamente a la vez que, cualitativamente, las pectinas incrementan su proporción de manera muy significativa, lo que las lleva a que su peso relativo en la pared supere claramente el 50%. Estos datos estarían de acuerdo con las tendencias observadas por otros autores para la fresa (Rosli y col., 2004; Koh y Melton, 2002). También, en términos generales, parece lógico pensar que una disminución de 8 veces en el contenido de pared celular con la maduración se traduzca en un debilitamiento estructural importante resultando en un reblandecimiento del fruto. Pero no sólo la cantidad de andamiaje estructural es importante, también lo es el comportamiento físico de esas estructuras ya que en ellas se llevan a cabo las relaciones hídricas a nivel celular y tisular determinando el comportamiento mecánico de los tejidos. De hecho, la disminución en la cantidad de pared no fue el único cambio observado, las interacciones físicas entre sus componentes poliméricos también habían cambiado en los frutos rojos como demuestra la mayor capacidad de hidratación/hinchamiento de las paredes extraídas en este estadio. Este hinchamiento de la pared celular se ha observado previamente en fresa y otros frutos (Redgwell y col., 1997b) y se relaciona con un incremento del tamaño medio de poro en la pared celular causado, probablemente, por el desmantelamiento ordenado de la matriz péctica provocado por la actuación coordinada de las pectinasas (Redgwell y col., 1997b; Hadfield y Bennett, 1998; Santiago-Doménech y col., 2008). Maduración 115 Este comportamiento físico diferencial y, probablemente, también el reblandecimiento del fruto está causado por los cambios en la composición y en las interacciones entre los componentes de la pared celular. Ya hemos comentado que el componente péctico se incrementa al doble en las paredes de fruto rojo pero no es sólo eso, su distribución entre fracciones de extracción es distinta en estos frutos. Esta distribución desigual puede ser interpretada como una solubilización de grupos de polímeros pécticos. La solubilización de pectinas es un proceso observado con bastante frecuencia en la maduración de frutos carnosos y blandos (soft). Este proceso consiste en un incremento del contenido de pectinas solubles de la pared celular (fracción AGUA) y, en algunos casos, las pectinas iónicas. En paralelo, puede ocurrir una disminución de la cantidad de las unidas covalentemente. Según Koh y Melton (2002), en fresa, el mayor incremento de pectinas solubles ocurre al pasar del estadio verde a los intermedios y luego no se incrementan mucho o permanecen constantes en el estadio rojo (si se considera como porcentaje de pared aislada). Nosotros no hemos evaluados estadios intermedios pero sí verificamos en buena medida ese incremento de pectinas solubles en nuestras muestras de frutos rojos. La cantidad de polímeros solubles en agua aumenta de estadio verde a rojo. Por el contrario, la cantidad de pectinas unidas covalentemente disminuyen durante la maduración, quedando patente que se produce una solubilización de las pectinas durante la maduración de nuestros frutos. Esta solubilización ocurre a expensas de las pectinas covalentemente unidas a la pared (Wakabayashi, 2000; Brummell, 2006; Mercado y col., 2011; Paniagua y col., 2014). Una interpretación alternativa o complementaria al hecho experimental de la solubilización fue la propuesta de Huber (1984). Este autor sugería a la síntesis di novo de pectinas más solubles como la causa de la observación de una mayor proporción de pectinas solubles, no ligadas o débilmente ligadas a la fase sólida de la pared celular. Sin embargo, parece que la causa más probable sea el resultado de una pérdida y/o degradación (Inari y Takeuchi, 1997) de pectinas no esterificadas y muy ramificadas durante la maduración. Otros autores también sugieren que las pectinas en realidad se solubilizarían al degradarse las hemicelulosas a las que estarían unidas en la pared primaria (Koh y Melton, 2002). Esta degradación de la hemicelulosa podría ser un proceso constante desde los Capítulo 5 116 estadios iniciales hasta el comienzo de la coloración del fruto como se refleja por una disminución gradual de los azúcares neutros en las fracciones CDTA y CARBONATO (Koh y Melton, 2002) que nosotros no observamos (Figura 5.4 B) y, además, el contenido relativo de azúcares neutros se incrementan en las dos fracciones hemicelulósicas (KOH 1 y 4 M). Si bien es cierto que los perfiles cromatográficos que hemos obtenido de la fracción KOH 4M muestra una despolimerización de las hemicelulosas durante la maduración del fruto que también ha sido observada por otros autores anteriormente (Rose y col., 2004; Brummell, 2006). También, en relación con esta cuestión, conviene recordar que nosotros hemos encontrado que el silenciamiento de la pectato liasa, que actúa específicamente sobre la matriz péctica, tuvo también como efecto colateral en las dos fracciones de hemicelulosa. Observamos un menor contenido del pico mayoritario de azúcares neutros presentes en los perfiles cromatográficos de las dos fracciones (Capítulo 6, Figura 6.10; Santiago-Doménech y col., 2008). Como ya hemos comentado, la complejidad del metabolismo de la pared celular y la multiplicidad de agentes que actúan en ella al mismo tiempo interactuando entre sí dificultan el que, en muchos ocasiones, sea posible distinguir causas de efectos con claridad. Volviendo a las pectinas, hemos encontrado que, el contenido de ácidos urónicos referidos a pared celular, en términos generales, presentan un mayor contenido en fruto rojo coincidiendo con Woodwards (1972). Si bien otros autores han observado una disminución en la cantidad total de ácidos urónicos (Rosli y col., 2004; Koh y Melton, 2002), mientras que Huber (1984) no observó cambios. Aunque cuando los resultados se expresan como total de AU con respecto a peso de pared celular, Rosli y col., (2004) también observan un incremento al pasar de estadio verde al blanco y de éste al estadio rojo permanece constante. Nosotros no hemos evaluado contenidos en estadios intermedios pero si hemos verificado el ya mencionado mayor contenido de ácidos urónicos en fruto rojo con respecto al verde. Además de los procesos de solubilización, en determinados frutos la despolimerización de polímeros pécticos por la actuación de poligalacturonasas y otros enzimas pectinolíticos (Brummell y col., 1988) puede jugar un papel importante en el Maduración 117 desmantelamiento de la pared celular durante la maduración. Aunque en fresa se consideraba inicialmente este proceso de menor importancia debido a que los primeros estudios experimentales que abordaron la cuestión encontraron una relativamente baja actividad poligalacturonasa y escasas evidencias de despolimerización (Huber, 1984; Nogata y col., 1996; Brummell, 2006). Este posicionamiento inicial se ha visto modificado al aportarse evidencias de despolimerización cuantitativamente importante y alta actividad poligalacturonasa en cultivares especialmente blandos, como Toyonaka (Rosli y col., 2004; Villarreal y col., 2008) y nuestros propios resultados usando una aproximación transgénica (Capítulo 6; Santiago-Doménech y col., 2008). Nuestro estudio comparativo de los estadios verde y rojo en el cultivar Chandler también indica que se produce una despolimerización paulatina de las pectinas al alcanzar el fruto la madurez. Ello se pone de relieve por los cambios en los cromatogramas de las fracciones CDTA y, sobretodo, en los perfiles de la fracción CARBONATO cuando se comparan las muestras extraídas de fruto verde y rojo. Los picos asociados con polímeros ricos en AU y alta masa molecular tienden a desplazarse hacia zonas de menor peso molecular, lo que indicaría una degradación de las pectinas. Esta posible despolimerización afecta a la estructura de las pectinas y su interacción con otros componentes de la pared, afectando al comportamiento físico de la red y, en última instancia, a la textura del fruto, propiciando probablemente su reblandecimiento. Tampoco podemos descartar, que además de los procesos enzimáticos, las diferencias encontradas en los iones presentes en la pared, especialmente el calcio, que disminuye en fruto rojo significativamente, contribuyan también a cambios importantes en la estructura de la matriz péctica y sus propiedades físicas, propiciando, por ejemplo, la solubilización de grupos poliméricos de la lámina media en estadio rojo y afectando al hinchamiento de la pared celular. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto que en frutos de fresa del cultivar Chandler la solubilización y, en menor medida, la despolimerización de las pectinas, son parte significativa del proceso de desmantelamiento ordenado de la pared celular. Si junto a estos dos hechos consideramos: Capítulo 6 124 Puigjaner y col., 1997; Medina-Escobar y col., 1997; Nunan y col., 2001). Su posible papel en los procesos de maduración de frutos está bastante menos documentado que el de las poligacturonasas. En el año 2002, Jiménez-Bermúdez y col. (2002) lograron silenciar la expresión de un gen de pectato liasa en fresa mediante tecnología antisentido y correlacionarlo con la producción en estas plantas de frutos significativamente más duros en el estadio rojo de maduración y un mejor comportamiento postcosecha de los mismos. Este fenotipo se observó a pesar de que en este material se han descrito 3 genes de pectato liasa que comparten el patrón de expresión (Benítez-Burraco y col., 2003). Sin embargo, la similitud de las tres secuencias génicas y el diseño de la secuencia antisentido permitió que en las plantas transgénicas la expresión de los tres genes quedara inhibida significativamente (Benítez-Burraco y col., 2003). Estos frutos, además de la mencionada mayor firmeza, poseían paredes celulares que se hinchaban menos in vitro y también una aparente menor solubilización de las pectinas (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). Por tanto, este material transgénico es muy valioso para profundizar en la caracterización de los cambios en los polímeros pécticos presentes en las paredes de estos frutos mediante un análisis más profundo y ese es nuestro objetivo en este trabajo. Mostraremos resultados que evidencian el papel de la pectato liasa en la despolimerización y solubilización de las pectinas de la pared primaria y/o la lámina media y con ello reforzamos la necesidad de incluir a esas enzimas en los modelos que pretenden describir el desmantelamiento ordenado de la pared celular durante el proceso de maduración de frutos. 6.2. 6.2.6.2. 6.2.- -- - Resultados Resultados Resultados Resultados 6.2.1. 6.2.1.6.2.1. 6.2.1.- -- - Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “Más Duro” y comparación del Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “Más Duro” y comparación del Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “Más Duro” y comparación del Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “Más Duro” y comparación del estado de maduración de los estado de maduración de losestado de maduración de los estado de maduración de los distintos genotipos estudiados distintos genotipos estudiadosdistintos genotipos estudiados distintos genotipos estudiados La Figura 6.1 A muestra la consistencia y estabilidad del fenotipo “Más Duro” en dos líneas transgénicas con la pectato liasa silenciada (Jiménez-Bermúdez y col., 2002) en comparación con una línea control no transgénica durante 4 años Silenciamiento pectato liasa 125 consecutivos, del 2002 al 2005. Durante estos cuatro ciclos independientes de cultivo, las dos líneas transgénicas produjeron frutos significativamente más duros en estadio rojo (R). Este es el estadio en el que se centra el estudio y dado que el tiempo de maduración se podía ver afectado en los frutos transgénicos se usó como estimador de madurez el contenido de antocianina. En la Figura 6.1 B se muestran los resultados, los niveles de antocianinas fueron similares en las plantas utilizadas como plantas control y en las líneas transgénicas 23 y 39 y ligeramente mayor en la línea 14, indicando que los frutos transgénicos muestreados para el análisis de pared celular no eran más duros por estar su maduración más retrasada. A B 2002 2003 2004 2005 Año Dureza (% relativo al control) Contenido en antocianina (Abs 530 nmAbs 657 nm/g de peso fresco Control Apel 14 Apel 23 Apel 39 Figura 6.1 Figura 6.1Figura 6.1 Figura 6.1. Dureza y niveles de antocianina de frutos control y frutos transgénicos con la pectato liasa silenciada (Apel). A AA A: :: : Dureza del control y de los frutos transgénicos Apel 14 y 39 cosechados en 4 ciclos de cultivo independientes. B BB B: :: : Contenido en antocianina de los frutos maduros usados para la extracción y análisis de la pared celular. En este caso, las medidas se corresponden a frutos controles y a las líneas transgénicas Apel 14, 23 y 39. Las barras de error corresponden a desviaciones estándar. Capítulo 6 126 6.2.2. 6.2.2.6.2.2. 6.2.2.- -- - Extracción y fraccionamiento de la pared Extracción y fraccionamiento de la paredExtracción y fraccionamiento de la pared Extracción y fraccionamiento de la pared El contenido de pared celular estimado como peso seco y referido a 100 gramos de fruto fresco osciló entre los 0,92 y los 1,43 gramos. El mayor valor correspondió a la línea transgénica 23, y fue estadísticamente diferente del obtenido en frutos controles (P= 0,05). El contenido de pared celular de las otras dos líneas transgénicas fue similar al que se obtuvo en el control siendo el valor medio de 1,0 ± 0,1 g por 100 g de peso fresco de fruto. mg de fracción/100 mg pared celular PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH 4M Figura 6.2. Figura 6.2.Figura 6.2. Figura 6.2. Rendimiento relativo del fraccionamiento secuencial de la pared celular incluyendo la fracción PAW a partir de frutos control (C) y tres líneas transgénicas independientes con la pectato liasa silenciada (Apel 14, 23 y 39). Las barras de error corresponden a desviaciones estándar. Con el protocolo de extracción empleado, basado en el protocolo de Redgwell y col. (1992) ligeramente modificado como se indica en el capítulo 2 “Material y Métodos”, los polímeros de pared celular no sólo están presentes en los extractos de pared celular, sino que también se detectan en la fracción extraída con PAW. Por ello, en la Figura 6.2, junto al contenido de las distintas fracciones extraídas secuencialmente del residuo de pared celular, también se muestra el contenido de esta fracción PAW tras ser dializada y secada. A efectos comparativos, este contenido Silenciamiento pectato liasa 127 se relativizó a 100 mg de pared celular, como el resto de fracciones presentadas. Los valores medios de contenido de fracción PAW fueron más bajos en las tres líneas transgénicas pero las diferencias fueron estadísticamente significativas sólo en las líneas 23 y 39 (P= 0,05). Se observa una tendencia similar cuando el contenido de PAW se relativiza al peso fresco del fruto. Esa menor cantidad relativa de fracción PAW en las líneas transgénicas puede ser interpretada como un reflejo de una menor solubilización de polímeros de pared celular en estos frutos transgénicos, al menos en las líneas 23 y 39. En todos los genotipos estudiados el contenido de polímeros de la fracción PAW fue mayor en fruto rojo que en verde pero el incremento observado al comparar un estadio con el otro fue menor en los frutos transgénicos de media un 99% (128, 27 y 142% para las líneas Apel 14, 23 y 39, respectivamente) frente a un 427%, cuatro veces más, en la línea control. Este es otro dato que apoya la limitación de la solubilización (desmantelamiento) de la pared en los frutos transgénicos. En lo que se refiere a las fracciones de pared, desde el punto de vista del rendimiento de extracción se puede deducir a partir de la Figura 6.2 que se pierde algo de material de pared. De hecho, el conjunto de todas las fracciones obtenidas, incluyendo el residuo que queda después de la extracción con KOH 4M (no representado en la Figura 6.2), suponen el 76 ± 4% (p/p) de la cantidad del peso inicial de pared celular usado para la extracción. Por tanto, tenemos una pérdida debida a la manipulación del material y los distintos pasos de fraccionamiento próximo al 25%. La fracción más abundante de pared es la solubilizada con CDTA 50 mM y no existen en ella diferencias entre los genotipos analizados. Sólo en la fracción extraída con agua se observan diferencias significativas entre el control y las 3 líneas transgénicas, siendo la cantidad de fracción significativamente mayor en el control. Esto se puede interpretar en el mismo sentido que lo hemos hecho al referirnos a la fracción PAW. Capítulo 6 128 6.2.3. 6.2.3.6.2.3. 6.2.3.- -- - Contenido de pectinas y solubilización Contenido de pectinas y solubilización Contenido de pectinas y solubilización Contenido de pectinas y solubilización En todos los genotipos, el mayor contenido en ácidos urónicos (AU) se encontró en los extractos de PAW, con un valor medio más bajo en las tres líneas transgénicas, aunque estas diferencias sólo fueron estadísticamente significativas para la línea 23 (Figura 6.3 A). Entre las fracciones de pared celular los niveles mayores de AU estaban en la fracción CDTA y los más bajos se encontraban en la fracción de hemicelulosa KOH 4M. La cantidad de pectinas (estimada como la cantidad de AU) fue significativamente mayor en la fracción CDTA y en la fracción CARBONATO de las paredes celulares de las 3 líneas transgénicas que la obtenida en las fracciones del control (Figura 6.3 A). Esta diferencia es relevante ya que hemos comentado previamente que, en términos de peso, estas dos fracciones son similares a las del control (Figura 6.2). Si se calculan las relaciones de las pectinas más solubles (fracción PAW y AGUA) respecto a las pectinas más unidas (fracción CDTA y CARBONATO) en los distintos genotipos, vemos que es significativamente mayor en el control (3,0) que en las transgénicas (1,8) y esta diferencia es aún mayor si la fracción soluble se compara sólo con la fracción covalentemente unida (CARBONATO) (8,2 en el control y 4,0 en las transgénicas). Además de los ácidos urónicos, medimos en paralelo azúcares totales en las mismas fracciones pero no se encontraron diferencias significativas entre el control y las líneas transgénicas. Sí se observó, en cambio, que la relación AU/Azúcares totales fue mayor en las tres líneas transgénicas en las fracciones PAW, AGUA, CDTA, CARBONATO y KOH 1M. Esto indica que las fracciones de pared están enriquecidas en pectinas en el caso de los frutos transgénicos (Figura 6.3 B). La única excepción a esta tendencia fue la fracción CDTA de la línea transgénica 39. Silenciamiento pectato liasa 129 mg de AU/100 mg pared celular PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M Relación AU/Azúcares (mol/mol) A AA A PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M B BB B Figura FiguraFigura Figura 6.3 6.36.3 6.3 A: A:A: A: Contenido en ácidos urónicos (AU) de la fracción PAW y de las otras fracciones secuencialmente extraídas de la pared celular en frutos control (C) y tres líneas transgénicas independientes con la pectato liasa silenciada (Apel 14, 23 y 39). B: B:B: B: Relación de los AU respecto a los azúcares totales contenidos en estas mismas fracciones. Las barras de error corresponden a desviaciones estándar. El conjunto de estos resultados evidencian la existencia de una menor solubilización de las pectinas en las paredes extraídas de las líneas transgénicas con la pectato liasa silenciada. Esta interpretación además está apoyada por evidencias de índole microscópica (Figura 6.4). En las micrografías de cortes de tejido de fruto de transgénicas se observa una tinción de pectinas más densa (más color rosado) entre las células del tejido cortical de frutos transgénicos que en el tejido del fruto control. Además, existen menos espacios intercelulares en el tejido de los frutos transgénicos, los cuales muestran más Capítulo 6 130 zonas de contacto entre células que en los frutos control. Esta aparente mayor “adhesión” célula-célula en frutos transgénicos sugiere una mayor integridad de la lámina media que tiene una naturaleza eminentemente péctica en su composición. Figura 6.4 Figura 6.4Figura 6.4 Figura 6.4. Secciones de tejido cortical de fruto maduro de control y de dos líneas transgénicas independientes, Apel 14 y 39, teñidas para la visualización de pectinas. Las barras representan 50 µm. 6.2.4. 6.2.4.6.2.4. 6.2.4.- -- - Análisis de las fracciones solubles mediante cro Análisis de las fracciones solubles mediante croAnálisis de las fracciones solubles mediante cro Análisis de las fracciones solubles mediante cromatografía de filtración en matografía de filtración en matografía de filtración en matografía de filtración en gel gelgel gel Los perfiles cromatográficos de los polímeros pécticos presentes en la fracción PAW y AGUA se muestran en la Figura 6.5. Como carácter general, los perfiles correspondientes a la fracción PAW presentan un pico principal asimétrico de polímeros con una masa molecular mayor de 500 KDa que cae hacia la derecha formando una cola de material de masas moleculares inferiores, extendiéndose prácticamente por todo el rango de separación de la columna. La comparación de los perfiles de los tres frutos transgénicos con el correspondiente al control sugiere un pequeño incremento en la masa molecular media de las pectinas más solubles de los frutos con la pectato liasa silenciada. Los tres perfiles de las muestras transgénicas, a pesar de presentar una forma en conjunto similar al control, aparecen ligeramente desplazados hacia la izquierda. Silenciamiento pectato liasa 131 Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml) Densidad óptica relativa (515 nm) Fracción PAW Fracción AGUA Figura 6.5 Figura 6.5Figura 6.5 Figura 6.5. Perfiles cromatográficos de las fracciones PAW y AGUA de las paredes celulares de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa CL-6B. A las fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos, normalizando el valor a la máxima absorbancia obtenida en cada perfil para facilitar las comparaciones cualitativas. El volumen de vacío y la calibración de la columna se realizaron mediante dextranos de masa molecular conocida y el volumen correspondiente a su pico de elución se indica con flechas en la parte superior de la figura. La fracción AGUA de los distintos genotipos muestran en cambio una población de polímeros pécticos incluidos en un pico más simétrico que en el presente en las fracciones PAW. Estos polímeros eluyen mayoritariamente entre los volúmenes que van de 100 y 180 ml. La masa molecular media de estos picos es claramente inferior a la de las pectinas solubilizadas con PAW. Los perfiles de las cuatro muestras comparten un rango de elución similar, aunque en el control aparecen tres picos diferenciados, con masas moleculares entre los 20 y 80 KDa, que no se observan en Capítulo 6 132 las líneas transgénicas. La mayoría de los poliurónidos solubilizados con agua migran con masas moleculares aparentes comprendidas entre los 20 y 50 KDa. 6.2.5. 6.2.5.6.2.5. 6.2.5.- -- - Análisis de las fracciones unidas a pared celular por cro Análisis de las fracciones unidas a pared celular por croAnálisis de las fracciones unidas a pared celular por cro Análisis de las fracciones unidas a pared celular por cromatografía de matografía de matografía de matografía de filtración en gel filtración en gelfiltración en gel filtración en gel El solvente CDTA se usa para extraer polímeros pécticos iónicamente unidos a entre sí mediante enlaces en los que interviene el Ca2+, los perfiles cromatográficos correspondientes a esta fracción de cada uno de los genotipos estudiados se muestran en la Figura 6.6. Los polímeros eluyen a lo largo de todo el rango de la columna aunque buena parte del perfil se encuentra por encima de los 2.000 KDa. La principal diferencia entre el control y las líneas transgénicas es la presencia de un pico de masa molecular elevada que eluye en el entorno de los de los 13 ml, ausente en las tres líneas transgénicas estudiadas. En el perfil del control además se diferencian claramente dos picos adicionales que eluyen a 18 y 23 ml y que no coinciden con los picos de las líneas 14, 23 y 39, especialmente el pico que eluye a 18 ml. Los perfiles obtenidos con los poliurónidos solubilizados con CARBONATO (Figura 6.6, columna derecha) muestran la presencia de un primer pico que eluye entre 10 y 15 ml y que corresponde a pectinas de muy alto peso molecular. En las tres líneas transgénicas este primer pico tiene una masa molecular ligeramente superior a la que se deduce del perfil de la muestra control. Este pico es más importante cuantitativamente en las líneas 14 y 23. Se observa también un segundo grupo de polímeros pécticos (fracciones comprendidas entre los 15 y los 20 ml) en las tres líneas transgénicas que está ausente en el perfil del control, donde sólo se visualiza un pequeño hombro en esa zona. El conjunto de polímeros que eluyen entre los 20 y los 30 ml representa cuantitativamente, al menos, la mitad de los poliurónidos totales presentes en esta fracción y los perfiles de las líneas transgénicas sugieren que el procesamiento de las pectinas es distinto en estos frutos. Silenciamiento pectato liasa 133 Densidad óptica relativa (515 nm) Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml) Fracción CDTA Fracción CARBONATO Figura 6.6 Figura 6.6Figura 6.6 Figura 6.6. Perfiles cromatográficos de las fracciones CDTA y CARBONATO de las paredes celulares de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa CL-2B. A las fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos, normalizando el valor a la máxima absorbancia obtenida en cada perfil para facilitar las comparaciones cualitativas. El volumen de elución para el azul de dextrano (2.000 kDa) se muestra en la parte superior de la figura. De hecho, si comparamos los perfiles de la fracción CARBONATO con los de la fracción CDTA, llama la atención que las muestras transgénicas muestren picos resueltos a 13 y 18 ml, ausentes en control, y que se observe lo contrario en la fracción CDTA. Esto sugiere que el silenciamiento de las pectato liasas modifica el procesamiento de las pectinas de la pared primaria. Haciendo que determinado conjunto de polímeros aparezcan en la fracción de CARBONATO en los frutos transgénicos y que ello no ocurra en los frutos control quizá porque la pectato liasa sí haya actuado en estos frutos.