Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate
Abstract
El tomate (Solanum lycopersicum) es uno de los cultivos más importantes en el mundo, con multitud de tipos y variedades que presentan una gran variabilidad en el aspecto externo del fruto (especialmente color, forma y tamaño) y en relación a su calidad organoléptica (sabor, aroma, textura). En esta tesis se presentan resultados sobre el aspecto genético de factores que afectan a la calidad del fruto de tomate y se aportan resultados clave para el entendimiento de la fisiopatía de la mancha solar, que provoca una merma de la calidad del fruto. El material vegetal empleado es el derivado de un cruzamiento de una variedad de tomate cultivado con una entrada de una especie silvestre muy emparentada con la cultivada, que aporta caracteres de calidad de gran interés para la mejora genética. En el trabajo se aborda el estudio de caracteres cuantitativos relacionados con la calidad del fruto en una población de líneas recombinantes consanguíneas (en adelante RIL, acrónimo que procede de Recombinant Inbred Lines) procedentes del cruce interespecífico de S. lycopersicum cv. ‘Moneymaker’ x S. pimpinellifolium acc. TO-937. Las líneas parentales son muy divergentes en cuanto a muchos de los caracteres de calidad del fruto. Una vez caracterizada fenotípicamente la población RIL para un buen número de caracteres de fruto y planta, se ha observado amplia segregación para la mayoría de los caracteres. Se han calculado correlaciones fenotípicas y genéticas entre algunos de los caracteres estudiados, además de estimado sus heredabilidades, parámetros que dan idea de la posible pleitropía de los caracteres y sus posibilidades para la mejora genética. Con el uso de un mapa de ligamiento saturado, ya disponible previamente, se han detectado QTLs (Quantitative Trait Loci) asociados a algunos de los caracteres estudiados, y en algunos casos se han planteado posibles genes candidatos. Como resultados más destacados, se han localizado QTLs que no habían sido descritos previamente en otros estudios, como uno para el diámetro del tallo en el cromosoma 11, dos para forma del fruto en el cromosoma 2, otro en el cromosoma 2 para el % del peso del pericarpo y uno en el cromosoma 6 para la acidez del fruto, entre otros. Otro de los aspectos tratados es el inicio de los estudios fisiológicos y genético de la fisiopatía de la mancha solar. Se ha obtenido una pareja de líneas recombinantes hermanas, muy contrastantes para la sensibilidad a la mancha solar, pero que comparten gran parte de su fondo genético. Estas líneas contrastantes se emplearon en el estudio fisiológico de la fisiopatía. Mediante experimentos en invernadero y cubriendo los frutos en desarrollo para evitar la incidencia de la luz, se observó que la etiología de la mancha solar no se encuentra, como se había creído previamente, en la incidencia de un exceso de radiación solar en el momento de la maduración del fruto sino en la fase de verde inmaduro, lo que causa daños en los tejidos que se manifiestan posteriormente en la fase de maduración. En cuanto al control genético de la mancha solar, se abordó mediante la localización de QTLs en la población RIL y el estudio proteómico de los frutos de las líneas recombinates hermanas contrastantes. Se ha detectado un QTL mayor en el cromosoma 4 y hasta cuatro QTLs menores en los cromosomas 3, 8, 10 y 11, asociados al carácter, de los que se han planteado genes candidatos en algunos casos. Ambos parentales poseen a la vez alelos favorables y desfavorables para la aparición de la mancha solar y por ello la sensibilidad a la mancha solar se confiere por determinadas combinaciones alélicas de los QTLs. El estudio del proteoma de los frutos indica que en la variedad ‘Moneymaker’ de tomate cultivado se dan bajos niveles de expresión del enzima monodehidroascorbato reductasa (MDHAR). Como modelo genético/fisiológico que explique la aparición de la fisiopatía se plantea la hipótesis de que en genotipos con determinadas combinaciones alélicas, la mancha solar sea resultado de estrés oxidativo celular en la zona del hombro de los frutos producto de la fotosíntesis en los frutos verdes, que no puede paliarse por el bajo nivel de expresión de los mecanismos enzimáticos de reparación.
Full text
TESIS DOCTORAL Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate Carmen Ruiz Rubio
FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate Memoria de Tesis Doctoral presentada por la Licenciada en Biología Carmen Ruiz Rubio para optar al grado de Doctora en Biología por la Universidad de Málaga Director: Dr. Rafael Fernández Muñoz Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (IHSM UMA-CSIC) Málaga, febrero de 2016
AUTOR: Carmen Ruiz Rubio http://orcid.org/0000-0002-0483-1595 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es
D. Miguel Ángel Quesada Felice, Catedrático de Universidad adscrito al Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Málaga RATIFICA La presentación de la Tesis Doctoral titulada “Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate” realizada por la Licenciada Carmen Ruiz Rubio para optar al Título de Doctora en Biología. Y para que así conste y tenga los efectos que correspondan en cumplimiento de la legislación vigente, firma la presente autorización en Málaga, 11 de noviembre de 2015. Fdo.: Dr. Miguel Ángel Quesada Felice Tutor de la Tesis
D. Antonio Flores Moya, Director del Departamento de Biología Vegetal de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga AUTORIZA La presentación de la Tesis Doctoral titulada “Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate” realizada por la Licenciada Carmen Ruiz Rubio para optar al Título de Doctora en Biología. Y para que así conste y tenga los efectos que correspondan en cumplimiento de la legislación vigente, firma la presente autorización en Málaga, 11 de noviembre de 2015. Fdo.: Dr. Antonio Flores Moya Director del Departamento de Biología Vegetal de la UMA
Durante el periodo comprendido entre Noviembre de 2004 y Abril de 2008 he disfrutado de una Beca Predoctoral del Programa de Ayudas para la Formación de Doctores en Centros de Investigación y Universidades Andaluzas. Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto trilateral (Alemania, Francia y España) GEN2003-20211-C02-02/INTER de la convocatoria de Acción Estratégica de Genómica y Proteómica del antiguo Ministerio de Ciencia y Tecnología: Genomic and metabolomic exploration of natural variability of fruit development and quality in tomato. Los resultados del mismo han sido obtenidos en su mayor parte en el IHSM La Mayora CSIC con aportaciones de una estancia en el INRA-Avignon (Francia) y colaboraciones con el IBMCP UPV-CSIC (Valencia) y el Max Planck Institute en Golm (Alemania) en el marco de dicho proyecto.
Agradecimientos La realización de esta tesis ha sido una de las experiencias más enriquecedoras de mi vida. Quizá porque me ha llevado buena parte de ella y se han ido sumando en estos años vivencias en diferentes etapas, lugares, acompañada desde el principio por los que siempre están ahí, pero incorporando nuevas caras a lo largo del camino. Tengo suerte porque de todos me llevo algo bueno. Para decir gracias a todos tengo que pararme en el tiempo y necesitaré mucho papel y memoria, y como no puedo presumir de ésta última, desde ya recibid un enorme gracias y una sonrisa a todos los que me habéis acompañado hasta aquí; perdonad mi torpeza por no saber nombraros, pero saberos agradecidos. He de comenzar con un gracias a La Mayora, como ente vivo y completo, del que estoy muy orgullosa de pertenecer, y hablo en presente porque siempre la sentiré como mi casa. Comenzando por el principio, muchas gracias Fali por ayudarme a hacer esto posible, desde los primeros conocimientos del trabajo en invernadero hasta las dudas que ayer me resolvías, pasando por protocolos puestos a punto, la emoción del descubrimiento, conversaciones interminables y bromas… han pasado muchos años y he aprendido muchísimo, tanto que he llegado aquí, por lo que parece que el objetivo está cumplido desde que aquel señalado 11 de marzo decidiera embarcarme en esta aventura. A María José, mi compañera de tantos caminos, mi amiga. Gracias por enseñarme humildad y buen hacer, señas de tu trabajo y tu carácter. Llegaste después y acabaste antes, pero no sin grandes sacrificios en un duro camino. Gracias de corazón por estar siempre ahí. Gracias Adri por abrirme los ojos, si hoy estoy aquí es en gran parte por ti, amigo. Al gran Juanmita, que sabe esperar para decir algo de provecho, el mejor anfitrión que he podido tener, paciente y donador de paciencia, y de todo lo que esté en su mano. Gracias por abrirme las puertas y mostrarme “las cosas de la Mayora”. A mis compis mayores del cuartillo, a Antonio que le recuerdo escribiendo incansable, a Tere que compartió sus sufrimientos conmigo, al final todo llega. Y a Xavi, del que aprendí que la vida siempre te pone en el camino tarde o temprano. A todo el departamento de Mejora, a Anabel, Merce, Marisa, el profesor Cuartero, gracias por recibirme entonces y por vuestros ánimos en el camino. A los que se mueven por los laboratorios, Marina, Ana… gracias por vuestra ayuda en cada experimento. Gracias Toñi porque aquí hay mucho trabajo tuyo, a Luis por tenerlo todo siempre a mano. Gracias Eva por tu punto de vista, por compartirlo, es enriquecedor. De ti me llevo el tesón y el coraje para hacer las cosas, y no sólo para la tesis. A Zipi y Zape, gracias Emilio por ofrecer siempre tu sonrisa sincera, y a Fernando por enseñarme a ser productiva. He visto florecer el departamento surgiendo salas llenas de becarios y nuevos laboratorios más allá de las fronteras, gracias a todos con los que los he compartido. Del mucho tiempo de trabajo en el invernadero siempre me quedará sobre todo la alegría de los que trabajan en él, a pesar del calor y la fatiga, gracias a todos por cuidar de las plantas como tan bien sabéis. A Rafa el rubio, a Paco Sánchez, un placer teneros en el equipo.
A Antonio Cordón por estar siempre disponible, por escuchar, por decidir en la dificultad, gracias por facilitarme el camino siempre que pudiste. A Eduardo, en incansable búsqueda por aquello que necesitas, gracias por disponer de todo. A todo el equipo de administración, gracias por ayudarme con los papeleos. A los que también han acompañado mi vida en la Mayora, aunque desde otros departamentos, gracias por abrirme las puertas de vuestros laboratorios y ayudarme, siempre me he sentido como en casa. Gracias a Elena “la petarda”, a Cañi, a Isa, por esas carreras por la playa. A María Victoria por su diligencia y dulzura. A Helena por hacerme actriz en un plis plas. A Yolanda por su energía y nuestras charlas en positivo. A Fran por venir a rescatarme aquel día en la residencia sin vacilar un momento, no me olvido. Si la Mayora es un mundo aparte, la residencia es un micromundo. Mezcla de culturas. Torre de Babel. Suerte de poder vivir allí. Gracias a todos los vecinos que he tenido, de aquí o del otro confín. Recuerdo con cariño las cenas en la azotea, las charlas en la lavadora, los carteles informativos… Antonio, Susana, María José, Rocío, Chus, Gloria, todos me habéis dado un pedacito de vosotros y ahora me doy cuenta. Gracias. Y me fui a Avignon, y allí aprendí lo que se aprende cuando sales fuera. A sobrevivir, a no querer parar de descubrir, a sentir cómo se hacen las cosas de otra manera, para poder volver recargado de nuevas sensaciones. Allí gracias a Eugenia, Monika, Juan, Manolo, Nico, me surgió lo que decidí llamar el “espíritu de Avignon”, entre calles y muros de piedra, con el sonido de los pedales, comprendí que llenarme de cosas nuevas no me cansará nunca. Gracias Mathilde, Mireille, Caroline, Esther, por dejarme inaugurar los laboratorios, qué bien se trabaja con vosotros. A los de fuera de la Mayora, los amigos de siempre, ya saben quiénes son, gracias por preguntar por mis “tomates” cada dos por tres. Cada empujoncito ha servido. A mi nueva familia del CAD, que va para ocho años, gracias por enseñarme el trabajo en equipo que tanto me gusta, somos privilegiados. Irene de ti he aprendido la capacidad de ver lo bueno de las personas, entre otras muchas cosas útiles para la vida. Gracias. A los que van sobre ruedas, que va para seis años ya, gracias por preguntar, insistir, animar... Formáis parte de una pasión renovada cada día. Gracias por estar. A mi gran familia, mis hermanos, cuñados, sobrinos, quiero disfrutaros más. A mi otra familia, gracias siempre por el apoyo incondicional, sois de lujo. A los que me han sufrido en todos mis caminos, desde siempre, mis padres. Imposible agradecerles en unas líneas TODO, por eso este trabajo va para vosotros. A mis abuelos, que siguen conmigo. Y a mi compañero de vida, desde el primer tomate que recogiste hasta la última parrafada escrita, esta tesis es tuya. Gracias por entenderme, apoyarme, ayudarme, por tu amor infinito. Sin ti no lo habría logrado.
6 Capítulo 2: En el capítulo 2 se presentan los primeros pasos del estudio de la fisiopatía de la mancha solar, que comienza con la obtención del material vegetal derivado de la población RIL descrita en el capítulo 1, tras una primera preselección, y sigue con diversos experimentos para la evaluación del efecto de algunos de los factores ambientales que puedan provocar la manifestación de la mancha solar y que finalmente llevaron a determinar el momento clave para su aparición. Capítulo 3: En el capítulo 3 se continúa el estudio de la mancha solar, esta vez empleando el material vegetal obtenido en la última selección, para comprender los factores genéticos que puedan estar actuando en la manifestación del carácter. Los estudios realizados abordan diferentes aspectos: Proteómica y genética. Se plantea un modelo genético que explique la aparición de la mancha solar.
7 Introducción general “…a fruit that is almost universally treated as a vegetable and a perennial plant that is almost universally cultivated as an annual” (Rick, 1978) I. EL TOMATE: ASPECTOS BOTÁNICOS Y TAXONÓMICOS, VARIABILIDAD NATURAL E IMPORTANCIA ECONÓMICA. I.1. Descripción botánica. El tomate cultivado (Solanum lycopersicum) pertenece a la familia Solanaceae, que se enmarca en el orden Solanales, subclase Asteridae, clase Magnoliopsida, división Magnoliophyta. Es una planta perenne y rastrera, que se cultiva como anual. Existen variedades de crecimiento determinado y otras de crecimiento indeterminado. En las plantas de hábito indeterminado, carácter silvestre de la especie, hay un crecimiento nodal continuo a partir de la aparición de la primera inflorescencia, entre la séptima y la décima hoja verdadera. Las plantas de hábito determinado se caracterizan porque la primera inflorescencia aparece relativamente pronto, hay tendencia de que existan menos de tres hojas nodales entre racimos y el tallo principal termina en una inflorescencia, por lo que el crecimiento de la planta ha de seguir por los tallos laterales o secundarios. El sistema radical consta de una raíz principal (corta y débil) y raíces secundarias (numerosas y potentes), además de raíces adventicias. La
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 8 raíz es pivotante pero tiende a ser fasciculada si la planta proviene de trasplante. Todos los órganos aéreos están cubiertos por tricomas, por lo que las plantas son pubescentes y glandulares y manchan al tocarlas, dejando un característico aroma “a tomate”. Los tallos son verdes, gruesos y angulosos, con nodos compuestos de 2 ó 3 hojas y una inflorescencia. Las hojas son anchas, planas, compuestas e imparipinnadas, presentando 7-11 foliolos, y se disponen de forma alterna sobre el tallo. En la axila de cada hoja aparece un tallo secundario. Las inflorescencias son de tipo racimo o cima, y se desarrollan cada 2-3 hojas en las axilas, con un número de flores variable, y pueden estar divididas o no. Las flores son hermafroditas, actinomorfas (generalmente pentámeras) e hipóginas. El cáliz está formado por 5 (o más) sépalos lanceolados y fusionados en la base. La corola tiene igual número de pétalos de color amarillo, lanceolados y fusionados en la base. El androceo tiene igual número de estambres, que se encuentran fusionados a la corola por sus filamentos, y poseen anteras largas y de color amarillo, conniventes, que forman un cono estaminal envolviendo al gineceo y encerrando al estilo en su interior. Cada antera posee una extensión apical y generalmente están fusionadas. El polen es binucleado. El pistilo está formado por un ovario bio pluricarpelar, un estilo delgado y un estigma cubierto por una secreción fluida de naturaleza lipídica. La flor se une al eje floral por medio de un pedicelo articulado que contiene la zona de abscisión, que se distingue por un engrosamiento con un pequeño surco originado por una reducción del espesor del córtex. El fruto es una baya, generalmente de color rojo, bio multiloculada. Está constituido por el pericarpo y el tejido placentario en el que se encuentran numerosas semillas recubiertas de una sustancia mucilaginosa. Tras la abcisión el cáliz permanece en el fruto y al ser de tipo acrescente y permanente, alcanza un mayor tamaño conforme el fruto se va desarrollando y permanece en el fruto tras la abcisión. Se puede encontrar una extensa diversidad de formas, tamaños, composición y sabores del fruto, según la variedad de tomate cultivado. I.2. Situación taxonómica. La taxonomía del grupo en el que se enclava el tomate se ha revisado en los últimos años por ser muy controvertida. Hasta el año 2005, la clasificación que
Introducción general 9 tradicionalmente se había seguido era en esencia la propuesta por Miller desde 1754, que consideraba que el grupo taxonómico que contiene al tomate cultivado y sus parientes silvestres tenía las suficientes características como para formar el género Lycopersicon, distinto al del género Solanum, donde en los inicios fue incluido por Linneo. En los últimos años, el uso de nuevas herramientas moleculares aplicadas en el campo de la taxonomía está revelando que los géneros Solanum y Lycopersicon no son tan distintos como se pensaba: datos morfológicos y de marcadores RFLP cloroplastídicos (Spooner et al. 1993), secuenciación del gen GBSSI (Granule-Bound Starch Synthase) (Peralta & Spooner 2001), varios caracteres de la corola, anteras, estigma, apertura de la flor, atracción de polinizadores, junto con datos moleculares (Peralta et al. 2005) y evidencias biogeográficas y caracterización molecular mediante AFLP (Spooner et al. 2005), entre otros estudios, han llevado a reconsiderar la clasificación taxonómica. El resultado de estos amplios estudios es que el género Lycopersicon cambia de categoría taxonómica y pasa de ser género a ser la sección Lycopersicon dentro del género Solanum L., volviéndose así a la clasificación propuesta por Linneo, en la que el tomate cultivado y sus parientes silvestres quedan incluidos en el género Solanum L., sección Lycopersicon. En la Tabla I.1 se muestran las correspondencias entre la nomenclatura de Miller y los nombres consensuados en la actualidad. Nombre en Solanum Equivalente en Lycopersicon S. arcanum Peralta Parte de L. peruvianum (L.) Miller S. chilense (Dunal) Reiche L. chilense Dunal S. cheesmaniae (L. Riley) Fosberg L. cheesmaniae L. Riley (publicado incorrectamente como cheesmanii) S. chmielewskii (C.M. Rick, Kesicki, Fobes & M. Holle) D.M. Spooner, G.J. Anderson & R.K. Jansen L. chmielewskii C.M. Rick, Kesicki, Fobes & M. Holle S. corneliomulleri J.F. Macbr. Parte de L. peruvianum (L.) Miller; conocido como L. glandulosum C.F. Mull. S. galapagense S. Darwin & Peralta Parte de L. cheesmaniae L. Riley (reconocido previamente como forma o variedad minor) S. habrochaites S. Knapp & D.M Spooner L. hirsutum Dunal Tabla I.1. Lista de especies del género Solanum, sección Lycopersicon. Se proporciona la correspondencia con la nomenclatura previa. Tomado de Peralta y colaboradores (2005).
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 10 I.3. Origen y domesticación de la especie. El origen de las especies silvestres de tomate se localiza en la región andina que se extiende desde el Sur de Colombia al Norte de Chile y desde la costa del Pacífico (incluidas las islas Galápagos) a las estribaciones orientales de los Andes, comprendiendo los países de Colombia, Ecuador, Perú, Bolivia y Chile (EsquinasAlcázar & Nuez 1995). Sin embargo, el origen del cultivo del tomate parece que se sitúa en México (Rick et al. 1976), donde se formó un centro de diversificación secundario de la especie, ya que existía un gran número de variedades en cuanto al tamaño, forma y color del fruto, ya antes de la llegada de los españoles en 1523 (Rick 1978). Tras varios estudios realizados, lo que no parece claro es la especie de la que se originó el tomate cultivado; muchos apuntan a un origen probable a partir de S. lycopersicum var. cerasiforme (Rick 1983), pero se ha demostrado que el conjunto de formas conocidas como var. cerasiforme son una mezcla de tomate cultivado y silvestre más que en sí el “ancestro” del tomate cultivado (Nesbitt & Tanksley 2002). Estudios más recientes han descrito que el origen de S. lycopersicum var. cerasiforme parece ser una domesticación anterior de S. pimpinellifolium (Ranc et al. 2008), que tuvo lugar en Perú (Blanca et al. 2012). El tomate estaba integrado en la cultura azteca y en la de otros pueblos del área mesoamericana siendo parte básica de la dieta, de hecho el nombre tomate se deriva del náhuatl tomatl, un vocablo genérico para plantas con frutos globosos, muchas semillas, pulpa acuosa y a veces encerrados en una membrana; en concreto se Nombre en Solanum Equivalente en Lycopersicon S. huaylasense Peralta Parte de L. peruvianum (L.) Miller S. lycopersicum L. L. esculentum Miller S. neorickii (C.M. Rick, Kesicki, Fobes & M. Holle) D.M. Spooner, G.J. Anderson & R.K. Jansen L. parviflorum C.M. Rick, Kesicki, Fobes & M. Holle S. pennellii Correll L. pennellii (Correll) D’Arcy S. peruvianum L. Parte de L. peruvianum (L.) Miller S. pimpinellifolium L. L. pimpinellifolium (L.) Miller
Introducción general 11 empleaba xitomatl (jitomate) para hablar de S. lycopersicum, y miltomatl (tomate de milpa o simplemente tomate) para referirse a Physalis philadelphica Lam. que en el México prehispánico era mucho más apreciado incluso que el jitomate. Tras el curso de los siglos esta preferencia no se ha mantenido salvo en el medio rural y a día de hoy sólo en el centro de México se conoce el fruto de S. lycopersicum como jitomate. Cuando el tomate, ya plenamente domesticado en México, fue llevado por los conquistadores al Viejo Continente, fue introducido con facilidad en la gastronomía popular de España, Portugal e Italia, sin embargo en el resto de Europa fue usado sólo como planta ornamental o medicinal, y no se consumía por temor a intoxicaciones, ya que se conocían otras solanáceas ricas en alcaloides tóxicos que llegaban a ser mortales. La primera descripción botánica del tomate en Europa la realizó Pier Andrea Mattioli, del jardín botánico de Padua (Italia), quien publicó su herbario en 1554. Desde entonces aparece descrito en numerosos herbarios como el de Matthias de L`Obel en 1581, el de Gerard en Inglaterra en 1597 o el de Salmon en Estados Unidos, ya en 1710. Aún así el temor a su utilización y consumo se mantuvo en muchos países hasta principios del siglo XIX, mientras que España y Portugal lo difundieron por todo el mundo a través de sus rutas comerciales y colonias de ultramar. La domesticación sufrida por el tomate ha llevado al cultivo a varios cuellos de botella consecutivos durante su peregrinación de los Andes a Centroamérica y de allí a Europa, ya que al ir seleccionando los genotipos más apropiados entre los existentes se produjeron grandes reducciones poblacionales debido al bajo número de plantas seleccionadas para los cultivos, lo que se tradujo en una disminución de la variabilidad genética (Rick et al. 1976; Bai & Lindhout 2007). Las variedades de tomate cultivado actual conservan la base genética de los primeros tomates introducidos en Europa por los españoles (Foolad 2007) y se estima que el genoma de los cultivares de tomate contiene alrededor de un 5% de la variación genética total encontrada en sus parientes silvestres (Miller & Tanksley 1990; Bai & Lindhout 2007). Con ello, a pesar de la gran diversidad existente en color, forma y calidad de fruto, tipo de crecimiento y morfología de hoja, otros caracteres agronómicos importantes como la resistencia a
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 12 estreses bióticos y abióticos se fueron perdiendo gradualmente durante la domesticación (Schauer et al. 2005). Las especies silvestres de tomate tienen una enorme diversidad genética (Rick 1978), al ser especies autoimcompatibles debido a la exerción del estigma respecto al cono estaminal y, en varias de dichas especies, a una barrera de autoincompatibilidad genética de tipo gametofítico (Rick et al. 1979). La domesticación de S. lycopersicum se acompañó por una transición de estigma exerto a inserto desde una especie ya autocompatible genéticamente como es S. pimpinellifolium, por lo que la polinización cruzada derivó a una autogamia forzada y como resultado la mayoría de las variedades cultivadas son esencialmente líneas puras (Foolad 2007). El escenario más probable es que el tomate cultivado no haya tenido intercambios genéticos con las especies silvestres antes de 1940. Por entonces el renombrado genetista Dr. Charles M. Rick de la Universidad de California, Davis, observó que los cruces entre especies silvestres y cultivadas generaban toda una gama de nuevas variaciones genéticas en la descendencia. Desde entonces la mejora genética desde especies silvestres por medio de cruces interespecíficos ha sido la clave para la incorporación de caracteres favorables que estaban ocultos en los germoplasmas exóticos de tomate (Bai & Lindhout 2007). Este objetivo ha hecho imprescindible la creación y el mantenimiento de bancos de germoplasma de tomate, así como la descripción, propagación y distribución del material genético para facilitar los programas de mejora (Bai & Lindhout 2007). La mayoría de los grandes bancos de germoplasma de tomate silvestre se encuentran en Estados Unidos, necesario mencionar la Plant Genetic Resources Unit, en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, Geneva, New York), y el Charles Rick Tomato Genetic Resource Center (TGRC), en el Departamento de Cultivos Hortícolas de la Universidad de California (Davis, California). En España el Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV-UPV), junto con el banco de germoplasma de hortícolas del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) en Zaragoza, y el Centro de Recursos Fitogenéticos (CRF) en Madrid, conservan el banco de tomate más completo de Europa. El banco de germoplasma de nuestro centro, IHSM La Mayora, UMA-CSIC, también tiene una larga
Introducción general 13 trayectoria de búsqueda y mantenimiento de nuevas variedades de tomate, tanto cultivado como silvestre, que presenten caracteres agronómicos interesantes. De hecho los materiales empleados en este trabajo de tesis se han originado desde un programa de mejora para encontrar nuevas fuentes de resistencia frente a artrópodos, y que partió de material genético proveniente de nuestro banco de germoplasma (Fernández-Muñoz et al. 2000). I.4. Importancia del tomate. El tomate es una de las hortalizas más consumidas en el mundo y un producto básico de la horticultura española. En el año 2013 se cultivaron más de 4,7 millones de ha en todo el mundo, con una producción total de más de 163,9 millones de toneladas, siendo China, India y Estados Unidos de América los principales países productores. España se situó en el noveno lugar a escala mundial y el segundo tras Italia en el ámbito europeo, con más de 3.5 millones de toneladas producidas, de las que casi el 25% se destina a la exportación, siendo el mercado europeo el principal consumidor (FAO 2013). El consumo de tomate fresco es elevado en la temporada de verano, propicia para su cultivo, pero además se ha adaptado bien a condiciones de invernadero durante el invierno, lo que permite disponer de tomate fresco en todas las estaciones, por lo que el consumo se ha incrementado regularmente durante los últimos 20 años (Causse et al. 2003). A ello se suma el alto consumo de productos de tomate procesado en diferentes formatos (pelado, triturado, concentrado, frito, kétchup). Esto hace que el tomate sea una parte importante de una dieta variada y equilibrada en todo el mundo (Willcox et al. 2003), ya que a pesar de no liderar el ranking de alimentos con valor nutricional, se puede afirmar que contribuye significativamente a la ingesta diaria de antioxidantes como la vitamina C y los carotenoides (licopeno, β-caroteno, luteína, entre otros), minerales, y compuestos saludables (flavonoides, ácido fólico, etc.) (Tabla I.2), ya que la gran cantidad de tomate y productos derivados que se consumen conforman una matriz apropiada en la que estos nutrientes son suministrados en la dieta, además de presentar bajo nivel calórico y un contenido medio de fibra (Davies et al. 1981; Beecher 1998; Dorais et al. 2008).
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 14 Nutriente Valor por 100g de porción comestible Nutriente Valor por 100g de porción comestible Azúcares totales 2.63 g Vitamina C Ácido ascórbico total 12.7 mg Sacarosa 0.00 g Glucosa 1.25 g Folato total 15 µg Fructosa 1.37 g Vitamina A 833 UI Calcio 10 mg β-caroteno 449 µg Magnesio 11 mg α-caroteno 101 µg Fósforo 24 mg Licopeno 2573 µg Potasio 237 mg Luteína + zeaxantina 123 µg El procesado industrial del tomate puede afectar la biodisponibilidad de estos nutrientes. En los productos de tomate procesado, la homogeneización, el calor y la incorporación de aceites llevan a un incremento de la biodisponibilidad de licopeno, a la vez que algunos de estos procesos ocasionan una pérdida importante de otros nutrientes importantes como la vitamina C. El contenido en nutrientes también se ve afectado por la variedad y el estado de maduración. La mayoría de estos nutrientes pueden actuar de manera individual, o conjunta, en la protección de las lipoproteínas y las células vasculares de la oxidación, que es la teoría más ampliamente aceptada para el origen de la aterosclerosis (Willcox et al. 2003). El licopeno es un carotenoide no precursor de la vitamina A, pero es el antioxidante más eficiente entre los carotenoides por su actividad neutralizadora del singlete de oxígeno y de los radicales peróxidos (Dorais et al. 2008), teniendo el doble de capacidad antioxidante que el βcaroteno (Di Mascio et al. 1990). Numerosos estudios epidemiológicos han demostrado que una ingesta diaria de alimentos ricos en licopeno se relacionan con un descenso en la incidencia de ciertos tipos de cáncer, incluyendo el de próstata, pulmón, boca y colon, así como de enfermedades coronarias, cataratas y en cierta medida puede que la degeneración macular (Willcox et al. 2003; Giovannucci 2002; Giovannucci 1999; Gerster 1997). Por tanto, debido a que los tomates contienen varios nutrientes asociados con efectos teóricos o probados y son ampliamente consumidos durante todo el año, deben ser tenidos en cuenta como un componente valioso de una dieta cardioprotectora (Willcox et al. 2003). Tabla I.2. Contenido medio de nutrientes en un tomate fresco, rojo maduro. Selección tomada de Causse y colaboradores (2007).
Introducción general 15 A la vez que su consumo se ha incrementado, se observa desde los años 90 que los consumidores tienden a quejarse del sabor del tomate (Hobson 1988; Bruhn et al. 1991; Ratanachinakorn et al. 1997), con frecuencia culpando a los cultivares modernos de falta de sabor. Parece que en el proceso de mejora del cultivo, la búsqueda de la disponibilidad de tomate durante todo el año, por un lado, y la tendencia de los mejoradores hacía un fruto cada vez más firme y de mayor vida poscosecha empleando genes que alteran la maduración normal del fruto, por otro, han desembocado en esta situación (Causse et al. 2010). II. MEJORA GENÉTICA DE LA CALIDAD DEL FRUTO DE TOMATE. II.1. El concepto de calidad del fruto. Los principales objetivos de los programas de mejora de tomate han sido alta productividad, resistencia a enfermedades, uniformidad de tamaño y color de fruto, adaptación a condiciones de crecimiento específicas y la vida post-cosecha del fruto (Causse et al. 2010; Baldwin et al. 1998). Se han conseguido con éxito cultivares e híbridos resistentes, con tomates uniformes y atractivos, sin embargo estas nuevas variedades presentan una calidad de sabor bastante reducida (Galiana-Balaguer et al. 2006). Siguiendo a Llácer et al. (2006), la calidad de un producto hortofrutícola para el consumidor está relacionado con la: - Calidad organoléptica o sensorial, aquella que capta el consumidor directamente con sus sentidos, y se refiere al color, sabor, aroma, textura. - Calidad nutricional, la que está relacionada con la capacidad de los alimentos de proporcionar todos los nutrientes que favorezcan una buena salud y eviten la aparición de enfermedades. - Calidad sanitaria, que tiene en cuenta la presencia o ausencia de tóxicos naturales, contaminantes y/o microorganismos patógenos que puedan dar lugar a una acción tóxica.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 22 número de frutos afectados y su severidad, ya sea en invernadero o en campo (Picha & Hall 1981; Hartz et al. 1999; Hartz 2005; Trudel & Ozbun 1971). Entre los factores ambientales se ha observado que la radiación solar sobre el fruto verde está implicada en la aparición posterior de la mancha en fruto rojo maduro, y así, evitando la exposición a la radiación solar se consigue impedir su aparición (Ruiz-Rubio C. et al. 2006). Acerca de los factores genéticos, experimentos anteriores en la Estación Experimental La Mayora-CSIC (EELM) han mostrado que la mancha solar parece tener un carácter poligénico. El único gen conocido que parece estar relacionado con la mancha solar es el gen u, de maduración uniforme, responsable del fenotipo hombro verde en los frutos inmaduros. Los genotipos de maduración uniforme (u/u) tienden a mostrar “yellow ring”; y la mancha solar tal y como se describe anteriormente se encuentra normalmente en genotipos de maduración no uniforme (U/U), que presentan hombro verde durante el comienzo de la maduración (Francis et al. 2000). III.2. Selección del material vegetal. Debido al carácter poligénico de la mancha solar, para su estudio se hace necesario conseguir un material vegetal con pocas diferencias en su fondo genético, pero a su vez contrastante para el carácter, de manera que las diferencias entre ese material vegetal contrastante deben responder a diferencias genéticas directamente relacionadas con la mancha solar. En el proceso de obtención de la población de las líneas recombinantes se observó que varias líneas RIL presentaban mancha solar en los frutos, a pesar de que los parentales no presentaban el carácter. Este hecho permitió que tras varias evaluaciones se seleccionaran dos plantas dentro de una misma RIL en construcción, en la generación F6, porque presentaban diferencias para el carácter de mancha solar, a pesar de ser plantas hermanas. Desde entonces se realizaron 4 sucesos de siembra, autofecundación, evaluación y selección para definir y obtener dos líneas que comparten gran parte de su fondo genético, pero que son diferentes para el carácter mancha solar. En los capítulos 2 y 3 de esta Memoria se detallará cómo estas líneas contrastantes para mancha solar se han empleado para analizar el efecto de la
Introducción general 23 radiación solar en la aparición de la mancha y para generar el primer modelo que explicaría las bases genéticas de esta fisiopatía, mediante análisis genéticos y proteómicos.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 24
Introducción general 25 Objetivos • Caracterizar fenotípicamente la población RIL para caracteres de calidad interna y externa y estimar parámetros genéticos útiles para su mejora. • Localizar Quantitative Trait Loci (QTLs) de dichos caracteres en un mapa genético de la población. • Estudiar el efecto de la radiación solar y el estado fenológico en la aparición de la fisiopatía de la mancha solar del fruto. • Plantear un modelo genético que explique la aparición de mancha solar en el fruto de tomate.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 26
Introducción general 27 Bibliografía Bai, Y. & Lindhout, P., 2007. Domestication and breeding of tomatoes: what have we gained and what can we gain in the future? Annals of botany, 100(5), pp.1085–94. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2759208&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed March 3, 2013]. Baldwin, E. et al., 1998. Relationship between sensory and instrumental analysis for tomato flavor. Journal of the American Society for Horticultural Science, 123(5), pp.906–915. Beecher, G.R., 1998. Nutrient content of tomatoes and tomato products. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 218(2), pp.98–100. Available at: ISI:000073729900003. Blanca, J. et al., 2012. Variation revealed by SNP genotyping and morphology provides insight into the origin of the tomato. PloS one, 7(10), p.e48198. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3485194&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed November 30, 2014]. Bruhn, C.M. et al., 1991. Consumer perceptions of quality: apricots, cantaloupes, peaches, pears, strawberries, and tomatoes. Journal of Food Quality, 14(3), pp.187–195. Available at: http://dx.doi.org/10.1111/j.1745-4557.1991.tb00060.x. Causse, M. et al., 2010. Consumer preferences for fresh tomato at the European scale: a common segmentation on taste and firmness. Journal of food science, 75(9), pp.S531–41. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21535628 [Accessed March 11, 2013]. Causse, M. et al., 2001. Genetic analysis of organoleptic quality in fresh market tomato. 2. Mapping QTLs for sensory attributes. Theoretical and Applied Genetics, 102(2-3), pp.273–283. Available at: ISI:000167232800012. Causse, M. et al., 2007. Genetic Improvement of Solanaceous Crops. Vol 2: Tomato 2007th ed. M. K. Razdan & A. K. Mattoo, eds., Enfield, NH, USA: Science Publishers.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 28 Causse, M. et al., 2003. Inheritance of nutritional and sensory quality traits in fresh market tomato and relation to consumer preferences. Journal of Food Science, 68(7), pp.2342–2350. Available at: ISI:000185523900035. Causse, M. et al., 2002. QTL analysis of fruit quality in fresh market tomato: a few chromosome regions control the variation of sensory and instrumental traits. Journal of Experimental Botany, 53(377), pp.2089–2098. Available at: ISI:000178254300009. Chaib, J. et al., 2006. Stability over genetic backgrounds, generations and years of quantitative trait locus (QTLs) for organoleptic quality in tomato. Theoretical and Applied Genetics, 112(5), pp.934–944. Available at: ISI:000235751700016. Chaïb, J. et al., 2007. Physiological relationships among physical, sensory, and morphological attributes of texture in tomato fruits. Journal of experimental botany, 58(8), pp.1915–25. Available at: http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/content/long/58/8/1915 [Accessed February 9, 2015]. Chen, F.Q. et al., 1999. Mapping of QTLs for lycopene and other fruit traits in a Lycopersicon esculentum x L-pimpinellifolium cross and comparison of QTLs across tomato species. Molecular Breeding, 5(3), pp.283–299. Available at: ISI:000080358000008. Darrigues, A., Schwartz, S.J. & Francis, D.M., 2008. Optimizing sampling of tomato fruit for carotenoid content with application to assessing the impact of ripening disorders. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(2), pp.483–487. Available at: ISI:000252434800028. Davies, J.N., Hobson, G.E. & McGlasson, W.B., 1981. The constituents of tomato fruit — the influence of environment, nutrition, and genotype. C R C Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 15(3), pp.205–280. Available at: http://dx.doi.org/10.1080/10408398109527317. Dorais, M., Ehret, D.L. & Papadopoulos, A.P., 2008. Tomato (Solanum lycopersicum) health components: From the seed to the consumer. Phytochemistry Reviews, 7,
Introducción general 29 pp.231–250. Eshed, Y. & Zamir, D., 1995. An introgression line population of Lycopersicon pennellii in the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of yieldassociated QTL. Genetics, 141(3), pp.1147–1162. Available at: http://www.genetics.org/content/141/3/1147.abstract. Esquinas-Alcázar, J. & Nuez, F., 1995. Situación taxonómica, domesticación y difusión del tomate. In Mundi-Prensa, ed. El cultivo del tomate. Madrid, pp. 15–43. FAO, 2013. FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Available at: http://faostat3.fao.org/home/E. Fernández-Muñoz, R. et al., 2003. Inheritance of Resistance to Two-spotted Spider Mite and Glandular Leaf Trichomes in Wild Tomato Lycopersicon pimpinellifolium (Jusl.) Mill. Journal of the American Society for Horticultural Science, 128(2), pp.188–195. Available at: http://journal.ashspublications.org/content/128/2/188.abstract. Fernández-Muñoz, R., Domínguez, E. & Cuartero, J., 2000. A novel source of resistance to the two-spotted spider mite in Lycopersicon pimpinellifolium (Jusl.) Mill.: Its genetics as affected by interplot interference. Euphytica, 111, pp.169–173. Fernie, A.R., Tadmor, Y. & Zamir, D., 2006. Natural genetic variation for improving crop quality. Current opinion in plant biology, 9(2), pp.196–202. Available at: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526606000112 [Accessed February 9, 2015]. Foolad, M.R., 2007. Genome mapping and molecular breeding of tomato. International Journal of Plant Genomics, 2007, pp.1–52. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2267253&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed March 6, 2013]. Francis, D.M., Barringer, S.A. & Whitmoyer, R.E., 2000. Ultrastructural characterization of yellow shoulder disorder in a uniform ripening tomato genotype. Hortscience, 35(6), pp.1114–1117. Available at: ISI:000089964200030.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 30 Fridman, E. et al., 2004. Zooming in on a quantitative trait for tomato yield using interspecific introgressions. Science, 305(5691), pp.1786–1789. Available at: ISI:000224039500045. Fridman, E., Pleban, T. & Zamir, D., 2000. A recombination hotspot delimits a wildspecies quantitative trait locus for tomato sugar content to 484 bp within an invertase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(9), pp.4718– 4723. Available at: http://www.pnas.org/cgi/content/long/97/9/4718 [Accessed February 14, 2015]. Fulton, T.M. et al., 2000. Advanced backcross QTL analysis of a Lycopersicon esculentum ×Lycopersicon parviflorum cross. Theoretical and Applied Genetics, 100(7), pp.1025–1042. Available at: http://dx.doi.org/10.1007/s001220051384. Fulton, T.M. et al., 2002. Quantitative trait loci (QTL) affecting sugars, organic acids and other biochemical properties possibly contributing to flavor, identified in four advanced backcross populations of tomato. Euphytica, 127(2), pp.163–177. Available at: http://dx.doi.org/10.1023/A%3A1020209930031. Galiana-Balaguer, L., Roselló, S. & Nuez, F., 2006. Characterization and selection of balanced sources of variability for breeding tomato (Lycopersicon) internal quality. Genetic Resources and Crop Evolution, 53(5), pp.907–923. Available at: ISI:000238270600006. Gerster, H., 1997. The potential role of lycopene for human health. Journal of the American College of Nutrition, 16(2), pp.109–126. Available at: ISI:A1997WQ60400004. Giovannucci, E., 2002. A review of epidemiologic studies of tomatoes, lycopene, and prostate cancer. Experimental Biology and Medicine, 227(10), pp.852–859. Available at: ISI:000179078600003. Giovannucci, E., 1999. Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review of the epidemiologic literature. Journal of the National Cancer Institute, 91(4), pp.317–331. Goldman, I., Paran, I. & Zamir, D., 1995. Quantitative trait locus analysis of a
Introducción general 31 recombinant inbred line population derived from a Lycopersicon esculentum x Lycopersicon cheesmanii cross. Theoretical and Applied Genetics, 90(7), pp.925– 932. Available at: http://www.springerlink.com/index/10.1007/BF00222905. González-Fernández, J., Fernández-Muñoz, R. & Cuartero, J., 1995. Report of the Tomato Genetics Cooperative, Ithaca, NY. Hanson, P.M. et al., 2004. Variation for antioxidant activity and antioxidants in tomato. Journal of the American Society for Horticultural Science, 129(5), pp.704–711. Available at: ISI:000223836100013. Hartz, K., 2005. Processing tomato yield and fruit quality improved with potassium fertigation. Hortscience, 40(6), pp.1862–1867. Hartz, T.K. et al., 1999. Potassium requirements for maximum yield and fruit quality of processing tomato. Journal of the American Society for Horticultural Science, 124(2), pp.199–204. Available at: ISI:000078681600016. Hobson, G.E., 1988. How the tomato lost its taste. , pp.46–50. Hovav, R. et al., 2007. The identification of a gene (Cwp1), silenced during Solanum evolution, which causes cuticle microfissuring and dehydration when expressed in tomato fruit. The Plant Journal, 52(4), pp.627–639. Available at: http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03265.x. Lecomte, L. et al., 2004. Marker-assisted introgression of five QTLs controlling fruit quality traits into three tomato lines revealed interactions between QTLs and genetic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics, 109(3), pp.658–668. Available at: ISI:000223097700023. Lincoln, R.E. et al., 1943. Provitamin A and vitamin C in the genus Lycopersicon. Botanical Gazette, 105(1), pp.113–115. Llácer, G. et al., 2006. Mejora genética de la calidad en plantas 1st ed. Universidad Politécnica de Valencia, ed., Valencia. Di Mascio, P. et al., 1990. Carotenoids, tocopherols and thiols as biological singlet molecular oxygen quenchers. Biochemical Society transactions, 18(6), pp.1054–
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 38 encuentra representado en igual proporción el genoma de los dos parentales de partida, siendo cada una de las líneas una combinación única de los genes de los parentales, lo que permite el estudio de caracteres en cuya genética interviene la epistasia (Paran et al. 1995). Existen múltiples estudios que han analizado QTLs para calidad de fruto y algunos caracteres vegetativos, empleando poblaciones F2 (Paterson et al. 1991) o bien poblaciones obtenidas con diferentes grados de retrocruzamientos (Paterson et al. 1988; Grandillo & Tanksley 1996; Tanksley et al. 1996; Chen et al. 1999). Otros han empleado líneas RIL para detectar QTLs, ya que una población RIL es más eficiente que una población F2 porque se necesitan menos individuos para detectar ligamientos de la misma magnitud entre un marcador y un QTL (Simpson 1989). Se han generado poblaciones RIL desde cruces entre el tomate cultivado y varias especies de Solanum para analizar las bases genéticas de caracteres cuantitativos. Entre otros, Goldman (1995) empleó S. cheesmaniae para detectar QTLs para peso del fruto (FW), sólidos solubles (SSC) y peso de la semilla; Causse y Saliba-Colombani (Saliba-Colombani et al. 2001; Causse et al. 2001) recurrieron a una variedad cerasiforme de tomate para detectar QTLs de varios caracteres de calidad de fruto y sensorial; y Rodríguez y Pratta (Rodríguez et al. 2006; Pratta et al. 2011) utilizaron una entrada silvestre de S. pimpinellifolium para detectar QTLs relacionados con el peso y la vida post-cosecha del fruto. Como se ha comentado en la introducción general, la población empleada en este trabajo son líneas RIL que provienen del cruzamiento de una variedad de tomate cultivado S. lycopersicum “Moneymaker”, con la entrada de S. pimpinellifolium TO-937, parentales que presentan valores muy dispares para caracteres externos del fruto, así como para el contenido de compuestos relacionados con la calidad interna del fruto. Debido a estas diferencias, se espera que los caracteres estudiados presenten un rango amplio de variabilidad en las líneas RIL, lo que nos permitirá la caracterización genética de esos caracteres.
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 39 Los objetivos del capítulo 1 son fenotipar la población RIL, los parentales y el híbrido para una serie de caracteres seleccionados y desarrollar un mapa de ligamiento saturado, con el fin de determinar el tipo de herencia que presentan esos caracteres, valorar el grado de afectación por los factores ambientales, desvelar las correlaciones fenotípicas y genéticas que se establecen entre ellos, estimar la heredabilidad asociada a cada carácter y, finalmente, con esta información ser capaces de detectar QTLs asociados a los caracteres analizados en este trabajo. 1.2. MATERIALES Y MÉTODOS 1.2.1. Material vegetal El trabajo se inició con el material vegetal de los pasos finales de la obtención de una población de 169 líneas RIL desarrollada por el método del single seed descent (SSD) hasta llegar a la generación F8, a partir del cruzamiento interespecífico de una variedad de tomate cultivado Solanum lycopersicum cv. “Moneymaker”, con una entrada de S. pimpinellifolium, TO-937, del banco de germoplasma de la entonces Estación Experimental La Mayora – CSIC, hoy IHSM UMA-CSIC. 1.2.2. Diseño experimental La organización del cultivo de las plantas se inicia a finales de febrero con la preparación de los semilleros y la siembra de las semillas del conjunto de las líneas RILs. También se realiza la siembra de semillas de otro conjunto de las líneas RIL llamadas R, que se han generado en paralelo a las principales para tener posibilidad de reposición en el caso de pérdida de alguna línea, por fallo en la germinación o fructificación, de forma que la línea perdida se reponga con la línea R descendiente de la misma planta F2 de la que provenía la perdida. Al llegar a la generación F8 se evaluaron las líneas principales y se hizo necesario tomar 8 líneas R para completar el juego completo de RILs. Desde la generación F8 sólo se trabaja con el conjunto principal de semillas, incluyendo esas 8 líneas R, que desde ese momento se consideran también principales. Como norma general en el proceso de SSD, para
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 40 obtener las semillas de la siguiente generación se usaba la planta 1 de la línea de cultivo de cada familia, o en casos de pérdida o clara desviación del tipo, se empleaba la siguiente planta en el orden de la línea de goteros. En todo el proceso se tenía cuidado en no realizar selección de plantas por mejor apariencia o cualquier otro carácter, de forma que las 3 plantas que iban al invernadero también habían sido las 3 plantas primeras en el orden la bandeja de semillero. Para los experimentos de este capítulo, se germinaron semillas de cada familia o línea en un invernadero de vidrio en febrero y a los 40 días se trasplantaron las plántulas de cada línea en un invernadero de polietileno, en suelo enarenado, con fertirrigación por lineas de goteros como en la práctica de cultivo comercial. Dentro del invernadero la radiación fotosintéticamente activa (PAR), la temperatura y la humedad relativa fueron registradas en continuo con una estación meteorológica (Meteodata256, Geónica, Madrid, España). El diseño experimental para llevar a cabo el análisis de los caracteres, que están detallados en profundidad en el siguiente apartado, se planificó en 2 temporadas estivales consecutivas, cada una con un objetivo diferente. Los caracteres de calidad interna del fruto se midieron en las dos temporadas siguiendo el siguiente esquema: Temporada 1: Se sembraron semillas de cada una de 169 familias F6:7 de las que se trasplantaron 3 plantas al invernadero. De ellas, se seleccionó como planta fundadora de las RILs, siempre que fue posible, la primera planta de las 3 cultivadas, salvo pérdida, en cuyo caso se seleccionó la segunda o, si no, la tercera planta. En esta planta F7 elegida se tomaron frutos de 3 racimos diferentes por separado, en principio los racimos 3, 5 y 7, cuando la producción de la planta así lo permitió, en estado de rojo maduro. De esta forma se podrá realizar una primera caracterización de la línea respecto a los caracteres de calidad interna con la planta fundadora; y en los casos en que se pudo tomar muestras de diferentes racimos, se podrá analizar si existen diferencias en los caracteres debidas a las diferencias ambientales en las que se desarrollan los
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 41 racimos. De los frutos analizados de la planta F7 elegida se extrajeron las semillas de familias F7:8 que constituyen ya la población RIL final. Temporada 2: Se trasplantaron un máximo de 7 plantas por familia F7:8 de las que se seleccionaron las 5 primeras que hubiera en la fila para prealizar un estudio de la variabilidad intralínea y poder estimar parámetros genéticos. En cada planta por separado se tomaron frutos para una muestra representativa de la planta, siendo estos frutos de los racimos 3 al 5, salvo contadas excepciones. Los caracteres vegetativos, de la inflorescencia y del exterior del fruto al completo, se midieron sólo en esta segunda temporada. El diseño experimental mostrado arriba contempla que se obtengan 3 muestras por racimo estudiado. Estas 3 muestras se corresponden con 3 viales, cada uno conteniendo el pericarpo de un fruto diferente. Este diseño se pudo mantener en las líneas con un tamaño de fruto intermedio, en las que el pericarpo de un solo fruto pesaba mínimo 4-5 g. En los casos de frutos más pequeños se unificó el pericarpo de varios frutillos en un vial hasta que alcanzó el peso mínimo. Para frutos muy grandes, como el del parental “Moneymaker”, que no pueden ir enteros en el vial, se cortaron también por el ecuador y se vaciaron, pero la muestra se tomó cortando en uno y otro hemisferio un meridiano que pasó por el tabique central y que era representativo del fruto completo. El protocolo para preparar cada muestra siguió los siguientes pasos: a. Lavado y secado de los frutos seleccionados. b. Medida de caracteres externos cuantificables (color, peso…) c. Anotación del resto de caracteres externos. d. Corte por plano ecuatorial y anotación de los caracteres correspondientes. e. Retirada de mucílago y columela, dejando el tabique interlocular. f. Medida del peso del pericarpo. g. Distribución de los pericarpos en los viales para su congelación y su análisis posterior.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 42 Figura 1.1. Representación de la variabilidad encontrada en las líneas RILs. A: Variabilidad externa de los frutos de las RILs. Frutos de los parentales (arriba izquierda y derecha), el híbrido (arriba centro) y varias líneas RILs (debajo). B y C: Variabilidad en el grado de exerción del estilo. Detalle de una flor con estilo muy exerto, grado 4 (B). Detalle de una flor con estilo poco exerto, grado 3 (C). Moneymaker TO-937 MMxTO-937 AB C 1.2.3. Medida de los caracteres de calidad de fruto y planta Dada la singularidad de la población RIL descrita, en la que se puede observar a simple vista gran variabilidad a nivel de planta y exterior del fruto entre las 169 líneas (Figura 1.1), en este trabajo se han evaluado no sólo los caracteres que afectan directamente a la calidad del fruto, sino que se ha tenido en cuenta además una serie de caracteres de otro tipo que han permitido conocer y evaluar la población RIL en varios aspectos. Además se ha evaluado la presencia de mancha solar u hombro amarillo de los frutos (YSD, Yellow Shoulder Disorder) (Picha 1987), fisiopatía para la que la población presenta gran variabilidad. Esta fisiopatía no aparece en ninguno de los dos parentales ni en el híbrido F1, pero sí en varias de las líneas RIL, por lo que se le dedica mayor atención en los siguientes capítulos. A continuación se detallan los caracteres seleccionados para su análisis en la población. 1.2.3.1. Caracteres Vegetativos La observación y cuantificación de los caracteres morfológicos de la parte vegetativa de las plantas RIL se realiza cuando los frutos de los racimos 2 y 3 están maduros. Los caracteres se observan en 3 plantas por RIL y se calcula el valor medio. A
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 43 continuación se presenta una tabla resumen; los detalles de los caracteres observados se explican en el anexo 1.1. Caracteres Vegetativos Color del hipocótilo Tipo de crecimiento Longitud de la planta Diámetro del tallo Pubescencia de tallos y hojas Distancia entre racimos Número de hojas entre racimos Distancia entre hojas Número de hojas hasta primer racimo Densidad del follaje Inclinación de la hoja Grado de división de la hoja Borde del foliolo Posición de los foliolos en los 2 extremos de la hoja Giro del follaje Tamaño de foliolo diferente Inserción del foliolo Rizado del foliolo 1.2.3.2. Caracteres de la inflorescencia La observación y cuantificación de los caracteres morfológicos de la inflorescencia de las plantas RIL se realiza cuando el tercer fruto de los racimos 2 y 3 está maduro. Los caracteres se observan en 3 plantas por RIL. A continuación se presenta una tabla resumen; los detalles de los caracteres observados se explican en el anexo 1.2.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 44 Caracteres de la inflorescencia Tipo de inflorescencia Número de flores por inflorescencia Presencia de tallo tras el racimo Color de la corola Fusión de la corola Ángulo de apertura-exposición de la flor Tamaño relativo de la flor Posición del estilo Dehiscencia de la antera 1.2.3.3. Caracteres del fruto La observación y cuantificación de los caracteres morfológicos del fruto de las plantas RIL se realiza cuando el tercer fruto de los racimos 2 y 3 está maduro. Los caracteres se observan en 5-6 plantas por RIL. Los caracteres de fruto verde se miden en un fruto por cada planta. El resto de los caracteres, de fruto rojo maduro, se observan en los mismos frutos recogidos para el estudio de los caracteres de calidad interna. A continuación se presenta una tabla resumen; los detalles de los caracteres observados se explican en el anexo 1.3. Caracteres del fruto Color del fruto verde Rayas verdes en el fruto Intensidad de hombros verdes Pubescencia del fruto verde Peso Peso pericarpo % Peso pericarpo Diámetro ecuatorial
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 45 Diámetro polar Forma Color del fruto rojo Mancha solar Brillo Forma del hombro Forma de la sección polar Forma de la zona apical Agrietado Pilosidad Grosor del pericarpo en sección ecuatorial Color interno del pericarpo Forma de la sección ecuatorial Número de lóculos y simetría 1.2.3.4. Caracteres de calidad interna del fruto El análisis de los caracteres de calidad interna del fruto de las plantas RIL se realiza en frutos rojo maduro. A continuación se presenta una tabla resumen; los detalles de los caracteres analizados se explican en el anexo 1.4. Caracteres de calidad interna Sólidos Solubles Acidez Titulable Licopeno β-caroteno % Licopeno Glucosa Fructosa Sacarosa
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 46 1.2.4. Análisis de los datos Para realizar los análisis estadísticos de los datos obtenidos se han empleado varios métodos que se detallan a continuación en el apartado de Resultados. Se ha utilizado el paquete estadístico SPSS 22.0 (IBM Corp. 2013) para los diferentes análisis basados en el análisis de la varianza. Cuando la naturaleza de los datos lo requería, algunas variables fueron transformadas previamente al análisis con el objetivo de normalizar los datos para homogeneizar las varianzas de los diferentes caracteres evaluados. Algunas variables fueron Log-transformadas (log(x+1)) y a las variables de tipo porcentual se les aplicó el arcoseno de la raíz del % dividido entre 100. 1.2.4.1. Evaluación del efecto ambiental durante la misma temporada Con el objetivo de determinar si existen diferencias entre los frutos recogidos en diferentes cosechas durante la misma temporada, que serían debidas a la diferencia de condiciones ambientales que se suceden durante toda una temporada de cultivo, se realizó un Análisis de la Varianza (ANOVA) entre los datos de los caracteres de fruto que se recogieron en dos momentos de la campaña. 1.2.4.2. Estima de las heredabilidades de los caracteres analizados en la población RIL La variación observada entre los individuos se puede deber a factores genéticos y/o ambientales. La heredabilidad de un carácter es la proporción de la variación fenotípica en una población que se atribuye a la variación genotípica entre individuos. Los análisis de heredabilidad estiman las contribuciones relativas de los factores genéticos y no genéticos a la varianza fenotípica total en una población. La heredabilidad en sentido amplio (H) se define como el cociente entre la varianza genética aditiva (o alélica) y la varianza fenotípica, siguiendo la fórmula: = (+)
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 47 donde VG es la varianza genotípica y VE es la varianza ambiental. La heredabilidad en sentido amplio (H) refleja todas las contribuciones genéticas posibles a la varianza fenotípica de una población. Se incluyen los efectos debidos a la variación alélica (varianza aditiva), variación por dominancia y de acción epistática (interacciones multi-génicas), así como efectos materno y paterno. La heredabilidad en sentido estricto (h2) sólo tiene en cuenta, de entre los factores genéticos, la varianza aditiva (Falconer & Mackay 2001). Para el caso particular de las poblaciones RIL, en las que únicamente hay genotipos homocigotos, su estima se puede calcular con la siguiente fórmula (Strom 1999), basada en que en las RILs en cada locus hay dos copias del mismo alelo en homocigosis: ℎ=12 (12 +) y cuantifica sólo la porción de la variación fenotípica que es ‘’aditiva’’ (alélica) por naturaleza (Falconer & Mackay 2001). El valor de la heredabilidad de un carácter determinado se refiere a una población y unas condiciones ambientales concretas. Los valores que pudieran calcularse en otras poblaciones o estructura poblacional serán más o menos parecidos, dependiendo del grado de semejanza de la estructura poblacional y de las características del medio (Falconer & Mackay 2001). 1.2.4.3. Relación entre los caracteres analizados en la población RIL Para conocer las relaciones que se establecen entre los diferentes caracteres evaluados en la población RIL es necesario observar si existe correlación entre ellos, y distinguir las causas de correlación entre caracteres, que pueden ser genéticas y ambientales. La causa genética de la correlación es principalmente la pleiotropía, aunque el ligamiento también causa correlaciones transitorias, particularmente en
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 54
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 55
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Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 57
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 58 1.3.2. Evaluación del efecto ambiental durante la misma temporada. La primera cosecha se realiza del racimo 3 y se compara con los datos de los frutos del racimo 7, cosechados de media 18.5 días más tarde, en 53 de las RILs que así lo permitieron por su producción de frutos. Se encontraron diferencias significativas según la época de cosecha en varios de los caracteres analizados con un nivel de significación del 95%. Los caracteres afectados son parámetros de calidad externa diferentes como peso, diámetros, variables de color de fruto en espacio de color CIELab entre otros, pero en ningún caso se encontraron diferencias significativas entre racimos en parámetros de calidad interna (Figura 1.3). 1.3.3. Heredabilidad de los caracteres analizados en la población RIL La heredabilidad de los caracteres evaluados en la población RIL, estimada mediante los componentes de la varianza, se muestran en la Tabla 1.2. Los valores de heredabilidad en sentido estricto (h2) estimados han sido variables debido a la Figura 1.2. Distribución de frecuencias de valores medios de los caracteres analizados en las RILs derivadas de S. lycopersicum cv. “Moneymaker” x S. pimpinellifolium acc. TO-937. Se muestran los valores de media y desviación típica de la distribución. Las flechas indican los valores medios de los parentales y el híbrido (línea continua: S. lycopersicum cv. “Moneymaker”; línea discontinua S. pimpinellifolium acc. TO-937; línea de puntos: S. l y co p ersicum cv. “Mone y maker” x S. p im p inelli f olium acc. TO-937 ) . Figura 1.3. Valores medios de los caracteres de fruto que presentaron diferencias significativas al 95% entre el racimo 3 y el racimo 7 en las 53 RILs analizadas para ambos racimos. LogPeso: Peso del fruto logtransformado. Forma: D.Ec/D.Po. LogP_Peric: Peso del pericarpo log-transformado. Simétricos: Grado de simetría entre los lóculos. L, C, a: Parámetros de color (anexo 1.5.).
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 59 diversidad de caracteres analizados, pero la mayoría han sido de moderados a altos. Estos datos evidencian el componente genético de la mayoría de los caracteres analizados (algunos de ellos son caracteres empleados en caracterización primaria de germoplasma) y confirman la aptitud del diseño experimental para estos cálculos, en los que se emplearon de 3 a 5 plantas por RIL para su estimación. Carácter VG V E H h2 Color del hipocótilo 0.130 0.000 1.00 1.00 Tipo de crecimiento 0.031 0.002 0.94 0.89 Longitud de la planta 0.081 0.034 0.70 0.54 Diámetro del tallo 3.502 1.434 0.71 0.55 Pubescencia de tallos y hojas 0.522 0.059 0.90 0.82 Distancia entre racimos* 0.011 0.012 0.49 0.32 Número de hojas entre racimos* 0.008 0.012 0.39 0.24 Distancia entre hojas* 0.023 0.026 0.48 0.31 Número de hojas hasta primer racimo 2.243 1.375 0.62 0.45 Densidad del follaje 0.341 0.036 0.91 0.83 Inclinación de la hoja 0.782 0.010 0.99 0.98 Grado de división de la hoja 0.169 0.000 1.00 1.00 Borde del foliolo 0.549 0.002 1.00 0.99 Giro del primer foliolo 0.407 0.000 1.00 1.00 Giro del último foliolo 0.361 0.008 0.98 0.96 Giro del follaje 0.067 0.039 0.63 0.46 Inserción del foliolo 0.026 0.030 0.47 0.31 Rizado del foliolo 0.056 0.002 0.97 0.93 Hoja convoluta 0.085 0.000 1.00 1.00 Tipo de inflorescencia 0.058 0.129 0.31 0.18 Número de flores en racimo 2* 0.020 0.027 0.43 0.27 Número de flores en racimo 6* 0.061 0.056 0.52 0.35 Presencia de tallo tras el racimo 0.102 0.104 0.50 0.33 Color de la corola 0.428 0.000 1.00 1.00 Fusión de la corola 0.176 0.008 0.96 0.92 Ángulo de apertura-exposición de la flor 0.531 0.008 0.99 0.97 Tamaño relativo de la flor 0.300 0.008 0.97 0.95 Posición del estilo 0.488 0.036 0.93 0.87 Rayas verdes en el fruto 0.249 0.025 0.91 0.83 Intensidad de hombros verdes 0.623 0.033 0.95 0.90 Pubescencia del fruto verde 0.217 0.028 0.89 0.80 Peso* 0.060 0.007 0.90 0.81 Peso pericarpo* 0.070 0.008 0.90 0.82 Tabla 1.2. Estimación de la heredabilidad en sentido amplio (H) y debida a efectos aditivos (h2). Se muestran además los valores p ara la varianza g enotí p ica ( V G ) y la varianza debida al error ( V E ) .
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 60 Carácter VG V E H h2 % Peso Pericarpo** 0.004 0.001 0.74 0.58 Diámetro ecuatorial 31.340 4.027 0.89 0.80 Diámetro polar 24.187 3.016 0.89 0.80 Forma 0.006 0.002 0.74 0.59 L. zona 1 (Hombro) 13.061 8.481 0.61 0.44 C. zona 1 (Hombro) 19.935 12.467 0.62 0.44 H. zona 1 (Hombro) 97.443 61.724 0.61 0.44 L. zona 2 (Ecuat-Hombro) 1.554 2.020 0.43 0.28 C. zona 2 (Ecuat-Hombro) 6.118 6.191 0.50 0.33 H. zona 2 (Ecuat-Hombro) 17.556 14.251 0.55 0.38 L. zona 3 (Ecuat-Apical) 1.681 1.474 0.53 0.36 C. zona 3 (Ecuat-Apical) 7.096 6.084 0.54 0.37 H. zona 3 (Ecuat-Apical) 27.215 10.733 0.72 0.56 L. zona 4 (Apical) 1.603 1.419 0.53 0.36 C. zona 4 (Apical) 7.387 6.301 0.54 0.37 H. zona 4 (Apical) 28.029 10.544 0.73 0.57 Índice de mancha solar observada 0.714 0.418 0.63 0.46 YSD index 3.093 1.698 0.65 0.48 Brillo 0.404 0.397 0.50 0.34 Forma del hombro 0.156 0.131 0.54 0.37 Forma de la sección polar 0.002 0.002 0.45 0.29 Marcado de hombros 0.223 0.259 0.46 0.30 Forma de la zona apical 0.013 0.010 0.56 0.39 Agrietado 0.552 0.778 0.41 0.26 Russeting 0.114 0.103 0.52 0.35 Densidad pilosidad 0.834 0.410 0.67 0.50 Longitud pilosidad 0.295 0.218 0.58 0.40 Grosor del pericarpo en sección ecuatorial 0.800 0.128 0.86 0.76 Color interno del pericarpo 0.176 0.293 0.37 0.23 Color interno variado 0.268 0.367 0.42 0.27 Forma de la sección ecuatorial 0.003 0.010 0.22 0.13 Nº Lóculos 0.053 0.073 0.42 0.27 Simetría en lóculos 0.016 0.047 0.25 0.14 Sólidos Solubles 1.292 0.632 0.67 0.51 Acidez Titulable* 0.011 0.004 0.74 0.59 Licopeno* 0.031 0.017 0.64 0.47 β-caroteno* 0.022 0.013 0.63 0.46 % Licopeno** 0.001 0.000 0.76 0.61 Glucosa* 0.028 0.017 0.62 0.45 Fructosa* 0.014 0.008 0.65 0.49 Ratio Fructosa/Glucosa 0.157 0.210 0.43 0.27 *Heredabilidad calculada con los datos transformados en logaritmo en base 10.
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 61 ** Heredabilidad calculada con los datos transformados en arcoseno de la raíz del % dividido entre 100. 1.3.4. Relación entre los caracteres analizados en la población RIL Debido al alto número de caracteres estudiados se han seleccionado para su inclusión en este apartado de resultados con el fin de detectar pleiotropía entre caracteres, únicamente las parejas de caracteres que presentan un valor alto para la correlación fenotípica (rP mayor de 0,6-0,7) y además presentan una alta correlación genética, organizados según el tipo de caracteres. Los valores de coeficientes de correlación de Rho de Spearman (rP), correlaciones genéticas (rG) y correlaciones ambientales (rE) obtenidos para los caracteres evaluados en la población RIL se presentan en la Tabla 1.3. 1.3.4.1. Correlación entre caracteres vegetativos. Hay 3 caracteres que correlacionan entre ellos: La distancia entre los racimos 1 y 2, el número de hojas entre los racimos 1 y 2, y la distancia entre las hojas más alejadas de dicho espacio entre los racimos 1 y 2. 1.3.4.2. Correlación entre caracteres de tamaño y aspecto del fruto. El peso del fruto correlaciona con el diámetro ecuatorial y el diámetro polar del fruto, con valores altos tanto de rP como de rG. Lo mismo ocurre entre el peso del pericarpo del fruto y los diámetros del fruto, ya que el peso del fruto y el peso del pericarpo están muy correlacionados, también genéticamente. Existen otros caracteres en los que un valor alto de rP no se acompaña de un valor de rG de similar magnitud, como ocurre entre los diámetros ecuatorial y polar del fruto, entre el peso del pericarpo y el grosor del pericarpo, y en menor medida entre el peso del fruto y el grosor del pericarpo (no mostrado en la Tabla 1.3). La densidad de la pilosidad del fruto correlaciona positivamente con la longitud de la misma, con valores altos de rP como de rG.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 62 1.3.4.3. Correlación entre caracteres de color del fruto verde observados. La presencia de rayas en el fruto verde correlaciona con la presencia de hombro verde oscuro, y aunque son valores moderados, hay que resaltar que el valor de la correlación genética es mayor que el valor de la correlación fenotípica, y la correlación ambiental tiene un valor negativo. 1.3.4.4. Correlación entre caracteres de color del fruto rojo medidos con colorímetro (CIELab). Los datos de rP y rG entre las variables L, C, H y a, que se obtienen de la medida de color del fruto rojo con el colorímetro, muestran correlaciones diversas entre ellas. Si se analiza dentro de cada parámetro, las diferentes zonas, los valores de L entre las 4 zonas del fruto correlacionan entre ellos; y los valores de C en las 4 zonas presentan un comportamiento similar. En cambio los valores de H sólo presentan correlación entre las zonas 3 y 4, zona donde no aparece mancha solar. Al analizar los resultados por zona es en la zona 1, la zona del hombro, la única donde correlacionan los 3 parámetros L, C y H, mostrando la zona 2 un comportamiento similar pero en menor grado. Por último se observa correlación entre los valores C de saturación y a en el eje del rojo. 1.3.4.5. Correlación entre caracteres relacionados con la mancha solar. El YSD index presenta una alta correlación con la diferencia de H (diffH) y el valor de H en la zona 1. Además como hemos visto antes en la zona 1 las variables L, C y H estaban correlacionadas en mayor o menor medida, por eso correlacionan también con el YSD index. Por otro lado la valoración a visu de la mancha solar en los frutos (índice de mancha solar observada) correlaciona con el índice de mancha solar calculado (YSD index), así como con las variables L y H de la zona 1 y la diferencia de H. 1.3.4.6. Correlación entre caracteres del contenido en azúcares reductores en fruto rojo. El contenido en glucosa correlaciona con el contenido en fructosa del fruto pero el valor de la correlación genética es menor. El
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 63 contenido en glucosa correlaciona con el ratio Fructosa/Glucosa porque va implícita en la fórmula, pero la fructosa no correlaciona. 1.3.4.7. Correlación entre caracteres del contenido en carotenoides en fruto rojo. El contenido en licopeno correlaciona con el contenido en β-caroteno del fruto, y también con el porcentaje de licopeno en el fruto, respecto al total de licopeno y β-caroteno, pero no con valores altos. Vx V y r P r G r E Distancia entre racimos* Número de hojas entre racimos* 0.771 0.662 0.818 Distancia entre racimos* Distancia entre hojas* 0.905 0.778 0.964 Número de hojas entre racimos* Distancia entre hojas* 0.794 0.767 0.807 Peso* Peso pericarpo* 0.958 0.972 0.894 Peso* Diámetro ecuatorial 0.979 0.929 1.184 Peso* Diámetro polar 0.951 0.839 1.417 Peso pericarpo* Diámetro ecuatorial 0.934 0.896 1.098 Peso pericarpo* Diámetro polar 0.927 0.842 1.299 Peso pericarpo* Grosor del pericarpo 0.847 0.645 1.635 Diámetro ecuatorial Diámetro polar 0.926 0.720 1.740 Densidad pilosidad Longitud pilosidad 0.917 0.819 1.006 Rayas verdes en el fruto Hombro fruto verde 0.535 0.641 -0.163 L. zona 1 (Hombro) C. zona 1 (Hombro) 0.836 0.779 0.881 L. zona 1 (Hombro) H. zona 1 (Hombro) 0.907 0.893 0.918 C. zona 1 (Hombro) H. zona 1 (Hombro) 0.622 0.570 0.663 C. zona 1 (Hombro) C. zona 2 (Ecuat-Hombro) 0.629 0.600 0.654 L. zona 2 (Ecuat-Hombro) H. zona 2 (Ecuat-Hombro) 0.567 0.610 0.551 L. zona 2 (Ecuat-Hombro) L. zona 3 (Ecuat-Apical) 0.870 0.644 0.981 C. zona 2 (Ecuat-Hombro) C. zona 3 (Ecuat-Apical) 0.892 0.775 0.956 C. zona 2 (Ecuat-Hombro) C. zona 4 (Apical) 0.779 0.720 0.812 Tabla 1.3. Coeficientes de correlación de Rho de Spearman (rP), correlaciones genéticas (rG) y correlaciones ambientales (rE) entre los distintos caracteres evaluados.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 70 para las líneas heterocigotas. µB: Media estimada de la distribución del carácter para las líneas homocigotas pim. PVE: Porcentaje de Varianza Fenotípica Explicada. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, ns no significativo. a El signo de la aditividad se refiere al efecto del alelo lyc. b Calculado con los datos transformados en logaritmo en base 10. c Calculado con los datos transformados en arcoseno de la raíz del % dividido entre 100. sol: solcap_snp_sl. 1.4. DISCUSIÓN Los caracteres cualitativos típicos son aquellos que permiten su clasificación en categorías fenotípicas bien diferenciadas, y están bajo el control genético de uno o varios genes, los cuales se ven afectados poco o nada por la variabilidad ambiental a la hora de expresarse. Sin embargo los caracteres de mayor importancia agrícola no se suelen ajustar de manera precisa a una determinada clase fenotípica, sino que forman una gama de fenotipos que se combinan imperceptiblemente entre sí, uno con otro y con una variabilidad continua. Estos caracteres que presentan un rango continuo y se pueden medir de una manera u otra son los caracteres cuantitativos. La principal diferencia que existe, además de la forma de observarlos/medirlos, entre los caracteres cualitativos y los cuantitativos se suele basar en el número de genes que contribuyen a la variabilidad fenotípica y el grado de modificación del fenotipo por medio de factores ambientales. Los caracteres cuantitativos suelen estar codificados por varios o, incluso, muchos genes contribuyendo al fenotipo con tan pequeña cantidad cada uno que sus efectos individuales no pueden ser detectados por los métodos de análisis mendeliano. Los genes de esta naturaleza se denominan loci de caracteres cuantitativos o QTLs (Quantitative Trait Loci). La variabilidad fenotípica expresada en la mayor parte de los caracteres cuantitativos tiene un componente ambiental relativamente grande en comparación con el genético. La Genética Cuantitativa trata de determinar el grado de influencia que tienen tanto los componentes ambientales como los genéticos sobre el total de la variabilidad fenotípica del carácter cuantitativo en una población. En el presente trabajo nos propusimos hacer un estudio de la genética cuantitativa de los caracteres que afectaban a la calidad externa e interna del fruto, con especial atención al color y al contenido en componentes saludables; así como
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 71 caracterizar a las plantas de la población RIL en aspectos descriptivos abarcando caracteres vegetativos y florales. Entre los caracteres analizados y medidos se encuentran algunos que por la metodología empleada en su medida no generaron datos de carácter cuantitativo sino categórico, por lo que no se pudieron incluir en el estudio de genética cuantitativa. Se encontraron seis caracteres que presentaban una distribución quasi normal cuando se representaron las frecuencias de los valores obtenidos por medio de histogramas, pero mostraron una tendencia sesgada hacia alguno de los extremos (distribuciones log-lineales en la terminología estadística), incluso cuando debido a la naturaleza de los datos, las variables fueron Log-transformadas previamente al análisis con el objetivo de normalizar los datos y homogeneizar las varianzas. En todos ellos el sesgo fue hacia el parental de menor valor pero no se encontraron valores transgresivos en la población RIL. De estos 6 caracteres, 5 son caracteres de calidad externa del fruto como el peso del fruto y del pericarpo, diámetros ecuatorial y polar y grosor del pericarpo. En el carácter longitud de la planta el híbrido MMxTO-937 mostró sobredominancia hacia el parental de mayor valor (pim), pero no así la población RIL, que como se ha dicho arriba, estaba algo sesgada hacia el otro parental (lyc). Siete de los caracteres medidos en la población RIL presentaron una distribución claramente normal cuando se representaron las frecuencias de los valores obtenidos por medio de histogramas, y en los siete la población mostraba herencia transgresiva. En el caso del porcentaje del peso del pericarpo respecto al peso total del fruto y la forma del fruto, el híbrido MMxTO-937 mostraba dominancia parcial hacia uno de los parentales, y la dirección de la herencia transgresiva de la población mostró el mismo sentido que tenía el híbrido. En el caso del diámetro del tallo el híbrido también mostraba dominancia parcial hacia uno de los parentales pero la herencia transgresiva que mostró la población RIL fue en ambos sentidos. La distancia entre hojas, la distancia entre racimos y el contenido en sólidos solubles (SSC), éste último un carácter principal en la mejora de la calidad de fruto, presentaron distribución normal pero transgresiva en ambos sentidos, sin embargo el híbrido MMxTO-937 mostró herencia intermedia. El contenido medio de SSC (medido en ºBrix) en la
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 72 población fue de 5,99 ºBrix, cuando se suele aceptar que esta carácter varía en cultivares comerciales de tomate entre 4,6 ºBrix (la mayoría para consumo fresco sin contar los de tipo cherry) y 6,3ºBrix (la mayoría para procesado, y por encima para tomates de tipo cherry) del peso fresco (Llácer et al. 2006). Sin embargo, en la bibliografía se han identificado entradas en especies relacionadas con el tomate, incluyendo S. pimpinellifolium, S. chmielewskii y S. cheesmanii, con concentraciones mucho más altas de SSC, en torno a 9-15% (Rick 1974; Hewitt & Garvey 1987). A pesar de esta variabilidad genética en el germoplasma, los mejoradores han tenido un éxito limitado en el incremento del SSC del fruto o en la combinación de alto SSC y alta producción, debido a varias razones, entre ellas la naturaleza cuantitativa muiy compleja del carácter (Stoner & Thompson 1966) y la relación negativa entre la producción y el SSC (Georgelis et al. 2004; Stevens & Rudich 1978). La herencia de tipo transgresivo implica que aparecieron RILs con valores que sobrepasaban el valor de los parentales, lo que indicaría, en principio, la presencia de alelos tanto favorables como desfavorables en cada parental y que estos caracteres evaluados están determinados por varios genes cuyos efectos individuales son equivalentes y pequeños, y cuya expresión fenotípica final para cada carácter considerado es la suma de los efectos individuales, es decir, que existe una interacción aditiva entre los genes provenientes de ambos parentales. Esto señala la complejidad de la genética de estos caracteres. En algunos caracteres fue el híbrido MMxTO-937 el que mostró sobredominancia hacia uno de los dos parentales. Entre los caracteres de calidad interna del fruto, todos excepto el contenido en sólidos solubles, licopeno, β-caroteno, glucosa, fructosa y acidez mostraron un comportamiento sesgado hacia el parental de menor valor (lyc); únicamente el contenido en sólidos solubles mostró distribución normal, incluso sin necesidad de transformar sus valores. En todos ellos la población RIL mostró una herencia transgresiva, siendo en los casos de caracteres sesgados, hacia el mismo sentido que presentaba el histograma de la población RIL, y en el caso del contenido en sólidos solubles, en ambos sentidos. La mejora de la calidad del fruto tiene como uno de sus objetivos conseguir líneas con alto contenido en compuestos saludables como los
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 73 carotenoides, o bien con contenidos compensados de azúcares y acidez para obtener sabores agradables para el consumidor. A este respecto, Malundo y col. (1995) encontraron que los niveles de ácidos del fruto de tomate se podían incrementar hasta un nivel optimo, por encima del cual la aceptación del consumidor decrece; mientras Baldwin y col. (1998) mostraron que la aceptación general estaba relacionada con el ratio azúcares/acidez titulable y la concentración de diferentes compuestos aromáticos (Sinesio et al. 2010). Los resultados obtenidos muestran la dificultad de obtener líneas con mayor contenido en carotenoides, azúcares y acidez que el parental TO-937. Ello no es nuevo, ya que se conoce que, al menos en parte, existe una limitación fisiológica a la obtención de frutos de muy alto contenido en metabolitos que confieren calidad interna en frutos grandes de tomate a partir de las introgresiones de especies silvestres de fruto pequeño (Schauer et al. 2006; 2008). Sin embargo el objetivo de este estudio no es obtener líneas que igualen o superen los del parental silvestre, sino más bien proporcionar información sobre el comportamiento de los caracteres para ayudar a conseguir líneas con valores algo más elevados en el contenido de estos compuestos relacionados con la calidad del fruto que los de las variedes comerciales actuales y que además presenten otros caracteres agronómicos interesantes que no tiene el parental TO-937, como un mayor tamaño del fruto En los caracteres de contenido en glucosa y fructosa del fruto, a pesar de que el híbrido mostraba sobredominancia hacia el parental de mayor valor (pim), la población RIL presentaba una herencia sesgada y transgresiva hacia el parental de menor valor (lyc). En cambio, algunos caracteres vegetativos como el número de hojas hasta el racimo 1 y entre los racimos 1 y 2, y el número de flores en el racimo 2, mostraron a la población RIL con una herencia sesgada y transgresiva hacia el parental de mayor valor, y además el híbrido mostraba sobredominancia también hacia el parental de mayor valor, es decir, la herencia del híbrido y de la población RIL tenían la misma tendencia, al contrario de lo que ocurría con el contenido en glucosa y fructosa. Los caracteres relacionados con el color del fruto, los parámetros L* y H*, presentaron una herencia sesgada hacia el parental de menor valor (pim), lo que indica un color más rojo y más oscuro. Esta tendencia es deseable en la mejora de la calidad
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 74 de fruto, ya que el consumidor tiende a elegir los frutos más rojos porque los asocia con un producto más saludable y atractivo. Sin embargo la población RIL respecto al contenido en licopeno está sesgada hacia el parental con menor contenido (lyc). Este contrasentido en los resultados demuestra que el color rojo del fruto de tomate no siempre es indicativo de su contenido en licopeno, por varias razones. La primera es que el color interior del fruto no siempre es uniformemente rojo, debido a fisiopatías conocidas como el Internal White Tissue (Sadik & Minges 1966), en las que el mesocarpo del fruto maduro queda amarillo-blanquecino, oculto bajo el exocarpo rojo, o bien el tejido alrededor de los haces vasculares del fruto aparecen blanquecinos. La segunda es el color de la cutícula del fruto, carácter medido en esta población RIL aunque no estudiado dentro de este trabajo, que presentó un rango desde incoloro a amarillo-anaranjado y que obviamente afecta al dato de color que se toma con el colorímetro a través de la cutícula al ser esta translúcida. También habría que tener en cuenta, además, las variaciones entre el contenido relativo de licopeno y β-caroteno (que da un color más anaranjado) y que la concentración de metabolitos en realidad no es independiente del tamaño del fruto debido al efecto de concentración/dilución de los mismos según sea el tamaño. El carácter de mancha solar en la población RIL, medido con el YSD index, mostró un comportamiento sesgado hacia el parental de menor valor (pim), pero en muchas de las líneas se observó un comportamiento transgresivo muy notable, apareciendo varias RILs con frutos afectados por mancha solar en más de un tercio del fruto. En total casi 1/3 de las RILs presentaron mancha solar en mayor o menor extensión, y en mayor o menor proporción del número de frutos. Según De Vicente y Tanksley (1993) la herencia transgresiva se puede deber a dos motivos: heterosis, el cual es poco probable en este caso dado el alto nivel de homocigosidad que presenta la población RIL en generación F7:8; o más bien se debe a la presencia en ambos parentales de alelos que incrementan o disminuyen el valor del carácter, y que recombinan durante los ciclos de autofecundación y selección, de manera que el parental que presenta el valor más bajo para un carácter puede portar alelos que provoquen el aumento del carácter, pero tales alelos sólo se expresarán en un fondo genético concreto y adecuado, cuando se recombina con los alelos del otro parental.
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 75 Esto no hace más que corroborar la complejidad del carácter de mancha solar, que demuestra estar gobernado por varios genes, además de verse afectado por factores ambientales, por tanto se le dedicará gran atención en el resto de la Memoria. Algunos de los caracteres evaluados, fundamentalmente relativos al tamaño y forma del fruto, así como a su color e incidencia del YSD, presentaron diferencias significativas entre las dos cosechas realizadas (ejemplificadas en los racimos 3 y 7). Los datos de las variables ambientales tomados en el interior del invernadero mediante un sistema de monitorización de temperatura, humedad y radiación PAR, mostraron que en los días en los que se realizó la segunda cosecha, la temperatura media fue casi 3ºC superior, siendo la máxima de unos 7ºC superior, y la humedad relativa media fue un 25% menor, todo respecto a los datos del día de la primera cosecha. Las diferencias significativas encontradas en los parámetros de calidad externa como peso, diámetros y mancha solar, entre otros, en las diferentes épocas de cosecha se pueden atribuir a estas amplias diferencia en condiciones ambientales, con una mayor demanda hídrica por parte de la planta en el estadio fenológico de maduración de los racimos superiores que repercuten en el fruto en desarrollo; así, plantas en situación de estrés hídrico ambiental (que se produce en los invernaderos independientemente de que estén bien regados debido a la alta temperatura y baja humedad relativa del aire) es conocido que provoca la reducción del tamaño del fruto y el aumento de los síntomas de mancha solar. También debe contribuir a esto el estadio fenológico en sí, puesto que el desarrollo de los primeros racimos de las plantas de tomates de hábito de crecimiento indeterminado tiene a su disposición toda la maquinaria fotosintética en forma de hojas jóvenes, mientras que en los racimos superiores hay competencia por los fotoasimilados con los últimos frutos en desarrollo de los racimos inferiores en un momento en que, además, las hojas basales van entrando en senescencia. Uno de los factores más importantes para la Mejora Vegetal es el conocimiento de la contribución relativa de los genes a la variabilidad del carácter que se está considerando. La variación entre individuos de una población se puede deber a factores genéticos y/o ambientales. La heredabilidad de un carácter es la proporción
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 76 de la variación fenotípica en una población atribuible a la variación genotípica entre individuos, y los análisis de heredabilidad permiten estimar las contribuciones relativas de las diferencias en factores genéticos y no-genéticos a la varianza fenotípica total en una población. La heredabilidad no es una propiedad del carácter únicamente, sino que también lo es de la población y de las circunstancias ambientales a las que están sujetos los individuos. De hecho, para lo que es más útil la estima de la heredabilidad es para comparar entre variables en cuanto a la magnitud de sus componentes genéticos y sus, por tanto, posibilidades de respuesta a la selección en la mejora genética. En nuestro estudio los caracteres evaluados en la población RIL mostraron valores de heredabilidad en sentido estricto muy variables según el tipo de carácter. Los caracteres relacionados con el tamaño del fruto rojo maduro, el exterior del fruto verde, la flor, la hoja y los foliolos, así como el tipo de crecimiento mostraron valores altos de h2. Los caracteres que evaluaban el color, la mancha solar, la composición interna y otros caracteres de la planta como la longitud, el diámetro del tallo o la arquitectura mostraron una heredabilidad en sentido estricto moderada. El color interno del fruto rojo maduro, la distribución de los racimos y algunos de los caracteres que evaluaban el aspecto externo del fruto mostraron valores bajos de h2. Está ampliamente aceptado que el poder de resolución y la precisión del cartografiado genético se ve afectado significativamente por la magnitud de la heredabilidad del carácter (Flint et al. 2005). Según Moreau y col. (1998) la detección de QTLs es más fácil en caracteres donde el número de loci implicados es bajo y la heredabilidad es alta. Más adelante se valorará si esta afirmación se cumple en nuestra población, ya que según los datos obtenidos por Illa-Berenguer y col. (2015), la heredabilidad en sentido amplio (H) no fue un parámetro fiable para predecir QTLs putativos, aunque reconoce que la precisión en los cálculos de los valores de heredabilidad se podría haber mejorado con más réplicas de los parentales y la F1. Saber en qué medida dos caracteres están correlacionados es importante por tres razones. Primero, en relación con las causas genéticas de la correlación a través de la acción pleiotrópica de los genes. Segundo, en relación con los cambios inducidos por la selección. En tercer lugar, en relación con la selección natural. Es necesario distinguir
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 77 las causas de correlación entre caracteres, entre la genética y la ambiental. Se calcularon tres tipos de correlaciones entre todos los caracteres evaluados: la fenotípica, la genética y la ambiental. La magnitud de la correlación genética, que es inducida por la pleiotropía (o por, no se debe descartar, el ligamiento genético) expresa en qué medida los dos caracteres están influidos por los mismos genes, sin embargo el ambiente es una causa de correlación en tanto que los dos caracteres sujetos a la correlación estén influenciados por las mismas diferencias en las condiciones ambientales (Falconer & Mackay 2001). Debido al alto número de caracteres evaluados en este trabajo no podemos ser exhaustivos, y se seleccionaron para su presentación unas pocas de ellas. En primer lugar, se tuvo en cuenta las que presentaban valores de correlación fenotípica significativos al 99% (calculada según el método Rho de Spearman) que presentaran un valor absoluto mayor de 0,5, y entre ellas, se prestó atención a aquellas correlaciones que además mostraban valores absolutos de correlación genética mayores de 0,6 (positivo o negativo). Las correlaciones observadas entre caracteres vegetativos presentaron valores altos pero se han de considerar triviales, ya que son claramente debidas a efectos pleiotrópicos entre caracteres muy relacionados en el crecimiento vegetativo y la estructura de la planta. Se detectó un QTL en el cromosoma 2 asociado la longitud de la planta (Ht2) que explicaba el 9.9% de la varianza fenotípica, siendo los alelos de S. pimpinellifolium los responsables del incremento en la longitud de la planta. De Vicente y Tanskley (1993) detectaron hasta 9 QTLs asociados a este carácter en una población F2 derivada de un cruce con S. pennellii, pero ninguno en el cromosoma 2. Posteriores estudios de Grandillo y Tanksley (1996) y Paran y colaboradores (1997) sí que detectaron este QTL situado en el cromosoma 2, en poblaciones BC1 y RIL derivadas de cruces con especies silvestres más emparentadas con la cultivada, concretamente S. pimpinellifolium y S. cheesmaniae respectivamente. En el primer estudio, el QTL pvh2.1 está asociado al marcador TG492 que se encuentra en el mapa físico de la secuencia de referencia del tomate en 51.2 MB del cromosoma 2 (versión SL5.0 del genoma de tomate accesible en http://solgenomics.net), la misma región genómica que el marcador asociado al QTL Ht2 detectado en este trabajo, sin embargo la dirección del efecto del QTL es contraria ya que en el estudio el alelo S.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 78 pimpinellifolium provocó una disminución del carácter, aunque hay que reseñar que la entrada silvestre parental de la población empleada era distinta a TO-937 y que es bien conocido que S. pimpinellifolium posee una enorme variabilidad intraespecífica. En el último estudio (Paran et al. 1997) se han detectado 2 QTLs dentro del cromosoma 2, de los cuales el QTL situado al final del cromosoma (marcador asociado TG188, 54 MB) también coincide en la región genómica con el Ht2. Se detectaron dos QTLs asociados al diámetro del tallo (SW4 y SW11) que entre ambos explicaban el 32% de la varianza fenotípica, siendo los alelos de S. lycopersicum los que provocan el incremento del diámetro. De Vicente y Tanskley (1993) detectaron hasta 7 QTLs para este carácter en la población F2 derivada de un cruce con S. pennellii, pero ninguno situado en los cromosomas 4 y 11. El QTL SW11 se sitúa en 54.2 MB en el mapa físico, en esa zona se encuentran dos genes relacionados con la división celular. El gen más cercano al QTL codifica una serin/treonin proteinkinasa. Las protein-kinasa juegan un papel en multitud de procesos celulares, incluyendo la división, proliferación, apoptosis y diferenciación. El otro gen, situado a 110 kB cadena abajo del primero, codifica una proteasa también involucrada en división celular, con un dominio ATPasa tipo AAA. Las proteasas AAA son metalopeptidasas ATP-dependientes, también conocidas como FtsH en referencia a la enzima de Escherichia coli (Filamentous temperature sensitive H). Se han encontrado hasta 12 ortólogos en el genoma de las plantas. Este tipo de ATPasas forman una gran familia de proteínas y juegan varios papeles en la célula, incluyendo la regulación de los ciclos celulares, la proteolisis y disgregación de proteínas, la biogénesis de orgánulos y el transporte intracelular. Estos dos genes descritos se pueden establecer como posibles genes candidatos para explicar el mecanismo del QTL asociado al diámetro del tallo, dado que un incremento en el número de divisiones celulares, y por tanto en el número de células, en el plano axial del tallo, provocaría el incremento del diámetro del tallo. Se detectó un QTL en el cromosoma 2 para la exerción del estilo (Style2) que explicaba el 31.2% de la varianza fenotípica, siendo los alelos de S. pimpinellifolium los responsables de la exerción del estilo. Este QTL ya es bien conocido, pues fue
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 79 detectado en una población BC1 derivada de un cruce con Lycopersicon hirsutum (actualmente S. habrochaites) (Bernacchi & Tanksley 1997) y posteriormente detectado (Chen & Tanksley 2004) y clonado en una población de líneas de introgresión de S. pennellii, descubriéndose que era un gen que codificaba un posible factor de transcripción que regulaba la elongación celular en los estilos en desarrollo. De esta manera la transición de la polinización cruzada a la autopolinización fue acompañada, no de un cambio en la proteína sino en la regulación a la baja de la expresión del gen durante el desarrollo de la flor (Chen et al. 2007). Se detectaron 3 QTLs asociados al número de flores por inflorescencia en los cromosomas 2 (Nflt2), 6 (Nflt6) y 10 (Nflt10), que explicaban entre el 9.2 y el 18.5% del total de la varianza fenotípica. Nflt2 se encuentra en la parte final del cromosoma 2, en 54 MB en el mapa físico, y el incremento en el número de flores por inflorescencia es atribuido a los alelos de S. pimpinellifolium. Coincide en la misma región genómica con el QTL nfl2.1 asociado al marcador TG537 (51 MB) detectado por van der Knaap (2003), en una población F2 proveniente de un cruce con S. pimpinellifolium. En los QTLs Nflt6 y Nflt10 son los alelos de S. lycopersicum los que provocaron el incremento en el número de flores por inflorescencia, efecto contrario al esperado según el fenotipo de los parentales. Se ha descrito previamente por Grandillo (1996) un QTL para el número de frutos por racimo en el cromosoma 6 cercano al marcador morfológico sp, en una población BC1 también proveniente de un cruce con S. pimpinellifolium. Este QTL y el Nflt6 detectado en este trabajo se sitúan en la misma región cromosómica, en 42.5 MB, por lo que podrían ser el mismo QTL. De cualquier forma, sería un QTL bastante coherente puesto que el gen SP (self-pruning) es miembro, como Terminal flower y Single flower truss, de la familia de genes CET (McGarry & Ayre 2012) relacionados con el equilibrio Florigen/Antioflorigen y, por tanto, con la inducción/terminación del desarrollo de flores en los meristemos. Respecto al cromosoma 10, Doganlar (2002) detectó en una población BC2F6 proveniente de S. pimpinellifolium el QTL para el número de frutos por racimo nof10.1, en 2-3 MB en el mapa físico, asociado al marcador morfológico u, de maduración uniforme. El QTL Nflt10 detectado en este trabajo está situado en 61-63 MB, por lo
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 86 longitudinales en el fruto verde, lo que indicaría pleiotropía del gen subyacente. Se detectó un QTL mayor (GSh10) en el brazo corto del cromosoma 10, asociado a los parámetros L, a y H de la zona peduncular (hombro), así como a la presencia de rayas verdes y hombro más oscuro en la zona peduncular. Este QTL mayor explicó entre un 33% y un 65% de la varianza fenotípica y por su localización en 2.3 MB en el mapa físico se corresponde, como era de esperar, con el gen GLK2 (Powell et al. 2012; estudio en el que, entre otras, se utilizó nuestra misma población RIL en su localización), ya conocido por ser el gen que codifica un factor de transcripción responsable del fenotipo del marcador morfológico u (uniform ripening), responsable de generar hombro verde oscuro en los frutos verdes en las especies silvestres, y que en esta población lo aporta el parental S. pimpinellifolium. El valor de la correlación ambiental es muy bajo, lo que indica que este carácter estaría muy poco influenciado por el ambiente. En los siguientes capítulos de esta Memoria se profundizará en el comportamiento de este carácter respecto a los factores ambientales y su relación con la fisiopatía de la mancha solar. La correlación observada entre los caracteres relacionados con la mancha solar se debe a que el índice de mancha solar (YSD index) se calcula mediante una fórmula que emplea el valor de la diferencia de H (DiffH) entre la zona del hombro (1) y la zona apical (4) del fruto. Además de esta diferencia de H, también emplea los valores de H y L de la zona apical (4). Es por esta razón que existe una alta correlación entre este índice, la diferencia de H y el valor de H en la zona 1. Por otro lado, el índice de mancha solar observada correlaciona con el YSD index, (así como con las variables L y H de la zona 1 y la diferencia de H, por las razones arriba descritas). Esto puede indicar la calidad del índice de mancha solar, sin embargo sólo en estas correlaciones donde está este carácter implicado, el valor de la correlación genética es sensiblemente menor que el de la ambiental, hecho que señala que el ambiente es el mayor factor de variación fenotípica cuando se emplea la valoración de la mancha solar a visu. Al analizar los parámetros de color del fruto rojo maduro, en la zona del hombro, se detectó el mismo QTL GSh10 en los parámetros L (Li10), C (Sat10.1) y H (Co10) de la zona peduncular, la diferencia de H entre las zonas peduncular y apical y el índice de mancha solar (YSD10). Este QTL común asociado a la mancha solar no llegó a ser
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 87 significativo en estos caracteres de color. El motivo es que, a pesar de haber casi la mitad de las RILs afectadas por la mancha solar, en muchas de ellas las plantas no mostraban el carácter en todos los frutos, y algunas lo mostraban con poca severidad. Es posible que al tomar los frutos para los ensayos de calidad, siguiendo el apartado 1.2.2, no se tomara el número suficiente de frutos y no reflejara bien el valor real del carácter mancha solar para la línea por una cuestión de muestreo insuficiente para un carácter tan variable en su expresión. Es por ello quizás que la detección del QTL no llegue al valor umbral para ser significativa. Por todo ello, nos planteamos realizar un nuevo fenotipado de la población RIL y estudio de localización de QTLs específico para la fisiopatía de la mancha solar, que se detalla en el capítulo 3 de esta memoria. Los coeficientes de correlación entre los parámetros de color L, C, H y a para el fruto rojo maduro muestran que los valores de C entre las 4 zonas del fruto correlacionan entre ellos. Se observa que entre las zonas 1 (Peduncular) y 2 (Subpeduncular) las correlaciones no son tan altas (en torno a 0,6) debido a la mancha solar de algunos frutos. Así mismo, la zona 1 correlaciona con la 3 y 4 significativamente pero con valores menores no mostrados en la Tabla 1.3. Los valores de L entre las 4 zonas del fruto presentan un comportamiento parecido al de la variable C, ya que correlacionan bien las zonas 2, 3 y 4, entre ellas pero no la zona 1 con las otras zonas debido también a la mancha solar de algunos frutos. Los valores de H entre las 4 zonas del fruto presentan un comportamiento diferente al de las variables L y C. Sólo correlacionan las zonas 3 y 4 entre ellas porque H es una variable con mayor rango de variabilidad en los frutos, representando el color tal y como lo conocemos, desde 27° (rojo) a 95°-100° (amarillo) de manera aproximada. Dado que el color rojo es más uniforme en las zonas 3 y 4 la correlación es mayor. Al contrario, en las zonas 1 y 2, donde se puede desarrollar la mancha solar, los valores de rP y rG son sensiblemente menores. En la zona del hombro (zona 1) correlacionan L con C y L con H (entre C y H también hay correlación pero de menor valor). Sin embargo esto no ocurre en el resto de zonas. Puesto que la diferencia entre la zona del hombro y el resto del fruto es la presencia de la mancha solar en frutos de algunas RILs cabe pensar que la presencia de mancha provoca que se incremente el valor de H de rojo (27°) hacia amarillo (95°-100°), a la vez que el valor L de luminosidad y el valor de C de
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 88 saturación del color aumentan. En la zona entre el hombro y el ecuador del fruto (zona 2) correlaciona L con H. Esto es un reflejo de lo que se ha explicado para la zona 1 respecto al efecto de la mancha solar, ya que en algunos frutos la mancha es tan grande que puede llegar hasta el eje ecuatorial del fruto, si bien como se ve en la Tabla 1.3 los valores son menores que para la zona 1. Entre los valores C de saturación y a en el eje del rojo existe correlación. Esto se observa en las zonas 2, 3 y 4, y los valores son mayores conforme se van acercando a la zona apical del fruto (desde zona 2 a zona 4). No existe correlación en la zona 1 que es donde se desarrolla la mancha solar del fruto cuando aparece. Se detectaron 3 QTLs asociados al contenido de sólidos solubles del fruto (SSC), en los cromosomas 2 y 3 (SSC2, SSC3.1 y SSC3.2) que entre todos explicaban el 35.3% de la varianza fenotípica. El contenido en sólidos solubles es de los primeros caracteres estudiados por los mejoradores por su importancia tanto en el mercado de tomate fresco como en el de procesado, ya que afecta a la calidad organoléptica y al rendimiento del producto final (pasta deshidratada), respectivamente. Se han detectado varios QTLs asociados al SSC en varias poblaciones provenientes de cruzamientos con S. chmielewskii (Paterson et al. 1988), S. cheesmaniae (Goldman et al. 1995), S. peruvianum (antiguo L. peruvianum) (Fulton et al. 1997), S. pimpinellifolium (Tanksley et al. 1996; Grandillo & Tanksley 1996; Chen et al. 1999; Capel et al. 2015) y con S. lycopersicum var. cerasiforme (Saliba-Colombani et al. 2001; Lecomte et al. 2004). También se ha aprovechado el conocimiento de estos QTLs para realizar estudios de introgresión de las zonas genómicas que portaban QTLs conocidos para SSC de especies silvestres en el genoma de tomate cultivado, con el fin de estudiar sus efectos (Eshed & Zamir 1995; Fridman et al. 2000; Yousef & Juvik 2001; Yates et al. 2004; Fridman et al. 2004; Baxter et al. 2005). Varios QTLs detectados en los estudios señalados se encuentran en la misma región genómica que los QTLs detectados en esta Memoria, en concreto el QTL detectado en el cromosoma 2 (SSC2) se localiza en 43.6 MB, y en varios estudios se han detectado QTLs asociados a SSC en la misma región genómica (Goldman et al. 1995; Tanksley et al. 1996; Fulton et al. 1997; Chen et al. 1999; Saliba-Colombani et al. 2001; Lecomte et al. 2004; Capel et al. 2015; este último estudio, realizado con la misma población RIL que esta memoria).
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 89 Respecto a los dos QTLs del cromosoma 3, se sitúan en 54.7 MB (SSC3.1) y 68.4 MB (SSC3.2). Se ha encontrado en la bibliografía que en la zona genómica de SSC3.1 han sido detectados QTLs para SSC en el estudio de Goldman y col. (1995). En cambio, varios trabajos han detectado QTLs para SSC en la zona genómica de SSC3.2 (Paterson et al. 1988; Goldman et al. 1995; Tanksley et al. 1996; Chen et al. 1999; Capel et al. 2015), y además en todos coincide que son los alelos de S. lycopersicum los responsables del incremento del carácter. El contenido en glucosa correlaciona con el contenido en fructosa porque son los azúcares predominantes en el fruto, sin embargo están implicados en múltiples rutas diferentes de síntesis y degradación, por lo que el valor de la correlación genética es menor que el de la correlación fenotípica. El coeficiente de correlación ambiental entre la glucosa y la fructosa es mayor que el de la correlación genética, lo que permite afirmar que el ambiente es el mayor factor de variación fenotípica en la relación entre los contenidos de los dos azúcares reductores. En este estudio no se detectaron QTLs significativos para el contenido en glucosa y fructosa del fruto. Se detectó un QTL para la acidez del fruto en el cromosoma 6 (TA6) en 42.8 MB en el mapa físico que explicaba el 12.4% de la varianza fenotípica. En la bibliografía existen estudios que han detectado QTLs asociados a la acidez del fruto en otros cromosomas (Saliba-Colombani et al. 2001; Lecomte et al. 2004; Capel et al. 2015), pero no en el cromosoma 6, donde se localiza el QTL TA6 detectado en este trabajo. El contenido en licopeno correlaciona con el contenido en β-caroteno del fruto ya que comparten la misma ruta biosintética (Goodwin 1994; Armstrong & Hearst 1996; Hirschberg et al. 1997; Hirschberg 2001). Por otro lado la correlación del licopeno con el porcentaje de licopeno en el fruto (respecto al total de licopeno y βcaroteno), presenta valores más bajos, lo que se puede explicar por qué el rango de valores de contenido de licopeno entre las RILs es muy amplio (desde 12 a 240 µg/g) pero los porcentajes de licopeno en el fruto, respecto al total de licopeno y β-caroteno no es un carácter con un rango tan amplio, del 54 al 71%. Se detectó un QTL común para el contenido en licopeno y β-caroteno del fruto en el cromosoma 1 (Lyc1/B-c1),
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 90 que explicaban cada uno el 11.8% de la varianza fenotípica. Además se detectaron dos QTLs para el contenido en β-caroteno del fruto en los cromosomas 2 (B-c2), y 7 (B-c7), cada uno explicando algo más del 10% de la varianza fenotípica. Por último se detectaron dos QTLs para el porcentaje de licopeno respecto al β-caroteno del fruto en el cromosoma 4 (PLyc4.1 y PLyc4.2), que explicaban entre ambos más del 32% de la varianza fenotípica. En todos los QTLs presentados fueron los alelos de S. pimpinellifolium los responsables del incremento del contenido de los carotenoides medidos. Ya ha sido detectado un QTL en el cromosoma 1 en nuestra población, asociado al marcador SSR75, que se sitúa en la misma región genómica que nuestro QTL Lyc1/B-c1 localizado en 83.7 MB (Capel et al. 2015); sin embargo en dicho estudio el QTL sólo estaba asociado al contenido en β-caroteno, no al del licopeno. Existe otro estudio anterior, de Chen y col. (1999), que detecta un QTL en el cromosoma 1 para contenido en licopeno pero la región genómica no es la misma. En el cromosoma 2 Capel y col. (2015) han detectado un QTL asociado al marcador SSR66 para el contenido en β-caroteno, que se sitúa en 38.6 MB, muy cerca de la región genómica de B-c2, detectado en 35.2 Mb en nuestra población. En el estudio de Chen y col. (1999) se ha detectado también un QTL en el cromosoma 7, asociado al marcador TG113, para el contenido en licopeno en 1.7 MB. Este QTL se sitúa muy cerca de la región genómica de B-c7, detectado en 0.6 Mb en nuestra población, aunque no para el contenido en licopeno sino en β-caroteno. No se ha encontrado en la bibliografía ningún estudio de QTLs del carácter medido en nuestra población como porcentaje de licopeno respecto al β-caroteno del fruto, pero sí se han encontrado estudios que muestran QTLs para el contenido en licopeno en el cromosoma 4, donde se sitúan los dos QTLs PLyc4.1 y PLyc4.4. El QTL detectado a 53.2 MB (PLyc4.1) se encuentra en la misma región genómica que los QTLs detectados para el contenido en licopeno asociados a los marcadores TG287 (Saliba-Colombani et al. 2001) y SSR94 (Capel et al. 2015); mientras que el QTL detectado a 62.7 MB (PLyc4.2) se encuentra en la misma región genómica que el QTL detectado por Chen y col. (1999) para el contenido en licopeno asociado al marcador CT50. Este hecho se debe a que la medida del porcentaje de licopeno es una medida indirecta del contenido en licopeno. Los resultados muestran que es útil para el estudio de QTLs asociados al contenido en licopeno, ya que parece que al relacionar el contenido en licopeno con el contenido en
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 91 β-caroteno se soslaya el error experimental que está asociado al protocolo de extracción de carotenoides. Los caracteres medidos en la población que mostraron heredabilidad en sentido amplio (H) alta o moderada fueron, entre otros, los relacionados con tamaño del fruto, exterior del fruto verde, mancha solar, SSC, acidez, longitud de la planta, diámetro del tallo y flor. Ha sido en estos caracteres en los que se detectaron la mayoría de los QTLs, por lo que en nuestro estudio se corrobora efectivamente lo establecido por Moreau y col. (1998), que la detección de QTLs es más fácil en caracteres donde el número de loci implicados es bajo y la heredabilidad es alta. Existen caracteres de calidad de fruto que por su interés agronómico y comercial han sido ampliamente estudiados, como puede ser el tamaño del fruto o el contenido en sólidos solubles. Ya se han mencionado los QTLs detectados con anterioridad a este trabajo, e incluso algunos de ellos han sido clonados y se conoce el gen último responsable del carácter. Varios de los QTLs detectados en este trabajo, y que han sido presentados en la Tabla 1.4 coinciden en la misma región genómica que QTLs detectados para los mismos caracteres en diferentes trabajos anteriores, aun habiendo sido realizados en diferentes tipos de población y con diferentes parentales silvestres. Estas coincidencias en la detección de QTLs confirman que el estudio realizado en esta Memoria es coherente y fiable para la caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. Esto nos permite confiar en que los QTLs detectados que no han sido descritos antes en otros estudios, como SW11 asociado al diámetro del tallo, FS2.1 y FS2.2 asociados a la forma del fruto, PP2.1/BkS2.1 asociados al porcentaje del peso del pericarpo y marcado del hombro y TA6 asociado a la acidez del fruto, entre otros, son consistentes y se pueden emplear como punto de partida en nuevos estudios que profundicen en el conocimiento del mecanismo que subyace en esos QTLs, como el estudio de genes candidatos. De igual manera, el estudio de localización de QTLs descrito en este capítulo se puede considerar como una prueba de concepto de su validez para la detección de QTLs para el carácter principal estudiado en este trabajo de tesis, la fisiopatía de la mancha solar
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 92 cuando se emplee una caracterización de la población (detallada en el capítulo 3) que obvie la gran variabilidad entre frutos para su expresión fenotípica.
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 93 Bibliografía Alpert, K.B., Grandillo, S. & Tanksley, S.D., 1995. FW-2.2 - A MAJOR QTL CONTROLLING FRUIT WEIGHT IS COMMON TO BOTH RED-FRUITED AND GREEN-FRUITED TOMATO SPECIES. Theoretical and Applied Genetics, 91(6-7), pp.994–1000. Available at: ISI:A1995TH31900025. Anastasiou, E. et al., 2007. Control of Plant Organ Size by KLUH/CYP78A5-Dependent Intercellular Signaling. Developmental Cell, 13(6), pp.843–856. Armstrong, G.A. & Hearst, J.E., 1996. Carotenoids .2. Genetics and molecular biology of carotenoid pigment biosynthesis. Faseb Journal, 10(2), pp.228–237. Available at: ISI:A1996TY96200007. Baldwin, E. et al., 1998. Relationship between sensory and instrumental analysis for tomato flavor. Journal of the American Society for Horticultural Science, 123(5), pp.906–915. Baxter, C.J. et al., 2005. Fruit carbohydrate metabolism in an introgression line of tomato with increased fruit soluble solids. Plant & Cell Physiology, 46(3), pp.425– 437. Available at: ISI:000227974400005. Bernacchi, D. & Tanksley, S.D., 1997. An interspecific backcross of Lycopersicon esculentum x L. hirsutum: linkage analysis and a QTL study of sexual compatibility factors and floral traits. Genetics, 147(2), pp.861–877. Available at: http://www.genetics.org/cgi/content/abstract/147/2/861. Burr, B. & Burr, F., 1991. RECOMBINANT INBREDS FOR MOLECULAR MAPPING IN MAIZE - THEORETICAL AND PRACTICAL CONSIDERATIONS. Trends in Genetics, 7(2), pp.55–60. Available at: ISI:A1991ET66800008. Capel, C. et al., 2015. Wide-genome QTL mapping of fruit quality traits in a tomato RIL population derived from the wild-relative species Solanum pimpinellifolium L. Theoretical and Applied Genetics. Available at: http://link.springer.com/10.1007/s00122-015-2563-4. Causse, M. et al., 2001. Genetic analysis of organoleptic quality in fresh market tomato. 2. Mapping QTLs for sensory attributes. Theoretical and Applied Genetics,
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 94 102(2-3), pp.273–283. Available at: ISI:000167232800012. Chakrabarti, M. et al., 2013. A cytochrome P450 regulates a domestication trait in cultivated tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(42), pp.17125–17130. Available at: http://www.pnas.org/content/110/42/17125.abstract. Chen, F.Q. et al., 1999. Mapping of QTLs for lycopene and other fruit traits in a Lycopersicon esculentum x L-pimpinellifolium cross and comparison of QTLs across tomato species. Molecular Breeding, 5(3), pp.283–299. Available at: ISI:000080358000008. Chen, K.-Y. et al., 2007. Changes in regulation of a transcription factor lead to autogamy in cultivated tomatoes. Science, 318(5850), pp.643–5. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17962563 [Accessed March 13, 2012]. Chen, K.-Y. & Tanksley, S.D., 2004. High-resolution mapping and functional analysis of se2.1: a major stigma exsertion quantitative trait locus associated with the evolution from allogamy to autogamy in the genus Lycopersicon. Genetics, 168(3), pp.1563–73. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1448767&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed June 5, 2012]. Cong, B. & Tanksley, S., 2006. FW2.2 and cell cycle control in developing tomato fruit: a possible example of gene co-option in the evolution of a novel organ. Plant Molecular Biology, 62(6), pp.867–880. Available at: http://dx.doi.org/10.1007/s11103-006-9062-6. DeVicente, M.C. & Tanksley, S.D., 1993. QTL analysis of transgressive segregation in an interspecific tomato cross. Genetics, 134(2), pp.585–596. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1205500&tool=pmc entrez&rendertype=abstract. Doganlar, S. et al., 2002. Mapping quantitative trait loci in inbred backcross lines of Lycopersicon pimpinellifolium (LA1589). Genome, 45(6), pp.1189–1202. Available at: http://dx.doi.org/10.1139/g02-091.
Capítulo 1. Caracterización genética de caracteres relacionados con la calidad del fruto. 95 Eshed, Y. & Zamir, D., 1995. An introgression line population of Lycopersicon pennellii in the cultivated tomato enables the identification and fine mapping of yieldassociated QTL. Genetics, 141(3), pp.1147–1162. Available at: http://www.genetics.org/content/141/3/1147.abstract. Falconer, D.S. & Mackay, T.F.C., 2001. Introducción a la genética cuantitativa 1st ed. Editorial Acribia S.A., ed., Zaragoza. Flint, J. et al., 2005. Strategies for mapping and cloning quantitative trait genes in rodents. Nat Rev Genet, 6(4), pp.271–286. Available at: http://dx.doi.org/10.1038/nrg1576. Foolad, M.R., 2007. Genome mapping and molecular breeding of tomato. International Journal of Plant Genomics, 2007, pp.1–52. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2267253&tool=pmc entrez&rendertype=abstract [Accessed March 6, 2013]. Frary, A. et al., 2000. fw2.2: A quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science, 289(5476), pp.85–88. Available at: ISI:000088090400035. Frary, A. et al., 2014. QTL hotspots in eggplant (Solanum melongena) detected with a high resolution map and CIM analysis. Euphytica, 197(2), pp.211–228. Available at: http://dx.doi.org/10.1007/s10681-013-1060-6. Fridman, E. et al., 2004. Zooming in on a quantitative trait for tomato yield using interspecific introgressions. Science, 305(5691), pp.1786–1789. Available at: ISI:000224039500045. Fridman, E., Pleban, T. & Zamir, D., 2000. A recombination hotspot delimits a wildspecies quantitative trait locus for tomato sugar content to 484 bp within an invertase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(9), pp.4718– 4723. Available at: http://www.pnas.org/cgi/content/long/97/9/4718 [Accessed February 14, 2015]. Fulton, T.M. et al., 2000. Advanced backcross QTL analysis of a Lycopersicon esculentum ×Lycopersicon parviflorum cross. Theoretical and Applied Genetics, 100(7), pp.1025–1042. Available at: http://dx.doi.org/10.1007/s001220051384.
101 Capítulo 2 APROXIMACIÓN A LA FISIOPATÍA DE LA MANCHA SOLAR. OBTENCIÓN DE MATERIAL VEGETAL PARA EL ESTUDIO DE LA MANCHA SOLAR. 2.1. ANTECEDENTES El primer paso para estudiar la fisiopatía de la mancha solar, conocida por las siglas en inglés como YSD (Yellow Shouler Disorder), es encontrar una descripción apropiada de ella. Varios estudios, entre ellos el de Sadik y Minges (1966) han tratado de describirla según su apariencia externa como un blotchy ripening disorder, término que describe las fisiopatías que provocan una maduración del fruto sin uniformidad en el color. Dicho estudio describe la mancha solar como la presencia de Internal White Tissue (IWT) bajo la piel del fruto y localizada alrededor de la cicatriz peduncular. En ese mismo trabajo se realiza un estudio detallado del origen y el desarrollo del IWT, y también se describen otras alteraciones del color como debidas a la presencia de IWT, pero situado en diferentes localizaciones en todo el fruto, por lo que tendrían causas diferentes. Estas alteraciones son denominadas en el estudio como subsurface yellowing, blotches o anillo amarillo. Esta clasificación de la mancha solar como un blotchy ripening disorder es anterior al descubrimiento del gen u (Ayers & Tomes 1966)
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 102 cuya mutación determina un color verde claro uniforme en los frutos inmaduros, sin presencia de hombro verde oscuro alrededor de la cicatriz peduncular, como ocurre en las especies silvestres y variedades de tomates tradicionales. Un año antes Venter (1965), en sus investigaciones sobre el hombro verde, antes del conocimiento del gen u, ya describía que en los frutos que presentaban hombro verde oscuro el color de esta zona normalmente evolucionaba, pero no a rojo, sino a amarillento, y que el tejido no se ablandaba como el resto del fruto maduro. Con posterioridad, Picha (1987) concluía que en la mancha solar encontrada en frutos de variedades de maduración no uniforme, la zona amarilla que aparece en el hombro del fruto podía ser de tamaño variable, se continuaba algunos milímetros en el interior del pericarpo y se mostraba más o menos endurecida, por lo que contrastaba con el resto del fruto que presentaba una apariencia de rojo maduro normal. Por otro lado, Hartz (1999), en un estudio en variedades de tomate para procesado de maduración uniforme (no mostraban hombro verde oscuro), describía la presencia de un anillo amarillo alrededor de la zona de abcisión, y lo llamaba yellow shoulder. Este contraste entre los dos desórdenes del desarrollo normal del fruto, anillo amarillo y mancha solar, fue estudiado por Francis y col. (2000), que postulaban que podría deberse a diferencias en el genotipo y el ambiente, o simplemente ser el reflejo de diferentes grados de severidad y localización del IWT. Los estudios histológicos de la zona del fruto con YSD (Francis et al. 2000) revelan que presenta características de frutos verde maduro, por la presencia de laminilla media y por el estadío de desarrollo de los cromoplastos, pero a su vez presenta diferencias con el tejido verde, ya que el tejido de YSD tiene células más pequeñas y desorganizadas. En relación con los pigmentos, Darrigues y col. (2008) comprobaron que el tejido amarillo presentaba bajo contenido en licopeno y βcaroteno. Picha (1987) investigó sobre las diferencias en la composición entre el tejido con mancha solar y el tejido rojo maduro de la zona apical. En el tejido amarillo los niveles de ácido cítrico y la acidez titulable fueron más bajos, y el contenido en materia seca, ácido málico, el ratio entre los ácidos málico/cítrico y el pH fueron más altos. Además el equilibrio catión-anión estaba afectado en el tejido amarillo, ya que los niveles de los iones P y K aparecían más bajos que en el tejido rojo, y el nivel de calcio
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 103 fue más alto. Según Picha (1987), los bajos niveles de K en el tejido amarillo pueden deberse a la disminución de la capacidad de incorporación y acumulación de K por parte de las células del tejido, debido en parte al detrimento del contenido ácido. En cambio no asoció el YSD con desequilibrios en el contenido de iones N o Mg. Respecto a los azúcares, los niveles de sacarosa fueron más altos y el contenido en sólidos solubles (SSC) más bajo en el tejido amarillo, mientras que los azúcares reductores no mostraron cambios. Al comparar los datos de composición del tejido afectado con YSD con los estudios sobre blotchy ripening, se comprobó que las diferencias en la acidez titulable, el ácido cítrico, el SSC y el pH entre los tejidos amarillo y rojo fueron consistentes con lo establecido previamente por Davies (1966b; 1966a), entre el tejido blotchy y el tejido rojo. Sin embargo, el contenido en materia seca y el de azúcares reductores fueron menores en el tejido blotchy respecto al rojo. Como conclusión del conocimiento generado por estos estudios, se ha definido el YSD como una alteración en el desarrollo y maduración del fruto pero nunca como un retraso del desarrollo (Trudel & Ozbun 1970; Francis et al. 2000). Las causas por las que aparece la mancha solar no están claras, pudiendo ser nutricionales, ambientales y genéticas (Picha & Hall 1981; Francis et al. 2000). Numerosos estudios establecen un factor nutricional en la aparición de la mancha solar, observándose una correlación negativa entre el nivel de potasio en el suelo y el número de frutos afectados y su severidad, ya sea en invernadero o en campo (Trudel & Ozbun 1971; Picha & Hall 1981; Hartz et al. 1999; Hartz 2005). La misma correlación negativa se ha descrito para los frutos con blotchy ripening (Jones & Alexander 1962; Ozbun et al. 1967). El problema aparece en los suelos con alta capacidad de fijación de K, pero Hartz (1999) también encontró en esos suelos con bajo nivel de K que los frutos con bajo contenido en K no mostraban YSD, por lo que debe haber otros factores. Trudel y Ozbun (1971) detectaron una correlación positiva entre los niveles de K de la solución nutritiva que se añadía a las plantas y los carotenoides del fruto, específicamente con el licopeno, mientras que el β-caroteno seguía un patrón inverso. Entre los factores ambientales se ha sugerido que una combinación de radiación de corta y larga longitud de onda es una posible causa (Lipton 1970; Picha
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 104 1987; Hartz et al. 1999; Romero-Aranda et al. 2004). Entre los ensayos realizados por Venter (1965) acerca de los factores que afectaban a la aparición del hombro verde, demostró que el sombreado de los frutos con lámina de aluminio disminuía significativamente la presencia del hombro comparado con los frutos no sombreados. Sin embargo, Venter no especifica en qué momento del desarrollo del fruto inició el tratamiento, cuánto duró o de qué manera se colocó la lámina de aluminio, pero lo que parece claro es que la radiación solar sobre el fruto está implicada en la aparición de la mancha solar. Picha (1987) determinó que la incidencia de la mancha solar en los frutos prácticamente desaparecía al recolectarlos en estado verde maduro, y dejarlos madurar en condiciones ambientales de sala (23ºC, 75% de humedad relativa), en vez de dejarlos madurar en la planta. Este hecho le llevó a concluir que la mancha solar estaba mediada por las condiciones ambientales durante la maduración del fruto y que la predisposición del fruto a mostrar mancha solar podría iniciarse durante los estadios de desarrollo y maduración. Sin embargo, argumentó que la expresión del carácter sólo se hace presente bajo ciertas condiciones ambientales desfavorables durante el desarrollo del fruto mientras madura en la planta. Sugirió entre otras condiciones desfavorables, que la asociación de la mancha solar con la presencia de hombro verde durante la maduración se pude deber a la acumulación de calor en el hombro verde oscuro. El efecto de la temperatura no está demostrado, aunque se sabe que la producción de etileno se inhibe en condiciones de alta temperatura en muchas plantas (Lipton 1970; Yang 1980), así como la síntesis de licopeno (Cheng et al. 1988). Por tanto no se conoce con exactitud si la influencia de las condiciones ambientales adversas se produce en cualquier momento del desarrollo del fruto o en uno o varios periodos sensibles concretos. También se desconoce si la mancha solar se debe a la radiación solar como el espectro completo o al efecto de la radiación con determinada longitud de onda, como la luz ultravioleta, que recibe el fruto. En este capítulo se tratará de dar respuesta a este aspecto. Un aspecto a tener en cuenta para la evaluación de la presencia de mancha solar es la subjetividad con la que se realiza en algunos estudios, basándose sólo en índices visuales. Una manera de soslayarlo es utilizar medidas de color objetivas con un colorímetro de tipo Hunter, que trabaja en el espacio de color CIELab (Anexo 1.5).
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 105 De esta manera los parámetros que conforman el espacio CIELab aportan información de diferentes aspectos del color. Se han desarrollado otras maneras de medir el color de manera objetiva, una de ellas es el TACT (Tomato Analyzer-color Test), desarrollada por Darrigues y col. (2008). Emplea un escáner para tomar datos de color de los frutos en el espacio CIELab, a los que se les corta una parte de la zona peduncular para dejar al descubierto el pericarpo, que es la zona que se escanea. En este trabajo Darrigues y col. compararon los resultados de emplear el TACT frente a un colorímetro en la caracterización del color de varios frutos, en algunos casos afectados de mancha solar. Encontraron una alta correlación y linearidad de los valores de L*, a* y b* obtenidos con ambos métodos. Una de las ventajas de emplear el TACT que salta a la vista es que la zona de medida del color es mayor en el TACT que empleando el colorímetro. En el caso de frutos con mancha solar, en los que la zona amarilla no sea muy extensa, como por ejemplo el anillo amarillo, el colorímetro puede falsear la medida si en el área del disparo de medición del color entra alguna zona roja. Este problema se podría evitar con el TACT, que te permite seleccionar el área a medir. No obstante, tanto en los estudios de caracterización de la población RIL, mostrados en el capítulo 1, como en los realizados en este capítulo para el estudio sobre la mancha solar, no se ha empleado el TACT, por varios motivos. Las medidas con el TACT necesitan de un tiempo extra en la toma de datos, que no puede permitirse en el diseño de ensayos tan complejos como los empleados en nuestro estudio. Además la principal desventaja del TACT reside en que es destructivo con la muestra, por la necesidad de cortar el fruto, por lo que la muestra sólo se puede tomar una vez. En cambio el colorímetro permite realizar un seguimiento de la muestra, ya que se pueden tomar datos de campo del mismo fruto en la planta, durante todo su desarrollo, desde verde inmaduro hasta rojo maduro. Acerca de los factores genéticos que afectan a la aparición del YSD se ha encontrado poca información en la bibliografía consultada. Como se ha comentado en la introducción general, por observaciones anteriores en el IHSM La Mayora, se calculó que la mancha solar podría tener un carácter poligénico, pero será en el capítulo 3 donde se profundizará en este aspecto de la mancha solar. Debido a este carácter poligénico se hacía necesario conseguir un material vegetal consistente en una pareja
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 106 de líneas con pocas diferencias en su fondo genético, pero a su vez contrastante para el carácter, de manera que las diferencias entre esas líneas contrastantes deben responder a diferencias genéticas directamente relacionadas con la mancha solar. Los objetivos específicos del capítulo 2 son la obtención de material vegetal contrastante para el estudio de la fisiopatía de la mancha solar, la evaluación del efecto de factores ambientales como la luz sobre la aparición de la mancha, así como la determinación del momento clave en el desarrollo del fruto en el cual se puede evitar su aparición. 2.2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.2.1. Material vegetal En el proceso de obtención de la población de las líneas recombinantes analizadas en el capítulo 1, procedentes del cruce de Solanum lycopersicum “Moneymaker” con la entrada de S. pimpinellifolium TO-937, se observó que varias líneas RIL presentaban mancha solar en los frutos, a pesar de que ninguno de los dos parentales presentaba el carácter. En la generación RIL F5 se observaron varias líneas cuyas progenies presentaban segregación para mancha solar, de manera que unas plantas mostraban frutos con mancha solar y otras no. Se seleccionaron varias plantas de tres de estas líneas RIL (116, 143 y 177R) en F5 con objeto de fijar mediante autofecundación y selección la presencia / ausencia de mancha solar, hasta la generación F8 donde se consideran líneas homocigotas y quasi-isogénicas. De esta forma para cada una de estas progenies de F5 se obtuvo finalmente una pareja de subRILs en F8 contrastantes para el carácter. Se emplearon 10 líneas sub-RILs en F7, con diferente expresión del carácter mancha solar (Tabla 2.1). Se germinaron semillas de cada línea en un invernadero de vidrio en febrero y a los 40 días se sembraron las plántulas de cada línea en el invernadero de polietileno correspondiente. Estas líneas se evaluaron y se seleccionaron las plantas F8 para formar las parejas finales. Tras los ensayos, en cada
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 107 una de las 3 sub-RIL (116, 143 y 177R) se eligieron las 2 plantas que formaban la pareja más contrastante para el carácter. Presencia de mancha solar No presencia de mancha solar o segrega para el carácter 116-3-1-12 116-R1-10-1 143-2-9-3 / 143-3-7-2 143-R1-6-1 / 143-R2-11-1 177-R1-4-7 177-R1-6-11/ 177-R2-4-5 / 177-R3-2-6 2.2.2. Valoración de los parámetros de color L* y H* Se cultivaron de 5 a 15 plantas de cada una de las 10 líneas sub-RILs en F7 en un invernadero tipo parral con cubierta de polietileno. Se seleccionaron frutos en estadio verde maduro de cada una de las líneas para observar la aparición de hombros verdes y la evolución del color del fruto para detectar la aparición de mancha solar. Para ello se le realizaba a cada fruto un seguimiento que conllevaba la toma de datos de color con el colorímetro, tal y como se explica en el apartado 2.2.7, espaciadas cada 3 días, durante todo el desarrollo y maduración del fruto hasta su recogida. 2.2.3. Efecto de la calidad de la luz sobre el mismo genotipo Este ensayo trató de evaluar el efecto de la calidad de luz recibida por el fruto, empleando un solo genotipo. La línea seleccionada fue la 116-3-1 que presentó en prácticamente el 100% de los frutos una mancha que ocupaba de un tercio a casi la mitad del fruto. Las plantas se cultivaron en un invernadero multitúnel de polietileno (48 x 24 m, con una altura de 4 a 6 m), regadas con una solución estándar (Cánovas 1995). Se realizaron 2 tratamientos diferentes con 5 plantas de la línea 116-3-1 por cada tratamiento, que consistió en cubrir los 5 primeros frutos del tercer racimo de cada planta, en estado verde inmaduro. La diferencia entre los tratamientos fue el material con el que se cubrieron los frutos, que está detallado en el apartado 2.2.6. En un tratamiento se empleó una malla que ofrecía una tramitancia de un 32% de la radiación aproximadamente, independientemente de su longitud de onda (Figura 2.4). Tabla 2.1. Desglose de las 10 líneas sub-RILs seleccionadas en F7 para el estudio de mancha solar, ordenadas según presencia (izquierda) o ausencia (derecha) de mancha.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 108 En el otro tratamiento se cubrieron los frutos por completo con papel de aluminio, que provoca un sombreado total (Figura 2.1). Se contó como control con otras 5 plantas de la misma línea, en la que no se cubrieron los frutos. Al final del experimento se tomaron los datos de color con el colorímetro a todos los frutos según lo detallado en el apartado 2.2.7. 2.2.4. Efecto de la calidad de la luz sobre diferentes genotipos Este ensayo trató de evaluar el efecto de la calidad de luz recibida por el fruto, empleando otros materiales detallados en el apartado 2.2.6, aplicados a diferentes genotipos. Se emplearon 15 plantas de cada una de las líneas sub-RIL (Tabla 2.1). En cada una de ellas se escogieron 2 frutos, procurando que se encontraran a alturas o posiciones diferentes dentro de la planta. Esas 15 plantas de cada genotipo se distribuyeron en el invernadero repartidas de 5 en 5 para poder aplicar cada tratamiento. El tratamiento 1 provocaba una reducción drástica de la radiación ultravioleta sobre la planta, mediante el uso de un plástico de polietileno fotoselectivo que contiene aditivos que absorben específicamente la radiación ultravioleta (UV). Estaba colocado a una altura de 2,10 metros sobre las plantas dentro del invernadero (Figura 2.2). En el momento de colocarlo, este plástico reducía en un 95% la radiación Figura 2.1. Detalle de plantas de la línea 116-3-1 con los racimos 3 cubiertos. (A) Racimos 3 cubiertos con malla. (B) Racimos 3 cubiertos con aluminio (flecha roja) y con malla (flecha azul). A B
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 109 ultravioleta y en un 42% la radiación fotosintéticamente activa (PAR), comparado con la radiación que llegaba dentro del invernadero bajo la cubierta de plástico estándar (Figura 2.4). El tratamiento 2 generaba una disminución de la radiación sobre la planta, con el uso de un plástico de polietileno normal, sin aditivos especiales para filtrar UV, también colocado a 2,10 metros sobre las plantas (Figura 2.2). Este plástico reducía cerca del 33% de la radiación PAR y un 86% la luz ultravioleta, en comparación con la luz que llegaba al interior del invernadero (Figura 2.4). El tratamiento 3 consistió en el ensayo control, sin modificación alguna de la radiación recibida por los frutos dentro del invernadero. Para evitar el efecto borde en las plantas perimetrales de la parcela experimental se sembraron alrededor veras de plantas de la variedad comercial ‘Josefina’. Al final del experimento se tomaron los datos de color con el colorímetro a todos los frutos según lo detallado en el apartado 2.2.7. 2.2.5. Determinación del momento sensible a la inducción de la mancha solar Con el objetivo de determinar el momento clave en el desarrollo del fruto en el que se provoca la aparición de la mancha solar se diseñó un experimento en 3 fases, de manera que con los ensayos de cada fase la concreción del período de tiempo en el BA Figura 2.2. Posición de los plásticos en el interior del invernadero para el ensayo sobre el efecto de la calidad de la luz sobre diferentes genotipos. (A y B) El plástico fotoselectivo que impide la entrada de luz UV es el situado a la izquierda. (A) Plántulas sembradas. (B) Plantas adultas.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 110 que el fruto es sensible a la aparición de mancha iba aumentando, ya que los resultados obtenidos en cada fase se aplicaban en el diseño experimental de la siguiente fase. El experimento se basó en cubrir frutos con papel de aluminio para evitar la radiación solar en períodos concretos, descubrirlos tras un tiempo determinado y medir la evolución del color del fruto con el colorímetro, para detectar objetivamente la aparición o no de mancha solar. La fase 1 se diseñó para determinar, en una primera aproximación, si la inducción de aparición de la mancha ocurría durante el estado verde del fruto o después del virado de color de verde al rojo del fruto (estado breaker o pintón). Una vez establecido el período, la fase 2 trató de acotar el momento de inducción de la mancha solar a un tramo corto de días concretos durante su desarrollo. Los resultados de la fase 2 obligaron a evaluar tramos más largos de días en la fase 3 final. Para las 3 fases se emplearon plantas de la línea 116-3-1 que ha presentado siempre mancha solar en los frutos y no segrega para el carácter; además posee racimos muy largos, con más de 15 frutos, que resultaron muy útiles. Fase 1 Para la Fase 1 se emplearon 5 plantas de la línea 116-3-1. Se seleccionó el racimo 3 de cada planta para hacer dos tratamientos diferentes pero sincrónicos. Los dos tratamientos se realizan a la vez sobre diferentes grupos de frutos dentro del mismo racimo 3, de manera que el primer tratamiento emplea los frutos del 1 al 6 y el segundo tratamiento emplea los frutos del 7 al 12. En la Figura 2.3 se detalla en imágenes ambos tratamientos en el inicio del ensayo (figura 2.3.A) y en un estadio más avanzado en el tiempo (figura 2.3.B). En el primero de los tratamientos el fruto 1º del racimo 3 se empleó como control y se fueron tomando datos con el colorímetro de los frutos 2º al 6º en estado verde inmaduro y verde maduro, según lo detallado en el apartado 2.2.7 (Figura 2.3.A). En el momento en el que el fruto 1º control viró a rojo, esto es, cuando comienza a tomar color rojo en la zona apical (estado breaker), se taparon los frutos del 2º al 6º con papel aluminio. Aun tapados se realizó la medida de color en los estadíos verde inmaduro y verde maduro, retirando momentáneamente el aluminio cuando era necesario. Tras la completa maduración de cada fruto, se midió el
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 117 Genotipo Control diffH* No UV diffH* Normal diffH* 116-3-1-12* 41,15 ab A 32,06 b A 50,22 a A 177-R1-4-7* 36,99 a A 31,93 a A 45,61 a AB 143-2-9-31* 33,21 a A 36,60 a A 23,25 a CD 143-3-7-2* 33,99 a A 43,21 a A 22,62 a CDE 116-R1-10-1 14,44 a B 27,41 a A 29,34 a BC 177-R1-6-11 6,20 b B 11,75 a B -0,44 b F 177-R2-4-5 5,55 a B 5,36 a B 2,41 a F 177-R3-2-6 10,23 a B 3,71 b B 6,96 ab DEF 143-R1-6-1 3,36 a B 1,83 a B 3,56 a EF 143-R2-11-1 12,33 a B 9,91 a B 16,45 a CDEF 2.3.4. Determinación del momento sensible a la inducción de la mancha solar Fase 1 Se calculó para cada fruto estudiado en el experimento, la diferencia de H* entre la zona 1 y la zona 2, en el estadio rojo maduro. Se realizó un análisis de la varianza para observar si había diferencias significativas entre los valores de diferencia de H* entre zonas, entre los frutos cubiertos o no con aluminio antes del estadío breaker (Tabla 2.5). Los resultados muestran que los frutos cubiertos antes del estadío breaker mostraron una diffH* entre zonas significativamente menor que los frutos que no estuvieron cubiertos antes de breaker. Cubierto antes de Breaker N Medias diffH* Error típico No 12 41,75 a 7,44 Sí 36 26,78 b 3,06 Tabla 2.4. Medias de las diferencias del parámetro H* entre las zonas 1 y 2 del fruto rojo. Las medias con la misma letra no son significativamente distintas. Las letras minúsculas se refieren a diferencias entre tratamientos, dentro del mismo genotipo y las letras mayúsculas a diferencias entre los distintos genotipos, según el tratamiento. *Líneas cuyos frutos presentan mancha solar. Tabla 2.5. Medias de las diferencias del parámetro H* entre las zonas 1 y 2 del fruto rojo. Las medias con la misma letra no son significativamente distintas.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 118 Fase 2 Se calculó para cada fruto estudiado en el experimento, la diferencia de H* entre la zona 1 y la zona 2, en el estadio rojo maduro. Se representó de manera gráfica la media de la diferencia de H* (diffH*) para cada categoría de fruto, acompañada de las barras de error. En el eje horizontal se representan los tramos cortos de días desde antesis en los que el fruto ha estado cubierto con papel de aluminio, durante el tiempo de desarrollo y maduración del fruto (Figura 2.6). Los resultados obtenidos mostraron que todos los frutos presentaron valores de diferencia de H* que indican presencia de mancha solar, que además se observó de manera visual. Los frutos cubiertos de 5-11 dpa (días post-antesis), 10-16 dpa y 13-19 dpa mostraron valores algo más reducidos de diffH* que el resto de los frutos de otras categorías. Fase 3 Se calculó para cada fruto estudiado en el experimento, la diferencia de H* entre la zona 1 y la zona 2, en el estadio rojo maduro. Se representó de manera gráfica la media de la diferencia de H* (diffH*) para cada categoría de fruto, acompañada de Figura 2.6. Medias de las diferencias del parámetro H* entre las zonas 1 y 2 del fruto rojo. En el eje horizontal se representan los tramos cortos de días desde antesis en los que el fruto ha estado cubierto con papel de aluminio. El fruto marcado como control no estuvo nunca cubierto. La línea horizontal punteada delimita el valor de diffH* por encima del cual se considera que el fruto presenta mancha solar. Las barras indican el error típico.
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 119 las barras de error. En el eje horizontal se representan los tramos largos de días desde antesis en los que el fruto ha estado cubierto con papel de aluminio, durante el tiempo de desarrollo y maduración del fruto (Figura 2.7). Los resultados obtenidos mostraron claramente que los frutos que habían permanecido cubiertos desde antesis hasta un máximo de 13 días presentaron valores de diferencia de H* que indican presencia de mancha solar, que además se observó de manera visual. Los frutos cubiertos desde antesis hasta al menos 16 dpa en adelante presentaron valores de diferencia de H* que indican ausencia de mancha solar. Los frutos de la categoría de 0 a 13 dpa mostraron un rango amplio de variabilidad en los valores de diffH* indicando que algunos mostraron mancha solar y otros no. El valor medio de los frutos de la categoría de 0 a 13 dpa se situó cercano al valor de diffH* establecido como umbral para determinar presencia o ausencia de mancha. 2.3.5. Obtención de las parejas de sub-RILs contrastantes Se seleccionaron las plantas F8 para formar las parejas. En cada una de las 3 sub-RIL se eligieron las 2 plantas que formaban la pareja más contrastante para el carácter. La selección se basó previamente en los datos de color de los frutos elegidos, Figura 2.7. Medias de las diferencias del parámetro H* entre las zonas 1 y 2 del fruto rojo. En el eje horizontal se representan los tramos largos de días desde antesis en los que el fruto ha estado cubierto con papel de aluminio. El fruto marcado como control no estuvo nunca cubierto. La línea horizontal punteada delimita el valor de diffH* por encima del cual se considera que el fruto presenta mancha solar. Las barras indican el error típico.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 120 y se completó con la observación directa en el campo (Figura 2.8), para evitar la selección de líneas que mantuviesen una cierta segregación. Las plantas finalmente seleccionadas (Tabla 2.6) se autofecundaron y las semillas recogidas corresponden a las líneas ya fijadas. Figura 2.8. Muestra de algunos frutos representativos de cada línea. Las imágenes superiores son las 3 líneas seleccionadas por la aparición del carácter. Las imágenes inferiores son las seleccionadas por no presentar la fisiopatía. 116-3-1-12-1 143-2-9-3-4 177-R1-4-7-4 143-R1-6-1-4 177-R1-6-11-5 116-R1-10-1-4
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 121 Línea con mancha solar Observaciones de campo Línea sin mancha solar Observaciones de campo 116-3-1-12-1 Mancha en el 95% de los frutos, ocupando de ¼ a ½ del fruto 116-R1-10-1-4 Segregación entre plantas, mancha solar muy reducida o nula 143-2-9-3-4 Mancha en el 85% de los frutos, ocupando de ¼ a 1/3 del fruto 143-R1-6-1-4 No presencia de mancha 177-R1-4-7-4 Mancha en el 90% de los frutos, ocupando de ¼ a 1/3 del fruto 177-R1-6-11-5 No presencia de mancha 2.3.6. Medidas de radiación, temperatura y humedad relativa Se midieron en continuo algunas variables ambientales dentro del invernadero durante los meses en los que las plantas se emplearon en los ensayos. Los resultados obtenidos de estas variables se presentan en la Tabla 2.7. Variables Medias Desv.tip. Temperatura (ºC) Temperatura mínima Temperatura máxima Temperatura media 16,6 35,1 24,1 3,3 4,5 3,6 Humedad (%) Humedad relativa mínima Humedad relativa máxima Humedad relativa media 29,2 86,6 60,4 7,8 6,7 8,9 Radiación (mol m-2 d-1) Radiación PAR acumulada 26,4 4,8 Tabla 2.6. Parejas de líneas sub-RILs ya seleccionadas y algunas características. Tabla 2.7. Media y desviación típica de las variables ambientales durante el período del ensayo en el interior del invernadero.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 122 2.4. DISCUSIÓN Los parámetros del espacio de color CIELab resultan muy útiles en cuanto a lo que representan, esto es, una medida objetiva del color y susceptible de ser analizada estadísticamente y representada gráficamente. De todos, el parámetro H* es el que se concibe de manera más fácil, puesto que representa una escala numérica para lo que conocemos por “color”. Según la calibración realizada al colorímetro, en tomate hemos observado que valores de H* entre 120° y 100° equivalen al color verde, entre 100° y 70° equivalen a amarillo, entre 70° y 45° a naranja y de 45° a 27° a rojo, no habiéndose hallado valores más bajos en nuestros resultados. El valor de la diferencia de H* entre las zonas del hombro y apical de los frutos es una medida objetiva del grado de mancha solar que estos presentaban. Hemos considerado que valores de diffH* de hasta 25°, incluso 30°, se pueden asumir como un fruto que no presenta mancha solar. El parámetro L* se debe entender como la claridad u oscuridad del color. A la vista de los resultados se podría utilizar el valor de L* para predecir desde un fruto verde la posible aparición de la mancha solar, ya que como se observa en la Figura 2.5 su valor es menor en la zona del hombro de frutos que posteriormente presentan la fisiopatía. Los datos de seguimiento del color con el colorímetro han demostrado que los frutos que presentan en estadío verde los hombros oscuros, esto es, un valor de L* en el hombro más bajo que en la zona apical, son más propensos a la aparición de mancha solar. Esto podría deberse a que los colores más oscuros absorben mayor cantidad de radiación solar, y por tanto acumulan más calor, potencialmente causante de la fisiopatía. Esta acumulación de energía por la radiación solar en la zona podría provocar un daño tisular que altera el desarrollo normal del tejido, impidiendo su evolución hacia tejido rojo maduro. La aplicación del parámetro C* se hace más ardua, debido a la dificultad de asumir la función práctica de C* en el color; se puede pensar como la pureza del color, y acercarlo al contenido de pigmentos en el fruto y sus porcentajes, pero parece un parámetro menos interesante puesto que no hemos observado diferencias en la descripción objetiva del color de los frutos afectados por la fisiopatía.
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 123 La mancha solar es un daño a nivel tisular que se produce en la zona del hombro del fruto, posiblemente debida a una combinación de varios factores ya comentados. Varias observaciones han llevado a pensar que la radiación solar incidente en el fruto es responsable en parte de su aparición. Se quiso evaluar el efecto de la calidad de la luz que incide sobre el fruto en la aparición de la mancha. Teniendo en cuenta que la luz UV al tener más energía podría provocar daños en el fruto, se ensayó evitar su incidencia sobre los frutos para tratar de conseguir disminuir la mancha solar. Los resultados de este ensayo mostraron que la evitación de la luz UV sobre los frutos en todo su desarrollo no impidió que apareciera la mancha solar en los 4 genotipos que presentan el carácter (marcados con * en la Tabla 2.4). Sí se observaron algunas diferencias significativas en 2 de los 6 genotipos que no presentaban mancha solar (177-R1-6-11 y 177-R3-2-6), con sentidos opuestos, pero al evaluar cada uno de los valores de las medias se confirma que ninguno alcanzó un valor de diffH* mayor de 25º, establecido como umbral para la asignación de mancha solar. Sólo en el caso de la línea 116-R1-10-1 las medias de diffH*, aunque no fueron significativamente diferentes, superaron el valor de 25°, pero se debe a que en esta línea el carácter estaba segregando y no se consiguió fijarlo, de manera que algunos frutos presentaron mancha solar y otros no. El tratamiento en el que se aplicó un plástico no fotoselectivo no generó diferencias significativas en ninguno de los genotipos. Los resultados obtenidos con diferentes calidades de luz sobre distintos genotipos apuntan a que los tratamientos empleados no tienen efecto sobre la aparición de la mancha. El hecho de limitar la luz UV que recibe la planta completa puede no ser beneficioso, ya que junto con la casi eliminación de la luz UV, se está reduciendo drásticamente la radiación PAR recibida por la planta, un 42% comparado con la radiación que llegaba dentro del invernadero. Habría que comprobar el efecto de esta reducción en la luz recibida, ya que quizá la planta descienda sus niveles de fotoprotección y por ello sea más sensible aún a la luz UV, por muy pequeña que sea la cantidad recibida. Estas hipótesis necesitarían experimentos ulteriores.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 124 Venter (1965) ya demostró que el sombreado de los frutos con papel de aluminio disminuía significativamente la presencia del hombro comparado con los frutos no sombreados. En nuestros ensayos se probaron 2 materiales para sombrear los frutos, papel de aluminio y malla. El resultado fue que los frutos cubiertos con aluminio presentaban una media de la diferencia de H* entre zonas de 17°, mientras que los frutos cubiertos con malla o no cubiertos mostraban una media de la diferencia de los valores de H* en torno a 38°. Estas diferencias fueron significativas, por lo que los resultados apuntan a que la eliminación total de la radiación solar sobre el fruto, por medio de aluminio en este caso, lleva a la no aparición de la fisiopatía. Los resultados de los frutos cubiertos con la malla hacen pensar en que la simple reducción de la radiación recibida no es suficiente para evitar la fisiopatía, como también apuntaban los resultados del experimento con diferentes genotipos. Se ha demostrado que es necesario evitar la radiación solar sobre los frutos para evitar la aparición de la mancha solar, y uno de los objetivos de este capítulo es conocer el período clave concreto durante el desarrollo del fruto en el que es más sensible a la inducción de la fisiopatía debido a la radiación solar. Para ello se diseñó un experimento en 3 fases. Los resultados de los ensayos de la fase 1 mostraron que los frutos cubiertos con aluminio antes del momento de virado al rojo, esto es, durante su estadío en verde, presentaron menor o nula incidencia de mancha, respecto a los frutos cubiertos después del estadío breaker, siendo estas diferencias significativas. Por tanto el momento más sensible durante el desarrollo del fruto, en el que la radiación recibida provocaría la aparición de mancha solar en el fruto rojo, es el estadío verde. Conociendo este resultado se evaluaron en la fase 2 pequeños tramos de 6 días a lo largo del estadío verde en los que los frutos estaban cubiertos con aluminio, pero el mantener los frutos 6 días cubiertos no fue suficiente para evitar la aparición de mancha solar. Sin embargo, se observaron tres categorías de fruto que parecían más sensibles al tratamiento: 5-11 dpa, 10-16 dpa y 13-19 dpa, en los que el valor de diffH* disminuyó. En la fase 3 los tramos de días de fruto cubierto fueron mayores y todos partieron desde antesis (0 dpa), para complementar la información obtenida en la fase 2. Los resultados a simple vista muestran que el fruto es sensible al efecto de la radiación solar sobre la aparición de la mancha desde su establecimiento
Capítulo 2. Aproximación a la fisiopatía de la mancha solar. Obtención de material vegetal. 125 hasta el día 16 tras la antesis. No obstante se observa un patrón que concuerda con lo observado en la fase 2, y que muestra cómo parece existir dos momentos concretos más sensibles para la inducción de mancha solar por la radiación. El primer momento sensible no se observa hasta los 5-10 dpa, que coincidiría con el momento en el que el frutillo asoma y deja de estar cubierto por el cáliz. Esos son los primeros días en los que la luz incide directamente sobre el fruto y quizás debe de estimular la generación de mayor número de cloroplastos, la síntesis de clorofila y los mecanismos de fotoprotección. Un segundo momento más sensible se establecería en torno a los 1316 dpa, en los que el fruto sigue siendo verde inmaduro. Estos dos momentos no son independientes, de manera que es necesario evitar la radiación durante ambos períodos para evitar la mancha solar. Queda demostrado que el período más sensible para la inducción de la mancha solar en el fruto rojo maduro es el período inicial verde inmaduro, de 5 a 16 dpa, y que no es una fisiopatía cuya etiología se produzca en el momento de la maduración en la que ya nada se podría hacer para evitarla pues el daño se produjo con anterioridad. Ya obtenidas las parejas contrastantes para el carácter mancha solar, se seleccionó sólo una de ellas para continuar con los ensayos de mancha solar del capítulo 3 que nos llevarán a profundizar en aspectos genéticos y proteómicos, entre otros. La pareja de líneas contrastantes derivada de la línea 116 se descartó porque la mancha solar estaba fijada prácticamente antes de la separación de las líneas hermanas y no se ha podido conseguir una línea resistente a la mancha solar que no presente segregación. Entre las dos parejas restantes se seleccionó la derivada de la línea 177, ya que por un lado la línea hermana que no presentaba mancha no segregaba, como le ocurría a la 116, y por otro lado presentaba mayor proporción de frutos afectados (Tabla 2.6) y mayor tamaño de fruto que las líneas derivadas de la 143 (Figura 2.8).
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 126 Bibliografía Ayers, J. & Tomes, M., 1966. The effect of two uniform ripening genes on chlorophyll and carotenoid contents of tomato fruit. Journal of the American Society for Horticultural Science, 88, pp.550–556. Cánovas, F., 1995. Manejo del cultivo sin suelo. In F. Nuez, ed. El cultivo del tomate. Madrid: Mundiprensa, pp. 227–254. Cheng, T.-S. et al., 1988. The Effect of High-Temperature Stress on Ripening of Tomatoes (Lycopersicon esculentum). Journal of Plant Physiology, 132(4), pp.459–464. Available at: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0176161788800634 [Accessed October 29, 2015]. Darrigues, A., Hall, J., et al., 2008. Tomato Analyzer-color Test : A New Tool for Efficient Digital Phenotyping. , 133(4), pp.579–586. Darrigues, A., Schwartz, S.J. & Francis, D.M., 2008. Optimizing sampling of tomato fruit for carotenoid content with application to assessing the impact of ripening disorders. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(2), pp.483–487. Available at: ISI:000252434800028. Davies, J.N., 1966a. Changes in non-volatile organic acids of tomato fruit during ripening. Journal of the Science of Food and Agriculture, 17(9), pp.396–400. Available at: ISI:A19668361400003. Davies, J.N., 1966b. Non-volatile organic acids of differently coloured areas of walls of blotchy ripened tomatoes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 17(9), pp.400–403. Available at: ISI:A19668361400004. Francis, D.M., Barringer, S.A. & Whitmoyer, R.E., 2000. Ultrastructural characterization of yellow shoulder disorder in a uniform ripening tomato genotype. Hortscience, 35(6), pp.1114–1117. Available at: ISI:000089964200030. Hartz, K., 2005. Processing tomato yield and fruit quality improved with potassium fertigation. Hortscience, 40(6), pp.1862–1867. Hartz, T.K. et al., 1999. Potassium requirements for maximum yield and fruit quality of processing tomato. Journal of the American Society for Horticultural Science, 124(2), pp.199–204. Available at: ISI:000078681600016. IBM Corp., 2013. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Jones, J.P. & Alexander, L.J., 1962. Relation of certain environmental factors and tobacco mosaic virus to blotchy ripening of tomatoes. Phytopathology, 52(6), pp.524–528. Available at: ISI:A19621809C00008. Lipton, W.J., 1970. Effects of high humidity and solar radiation on temperature and color of tomato fruits. Journal of the American Society for Horticultural Science, 95(6), pp.680– 684. Available at: ISI:A1970I033400006.
Capítulo 3. Fisiopatía de la mancha solar: genética y proteómica. 133 líneas comparten un fondo genético común desde una misma planta F5. Se germinaron semillas de cada línea en un invernadero de vidrio en febrero y a los 40 días se sembraron 21 plántulas de cada línea en un invernadero multitúnel de polietileno. En ambas líneas se realizaron observaciones de algunos caracteres de la planta, de los racimos y de los frutos para detectar las diferencias existentes, además del hecho de ser contrastantes para el carácter mancha solar (Figura 3.1). Para la detección de QTLs se empleó la población de 169 líneas RIL descrita en el capítulo 1, apartado 1.2.1, empleando 5-6 plantas por línea. 3.2.2. Detección de QTLs asociados a mancha solar Se recogieron todos los frutos producidos de cada planta de cada RIL hasta el racimo 7-8 y se les asignó un valor a cada uno según el índice de mancha solar observada (Anexo 1.3). Usando el valor medio de este índice para cada RIL se realizó el estudio de localización de QTLs siguiendo la metodología explicada en el apartado 1.2.4.4 del Capítulo 1. 3.2.3. Diseño experimental Se diseñó el ensayo para poder tomar muestras suficientes de frutos en cada uno de los estados de maduración, entiéndase verde maduro (VM) y rojo maduro (RM), en las plantas de cada una de las dos líneas contrastantes para los estudios del proteoma. Para cada uno de esos estados de maduración se aplicó un tratamiento que fue cubrir unos frutos con papel de aluminio desde la caída de la corola hasta su Figura 3.1. Frutos de las líneas contrastantes seleccionadas. (A y C) Estadio verde maduro. (B y D) Estadio rojo maduro. Frutos de la línea resistente a mancha solar 177R6 (A y B). Frutos de la línea sensible a mancha solar 177R4 (C y D). A C B D
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 134 recogida y dejar otros sin cubrir. Para cumplir con este diseño en cada planta sembrada se etiquetaron 8 frutos, evitando siempre usar el primer fruto del racimo, distribuidos en los racimos 3 y 4. En el tercer racimo se etiquetaron 2 frutos para recogerlos en rojo maduro (RM), de los que un fruto había sido cubierto y otro no. Además se etiquetaron dos frutos intercalados, sin cubrir, que se dejarían madurar en la planta como control para evaluar la aparición de la mancha solar y su extensión en fruto rojo maduro. En el cuarto racimo se etiquetaron 2 frutos para recogerlos en verde maduro (VM), de los que un fruto había sido cubierto y otro no. De la misma manera que se ha explicado para el racimo 3, se etiquetaron además dos frutos controles intercalados. El planteamiento del diseño permitió que la recogida de los frutos se concentrara en un período de tiempo más corto. En cada racimo de cada planta se alternó el orden de los frutos para evitar efectos posicionales. El etiquetado de los frutos se realizó a principios de mayo (Figura 3.2). 3.2.4. Toma de muestras Durante el tiempo del ensayo se realizó un seguimiento a los frutos cada día para comprobar si le correspondía su recogida según su asignación, siguiendo el diseño experimental descrito en el apartado 3.2.2. Los frutos VM se recogieron a 28-30 dpa, mostrando más brillo pero nunca presentando cambio de color a amarillo. Los frutos RM se recogieron a 46-47 dpa, apareciendo rojo intenso y con dureza intermedia. Los frutos se recogían y procesaban dentro del invernadero (Figura 3.3), siempre entre las A B Figura 3.2. Diseño experimental. (A) Plantas sembradas para el ensayo con frutos cubiertos con papel de aluminio. (B) Detalle de un racimo con algunos frutos cubiertos y no cubiertos, en estado verde inmaduro.
Capítulo 3. Fisiopatía de la mancha solar: genética y proteómica. 135 12.30 y las 15.00 horas, cuando la temperatura y la radiación eran máximas. El procesado de cada fruto conlleva el lavado, secado, medida con el colorímetro (ver anexo 1.5) en la zona peduncular y estilar, y numeración del fruto. Con los frutos cubiertos se realizó el mismo proceso, pero manteniéndolos el mínimo tiempo expuestos a la luz. Luego se cortó cada fruto transversalmente separando las zonas peduncular (un tercio del fruto) y estilar. En los casos en los que presentaban mancha solar u hombro verde se cortó por la línea que delimita esta zona con la zona del fruto de color normal. Se descartó el mucílago con las semillas y la columela en ambas partes del fruto y se metió cada fruto partido y vaciado en bolsas individuales de cierre zip perforadas, para inmediatamente después congelarlas en nitrógeno líquido in situ en el invernadero, y almacenarlas a -80ºC hasta su posterior utilización (Figura 3.4). Figura 3.4. Diagrama del proceso de la toma de muestras y preparación hasta su conservación a -80ºC. Lavado Colorímetro Corte del fruto Retirada de mucílago y semillas Congelación en N2 líquido y a -80ºC Figura 3.3. Detalle de la recogida, numeración, medición del color y toma de muestras de frutos en el invernadero.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 136 3.2.5. Evaluación, selección y procesado de las muestras tomadas Entre todos los frutos recogidos se seleccionaron los que se emplearían para los análisis, según los datos tomados con el colorímetro. Se calculó la diferencia de los valores de H* entre la zona peduncular (zona 1) y estilar (zona 2) y también el YSD index (descrito en el anexo 1.3). Según los resultados, para la línea 177R4 se seleccionó solamente los frutos cuyos controles presentaron mancha. Los frutos control se quedaron en la planta hasta su maduración, cuando fueron medidos con el colorímetro en su parte peduncular y estilar, y se les dio un valor siguiendo el índice de mancha solar observada descrito en el anexo 1.3. Ya en el laboratorio se prepararon 16 muestras en total, procedentes del pericarpo de frutos de las dos líneas hermanas (177R4 y 177R6), de los dos tratamientos aplicados (cubierto y no cubierto), en dos estadíos diferentes de maduración [verde maduro (28-30 dpa) y rojo maduro (46-47 dpa)], y de las dos zonas del fruto concretas (peduncular y estilar). En cada una de las 16 muestras los medios frutos seleccionados se trocearon con nitrógeno líquido en un mortero de porcelana, luego se trituraron en un molinillo de café enfriado siempre con nitrógeno líquido, se pasaron de nuevo al mortero enfriado para dejar la muestra bien triturada y se repartió en viales enfriados con nitrógeno para inmediatamente almacenar a –80ºC. 3.2.6. Extracción de proteínas. Electroforesis bidimensional La extracción de proteínas en las 16 muestras se realizó siguiendo el protocolo de Faurobert (2007), extrayendo de cada muestra 3 réplicas de aproximadamente 2.5 g cada una. Esta extracción fenólica de proteínas es una alternativa al método clásico de Tricloroacético-acetona y permite una recuperación eficiente de proteínas, retirando los componentes no proteicos en el caso de tejidos vegetales ricos en polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos. Tras la extracción fenólica las proteínas se precipitan con acetato amónico en metanol. A partir de este punto del protocolo los análisis se realizaron en los laboratorios del centro INRA Provence-Alpes-Côte d'Azur, situado en Avignon (Francia), dentro de la Unidad Génétique et Amélioration des Fruits
Capítulo 3. Fisiopatía de la mancha solar: genética y proteómica. 137 et Légumes. El precipitado se resuspende en el tampón IEF (Isoelectric Focusing) y se mide la concentración de proteínas con un método Bradford modificado (Biorad®) antes de la electroforesis. Cada uno de los 48 extractos fue sometido a una electroforesis de dos dimensiones en geles de poliacrilamida (Wang et al. 2006; Faurobert, Pelpoir, et al. 2007). En este tipo de electroforesis las proteínas quedan separadas en el gel según su punto isoeléctrico en el eje horizontal, y según el peso molecular en el eje vertical del gel (Figura 3.5). Los geles de proteínas se visualizan con una tinción con azul de Coomassie CBB G-250 coloidal, quedando las proteínas separadas como puntos en el gel. Figura 3.5. Detalle del protocolo de la electroforesis bidimensional. (A) Primera electroforesis que separa las proteínas por su punto isoeléctrico a lo largo de unas tiras de gel diseñadas para un rango de pH de 4 a 7. (B). Colocación de esas tiras en un gel de poliacrilamida polimerizada para realizar la segunda electroforesis, que separa a las proteínas por el peso molecular. AB
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 138 3.2.7. Análisis de resultados Las imágenes de los geles se obtuvieron con un escáner de imágenes (Amersham Biosciences). Se empleó el paquete Progenesis Stats integrado en el programa Progenesis SameSpot v 2.0 (Nonlinear Dynamics), para explorar la expresión diferencial de puntos (spots) en las imágenes con extensión .mel obtenidas de los 48 geles. Este programa permite realizar análisis univariante y multivariante, incluido ANOVA de una vía, y distingue spots con diferencias de 1.5 o mayores en la intensidad, entre los grupos experimentales. Los spots variables equivalen a proteínas con diferentes niveles de expresión entre las diferentes muestras, encontrando spots presentes en las réplicas de un mismo tipo de muestra pero ausentes en otras. Estas proteínas diferenciales se recortan del gel y se analizan por espectrometría de masas (MALDI/TOF, LC MS/MS) siguiendo Faurobert y col. (Faurobert, Mihr, et al. 2007) para identificar su secuencia de aminoácidos. Una vez obtenida la secuencia se realizan BLAST frente a las bases de datos de proteínas (SwissProt, ESTs) para encontrar homologías y conocer la función putativa del péptido detectado. Los datos obtenidos se volcaron en la base de datos PROTICdb (Ferry-Dumazet et al. 2005), diseñada principalmente para poder almacenar y analizar datos proteómicos de plantas generados por electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE). Dada la complejidad del diseño muestral, con 4 variables dicotómicas a tener en cuenta, se empleó un software desarrollado por el TIGR (The Institute for Genomic Research) llamado MultiExperiment Viewer (TMEV) para mostrar los resultados (Saeed et al. 2003). Este software se emplea para manejar datos experimentales obtenidos de microarrays, de manera que convierte imágenes en datos numéricos, normalizando los datos y analizando finalmente los datos normalizados. El TMEV es una aplicación que genera tonos de verde para los spots ausentes en la muestra y rojo para los spots con presencia, generando toda una escala intermedia de colores para los valores no extremos. Al aplicar TMEV en nuestros datos proteómicos nos permite una visión que facilita la identificación de patrones de expresión, en este caso de proteínas, en las diferentes muestras.
Capítulo 3. Fisiopatía de la mancha solar: genética y proteómica. 139 Figura 3.6. Diferencias en el tamaño del fruto entre las líneas 177R4 y 177R6. (A) Tamaño medio del fruto de cada línea bajo los tratamientos aplicados de cubrir y no cubrir frutos. CUB: Cubierto. (B) Vista del extremo peduncular de los frutos en rojo maduro, del tratamiento cubierto, de las líneas 177R6 (arriba) y 177R4 (abajo). A B 177R6CUB 177R4CUB 3.3. RESULTADOS 3.3.1. Diferencias observadas entre las líneas hermanas A mitad del período de cultivo se observó si existían diferencias llamativas entre las dos líneas contrastantes 177R4 y 177R6, además de recoger documentación fotográfica de varios caracteres observados. No se encontraron diferencias en la altura de la planta, en el tipo de racimo (que en ambos casos son de tipo múltiple), ni en la pilosidad. Sí se han observado diferencias en la longitud de los racimos y en el tamaño de los frutos en rojo maduro, siendo las plantas de la línea 177R4 las que presentan racimos más largos y frutos más grandes (Figura 3.6). A la vista de los datos obtenidos se extrae que el tratamiento de cubrir los frutos provoca una pequeña disminución en el tamaño final de los mismos, que afecta por igual a los frutos de las dos líneas, pero que no llega a ser significativa en ninguno de los casos. Respecto al carácter del agrietado del fruto, se evaluaron 25 frutos en condiciones normales y 25 cubiertos con aluminio, en la línea 177R6. Para la línea 177R4 fueron 20 y 20 para cada tratamiento. Los resultados muestran que en condiciones normales los frutos de la línea 177R6 no presentan agrietado, pero tras el tratamiento 19 de los 25 frutos evaluados (76%) sí mostraban agrietado. En el caso de la línea sensible, presentó el 40% de los frutos agrietados en condiciones normales, y el 50% bajo el tratamiento cubierto (Figura 3.7).
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 140 3.3.2. Detección de diferencias proteómicas El rendimiento medio de la extracción de proteínas en las muestras fue de 3.67 µg/mg de peso fresco empleado, llegando algunas muestras a más de 6 µg/mg. Estos valores se situaron por encima de los valores medios obtenidos normalmente por el laboratorio del centro INRA Avignon en las extracciones de proteínas de fruto de tomate, lo que muestra la buena adaptación del protocolo de Faurobert y col. (2007) en el laboratorio del IHSM La Mayora. Figura 3.7. Número de frutos agrietados y no agrietados respecto al número total de frutos, en las líneas 177R6 y 177R4, bajo los tratamientos cubierto (CUB) y no cubierto (NoCUB). Figura 3.8. Gel bidimensional teñido con azul de Coomassie coloidal que recopila todos los spots encontrados en los diferentes ensayos. En el eje horizontal se relacionan los valores de punto isoeléctrico. En el eje vertical el peso molecular en KDa.
Capítulo 3. Fisiopatía de la mancha solar: genética y proteómica. 141 El análisis de imagen de los geles con el software Progenesis SameSpot detectó una media de 1700 spots/gel (Figura 3.8). Entren ellos se encontraron un total de 71 spots significativamente variables entre las condiciones del ensayo (Figura 3.9). De los 71 spots, 26 fueron detectados en el estado verde, aunque sólo 25 fueron significativos en el ANOVA, y 45 fueron detectados en el estado rojo, de los que 43 fueron significativos en el ANOVA. Figura 3.9. Detalle de un gel bidimensional analizado con el software SameSpot en el que se observa un spot diferencial entre los genotipos resistente (R) y sensible (S). Ambos spots parecen tener el mismo peso molecular, pero diferente punto isoeléctrico. El programa emplea un código de color para facilitar el análisis, en este caso asignó verde al del resistente y morado al del sensible. Figura 3.10. Diagrama de color que representa los niveles de expresión de los spots significativamente variables, detectados en las muestras en el estadío verde maduro (A) y rojo maduro (B), representado por el software TMEV. Tonos de rojo: mayor expresión del spot. Tonos de verde: menor expresión y ausencia del spot. En el eje horizontal aparece la identificación de las muestras. R: Resistente vs. S: Sensible. C: Cubierto vs. NC: No cubierto. B: Bottom (zona apical) vs. S: Shoulder (zona peduncular). Los números del 1 al 3 indican la réplica de la muestra. En el eje vertical se detallan los códigos de cada spot detectado. Encuadrado en azul oscuro los spots con diferencia de expresión debidas al genotipo. Encuadrado en azul claro los spots con diferencia de expresión según la zona del fruto. Encuadrado en morado los spots con diferencia de expresión debidas al tratamiento.
Genética de la fisiopatía de la mancha solar del fruto de tomate 142 3.3.3. Agrupación jerárquica de los spots variables Se aplicó el software TMEV a los resultados obtenidos en el programa SameSpot y se obtuvieron los diagramas de color para los dos estadíos verde maduro y rojo maduro (Figura 3.10). A B