Efectos clínicos del suero autólogo y de sangre de cordón en el ojo seco

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE OFTALMOLOGÍA Efectos clínicos del suero autólogo y de sangre de cordón en el ojo seco MEMORIA PARA ACCEDER AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR: MARINA RODRÍGUEZ CALVO DE MORA DIRECTORES: PROF. D. ANTONIO MORENO GUERRERO DR. D. ISIDRO PRAT ARROJO Málaga, 2015 AUTOR: Marina Rodríguez Calvo de Mora http://orcid.org/0000-0002-5513-8790 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es 3 Agradecimientos A los doctores Moreno Guerrero y Prat Arrojo por su respaldo y apoyo incondicional. A los doctores Fernández-Baca Casares y Villalvilla Castillo, jefes pasado y presente del Servicio de Oftalmología del Hospital Regional de Málaga, por animarme a perseverar. Al Dr. Rodríguez Moreno por su ayuda inestimable en las tareas logísticas, y sobre todo, por su apoyo y cariño constantes mientras elaboraba este trabajo. A los Dres. Domínguez Ruiz y Barrero Sojo por su asistencia en la revisión de los pacientes. Y en general, a todos mis compañeros del Servicio de Oftalmología, sin los que hubiera sido mucho más complicado elaborar el presente trabajo. A los miembros del Centro Regional de Transfusión Sanguínea de Málaga, en especial a la Dra. Hernández Lamas y la Dra. Antúnez Rodríguez por profesionalidad y su buen hacer. A la Fundación Pública Andaluza para la Investigación de Málaga en Biomedicina y Salud (FIMABIS), en especial a la Sra. Patricia Vergara por la colaboración en la consecución de este ensayo clínico y a la Sra. Rita González, por el análisis estadístico. A todos los miembros del Netherlands Institute for Innovative Ocular Surgery (NIIOS) de Rotterdam, por hacer los ocho meses de aprendizaje intensivo en investigación clínica un periodo satisfactorio y fértil. Al Dr. Juan Domínguez Martínez, profesor titular de la Universidad de Málaga en el departamento de Estadística, por el desinteresado y complicadísimo cálculo del número muestral. A la Asociación de Síndrome de Sjögren por incluirme en sus actividades divulgativas y colaborar en el reclutamiento de pacientes. Y, por supuesto, a los pacientes, sin los que este trabajo no sería posible ni tendría sentido. 4 5 El trabajo de investigación aquí presentado ha sido financiado a través de una beca concedida por el Ministerio de Sanidad en el marco de las Ayudas para la Investigación Clínica Independiente de 2011 (EC11-506), cuyo promotor es la Fundación Pública Andaluza para la Investigación de Málaga en Biomedicina y Salud (FIMABIS). 6 7 Índice 8 Índice 1. Importancia y justificación del trabajo………………………………………15-21 1.1. Contexto……………………………………………………………….15 1.2. Antecedentes…………………...……….....……………………….….15 1.3. Justificación del estudio………………….…...……………….………18 1.4. Hipótesis………….…………………………………………...............19 1.4.1. Hipótesis específicas…...…………...……………………….19 1.4.2. Preguntas de investigación…………………………...……...19 1.5. Objetivos…………………………………...…………...................19-20 1.5.1. General…………………………...………………………….19 1.5.2. Específicos………..…………...…………………………….19 1.6. Síntesis y abstract……….…………..…………………….….…...20-21 2. Introducción…...……..………………………………………………….…..23-86 2.1. Breve repaso histórico………………………………...………...…23-26 2.1.1. Periodo hipocrático……...……………………...…………...23 2.1.2. Periodo sjögrénico…………………...……………...…........24 2.1.3. Descubrimiento del ojo seco leve…………...……...……….25 2.2. La superficie ocular y la película lagrimal……….…….………….26-40 2.2.1. Recuerdo anatómico y fisiológico……………...…....….26-33 2.2.1.A. Anejos oculares………………...…………............27 2.2.1.B. Glándulas lagrimales………...………….………...27 2.2.1.C. Conjuntiva………...………………………………27 2.2.1.D. Limbo……………...……………………….……..29 2.2.1.E. Córnea…………………………...……...…………29 2.2.2. La secreción lagrimal…………………………………….33-38 2.2.2.A. Funciones……………………………...………….33 2.2.2.B. Componentes……………………...………………34 2.2.2.C. Propiedades físico-químicas………………………36 2.2.2.D. Estructura…………………...…………...………..36 9 2.2.3. La unidad funcional lagrimal…………………………….38-40 2.2.3.A. Funciones………………………………...……….38 2.2.3.B. Componentes…….……………………...………...39 2.2.3.C. Aparato y secreción lagrimal……………………...39 2.2.3.D. Inervación y mecanismo de lagrimación……….…40 2.3. Síndrome de ojo seco……………………………...…………...….40-53 2.3.1. Introducción.……...……………………….………....……...40 2.3.2. Epidemiología del ojo seco.…………………...…...………..41 2.3.3. Clasificación del ojo seco……………...………………...42-52 2.3.3.A. Clasificación etiológica del ojo seco…………...…42 2.3.3.B. Clasificación fisiopatológica…………..........…45-48 2.3.3.B.1. Ojo seco acuo-deficiente………………...45 2.3.3.B.2. Ojo seco evaporativo……………............48 2.3.3.C. Fisiopatología del síndrome de ojo seco……….....49 2.3.3.D. Clasificación según estadío de gravedad……….....51 2.4. Impacto del ojo seco ……………………………………..…………...53 2.5. Diagnóstico del ojo seco………………...…………..………...…...53-63 2.5.1 Pruebas complementarias………...……...............…….…54-63 2.5.1.A. Tiempo de rotura lagrimal...…..………...………...54 2.5.1.B. Test de Schirmer.………………...………..............55 2.5.1.C. Tinción córneo-conjuntival ….………………...…55 2.5.1.D. Citología de impresión conjuntival.…………........58 2.5.1.E. Otros métodos diagnósticos …….………….……..60 2.5.2. Síntomas clínicos de ojo seco ………………...…………….62 2.5.3. Cuestionarios……………………………………...…………63 2.6. Tratamiento del ojo seco…………………………………….…….64-71 2.6.1. Ojo seco grado 1…………………………...………..………64 2.6.2. Ojo seco grado 2…………………………...………………..67 2.6.3. Ojo seco grado 3………………………………...…………..70 2.6.4. Ojo seco grado 4………………………………...………..…70 2.7. Antecedentes y estado actual del tema de estudio………...…….…71-84 2.7.1. Suero autólogo…………………………………….…......71-81 2.7.1.A. Efectos biológicos ……………..…………............76 2.7.1.B. Efectos sobre el ojo seco ……………………..…..78 16 (tapones lagrimales, tarsorrafia, trasplante de membrana amniótica, trasplante de glándulas salivares...). A pesar del tratamiento, muchos pacientes siguen presentando signos y síntomas de ojo seco. El uso de sustancias que aporten no sólo hidratación sino nutrición y factores de crecimiento constituye una alternativa esperanzadora. Los efectos terapéuticos de la aplicación del colirio suero autólogo (SA) a pacientes se conocen desde 1984 gracias a los trabajos de Fox (4), que describió su experiencia en enfermos con queratoconjuntivitis. A pesar de ello, el pobre conocimiento de su mecanismo de acción a nivel de la superficie ocular, hizo que su utilización fuese escasa hasta finales de los años 90 gracias a los trabajos de Tsubota (5). El mecanismo de acción del SA se basa principalmente en su propiedad lubricante, pero lo que lo hace especialmente interesante es su concentración en vitaminas A y E, factores de crecimiento y fibronectina (6,7), que promueven el trofismo celular del epitelio corneal interviniendo en su regeneración (5,8). El SA presenta pH y osmolaridad similares a la lágrima y, además, cuenta con componentes de acción epiteliotrófica en concentraciones superiores a la misma. Gracias a estas propiedades podemos afirmar que el SA no sólo actúa humidificando la superficie sino que además aporta factores nutricionales y de crecimiento necesarios para mantener la viabilidad celular en los procesos de reparación epitelial. Se piensa que estos factores son los responsables de los efectos terapéuticos observados. Posee asimismo componentes bactericidas, disminuyendo el riesgo de contaminación e infección. En los últimos años, el empleo del SA se ha ido extendiendo debido al aumento de patologías susceptibles de su indicación, así como la disponibilidad de bancos de tejidos dotados de la infraestructura necesaria para su preparación dentro de un sistema de calidad implantado. Así, el SA constituye hoy día una alternativa terapéutica eficaz para el tratamiento de las enfermedades de la superficie ocular no respondedoras a tratamiento convencional (9,10,11), empleándose con éxito en numerosas patologías además del ojo seco: Defectos epiteliales persistentes (12), erosiones recurrentes (13,14,15), úlceras neurotróficas (16), Enfermedad Injerto Contra Huésped (17), queratopatía anirídica (18), queratoconjuntivitis límbica superior (19), cirugía vítreo-retiniana de agujeros maculares (20,21,22), etc. 17 Noble (23) describe en sus estudios que el SA es superior a la terapia convencional para el tratamiento de las patologías de la superficie ocular. El Subcomité para el Manejo y Tratamiento de Ojo Seco del Taller Internacional de Ojo Seco (24), lo incluye entre las terapias recomendadas para el estadío moderadograve o no respondedor a terapia convencional. En el servicio de Oftalmología del Hospital Regional Universitario de Málaga se está indicando el empleo de SA desde el año 1999, elaborado por el Banco Sectorial de Tejidos. Desde el año 2013, se ha tratado a más de1.600 pacientes con diversas patologías oftalmológicas, siendo la más frecuente el SOS. Entre los inconvenientes de la aplicación del SA se encuentran la frecuencia en el número de extracciones de sangre y la posibilidad de que el paciente padezca una enfermedad infecciosa, con la consiguiente posibilidad de contagio. Hay enfermos que no son candidatos a la extracción periódica de sangre: insuficiencia cardiaca, mal estado general, anemia, discrasias sanguíneas, niños, pacientes psiquiátricos, tratamiento quimioterápico y padecimiento de enfermedades autoinmunes que puedan alterar la calidad y eficacia del suero. Los enfermos diabéticos, con enfermedades autoinmunes, colagenosis y aquellos con infección activa por VHC y VIH, presentan, con frecuencia, signos y síntomas de ojo seco severo, cuya respuesta al tratamiento convencional suele ser pobre. Las características del colirio de suero heterólogo (SH) no difieren del autólogo y pueden resultar beneficiosas en aquellos enfermos que presenten ciertas limitaciones en la extracción de su propio suero. Desde el comienzo del empleo de SA en el Hospital Regional Universitario de Málaga, se ha aplicado también SH a más de 1.200 pacientes. El suero procedía de donantes de sangre habituales de grupo sanguíneo AB, previo consentimiento informado sobre los fines de esa donación. Recientemente se ha realizado un estudio planteando la necesidad de valorar ambos grupos de pacientes mediante un cuestionario de autoevaluación antes y después de la utilización de SA y SH (25). Los resultados se presentaron en el Congreso Internacional de Banco de Tejidos en Barcelona, 2011 (26). Yoon (27,28,29) investigó la eficacia del suero procedente de sangre de cordón umbilical (SCU) en pacientes con ojo seco severo comparando los efectos clínicos y los niveles de componentes esenciales con el suero elaborado a partir de sangre periférica. El SCU presenta según este autor mayor cantidad de moléculas 18 tróficas y tras su empleo se obtienen mejores resultados clínicos. Sin embargo se trata de series cortas. No existen en la actualidad estudios aleatorizados ni con el suficiente número de pacientes para afirmar qué fuente de obtención es la mejor para el tratamiento del ojo seco. Sin embargo, las publicaciones de Yoon y la existencia en Málaga del primer Banco de Sangre de Cordón Umbilical de Europa en número de unidades almacenadas, han propiciado este ensayo que compara el efecto clínico de los dos tipos de sueros: SA y SCU. 1.3. Justificación del estudio Este estudio clínico surge de la necesidad de encontrar nuevas terapias para el ojo seco grave, especialmente para aquellos pacientes en los cuales el empleo del SA no está indicado. La justificación del presente trabajo puede resumirse en: a. La frecuencia del ojo seco y su insatisfactorio tratamiento produce el consecuente impacto en la calidad de vida de los pacientes y en la economía de los países desarrollados. b. El empleo del SA como tratamiento del ojo seco está actualmente estandarizado. Sin embargo, existen pacientes a los que no es posible o no conviene su aplicación. c. Los estudios realizados por Yoon son prometedores pero insuficientes. Consideramos necesarios los estudios prospectivos en forma de ensayo clínico para verificar el efecto terapéutico del SCU. d. En el presente ensayo clínico, se plantea un enfoque novedoso: se comparan los efectos clínicos del SCU en casos de SOS moderado-grave con la terapia con SA. Si los efectos del SCU igualan o superan en eficacia a la aplicación tópica del SA, podría aumentarse el arsenal terapéutico disponible para dicha patología. 1.4. Hipótesis 19 1.4.1. Hipótesis específicas 1. La aplicación tópica cinco veces al día de SA mejora los signos y síntomas derivados del ojo seco en el plazo de tres meses de tratamiento. 2. La aplicación tópica cinco veces al día de colirio SCU mejora los signos y síntomas derivados del ojo seco en el plazo de tres meses de tratamiento. 3. No inferioridad del SCU frente al SA en el tratamiento del ojo seco moderado-severo. 4. No inferioridad en la concentración de factores de crecimiento del SCU frente a SA. 1.4.2. Preguntas de investigación 1. ¿Es el colirio de SCU igual de eficaz que el colirio de SA para el tratamiento del ojo seco? 2. ¿Se podría utilizar, una vez probada la eficacia del colirio SCU, como alternativa al SA para estos pacientes? 3. ¿Difieren las concentraciones de factores de crecimiento, neurotróficos, vitaminas y otras moléculas en cada uno de los sueros comparados con la lágrima? 4. ¿Difieren las concentraciones de factores de crecimiento, neurotróficos, vitaminas y otras moléculas entre SA y SCU? 1.5. Objetivos 1.5.1. General Comprobar la eficacia del SCU en el tratamiento del ojo seco moderado-severo. 1.5.2. Específicos 1. Medir los efectos del SA y SCU sobre la película lagrimal y la superficie ocular a lo largo de los tres meses de tratamiento del estudio, mediante las pruebas objetivas (test de Schirmer, BUT, tinción con fluoresceína, tinción 20 con verde de lisamina) y los síntomas, mediante el cuestionario validado de Donate. 2. Comparación de los efectos clínicos sobre la película lagrimal y la superficie ocular del SA y SCU entre sí mediante las pruebas objetivas (test de Schirmer, BUT, tinción con fluoresceína, tinción con verde de lisamina) y los síntomas, mediante el cuestionario validado de Donate. 3. Caracterización y cuantificación en las dos modalidades de suero de : • Proteínas: albúmina, fibronectina. • Vitamina A. • Vitamina E. • IgG, IgA, IgM. • Factor β Transformante del Crecimiento de Fibroblastos (TGF-β). • Factor de Crecimiento Epitelial (EGF). 1.6. Síntesis y abstract El término síndrome de ojo seco (SOS), representa un grupo variado de afecciones que se caracterizan por disminución en la producción de lágrima o a una evaporación anormalmente rápida de la película lagrimal, con el resultado de molestias y secuelas oculares de diverso grado. El SOS, es una patología multifactorial muy prevalente que afecta del 8 al 33% de la población. A pesar de las múltiples terapias y técnicas quirúrgicas que se emplean en la actualidad para tratarlo, existe un porcentaje elevado de pacientes en que dichos tratamientos resultan insatisfactorios. El SA, que se realiza a partir de la sangre del propio paciente, ha demostrado ser útil en el tratamiento del ojo seco refractario y otras muchas patologías oftalmológicas de la superficie ocular, debido a que contiene factores de crecimiento y moléculas esenciales para la regeneración epitelial y el trofismo corneal en mayor concentración que en la lágrima. Sin embargo, existen pacientes que no son candidatos a la extracción periódica de sangre o bien precisan el tratamiento con urgencia debido a una patología grave de la superficie ocular y, por tanto, el SA no es una opción 21 terapéutica. Recientemente se han realizado estudios piloto empleando SCU con resultados esperanzadores. Según los datos arrojados por dichos trabajos, este suero contendría más factores de crecimiento que el SA. En este ensayo clínico pretendemos comparar los efectos de los dos tipos de suero, SA y SCU, en el tratamiento del ojo seco y determinar los factores de crecimiento, factores neurotróficos, vitaminas y otras moléculas esenciales para la nutrición de la superficie ocular en dichos sueros y valorar la introducción de nuevas opciones de tratamiento para el ojo seco. The dry eye syndrome (DES) is a group of ocular illnesses that have in common the ocular discomfort and the diminished tear secretion or the abnormal evaporation of the tear film. The DES is a multifactorial and frequent condition: depending on the series, from 8 to 33% of the population is affected. The signs and symptoms can vary greatly, from occasional pain and redness to severe conditions of the ocular surface. Despite of the multiple treatments available, a high percentage of patients do not show improvement or experience sequelae. The autologous serum (AS) eye drops are prepared from the patient’s own blood. AS eye drops have shown to be useful in refractory DES and other conditions of the ocular surface. However, there are some patients with severe DES that are not candidates for blood extraction, because of their physical condition, contagious illnesses or lack of collaborative attitude. Apart from avoiding the periodical blood extraction needed for AS treatment, promising results have been published regarding the use of umbilical cord blood serum (UCBS) eye drops, that may have a higher percentage of growing factors than the AS. With this clinical trial we intend to compare the clinical effects of the AS and the UCBS eye drops and quantify the growing factors, vitamins and other essential molecules for the ocular surface homeostasis, in order to explore new therapies for the DES. 22 Introducción 23 2. Introducción 2.1. Breve repaso histórico El ojo seco es una patología que se conoce desde la antigüedad. Murube (30) divide en tres periodos las historia del ojo seco: a) Hipocrático o del ojo seco grave, b) Sjögrénico o del descubrimiento del ojo seco medio y c) Periodo del siglo XXI o del descubrimiento del ojo seco leve. 2.1.1. Periodo hipocrático La sangre y otros fluidos humanos (leche materna, placenta, saliva, orina y excrementos) han sido empleados desde la antigüedad para el tratamiento de diversas afecciones. El papiro de Ebers es uno de los tratados médicos conocidos más antiguos y mejor conservados. Redactado en el antiguo Egipto en el año 1534 antes de nuestra era, menciona numerosas enfermedades oftalmológicas y sus respectivos tratamientos, entre los que se encuentra el uso de la sangre en forma tópica para tratar el enrojecimiento ocular o la pérdida de visión (31, 32). En la antigua Grecia se acuñó el término “xeroftalmía” (de xérós, seco, ophthalmos, ojo e -ía, sufijo de enfermedad) para aquellos ojos con una sequedad absoluta de la superficie ocular y alteraciones corneales irreversibles que provocaban ceguera. Hipócrates (460-375 a.C.) clasificaba las patologías oculares en húmedas y secas y consideraba que éstas últimas eran más graves y estaban ocasionadas por los “humores” del paciente y el ambiente (33). Durante el Imperio Romano el ojo seco se denominaba lippitudo arida o lippitudo sicca (legañosidad u oftalmía seca). Se han encontrado sellos (sigilla "ad siccam lipp") que regulaban la prescripción de colirios para estos ojos secos graves (33). Aulo Cornelio Celso (25 a. C. - 50 d. C.) describe la “oftalmia seca” en su tratado De Re Medica como una enfermedad en la que no se produce lagrimeo ni tumefacción y en la que se da hiperemia, pesadez y picor, así como adherencia palpebral durante la noche. Galeno (130-200 a.C.) distinguía dos enfermedades que hoy podemos 24 considerar como ojo secos (33): la sklerophthalmia (del griego, sklerós, que significa “duro”) en la que el ojo estaba endurecido y poco móvil y la xerophthalmia, que cursaba con molestias, picor y lágrima “salmuera y nitrosa” (33). Pablo de Egina (s. VII d.C.) en su obra Hypomnema recogía el concepto de Galeno y definía el ojo asociado a la escleroftalmía como duro, doloroso, hiperémico y con limitación a la movilidad. En el siglo XVII siguen vigentes los postulados de los médicos clásicos. Plenk dividió el ojo seco en cuatro clases: exhastaustorum, itinirerarium, febrile e inflammatorium. Según Murube, podrían deberse a etiologías nutricionales las dos primeras clases y a síndromes tipo Stevens-Johnson y conjuntivitis cicatriciales la tercera y cuarta causa, respectivamente (30). 2.1.2. Periodo sjögrénico El periodo sjögrénico se inició en el siglo XIX. La medicina de este periodo adopta un carácter más científico, con un continuo desarrollo de nuevas técnicas y conceptos. Se investiga en diversos campos y surgen destacados médicos y científicos como Virchow, Rokitanski, Claude Bernard, Luis Pasteur, Robert Koch, Purkinje, Addison, Santiago Ramón y Cajal, etc. Se identifican los ojos secos menos graves, por lágrima insuficiente cuya merma provocaba alteraciones reversibles en la superficie ocular. Surgieron entonces por parte de los grandes oftalmólogos de la época nuevas denominaciones para designar los síntomas y signos que observaban en la práctica clínica (30), tales como la xerosis epitelialis descrita por Raymond, la keratopathia filamentosa acuñada por Leber o keratitis sicca observada por Duke-Elder. Henrik Samuel Conrad Sjögren (1899-1986) definió el término keratoconjunctivitis sicca en su tesis doctoral “Zur Kenntnis der keratoconjunctivitis sicca”, basándose en cuatro casos que había publicado anteriormente. Curiosamente, su trabajo doctoral no obtuvo la calificación suficiente como para permitirle en ese momento acceder a los estudios de oftalmología. Gougerot, en 1925, y Houwer, en 1927, habían descrito parcialmente la entidad (de hecho, algunos autores como Paganoni denominaron el Síndrome como de Gougerot-Houwers-Sjögren). Sin embargo, fue Sjögren el que más datos 25 clínicos e histológicos aportó al conocimiento de este síndrome y el que propuso su naturaleza generalizada, asociado a enfermedades del tejido conectivo (34). 2.1.3. Descubrimiento del ojo seco leve En la última mitad del siglo pasado se detecta el ojo seco leve, sintomático, pero sin signos claros en la exploración. En 1950, von Rötth introdujo el término “Dry Eye” para cualquier tipo de insuficiencia de las glándulas lagrimales. Wolf introdujo el concepto de la película lagrimal constituida por tres capas diferenciadas: mucinosa, acuosa y lipídica, cada una de las cuales presentaba una función específica. Posteriormente se introdujo el concepto de alteración de la estructura trilaminar de la película lagrimal causada por acuodeficiencia (35), mucodeficiencia (36), lipodeficiencia (37) o epiteliopatía (38). Por su parte, Thoft y Fiend (39) concebían la película lagrimal como parte funcional y anatómica de la superficie ocular y Stern (40) concluye en su artículo que la unidad funcional lagrimal estaba constituida por las glándulas lagrimales, la superficie ocular y sus interconexiones nerviosas. Paralelamente diversos estudios ponen de manifiesto el papel clave de la reacción inflamatoria en la génesis y cronificación del proceso, descrita con anterioridad en el ojo seco asociado al síndrome de Sjögren pero sin un protagonismo destacable hasta el momento en ojos secos no relacionado con el síndrome de Sjögren (34). En el siglo XX hubo nuevos intentos para emplear el suero en diversas concentraciones y formulaciones como terapia para la sequedad de la superficie ocular (31), entre los que que podemos citar a Fromaget (1930), Rucker (1938), Hamilton (1940), Grawitz (1960) y Bisantis (1976). Los trabajos de Fox (4), en 1984, contribuyeron al conocimiento de su mecanismo de acción. En nuestro país, el empleo de derivados hemáticos para el tratamiento de patologías oculares ha suscitado un gran interés en las últimas dos décadas, dando lugar a gran número de publicaciones entre las cuales se pueden destacar las de Alió (41,42,43), Alvarado Valero (44), Bosch-Valero (7), del Castillo (13), López-García (9,11) Díaz Llopis (45), García Gómez (46), López-García (9,18) y López-Plandolit (47). Surge entonces la necesidad de una clasificación y una sistematización del 32 Es una monocapa de células planas hexagonales sin capacidad mitótica “in vivo” probada cuya densidad va disminuyendo gradualmente conforme avanza la edad: desde las 3.500-4.000 células/mm2 al nacer hasta las 2.5003.000 células/mm2 de una córnea adulta sana. Cuando se daña una porción de endotelio, las células vecinas aumentan de tamaño y suplen a las células alteradas. La función del endotelio radica en impedir la hidratación del estroma mediante el bombeo en contra de gradiente del humor acuoso, manteniendo así el equilibrio hídrico de la córnea. Esa función se puede mantener con una densidad de hasta 600 células/mm2. Por debajo de 500 células/mm2 se produce edema del estroma y se altera por lo tanto la transparencia corneal. c) Privilegio inmunológico. La reacción frente a antígenos extraños (incluido el transplante corneal) se encuentra disminuida. Esto se debe a los siguientes factores (51): • Ausencia de vasos sanguíneos y linfáticos y por lo tanto de células inmunes. • Existencia de factores inmunoreguladores de acción depresora en la córnea, como el Factor de Crecimiento Transformante Beta (TGF-β) y la Hormona Alfa Estimuladora de los Melanocitos (α-MSH). • Expresión del ligando Fas en las células corneales, que actúa induciendo la apoptosis de los linfocitos activados. d) Inervación. La córnea es el tejido más densamente inervado del organismo. Se calcula que en la córnea posee una inervación sensitiva 300 veces mayor que la de la piel y 80 veces del tejido dentario (56). La inervación sensitiva de la córnea (50,53) tiene lugar a través de las ramificaciones de los nervios ciliares largos, ramas del V par craneal, y probablemente con participación de los nervios ciliares posteriores cortos, ramas del nervio nasociliar. Los nervios penetran a través del estroma corneal en las zonas nasal y temporal, discurren paralelos a las fibras de colágeno, pierden su vaina de mielina, disminuyen de diámetro y se ramifican, formando así el plexo estromal anterior. Posteriormente, atraviesan la membrana de Bowman para formar un plexo denso a nivel subepitelial, que constituye el plexo sub-basal. Finalmente, terminan 33 su trayecto entre las células epiteliales como terminaciones libres epiteliales (56). Casi todas las células basales están en contacto con un nervio. Estas terminaciones nerviosas superficiales responden a estímulos mecánicos, térmicos y químicos. Actúan liberando neurotransmisores que regulan el metabolismo de las células epiteliales. Asimismo, ramas recurrentes de estos nervios inervan el limbo y la conjuntiva circundante. e) Trofismo corneal. Los neurotransmisores liberados desde las terminaciones nerviosas superficiales regulan el trofismo corneal, desde el metabolismo hasta la diferenciación celular. La denervación corneal produce las siguientes alteraciones en la superficie ocular: • Altera la mitosis de las células basales del epitelio corneal, disminuyendo la posibilidad de recambio celular. • Provoca la disminución de las microvellosidades del glicocálix y por tanto la pérdida de adherencia de la película lagrimal. • Disminuye la frecuencia del parpadeo por disminución de la respuesta a estímulos (hipoestesia corneal). 2.2.2. La secreción lagrimal La película lagrimal es de importancia capital para la visión y la integridad de la superficie ocular. 2.2.2.A. Funciones La película lagrimal presenta una cuádruple función: • Óptica. La interfase de la película lagrimal precorneal-aire es la superficie refractiva inicial del ojo, necesaria para una óptima calidad visual. • Mecánica. La lágrima lubrica la superficie ocular, diluye y elimina los agentes nocivos y facilita la llegada de los leucocitos a la córnea. • Nutricia para la córnea. Gracias a los factores de crecimiento fundamentales para la homeostasis del 34 epitelio y la permeabilidad al oxígeno. • Antibacteriana. Debido a la multitud de moléculas antimicrobianas que contiene. 2.2.2.B. Componentes Se estima que la lágrima contiene más de 500 tipos de proteínas (56). La composición de la película lagrimal debe mantenerse dentro de límites cuantitativos y cualitativos bastante estrechos para preservar la integridad y el funcionamiento correcto del sistema visual. Las anormalidades de la película lagrimal que afectan a sus componentes o a su volumen provocan disfunción grave de los párpados y la conjuntiva, con pérdida simultánea de la transparencia corneal. Se mencionan a continuación algunas de las moléculas contenidas en la secreción lagrimal que desempeñan una función más destacada (56, 57): a) Factores de crecimiento: • Factor de Crecimiento Epitelial (EGF). Acelera el proceso de migración de las células epiteliales contando con efectos antiapoptóticos. Se ha mostrado efectivo en la curación de erosiones epiteliales. • Factores de Crecimiento Transformante Beta (TGF-β1 y TGF-β2) Implicados en los procesos de reparación epitelial y estromal. El TGF-β1 también se considera una citoquina anti-inflamatoria. • Factor de Crecimiento Transformante Alfa (TGF α), Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), Factor de Crecimiento Básico de Fibroblastos (FGF2), Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF). Implicados en procesos de respuesta a lesión epitelial. • Factor de Crecimiento Derivado de las Plaquetas (PDGF). Su isoforma AB se activa intracelularmente mientras es secretada por los gránulos alfa de las plaquetas y favorece la mitosis y la cicatrización. • Factor de Crecimiento Insulin-like 1 (IGF-1). Implicado en la migración y adhesión del epitelio corneal. • Factor de Crecimiento Neuronal (NGF). Importante para la neurogénesis. 35 b) Moléculas con actividad antimicrobiana: • IgG, IgE, leucocitos, y factores del complemento. Aportan efecto bacteriostático y bactericida. • IgA secretora. Minimiza la adherencia de las bacterias a la mucosa, neutraliza virus y toxinas en la lágrima y regula el desarrollo de la flora normal. • Lisozima. Actúa hidrolizando uniones de la pared celular de las bacterias Gram negativas y ciertos hongos, provocando la lisis celular. • Lactoferrina. Capta hierro, privando así por competencia a las bacterias Gram +, que precisan del hierro para su metabolismo. Potencia la función de los linfocitos Natural Killer (NK). • Ácidos grasos de cadena corta y larga. Desestabilizan la membrana celular bacteriana e inhiben el metabolismo bacteriano, respectivamente. • Lipocalina, lipofilina, catepsinas, metaloproteinasas y fosfolipasa A2. c) Moléculas esenciales para apoyar la proliferación, migración y diferenciación de los epitelios córneo-conjuntivales: • Fibronectina. Capital en la migración celular. • α-2 macroglobulina. Presenta actividad anticolagenasa. • Albúmina. Posee actividad antiapoptótica. • Vitamina A. Previene los procesos de metaplasia escamosa epitelial. • Sustancia P y calcitonina. Implicadas en la migración y adhesión del epitelio corneal. La falta de estos factores epiteliotróficos puede derivar en una afectación severa de la superficie ocular. 2.2.2.C. Propiedades físico-químicas Propiedades físico-químicas más importantes de la lágrima (50,56,57): • Grosor de la película lagrimal. Se ha estimado clásicamente en unas 7-9 µm. 36 Sin embargo, los estudios de Prydal (58) con microscopía confocal e interferometría hablan de un grosor de 40 µm. Por su parte, King-Smith (59), empleando la técnica de reflexión espectral, encuentra una película lagrimal de unas 3 µm. • Volumen. De 6-9 μl. • pH. Entre 6,5 – 7,6. • Osmolaridad. Entre 302 ± 9,7 mOsm/L (60). • Na+ y K+. Mayor concentración que en el plasma. • Glucosa. Menor concentración que en el plasma. 2.2.2.D. Estructura La división de la película lagrimal en tres estratos se conoce desde 1892 gracias a Terson, pero fue Wolf en 1946 quien postuló que la película lagrimal está constituida por tres capas perfectamente diferenciadas: mucinosa, acuosa y lipídica, cada una de las cuales con una función específica (34, 61). Esta presunta estructuración estratigráfica, que ha permanecido casi inalterada desde su descripción inicial, está siendo sometida actualmente a revisión ya que, según diversos estudios, las capas mucinosa y acuosa no existirían con independencia sino como una mezcla con la consistencia de un gel, con la mucina más concentrada en la interfase epitelial (62). A continuación se describen las características de las capas de la película lagrimal (50,56,62,63). Con fines esquemáticos, se describe la película lagrimal tradicional, compuesta por tres capas, aunque, como se ha comentado, esta división no es estricta, sino que las tres capas forman un continuum: a) Capa lipídica. • La más exterior. Muy delgada (15-157 ηm de grosor [60]). Producida por las glándulas sebáceas modificadas de Meibomio (y en menor medida por las glándulas de Moll y Zeiss), constituye una mezcla de fosfolípidos hidrofílicos (polares) y ceras, ésteres de colesterol y triglicéridos hidrofóbicos (no polares) en estado líquido a la temperatura de la superficie ocular. Los lípidos hidrofílicos están en contacto con la capa acuosa y los hidrofóbicos hacia la interfase aérea. 37 • Funciones: o Retrasar la evaporación de la lágrima. o Mejorar su estabilidad, manteniendo la tensión superficial de la película lagrimal (actúa como surfactante). o Contener el menisco lagrimal. • La disfunción de las glándulas de Meibomio (DGM) es una causa frecuente de película lagrimal inestable y produce un Ojo Seco Evaporativo (OSE). b) Capa acuosa. • La capa intermedia y mayor volumen (6’5 μm de grosor). Secretada por las glándulas lagrimales principales (sitas en la órbita) y secundarias de Krause y Wolfring (sitas en la conjuntiva). Se compone de agua, electrolitos, mucinas y proteínas disueltas, así como factores de crecimiento y citocinas. También aparecen las células epiteliales descamadas del epitelio corneal y conjuntival y algunas células derivadas del tejido linfoide y los vasos sanguíneos (51). • Funciones: o Transporte de los nutrientes hidrosolubles. Para la nutrición corneal. o Protección. Elimina deshechos, permite el paso de células inmunitarias tras una lesión y posee función antibacteriana. o Proporcionar una superficie óptica lisa a la córnea. • La deficiencia de lágrima acuosa o Ojo Seco Acuo-Deficiente (OSAD) es una causa frecuente de ojo seco. c) Capa mucínica. • Es la capa más interna. Tiene unas 0’2-0’5 μm de grosor. Las mucinas son glucoproteínas de alto peso molecular, producidas por las células caliciformes conjuntivales. Conforman el glicocálix de las microvellosidades de las células epiteliales de la córnea, comportándose como moléculas antipáticas (adhieren tanto moléculas hidrofílicas como hidrofóbicas). La correcta secreción de las mucinas depende de la presencia de la vitamina A y los retinoides, pero también son secretadas en respuesta a la irritación de la superficie ocular por mediadores inflamatorios, traumas o toxinas, de modo que en los procesos inflamatorios agudos aumenta la 38 densidad de células caliciformes. Por el contrario, en los procesos inflamatorios crónicos o cicatriciales (síndrome de Sjögren, penfigoide, síndrome de Stevens-Johnson, quemaduras oculares…), disminuye la densidad de células caliciformes. • Funciones: o Adherir la película lagrimal al epitelio corneal. o Mejorar la capacidad de diseminación de la capa acuosa sobre el epitelio corneal. o Regular la tensión superficial. o Lubricar y proteger las células epiteliales. o Convertir el epitelio corneal en una superficie hidrofílica. o Favorecer la captura y arrastre de cuerpos extraños, detritus y microorganismos, atrapar factores tróficos, leucocitos y citocinas. • Su deficiencia provoca formas graves de ojo seco, ya sea de tipo evaporativo (OSE) o hiposecretor (OSAD). 2.2.3. La unidad funcional lagrimal La Unidad Funcional Lagrimal (UFL) es un sistema integrado complejo que controla los componentes principales de la película lagrimal de forma regulada y responde a influencias medioambientales, endocrinas y corticales. 2.2.3.A. Funciones • Secreción y eliminación del fluido lagrimal mediante el aparato lagrimal. • Regulación neurogénica de la secreción lagrimal. • Preservación de la integridad de la película lagrimal y la transparencia de la córnea mediante el mantenimiento del epitelio de la superficie ocular y el estroma subyacente (51). 2.2.3.B. Componentes La UFL está compuesta por: • Las glándulas lagrimales. • La superficie ocular (córnea, conjuntiva y glándulas de Meibomio). 39 • Los párpados y demás anejos. • Los nervios sensoriales y motores que los conectan y posibilitan el parpadeo (62). 2.2.3.C. Aparato y secreción lagrimal La película lagrimal se secreta y mantiene gracias a un sistema elaborado: el aparato lagrimal, que tiene componentes secretores, de distribución y excretores (56). a) Componente secretor. Comprende: la glándula lagrimal (produce alrededor del 95% de la secreción), el tejido glandular accesorio, las glándulas sebáceas de los párpados, las células caliciformes y otros elementos secretores de mucina de la conjuntiva. Existen tres variedades de lacrimación: basal, refleja y emocional. Se ha considerado tradicionalmente que la lacrimación basal se lleva cabo por las glándulas lagrimales accesorias y que la glándula principal, con inervación secretoria, produciría los tres tipos de secreción. No obstante, estudios recientes cuestionan esta fragmentación clásica de la secreción lagrimal y postulan que ambos tipos glandulares responden al unísono a una regulación neural constante mediante un mecanismo reflejo regulador común (34, 56). b) Componente de distribución. El parpadeo y los movimientos oculares distribuyen uniformemente la película lagrimal sobre la superficie ocular. c) Componente excretor. El sistema de drenaje elimina la porción de la película lagrimal que no se ha evaporado. La eliminación de las secreciones lagrimales se basa en el movimiento a través del ojo, favorecido por el parpadeo y un sistema de drenaje que consta de los puntos lagrimales, los canalículos, el saco lagrimal y el conducto lacrimonasal. 2.2.3.D. Inervación y mecanismo de lagrimación La inervación de la superficie ocular y la UFL puede resumirse de la siguiente manera (57,65): • El arco aferente de la secreción lagrimal está constituido por los nervios sensoriales de la córnea, la conjuntiva y los párpados, que responden a la 40 temperatura, el grado de humedad y las agresiones del entorno enviando señales a ganglio trigémino. La respuesta del lagrimeo se vehicula a través de los núcleos preganglionares parasimpáticos. • Otra vía neural controla el reflejo del parpadeo: la vía trigeminal y las fibras eferentes somáticas del séptimo par craneal. 2.3. Síndrome de ojo seco 2.3.1. Introducción El ojo seco es una enfermedad frecuente y multifactorial. Se asocia sobre todo a edad avanzada, mujeres post-menopáusicas, enfermedades autoinmunes, el uso de algunos fármacos y a enfermedad de la superficie ocular. Diversos factores alteran la secreción o composición de la película lagrimal, produciéndose inestabilidad e inflamación continuada de la superficie ocular, lo que conlleva la alteración de la homeostasis de la misma. Los síntomas más frecuentes son las molestias oculares (quemazón, picor, sensación de pinchazos, arenilla, cuerpo extraño, fatiga o lagrimeo) y visión borrosa. En ocasiones, las alteraciones oculares pueden ser graves, requiriendo intervenciones quirúrgicas o bien ocasionando una pérdida importante de la agudeza visual. El SOS puede manifestarse como una patología aguda o crónica. En el caso del SOS crónico, las alteraciones cuantitativas o cualitativas de la lágrima provocan la sensación de malestar permanente, ocasionando implicaciones significativas en el ámbito económico y en la calidad de vida de los pacientes. Se ha avanzado mucho en los últimos años en el conocimiento de la fisiopatología del SOS, no así en su tratamiento, que sigue siendo en muchos casos insatisfactorio. 2.3.2. Epidemiología del ojo seco 41 El SOS es una de las patologías oculares más frecuentes. Se calcula que la prevalencia del ojo seco varía del 5% al 34% (60) dependiendo del estudio, los criterios diagnósticos y la población estudiada. Se trata, por lo tanto, de un problema de salud pública de primer orden. El Beaver Dam Study (66) halló una prevalencia de ojo seco del 14% en los adultos de entre 48 a 91 años. Esto supondría unos 3,2 millones de mujeres y 1,05 millones de hombres afectados de ojo seco en EE.UU. Afecta más frecuentemente (67) a mujeres post-menopáusicas, ancianos y pacientes con enfermedades autoinmunes (estos últimos suponen aproximadamente el 8% de la población, y en un 78% se trata de mujeres). Estudios epidemiológicos internacionales refrendan cifras similares o superiores en todo el mundo: el Women’s Health Study (68) refleja que la prevalencia de ojo seco sintomático en individuos mayores de 50 años es de un 7% en mujeres y un 4% en hombres en EE.UU. La prevalencia estimada de SOS en Australia (69) es del 7,4% de la población, incrementándose dicho porcentaje en mujeres mayores de 50 años y ancianos. Un estudio realizado en Indonesia (70) calculó que la prevalencia ascendía al 27,5% de la población, y se asociaba con la edad provecta, el hábito tabáquico y la presencia de pterigium. En un estudio realizado en Taiwan (71), la prevalencia de SOS entre los ancianos fue del 33,7%, siendo las mujeres las que más referían más síntomas. El porcentaje de pacientes afectos de SOS en Canadá (72) se estimó en un 26% y en un 33% en Japón (73). Las variaciones en las estimaciones de la prevalencia del SOS pueden atribuirse a la falta de una definición clara del mismo y la variabilidad de las poblaciones estudiadas. Por otro lado, un porcentaje nada desdeñable de la población afecta de SOS tiende a auto-medicarse, por lo que la prevalencia que los estudios anteriormente mencionados calculan varía dependiendo de si los datos proceden de la población general o de los datos proporcionados por facultativos. Asimismo, estos últimos datos dependen a su vez de los criterios empleados por los médicos para diagnosticar el SOS. De hecho, el porcentaje del 33% obtenido en el Beaver Dam Study (66) se obtuvo de un estudio poblacional mediante cuestionario. De los pacientes que referían tener ojo seco, sólo el 11% habían acudido al médico. Los porcentajes de prevalencia más bajos se hallan en los estudios que se basan en los datos de oftalmólogos especializados en superficie 48 normalmente caracterizada por la obstrucción de los conductos terminales y/o cambios cualitativos/cuantitativos en la secreción glandular. Esto puede resultar en una alteración de la película lagrimal, síntomas de irritación ocular, inflamación clínicamente aparente y enfermedad de la superficie ocular (77). • Clasificación: Las DGM pueden clasificarse según su secreción en de baja producción (sicca meimobiana) o de alta producción (seborrea meimobiana). Ambas pueden ser primarias o secundarias a una patología ocular o sistémica. • Fisiopatología: Independientemente del mecanismo etiológico, la consecuencia final de la DGM es la baja secreción de lípidos procedentes de las glándulas de Meibomio. Esta carencia ocasiona alteraciones en la capa lipídica externa de la película lagrimal, lo que puede ocasionar la evaporación, hiperosmolaridad y la inestabilidad de la misma, así como aumentar el número de bacterias en el borde palpebral (77). Podemos describir DGM en patologías oculares muy frecuentes tales como blefaritis posterior, rosácea y queratoconjuntivitis atópica. • La DGM parece ser la causa principal de SOS en todo el mundo (60, 77, 78). El International Workshop on Meibomian Gland Dysfunction señala que tradicionalmente se han empleado los términos “blefaritis posterior” y DGM como si fueran sinónimos, pero que dichos términos no son intercambiables (78). El término blefaritis posterior se emplea para describir condiciones inflamatorias del borde posterior del párpado, de las cuales la DGM es solo una posible causa. El término meibomitis/meibomiamitis designaría una DGM con componente inflamatorio, lo que no siempre ocurre. b) Uso de LDC. Incrementan la osmolaridad al aumentar la evaporación lagrimal. Parece que la hipoestesia corneal secundaria que produce su uso continuado también puede contribuir en el proceso (79). 49 c) Factores ambientales. La baja humedad ambiental, las altas temperaturas o actividades laborales relacionadas con la baja frecuencia de parpadeo, como el uso de pantallas de ordenador. d) Alteraciones palpebrales. Aumento de tamaño de la apertura palpebral (exoftalmos) o la mala congruencia párpado/globo ocular, lagoftalmos, baja frecuencia de parpadeo o parpadeo defectuoso. e) Interacciones con los componentes preservativos de fármacos tópicos. 2.3.3.C. Fisiopatología del síndrome de ojo seco Tanto el OSAD como el OSE pueden ocasionar inestabilidad de la película lagrimal y aumento de su osmolaridad, lo que altera la homeostasis de la superficie ocular. La osmolaridad normal se estima que está en 302 ± 9,7 mOsm/l (60). El punto de corte más aceptado es > 316 mOsm/l (34). La medida de la osmolaridad lagrimal se considera una de las mejores pruebas para el diagnóstico del SOS y se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (80). Sea por la secreción insuficiente o por la evaporación excesiva, la capa acuosa de la lágrima disminuye, por lo que los solutos presentes en ella se concentran, aumentando la osmolaridad. Este incremento ocasiona, por un lado, que la células del epitelio corneal liberen agua para contrarrestar el aumento de solutos de la lágrima, lo que puede conducir al estrés osmótico y, finalmente, a la apoptosis celular (81, 82). El daño de las células epiteliales estimula las terminaciones nerviosas, lo que a su vez ocasiona la pérdida de la señalización nerviosa en la glándula lagrimal, menor secreción lagrimal refleja y disminución de la sensibilidad corneal, agravando por un lado el déficit lagrimal y estimulando la inflamación, por otro (60). En la inflamación de la superficie ocular secundaria a la osmolaridad y la apoptosis celular (81-86), se superponen, de manera aún no filiada del todo, alteraciones hormonales, neurológicas e inflamatorias. En este proceso inflamatorio crónico se infiltran los tejidos MALT (conjuntiva y glándulas lagrimales) por parte 50 de células inmuno-competentes, que secretan citocinas pro-inflamatorias y reclutan más linfocitos dañando la superficie ocular y las glándulas lagrimales por inflamación neurogénica y activación patológica del proceso de apoptosis, cerrando el círculo del ojo seco. Aunque no se conoce con certeza el mecanismo exacto, la hisperosmolaridad de la superficie ocular podría causar sobre-expresión del HLA DR y la acción de las células presentadoras de antígeno de la conjuntiva que, mediante la acción de citocinas pro-inflamatorias, activarían de manera masiva y progresiva a los linfocitos (sobre todo LTCD4 y LNK). Éstas, a su vez, reclutarían más células inmunes y activarían la secreción de más citocinas pro-inflamatorias en la conjuntiva y en las glándulas lagrimales, entre las cuales se encuentran las interleukinas (IL) IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7I, L-8, IFN-γ, TNF-α, and IL-1β, TNF-α, y la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) (60,85,86). Se ha correlacionado la población celular positiva para HLA DR con la gravedad del ojo seco (87). Asimismo, se han hallado concentraciones más elevadas de citocinas y quemocinas inflamatorias, especialmente IL-1β, IL6, IL8, IL-10, TNF-α and IFNγ, en las lágrimas de pacientes con SOS, comparado con la de controles (88). Sin embargo, dada la diversidad de perfiles de moléculas proinflamatorias detectadas en las muestras de los pacientes con SOS, no es sencillo establecer una correlación entre una citocina/quemocina concreta y la presencia/gravedad de la enfermedad. Por otro lado, la hiperosmolaridad y la inflamación de la superficie ocular también causan la pérdida de células caliciformes (60). Este ciclo se conoce como “el círculo vicioso del ojo seco” (ver figura 1). No importa cómo se inicie el ciclo, una vez que se establece de manera crónica conduce a un SOS, que puede ocasionar daños graves en la superficie ocular si no se instaura un tratamiento correcto a tiempo (89). 51 Figura 1. Fisiopatología del ciclo del ojo seco. Modificada de Baudouin (89). 2.3.3.D. Clasificación según estadío de gravedad El DEWS clasifica el SOS en cuatro estadíos (24), de menor a mayor gravedad: a) Nivel 1 Molestias leves o esporádicas, a menudo en respuesta a estímulos ambientales, con o sin síntomas visuales. Signos leves, si los hubiera, de hiperemia conjuntival, tinción de la superficie ocular o enfermedad palpebral. La estabilidad de la lágrima, medida mediante test de rotura lagrimal, y la producción de la misma, medida mediante test de Schirmer, quedan afectadas de forma variable (ver el epígrafe 3.5, “Diagnóstico del ojo seco”, para definición del test de rotura lagrimal y el test de Schirmer). b) Nivel 2 Molestias leves y síntomas visuales intermitentes con o sin exposición a estímulos que los provoquen; más frecuentemente muestran tinción corneal o conjuntival, así como secreción leve. Puede aparecer enfermedad palpebral y la estabilidad y producción de la lágrima suele quedar afectada. El test de Schirmer presenta valores entre 6-10 mm y el test de rotura lagrimal, entre 6-10 segundos. Es un grado de SOS moderado. c) Nivel 3 Síntomas frecuentes o constantes sin provocación o síntomas visuales que pueden limitar las actividades. Tinción moderada de la superficie ocular (corneal y 52 conjuntival). La enfermedad palpebral es común y la estabilidad y producción de la película lagrimal suelen estar considerablemente reducidas. Frecuentemente se asocia con disfunción glandular de Meibomio. El test de Schirmer presenta valores entre 3-5 mm y el test de rotura lagrimal, entre 3-5 segundos. Es un grado de SOS severo. d) Nivel 4 Síntomas constantes e incapacitantes. Marcada enfermedad palpebral a menudo presente. Inyección conjuntival marcada. Tinción córneo-conjuntival > 2/3 con densidad de tinción elevada. Tasa de producción lagrimal mínima. El test de Schirmer presenta valores ≤ 2 mm y el test de rotura lagrimal, ≤ 2 segundos. Es un grado de SOS muy severo. Grado severidad 1 2 3 4 Síntomas Leves y esporádicos. Desencadenados por factores ambientales Moderados, esporádicos o crónicos. No necesariamente desencadenados por factores ambientales Severos, constantes o frecuentes. No precisan desencadenante ambiental Severos, constantes e incapacitantes Alteraciones visuales Ninguno o fatiga esporádica Limitan esporádicamente actividades cotidianas Crónicos. Limitan actividades cotidianas Constantes y, en ocasiones, incapacitantes Inyección conjuntival Ausente o leve Ausente o leve +/− +/++ Tinción córneoconjuntival Ausente o leve Variable Moderada o severa Severa BUT (seg) Variable 6-10 3-5 ≤ 2 Test de Schirmer (mm/5 min) Variable 6-10 3-5 ≤ 2 DGM Variable Variable Frecuente Frecuente Otros - Disminución menisco lagrimal Queratitis filamentosa, acúmulos de moco, aumento de detritus. Lo anterior más: ulceración, triquiasis, queratinización, simbléfaron. Tabla 1. Clasificación ojo seco según sintomatología. Modificado DEWS (24). DGM: Degeneración de las glándulas de Meibomio; BUT: Tiempo de rotura lagrimal. 53 2.4. Impacto del ojo seco El SOS es una patología crónica muy frecuente que ocasiona pérdida de calidad de vida a los pacientes afectos, así como un efecto notable en el gasto farmacéutico de los países. Por tanto, se trata de un problema destacado de salud pública. Plugefelder (90) pone de manifiesto que el ojo seco altera la realización de muchas actividades no necesariamente relacionadas con la visión, ya sean de tipo social, laboral o cotidianas. Asimismo señala que el impacto económico del SOS es destacado, y se deriva tanto de los costes directos (consultas, prescripción de medicamentos, lentes especiales, humidificadores, procedimientos quirúrgicos), indirectos (absentismo y baja productividad laboral, cambio de trabajo) e intangibles (reducción en la calidad de vida, afectación del tiempo libre, alteración en la vida social, física y emocional). Friedman (91), por su parte, apunta que en los pacientes con ojo seco se afecta de manera importante la agudeza visual funcional, es decir, aquella que se alcanza tras mantener los ojos abiertos y que perjudica la realización de tareas tan necesarias como la lectura, la conducción o el trabajo con ordenador. Basándose en análisis farmaco-económicos cifra en 6.500 dólares americanos la reducción de la productividad por persona y año (datos de 2007). Shiffman (92), realizó un estudio de coste-utilidad en el que evaluó el impacto del ojo seco en la calidad de vida de los pacientes. Los pacientes afectos de SOS moderado afirmaban que éste tenía mayor impacto sobre su calidad de vida que patologías como la psoriasis o la ceguera monocular. Los pacientes con ojo severo cifraban la reducción de la calidad de vida en el mismo plano que el de la angina de pecho inestable, la insuficiencia renal tratada con diálisis o una fractura cadera incapacitante. 2.5. Diagnóstico del ojo seco El diagnóstico preciso del SOS mediante pruebas complementarias presenta dificultades debido a que: 54 a) No existe en la actualidad ninguna prueba complementaria considerada Gold Standard que por sí misma permita diagnosticar el síndrome. b) Ningún cociente permite ponderar la importancia de dichas pruebas complementarias, ya que el SOS presenta etiologías y patofisiologías variadas: distintos tests objetivos analizan los diversos aspectos de la fisiología lagrimal (93). c) No se han establecido puntos de corte claros a partir de los cuales las prubeas complementarias existentes se consideran patológicas (94). d) Existe una baja reproducibilidad de las pruebas objetivas, ya que el sistema lagrimal es cambiante y sus componentes son interdependientes. e) No existe concordancia entre las pruebas objetivas y los síntomas (95). Por otro lado, existe un componente subjetivo, la sintomatología, que es de crucial importancia en el ojo seco y se evalúa mediante cuestionarios. La combinación de todas estas pruebas nos permite diagnosticar el SOS. 2.5.1 Pruebas complementarias 2.5.1.A. Tiempo de rotura lagrimal. El tiempo de rotura lagrimal (TRPL) o BUT (Break-Up Time), descrito por Norm en 1969, se define como el intervalo de tiempo transcurrido entre un parpadeo y la primera aparición de un islote de desecación en la superficie corneal. Se trata de un test cualitativo que estima la calidad de la lágrima (es un buen indicador de la inestabilidad de la película lagrimal, pero no aclara cuál es el factor deficitario). Es anormal en el SOS tipo OSE, siendo la DGM una causa frecuente. Se suele realizar instilando una gota de fluoresceína sódica al 2% (Fluotest, 2.5 mg de fluoresceína sódica y 4 mg de oxibuprocaína clorhidrato por ml) en el fondo de saco conjuntival inferior. Después de eliminar el exceso de colorante, se pide al paciente que parpadee y se espera un minuto para que la fluorescencia del producto sea mayor. Mediante exploración en lámpara de hendidura con luz azul cobalto se mide el tiempo transcurrido entre el último parpadeo y la aparición de islotes de hipofluorescencia o irregularidades de ésta en la superficie corneal. El tiempo normal de rotura de la película lagrimal debe ser > 10 segundos. La 55 aparición de islotes de desecación corneal antes de los 10 segundos se considera patológica. En los últimos años Abelson et al (96) han propuesto la reducción del nivel de corte a ≤ 5 segundos. No obstante, actualmente no se dispone de suficientes datos para apoyar este cambio de criterio (34). 2.5.1.B. Test de Schirmer. Es la prueba clásica para el diagnóstico del ojo seco. El test de Schirmer es un método cuantitativo de estimación de la secreción glandular lagrimal. Sus diversas formas, así como las distintas variantes introducidas para la realización de este test, tratan de medir la producción lagrimal tanto basal como refleja. Se afecta sobre todo en casos de ojo seco acuodeficiente (OSAD). Durante la exploración no debe haber luces fuertes ni corrientes de aire. A los 5 minutos se retira la tira y se anotan los milímetros lineales humedecidos en la parte no introducida. Los pacientes deben ser explorados siempre en la misma habitación, con luz tenue, una temperatura de unos 25º C y humedad aproximada del 40%. Existen tres modalidades: 1. Schirmer tipo I sin anestesia: Mide la secreción basal y refleja. Se considera normal un valor > 10 mm de la tira. 2. Schirmer tipo I con anestesia: La prueba mide la secreción basal incrementada por el reflejo trigeminal naso-lacrimal. Se considera normal un valor > 6 mm de la tira. 3. Schirmer tipo II (con estimulación nasal): Mide la secreción basal y refleja máximas. Es de gran utilidad a la hora de distinguir entre pacientes con síndrome de Sjögren de aquéllos sin síndrome de Sjögren. En los pacientes no Sjögren presentan un considerable aumento secretorio lagrimal tras la estimulación nasal, mientras que casi no hay cambios secretorios en los pacientes con Síndrome de Sjögren. 2.5.1.C. Tinción corneo-conjuntival. Para valorar las características histopatológicas de la superficie ocular se emplean diversos colorantes: fluoresceína, rosa de Bengala y verde lisamina. Cada una de estas tinciones presenta apetencias tisulares diferentes. 56 • Fluoresceína. Se fija a las membranas basales tiñendo las células epiteliales que presentan membranas celulares dañadas o abrasiones corneales. Por lo tanto sirve para observar defectos epiteliales y áreas en las que las estructuras de unión intercelulares están dañadas (97). Se instila una gota de fluoresceína sódica al 2% (Fluotest, 2.5 mg de fluoresceína sódica y 4 mg de oxibuprocaína clorhidrato por ml) en el fondo de saco conjuntival inferior. Tras 2 minutos de la instilación se evalúa el grado de tinción de la córnea y de la conjuntiva con luz azul cobalto. (Figura 2). Figura 2. Fotografía del polo anterior con tinción corneal con fluoresceína. • Rosa de Bengala y verde de lisamina. Muestran las zonas donde no existe epitelio corneal o éste está alterado. El rosa de Bengala, repelido por la mucina de la película lagrimal, tiñe las células degeneradas, al igual que el verde lisamina, y las células viables, no afectadas por esa tinción. Se utilizan para visualizar defectos mucínicos indistintamente ya que ambas presentan el mismo patrón de tinción (34). El verde de lisamina es mejor tolerado, por lo que se emplea más a menudo. (Figura 3). Figura 3. Fotografía del polo anterior con tinción córneo-conjuntival con verde de lisamina. Las tinciones ayudan a diferenciar los pacientes con SOS tipo OSAD 57 (tinción en línea media nasal, temporal y corneal), con el lagoftalmos (tinción inferior), con la queratoconjuntivitis límbica superior (tinción superior), con la disfunción de glándulas de Meibomio (puede no dar tinción o ser mínima) y la blefaritis moderada o grave (la tinción puede invadir casi toda la córnea) (97). Para la evaluación de estas tinciones se dispone actualmente de dos métodos: el método de Oxford (97), empleado normalmente para la tinción con fluoresceína y el método de van Bijsterveld (98) para el verde de lisamina y el rosa de Bengala: • La tinción, según el esquema de Oxford, divide en seis grados la zona de la córnea y la conjuntiva, numerados del 0 al 5 (figura 4). Figura 4. Escala de Oxford. • La puntuación de van Bijsterveld (figura 5) divide la superficie ocular en tres áreas (conjuntiva nasal, córnea y conjuntiva temporal) y se puntúa la tinción de cada una de ellas del 0 a 3, considerando valor 0 la ausencia de puntos impregnados, 1 presencia de algunos puntos impregnados, 2 zonas impregnadas bien definidas y 3 impregnación total. La puntuación global corresponde a la suma de las 3 áreas. Una puntuación ≥ 3,5 se considera como patológica. 64 2.6. Tratamiento del ojo seco El ojo seco generalmente no tiene cura, por lo tanto, el tratamiento se estructura en torno al control de los síntomas y la prevención del daño de la superficie. Existen cuatro tipos de intervenciones (107): • La substitución lagrimal (básicamente el empleo de lágrimas artificiales y lubricantes). • La preservación lagrimal mediante la oclusión del sistema de drenaje lagrimal. • La estimulación farmacológica del proceso de lagrimeo (empleo de sustancias secretagogas). • El tratamiento de las causas etiológicas de la enfermedad (inmunosupresores, antibióticos, hormonas sexuales, hemoderivados…). La elección del tratamiento depende de la severidad de la patología de la superficie ocular. El Subcomité nombrado por el Taller Internacional sobre el Ojo Seco (24), formuló las siguientes recomendaciones terapéuticas. 2.6.1. Ojo seco grado 1 • Modificaciones ambientales. Evitar ambientes secos y cálidos, uso de humidificadores y recomendaciones para los pacientes que trabajan con ordenadores (condiciones ergonómicas, iluminación adecuada, descansos periódicos, estar debidamente refraccionados). Pueden padecer el “síndrome ocular de pantallas de visualización”. Se recomienda la higiene palpebral diaria en pacientes con DGM. • Uso de lentes de contacto (LDC). El problema principal en el uso de LDC es la limitación del paso del oxígeno a través de la lágrima que la superficie corneal necesita para su normal funcionamiento. Existen LDC elaboradas a partir de diversos tipos materiales, cada uno con distinta permeabilidad al oxígeno. Las lentes rígidas permeables al gas presentan el mejor índice de permeabilidad al oxígeno. La hipoxia secundaria al uso continuado de LDC provoca que la 65 córnea adopte metabolismo anaerobio y acidosis láctica, que inhibe la barrera normal y los mecanismos de bomba de la córnea (79). Se producen así diversas alteraciones corneales en las células epiteliales y endoteliales, disminución de células caliciformes conjuntivales, edema, hipoestesia, vascularización periférica, alteraciones lagrimales y cambios en la flora microbiana (109). • Cirugía refractiva. La cirugía refractiva, especialmente el LASIK (acrónimo de Laser-Assisted in Situ Keratomileusis) se ha popularizado en los últimos tiempos. La técnica implica la sección de las terminaciones nerviosas corneales del plexo nervioso sub-basal y estromal con el objeto de crear el flap epitelial. De ahí se deriva una disminución de la sensibilidad corneal, que provoca una disminución del estímulo aferente corneal responsable de la producción acuosa (109). El plexo nervioso se comienza a regenerar a los seis meses tras la cirugía y su densidad alcanza niveles pre-operatorios a los cinco años de la intervención, aunque la conformación del plexo difiere de la preoperatoria (110). La sensibilidad corneal previa se recupera de tres a nueves meses post-intervención (110). Sin embargo, los pacientes usuarios de LDC de larga duración pueden no recuperar nunca una sensibilidad corneal normal (111). Por otro lado, la disminución de la sensibilidad corneal post-LASIK trae aparejada una disminución de la frecuencia del parpadeo y por lo tanto un aumento de la evaporación lagrimal y de la osmolaridad de la misma. Con respecto a las pruebas complementarias para el diagnóstico del SOS tras cirugía refractiva, Toda (112), halló que tanto el test de Schirmer como el aclaramiento de fluoresceína se encontraban disminuidos hasta un año después de la intervención, mientras que el BUT volvía a valores normales a los seis meses. • Control de medicaciones concomitantes que producen ojo seco. Antidepresivos, ansiolíticos, antiparkinsionianos, antihistamínicos, anticolinérgicos, antihipertensivos, diuréticos… recogidos en el cuarto punto de la clasificación etiológica de Murube (74). • Lágrimas artificiales. A pesar de los avances que se han producido en el entendimiento de la patología del SOS y en su terapéutica, las lágrimas artificiales continúan 66 siendo el tratamiento más empleado para su tratamiento (113). La lágrima presenta una composición compleja (agua, sales, compuestos hidrocarbonatos, proteínas y lípidos) y cambiante según las necesidades de la superficie ocular (79). Además, los sustitutivos no pueden reproducir la estructura de la película lagrimal y se administran de manera discontinua, a diferencia de la lágrima natural. Por todo lo anterior, resulta extremadamente difícil conseguir sustitutivos lagrimales eficaces (107). En la fisiopatología del ojo seco existe una inflamación e hiperosmolaridad patológicas, por lo que para las lágrimas artificiales se han desarrollado de fórmulas iso o hipoosmolares. Asimismo, el pH de la película lagrimal debe permanecer constante para mantener el normal funcionamiento de las células epiteliales (97). Ciertos electrolitos como el potasio, el magnesio, el calcio, así como el bicarbonato como solución tamponadora ayudan a la conservación de la homeostasis de la superficie ocular (113). Las formulaciones comerciales incluyen a menudo conservantes en sus productos, sobretodo cloruro de benzalconio o el tiomersal, que, paradójicamente, producen alteraciones de la superficie ocular parecidas a los síntomas del ojo seco, como disminución de la estabilidad de la película lagrimal, alteraciones de la barrera epitelial y reacciones de hipersensibilidad (114-116). Para el SOS leve se emplean las formulaciones más fluidas como los derivados de la celulosa, el alcohol de polivinilo y el cloruro sódico, que lubrican la superficie ocular. o Ésteres de celulosa. Son mucílagos con buen tiempo de retención. Algunos de ellos son la hipromelosa, hidroexietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa. La carboximetilcelulosa se fija al epitelio corneal. Están indicados en SOS tipo OSAD (113). Versura (117) encontró una disminución de la tinción patológica con rosa de Bengala en pacientes tratados con hidroximetilcelulosa. o Povidona y polivinil alcohol. Son polímeros que, combinados se han demostrado útiles para el tratamiento de patologías conjuntivales, ya que actúan sobre todo ante las alteraciones de las células caliciformes (113). 67 2.6.2. Ojo seco grado 2 • Se emplean lágrimas artificiales sin conservantes ya se a en formato unidosis que no contienen dichos conservantes o bien envases especiales que no los requieren (con filtros de poliamida o polietersulfona) o que poseen conservantes más respetuosos con la superficie ocular (Poliquaternum). Se emplean también formulaciones más espesas, geles o ungüentos. o Carbómeros y hialuronatos. Se prefieren en este estadío del ojo seco, ya que contienen sustancias viscosizantes que aumentan el tiempo de permanencia de la lágrima artificial sobre la superficie ocular. Diversos estudios añaden un papel protector de estos compuestos sobre el epitelio de superficie (34). o Ácido hialurónico. Es un mucopolisacárido de alto peso molecular que disminuye la evaporación lagrimal, mejora el trofismo corneal y parece regular la respuesta inflamatoria, aunque no se ha hallado una correlación clínica evidente (113, 118). o Ungüentos. Los lípidos de la lágrima disminuyen con la evaporación. Forman la capa más externa de la lágrima y son difíciles de sustituir (113). Con objeto reducir la evaporación se emplean preparaciones con parafina y lanolina en forma de ungüentos o pomadas. Actualmente existen en el mercado preparados mixtos, en los que se combinan lípidos y polímeros, con los que se pretende aunar los efectos de ambos compuestos (34). • Anti-inflamatorios tópicos. Al existir un mecanismo fisiopatológico inflamatorio crónico subyacente en el SOS, se emplea terapia anti-inflamatoria. En este nivel se recomiendan corticoides tópicos y ciclosporina A al 0’05%. o Corticoides. Los corticoides ejercen su actividad anti-inflamatoria mediante la 68 inhibición de la cascada inflamatoria en varios puntos (34,119): la síntesis de derivados del ácido araquidónico, el reclutamiento de células inmunes, la actividad enzimática de la MMP 9 y de distintas colagenasas. Además, preservan las uniones estrechas del epitelio y disminuyen la descamación celular (116). La aplicación tópica de los mismos provoca una inmunosupresión a nivel local con aplicabilidad clínica en el SOS como ponen de manifiesto diversos estudios en los que se demuestra la mayor capacidad de estos compuestos frente a tratamientos convencionales para reducir tanto los síntomas como los signos de la enfermedad (34,121,122). Pflugfelder encontró mejoría en los signos y síntomas del ojo seco empleando corticosteroides tópicos, así como descenso en los niveles de IL 8 en el epitelio conjuntival (123). Los corticoides con menor capacidad de penetración en la cámara anterior son los derivados fosfatos, que son los recomendados en este nivel. La máxima penetración y potencia la alcanza el acetato de prednisolona. Su uso prolongado produce efectos secundarios bien conocidos: aumento de la presión intraocular, cataratas, aumento de la susceptibilidad a infecciones y retraso de la cicatrización corneal (119). Por ello, se reservan para las exacerbaciones de los síntomas de ojo seco (107). o Ciclosporina A al 0’05%. Inhibe la producción de la IL 2, lo cual disminuye la activación linfocitos CD4 y CD8 y la producción de citoquinas proinflamatorias, sin provocar ningún efecto citotóxico directo (119). También aumenta el número de células caliciformes (124,125). La ciclosporina tópica ha demostrado disminuir los síntomas y la enfermedad de la superficie ocular en ensayos clínicos aleatorizados (126), así como disminuir la expresión la IL 6 en el epitelio conjuntival (127). • Tetraciclinas vía oral. Además del efecto antibiótico mediante la inhibición de la síntesis de proteínas de la pared bacteriana, las tetraciclinas presentan actividad anti- 69 inflamatoria y anticolagenolítica (128). La inhibición directa de la síntesis de MMP y de la actividad colagenasa (129,130) así como de la secreción de mediadores de la inflamación como la IL Iβ, del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) (130) y del óxido nítrico (131), son los principales factores que contribuyen a una mejoría clínica en el ojo seco, ya que se reducen los procesos de destrucción de tejido corneal. Se recomiendan especialmente, aunque no únicamente, en los cuadros asociados a DGM, como úlceras recalcitrantes, blefaritis, flictenulosis, y rosácea (129). Además regulan la presencia de ácidos grasos en la lágrima mediante la inhibición de producción de lipasas bacterianas (132). • Secretagogos o La pilocarpina vía oral en dosis de 20 mg/día se muestra eficaz en el tratamiento síndrome de Sjögren moderado, mejorando los síntomas de ojo seco, aunque resulta más eficaz para la xerostomía (133). Presenta el inconveniente de que no puede emplearse en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, ni en casos de insuficiencia renal ni cardiaca. o La cevilemina presenta menos efectos adversos y también mejora la sequedad bucal y ocular en diversos ensayos clínicos (134,135), aunque otros autores encuentran mejoría de los síntomas, pero no en los signos objetivos de ojo seco (136). o Actualmente se encuentran en investigación otras sustancias de efecto secretagogo: Diquafosol (137), Rebamipide (138), Elodoisina (139) y el ácido 15-S hidroxeicosatetraenoico (en proceso de patente). • Oclusión lagrimal transitoria: tapones lagrimales. Proporcionan una oclusión transitoria del sistema de drenaje lagrimal. Se inertan fácilmente y son efectivos (107,140,141). Normalmente se emplean en casos de ojo seco hiposecretor como tratamiento temporal o bien para valorar la tolerancia del paciente a la oclusión puntal definitiva y el grado de epífora. Pueden insertarse en la porción vertical del canalículo o bien 70 intracanaliculares. Según su composición pueden ser reabsorbibles (tapones de colágeno, gelatina, compuestos de polímeros acrílicos termodinámicos o bien de hidroxipropilcelulosa) o no reabsorbibles (silicona, cianocrilato). Pueden ocluirse ambos canalículos en casos graves, o solamente los inferiores, lo que suele constituir la actitud inicial. Un estudio reciente, prospectivo, encontró que la oclusión intracanalicular con el material termosensible mejoraba tanto el test de Schirmer como el BUT (140). Otros autores realizaron una revisión de estudios previos y encontraron que entre los efectos de la oclusión de la vía lagrimal se encuentran (141): la disminución de la osmolaridad lagrimal, el aumento de las células caliciformes y la disminución de los síntomas y signos del ojo seco (test de Schirmer, tinción con fluoresceína, queratitis filamentosa, ulceraciones corneales). 2.6.3. Ojo seco grado 3 • Suero autólogo. Ver apartado 2.7.1: “Suero autólogo”. • Oclusión permanente de los puntos lagrimales. Mediante cauterización de los mismos o bien cubriéndolos con un parche de conjuntiva. Pueden producir epífora molesta para el paciente. • LDC terapéuticas. Aunque el uso de LDC puede aumentar la evaporación de la película lagrimal y reducir el flujo lagrimal, el reservorio atrapado detrás de la lente puede contrarrestar este efecto (6). En ocasiones, se emplean las lentes esclerales permeables al gas como medida tectónica en ojos secos severos con exposición para evitar la formación de defectos epiteliales o bien para acelerar la curación de éstos. 2.6.4. Grado 4 • Medidas tectónicas. Escudos y gafas protectoras. Crean un ambiente húmedo y cerrado en el que disminuye la evaporación lagrimal. • Cirugía. Desde la inyección de toxina botulínica y las tarsorrafias para producir 71 ptosis hasta procedimientos más agresivos para intentar aumentar la producción lagrimal como la transposición del conducto parotídeo, el transplante de glándulas salivales o el implante de bombas subcutáneas de perfusión lagrimal. • Tratamiento sistémico. o Fármacos inmunosupresores/inmunomoduladores. Su uso se basa en las manifestaciones extragangionares mediadas por inmunocomplejos que acontecen en el síndrome de Sjögren (133). Pueden emplearse los corticoides y la ciclosporina orales, que no se han mostrado eficaces en los últimos estudios (142,143,144). Se está investigando el uso de otros fármacos de efecto inmunodepresor como la hidroxicloroquina (145), el rituximab (146,147), los llamados fármacos antifactor de necrosis tumoral alfa: infliximab (148) y etanercept (149); la D-penicilamina (150), el ácido micofenólico (151) y el interferón α2 (152), con resultados desiguales. o Existen otras moléculas cuyo empleo se postula para el tratamiento del SOS (34), como la bromhexina, las hormonas sexuales o los inhibidores de la transcriptasa inversa pero todavía existen múltiples lagunas en este campo que será preciso aclarar antes de la introducción de estos compuestos en la práctica clínica. A pesar de las múltiples opciones terapéuticas anteriormente descritas, el tratamiento del ojo seco moderado-severo sigue siendo insatisfactorio, ya que se trata de una patología crónica sin tratamiento etiológico específico. A pesar de emplear los métodos arriba expuestos, algunos pacientes siguen presentando signos y síntomas de ojo seco. El uso de sustancias que aportasen no sólo hidratación, sino nutrición y factores de crecimiento constituye una alternativa esperanzadora. 2.7. Antecedentes y estado actual del tema de estudio 2.7.1. Suero autólogo 72 La lágrima es de capital importancia para la lubricación y la correcta función visual, así como para asegurar la nutrición de la superficie ocular y protegerla ante agresiones. El SOS puede producirse como consecuencia de una escasa secreción de lágrima (OSAD), una evaporación excesiva (OSE) o de deficiencias en la captación de lágrima (factores tantálicos). Independientemente del mecanismo etiopatogénico del SOS se produce una inflamación crónica de la superficie ocular (83-89), que deriva en molestias que pueden llegar a ser incapacitantes y signos que van desde la queratitis y la DGM hasta la queratinización conjuntival (24). Los tratamientos tradicionales basados en la humectación (lágrimas artificiales y ungüentos), la preservación de la lágrima (tapones lagrimales, LDC) e incluso la inmunosupresión (corticoides, ciclosporina A) pueden paliar la sequedad y disminuir la inflamación, pero no contienen moléculas necesarias para mejorar la homeostasis de la superficie ocular alterada. La utilización del suero autólogo (SA) en oftalmología se debe a la necesidad de encontrar sustitutos lagrimales que, además de humidificar, aporten estos componentes (factores de crecimiento, vitaminas, inmunoglobulinas) presentes en la lágrima y que se encuentran en menor concentración de la fisiológica en casos de sequedad ocular (153). Los efectos terapéuticos de la aplicación de SA a pacientes se conoce desde el año 1984 gracias a los trabajos de Fox (4), pero su uso no se extendió hacia finales de los años 90, gracias a los trabajos de Tsubota (5). Propiedades biológicas del SA: a) Acción óptica y lubricante por presentar pH y osmolaridad similares la lágrima. b) Contenido en factores de crecimiento en mayor concentración que la lágrima, entre los que destacan (153): • El Factor de Crecimiento Epitelial (EGF). o Acelera el proceso de reparación y cicatrización de heridas debido a que: § Favorece la proliferación, migración y diferenciación de las 73 células epiteliales y fibroblastos. § Aumenta la síntesis de proteínas como la fibronectina y la formación de matriz extracelular. § Tiene efectos antiapoptóticos. § Aumenta la producción de mucina 1. • El Factor β Transformante del Crecimiento de Fibroblastos (TGF-β). o Efecto regulador sobre otros factores de crecimiento. o Los efectos del TGF-β en los procesos de regeneración corneal se consideran en general negativos, ya que por su efecto pleiotrópico, por un lado inhibe las células epiteliales y por otro presenta acción profibrótica. En acción sinérgica con PDGF y las integrinas, el TGF-β favorece la contracción de las heridas (154,155), lo que podría dar lugar a una regeneración anómala del estroma, con la consiguiente pérdida de transparencia corneal. Por este motivo es conveniente diluir el SA para su aplicación oftalmológica (156). o Detalle de las acciones regenerativas del TGF-β: § Inhibe la proliferación celular y la migración de queratocitos pero favorece la migración de fibroblastos y su diferenciación a miofibroblastos. § Implicado en los procesos de reparación epitelial y estromal: favorece la formación de matriz extracelular, la neovascularización e inhibe las metaloproteinasas. § Efecto quimiotáctico sobre linfocitos. § Efecto antiinflamatorio. • El Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF). o Su principal reservorio son los gránulos alfa de las plaquetas. o Regula la expresión de otros factores de crecimiento, como el TGFβ. o Regula las relaciones entre células epiteliales y estroma durante los procesos de cicatrización. o Favorece migración y diferenciación de fibroblastos acelerando el depósito de matriz extracelular y aumentando la producción, resistencia y contracción del colágeno (155). o Efecto antiangiogénico y quimiotáctico sobre monocitos y 80 larga duración (5). Sin embargo, por no poseer conservantes, existe el riesgo de contaminación (169). Se han descrito un número escaso de contaminaciones (7,158,162). Teóricamente, los anticuerpos y antígenos presentes en el suero pueden ocasionar reacciones inmunológicas (169). Se ha descrito la formación de un infiltrado anular en un paciente tratado por defecto epitelial persistente postqueratitis herpética (170) y de un infiltrado periférico en un caso de ojo seco asociado a artritis reumatoide (157). 2.7.1.E. Preparación La elaboración del SA no es especialmente compleja y no supone un alto coste sanitario. Se lleva a cabo bajo condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar (grado A) y en entorno D de tratamiento de aire; bajo previa indicación facultativa y tras descartar patología infecciosa mediante control serológico. Habitualmente se prepara al 20% salvo excepciones justificadas. Los viales se almacenan en nevera a 4ºC, siendo su caducidad de 21 días. Se entregan al paciente los viales protegidos con papel de aluminio y se adjuntan las normas de empleo. El procedimiento de preparación puede variar según el centro de procesamiento, siendo variables en el proceso la concentración de la preparación, la utilización de filtros, el tiempo de almacenamiento en fresco así como el medio para realizar la concentración exigida. Actualmente, no existe consenso sobre la concentración a la que preparar el SA para la administración en colirio ocular, ya que hay grupos que lo están administrando al 10, 20, 40, 50, 80 y hasta 100% en una solución normalmente fisiológica. La concentración al 20% parece suficiente y evita las molestias derivadas de la mayor viscosidad de preparados más concentrados y disminuye considerablemente el número de extracciones de sangre (157). 2.7.1.F. Legislación vigente La legislación que le compete al colirio de SA no es uniforme a nivel mundial, así pues, en EE.UU. está regulado por la Food and Drug Administration (FDA) al considerarlo como un producto farmacéutico. En Inglaterra y País de 81 Gales el protocolo estandarizado de preparación sigue las directrices del Servicio Nacional de la Sangre y la Agencia de Control de Medicamentos de Gran Bretaña y de acuerdo con la guía de autotransfusión del British Comitee for Standard in Haematology (171). En Alemania, el protocolo estándar de preparación sigue las directrices de la guía del Bundesärztekammer y del Instituto Paul Ehrlich para donación y uso de productos hemáticos. En estos protocolos se aplican los mismos criterios que para la extracción de sangre destinada a donación, es decir, a los pacientes se les realiza un despistaje de enfermedades infecciosas de transmisión parenteral. En España, el colirio de SA no tiene una legislación específica que lo contemple, si bien se establecen algunas referencias legales que amparan esta terapia clínica. Son cuatro los reales decretos que los autores manejan como referentes a esta modalidad terapéutica: 1Real Decreto 175/2001 de 23 de febrero, por el que se aprueban las normas de correcta elaboración y control de calidad de fórmulas magistrales y preparados oficinales. 2Real Decreto 1015/2009, de 19 de junio, por el que se regula la disponibilidad de medicamentos en situaciones especiales. 3Real Decreto 1088/2005, de 16 de septiembre, por el que se establecen los requisitos técnicos y condiciones mínimas de la hemodonación y de los centros y servicios de transfusión. 4Real Decreto-ley 9/2014, de 4 de julio, por el que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos. Entre los inconvenientes de la aplicación del SA se encuentran la frecuencia en el número de extracciones de sangre, sobre todo en aquellos pacientes con tratamiento anticoagulante o antiagregante, que pueden desarrollar hematomas post extracción; y el peligro que supone el hecho que el paciente padezca una enfermedad infecciosa, con la posibilidad de contagio. 82 2.7.2. Suero heterólogo de sangre periférica 2.7.2.A. Propiedades Las características del suero heterólogo (SH) no difieren de las del SA. Puede ser beneficioso su uso en algunos pacientes que presenten ciertas limitaciones en la extracción de su propio suero para realizar el colirio. Entre éstas podrían encontrarse la edad y limitaciones del paciente, la falta de medios para desplazarse periódicamente a realizarlo, el padecimiento de enfermedades autoinmunes que puedan poner en tela de juicio la calidad y eficacia del suero y enfermedades infecciosas transmisibles, sobre todo infección activa por VHC y VIH. También sería interesante emplearlo en caso de niños no colaboradores. 2.7.2.B. Preparación Igual al proceso descrito para el SA, pero con sangre procedente del Banco de donantes de sangre. 2.7.2.C. Comparación con suero autólogo Hay algunos pacientes en los que no es recomendable la aplicación del SA. Esta evidencia fue contemplada en el Centro Regional de Transfusión Sanguínea (CRTS). Por ello, y en consenso con el servicio de Oftalmología, desde el comienzo del programa de empleo de SA, se ha aplicando SH procedente de donante de sangre a pacientes con dichas características. Se seleccionan donantes de sangre habituales del grupo AB para evitar problemas de rechazo antigénico, firmando un consentimiento informado sobre los fines de esa donación. Recientemente se ha realizado un estudio en el que se plantea la necesidad de valorar ambos grupos de pacientes mediante un cuestionario de autoevaluación realizado a los pacientes antes y después de la utilización del colirio (26). 2.7.3. Suero de sangre de cordón umbilical 2.7.3.A. Propiedades 83 Yoon investigó la eficacia del suero de sangre de cordón umbilical (SCU) en pacientes con SOS severo de diversa etiología (28) y SOS grave asociado a EICH (29), así como pacientes con defecto epitelial persistente (27) y con queratitis neurotrófica (172), quemaduras oculares (173,174) y problemas de la superficie ocular tras cirugía refractiva (173, 174). En el SOS el uso de colirio de SCU mejoró el BUT, la tinción epitelial, el grado de metaplasia escamosa, la densidad de células caliciformes y las puntuaciones en los cuestionarios (28). Otros autores han hallado asimismo mejoras en el daño epitelial, la puntuación en los cuestionarios, la citología de impresión conjuntival, la osmolaridad lagrimal y la sensibilidad corneal (175). 2.7.3.B. Comparación entre suero de sangre de cordón umbilical y suero autólogo Yoon también comparó los niveles de componentes esenciales de la lágrima en el SCU y en el SA (173,174). Ambos sueros mostraron mejoría en los síntomas, el BUT, la tinción corneal y la citología de impresión conjuntival (en SA, sólo en los pacientes sin síndrome de Sjögren). Sin embargo, el tratamiento con SCU obtenía mejores resultados en la sintomatología, la tinción corneal y la citología de impresión conjuntival en pacientes con síndrome de Sjögren. Asimismo, halló que el SCU contenía tres veces más EGF y dos veces más TGFβ. También eran superiores las concentraciones, pero en menor medida, del NGF y la sustancia P. El SA contenía, en cambio, IFG-1 en mayor proporción. La presencia de vitamina A en el SCU, aunque menor que en el SA, era superior a la presente en la lágrima endógena y suficiente para prevenir metaplasia escamosa. Según Yoon, la terapia con SCU tiene ventajas en los efectos clínicos sobre la terapia con SA y presenta el mismo nivel de seguridad, siempre que se realice a las madres donantes una serología previa. Por tanto, emplear el SCU presenta tres ventajas adicionales (173, 174, 176): 1. La obtención de SCU de donante genera suero para muchos pacientes. 2. Este suero puede conservarse, de manera que el tiempo de espera para administrarlo al paciente es mínimo. 3. Este suero puede emplearse, en los mismos casos que el SH de sangre 84 periférica, para pacientes en que no sea recomendable/plausible la extracción sanguínea periódica. 2.7.3.C. Comparación entre suero de sangre de cordón umbilical y suero heterólogo La principal ventaja del SCU comparado con el SH es que no es necesario emplear sangre de banco, que es escasa y puede destinarse a otros múltiples fines, sino que una vez descartada la donación de sangre de cordón umbilical para realizar un trasplante de progenitores hematopoyéticos, puede emplearse únicamente para realizar colirio de SCU. Por otro lado, la sangre de cordón umbilical no posee aglutininas, y por lo tanto no es antigénico. La sangre de banco empleada para realizar SH tiene provenir necesariamente de donantes AB. 2.7.3.D. Preparación del colirio de suero de sangre de cordón umbilical La sangre del cordón umbilical se extrae de las gestantes durante el parto. Se realizan test serológicos previos en las semanas 8 y 38 de gestación para descartar VHB, VHC y VIH. Tras el parto, se obtiene una muestra de 60 a 80 mL de sangre de la vena del cordón umbilical (figura 6). Figura 6. Extracción de muestra de sangre de la vena del cordón umbilical La muestra se mantiene dos horas a temperatura ambiente y se dispensa en tubos de cristal estériles de 10 mL. Después de 20 minutos de centrifugación a 2800G a 20ºC, se decanta el sobrenadante y se diluye al 20% con solución salina balanceada (BSS) (figura 7). 85 Figura 7. Preparación del colirio de SCU con BSS. Los viales de colirio resultantes son etiquetados, se introducen en congelador eléctrico a - 80º C y se almacenan en condiciones estériles, en nuestro caso y protegidos con un papel de aluminio para evitar la degradación de vitamina A por la luz (figura 8). Una vez abiertos, los recipientes se conservan a 4ºC en la nevera durante un máximo de una semana. Los recipientes sin abrir pueden conservarse a -20ºC de tres a seis meses (173). Figura 8. Colirio de SCU etiquetado y protegido con papel de aluminio. Para la elaboración de los viales de nuestro estudio se han tenido en cuenta los siguientes criterios de selección: • Unidades con menos de 24 horas desde la extracción a la separación. • Historia y antecedentes obstétricos normales, de unidades no aptas para el procesamiento al banco público. • Consentimiento informado específico. Como controles de calidad se realiza un hemocultivo inicial y final del proceso y contaje celular del sobrenadante con ausencia de células. Se reservaron alícuotas para la determinación de factores de crecimiento. 86 2.7.4. Derivados hemáticos plaquetarios Las plaquetas tienen un papel fundamental en la regeneración tisular y constituyen un reservorio de factores de crecimiento, factores fibrinolíticos, proteínas de adhesión y quimiocinas. Los derivados hemáticos plaquetarios se obtienen mediante la centrifugación de la sangre, obteniéndose el plasma con una gran concentración de plaquetas. Al aplicar el plasma en la superficie ocular, se produce un coágulo de fibrina que va liberando los factores de crecimiento contenidos en las plaquetas lentamente. Los derivados plaquetarios que se emplean con mayor frecuencia en oftalmología son el colirio de plasma enriquecido en plaquetas y el colirio plasma rico en factores de crecimiento. Ambos se diferencian básicamente en su modo de preparación, que a su vez presenta muchas variantes (177). Por ello, las evidencias clínicas sobre su uso son inconstantes. Sin embargo, algunos autores han obtenido buenos resultados aplicando los concentrados autólogos de plaquetas para el SOS, úlceras neurotróficas y síndrome de post-intervención con LASIK (178, 179). 87 Material y métodos 88 3. Material y métodos 3. 1. Universo y muestra 3.1.1. Ámbito de estudio Los pacientes han sido reclutados entre los que acudieron al Hospital Regional Universitario Carlos Haya de Málaga, tanto al Servicio de Oftalmología como al resto de servicios del Complejo Hospitalario, durante el periodo de septiembre del 2011 a mayo de 2015. 3.1.2. Criterios de inclusión Es necesario cumplir dos o más criterios de los tres siguientes: a) Síntomas de ojo seco por más de tres meses. b) Test de Schirmer tipo I ≤ 5 mm. c) Tiempo de ruptura lagrimal ≤ a 5 segundos. Se incluyen en el estudio los pacientes con SOS de las siguientes etiologías: a) SOS no asociado a colagenopatía • Idiopático. • Secundario: Disfunción de las glándulas de Meibomio (mediante observación del reborde palpebral y la expresión de las glándulas) y demás causas de OSE, SOS mucodeficiente, síndrome del párpado fláccido, queratoconjuntivitis límbica superior, SOS secundario a radioterapia, queratopatía bullosa, enfermedad de GravesBasedow,… b) SOS secundario a síndrome de Sjögren, primario o secundario: • Artritis reumatoide. • Lupus eritematoso sistémico. • Esclerodermia. • Dermatomiositis. • Enfermedad mixta del tejido conectivo. 89 • Tiroiditis de Hashimoto. • Cirrosis biliar primaria. • Hepatitis crónica autoinmune. c) Causas oftalmológicas • Úlcera neurotrófica. • Defecto epitelial persistente. • Queratopatía por exposición. • Queratopatía cálcica. • Distrofias corneales. • Úlceras marginales secundarias a vasculitis sistémicas. • Úlcera de Mooren. • Úlcera de Terrien. • EICH. • Síndrome de insuficiencia limbar. • Síndrome de Stevens-Johnson. • Penfigoide. • Causticación corneal. 3.1.3 Criterios de exclusión a) Menores de 18 años. b) Mujeres embarazadas o que puedan estarlo. c) Usuarios de lentes de contacto. d) Historia de alergia ocular en los últimos tres meses. e) Cirugía intraocular o refractiva en los últimos seis meses. f) Alteraciones anatómicas de párpado y pestañas. g) Enfermedades infecto-contagiosas (VIH, VHC, VHB). 3.2. Metodología Los datos del presente trabajo se extrajeron de un ensayo clínico aleatorizado, unicéntrico, de tres ramas paralelas (SA, SH, SCU) para el tratamiento del ojo moderado-severo, con número muestral de 123 pacientes. En cada grupo se 96 Resultados 97 4. Resultados 4.1. Datos demográficos • Número de pacientes: 64 ojos, 32 SA y 32 SCU, de 32 pacientes, 16 en cada grupo (Cuadro 1). • Sexo: 28 mujeres (86%), 4 varones (Tabla 6, cuadro 2). • Edad media: 61,5 años, rango 44-88. La edad media era de 56 (45,9 - 64) años en el grupo tratado con SA y de 62 años (57,75 – 69,25) en el grupo tratado con SCU. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,010). • Abandonos: 14 ojos, 7 pacientes, no terminan el estudio (Cuadro 3). • Enfermedad autoinmune previa: 43 ojos (67%, tabla 6, cuadro 4). • Tratamiento previo con SA: 12 (38%) ojos del grupo tratado con SA y 8 ojos del grupo tratado con SCU (25%) (Tabla 6). • Menopausia: el 85% de las 28 mujeres incluidas en el estudio (Tabla 6, cuadro 5). Variable Categorías SA % SCU % Ntotal %total Sexo H om b re M uj er 0 0,0 32 100,0 8 25,0 24 75,0 8 12,5 56 87,5 p = 0,0048 Todos 32 100,0 32 100,0 64 100,0 Enf. autoinmune N o Sí 11 34,4 21 65,6 10 31,2 22 68,8 21 32,8 43 67,2 p = 1,00 Todos 32 100,0 32 100,0 64 100,0 Trat. previo N o Sí 20 62,5 12 37,5 24 75,0 8 25,0 44 68,8 20 31,2 p = 0,42 Todos 32 100,0 32 100,0 64 100,0 Menopausia N o Sí 6 20,7 23 79,3 2 8,3 22 91,7 8 15,1 45 84,9 p = 0,27 Todos 29 100,0 24 100,0 53 100,0 Tabla 6. Descriptivo variables cualitativas 98 Cuadro 1. Distribución de pacientes según tratamiento. Cuadro 2. Distribución de pacientes según sexo. Cuadro 3. Distribución de pacientes según finalizan o no el ensayo. Pacientes según tratamiento SA SCU Pacientes según sexo Mujer Varón Ojos que finalizan el ensayo Sí No 99 Cuadro 4. Distribución de pacientes según la presencia de enfermedad autoinmune. Cuadro 5. Distribución de pacientes femeninas según la presencia de menopausia. 4.2. Respuesta al tratamiento con los distintos sueros Respuesta al tratamiento del ojo seco con los distintos sueros, medida por el cambio producido por la terapia en: 1) Test de Schirmer (mm). 2) Tiempo de rotura lagrimal o BUT, en segundos. 3) Tinción de fluoresceína de la superficie ocular, según la escala de Oxford. 4) Tinción con verde lisamina del epitelio córneo-conjuntival, evaluada según la escala de van Bijsterveld. 5) Cuestionario de Donate (104). Enfermedad autoinmune Sí No Menopausia Sí No 100 4.2.1. Análisis de las variables en dos grupos independientes No existen diferencias estadísticamente significativas en las pruebas realizadas, en ninguna de las visitas (cuadro 6). SA SCU p T e st Edad Schirmer ( mm ) Visita 1 Visita 2 Visita 3 BUT (seg) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Fluoresceína (Oxford) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Verde lisamina (Bijsterveld) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Cuestionario (Donate) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Cu es t ioan r io Cu es t ionar io2 Cu es t ionario 3 56 ( 49,75 , 64,25 ) 4 ( 1,75 , 5 ) 6 (2 , 17,25 ) 6 (2 , 12 ) 4 (2 , 5 ) 5 ( 3,25 , 6,75 ) 6 (5 , 8 ) 3 (2 , 3 ) 1,5 (1 , 3 ) 2 (1 , 2 ) 3 (2 , 4) 2,35 ( 1,26 ) 2 (1 , 3 ) 39,81 ( 10,03 ) 30,31 ( 12,80 ) 26,39 ( 14,17 ) 62 ( 57,75 , 69,25 ) 3 (2 , 4,25 ) 3 (2 , 5,5 ) 5,5 (2 , 10 ) 4 (3 , 5 ) 6 (5 , 8 ) 7,5 (5 , 10 ) 3 (2 , 4 ) 2 (1 , 3 ) 1,5 (1 , 2 ) 4 (3 , 5.25 ) 3,25 ( 2,09 ) 3 ( 1,75 , 5 ) 41,63 ( 12,14 ) 30,42 ( 16,05 ) 35,42 ( 17,09 ) 0,018 0,588 0,143 0,632 0,250 0,124 0,486 0,207 0,355 0,797 0,054 0,075 0,093 0,649 0,985 0,162 ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( b ) ( c) ( a) ( a) ( a) Cuadro 6. Análisis de variables cuantitativas en dos grupos independientes en el global de individuos. (a) T es t t - st ud en t as um i en do homogeneidad de v arian zas . Se ex p r esa en media ( s d) (b) T es t t -s t ud en t cuando no se cu mp l e hom ogen ei dad de v ar i anz as. Se e xp r es a en media (sd) (c) T e st U Mann W hi t n ey - W il c o xon . Se ex p r esa en mediana IC (P25,P75). 4.2.2. Análisis de la variación de la tercera-primer visita Al realizar un análisis de la variación de los resultados de la tercera visita comparada con la primera entre ambos sueros para el test de Schirmer, tiempo de rotura lagrimal, tinción de fluoresceína, verde lisamina y cuestionario, no se encontraron diferencias significativas (cuadro 7). 101 SA SCU p T e st Schirmer ( mm ) BUT (seg) Fluoresceína (Oxford) Verde lisamina (Bijsterveld) Cuestionario (Donate) 1,5 (0 , 4 ) 2,81 ( 2,21 ) -1 (-2 , -1 ) -0.89 ( 1,56 ) -15,15 ( 14,39 ) 1,5 ( -0,25 , 5 ) 2,71 ( 2,579, ) -2 (-2 , 0 ) -0.67 ( 3,12 ) -7,58 ( 11.56 ) 0,98 0,89 0,42 0,76 0,16 ( c) ( a) ( c) (b) ( a) Cuadro 7. Análisis de la variación (resultados tercera visita – resultados primera visita) en el global de individuos. Análisis de variables cuantitativas en dos grupos independientes. (a) T es t t - st ud en t as um i en do homogeneidad de v arian zas . Se ex p r esa en media ( s d) (b) T es t t -s t ud en t cuando no se cu mp l e hom ogen ei dad de v ar i anz as. Se e xp r es a en media (sd) (c) T e st U Mann W hi t n ey - W il c o xon . Se ex p r esa en mediana IC (P25,P75). 4.2.3. Análisis ANOVA de medidas repetidas En todos los valores evaluados (test de Schirmer, tiempo de rotura lagrimal, tinción de fluoresceína, verde lisamina y cuestionario) los resultados muestran que existen diferencias significativas en las puntuaciones a lo largo del tiempo en el análisis ANOVA de medidas repetidas, que a continuación se especifican para cada una de las pruebas efectuadas (cuadro 6). 4.2.3.A. Test de Schirmer Con el objeto de analizar si la variación del test Schirmer es la misma en los tres momentos considerados se aplica el test ANOVA de dos factores con medidas repetidas en un factor. Al aplicar el test de Mauchly para analizar si la matriz de las varianzas es circular o esférica, condición necesaria en los modelos de medidas repetidas, obtenemos p = 0,0007, por tanto no se cumple condición de esfericidad. Al no cumplirse el requisito de esfericidad, utilizaremos un índice corrector llamado Epsilon obtenido según las estimaciones de Greenhouse-Geisser, según estos resultados: la variable tiempo obtenemos p = 0,012 <0,05, por lo tanto los resultados apuntan a que las puntuaciones de Schirmer varían de forma significativa a lo largo del tiempo. En el caso del SA, de una media de 4 (1,75 – 5) mm en la primera visita mejoró a 6 (2 -12) mm en la visita 3 (cuadro 6). Con respecto al SCU, de una media de 3 (2 – 4,25) mm en la primera visita mejoró a 5,5 (2 -10) mm en la visita 3 (cuadro 6). 102 4.2.3.B. BUT Con el objeto de analizar si la variación de BUT es la misma en los tres momentos considerados se aplica el test ANOVA de dos factores con medidas repetidas en un factor. Al calcular la prueba de esfericidad de Mauchly obtenemos p = 0, 771 > 0.05 y aceptamos por tanto la hipótesis de esfericidad. Cuando asumimos esfericidad obtenemos que la variable tiempo (momento factor) es significativo, p < 0,001, por lo que los resultados sugieren que las puntuaciones del BUT o tiempo de rotura lagrimal varían de forma significativa a lo largo del tiempo. En el caso del SA, de una media de 4 (2 – 5) segundos en la primera visita mejoró a 6 (5 -8) segundos en la visita 3 (cuadro 6). Con respecto al SCU, de una media de 4 (3 – 5) segundos en la primera visita mejoró a 7,5 (5 -10) segundos en la visita 3 (cuadro 6). 4.2.3.C. Tinción con fluoresceína Con el objeto de analizar si la variación en la tinción de la superficie ocular con fluoresceína es la misma en los tres momentos considerados se aplica el test ANOVA de dos factores con medidas repetidas en un factor. Al aplicar el test de Mauchly para analizar si la matriz de las varianzas es circular o esférica, condición necesaria en los modelos de medidas repetidas, obtenemos p = 0,049, por tanto no se cumple condición de esfericidad. Al no cumplirse el requisito de esfericidad, utilizaremos un índice corrector llamado Epsilon obtenido según las estimaciones de Greenhouse-Geisser, según estos resultados: la variable tiempo obtenemos p < 0,001 <0,05, por lo tanto los resultados apuntan a que las puntuaciones de la tinción con fluoresceína varían de forma significativa a lo largo del tiempo. En el caso del SA, de una media de puntuación de 3 (2 – 3) en la escala de Oxford en la primera visita disminuyó a 2 (1 - 2) puntos en la visita 3 (cuadro 6). Con respecto al SCU, de una media de puntuación de 3 (2 – 4) en la escala de Oxford en la primera visita disminuyó a 1,5 (1 - 2) puntos en la visita 3 (cuadro 6). 4.2.3.D. Tinción con verde de lisamina Con el objeto de analizar si la variación en la tinción de la superficie ocular 103 con verde de lisamina es la misma en los tres momentos considerados se aplica el test ANOVA de dos factores con medidas repetidas en un factor. Al calcular la prueba de esfericidad de Mauchly obtenemos p = 0, 29 > 0,05 y aceptamos por tanto la hipótesis de esfericidad. Cuando asumimos esfericidad obtenemos que la variable tiempo (momento factor) es significativo, p < 0,012 <0,05, por lo que los resultados indican que las puntuaciones de la tinción con verde de lisamina varían de forma significativa a lo largo del tiempo. En el caso del SA, de una media de puntuación de 3 (3 – 5) en la escala de van Bijsterveld en la primera visita disminuyó a 2 (1,25 – 4,75) puntos en la visita 3 (cuadro 6). Con respecto al SCU, de una media de puntuación en la escala de van Bijsterveld de 4,5 (3 – 6) en la primera visita disminuyó a 3 (2 – 4,75) puntos en la visita 3 (cuadro 6). 4.2.3.E. Cuestionario Con el objeto de analizar si la variación el cuestionario es la misma en los tres momentos considerados se aplica el test ANOVA de dos factores con medidas repetidas en un factor. Al calcular la prueba de esfericidad de Mauchly obtenemos p = 0,0793 > 0,05 y aceptamos por tanto la hipótesis de esfericidad. Por lo tanto cuando asumimos esfericidad obtenemos que la variable tiempo (momento factor) es significativo, p < 0,001 <0,05, los resultados apuntan a que las puntuaciones del cuestionario varían de forma significativa a lo largo del tiempo. En el caso del SA, de una media de puntuación de 40 puntos en el cuestionario de Donate en la primera visita disminuyó a 28 puntos en la visita 3 (cuadro 6). Con respecto al SCU, de una media de puntuación en el cuestionario de Donate de 40 puntos en la primera visita disminuyó a 30 puntos en la visita 3 (cuadro 6). 4.2.4. Análisis de los indicadores de mejoría para cada una de las pruebas Para valorar la respuesta al tratamiento con cada uno de los sueros por separado, se consideró mejoría: a) Test de Schirmer: incremento de 3 mm. b) Tiempo rotura lagrimal: incremento 2 segundos. c) Fluoresceína: decremento de un área. 104 d) Verde lisamina: decremento de dos puntos. e) Cuestionario: decremento de tres puntos. Se aplicó un test de Fischer para comprobar si existe asociación entre el tratamiento que recibe el paciente y el valor de la respuesta. No se halló significación estadística para ninguno de los tests (cuadro 8): a) La mejoría en el test de Schirmer fue del 38,5% para SA y 37,5% para SCU, con una p = 1,00. b) La mejoría en el BUT fue del 69,2% para SA y 65.5% para SCU, con una p = 0,84. c) La mejoría en la tinción con fluoresceína fue del 80,8% para SA y 70,8% para SCU, con una p = 0,62. d) La mejoría en para la tinción con verde de lisamina fue del 34,6% para SA y 45,8% para SCU, con una p = 0,60. e) La mejoría en el cuestionario fue del 92,3% con el SA y 75% para SCU, con una p = 0,53. Variable Nivel de mejoría SA % SCU % Ntodos % todos Schirmer Incremento < 3m m I ncrem en t o > 3m m 16 61,5 10 38,5 15 62,5 9 37,5 31 62,0 19 38,0 p = 1,00 Todos 26 100,0 24 100,0 50 100,0 BUT I ncremen t o < 2sg I ncrem en t o > 2sg 8 30,8 18 69,2 9 37,5 15 62,5 17 34,0 33 66,0 p = 0,84 Todos 26 100,0 24 100,0 50 100,0 Fluoresceina Descenso < 1 u nidad Descenso > 1 u nidad 5 19,2 21 80,8 7 29,2 17 70,8 12 24,0 38 76,0 p = 0,62 Todos 26 100,0 24 100,0 50 100,0 Verde Lisamina Descenso < 2 p un to s Descenso > 2 pun to s 17 65,4 9 34,6 13 54,2 11 45,8 30 60,0 20 40,0 p = 0,60 Todos 26 100,0 24 100,0 50 100,0 Cuestionario Descenso < 3 pun to s Descenso > 3 pun to s 1 7,7 12 92,3 3 25,0 9 75,0 4 16,0 21 84,0 p = 0,53 Todos 13 100,0 12 100,0 25 100,0 Cuadro 8. Descriptivo indicadores mejora de cada uno de los tests. 105 4.3. Comparación de la respuesta al tratamiento entre SA y SCU Al comparar los resultados de ambos grupos de tratamiento para cada uno de las pruebas realizadas, los datos indicaron que no existen diferencias significativas entre SA y SCU para el test de Schirmer (cuadro 9), el BUT (cuadro 10), la tinción con fluoresceína (cuadro 11), ni la puntuación del cuestionario (cuadro 13). Sí se encontraron diferencias significativas en la tinción con verde de lisamina (cuadro 12), en la que el grupo tratado con SA obtiene mejores resultados es decir, menor puntuación (cuadro 6). 4.3.1. Test de Schirmer Al considerar el factor tratamiento (SA vs SCU) en la mejoría del test de Schirmer obtenemos una p = 0,268, por lo tanto no existen diferencias significativas entre ambos tratamientos. El gráfico de perfil muestra las puntuaciones de Schirmer en cada uno de los momentos considerados en función del tratamiento (cuadro 9). Se observa que en la segunda visita las puntuaciones de Schirmer en el grupo tratado con suero de SA son más elevadas y que en la tercera visita las puntuaciones en este grupo descienden. Cuadro 9. Comparación de las puntuaciones del test de Schirmer entre SA y SCU. 112 SA SCU p T e st Edad Schirmer ( mm ) Visita 1 Visita 2 Visita 3 BUT (seg) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Fluoresceína (Oxford) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Verde lisamina (Bijsterveld) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Cuestionario (Donate) Visita 1 Visita 2 Visita 3 Cu es t ioan r io Cu es t ionar io2 Cu es t ionario 3 56 (46 , 60 ) 3 (0 , 5 ) 3 ( 1,25 , 16,5 ) 4 (2 , 11,5 ) 4 (3 , 5 ) 5,17 ( 2,18 ) 6,61 ( 2,03 ) 3 (2 , 3 ) 2 (1 , 3 ) 2 (1 , 2 ) 3 (3 , 5 ) 3 ( 1,25 , 3 ) 2 ( 1,25 , 4,75 ) 40,55 ( 10,93 ) 28,89 ( 10,79 ) 27,56 ( 14,40 ) 69 ( 57,25 , 70,75 ) 2,5 ( 1,25 , 4 ) 2,5 ( 1,25 , 4,75 ) 2,5 ( 1,25 , 11,25 ) 4 (4 , 5 ) 6,5 ( 2,09 ) 6,17 ( 2,73 ) 3 (2 , 3 ) 2 (1 , 2,75 ) 2 (1 , 2,75 ) 4,5 (3 , 6 ) 4 (2 , 5,75 ) 3 (2 , 4,75 ) 40,27 ( 11.93 ) 26,89 ( 14,62 ) 30,44 ( 15,49 ) 0,003 1,000 0,453 0,712 0,210 0,070 0,583 0,795 0,646 0,987 0,229 0,082 0,608 0,956 0,746 0,687 ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( a) ( a) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( c) ( a) ( a) ( a) Cuadro 18. Análisis de variables cuantitativas en dos grupos independientes en individuos con enfermedades autoinmunes. (a) T es t t - st ud en t as um i en do homogeneidad de v arian zas . Se ex p r esa en media ( s d) (b) T es t t -s t ud en t cuando no se cu mp l e hom ogen ei dad de v ar i anz as. Se e xp r es a en media (sd) (c) T e st U Mann W hi t n ey - W il c o xon . Se ex p r esa en mediana IC (P25,P75). SA SCU p T e st Schirmer ( mm ) BUT (seg) Fluoresceína (Oxford) Verde lisamina (Bijsterveld) Cuestionario (Donate) 2,5 ( 0,25 , 6 ) 4 ( 2,25 , 4,75 ) -1 (-2 , -1 ) 0 (-1 , 0 ) -15 ( 11,60 ) 1 (0 , 8 ) 1,5 (1 , 4 ) -1 (-2 , 0 ) -1 ( -3,75 , 0,75 ) -9,56 ( 12,02 ) 0,589 0,224 0,934 0,419 0,343 ( c) ( c) ( c) ( c) ( a) Cuadro 19. Análisis de la variación (resultados tercera visita – resultados primera visita) en individuos con tratamiento previo. (a) T es t t - st ud en t as um i en do homogeneidad de v arian zas . Se ex p r esa en media ( s d) (b) T es t t -s t ud en t cuando no se cu mp l e hom ogen ei dad de v ar i anz as. Se e xp r es a en media (sd) (c) T e st U Mann W hi t n ey - W il c o xon . Se ex p r esa en mediana IC (P25,P75). 113 4.6. Comparación de la concentración de las moléculas Se determinó la concentración de albúmina (g/dl), fibronectina (µg/ml), IgA (mg/dl), IgG (mg/dl), IgM (mg/dl), vitamina A (µg/dl), vitamina E (µg/dl), EGF (ng/dl) y TGF (ng/dl): • En 15 muestras de SA para todas las moléculas, excepto para vitamina E, TGF y EGF, en el que se analizó en las 14 muestras disponibles. • En 8 SCU procedentes de donantes (sueros elaborados a partir de la misma donante se emplearon para varios pacientes). El valor medio de cada molécula, la desviación típica y el error típico de la media para ambos sueros se muestran en el cuadro 20. Para comparar si las concentraciones de dichos componentes eran similares en ambos sueros se empleó la comparación de medias con la prueba T para muestras independientes, empleando la prueba de Levene para evaluar si existe o no homocedasticidad entre las muestras de ambos sueros. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas en todas las moléculas a favor del SA (cuadro 20). 114 Cuadro 20. Datos estadísticos para la concentración de las distintas moléculas en los sueros. Comparación de medias con la prueba T para muestras independientes de las concentraciones de las distintas moléculas entre ambos sueros. Los valores de la última columna en negrita señalan las diferencias significativas. 115 4.7. Valores de las moléculas Se representan los valores de las moléculas mediante diagramas de cajas, que proporcionan información sobre los valores mínimo y máximo, los cuartiles Q1, Q2 o mediana y Q3, la existencia de valores atípicos y la simetría de la distribución. a) Albúmina • La media de concentración en SA fue de 3,87 g/dl, con una desviación típica de 0,66 y un error típico de la media de 0,17 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 2,24 g/dl con una desviación típica de 0,50 y un error típico de la media de 0,17 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, asumiendo varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). Cuadro 21. Diagrama de cajas de las concentraciones de albúmina entre ambos sueros. b) Fibronectina • La media de concentración en SA fue de 255,13 µg/ml con una desviación típica de 185,30 y un error típico de la media de 49,52 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 92,49 µg/ml con una desviación típica de 41,09 y un error típico de la media de 14,52 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, asumiendo varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,025 (cuadro 20). 116 Cuadro 22. Diagrama de cajas de las concentraciones de fibronectina entre ambos sueros. c) IgA • La media de concentración en SA fue de 344,46 mg/dl con una desviación típica de 232,92 y un error típico de la media de 60,13 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 8,43 mg/dl con una desviación típica de 6,69 y un error típico de la media de 2,36 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). Cuadro 23. Diagrama de cajas de las concentraciones de IgA entre ambos sueros. 117 d) IgG • La media de concentración en SA fue de 1.663,53 mg/dl con una desviación típica de 1.066,25 y un error típico de la media de 275,30 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 705,62 mg/dl con una desviación típica de 199,33 y un error típico de la media de 70,47 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,04 (cuadro 20). Cuadro 24. Diagrama de cajas de las concentraciones de IgG entre ambos sueros. e) IgM • La media de concentración en SA fue de 142,02 mg/dl con una desviación típica de 87,56 y un error típico de la media de 22,60 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 8,43 mg/dl con una desviación típica de 6,12 y un error típico de la media de 2,16 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). 118 Cuadro 25. Diagrama de cajas de las concentraciones de IgM entre ambos sueros. f) Vitamina A • La media de concentración en SA fue de 42,60 µg/dl con una desviación típica de 15,37 y un error típico de la media de 3,96 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 12,12 µg/dl con una desviación típica de 4,85 y un error típico de la media de 1,71 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). Cuadro 26. Diagrama de cajas de las concentraciones de vitamina A entre ambos sueros. 119 g) Vitamina E • La media de concentración en SA fue de 1.556,26 µg/dl con una desviación típica de 344,96 y un error típico de la media de 89,06 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 230,50 µg/dl con una desviación típica de 52,93 y un error típico de la media de 18,71 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). Cuadro 27. Diagrama de cajas de las concentraciones de vitamina E entre ambos sueros. h) TGF • La media de concentración en SA fue de 21,18 ng/dl con una desviación típica de 5,66 y un error típico de la media de 1,51 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 3,04 ng/dl con una desviación típica de 1,90 y un error típico de la media de 0,72 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, sin asumir varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,0001 (cuadro 20). 120 Cuadro 28. Diagrama de cajas de las concentraciones de vitamina TGF entre ambos sueros. i) EGF • La media de concentración en SA fue de 0,81 ng/dl con una desviación típica de 0,56 y un error típico de la media de 0,15 (cuadro 20). • La media de concentración en SCU fue de 0,13 ng/dl con una desviación típica de 0,24 y un error típico de la media de 0,08 (cuadro 20). • En la prueba T para igualdad de medias, asumiendo varianzas iguales, hubo una significación de p = 0,04 (cuadro 20). Cuadro 29. Diagrama de cajas de las concentraciones de vitamina EGF entre ambos sueros. 121 Discusión y discussion 128 Sin embargo, las concentraciones de la moléculas en el SCU de nuestras muestras son inferiores a la del SA, al contrario de lo que cabría esperar según lo publicado en la literatura (28,173-175,187), con excepción de la vitamina A, cuya concentración era esperable que fuese menor. Tabla 7. Comparación de los valores medios de diversas moléculas entre el SA de nuestras muestras y los publicados por Geerling (157). Este hecho puede deberse a varias razones: • Es necesario tener en cuenta que las determinaciones en bibliografía se realizan directamente a partir de muestras de suero y en nuestro centro se emplean las determinaciones en plasma, que poseen dilución con anticoagulante (por cada 60 ml de plasma aproximadamente 20 ml de la solución anticoagulante). Haciendo cálculos aproximados esto supondría: o En el caso concreto del EGF, pasa de una media de 0,13 a 0,20 ng/ml para EGF. Versura (175,187) presenta un rango de valores de EGF entre 0,2-3 ng/ml. Nuestra media de EGF se encontraría, por tanto, en el límite inferior. o Con respecto al TGF, haciendo la conversión de plasma a suero se pasaría de 3,04 a 4,56 ng/ml. En este caso, la concentración es claramente inferior a los valores publicados por otros autores (175), 30-51 ng/ml. • El tiempo entre la recogida de la muestra y el procesamiento del cordón para elaborar los colirios podría influir en los resultados. Liu (188) afirma que el tiempo de coagulación puede influir aumentando los niveles de EGF y disminuyendo los valores de TGF, pero sólo estudia el efecto hasta 120 minutos de reposo. En nuestro estudio el tiempo Nuestro estudio Geerling (157) EGF (ng/ml) 0,81 0,5 TGF-β (ng/ml) 21,10 (±5,66) 6-33 Vitamina A (mg/ml) 42,60 (±15,37) 46 IgA (mg/dl) 344,46 (±232,92) 2 Fibronectina (µg/ml) 255 (±185,30) 205 129 máximo establecido entre la extracción y procesamiento es 24 horas, mientras que otros autores (174,175) preparan el colirio de SCU de manera similar al SA, centrifugando la muestra de sangre tras dejarla dos horas a temperatura ambiente. Si el TGF disminuye en función del tiempo previo a la preparación del suero, podría ser una explicación de los bajos niveles obtenidos en nuestras muestras de SCU. 5.7. Particularidades del procesamiento del SCU en nuestro centro 5.7.1. Tiempo de procesamiento La razón por la cual las muestras de SCU de este estudio tardaron más en procesarse que las de SA es que en nuestro centro primero se evaluaba la idoneidad de la muestra de sangre de cordón umbilical para ser empleada como trasplante de progenitores hematopoyéticos. En caso de que se descartase para este fin, la muestra de sangre de cordón umbilical se destinaba al presente estudio. En todos los casos se emplearon unidades con menos de 24 horas desde la extracción a la separación. Quizá por el tiempo transcurrido mientras se realizaba dicha valoración, las concentraciones de las diversas moléculas en el SCU descendían, como hipotiza Liu (188) para el TGF y por tanto no son comparables a las publicadas por otros autores (28,173-175,187), que procesaban con relativa inmediatez (dos horas) la muestra para obtener el colirio de SCU. Sin embargo, es posible congelar las muestras de SCU a - 80ºC durante seis meses sin que desciendan el EGF y el TGF (175). Por nuestra parte, pretendemos realizar estudios de estabilidad de las moléculas en el SCU según el tiempo transcurrido entre la extracción de sangre y la preparación del colirio para confirmar esta hipótesis. 5.7.2. Rentabilidad del colirio de SCU La preparación del colirio de SCU ha sido complicada: Se procesaron 34 130 donaciones de SCU, de las cuales sólo 17 (50%) resultaron válidas, ya que las otras 17 (50%) muestras presentaron un severo grado de hemólisis tras la centrifugación. De estas 17 donaciones aptas, sólo se pudieron emplear las muestras de 14 donantes, ya que otras tres (17,6%) fueron positivas a control de bacteriología. Sin embargo, el colirio de SCU presenta una gran rentabilidad en nuestras manos: con una sola donación, se han obtenido de media 15 viales. En total, de las 14 donaciones viables, se obtuvieron 211 viales de colirio de SCU. La principal ventaja del SCU comparada con otros sueros heterólogos es que no es necesario emplear sangre de banco para elaborarlo, que es escasa, puede destinarse a múltiples fines y además debe ser del exclusivamente del tipo AB para evitar antigenicidad. Para la preparación del colirio SCU siempre puede emplearse la sangre de las donaciones de sangre de cordón umbilical no aptas para realizar un trasplante de progenitores hematopoyéticos. Por otro lado, la sangre de cordón umbilical no posee aglutininas, y por lo tanto no es antigénica. 5.8. Limitaciones del estudio 5.8.1. Cálculo del número muestral Ha sido extremadamente complicado realizar un cálculo del número muestral para este ensayo clínico. Las principales dificultades para el cálculo del número muestras derivaron de que este es el primer ensayo clínico que compara el efecto de los tres sueros (SA, SH, SCU) entre sí de manera aleatorizada, por lo que ha sido necesario recurrir a cálculos estadísticos muy complejos (ver apartado “Material métodos”). 5.8.2. Reclutamiento de pacientes Es importante señalar la enorme dificultad enfrentada en el reclutamiento de pacientes en el presente estudio. Desde diciembre de 2012 hasta mayo de 2015 se han evaluado casi 500 pacientes derivados por oftalmólogos por presentar quejas de ojo seco que no respondían a tratamiento habitual. Finalmente se incluyeron en el estudio 96 ojos de 48 pacientes: tres grupos de 32 ojos de 16 pacientes tratados con SCU, SA y SH, respectivamente. Para el presente trabajo sólo se emplean los datos 131 referidos al SA y al SCU. El número total de pacientes del ensayo clínico es similar al publicado por Yoon (174), que comparó 92 ojos de 48 pacientes con SOS moderado-severo. Sin embargo, es posible que con un mayor número de pacientes incluidos se hubieran podido detectar diferencias entre SA y SCU. Muy pocos pacientes de nuestro medio presentan los criterios de inclusión necesarios para participar en este ensayo, con excepción de los pacientes con enfermedades autoinmunes. De entre los pacientes que cumplían los criterios, un porcentaje desestimaba la participación debido a su rechazo a emplear suero procedente de otros sujetos (heterólogo, sangre de banco / donantes de cordón), mientras que otros manifestaban imposibilidad logística para efectuar las visitas periódicas necesarias para la extracción sanguínea y las revisiones oftalmológicas. Con respecto a los abandonos, 14 ojos de 7 pacientes firmaron el consentimiento y comenzaron el estudio, pero lo abandonaron tras la primera visita oftalmológica y no llegaron a extraerse la sangre. Es preciso señalar que todos los pacientes que se extrajeron sangre y comenzaron con el tratamiento tópico con hemoderivados completaron el estudio. Ningún paciente abandonó el ensayo entre la segunda y tercera visita. 5.8.3. Ausencia de grupo control No hemos considerado la inclusión de un grupo control de individuos sanos en este estudio desde el punto de vista ético debido a la improbable, aunque posible, transmisión de enfermedades infecto-contagiosas vía la instilación de los sueros. Asimismo, el requerimiento de la extracción periódica de sangre durante tres meses constituía un inconveniente al que no deseábamos someter a los posibles individuos del grupo control. 5.8.4. Sesgos 5.8.4.A. Sesgo de selección. a) Autoselección. La decisión final de participar en el ensayo clínico recae en el paciente. b) Pérdida. 132 La falta de seguimiento de pacientes durante el estudio puede estar causada por ciertas características intrínsecas a la efectividad del tratamiento o sus efectos adversos. 5.8.4.B. Sesgo de medida. Por todo lo comentado en el apartado 5.3.1., “Cálculo del número muestral”, la exploración mediante pruebas objetivas del ojo seco presenta un cierta variabilidad intra e interobservador, al tratarse de pruebas no automatizadas y que pueden variar según las condiciones ambientales, con lo que puede incurrirse en un déficit de concordancia. 5.8.4.C. Sesgo de participación en ensayos clínicos (efecto Hawthorne). Supone la alteración en la actitud del paciente incluido en un ensayo clínico al saber que está siendo estudiado. 5.8.5. Test empleados Para el presente trabajo hemos seleccionado como tests oftalmológicos objetivos el test de Schirmer, el BUT, la tinción con fluoresceína y la tinción con verde de lisamina, que son pruebas ampliamente contrastadas, validadas y empleadas en multitud de estudios. Asimismo, practicamos una citología de impresión a todos los pacientes en cada una de las visitas, pero por problemas logísticos y de conservación de las muestras, no se han podido analizar correctamente. Por no disponer en nuestro centro de pruebas como la osmometría lagrimal, la meibomiografía, la meniscografía, la medición del aclaramiento lagrimal, la estesiometría, la termografía, la microscopía confocal y la estimación objetiva del tiempo de parpadeo, no ha sido posible efectuarlas. Podría haber sido interesante haber realizado pruebas topográficas de la morfología corneal y la determinación de los componentes lagrimales. Sin embargo, es necesario recalcar que varios autores (189-191) y el propio Subcomité para el diseño de ensayos clínicos acerca de ojo seco del Taller Internacional de Ojo Seco (24) señalan que ninguna variable para ser tomada como variable principal y que no existe ninguna técnica que constituya por sí misma un Gold Standard para el diagnóstico de SOS (24). 133 5. Discussion 5.1. Demographic data In the present study 64 eyes of 32 caucasian patients with moderate to severe dry eye syndrome (DES) where recruited and randomized. The scope of the present work is to assess the effect of autologous serum eye drops (AS) versus umbilical cord blood serum (UCBS) eye drops at one and three months, measuring the following ocular surface test: Schirmer test, BUT, fluorescein staining, lissamine green staining and a questionnaire (104). Yoon (174) compared 92 eyes of 48 patients with moderate to severe DES. 41 eyes of 21 patients were assigned to the AS Group and 51 eyes of 27 patients to the UCBS group. Schirmer test, BUT, fluorescein staining, tear clearance, corneal esthesiometry and a questionnaire where performed, at one and two months after the beginning of the treatment. Versura (175) applied UCBS in 59 eyes 30 patients, 33 with GVHD and 26 with Sjögren syndrome with a grade 4 or more in the Oxford scale. Schirmer test, BUT, fluorescein staining, corneal esthesiometry and symptoms, satisfaction and tolerability tests were performed before and one month after starting the treatment. Most of the patients of our study were females: 56 patients (86%), with a feminine/masculine ratio for the AS group of 32:0, and a 24:8 (3:1) ratio for the UCBS group. The mean age of the patients of the present study was 61.5 years (range 44 - 88). The mean age in the AS group was 56 years (range 45.9 - 64) and 62 years (range 57.75 – 69.25) in the UCBS group. This difference was statistically significant (p = 0,010). Yoon (174) provides a more homogeneous group, with a feminine/masculine ratio of 11:10 for the AS group and a 15:12 ratio for the SCU Group. Besides, the population in his work is also younger, the mean age was 39.95 years (range 20 - 59) and 41.96 years (range 20 – 61) in the AS group and in the UCBS group, respectively. 134 Versura (174) reported 59 eyes, 19 were female patients and 11 man patients. The Sjögren syndrome group was constituted only by female patients with a mean age of 59.6 ± 13.1 years. El GVHD group had a higher proportion of male patients (11 versus 6 female patients) and lower mean age: 38.8 ± 5.8 years. DES affects mainly post-menopausal woman, elderly patients and patients with autoinmune diseases (66-71). While the subgroup with auto-immune diseases of Versura (175) and the patients of our study coherent with the described epidemiology of DES, The demographic sample of Yoon’s article (174) is not (6671), even when considering the Korean population, where he performed the study (181). 5.2. Response to the treatment When analysing the clinical response to AS and UCBS eye drops, measured by the changes in Schirmer test (mm), BUT (seconds), fluorescein staining of the ocular surface (according to Oxford scale), lissamine green staining of the corneoconjunctival epithelium (according to the van Bijsterveld scale) and the questionnaire of Donate (104), we found statistically significant changes in all the tests. Thus, both treatments significantly improved the condition of the ocular surface after three months of treatment. The effects of AS eye drops for DES are well-known. Almost all authors have found a subjective improvement of the ocular surface as soon as 48 after starting the treatment (23,165,166): Tsubota (158) and Poon (162) described an improvement in the fluorescein staining (165) and Schirmer test. Other authors did not find changes in the Schirmer test with the AS (5,23,158). Kojima (164) reported an improvement in the BUT of patients treated with AS compared to conventional artificial tears. Yoon (174) and Versura (175) have reported the outcomes of UCBS eye drops treatment for DES. Yoon (174) found an improvement in the questionnaire, BUT and fluorescein staining, both with AS and UCBS eye drops after one and two months of treatment. Versura (175) reported positive changes in Schirmer test, BUT, osmolarity, squamous metaplasia and questionnaire as soon as one month after the treatment. 135 5.3. Comparison between AS and UCBS eye drops The results from the present study show that UCBS eye drops are not inferior to AS eye drops for the treatment of DES: • When comparing the outcomes of both treatments for the Schirmer test, BUT and fluorescein staining, no statistically significant differences where found. • Statistically significant differences were found in the lissamine green staining, wich showed slightly better results in the SA group. However, given that the values were already better in the first appointment (previous to treatment), it does not seems like a relevant outcome. • When comparing the results from the third follow-up to the first one for all the tests performed, including the questionnaire, there were no statistically significant differences between both treatments. Yoon (174) reported that eyes treated with both AS and UCBS eye drops showed improvement in symptoms, BUT, corneal staining and citology (in AS, only in patients without Sjögren syndrome). UCBS eye drops were more effective tha AS in the punctuation of questionnaire, corneo-epitheliopathy healing and the density of conjunctival goblet cells. Shen (182) showed that UCBS was superior to AS regarding epithelial cells proliferation and differentiation. 5.4. Patients with previous treatment There were 12 eyes (38%) in the AS group and 8 eyes (25%) in the UCBS group that used previous treatment with AS an fulfilled the inclusion criteria of our study, all of them women with autoimmune disease. After a whasout period of four weeks using artificial tears and ointments, they were enrolled in the study. There were not statistically significant differences between the patients that have previously used treatment with AS and where assigned to the AS group and those assigned to the UCBS treatment. Surprinsingly, the only statistically significant value (p = 0.046) was the scoring of the questionnaire in the third appointment, which was inferior (thus, better) in those patients assigned to the AS 136 group that previously used AS. This maybe caused by the Hawthorne effect, also known as the observer effect. 5.5. Patients with autoimmune disease In our study 67% of the patients showed previous autoimmune disease, 86% of them were female patients. These figures are coherent with the works published by other authors (67), that also find that patients with autoimmune diseases show more often signs and symptoms of DES, and are generally female patients (78%). The most prevalent illnesses in our study where primary Sjögren syndrome (18 eyes, 9 patients) and rheumatoid arthritis (18 eyes, 9 patients). Yoon (174), however, reported a 37% of patients with Sjögren syndrome (the only autoimmune disease he included in his study), of which 77% were women. DES in Sjögren syndrome is often severe and refractary to treatment because the lagrimal secretion is greatly impaired (167). Tsubota (158) argues that AS is the preferred theraphy in these patients, due to the similar biochemichal characteristics of AS compared to the tear fluid, for being hypoalergenic and for containing growth factors and other necessary molecules for the ocular surface homeostasis. Noble (23) and Kojima (157) in their prospective and randomized studies treating Sjögren syndrome patients with AS, only found improvement in the conjunctival citology and symptom scoring. Before starting this study, we had a concern about using AS in patients with autoimmune diseases, given that the concentration of growing factors is lower in the serum of these patients (174,175,183-186). Nonetheless, the statistical analysis performed in the present work did not show differences between patients with autoimmune diseases assigned to SA group and those that were treated with UCBS eye drops. The only statistically significant value was the difference in the age of patients (p = 0.003). On the other hand, Yoon (174), found that UCBS eye drops were more effective than AS eye drops in the treatment of Sjögren syndrome, regarding symptom scoring, corneal staining and conjunctival citology. Versura (175) included graf-versus-host-disease and Sjögren syndrome patients with severe persistent corneal defects. After one month of treatment with UCBS, BUT, Schirmer 137 test, tear osmolarity, corneal esthesiometry, conjunctival epithelial metaplasia and the scoring of the questionnaire improved significantly. 5.6. Concentration of molecules There was a significant difference in the values of all the molecules in favor of the AS: albumin (g/dl), fibronectine (µg/ml), IgA (mg/dl), IgG (mg/dl), IgM (mg/dl), vitamine A (µg/dl), vitamine E (µg/dl), EGF (ng/dl) and TGF (ng/dl). However, the previous work in which the present study was based (174) and posterior articles (175,187,188), reported that the concentration of growth factors is higher in UCBS that in peripheral blood serum (AS in our study), except for vitamine A. Specifically, Yoon and Versura (28,173-175,187) found: a) Concentration of molecules that where higher in UCBS that AS: • EFG and TGFβ, three times and twice higher, respectively. • Other growth factors not included in this study: NGF y VEGF. • P substance. b) Concentration of molecules that where lower in UCBS that AS: • IGF (not included in this study). • Vitamine A. Even with the lower concentration in UCBS than AS, it was still higher than the concentration in tears and enough to prevent squamous metaplasia. The Centro Regional de Transfusión Sanguínea of Málaga owns the bigger Cord Blood Bank in Europe in terms of stored units. We do not believe that there were mistakes in the tecnique of preparation of the serum eye drops, because in the AS eye drops we obtain similar values to those reported by other authors (157,161,174,175,187). When comparing the mean values of the molecules of the AS eye drops samples with those reported by Geerling (157), they were equivalent, except for the vitamine A, whose concentrations where higher in our samples (table 7). 144 6. Conclusiones Del análisis de los resultados obtenidos en el presente trabajo, se extrajeron las siguientes conclusiones: 1. Ambos sueros son efectivos para el tratamiento del ojo seco. El test de Schirmer, el BUT, la tinción con fluoresceína, la tinción con verde de lisamina y el cuestionario mejoraron a lo largo de los tres meses del estudio con ambos tratamientos. 2. El SCU no es inferior al SA en el tratamiento del ojo seco. No ha habido diferencias estadísticamente significativas entre ambos tratamientos en el test de Schirmer, BUT, tinción con fluoresceína y el cuestionario, al mes y los tres meses de comenzar el tratamiento. Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en la tinción con verde de lisamina a favor del SA. 3. El SCU no presenta una mayor concentración de moléculas que el SA. En el presente estudio se ha hallado una menor concentración de albúmina, fibronectina, IgA, IgG, IgA, vitamina A, vitamina E, EGF y TGF en el SCU comparado con el SA. Este hecho puede ser debido a que el tiempo de almacenamiento previo a la preparación del colirio de SCU fue mucho mayor que el del SA. 4. El SCU presenta algunas ventajas con respecto al SA. • Pueden prepararse varios viales de una sola donante (15 viales de media por donación). 145 • Puede almacenarse de manera segura, por lo que puede administrarse inmediatamente en pacientes con patología urgente de la superficie ocular. • No es necesaria la extracción sanguínea al paciente, sino que se aprovechan las donaciones de sangre de cordón umbilical descartadas para trasplante de progenitores hematopoyéticos. Por tanto, es una opción terapéutica en pacientes no candidatos a la extracción periódica de sangre. 5. Más estudios prospectivos, aleatorizados y con número muestral amplio son necesarios para comparar los efectos entre los distintos sueros, con el objetivo de elaborar recomendaciones específicas para su empleo en los diversos contextos clínicos. 146 6. Conclusions After analyzing the data of the present study, we have arrived to the following conclusions: 1. Both AS and UCBS eye drops are effective for the treatment of the dry eye. Schirmer test, BUT, fluorescein staining, lissamine green staining and questionnaire scores improved during the three months of the study both with AS and UCBS eye drops. 2. UCBS is not inferior to AS in the treatment of the dry eye. There have not been statistically significant differences between AS and UCBS for the Schirmer test, BUT, fluorescein staining and the questionnaire scores at one and three months after starting the treatment. There has been, however, a statistically significant difference in the lissamine green staining in favour of SA. 3. UCBS do not contain a higher concentration of molecules compared to AS. In the current study we have been found a lower concentration of albumin, fibronectine, IgA, IgG, IgA, vitamine A, vitamine E, EGF and TGF in the UCBS eye drops compared to the AS eye drops. This may have been caused because of the longer storage time before the preparation of the UCBS eye drops compared to the AS eye drops. 4. UCBS eye drops show some advantages compared to AS eye drops. • Various vials can be obtained from a single donor (15 on average). 147 • It can be prepared and stored safely in advance, so it can be administered immediatly in case of an urgent condition of the ocular surface. • It is not necessary to perform the blood extraction to the patient. The eye drops are prepared from those samples that are no valid for the transplant of hemopoietic progenitors. Thus, UCS eye drops are an excellent option in those patients not suitable for periodic blood extraction. 5. The outcomes of the present study warrant further exploration in a larger, prospective, aleatorized study in order to compare the effects of the different serum eye drops, with the aim of developing specific recommendations for the diverse clinical scenarios. 148 Abreviaturas 149 7. Abreviaturas SOS = síndrome de ojo seco SA = colirio de suero autólogo SH = colirio de suero heterólogo SCU = colirio de suero de sangre de cordón umbilical UFL = unidad funcional lagrimal OSAD = ojo seco acuo-deficiente OSE = ojo seco evaporativo BUT = break up time, tiempo de rotura lagrimal EICH = enfermedad injerto contra huésped. 150 Bibliografía 151 8. Bibliografía 1. Gayton LG. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 2009; 3: 405–1 412. 2. (Miljanovic B, Dana R, Sullivan DA, Schaumberg DA. Impact of dry eye syndrome on vision-related quality of life. Am J Ophthalmol 2007; 143: 409-15. 3. Pflugfelder 1994Prevalence, Burden, and Pharmacoeconomics of Dry Eye Disease. 1994 4. Fox RI, Chan R, Michelson JB, Belmont JB, Michelson PE. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis Rheum 1984; 27: 459-461. 5. 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