Análisis morfológico y funcional de la interacción Podosphaera xanthii-cucurbitáceas

Departamento de Microbiología IHSM-UMA-CSIC Facultad de Ciencias Análisis morfológico y funcional de la interacción Podosphaera xanthiicucurbitáceas TESIS DOCTORAL JESÚS MARTÍNEZ CRUZ Málaga, 2016 AUTOR: Jesús Martínez Cruz http://orcid.org/0000-0002-3632-0837 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons ReconocimientoNoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Departamento de Microbiología IHSM-UMA-CSIC Facultad de Ciencias Análisis morfológico y funcional de la interacción Podosphaera xanthiicucurbitáceas Memoria presentada por Jesús Martínez Cruz Para optar al grado de Doctor por la Universidad de Málaga Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias D. Juan JOSÉ BORREGO GARCÍA, Director del Departamento de Microbiología de la Universidad de Málaga. AUTORIZA: La presentación de la Tesis Doctoral titulada “Análisis morfológico y funcional de la interacción Podosphaera xanthii-cucurbitáceas” del doctorando D. JESÚS MARTÍNEZ CRUZ para optar al grado de Doctor en Biología, por el Departamento de Microbiología de esta Universidad. Y para que así conste, y tenga los efectos que correspondan, en cumplimiento de la legislación vigente, expedimos el presente informe. En Málaga, 12 de Julio de 2016 Fdo. D. Juan José Borrego García Departamento de Microbiología IHSM-UMA-CSIC Facultad de Ciencias D. ALEJANDRO PÉREZ GARCÍA, Profesor Titular del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias, en la Universidad de Málaga. D. DIEGO FRANCISCO ROMERO HINOJOSA, Investigador Científico del Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias, en la Universidad de Málaga. INFORMAN: Que D. JESÚS MARTÍNEZ CRUZ, ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo experimental conducente a la elaboración de la presente Memoria de Tesis Doctoral. Y para que así conste, y tenga los efectos que correspondan, en cumplimiento de la legislación vigente, expedimos el presente informe. En Málaga, a 12 de Julio de 2016 Fdo. D. Alejandro Pérez García Fdo. D. Diego Fco. Romero Hinojosa Departamento de Microbiología IHSM-UMA-CSIC Facultad de Ciencias Este trabajo ha sido subvencionado por los proyectos: APROXIMACIONES GENOMICAS PARA EL CONTROL RACIONAL DEL OIDIO DE LAS CUCURBITACEAS (POSDOSPHAERA FUSCA). Programa Nacional de Recursos y Tecnologías Agroalimentarias (Plan Nacional de I+D+I) (AGL 2010-21848-CO2-01). Investigador Principal: Dr. Alejandro Pérez García EXPLOTACIÓN DE LA GENOMICA PARA EL CONTROL DEL OIDIO DE LAS CUCURBITACEAS. Ministerio de Economía y Competitividad, Programa Estatal de I+D+i orientada a los Retos de la Sociedad (AGL2013-41939-R).Investigador principal: Dr. Alejandro Pérez García. Jesús Martínez Cruz disfrutó de una ayuda Predoctoral de Formación de Personal Investigador (FPI) del Ministerio de Economía y Competitividad de referencia BES-2011-046757 asociada al proyecto de investigación AGL 2010-21848-CO2-01. Resumen 7 abre una nueva vía para el estudio de los oídios, permitiendo, por ejemplo, la realización de estudios de localización de proteínas fúngicas sin la intermediación de la planta como hasta ahora. Hasta el momento se han identificado numerosos efectores de hongos filamentosos, sin embargo, son pocos los identificados en oídios y muchos menos en los que se ha determinado papel que desempeñan en la interacción hongoplanta. Debido a la necesidad de identificar el panel de efectores y lo que es más importante, su función en la interacción, se desarrolló una metodología para el análisis funcional de efectores candidatos de P. xanthii. Para determinar el papel como verdaderos efectores de los efectores candidatos identificados en el secretoma epifítico de P. xanthii, se desarrolló un método de silenciamiento génico inducido por el hospedador mediante Agrobacterium tumefaciens (AtMHIGS, su acrónimo en inglés) sobre cotiledones de melón (capítulo 5). El análisis del desarrollo del hongo tras el silenciamiento mediante una tinción de sus estructuras fúngicas como el azul toluidina, reveló diferentes tipos de respuesta en el desarrollo de la infección. El análisis estadístico de los recuentos de haustorios por milímetro cuadrado a diferentes tiempos tras la inoculación agrupó a los efectores en cinco fenotipos según el efecto negativo de su silenciamiento sobre el crecimiento del hongo: ninguno, bajo, intermedio, alto y muy alto. Así, el silenciamiento de CSEP2838 no produjo ningún efecto significativo en comparación con el control negativo (vector vacío). En los casos de CSEP3171 y CSEP7690, el silenciamiento produjo un efecto negativo bajo sobre el crecimiento del hongo. El silenciamiento de CSEP2835 causó un efecto negativo intermedio. Por último, se observó un efecto negativo alto en los silenciamientos de CSEP2707 y CSEP2718 y muy alto en los silenciamientos de CSEP1984 y CSEP2978. Resumen 8 Además, el silenciamiento de los deferentes efectores candidatos analizados provocó diferentes efectos sobre la acumulación en las células de la planta de compuestos relacionados con la respuesta de defensa, como peróxido de hidrógeno (H2O2), lo que sugiere el desempeño de diferentes papeles en el establecimiento de la infección según el efector. En este caso, la agrupación de los efectores según la respuesta defensiva de la planta mostró un resultado similar a lo observado para el desarrollo del hongo. En el caso de CSEP2838 no se observó una respuesta significativa con respecto al control negativo, mientras que el del resto de efectores provocó distintas respuestas, significativamente diferenciables del control.. El principal problema del estudio funcional de los efectores de los oídios es el escaso número de proteínas con función anotadas. Este problema hace muy difícil dilucidar la función que desempeñan estas proteínas. Sin embargo, en los últimos años, los análisis y las predicciones bioinformáticas han resultado ser herramientas muy útiles para predecir la función de proteínas nuevas. Es por ello, que en este trabajo hemos empleado un conjunto de herramientas informáticas para la predicción de modelos 3D de los CSEP, así como para la identificación de sus posibles ligandos y funciones. Basándonos en las predicciones, obtuvimos que CSEP2838 pudiera tener una gran similitud estructural con una cupredoxina de pepino, lo que siguiere que podría actuar como un transportador de electrones posiblemente en la matriz extrahaustorial, ya que presenta péptido señal de secreción. El caso de CSEP2835 es muy interesante. Es un efector candidato con un dominio cerato-platanin, característico de proteínas con papel en la patogénesis. El papel que desempeña este tipo de proteínas es muy variado desde su participación en el desarrollo del hongo, protección de la pared celular o interacción con las respuestas de defensa del hospedador. Según las predicciones bioinformáticas, CSEP2835 podría actuar secuestrando fragmentos de celulosa Resumen 9 liberados como consecuencia de la degradación de la pared celular de la planta por la actividad de las enzimas del patógeno, evitando que se activen los mecanismos de defensa de la planta. CSEP1984 tiene alta homología con la proteína humana Alix y su ortólogo en la levadura Bro1. Estas proteínas también están presentes en las plantas y se caracterizan por participar en procesos esenciales para la vida vegetal como el tráfico de endosomas y cuerpos multivesiculares, la prevención de la apoptosis, regulación del tráfico de fosfato, el tráfico intracelular y la degradación de proteínas de membrana. Este tipo de actividad, regulando todos estos procesos en la planta, sería de gran utilidad para el patógeno, ya que en el sitio de intento de penetración de la célula huésped, la planta acumula gran cantidad de vesículas con compuestos antifúngicos. Además, en estos patógenos se ha observado la capacidad para inhibir la muerte celular programada. Es llamativa la homología estructural que presenta CSEP1984 con ALIX de melón a pesar de ser completamente diferentes a nivel de secuencia. El análisis del transcriptoma epifítico de P. xanthii reveló la presencia de dos proteínas adicionales con dominio ALIX. Sin embargo, a pesar de presentar gran homología a nivel de secuencia de nucleótidos, las proteínas son completamente distintas en estructura y en secuencia aminoacídica. La imitación de la estructura y función de la proteína ALIX de melón nos lleva a pensar en una estrategia de mimetismo por parte de P. xanthii para manipular procesos celulares básicos de la planta. Esta estrategia de mimetismo de proteínas ha sido observada en otros patógenos. En el caso de CSEP2707, este efector candidato presenta un dominio CFEM, característico de proteínas de membrana relacionadas con patogénesis. Un aspecto realmente interesante es la estructura de su secuencia, que tiene una región Nterminal similar a proteínas CFEM y una región homóloga a proteínas sensoras de estrés en el extremo C-terminal. Los resultados obtenidos de las predicciones Resumen 10 sugieren que CSEP2707 podría jugar un papel como sensor de P. xanthii, ya que su extremo extracelular es el similar a las proteínas sensoras de estrés. Además, esta región contiene un dominio de baja complejidad rico en Gly/Asp, relacionado con la interacción con otras proteínas y ligandos. Esta hipótesis está en consonancia con la descrita por varios autores que sugieren que las proteínas CFEM actuarían como sensores de la superficie de la planta. Otro dato interesante es el papel que podría desempeñar CSEP2718 en la interacción patógeno-planta como una posible metiltransferasa de acuerdo con las predicciones de la informática. Por otra parte, su estructura es muy similar a Sp1, una pequeña proteína (29 aminoácidos) de humanos, que actúa como un factor de transcripción en el control de muchos procesos inmunes. Las predicciones de ligandos indican que CSEP2718 se une potencialmente a adenina, péptidos y Sadenosilmetionina. Curiosamente, las metiltransferasas se caracterizan por su capacidad para transferir grupos metilo de un donante, tal como Sadenosilmetionina, a un receptor que puede ser proteína, como las histonas, ADN o ARN, concretamente los residuos de adenina y citosina. Estudios anteriores han demostrado que estas modificaciones epigenéticas son explotadas por varios patógenos, que secretan metiltransferasas como efectores en el interior de células del huésped, provocando la desregulación de la expresión de ciertos genes. En una línea similar se enmarca el papel de CSEP2978, cuyo modelo 3D y las predicciones de ligando, indican que podría actuar como un factor de transcripción. Por desgracia, no se encontró homología con ninguna estructura cristalina en bases de datos de proteínas. La posibilidad de que P. xanthii pudiera disponer de efectores con papel en la regulación de la transcripción no sería tan extraño, ya que se conocen varios ejemplos de infecciones en las que se han observado cambios transcripcionales modulados por los patógenos para mejorar su propia supervivencia. Resumen 11 De acuerdo con la homología del modelo 3D y las predicciones informáticas, CSEP3171 podría ser una α-manosidasa y tendría a αy β-manosa como ligandos. Este tipo de actividad y ligandos son características de exo-α-manosidasa, cuya actividad es el procesamiento de la manosa de los enlaces N-glicanos. La Nglicosilación es un proceso importante para la estructura como para la actividad de algunas proteínas de eucariotas. Por tanto, un efector con este tipo de actividad sería de gran utilidad para el patógeno puesto que le permitiría poder alterar la actividad de algunas proteínas de la planta. Es bien conocido que el papel de los efectores de hongos no es únicamente suprimir las respuestas de defensa de la planta, sino también para modular la fisiología y la arquitectura de la célula huésped para acomodar la estructura invasiva del hongo como es el haustorio. En este contexto, el modelo 3D de CSEP7690 sugiere un papel muy interesante para este efector en el establecimiento de la infección. Este efector candidato presenta una alta homología estructural con el dominio F-BAR de tirosina quinasa humana y el dominio F-BAR de Saccharomyces cerevisiae, proteínas que están relacionadas con la remodelación de las membranas celulares, la biogénesis de orgánulos, el tráfico de membrana, la morfología celular y una variedad de procesos basados en actina. Por tanto, la estructura hipotética de este efector sugiere un papel muy interesante desde el punto de vista del establecimiento del haustorio, pudiendo actuar sobre las rutas de remodelación de las membranas de la planta. Tras los resultados obtenidos podemos concluir que el silenciamiento génico inducido por hospedador mediado por A. tumefaciens (AtM-HIGS) es un método fiable para el estudio del papel de los efectores candidatos de P. xanthii en la interacción hongo-planta, que ha permitido determinar que los efectores ensayados participan de distinta forma en la interacción patógeno-planta manipulando las respuestas de defensa de la planta. De esta forma, hemos Resumen 12 establecido un "flujo de trabajo" eficaz para la caracterización de los efectores candidatos de P. xanthii basándonos en el análisis combinado de su función in vivo mediante AtM-HIGS y su función in silico mediante el empleo de un conjunto de herramientas bioinformáticas para la modelización de estas proteínas y la predicción de interacciones proteína-ligando. Los resultados nos han permitido formular diversas hipótesis sobre el papel que los diferentes CSEP de P. xanthii podrían desempeñar en la interacción. Obviamente, estudios funcionales adicionales tienen que llevarse a cabo para determinar la función exacta de estos efectores en la patogénesis de P. xanthii. Tras la puesta a punto de un método de silenciamiento de los efectores de P. xanthii en cotiledones de melón mediante A. tumefaciens, llevamos a cabo el análisis de una familia de doce efectores candidatos de P. xanthii (capítulo 6). El análisis de las secuencias aminoacídicas de los doce miembros de la familia mostró que sus secuencias son prácticamente idénticas salvo el extremo carboxilo terminal que contiene una región de baja complejidad, lo que permite clasificarlas en 5 grupos filogenéticos. Además, la comparación de las secuencias con sus homólogos en Blumeria graminis f. sp. hordei, Golovinomyces orontii y Erysiphe pisi, indica que están muy conservadas, incluso a nivel de nucleótidos, entre especies cercanas. Los análisis mediante BLASTx mostraron que estas proteínas están ampliamente distribuidas entre diferentes especies de hongos filamentosos, todos ellos hongos patógenos. El análisis de la expresión de representantes de cada uno de los grupos mostró que su expresión aumentaba en los primeros momentos de la infección, coincidiendo con la penetración de la célula huésped, disminuyendo durante el desarrollo del haustorio. Este patrón de expresión está correlacionado con la expresión de genes de defensa en planta, cuya expresión alcanza su máximo en el momento de penetración del hongo. Resumen 13 Para analizar el papel de estos efectores en el desarrollo de la infección y en la respuesta de defensa de la planta llevamos a cabo el silenciamiento simultáneo de todos ellos y de un miembro de cada uno de los grupos que componen esta familia mediante el sistema AtM-HIGS. Analizando el desarrollo del hongo tras el silenciamiento, observamos que el número de haustorios por milímetro cuadrado respecto al control disminuía y se hacía más patente a las 120 horas tras la inoculación. El efecto negativo sobre el crecimiento del hongo variaba, no obstante, según el grupo silenciado, siendo muy notorio en el caso del silenciamiento simultáneo de los doce miembros de la familia. Resultó muy interesante el efecto sobre la colonia fúngica, mostrando un desarrollo más compacto y los puntos de penetración más cercanos entre sí en comparación con las hojas agro-infiltradas con el vector vacío. En el caso del análisis de la respuesta de defensa de la planta, el silenciamiento mostró que cada grupo que compone esta familia tiene un papel diferente en la interacción con el hospedador. Su silenciamiento se traduce en un aumento del número de células que acumulaban H2O2 y calosa. Además, el silenciamiento del conjunto de todos los miembros aumentó drásticamente la respuesta de defensa de la planta, lo que indicaba que sus actividades son sumatorias y no independientes. Ante la falta de homología con proteínas funcionalmente anotadas se llevó a cabo el análisis bioinformático. El modelaje con I-TASSER y el análisis bioinformático mostraron una gran homología estructural con el cristal de varias quitinasas. Además, las predicciones de ligando indicaban que se trataba de proteínas que tenían como sustrato N-acetilglucosamina, monómero que conforma la quitina, compuesto mayoritario de la pared celular de los hongos, insectos y crustáceos. Estas predicciones preliminares se tornaron en certezas tras realizar ensayos de degradación de quitina in vitro con proteína purificada a partir de su expresión en Escherichia coli. Los ensayos de turbidez mostraron que la turbidez Resumen 14 de las suspensiones de quitina coloidal disminuía en presencia de estas proteínas. Además, el ensayo de liberación de azúcares reducidos, demostró la actividad de estos efectores candidatos liberando este tipo de compuestos, que es característico de la actividad de las quitinasas. Por otro lado, los ensayos de afinidad frente a diferentes concentraciones de quitina coloidal mostraron la afinidad de estos efectores candidatos por la quitina. Estos resultados indicaban que estos efectores tenían actividad quitinasa. Tras los resultados obtenidos surgió la pregunta de qué papel desempeñaban estos efectores en la interacción P. xanthii-cucurbitáceas. Tal y como se ha visto en otros sistemas, los hongos patógenos son capaces de ocultar compuestos de su pared celular que sean reconocidos por receptores del hospedador, evitando de esta manera activar las respuestas de defensa de la planta. Por ello, nos planteamos que el papel de esta familia de efectores reside en la degradación de fragmentos de quitina, un reconocido patrón molecular asociado al patógeno (PAMP), que se libera de la pared celular del hongo como consecuencia de la actividad de las quitinasas de la planta, evitando que se active la inmunidad disparada por quitina. Para corroborar dicho planteamiento, se llevó a cabo el doble silenciamiento del conjunto de efectores y el principal receptor de quitina de la planta, CERK1. Los resultados mostraron que, en ausencia de CERK1, la respuesta de defensa de la planta disminuía significativamente a pesar de estar silenciados estos efectores, lo que demuestra el papel de éstos en la interacción es evitar el reconocimiento de los fragmentos de quitina del hongo. Además, la localización de dos de estos efectores CSEP2158 (grupo 2) y CSEP5191 (grupo 3) mostró que ambos efectores se localizaban en la papila de la planta, colocalizando con polímeros libres de quitina acumulados como consecuencia de la degradación de la quitina del hongo por las quitinasas de la planta. Resumen 15 Tras los resultados obtenidos concluimos que esta familia de doce efectores está ampliamente distribuida sólo y exclusivamente en hongos patógenos. Además, participa en la interacción con la planta, actuando como quitinasas secretadas por el patógeno y degradando los fragmentos de quitina liberados de la pared celular del hongo y evitando la inmunidad disparada por quitina. Por consiguiente, estos efectores fueron designados como proteínas ECHA, acrónimo de las siglas “effectors with chitinase activity”. El análisis del secretoma epifítico de P. xanthii permitió identificar un transcrito codificante para una quitina deacetilasa, PxCDA. Las quitinas desacetilasas son enzimas responsables de la modificación de la quitina de la pared celular fúngica, hidrolizando el grupo acetamido de las unidades de Nacetilglucosamina, para obtener quitosano, una molécula menos accesible a las quitinasas de la planta. De esta forma, la quitina de la pared celular del hongo es ocultada de la percepción de la planta, evitando así la activación de la inmunidad disparada por quitina. A pesar de ser una proteína identificada en numerosos hongos filamentosos e incluso en insectos, su papel en la interacción plantapatógeno no ha sido analizado. Por ello llevamos a cabo ensayos de silenciamiento de pxcda mediante el sistema AtM-HIGS en cotiledones de melón (capítulo 7). El silenciamiento de PxCDA resultó en la completa inhibición del crecimiento del hongo, observándose una disminición de casi la mitad del porcentaje de superficie infectada en comparación con las plantas control. Visualizando las estructuras fúngicas mediante toluidina se observaron conidias con un tubo germinativo y un haustorio inmaduro. Sin embargo, la infección era totalmente frenada puesto que no se observaban hifas secundarias. Además, el análisis de la respuesta de defensa de la planta mostró que tras el silenciamiento de PxCDA se Resumen 16 producía un aumento drástico de la acumulación de H2O2 en el interior de las células vegetales que interaccionaban con el hongo. Tal y como se realizó en el análisis de la familia de quitinasas de P. xanthii, los efectores ECHA, se llevó a cabo el doble silenciamiento de PxCDA y el receptor de quitina de melón CERK1. Los resultados mostraron la reversión del crecimiento del hongo y la disminución del número de células de la planta que acumulaban H2O2. Incluso se observó muerte celular en las células de la planta donde el patógeno había intentado fallidamente penetrar. Todo esto indicaba que el efecto negativo del silenciamiento de pxcda sobre el crecimiento del hongo estaba asociado a la activación de la inmunidad disparada quitina. Además, el análisis de la localización subcelular de estas proteínas mediante su fusión a GFP mostró que la fluorescencia se localizada en la pared celular del hongo desde el desarrollo de la clavija de penetración hasta la formación del haustorio inmaduro, estando ausente en el haustorio maduro, lo que indicaba que el papel que desempeñan estas proteínas estaba restringido a las fases más tempranas e íntimas de la interacción. Consecuencia de la actividad deacetilasa de estas proteínas se libera acetato. En trabajos previos se había demostrado que la acumulación de acetato produce la inhibición de la actividad quitina deacetilasa in vitro como consecuencia de un fenómeno de retroalimentación negativa. Además, compuestos derivados del acetato, los denominados ácidos carboxílicos, como el ácido acético y ácido láctico, también han resultado ser inhibidores de la actividad quitina deacetilasa. Es por ello que decidimos llevar acabo ensayos de inhibición del crecimiento de P. xanthii en discos de melón tratados con diferentes concentraciones de ácido acético, láctico y EDTA (un derivado del acetato). La medición de los diámetros de las colonias mostró que la aplicación de estos compuestos tanto antes como después de la inoculación de P. xanthii producía una inhibición del desarrollo de Conclusions 463 The main conclusions derived from this work were as follows: 1. Haustorial lobes of Podosphaera xanthii are primarily responsible for vesicle trafficking and most likely act as major mediators of the fungus-plant dialogue. 2. Agrobacterium tumefaciens is a useful, reliable and reproducible tool for transient transformation of P. xanthii, which allows, for example, studies location effectors. 3. This work describes for the first time the transformation of haustoria with A. tumefaciens as a tool for transient transformation of haustoria-forming fungi. In P. xanthii, this strategy is more effective than the direct transformation of conidia. 4. The host induced gene silencing by A. tumefaciens (AtM-HIGS) is a very useful tool for the identification of effectors from P. xanthii. 5. Candidates effectors CSEP1984, CSEP2707, CSEP2718, CSEP2835, CSEP2978, CSPE3171 and CSEP7690 are bona fide effectors of P. xanthii although they contribute differently to the pathogenesis. Conclusions 464 6. During the penetration of the host, P. xanthii secretes a family of at least twelve chitinases apparently responsible for the degradation of chitin-oligomers released from the fungal cell wall by the action of plant chitinases, which contributes to arrest the activation of chitin-triggered plant immunity. 7. These chitinase called ECHA and identified for the first time in this study, are widely distributed among different species of plant pathogenic fungi, animals and opportunistic, suggesting a central role in the interaction with the host. 8. Chitin deacetylases from P. xanthii are essential proteins to hide the pathogen from the innate immune mechanisms of plants. 9. In addition, inhibition assays with different carboxylic acids suggest that chitin deacetylases are potentially very interesting targets for the development of new phytosanitary. 10. In this work a chitin binding protein lacking the typical LysM domain has been identified for the first time. This effector from P. xanthii called CHEB1 is a truncated version of a chitin deacetylase, as result of a process of alternative splicing. This effector would be responsible for the sequestration of chitin polymers released at the fungal penetration point, preventing the activation of the chitin-triggered immunity. CONCLUSIONES Conclusiones 467 Las principales conclusiones derivadas de este trabajo fueron los siguientes: 1. Los lóbulos del haustorio de Podosphaera xanthii son los principales responsables del tráfico de vesículas y muy probablemente actúan como los principales mediadores del diálogo hongo-planta. 2. Agrobacterium tumefaciens es una herramienta útil, fiable y reproducible para la transformación transitoria de P. xanthii, que ha permitido, por ejemplo, la realización de estudios de localización de efectores. 3. En este trabajo se ha descrito por primera vez la transformación de haustorios mediante A. tumefaciens como herramienta para la transformación transitoria de hongos formadores de haustorios. En P. xanthii esta estrategia es más eficaz que la transformación directa de conidios. 4. El silenciamiento génico inducido por hospedador mediante A. tumefaciens (AtM-HIGS) es una herramienta muy útil para la identificación de efectores de P. xanthii. Conclusiones 468 5. Los efectores candidatos CSEP1984, CSEP2707, CSEP2718, CSEP2835, CSEP2978, CSPE3171 y CSEP7690 son verdaderos efectores de P. xanthii aunque contribuyen de distinta manera a la patogénesis. 6. Durante la penetración del huésped, P. xanthii secreta una familia de al menos doce quitinasas que parecen ser responsables de la degradación de los oligómeros de quitina liberados de la pared celular del hongo por la acción de quitinasas de la planta, evitando así la activación de la inmunidad disparada por quitina. 7. Estas quitinasas, denominadas ECHA e identificadas por primera vez en este estudio, están ampliamente distribuidas entre diferentes especies de hongos patógenos de plantas, de animales y oportunistas, lo que sugiere un papel central en la interacción con el huésped. 8. Las quitina deacetilasas de P. xanthii son proteínas fundamentales para la ocultación del patógeno a los mecanismos de inmunidad innata de la planta. 9. Además, los ensayos de inhibición con diferentes ácidos carboxílicos sugieren que las quitinas deacetilasas son dianas potencialmente muy interesantes para el desarrollo de nuevos fitosanitarios. Conclusiones 469 10. En este trabajo se ha identificado por primera vez una proteína de unión a quitina que carece de los típicos motivos LysM. Este efector de P. xanthii denominado CHEB1, es una versión truncada de quitina deacetilasa obtenida mediante splicing alternativo. Dicho efector sería responsable de secuestrar polímeros de quitina liberados en el punto de penetración, evitando la activación de la inmunidad disparada por quitina.