Efecto de Hidroxitirosol sobre algunos biomarcadores cardiovasculares en la Diabetes Mellitus experimental

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Ciencias de la Salud TESIS DOCTORAL E Ef fe ec ct to o d de e h hi id dr ro ox xi it ti ir ro os so ol l s so ob br re e a al lg gu un no os s b bi io om ma ar rc ca ad do or re es s c ca ar rd di io ov va as sc cu ul la ar re es s e en n l la a D Di ia ab be et te es s M Me el ll li it tu us s e ex xp pe er ri im me en nt ta al l Miriam Abdel Karim Ruiz Málaga, Enero de 2016 Laboratorio de Investigaciones Antitrombóticas e Isquemia Tisular Departamento de Farmacología y Terapéutica Clínica Departamento de Farmacología y Terapéutica Clínica AUTOR: Miriam Abdel Karim Ruiz http://orcid.org/0000-0002-8251-1386 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Y PEDIATRÍA D. JOSE ANTONIO GONZALEZ CORREA, Doctor en Medicina y Cirugía, D. JOSE PEDRO DE LA CRUZ CORTES, Doctor en Medicina y Cirugía y D. JUAN ANTONIO LOPEZ VILLODRES, Doctor en Medicina y Cirugía, adscritos al Área de Farmacología y Terapéutica Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Málaga, CERTIFICAN: Que Dª. Miriam Abdel Karim Ruiz ha obtenido y estudiado personalmente bajo nuestra dirección el material necesario para la realización de su Tesis Doctoral titulada: “E Ef fe ec ct to o d de e h hi id dr ro ox xi it ti ir ro os so ol l s so ob br re e a al lg gu un no os s b bi io om ma ar rc ca ad do or re es s c ca ar rd di io ov va as sc cu ul la ar re es s e en n l la a D Di ia ab be et te es s M Me el ll li it tu us s e ex xp pe er ri im me en nt ta al l” ”, la cual ha finalizado con todo aprovechamiento, habiendo los que la suscriben revisado su Tesis y estando conformes para ser juzgada. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, expedimos el presente certificado en Málaga a 12 de Noviembre de 2015. J.A. González Correa J.P. de la Cruz Cortés J. A. López Villodres En primer lugar una mención a los Profesores José Pedro de la Cruz Cortés, José Antonio González Correa, y Juan Antonio López Villodres. Mi agradecimiento a José Pedro por haberme acogido en su grupo de trabajo. Todavía recuerdo el primer día que entre en el Departamento, me dijo que no, que no necesitaban alumnos, me fui desilusionada. Pero mi voz interior, me impulsaba a insistir, y aquí estoy leyendo mi tesis en el día de hoy. Gracias por tanta paciencia y confianza que ha mostrado conmigo y el entusiasmo con el que me ha guiado. A José Antonio, gracias, por orientarme y aconsejarme, por acogerme en su grupo de trabajo, así como la guía que me ha ofrecido durante estos años, por los consejos que me ha brindado y en general por estar siempre disponible para ayudar. A Juan agradecerle, su dedicación, el tiempo que ha pasado junto a mí, en el Laboratorio, en el Animalario, por sus explicaciones, por sus consejos…ayudándome con su experiencia y conocimiento a darle forma a este trabajo. A los doctores Javier Muñoz Marín, Ana Guerrero Loriguillo y Antonio Pino Blanes, por las infinitas horas, por haber sido mi paño de lagrimas, por haber brindado su esfuerzo, por su tiempo y sus opiniones. Nos dijeron que no éramos de aquí que eramos viajeros, gente de paso huéspedes de la tierra, camino de las nubes. Rafael Alberti A Jose Julio, por aquella tarde, compartir conmigo su meta, su doctorado, haciendo que me interesase, y agradecerle las infinitas veces que se ha puesto a explicarme, con esos ejemplos tan fáciles para que pudiese entender las dudas que tenía. A Beatriz, Lucía, Elena, Maribel, Rocío, Miriam, María, Lidia, Inma, Susana y Nuria mis compañeras del Laboratorio por las horas que habéis compartido conmigo. Al personal del Animalario, por el cuidado y mantenimiento de mis ratillas. Recuerdo, con mucho cariño, aquella vez que entretuvieron a mi hija Dana enseñándole los animalillos mientras yo les daba el tratamiento. O, el día que, tuve que entrar con ella, le encantaban, las quería coger, las observaba muy de cerca y constantemente me preguntaba que como estaban, lo qué iba a ser de ellas… Bueno, pues aquí estoy…por fin…y parece que fue ayer… Ahora me encuentro finalizando esta aventura tan enriquecedora. No siempre ha sido fácil. Las circunstancias de mi vida han hecho que la realización del doctorado se convirtiera por momentos en un tormento. Cuantas veces pensé en abandonar pues todo lo tenía en contra. Esta experiencia me ha permitido conocerme mucho mejor y desarrollar mi paciencia, comprender lo que mis padres me decían sobre la importancia vital de terminar lo que uno empieza, crecer en fortaleza, seguir siempre adelante y no rendirme nunca. Gracias a la vida por esta experiencia en la que mis lagrimas, se han convertido a día de hoy en destellos de luz y alegría. A Jose y Dana, por su paciencia, su ánimo, por su comprensión, por no poder dedicarles su tiempo. Como no, a mis padres por su ejemplo y constante ayuda… A mi abuelo y sus anécdotas, a mi abuela...., dondequiera que esten… A mis hermanas, Yasmeen y Naila. A Gloria, mi amiga del alma. A Rosario por su incondicional amistad. A Soledad, por su sonrisa, por su dulzura. A María Dolores, por estar siempre ahí. A Latifa, siempre, desde niñas. A María Jesús por la paz que trasmites. Mi reconocimiento a Jose Luís, Marian y Moisés por estar siempre apoyándome. A Manuel, Migue, Angie, Alfonsa, Miguel y Matias por sus ánimos. A Patricia Carbonell y Oscar, por esas horas… A Rafa y mis compañeros Almudena, Bea, Begoña, Carlos, Cuca, Encarni, Esperanza, Eva, Irene, Isa, Lourdes, Manolo, Mª Carmen, Mariela, Mery, Paco, Paola, Patri, Rocio, Sonia Muñoz y Sonia Sanchez por su gran ayuda en la Unidad de Hemodiálisis del Hospital Costa del Sol. A Joana de la Biblioteca del Hospital Costa del Sol por facilitarme los artículos. A Ahmad, gracias por su apoyo, su confianza, su ayuda y su tiempo… Muchas gracias. Abreviaturas A AA: Ácido araquidónico ADA: Asociación Americana de Diabetes ADP: Adenín difosfato AP-1: Proteína activadora 1 AO: Aceite de oliva AOV: Aceite de oliva virgen ATP: Adenín trifosfato ANOVA: Análisis de la varianza B BBS: Solución tampón bicarbonatada BH4: Tetrahidrobiopterina C CaM: calmodulina COX: Ciclooxigenasa D DAG: Diacilglicerol DE: Disfunción endotelial DietMed: Dieta Mediterránea Abreviaturas DM: Diabetes Mellitus DM1: Diabetes Mellitus tipo 1 DM2: Diabetes Mellitus tipo 2 E ECA: Enzima convertidora de angiotensina ECE: Enzima convertidora de endotelina ECGS: Suplemento de crecimiento de células endoteliales ECV: Enfermedad Cardiovarcular eNOS: Óxido nítrico sintasa endotelial ERO: Especies reactivas de oxígeno ERN: Especies reactivas de nitrógeno ET: Endotelina F FAD: Flavina adenina dinucleótido FAM: Flavina adenina mononucleótido FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations FCEV: Factor de crecimiento del endotelio vascular FNTα: Factor de necrosis tumoral alfa FvW: Factor von Willebrand Abreviaturas G G6PD: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GC: Guanilato ciclasa GCs: Guanilato ciclasa soluble GMPc: Guanosín monofosfato cíclico Glu: glutamato GLUT 4: Glucosa transportadora tipo 4 Gln: Glutamina GSH: Glutation H H2O2: Peróxido de hidrógeno HDL: Lipoproteína de alta densidad HbA1c: Hemoglobina glicosilada A1c HT: Hidroxitirosol I ICAM: Moléculas de adhesión intracelular IFNγ: monoquina inducida por interferón IL: Interluquina Abreviaturas iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible L LDL: Lipoproteína de baja densidad LDLox: Lipoproteína de baja densidad oxidada M MAPK: Proteína quinasa activada por mitógenos MCP-1: Proteína quimiotáctica monocitaria 1 MDA: Malondialdehido MMP: matriz metaloproteasa MPO: Mieloperoxidasa MPOx: Concentración sérica de Mieloperoxidasa N NDDG: National Diabetes Data Group NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NADP+: Alcohol deshidrogenasa NF-kB: Factor de transcripción nuclear kB NO: Óxido nítrico NOS: Óxido nítrico sintasa NOSn: Oxido nítrico sintasa neuronal Abreviaturas NOSe: Óxido nítrico sintasa endotelial O O2−: Anión superóxido -OH: Anión hidroxilo OMS: Organización Mundial de la Salud ONOO −: peroxinitrito P PAI-1: Plasminógeno de tipo 1 PCR: reacción de la cadena de la polimerasa PFG: productos finales de glicación PGI2: Prostaciclina. PKC: Proteína quinasa C PNs: Péptidos natriuréticos PREDIMED: Prevención con dieta mediterránea R RL: Radicales libres rpm: Revoluciones por minuto. RAGE: Receptores específicos S Abreviaturas SOD: Superoxido dismutasa. STAT-1α: Activador de transcripción-1 α sGC: Guanilato ciclasa soluble T TBARS: Ácido tiobarbitúrico TNF-α: Factor de necrosis tumoral α. tPA: activador del plasminógeno tisular TxA2: Tromboxano A2 TxB2: Troboxano B2 U UDP-NAc-glu: Uridin-difosfato N-Acetil-glucosamina V VCAM: Moléculas de adhesión de células vasculares. ÍNDICE Índice 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. DEFINICION DE DIABETES MELLITUS 3 1.2. CLASIFICACIÓN. 4 1.2.1 DIABETES MELLITUS TIPO 1 AUTOINMUNE. 5 1.2.2 DIABETES MELLITUS TIPO 2. 5 1.3. FACTORES DE RIESGO PARA DESARROLLAR DIABETES 6 1.4. EPIDEMIOLOGÍA EN LA DIABETES 7 1.5. COMPLICACIONES DE LA DIABETES MELLITUS 8 1.6. MECANISMOS DE DAÑO DE HIPERGLUCEMIA. CAMBIOS EN VÍAS BIOQUÍMICAS. 10 1.6.1. ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE LOS POLIOLES 12 1.6.2. VÍA DE LA HEXOSAMINA 14 1.6.3. VÍA DEL DIACILGLICEROL-PROTEINCINASA C 15 1.6.4. FORMACIÓN DE PRODUCTOS FINALES DE GLICACIÓN AVANZADA (PFG) 18 1.6.5. ESTRÉS OXIDATIVO 19 1.7. ENDOTELIO VASCULAR 24 1.8. SUSTANCIAS VASODILATADORAS DEL ENDOTELIO 25 1.8.1. ÓXIDO NÍTRICO 25 1.8.2. PROSTACICLINA 28 1.9. SUSTANCIAS VASOCONSTRICTORAS DEL ENDOTELIO 29 1.9.1. ENDOTELINAS 29 1.9.2. ANGIOTENSINA II 30 1.9.3. TROMBOXANO A2 31 1.10. DISFUNCIÓN ENDOTELIAL 32 1.11. DAÑOS BIOQUÍMICOS: ESTÍMULO DE LA INFLAMACIÓN 35 1.12. COAGULABILIDAD 39 1.13. DIETA MEDITERRANEA 41 1.14. ACEITE DE OLIVA 46 1.15. OBTENCIÓN DEL ACEITE DE OLIVA 47 1.16. TIPOS DE ACEITE DE OLIVA 50 1.17. COMPONENTES DEL ACEITE DE OLIVA 51 1.18. HIDROXITIROSOL 55 1.19. PROPIEDADES DEL HIDROXITIROSOL 57 Introducción Algunos procesos patogénicos implicados en el desarrollo de la DM destruyen las células beta del páncreas con la consiguiente deficiencia de insulina, y otros que resultan en la resistencia a la acción de la insulina. Las anomalías del metabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas son deficientes debido a la acción de la insulina sobre los tejidos diana que resultan de la insensibilidad o la falta de insulina (Bosch, Alfonso, & Bermejo, 2002; World Health Organization, 1999). 1.2. CLASIFICACIÓN. La clasificación de la DM, data del año 1979 por la National Diabetes Data Group (NDDG), que aprobó un documento, titulado “Classification and diagnosis of DM and other categories os glucose intolerance”, publicado en la revista de Diabetes y posteriormente adaptado y publicado por la OMS. En 1997, tras dos años de trabajo de una comisión formada por expertos de la OMS y la Asociación Americana de Diabetes (ADA), se dieron a conocer los diferentes tipos de DM que quedaron reducidos a 4 grupos (Albert Cuñat, 2001; Alberti & Zimmet, 1998; World Health Organization, 1999): 1. Diabetes tipo 1. 2. Diabetes tipo 2. 3. Diabetes gestacional. 4. Otros tipos específicos. a. Defectos genéticos de las células Beta. b. Defectos de acción de la insulina de etiologia genética. c. Enfermedades del páncreas exócrino. 4 Introducción d. Endocrinopatías. e. Inducida por fármacos u otras sustancias químicas f. Infecciones. g. Formas infrecuentes de diabetes mediada por inmunidad. h. Otros síndromes genéticos a veces asociados a diabetes. 1.2.1 DIABETES MELLITUS TIPO 1 AUTOINMUNE. Este tipo de diabetes corresponde a la llamada antiguamente Diabetes Insulino dependiente o Diabetes de comienzo juvenil. Puede afectar a todas las edades, pero es más frecuente en niños, jóvenes y adultos jóvenes, y por lo general se diagnostica antes de los 30-40 años. Suele tener un comienzo brusco, con abundante sintomatología. En las personas con diabetes tipo 1 el páncreas es incapaz de producir suficiente insulina, debido a la destrucción autoinmune de las células β de los Islotes de Langerhans del páncreas regulado por células T, necesitando la administración de insulina para poder controlar los niveles de insulina en sangre. 1.2.2 DIABETES MELLITUS TIPO 2. Es un mecanismo fisiológico y complejo, aquí el páncreas sí produce insulina pero, o bien, no produce suficiente, o no puede aprovechar la que produce y la glucosa no está bien distribuida en el organismo (resistencia a la insulina), esto quiere decir que el receptor de insulina de las células que se encargan de facilitar la entrada de la glucosa a la propia célula están dañados. Este tipo afecta al 90-95% de las personas, se observa en adultos y ancianos, aunque puede aparecer en niños y adolescentes, se relaciona con 5 Introducción la obesidad; anteriormente llamada diabetes del adulto o diabetes relacionada con la obesidad. Habitualmente se diagnóstica por encima de los 30-40 años de edad. Frecuentemente la persona no nota los síntomas, por lo que se diagnostica después de algún tiempo de padecerla sin saberlo. Se caracteriza porque aunque el páncreas produce insulina (a veces en cantidades superiores a lo normal), el organismo no es capaz de utilizarla de modo eficaz. Para controlarla es necesario el uso de antidiabéticos orales, y pueden acabar precisando inyecciones de insulina. Los criterios diagnósticos para la DM en la actualidad son: Glucosa en ayuno < 100 mg/dL = glucosa de ayunas normal. AGA 101 mg/dL y < 126 mg/dL = AGA = anomalías de glucosa de ayuno. DM > 126 mg/dL = diagnóstico de DM. 1.3. FACTORES DE RIESGO PARA DESARROLLAR DIABETES Los principales factores de riesgo para la diabetes son la edad (se incrementa con la edad), el sobrepeso o la obesidad, los antecedentes familiares, el sedentarismo, el pertenecer a un grupo étnico de alto riesgo y el haberle identificado prediabetes con anterioridad. Otros factores de riesgo son la diabetes gestacional o haber dado a luz un bebé con un peso igual o superior 4 kg, la hipertensión arterial, la hipertrigliceridemia (> 2.82 mmol/L o 250 mg/dL) o tener niveles séricos bajos de colesterol de alta densidad (HDL 6 Introducción 0.9 mmol/L o 35 mg/dL). El síndrome de ovarios poliquísticos y la historia de enfermedad vascular también son considerados factores de riesgo para la diabetes. En pacientes con síndrome metabólico el riesgo de desarrollar diabetes es, en promedio tres veces mayor (Gerstein et al., 2007). El conocimiento de los principales factores de riesgo para estas enfermedades y las conductas preventivas en la población, son fundamentales para la prevención y el control de estas afecciones. 1.4. EPIDEMIOLOGÍA EN LA DIABETES La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha pronosticado que en el año 2030 la diabetes afectará a 370 millones de personas, lo que supone un aumento de un 114% con respecto a las últimas cifras publicadas por esta entidad, correspondientes al año 2000. La prevalencia de la diabetes para todos los grupos de edad en todo el mundo se estimó en 4,4% en 2030. El cambio demográfico más importante en cuanto a la prevalencia de la diabetes en todo el mundo, se incrementa en personas > 65 años de edad (Wild, Roglic, Green, Sicree, & King, 2004). Actualmente, la diabetes se distribuye por todo el mundo, aunque tiene mayor peso en los países desarrollados y en aquellos en vías de desarrollo, existiendo actualmente unos 177 millones de enfermos en todo el mundo, de los cuales más del 90% son pacientes con diabetes tipo 2 (DM2). La incidencia de la DM2 podría cifrarse en torno a 60-150 casos nuevos por 100.000 habitantes y año, mientras que en la diabetes tipo 1 (DM1) se acercaría a 10-12 casos por 100.000 habitantes. En los 7 Introducción próximos años las cifras obtenidas aumentaran, entre otros factores, por el envejecimiento de la población y el estilo de vida sedentario, y una de sus consecuencias, el aumento de la obesidad, especialmente entre los niños. En este sentido, los especialistas recomiendan la adopción de medidas higiénico-dietéticas con carácter preventivo para intentar limitar la prevalencia futura de la patología. En España, la DM es una de las primeras causas de mortalidad. Canarias y Andalucía presentan la mayor mortalidad, con una tendencia descendente. Los diabéticos tienen una mayor mortalidad que los no diabéticos, sus complicaciones son las principales causas de la mayor mortalidad, sobre todo la enfermedad isquémica del corazón. Las estimaciones de prevalencia de DM2 en España varían entre el 4,8 y el 18,7%, las de DM1 entre el 0,08 y el 0,2%. En cuanto a incidencia anual, se estima entre 146 y 820 por 100.000 personas para la DM2 y entre 10 y 17 nuevos casos anuales por 100.000 personas para la DM1. Los costes económicos de la DM1 van de 1.262 a 3.311 €/persona/año. Los costes de la DM2 oscilan entre 381 y 2.560 €/paciente/año. Los estudios que estiman costes totales los sitúan entre 758 y 4.348 €/persona/año. Se ha demostrado que a menor nivel socioeconómico peor es el control de la enfermedad y mayor su frecuencia y los otros factores de riesgo de DM2 (Ruiz-Ramos, EscolarPujolar, Mayoral-Sánchez, Corral-San & Fernández-Fernández, 2006). 1.5. COMPLICACIONES DE LA DIABETES MELLITUS Cuando se inicia la DM, si hay un control glucémico adecuado no suele cursar con complicaciones, pero sí, cuando el control es inadecuado, sobre todo en hiperglucemias que asocian cifras de HbA1c > 7% de forma crónica. También se 8 Introducción complica cuando se produce un déficit agudo de insulina o cuando hay un exceso de la misma en las que se denominan complicaciones agudas. Las complicaciones crónicas, surgen en los dos tipos de diabetes, porque aparece una descompensación en los valores de glucemia, apareciendo las complicaciones microangiopáticas y macroangiopáticas. Complicaciones de la DM Descompensaciones agudas Hiperglucemia cetoacidótica Hiperglucemia hiperosmolar Hipoglucemia Complicaciones microvasculares Retinopatía Nefropatía Neuropatía Complicaciones macrovasculares Cardiopatía isquémica Accidente vasculocerebral Arteriopatía periférica Las complicaciones vasculares de la DM1 y de la DM2 se centran en la enfermedad vascular, se clasifican en (Mahía Vilas M & Pérez Pérez L, 2000): 9 Introducción Microangiopatía, que es un proceso típico de diabetes, que afecta a pequeños vasos de la microcirculación que afecta a la retina, el glomérulo y a los nervios periféricos y que se conoce como, retinopatía, nefropatía y neuropatía diabética. Macroangiopatía, está ligada a un proceso de aterosclerosis y aterogénesis progresivo, afecta a los vasos de grueso y mediano calibre, fundamentalmente a las arterias coronarias, cerebrales, aorta, corazón y los miembros inferiores. Sus manifestaciones clínicas son: la cardiopatía coronaria isquémica, los accidentes vasculares cerebrales y la arteriosclerosis obliterante de las extremidades (Rask-Madsen & King, 2013). La aterosclerosis es una enfermedad, se caracteriza por la presencia de depósitos de lípidos y elementos celulares en la capa íntima de las arterias grandes, medianas o pequeñas, produciendo con el tiempo la placa aterosclerótica que obstruye parcial y totalmente, la luz arterial. En el paciente diabético, la aterosclerosis se desarrolla más rápidamente y afecta a mayor número de vasos. Las lesiones aterosclerosas tienen más contenido lipídico y más complicaciones trombóticas, que las de los no diabéticos (Kannel, 1985; Laakso & Lehto, 1998). 1.6. MECANISMOS DE DAÑO DE HIPERGLUCEMIA. CAMBIOS EN VÍAS BIOQUÍMICAS. En individuos sanos la glucosa se metaboliza en el citoplasma por la vía glucolítica y por la vía de las pentosas fosfato. El exceso de glucosa se metaboliza por 10 Introducción las vías alternativas, normalmente poco activas (Bonafonte S, Arévalo F, & García RA, n.d.) . La hiperglucemia crónica es el defecto subyacente sobre el que giran todas las alteraciones implicadas en el desarrollo de la diabetes (De La Cruz, González-Correa, Guerrero, & de la Cuesta, 2004; “The effect of intensive diabetes treatment on the progression of diabetic retinopathy in insulin-dependent DM. The Diabetes Control and Complications Trial,” 1995, “The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent DM. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group,” 1993). Las cifras altas de glucosa sanguínea provocan cambios importantes en el metabolismo celular, entre los que destacan, por su especial importancia, los siguientes (De La Cruz et al., 2004; Miranda et al., 2004, 2006): Activación de la vía de los polioles. Activación de la vía de la hexosamina. Activación de la vía del diacilglicerol-proteincinasa C. Formación de productos finales de la glicación de proteínas. Estímulo del estrés oxidativo celular. Estas alteraciones pueden explicar la mayor parte de las lesiones celulares, fundamentalmente las más precoces, que se centran en el endotelio, dando lugar a la denominada DE (De Vriese, Verbeuren, Van de Voorde, Lameire, & Vanhoutte, 2000). 11 Introducción Dichas alteraciones están relacionadas entre sí, influyendo cada una en todas las demás. 1.6.1. ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE LOS POLIOLES En condiciones normales, la glucosa intracelular se metaboliza, por fosforilación y glucólisis. Cuando hay hiperglucemia, el exceso de glucosa intracelular se convierte en sorbitol y posteriormente en fructosa, lo que genera una alteración del potencial oxirreductor, induce a un estado hiperosmolar intracelular, genera una situación de estrés oxidativo (EO) y cambios celulares que conducen a la apoptosis celular. Las enzimas de estas reacciones son aldosa-reductasa y sorbitol-deshidrogenasa (King & Brownlee, 1996). Glucosa ATP ↑SORBITOL ↑ Fructosa ADP Glucosa6P NADPH NADP+ NAD+ NADH Figura 1.1: Vía de los polioles. La aldosa-reductasa, cataliza la reacción de galactosa a galactitol además de la ya mencionada transformación de la glucosa en sorbitol. La aldosa-reductasa tiene más Aldosa reductasa Sorbitol deshidrogen ERO ERO 12 Introducción afinidad por la galactosa que por la propia glucosa. El acúmulo de polioles es mayor en la galactosemia que en la diabetes, por dicho motivo y debido además a que la enzima sorbitol deshidrogenasa transforma lentamente el sorbitol a fructosa, pero no metaboliza el galactitol. Galactosa ↑ GALACTITOL no reacción NADPH NADP+ Figura 1.2: Vía metabólica de la Galactosa. El incremento de la vía de los polioles se relaciona con otras alteraciones, tales como el incremento del EO celular, el incremento de la síntesis de prostaglandinas y la disminución en la producción de óxido nítrico (NO) (De La Cruz, González-Correa, Guerrero, & de la Cuesta, 2004). Se ha relacionado que la oxidación del sorbitol por el NAD+ aumenta el cociente NADH/NAD+ inhibiendo la actividad de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (enzima que inicia la segunda fase de la glucólisis), aumentando la concentración de D-gliceraldehído 3-fosfato y por tanto la formación de metilglioxal, un precursor de los productos avanzados de la glicación y del diacilglicerol, potente estimulador de la proteincinasa C (PCK) (Williamson et al., 1993). Aldosa reductasa Sorbitol deshidrogenasa ERO 13 Introducción Químicamente un radical libre se define como un átomo o molécula que en su orbital más externo presenta uno o más electrones no apareados, por lo que es altamente inestable y reactivo, por lo que tiende rápidamente a reaccionar con otro átomo o molécula a fin de aparear su electrón y conseguir la estabilidad. Si esto sucede, puede afectar la fisiología de las células al oxidar a los lípidos de la membrana, a los carbohidratos, a las proteínas, e incluso al ADN, lo cual sería uno de los mecanismos de daño (Rosado-Pérez & Mendoza-Núñez, n.d.). Cualquier molécula puede convertirse en un RL, no obstante, cuánto más pequeña sea, más capacidad de formación de RL posee. En este sentido, es el oxígeno el que con mayor frecuencia e importancia biológica lo realiza. En condiciones normales, las células mantienen un equilibrio entre los mecanismos oxidativos y sus defensas antioxidantes, estableciéndose el denominado estatus oxidativo tisular. Se define el EO tisular como una situación de desequilibrio entre agentes oxidantes y antioxidantes en favor de los primeros, superándose el límite máximo de formación mitocondrial de ERO. Esto puede ocurrir cuando se forman muchos RL, cuando disminuyen las defensas antioxidantes endógenas (fundamentalmente el glutatión) o, lo que ocurre con mayor frecuencia, ambas cosas a la vez (De La Cruz et al., 2004; Miranda et al., 2004, 2006). Todas las vías anteriores producen especies reactivas del oxígeno (ERO), la más importante parece ser la hiperproducción del anión superóxido (O2-) por la cadena mitocondrial de transporte de electrones, que provocan lesiones oxidativas vasculares. Se 20 Introducción forman por autooxidación de la glucosa y por cualquiera de las vías bioquímicas mayores descritas antes, sobre todo la vía de los polioles (Wolff & Dean, 1987). En la diabetes se ha observado a la vez una disminución de las defensas antioxidantes endógenas y un aumento de la producción de RL, causando un aumento de los marcadores del EO como son los marcadores de la peroxidación lipídica. Asimismo, las arterias de los animales diabéticos son más sensibles a los RL que la de los animales normales. Un exceso de producción de RL puede dañar a cualquier estructura celular, ya sean las membranas (peroxidación lipídica), proteínas (polimerización anómala) o el núcleo celular (daño en la estructura del ADN). Así mismo, estos RL pueden reaccionar con el NO y formar peroxinitritos, que son más lesivos aún que el propio anión hidroxilo. También se ha demostrado que el acúmulo de RL descrito en la diabetes, puede originar glicación no enzimática de las proteínas y acúmulo de sorbitol en las células endoteliales (De La Cruz et al., 2010). . Se ha comprobado que las células β de los islotes de Langerhans pancreáticos son altamente sensibles a la acción de estos RL, al poseer el más bajo potencial secuestrador de ERO. Actualmente se cree que los RL desempeñan una función importante en la destrucción de las células β del páncreas en la DM1. El EO ha sido relacionado con más de 100 enfermedades crónicas entre las que están la aterosclerosis, el cáncer, la artritis reumatoide y por supuesto la DM. La generación de las ERO se encuentra aumentada tanto en la DM1 como en la DM2, y en modelos experimentales; por ello, el surgimiento de la diabetes, el desarrollo 21 Introducción de resistencia a la insulina y de las complicaciones tardías de la diabetes, están estrechamente asociados al EO. Las ERO contribuyen a la resistencia a la insulina, debido a que interfiere con las vías de señalización inducida por esta hormona y evitan la traslocación del transportador de glucosa GLUT 4 a la membrana plasmática. El mecanismo por el que contribuyen a las complicaciones de la diabetes es parcialmente conocido y se piensa que actúan por la modificación oxidativa de macromoléculas y por la activación del factor de transcripción NFκB, lo que conduce a la expresión alterada de genes. En concordancia con esta hipótesis, se ha encontrado que en pacientes diabéticos el empleo de antioxidantes como el ácido lipoico reduce la activación del NFκB (DíazFlores et al., 2004). Así pues, la hiperglucemia, a través de diversos mecanismos, puede inducir una producción incrementada de EO, debido a un aumento de RL y disminución de los sistemas de defensa de antioxidantes, responsables de la degradación del estrés oxidativo (NO), dando lugar a la disfunción endotelial (DE), crecimiento del número de células, inflamación producida por la activación del factor nuclear kappa beta (NF-κβ), la proteína quimiotáctica monocitaria 1 (MCP-1), la molécula de adhesión celular vascular y la liberación de citocinas como la interleucina 6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). La acción de las moléculas de adhesión y las citocinas aumentan la adhesión del endotelio y fijación de las células inflamatorias a la superficie endotelial, causando inflamación y trombosis vascular (Gerich, 2003; Hsueh, Jackson, & Law, 2001). 22 Introducción Figura 1.6: Hiperglucemia y daño vascular Hiperglucemia y daño vascular DIABETES HIPERGLUCEMIA Glicosilación proteica Estrés Oxidativo PCK PGA-RAGE ERO DAG DISFUNCIÓN ENDOTELIAL ↓ NO ↑ ET1 ↑ ATII ↑ NF-kβ ↑ TGF-β1 ↑ PAI-1 ↓ NO Vasoconstricción Inflamación: (proteína quimiotáctica: MCP-1; moléculas de adhesión: VCAM, ICAM-1; Citocinas: IL6, TFN-α Trombosis Hipercoagulación Activación plaquetaria ATEROGÉNESIS 23 Introducción 1.7. ENDOTELIO VASCULAR El endotelio forma una monocapa celular que cubre la superficie interior de los vasos sanguíneos. Cada célula endotelial es nucleada y tiene una superficie hacia el espacio subendotelial con diferentes proteínas de membrana. Entre las células endoteliales se constituyen puentes de hidrógeno que regulan la permeabilidad entre la sangre y los tejidos. Su estructura y función depende del territorio vascular que se considere (Badimón & Martínez-González, 2006; Dalli, 2005). Las células del endotelio ejercen funciones vasodilatadoras y vasoconstrictoras, mitógenas y antimitógenas, procoagulantes y anticoagulantes, inflamatorias y antiinflamatorias, fibrinolíticas y antifibrinolíticas, oxidantes y antioxidantes, proliferativas y antiproliferativas, angiogénicas y antigiogénicas, inmunes y autoinmunes, y autocrinas, paracrinas y endocrinas. De su equilibrio depende la homeostasis y la salud vascular. El endotelio sano presta su superficie para elementos claves del metabolismo (lipoproteína lipasa) y del sistema antitrombótico (heparinoides de superficie, proteínas anticoagulantes) pero además produce y libera una serie de sustancias como el NO, ET, prostaciclina (PGI2), y factor von Willebrand (FvW), entre otras. Cuando el endotelio reduce su capacidad de mantener equilibrio, producidos por factores de riesgo (colesterol, hipertensión, tabaquismo, homocisteína, procesos inmunoinflamatorios y diabetes), se crean condiciones en las que penetran lípidos, leucocitos, monocitos y linfocitos T, se inician mecanismos inflamatorios e instalación de células espumosas (foam cells), matriz de estría grasa, constituyendo el primer paso de la formación de la placa ateroesclerosa. (Cruz Hernández, Licea Puig, Hernández García, Yanes Quesada, & Salvato Dueñas, 2012; Esper et al., 2006; Melagarejo, 2005). 24 Introducción Esto, se traduce en una cascada de daño funcional y estructural, que conlleva a la muerte. Esta cascada se resume en: reducción en la producción de óxido nítrico, pérdida del control del tono vascular, aumento de adherencia leucocito-monocito, reducción en la producción de otros inhibidores de crecimiento, aumento en el depósito de lípidos, alteración de la relación tPA y PAI1 convirtiendo al endotelio en una estructura protrombótica y anfibrinolítica e hiperproducción de radicales (Melagarejo, 2005). 1.8. SUSTANCIAS VASODILATADORAS DEL ENDOTELIO 1.8.1. ÓXIDO NÍTRICO El óxido nítrico (NO) es un gas inorgánico, presente en casi todas las células del organismo, que en condiciones normales actúa como mediador fisiológico de la vasodilatación. Su síntesis se realiza a partir de L-arginina y tiene como producto final de la reacción la L-citrulina (Moncada & Higgs, 1995). Para que tenga lugar dicha reacción se requiere la participación de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), calmodulina (CaM) y una serie de cofactores, entre ellos la tetrahidrobiopterina (BH4). En ausencia de CaM se genera anión superóxido (O2–) que puede unirse al NO dando lugar a peroxinitritos (ONOO-). La falta de tetrahidrobiopterina (TBH) genera además de O2–, H2O2 (Domenico, 2004). Se han identificado diferentes isoformas de NO sintasa, han sido clasificadas de la siguiente manera: 25 Introducción Óxido nítrico sintasa Ubicación Función Tipo I: NOS neuronal (NOSn) Neuronas Neuroglia Médula espinal Sistema nervioso periférico leucocitos Comunicación celular Tipo II: NOS inducible (iNOS) Células musculares lisas Macrófagos Neutrófilos Hepatocitos Endotelio Defensa inmune contra patógenos Tipo III: NOS endotelial (NOSe) endotelio leucocitos plaquetas Vasodilatación Defensa inmune contra patógenos Figura 1.7: Clasificación del Óxido nítrico sintasa. Las isoformas tipo I, presentes en el cerebro, y la tipo III, aislada en las células endoteliales vasculares, son reguladas por Ca2+-calmodulina y utlilizan NADPH, flavina adenina dinucleótido/mononucleótido (FAD/FAM) y tetrahidrobiopterina (BH4) como cofactores. El NOS tipo III endotelial, produce NO que se difunde desde el endotelio al musculo liso vascular, a través de enzima guanilatociclasa (GC) provoca la degradación del trifosfato cíclico de guanosina (GTPc), liberando monofosfato cíclico de guanosina 26 Introducción (GMPc), molécula que reduce la concentración de Ca2+ citosólico, responsable de la vasodilatación a nivel de las células musculares lisas. A nivel de la plaqueta, la elevación del GMPc es responsable de la antiagregación (Rooke, 2008) . El GMPc es sintetizado por enzimas de la membrana plasmática llamadas guanililciclasas o guanilato ciclasas (GC). Su forma soluble (GCs) es considerada el receptor del NO que comparte con la nitroglicerina y sorprendentemente con el monóxido de carbono (CO). Las GC no solubles o de membrana son activadas por péptidos. La primera de las GC que fue aislada presenta receptores para la familia de los péptidos natriuréticos (PNs): GC-A para el PNA y el GC-B (para el PN tipo C). El NO además de actuar sobre la GCs también actúa sobre otras enzimas, activándolas o inhibiéndolas. A las primeras pertenece la COX, y a las segundas la ribonucleótido reductasa, el citocromo P450 y la oxidasa de NADPH. A nivel plaquetario, además de producir una elevación del GMPc, disminuye la P-selectina en el endotelio, que interviene en el frenado de la plaqueta, e inhibe la glicoproteína IIb/IIIa. Ésta representa el principal receptor en la membrana plaquetaria y es un miembro de la familia de las integrinas. Participa en la agregación plaquetaria por unión a las proteínas adhesivas como el factor von Willebrand (FvW) y el fibrinógeno. El NO además de antiagregante y vasodilatador, es scavenger o capturador de RL, antiproliferativo (inhibe la proliferación de las células musculares lisas) y antiapoptótico. Junto a ello disminuye la expresión de moléculas de adhesión como VCAM (moléculas de adhesión de células vasculares) y chemoquinas como MCP-1 (J. Ruiz, 2009). 27 Introducción 1.8.2. PROSTACICLINA Es el mayor miembro de la familia de las prostaglandinas producida por el endotelio. Se trata de una sustancia vasodilatadora, no tan potente como el NO, pero que también inhibe la agregación plaquetaria mediante la activación de la adenilciclasa; además, es rápidamente degradada en el plasma (Mitchell et al., 2014; Moncada, Gryglewski, Bunting, & Vane, 1976). Existen evidencias que sugieren que el NO puede aumentar o inhibir la actividad y expresión de la COX (Villar, Francis, Webb, Hobbs, & Ahluwalia, 2006). Además, la prostaciclina inhibe la agregación plaquetaria y la liberación de factores de crecimiento implicados en el engrosamiento de la pared vascular (Zou, 2007). La enzima COX tiene dos isoformas, COX-1 (ciclooxigenasa-1) y COX-2. La COX-1 se expresa de forma constitutiva por la mayoría de los tejidos y participa en la síntesis de las prostaglandinas que controlan procesos fisiológicos. Por el contrario, la isoforma COX-2 es inducible y se expresa en respuesta a diferentes estímulos proinflamatorios o factores mitogénicos en distintos tipos celulares (células endoteliales, células de músculo liso vascular, macrófagos, etc.). Además, se ha descrito que la COX-2 contribuye a la proliferación de la célula muscular lisa inducida por el factor de necrosis tumoral (TNFα) y por la angiotensina II (Kang, Van Der Zypp, Iannazzo, & Majewski, 2006). Existen estímulos mecánicos y químicos a nivel de la membrana que ocasionan la liberación de prostaglandinas, incluyendo prostaciclina, las cuales no son almacenadas. De esta manera, en el endotelio, el flujo pulsátil además de algunos mediadores endógenos (bradiquinina, trombina, serotonina, factor de crecimiento derivado de la 28 Introducción plaqueta, interleucina-1) y la hipoxia, estimulan la producción de prostaciclina. Esta producción se inicia con la activación de la fosfolipasa A2, la cual libera ácido AA a partir de los fosfolípidos de membrana. Posteriormente la COX lo convierte en endoperóxidos de prostaglandina (prostaciclina H2) y finalmente la prostaciclina sintetasa, la convierte a prostaciclina, que se une a su receptor de membrana, activando la adenil-ciclasa y aumentando subsecuentemente los niveles de AMPc. Las plaquetas son muy sensibles al aumento del AMPc, el cual inhibe la activación pero no la adhesión plaquetaria. Esto se traduce en que la PGI2 tiene como mayor papel biológico, la prevención de la activación de las plaquetas y la formación de trombos. La síntesis de PGI2 puede ser estimulada por ATP, catecolaminas, kininas, calcioantagonistas, inhibidores de la enzima convertidora y nitrovasodilatadores. Al mismo tiempo que se produce prostaciclina, se produce tromboxano A2 (TxA2), el cual tiene propiedades proagregantes y de vasoconstricción. En caso de DE, predomina la acción del TxA2 (Dimitropoulou, Chatterjee, McCloud, Yetik-Anacak, & Catravas, 2006). 1.9. SUSTANCIAS VASOCONSTRICTORAS DEL ENDOTELIO 1.9.1. ENDOTELINAS La endotelina-1 (ET-1) es un péptido vasoconstrictor con propiedades promitogénica y pro-inflamatorias y por tanto es de interés en el desarrollo de la DE. ET-1 actúa como un antagonista fisiológico del NO y es producida en macrófagos, células de músculo liso y, principalmente, en la célula endotelial a partir de la proendotelina, sobre la que actúa la enzima convertidora de endotelina (ECE) (Lemkens et al., 2012). 29 Introducción 5) La tumefacción de las células tisulares. Algunos de los muchos productos tisulares que provocan estas reacciones son la histamina, la bradicinina, la serotonina, las prostaglandinas, varios productos de reacción diferentes del sistema del complemento, los productos de reacción del sistema de coagulación de la sangre y múltiples sustancias llamadas linfocinas. Varias de estas sustancias activan el sistema macrofágico y en pocas horas los macrófagos comienzan a devorar los tejidos destruidos, en ocasiones también lesionan las células tisulares aún vivas. La inflamación desempeña un papel central en la fisiopatología de la aterosclerosis, a partir de la iniciación, progresión y a través de las complicaciones trombóticas de la aterosclerosis. Las LDLox y otros restos biológicamente activos se localizan en el núcleo lipídico de la placa de ateroma y estos lípidos modificados, inducen la expresión de moléculas de adhesión, quimiocinas, citocinas pro-inflamatorias en los macrófagos y endotelio (Maiti & Agrawal, 2007). La activación inflamatoria de las células endoteliales causa un aumento de la expresión de selectina (P y E), VCAM-1 e ICAM-1. Diferentes citocinas proinflamatorias (IL-1β, TNF-α), proteína de fase aguda, LDLox, CD40 / CD40 ligando también inducen la expresión de moléculas de adhesión. Aunque el endotelio arterial normal resiste el contacto prolongado con leucocitos, incluyendo los monocitos de la sangre, con el aumento de la expresión de moléculas de adhesión, existe un mayor reclutamiento de monocitos y su adhesión al endotelio. Una vez que los monocitos entran en la íntima adquieren características de macrófagos. En el ateroma, los 36 Introducción macrófagos presentan en su superficie receptores llamados “scavenger o basureros”, que reconocen y captan lipoproteínas modificadas y otras partículas. La capatación de lípidos por los macrófagos hace que se acumulen en el interior de la célula transformándose en células espumosas. Estas células espumosas secretan citoquinas pro-inflamatorias que amplifican la respuesta inflamatoria, continúando el círculo vicioso (Szmitko et al., 2003). Los linfocitos T también entran en la íntima después de la unión a VCAM-1 y en respuesta a sustancias quimioatrayentes, que incluyen γ-interferón-inducible y quimiocinas. Una vez se convierten en residentes en la íntima arterial, las células T interactúan con LDLox y proteínas de choque térmico y se activan para producir citoquinas que influyen en el comportamiento de otras células presentes en el ateroma. En general, las células TH1 predominan en el ateroma, y secretan citoquinas proinflamatorias como IL-1, TNF y IFN-γ (Libby, 2002). Los leucocitos se infiltran dentro de las placas de ateroma, también se encuentra una importante población de mastocitos. En la íntima, los mastocitos se someten a la degranulación y liberación de TNF-α y proteasas (triptasa y quinasa). La quinasa tiene un papel muy importante en la conversión de angiotensina I en angiotensina II, importante en la DE. Las plaquetas también tienen un papel importante en la inflamación, contribuyen a la modificación oxidativa de las LDL, a la proliferación del músculo liso, a la reacción inflamatoria mediante la expresión y a la liberación de CD40 ligando, que resulta en la activación de la matriz metaloproteasa y la actividad procoagulante (D Tousoulis, Davies, Stefanadis, Toutouzas, & Ambrose, 2003). La formación de la estría grasa, se inicia con la migración de las células del músculo liso desde la capa media hacia la matriz subendotelial, allí las células proliferan 37 Introducción y captan las lipoproteínas modificadas contribuyendo así junto con las células espumosas al engrosamiento del núcleo lipídico. Con la expansión de la lesión, comienza a aparecer el estrechamiento de la luz, lo que dificulta el flujo de sangre. La liberación continuada de citoquinas como MCP-1 por las células endoteliales activadas es responsable del crecimiento de la lesión, ya que influye en la actividad del músculo liso, además de perpetuar la inflamación y la acumulación de lípidos (Szmitko et al., 2003). Tanto en modelos animales diabéticos como en pacientes con DM1 y DM2, se han encontrado aumentadas las concentraciones circulantes de factores inflamatorios como la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) y citoquinas proinflamatorias, como la IL-1β y el TNF-α (Marques-Vidal et al., 2013; Wang et al., 2013). La IL-1β y el TNF-α son citoquinas pro-inflamatorias producidas por múltiples estirpes celulares en respuesta a infecciones o cualquier tipo de lesión o estrés. Son mediadores que actúan en la superficie de las células vasculares sobre receptores específicos de membrana, los cuales, una vez activados, desencadenan una señalización intracelular que genera ERO y activa diferentes vías sensibles a ellas, como las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Las MAPK promueven la síntesis proteica y activan distintos factores de transcripción, incluyendo el NF-κB que, a su vez, facilita la expresión de genes sensibles al estado de óxidoreducción intracelular que codifican citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión y enzimas proinflamatorias, como la COX-2 y la iNOS (Kracht & Saklatvala, 2002). 38 Introducción 1.12. COAGULABILIDAD En estos momentos, se sabe que la lesión no solo afecta al endotelio, o a la media de la arteria, hay una ruptura de la elástica interna e inflamación que afecta a la adventicia, participando los vaso-vasorum. Esta agresión favorece la neovascularización de las placas y de la capa media y puede ser clave de los fenómenos trombóticos. El endotelio también contribuye a la activación plaquetaria mediante la liberación de FvW, que promueve la agregación de las plaquetas por la unión de los complejos de plaquetas GPIb-IX y IIb-IIIa. En los pacientes diabéticos se elevan: FvW, fibrinógeno, factorVII, factor VIII, factorXI, factorXII, calicreína, el fragmento de protrombina activación 1 y 2 y complejos trombina-antitrombina están también elevada en la DM. Por el contrario, el nivel de proteína C anticoagulante disminuye (Carr, 2001). Se considera, la trombosis como la principal causa de estenosis coronaria y muerte súbita y como una de las principales complicaciones de la evolución de la placa de ateroma. En la diabetes intervienen una serie de circunstancias que influyen en la aterotrombosis y las complicaciones cardiovasculares. De hecho, se piensa en la diabetes como un estado procoagulante. En los diabéticos, en la placa de ateroma, se localiza una elevada expresión del factor tisular, principal activador de la vía extrínseca de la coagulación, que facilita la actividad procoagulante. La ruptura de la placa permite que el factor tisular entre en contacto con el Factor VII circulante en la sangre, induciendo en la generación de VIIa activo y la formación de complejos factor tisular-VIIa, incidiendo en la cascada de coagulación. 39 Introducción Figura 1.8: Cascada de la coagulación. En los diabéticos, es la DE la que reduce las propiedades anticoagulantes del endotelio, al disminuir la síntesis de PGI2 y NO y facilitar la adhesión de plaquetas. La disfunción se asocia al aumento de citoquinas inflamatorias (IL-6, FNTα, y PCR). Tanto en la DM1 como en la DM2 se han descrito alteraciones en la función plaquetaria, con un aumento de agregabilidad, adhesividad secundaria a la elevación del TXA2. Todos estos cambios contribuyen al estado procoagulante y favorecen la aterotrombosis, al permitir la expansión de los trombos generados en la ruptura de la placa (Grant, 2007). 40 Introducción 1.13. DIETA MEDITERRANEA La dieta Mediterránea (DietMed) ha sido considerada con frecuencia como un "elixir" nutricional que reduce los factores de riesgo asociados con la enfermedad. La DietMed antigua se centra en las especies: trigo, cebada, uvas, higos, granadas, aceitunas, y miel junto con otros alimentos indígenas de Oriente Medio que irradiaban de la cuna de la civilización en Mesopotamia (Berry, Arnoni, & Aviram, 2011). En la actualidad, el término “DietMed” se refiere a los hábitos alimenticios de algunas regiones mediterráneas asociadas al cultivo del olivo. Estos países incluyen Marruecos y Túnez en el norte de África; Grecia, Portugal, España, sur de Francia, algunas partes de Italia, Turquía en Europa; Líbano y Siria en Oriente Medio. Estas regiones han ayudado a desarrollar toda la forma original de la DietMed, que se deriva de las tradiciones rurales y de los productos agrícolas en estas regiones (da Silva et al., 2009; Noah & Truswell, 2001). Aunque el patrón dietético mediterráneo varía según que regiones, se pueden identificar algunas características comunes caracterizado por un consumo elevado de verduras, hortalizas, frutas, pasta, arroz, frutos secos, leguminosas y una rica variedad de pescados, además de aceite de oliva virgen (AOV), te y vino tinto (Pérez-Jiménez & Saura-Calixto, 2005; Trichopoulou & Lagiou, 1997) que tienen efectos beneficiosos sobre la función endotelial y por lo tanto podrían reducir el riesgo cardiovascular (Chistiakov, Revin, Sobenin, Orekhov, & Bobryshev, 2015). Se caracteriza por un perfil 41 Introducción de ácidos grasos beneficiosos con grandes cantidades de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y un ácido graso superior MUFA-a-saturado (SFA) (Bos et al., 2010). El elevado consumo de compuestos antioxidantes es otro de los argumentos empleados para explicar el efecto beneficioso de la DietMed en patologías como la ECV (Bazzano, Serdula, & Liu, 2003; Trichopoulou & Lagiou, 1997). La elevada exposición a las radiaciones solares y las temperaturas cálidas existentes en las regiones de la cuenca mediterránea, lleva a las especies vegetales a desarrollar mecanismos de defensa frente a las radiaciones ultravioletas y la producción excesiva de RL, mediante la acumulación de sustancias antioxidantes, como flavonoides, antocianinas y polifenoles (D’Angelo et al., 2005). Los rápidos cambios en las dietas y estilos de vida como resultado de la industrialización, la urbanización, el desarrollo económico, el mercado y la globalización está teniendo un efecto significativo en la salud y el estado nutricional de las poblaciones (Reguant-Aleix, Arbore, Bach-Faig, & Serra-Majem, 2009). En países como España e Italia han mostrado una tendencia a la baja en la adhesión al patrón de DietMed en las últimas décadas (Bach-Faig, Fuentes-Bol, et al., 2011). En este sentido, la DietMed se ajusta adecuadamente a las recomendaciones de la conocida “pirámide nutricional” (Figura 1.9), que es el resultado de un consenso internacional, que se basa en los últimos datos científicos de salud y nutrición publicados en cientos de artículos en las últimas décadas. Se recomienda su uso y promoción, sin ninguna restricción, y la edición de 2010 tiene adaptado, traducido y editado en 10 idiomas diferentes (inglés, árabe, catalán, gallego, euskera, francés, español, italiano, 42 Introducción portugués y griego) en colaboración con algunas organizaciones internacionales (BachFaig, Berry, et al., 2011). Figura 1.9: Pirámide nutricional. La DietMed, que se caracteriza por los alimentos que contienen fenoles, se correlacionó con una menor incidencia de ECV (Migliori et al., 2015), cáncer (Kontou, 2015) y enfermedades inflamatorias (Rodríguez-Morató et al., 2015). La DietMed es un patrimonio cultural, histórico, social, territorial y medioambiental transmitida de generación en generación durante siglos, y ha formado parte, como un Sistema Alimentario del Mediterráneo, de los estilos de vida de Pueblos del Mediterráneo a lo largo de su historia (Reguant-Aleix, Arbore, Bach-Faig, & SerraMajem, 2009). En el año 2010, es reconocida como Patrimonio Cultural Inmaterial de la Humanidad por las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la Cultura. Fue el resultado de un proceso internacional coordinado desde España por la Fundación 43 Introducción DietMed. Este reconocimiento permite un mejor entendimiento de la DietMed en todo el mundo (UNESCO, 2010). En 2009, en Parma, Italia, la conferencia internacional de la DietMed, como modelo de dieta sostenible, fue organizada por CIISCAM (Centro interuniversitario internacional de estudio sobre cultura alimentaria mediterránea) en colaboración con la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations), División de Protección al Consumidor, el Foro sobre culturas del Mediterráneo, y el CIHEAM-IAM (Centro International de Estudios Agronómicos Mediterráneos Instituto Agronómico Mediterráneo de Montpellier) de Bari. Su objetivo era promover la DietMed como ejemplo de una dieta sostenible en el que la nutrición, la producción de alimentos, la biodiversidad, la cultura y la sostenibilidad estaban fuertemente interrelacionados, con un bajo impacto sobre el medioambiente (Burlingame & Dernini, 2011). En la DietMed se ha demostrado que disminuyen biomarcadores asociados con un mayor riesgo para la ECV. Además, numerosos estudios han demostrado que la dieta mediterranea mejora la resistencia a la insulina, aumenta el colesterol HDL, y disminuye los triglicéridos en plasma, así como los marcadores inflamatorios y la presión arterial (Estruch et al., 2013). El estudio PREDIMED (Prevención con DietMed) y Lyon Diet Heart han demostrado los efectos protectores y beneficiosos asociados a la DietMed en la prevención de diversas enfermedades crónicas como pueden ser la diabetes, el cáncer, la HTA o enfermedades neurodegenativas; por ejemplo, parece estar asociada a un menor riesgo de deterioro cognitivo leve durante el envejecimiento, en la etapa de transición de 44 Introducción la demencia y en el deterioro cognitivo leve de la enfermedad de Alzheimer (de Lorgeril et al., 1999; Martínez-González et al., 2015; Ros et al., 2014). La OMS en su último informe recomienda sustituir el consumo de grasa saturada por grasa monoinsaturada (subrayando así el consumo de el aceite de oliva) y aumentar el consumo de frutas y verduras frescas (OMS, 2003). Según el informe anual del año 2012 de la OMS, las ECV causaron casi 17,5 millones de muertes en 2012; es decir, 3 de cada 10. De estas, 7,4 millones se atribuyeron a la cardiopatía isquémica, y 6,7 millones, a los accidentes cerebrovasculares. Según el informe del Instituto Nacional de Estadística de España, en 2012 la muerte por enfermedades cardiovasculares fue del 30,3%, lo que supone el primer puesto del total de defunciones (“WHO | Healthy diet,” n.d.). La American Heart Association, también emitió una advertencia científica que indica que una DietMed demuestra efectos impresionantes en ECV (Kris-Etherton et al., 2001). La dieta, la obesidad, la dislipidemia, la hipertensión y la DM son factores de riesgo para la aterosclerosis (Camargo et al., 2012) y esta es un factor de riesgo de las ECV, el desarrollo de la placa aterosclerótica es el resultado de una compleja cascada de procesos inflamatorios, acumulación de lípidos y calcificación (Urpi-Sarda et al., 2012). La principal fuente de grasa en la DietMed es aceite de oliva (AO). En las poblaciones mediterráneas se estima que las personas consumen entre 25 y 50 ml de AO 45 Introducción La mayor parte de estos ácidos grasos del AO están esterificados a una molécula de glicerol, formando los triacilglicéridos o triglicéridos, aunque también están presentes en un porcentaje minoritario formando parte de mono y diglicéridos, fosfátidos y ácidos grasos libres. Composición Ácidos Grasos del Aceite de Oliva Saturado Ácido mirístico Ácido palmítico Ácido margárico Ácido esteárico Ácido araquídico Ácido behénico Ácido lignocérico Insaturado Monoinsaturado Ácido palmitoleico Ácido Heptadecenoico Ácido oleico Ácido eicosenoico Poliinsaturado ω-6 Ácido Linoleico ω-3 α-ÁcidoLinolénico Figura 1.12: Composición Ácidos Grasos del Aceite de Oliva De entre los componentes que forman el AO, tres destacan por sus efectos sobre la salud en las personas; el ácido oleico, el escualeno y los componentes fenólicos. El ácido oleico (18:1n9) es el componente principal (55-83%) de la fracción saponificable; otros ácidos grasos son palmítico, esteárico, linoleico, linolénico y aácidos (Servili et al., 2013). 52 Introducción Históricamente, los efectos beneficiosos para la salud del AO se le atribuía al ácido oleico (Hannachi et al., 2008). Sin embargo, otros aceites de semilla como: girasol, soja y colza contienen altas cantidades de grasas monoinsaturadas y son ineficaces en el riesgo de enfermedades crónicas (Di Vaio, Nocerino, Paduano, & Sacchi, 2013; Vinha et al., 2005). El escualeno es un hidrocarburo triterpénico, uno de los compuestos principales de la facción insaponificable, importante intermediario en la biosíntesis de colesterol. Los componentes fenólicos, principal antioxidante junto con los carotenos, están relacionados con las propiedades saludables del AO y están asociados con la estabilidad de la oxidación y sabor característico de AOV. El contenido de estos componentes en el AO varía dependiendo de la variedad de la aceituna, el clima, la maduración en la cosecha, el sistema de tratamiento utilizado y las condiciones de almacenamiento (Di Giovacchino et al., 2002; Servili et al., 2007). La concentración de estos compuestsos varían entre los frutos y aceites de las variedades Arbequina, Cornicabra, Morisca, Picolimón, Picudo y Picual a tres índices de maduración diferentes (verde, envero y negra) (Gómez‐Rico et al., 2008). Los compuestos fenólicos, a bajas concentraciones, funcionan como antioxidantes. Esta propiedad es beneficiosa tanto para el alimento en sí como en el organismo después de haberlo ingerido, ya que en ambos casos evitan la oxidación de otros componentes importantes del alimento o de las células del cuerpo humano. Esta actividad antioxidante está relacionada con el efecto que se le atribuye a los fenoles 53 Introducción como antiarterioescleróticos, cardioprotectores, neuroprotectores, antiinflamatorios, antimutagénicos, anticarcinogénicos, moduladores hormonales, protectores endoteliales, protectores del sistema inmunológico, antialergénicos y antidiabéticos (Cicerale et al., 2010; Han, Shen, & Lou, 2007). Los compuestos fenólicos que contiene el aceite son muy variados, desde fenoles simples, ácidos fenólicos, difenoles, hasta moléculas complejas de polifenoles. Los compuestos fenólicos del AO son, fenoles hidrofílicos como: alcoholes y ácidos fenólicos, flavonoides, lignanos y secoiridoides. Y los fenoles lipofílicos, incluyen tocoferoles. Los compuestos secoiridoides principales en la aceituna son oleuropeína y ligustrósido, que son formas glucosiladas de esteres del ácido elenólico con 2‐ (3,4‐dihidroxifenil) etanol (hidroxitirosol) y 2‐ (4‐hidroxifenil) etanol (tirosol), respectivamente (Ghanbari, Anwar, Alkharfy, Gilani, & Saari, 2012; Soler-Rivas, Espín, & Wichers, 2000). Uno de los compuestos fenólicos del AO cuyo estudio ha generado un mayor interés ha sido el hidroxitirosol. Varios estudios han confirmado que este compuesto inhibe la oxidación de las LDL, así como su efecto protector frente a la muerte celular de las células endoteliales. Gran parte de los derivados secoiridoides presentes en el AO, son transformados a tirosol e hidroxitirosol durante la digestión. Estos compuestos son absorbidos en el intestino y sus metabolitos son posteriormente detectados en el plasma sanguíneo (Fitó et al., 2007; Rubió et al., 2012). 54 Introducción A nivel mundial, la cantidad de polifenoles en el AO oscila entre 200 y 1000 mg/kg, dependiendo de la variedad y las prácticas agrícolas. Por lo tanto, la dosis diaria para HT (que combina el volumen de AO y la cantidad de polifenoles) no podrá exceder de 7 mg / día (Rodríguez-Morató et al., 2015). Figura 1.13: Propiedades de los compuestos fenólicos. 1.18. HIDROXITIROSOL El hidroxitirosol (HT), es un polifenol que se encuentra en diversas fuentes naturales, especialmente en el olivo. El contenido de HT es superior en las hojas que en Propiedades de los compuestos fenólicos Antioxidante Sistema nervioso central neuroprotector Efectos cardiovasculares Actividades de presión antihipertensivo de sangre. Autonómicos Efectos colinérgicos y adrenérgicos Plaquetas y la función endotelial. Contra la aterosclerosis. Otras propiedades cardioprotectoras Propiedades contra enfermedades pulmonares. Antiinflamatorio contra las enfermedades cardiovasculares (ECV) y algunos tipos de cáncer Contra el cáncer y efectos quimiopreventivos puede controlar directamente el crecimiento celular en diferentes etapas de la carcinogénesis a través la inducción de apoptosis o inhibición de la proliferación Antimicrobianos y quimioterapia Antibacterial , propiedades antifúngicas y antivirales. Antiprotozoario y actividades antiparasitarias. Endocrino antidiabético osteoprotectora y otros efectos endocrinos Efecto apoptótico y antiapoptótico 55 Introducción los frutos del olivo, por lo que puede ser extraído con mejores rendimientos a partir de extractos metanólicos de la hoja (Ryan, Prenzler, Lavee, Antolovich, & Robards, 2003). En su forma pura es un líquido transparente e inodoro. El HT se encuentra en el AOV extra bien en forma libre o en forma de éster, contribuyendo en un 70 - 80% a la fracción fenólica total (M. Ruiz, 2013). Un grupo de investigadores del Centro Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, Sevilla), ha desarrollado un sistema de aislamiento y purificación de HT, a escala industrial, a partir de subproductos de la fabricación de aceitunas de mesa o del aceite, utilizando agua de lavado, hueso de aceituna, alpechín y alperujo, que son mezclas de agua y sólidos residuales de la obtención de AO (protegido bajo patente) y por lo tanto, más económico. Este HT puede tener una pureza de hasta el 95% (Fernández-Bolaños et al., 2005). Químicamente el HT es un orto-difenol. Su fórmula molecular es C8H10O3, y su peso molecular es 154,166 g/mol. Figura 1.14: Hidroxitirosol: 3,4-dihidroxifeniletanol 56 Introducción La principal actividad del HT se basa en sus propiedades antioxidantes así como aditivo alimentario para estabilizar alimentos funcionales ricos en los ácidos grasos poliinsaturados ω-3. 1.19. PROPIEDADES DEL HIDROXITIROSOL El compuesto fenólico, HT ha sido identificado como uno de los antioxidantes más potentes que se encuentran en el AO. Presenta una variada gama de actividades biológicas como son: actividad antimicrobiana, antihipertensiva, hipoglucémica, antiagregante plaquetaria, cardioprotectora y antiinflamatoria (Visioli et al., 2002a; Tuck y Hayball, 2002a; Bianco y Ramunno, 2006; Covas et al., 2006a y b; Bendini y cols., 2007; Reyes et al., 2013; Covas, de la Torre, & Fitó, 2015), aparte de inhibir la proliferación y promover la apoptosis en numerosas líneas celulares tumorales humanas (Fabiani et al., 2009). 1.19.1. ANTIOXIDANTE La actividad antioxidante está relacionada con el efecto que se le atribuye a los fenoles como antiarterioescleróticos, cardioprotectores, neuroprotectores, antiinflamatorios, antimutagénicos, anticarcinogénicos, moduladores hormonales, protectores endoteliales, protectores del sistema inmunológico, antialergénicos y antidiabéticos (Cicerale et al., 2010; Hu, He, Jiang, & Xu, 2014). Una de las características comunes de estas enfermedades degenerativas crónicas es una sobreproducción de RL incontrolada que conduce a EO y la desregulación de la 57 Introducción célula. La DietMed otorga una ingesta elevada de micronutrientes como vitaminas, carotenoides y polifenoles, los cuales tienen un efecto potente antioxidante (Balsano & Alisi, 2009; Fitó et al., 2007) El HT tiene propiedades antiaterogénicas con fuerte poder antioxidante. Actúa como eliminador de RL con el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso, etc. Además, tiene un fuerte efecto quelante sobre metales como el hierro, disminuyendo la aparición de ERO derivadas de reacciones asociado con este metal. Esta característica es responsable del efecto en la aterosclerosis, caracterizado por la entrada de partículas de LDLox en el interior de la íntima arterial. Es capaz de prevenir la oxidación de estas lipoproteínas por macrófagos, ya que aumenta la capacidad antioxidante de estas células relacionadas con los bajos niveles de glutatión (GranadosPrincipal, Quiles, Ramirez-Tortosa, Sanchez-Rovira, & Ramirez-Tortosa, 2010a). El HT neutraliza a ERO producidos por los neutrófilos y otros fagocitos, que están implicados en la inducción de muchas enfermedades. Además de HT, otros compuestos de AO como oleuropeína, tirosol, escualeno, ácido oleico, y tocoferoles también tienen actividades antioxidantes. La ingesta dietética de los polifenoles del AO puede reducir el riesgo de enfermedades mediadas por ERO y explicar el efecto beneficioso de la DietMed sobre la salud humana (Antonio Moreno et al., 2003). 58 Introducción 1.19.2. ANTICANCERÍGENO El EO y la generación de RL también parecen estar implicados en la patología del cáncer y se ha sugerido que el HT y los compuestos fenólicos del AO han mostrado actividad en la prevención del cáncer. El consumo de AO tiene beneficios para la prevención del cáncer de colon y de mama (Owen et al., 2004; Waterman & Lockwood, 2007). Cualquier alteración oxidativa del ADN y ARN juega un papel esencial en la patogenia de las principales enfermedades degenerativas y, en particular, puede constituir el punto de partida para el desarrollo de cualquier tipo de cáncer (Evans, Dizdaroglu, & Cooke, 2004). Debido a sus antioxidantes, antiproliferativos, actividades proapoptóticos, y antiinflamatorias, el HT tiene el potencial de contrarrestar todas las características distintivas del cáncer (Bernini, Merendino, Romani, & Velotti, 2013). Estudios con cultivos celulares mostraron que el HT fue capaz de detener el ciclo celular, reduciendo el crecimiento y la proliferación de células cancerosas, e inducir la apoptosis de células HL60 (leucemia promielocítica) y células HT29 (adenocarcinoma de colon) sin afectar a otro tipo de células no cancerosas como linfocitos aislados y células polimorfonucleares (Waterman & Lockwood, 2007). 59 Introducción Se ha comprobado que HT presenta efecto anticancerígeno, atenuando la proliferación de células en cultivos celulares humanos de adenocarcinoma colo-rectal, un efecto relacionado con su actividad antiinflamatoria (Terzuoli et al., 2010). 1.19.3. ANTIINFLAMATORIO Y ANTIAGREGANTE PLAQUETARIO También se han descrito efectos del HT en la inflamación y la agregación plaquetaria en sangre de ratas sanas y humanos voluntarios sanos (González-Correa, Navas, Muñoz-Marín, et al., 2008; Reyes et al., 2013). La inflamación y sus consecuencias tienen un papel importante en la aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares. Se ha demostrado en varios estudios epidemiológicos y en animales que los polifenoles disminuyen la producción de marcadores inflamatorios, como son el NO y las citoquinas (Bernini et al., 2013; Richard et al., 2011). También tienen beneficios sobre la función plaquetaria, estrechamente relacionada con la inflamación, al demostrar que inhibe la inducción química de la agregación, la acumulación del pro-agregante TxB2 en suero humano, la producción de moléculas pro-inflamatorias de leucotrienos y la actividad de la lipoxigenasa araquidonato (González-Correa et al., 2009; González-Correa, Navas, Muñoz-Marín, et al., 2008). El HT tiene efectos in vitro sobre la función plaquetaria. El compuesto inhibe la agregación plaquetaria, la acumulación del tromboxano agente proagregante en el suero 60 Introducción humano, la producción de leucotrienios moléculas proinflamatorias y la inhibición del araquidonato lipooxigenasa (Visioli & Galli, 2002). El HT reduce el riesgo de enfermedad de la arteria coronaria como consecuencia de su alto contenido de antioxidantes, debido a las ICAM-1 y VCAM-1 , E-selectina y adhesión a monocitos, que son cruciales para la activación endotelial y se las relaciona con la inflamación y propiedades antiagregantes (Dell’Agli et al., 2006; Caterina Manna, Napoli, Cacciapuoti, Porcelli, & Zappia, 2009). Carluccio et al., demostraron que el tratamiento con HT y resveratrol disminuyen la expresión del ARNm de VCAM-1 mediante el bloqueo de la activación de los factores de transcripción NF-kB y AP-1, que pueden regular directamente la expresión de sustancias proinflamatorias / genes proaterogénicos (Carluccio et al., 2003). Se investigó el efecto HT, a través de la medición del iNOS y la COX-2 en macrófagos de ratón J774 estimulados con lipopolisacárido. La incubación de las células con liposacaridos provocaron un aumento de la iNOS y COX-2 y el nivel de proteínas, así como la generación de ERO, lo que fue disminuido por HT. Además, el HT bloqueó la activación del NF-κB, transductor de señal nuclear y activador de la transcripción-1 alfa (STAT-1α) y el factor 1 regulador de interferón. Por otra parte, HT ejerce actividad anti-inflamatoria, su concentración inhibe la COX-2 y la iNOS en células monocíticas humanas (Zhang, Cao, & Zhong, 2009). 61 Introducción 1.19.8. ACTIVIDAD ANTIDIABÉTICA Existen evidencias que una mayor adherencia a la DietMed, puede aportar mecanismos de protección tanto en la prevención como en el desarrollo de la DM, puede tener también un papel beneficioso en la prevención primaria y secundaria de las enfermedades cardiovasculares y un efecto favorable sobre el hígado y la función sexual en este tipo pacientes (Pauwels, 2011). Se diseñó un estudio donde se utilizaron ratas Wistar diabéticas inducidas por inyecciones intraperitoneales de aloxan (tóxico análogo de la glucosa que destruye las células β del páncreas). Estas mostraron hiperglucemia, hipercolesterolemia, aumento de la peroxidación lipídica, y el agotamiento de las actividades de las enzimas antioxidantes. Se le administró, durante 4 semanas, oleuropeína y extractos ricos HT, entre 8 y 16 mg / kg de peso corporal de cada compuesto, disminuyendo los niveles de glucosa en suero y colesterol, y restaurado las perturbaciones antioxidantes. Estos resultados sugierieron un efecto antidiabético (Jemai, El Feki, & Sayadi, 2009). En otro estudio se evaluó el efecto del HT sobre el EO en ratas diabéticas inducidas por alloxan. Su administración causó una disminución del nivel de glucosa en plasma y un aumento de la superóxido dismutasa renal (SOD), catalasa y glutatión peroxidasa (GPX) actividades en el hígado y el riñón. Además, se observó una acción protectora contra la toxicidad hepática y renal. En este estudio se demostró que los polifenoles y especialmente HT son eficientes en la inhibición de la hiperglucemia y el EO inducido por la diabetes y sugiere que la administración de HT puede ser útil en la 68 Introducción prevención de las complicaciones diabéticas asociadas con el EO (Hamden, Allouche, Damak, & Elfeki, 2009). Del mismo modo, los polifenoles presentes en extracto de hoja de olivo, oleuropeína e HT como compuestos mayoritarios, revirtieron la inflamación crónica y el EO causantes de los síntomas cardiovasculares, hepáticos y metabólicos en un modelo de ratas Wistar macho obesas con diabetes inducida por la dieta y otras inducidas por estreptozotocina (Poudyal, Campbell, & Brown, 2010). Otros estudios basados en un tratamiento crónico mediante administración oral de HT a ratas diabéticas mejoraron el efecto de la aspirina sobre una de las complicacionesde la DM como es la retinopatía diabética (De La Cruz et al., 2010). Cabe destacar la ausencia de toxicidad que se ha observado en los datos científicos disponibles, incluso a altas concentraciones, tanto en estudios in vitro como in vivo realizados en ratas (Granados-Principal et al., 2010a). 1.20. ESTUDIOS EN HUMANOS: OTROS DATOS Las primeras evidencias de la absorción del HT en humanos se publicaron en el año 2000 (Visioli et al., 2000). En este estudio se administraron diferentes aceites de oliva con distinto contenido en compuestos fenólicos, encontrando de HT y tirosol en orina cuya cantidad fue proporcional al contenido de los mismos en el aceite. Así, la excreción de HT por orina fue mayor cuando se ingirió AOV que cuando el aceite estaba enriquecido en compuestos fenólicos, o cuando este compuesto fue incorporado a otro alimento como el yogurt (Visioli et al., 2003). 69 Introducción Bonanome et al., publicaron un trabajo, en el que se detectó tirosol y en algunos casos también HT en las lipoproteínas plasmáticas después del consumo de 100 ml de aceite de oliva (Bonanome et al., 2000). En el año 2000 se publicó un estudio, en el que los datos cinéticos demostraban que el transporte de HT se produce a través de un mecanismo de difusión pasiva y es bidireccional; el coeficiente de permeabilidad aparente que se ha calculado indica que la molécula se absorbe cuantitativamente a nivel intestinal (Manna et al., 2000). Miro-Casas et al., desarrolló un método analítico para HT y 3-O-metilhidroxitirosol en plasma. La dosis administrada de los compuestos fenólicos se estimó a partir de extractos metanólicos de AOV después de someterlos a diferentes tratamientos hidrolíticos. Las muestras de plasma y orina se recogieron de 0 a 12 horas antes y después de administrar 25 ml de AOV, una dosis similar a la utilizada en los países mediterráneos. Aproximadamente el 98% de HT parece estar presente en el plasma y orina en formas conjugadas (Miro-Casas et al., 2003). El HT es el principal polifenol de AO consumido y se absorbe bien en los seres humanos. Se considera que tiene la mayor potencia antioxidante en comparación con los otros polifenoles de AO. Se revisaron estudios de intervención en humanos y mostraron que los polifenoles de AO disminuyeron los niveles de LDLox en el plasma y varios biomarcadores de daño oxidativo. Se observaron los efectos antioxidantes de estos polifenoles, en la oxidación de la LDL después de una ingestión dietética de aproximadamente 10 mg por día. La evidencia general de ensayos in vitro y animales y estudios en humanos apoyan el efecto antioxidante de estos polifenoles de AO. Sin 70 Introducción embargo, se necesitan más estudios para aclarar el efecto de los polifenoles sobre los marcadores de EO, en particular los niveles de daño del ADN e isoprostano plasma (Raederstorff, 2009). En mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas recibieron 250 mg de extracto de hoja de olivo, se tomaron muestras de sangre y orina. Los niveles plasmáticos de HT glucurónido, sulfato de HT, oleuropeína aglicona glucurónido y oleuropeína aglicona derivado 1 fueron mayores en las mujeres posmenopáusicas y los niveles de MDA se redujeron en estas. Con la ingesta de compuestos fenólicos de AO se evita la osteoporosis (García-Villalba, Larrosa, Possemiers, Tomás-Barberán, & Espín, 2014). Soni et al., revisaron la literatura relacionada con la seguridad / toxicidad disponibles en polifenoles de AO, especialmente el HT. En los estudios de biodisponibilidad oral, se encontró la excreción urinaria de HT y su glucurónido para ser asociado con la ingesta de HT. En estudios comparativos, la excreción urinaria de HT fue mayor en humanos que en ratas. Sobre la base de los estudios disponibles del extracto y polifenoles, y una historia de la exposición y el uso de componentes del extracto a través de la aceituna de mesa, productos de la oliva y del AO. El consumo de HIDROX se considera seguro a niveles de hasta 20 mg / kg / día (Soni, Burdock, Christian, Bitler, & Crea, 2006). En este estudio, se administró a 12 varones voluntarios sanos, tirosol e HT, estos compuestos fenólicos, se absorbieron dosis-dependiente (p <0,001) el contenido fenólico del AO parece modular el contenido fenólico LDL y el EO postprandial promovido por 71 Introducción 40 ml de oliva de la ingestión de aceite en los seres humanos (Covas, de la Torre, et al., 2006). Vissers et al., realizaron una revisión blibliografica y encontraron estudios en los que la biodisponibilidad en humanos mostraron que la absorción de tirosol e HT es 55 a 66 % moles, y que al menos 5% se excreta en la orina. En algunos de los estudios en humanos, no se encontraron efectos de estos fenoles. No hay datos sobre las concentraciones de fenol en el plasma que sean alcanzables por la ingesta de AO. Se estimó que 50 g de AO por día proporciona aproximadamente 2 mg o aproximadamente 13 micromol de HT por día, y que la concentración plasmática de fenoles en el AO con potencial antioxidante resultante de una ingesta de este tipo puede ser a lo sumo 0,06 micromol / l. Esto es mucho más bajo, que las concentraciones mínimas de estos fenoles (50-100 micromoles), necesarios para mostrar la actividad antioxidante in vitro (Vissers, Zock, & Katan, 2004). Muchas de las propiedades beneficiosas del HT descritas en modelos in vitro también se han observado en animales y humanos cuando se administra un AOV lo que hizo suponer que estos compuestos pudieron absorberse y ejercer su efecto in vivo (Ramírez-Tortose, Pulido-Moran, Granados, Gaforio, & Quiles, 2015). 72 2. OBJETIVOS Objetivos Los beneficios que la adherencia a una DietMed tiene sobre diversos aspectos de la salud humana es algo que ya no es elemento de discusión ni controversia. El amplio estudio PREDIMED ha demostrado que este tipo de dieta es un pilar muy importante para el prevención de enfermedades cardiovasculares (cardiacas, cerebrales y periféricas), síndrome metabólico, procesos neurodegenerativos (Martínez-González et al., 2015) y, más recientemente, algunos tipos de cánceres (Toledo et al., 2015). Por otra parte, como consecuencia de numerosos estudios preclínicos y clínicos, se centra la responsabilidad de este beneficio en varios aspectos, siendo posiblemente el de más relevancia la mayor ingesta de micronutrientes, respecto a otro tipo de alimentación. Entre dichos micronutrientes se encuentran los flavonoides y los polifenoles (Tresserra-Rimbau et al., 2014): los primeros se encuentran mayoritariamente en cereales, frutas y verduras; los polifenoles principales se encuentran en vino tinto y AOV. En este esquema no hay que olvidar que la DietMed también se caracteriza por el consumo habitual de pescados ricos en ácidos grasos omega-3, los cuales han demostrado también un beneficio evidente sobre algunos aspectos de la prevención de enfermedades (Enns et al., 2014). Por último, los factores no alimenticios (sociabilidad de la comida, ambiente tranquilo y relajado, ejercicio moderado, etc.) hay que tenerlos en cuenta a la hora de entender globalmente por qué la DietMed es recomendada en todos los ámbitos de la Medicina como factor preventivo de primera línea. Debido a la trayectoria de investigación de nuestro grupo, nos interesó especialmente el papel del AOV y de su principal componente polifenólico HT, en diversos aspectos de la bioquímica y función cardiovascular, sobre todo en lo referente a 75 Objetivos su papel en la prevención de fenómenos isquémicos. Se ha demostrado que este componente del AOV disminuye una serie de factores bioquímicos y/o funcionales reconocidos como participantes fundamentales en el desarrollo de la ECV, tales como agregación plaquetaria, oxidación de la lipoproteína LDL, EO, etc (Covas et al., 2015; Reyes et al., 2013). La mayor parte de estos estudios se realizan en modelos experimentales in vitro o en animales de experimentación sanos. En ambos casos se induce el daño bioquímicofuncional mediante agentes químicos reconocidos y se observa que la presencia de HT reduce la mayor parte de los efectos de estos agentes nocivos. Sin embargo, son pocos los estudios que utilizan modelos en los que el daño cardiovascular se derive del desarrollo de una enfermedad determinada. Por ello nos interesó abordar este campo, ya que constituye un paso más en el conocimiento de los efectos protectores cardiovasculares del HT. Uno de los principales factores de riesgo de la ECV es la DM. Las complicaciones a largo plazo de esta enfermedad a nivel vascular son bien conocidas y se han estudiado los principales mecanismos de daño. Por ello elegimos un modelo experimental de DM que analiza el daño vascular en sus primeros estadíos, es decir, cuando se produce una inflamación vascular sin detectar aún un daño morfológico evidente. De esta forma podríamos definir mejor el posible efecto preventivo de la administración oral de HT. Como consecuencia de estos conocimientos, nos planteamos un trabajo en un modelo experimental de DM, con el objetivo de valorar la posible modificación de los 76 Objetivos principales biomarcadores que inciden en la aparición de la enfermedad vascular diabética derivada de la administración oral de HT. 77 Metodología Igualmente se practicó un control semanal del peso de los animales a todos los grupos experimentales, ajustándose la dosis del fármaco al peso semanal del animal tratado. Todos los animales diabéticos mantuvieron cifras de glucemia entre 400 y 600 mg/dl, mediante la inyección subcutánea de insulina Levemir FlexPen® (BagsværdDinamarca) usando agujas desechables NovoFine® (Madrid-España). La dosis de insulina administrada osciló entre 4 y 6 UI dependiendo de la cifra de glucemia obtenida previamente. 3.4. OBTENCIÓN DE MUESTRAS Al finalizar el periodo de tratamiento de dos meses, se procedió a la obtención de muestras. Una hora antes del sacrificio se les administró la última dosis del tratamiento. Se realizó una inducción anestésica con 50 mg/kg de diazepam (Valium®, Roche Farma, S.A. Madrid-España) y tras ello se anestesiaron con una dosis de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (Dolethal. Vetoquinol S.A.). Una vez anestesiadas fueron inmovilizadas en decúbito supino, se procedió a abrir la cavidad abdominal, y, previo desplazamiento del paquete intestinal hacia el lado derecho, se procedió a la disección de la aorta abdominal a nivel de su bifurcación en las dos ilíacas. A este nivel fue puncionada dicha arteria, procediéndose a la extracción de sangre. La sangre obtenida se dividió en dos muestras: 84 Metodología 1. La primera fue anticoagulada con citrato sódico 3.8% en proporción 1:10 y, a su vez, fue dividida en dos. Una para ser posteriormente usada como tal en la técnica de agregometría plaquetaria inducida con colágeno, previo contaje celular de las plaquetas (Coulter MD10. Coulter Electronics Limited). La otra parte de esta muestra anticoagulada fue centrifugada a 1500 x g (centrífuga refrigerada modelo 5800. Kubota Co. Japón), durante 15 minutos y a una temperatura de 4ºC, el plasma obtenido se congeló a -80ºC (ultracongelador -80ºC. Heraeus. USA) para la posterior determinación de los distintos parámetros bioquímicos. Del pellet obtenido, se obtuvo lisado de hematíes diluyendo 1mL del mismo con 3 mL de agua HPLC fría y tras un proceso de centrifugación a 5000 x g (Eppendorf Centrifuge 5415D), durante 15 minutos y a 4 ºC. Posteriormente, se realizó un contaje celular de las muestras y tras ello se procedió a su congelación a -80ºC hasta su procesamiento. 2. La segunda muestra de sangre total sin anticoagulantes, se dejó 30 minutos a 37°C, transcurridos los cuales se paralizó la actividad ciclooxigenasa con 10 µl de indometacina 100 µM y se centrifugó a 1500 x g durante 15 minutos. El suero obtenido se congeló a -80ºC. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA VASCULAR Una vez abierta la cavidad abdominal, por el procedimiento descrito anteriormente para obtención de sangre, continuamos la incisión y descubrimos la cavidad torácica de la cual se extrajo la aorta torácica completa. 85 Metodología La aorta se lavó cuidadosamente en suero salino isotónico, se dividió en 3 partes, se pesó. Dos segmentos se introdujeron en un recipiente con 500 µl de tampón compuesto por: NaCl (100 mM), KCl (4 mM), NaHCO3 (25 mM), Na2SO4 (2.1 mM), citrato sódico (20 mM), glucosa (2.7 mM) y Tris (50 mM) (pH 8.3). Se añadió 10µl de ionoforo de calcio A23187 (Sigma Chemical Co. USA), se incubó durante 20 minutos a 37ºC y se conservó el sobrenadante a -80ºC hasta su utilización para la determinación de la 6-keto prostaglandina F1α y producción de NO. El tercer segmento se utilizó para las determinaciones morfológicas, que se describirán posteriormente. 3.5. COMPUESTO DE ESTUDIO El compuesto de estudio fue el siguiente: HIDROXITIROSOL: 3,4-dihidroxifeniletanol (cedido gentilmente por Dr. Juan Fernández Bolaños, Biotecnología de los Alimentos, Instituto de la Grasa, CSIF, Sevilla). 86 Metodología 3.6. VARIABLES DE ESTUDIO PARÁMETROS PLAQUETARIOS Y ENDOTELIALES En las muestras de sangre y de aorta se cuantificaron algunos parámetros que regulan la interacción plaqueta-endotelio: 3.6.1. PARÁMETROS PLAQUETARIOS Agregometría plaquetaria en sangre total inducida con colágeno y determinación de la producción de TxB2 (metabolito estable del TxA2) en suero. 3.6.2. PARÁMETROS ENDOTELIALES Producción vascular de 6-keto-prostaglandina F1α (metabolito estable de la PGI2) y de nitritos y nitratos (índice indirecto de la producción endotelial de NO). Ambos parámetros en pared de aorta torácica obtenida según procedimiento detallado anteriormente. 3.7. PARÁMETROS DE ESTRÉS OXIDATIVO En las muestras obtenidas se valoraron una serie de parámetros que definen el estrés oxidativo. 87 Metodología 3.7.1. DAÑO OXIDATIVO Determinación de la capacidad de peroxidación lipídica a través de la cuantificación de los productos de reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) en muestras de plasma. 3.7.2. LDL OXIDADA (LDLox) La oxidación de las moléculas de LDL constituye la forma más aterogénica de las mismas, acontece ante un exceso de RL de oxígeno y se ha postulado como clave en el desarrollo de la patología vascular, estando en el origen de, entre otros procesos, de la DE. Se realizó en muestras de plasma. 3.8. PARÁMETROS INFLAMATORIOS Determinación de parámetros presentes en procesos inflamatorios vasculares, se estudió en muestras séricas donde se cuantificó la concentración de mieloperoxidasa (MPOx), interleucina 6 (IL-6) y moléculas de adhesión (VCAM-1) como índice de activación leucocitaria, producción de interleucinas y la expresión de moléculas de adhesión endotelio-leucocitos. También se ha realizado la determinación de la producción de peroxinitritos a través de la nitración de proteínas, concretamente de la 3nitrotirosina, por ello a través de su expresión se puede valorar el efecto tóxico del NO. Se realizó en muestras de plasma. 88 Metodología 3.9. PARÁMETROS MORFOLÓGICOS Como es conocido, la diabetes provoca un daño considerable en el sistema vascular. La DE, que predispone a la aterosclerosis y a otras comorbilidades cardiovasculares, es generalizada en la diabetes y entre otros, causa efectos sobre el tono vascular provocando vasoconstricción, al igual que hiperplasia y migración anormal de miocitos. Por ello se cuantificó el grosor de la pared arterial y la densidad de células en segmentos aórticos. 3.10. DESCRIPCIÓN DE LAS DETERMINACIÓN DE LAS VARIABLES DE ESTUDIO. 3.10.1. VARIABLES PLAQUETARIAS Agregometría plaquetaria en sangre total inducida con colágeno y determinación de la producción de TxB2 (metabolito estable del TxA2). AGREGACIÓN PLAQUETARIA Esta prueba tiene por finalidad establecer cuantitativamente la proporción de plaquetas que forman agregados tras la adición de un inductor de la agregación plaquetaria. Como consecuencia estudia la actividad global plaquetaria ante determinados estímulos químicos. 89 Metodología Esta técnica aporta como ventaja fundamental la posibilidad de explorar el funcionalismo plaquetario en presencia de todos los elementos sanguíneos. Es por ello que sea considerada como una de las técnicas que más fisiológicamente explora el funcionalismo plaquetario. Esta técnica se basa en la introducción de dos electrodos en la muestra de sangre, dejando circular una corriente eléctrica entre ambos, que pasará a través de la sangre. Cuando se añade un agente inductor de la agregación plaquetaria, las plaquetas se adhieren a los electrodos en proporción directa al grado de agregabilidad, incrementando la resistencia al paso de la corriente eléctrica de forma proporcional al número de plaqueta agregadas en dichos electrodos. Estos cambios en la impedancia eléctrica se pueden registrar gráficamente, constituyendo la denominada curva de agregación plaquetaria. Para la realización de las curvas de agregación se utilizó sangre anticoagulada. Posteriormente se distribuyó la sangre en cubetas siliconadas, 500 µL en cada cubeta, a las cuales se les añadió 500 µL de suero salino isotónico. De esta forma el volumen final de cada cubeta fue de l ml. Esta dilución se realizó en base a trabajos previos según los cuales el registro gráfico es más apropiado y cuantificable empleando esta dilución. Las cubetas con las muestras y un imán agitador se introducen en unos pocillos de incubación que para tal efecto posee el agregómetro (modelo 590-2D Chrono-log Corporation Havertown USA) a una temperatura constante de 37ºC. Cuando la sangre adquirió esta temperatura, se introdujo la muestra en el pocillo de agregación, fijándose la velocidad del imán a 1000 rpm. A continuación se 90 Metodología introdujeron los electrodos en la sangre, graduando el registro gráfico en su línea basal (mínima impedancia o máximo paso de corriente eléctrica). Después se añadió el agente inductor, en nuestro caso colágeno, registrándose la agregación durante un tiempo mínimo de 10 minutos. Una vez obtenida la curva de agregación, se consideró como intensidad máxima de agregación la altura en centímetros (correspondiente al valor numérico de la impedancia en ohmios) desde la línea basal hasta el punto máximo de la curva. Dicho valor fue expresado en ohmios de resistencia eléctrica. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN PLAQUETARIA DE TROMBOXANO B2 Mediante la determinación del tromboxano B2 (TxB2) conocemos la actividad metabólica del AA trombocitario. El TxB2 se cuantificó mediante técnicas de enzimoinmunoensayo en las muestras congeladas de suero (RPN-220 Thromboxane B2 biotrak assay. GE Healthcare) y para su posterior medición se necesitó un espectrofluorímetro (Polarstar Galaxy. BMG Labtechnologies. Alemania). 3.10.2. VARIALES ENDOTELIALES PRODUCCIÓN VASCULAR DE 6-KETO-PROSTAGLANDINA F1α (6-KETOPGF1α) La determinación y posterior medición de la producción vascular de 6-ketoPGF1α en el sobrenadante de las muestras inducidas de aorta, al igual que la descrita para la determinación del TxB2, se realizó mediante técnicas de enzimoinmunoensayo en las 91 Metodología muestras congeladas (6-keto-Prostaglandin F1α ELISA Kit. Cayman Chemical). Los resultados de la lectura se ajustaron según el peso de la porción arterial correspondiente. PRODUCCIÓN ENDOTELIAL DE ÓXIDO NÍTRICO Se realizó mediante la determinación de nitritos-nitratos, que se utiliza como medida indirecta de la producción de NO, se determinó en el sobrenadante obtenido tras inducción de arteria aórtica con ionóforo de Ca. Una vez obtenidos, se congelaron a -80ºC hasta su procesamiento con el kit nitrate/nitrite colorimetric assay kit (Cayman Chemichal Company) y posterior medición en espectrofluorímetro. Los resultados de la lectura se ajustaron según el peso de la porción arterial correspondiente. 3.10.3. VARIABLES DE ESTRÉS OXIDATIVO PEROXIDACIÓN LIPÍDICA Se valoró el EO a través de la determinación de la reacción con el ácido tiobarbitúrico, cuantificándose los productos de reacción con el ácido tiobarbitúrico o TBARS, cuyo principal representante es el malondialdehido (MDA). El MDA es un producto derivado del metabolismo del AA, que se produce por hidrólisis del endoperóxido cíclico PGH2 junto al ácido 12-hidroxiheptadecatrienoico (HHT). 92 Metodología La determinación de este metabolito del AA nos indica de modo indirecto los niveles de peroxidación alcanzados y aunque no es un metabolito específico del catabolismo peroxidativo, es un buen indicador, aceptado por muchos autores, del funcionalismo de esta vía oxidativa. Presenta también la ventaja de que puede colorearse al reaccionar con el ácido tiobarbitúrico, lo que nos permite de forma fácil cuantificar sus niveles en cualquier muestra determinando simplemente su absorbancia espectrofotométrica (Polarstar Galaxy. BMG Labtechnologies. Alemania). Se determinó la concentración de proteínas en plasma antes de centrifugar, para ello, aplicamos el método de Bradford (técnica detallada más adelante). Tomamos 500 µl de muestra en un tubo y añadimos 250 µl de ácido tricloroacético, agitamos y centrifugamos 5 min a 20000 x g (ultracentrífuga Modelo L-80. Beckman Instrument S.A. España). Se preparó el reactivo TRIS-TBA de la siguiente manera: - TRIS: 1,5 g de Tris en 50 ml de agua destilada - 17,2 mg de TBA por 1 ml de TRIS. Tomamos 500 µl del sobrenadante de la muestra tras su centrifugación y le añadimos 100 µl de TRIS-TBA. Incubamos en el baño de 100º durante 15 min. A continuación enfriamos y tomamos 200 µl en las placas transparentes y medimos la absorbancia espectrofotométrica a 532 nm. El cero se hace con suero fisiológico o agua. Los valores de MDA en nmoles producidos por las muestras, se relacionaron posteriormente con los mg de proteínas existentes en ella, expresando el índice de productos lipídicos reaccionantes con el ácido tiobarbitúrico en último término en nmoles de MDA/mg de proteínas. 93 Metodología Las diferencias entre las distintas dosis del compuesto utilizado respecto a las distintas variables, se han establecido mediante la aplicación de test de ANOVA con posterior transformación de Bonferroni. En todos los casos, se ha asumido significación estadística con un valor de p < 0.05. 100 4. RESULTADOS Resultados 4.1. PARÁMETROS ZOOMÉTRICOS En la Tabla 4.1. se muestran los valores medios (media ± error estándar de la media) correspondientes a los principales parámetros zoométricos obtenidos en los animales controles y en los diabéticos sin tratamiento y en aquellos tratados con HT (0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) durante los dos meses de la diabetes experimental, iniciándose el tratamiento una semana antes del inicio de la diabetes. Estas variables hacen referencia al peso de los animales al final del periodo experimental, los niveles de glucemia y determinaciones básicas hematimétricas, tales como los recuentos celulares (hematíes, leucocitos y plaquetas), hemoglobina y parámetros de segundo orden como el hematocrito y el volumen plaquetario. En términos generales se observa una obvia diferencia estadísticamente significativa en la glucemia de los animales diabéticos respecto a los no diabéticos y solo se cuantificó significancia estadística en el volumen plaquetario de los animales diabéticos sin tratamiento y en aquellos tratados con 0.5 y 1 mg/kg/día p.o. de HT. En las Figuras 4.1 a 4.3 se representan gráficamente, en forma de histograma, estos resultados zoométricos. 103 Resultados Tabla 4.1. Valores medios (media ± SEM) de las principales variables zoométricas cuantificadas en los grupos experimentales. CND CD HT-0.5 HT 1.0 HT-2.5 HT-5.0 HT10.0 Peso (g) 420±7 387±16 386±9 391±14 402±12 393±12 350±14 Glucemia (mg/dL) 102±3* 491±8 507±7 512±9 487±28 474±14 496±5 Hematíes (X1012/L) 8.6±0.2 9.0±0.2 8.6±0.2 8.2±0.2 8.2±0.1 8.6±0.2 8.2±0.7 Leucocitos (X106/L) 6.1±0.3 6.4±1.9 5.9±0.5 5.3±0.4 5.4±0.6 5.0±0.3 5.1±0.6 Plaquetas (X106/L) 909±33 924±20 893±27 882±30 910±22 890±22 925±13 Hb (g/L) 16.0±0.4 16.7±0.5 15.8±0.3 16.3±0.3 16.6±0.2 16.7±0.3 16.4±0.5 Hematocrito (%) 46.8±1.0 46.4±1.3 44.3±0.8 45.8±0.8 48.5±0.7 48.4±0.7 45.2±1.2 Vol.plaquetario (fL) 4.9±0.1 5.9±0.1† 5.3±0.1# 5.3±0.1# 5.6±0.1 5.8±0.1 5.6±0.2 *P < 0.05 respecto al resto de grupos. †P < 0.05 respecto a CND. #P < 0.05 respecto a CD. CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 104 Resultados Figura 4.1. Valores medios de peso corporal y glucemia al finalizar el periodo de seguimiento. Peso corporal CND CD 0.5 12.5 510 0 100 200 300 400 500 HT (mg/kg/día) Peso final (g) Glucemia CND CD 0.5 12.5 510 0 200 400 600 HT (mg/kg/día) *P < 0.05 respecto al resto de grupos * mg / dL 105 Resultados Figura 4.2. Valores medios de recuentos celulares sanguíneos al finalizar el periodo de seguimiento. Hematíes CND CD 0.5 12.5 510 0 2 4 6 8 10 HT (mg/kg/día) células x 10 12 /L Leucocitos CND CD 0.5 12.5 510 0 2 4 6 8 HT (mg/kg/día) células x 10 6 /L Plaquetas CND CD 0.5 12.5 510 0 200 400 600 800 1000 HT (mg/kg/día) células x 10 6 /L 106 Resultados Figura 4.3. Valores medios de hematimetría al finalizar el periodo de seguimiento. Hemoglobina CND CD 0.5 12.5 510 0 5 10 15 20 HT (mg/kg/día) g / L Hematocrito CND CD 0.5 12.5 510 0 20 40 60 HT (mg/kg/día) L / L Volumen Plaquetario CND CD 0.5 12.5 510 0 1 2 3 4 5 6 HT (mg/kg/día) fL 107 Resultados 4.2. PARÁMETROS DE FUNCIÓN PLAQUETARIA: AGREGACIÓN PLAQUETARIA Y PRODUCCIÓN DE TROMBOXANO En la Tabla 4.2. se muestra los valores medios (media ± error estándar de la media) correspondientes a la intensidad máxima de agregación plaquetaria (Imax) y a la producción plaquetaria de TxB2 en los animales controles y en los diabéticos sin tratamiento y en aquellos tratados con HT (0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) durante los dos meses de la diabetes experimental, iniciándose el tratamiento una semana antes del inicio de la diabetes. En términos generales se observa un incremento estadísticamente significativo de estos parámetros en los animales diabéticos sin tratamiento. La administración de HT reduce significativamente la Imax y la producción de TxB2. En las Figuras 4.4 y 4.5 se representan gráficamente, en forma de histograma, estos resultados plaquetarios. 108 Resultados Tabla 4.2. Valores medios (media ± SEM) de las principales variables plaquetarias cuantificadas en los grupos experimentales. mg/kg/día p.o. Imax (ohms) TxB 2 (pg/mL) CND 14.50 ± 1.36 44.72 ± 4.03 CD 28.30 ± 1.42* 75.81 ± 3.46* HT – 0.5 26.27 ± 0.84 67.22 ± 3.17 HT – 1 21.66 ± 0.44†† 62.19 ± 4.00 HT – 2.5 18.60 ± 0.85†† 61.11 ± 5.51 HT – 5 16.81 ± 1.09†† 57.03 ± 3.91† HT – 10 10.83 ± 0.87†† 47.01 ± 4.67† *P < 0.0001 respecto a CND. †P < 0.05, ††P < 0.0001 respecto a CD. CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 109 Resultados Prostaciclina arterial CND CD 0.5 12.5 510 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 HT (mg/kg/día) * ++ *P < 0.001 respecto a CND. +P < 0.05 respecto a CD 6-keto-PGF 1α (pg/mg aorta) Figura 4.6. Valores medios de 6-keto-PGF1α en anillos aórticos al finalizar el periodo de seguimiento 116 Resultados Figura 4.7. Valores medios de nitritos+nitratos en anillos aórticos al finalizar el periodo de seguimiento Nitritos+Nitratos aórticos CND CD 0.5 12.5 510 0 5 10 15 HT (mg/kg/día) *P < 0.0001 respecto a CND. + P < 0.001 respecto a CD * ++ + + nmol /mg aorta 117 Resultados 4.4. LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD OXIDADA (LDLOX) Y PEROXIDACIÓN LIPÍDICA En la Tabla 4.6. se muestran los valores medios (media ± error estándar de la media) correspondientes a la concentración plasmática de lipoproteína de baja densidad en forma oxidada (LDLox) y de los productos de reacción con ácido tiobarbitúrico (TBARS), en los animales controles y en los diabéticos sin tratamiento y en aquellos tratados con HT (0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) durante los dos meses de la diabetes experimental, iniciándose el tratamiento una semana antes del inicio de la diabetes. En términos generales se observa un incremento estadísticamente significativo de la concentración plasmática de LDLox en los animales diabéticos, reduciéndose tras la administración de HT. En las Figura 4.8 y 4.9 se representan gráficamente, en forma de histograma, estos resultados de LDLox y TBARS. 118 Resultados Tabla 4.6. Valores medios (media ± SEM) de la concentración de lipoproteína de baja densidad oxidada (LDLox) cuantificada en los grupos experimentales. mg/kg/día p.o. LDLox (ng/mL) TBARS (nmol/mg proteína) CND 13.09 ± 1.73 0.27 ± 0.03 CD 21.86 ± 2.07* 0.61 ± 0.05** HT – 0.5 14.69 ± 0.97† 0.33 ± 0.04†† HT – 1 14.88 ± 1.32† 0.28 ± 0.03†† HT – 2.5 11.58 ± 0.79†† 0.15 ± 0.02†† HT – 5 11.78 ± 1.06†† 0.12 ± 0.05†† HT – 10 13.58 ± 1.03† 0.19 ± 0.02†† *P < 0.001, **P < 0.0001 respecto a CND. †P < 0.01, ††P < 0.0001 respecto a CD. CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 119 Resultados Tabla 4.7. Comparación estadística (análisis ANOVA) entre grupos de animales diabéticos P LDLox TBARS CD 0.5 1 2.5 5 10 0.002 0.010 0.0001 0.0001 0.009 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 HT-0.5 CD 1 2.5 5 10 0.002 1.000 0.976 1.000 1.000 0.0001 1.000 0.002 0.0001 0.291 HT-1 CD 0.5 2.5 5 10 0.010 1.000 1.000 1.000 1.000 0.0001 1.000 0.148 0.017 1.000 HT-2.5 CD 0.5 1 5 10 0.0001 0.976 1.000 1.000 1.000 0.0001 0.002 0.148 1.000 1.000 HT-5 CD 0.5 1 2.5 10 0.0001 1.000 1.000 1.000 1.000 0.0001 0.0001 0.017 1.000 1.000 HT-10 CD 0.5 1 2.5 5 0.009 1.000 1.000 1.000 1.000 0.0001 0.291 1.000 1.000 1.000 CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 120 Resultados Figura 4.8. Valores medios de la concentración de lipoproteína de baja densidad en forma oxidada (LDLox) al finalizar el periodo de seguimiento LDL oxidada plasmática CND CD 0.5 12.5 510 0 5 10 15 20 25 HT (mg/kg/día) * ++++ ++ + *P < 0.001 respecto a CND. + P < 0.01, ++P < 0.0001 respecto a CD ng/mL 121 Resultados Figura 4.9. Valores medios de la concentración de peróxidos lipídicos plasmáticos (TBARS) al finalizar el periodo de seguimiento TBARS en plasma CND CD 0.5 12.5 510 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 HT (mg/kg/día) * ++ +++ *P < 0.0001 respecto a CND. + P < 0.0001 respecto a CD nmol/mg prot 122 Resultados 4.5. PARÁMETROS INFLAMATORIOS En la Tabla 4.8. se muestran los valores medios (media ± error estándar de la media) correspondientes a la concentración séricas de MPOx, VCAM-1, IL-6 y 3nitrotirosina (representación de la concentración plasmática de peroxinitritos), en los animales controles y en los diabéticos sin tratamiento y en aquellos tratados con HT (0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) durante los dos meses de la diabetes experimental, iniciándose el tratamiento una semana antes del inicio de la diabetes. En términos generales se observa un incremento estadísticamente significativo de los mediadores inflamatorios en los animales diabéticos, reduciéndose tras la administración de HT. Asimismo se aprecia que esta reducción se produce con las dosis más bajas, existiendo un menor efecto reductor con las mayores. En las Figuras 4.10 a 4.13 se representan gráficamente, en forma de histograma, estos resultados de variables inflamatorias. 123 Resultados Tabla 4.8. Valores medios (media ± SEM) de las principales variables inflamatorias cuantificadas en los grupos experimentales. mg/kg/día p.o. MPOx (ng/mL) VCAM-1 (ng/mL) IL-6 (pg/mL) 3-nitrotirosina (pg/mL) CND 4.08±0.23 0.37±0.03 12.46 ± 0.11 0.79±0.02 CD 12.30±1.23* 1.16±0.09* 12.66 ± 0.22 5.98±0.64* HT – 0.5 3.10±0.20† 0.22±0.04† 11.58 ± 0.13 3.85±0.48 HT – 1 3.69±0.35† 0.43±0.06† 12.05 ± 0.15 2.43±0.19†† HT – 2.5 7.10±0.83† 0.48±0.06† 12.65 ± 0.53 0.97±0.04†† HT – 5 8.59 ± 0.77†† 0.58±0.05† 13.74 ± 1.06 2.93±0.36†† HT – 10 7.14± 0.99†† 0.49±0.08† 13.15 ± 0.69 2.85±0.12†† *P < 0.0001 respecto a CND. †P < 0.0001, ††P < 0.05, respecto a CD. CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 124 Resultados Tabla 4.9. Comparación estadística (análisis ANOVA) entre grupos de animales diabéticos P MPOx VCAM-1 3-nitrotirosina CD 0.5 1 2.5 5 10 0.0001 0.0001 0.0001 0.032 0.003 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.204 0.002 0.0001 0.011 0.064 HT-0.5 CD 1 2.5 5 10 0.0001 1.000 0.111 0.002 0.434 0.0001 0.380 0.043 0.002 0.369 0.204 1.000 0.027 1.000 1.000 HT-1 CD 0.5 2.5 5 10 0.0001 1.000 0.110 0.003 0.394 0.0001 0.380 1.000 1.000 1.000 0.002 1.000 1.000 1.000 1.000 HT-2.5 CD 0.5 1 5 10 0.0001 0.111 0.110 1.000 1.000 0.0001 0.043 1.000 1.000 1.000 0.0001 0.027 1.000 0.419 1.000 HT-5 CD 0.5 1 2.5 10 0.032 0.002 0.003 1.000 1.000 0.0001 0.002 1.000 1.000 1.000 0.011 1.000 1.000 0.419 1.000 HT-10 CD 0.5 1 2.5 5 0.003 0.434 0.394 1.000 1.000 0.0001 0.369 1.000 1.000 1.000 0.064 1.000 1.000 1.000 1.000 CND: control no diabético, CD: control diabético, HT: hidroxitirosol (la numeración se refiere a las dosis administradas: 0.5, 1, 2.5, 5 y 10 mg/kg/día p.o.) 125