Estudio de polimorfismos genéticos implicados en el metabolismo de hormonas sexuales y su asociación con Abortos Espontáneos de causa desconocida.

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Medicina Departamento de Especialidades Quirúrgicas, Bioquímica e Inmunología Tesis Doctoral ESTUDIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS IMPLICADOS EN EL METABOLISMO DE HORMONAS SEXUALES Y SU ASOCIACIÓN CON ABORTOS ESPONTÁNEOS DE CAUSA DESCONOCIDA BEATRIZ PÉREZ NEVOT Málaga, 2016 AUTOR: Beatriz Pérez Nevot http://orcid.org/0000-0002-7778-2624 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE ESPECIALIDADES QUIRÚRGICAS, BIOQUÍMICA E INMUNOLOGÍA ESTUDIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS IMPLICADOS EN EL METABOLISMO DE HORMONAS SEXUALES Y SU ASOCIACIÓN CON ABORTOS ESPONTÁNEOS DE CAUSA DESCONOCIDA Directores de Tesis PROF. ARMANDO REYES ENGEL PROF. MAXIMILIANO RUIZ GALDÓN Doctoranda BEATRIZ PÉREZ NEVOT Departamento de Especialidades Quirúrgicas, Bioquímica e Inmunología FACULTAD DE MEDICINA D. ARMANDO REYES ENGEL Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular D. MAXIMILIANO RUIZ GALDÓN Profesor Titular de Bioquímica y Biología Molecular CERTIFICAN: que la Tesis Doctoral que presenta Dª Beatriz Pérez Nevot, Licenciada en Farmacia, ha sido realizada bajo su dirección, con el título “Estudio de polimorfismos genéticos implicados en el metabolismo de hormonas sexuales y su asociación con Abortos Espontáneos de causa desconocida” para su lectura y defensa ante el Tribunal designado por la Comisión de Doctorado de la Universidad de Málaga. Una vez redactado el presente trabajo, ha sido revisado encontrándose conforme para ser defendido y aspirar al grado de Doctor. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, se expide el presente certificado. Lo que se firma en Málaga, en diciembre de 2015 Fdo.: Armando Reyes Engel Fdo.: Maximiliano Ruiz Galdón A mis padres AGRADECIMIENTOS Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, he recibido el apoyo de numerosas personas a las que quisiera expresar mi gratitud: En primer lugar, al Profesor Armando Reyes Engel, director de esta investigación, por la orientación, el seguimiento y su supervisión. Gracias por esas largas conversaciones con las que nos hemos entusiasmado y que nos han permitido sentar las bases de este trabajo. Por transmitir y compartir conmigo la pasión por la Genética Humana. Al Profesor Maximiliano Ruíz Galdón, codirector en este trabajo, por abrirme las puertas de su despacho y confiar desde el primer momento en mí. Gracias por tu generosidad, tu tiempo, apoyo profesional, científico y personal. Eres un gran maestro. A Arturo, Ana y Miriam, los mejores compañeros de viaje que se puede tener. Gracias por vuestra amistad. A los Hermanos Porta, Tamara e Irene, especialmente por su ayuda en la puesta a punto de las técnicas necesarias para la realización de esta Tesis. Habéis hecho que lo más complicado sea muy sencillo a vuestro lado. A la Dra. Jiménez por su acogida en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Materno Infantil de Málaga. Gracias por tu ayuda desinteresada e impecable trabajo. A todos los facultativos del Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Virgen de la Victoria y a mis compañeros de residencia por estar disponibles y dispuestos a tenderme siempre una mano. Porque aunque el tiempo pase siempre me hacéis sentir muy querida. ÍNDICE POLIMORFISMOS ESTUDIADOS ........................................................................ 51 1.7.1. SRD5A2 ............................................................................................................. 51 1.7.2. CYP19A1 ........................................................................................................... 54 1.7.3. ESR1 .................................................................................................................. 58 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................ 63 HIPÓTESIS ............................................................................................................... 66 OBJETIVOS.............................................................................................................. 67 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 69 TIPO DE ESTUDIO.................................................................................................. 71 POBLACIÓN DE ESTUDIO ................................................................................... 72 3.2.1. Grupo Fetal ........................................................................................................ 72 3.2.2. Grupo Control .................................................................................................... 73 EVALUACIÓN CLÍNICA ....................................................................................... 75 3.3.1. Criterios de inclusión ......................................................................................... 75 3.3.2. Criterios de exclusión ........................................................................................ 75 DETERMINACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS .......................... 78 3.4.1. Extracción de DNA ............................................................................................ 78 3.4.2. Análisis de calidad DNA extraído ..................................................................... 81 3.4.3. Determinación de los polimorfismos genéticos a estudiar ................................ 82 ANÁLISIS DE CROMOSOMOPATÍAS EN UNA SUBPOBLACIÓN DE ABORTOS ESPONTÁNEOS ............................................................................................. 84 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS .............................................. 89 3.6.1. Análisis descriptivo de polimorfismos............................................................... 90 3.6.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg .......................................................................... 90 3.6.3. Análisis de asociación de polimorfismos con la enfermedad ............................ 91 3.6.4. Estudio del desequilibrio de ligamiento ............................................................. 94 3.6.5. Estudio de asociación haplotípica ...................................................................... 96 ÍNDICE 3.6.6. Estudio de interacciones génicas ....................................................................... 97 3.6.7. Estimación de la función de supervivencia ........................................................ 98 4. RESULTADOS ............................................................................................................ 103 CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS DE LAS POBLACIONES ESTUDIADAS .................................................................................................................. 105 4.1.1. Grupo Fetal ...................................................................................................... 105 4.1.2. Grupo Control .................................................................................................. 108 FRECUENCIAS ALÉLICAS Y FRECUENCIAS GENOTÍPICAS ...................... 109 EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG .............................................................. 111 ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN DE GENOTIPOS INDIVIDUALES Y MODELOS DE HERENCIA ................................................................................................................. 114 4.4.1. Modelos de herencia ........................................................................................ 116 4.4.2. Genotipos individuales divididos por trimestres gestacionales ....................... 122 ESTUDIO DEL DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO ....................................... 126 4.5.1. Gen SRD5A2 ................................................................................................... 126 4.5.2. Gen CYP19A1 ................................................................................................. 127 4.5.3. Gen ESR1......................................................................................................... 128 ESTUDIO DE ASOCIACIÓN HAPLOTÍPICA..................................................... 130 4.6.1. Gen SRD5A2 ................................................................................................... 130 4.6.2. Gen CYP19A1 ................................................................................................. 130 4.6.3. Gen ESR1......................................................................................................... 131 ESTUDIO DE INTERACCIONES GÉNICAS ...................................................... 133 ESTUDIO DE CROMOSOMOPATÍAS Y SEXO FETAL ................................... 139 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN UNA SUBPOBLACIÓN EUPLOIDE DE ABORTOS ESPONTÁNEOS ........................................................................................... 140 4.9.1. Análisis de asociación de genotipos individuales en subpoblación euploide .. 140 4.9.2. Genotipos individuales divididos por sexo fetal .............................................. 143 5. DISCUSIÓN ................................................................................................................. 145 ÍNDICE SOBRE CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS DE LAS POBLACIONES ESTUDIADAS .................................................................................................................. 147 5.1.1. Grupo Fetal ...................................................................................................... 147 5.1.2. Grupo Control .................................................................................................. 148 SOBRE CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS ... 149 5.2.1. Comparación de frecuencias alélicas y genotípicas con bases de datos científicas 149 5.2.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg ........................................................................ 149 SOBRE EL ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN DE GENOTIPOS INDIVIDUALES Y MODELOS DE HERENCIA ............................................................................................. 151 5.3.1. Genotipos individuales divididos por trimestres gestacionales ....................... 156 SOBRE EL DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO Y ASOCIACIONES HAPLOTÍPICAS ............................................................................................................... 158 5.4.1. Gen SRD5A2 ................................................................................................... 159 5.4.2. Gen CYP19A1 ................................................................................................. 159 5.4.3. Gen ESR1......................................................................................................... 160 SOBRE EL ESTUDIO DE INTERACCIONES GÉNICAS .................................. 162 SOBRE EL ESTUDIO DE CROMOSOMOPATÍAS Y POLIMORFISMOS EN LA SUBPOBLACIÓN EUPLOIDE ........................................................................................ 164 LIMITACIONES .................................................................................................... 167 PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................. 168 6. CONCLUSIONES........................................................................................................ 169 7. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................... 173 8. ANEXOS ....................................................................................................................... 201 INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 2 INTRODUCCIÓN 3 El grupo de investigación en el que participo trabaja en el ámbito de la Genómica de la Fertilidad Humana desde tres ejes metabólicos (folatos, neurotransmisores y hormonas sexuales) con posibles relaciones hipostáticas o epistáticas, relacionando polimorfismos genéticos con indicadores bioquímicos y cuadros clínicos. Se podría decir que las pérdidas reproductivas precoces constituyen en la práctica médica el cuadro clínico de mayor incidencia en el ser humano. Hasta un 15% de los embarazos reconocidos fracasan, y una de cada cuatro mujeres experimentará un aborto espontáneo (AE) en algún momento de su vida (Blumenthal, 1992). Dada su gran frecuencia, el AE constituye una grave preocupación de salud pública, además, porque sin un tratamiento adecuado puede provocar una alta morbilidad e incluso mortalidad para la madre. INTRODUCCIÓN 4 DESARROLLO EMBRIO-FETAL La vida humana debe ser entendida como un proceso continuo en el cual la fecundación resulta un momento crítico en tanto que, en condiciones normales, conforma un nuevo individuo genéticamente distinto, a pesar de que el genoma embrionario no se activará realmente hasta que se formen 4-8 células (a los 2-3 días post fecundación aproximadamente). La fecundación es el conjunto de acontecimientos que comienzan cuando un espermatozoide contacta con un ovocito secundario o sus cubiertas y que conducirá finalmente a la mezcla de cromosomas paternos y maternos en la metafase de la primera división mitótica del embrión unicelular (zigoto). Este complejo proceso, que dará entidad al embrión como unidad genética, se extiende durante horas, por lo que, a pesar de que resulte didáctico considerarlo así, no está justificado hablar del “momento de la fecundación”. Aunque el desarrollo embrio-fetal debe ser entendido como un proceso continuo con límites no siempre fácilmente precisables, existen ciertas subdivisiones dentro del mismo cuyo interés resulta más didáctico que biológico (Figura 1). Entre ellas destaca aquella que fragmenta el periodo de desarrollo en dos fases, embrionaria y fetal, atendiendo a cronología. La primera de ellas se extiende hasta la octava semana gestacional y viene definida por la génesis tisular, mientras que la segunda ocupa desde este límite temporal hasta la fecha del parto, caracterizándose por un continuo proceso de maduración y crecimiento tisular. INTRODUCCIÓN 5 Figura 1. Periodos del desarrollo prenatal. 1.1.1. Periodo embrionario Se extiende desde la 3ª semana hasta las 8ª semana. En él las células embrionarias dan origen a sus propios tejidos y sistemas orgánicos, apareciendo como consecuencia de ello los caracteres principales del cuerpo. El ectodermo da origen a los órganos y estructuras en contacto con el mundo exterior: sistemas nervioso central y periférico, epitelio sensorial del oído, nariz y ojo, piel y sus anexos; la hipófisis, glándulas mamarias, sudoríparas y esmalte dentario. El mesodermo da origen al sistema vascular, urogenital, bazo y corteza de las glándulas suprarrenales. Se divide en: para-axial, intermedio y lateral. El para-axial forma las somitomeras, que darán origen al mesénquima de la cabeza y se organiza en somitas en los segmentos occipital y caudal. Cada somita posee un miotoma, esclerotoma y dermatoma. El endodermo forma el epitelio de revestimiento del tracto respiratorio, gastrointestinal y la vejiga. Forma el parénquima de: tiroides, paratiroides, hígado y páncreas. Como consecuencia del crecimiento del sistema nervioso central, el disco embrionario aplanado empieza a plegarse en dirección cefalocaudal y transversal, formando las curvas cefálica y caudal y la forma redondeada del cuerpo del embrión. Durante esta INTRODUCCIÓN 6 etapa se mantiene la conexión del saco vitelino y la placenta por medio del conducto vitelino y el cordón umbilical respectivamente. 1.1.2. Periodo fetal Este periodo comprende de la semana 9ª a la fecha del parto y se caracteriza por la maduración de los órganos y tejidos y el crecimiento rápido del cuerpo, siendo más lento el desarrollo de la cabeza. Se produce la maduración de los esbozos embrionarios, su ubicación topográfica definitiva y el inicio de su función para cubrir parte de las necesidades biológicas. Para la consecución de un organismo completo a partir del cigoto, el desarrollo normal implica crecimiento y diferenciación, sometidos ambos a una estrecha coordinación y a una organización rigurosa. Esta regulación es genética, la cual determina la especificidad del organismo, y epigenética, que asegura primero la formación progresiva de los esbozos y de los órganos definitivos después, merced a complejos mecanismos de motilidad celular, inducción, regresión y regulación. Al comenzar el 3º mes, el desarrollo de la cabeza se vuelve más lento en comparación con el resto del cuerpo. La cara adquiere un aspecto más humano y en torno a la semana 12 aparecen los centros de osificación primaria en los huesos largos y del cráneo. Durante el 3º, 4º y 5º mes el feto crece en longitud, mientras que el incremento de peso se realiza en los últimos meses antes del parto. Inicialmente la piel fetal tiene aspecto arrugado por la falta de conectivo y su piel es rojiza, pero en los últimos meses se redondea el contorno corporal por el depósito de grasa subcutánea. Hacia el final de la vida intrauterina el feto está cubierto de vermix caseoso. INTRODUCCIÓN 7 CONCEPTO DE ABORTO ESPONTÁNEO Se define aborto espontáneo como la pérdida de un embrión o feto por causas no provocadas intencionalmente, distinguiéndose del aborto inducido o interrupción voluntaria del embarazo. Además, según la clasificación clásica, aborto es la finalización de la gestación antes de que el feto alcance la edad gestacional suficiente para sobrevivir fuera del claustro materno, es decir, antes de la viabilidad fetal (Acién, 1998). En un principio el concepto resulta claro, sin embargo, la mayor dificultad reside en la definición de viabilidad fetal, dado que el pronóstico de supervivencia ha variado sensiblemente en los últimos años. Por tanto, esta definición es imprecisa ya que no aporta dato objetivo alguno que nos permita delimitar con exactitud un aborto de un parto inmaduro. En 1977, la Organización Mundial de la Salud (OMS), con el objetivo de unificar criterios y no subestimar la mortalidad neonatal, definió el aborto como la expulsión o extracción uterina de un embrión o feto de 500 gramos o menos (WHO: recommended definitions, terminology and format for statiscal table related to the perinatal period and use of a new certifícate for cause of perinatal deaths). Posteriormente, la Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO) estableció además la edad gestacional de 22 semanas como límite, aunque este dato varía según la bibliografía y medio que se consulte. La literatura anglosajona refiere, en general, el límite de las 20 semanas, mientras que en nuestro medio, se prefiere 22 semanas de gestación dado que coincide aproximadamente con el peso establecido por la OMS y con la edad vigente en el legislación española para la interrupción voluntaria del embarazo. INTRODUCCIÓN 14 ETIOPATOLOGÍA DEL ABORTO ESPONTÁNEO El proceso reproductivo implica una fina coordinación de gran número de procesos en los cuales pueden producirse alteraciones que conduzcan a errores irreparables manifestados en forma de aborto. Resulta difícil hablar de etiología del AE porque aunque han sido muchas las “causas” descritas, no hay estudios adecuadamente controlados que establezcan un claro vínculo causa-efecto. En realidad, más que de factores etiológicos deberíamos hablar de factores asociados a un proceso del cual desconoceremos el agente causal en un gran porcentaje de casos (AE de causa desconocida). Por tanto, los AE se han asociado a múltiples causas, destacando las anomalías intrínsecas del producto y algunas ambientales, pero en la práctica clínica habitual no se identifican en la mitad de los casos (Hanna, Bretherick, Liu, Stephenson & Robinson, 2010). Por otro lado, dentro de los efectos adversos asociados al consumo de fármacos (teratogénesis), el creciente desarrollo de la genética está demostrando que dichos agentes agresores prenatales actúan sobre un terreno genéticamente predispuesto, es decir, existe una estrecha relación entre genotipo y ambiente en lo relativo a la teratogenicidad embrio-fetal. La existencia de determinadas mutaciones genéticas más la acción del ambiente puede conllevar a una alteración en un metabolito o enzima que intervenga en la vía metabólica de la degradación de dicho medicamento. Las principales etiologías propuestas para los AE se pueden clasificar en los siguientes grupos: INTRODUCCIÓN 15 1.4.1. Anomalías cromosómicas y monogénicas. En general, los factores genéticos juegan un papel muy importante en los AEs (Rynekrova, Kasparova, Adamkova, Fait & Hubacek, 2012; García-Enguídanos, Calle, Valero, Luna & Domínguez-Rojas, 2002; Pandey, Rani & Agrawal, 2005) y, en particular, se sabe que las anomalías cromosómicas son la causa más frecuente de AE del primer trimestre (50-60%). En el segundo trimestre de gestación la frecuencia desciende a un 5-15% (Simpson, 2007). Algunas anomalías monogénicas como la deficiencia de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (Toncheva & Tzoneva, 1985) o alteraciones en la inactivación del cromosoma X han sido asociadas a una mayor tasa de AE de repetición (Beever et al., 2003; Lanasa et al., 2001). Sin embargo, las causas demostradas en la actualidad son realmente las cromosómicas. Las cromosomopatías “de novo” en los embriones pueden ocurrir en un 5060% de los AEs, sobre todo los que ocurren muy precozmente, siendo las más frecuentes las trisomías autosómicas (Boue, Boué & Lazar, 1975; Kalousek, Pantzar, Tsai & Paradice, 1993; Lauritsen, 1975) y siendo ésta también una causa de los abortos de repetición. Las poliploidías se presentan en un 20% de los casos y las monosomías en un 10% (Salazar, Álamos, Arriagada & Selman, 2011). Diferentes estudios coinciden en que la trisomía 16 seguida de las 22, 13 y 21 son las más prevalentes y en ningún caso se observa trisomía del cromosoma 1 (Quiroga de Michelena et al., 2007; Fritz et al., 2001). También se han encontrado anomalías cromosómicas asociadas a los gametos de los progenitores en un 310% de los casos de aborto (Carp, Feldman, Oelsner & Schiff, 2004; De Braekeleer & Dao, 1990). INTRODUCCIÓN 16 Existe controversia en cuanto a la creencia de la aneuploidía recurrente como origen del aborto de repetición. Hassold (1980) mostró que el cariotipo de un segundo aborto sucesivo era anormal en cerca del 70% de los casos en los que se encontró una aneuploidía en el primer aborto, y sólo en un 20% de los casos si el primer aborto era cromosómicamente normal (Hassold, 1980). Sin embargo, esta observación podía deberse más a la edad materna que a cualquier otro factor. Más recientemente, otros dos grupos volvieron a mostrar que el siguiente aborto en mujeres con aborto habitual era cromosómicamente anormal en por lo menos el 48% de los casos, sugiriendo la posibilidad de una aneuploidía recurrente a pesar de la normalidad de los cariotipos paternos (Daniely, Aviram-Goldring, Barkai & Goldman, 1998; Stern, Dorfmann, Gutiérrez-Najar, Cerrillo & Coulam, 1996). En un estudio de otro grupo se observó que, en 14 parejas con antecedentes de aborto de repetición, la proporción de embriones anormales en dos ciclos consecutivos de fecundación in vitro era similar (Rubio et al., 2003). Estos datos sugieren la recurrencia de tasas similares de cromosomopatías en las mujeres que sufren aborto habitual. Sin embargo, otros autores cuestionan la aneuploidía recurrente como origen del aborto de repetición (Ogasawara, Aoki, Okada & Suzumori, 2000; Sullivan et al., 2004). 1.4.2. Anomalías anatómicas. Las anomalías anatómicas como las malformaciones uterinas o los miomas pueden ser causas probables pero no demostradas de AE de repetición en primer y segundo trimestre del embarazo (Homer, Li & Cooke, 2000; Li, Tuckerman & Laird, 2002). Por ejemplo, el útero septo es el más frecuente y el que peor pronóstico tiene en lo que se refiere a la reproducción. Está dudosamente relacionado con abortos precoces por posibles defectos en la vascularización en el septo (Fedele, Dorta, Brioschi, Giudici & Candiani, 1989) y de forma INTRODUCCIÓN 17 más consistente con abortos tardíos debidos a incompetencia cervical y a un reducido volumen intracavitario (Propst & Hill, 2000). Sin embargo, no existe ningún estudio hasta el momento que haya demostrado que al corregir un problema uterino determinado, las pacientes intervenidas aborten menos que las no operadas (Rai & Regan, 2006). 1.4.3. Infecciones microbianas. La presencia de infecciones o una flora bacteriana anormal en el tracto genital externo, vagina y cérvix pueden ser causa de AE (Martin et al., 1982). Pacientes no inmunizadas frente a Toxoplasma o Rubeola y que contraen dicha infección pueden sufrir un AE esporádico, pero casi de forma imposible podrá ser la causa de aborto de repetición ya que la primoinfección genera inmunidad a largo plazo que suele proteger a la mujer durante el resto de su edad fértil. 1.4.4. Trastornos endocrinos u hormonales. Existe una débil y no del todo demostrada asociación entre el aborto y, por extensión, el aborto de repetición, y los desórdenes endocrinos u hormonales como el síndrome de ovarios poliquísticos, diabetes mellitus o mujeres con problemas de tiroides (especialmente hipotiroidismo), hipersecreción de LH, disminución de la progesterona o con defectos en la fase lútea del ciclo (Coulam & Stern, 1994; Kalter, 1987; Tulppala, Stenman, Cacciatore & Ylikorkala, 1993). INTRODUCCIÓN 18 1.4.5. Factor seminal severo. La mayor presencia de anomalías cromosómicas o menor cantidad de espermatozoides de morfología normal en varones cuya pareja sufre aborto de repetición ha sido propuesta en algunos estudios como una posible etiología (Carranza-Lira & Celis-Rico, 2011; Collodel et al., 2009). Se propone como hipótesis una mayor velocidad de los espermatozoides con aneuploidías, por lo cual consiguen llegar al óvulo con mayor probabilidad, crear una fecundación anómala y ser responsables de la pérdida de la gestación de forma recurrente (Giorlandino, Calugi, Iaconianni, Santoro & Lippa, 1998). Sin embargo, la asociación entre anomalías espermáticas y el aborto de repetición no ha podido ser confirmada en otros trabajos, en especial en ausencia de patología seminal severa (Bronet et al., 2012). Pese a la relación inicialmente establecida entre microdeleciones del cromosoma Y (Dewan, Puscheck, Coulam, Wilcox & Jeyendran, 2006) y fragmentación aumentada del ADN espermático (Carrell et al., 2003) con el aborto de repetición, recientes estudios (Bellver et al., 2010; Wettasinghe, Jayasekara & Dissanayake, 2010) han mostrado que los varones de parejas con aborto de repetición idiopático y patología seminal ausente o no severa, no presentan mayor prevalencia de microdeleciones Y, y que, aunque muestran un incremento significativo de los índices de oxidación y fragmentación del ADN espermático, similar al de varones con oligozoospermia severa, dichos índices se solapan tanto con los de varones fértiles que no presentan ningún valor predictivo sobre la ocurrencia de aborto de repetición. Es decir, que si bien puede estar algo más elevada la oxidación y la fragmentación del ADN espermático, estos valores no predicen de forma adecuada qué varones sufrirán o no aborto de repetición, no presentando su evaluación por tanto ninguna utilidad diagnóstica. INTRODUCCIÓN 19 1.4.6. Trombofilias adquiridas y trombofilias heredadas. Las trombofilias representan un grupo de patologías que se caracterizan por un desequilibrio entre los sistemas de coagulación y fibrinolisis, a favor del primero. Pueden ser adquiridas, como el Síndrome Antifosfolípido (SAF) o algunos casos de resistencia a la proteína C activada (APCR), o congénitas, como los déficits de proteína C o S y de antitrombina III, o mutaciones puntuales de genes implicados en la cascada de coagulación (Adelberg & Kuller, 2002). En principio, todas ellas podrían producir complicaciones gestacionales, como aborto de repetición, por su efecto trombogénico. Con respecto al SAF, es la única causa no genética que ha demostrado invariablemente, a través de ensayos clínicos prospectivos aleatorizados, revisiones sistemáticas y metaanálisis, ser origen del aborto de repetición, pues su tratamiento etiológico reduce drásticamente la probabilidad de un nuevo aborto (Rai & Regan, 2006). Se considera responsable de un 10-15% de los casos (Branch, Silver, Pierangeli, van Leeuwen & Harris, 1997; Kutteh, 1996). Los anticuerpos anticoagulante lúpico y anticardiolipina IgG son los más importantes ya que son los que tienen mayor poder trombogénico y abortivo. El SAF parece actuar de dos maneras distintas en la génesis del aborto: a) Su efecto trombogénico arterial y venoso sólo parece ser responsable de los abortos más tardíos, originados a partir de las 8-10 semanas, momento en que las conexiones vasculares placentarias ya están formadas y son susceptibles de trombosis. b) Antes de este tiempo, es posible que en su mecanismo de actuación intervenga un desequilibrio en la producción hormonal y una deficiente invasión trofoblástica endovascular (Chamley, 2002; Levine, Branch & Rauch, 2002), debida a la unión de los anticuerpos antifosfolípido a los fosfolípidos de INTRODUCCIÓN 20 membrana del trofoblasto o a las células endoteliales de los vasos deciduales o trofoblásticos (Sebire et al., 2002). Este doble mecanismo del SAF (alteración de la implantación embrionaria y posterior efecto trombótico en los vasos útero-placentarios) explicaría también el problema de insuficiencia placentaria originada por el síndrome, responsable de los distintos trastornos asociados a la gestación (preeclampsia, desprendimiento de placenta, retraso de crecimiento intrauterino, muerte fetal intraútero, parto prematuro), y justificaría la vasculopatía de los vasos deciduales presente en los estudios anatomopatológicos realizados tras los abortos (Heilmann, von Tempelhoff & Pollow, 2003). 1.4.7. Factores ambientales y de estilo de vida. En general, el estrés, tabaco, alcohol, radiaciones, factores psicológicos y un IMC superior a 30 pueden estar relacionados con los AEs y de repetición (Harlap & Shiono, 1980; Sugiura-Ogasawara et al., 2002), aunque no han sido claramente relacionados con los últimos. Clásicamente se ha relacionado el estrés en la mujer como factor que puede actuar negativamente en la gestación. En un estudio prospectivo sobre 336 mujeres en las cuales se determinó el estrés mediante tres tests diferentes y la determinación de cortisol sanguíneo, no se observó que incrementara el riesgo de AE (Nelson et al., 2003). En cuanto al tabaco, aunque existen estudios que habían relacionado éste como un factor de riesgo de aborto, se ha discutido su metodología, y estudios recientes no confirman esta asociación, incluso en gestantes que fuman 20 cigarrillos o más (Wisborg, Kesmodel, Henriksen, Hedegaard, & Secher, 2003; Rasch, 2003; Harlap & Shiono, 1980). INTRODUCCIÓN 21 Existen indicios en estudios realizados sobre un número amplio de gestantes con embarazo único (24.679) que indican que un consumo de cinco o más bebidas alcohólicas por semana durante la gestación puede incrementar el riesgo de AE en el primer trimestre (Rasch, 2003; Harlap & Shiono, 1980; Parazzini et al., 1994). Sin embargo, es común en este tipo de estudios que el consumo de alcohol pueda estar infraestimado porque la paciente no reconoce la cantidad consumida. Armstrong et al. calcularon que el riesgo de abortos aumentaba un promedio de 1,3 por cada día en que se bebiera (Armstrong, McDonald, & Sloan, 1992). En cambio, King & Fabro en un trabajo prospectivo con 564 mujeres, comunicó que un bajo nivel de consumo durante el embarazo no se asociaba con riesgo significativo de aborto (King & Fabro, 1983). 1.4.8. Factor fármacológico. Hace décadas se creía que la placenta servía de barrera estanca que protegía al feto de los efectos adversos de los fármacos. El desastre de la talidomida cambió completamente esta idea, demostrando que la exposición embrio-fetal a fármacos durante los periodos críticos del desarrollo podía producir daños irreversibles. El comprobado por este fármaco ha sugerido la posibilidad de que cualquier fármaco pueda ser una nueva talidomida, lo que ha conducido, en ocasiones, al extremo contrario como es tener una percepción de teratogénesis alejada del perfil de seguridad real del fármaco (Koren, Pastuszak, & Ito, 1998). Por teratogénesis o dismorfogénesis entendemos la alteración morfológica, bioquímica o funcional, inducida durante el embarazo y que es detectada durante la gestación, en el nacimiento o con posterioridad (Pérez-Landeiro, Allende-Bandrés, Fernández, J, & Palomo Palomo, 2002). INTRODUCCIÓN 22 Los medicamentos pueden dañar al feto en cualquier periodo del embarazo, aunque el momento de mayor riesgo es el primer trimestre ya que durante la fase embrionaria (especialmente en los días 20-55 posfecundación) tiene lugar la formación de la mayoría de los órganos. Evidentemente, un factor de gran importancia es el tipo de sustancia consumida. Los efectos nocivos que los fármacos administrados a la madre pueden tener sobre el feto han sido conceptualizados en tres tipos: teratogenia, efectos indeseables sobre el desarrollo y efectos secundarios sobre el feto y/o neonato. Los mecanismos de lesión embriofetal son múltiples: la acción que pueden producir sobre el material hereditario, las alteraciones del crecimiento de los tejidos, la detención o modificación de la morfogénesis normal y la destrucción celular. Por su parte, la variabilidad en la expresión del potencial teratogénico de un medicamento depende de factores como la dosis consumida, el período del embarazo en que se administró, la interacción con otros factores ambientales (por ejemplo la multiterapia) y la susceptibilidad individual de la madre y el feto (Mitchell, 2003). Lógicamente, cuanto más inmaduro es el producto de la concepción, más sensible resulta a los posibles agentes nocivos. Pero, además del agente en sí, interesa el momento en que actúa a modo de noxa farmacológica. El amplio conocimiento actualmente existente sobre desarrollo embriológico humano permite tener bien establecido el momento de mayor vulnerabilidad para cada órgano o sistema de órganos. Según se muestra en la Figura 2 queda bien establecido el momento de mayor vulnerabilidad para cada órgano o sistema de órganos. Las barras de color morado corresponden a los períodos de mayor susceptibilidad, en dependencia del calendario de morfogénesis por períodos del desarrollo y que corresponde a la fase de máxima intensidad en la síntesis de ADN en cada uno de esos órganos o sistemas (Taboada Lugo, Lardoeyt Ferrer, Quintero Escobar, & Torres Sánchez, 2004). INTRODUCCIÓN 23 Figura 2. Fases del desarrollo, consecuencias de la acción teratógena de los fármacos en cada fase y periodos de mayor sensibilidad a la acción teratógena de los fármacos. Esquema de Moor modificado (tomado de Alonso et al., 1987). El creciente desarrollo de la genética está demostrando que los agentes agresores prenatales de naturaleza ambiental actúan sobre un terreno genéticamente predispuesto, por lo que existe una relación estrecha entre genotipo y ambiente en lo relativo a la teratogenicidad embrio-fetal inducida por medicamentos. Esto explica el hecho de que un mismo medicamento no presente la misma potencialidad teratogénica en dos gestantes que lo hayan consumido en el mismo período y con igual dosis, lo que pudiera deberse a la existencia en tal caso de un defecto génico que conlleve una alteración en un metabolito o enzima que intervenga en la vía metabólica de la degradación de dicho medicamento. Un ejemplo en tal sentido lo constituye la administración de un aminoglucósido a dosis mínima en dos gemelos dicigóticos, que produjo sordera en uno de ellos y en el otro no. La existencia INTRODUCCIÓN 30 Se han identificado dos formas diferentes del RE, normalmente referidas como las formas α y β, ambas codificadas por genes diferentes e independientes (ESR1 y ESR2, respectivamente). La conformación activada del RE forma un dímero y, puesto que ambas variantes son coexpresadas en diversos tipos de células, los receptores pueden formar homodímeros del tipo REα (αα) o REβ (ββ), o heterodímeros del tipo REαβ (αβ) (X. Li et al., 2004). Los RE α y β muestran una significativa similitud de secuencia, y ambos se componen de siete dominios (Figura 5). Figura 5. Dominios de REα y REβ, incluyendo algunos de los sitios de fosforilación conocidos implicados en la regulación independiente de ligando. El dominio AF-1 reside en la parte aminoterminal de la molécula y no necesita fijar estrógeno para iniciar la transcripción génica. El dominio AF-2 reside en la porción carboxiterminal donde se fijan los estrógenos. El complejo receptor-estrógeno cambia las características del receptor y, una vez introducido en el núcleo, permite la unión de una larga serie de factores de transcripción intermedios (proteínas coactivadoras) que inician la transcripción génica. Recientemente se ha descrito la existencia de un segundo RE, lo que añade más complejidad al mecanismo de acción de los estrógenos (Amado & Flórez, 2003). INTRODUCCIÓN 31 Ambos tipos de receptores se expresan en una amplia variedad de tejidos (Figura 6), aunque existen notables diferencias en sus patrones de expresión (Couse, Lindzey, Grandien, Gustafsson, & Korach, 1997): El RE-α es expresado mayoritariamente en testículo, epidídimo, ovario (células de la granulosa y células de la teca, glándula mamaria, el cerebro (glándula pituitaria), tejido adiposo, hueso, corazón y el útero (Grohé et al., 1997; Kuiper et al., 1997; Drummond, Baillie, & Findlay, 1999; Pelletier & El-Alfy, 2000; Taylor & Al-Azzawi, 2000; Anwar et al., 2001; Horner, Beavan, & Compston, 2001; Morani, Warner, & Gustafsson, 2008; Weiser, Foradori, & Handa, 2008). En cambio, el RE-β es expresado mayoritariamente el ovario (células de la granulosa y células de la teca, cuerpo lúteo y ovocito), colon, hipotálamo, trompas de Falopio, pulmón, adipocito, riñón, hueso, corazón, vejiga, suprarrenales, testículos y próstata (Enmark et al., 1997; Grohé et al., 1997; Kuiper et al., 1997; Saunders, Maguire, Gaughan, & Millar, 1997; Taylor & Al-Azzawi, 2000; Anwar et al., 2001; Bord, Horner, Beavan, & Compston, 2001; Bocca, Billiar, Albrecht, & Pepe, 2008; Driesche, Smith, Myers, & Duncan, 2008; Morani, Warner, & Gustafsson, 2008; Weiser Foradori, & Handa, 2008). INTRODUCCIÓN 32 Figura 6. Representación esquemática de la localización del receptor de estrógenos en el tejido humano (de tomado Drummond & Fuller, 2010). Los receptores de estrógeno son receptores citoplásmicos en ausencia de ligando, pero los últimos estudios llevados a cabo han demostrado que una fracción de estos receptores se localizan en el núcleo celular (Htun, Holth, Walker, Davie, & Hager, 1999). 1.5.1.2. Acciones de los estrógenos Los estrógenos son considerados principalmente hormonas feminizantes. Entre sus efectos se encuentran los cambios en los depósitos de grasa corporal, el desarrollo y crecimiento mamario, la estimulación de la proliferación celular del útero, trompas de Falopio y epitelio vaginal, la maduración de los ovarios y la producción de hormonas esteroides durante la fase luteal del embarazo (Sherwood, 2011; Telleria et al., 1998). Asimismo, también se encuentran implicados en el control de la conducta sexual INTRODUCCIÓN 33 femenina a nivel del SNC (Freeman, 2006). Por otro lado, además de participar en la función reproductiva, los estrógenos son necesarios para el mantenimiento del equilibrio hidroelectrolítico y de la masa ósea (de ahí los problemas de osteoporosis que se presentan después de la menopausia) y participan en aspectos relacionados con la fisiología vascular tales como la proliferación epitelial de los vasos sanguíneos, siendo factores cardioprotectores, entre otras funciones (Harris, 2007; Sherwood, 2011), No obstante su importante papel en la fisiología femenina, los estrógenos también son necesarios en procesos fisiológicos de los machos, lo que ha dejado atrás la idea de que las características definitorias de machos y hembras se deben a andrógenos y estrógenos respectivamente. Uno de los efectos estrogénicos más estudiados en el macho es el feedback negativo sobre la secreción de testosterona. Este fenómeno consiste en la inhibición que los estrógenos ejercen sobre la secreción de la LH en pituitaria (Sandberg, 1980; Ricke et al., 2008). Puesto que esta hormona se encarga de estimular la secreción de testosterona por parte de las células de Leydig testiculares, el feedback negativo producido por los estrógenos resulta en disminución de los niveles testosterona, que a su vez lleva a una menor producción de DHT (Ricke et al., 2008; Sharpe, 1998). El desarrollo y función testicular también requieren de los estrógenos, lo cual queda evidenciado por el macroorquidismo y la oligozoospermia que se observan en hombres con niveles bajos de E2. Sin embargo, quizá el efecto estrogénico más importante a nivel del éxito reproductivo del macho sea el control de la reabsorción de fluidos a nivel del epidídimo, proceso que causa un aumento en la cantidad de espermatozoides en el semen y por lo tanto aumenta la probabilidad de que se produzca la fecundación (Sharpe, 1998; Hess et al., 1997) INTRODUCCIÓN 34 1.5.2. Andrógenos El principal andrógeno es la testosterona, que contiene 19 C con dos grupos metilo en posiciones 18 y 19, y doble enlace en 4-5. En muchos tejidos la testosterona se convierte en dihidrotestosterona (DHT), por reducción en posición 5α, comportándose como metabolito activo (Figura 7). Existen otros andrógenos naturales con actividad débil; los principales son los precursores androstenodiona y el andrógeno de origen suprarrenal deshidroepiandrosterona. Figura 7. Transformación de testosterona en dihidrotestosterona por acción de la enzima 5α-reductasa. Los andrógenos son hormonas sexuales esteroideas derivadas del colesterol de tipo masculino, por los testículos, pero también por los ovarios en la mujer (androstenediona) y por la corteza suprarrenal de las glándulas suprarrenales (principalmente dihidroepiandrosterona). INTRODUCCIÓN 35 1.5.2.1. Receptor androgénico El receptor de los andrógenos tiene la misma estructura básica de los receptores esteroides, pero su concentración celular es más baja que la de otros receptores esteroides, incluso en los tejidos andrógeno-dependientes. Su gen se localiza en el cromosoma X y su mecanismo de acción es similar al de todos los receptores esteroideos. El receptor responde a la testosterona, pero tiene tres veces más afinidad por la DHT (Hemat, 2004), un derivado de la testosterona que se produce en diversas células mediante el efecto de la 5α-reductasa (Figura 8). El receptor no sólo tiene más afinidad por la DHT sino que además el complejo DHT-receptor es más estable que el complejo testosterona-receptor. Hay dos enzimas 5a-reductasa, con el 50 % de homología en su secuencia de aminoácidos. El gen de la enzima de tipo 1 (SRD5A1) se encuentra en el cromosoma 5 y la enzima se expresa preferentemente en la piel del área no genital (p. ej., en el cuero cabelludo), hígado y cerebro, mientras que el gen de la enzima de tipo 2 (SRD5A2) se encuentra en el cromosoma 2 y la enzima se expresa en los tejidos genitales del varón (piel escrotal, epidídimo, vesículas seminales y próstata) e hígado. Esta última enzima se encuentra asociada a la membrana nuclear y es inhibida por el antagonista finasterida (Rittmaster, 1994). 1.5.2.2. Acciones de los andrógenos Los efectos de los andrógenos no son resultado de distintas acciones de una misma hormona, sino que son el reflejo de la misma acción sobre diferentes tejidos.  Acciones androgénicas. Los andrógenos son los responsables de que se desarrollen los caracteres sexuales secundarios del varón, que empiezan en la pubertad y terminan en la madurez. La testosterona origina: INTRODUCCIÓN 36 - Crecimiento y maduración de los órganos sexuales. - Crecimiento del pelo - Efecto sobre la voz, hipertrofia de la mucosa laríngea. - Aumenta el espesor de la piel y la resistencia de los tejidos subcutáneos.  Acciones anabolizantes (síntesis proteica). Los andrógenos favorecen el desarrollo muscular mediante la incorporación de aminoácidos en las proteínas musculares (Salvador, Moya-Albiol, Martínez-Sanchis & Simon, 1999). En este sentido han sido administrados en la vejez para aumentar la fortaleza muscular y el vigor (Johansen, Mulligan & Schambelan 1999). También se ha observado un bloqueo post-ejercicio del catabolismo proteico. Se invierten los efectos catabólicos de los glucocorticoides puesto que sus receptores son ocupados por los andrógenos (Wilson, 1988).  Efecto sobre el crecimiento óseo y la retención del calcio. Gracias a la acción de los andrógenos el espesor de los huesos aumenta de manera considerable, tanto a nivel cortical como trabecular (Chesney, Mazess & Rose, 1978) y además, se depositan en ellos gran cantidad de sales de calcio.  Aumento de la eritropoyesis. Los andrógenos incrementan el número de células rojas, hemoglobina y hematocrito, además de incrementar también la síntesis de eritropoyetina (Palacios, Campfield, Mclure, Steiner & Swerdloff, 1983). Hecho por el cual se produce un aumento de la capacidad aeróbica.  Efecto sobre el equilibrio de electrolitos y agua. Aumenta la reabsorción de sodio en los riñones, por lo que se retiene agua y cloruro sódico. Este fenómeno provoca un aumento de peso.  Estimulan la lipólisis. Se ha visto que parecen aumentar el número de betaadrenorreceptores en el tejido adiposo (Xu, Pergola & Björntorp, 1990) INTRODUCCIÓN 37  Otros efectos. Los andrógenos inhiben la secreción gonadotrópica de la adenohipófisis (Bijlsma, Duursma, Thijssen & Huber, 1982), disminuyen la concentración plasmática de SHBG, elevan las concentraciones plasmáticas de LDL-colesterol y provocan un descenso del HDL colesterol (Crist, Peake & Stackpole, 1986), aumentan la excreción de 17-cetoesteroides. 1.5.3. Diferenciación gonadal y sexual La existencia de hormonas gonadales en un individuo y su concentración en un momento determinado de su vida constituyen un marco de referencia que, en condiciones fisiológicas, se halla establecido por los mecanismos de diferenciación sexual. La determinación del sexo y la diferenciación sexual son procesos secuenciales que implican, de manera sucesiva, el establecimiento del sexo genético o cromosómico del cigoto en el momento de la concepción, la determinación del sexo gonadal o primario en respuesta al sexo genético y la regulación por parte del sexo gonadal de la diferenciación del aparato genital que define al sexo fenotípico. El desarrollo de los caracteres sexuales secundarios, específicos de cada sexo, en la época de la pubertad refuerza la expresión fenotípica del dimorfismo sexual. La determinación del sexo está íntimamente relacionada con el control del desarrollo del sexo gonadal o primario, es decir, de los ovarios o los testículos, y la diferenciación sexual depende de los sucesos que ocurran después de la organogénesis gonadal. Estos procesos están regulados por no menos de 30 genes localizados en los cromosomas sexuales y autosomas, los cuales actúan mediante diversos mecanismos, como los factores de organización, las hormonas esteroideas gonadales, ciertas secreciones peptídicas y receptores tisulares específicos (Marx, 1995). Tanto el embrión masculino como el femenino INTRODUCCIÓN 38 poseen órganos primarios comunes e indiferenciados que siguen una tendencia inherente hacia la feminización, a menos que en su desarrollo sean interferidos por factores masculinizantes de diversa naturaleza, es decir, un ovario se diferencia como tal a menos que la gónada embrionaria indiferente sea desviada por un factor organizador del testículo, el cual es regulado por el cromosoma Y. Más aún, la diferenciación femenina de las estructuras somáticas sexuales (el tracto genital interno y externo) es independiente de la existencia de las hormonas gonadales y aparecerá siempre que no existan testículos, aun cuando no existan ovarios. Por consiguiente, el dimorfismo sexual del fenotipo, derivado de la diferenciación sexual, está mediado por el testículo fetal y sus secreciones hormonales, no por el ovario. La diferenciación masculina si existen testículos surge a pesar de que el feto se encuentra en un ambiente rico en estrógenos y gestágenos de origen placentario. La principal función del cromosoma Y es dirigir la gónada embrionaria bipotencial e indiferenciada hacia la diferenciación como testículo y asegurar la espermatogénesis. La organización testicular se origina hacia los 45 días de la gestación, a diferencia del ovario que no sale de su etapa indiferenciada hasta los 3 meses. Las primeras células específicas del varón que se diferencian son las células de Sertoli, que rodean las células germinales. Estas células obligatoriamente han de tener la dotación cromosómica Y. La siguiente diferenciación de las células de Leydig (hacia los 60 días) parece que está bajo el control de las células de Sertoli. Estas células germinales no dirigen la diferenciación gonadal; sólo toman la forma de la gónada en la que se encuentran (oocitos en el ovario normal y espermatogonias en el testículo normal). Los genes WT1, codificador de la proteína del tumor de Wilms, y SF1, codificador del factor esteroidogénico 1, son esenciales para el desarrollo de la gónada indiferenciada (Barrionuevo, Burgos, Scherer, & Jiménez, 2012). INTRODUCCIÓN 39 Posteriormente, en la diferenciación hacia testículo desempeña un papel esencial el gen SRY (Región determinante del sexo en Y) del cromosoma Y. La proteína SRY tiene una secuencia central de 80 aminoácidos homóloga a las proteínas HMG (high mobility group), que se fija al ADN y actúa como un factor de transcripción (Lefebvre, Dumitriu, PenzoMéndez, Han, & Pallavi, 2007). También resulta esencial para la diferenciación hacia testículo un gen del cromosoma 17, el SOX9, que también codifica una proteína HMG, la cual es potenciadora de los efectos de la proteína SRY (Clarkson & Harley, 2002). Además, en la diferenciación hacia ovario es necesaria la actuación de un gen del cromosoma X, el DAX1, que pertenece a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas. Conseguida la diferenciación testicular, las células de Sertoli segregan, entre otros elementos, la sustancia inhibidora del conducto de Müller, una glucoproteína que funciona como secreción paracrina, que avanza por difusión y disuelve el conducto. Esta proteína pertenece a la familia del factor de crecimiento transformante b, es similar a la inhibina y su gen se ha localizado en el cromosoma 19. Las células de Leydig comienzan a sintetizar testosterona a las 9 semanas, al tiempo que aparecen en ellas receptores para las gonadotropinas hCG (Gonadotropina coriónica humana) y LH. Aunque la involución mülleriana no depende de la testosterona, la estimulación de los conductos de Wolff para que se diferencien en epidídimo, conducto deferente y vesículas seminales depende de la existencia de testosterona y de receptores androgénicos. Curiosamente, el gen responsable de la síntesis de receptores androgénicos está localizado en el cromosoma X. En cambio, la diferenciación de los genitales externos masculinos y del seno urogenital se debe a la dihidrotestosterona (DHT), derivado activo producido por la enzima 5α-reductasa. La próstata y las glándulas bulbouretrales provienen del seno urogenital y su diferenciación está mediada también por la DHT. Las máximas concentraciones de testosterona fetal (200-600 ng/dl) se alcanzan a las 16 semanas de INTRODUCCIÓN 46 Figura 10. Regulación hormonal del ciclo reproductor femenino. 1.5.5. Mecanismo de acción del receptor esteroideo Los receptores esteroideos pertenecen a una superfamilia de proteínas (receptores de hormonas esteroideas, hormonas tiroideas, vitamina D y A y otras) que reconocen pequeñas estructuras lipófilas y activan la transcripción de ciertos genes. Dichos receptores son activados por la presencia del ligando, formando dímeros. Los receptores nucleares actúan uniéndose a través del su dominio de unión a DNA a los elementos de respuesta a hormona (HREs), cortas secuencias de DNA palindrómicas AGGTCA o AGGACA espaciadas por un número variable de nucleótidos. INTRODUCCIÓN 47 Estos HREs están alejados del sitio de inicio de transcripción, lo que implica la formación de un bucle en el DNA que los acerque al promotor génico. Los efectos transcripcionales de los receptores nucleares están mediados por el reclutamiento de coactivadores y correpresores. En el caso de las hormonas esteroideas los receptores nucleares pertenecen a una subfamilia llamada tipo I. Las hormonas esteroideas penetran en las células por difusión (Figura 11); en sus células diana, es decir, las que son sensibles a la hormona, el esteroide se une a dichos receptores de manera específica y con gran afinidad, las cuales se encuentran tanto en el citoplasma como en el núcleo de la célula, formando dímeros. La fijación del complejo receptor-esteroide a los HREs modifica la transcripción de ciertos ARNm, su procesamiento y traducción a proteínas específicas en genes alejados de los sitios de unión, gracias a la presencia de coactivadores/correpresores. Una vez que el complejo receptoresteroide ha interactuado con los sitios aceptores del núcleo, sufre reacciones que terminan por desocupar el receptor, que es reciclado, y eliminar el esteroide de la célula. Figura 11. Mecanismo de acción clase I de los receptores nucleares. INTRODUCCIÓN 48 Los receptores esteroideos pueden constar de diversas subunidades y mostrar grados distintos de asociación según si el esteroide está unido o no y según si progresa hacia el núcleo o permanece en el citoplasma. Una manera de detectar estos cambios en la asociación de subunidades es la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa, en condiciones de alta (0,3M ClK) o baja (no ClK) fuerza iónica. En el primer caso, las constantes de sedimentación suelen ser de 3,5 S a 4 S; en el segundo de 6 S a 10 S. Un coeficiente alto de sedimentación en ambiente de fuerza iónica baja indica que se ha formado un complejo que contiene, por lo menos, una subunidad fijadora de hormona. INTRODUCCIÓN 49 HORMONAS SEXUALES Y SU RELACIÓN CON ABORTOS ESPONTÁNEOS DE CAUSA DESCONOCIDA En cuanto a la relación de los polimorfismos genéticos en el desarrollo de AE de causa desconocida no está aún clara (Pandey et al., 2005). En los últimos años ha habido grandes esfuerzos en investigar el papel de las variantes comunes genéticas en la predisposición a padecer un AE, como por ejemplo, polimorfismos del sistema inmune, variaciones en el gen del factor V, o en el gen de MTHFR (Rynekrova et al., 2012). Sin embargo, aunque las hormonas sexuales están implicadas en todas las etapas de reproducción y en el desarrollo fetal, polimorfismos de genes implicados en sus vías metabólicas no han sido tan extensamente estudiados. Se sabe que los niveles reducidos de progesterona pueden conducir a AE (SzekeresBartho, Wilczynski, Basta & Kalinka, 2008) en las primeras etapas de gestación. Algunos estudios han encontrado relación entre polimorfismos del receptor de progesterona y AE (Schweikert et al., 2004; Su, Lee, Chen & Kuo, 2011) pero no ha sido confirmado por otros autores (Traina et al., 2011; Aruna et al., 2010; Su, Lin & Chen, 2011). Los estrógenos son también importantes para el éxito reproductivo, ya que influyen en el desarrollo del endometrio, así como la función placentaria, la maduración y la perfusión (Albrecht, Aberdeen & Pepe, 2000; Guibourdenche, Fournier, Malassiné & EvainBrion, 2009). Varios polimorfismos que codifican para los receptores de estrógenos tipo 1 (ESR1) han sido evaluados en pacientes con AE de repetición, pero dicha asociación requiere INTRODUCCIÓN 50 de una mayor investigación. También se han encontrado asociaciones entre polimorfismos del gen que codifica la enzima aromatasa CYP19A1 y AE (Cupisti et al., 2009). Y en cuanto a los andrógenos, también se conoce que son un factor esencial para el éxito de la reproducción (Walters, Simanainen & Handelsman, 2010). A nivel molecular, sus efectos son mediadas a través de la activación de los receptores de andrógenos (AR), a través de la conversión de testosterona en DHT mediante la enzima 3-oxo-5-alfa-esteroide 4deshidrogenasa (SRD5A1 y 2). Aunque no se han encontrado estudios en mujeres abortadoras, estudios en modelos animales encuentran una asociación entre la deficiencia de esta enzima y la pérdida fetal (Mahendroo, Cala, Landrum & Russell, 1997). Por tanto, existen evidencias para pensar que ciertas alteraciones genéticas en las vías metabólicas de las hormonas sexuales puedan tener una influencia en el riesgo de pérdida fetal. Es interesante indicar que en la actualidad la mayoría de los trabajos relacionados con este tema, se han realizado en madres abortadoras de repetición y muy pocos estudios hacen el análisis genético en el propio tejido fetal, como es nuestro caso. El presente trabajo, pretende investigar en muestras de tejido fetal 8 polimorfismos de genes implicados en el metabolismo de hormonas sexuales (ESR1, CYP19A1 y SRD5A2) y su asociación con los AE de causa desconocida. INTRODUCCIÓN 51 POLIMORFISMOS ESTUDIADOS Ver Anexo I: Características de los genes y polimorfismos estudiados. 1.7.1. SRD5A2 La enzima 3-oxo-5-alfa-esteroide delta 4-deshidrogenasa 2 es codificada por el gen SRD5A2 (2p23.1). Este gen se extiende por más de 40 kilobases de ADN genómico y contienen 5 exones y 4 intrones. La proteína está compuesta por 254 aminoácidos. Cataliza la conversión irreversible intracelular de testosterona en el más potente andrógeno, la DHT, la cual es esencial para una diferenciación normal de los genitales masculinos externos y el desarrollo del seno urogenital. Esta proteína (isoenzima 2) se expresa en niveles altos en estructuras andrógeno-dependiente, tales como la próstata, el epidídimo (especialmente en las células basales), y las vesículas seminales. Es activa a pH ácido, presentando un estrecho intervalo de pH óptimo (alrededor de 5) y es sensible a inhibidores 4-azasteroide, por ejemplo finasteride (facilitado por RefSeq, Julio 2008). Mediante la inhibición se bloquea la conversión de testosterona en DHT, produciendo reducciones significativas de los niveles de DHT en suero y tejidos. Tanto la isoenzima 1 como la 2 tienen como sustrato preferente a la progesterona, seguido por la testosterona y con una considerable distancia, la corticosterona (Negri-Cesi, Poletti, A., & Celotti, 1996). INTRODUCCIÓN 52 La deficiencia en la isoenzima 2 es un trastorno autosómico recesivo poco frecuente que provoca un Pseudohermafroditismo masculino en el hombre. Es una enfermedad caracterizada por una diferenciación incompleta de los genitales masculinos en pacientes con genotipo 46 X-Y. Por su parte, el síndrome clásico (Hipospadias pseudovaginales perineoscrotales) se caracteriza en el nacimiento por la presencia de unos genitales externos ambiguos con un falo de aspecto clitoriano, hipospadias, escroto bífido y seno urogenital persistente con un orificio vaginal perineal ciego. Sin embargo, los fenotipos de los genitales externos pueden ir desde una aspecto femenino completo a uno masculino con hipospadias y/o micropene. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de los siguientes polimorfismos del SRD5A2: 1.7.1.1. rs523349 El polimorfismo rs523349 (V89L), ubicado en chr2:31805706-31805706, es una variante C>G que corresponde a un mutación de sentido equivocado por sustitución de valina por leucina en el codón 89 (V89L). Se sabe que la variante G (leucina) disminuye la tasa de conversión de testosterona en DHT tanto in vitro como in vivo (Makridakis et al., 1997). Un estudio publicado en el año 2007 de 1466 casos, relacionó al alelo G de este SNP con aumento de riesgo de cáncer de ovario (Beesley et al., 2007). Las frecuencias poblacionales alélicas de 5 sub-poblaciones Europeas del rs523349 se encuentran expresadas en la Figura 12 («1000 Genomes browser: Homo sapiens - Population genetics - rs523349 (SNP)», s. f.). INTRODUCCIÓN 53 Figura 12. Frecuencias sub-poblacionales Europeas de rs523349. CEU= Utah Residents (CEPH) with Northern and Western European Ancestry, FIN= Finnish in Finland, GBR= British in England and Scotland, IBS= Iberian Population in Spain, TSI= Toscani in Italia. 1.7.1.2. rs9282858 El SNP rs9282858 (A49T), en posición chr2:31805826-31805826, es una variante A>G que corresponde a una mutación de sentido equivocado. Provoca un cambio de aminoácido alanina por treonina en posición 49 (A49T) lo cual incrementa la actividad SRD5A2 in vitro (Makridakis, di Salle & Reichardt, 2000). Las frecuencias poblacionales alélicas de 5 sub-poblaciones Europeas del rs9282858 se encuentran expresadas en la Figura 13 («1000 Genomes browser: Homo sapiens - Population genetics - rs9282858 (SNP)», s. f.). Figura 13. Frecuencias sub-poblacionales Europeas de rs9282858. CEU= Utah Residents (CEPH) with Northern and Western European Ancestry, FIN= Finnish in Finland, GBR= British in England and Scotland, IBS= Iberian Population in Spain, TSI= Toscani in Italia. INTRODUCCIÓN 54 1.7.2. CYP19A1 El gen CYP19A1, ubicado en el cromosoma 15q21.1, codifica un miembro de la superfamilia de enzimas del citocromo p450, la enzima aromatasa. El gen está constituido por 10 exones separados por intrones de longitud variable, que dan lugar a un ADNc de 3,4 kb y codifican una proteína de 503 aminoácidos (pm 55 kDa). Al menos cuatro promotores distintos se han identificado para la aromatasa, dando lugar a diferentes regulaciones tisulares de su expresión. La proteína codificada se localiza en el retículo endoplasmático de la célula y cataliza los últimos pasos de la biosíntesis de los estrógenos, tres hidroxilaciones consecutivas en el C18 junto con 2 deshidrataciones que conducen a la aromatización del anillo de androstenediona a estrona (Figura 14). Es una enzima limitante de la velocidad de conversión de andrógenos en estrógenos (Ghimenti et al., 2013). Puede ser encontrada en varios tejidos incluyendo las gónadas, cerebro, tejido adiposo, placenta, vasos sanguíneos, piel, huesos, y endometrio, como también en los tejidos de la endometriosis, fibroides uterinos, cáncer de mama, y cáncer de endometrio. Figura 14. Biosíntesis de estrógenos. INTRODUCCIÓN 55 Las mutaciones en este gen pueden resultar en un aumento o disminución de la actividad aromatasa; los fenotipos asociados sugieren que el estrógeno funciona tanto como una hormona esteroide sexual como un factor de crecimiento y diferenciación. Este gen expresa las dos variantes de la transcripción (facilitado por RefSeq, Mayo 2014). Se ha descrito un síndrome causado por una mutación del gen CYP19 que es heredado de una forma autosómica recesiva: Síndrome de deficiencia de la aromatasa. La acumulación de andrógenos durante el embarazo puede llevar a una virilización de una mujer al nacer. Las mujeres tendrán amenorrea primaria y los individuos de ambos sexos son altos, ya que la falta de estrógenos no llevará la epífisis al cierre. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de los siguientes polimorfismos del CYP19A1: 1.7.2.1. rs4646 El SNP rs4646, en posición chr15:51502844-51502844, es una variante 3’ UTR A>C. El alelo C (o G) ha sido asociado con aumento de niveles de estrógenos (Raskin et al., 2009). Recientemente se ha publicado que la frecuencia G-G del haplotipo establecido entre rs4646-rs700518 es significativamente mayor en mujeres con preeclampsia en comparación con muestras control (Shimodaira et al., 2012). Las frecuencias poblacionales alélicas de 5 sub-poblaciones Europeas del rs4646 se encuentran expresadas en la Figura 15 («1000 Genomes browser: Homo sapiens - Population genetics – rs4646 (SNP)», s. f.). INTRODUCCIÓN 62 desarrollo, o en alguna de la isoformas. Por lo tanto, es poco probable que todos los genes impresos humanos sean ya conocidos (Van der Zanden et al., 2012). Las frecuencias poblacionales alélicas de 5 sub-poblaciones Europeas del rs6932902 se encuentran expresadas en la Figura 21 («1000 Genomes browser: Homo sapiens - Population genetics – rs6932902 (SNP)», s. f.). Figura 21. Frecuencias sub-poblacionales Europeas de rs6932902. CEU= Utah Residents (CEPH) with Northern and Western European Ancestry, FIN= Finnish in Finland, GBR= British in England and Scotland, IBS= Iberian Population in Spain, TSI= Toscani in Italia. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 63 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 64 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 65 La incidencia de interrupciones del desarrollo reproductivo es un proceso frecuente en el embarazo (entre el 4% y el 10%, dependiendo del periodo de gestación). Mientras que las infecciones, la toxicidad química y farmacológica, desórdenes endocrinos, enfermedades maternas (fibromas uterinos, diabetes mellitus, trastornos tiroideos, trombofilias, anticuerpos antifosfolípido y anticoagulante lúpico, hiperhomocisteinemia, hipertermia materna…) y otros factores han sido considerados como un impacto negativo para el desarrollo embrionario, es evidente que los factores genéticos juegan un papel muy importante en el AE. En particular, se sabe que las anomalías cromosómicas son causa frecuente de AE. Sin embargo, una vez descartadas las patologías anteriormente mencionadas queda un porcentaje de AE donde no se encuentra causa etiológica. El creciente desarrollo de la genética está demostrando que ciertos polimorfismos genéticos maternos o fetales pueden relacionarse con esos AEs no clasificables (ver introducción). HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 66 HIPÓTESIS En nuestro trabajo nos hemos centrado en el estudio de 8 polimorfismos relacionados con el metabolismo de las hormonas sexuales en el feto y su relación con los AE de causa desconocida, bajo la hipótesis de que un desequilibrio en la producción de hormonas sexuales en el feto está implicada en la interrupción de la gestación. Para ello se han seleccionado muestras de tejido fetal procedentes de AE de causa desconocida y se han estudiado varios polimorfismos de dos enzimas presentes en dicho eje hormonal y un receptor: - La enzima 5α-reductasa (SRD5A2), que cataliza la conversión de testosterona en dihidrotestosterona; - La enzima aromatasa (CYP19A1), responsable de la conversión de testosterona en estradiol; y - El receptor de estrógenos tipo 1 (ESR1). HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 67 OBJETIVOS Demostrar la asociación de variaciones genéticas polimórficas con Abortos Espontáneos de causa desconocida en muestras fetales, por sus segregaciones alélicas y genotípicas en valoraciones; individuales, en interacciones y haplotipos, aplicando dos perspectivas: 1) Asociación de la edad gestacional del aborto con las variaciones polimórficas seleccionadas, 2) Asociación del sexo fetal a las variantes estudiadas y su relación con la edad gestacional. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 68 MATERIALES Y MÉTODOS 69 3. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 70 MATERIALES Y MÉTODOS 71 TIPO DE ESTUDIO El estudio realizado es de tipo epidemiológico, observacional, retrospectivo de casos y controles. Fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Virgen de la Victoria (Málaga). Las muestras del grupo control fueron obtenidas con el consentimiento informado por escrito de los sujetos. El estudio se hizo conforme a la declaración de Helsinki (General Assembly of the World Medical Association, 2014). MATERIALES Y MÉTODOS 78 DETERMINACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS 3.4.1. Extracción de DNA Para la extracción de DNA de las muestras del grupo fetal y control se llevaron a cabo dos protocolos normalizados de trabajo diferentes debido a las distintas características de éstas. En el grupo fetal, el estudio genético de los productos del embarazo abortado es muy complejo, ya que el tiempo transcurrido desde que el aborto tiene lugar y las alteraciones consecuentes a una maniobra evacuadora (generalmente un legrado) impiden habitualmente un análisis adecuado del material. 3.4.1.1. Tejidos parafinados de Abortos Espontáneos (Grupo Fetal) Las muestras fetales fueron obtenidas de tejidos parafinados y fijados en formol tamponado neutro procedentes de los archivos histológicos de Anatomía Patológica. Los tejidos fueron previamente desparafinados mediante tratamiento con xilol (Coura, Prolla, Meurer & Ashton-Prolla, 2005). La extracción de DNA se llevó a cabo mediante técnica de salting-out (Miller, Dykes & Polesky, 1988). Se detalla el protocolo llevado a cabo en las muestras del grupo fetal:  Preparación de la muestra e identificación  Cortes en secciones de 15-20 µm siguiendo los criterios de inclusión-exclusión para el grupo fetal anteriormente descritos.  Registro de la muestra con su número de identificación en la base de datos. MATERIALES Y MÉTODOS 79  Desparafinización  Xilol: 1mL (10 min, 65ºC).  Centrifugar a 12000 rpm, 5 min.  Descartar sobrenadante. (Repetir proceso anterior 5 veces)  Etanol Absoluto, 96%, 70%: 1ml. Lavar la muestra con la serie descendente de alcoholes, homogenizando y centrifugando a 12000 rpm, 5 min y descartando sobrenadante.  Agua destilada: 100µL. Diluir el pellet.  Tris ClH 1 M, EDTA 100 mM: 1mL (lavar).  Centrifugar a 13000 rpm, 10 min.  Descartar sobrenadante.  Tris ClH 1 M, EDTA 100 mM con SDS 1%: 0.6 mL, Tris ClH 1 M, EDTA 100 mM: 0.6 mL y Proteinasa K: 40 µL. Añadir al pellet e incubar a 55°C toda la noche. Agitar.  Extracción DNA (Salting Out)  Precipitación salina en frío: En esta etapa se precipitan los restos celulares. Se realiza en frío, introduciendo los viales en hielo picado, y añadiendo la solución salina (NaCL 6M). 1. Añadir 320L de NaCl 6M (solución de precipitación), agitar los viales e introducir en frío 10 minutos. MATERIALES Y MÉTODOS 80 2. Centrifugar 3 min, 4°C a máximas rpm. 3. Pasar el sobrenadante a un nuevo tubo, el DNA está en la solución. 4. Repetir la operación.  Precipitación del DNA con isopropanol 1. Añadir 600 L de isopropanol y mantener 10 minutos a temperatura ambiente. Mezclar suavemente. 2. Centrifugar 3 min, 4°C a máximas rpm. 3. Retirar el sobrenadante, el pellet es el DNA precipitado.  Etanol 70 1. Añadir 500L de EtOH 70°C en frío. Mezclar suavemente. 2. Centrifugar 3min, 4°C a máximas rpm. 3. Retirar el máximo posible de EtOH y secar muy bien antes de la elución.  Elución en agua 1. Añadir 200L de agua libre de nucleasas a 55°C y dejar media hora en el bloque caliente. Después se mantendrá en agitación a 37°C, 600 rpm durante una hora. 3.4.1.2. Saliva (Grupo Control) En el grupo control la extracción de DNA se llevó a cabo en saliva mediante el kit comercial Wizard Genomic DNA purification (Promega®). El procedimiento consiste básicamente en una lisis celular en presencia de proteinasa K y RNAasa, precipitación de proteínas y precipitación de DNA con isopropanol. El DNA precipitado se seca con etanol y se rehidrata con agua libre de DNAasa. MATERIALES Y MÉTODOS 81 3.4.2. Análisis de calidad DNA extraído Una vez extraído el DNA, tanto del grupo fetal como del grupo control, se llevó a cabo un análisis de calidad. Para ello se evaluó concentración, pureza y fragmentación. 3.4.2.1. Concentración y pureza La cuantificación del DNA se basa en medidas de absorbancia mediante espectrofotometría, utilizando el espectro de luz ultravioleta. El método espectrofotométrico está basado en la medida directa de la absorción de la radiación electromagnética por parte de la muestra, siendo ésta cuantificable mediante la correlación de la absorbancia con la concentración del ácido nucleico a determinar. La concentración de ácidos nucleicos se determina midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. Para este trabajo se utilizó el espectrofotómetro de amplio espectro NanoDrop®, que mide muestras de 1 l con alta precisión y reproducibilidad mediante métodos de tensión superficial. Dado que la absorbancia máxima (A) de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas es a 280 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos. Consideramos una extracción lo suficientemente pura para el análisis de polimorfismos los valores obtenidos de A260/A280 superiores a 1,8. Si la muestra también contiene proteínas, el cociente A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá determinarse con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos. 3.4.2.2. Fragmentación Se valoró la integridad del DNA extraído mediante su visualización en gel de agarosa al 0,8%. Se eligió un total de 15 muestras al azar para la comprobación. MATERIALES Y MÉTODOS 82 La totalidad de las muestras pertenecientes al grupo fetal presentaron rasgos de fragmentación pero en todas ellas se evidenció fragmentos superiores a 3000 pb. La amplificación de ADN a partir de tejidos embebidos en parafina en los servicios de Anatomía Patológica, mediante reacción en cadena de la polimerasa, es afectado por el tipo de fijador y los tiempos empleados (García, Benavente, Melo, Roa & Roa, 2006). Este tratamiento de la muestra repercute negativamente en la integridad del DNA, lo que ha añadido un nivel de dificultad al análisis de polimorfismos en la muestra de tejido fetal. 3.4.3. Determinación de los polimorfismos genéticos a estudiar En el presente trabajo se han estudiado 2 polimorfismos de SRD5A2 (rs523349, rs9282858), 3 polimorfismo del CYP19A1 (rs4646, rs10046, rs2236722) y 3 polimorfismos del receptor de ESR1 (rs9340799, rs2234693, rs6932902) tanto en el grupo fetal como en el grupo control. El análisis de SNP se realizó mediante RT-PCR con sondas TaqMan® usando una técnica de microarray comercializada (TaqMan® Open Array Genotyping System - Applied Biosystems). Los resultados obtenidos fueron posteriormente procesados mediante el programa informático TaqMan Genotyper® Software. TaqMan® Open Array Genotyping System (Applied Biosystems) es una plataforma de genotipado de SNPs compuesta por un cargador automático de muestras, un termociclador específico para amplificación en arrays y un sistema de toma de imagen para captura de señal fluorescente de la sonda. Esta plataforma permite el genotipado masivo de SNPs combinando la química TaqMan® y la nanofluídica en un soporte o array dividido en 48 sub-arrays compuestos por 64 orificios. Así, el array cuenta con 3072 orificios (capacidad de 33 nl retenido por capilaridad) que permite la obtención simultánea de 3072 genotipos. En dichos orificios se MATERIALES Y MÉTODOS 83 ubican las sondas específicas (previamente seleccionadas por el usuario y sintetizadas por la casa comercial) y se llevan a cabo las reacciones TaqMan® específicas. Para extraer la información de genotipos se utilizó TaqMan Genotyper® Software que permite interpretar los datos de fluorescencia de sondas Taqman por RT-PCR para convertirlos a genotipo. El flujo de trabajo consistió en la mezcla de las muestras con TaqMan® OpenArray® Genotyping Master Mix, el producto se cargó sobre la placa de genotipado previamente diseñada, se selló, se programó el ciclo adecuado y se capturó el resultado en forma de imagen. Para nuestro estudio, la placa diseñada permitió el genotipado de 64 SNPs (es este trabajo solo se expone 8 de esos SNPs) para cada una de las 48 muestras procesadas simultáneamente. Se consideró como criterio de correcta amplificación la detección de más de 58 SNPs de los 64 estudiados (aproximadamente el 90%) por muestra. El diseño de las sondas y cebadores utilizados fue realizado por la casa comercial Applied Biosystems en base a las secuencias adyacentes y la zona polimórfica de los SNPs de interés nuestros («TaqMan Search», s. f.). MATERIALES Y MÉTODOS 84 ANÁLISIS DE CROMOSOMOPATÍAS EN UNA SUBPOBLACIÓN DE ABORTOS ESPONTÁNEOS El análisis de cromosomopatías se llevó a cabo en una subpoblación de 94 AEs seleccionados al azar. Para su estudio se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y fluorescente (QF-PCR), que utiliza varios marcadores polimórficos (pequeñas repeticiones en tamden o microsatélites) específicos para cada cromosoma. Se analizaron los marcadores clásicos de las aneuploidías utilizadas en el diagnóstico clínico, 13, 18, 21 X e Y y además se añadieron marcadores de los cromosomas 15, 16 y 22. De esta forma, podemos detectar por encima del 70% de las cromosomopatías más prevalentes encontradas en AEs (Quiroga de Michelena et al., 2007; Fritz et al., 2001). Para ello el DNA fetal se amplificó en tres reacciones de multiplex (A, B y C). La mezcla de cebadores que se utilizó en cada reacción, así como su secuencia, concentración y marcador fluorescente se muestra en la Tabla 1. Las condiciones de PCR llevadas a cabo fueron: 100 ng de ADNg, 1X TaqGold Buffer, 1,5 mM de Cl2Mg, 200nM de dNTPs, 3 µl de la mezcla de primers (Tabla 1) y 2U de Amplitaq Gold DNA Polimerase (Applied Biosystems). La reacción de PCR de cada marcador se ha estudiado individualmente en el termociclador con gradiente de temperatura Perkin-Elmer 9600®. El análisis tiene las mismas condiciones de amplificación para las 3 mezclas. La amplificación se llevó a cabo en termociclador ABI2720 (Applied Biosystems) usando: 94ºC 10 min, seguido de 32 ciclos de 94ºC 1 min, 58ºC 1min, 72ºC 1 min, con una extensión final de 15 min a 72ºC (Tabla 2). Los productos de las reacciones fueron analizados utilizando un secuenciador automático MATERIALES Y MÉTODOS 85 ABI 3130 (Applied Biosystems). El tamaño de los alelos y las áreas de cada uno de ellos fue determinado y revisado con el software Genotyper Versión 4.0 (Applied Biosystems). Se ha incluido un control negativo (H2O) en todas las series de trabajo. MATERIALES Y MÉTODOS 86 Tabla 1. Secuencia de los cebadores, concentración de éstos y posición en el cromosoma en cada mezcla de reacción multiplex (A, B y C). NOMBRE MEZCLA SECUENCIA CEBADORES CONCENTRACIÓN LOCALIZACIÓN D13S742 Fwd A PET-ATAACTGGGCTAGGAATGGAAATA 55nM 13q12.12 D13S742 Rev A GACTTCCCAATTCAGGAGGACT 55nM 13q12.12 D13S258 Fwd A FAM-ACCTGCCAAATTTTACCAGG 35nM 13q21 D13S258 Rev A GACAGAGAGAGGGAATAAACC 35nM 13q21 D13S631 Fwd A PET-GGCAACAAGAGCAAAACTCT 35nM 13q31-32 D13S631 Rev A TAGCCCTCACCATGATTGG 35nM 13q31-32 D13S628 Fwd A FAM-TAACATTCATTGTCCCTTACAGAT 110nM 13q31-q32 D13S628 Rev A GCAAGGCTATCTAACGATAATTCA 110nM 13q31-q32 D18S391 Fwd A PET-GGACTTACCACAGGCAATGTGACT 35nM 18pter-18p11.22 D18S391 Rev A TAGACTTCACTATTCCCATCTGAG 35nM 18pter-18p11.22 D18S535 Fwd A NED-TCATGTGACAAAAGCCACAC 70nM 18q12.2 D18S535 Rev A AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA 70nM 18q12.2 D18S858 Fwd A FAM-AGCTGGAGAGGGATAGCATT 55nM 18q21.1 D18S858 Rev A TGCATTGCATGAAAGTAGGA 55nM 18q21.1 D18S499 Fwd A FAM-CTGCACAACATAGTGAGACCTG 70nM 18q21.32-q21.33 D18S499 Rev A AGATTACCCAGAAATGAGATCAGC 70nM 18q21.32-q21.33 D18S390 Fwd A NED-TAACCAAAGCAAATCCCTGG 30nM 18q22.2 D18S390 Rev A CACTTACACTGTTATCCTGG 30nM 18q22.2 D21S1435 Fwd A VIC-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC 35nM 21q21 D21S1435 Rev A GCAAGAGATTTCAGTGCCAT 35nM 21q21 D21S1437 Fwd A FAM-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG 40nM 21q21.1 D21S1437 Rev A TTCTCTACATATTTACTGCCAACA 40nM 21q21.1 DXYS218 Fwd A VIC-TGTGTTTGGGTTTCCTCTGTC 70nM Xp22.32 Yp11.3 DXYS218 Rev A AGCGAAACTCCGTCTCAAAATA 70nM Xp22.32 Yp11.3 DXS 6803 Fwd A VIC-GAAATGTGCTTTGACAGGAA 70nM Xq12-Xp21.33 DXS 6803 Rev A CAAAAAGGGACATATGCTACTT 70nM Xq12-Xp21.33 X22 Fwd A VIC-TCTGTTTAATGAGAGTTGGAAAGAAA 70nM Xq28 Yq X22 Rev A ATTGTTGCTACTTGAGACTTGGTG 70nM Xq28 Yq SRY Fwd B VIC-AGTAAAGGCAACGTCCAGGAT 55nM Yp11.31 SRY Rev B TTCCGACGAGGTCGATACTTA 55nM Yp11.31 D13S305 Fwd B VIC-GCCTGTTTGAGGACCTGTCGTTA 55nM 13q12.1-13q14.1 D13S305 Rev B TGGTTATAGAGCAGTTAAGGCAC 55nM 13q12.1-13q14.1 D13S634 Fwd B NED-TCCAGATAGGCAGATTCAAT 170nM 13q14.3 D13S634 Rev B CCTTCTTCTTCCCATTGATA 170nM 13q14.3 D18S1002 Fwd B FAM-CAAAGAGTGAATGCTGTACAAACAGC 70nM 18q11.2 D18S1002 Rev B CAAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG 70nM 18q11.2 D18S386 Fwd B PET-TCAGGAGAATCACTTGGAAC 90nM 18q22.1 D18S386 Rev B TCCATGAAGTAGCTAAGCAG 90nM 18q22.1 D21S1414 Fwd B FAM-CAATTCCCCAAGTGAATTGCCTTC 70nM 21q21 D21S1414 Rev B AAATTAGTGTCTGGCACCCAGTA 70nM 21q21 D21S1809 Fwd B NED-TACCCAAGGTGACAGACACC 40nM 21q21.1 D21S1809 Rev B GAGCAGGTTGTCCTACCTCA 40nM 21q21.1 D21S1412 Fwd B VIC-CGGAGGTTGCAGTGAGTTG 40nM 21q22.2 D21S1412 Rev B GGGAAGGCTATGGAGGAGA 40nM 21q22.2 D21S1411 Fwd B PET-AATGTGTGTCCTTCCAGGC 90nM 21q22.3 D21S1411 Rev B GTAGATACATACATATGATGAATGC 90nM 21q22.3 Fwd = Foward (cebador 5’) Rev = Reverse (cebador 3’). En color aparecen los marcadores fluorescentes. MATERIALES Y MÉTODOS 87 Tabla 1.- Cont. Secuencia de los cebadores, concentración de éstos y posición en el cromosoma en cada mezcla de reacción multiplex (A, B y C). NOMBRE MEZCLA SECUENCIA CEBADORES CONCENTRACIÓN LOCALIZACIÓN D21S1446 Fwd B FAM-ATGTACGATACGTAATACTTGACAA 90nM 21q22.3-ter D21S1446 Rev B GTCCCAAAGGACCTGCTC 90nM 21q22.3-ter DXYS 6809 Fwd B FAM-TGAACCTTCCTAGCTCAGGA 55nM Xp DXYS 6809 Rev B TCTGGAGAATCCAATTTTGC 55nM Xp AMXY Fwd B NED-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG 40nM Xp22.1-22.3 AMXY Rev B ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 40nM Xp22.1-22.3 SBMA Fwd B FAM-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT 55nM Xq11.2-Xq12 SBMA Rev B TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC 55nM Xq11.2-Xq12 HPRT Fwd B VIC-ATGCCACAGATAATACACATCCCC 35nM Xq26.1 HPRT Rev B CTCTCCAGAATAGTTAGATGTAGG 35nM Xq26.1 D15S1050 Fwd C FAM-TGGAACATCTGTCATAGTGG 150nM 15q D15S1050 Rev C TCCCTGTTTAATCATCTTCA 150nM 15q D15S818 Fwd C VIC-TGTGCATCCTCTATGTCCCT 20nM 15q22 D15S818 Rev C GCTAAGATGGCGCCATTG 20nM 15q22 D15S123 Fwd C VIC-AGCTGAACCCAATGGACT 40nM 15q22.33 D15S123 Rev C TTTCATGCCACCAACAAA 40nM 15q22.33 D15S816 Fwd C FAM-AATAGAAACACAGGAGATCTCTTT 40nM 15q25 D15S816 Rev C GTCAGGCGAGTTTTTGAAGA 40nM 15q25 D16S764 Fwd C VIC-TTGTTAAGTGAGGCATGATG 80nM 16p13.1 D16S764 Rev C CTGTGCTTGGACCTGAAGAT 80nM 16p13.1 D16S490 Fwd C FAM-TGACAGGCACATAGATTATTATGC 70nM 16p13.3 D16S490 Rev C CGTACCCGGCTGATTATTTTAGAT 70nM 16p13.3 D16S2624 Fwd C VIC-TGAGGCAATTTGTTACAGAGC 40nM 16q22.3 D16S2624 Rev C TAATGTACCTGGTACCAAAAACA 40nM 16q22.3 D16S2621 Fwd C VIC-GTCATATGGGCCAATTCCC 35nM 16q24.2 D16S2621 Rev C TACCGCGTAGTGAGACTGTG 35nM 16q24.2 D22S685 Fwd C FAM-TTCTTAGTGGGGAAGGGATC 80nM 22q11 D22S685 Rev C TGAGTTTGATGTTTTTGATAGACA 80nM 22q11 D22S444 Fwd C FAM-TTTGAACTAAGCCTTAAAAATGC 20nM 22q12 D22S444 Rev C TGTTTGGCTTGAAGAAGGAG 20nM 22q12 D22S684 Fwd C FAM-CCCTCTCCCTCTCTTACAGG 20nM 22q12 D22S684 Rev C TTCTTAGTGGGGAAGGGATC 20nM 22q12 D22S280 Fwd C VIC-GCTCCAGCCTATCAGGATG 40nM 22q13 D22S280 Rev C GATTCCAGATCACAAAACTGGT 40nM 22q13 Fwd = Foward (cebador 5’) Rev = Reverse (cebador 3’). En color aparecen los marcadores fluorescentes. MATERIALES Y MÉTODOS 94 que los heterocigotos. Se compara la combinación ponderada, donde se da peso 1 a los heterocigotos y peso 2 a los homocigotos CC: log[p/(1-p)] = α + βAd + γZ 3.6.3.1. Elección de modelos de herencia No es fácil hallar un criterio para establecer el modelo de herencia más adecuado para los 8 polimorfismos estudiados en este trabajo. Habitualmente se suele comparar el ajuste del modelo codominante, que es el más general (2 parámetros), con los demás modelos (1 parámetro). Estas comparaciones pueden realizarse mediante el test de la razón de verosimilitudes. Aun así, a menudo no es posible diferenciar entre varios modelos y se elige el que tenga menor valor del criterio de información de Akaike (AIC = –2log[L] + #parámetros), donde L es la verosimilitud del modelo. Este criterio pondera el ajuste del modelo (–2logL) con la complejidad (número de parámetros) (Iniesta, Guinó & Moreno, 2005). Los resultados obtenidos al aplicar este criterio, puramente estadístico, deben ser reconsiderados en cada caso particular. 3.6.4. Estudio del desequilibrio de ligamiento Con frecuencia son varios los polimorfismos que se analizan simultáneamente en un gen o región candidata de un gen. El motivo es que el polimorfismo realmente responsable de influir o modificar el riesgo de la enfermedad puede ser desconocido; por ello se analizan varios polimorfismos para intentar identificarlo. Entre diferentes polimorfismos localizados en el mismo cromosoma y relativamente próximos entre sí suele observarse cierto grado de correlación o asociación estadística denominada desequilibrio de ligamiento (linkage disequilibrium). Esta asociación tiene su origen en la meiosis, el proceso de la división MATERIALES Y MÉTODOS 95 celular que ocurre en la maduración de las células sexuales. Al final del proceso habrá dos gametos, cada gameto con una copia de cada par de cromosomas. Estos cromosomas no son idénticos a los cromosomas de los padres debido al proceso de recombinación (proceso por el que se intercambian fragmentos de diferentes ejemplares de un mismo par de cromosomas). De esta manera, los cromosomas heredados por los hijos son una combinación entre los cromosomas del padre y la madre. La frecuencia de entrecruzamiento por cromosoma es pequeña, de 1 a 4, y depende de su tamaño. La probabilidad de que entre dos loci cercanos se dé una recombinación es baja y, por ello, se observa el desequilibrio de ligamiento, que tiende a disminuir en sucesivas generaciones hasta llegar al equilibrio (independencia estadística). Así que, los polimorfismos próximos al agente causal de la enfermedad estudio estarán asociados con la enfermedad también, y el análisis completo del locus podría ser muy útil para localizar el polimorfismo causal que está directamente relacionado con la enfermedad. Para determinar el desequilibrio de ligamiento se calcula la D estadística, es la desviación entre la frecuencia del haplotipo esperado (bajo el supuesto de no asociación) y la frecuencia observada. Si tenemos en cuenta un caso con dos tipos de alelos, el cálculo de D es el producto de las probabilidades de los dos alelos, y la probabilidad observada de la pareja: D= -p12p1p2 El valor de D ' es igual a D en escala [-1,1]. El coeficiente de correlación entre los alelos (r) y su nivel de significación (p) se proporciona también. MATERIALES Y MÉTODOS 96 3.6.5. Estudio de asociación haplotípica La estimación de las frecuencias para cada haplotipo sería sencilla si no se dieran casos de incertidumbre, es decir, casos en que no es posible determinar la pareja de haplotipos que lleva el individuo debido a que éste tenga 2 o más loci heterocigotos. Si, además, hay valores perdidos en la determinación de alguno de los genotipos, la incertidumbre aumenta. El método utilizado para realizar la estimación estadística de frecuencias haplotípicas ha sido el algoritmo esperanza-maximización (EM) (Excoffier & Slatkin, 1995). El algoritmo itera repetidamente entre 2 pasos hasta conseguir convergencia. En primer lugar, se usan unas frecuencias iniciales, no necesariamente correctas, para cada posible haplotipo. En el supuesto de que esas frecuencias fuesen correctas, y asumiendo que hay EHW, se podría calcular la frecuencia esperada de cada combinación de genotipos con incertidumbre (paso E). Con las frecuencias de cada combinación de genotipos se pueden obtener las frecuencias de cada haplotipo maximizando la función de verosimilitud de los haplotipos (paso M). Este paso consiste en contar los haplotipos compatibles con cada combinación de genotipos. El algoritmo converge a valores estables de frecuencia de combinaciones de genotipos con incertidumbre y de frecuencia de haplotipos, que es el objetivo. Para los individuos con incertidumbre, a cada pareja de haplotipos posible se le puede calcular una probabilidad. Una limitación de este método es que no proporciona directamente varianzas de las estimaciones y, si se analizan simultáneamente muchos polimorfismos (más de 20) con un alto grado de incertidumbre, pueden obtenerse soluciones incorrectas, pues el algoritmo puede tender hacia un máximo local. En estas situaciones es importante repetir el algoritmo empleando diferentes valores iniciales de las frecuencias de haplotipos. No obstante, para el análisis simultáneo de menos de 10 polimorfismos, como es nuestro caso, este método proporciona soluciones coherentes. MATERIALES Y MÉTODOS 97 Este algoritmo permite por tanto identificar o estimar, para cada individuo, la pareja de haplotipos que posee en función de los genotipos. Los haplotipos obtenidos se pueden analizar en relación con la enfermedad mediante modelos de regresión logística. Normalmente se realiza un análisis de cromosomas y no de individuos, es decir, se duplica la muestra, de manera que cada individuo contribuye con 2 observaciones, una para cada haplotipo, y se compara el riesgo asociado con los diversos haplotipos entre sí, tomando como referencia el más frecuente. Este análisis es más sencillo de analizar e interpretar que el de parejas de haplotipos y no parece que requiera la realización ajustes, pues los haplotipos se heredan de manera independiente; no obstante, este aspecto no está completamente estudiado. En caso de incertidumbre por múltiples heterocigotos o valores perdidos, el método basado en el algoritmo EM proporciona una lista de parejas de haplotipos compatibles, cada una con una probabilidad de aparición asociada. Entonces, estos individuos contribuyen en los datos con más de 2 observaciones y se emplean las probabilidades de aparición de cada haplotipo como pesos en el modelo de regresión logística. El análisis combinado de genotipos y haplotipos suele ser más informativo que cualquiera de los 2 aislados, aunque hay cierta discusión sobre qué análisis es preferible en cada situación (Clayton, Chapman & Cooper, 2004; Cordell, & Clayton, 2002). 3.6.6. Estudio de interacciones génicas Los modelos de interacción gen-gen añaden el producto de 2 genotipos a la ecuación: log[p/(1-p)] = α + β1G1 + β2G2 + γZ + δG1 × G2 MATERIALES Y MÉTODOS 98 A partir de los coeficientes β y δ de los modelos se puede calcular las OR de asociación entre cada genotipo y la enfermedad y los correspondientes intervalos de confianza del 95%. 3.6.7. Estimación de la función de supervivencia 3.6.7.1. Método de Kaplan-Meier Los datos proporcionados por los estudios clínicos se expresan en múltiples ocasiones en términos de supervivencia. Esta medida no queda limitada a los términos de vida o muerte, sino a situaciones en las que se mide el tiempo que transcurre hasta que sucede un evento de interés, como puede ser tiempo de recurrencia, tiempo que dura la eficacia de una intervención, tiempo de un aprendizaje determinado, o como en el presente caso tiempo en que se produce la muerte fetal. Por tanto, la supervivencia es una medida de tiempo a una respuesta, fallo, muerte, recaída o desarrollo de una determinada enfermedad o evento. El término supervivencia se debe a que en las primeras aplicaciones de este método de análisis se utilizaba como evento la muerte de un paciente. La observación de cada paciente se inicia al inicio del proceso (tiempo = 0) y continua hasta la muerte o hasta que el tiempo de seguimiento se interrumpe. Cuando el tiempo de seguimiento termina antes de producirse la muerte o, más ampliamente, antes de completar el período de observación, lo que suele ocurrir en estudios clínicos por abandono del proceso por parte del paciente, se habla de paciente “censurado”. En el caso de los AEs, el tiempo cero correspondería al comienzo de la gestación y no existirán individuos censurados ya que todos terminan el estudio (es decir, los individuos abortan en una semana determinada). El tiempo de supervivencia se define como el tiempo transcurrido desde el acontecimiento o estado inicial hasta el estado final. El estado inicial debe ser definido de manera que la fecha en que se produjo el evento pueda ser conocida exactamente (fecha de MATERIALES Y MÉTODOS 99 diagnóstico, fecha de la intervención quirúrgica, fecha de inicio de la radioterapia o quimioterapia, etc.). Como previamente se señaló las fechas correspondientes al estado inicial son diferentes para cada sujeto. El acontecimiento o suceso estudiado también debe estar perfectamente definido para poder determinar exactamente la fecha del mismo. Este evento está casi siempre asociado a la muerte del paciente pero no tiene por qué ser así, ya que puede hacer referencia también a la fecha de alta, la fecha de remisión de la enfermedad, la fecha de recidiva, la fecha de recaída o fallo, etc. Los métodos estadísticos más utilizados son los no paramétricos. Así, las curvas de supervivencia por lo general se producen usando uno de dos métodos: el análisis actuarial o el método del límite de producto de Kaplan-Meier (Collet, 1994). El método Kaplan-Meier calcula la supervivencia cada vez que un paciente “muere”. El análisis actuarial divide el tiempo en intervalos y calcula la supervivencia en cada intervalo. El procedimiento Kaplan-Meier da proporciones exactas de supervivencia debido a que utiliza tiempos de supervivencia precisos; en cambio, el análisis actuarial da aproximaciones, debido a que agrupa los tiempos de supervivencia en intervalos. En este estudio se ha seguido el método de Kaplan-Meier, conocido también como del “limite del producto”. La característica distintiva del análisis con este método es que la proporción acumulada que sobrevive se calcula para el tiempo de supervivencia individual de cada paciente y no se agrupan los tiempos de supervivencia en intervalos. Por esta razón es especialmente útil para estudios que utilizan un número pequeño de pacientes. El método de Kaplan-Meier incorpora la idea del tiempo al que ocurren los eventos. La validez de este método descansa en dos suposiciones: 1. Las personas que se retiran del estudio tienen un destino parecido a las que quedan. MATERIALES Y MÉTODOS 100 2. El período de tiempo durante el cual una persona entra en el estudio no tiene efecto independiente en la respuesta. La mejor manera de analizar el método de Kaplan-Meier es mediante un ejemplo: supongamos que disponemos de los datos de supervivencia de 10 pacientes que han sido aleatoriamente asignados a los tratamientos A y B (datos hipotéticos). Tratamiento: A: 3, 5, 7, 9+, 18 B: 12, 19, 20, 20+, 33+ “+” indica dato censurado y, por tanto, no ha presentado el evento (en este caso morir de cáncer). Con estos datos se construye una tabla como la representada en la Figura 22 para calcular la proporción acumulativa que sobreviven hasta el tiempo t, o tasa de supervivencia acumulativa, de la misma forma que se indicó en el ejemplo previo. Una vez calculada la probabilidad de supervivencia, ésta puede representarse gráficamente, tal como se observa en la Figura 23. Si la última observación es censurada, el estimador no llega a cero, como se ve en la figura en el caso del tratamiento B. Los peldaños de la escalera que desciende se deben a los tiempos no censurados. MATERIALES Y MÉTODOS 101 Figura 22. Tabla para el cálculo de la tasa de supervivencia acumulativa. Figura 23. Curva de Kaplan-Meier. MATERIALES Y MÉTODOS 102 3.6.7.2. Prueba de Mantel-Cox Para contrastar las funciones de supervivencia de varias poblaciones se suele utilizar un test no paramétrico, la prueba de Mantel-Cox (Lee & Wang, 2003). Es un estimador χ2 que compara las estimaciones de la función de riesgo de dos o más grupos en cada unidad de tiempo en que ocurre un evento. Se construye comparando el número observado y esperado de sucesos en uno de los grupos en cada uno de esos momentos y agrupando los resultados para obtener un valor global. De esta forma se calcula si existen diferencias significativas entre los diversos grupos sometidos al análisis de supervivencia (p<0.05) En el presente estudio hemos analizado estos métodos para estimar diferencias en la aparición de los AEs en los genotipos de riesgo significativo utilizando para ello el paquete estadístico SPSS 22.0.2. RESULTADOS 103 4. RESULTADOS RESULTADOS 110 Tabla 3. Frecuencias alélicas y genotípicas Gen Referencia Genotipo C [n (%)] AE [n (%)] SRD5A2 rs523349 C 460 (0.75) 116 (0.54) G 154 (0.25) 98 (0.46) C/C 173 (56.4) 28 (26.2) C/G 114 (37.1) 60 (56.1) G/G 20 (6.5) 19 (17.8) rs9282858 G 639 (0.98) 282 (0.98) A 15 (0.02) 6 (0.02) G/G 312 (95.4) 139 (96.5) A/G 15 (4.6) 4 (2.8) A/A 0 (0) 1 (0.7) CYP19A1 rs4646 C 476 (0.73) 199 (0.72) A 174 (0.27) 79 (0.28) C/C 179 (55.1) 67 (48.2) A/C 118 (36.3) 65 (46.8) A/A 28 (8.6) 7 (5) rs10046 G 320 (0.5) 122 (0.56) A 322 (0.5) 96 (0.44) G/G 86 (26.8) 29 (26.6) A/G 148 (46.1) 64 (58.7) A/A 87 (27.1) 16 (14.7) rs2236722 A 649 (1) 239 (0.98) G 1 (0) 5 (0.02) A/A 324 (99.7) 117 (95.9) A/G 1 (0.3) 5 (4.1) ESR1 rs9340799 A 396 (0.65) 88 (0.53) G 210 (0.35) 78 (0.47) A/A 137 (45.2) 33 (39.8) A/G 122 (40.3) 22 (26.5) G/G 44 (14.5) 28 (33.7) rs2234693 T 368 (0.56) 137 (0.52) C 284 (0.44) 127 (0.48) T/T 107 (32.8) 32 (24.2) C/T 154 (47.2) 73 (55.3) C/C 65 (19.9) 27 (20.4) rs6932902 G 575 (0.9) 232 (0.89) A 65 (0.1) 28 (0.11) G/G 256 (80) 104 (80) A/G 63 (19.7) 24 (18.5) A/A 1 (0.3) 2 (1.5) C: Controles, AE: Abortos espontáneos RESULTADOS 111 EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG En las Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6 se observan los resultados del análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cada SNP teniendo en cuenta los casos, los controles y la muestra completa. Cada tabla recoge los resultados de un gen. Tabla 4. Equilibrio de Hardy-Weinberg para los SNPS del gen SRD5A2 estudiados. rs523349 C/C C/G G/G C G p-valor TODOS 201 174 39 576 252 0.91 CONTROLES 173 114 20 460 154 0.88 CASOS 28 60 19 116 98 0.24 rs9282858 G/G A/G A/A G A p-valor TODOS 451 19 1 921 21 0.2 CONTROLES 312 15 0 639 15 1 CASOS 139 4 1 282 6 0.052 RESULTADOS 112 Tabla 5. Equilibrio de Hardy-Weinberg para los SNPS del gen CYP19A1 estudiados. rs4646 C/C A/C A/A C A p-valor TODOS 246 183 35 675 253 0.91 CONTROLES 179 118 28 476 174 0.2 CASOS 67 65 7 199 79 0.097 rs10046 C/C T/C T/T C T p-valor TODOS 115 212 103 442 418 0.77 CONTROLES 86 148 87 320 322 0.18 CASOS 29 64 16 122 96 0.055 rs2236722 T/T T/C C/C T C p-valor TODOS 441 6 0 888 6 1 CONTROLES 324 1 0 649 1 1 CASOS 117 5 0 239 5 1 Tabla 6. Equilibrio de Hardy-Weinberg para los SNPS del gen ESR1 estudiados. rs9340799 A/A A/G G/G A G p-valor TODOS 170 144 72 484 288 *<0.0001 CONTROLES 137 122 44 396 210 0.057 CASOS 33 22 28 88 78 *<0.0001 rs2234693 T/T C/T C/C T C p-valor TODOS 139 227 92 505 411 1 CONTROLES 107 154 65 368 284 0.5 CASOS 32 73 27 137 127 0.29 rs6932902 G/G A/G A/A G A p-valor TODOS 360 87 3 807 93 0.61 CONTROLES 256 63 1 575 65 0.22 CASOS 104 24 2 232 28 0.64 RESULTADOS 113 Como se observa en las Tabla 4 y Tabla 5, todos los SNPs de los genes SRD5A2 y CYP19A1 se encuentran en EHW, es decir, se puede aceptar que las frecuencias genotípicas observadas para cada SNP son compatibles con EHW. En cambio, para el rs9340799 del ESR1 (Tabla 6) se observan valores de p significativos para el grupo de AE y la población completa, lo que indica que ambas muestras se encuentran en desequilibrio de HW. La población de controles para todos los polimorfismos analizados se encuentra en EHW. RESULTADOS 114 ANÁLISIS DE ASOCIACIÓN DE GENOTIPOS INDIVIDUALES Y MODELOS DE HERENCIA En primer lugar se presentan las tablas donde vienen expresados los valores de p obtenidos de las pruebas de asociación alélicas con la enfermedad utilizando un modelo de regresión logística (Tabla 7, Tabla 8 y Tabla 9). Además se incluye el valor de OR con un 95% de intervalo de confianza para cada genotipo (test Cochran’sHaenzel). Cada tabla se recoge los resultados de un gen. Los polimorfismos rs523349 (SRD5A2), rs2236722 (CYP19A1) y rs9340799 (ESR1) presentaron diferencias significativas en sus frecuencias alélicas entre grupo control y los AEs. Se considera significativo un valor de p<0,05 con un 95% de intervalo de confianza. Tabla 7. Análisis de asociación alélica de los SNPs del gen SRD5A2 con AE. Referencia Alelo Estadística OR (95% CI) p-Valor rs523349 C 1 *<0.0001 G 2.52 (1.82-3.49) rs9282858 G 1 0.8405 A 1.10 (0.42-2.87) RESULTADOS 115 El polimorfismo rs523349 del gen SRD5A2 mostró un patrón claro de relación con el AE observándose una correlación de riesgo con el alelo G (OR=2.52, 95% IC=1.82-3.49, p<0.0001). Tabla 8. Análisis de asociación alélica de los SNPs del gen CYP19A1 con AE. Referencia Alelo Estadística OR (95% CI) p-Valor rs4646 C 1 0.6056 A 1.09 (0.79-1.48) rs10046 G 1 0.1187 A 1.28 (0.94-1.74) rs2236722 A 1 *0.0175 G 13.58 (1.58-116.81) En cuanto al gen CYP19A1, los polimorfismo rs4646 y rs10046 no mostraron diferencias significativas en sus frecuencias alélicas, mientras que en el mismo gen, el alelo G del polimorfismo rs2236722 presentó un alto riesgo (OR=13.58, 95% IC=1.58116.81, p=0.0175). RESULTADOS 116 Tabla 9. Análisis de asociación alélica de los SNPs del gen ESR1 con AE. Referencia Alelo Estadística OR (95% CI) p-Valor rs9340799 A 1 *0.0038 G 1.67 (1.18-2.37) rs2234693 T 1 0.2103 C 1.20 (0.90-1.60) rs6932902 G 1 0.7843 A 1.07 (0.67-1.70) El polimorfismo rs9340799 del gen ESR1, definido por la enzima de restricción XbaI, presentó diferencias significativas para el alelo G (OR=1.67, 95% IC=1.18-2.37, p=0.0038). 4.4.1. Modelos de herencia Para estudiar la asociación con la enfermedad y establecer el modelo de herencia más adecuado para cada uno de los 8 polimorfismos analizados, se hizo otro estudio de regresión logística para el cálculo de odds ratio (OR) en función de los 5 modelos de herencia (codominante, dominante, recesivo, sobredominante y aditivo) y se aplicó el Criterio de Información de Akaike (AIC) y el Criterio de Información Bayesiano (BIC). Estos resultados están expresados en la Tabla 10-17 y el modelo seleccionado se encuentra sombreado en cada caso. RESULTADOS 117 El polimorfismo rs523349 del gen SRD5A2, mostró un patrón claro de relación con el AE observándose una correlación de riesgo que pormenorizada en sus genotipos se expresa como una OR de 3.25, 95% IC=1.96-5.40, p<0.0001 para el heterocigótico CG y OR de 5.87, 95% IC=2.79-12.35, p<0.0001 para el homocigótico GG (Tabla 10). Se puede observar que cada copia de G modifica el riesgo en una cantidad aditiva, lo homocigotos GG tienen aproximadamente el doble de riesgo que los heterocigotos CG. Se ajusta a un modelo aditivo. En cuanto al gen CYP19A1, el polimorfismo rs4646 (Tabla 12) mostró diferencias significativas en heterocigocia, AC (OR de 1.54, 95% IC=1.03-2.30, p=0.036), siendo el modelo que mejor se ajusta el sobredominante. Sin embargo, aunque el SNP rs10046 (Tabla 13) que mostró un riesgo significativo en el heterocigótico AG (OR de 1.66, 95% IC=1.07-2.58, p=0.023), su modelo de herencia se ajusta a un modelo recesivo donde se observa una alta protección para el homocigótico AA (OR de 0.46, 95% IC=0.26-0.83, p=0.0064). En el mismo gen CYP19A1, el rs2236722 (Tabla 14) mostró un alto riesgo en su genotipo heterocigótico que se evidenció a pesar de su poco impacto poblacional AG (OR de 13.85, 95% IC=1.60-119.76, p=0.0039). Por último, el polimorfismo rs9340799 del gen ESR1 (Tabla 15), definido por la enzima de restricción XbaI, presentó diferencias significativas para el homocigoto GG (OR=3.00, 95% IC=1.72-5.23, p=0,0002), ajustándose a un modelo de herencia recesivo, mientras que los otros dos SNPs estudiados en el mismo gen, rs2234693 y rs6932902, no mostraron asociación con la enfermedad (Tabla 16 y Tabla 17). RESULTADOS 118 Tabla 10. Asociación genotípica del polimorfismo rs523349 del gen SRD5A2 con AE de causa desconocida en función del modelo de herencia. Modelo Genotipo C [n (%)] AE [n (%)] OR (95% CI) P-valor AIC BIC Co C/C 173 (56.4) 28 (26.2) 1.00 *<0.0001 446.5 458.6 C/G 114 (37.1) 60 (56.1) 3.25 (1.96-5.40) G/G 20 (6.5) 19 (17.8) 5.87 (2.79-12.35) Do C/C 173 (56.4) 28 (26.2) 1.00 *<0.0001 447.2 455.3 CG-GG 134 (43.6) 79 (73.8) 3.64 (2.24-5.93) Re C/C-C/G 287 (93.5) 88 (82.2) 1.00 *0.0012 466.7 474.7 G/G 20 (6.5) 19 (17.8) 3.10 (1.58-6.07) S-Do C/C-G/G 193 (62.9) 47 (43.9) 1.00 *0.0007 465.6 473.6 C/G 114 (37.1) 60 (56.1) 2.16 (1.38-3.38) Ad --- --- --- 2.61 (1.85-3.69) *<0.0001 445.9 454 Co: Codominante, Do: Dominante, Re: Recesivo, S-Do: Sobredominante, Ad: Aditivo, C: Controles, AE: Abortos espontáneos, OR: Odds Ratio, AIC: Criterio de Información de Akaike, BIC: Criterio de Información Bayesiano Tabla 11. Asociación genotípica del polimorfismo rs9282858 del gen SRD5A2 con AE de causa desconocida en función del modelo de herencia. Modelo Genotipo C [n (%)] AE [n (%)] OR (95% CI) P-valor AIC BIC --- G/G 312 (95.4%) 139 (96.5%) 1.00 0.57 583.6 591.9 A/G 15 (4.6%) 5 (3.5%) 0.75 (0.27-2.10) C: Controles, AE: Abortos espontáneos, OR: Odds Ratio, AIC: Criterio de Información de Akaike, BIC: Criterio de Información Bayesiano RESULTADOS 119 Tabla 12. Asociación genotípica del polimorfismo rs4646 del gen CYP19A1 con AE de causa desconocida en función del modelo de herencia. Modelo Genotipo C [n (%)] AE [n (%)] OR (95% CI) P-valor AIC BIC Co C/C 179 (55.1) 67 (48.2) 1.00 0.071 567.3 579.7 A/C 118 (36.3) 65 (46.8) 1.47 (0.97-2.22) A/A 28 (8.6) 7 (5) 0.67 (0.28-1.60) Do C/C 179 (55.1) 67 (48.2) 1.00 0.17 568.7 577 A/C-A/A 146 (44.9) 72 (51.8) 1.32 (0.88-1.96) Re C/C-A/C 297 (91.4) 132 (95) 1.00 0.17 568.6 576.9 A/A 28 (8.6) 7 (5) 0.56 (0.24-1.32) S-Do C/C-A/A 207 (63.7) 74 (53.2) 1.00 *0.036 566.1 574.4 A/C 118 (36.3) 65 (46.8) 1.54 (1.03-2.30) Ad --- --- --- 1.09 (0.79-1.48) 0.61 570.3 578.6 Co: Codominante, Do: Dominante, Re: Recesivo, S-Do: Sobredominante, Ad: Aditivo, C: Controles, AE: Abortos espontáneos, OR: Odds Ratio, AIC: Criterio de Información de Akaike, BIC: Criterio de Información Bayesiano Tabla 13. Asociación genotípica del polimorfismo rs10046 del gen CYP19A1 con AE de causa desconocida en función del modelo de herencia. Modelo Genotipo C [n (%)] AE [n (%)] OR (95% CI) P-valor AIC BIC Co G/G 86 (26.8) 29 (26.6) 1.00 *0.015 484.5 496.7 A/G 148 (46.1) 64 (58.7) 1.28 (0.77-2.14) A/A 87 (27.1) 16 (14.7) 0.55 (0.28-1.08) Do G/G 86 (26.8) 29 (26.6) 1.00 0.97 490.9 499 A/G-A/A 235 (73.2) 80 (73.4) 1.01 (0.62-1.65) Re G/G-A/G 234 (72.9) 93 (85.3) 1.00 *0.0064 483.4 491.6 A/A 87 (27.1) 16 (14.7) 0.46 (0.26-0.83) S-Do G/G-A/A 173 (53.9) 45 (41.3) 1.00 *0.023 485.7 493.8 A/G 148 (46.1) 64 (58.7) 1.66 (1.07-2.58) Ad --- --- --- 0.78 (0.58-1.07) 0.12 488.5 496.6 Co: Codominante, Do: Dominante, Re: Recesivo, S-Do: Sobredominante, Ad: Aditivo, C: Controles, AE: Abortos espontáneos, OR: Odds Ratio, AIC: Criterio de Información de Akaike, BIC: Criterio de Información Bayesiano RESULTADOS 126 ESTUDIO DEL DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO A continuación se muestra la medida de DL (D, D’, r y p-valor) para los polimorfismos de los tres genes estudiados: SRD5A2 (Tabla 21), CYP19A1 (Tabla 22) y ESR1 (Tabla 23). En algunas parejas de polimorfismos analizados se obtienen valores de p superiores a 0.05, lo que indica la independencia de estos marcadores en las poblaciones de estudio, por el contrario, aquellas parejas que muestran valores cercanos a 1 de D’ y una p < 0.05 consideramos que se encuentran en desequilibrio de ligamiento. 4.5.1. Gen SRD5A2 Según los resultados obtenidos en la Tabla 21 se puede deducir que los polimorfismos rs523349 y rs9282858 del gen SRD5A2 no se encuentran en desequilibrio de ligamiento. RESULTADOS 127 Tabla 21. Desequilibrio de ligamiento de los polimorfismos estudiados en el gen SRD5A2 D rs523349 rs9282858 rs523349 . -0.0021 rs9282858 . . D' rs523349 rs9282858 rs523349 . 0.3065 rs9282858 . . r rs523349 rs9282858 rs523349 . -0.0306 rs9282858 . . p-Valor rs523349 rs9282858 rs523349 . 0.3795 rs9282858 . . 4.5.2. Gen CYP19A1 Los 3 polimorfismos estudiados del gen CYP19A1 (rs4646, rs10046 y rs2236722), presentaron valores de D’ muy próximos a 1 y un valores de p <0.05 en el estudio de ligamiento, lo que indica que se encuentran en desequilibrio de ligamiento (Tabla 22). RESULTADOS 128 Tabla 22. Desequilibrio de ligamiento de los polimorfismos estudiados en el gen CYP19A1 D rs4646 rs10046 rs2236722 rs4646 . -0.1238 0.0048 rs10046 . . 0.0034 rs2236722 . . . D' rs4646 rs10046 rs2236722 rs4646 . 0.9342 0.9903 rs10046 . . 0.9862 rs2236722 . . . r rs4646 rs10046 rs2236722 rs4646 . -0.5562 0.133 rs10046 . . 0.0834 rs2236722 . . . p-Valor rs4646 rs10046 rs2236722 rs4646 . <0.0001 0.0001 rs10046 . . 0.0156 rs2236722 . . . 4.5.3. Gen ESR1 De los resultados obtenidos en la Tabla 23 se puede concluir que los SNPs rs9340799 y rs2234693 del gen ESR1 se encuentran en desequilibrio de ligamiento con un valor de D’ igual a 0.8805. Por el contrario, el rs6932902 del mismo gen no presenta una p significativa cuando se combina con rs9340799 o rs2234693. RESULTADOS 129 Tabla 23. Desequilibrio de ligamiento de los polimorfismos estudiados en el gen ESR1 D rs9340799 rs2234693 rs6932902 rs9340799 . 0.1811 0.0127 rs2234693 . . 0.0032 rs6932902 . . . D' rs9340799 rs2234693 rs6932902 rs9340799 . 0.8805 0.1963 rs2234693 . . 0.0563 rs6932902 . . . r rs9340799 rs2234693 rs6932902 rs9340799 . 0.7528 0.0864 rs2234693 . . 0.0212 rs6932902 . . . p-Valor rs9340799 rs2234693 rs6932902 rs9340799 . <0.0001 0.0176 rs2234693 . . 0.5277 rs6932902 . . . RESULTADOS 130 ESTUDIO DE ASOCIACIÓN HAPLOTÍPICA En las Tablas 24-26 se observan los resultados del análisis de asociación para los haplotipos formados por dos o tres SNPs a la vez, de un único gen. 4.6.1. Gen SRD5A2 Analizando los haplotipos formados por los dos SNPs del gen SRD5A2 (Tabla 24) observamos que el haplotipo asociado de manera significativa con el AE de causa desconocida es el formado por el alelo G de rs523349 y el alelo G de rs9282858 (p<0.0001). Tabla 24. Prueba de asociación haplotípica para SNPs de SRD5A2. Haplotipo Frecuencias haplotípicas Estadística rs523349/rs9282858 C AE Freq OR (IC 95% ) p-Valor C/G 0.7263 0.5411 0.6696 1.00 --- G/G 0.2508 0.4379 0.3081 2.38 (1.67 - 3.38) *<0.0001 C/A 0.0229 0 0.0159 0.00 (-Inf - Inf) 1 C: Controles, AE: Abortos Espontáneos, Freq: Frecuencia, OR: Odds ratio 4.6.2. Gen CYP19A1 En cuanto al gen CYP19A1 ningún haplotipo formado por los 3 polimorfismos analizados arrojó resultados significativos (Tabla 25). RESULTADOS 131 Tabla 25. Prueba de asociación haplotípica para SNPs de CYP19A1. Haplotipo Frecuencias haplotípicas Estadística rs4646/rs10046 C AE Freq OR (IC 95% ) p-Valor C/A 0.4964 0.4372 0.4781 1.00 --- A/G 0.2618 0.2655 0.2631 1.17 (0.83 - 1.66) 0.37 C/G 0.2359 0.2779 0.2489 1.36 (0.91 - 2.04) 0.13 rs4646/rs2236722 C AE Freq OR (IC 95% ) p-Valor C/A 0.7323 0.7087 0.725 1.00 --- A/A 0.2661 0.2713 0.2677 1.07 (0.78 - 1.46) 0.69 rs10046/rs2236722 C AE Freq OR (IC 95% ) p-Valor G/A 0.497 0.5619 0.5162 1.00 --- A/A 0.5015 0.418 0.477 0.78 (0.57 - 1.06) 0.11 rs4646/rs10046/rs2236722 C AE Freq OR (IC 95% ) p-Valor C/A/A 0.4964 0.439 0.4777 1.00 --- A/G/A 0.2603 0.2508 0.2572 1.15 (0.81 - 1.64) 0.43 C/G/A 0.2359 0.271 0.2477 1.40 (0.93 - 2.11) 0.11 C: Controles, AE: Abortos Espontáneos, Freq: Frecuencia ,OR: Odds ratio 4.6.3. Gen ESR1 En la Tabla 26 se puede observar que el haplotipo formado por el alelo A del rs9340799 (XbaI) y el alelo C del rs2234693 (PvuII) del gen ESR1 está asociado estadísticamente con la enfermedad (OR=1.85, p=0.023). Con mayor potencia estadística y un riesgo mucho superior está asociado el haplotipo formado por el alelo G de XbaI y el alelo T de PvuII (OR=30.84, p<0.0001). Los haplotipos dobles con el rs6932902 no mostraron diferencias significativas, sin embargo, cuando se asocian los haplotipos anteriormente mencionados (AC y GT de XbaI/PvuII) con el alelo G de este polimorfismo los riesgo aumentan considerablemente (2.00 y 50.31 respectivamente). RESULTADOS 132 Tabla 26. Prueba de asociación haplotípica para SNPs de ESR1. Haplotipo Frecuencias haplotípicas Estadística rs9340799/rs2234693 C AE Freq OR (IC 95%) p-Valor A/T 0.5607 0.412 0.5185 1.00 --- G/C 0.334 0.3489 0.3383 1.25 (0.89 - 1.75) 0.2 A/C 0.1016 0.1391 0.113 1.85 (1.09 - 3.13) *0.023 G/T 0.0037 0.1 0.0303 30.84 (6.56 - 144.99) *<0.0001 rs9340799/rs6932902 C AE Freq OR (IC 95%) p-Valor A/G 0.5936 0.5042 0.5695 1.00 --- G/G 0.305 0.3881 0.3272 1.36 (0.95 - 1.94) 0.093 A/A 0.0602 0.0342 0.0527 0.67 (0.27 - 1.64) 0.38 G/A 0.0413 0.0735 0.0505 1.92 (0.97 - 3.81) 0.063 rs2234693/rs6932902 C AE Freq OR (IC 95%) p-Valor T/G 0.5107 0.4652 0.4973 1.00 --- C/G 0.3877 0.4272 0.3993 1.21 (0.88 - 1.67) 0.24 T/A 0.0537 0.0536 0.0536 1.10 (0.49 - 2.49) 0.81 C/A 0.0478 0.054 0.0497 1.24 (0.56 - 2.71) 0.59 rs9340799/rs2234693/rs6932902 C AE Freq OR (IC 95%) p-Valor A/T/G 0.5077 0.3744 0.4687 1.00 --- G/C/G 0.2948 0.2902 0.2917 1.18 (0.80 - 1.73) 0.41 A/C/G 0.094 0.1449 0.1104 2.00 (1.13 - 3.51) *0.017 A/T/A 0.0531 0.0391 0.05 0.97 (0.39 - 2.44) 0.95 G/C/A 0.0391 0.0524 0.0447 1.73 (0.74 - 4.07) 0.21 G/T/G 0.0022 0.0828 0.026 50.31 (6.05 - 417.99) *0.0003 C: Controles, AE: Abortos Espontáneos, Freq: frecuencia, OR: Odds ratio RESULTADOS 133 ESTUDIO DE INTERACCIONES GÉNICAS Se estudiaron las interacciones génicas de los polimorfismos de diferentes genes manteniendo los modelos de herencia seleccionados en cada caso. En primer lugar se enfrentó el rs523349 y rs9282858 del gen SRD5A2 a los polimorfismos rs4646 (sobredominante), rs10046 (recesivo) y rs2236722 del gen CYP19A1 y al rs9340799 (recesivo), rs2234693 (dominante) y rs6932902 (recesivo) del ESR1. En segundo lugar, se analizó la interacción de éstos últimos SNPs del gen ESR1 con los polimorfismos del gen CYP19A1 (rs4646, 10046 y rs2236722). Se observaron múltiples asociaciones con un posible efecto epistático entre los distintos polimorfismos estudiados, la mayoría de ellas no superaban las ORs halladas en los genotipos individuales, sin embargo, en algunos casos como en las interacciones GG/AC (rs523349/rs4646) y CG/AG (rs523349/rs2236722) (Tabla 27, Tabla 28, Tabla 29, Tabla 30 y Tabla 31) las OR de las mencionadas interacciones superaban las OR de los genotipos individuales, lo que nos lleva a plantearnos posibles sinergias sobre el efecto abortivo. RESULTADOS 134 Tabla 27. Interacciones génicas del polimorfismo rs523349 del gen SRD5A2 con el resto de SNPs estudiados. Referencia Modelo C/C C/G G/G C EA OR p C EA OR p C EA OR p (n) (n) (95% CI) (n) (n) (95% CI) (n) (n) (95% CI) rs4646 C/C A/A 100 14 1.00 - 78 23 2.11 (1.024.36) * 0.0447 18 12 4.76 (1.9011.95) *0.0009 A/C 73 14 1.37 (0.623.05) 0.4406 36 33 6.55 (3.1513.61) *< .0001 2 4 14.28 (2.3985.32) *0.0035 rs10046 G/G A/G 125 18 1.00 - 83 49 4.10 (2.237.52) *< .0001 16 12 5.21 (2.1212.77) *0.0003 A/A 45 7 1.08 (0.422.76) 0.8718 31 4 0.90 (0.282.84) 0.8519 3 3 6.94 (1.3037.07) *0.0233 rs2236722 A/A 172 27 1.00 - 113 49 2.76 (1.634.68) *0.0002 20 18 5.73 (2.6912.20) *< .0001 A/G 1 0 2.09 (0.0852.64) 0.6540 0 5 69 (3.711283.13) *0.0045 0 0 - - rs9340799 A/A A/G 136 14 1.00 - 94 22 2.27 (1.114.67) *0.0253 15 10 6.48 (2.4517.10) *0.0002 G/G 24 8 3.24 (1.238.55) * 0.0177 14 12 8.33 (3.2321.47) *< .0001 4 3 7.28 (1.4835.90) *0.0147 rs2234693 T/T 53 7 1.00 - 40 11 2.08 (0.745.85) 0.1640 5 1 1.51 (0.1514.91) 0.7222 C/T-C/C 120 18 1.13 (0.452.88) 0.7888 74 45 4.60 (1.9311.00) *0.0006 15 18 9.08 (3.2025.82) *< .0001 rs6932902 G/G-A/G 171 27 1.00 - 114 55 3.05 (1.825.13) *< .0001 19 19 6.33 (2.9813.47) *< .0001 A/A 1 1 6.33 (0.38104.30) 0.1966 0 0 - - 0 0 - - C: Controles, AE: Aborto Espontáneo, OR: Odds Ratio RESULTADOS 135 Tabla 28. Interacciones génicas del polimorfismo rs9282858 del gen SRD5A2 con el resto de SNPs estudiados. Referencia Modelo G/G A/G C (n) EA (n) OR (95% CI) p C (n) EA (n) OR (95% CI) p rs4646 C/C A/A 199 69 1.00 - 8 3 0.67 (0.17-2.62) 0.5666 A/C 111 62 1.61 (1.06-2.44) * 0.0241 7 2 0.51 (0.10-2.54) 0.4121 rs10046 G/G A/G 222 88 1.00 - 12 3 0.63 (0.17-2.29) 0.4834 A/A 84 14 0.42 (0.23-0.78) *0.0059 3 1 0.84 (0.09-8.19) 0.8814 rs2236722 A/A 309 111 1.00 - 15 5 0.93 (0.33-2.61) 0.8874 A/G 1 5 13.92 (1.61120.45) *0.0168 0 0 - - rs9340799 A/A A/G 249 52 1.00 - 10 1 0.48 (0.06-3.82) 0.4872 G/G 41 28 3.27 (1.86-5.76) * < 0.0001 3 0 0.68 (0.0313.34) 0.7988 rs2234693 T/T 99 28 1.00 - 8 1 0.28 (0.03-2.31) 0.2398 C/T-C/C 212 93 0.64 (0.40-1.05) 0.0762 7 4 1.30 (0.37-4.56) 0.6791 rs6932902 G/G-A/G 304 120 1.00 - 15 5 0.84 (0.30-2.37) 0.7486 A/A 1 2 5.07 (0.45-56.40) 0.1869 0 0 - - C: Controles, AE: Aborto Espontáneo, OR: Odds Ratio