Alteraciones motoras, cognitivas y emocionales en la encefalomielitis autoinmune experimental

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Psicología Trabajo de Fin de Grado ALTERACIONES MOTORAS, COGNITIVAS Y EMOCIONALES EN LA ENCEFALOMIELITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL Autora: Cristina Sánchez Morales Director: Dr. Luis Javier Santín Núñez Málaga, diciembre de 2015 Índice RESUMEN 1 INTRODUCCIÓN 1 MATERIAL Y MÉTODOS 5 Animales 5 Inducción de la EAE 5 Diseño experimental 6 Evaluación conductual 7 - Test de actividad en rodillo 8 - Laberinto en Y 8 - Reconocimiento de objetos con desplazamiento espacial 10 - Laberinto en cruz elevado 12 Análisis estadísticos 13 RESULTADOS 13 Evolución de los síntomas clínicos 13 Actividad locomotora reducida 15 Afectación de la memoria espacial de trabajo 15 Afectación de la memoria espacial a corto plazo 17 Incremento del nivel de ansiedad 19 DISCUSIÓN 20 CONCLUSIÓN 24 REFERENCIAS 25 1 1. RESUMEN La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neuroinflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC). Actualmente, el modelo animal experimental más adecuado para la EM humana es la encefalomielitis autoinmune experimental (i.e. EAE), la cual utilizamos en nuestro estudio para la evaluación de las alteraciones motoras, cognitivas y emocionales de nuestros ratones con curso remitente-recurrente. A día de hoy, el estudio del deterioro cognitivo en la EAE es reciente y escaso, siendo necesario realizar estudios pre y post-sintomáticos. En este sentido, analizamos de forma experimental el grado de afectación durante estadios más avanzados (fases de brote, remisión y estabilización). En conjunto, nuestros resultados indicaron que nuestros ratones EAE presentaron: alteraciones motoras, incremento de la conducta ansiosa, y déficits de memoria espacial de trabajo y a corto plazo. Palabras clave: cognición, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, EAE, curso remitente-recurrente, evaluación conductual. 2. INTRODUCCIÓN La Esclerosis múltiple (EM) se considera una enfermedad degenerativa, progresiva y desmielinizante de origen autoinmune, que cursa con la aparición de lesiones inflamatorias focales (placas escleróticas) en los axones de las neuronas del cerebro y de la médula espinal, que como consecuencia, impide el funcionamiento normal de las fibras nerviosas (Martin et al., 1992; Steiman, 1996; Compston y Coles, 2008; Lassmann et al., 2007). A pesar de que su descubrimiento se remonte al año 1868, de la mano de Charcot, su etiología y patología son aún desconocidas (Milo y Miller, 2014). Constituye la causa más frecuente de incapacidad de origen neurológico entre los jóvenes adultos (Bártulos et al., 2014). En 2013, se estimó que alrededor de más de 2 millones de personas fueron diagnosticadas en todo el mundo y sólo en Europa 500.000 fueron las afectadas. España, con 46.000 diagnosticados, se considera el sexto país europeo con mayor prevalencia (Browne et al., 2014), encontrándose sólo en Málaga entorno a 2.000 casos diagnosticados (Fernández, 2014). Actualmente, la incidencia mundial está en aumento, de los 2,1 millones de afectados en 2008 a los 2,3 millones en 2013; siendo las mujeres diagnosticadas con mayor frecuencia que los hombres, en una relación de 3 a 1 (Fernández et al., 2014). 2 La EM es causada por la sobreactivación del sistema inmunológico (SI), y se caracteriza principalmente por una patología neuroinflamatoria, que es seguida de un proceso neurodegenerativo. Este sistema de defensa, en colaboración con las células T y a través del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), detecta posibles antígenos en los componentes de la mielina. De esta forma, las células T sobreactivadas migran al SNC desencadenando anticuerpos contra la glicoproteína oligodendrocitaria de la mielina (MOG, de su denominación en inglés, myelin oligodendrocyte glycoprotein) o contra la proteína básica de la mielina (Martínez, 2013 y Sánchez, 2008); atacando al SNC como si de un virus se tratara. En la Esclerosis múltiple, las células T sobreactivadas más representativas son los linfocitos CD4+, que estos a su vez se diferencian en tres linfocitos cooperadores del SI: Th1, Th2 y Th17; siendo Th1 y Th17 los linfocitos más relevantes en la EM y en la EAE (McFarland y Martin, 2007; Lovett-Racke et al., 2010). La Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más empleado en el estudio de la Esclerosis múltiple (Rangachari y Kuchroo, 2013), ya que al relacionarse con la sobreactivación de los linfocitos T CD4+ (Th1 y Th17), sus mecanismos inmunológicos conducen a similares características patológicas de la EM: inflamación, desmielinización, pérdida axonal y gliosis (Constantinescu et al., 2011; McCarthy et al., 2012). Los orígenes del modelo EAE, se remontan a la primera inducción inflamatoria sobre la médula espinal en conejos, llevada a cabo por Koritschoner y Schweinburg en el año 1920 (Koritschoner y Schweinburg, 1925); a partir de entonces, ha sido inducida en múltiples especies, incluyendo a primates y roedores. En cuestión al desarrollo de la EAE, el modelo puede inducirse de dos maneras: de forma activa o de forma pasiva. En la forma activa se administran péptidos o proteínas de la mielina, como la glucoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG), que generan la respuesta citotóxica-proinflamatoria y el consecuente proceso de desmielinización (Steinman, 2007; GarcíaDíaz y Estivill-Torrús, 2008; Mannara et al., 2012). En la forma pasiva se realiza la transferencia de células T específicas contra antígenos de la mielina, que conllevan al mismo resultado de desmielinización (Mendel et al, 1995; Stefferl et al, 2000). En nuestro estudio se empleó la inducción activa de la EAE, considerada la más sencilla y eficaz para producir resultados rápidos y robustos (Mannara et al, 2012). 3 En cuestión al curso que pueda desarrollarse tanto en la EM como en la EAE, encontramos cuatro tipos de evolución con un alto grado de heterogeneidad (figura 1): - Curso remitente-recurrente (RR). El más frecuente y detectado en el 85% de los pacientes de EM (McKay et al., 2015). Se caracteriza por presentar una fase inicial donde no suelen aparecer síntomas detectables, seguida de una fase de brote en la que se detectan síntomas agudos durante varios días o semanas. Esta fase de brote es seguida de una recuperación espontánea, conocida como fase de remisión, y finalmente por una fase de estabilización de los síntomas. De esta forma se obtiene un curso intermitente. - Curso progresivo primario (PP). El 10% de los pacientes presentan un inicio y empeoramiento lento y continuo, en ausencia de remisiones y brotes definidos (Lublin y Reingold, 1996). - Curso progresivo recidivante (PR). Se presenta con una menor prevalencia (Tullman et al., 2004), y está caracterizada por una forma atípica, después de la aparición de la enfermedad. A diferencia de los PP, muestran brotes agudos con o sin recuperación completa. No obstante, los períodos de remisión suelen ser progresivos de forma continua. - Curso progresivo secundario (PS). Aparece entre un 30-50% de los pacientes, después de los 10-15 años de evolución del curso RR (Gold y Rieckmann, 2000). Caracterizado por un empeoramiento gradual con o sin recaídas ocasionales, remisiones poco relevantes y fases de estabilidad (Chiaravalloti y DeLuca, 2008; Rommer y Stüve, 2013). Figura 1. Curso clínico de la Esclerosis múltiple. 4 El modelo de la EAE nos permite inducir en los animales la mayoría de los síntomas clínicos de la EM, como la disminución progresiva de las funciones motoras, cognitivas y emocionales (Miller, 2012); las cuales derivan, en la mayoría de los casos, a una incapacidad permanente (Steinman, 2007; Dutra et al., 2013). En cuanto a la afectación motora y sensorial, se suelen observar problemas de coordinación, dolor muscular y trastornos visuales (Ziemssen, 2011). De entre las alteraciones cognitivas principales, se pueden presentar problemas en la memoria (Muhlert et al., 2014; Hulst et al., 2015), la atención (Paul et al., 1998; Jongen et al., 2012), las funciones ejecutivas (Foong et al., 1997; Jongen et al., 2012), la velocidad de procesamiento cognitivo (Rao et al., 1989; Parmenter et al., 2007) y la capacidad visoespacial (Longoni et al., 2015). Además de las alteraciones emocionales, de las cuales un 35% de los pacientes suelen sufrir problemas de ansiedad (Brenner et al., 2014) y un 50% de depresión (Siegert y Abernethy, 2005). No obstante, la alta comorbilidad de la EM (presencia de una o más condiciones o enfermedades concurrentes) origina importantes retrasos en la realización de los diagnósticos y la aplicación de los tratamientos necesarios (Marrie et al, 2015); siendo la depresión y la ansiedad dos de las cinco comorbilidades más predominantes (Acharjee et al., 2013). Sin embargo, en la actualidad aún no existen tratamientos eficaces para la presencia de los síntomas cognitivos, emocionales y motores de EM y EAE. Dado el alto impacto disfuncional de la discapacidad y los ineficaces tratamientos que actualmente existen (Acharjee et al., 2013), hemos evaluado las alteraciones motoras, cognitivas y emocionales, con el objetivo de obtener información sobre el desarrollo de la enfermedad en el modelo EAE con curso remitente-recurrente. Para ello, hemos utilizado una serie de pruebas conductuales para evaluar la afectación de la coordinación motora, la memoria y la ansiedad. Una vez identificados estos déficits, nuestros resultados serán de utilidad para la evaluación futura de la eficacia terapéutica de la administración de células mesenquimales derivadas de tejido adiposo, estudios que se están desarrollando en el grupo de investigación con el que se realizó este trabajo de fin de grado. 5 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Animales Todos los experimentos se realizaron empleando ratones hembras (fondo genético C57BL/6J x 129X1/SvJ) con 6-8 semanas de edad, criados y mantenidos en las instalaciones de la Unidad de Experimentación Animal de la Universidad de Málaga. Siete ratones hembras fueron asignadas al grupo experimental de inducción de la enfermedad (grupo EAE), y nueve ratones hembras al grupo control (N=16). Todos los animales fueron marcados para su identificación, siendo alojados en grupos de 3-4 ratones por jaula. Durante la realización del experimento, los animales se estabularon en condiciones estándar, disponiendo de comida y agua “ad libitum”, y un ciclo constante de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo a las Directivas del Consejo de la Comunidad Europea 2010/63/EU, 90/219/CEE, y Regulación (EC) nº1946/2003, siendo aprobados por el comité ético de la Universidad de Málaga (CEUMA: 2012-0006-A; 2012-0007-A) y desarrollados siguiendo la normativa Española (Real Decreto 53/2013 y 178/2004, Ley 32/2007 y 9/2003, y Decreto 320/2010). Los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical para la extracción de sangre y diversos tejidos; tales como cerebro, médula y bazo. Las muestras de sangre así como los tejidos obtenidos, fueron utilizados para el posterior análisis inmunohistoquímico y la obtención del perfil inflamatorio de citoquinas; estudios no incluidos en este trabajo de fin de grado. 3.2. Inducción de la Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) La inducción de la EAE se realizó empleando la inmunización activa: se administró por vía subcutánea 50 µl de una emulsión en cada lado de la cola (100 µl en total), conteniendo 200 µg de la proteína de la mielina del oligodendrocito (MOG35-55; del inglés myelin oligodendrocyte glycoprotein, Biomatik Corporation, Cambridge, Canadá) y de coadyuvante de Freund (CFA, Sigma-Aldrich Qímica S.A, Madrid, España); realizándose de nuevo la inmunización a los 7 días post-inmunización (dpi). La toxina pertussis (500 ng/ratón, TocrisBioscience, Bristol, Reino Unido) fue inyectada el día de la inmunización (0 dpi), 48 horas después (2 dpi), y repetida a los 7 y 9 días. Como grupo control se emplearon un total de 9 ratones hembras, las cuales recibieron 40 µl de CFA y toxina pertussis, repetida la administración de CFA a los 7 dpi. El curso de la enfermedad EAE se definió como remitente-recurrente, caracterizado por presentar dos o más brotes seguidos de los correspondientes períodos de remisión. 6 La puntuación del grado de afectación se obtuvo diariamente en cada uno de los ratones, según una escala de 0 a 5 puntos establecida en nuestro laboratorio y basada en el protocolo descrito por Hooke Laboratories (2008-2014) y publicaciones previas (Miller et al., 2007; Acharjee et al., 2013) (tabla 1). Tabla 1. Puntuación de la EAE Puntuación Síntomas Clínicos 0.0 Saludable. La cola del ratón tiene tensión y está erecta. Cuando el ratón está caminando no hay inclinación de la cabeza. 0.5 El final de la cola está flácido, la cola tiene tensión a excepción de la punta. No obstante, la cola sigue moviéndose, con un considerable esfuerzo muscular. 1.0 Cola flácida, no se observan signos de movimiento de la cola. Las patas traseras presentan una inusual separación. 1.5 Cola flácida e inhibición de las patas traseras. Mantienen un movimiento tambaleante cuando caminan. 2.0 Cola flácida y debilidad en las patas traseras. 2.5 Cola flácida y arrastre de las patas traseras. 3.0 Cola flácida y parálisis completa de las patas traseras. 3.5 Cola flácida y parálisis completa de las patas traseras, con un movimiento circular constante alrededor de la jaula, al no ser capaz de enderezarse. 4.0 Cola flácida, parálisis completa de las patas traseras y parálisis parcial de las patas delanteras. 4.5 Parálisis completa de las patas traseras, y parálisis parcial de las patas delanteras, sin presentar movimiento alrededor de la jaula. El ratón no está alerta. 5.0 El ratón está rodando de forma espontánea en la jaula (se recomienda la eutanasia). 3.3. Diseño experimental Ratones hembras de 6-8 semanas de edad fueron divididas en dos grupos: grupo control y grupo EAE. Cuatro días antes de la inmunización se realizó la primera evaluación conductual, denominada fase basal (en ausencia de síntomas clínicos). Posteriormente, se procedió a la inducción de la EAE en el grupo experimental y en el grupo control (día 0). A partir del día 19 dpi, se realizó una segunda evaluación conductual (19-21 dpi), que correspondió con la 7 fase de brote de la EAE (aparición de los primeros síntomas de la enfermedad). La tercera evaluación conductual se realizó a los 41-43 dpi, la cual coincidió con la fase de estabilización. Finalmente, los ratones se sacrificaron en el día 57 (figura 2). Las pruebas de comportamiento que se llevaron a cabo fueron: el test de actividad en rodillo (rotarod), el laberinto en Y, el test de reconocimiento de objetos con desplazamiento espacial y el laberinto en cruz elevado; siendo la prueba de rotarod y el laberinto en Y, las que se administraron conjuntamente en un mismo día del experimento. Con estas pruebas se evaluaron la coordinación motora, la memoria espacial de trabajo (MT), la memoria espacial a corto plazo (MCP) y la emisión de conductas relacionadas con la ansiedad, respectivamente. Figura 2. Diseño experimental para el estudio de la esclerosis múltiple en el modelo animal de EAE. Se detalla la planificación temporal de la aplicación de las pruebas conductuales. 3.4. Evaluación conductual Antes de iniciarse la evaluación conductual en la fase basal, todos los animales fueron manipulados durante 5 minutos por el experimentador y habituados a las condiciones ambientales de la sala experimental. Las pruebas conductuales se realizaron en diferentes días y se administraron siguiendo un orden inverso a la capacidad de la prueba para generar estrés en los ratones (figura 2). Una vez finaliza cada una de las pruebas, los animales fueron depositados en su jaula experimental, manteniéndose en la sala de estabulación hasta su uso posterior. Las pruebas fueron repetidas a la misma hora de la mañana (09:00 a.m.), y una vez realizadas de forma individual, se limpiaron con etanol al 70% para evitar que los olores y las feromonas interfirieran en los resultados. Todas las tareas fueron administradas tanto al grupo experimental de EAE como al grupo control. 14 En el día 17 después de la inmunización, los animales alcanzaron el grado 1 de puntuación en la escala de afectación, caracterizado por presentar síntomas de debilidad, sin movimiento en la totalidad de la cola (figura 17). De esta manera, se definió la primera fase de brote, al obtener la puntuación ≥1 durante al menos dos días consecutivos (Hammer et al., 2015). A partir de este momento, los animales continuaron incrementando su grado de afectación hasta alcanzar una puntuación de 2 el día 24 después de la inmunización (debilidad en las extremidades y una aparente flacidez en la cola). La fase de remisión se inició el día 27 después de la inmunización, ya que los ratones disminuyeron su puntuación ≥0.5 grados durante al menos dos días consecutivos. En esta fase, presentaron una puntuación media de 1.5 en la escala de EAE, con flacidez en la cola e inhibición en las patas traseras, manteniendo un movimiento tambaleante cuando caminaban. Seguidamente, los ratones mostraron una segunda fase de brote en el día 29 con 2 grados de puntuación, y una segunda fase de remisión en el día 31 con 1.5 grados de puntuación. Posteriormente, los animales volvieron a manifestar una tercera fase de brote que se inició el día 34 dpi, presentando el grupo EAE una puntuación media de 2 grados en la enfermedad, que se mantuvo estable hasta el final del registro de los síntomas (fase de estabilización). Esta última fase se pudo observar a partir del día 38 después de la inmunización. Figura 11. Evolución de la EAE. Las flechas rojas indican las fases de brote, las flechas verdes señalan las fases de remisión y la flecha negra horizontal indica la fase de estabilización. Los momentos de la realización de las pruebas de comportamiento corresponden con la fase de brote inicial (19-21 dpi) y la fase estabilización (38 dpi). Días post-inmunización 010 20 30 40 50 60 Puntuación de la enfermedad 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Control EAE 15 4.2. Actividad locomotora reducida en el grupo EAE Para estudiar la alteración motora inducida por la enfermedad, se analizó el tiempo que permanecieron los ratones en el rotarod (figura 12). El ANOVA de medidas repetidas mostró un efecto del tratamiento (F1, 14 = 12,266; p≤0,05) y un efecto de la variable “día” (F2, 28 = 4,105; p≤0,05), sin observarse una interacción estadísticamente significativa (F2, 28 = 2,496; p≥0,05). Los análisis post hoc mostraron que el grupo EAE pasó menos tiempo que el grupo control en el rotarod durante la fase de brote y de estabilización (LSD: p≤0,05). Figura 12. Tiempo de permanencia en el rotarod. Medias ± SEM. El grupo EAE permaneció un menor tiempo en rodillo durante las fases de brote y de estabilización. LSD: diferencia entre el grupo EAE y control (*p≤0,05), y entre las fases basal, de brote y de estabilización (#p≤0,05). 4.3. Afectación de la memoria espacial de trabajo en el grupo EAE Los resultados del ANOVA mostraron un efecto del tratamiento, indicando que los ratones EAE exhibieron un menor porcentaje de alternancia espontánea en el laberinto en Y (F1, 14 = 10,695; p≤0,001), tanto en la fase de brote como en la fase de estabilización (LSD: p≤0,05). No existió un efecto del día (F2, 28 = 1,328; p≥0,05), ni interacción entre ambas variables (F2, 28 = 1,809; p≥0,05) (figura 13.a). Con respecto a la locomoción (distancia total recorrida (cm)), el ANOVA de medidas repetidas mostró un efecto del tratamiento (F1, 14 = 5,703; p≤0,05), siendo el grupo EAE el que obtuvo una reducción de la distancia total recorrida durante la fase de brote (LSD: p≤0,05), en comparación con el grupo control (figura 13.b). Además, la variable “día” mostró un efecto significativo (F2, 28 = 5,435; p≤0,05), disminuyendo la locomoción de los ratones EAE en la fase de brote con respecto a la basal (LSD: p≤0,05), y aumentando significativamente en la B a sa l B ro te E s tab iliz ació n 0 20 40 60 80 100 120 Tiem p o en el rotor (s) C o n tro l EAE * * ## R otarod 16 fase de estabilización con respecto a la fase de brote (LSD: p≤0,05). Sin embargo, no se observó una interacción estadísticamente significativa (F2, 28 = 1,224; p≥0,05) entre ambas variables. En relación al número de entradas en el laberinto en Y, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los ratones EAE con respecto al grupo control (F1, 14 = 0,4864; p≥0,05). No obstante, los animales de ambos grupos mostraron un del efecto día (F2, 28 = 9,984; p≤0,05) con una disminución del número total de entradas en los brazos del laberinto en la fase de brote en comparación a la fase basal (LSD: p≤0,05); no existiendo una interacción estadísticamente significativa (F2, 28 = 0,233; p≥0,05) (figura 14). Figura 13. Porcentaje de alternancia espontánea (A) y Locomoción (B), en el test del laberinto en Y. Medias ± SEM. (A) Se observa una disminución en el porcentaje de alternancia espontánea en los ratones EAE durante las fases de brote y estabilización, (B) y una disminución de la distancia recorrida en la fase de brote. LSD: diferencia entre los grupos (*p≤0,05), y entre las fases (#p≤0,05). Figura 14. Número de entradas a los brazos del laberinto en Y. Medias ± SEM. Ambos grupos presentan una disminución en el número de entradas a los brazos durante la fase de brote. LSD: diferencia entre los grupos (*p≤0,05), y entre las fases (#p≤0,05). B a sa l B ro te E sta b iliz a ció n 0 20 40 60 80 100 Lab erinto en Y A lternan cia espontánea (% ) C o n tro l EAE * * B a sal B ro te E sta b iliz ac ió n 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Lab erinto en Y Lo com o ción (cm ) C ontrol EAE * # # 17 4.4. Afectación de la memoria espacial a corto plazo en la prueba de reconocimiento de objetos en el grupo EAE Con respecto a la locomoción en la fase de habituación, el ANOVA de medidas repetidas reveló la existencia de efectos estadísticamente significativos en la variable del tratamiento (F1, 14 = 5,792; p≤0,05), así como del día (F2, 28 = 21,834; p≤0,05) y de la interacción entre ambas (F2, 28 = 10,743; p≤0,05). Los análisis post hoc mostraron que el grupo EAE disminuyó significativamente su locomoción en comparación al grupo control en la fase de estabilización (LSD: p≤0,05); mientras que hubo una mejora en el grupo control durante la fase de estabilización con respecto a la fase basal y de brote (LSD: p≤0,05), así como una disminución en el grupo EAE en la fase de brote y una mejora en la fase de estabilización (LSD: p≤0,05) (Figura 15). Figura 15. Locomoción en la fase de habituación. Medias ± SEM. Los ratones EAE disminuyen la distancia total recorrida (locomoción) durante la fase de estabilización, en comparación con los controles. LSD: diferencia entre los grupos (*p≤0,05), y entre las fases (#p≤0,05). En la fase de muestra, el ANOVA de medidas repetidas no mostró un efecto del tratamiento en el tiempo total de exploración de los objetos (F1, 14 = 0,465; p≥0,05). Sin embargo, la variable “día” si mostró un efecto significativo (F2, 28 = 11,394; p≤0,05), reduciéndose la exploración tanto en la fase de brote como de estabilización, en comparación con la exploración basal (LSD: p≤0,05). No se observó un efecto estadísticamente significativo en la interacción entre ambas variables (F2, 28 = 1,323; p≥0,05) (Figura 16). B as al B ro te E s tab iliz a ció n 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Fase h abitu ació n Locom o ción (cm ) C o n tro l EAE * # # 18 Figura 16. Tiempo de exploración de los objetos en la fase de muestra, en la prueba de reconocimiento de objetos con desplazamiento espacial. Medias ± SEM. Ambos grupos realizan un mismo tiempo de exploración de los objetos, a pesar de que existen diferencias entre las fases. LSD: diferencia entre los grupos (*p≤0,05), y entre las fases (#p≤0,05). Durante la fase de recuerdo, no se observó una afectación diferencial del tiempo de exploración de los objetos en ambos grupos (F1, 14 = 1,136; p≥0,30). No obstante, la exploración fue menor en ambos grupos tanto durante la fase de brote como la fase de estabilización (F2, 28 = 9,797; p≤0.05; LSD:p≤0,05). Tampoco hubo un efecto estadísticamente significativo en la interacción entre ambas variables (F2, 28 = 2,166; p≥0,05) (Figura 17). Figura 17. Tiempo de exploración de los objetos en la fase de recuerdo, en la prueba de reconocimiento de objetos con desplazamiento espacial. Medias ± SEM. Ambos grupos realizan un mismo tiempo de exploración de los objetos, a pesar de que existen diferencias entre las fases. LSD: diferencia entre los grupos (*p≤0,05), y entre las fases (#p≤0,05). Con respecto al índice de discriminación, el ANOVA de medidas repetidas mostró un efecto estadísticamente significativo de la variable “día” entre las diferentes fases (F2, 28 = 3,612; p≤0.05), pero sólo en el grupo EAE (LSD: p≤0,05). Además, se obtuvo un efecto significativo de la interacción (F2, 28 = 2,896; p≤0.05), obteniéndose diferencias significativas entre ambos grupos en la fase de estabilización (LSD: p≤0,05). 19 Figura 18. Índice de discriminación en la fase de recuerdo, en la prueba de reconocimiento de objetos con desplazamiento espacial. Medias ± SEM. LSD: diferencia entre el grupo EAE y control (*p≤0,05), y entre las fases basal, de brote y de estabilización (#p≤0,05). 4.5. Incremento del nivel de ansiedad en el grupo EAE en el laberinto elevado en cruz El ANOVA de medidas repetidas mostró un efecto de tratamiento (F1, 14 = 4,911; p≤0,05), ya que los ratones EAE presentaron un menor índice de ansiedad en el laberinto elevado en cruz durante la fase de brote de la enfermedad, en comparación con el grupo control (LSD: p<0,05). Lo cual, esto significa que los ratones mostraron un aumento del nivel de ansiedad. Además, la variable día tuvo un efecto significativo en ambos grupos (F2, 28 = 12,973: p≤0.05), siendo menor el índice de ansiedad en la fase de brote y de estabilización, en comparación a la fase basal (LSD: p≤0,05) (figura 19.a). Sin embargo, no hubo efecto de interacción entre las variables “tratamiento” y “día” (F2, 28 = 1,239; p≥0.05). En cuestión a la locomoción, El ANOVA de medidas repetidas reveló una disminución en los ratones EAE, en comparación a los controles (F1, 14 = 49,148; p≤0,05), durante la fase de brote y de estabilización (LSD: p≤0,05) (Figura 19.b). La variable “día” mostró un efecto significativo (F2, 28 =19,407; p≤0,05) sólo en el grupo EAE, reduciéndose la locomoción en la fase de brote con respecto a la fase basal y a la fase de estabilización (LSD: p≤0,05). También se observó una interacción estadísticamente significativa (F2, 28 = 18,015; p≤0,05) entre ambas variables. 20 Figura 19. Índice de ansiedad (A) y Distancia total recorrida (locomoción) (B), en el laberinto elevado en cruz. Medias ± SEM. Los ratones EAE muestran una disminución del índice de ansiedad (aumento del nivel de ansiedad) durante la fase de brote, al igual que disminuyen su locomoción en las fases de brote y de estabilización. LSD: diferencia entre el grupo EAE y control (*p≤0,05), y entre las fases basal, de brote y de estabilización (#p≤0,05). 5. DISCUSIÓN El objetivo principal de nuestro trabajo, ha sido estudiar la presencia de alteraciones de tipo exploratorio, cognitivo y emocional en ratones con EAE, un modelo animal de EM. A diferencia de otras investigaciones, en las que se han realizado estudios presintomáticos en ausencia de déficits motores (Acharjee et al, 2013; Dutra et al, 2013; Peruga et al, 2011), nosotros nos hemos centrado en estudiar estos déficits durante estadios más avanzados (i.e. fase de brote, remisión y estabilización). El protocolo de inducción de la EAE empleado en nuestro trabajo, dio como resultado la aparición de un curso remitente-recurrente de la enfermedad, donde se observaron las fases de brote, remisión y estabilización, características de la misma. La enfermedad comienza con una fase presintomática (no analizada en nuestro estudio), acompañada de alteraciones cognitivas y emocionales en ausencia de síntomas motores (Acharjee et al., 2013; Kim et al., 2012; Dutra et al., 2013). Estas alteraciones se asocian con la presencia de infiltraciones de células T (Acharjee et al., 2013; Yang et al., 2013) y con procesos de inflamación periférica (Konsman et al., 2002). A continuación, comienzan a observarse los primeros síntomas clínicos, con la aparición de las alteraciones motoras que caracterizan al primer brote de la enfermedad (fase de brote o también denominada fase temprana), acompañándose de alteraciones cognitivas y emocionales. Esta fase se caracteriza por la presencia de procesos de neuroinflamación, 21 relacionada con una severa disminución de la plasticidad sináptica (Kim et al, 2012, Olechowski et al., 2009; Dutra et al., 2013). Durante la fase de estabilización de la enfermedad (también denominada fase tardía), los ratones presentan una estabilización de los síntomas clínicos y una progresión de las alteraciones cognitivas y emocionales. Esta fase y las alteraciones características, se asocian a procesos de neurodegeneración y desmielinización en el que tienen lugar fenómenos de muerte celular en neuronas, interneuronas y astrocitos, principalmente (Ziehn et al., 2010; Ziehn et al., 2012). De esta manera, diferentes mecanismos median los cambios de comportamiento en cada una de las fases de la enfermedad, asociándose los fenómenos inflamatorios a las alteraciones presentes durante las fases iniciales, y los fenómenos neurodegenerativos a las alteraciones producidas en la fase más tardía. Nuestros resultados indicaron que los ratones con EAE mostraron alteraciones exploratorias, elevados niveles de ansiedad y disfunciones en tareas de memoria espacial de trabajo y a corto plazo, alteraciones que frecuentemente han sido asociadas tanto a la EM (Wallin et al, 2006; Goretti et al, 2014; Tan-Kristanto et al, 2015; Sandry et al, 2014) como a la EAE (Acharjee et al, 2013; Dutra et al, 2013; Peruga et al, 2011). La discapacidad motora se considera el síntoma más evidente y detectable tanto en la EM como en la EAE, en comparación con los síntomas cognitivos y emocionales (Rodrigues et al., 2011). En este sentido, en la prueba de rotarod, nuestros animales mostraron una afectación en la locomoción, tanto durante la fase brote como en la fase tardía de la enfermedad. Estos resultados obtenidos durante la fase tardía, no pudieron ser contrastados con otros trabajos, ya que sólo tuvimos conocimiento de estudios que evaluaban las alteraciones motoras en estadios menos avanzados (Acharjee et al, 2013; Peruga et al, 2011). Sin embargo, en otras investigaciones los ratones EAE no mostraron afectaciones locomotoras durante la fase de brote (Olechowski et al., 2009; Dutra et al, 2013; Olechowski et al., 2013). Cuando se observan déficits locomotores en animales con EAE, debe tenerse en cuenta que la discapacidad motora reflejada en la locomoción, pueda ser confundida o influenciada por otro síntoma como la fatiga, tanto en la prueba de rotarod (Acharjee et al, 2013) como en la de campo abierto (Gould et al, 2009). En ese aspecto, la fatiga física y cognitiva constituyen los síntomas que afectan a un 95% de los pacientes con EM (Paul et al, 1998; Genova et al, 2013). Según DeHann, van der Vliet, Hendriks, Heijnen y Dijkstra (2004), la fatiga física podría tener lugar como consecuencia de la pérdida muscular de los ratones EAE. De este modo, no podemos descartar que las alteraciones motoras descritas en nuestro estudio en los ratones 22 EAE, puedan deberse, o al menos estar influenciadas, por la fatiga física y/o cognitiva. Hasta estos momentos, se carece de estudios sobre la fatiga que nos permitan confirmar o descartar su importancia para explicar nuestros resultados, lo que avala la conveniencia de planificar estudios experimentales que nos permitan conocer en detalle la relación entre la discapacidad motora y la fatiga en los modelos animales de EAE. A pesar de la relevancia de las alteraciones motoras, actualmente el foco de atención en el estudio de la EAE se dirige mucho más a la sintomatología cognitiva y emocional, ya que suelen padecerla el 65% de los pacientes con EM (Centonze et al., 2010; Steinman, 2001). En este sentido, la afectación de la memoria es la característica cognitiva más comúnmente afectada de todas ellas (Rao et al., 1991; Chiaravalloti y DeLuca, 2008). En consonancia con los estudios en pacientes clínicos, en nuestro estudio también hemos observado severas alteraciones de la memoria. En concreto, hemos hallado una clara afectación de la memoria espacial de trabajo evaluada en el laberinto en Y en los ratones EAE, tanto durante la fase brote como durante la fase tardía. Estos resultados, son congruentes con los obtenidos en otros estudios que emplearon la prueba del laberinto acuático de Morris (Kim et al., 2012; Dutra et al., 2013). Con el fin de descartar la posible participación de variables motivacionales relacionadas con la exploración en las alteraciones cognitivas, analizamos el número de entradas realizadas a los brazos del laberinto en Y, como un indicador de la motivación exploratoria (Kleen et al, 2006). Los resultados indicaron que la afectación de la memoria de trabajo no estuvo acompañada de una alteración de la motivación exploratoria inducida por la EAE, ya que ambos grupos presentaron el mismo número de entradas a los brazos del laberinto. Estos resultados indicaron que la alteración cognitiva observada en nuestro estudio, no se debía a la alteración concomitante del estado motivacional, sugiriendo la existencia de una afectación primaria de la memoria de trabajo espacial en los animales con EAE. Por otro lado, estudios recientes realizados en animales con EAE, indican que la memoria de reconocimiento de objetos a corto plazo se encuentra afectada durante la fase de brote (Olechowski et al., 2013), pero no estudian el grado de afectación de la misma en estadios más avanzados de la enfermedad. A diferencia de este trabajo, nosotros hemos estudiado la afectación de la memoria a corto plazo (MCP) en una tarea de desplazamiento de objetos durante la fase temprana y durante la fase de estabilización. En este sentido, nuestros resultados indicaron que la MCP de tipo espacial, no parecía verse afectada durante la fase inicial de brote, pero se encontró seriamente alterada durante la 23 fase de estabilización. Que no hayamos observado alteraciones durante la fase de brote, al contrario de lo obtenido por Olechowski et al (2013), podría deberse a diferencias en las dos tareas. En nuestro caso empleamos una tarea de reconocimiento espacial, y en el trabajo de Olechowski, se hizo uso de una tarea de reconocimiento de objetos. Ambos procesos se asocian a circuitos cerebrales diferentes (Ennaceur et al., 1997; Vogel-Ciernia y Wood, 2014), que podrían hallarse afectados de forma diferencial en la EAE. En apoyo a esta hipótesis, LoPresti (2015) observó en ratones EAE alteraciones de la MCP espacial, empleando un laberinto de cuatro brazos, tanto en la fase inicial de brote como en las fases más tardías. Sin embargo, un efecto inesperado en nuestros resultados, fue la mala ejecución en la tarea de MCP mostrada por los ratones controles, los cuales se igualaron al grupo EAE con un bajo índice de discriminación durante la fase de brote. En ambos grupos se produce una reducción de la exploración total de los objetos, un efecto normal que tiene lugar con la exposición repetida al mismo contexto y a los mismos objetos (Poucet, 1989), siendo mayor la reducción en el grupo EAE. Aunque el diferente grado de exploración de los animales en esta tarea podría dar lugar a mal interpretar los resultados de la MCP, no parece en nuestro experimento que la mala ejecución de ambos grupos, en la tarea de MCP, se deba a déficits exploratorios; ya que de ser así, sería esperable un mayor déficit en los animales EAE que en los controles, debido a su menor grado de exploración de los objetos. Aun cuando no seamos capaces de dar una explicación satisfactoria a estos resultados en la fase de brote, sí parece claro que los ratones EAE presentaron un claro déficit de MCP de tipo espacial durante la fase más tardía de estabilización. No obstante, los ratones EAE durante la fase de estabilización, exploraron preferentemente el objeto no desplazado, indicando la presencia de algún tipo de alteración de memoria espacial a corto plazo. Con respecto a la prueba del laberinto elevado en cruz, durante la fase de brote los ratones con EAE empleados en nuestro estudio, pasaron menos tiempo en los brazos abiertos que los ratones controles (menor índice de ansiedad), indicando que los ratones EAE mostraban unos niveles de ansiedad más elevados. Estos resultados son congruentes con los obtenidos en el estudio de Peruga et al. (2011). Incluso una elevada ansiedad ha sido observada ya antes de aparecer los primeros síntomas, durante la fase pre-sintomática de la enfermedad (Haji et al., 2012; Acharjee et al., 2013). En nuestro estudio, puede observarse que esta elevada ansiedad se mantiene estable incluso durante la fase tardía, si bien es cierto que los animales controles aumentan progresivamente el comportamiento ansioso (reducción del índice de ansiedad), lo que provoca que durante la fase de estabilización no se observen diferencias entre los dos 30 McKay, K. A., Kwan, V., Duggan, T. & Tremlett, H. (2015). 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