Interrelaciones de la sustancia gris periacueductal dorsolateral y la región protuberancial A5 en el control central cardiorrespiratorio

TESIS DOCTORAL “INTERRELACIONES DE LA SUSTANCIA GRIS PERIACUEDUCTAL DORSOLATERAL Y LA REGIÓN PROTUBERANCIAL A5 EN EL CONTROL CENTRAL CARDIORRESPIRATORIO.” Doctorando: Carlos A. Peinado Aragonés FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Málaga, Enero de 2016 AUTOR: Carlos Antonio Peinado Aragonés http://orcid.org/0000-0001-7385-4777 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es A MI HERMANO, A MIS PADRES, A MI MUJER, A MI HIJA. “Ten siempre a Ítaca en tu mente. Llegar allí es tu destino. Más no apresures nunca el viaje. Mejor que dure muchos años y atracar, viejo ya, en la isla, enriquecido de cuanto ganaste en el camino sin aguantar a que Ítaca te enriquezca.” Viaje a Ítaca Konstantinos Petrou Kavafis (1863-1933). Poeta griego. AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Me gustaría expresar mi más profunda gratitud a todas aquellas personas que a lo largo de todo este tiempo han aportado su granito de arena en la realización de esta tesis doctoral, con especial atención: Al Dr. D. Manuel Víctor López González, por su tiempo, por su esfuerzo, por su calidad como persona y la facilidad, naturalidad y sencillez con la que comparte su experiencia y conocimientos. Al Prof. Dr. D. Marc Stefan Dawid-Milner, mi sentido agradecimiento como director de este proyecto. Por inculcarme los valores científicos como investigador y orientarme en cada uno de los pasos que han llevado a la elaboración de esta tesis. Sus destacadas cualidades científicas, docentes y, sobre todo, humanas, especialmente como compañero de trabajo en el laboratorio, han hecho posible que el trabajo fuese realizado en un ambiente cordial, agradable y dinámico, lo cual ha contribuido de manera fundamental en la realización de esta Tesis. Al Prof. Dr. D. Salvador González Barón, mi agradecimiento por la dirección de este trabajo. Por haber puesto a mi disposición desde mi llegada a este Departamento todos los medios necesarios para la realización de esta Tesis, así como su confianza. Por permitir que participara desde el comienzo en labores de investigación y por su disposición siempre abierta a ayudar más allá de lo estrictamente necesario. Me gustaría destacar, además de sus ya probadas cualidades científicas y dilatada experiencia, su faceta humana. Sin ella, este Departamento no sería lo que ha sido y es actualmente. Por último, ÍNDICE 3.4. Fármacos utilizados 87 3.5. Protocolo experimental 89 3.6. Procesamiento histológico 93 3.7. Tratamiento estadístico 95 4. RESULTADOS 97 4.1. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) 97 4.2. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de PBS (phosphate buffer saline) en el Área A5 99 4.3. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Muscimol en el Área A5 111 4.4. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 125 4.5. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de DAP5 en el A5 139 4.6. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de CNQX en el A5 153 4.7. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de MCPG en el A5 167 ÍNDICE 5. DISCUSIÓN 181 5.1. Consideraciones generales 181 5.2. Metodología utilizada 187 5.3. Estimulación de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) 191 5.3.1. Efectos respiratorios y cardiovasculares 191 5.4. Efecto de la microinyección de Muscimol en el Área A5 sobre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 197 5.5. Efecto de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 sobre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 201 5.6. Efecto de la microinyección de DAP5 en el Área A5 sobre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 203 5.7. Efecto de la microinyección de CNQX en el Área A5 sobre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 205 5.8. Efecto de la microinyección de MCPG en el Área A5 sobre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 207 5.9. Hipótesis derivadas de los resultados 209 6. CONCLUSIONES 219 7. BIBLIOGRAFÍA 221 8. APÉNDICE 285 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN - 1 - 1. INTRODUCCIÓN Hace más de un siglo que se demostró que el tronco del encéfalo desempeña un papel esencial en la regulación cardiorrespiratoria. Posteriormente, se demostró también que varias regiones del sistema nervioso central ejercen una gran influencia en la función cardiorrespiratoria. Dentro de estas regiones podemos señalar la protuberancia, mesencéfalo, hipotálamo o la amígdala. Todavía no está totalmente esclarecida la manera en la que estas estructuras interactúan entre sí para coordinar e integrar respuestas cardiorrespiratorias tanto ante estímulos internos como externos. Se ha trabajado con cada una de estas regiones con el objetivo de intentar dilucidar el posible papel que juegan en la regulación cardiorrespiratoria en condiciones normales o ante una determinada situación de estrés. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de dos de estas regiones implicadas en el control cardiorrespiratorio: el mesencéfalo y la protuberancia. Concretamente hemos estudiado la interacción entre dos estructuras dentro de cada región. En el mesencéfalo nos hemos ceñido al estudio de una zona denominada Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) y en la protuberancia hemos estudiado el Área A5 catecolaminérgico (A5). Hemos intentado también aportar nuevos datos sobre su relación funcional y el posible papel del glutamato en dichas interacciones. A continuación, explicaremos brevemente los conocimientos actuales existentes sobre el papel de estas dos estructuras en el control cardiorrespiratorio. Comenzaremos hablando de la SGPdl. Más tarde, estudiaremos el Área A5 para terminar matizando los conocimientos INTRODUCCIÓN - 2 - actuales sobre aspectos morfofuncionales que llevan a plantear la hipótesis de la posible interrelación entre estas dos estructuras. INTRODUCCIÓN - 3 - 1.1. El mesencéfalo. Estructura y funciones El mesencéfalo, también conocido como cerebro medio, se encuentra localizado en la parte más rostral del tallo cerebral, por encima de la protuberancia y por debajo del diencéfalo. En cuanto a su anatomía macroscópica las estructuras que más resaltan a simple vista son los tubérculos cuadrigéminos, con cuatro elevaciones que se encuentran presentes en la vista dorsal. Están dispuestos en pares, también conocidos como colículos. Los colículos superiores se relacionan con la vista, mientras que los colículos inferiores se relacionan con la audición. Dos de las funciones principales del mesencéfalo son las de la vista y la audición gracias a estos colículos superiores e inferiores. También controla parte del movimiento de la cabeza en coordinación con los movimientos oculares, así en caso de que llegue a fallar o no funcione la vía corticoespinal va a corregir o reemplazar a esta vía dependiendo de cual sea el problema, aunque nunca como lo hacía la vía original. En clínica podemos encontrar un elevado número de patologías relacionadas con alguna mal función del mesencéfalo. Posiblemente la más importante entre ellas sea el Parkinson, que se origina por una falta de dopamina en la sustancia negra, que causa problemas de tipo motores que son muy característicos, como el temblor de la mano en reposo, la rigidez de los músculos, y una marcha característica. De esta zona surgen o se desarrollan los pares craneales motor ocular común y troclear, encargados de los movimientos de los ojos. Estos pares se desarrollan principalmente en los colículos superiores y por ende son de mayor tamaño. También aquí se encuentran INTRODUCCIÓN - 4 - las vías encargadas de los procesos de los movimientos del cuello en relación con los movimientos de los ojos y los reflejos de la pupila tanto directos (miosis y midriasis) como el reflejo consensual y, por último, el movimiento de mirada vertical. El colículo inferior está organizado en tres partes: núcleo central, núcleo pericentral y el núcleo externo. El núcleo central es el principal relevo de la audición, para que los sonidos de alta frecuencia se vayan a la parte ventral y los de baja frecuencia a la parte dorsal del núcleo. También se sabe que el núcleo pericentral trabaja en conjunto con el colículo superior ya que sirve para dirigir la atención del sonido, se refiere a la acción que se lleva a cabo al girar al lugar de origen de un sonido que nos llame la atención. La irrigación la lleva a cabo principalmente la arteria basilar por las ramas paramediana, cerebelosa superior y cerebelosa posterior. Esto es de vital importancia debido a que un fallo en ésta, provocaría déficits nutricionales en las células de esta estructura, que pueden causar síndromes e infartos como el síndrome vascular mesencefálico. INTRODUCCIÓN - 5 - CARACTERÍSTICAS ANATÓMICAS CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES Colículos superiores Se denomina pretectum *Brazo conjuntival superior: comunica el colículo superior con el núcleo geniculado lateral Función visual (reciben aferencias desde el tracto óptico, siendo estación de relevo entre este y el núcleo geniculado lateral) Colículos inferiores Varios núcleos: central, pericentral, exterior. *Brazo conjuntival inferior: comunica el colículo inferior con el núcleo geniculado medial Función auditiva (reciben aferencias desde los núcleos cocleares, siendo estación de relevo entre estos y el núcleo geniculado medial) Acueducto mesencefálico Localizado centralmente Comunicación entre el tercer y cuarto ventrículo. Sustancia Gris Periacueductal Alrededor del acueducto Recibe aferencias desde núcleos vegetativos hipotalámicos. Implicada en la modulación del dolor y estrés. Sustancia negra Dorsal a los pedúnculos cerebrales. -pars compacta -pars reticulata Forma parte de los ganglios de la base. Núcleo rojo Dorsal a la sustancia negra. *Tracto rubroespinal. Nace en núcleo rojo cruzando sus axones la línea media y dirigiéndose hasta el nivel torácico de la médula. Centro de relevo de vías reflejas cerebelosas y estriadas. Parte esencial de las vías extrapiramidales corticales. Control del tono muscular. Núcleo III nervio craneal Ventral a la sustancia gris periacueductal, craneal al núcleo del IV nervio craneal y a la altura del colículo superior. *Fascículo del III nervio craneal: las fibras atraviesan el núcleo rojo saliendo por la parte anterior del mesencéfalo, mediales a los pedúnculos cerebrales. Inervación músculos rectos superior-inferior-interno, oblicuo menor y elevador del párpado. Inervación parasimpática pupilar Núcleo del IV nervio craneal Sito en la región ventral de la SGP, en el nivel del colículo inferior. *Fascículo del IV nervio craneal: sigue un curso posterior e inferior al acueducto y se decusa en la parte posterior del mesencéfalo, emergiendo cerca de la línea media dorsal, justo bajo el colículo inferior Inervación músculo oblicuo superior INTRODUCCIÓN - 12 - núcleo accumbens. Las columnas SGPd y SGPv muestran, además, diferentes conexiones con el bulbo dorsomedial ipsilateral y el cerebelo (Sillery y cols., 2005). Estos hallazgos confirman la conectividad tan variada de las diferentes partes de la SGP. En particular, hay proyecciones directas de la corteza auditiva primaria y de la zona 18 (un área cortical visual secundaria en la rata) a la SGPdl pero no a otras subregiones de la SGP (Benzinger y Massopust, 1983; Newman y cols., 1989). También hay una proyección de la zona 18 al colículo superior que está por encima y adyacente a la SGPdl, (Benzinger y Massopust, 1983). Es más, hay una proyección desde el colículo superior a la SGP, que se dirige exclusivamente a la SGPdl. Además existen inputs exclusivamente hacia la SGPdl y no a otras subregiones de la SGP, desde dos núcleos que se sabe que tienen un papel importante en el control de los movimientos oculares como son el núcleo praepositus hypoglossi y el núcleo periparabigeminal (Klop y cols., 2005, 2006). Ambos también proyectan al colículo superior (Klop y cols., 2005, 2006). Klop y cols., (2006) han sugerido que estos inputs permiten que las neuronas de la SGPdl puedan responder a las señales visuales generadas por la presencia de objetos en el campo visual externo en lugar de cambios en las señales visuales causadas sólo por los movimientos del ojo. Consistente con esta hipótesis, las neuronas en la SGPdl se inhiben justo antes y durante los movimientos rápidos de los ojos (movimientos sacádicos) (Kase y cols., 1986). Una de las proyecciones más importantes que recibe la SGPdl proviene de las neuronas del núcleo dorsal premamilar (PMD) en el hipotálamo, en particular su porción ventrolateral (Motta y cols., 2009). Las lesiones en el PMD o el bloqueo de los receptores excitatorios en el PMD reducen en gran medida la respuesta de comportamiento defensivo ya sea a la presencia de un depredador, o al olor de éste (Markham y INTRODUCCIÓN - 13 - cols., 2004; Blanchard y cols., 2005; Do Monte y cols., 2008;. Motta y cols., 2009). La parte ventrolateral del PMD recibe su principal entrada de información desde proyecciones directas desde el núcleo hipotalámico ventromedial, parte dorsomedial (VMH), que a su vez recibe proyecciones desde dos zonas de la amígdala, la parte posteroventral del núcleo medial y la parte posterior de núcleo basomedial (Motta y cols., 2009). La parte posteroventral de la amígdala medial se activa por el olor del depredador (McGregor y cols., 2004), mientras que se cree que la parte posterior del núcleo basomedial es activada más por las señales que indican la presencia de un depredador (Motta y cols., 2009). La parte ventrolateral del PMD también recibe una entrada importante del área hipotalámica anterior (AHA) (Risold y cols., 1994), que junto con el PMD y VMH son parte del sistema que genera la respuesta de defensa desde el hipotálamo medial (Swanson, 2000). También hay una fuerte proyección de una región lateral en lugar circunscrita en el área hipotalámica anterior directamente a la SGPdl (Semenenko y Lumb, 1992). La activación de ésta evoca aumentos de la presión arterial, de flujo sanguínea en las extremidades y de la frecuencia respiratoria, similar a la respuesta cardiovascular asociada a la respuesta de defensa (Lumb y Lovick, 1993). La SGPdl en la rata recibe también proyecciones directas de las neuronas del córtex prefrontal medial (PFC), en particular desde su porción caudodorsal (córtex cingulado anterior y prelímbico caudal) (Floyd y cols., 2000; Gabbott y cols., 2005). Estas regiones corticales también proyectan al núcleo hipotálamico anterior y al VMH (Keay y Bandler, 2001), por lo que también pueden influir indirectamente sobre las neuronas de la SGPdl a través de estas regiones hipotalámicas. Se cree INTRODUCCIÓN - 14 - que el córtex prefrontal medial, incluyendo aquellas subregiones que proyectan hacia la SGPdl, está implicado en el razonamiento cognitivo complejo y la interpretación de los estímulos estresantes (Bandler y cols., 2000). En primates, las regiones corticales que son homólogas a la porción caudodorsal del córtex prefrontal medial son las zonas 10, 25 y 32, y los estudios anatómicos han demostrado que estas áreas son el origen de una proyección densa a la SGPdl (An y cols., 1998; Bandler y cols., 2000). Así mismo, daños en el córtex prefrontal en humanos afectan su capacidad para predecir las consecuencias de las conductas de riesgo, y también reduce las respuestas autónomas que normalmente se asocian con el estrés emocional en los comportamientos de riesgo (Bechara y cols., 1997). En resumen, las conexiones aferentes a la SGPdl surgen de un número de núcleos que reciben entradas relacionadas con las señales visuales, auditivas y olfativas, o de los núcleos que procesan tales señales. Es particularmente sorprendente que, a excepción de la proyección desde la PMDvl, todas estas entradas son exclusivas de la SGPdl. Por el contrario, hay muchas entradas a la SGP desde varias regiones (por ejemplo, núcleo central de la amígdala, el área preóptico medial, campo tegmental pontinomedular, y la médula espinal) que proyectan a todas las subregiones SGP excepto al SGPdl (Bjorkeland y Boivie, 1984; Wiberg y Blomqvist, 1984; Rizvi y cols., 1991, 1992; Herbert y Saper, 1992; Klop y cols., 2005). Es por esto que podemos afirmar que las aferencias a la SGPdl son altamente específicas y distintivas. Del mismo modo, las eferencias de la SGPdl también son altamente específicas y claramente diferentes a las de las otras subregiones de la SGP. Si atendemos a las eferencias más importantes de la SGP, hay fuertes proyecciones hacia la línea media del bulbo raquídeo, médula rostral ventrolateral (que contiene neuronas simpáticas INTRODUCCIÓN - 15 - premotoras (Dampney y cols., 2003; Guyenet, 2006)), así como al grupo respiratorio ventral desde SGPdm, SGPl y SGPvl (Beitz y cols., 1983; Van Bockstaele y cols., 1991; Cowie y Holstege, 1992; Gaytan y Pasaro, 1998). En contraste, la SGPdl no proyecta a ninguna de estas regiones (Beitz y cols., 1983; Van Bockstaele y cols., 1991; Cowie y Holstege, 1992; Gaytan y Pasaro, 1998). Las neuronas de la SGPdl proyectan, sin embargo, al núcleo cuneiforme (Redgrave y cols., 1988; Bernard y cols., 1989). No existe una proyección significativa al núcleo cuneiforme de otras subregiones de la SGP. El segundo objetivo más importante de las proyecciones desde la SGPdl es el complejo parabraquial, específicamente su núcleo superior lateral (Krout y cols., 1998). Aunque también hay proyecciones al complejo parabraquial desde las demás subregiones de la SGP, la SGPdl es la única subregión que proyecta exclusivamente al subnúcleo parabraquial lateral superior (Krout y cols., 1998). Es interesante resaltar que también hay una proyección muy densa desde el núcleo parabraquial lateral superior a la parte núcleo hipotalámico ventro medial (DMH) (Bester y cols., 1997) que, como se mencionó anteriormente, es parte del sistema que produce la respuesta de defensa desde el hipotálamo medial (Swanson, 2000). INTRODUCCIÓN - 16 - 1.2.3. Propiedades químicas de la SGPdl Al igual que sucede con las conexiones anatómicas, las propiedades químicas de la SGPdl son claramente diferentes de las otras subregiones de la SGP. Esto queda patente, sobre todo, en el caso de la NADPH diaforasa o la óxido nítrico sintasa (NOS), marcadores de las neuronas que sintetizan óxido nítrico (Herbert y Saper, 1992; Onstott y cols., 1993; Bandler y Shipley, 1994). Las neuronas de la SGP que contienen NADPH diaforasa se limitan básicamente a la subregión de la SGPdl. Del mismo modo, la enzima acetilcolinesterasa en la SGP también se encuentra sólo en la SGPdl (Illing y Graybiel, 1986). Por contra, la enzima citocromo oxidasa no está presente en la SGPdl pero sí lo está en el resto de subregiones de la SGP (Conti y cols., 1988). Otra característica distintiva de la SGPdl es que contiene una densidad mucho mayor de neuronas y terminales GABA que la SGPdm adyacente y la SGPl (Barbaresi, 2005, 2010). También hay una mayor densidad de receptores ionotrópicos y metabotrópicos de glutamato en la SGPdl en comparación con las otras subregiones de la SGP aunque, en este caso, la diferencia es menos marcada que en el caso de las neuronas y terminales GABA (Albin y cols., 1990; Azkue y cols., 1997). Por último hay que añadir que se describe una densidad muy baja de terminales inmunorreactivos para la dopamina-β-hidroxilasa en la SGPdl y SGPdm en comparación con la SGPl y SGPvl (Herbert y Saper, 1992), lo que indica que estas subregiones no reciben una inervación adrenérgica significativa. INTRODUCCIÓN - 17 - 1.2.4 Funciones de la SGP 1.2.4.1. Respuesta al estrés La SGP es un componente esencial de una red neuronal que se activa en respuesta tanto a estímulos internos (estrés interno) como los dolorosos y amenazas externas, como la presencia de un depredador. Esta red neural incluye varias áreas del córtex prefrontal. Córtex cingulado anterior, amígdala e hipotálamo, que conectan específicamente con las distintas columnas que conforman la SGP. Estas conexiones forman circuitos paralelos que son activados en función de las características de los estímulos recibidos, e inician diferentes respuestas moduladoras, ya sean dolorosas, autonómicas o motoras (Bandler y Shipley, 1994; Bandler y cols., 2000; Keay y Bandler, 2002). Los animales han desarrollado varios tipos de estrategias para defenderse de los diferentes tipos de estímulos que suponen una amenaza o estrés. Según Bandler y cols., (2000) y Keay y Bandler (2001), las estrategias se pueden clasificar como estrategias de afrontamiento activo o pasivo. El comportamiento defensivo activo se caracteriza por un aumento de la actividad somatomotora junto a cambios cardiovasculares y respiratorios que tienen el efecto de aumentar el flujo de sangre y el suministro de oxígeno a los músculos esqueléticos para su activación. Esta respuesta puede ser activada por estímulos de los que se puede huir y, por tanto, que activen la huida o escape del animal, tales como la presencia de un depredador o dolor cutáneo. Por el contrario, el comportamiento defensivo pasivo se caracteriza por disminución de la actividad somatomotora (por ejemplo, quiescencia) acompañado por cambios cardiovasculares apropiados, incluyendo reducción de la presión arterial y la frecuencia cardíaca. Esta respuesta INTRODUCCIÓN - 18 - es provocada por estímulos que son ineludibles, tales como dolor de origen profundo en los músculos o vísceras, o hemorragias (Carrive, 1993; Bandler y cols., 2000; Keay y Bandler, 2001). La microestimulación química de la SGP muestra que las diferentes columnas de la SGP organizan diferentes tipos de respuestas en función del estímulo recibido, ya sea doloroso o de otro tipo (Carrive, 1993; Bandler y Shipley, 1994; Bandler y cols., 2000; Keay y Bandler, 2002; Heinricher y cols., 2009; Nashold y cols., 1969; Keay y Bandler, 2001; Bandler y cols., 2000). La SGPl y SGPdl inician la respuesta de defensa (huída o lucha). Esta respuesta está asociada con taquicardia, hipertensión y redistribución del flujo sanguíneo. Esta respuesta simpatoexcitadora está mediada por el bulbo rostroventrolateral, el cual activa neuronas preganglionares simpáticas que controlan a los efectores cardiovasculares (Bandler y cols., 2000; Keay y Bandler, 2001; Hayward, 2007; de Menezes, 2009). Por el contrario, las neuronas de la SGPvl, inician respuestas simpatoinhibidoras (hipotensión y bradicardia) que están asociadas a inmovilidad e hiporeactividad al entorno. Esta respuesta vasodepresora está mediada por neuronas del bulbo ventromedial y el núcleo del rafe pálido (Vagg y cols., 2008), los cuales inhiben a las neuronas simpatoexcitadoras del bulbo rostroventrolateral. A nivel respiratorio también se producen respuestas específicas en función de si estimulamos la región de la SGGPdl (taquipnea) o de la SGPvl (bradipnea) (Tavares y Lima, 2007). Estas respuestas son mediadas por proyecciones a interneuronas premotoras a nivel de la protuberancia y el núcleo retroambiguo a nivel del bulbo. 1.2.4.2. Modulación del dolor La SGP es un componente esencial en el circuito neuronal implicado en la modulación del dolor. El control que ejerce es dual, INTRODUCCIÓN - 19 - inhibidor o excitador, a nivel de la transmisión nociceptiva del asta dorsal medular y del núcleo del trigémino. Esta red neuronal contiene conexiones a nivel del córtex prefrontal y del córtex cingulado, del hipotálamo, de la amígdala, de la formación reticular protuberancial, del bulbo rostroventrolateral y caudal (Heinricher y cols., 2009; Fields, 2004; Tavares y Lima, 2007) y las neuronas de esta red expresan receptores opioides y de TRPV1 (Fields, 2004; Palazzo y cols., 2010) e intervienen en la analgesia mediante opioides, placebo y acupuntura (Heinricher y cols., 2009; Fields, 2004; Parry y cols., 2008; Valet y cols., 2004; Wager y cols., 2007). El balance entre inhibición o facilitación nociceptiva es dinámico, y puede ser alterado en diferentes estados comportamentales, emocionales y patológicos (Keay y Bandler, 2002; Heinricher y cols., 2009). La estimulación de la SGP produce típicamente analgesia como demostró por primera vez Reynolds en rata (Reynolds, 1969), y posteriormente se confirmó en diferentes especies, incluyendo humanos (Nashold y cols., 1969; Hosobuchi y cols., 1977; Baskin y cols., 1986). Hay varios estudios que demuestran como la estimulación de la SGP inhibe fuertemente la actividad de las neuronas superficiales del asta dorsal medular que conducen la información nociceptiva procedente de fibras tipo C, aunque no afecta o incluso pueden potenciar la nocicepción mediada por fibras tipo A (Heinricher y cols., 2009; Simpson y cols., 2008). El efecto inhibidor sobre la neurotransmisión nociceptiva que tiene la SGP es resultado de una respuesta coordinada de las diferentes columnas que la conforman, y va a depender del tipo de estímulo doloroso recibido (Carrive, 1993; Bandler y Shipley, 1994; Bandler y cols., 2000; Nashold y cols., 1969; Keay y Bandler, 2001; Bandler y cols., 2000). La SGPl y dl producen una respuesta simpatoexcitadora y una analgesia de corta duración ante estímulos también de corta duración a nivel INTRODUCCIÓN - 20 - cutáneo, involucrando neurotransmisión no opioide (Keay y Bandler, 2001; Lumb, 2004; Bandler y cols., 2000). Por el contrario, dolor somático profundo, visceral o superficial repetitivo activa a la SGPvl y produce analgesia de larga duración dependiente de opioides y asociada a inmovilidad y vasodepresión (Keay y Bandler, 2001; Bandler y cols., 2000). La SGP ejerce su función moduladora a nivel de estos circuitos que llevan la información nociceptiva principalmente por su proyección directa sobre el bulbo rostroventrolateral, incluyendo al Rafe Magno y, en parte, por sus conexiones con el Área A5 protuberancial (Behbehani, 1995; Heinricher y cols., 2009; Fields, 2004). El bulbo rostroventrolateral ejerce un control bidireccional sobre el procesamiento nociceptivo, a nivel de 2 tipos celulares. Células que son activadas por opioides e inhiben la nocicepción, y células que son inhibidas por los opioides y promueven las respuestas nociceptivas (Fields, 2004). Así, el balance de la actividad de ambas poblaciones determina el umbral nociceptivo a nivel del asta dorsal medular. 1.2.4.3. Otras funciones La SGP tiene un papel crítico en la vocalización en respuesta a estímulos dolorosos (Jurgens, 2009). Hay estudios que demuestran que la SGPl y SGPvl integran la actividad espiratoria y laríngea necesaria para la generación de la vocalización (Subramanian y cols., 2008). El control voluntario de la vocalización incluye al córtex cingulado, el cual proyecta a la SGP. La SGP presenta conexiones con la formación reticular del bulbo que rodea al núcleo ambiguo, el cual proyecta, a su vez, a motoneuronas del asta ventral medular que controlan la espiración, al propio núcleo ambiguo (controla la fonación) y a los núcleos trigémino, facial e hipogloso INTRODUCCIÓN - 21 - que controlan la articulación. Las lesiones de la SGP producen mutismo tanto en animales como humanos (Jurgens, 2009, Esposito y cols., 1999). La SGP actúa como intermediaria entre la información aferente proveniente de la vejiga y las influencias moduladoras del mesencéfalo que controlan la micción. Normalmente, el vaciamiento de la vejiga implica la coordinación entre el reflejo espinobulbar y el centro de la micción protuberancial (Fowler y cols., 2008). La SGPvl recibe aferencias Aδ desde la vejiga y conduce esta información hasta el centro de la micción protuberancial (Holstege y cols., 2010). Hay estudios tanto en animales como en humanos (Liu y cols., 2004; Fowler y Griffiths, 2010) que demuestran que la SGP se activa tanto durante el llenado como durante el vaciado en la micción. Se ha realizado un modelo de las posibles conexiones funcionales entre la SGP y otros centros nerviosos mesencefálicos durante el control de la micción (Fowler y Griffiths, 2010). Según este modelo el córtex medial prefrontal ejerce una inhibición tónica sobre la SGP durante el almacenamiento de la orina, mientras que la supresión de esta inhibición permitiría a la SGP la activación del centro de la micción protuberancial cuando el sujeto de estudio desea orinar (Fowler y cols., 2008). También se ha descrito una función interesante de la SGPvl en los mecanismos de sueño-vigilia, y en el paso de sueño no-REM a REM (Fuller y cols., 2007; Hsieh y cols., 2011). Se han descrito una serie de neuronas dopaminérgicas dentro de la SGPvl que están activas durante la vigilia y silentes durante el sueño y que poseen una gran cantidad de conexiones con otros centros que modulan la regulación del sueño-vigilia en hipotálamo y protuberancia (Lu y cols., 2006). INTRODUCCIÓN - 28 - disminución en las funciones gastrointestinales y urogenitales. Además, en animales no anestesiados, éstos expresan reacciones emocionales que incluyen la furia o la ira asociadas a los cambios autonómicos y respiratorios que ocurren durante la estimulación de estas áreas de defensa (Mancia y Zanchetti, 1981) o ante un estímulo agudo como un chorro de aire o un ruido fuerte (Schadt y cols., 1998). Estudios realizados por miembros de nuestro grupo de investigación demuestran que la respuesta cardiorrespiratoria a la estimulación del área de Defensa Hipotalámica incluye facilitación del reflejo quimiorreceptor (Silva-Carvalho y cols., 1995), inhibición del reflejo barorreceptor (Coote y cols., 1979; Mifflin y cols., 1988b; Spyer, 1990) y del reflejo laríngeo apneico (Dawid-Milner y cols., 1995) por disfacilitación o inhibición de neuronas del NTS que reciben aferencias excitadoras barorreceptoras periféricas (Mifflin y cols., 1988a,b; Jordan y cols., 1988) mediante la activación de receptores GABAA (Jordan y cols., 1988). Esto implica que la estimulación hipotalámica puede, en condiciones apropiadas, inhibir el reflejo barorreceptor a través del NTS. Asimismo, existen evidencias de que el área de Defensa Hipotalámica establece sinapsis con el bulbo Rostroventrolateral (RVLM) (Hilton y cols., 1983; Hilton y Smith, 1984) que participa, como efector final, en la respuesta cardiorrespiratoria al estrés (Strack y cols., 1989). Hasta hace muy poco se desconocía si la respuesta evocada a la estimulación eléctrica de estas áreas cerebrales que participan en la respuesta de defensa era debida a la activación de somas específicos o a la activación de fibras de paso que tienen su origen fuera del hipotálamo caudal. Una parte de los autores han descrito que mediante la estimulación química con glutamato (Goodchild y cols., 1982), que activa específicamente cuerpos celulares sin afectar fibras de paso que tengan su origen en otros núcleos, el hipotálamo caudal es incapaz de provocar INTRODUCCIÓN - 29 - la misma respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica (Bandler, 1982; Tan y Dampney, 1983; Hilton y Redfern, 1986; Spencer y cols., 1990). Estos autores llegaron a la conclusión de que la respuesta cardiovascular provocada por la estimulación eléctrica del hipotálamo caudal se debe a la activación de fibras de paso originadas en otros núcleos y no a cuerpos celulares localizados dentro del hipotálamo caudal. Sin embargo, hay otros datos que demuestran que la estimulación química de neuronas del hipotálamo caudal provoca las mismas respuestas cardiorrespiratorias provocadas por estimulación eléctrica (DiMicco y cols., 1996; Fontes y cols., 2001; DiMicco y cols., 2002; Horiuchi y cols., 2004; Cao y cols., 2004; McDowall y cols., 2006). Como se puede observar, hace tiempo que la disyuntiva fibras de paso vs somas está en el aire. Esto es debido a distintas causas, aunque las más probables sean las diferencias entre el agente anestésico utilizado, las diferencias en el nivel de anestesia, las concentraciones del neurotransmisor excitador utilizado, el volumen microinyectado del mismo o la zona específica de microinyección (Lipski y cols., 1988). En la actualidad, desde nuestro grupo investigador se han realizado muchos trabajos en los que se han revisitado las conexiones desde regiones hipotalámicas que integran la respuesta de defensa como son el Área Perifornical Hipotalámica, el Núcleo Dorsomedial Hipotalámico y el Hipotálamo Lateral hacia otras zonas protuberanciales implicadas en el control cardiorrespiratorio, como son el Complejo Parabraquial (Dawid-Milner y cols., 1995; Díaz-Casares y cols., 2009, 2012) y el Área A5 (López-González y cols., 2013) demostrando que están implicadas en la respuesta de defensa y parecen presentar como neurotransmisor fundamental el glutamato. INTRODUCCIÓN - 30 - Otras conexiones anatómicas importantes son las que establece el Núcleo Dorsomedial Hipotalámico con el NTS y el RVLM (Fontes y cols., 2001) y el Rafe pálido (Samuels y cols., 2002, 2004; Horiuchi y cols., 2004). Confirmando lo anterior, se han realizado trabajos en los que se demuestra que la activación del aDH, concretamente del Núcleo Dorsomedial Hipotalámico y Región Perifornical Hipotalámica, y de la dlPAG activan receptores serotoninérgicos del tipo 5HT3 además de los GABAa en el NTS sirviendo así como una posible fuente de inhibición de las neuronas barosensibles del NTS (Sévoz-Couche y cols., 2003; Comet y cols., 2004). Hay autores que tienden a pensar que más que la inhibición o disfacilitación de neuronas barorreceptoras del NTS evocadas por estimulación del área de defensa hipotalámica descritas por Spyer, lo que se produce es una modulación o cambio en la sensibilidad del umbral de activación del reflejo barorreceptor y de la actividad del nervio simpático renal. El reflejo no quedaría propiamente inhibido sino que operaría en un rango de sensibilidad mucho más alto (Horiuchi y cols., 2006; McDowall y cols., 2006) La desinhibición del Núcleo Dorsomedial Hipotalámico (DMH) tras la microinyección de bicuculina (antagonista de receptores GABA) produce un aumento en la actividad simpática renal y la presión arterial que ha sido atribuida a la activación de neuronas en el RVLM (Fontes y cols., 2001; Cao y cols., 2004). La administración de bicuculina también produce un aumento de la frecuencia cardiaca, que disminuye entre un 30-50% por la inhibición del Rafe Pálido con muscimol (Samuels y cols., 2002; Zaretsky y cols., 2003; Horiuchi y cols., 2004). Además existen evidencias morfológicas de proyecciones desde el DMH hacia el Rafe Pálido (Samuels y cols., 2004). Los resultados INTRODUCCIÓN - 31 - parecen demostrar que la respuesta cardiovascular presora y taquicardizante evocada desde esta región presentaría dos rutas descendentes, una responsable del aumento de presión arterial, vía RVLM, y otra responsable del aumento de frecuencia cardiaca, vía Rafe Pálido. Actualmente se tiende a pensar que las distintas regiones del hipotálamo tienen funciones sutilmente diferentes en la organización de la reacción de defensa. La estimulación combinada de cuerpos celulares de distintos subnúcleos colabora para una perfecta integración de la respuesta de hipertensión, taquicardia, taquipnea y cambios autonómicos clásicamente descritos para la reacción de defensa. INTRODUCCIÓN - 32 - INTRODUCCIÓN - 33 - 1.3.3. Respuesta de defensa. Papel de la SGPdl Como se ha descrito anteriormente, la SGPdl recibe conexiones desde regiones sensitivas que incluyen información de receptores visuales, auditivos y olfativos, en particular los que pueden informar de una amenaza externa. En consonancia con estas conexiones anatómicas, se ha demostrado que un estímulo auditivo (la aplicación de ultrasonidos), puede accionar el comportamiento defensivo en ratas (Beckett y cols., 1996), como demuestra el aumento de la expresión de c-Fos (un marcador de activación neuronal) en la SGPdl durante la respuesta de defensa (Klein y cols., 2010). Del mismo modo, el olor a gato (sólo entrada olfativa) o la exposición a un gato (entradas visuales, olfativas y auditivas) también provoca un aumento de la expresión de c-Fos en la SGPdl (y en menor medida en la SGPdm) a niveles rostrales e intermedios de la SGP, pero no en un grado significativo en la SGPl y SGPvl a estos niveles (Canteras y Goto, 1999; Dielenberg y cols, 2001; Motta y cols, 2009). Además, estos estímulos también evocan una fuerte expresión de c-Fos en el PMDvl que, como se ha mencionado anteriormente, posee una gran cantidad de conexiones directas con la SGPdl (Motta y cols., 2009). En contraste, los estímulos que son esencialmente físicos, tales como el calor radiante o dolor muscular, evocan aumento de la expresión de c-Fos principalmente en la SGPl o vlSGPvl con poco efecto en la SGPdl (Keay y Bandler, 2001). Por último, los estímulos que tienen componentes tanto físicos como psicológicos (soplo de aire) evocan la expresión de c-Fos en todas las subregiones de la SGP (Furlong y cols., 2009). En consonancia con los resultados descritos anteriormente (olor a gato o la exposición a un gato), las lesiones de la SGP dorsal que incluyen la SGPdl causan una reducción en la respuesta de comportamiento y en la respuesta taquicárdica a estos estímulos, pero no INTRODUCCIÓN - 34 - tiene ningún efecto significativo sobre la respuesta presora (Dielenberg y cols., 2004). Por lo tanto, las neuronas en el SGPdl parecen contribuir a la expresión de algunos pero no todos los componentes de la respuesta cardiovascular y de comportamiento a estos estímulos amenazantes. Otros estudios de comportamiento han demostrado que la activación de los cuerpos celulares, por microinyección de un aminoácido excitatorio, de las neuronas de SGPl y SGPdl en rata, evoca respuestas defensivas de comportamiento (por ejemplo, de parálisis y de huida), pero el umbral para tales efectos es significativamente menor en la SGPdl (Bittencourt y cols., 2004). Una respuesta de comportamiento similar también puede ser evocada desde capas profundas del colículo superior que recubre la SGPdl (Bittencourt y cols., 2005). En ratas anestesiadas, la microinyección del aminoácido excitatorio ácido DL-homocistéico (DLH) en la SGPdl evoca cambios autonómicos y respiratorios que son apropiados para tales comportamientos, es decir, un notable incremento de la actividad nerviosa simpática renal (RSNA) y en la actividad respiratoria (Huang y cols., 2000; Subramanian y cols., 2008; Ligaya y cols., 2010). Ligaya y cols., (2010) también encontró diferentes patrones de respuesta desde la SGPdl en comparación con la SGPdm y SGPl mediante la inyección de cantidades muy pequeñas de DLH (750 pmol en 15 nl). En particular, mientras que los grandes incrementos en la RSNA fueron evocados desde estas tres subregiones de la SGP, el aumento de la actividad respiratoria fue mucho mayor desde la SGPdl. Por otra parte, el aumento de la actividad respiratoria evocada desde la SGPdl se debió principalmente a un aumento en la frecuencia respiratoria, mientras que la evocada desde la SGPl se debió principalmente a un aumento en la INTRODUCCIÓN - 35 - amplitud respiratoria (tal como se mide por las magnitudes de las ráfagas de actividad del nervio frénico). Otra característica interesante de las respuestas evocadas desde la SGPdl es la estrecha correlación entre los aumentos evocados en RSNA y los aumentos evocados en la actividad respiratoria (Ligaya y cols., 2010). El hecho de que poderosas respuestas simpáticas respiratorias y renales puedan ser al mismo tiempo generadas desde la SGPdl es consistente con la opinión de que esta región genera respuestas de comportamiento de defensa, en las que los aumentos simultáneos en la actividad respiratoria y simpática son fisiológicamente ventajosos. No hubo correlación, sin embargo, entre el aumento de la frecuencia cardíaca y el aumento de la actividad respiratoria, lo que refleja el hecho de que los cambios en la frecuencia cardiaca provocada desde la SGPdl son pequeños y variables (Ligaya y cols., 2010). Como se ha mencionado anteriormente, sin embargo, un estudio reciente ha demostrado que una alerta auditiva leve o estímulos visuales en ratas conscientes evocan un marcado aumento en la frecuencia respiratoria, pero tienen poco efecto sobre la frecuencia cardíaca (Kabir y cols., 2010). Estas observaciones apoyan la idea de que los cambios respiratorios y cardíacos provocados por estímulos auditivos o visuales están regulados por vías separadas dentro del cerebro. Como se describió anteriormente, la SGPdl tiene una alta concentración de receptores de GABA y enzimas que sintetizan óxido nítrico, mucho mayor que en otras subregiones de la SGP. La alta concentración de receptores de GABA indica que las neuronas en la SGPdl están sujetas a entradas inhibitorias fuertes. En consonancia con esto, el bloqueo de los receptores de GABA en la SGPdl por microinyección de bicuculina evoca una fuerte respuesta simpática y respiratoria (Ligaya y cols., 2012), lo que indica que las neuronas en la SGPdl que generan estas respuestas reciben entradas INTRODUCCIÓN - 36 - GABAérgicas tónicas. Del mismo modo, el bloqueo de la enzima óxido nítrico sintasa en la SGPdl evoca una respuesta presora (Hall y Behbehani, 1997), lo que indica que el óxido nítrico también tiene un efecto inhibidor tónico. Otro estudio utilizando registros de células completas demuestra que el mecanismo de este efecto se basa en la inhibición de la actividad neuronal en la SGPdl por el óxido nítrico a través de una potenciación de entradas sinápticas GABAérgicas (Xing y cols., 2008). Los estímulos fisiológicos que normalmente regulan la liberación de óxido nítrico en la SGPdl, así como las acciones sobre las neuronas GABAérgicas que no están mediadas por el óxido nítrico, sin embargo, siguen siendo desconocidos. Del mismo modo, no se ha determinado la fuente(s) de las entradas GABAérgicas a la SGPdl. También ha habido algunos estudios que proporcionan información sobre el papel de la SGP en el ser humano en la generación de cambios fisiológicos asociados con el estrés psicológico agudo. En particular, un ataque de pánico inducido por la administración de lactato en pacientes, conocido por estar asociado a un incremento significativo en la actividad simpática y respiratoria (Esler y Kaye, 2000; Sinha y cols., 2000), se ha demostrado que se asocia con un aumento del flujo sanguíneo a través del colículo superior y la región inmediatamente subyacente, que incluiría la SGPdl (Reiman y cols., 1989). En segundo lugar, un estudio de Mobbs y cols., (2007), utilizando imágenes de resonancia magnética funcional mostraron que la actividad en la SGPd se incrementaba en humanos enfrentados a un depredador virtual (mediante simulación por ordenador), y que esta actividad aumentaba con la proximidad de la amenaza. Aunque el estudio de la resolución de estas imágenes cerebrales no fue suficiente para identificar con precisión las subregiones SGP que se activaban, sí demostró que la SGPdl tiene un papel fundamental en la integración de las respuestas al estrés psicológico agudo. En apoyo de esto, estudios recientes han demostrado que la estimulación de la parte INTRODUCCIÓN - 37 - dorsal de la SGP en los seres humanos provoca aumentos en la presión arterial, presumiblemente debido a un aumento en la actividad simpática (Basnayake y cols., 2011, 2012). INTRODUCCIÓN - 44 - región Perifornical del Hipotálamo (PFH), Zona Incerta (ZI), Sustancia Gris Periacueductal (SGP), complejo Parabraquial (cPB), Locus Coerouleus (LC), núcleo Sensorial Principal del Trigémino (PrV), complejo Trigeminal Espinal (SpV), complejo Vestibular (VC), zonas intermedia y caudal del núcleo del Tracto Solitario (NTS), zona caudal ventral de la Formación Reticular (RF), Rafe Oscuro, línea media dorsal del bulbo y zona contralateral protuberancial de la formación reticular parvicelular. Evidentemente, unas zonas proyectan con más densidad que otras. Destacan por su densidad las profusas proyecciones desde las zonas intermedia y caudal del NTS, del complejo Parabraquial (principalmente desde la región lateral (lPB) y Kölliker-Fuse (KF) y con menor intensidad de la región medial), de la región Perifornical Hipotalámica (PFH) y del núcleo Paraventricular Hipotalámico (nPVH) (en mayor medida de la parte posterior de la subdivisión lateral parvicelular). Todas estas zonas están involucradas en el control cardiorrespiratorio. Esta relación morfológica parece corroborar el posible rol del Área A5 en el control y la modulación de la actividad central cardiorrespiratoria. El resto de zonas que envían proyecciones al Área A5 lo hacen de forma difusa o débil siendo, por tanto, su influencia mucho menor. Estudios posteriores han completado la lista de conexiones aferentes al Área A5. Caben destacar las conexiones desde la Sustancia Gris Periacueductal ventrolateral (SGPvl) (Bajic y Proudfit, 1999, 2012), desde las neuronas de la Lamina I de la médula espinal (Westlund y Craig, 1996); desde el bulbo, más concretamente desde el Bulbo Caudal Ventrolateral (CVLM) (Tavares y cols., 1996 y 1997; Cobos y cols., 2003) y desde las neuronas C1 del Bulbo Rostral Ventrolateral (RVLM) (Card y cols., 2006; Abbot y cols., 2012) y desde una nueva región descrita hace muy poco tiempo llamada Área Presora Caudal del Bulbo Caudal Ventrolateral (CPA) (Sun y Panneton, 2002, 2005, 2006; Natarajan y INTRODUCCIÓN - 45 - Morrison, 2000; Horiuchi y Dampney, 2002). Tanto la Lámina I como la región del Bulbo Caudal Ventrolateral tienen un papel preponderante en la integración de respuestas nociceptivas lo que añade un nuevo papel a la funcionalidad del Área A5. También se han descrito conexiones aferentes desde el Núcleo Retrotrapezoidal (Rosin y cols., 2006) y desde el Grupo Respiratorio Ventral (Dobbins y Feldman, 1994; Gaytan y cols., 1997, 2002). Así como aferencias trigeminales desde la cavidad nasal (Caous y cols., 2001; Panneton y cols., 2000). 1.4.2.2. Conexiones eferentes Los estudios de Byrum y Guyenet en 1987 demuestran que, al menos, el 92% de las neuronas noradrenérgicas del Área A5 proyectan sus axones a la médula espinal, principalmente a las neuronas preganglionares simpáticas de la columna Intermedio Lateral de la médula espinal (cIML). Concretamente a la lámina X y al área autónoma central. Esta proyección al cIML confirma definitivamente lo que ya se había descrito anteriormente por Blessing y cols., 1981; Westlund y cols., 1984; Byrum y cols., 1984; Loewy y cols., 1979, 1986 y posteriormente por Strack y cols., 1989; Kwiat y Basbaum, 1990; Huangfu y cols., 1991; Clark y Proudfit, 1993; Bajic y Proudfit, 1999; Bruinstroop y cols., 2011. Clark y Proudfit en 1993 demuestran que esta proyección espinal viaja por el funículo dorsolateral hacia los segmentos cervical, torácico y lumbar de la cIML, y que sus axones además de terminar en la lámina X, también lo hacen ipsilateralmente en las láminas IV, V y VI del asta dorsal y la lámina VII de la zona intermedia. Este dato añade a la conocida función cardiorrespiratoria del Área A5 una posible participación en la modulación nociceptiva, corroborando el trabajo realizado anteriormente por Burnett y Gebhart en 1991. Otros trabajos que confirman esta posibilidad son los del grupo de Tavares, Lima, Cobos y Teixeira (1996, INTRODUCCIÓN - 46 - 1997, 2002, 2003) que demuestran la existencia de conexiones recíprocas desde el Área A5 hacia una zona lateral del Bulbo Caudal Ventrolateral (VLMlat) y las conexiones recíprocas de ambas zonas con la Lámina I y, por tanto, su posible rol en la modulación nociceptiva. Con respecto a las neuronas descritas por Goodchild y Pilowsky (2001) que son inmunoreactivas a DβH pero no a TH y aaDC, no se conocen cuáles son sus proyecciones específicas, pero se sabe que no lo hacen ni a la RVLM ni a otros núcleos de la médula espinal como la columna intermediolateral (cIML). Se han descrito algunas conexiones desde el Área A5 al grupo respiratorio ventral usando las mismas técnicas descritas anteriormente (Smith y cols., 1988; Nuñez-Abades cols., 1993). Además de la densa proyección a las neuronas preganglionares simpáticas (92%), Byrum y Guyenet, 1987 describen conexiones hacia importantes núcleos de regiones mesencefálicas, protuberanciales y bulbares. Destacan las conexiones eferentes a la zona bulbar, concretamente a la mitad caudal del NTS y al núcleo Dorsal Motor del Vago, ambos de manera bilateral. Demuestran también que la inervación es completamente noradrenérgica y, además, que más de la mitad de las neuronas del Área A5 proyectan ipsilateralmente a ambos núcleos, incluso en algunos casos de manera bilateral. Otra proyección eferente muy importante es la que existe con la región del complejo Parabraquial. Más concretamente hacia el núcleo Parabraquial Lateral (lPB) y al núcleo Kölliker-Fuse (KF). También existen importantes conexiones con la zona mesencefálica a nivel de la Sustancia Gris Periacueductal ventral y lateral. Si seguimos la línea ascendente, este estudio muestra que, al menos, la tercera parte de las neuronas del Área A5 proyectan INTRODUCCIÓN - 47 - bilateralmente al Hipotálamo o a regiones superiores, con una proporción bastante alta de conexiones que continúan hasta niveles tuberales. En el hipotálamo, una quinta parte de las neuronas del Área A5 proyectan a la Región Perifornical de manera bilateral. Esta zona parece ser una de las zonas diana de los axones de las neuronas del Área A5 junto con el núcleo Paraventricular Hipotalámico. También se observan conexiones con el Núcleo Dorsomedial Hipotalámico y el núcleo Paraventricular del Tálamo. Otra región eferente diana para las neuronas del Área A5 parece ser el núcleo Central de la Amígdala (esta proyección se recoge también en el estudio de Usunoff y cols., 2006) ya que, al menos, la quinta parte de las neuronas del Área A5 proyectan de manera bilateral a la zona, junto a ella también presenta conexiones con el núcleo del lecho de la estría terminal. En trabajos más actuales, Bruinstroop y cols., 2012, se han vuelto a revisitar, describir y actualizar las conexiones eferentes del Área A5 hacia la zona dorsal y ventral de la médula espinal, a nivel cervical y lumbosacro (dispersas) y de la columna intermediolateral torácica (más densas), sobre todo a nivel de las neuronas preganglionares simpáticas. También se han descrito conexiones eferentes desde el Área A5 al núcleo Retrotrapezoidal (RTN) (Rosin y cols., 2006), donde actualmente se supone que se ubican quimiorreceptores centrales (Nattie y Li, 2006). En otro trabajo, Kubin y Rukhadze (2007) han descrito que el núcleo Motor del Hipogloso y el núcleo viscerosensorial del Núcleo del Tracto Solitario reciben conexiones eferentes desde el Área A5 en una proporción de un 46% y 43 % respectivamente, del total de las proyecciones catecolaminérgicas que reciben, indicando esto que el Área A5 puede jugar un papel importante en la modulación del flujo motor y de la transmisión viscerosensorial. INTRODUCCIÓN - 48 - En resumen, el Área A5 catecolaminérgica pontina proyecta de una manera muy amplia a muchas estructuras del sistema nervioso central subcortical implicadas en la modulación autónoma. Todo este entramado de conexiones permite establecer claramente el posible rol de esta región tanto en el control cardiorrespiratorio como en su posible papel en la modulación nociceptiva. INTRODUCCIÓN - 49 - 1.4.3. Función del Área A5 en el control cardiorrespiratorio 1.4.3.1. Papel del Área A5 en el control cardiovascular Históricamente ha habido una gran controversia acerca del posible papel en la regulación cardiovascular del Área A5. Los diferentes autores se han decantado por dos funciones completamente antagónicas: función simpatoexcitadora o función simpatoinhibidora. En algunos casos se han producido circunstancias dicotómicas, ya que la estimulación química ha provocado disminución de presión arterial y bradicardia, por lo que hablaríamos de simpatoinhibición (Neil, 1982; Close, 1982); mientras que la estimulación eléctrica ha sido simpatoexcitadora (aunque hay casos en los que incluso ha resultado cardioinhibidora, como en el caso de Drye, 1990). En estudios más recientes, los autores se decantan principalmente por la actividad simpatoexcitadora de la zona, ya que la estimulación eléctrica (Close, 1982; Loewy, 1979; Neil, 1982) y química (glutamato) del Área A5 se caracteriza por un incremento de la presión arterial y la frecuencia cardiaca (Dawid-Milner MS y cols., 2001; Dawid-Milner MS y cols., 2003) asociado a una respuesta de facilitación espiratoria con bradipnea y aumento de la presión subglótica (Lara JP y cols., 2002). Además, la respuesta a la microestimulación química con glutamato es muy similar a la producida en el núcleo Parabraquial medial tras la estimulación con el mismo neurotransmisor. Sugiriendo, por tanto, una posible relación funcional entre ambos. La microestimulación química de los somas del Área A5 produce también un aumento de la actividad nerviosa simpática renal y esplácnica. Este efecto es abolido por la destrucción selectiva de células catecolaminérgicas del Área A5 producido por la microinyección de 6-OHDA (Huangfu 1991, 1992; INTRODUCCIÓN - 50 - Koshiya y Guyenet, 1994). El Área A5, su estimulación, también modifica la lagrimación y la salivación (Toth y cols., 1999). Los registros neuronales unitarios realizados en las células putativas de esta región pontina confirman el papel simpatoexcitador de estas neuronas (Huangfu y cols., 1991; Guyenet y cols., 1993; Koshiya y Guyenet 1994; López-González y cols., 2013). En estos estudios se observa que la actividad de las neuronas del Área A5 está fuertemente influenciada por inputs aferentes de control cardiorrespiratorio, como el que llega desde los barorreceptores arteriales y los provenientes de los quimiorreceptores periféricos, así como desde el Área de Defensa Hipotalámica. Las neuronas del Área A5 correlacionan su descarga con la descarga simpática. La descarga del nervio espláncnico simpático se precede por un potencial de acción de las neuronas del Área A5 en unos 69 ms (Koshiya y Guyenet, 1994). Este dato es otra prueba a favor del papel simpatoexcitador de este grupo neuronal. El 63% de las neuronas registradas son inhibidas por el aumento de presión arterial concomitante a la inyección de adrenalina o al estímulo barorreceptor por constricción aórtica. Independientemente del modelo de activación barorreceptora, la inhibición se produce en un rango de presión arterial que abarca desde los 80 a los 140 mmHg. Asimismo, durante la disminución de presión arterial evocada por la estimulación del reflejo Von Bezold-Jarisch, en el cual se provoca la activación de receptores cardiopulmonares mediante la administración intravenosa de fenilbiguanida (agonista serotonérgico), se produce una disminución de la descarga nerviosa simpática. Acompañando a esta disminución de la actividad nerviosa espláncnica, las neuronas del Área INTRODUCCIÓN - 51 - A5 noradrenérgicas responden con un aumento brusco de su descarga, confirmando así su rol simpatoexcitador. Las neuronas del Área A5 juegan un papel importante en el aumento de la presión arterial evocado por la estimulación de los quimiorreceptores. Durante breves periodos de anoxia (10 s) o hipoxia (aplicando O2 al 12%) aumentan su frecuencia de descarga basal al mismo tiempo que la presión arterial y la actividad del nervio frénico. Este efecto no se observa en ratas en las que se han bloqueado los quimiorreceptores carotídeos. El mismo resultado aparece en animales durante hipercapnia (5-8% de CO2). El aumento de CO2 incrementa significativamente la actividad de las neuronas del Área A5 en animales con los quimiorreceptores periféricos intactos. La respuesta desaparece cuando se denervan estos quimiorreceptores. Otro dato que confirma el importante papel de estas neuronas en el reflejo quimiorreceptor es que la microinyección de muscimol (agonista gabaérgico) en el Área A5 disminuye hasta en un 85% la magnitud de este reflejo sin variar otras variables cardiorrespiratorias. Toda esta serie de datos nos permiten concluir que las neuronas del Área A5 poseen una función claramente simpatoexcitadora. En las últimas revisiones realizadas sobre el control simpático del sistema cardiovascular y de los mecanismos de integración de los reflejos barorreceptor y quimiorreceptor y de las vías centrales que los soportan tanto en animales conscientes (Dampney y Horiuchi, 2003; Dampney y cols., 2003) como anestesiados (Pilowsky y Goodchild, 2002; Guyenet, 2006; Kanbar y cols., 2011; López-González y cols., 2013), los distintos autores coinciden en otorgar un papel relevante al Área A5 en el control simpatoexcitador. INTRODUCCIÓN - 52 - Concretamente, en uno de los últimos trabajos publicados por nuestro grupo de investigación (López-González MV y cols., 2013), se pone de manifiesto esta actividad simpatoexcitadora al demostrarse la participación del Área A5 en la respuesta de defensa evocada desde el Área de Defensa Hipotalámica. En este trabajo nuestro grupo demuestra, por primera vez, mediante técnicas electrofisiológicas, neuroanatómicas y neurofarmacológicas la existencia de conexiones funcionales entre las dos zonas. Parece ser que el Área A5 es funcionalmente necesaria para que se produzcan los cambios autonómicos necesarios, entre ellos la inhibición del reflejo baroreceptor, durante la activación de la respuesta de defensa desde esta zona. Sin esta inhibición, no se podría obtener el aumento de frecuencia cardiaca y presión arterial necesarios para el correcto desarrollo de la respuesta de defensa del animal. Se sugiere que esta participación del Área A5 en la respuesta de defensa está mediada por las conexiones aferentes desde el Área de Defensa Hipotalámica y desde el Complejo Parabraquial hacia este núcleo, y las propias eferentes del Área A5 hasta las zonas bulbares y espinales implicadas en esta respuesta. Éstas serían las que posee con el Bulbo rostroventrolateral y caudoventrolateral y el Núcleo del Tracto Solitario y con la columna intermediolateral medular. 1.4.3.2. Papel del Área A5 en el control respiratorio Hay pocos estudios que hayan intentado dilucidar la función respiratoria del Área A5. Siempre que se ha estudiado la zona de la protuberancia ventrolateral ha sido de forma superficial y la mayoría de las veces como complemento al estudio de la actividad cardiovascular. Si echamos la vista atrás en el tiempo, ya en el año 1923, Lumsden y cols. hacían referencia al posible papel de la protuberancia en el control respiratorio utilizando técnicas de transección nerviosa bulbo- INTRODUCCIÓN - 53 - protuberancial. En un estudio que se ha convertido en un clásico, este autor demostró que existían ciertas estructuras pontinas, llamadas centros pneumotáxicos, que estaban implicados en el mantenimiento del patrón respiratorio normal en gatos adultos anestesiados y vagotomizados. Es más, la transección protuberancial media, eliminando eferencias de la protuberancia rostral, producía un patrón concreto llamado “apneústico”, caracterizado por inspiraciones largas y sostenidas interrumpidas por espiraciones cortas. Este patrón no sólo requería la ausencia de determinadas estructuras pontinas sino también vagotomía y anestesia. (Stella, 1938; St John y cols., 1972). Estimulaciones eléctricas, lesiones electrolíticas y registros neuronales han localizado los centros pneumotáxicos clásicamente en el núcleo Parabraquial Medial y en el núcleo KöllikerFuse (Bertrand y cols., 1971, 1973, 1974; Vibert y cols., 1976). Además, se sabe que las neuronas con control respiratorio de esos núcleos ejercen su función por medio de glutamato actuando en receptores NMDA de células diana ya que se puede producir apneusis bloqueando estos receptores (Foutz y cols., 1988; Borday y cols., 1998). En 1973 Bolme y Fuxe, al producir apneusis inhibiendo el Locus Coeruleus, introdujeron la posibilidad de que fueran las neuronas centrales noradrenérgicas las que pudieran producir este tipo de patrón respiratorio derivado del centro pneumotáxico. Incluso se ha hipotetizado a lo largo de los años con la posibilidad de que en realidad estos centros no existan en la rata ya que las dosis de antagonistas de NMDA que se debían usar no eran ni mucho menos comparables con aquéllas que eran eficientes en gatos (Monteau y cols., 1990). Recientemente se ha contemplado la posibilidad de que haya otros centros nerviosos implicados. Las lesiones químicas producidas en regiones de la protuberancia ventrolateral, incluyendo el Área A5, inducen un patrón de INTRODUCCIÓN - 60 - colaterales a la zona lateral del bulbo caudal ventrolateral (Tavares y cols., 1997). Como la noradrenalina y la clonidina inhiben a las neuronas de esta región bulbar produciendo hiperalgesia, es posible que la conexión entre esta zona y el Área A5 sea el sustrato anatómico para un circuito de feedback negativo que medie la inhibición del bulbo lateral ventrolateral disminuyendo la sensibilidad al dolor. Otros autores (Westlund y Craig, 1996; Wilson y cols., 2002) añaden que el Área A5 y la CVLMlat pueden ser importantes en la homeostasis. Por tanto, se puede decir que las neuronas de la zona caudal del bulbo ventrolateral poseen dos funciones: la primera, vasodepresora, ejercida a través de proyecciones inhibidoras al bulbo rostral ventrolateral, y una segunda función antinociceptiva que realizan a través de la ruta espinal noradrenérgica establecida con el Área A5. La primera ruta parece ser inhibidora y la segunda parece ser excitadora, por lo que podrían ser realizadas por grupos de neuronas diferentes. Otros datos que confirman el posible papel del Área A5 en el control nociceptivo son los de Cucchiaro y Commons, (2003) en los que demuestran que las neuronas del Área A5 poseen el receptor de acetilcolina (α4β2) el cual está implicado en los efectos analgésicos de derivados de la epibatidina como son el A-85380 y el ABT-594. Se comprobó que la subunidad α4 es la realmente importante a la hora de modular la acción analgésica de estas sustancias. Estos autores demuestran que la administración sistémica de epibatidina aumenta de manera muy significativa la expresión de c-Fos en las neuronas del Área A5 (además de en otros núcleos implicados en nocicepción), lo que indica que los efectos analgésicos de esta sustancia pueden estar mediados por su acción sobre la subunidad α4 en estos núcleos. INTRODUCCIÓN - 61 - En trabajos actuales, Bajic y Proudfit, 2012, demuestran una conexión anatómica monosináptica entre la SGPvl y las neuronas del Área A5 (tanto las noradrenérgicas como las que no lo son). Se describen 3 acciones principales sobre esta zona: 1) conexiones excitadoras postsinápticas, sobre neuronas de la zona rostral del Área A5 que incluirían glutamato y sustancia P como neurotransmisores, 2) conexiones inhibidoras postsinápticas, sobre neuronas de las zonas rostral y caudal del área A5, mediante los neurotransmisores GABA y encefalina, que actuarían tanto en interneuronas como en neuronas propias de la zona y 3) Una acción inhibidora a nivel presináptico, sobre terminales neuronales excitadores que llegan al Área A5, sobre todo que contactan con neuronas no catecolaminérgicas, desde otras regiones. Por tanto, sería una función moduladora de la excitabilidad de esta zona. La estimulación tanto eléctrica (Fang and Proudfit, 1996, 1998) como química (Yaksh, 1979; Jensen and Yaksh, 1984, 1986) de la SGPvl produce una potente simpatoinhibición y antinocicepción. Se sabe que esta función antinociceptiva es mediada, en su mayor parte, por neuronas noradrenérgicas que proyectan al asta dorsal de la médula espinal, donde entran en contacto con los inputs nociceptivos. Por tanto, los autores piensan que esta conexión monosináptica entre ambas áreas es básica para la función antinociceptiva, corroborando por tanto los estudios anteriormente citados. INTRODUCCIÓN - 62 - INTRODUCCIÓN - 63 - 1.4.5. Aspectos Fisiopatológicos del Área A5 Se ha analizado la cascada de genes que participan en la diferenciación de las neuronas noradrenérgicas del Área A5 durante el desarrollo del sistema nervioso central. Los genes más estudiados son: Rnx, Phox2a, Phox2b y Ret. Se sabe que mutaciones de alguno de ellos en ratones, no permiten un desarrollo del animal más allá de P1-P2. El corto periodo de vida de estos ratones se produce por una disfunción respiratoria fatal por déficit del efecto de la noradrenalina endógena sobre la maduración prenatal del Generador Central Respiratorio (GCR) (Blanchi y Sieweke, 2005). Los estudios respiratorios “in vivo” de ratones mutantes para estos genes y los análisis “in vitro” de la actividad del GCR revelan que es necesario el desarrollo correcto de los grupos noradrenérgicos troncoencefálicos para una actividad respiratoria normal y, por tanto, para la supervivencia del animal. Las alteraciones genéticas o epigenéticas de la maduración del sistema noradrenérgico durante el periodo perinatal pueden afectar a la maduración del GCR y, por tanto, tener drásticas consecuencias en la supervivencia postnatal. De hecho, el Síndrome de Muerte Súbita Infantil que es la causa principal de muerte en bebés de países industrializados, puede ser debido a desórdenes neurovegetativos, sobretodo a disfunciones cardiorrespiratorias durante el sueño (Horne y cols., 2004; Ribas-Salgueiro y cols., 2004). En el análisis postmortem de las víctimas de este síndrome se observa que, habitualmente, existen alteraciones en el sistema noradrenérgico en el tronco del encéfalo, con niveles anormales de metabolitos noradrenérgicos, morfología anormal de las neuronas noradrenérgicas y expresión anormal de receptores adrenales α2 y expresión anormal de enzimas catecolaminérgicos (Obonai y cols., INTRODUCCIÓN - 64 - 1998; Cann-Moisan y cols., 1999; Ozawa y cols., 1999, 2003) y presentan frecuentes mutaciones en genes implicados en la especificación del fenotipo noradrenérgico en genes tales como Phox2a, Ret y Rnx (WeeseMayer y cols., 2004). Existe otra enfermedad, el Síndrome de Hipoventilación Central Congénita (mal de Ondine) que es un desorden muy raro caracterizado por un fallo idiopático del control autonómico respiratorio (Sasaki y cols., 2003; Gaultier y cols., 2004). En estos pacientes se ha hallado la mutación heterocigota para el gen Phox2b, que induciría déficits en el sistema noradrenérgico. Estos síndromes junto a las apneas centrales o las apneas obstructivas del sueño pueden inducir una hipoxia crónica. Otros estudios actuales se han centrado en el posible papel de los factores de crecimiento, más concretamente BDNF y GDNF, en el desarrollo de la red neuronal del tronco del encéfalo responsable de la función respiratoria. Estos estudios han identificado al Área A5 como una posible diana de estos factores (Katz, 2003 y 2005; Guo y cols., 2005; Huang y cols., 2005). De manera específica se sabe que ratones Knockout null para los genes de BDNF y GDNF pierden el 44% y el 37% de las neuronas TH en el Área A5 respectivamente. También se ha visto en cultivos de células del Área A5 que BDNF y DNF exógenos aumentan las ramificaciones de las neuronas TH del Área A5 sin afectar al número de neuronas o la proliferación de las células TH, sugiriendo que estos factores son vitales en la proliferación más que en la supervivencia de las neuronas del Área A5 y que pueden actuar como cofactor uno del otro regulando esta diferenciación. Si tomamos en conjunto todos estos datos podemos afirmar que el Área A5 es un lugar donde una disrupción de las señales de BDNF y GDNF pueden desordenar el desarrollo de los inputs que manda al INTRODUCCIÓN - 65 - generador del patrón respiratorio bulbar, por lo que tendría unas potenciales implicaciones clínicas ya que la posibilidad de una malformación en este desarrollo noradrenérgico a nivel protuberancial podría contribuir a los fenotipos respiratorios asociados con mutaciones en GDNF o en su receptor RET, como en los casos del Síndrome de Hipoventilación Central Congénita (mal de Ondine) en humanos (Sasaki y cols., 2003). De manera similar el Área A5 podría estar implicada en el mal funcionamiento de el gen responsable del Síndrome de RETT o disrupción respiratoria durante la vigilia (Julu y cols., 2001), que es el MeCP2 (Amir y cols., 1999; Chen y cols., 2001; Guy y cols., 2001), que es un regulador transcripcional represor de BDNF (Chen y cols., 2003; Martinowich y cols., 2003). La delección de este gen en ratones desacopla la expresión de BDNF de su fina regulación por parte de la actividad neuronal (Chen y cols., 2003). Sin embargo no se conoce cómo la desregulación de BDNF puede dar lugar a la patología característica del Síndrome de RETT. Un resumen de los efectos que causan estas mutaciones lo vuelve a hacer Hilaire en su revisión del 2006: 1) en mutantes Rnx se observa que la formación de la mayoría de las neuronas noradrenérgicas está drásticamente comprometida, menos las neuronas del A6 que son parcialmente preservadas. En ella la frecuencia respiratoria es anormalmente alta al nacer, con ciclos respiratorios de muy alta variabilidad de duración y con frecuentes paradas respiratorias (Shirasawa y cols., 2000). Esto se explicaría por la falta de los grupos neuronales de A5, A1/C1 y A2/C2 durante la gestación. La pérdida de la inhibición del Área A5 sobre el Generador del Ritmo Respiratorio haría aumentar la frecuencia respiratoria, potenciada por la activación de las neuronas del A6. Además la falta de la facilitación INTRODUCCIÓN - 66 - realizada por las neuronas A1/C1 junto con la estabilización de las neuronas A2/C2 hacen que el ciclo respiratorio se haga irregular. 2) en mutantes Phox2a se preserva la formación de la mayoría de las neuronas noradrenérgicas excepto las del A6. Esto genera una respiración alterada de los fetos obtenidos por cesárea en el día gestacional número 18 (Viemari y cols., 2004), con un ritmo in vitro anormalmente bajo. Esto se explicaría por la falta de activación que tendrían los receptores α1, lo que conlleva una preponderancia de la activación que llega a los receptores α2 por parte del Área A5, disminuyendo la frecuencia respiratoria. 3) en mutantes Ret, la formación tanto del Área A5 como del A6 está alterada, sin alterar a los grupos noradrenérgicos bulbares (Viemari y cols., 2005). El análisis respiratorio de los fetos E18 nos da una tendencia a una frecuencia respiratoria más baja de lo normal, pero no estadísticamente significativa. En cambio, registros in vitro confirman el déficit respiratorio produciendo disminución de frecuencia respiratoria. 4) en mutantes Mecp2 se observa también que la delección de este gen también produce déficit en el contenido en noradrenalina y de la respiración (Viemari cols., 2005). Produciendo anormalidades en el ciclo respiratorio tanto en su duración como en la reducción de frecuencia respiratoria, consecuentes con déficit en los grupos A1/C1 y A2/C2. 5) en mutantes BDNF está deteriorada la expresión normal del comportamiento respiratorio al nacer (Erickson y cols., 1996). Estudios in vitro e in vivo muestran un ritmo respiratorio muy variable y deprimido durante el periodo postnatal. Además BDNF es necesario para la supervivencia postnatal de neuronas dopaminérgicas primarias, su inactivación puede alterar neuronas quimiorreceptoras aferentes INTRODUCCIÓN - 67 - periféricas y la respuesta respiratoria a la hipoxia (Erickson y cols., 2001), así como la facilitación a largo plazo de la respiración por hipoxia intermitente (Baker-Herman y cols., 2004). 6) en mutantes Phox2b el mutante homocigoto para el gen tiene comprometida la supervivencia de todos los grupos neuronales noradrenérgicos, pero el heterocigoto puede sobrevivir. Poseen frecuentes apneas durante el sueño pero una respiración normal mientras están despiertos (Durand y cols., 2005). La mutación heterocigota para este gen se ha hallado en muchos pacientes con el mal de Ondine. También se ha descrito que el estrés durante el periodo perinatal y neonatal puede afectar a la programación de expresión establecida para ciertos neurotransmisores y sus receptores, entre ellos la noradrenalina (Herlenius y Lagercrantz, 2004). Así, a parte de los factores genéticos, los factores epigenéticos también juegan un papel principal en el desarrollo del sistema noradrenérgico cuya alteración puede causar alteraciones respiratorias e hipoxia. Esto último puede afectar a la maduración y función de todas las neuronas cerebrales y sus circuitos funcionales, con consecuencias deletéreas en el sueño, memoria, comportamiento, etc. Queda patente, por tanto, que es necesario un desarrollo normal en el sistema noradrenérgico para asegurar un correcto desarrollo del sistema respiratorio durante el periodo perinatal y para una vida normal posterior. En otro trabajo muy interesante (Benarroch y cols., 2008), se ha descrito que en pacientes diagnosticados con atrofia multisistémica se produce una pérdida severa de neuronas noradrenérgicas a nivel del Locus Cerúleus y del Área A5. Estos autores sugieren que la pérdida de este tipo de neuronas contribuye al desarrollo de este tipo de enfermedad, más concretamente, a los síntomas cardiorrespiratorios asociados a las funciones ya descritas de estas zonas. INTRODUCCIÓN - 68 - OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS - 72 - MATERIAL Y MÉTODOS - 73 - 3.2. Preparación quirúrgica Anestesia del animal El anestésico empleado fue pentobarbital sódico (Penthotal) a una dosis de 60 mg/Kg de peso, administrado por vía intraperitoneal. El nivel de anestesia se valoró por ausencia de alteraciones de la presión arterial y de la frecuencia cardiaca o respiratoria durante el pinzamiento de las extremidades posteriores. Siempre que fue necesario, se administraron dosis suplementarias de pentobarbital sódico, 2 mg/Kg por vía intravenosa, para mantener el nivel de anestesia. Se rasuraron con esquiladora eléctrica las zonas siguientes: triángulo de Scarpa en la extremidad posterior izquierda, zona cervical anterior, región parieto-occipital y piel que cubre las regiones de las apófisis C7 y L2. A continuación se colocó el animal en posición de decúbito supino y se fijó por las cuatro extremidades y la boca en una mesa Palmer. Traqueotomía y canulación traqueal Se practicó una incisión cutánea longitudinal media a nivel del tercer anillo traqueal, de aproximadamente 1 cm de longitud en dirección caudal. A continuación se realizó disección por planos musculares y aislamiento de la tráquea, teniendo especial cuidado con los nervios laríngeos recurrentes para evitar su lesión. Una vez separados los nervios se pasaron dos hilos de sutura (calibre 0, métrico 3.5) por debajo de la tráquea y se procedió a su apertura mediante una incisión en cruz con termobisturí. Por último, se introdujo una cánula metálica (diámetro interno 2.5 mm) que se fijó para evitar su movimiento. MATERIAL Y MÉTODOS - 74 - Canulación esofágica Inmediatamente por debajo de la tráquea se localizó y aisló el esófago con hilo de sutura y se ligó la porción más craneal. Se practicó una incisión longitudinal media con termobisturí y se introdujo una cánula de propileno rellena de aire (0.8 mm de diámetro externo y 0.6 mm de diámetro interno) hasta aproximadamente 1 cm por encima del límite esternal caudal. Se fijó después la cánula a la piel con hilo de sutura (calibre 0, métrico 3.5). La valoración de la presión esofágica colocando el catéter en el tercio inferior del esófago permite obtener un registro continuo de presión pleural. Canulación de vena femoral Se buscó por palpación el pulso femoral en el triángulo de Scarpa, inmediatamente por debajo del ligamento inguinal. Se practicó una incisión en la zona de la arteria femoral. Se descubren vena y arteria femorales mediante disección roma y se pasó un hilo de referencia (hilo de sutura calibre 2/0, métrico 3) debajo de la vena femoral. Este hilo se deslizó en sentido distal en la vena. Otro hilo se colocó en sentido proximal. El hilo situado proximalmente se anudó, a la vez que se pinzaba la vena con unas pinzas hemostáticas miniaturizadas tipo bulldog (Aesculap). Se realizó una pequeña incisión transversal a través de la cual se introdujo un catéter con suero salino (diámetro interior 0.4 mm y exterior 0.8 mm) en la luz vascular. La introducción del catéter se acompañó de apertura controlada de la pinza hemostática. Una vez introducido el catéter se fijó con hilos de sutura (calibre 2/0, métrico 3). MATERIAL Y MÉTODOS - 75 - Canulación arterial Se procedió como en la canulación de la vena, anudando el hilo situado en la porción proximal y colocando las pinzas hemostáticas en la porción distal. Se realizó una pequeña incisión en la arteria, introduciendo un catéter (diámetro interior 0.4 mm y exterior 0.8 mm) purgado con suero heparinizado al 5% (heparina sódica BOIZOT). Una vez introducido el catéter se fijó con hilos de sutura (calibre 2/0, métrico 3). Posteriormente se cerró la herida con grapas (12 X 2.5 mm de Medicon Instruments) y se conectaron los catéteres a los sistemas de venoclisis. En ambos sistemas se intercalaron llaves de tres vías para permitir la introducción de distintos fármacos. Parietostomía bilateral posterior Una vez canulada la tráquea, el esófago la arteria y vena femorales, se situó el animal sobre el aparato de estereotaxia (Kopf Instrument) en posición decúbito prono, con la barra superior 3.3 mm por debajo de la línea interaural (Paxinos y Watson, 1997). El animal se fijó por medio de barras laterales en los conductos auditivos externos y también se fijaron el hocico y la boca. Una vez fijado el animal al aparato de estereotaxia, se colocó sobre un sistema de manta termostática homeotérmica, alimentado en DC (Harvard Aparatus) controlado por sonda rectal. La temperatura se mantuvo constante a 37 ± 0.5 ºC. Se realizó una incisión longitudinal media en la piel de la cabeza y se dejó al descubierto la calota mediante disección roma de aponeurosis y planos musculares con ayuda de una espátula. El diploe se cubrió de cera MATERIAL Y MÉTODOS - 76 - ósea para evitar hemorragias. A continuación se practicó parietostomía posterior bilateral de 4 mm de diámetro, con ayuda de un taladro quirúrgico, en las coordenadas 4.0 mm posterior a bregma y 0.6 mm lateral a la línea media, para la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl); -1.0 mm posterior a la línea interaural y 2.4 mm lateral a la línea media, para la región del Área A5. MATERIAL Y MÉTODOS - 77 - 3.3. Variables registradas y material utilizado En todos los experimentos se registraron directamente las siguientes variables: - Flujo respiratorio. - Presión pleural. - Presión arterial. - Frecuencia cardiaca. Estas variables fueron analizadas durante el experimento. A partir de ellas podemos obtener otras variables como son la frecuencia respiratoria instantánea, tiempo inspiratorio y tiempo espiratorio, obtenidas a partir del flujo respiratorio, y valores de frecuencia cardiaca instantánea obtenidos a partir del registro de frecuencia cardiaca. Figura 3.3.1. Almacenamiento y estudio de las señales Las señales de las diferentes variables eran enviadas tras su obtención y amplificación a un panel de conexiones múltiples. Desde este panel se envían las señales a un sistema de almacenamiento digital (Neurocorder de Neuro-Data, modelo DR-890) y a un polígrafo de plumillas multicanal (SANEI) para su estudio posterior. El sistema de almacenamiento consistía en un convertidor analógicodigital multiplexado, del cual utilizamos 6 canales (mode 4). Los diferentes canales y las variables grabadas "on line" en cada uno de ellos son; C2: flujo respiratorio; C3: presión pleural; C4: presión arterial; C6: frecuencia cardiaca. En todos ellos la frecuencia de muestreo fue de 11 KHz y el rango de trabajo de ± 8 voltios. MATERIAL Y MÉTODOS - 78 - Durante el transcurso de la experiencia también quedaron grabadas las explicaciones dadas en tiempo real, sobre el desarrollo de los experimentos. Las señales, una vez digitalizadas, fueron almacenadas en cinta de vídeo comercial mediante grabación en vídeo grabador-reproductor (JVC). Para el registro gráfico se dispuso en paralelo un polígrafo de plumillas de 7 canales, con 40 mm de ancho de registro por canal, con sensores y módulos de acondicionamiento. La velocidad del papel más frecuente para el registro de las variables fisiológicas fue de 100 mm/min. Se utilizaron también dos programas de adquisición, análisis e impresión de señales: Spike2 (CED), con el convertidor analógico-digital 1401, y Chart 5.0 con el convertidor analógico-digital PowerLab. Material técnico utilizado para el registro de las variables Dispositivos y transductores Transductores de presión Para la medida de la presión pleural valorada como presión esofágica se utilizó un transductor de presión aneroide, de la casa Coulbourn Instruments, modelo T41-05 y un transductor de presión diferencial modelo SP-2040D, para la valoración del flujo respiratorio. Estos transductores presentan una membrana balanceada por puente de Wheatstone. Las resistencias que constituyen el puente de Wheatstone son galgas extensométricas de una sustancia siliconada que varían su resistencia frente a pequeños estiramientos. Las galgas extensométricas pueden ser modificadas por la presión ejercida desde dos MATERIAL Y MÉTODOS - 79 - compartimentos independientes, lo que permite obtener la diferencia entre las dos presiones actuantes. Para la medida de la presión arterial se empleó un transductor modelo MP-15D, de la casa Coulbourn Instrument. Presenta un rango de actividad de -50 a 300 mmHg y una sensibilidad de 50 V/V/cmHg. Neumotacográfo Permitió el registro del flujo respiratorio. El modelo utilizado ha sido el tipo Fleisch (00) con una sensibilidad de 11.25 ml/s equivalente a 1 mm H2O. Se conectó a la cánula traqueal. Consiste básicamente en un tubo rígido, cuyo diseño permite únicamente el paso de aire en régimen laminar. Para ello presenta en su interior un sistema de canalículos, formando una rejilla fina, que aseguran esa circulación laminar con una resistencia baja y constante del aire. Podemos definir el flujo de un fluido como la razón entre la variación o gradiente de presión y la resistencia. Si la resistencia permanece constante, serán únicamente los cambios de presión los que modifiquen directamente el flujo de aire. F=P/R, siendo; F: el flujo instantáneo; P: el gradiente de presión; R: la resistencia al flujo de aire. Conectando el neumotacógrafo a un transductor de presión diferencial mediante dos conexiones situadas a cada uno de los lados de la resistencia mecánica, se obtuvo el gradiente de presión que es directamente proporcional al flujo de aire. El registro obtenido es el neumotacograma, con variaciones cíclicas MATERIAL Y MÉTODOS - 80 - de acuerdo con las fases de la respiración. De este modo, en cada ciclo respiratorio se pueden definir dos puntos de flujo cero, correspondientes al final de la inspiración y de la espiración y dos puntos de deflexión máxima del registro, correspondientes al flujo máximo inspiratorio y espiratorio. El flujo instantáneo puede definirse en cualquier momento del ciclo, correspondiendo con la pendiente de la curva inscrita en ese punto. Tacómetro La frecuencia cardiaca instantánea se obtuvo mediante tacómetro, modelo S77-26 de la casa Coulbourn Instruments. El sistema consiste en un procesador analógico que convierte el intervalo interlatido en un determinado valor de voltaje de salida que es proporcional a la señal de entrada. Sus características principales son: frecuencia de respuesta desde 4 a 1500 entradas/min. Tiempo de respuesta inmediata, con una estabilidad 1.5%. La señal de entrada fue la dP/dt obtenida desde el registro de presión arterial. Amplificadores Para el registro de presión pleural, flujo respiratorio y presión arterial se utilizaron amplificadores modelo S72-25, de la casa Coulbourn Instruments, con un nivel de entrada máximo de 10 mV, una resistencia de entrada de 1010  y una impedancia de salida de 50. Otros dispositivos empleados Osciloscopio digital Modelo VC-6023 de Hitachi. Este dispositivo permite trabajar con dos canales simultáneos, digitalizar la señal y mediante un programa propio MATERIAL Y MÉTODOS - 81 - calcular dimensiones y exportar resultados a un ordenador o plotter. Se utilizaron dos unidades. Una de ellas se utilizó para visualizar flujo y presión pleural, pudiéndose calcular también la resistencia respiratoria, gracias a la posibilidad de graficar estas 2 variables en el modo XY. La otra unidad fue utilizada para visualizar la intensidad de la estimulación eléctrica en tiempo real. La intensidad se obtenía de forma indirecta haciendo pasar un voltaje conocido a través de una resistencia de valor conocido. Dividiendo el valor del voltaje por la resistencia se obtiene el valor de la intensidad. Osciloscopio analógico Modelo 5112 de Tektronik. Este dispositivo permite trabajar con 5 canales simultáneos. Se utilizó para visualizar en tiempo real el flujo respiratorio, la presión pleural y la presión arterial. Además, permitió la presentación simultánea y en tiempo real de los potenciales de campo extracelulares (PAE) y flujo respiratorio. Por lo cual, podía estimarse cualitativamente la posible relación fásica entre ambos eventos y proceder a su estudio y almacenamiento. Así mismo, podía presentarse en pantalla la presión pleural, presión arterial y los impulsos del generador de rampa, que convierte los PAE detectados en impulsos TTL. Electrodos de estimulación bipolares Se utilizaron electrodos de estimulación concéntricos bipolares (SNE 100, Rhodes Medical Electrodes). MATERIAL Y MÉTODOS - 88 - selectivo de receptores ionotrópicos de glutamato que produce el bloqueo de receptores del tipo NMDA. La solución empleada fue 2 mM, inyectándose 50-100 nl, lo que implica una dosis de 0.1-0.2 nmoles. CNQX 6-ciano-7-nitroquinoxalino-2,3-dione (CNQX). Es un antagonista de receptores ionotrópicos de glutamato que produce el bloqueo de receptores de tipo no NMDA. La solución empleada fue 1 M, inyectándose 50-100 nl, lo que implica una dosis de 50-100 nmoles. MCPG -Metil-(4-carboxi-fenil) glicina (MCPG). Es un antagonista no selectivo (general) de receptores metabotrópicos de glutamato. La solución empleada fue 10 mM, inyectándose 50-100 nl, lo que implica una dosis de 0.5-1 nmoles. MATERIAL Y MÉTODOS - 89 - 3.5. Protocolo experimental Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) antes y después de la aplicación de distintos fármacos en el Área A5 Se situó estereotáxicamente el microelectrodo de estimulación en la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) (coordenada posterior desde bregma –4.0 mm, 0.6 mm lateral a la línea media y de 4.5-5.0 mm de profundidad con respecto a la superficie cerebral, Paxinos y Watson, 1997). Hay que tener en cuenta que la torre del equipo de estereotaxia donde está fijado el microelectrodo de estimulación, penetra en el cerebro del animal con una inclinación de 30º para evitar problemas de espacio con la segunda torre del equipo de estereotaxia, que se utiliza para la microinyección de fármacos en el área A5. Para la estimulación eléctrica se utiliza un electrodo de estimulación concéntrico bipolar (SNE 100, RODHES Medical Electrodes). El resumen esquemático de este protocolo experimental se recoge en la Figura 3.3.1. Se analizaron los cambios cardiovasculares y respiratorios durante estimulación eléctrica (30-40 A, 100 Hz, pulsos de 1 ms, durante 5 s) de la SGPdl. Los cambios en los parámetros respiratorios y cardiovasculares provocados durante la estimulación eléctrica de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) se analizaron antes y después de la microinyección de distintos fármacos. Cada fármaco se corresponde con un grupo experimental. Se utilizaron PBS, Muscimol, Kinurénico, DAP5, CNQX y MCPG en el Área A5. MATERIAL Y MÉTODOS - 90 - Se utilizó un microelectrodo de estimulación eléctrica en la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) (para la estimulación eléctrica), y una micropipeta de vidrio colocada en el Área A5 para las microinyecciones de los diferentes fármacos. Después de estimular eléctricamente la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl), se inyectó, en grupos experimentales distintos, Muscimol 4 mM (50-100 nl, 0.2-0.4 nmoles, pH 7.4  0.1, durante 5 s), Kinurénico 100 mM (50-100 nl, 5-10 nmoles, pH 7.4  0.1, durante 5 s), DAP5 2mM (50-100 nl, 0.1-0.2 nmoles, pH 7.4  0.1, durante 5 s), CNQX 1 M (50-100 nl, 50-100 nmoles, pH 7.4  0.1, durante 5 s) y MCPG 10 mM (50-100 nl, 0.5-1 nmol, pH 7.4  0.1, durante 5 s) en el Área A5. Para la microinyección la micropipeta de vidrio se rellena del fármaco correspondiente disuelto en PBS (phosphate buffer saline, pH 7.4  0.1) con un 1% de Azul de Evans para marcar el lugar de inyección (Figura 3.3.1). Se esperaron 4 minutos. Se analizaron los cambios cardiovasculares y respiratorios durante la estimulación eléctrica (30-40 A, 100 Hz, pulsos de 1 ms durante 5 s) de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) tras la microinyección de cada fármaco. Por último, se observaron las diferencias obtenidas entre la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación de la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) antes de la microinyección de los diferentes fármacos, y la respuesta obtenida tras la microinyección de los mismos. MATERIAL Y MÉTODOS - 91 - Figura 3.3.1. Diseño general del montaje y variables registradas durante la estimulación eléctrica (30-40 µA, 100 Hz, 1 ms, durante 5 segundos) de la Sustancia Gris Periacueductal Dorsolateral antes y después de la microinyección en el Área A5 de Muscimol (50-100 nl, 0.2-0.4 nmol), Kinurénico (50-100 nl, 5-10 nmol), CNQX (50-100 nl, 50-100 nmol), DAP5 (50-100 nl, 50-100 nmol) y MCPG (50-100 nl, 0.5-1 nmol). Todas las señales fueron visualizadas en tiempo real mediante polígrafo y almacenadas en un sistema digital por medio de convertidor A/D para el análisis posterior. MATERIAL Y MÉTODOS - 92 - MATERIAL Y MÉTODOS - 93 - 3.6. Procesamiento histológico Las lesiones eléctricas producidas por el electrodo de estimulación de la SGPdl, y la microinyección de Azul de Evans en el Área A5 nos permitieron marcar la posición de ambos núcleos. Al final de los experimentos se inyectó pentotal sódico, 4 mg/Kg por vía intravenosa, para inducir una anestesia profunda. A continuación se extrajo el encéfalo. Se realizó transección medular entre los límites bulboespinal y medio colicular. Se introdujo el tronco del encéfalo en una solución de formol 50 ml al 5% y se procedió a cortarlo en secciones de 80 m, con criotomo (Leica Instruments GmbH, Mod.1206). Los cortes así obtenidos fueron posteriormente teñidos con rojo neutro. (Figura 3.6.1). MATERIAL Y MÉTODOS - 94 - Figura 3.6.1. Fotografías de dos cortes coronales de secciones de 80 m teñidos con rojo neutro que muestran las dos regiones de trabajo. En la parte superior se aprecia el tejido microcoagulado marcando el punto de estimulación eléctrica de la SGPdl tras pasar una corriente de 250 A al final del experimento. En la fotografía inferior se puede apreciar el lugar exacto de la microinyección realizada en el Área A5 gracias a la tonalidad violácea que adquiere el tejido en contacto con el colorante Azul de Evans. Se ha superpuesto en ambas fotografías un esquema extraído del Atlas de Paxinos y Watson. MATERIAL Y MÉTODOS - 95 - 3.7. Tratamiento estadístico Los procedimientos del cálculo utilizado se han adaptado a las características de las variables, teniendo en cuenta el error por la distinta reactividad de los animales componentes de cada muestra. Para valorar los resultados de las medias obtenidas dentro de un mismo grupo de animales, una vez comprobada la normalidad y homocedasticidad de las variables de cada muestra se realizó mediante análisis de la varianza y el test de Student – Newman – Keuls de comparación múltiple. Las diferencias han sido consideradas significativas cuando p<0.05. En todos los casos, se han utilizado representaciones gráficas en forma de histograma. La distribución total de animales utilizados en cada uno de los grupos de experiencias ha servido para disponer del número necesario en cada caso concreto para el estudio estadístico. Ha sido posible reunir series de animales con datos muy homogéneos. Se realizaron medidas del tiempo inspiratorio, tiempo espiratorio, frecuencia respiratoria instantánea, presión arterial y frecuencia cardiaca instantánea. Estas medidas han sido tomadas 5 segundos antes de la estimulación, durante la estimulación y 20 segundos después de la estimulación. Sólo se han valorado los datos obtenidos en las experiencias en las que el estudio histológico demostró que las distintas estimulaciones y microinyecciones fueron realizadas en la Sustancia Gris Periacueductal dorsolateral (SGPdl) y/o Área A5, respectivamente. MATERIAL Y MÉTODOS - 96 - RESULTADOS RESULTADOS - 102 - Figura 4.2.1. Esquematización en secciones coronales del Área A5 desde la porción rostral (parte superior izquierda) a la porción caudal (parte inferior derecha), que muestra la localización de las zonas de microinyección de PBS en el Área A5. (A5) Área A5 catecolaminérgica; (7n) nervio facial o raíz de este nervio; (rs) tracto rubroespinal; (s5) raíz sensorial del nervio trigémino; (sp5) tracto trigéminoespinal. RESULTADOS - 103 - Frecuencia Respiratoria (rpm) Presión Pleural (cmH2O) Tiempo Espiratorio (s) Tiempo Inspiratorio (s) Figura 4.2.2 Cambios en los parámetros respiratorios promediados (n=7) obtenidos 5 segundos antes, durante y 20 segundos después de la estimulación eléctrica de la SGPdl. Se representan, de arriba hacia abajo, frecuencia respiratoria, presión pleural, tiempo espiratorio y tiempo inspiratorio. La línea continua representa la estimulación control. La línea discontinua representa la estimulación de la SGPdl tras la microinyección de PBS en el Área A5. Los datos se muestran como la media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 60 70 80 90 100 110 120 130 140 antes durante después *** *** *** *** 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 antes durante después *** *** *** *** 0,17 0,175 0,18 0,185 0,19 0,195 0,2 0,205 0,21 antes durante después 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 antes durante después * * * RESULTADOS - 104 - Presión Arterial (mmHg) Frecuencia Cardiaca (cpm) Figura 4.2.3. Cambios en la respuesta presora (arriba) y cardiaca (abajo) promediados (n=7) obtenidos 5 segundos antes, durante y 20 segundos después de la estimulación eléctrica de la SGPdl. La línea continua representa la estimulación control. La línea discontinua representa la estimulación de la SGPdl tras la microinyección de PBS en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 antes durante después *** *** *** *** 320 330 340 350 360 370 380 390 400 antes durante después *** *** *** *** RESULTADOS - 105 - Frecuencia Respiratoria (rpm) Presión Pleural (cmH2O) Tiempo Espiratorio (s) Tiempo Inspiratorio (s) Figura 4.2.4. Cambios en valores absolutos promediados (n=7) de las variables respiratorias durante la estimulación eléctrica de la SGPdl. Se representan de arriba hacia abajo y de izquierda a derecha, la frecuencia respiratoria, presión pleural, tiempo espiratorio y tiempo inspiratorio. En azul se representa la estimulación control. En rojo se representa la estimulación de la SGPdl tras la microinyección de PBS en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 0 10 20 30 40 50 60 Control PBS -0,5 -0,45 -0,4 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 0 Control PBS 0 0,005 0,01 0,015 0,02 Control PBS 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 Control PBS RESULTADOS - 106 - Presión Arterial (mmHg) Frecuencia Cardiaca (cpm) Figura 4.2.5. Cambios en valores absolutos promediados (n=7) de la presión arterial (arriba) y frecuencia cardiaca (abajo) durante la estimulación eléctrica de la SGPdl. En azul se muestra la estimulación control y en rojo la estimulación de la SGPdl tras microinyección de PBS en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Control PBS 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Control PBS RESULTADOS - 107 - ANTES DURANTE DESPUÉS Ti (s) Ctrl 0.196  0.01 0.199  0.01 0.183  0.01 PBS 0.193  0.01 0.203  0.01 0.185  0.01 Te (s) Ctrl 0.536  0.05 0.299  0.02 0.599  0.09 PBS 0.663  0.04 0.321  0.02 0.574  0.03 FR (rpm) Ctrl 85  5 123  5 83  7 PBS 71  3 116  4 80  3 PP(cmH2O) Ctrl 0.369  0.03 0.509  0.04 0.376  0.03 PBS 0.393  0.02 0.506  0.03 0.433  0.02 Tabla 4.2.I. Respuesta respiratoria evocada por estimulación de la SGPdl antes, durante y después de la microinyección de PBS en el Área A5. Se muestran los valores promediados de tiempo inspiratorio (Ti), tiempo espiratorio (Te), frecuencia respiratoria (FR) y presión pleural (PP). *** *** *** *** * * RESULTADOS - 108 - ANTES DURANTE DESPUÉS PA (mmHg) Ctrl 92  1 122  4 91  2 PBS 90  1 121  3 89  1 FC (cpm) Ctrl 352  12 389  12 351  14 PBS 354  14 381  15 351.0  15 Tabla 4.2.II. Respuesta cardiovascular evocada por estimulación de la SGPdl antes, durante y después de la microinyección de PBS en el Área A5. Se muestran los valores promediados de presión arterial (PA) y frecuencia cardiaca (FC). Todos los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 *** *** *** *** RESULTADOS - 109 - Ti (s) Te (s) FR(rpm) PP(cmH2O) PA(mmHg) FC(cpm) Control 0.004  0.01 0.237  0.02 39  8 0.140  0.02 30  3 37  4 PBS 0.010  0.01 0.342  0.07 44  10 0.110  0.05 31  4 27  3 Tabla 4.2.III. Cambios cardiorrespiratorios durante la estimulación de la SGPdl antes y después de la microinyección de PBS en el Área A5. Se muestran los cambios en valores absolutos promediados de tiempo inspiratorio (Ti), tiempo espiratorio (Te), frecuencia respiratoria (FR), presión pleural (PP), presión arterial (PA) y frecuencia cardiaca (FC). RESULTADOS - 110 - RESULTADOS - 111 - 4.3. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Muscimol en el Área A5 Se caracterizó la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Muscimol (50-100 nl, 0.2-0.4 nmol) en el Área A5 (7 ratas). La respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes de la microinyección se caracterizó por un incremento de frecuencia respiratoria por disminución del tiempo espiratorio, incremento de la presión pleural inspiratoria y aumento de presión arterial y frecuencia cardiaca. Figuras 4.3.2A, 4.3.3, 4.3.4, 4.3.5, 4.3.6; Tablas 4.3.I, 4.3.II y 4.3.III. La localización de las zonas de microinyección se observa en la figura 4.3.1. La microinyección de Muscimol en el Área A5 (50-100 nl, 0.2-0.4 nmol, n=7) produjo una respuesta bifásica (pequeño aumento seguido de disminución) en la presión arterial en 2 ratas, con ligero aumento de frecuencia respiratoria. En el resto, 5 ratas, se produjo un incremento de presión arterial, en 2 de ellas muy elevado, acompañado en todas ellas de un ligero aumento de la frecuencia cardiaca. Con respeto a la componente respiratoria en estos 5 animales, se produce apnea en 3 de ellos y un ligero aumento de frecuencia respiratoria en los otros dos. Tras cuatro minutos de la microinyección de Muscimol en el Área A5 se produjo disminución no significativa de la frecuencia respiratoria de reposo (de 107  4 a 101  5 rpm) debido a una disminución del tiempo RESULTADOS - 118 - Presión Arterial (mmHg) Frecuencia Cardiaca (cpm) Figura 4.3.4. Cambios en la respuesta presora (arriba) y cardiaca (abajo) promediados (n=7) obtenidos 5 segundos antes, durante y 20 segundos después de la estimulación eléctrica de la SGPAdl. La línea continua representa la estimulación control. La línea discontinua representa la estimulación de la SGPAdl tras la microinyección de Muscimol en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. RESULTADOS - 119 - Frecuencia Respiratoria (rpm) Presión Pleural (cmH2O) Tiempo Espiratorio (s) Tiempo Inspiratorio (s) Figura 4.3.5. Cambios en valores absolutos promediados (n=7) de las variables respiratorias durante la estimulación eléctrica de la SGPAdl. Se representan de arriba hacia abajo y de izquierda a derecha, la frecuencia respiratoria, presión pleural, tiempo espiratorio y tiempo inspiratorio. En azul se representa la estimulación control. En rojo se representa la estimulación de la SGPAdl tras la microinyección de Muscimol en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 ** 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 CONTROL MUSCIMOL RESULTADOS - 120 - Presión Arterial (mmHg) Frecuencia Cardiaca (cpm) Figura 4.3.6. Cambios en valores absolutos promediados (n=7) de la presión arterial (arriba) y frecuencia cardiaca (abajo) durante la estimulación eléctrica de la SGPAdl. En azul se muestra la estimulación control y en rojo la estimulación de la SGPAdl tras microinyección de Muscimol en el Área A5. Los datos se muestran como media  el error estándar de la media. RESULTADOS - 121 - ANTES DURANTE DESPUÉS Ti (s) Ctrl 0.212  0.01 0.184  0.01 0.201  0.01 MUS 0.211  0.01 0.212  0.01 0.207  0.01 Te (s) Ctrl 0.355  0.02 0.246  0.02 0.391  0.03 MUS 0.393  0.02 0.285  0.02 0.416  0.03 FR (rpm) Ctrl 107  4 143  8 104  6 MUS 101  5 123  7 99  5 PP(cmH2O) Ctrl 0.326  0.02 0.534  0.04 0.339  0.03 MUS 0.321  0.02 0.391  0.03 0.316  0.02 Tabla 4.3.I. Respuesta respiratoria evocada por estimulación de la SGPAdl antes, durante y después de la microinyección de Muscimol en el Área A5. Se muestran los valores promediados de tiempo inspiratorio (Ti), tiempo espiratorio (Te), frecuencia respiratoria (FR) y presión pleural (PP). *** *** *** *** *** RESULTADOS - 122 - ANTES DURANTE DESPUÉS PA (mmHg) Ctrl 108  1.4 155  4 109  3.5 MUS 118  3.8 157  2.4 118  3.7 FC (cpm) Ctrl 356  14 410  17 362  16 MUS 375  7 382  8 370  10 Tabla 4.3.II. Respuesta cardiovascular evocada por estimulación de la SGPAdl antes, durante y después de la microinyección de Muscimol en el Área A5. Se muestran los valores promediados de presión arterial (PA) y frecuencia cardiaca (FC). Todos los datos se muestran como media  el error estándar de la media. Los valores de p son: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 *** *** *** RESULTADOS - 123 - Ti (s) Te (s) FR (rpm) PP (cmH2O) PA (mmHg) FC (cpm) Control - 0.028  0.01 - 0.109  0.01 37  6 0.211  0.04 47  4 54  10 MUS 0.001  0.01 * - 0.125  0.01 23  5 0.068  0.01 39  2 7  9 Tabla 4.3.III. Cambios cardiorrespiratorios durante la estimulación de la SGPAdl antes y después de la microinyección de Muscimol en el Área A5. Se muestran los cambios en valores absolutos promediados de tiempo inspiratorio (Ti), tiempo espiratorio (Te), frecuencia respiratoria (FR), presión pleural (PP) y presión arterial (PA) y frecuencia cardiaca (FC). * *** ** ** RESULTADOS - 124 - RESULTADOS - 125 - 4.4. Caracterización de la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 Se caracterizó la respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes y después de la microinyección de Kinurénico (50-100 nl, 5-10 nmol) en el Área A5 (8 ratas). La respuesta cardiorrespiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl antes de la microinyección se caracterizó por un incremento de frecuencia respiratoria por disminución del tiempo espiratorio, y aumento de presión arterial y frecuencia cardiaca. Figuras 4.4.2A, 4.4.3, 4.4.4, 4.4.5, 4.4.6; Tablas 4.4.I, 4.4.II y 4.4.III. La localización de las zonas de microinyección se observa en la figura 4.4.1. La microinyección de Kinurénico en el Área A5 (50-100 nl, 5-10 nmol, n=7) en 5 casos no produjo efectos cardiorrespiratorios (localizadas las cinco en pleno Área A5), en otros 2 casos produjo una respuesta bifásica de la presión arterial (localizadas en pleno Área A5), en uno de estos casos se acompaña de un ligero aumento y en el otro de una ligera disminución de frecuencia cardiaca. Cuatro minutos después de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 se produjo una disminución significativa de la frecuencia respiratoria de reposo (de 98  4 a 85  7, p<0.05) y del tiempo espiratorio de reposo (de 0.362  0.02 a 0.480  0.05, p<0.01). No se modifican significativamente la componente cardiovascular ni el tiempo inspiratorio. RESULTADOS - 126 - Respuesta respiratoria La respuesta respiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl se modifica tras la microinyección de Kinurénico en el Área A5: La respuesta respiratoria evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 4 minutos después de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 se caracterizó por un incremento de frecuencia respiratoria (de 85  7 a 103  4 rpm, p<0.01) por disminución del tiempo espiratorio (de 0.480  0.05 a 0.350  0.02 s, p<0.01). Esta respuesta era acompañada por un incremento de presión pleural inspiratoria (de 0.388  0.04 a 0.516  0.04 cmH2O, p<0.05). No se produjeron cambios en el tiempo inspiratorio (de 0.254  0.01 a 0.241  0.02 s). Figuras 4.4.2B, 4.4.3; Tabla 4.4.I. El incremento en valores absolutos de la frecuencia respiratoria es de 18  5 rpm, este incremento se produjo por una disminución en valores absolutos del tiempo espiratorio de –0.131  0.04 s. Los cambios en valores absolutos del tiempo inspiratorio son de -0.013  0.02 s y de la presión pleural inspiratoria son de 0.128  0.03 cmH2O. Figura 4.4.5; Tabla 4.4.III. Existen diferencias significativas en el incremento en valores absolutos de la frecuencia respiratoria (de 31  5 a 18  5 rpm, p<0.05). Figura 4.4.5; Tabla 4.4.III. Respuesta cardiovascular La respuesta cardiovascular evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl se modifica sustancialmente tras la microinyección de Kinurénico en el Área A5. Se produce un menor incremento de presión RESULTADOS - 127 - arterial y se abole prácticamente el incremento de frecuencia cardiaca evocado por estimulación eléctrica de la SGPdl. La respuesta cardiovascular evocada por estimulación eléctrica de la SGPdl 4 minutos después de la microinyección de Kinurénico en el Área A5 se caracterizó por un incremento de presión arterial (de 103  1 a 137  6 mmHg, p<0.001). No se produjeron cambios de frecuencia cardiaca (de 383  15 a 380  14 cpm). Figuras 4.4.2B, 4.4.4; Tabla 4.4.II. Los cambios en valores absolutos de la presión arterial y frecuencia cardiaca son de 34  5 mmHg y -3  11 cpm respectivamente. Figura 4.4.6; Tabla 4.4.III. Se produjo un menor incremento en valores absolutos de presión arterial (de 43  3 a 34  5 mmHg, p<0,05) y de frecuencia cardiaca (de 39  6 a -3  11 cpm, p<0.01). Figura 4.4.6; Tabla 4.4.III. Otros resultados Hay que señalar que son cinco los animales en los que la microinyección bilateral de Kinurénico provocó una depresión gradual de la frecuencia respiratoria, que finaliza con la muerte de los mismos (localización de la microinyección en el Área A5). En otros 4 animales se microinyectó fuera de la zona de estudio. En uno de ellos, se produjo una ligera disminución de presión arterial y un ligero aumento de frecuencia respiratoria como consecuencia de la estimulación de la SGPdl tras la microinyección de Kinurénico (la microinyección se localizó encima de la salida del nervio facial, 7n). Otro animal tuvo una disminución de presión arterial y de frecuencia cardiaca tras la estimulación de la SGPdl (localización de la microinyección en la BIBLIOGRAFÍA - 224 - Barbaresi P. Postnatal development of GABA-immunoreactive neurons and terminals in rat periaqueductal gray matter: a light and electron microscopic study. J Comp Neurol 518: 2240–2260. 2010. Barman SM. 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Interactions between the hypothalamic defence Área and the A5 region: role of glutamate. Journal of Physiology, Vol 548P, 80-80. ISSN 0022-3751 Factor de impacto: 5,139 (JCR 2013). Cuartil: Q1. Publicaciones en Actas de Congresos (Proceedings) 1Dawid-Milner MS., López-González M.V., Díaz-Casares MA., Peinado C., Lara JP., González-Barón S. 2003. Interacciones funcionales entre el Área de Defensa Hipotalámica y regiones protuberanciales cardiorrespiratorias. Rev Neurol 37 (12): 1189. ISSN 0210-0010. (Nacional). 2Peinado C., López-González M.V., Dawid-Milner M.S., Lara J.P., González-Barón S. 2003. Respuesta cardiorrespiratoria evocada por la estimulación de la substancia gris periacueductal: función del Área A5. Rev Neurol 37 (12): 1189. ISSN 0210-0010. (Nacional). APÉNDICE - 287 - 3López-González M. V., Dawid-Milner M. S., Rioja J., PeinadoAragonés C. A., Lara J. P. & González-Barón S. 2004. A5 neurons modulate the cardiovascular response evoked by hypothalamic defence Área stimulation in the rat. FENS Abstr., vol.2, A091.3. (Internacional). 4Dawid-Milner M. S, Peinado-Aragonés C. A, López-González M. V., Lara J. P. & González-Barón S. 2004. Modulation of dorsolateral periaqueductal gray evoked cardiorespiratory responses by pontine structures in the rat. FENS Abstr., vol.2, A022.3. (Internacional). 5García-Pérez JA, López-González MV, Peinado-Aragonés CA, Dawid-Milner MS and González-Barón S. 2005. Effects of hypothermia on the tachycardic response to dorsolateral periaqueductal gray matter stimulation in anaesthetised rats. J Physiol Biochem 61 (1) 277. ISSN 1138-7548. (Internacional). 6Peinado Aragonés CA, Dawid-Milner MS, López-González MV, Lara JP and González-Barón. 2005. A5 glutamate receptors in the cardiorespiratory responses evoked from the dorsolateral periaqueductal gray matter in the rat: J Physiol Biochem 61 (1) 275. ISSN 1138-7548. (Internacional). 7M.V. López-González, C.A. Peinado Aragonés, J.A. García-Pérez, M.S. Dawid-Milner, J.P. Lara Muñoz, S. González Barón. 2005. Efectos de la hipotermia aguda sobre la inhibición del reflejo barorreceptor evocado por estimulación del área de defensa hipotalámica (adh) en rata. Rev Neurol 41 (2): 42. ISSN 0210-0010. (Nacional). APÉNDICE - 288 - 8C.A. Peinado Aragonés, M.S. Dawid-Milner, M.V. López-González, J.P. Lara Muñoz, S. González Barón. 2005. Participación de receptores glutamatérgicos del Área A5 protuberancial en la inhibición del reflejo barorreceptor evocado por estimulación de la sustancia gris periacueductal dorsolateral (dl-PAG) en rata. Rev Neurol 41 (2): 42. ISSN 0210-0010. (Nacional). 9M.S. Dawid-Milner, M.V. López-González, C.A. Peinado Aragonés, J.P. Lara Muñoz, S. González Barón. 2005. Modulación catecolaminérgica de la función cardiorrespiratoria. Rev Neurol 41 (2): 5. ISSN 0210-0010. (Nacional). 10López-González M. V., Peinado-Aragonés C. A., Dawid-Milner M. S., & González-Barón S. 2006. Effects of acute hypothermia on the inhibition of the baroreceptor reflex evoked by hypothalamic defence Área stimulation in anaesthetised rats. FENS Abstr., vol.3, A148.10. (Internacional). 11-López-González M. V., Peinado-Aragonés C. A., González-Barón S. y Dawid-Milner M. S. 2006. Effects of hypothermia on the cardiovascular response evoked by hypothalamic defence Área stimulation in rats. Clin Auton Res. 16 (2): 174. ISSN 0959-9851. (Internacional). 12L. Silva-Carvalho, M. Dawid-Milner, L. Peñuela-Ruiz, M. LópezGonzález, C. Peinado-Aragones, S. Laranjo, I. Rocha. 2008. Modulation of the autonomic cardiovascular response evoked by hypothalamic defence Área stimulation in the rat during hypothermia. Proc Physiol Soc, 10, PC36. Online ISSN: 1749-6187. (Internacional). APÉNDICE - 289 - 13López-González M.V., Peinado-Aragonés C.A., Díaz-Casares, A., González-Baron S. and Dawid-Milner M.S. 2010. The glutamate receptors of the a5 region are required for the cardiorespiratory response evoked by dorsolateral periaqueductal grey matter stimulation in the rat. FENS Abstr., vol.5, 021.3. (Internacional). 14Diaz-Casares A., López-González M. V., Peinado-Aragonés C. A., González-Barón S. & Dawid-Milner M. S. 2010. A morphological and electrophysiological study on the interactions of the parabrachial complex and the hypothalamic defence Área in the rat. FENS Abstr., vol.5, 021.9. (Internacional). 15M. López-González, A. Díaz-Casares, C.A. Peinado-Aragonés, M.A. Barbancho-Fernández, M.S. Dawid-Milner. 2014. A5 angiotensin receptors in the cardiorespiratory responses evoked from hypothalamic defence Área in the rat. FENS Abstr., vol.7, 3869. (Internacional). 16A. Díaz-Casares, M.V. López-González, C.A. Peinado-Aragonés, M.S. Dawid-Milner. 2014. Functional interaction between medial parabrachial region and the hypothalamic defence Área: role of angiotensin II. FENS Abstr., vol.7, 3866. (Internacional). Asistencia a congresos científicos 1. XXXIII Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas, Sevilla, 2005. 2. XI Congreso de la Sociedad Española de Neurociencia, Málaga, 2005. 3. XXXV Congress of the Spanish Society of Physiological Sciences, Valencia, 2009. APÉNDICE - 290 -