Mecanismos de incorporación y homeostasis citoplasmática de potasio y sodio en Halimione Portulacoides (L.) Aellen

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL (ÁREA DE FISIOLOGÍA VEGETAL) TESIS DOCTORAL Mecanismos de incorporación y homeostasis citoplasmática de potasio y de sodio en Halimione portulacoides (L.) Aellen KARIMA AIT HAMMOU Enero 2016 AUTOR: Karima Ait Hammou https://orcid.org/0000-0003-1173-3376 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Biología Vegetal (Área de Fisiología Vegetal) Programa de Doctorado Análisis y Gestión de Paisajes Mediterráneos Visado en Málaga a 16 Noviembre de 2015 Las directoras Fdo. Dra. Da. Mª Jesús García Sánchez Profesora Titular de Fisiología Vegetal Universidad De Málaga Fdo. Dra Da. Lourdes Rubio Valverde Profesora contratada de Fisiología Vegetal Universidad De Málaga Memoria presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Málaga Fdo. Da. KARIMA AIT HAMMOU UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento De Biología Vegetal (Área de Fisiología Vegetal) Da. MARÍA JESÚS GARCÍA SÁNCHEZ, Profesora Titular de Fisiología Vegetal de la Facultad de Ciencias de la Universidad De Málaga y Da. LOURDES RUBIO VALVERDE, Profesora Contratada Doctora de Fisiología Vegetal de la Facultad de Ciencias de la Universidad De Málaga. CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación: Mecanismos de incorporación y homeostasis citoplasmática de potasio y de sodio en Halimione portulacoides (L.) Aellen, realizado por Da. KARIMA AIT HAMMOU, desarrollado bajo nuestra dirección en el Dpto. de Biología Vegetal (área de Fisiología Vegetal) de la Universidad de Málaga, se considera finalizado y puede ser presentado para su exposición y defensa como Tesis Doctoral. Fdo. Dra. Da. María Jesús García Sánchez Fdo. Dra. Da. Lourdes Rubio Valverde Málaga, a dieciséis de Noviembre de dos mil quince La presente Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a una Beca de la Agencia Española de Cooperación Internacional y Desarrollo (AECID) del Ministerio de Asuntos Exteriores (BOE-A-2007-15995). El trabajo ha sido desarrollado dentro del grupo de investigación de la Junta de Andalucía Ecofisiología de Sistemas Acuáticos (RNM 176) y ha sido financiado principalmente por el proyecto de investigación Homeostasis citoplasmática de Na+, K+ y Cly mecanismos de incorporación de nutrientes en Sarcocornia sp. (CGL2007-66362/BOS) y también por el proyecto de referencia CGL2011-30356. Parte de los resultados incluidos en esta memoria han sido presentados en el Annual Main Meeting of the Society for Experimental Biology (Junio 2009, Glasgow, UK) y en la XIX Reunión Española de la Sociedad de Fisiología Vegetal (Junio 2011, Castellón, España). Además, parte de esta tesis conforma el artículo: Ait Hammou K, Rubio L, Fernández JA, García-Sánchez MJ (2014). Potassium uptake in the halophyte Halimione portulacoides L. Aellen. Environmental Experimental Botany 107,15-24. KARIMA AIT HAMMOU Abreviaturas Abreviaturas. Bis Tris Propano 1,3-bis [tris (hidroximetil) metilamino] propano Dmax Despolarización máxima !Em Despolarización de la membrana !"/F Gradiente de potencial electroquímico Em Potencial de membrana ENj Potencial de Nernst para el ión "j" ED Potencial de difusión K+c Actividad Citoplasmática de K+ Na+c Actividad Citoplasmática de Na+ Km Constante de Michaelis-Menten Kmapp Constante de Michaelis-Menten aparente MES Ácido 2-[N-Morfolino] etanosulfónico PK+ Permeabilidades de la membrana para el ion K+ PNa+ Permeabilidades de la membrana para el ion Na+ PClPermeabilidades de la membrana para el ion ClPVC Cloruro de polivinilo SHAM Ácido salicil hidroxámico TEA+ Cloruro de tetraetilamonio THF Tetrahidrofurano Vmax Velocidad máxima del transportador ! Coeficiente de actividad [ ]e Concentración externa de los iones [ ]i Concentración interna de los iones KARIMA AIT HAMMOU Índice I ÍNDICE I. Introducción 3 I.1. Las plantas halófitas: aspectos generales de la tolerancia a la salinidad 3 I.2. Mecanismos de tolerancia a la salinidad en halófitos 5 I.2.1. Ajuste osmótico, compartimentación de iones y solutos compatibles 5 I.2.2. Suculencia. Glándulas y vesículas de sal 7 I.2.3. Homeostasis citoplasmática de Na+ y K+ 8 I.2.4. Incorporación de K+ 10 I.2.5. Incorporación de Na+ 13 I.3. Halimione portulacoides (L.) Aellen 16 I.4. Objetivos 20 II. Material y Métodos 23 II.1. Material vegetal 23 II.1.1.Taxonomía, morfología y distribución de Halimione portulacoides 23 II.1.2. Germinación de semillas y cultivo de plántulas 26 II.2 Electrofisiología 28 II.2.1 Medida del potencial de membrana 28 II.2.1.1. Medida del flujo de iones mediante la medida del potencial de membrana 30 II.2.2. Medida de la actividad iónica: fabricación de microelectrodos selectivos para iones 32 II.2.2.1. Microelectrodos de potasio: medida de actividades de K+ 34 II.2.2.1.1. Minielectrodos de K+ 36 II.2.2.2. Microelectrodos de sodio: medida de actividades de Na+ 36 II.3 Diseño experimental 38 II.3.1. Caracterización del transporte de K+ en H. portulacoides 38 II.3.1.1. Incorporación de K+: experimentos de depleción en raíces 38 II.3.1.2. Caracterización electrofisiológica del transporte de K+ en células radiculares de plántulas crecidas en ausencia de Na+ 39 II.3.1.2.1. Efecto de la adición de K+ sobre el potencial de membrana 39 II.3.1.2.2. Efecto de la adición de Rb+ y de Cs+ sobre el potencial de membrana 40 II.3.1.2.3.Efecto del Rb+ y del Cs+ sobre el transporte de K+. Cálculo de la Ki 40 II.3.1.2.4. Efecto del Na+ sobre el transporte de K+ 41 Índice KARIMA AIT HAMMOU II II.3.1.3. Caracterización electrofisiológica del transporte de K+ en células radiculares de plántulas crecidas en presencia de Na+: efecto de la salinidad 41 II.3.1.3.1. Efecto de la adición K+ sobre el potencial de membrana 41 II.3.1.4. Efecto de distintos inhibidores e iones sobre el transporte de K+ en plántulas crecidas a salinidad creciente 42 II.3.1.4.1. Efecto del Cs+, Ba2+ y TEA+ 42 II.3.1.4.2. Efecto del pH 43 II.3.1.4.3. Efecto del NH4+ 43 II.3.1.5. Medida de la actividad citoplasmática de K+. Cálculo del gradiente de potencial electroquímico para K+ 44 II.3.2. Caracterización del transporte de Na+ en H. portulacoides 44 II.3.2.1.Incorporación de Na+: experimentos de depleción en raíces 45 II.3.2.2. Caracterización electrofisiológica del transporte de Na+ en células radiculares 45 II.3.2.2.1. Efecto de la adición de Na+ sobre el potencial de membrana 45 II.3.2.3. Efecto de distintos inhibidores e iones sobre el transporte de Na+ 45 II.3.2.3.1. Efecto del Rb+, Cs+ y Ba2+ 46 II.3.2.3.2. Efecto del pH 46 II.3.2.3.3. Efecto del Li+ y del Ca2+ 47 II.3.2.3.4. Efecto de la presencia de Na+ y K+ en el medio de cultivo 47 II.3.2.4. Medida de la actividad citoplasmática de Na+. Cálculo del gradiente de potencial electroquímico para Na+ 48 II.3.3. Homeostasis de Na+ en H. portulacoides 48 II.3.3.1 Efecto de la salinidad sobre el crecimiento de plántulas 48 II.3.3.2 Determinación de los contenidos totales de K+ y Na+ en tejidos de plántulas crecidas en ausencia y presencia de Na+ 49 II.3.3.3 Determinación de la permeabilidad relativa del Na+ con respecto al K+ (PNa+/PK+ ) en ausencia y presencia de Na+ 49 II.3.3.4. Efecto de la concentración externa de Na+ sobre la actividad citoplasmática de este ión en plántulas crecidas con o sin Na+. 51 II.4. Tratamiento de los datos 51 III. Resultados 55 III.1. Caracterización del transporte de K+ en H.portulacoides 55 III.1.1. Incorporación de K+ en raíces 55 III.1.2. Transporte de K+ en células radiculares de plántulas crecidas en ausencia de Na+ 55 KARIMA AIT HAMMOU Índice III III.1.2.1. Cinética de incorporación de K+ en células de la raíz 55 III.1.2.1.1. Cinéticas de incorporación de Rb+ y de Cs+ 57 III.1.2.2. Efecto del Rb+ y del Cs+ sobre el transporte de K+ 58 III.1.2.2.1. Cinéticas de incorporación de K+ en presencia de Rb+ 58 III.1.2.2.1.1. Tipo de inhibición. Cálculo de la Ki 60 III.1.2.2.2. Cinética de incorporación de K+ en presencia de Cs + 61 III.1.2.3. Efecto del Na+ sobre el transporte de K+ 62 III.1.3. Transporte de K+ en células radiculares de plántulas crecidas en presencia de Na+ : efecto de la salinidad 64 III.1.4. Efecto de distintos inhibidores e iones sobre el transporte de K+ en plántulas cultivadas a salinidad creciente 65 III.1.4.1. Efecto del Cs+ 66 III.1.4.2. Efecto del TEA+ 67 III.1.4.3. Efecto del Ba2+ 68 III.1.4.5. Efecto del pH sobre el transporte de K+ 70 III.1.4.6. Efecto del NH4+ 71 III.1.5. Actividad citoplasmática de K+ en células radiculares. Cálculo del !µ K+/F 75 III.2. Caracterización del transporte de Na+ en H. portulacoides 77 III.2.1. Incorporación de Na+ en raíces 77 III.2.2. Transporte de Na+ en células radiculares 78 III.2.3. Efecto del Rb+, Cs+ y Ba2+ sobre el transporte de Na+ 79 III.2.4. Efecto de la presencia de K+ y Na+ en el medio de crecimiento sobre el transporte de Na+ 80 III.2.5. Efecto del Li+, Ca2+ y pH sobre la incorporación de Na+ 82 III.2.6. Actividad citoplasmática de Na+ en células radiculares. Cálculo del !µNa+/F 84 III.3. Homeostasis citoplasmática de Na+ en H. portulacoides 86 III.3.1. Efecto del Na+ sobre el crecimiento de plántulas y sobre los contenidos totales de Na+ y K+ 86 III.3.2. Efecto del Na+ sobre la permeabilidad relativa Na+/K+ en células epidérmicas de la raíz 87 III.3.3. Efecto de la concentración externa de Na+ sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en ausencia del mismo 90 III.3.4. Efecto de la concentración externa de Na+ sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en presencia del mismo 92 Índice KARIMA AIT HAMMOU IV III.3.5. Efecto de la adición de inhibidores de la respiración sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en ausencia o en presencia de Na+ 94 IV. Discusión 99 IV.1. Transporte de K+ 99 IV.2. Transporte de Na+ 105 IV.3. Homeostasis citoplasmática de K+ y Na+ 110 IV.3. Modelo de incorporación y homeostasis de Na+ y K+ en H. portulacoides 118 V. Conclusiones 125 VI. Bibliografía 129 VII. Índice de Figuras 145 VIII. Índice de Tablas 151 Anexo 153 INTRODUCCIÓN KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 3 I. Introducción I.1. Las plantas halófitas: Aspectos generales de la tolerancia a la salinidad Los halófitos constituyen la flora natural de los suelos salinos y representan el 1% de la flora mundial. Así, estas plantas crecen en una gran variedad de ambientes salinos desde regiones costeras, como las marismas, a desiertos de interior, salares y estepas. Aunque se trata de una definición arbitraria, se considera que los halófitos son las plantas capaces de completar su ciclo de vida a concentraciones de sal (siendo el NaCl el tipo dominante) mayores o iguales a 200 mM (Flowers et al., 1986; Flowers y Colmer, 2008) y que, por tanto, se benefician de poseer cantidades substanciales de sal en el medio externo (Shabala, 2013). El resto de las especies menos tolerantes a la salinidad son denominadas glicófitas. Por otra parte, el hecho de incluir en la definición el ciclo de vida excluye a aquellas especies que toleran la salinidad pero que no viven habitualmente en suelos salinos (Flowers y Colmer, 2008). Siguiendo esta definición se considera que existen unas 350 especies de halófitas, que no se encuentran uniformemente distribuidas entre los taxones de las plantas con flores. Los órdenes con el mayor número de halófitos son las Cariofilales, que incluyen a géneros como Atriplex, Salicornia o Suaeda, y las Alismatales, que incluyen a géneros de plantas marinas como Zostera y Thalassia (Flowers et al., 2010). La distribución de las halófitas en diferentes familias indica un origen polifilético (Flowers et al., 1977), lo que explica que estas plantas empleen diferentes mecanismos de tolerancia a la salinidad (Flowers et al., 2010). La salinización del suelo puede ocurrir por causas naturales, tales como la geología local o la proximidad a zonas costeras, o ser causada por el hombre, por ejemplo, mediante el uso de agua de riego con altas concentraciones de sales (Maathuis, 2013). Además, la difusión de prácticas de riego no adaptadas a la variabilidad edáfica, el clima y los cultivos, con agua de mala calidad (Pitman y Läuchli, 2004), se traduce en una progresiva salinización del suelo. La salinidad del suelo puede producir estrés en las plantas de dos maneras (Munns y Tester, 2008). Las altas concentraciones de sal hacen que sea más difícil para las raíces extraer agua del suelo, al tener éste un potencial hídrico muy negativo, causando por tanto estrés hídrico a la planta, y una inhibición del crecimiento. Y, por otro lado, las sales pueden afectar al crecimiento celular y al metabolismo, debido a la toxicidad de los iones (estrés iónico). Así, el sodio y el cloro I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 4 pueden tener efectos tóxicos directos en las membranas y los sistemas enzimáticos. Otro efecto secundario del estrés salino es la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), que resultan especialmente destructivas para los lípidos, ácidos nucleicos y proteínas (Kant et al., 2006; Türkan y Demiral, 2009) y también para la maquinaria fotosintética. Una de las consecuencias de la generación de ROS es la acumulación de aldehídos altamente tóxicos, que son metabolizados por aldehído deshidrogenasas (Flowers et al., 2015). Así, el estrés salino, como otros tipos de estrés, inhibe el crecimiento de la planta. Una causa de la reducción del crecimiento es una menor tasa de fotosíntesis debida al cierre estomático y en consecuencia la limitación de la entrada de CO2. Más importante es, sin embargo, que el estrés inhibe directamente la división y expansión celular (Munns y Tester, 2008). De hecho, el bajo crecimiento de las plantas en zonas salinas es una característica adaptativa de las plantas para sobrevivir a este tipo de estrés. Así, en la naturaleza la capacidad de tolerar la salinidad o la sequía parece estar inversamente relacionada con la tasa de crecimiento. Sin embargo, los halófitos pueden crecer muy rápidamente en condiciones salinas, aunque el crecimiento disminuye cuando se alcanzan salinidades supraóptimas (Flowers y Colmer, 2008). La explicación de este último fenómeno no se conoce todavía, pero se cree que puede estar relacionada con la demanda energética de los procesos esenciales que determinan la tolerancia a la salinidad (Yeo, 1983; Flowers y Colmer, 2008). Se sabe que la tolerancia a la salinidad es un carácter complejo y que, como mínimo, requiere la combinación de diferentes caracteres: la acumulación y la compartimentación de iones para conseguir el ajuste osmótico; la síntesis de solutos compatibles; la capacidad para acumular nutrientes esenciales (especialmente K+) en presencia de concentraciones altas de otros iones, especialmente Na+; la capacidad para limitar la entrada de los iones Na+ y Clen la corriente transpiratoria, y relacionada con ésta, la capacidad de regular la transpiración en presencia de altas concentraciones de estos iones (Flowers y Colmer, 2008; Flowers et al., 2010). Además, la tolerancia a la salinidad a menudo forma parte de un síndrome más complejo que incluye también la tolerancia a la inundación (Colmer y Flowers, 2008) y a la sequía. Todas las plantas, no sólo los halófitos, poseen los mecanismos principales necesarios para tolerar la salinidad (por ejemplo, la compartimentación en vacuolas o la discriminación en la incorporación de K+ frente a Na+). Ello explica que las plantas se distribuyan en un continuo de tolerancia donde en un extremo se encuentran las especies de glicófitas que KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 11 presentan frente a los inhibidores (Maathuis y Sanders, 1996; Gierth y Maser, 2007; Britto y Kronzuker, 2008; Rubio et al., 2008; Alemán et al., 2011). El sistema de transporte de alta afinidad (HATS) funciona a concentraciones externas bajas (por debajo de 1 mM). Este sistema se satura y se puede analizar matemáticamente utilizando el modelo de Michaelis–Menten. En las glicófitas, el valor de la Km varía entre 13 y 130 µM, dependiendo de la especie estudiada (Maathuis y Sanders, 1996; Rubio et al., 2008; Szczerba et al., 2009). Por otra parte, se piensa que el transporte de K+ por este mecanismo esta acoplado a la entrada pasiva de protones, siguiendo su gradiente de potencial electroquímico (Maathuis y Sanders, 1994; Rodríguez-Navarro, 2000). Se ha mostrado que la importancia de la incorporación de K+ de alta afinidad es muy elevada en tejidos que contienen menos K+ (Kochian y Lucas, 1982). Además, el transporte de K+ de alta afinidad es sensible a NH4+ y se inhibe por Na+, especialmente a concentraciones externas en el rango milimolar (SantaMaría et al., 2000; Nieves-Cordones et al., 2007; Shabala y Cuin, 2007; NievesCordones et al., 2010). Muchos estudios moleculares en glicófitas han determinado que el transporte de alta afinidad de K+ esta dominado por la familia de transportadores KT/HAK/KUP (Fig. 1A), con una contribución menor de la familia de los transportadores HKT/Trk y CPA (Britto y Kronzuker, 2008; Szczerba et al., 2009; Alemán et al., 2011). Sin embargo, se ha propuesto también una contribución de canales de tipo AKT (Fig. 1A), que mediarían la incorporación pasiva de K+ desde concentraciones superiores a 0,01 mM (Hirstch et al., 1998; Alemán et al., 2011). El sistema de transporte de baja afinidad (LATS) funciona a concentraciones externas altas (superiores a 1 mM), y es insensible a la presencia de K+ (Kochian y Lucas, 1982) y NH4+ (Spalding et al., 1999; Santa-María et al., 2000). Se ha mostrado que la cinética del transporte de baja afinidad (LATS) es lineal, aunque a veces son saturantes, dependiendo de la metodología utilizada (Fu y Luan, 1998). En general, se considera que este transporte está mediado por canales, que pueden ser específicos para K+, canales AKT (inhibidos por Ba2+), o no específicos (Fig. 1A). En cualquier caso, el transporte se produce a favor de gradiente de potencial electroquímico (Szczerba et al., 2009). I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 12 Figura 1. Sistemas de transporte implicados en el transporte de K+ (A) y Na+ (B) en células radiculares. (A) Se indica el proceso de incorporación de K+ por la raíz en Arabidopsis thaliana (modificado de Alemán et al., 2001). El transporte de K+ estaría mediado por transportadores dependientes de protones HAK (HAK5 en el caso de Arabidopsis), inhibidos por NH4+, para concentraciones entre 0,001-1 mM K+ y por canales AKT (AKT1), inhibidos por Ba2+, para concentraciones mayores de 0.01 mM K+. Otros canales no específicos para K+ podrían permitir la entrada de K+ en el rango milimolar. (B) Se indican los principales transportadores implicados en la entrada de Na+ al interior celular: VI-NSCC, canales catiónicos no selectivos independientes del voltaje; LCT1, transportador de cationes de baja afinidad 1, ambos inhibidos por Ca2+; transportadores de tipo HKT, inhibidos por K+ y Ba2+ , mediarían el transporte de Na+ de alta afinidad. El transportador SOS1 excluye el Na+ del citoplasma y el NHX lo introduce en la vacuola, utilizando ambos el gradiente de H+ generado por las bombas de protones. Ba 2+ NH 4+ K + HAK5 K + AKT1 K + ? H + H + ADP ATP [K + ] ext (mM) 0,001 0,01 0,1 1 10 A Na + Na + H + ADP ATP HKT Na + LCT1 VI-NSCC H + Na + NHX Na + H + ATP ADP H + SOS1 H + PP i 2P i Ba 2+ K + Ca 2+ B KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 13 Algunos estudios sobre la incorporación de K+ en halófitas (Jefferies, 1973; Wickens y Cheeseman, 1991; Mori et al., 2011; Peng et al., 2004), han abordado algunos aspectos como la influencia del Na+ (Mori et al., 2011), o el efecto de varios inhibidores (Peng et al., 2004); sin embargo, existen muy pocas publicaciones sobre las cinéticas y afinidad de este transporte (Alemán et al., 2009). Por otra parte, en algunas especies de halófitas se han buscado homólogos de transportadores de K+ conocidos en glicófitas. Así, en Mesembryanthemum crystalinum se han encontrado!varios miembros de la familia de canales de potasio AKT/KAT, cuatro genes HAK y un miembro de la familia HKT (Sue et al., 2001, 2002, 2003). La expresión de estos genes en los tejidos de la planta y en levadura sugirió que los genes HAK podían estar implicados en la incorporación de K+ a alta salinidad en esta planta. De la misma manera, la expresión heteróloga del gen HAK de la halófita marina Cymodocea nodosa (Garciadeblás et al., 2002) también indicó la implicación de esta proteína en la incorporación de K+ de baja afinidad en esta planta. La supuesta implicación de los genes HAK en la incorporación de K+ en estas especies de halófitas contrasta con la inhibición por Na+ de la expresión de algunos transportadores HAK observada en algunas plantas glicófitas (NievesCordones et al., 2010). En definitiva, aunque se ha obtenido alguna información valiosa sobre la incorporación de K+ en halófitas desde el enfoque molecular, todavía se requiere evaluar las características funcionales del proceso de transporte de K+ en este grupo de plantas (Flowers y Colmer, 2008). I.2.5. Incorporación de Na+ Como se ha comentado anteriormente, la incorporación de Na+ es fundamental para la fisiología de las halófitas y éstas pueden mantener altas tasas de incorporación neta de este ión sin que la planta sufra daños (Flowers y Colmer, 2008). De hecho, pueden contener concentraciones de Na+ y de Cl- (también usado para el ajuste osmótico) superiores a 500 mM, referido a contenido de agua en el tejido (Flowers, 1985). Sin embargo, todavía no se conoce bien cómo entra el ión Na+ en las raíces de las halófitas (Flowers y Colmer, 2008; Cheeseman, 2013), así como tampoco en glicófitas (Kronzuker y Britto, 2011). El flujo de Na+ al interior de la planta, que muestra valores similares a la incorporación neta de Na+ en halófitos (Flowers y Colmer, 2008), se ha medido en I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 14 algunas especies de halófitas a concentraciones externas en el rango 25-500 mM NaCl (Jefferies, 1973; Shepherd y Bowling, 1979; Mills et al., 1985; Yeo y Flowers, 1986; Lazof y Cheeseman, 1988; Shennan et al., 1987; Wang et al., 2006; Wang et al., 2007), esto es, en el rango de baja afinidad. Sin embargo, sólo trabajos más recientes en las especies Thellungiella halophila (Wang et al., 2006), una especie tolerante a la salinidad y próxima a Arabidopsis, y Suaeda maritima (Wang et al., 2007), se han centrado en el estudio del mecanismo de transporte de Na+. Sin embargo, en plantas glicófitas este mecanismo se ha estudiado con mayor profundidad debido a sus implicaciones con respecto a la tolerancia a la salinidad de los cultivos. Así, se ha propuesto que varios sistemas de transporte de la membrana plasmática podrían estar involucrados en la incorporación de Na+ de baja afinidad en glicófitas, cuando éstas se encuentran en condiciones de alta salinidad (Horie y Schroeder, 2004; Apse y Blumwald, 2007; Zhang et al., 2010; Kronzucker y Britto, 2011; Maathuis, 2013; Kronzucker et al., 2013). Estos sistemas de transporte podrían, por tanto, estar también implicados en el caso de la incorporación de Na+ en halófitas. Una de las propuestas iniciales fue que los canales catiónicos no selectivos (NSCC, Fig. 1B) podrían participar en la incorporación de Na+ de baja afinidad en glicófitas (Amtmann y Sanders, 1999); más tarde, también se sugirió que estos canales tendrían ese mismo papel en el caso de la halófita T. halophila (Wang et al., 2006; Demidchick y Maathuis, 2007). Sin embargo, el papel de los NSCC en este proceso ha sido puesto en discusión recientemente (Kronzuker y Britto, 2011). Posteriormente se propuso la implicación del transportador de cationes de baja afinidad 1 (LCT1, Fig. 1B), aislado originalmente en trigo (Amtmann et al., 2001), pero dado que dicho transportador se inhibe por Ca2+, su papel en ambientes salinos, donde la concentración de Ca2+ es alta, se ha considerado poco probable (Zhang et al., 2010). Por otro lado, también se ha propuesto que transportadores de K+, tales como los transportadores de tipo HAK y HKT, así como canales selectivos de K+ (tales como AKT1) podrían estar implicados en la incorporación de Na+ en glicófitas (Santa-María et al., 1997; Garciadeblás et al., 2003; Goldack et al., 2003). De entre todos estos transportadores de la membrana plasmática, sólo los transportadores de tipo HKT y los canales AKT1 se han implicado en la incorporación de Na+ de baja afinidad en la especie halófita Suaeda maritima (Wang et al., 2007). KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 15 En glicófitas, no sólo se ha observado un transporte de Na+ de baja afinidad, sino que también se ha detectado una incorporación de alta afinidad. Así, algunas especies de plantas glicófitas pueden incorporar Na+ del medio a concentraciones externas tan bajas como las que se dan en el caso de la incorporación de K+ de alta afinidad (Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006). Una explicación probable para la incorporación de un ion, que es tóxico en el caso de las glicófitas, es que el Na+ es un sustituto adecuado del ión K+ cuando la baja disponibilidad de éste restringe el crecimiento de la planta (Marschner, 1995; Subbarao et al., 2003; Horie et al., 2007). Este proceso podría haber sido importante en estados iniciales de la evolución de las plantas terrestres, cuando la baja disponibilidad de K+ en el medio era frecuente (Beerbower, 1985). Este transporte de Na+ de alta afinidad, inicialmente descrito por Rains y Epstein (1967) en cebada, fue más tarde caracterizado mediante técnicas moleculares, y se ha demostrado que es diferente del transporte de K+ de alta afinidad presente en las plantas terrestres. Este transporte se ha descrito en el arroz, la cebada, el trigo y el girasol (Garciadeblás et al., 2003) y se demostró que era llevado a cabo por transportadores de tipo HKT en el arroz; y también parece que es así en el caso de la cebada y el trigo (Garciadeblás et al., 2003, Haro et al., 2005, Horie et al., 2007). El grupo de transportadores HKT, inicialmente descritos como transportadores de K+ de alta afinidad (Schachtman y Schroeder, 1994), ha resultado finalmente ser un grupo muy complejo (Corratge-Faillie et al., 2010), con diferentes familias que han sido principalmente implicadas en el transporte de Na+ en el rango de baja o de alta afinidad (Haro et al., 2010). En el arroz, la cebada y en el trigo, el transporte de Na+ de alta afinidad mediado por HKT es inhibido por K+ y Ba2+ (Fig. 1B) y se puede observar solamente cuando la planta se cultiva a una baja concentración de K+ y Na+ en el medio (Garciadeblás et al., 2003; Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006; Horie et al., 2007). En un estudio más amplio sobre el transporte de Na+ de alta afinidad, se analizaron varias especies de monoy dicotiledóneas, así como dos plantas sin flores (una especie de musgo y otra de hepática) y, en todos los casos, se detectó la existencia de un transporte de Na+ de alta afinidad (Haro et al., 2010). Sin embargo, las características del transporte de alta afinidad en estas especies eran distintas de las del arroz, ya que ni el Ba2+ y ni el K+ inhibieron el transporte de Na+. Se propuso entonces que otros transportadores, distintos a los HKT, podrían estar implicados en el transporte I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 16 de Na+ de alta afinidad en estas especies (Haro et al., 2010). Parece entonces que el transporte de Na+ de alta afinidad es una característica común de las plantas terrestres desde las briófitas a las plantas con flores (Haro et al., 2010). Sin embargo, los estudios de transporte de Na+ en halófitas, como se mencionó anteriormente, se han centrado en la incorporación de Na+ en el rango milimolar, ya que ésta es la concentración presente usualmente en el entorno de la planta. No obstante, considerando lo anterior, se plantea la cuestión de si el transporte de Na+ de alta afinidad podría estar presente en especies halófitas, y si ese transporte sería diferente del transporte de K+ de alta afinidad, como se ha observado en las plantas glicófitas. I.3. Halimione portulacoides (L.) Aellen Halimione (=Atriplex) portulacoides (L.) Aellen es una halófita perenne, arbustiva, que crece en las marismas alrededor de las costas de Europa, África del Norte y Sudoeste de Asia. Es la especie dominante en la parte alta de las marismas bien drenadas y a menudo bordea canales o estanques que son inundados frecuentemente en la marea alta (Chapman, 1950). Como consecuencia, H. portulacoides se expone a salinidades cercanas a la del agua del mar. Se ha demostrado experimentalmente que puede crecer en un rango amplio de salinidad, mostrando un índice de crecimiento máximo alrededor de 100-200 mM de NaCl, que va disminuyendo a concentraciones de NaCl mayores de 400 mM (Jensen, 1985; Redondo-Gómez et al., 2007). Así, su alta productividad y su capacidad para crecer en suelos contaminados por metales pesados (Sousa et al., 2008) hace de ésta una especie potencial para la recuperación de suelos salinos y para fitorremediación. Se han estudiado varios aspectos de los mecanismos de tolerancia a la salinidad de H. portulacoides, como la acumulación de sal en las hojas (Jensen, 1985), y su capacidad de eliminarla a través de glándulas epidérmicas (Schirmer y Breckle, 1980; Freitas y Breckle, 1992) o la acumulación de compuestos de amonio cuaternario utilizados como osmolitos (Stewart et al., 1979). Se trata, por tanto de una especie de tipo inclusor. Además, se ha analizado el efecto de la salinidad en la actividad fotosintética (Redondo-Gómez et al., 2007; Benzarti et al., 2012; Duarte et al., 2013), así como en los niveles de polifenoles, prolina y la actividad antioxidante de las hojas (Benzarti et al., 2012). Sin embargo, no hay información disponible sobre las KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 17 características de la incorporación de K+ y Na+ de esta especie, que puede ser esencial para comprender el mecanismo de tolerancia a la salinidad de esta planta, ni sobre la permeabilidad relativa Na+/K+ de la membrana plasmática de sus células. Por otra parte, aunque se han analizado los contenidos totales de K+ y Na+ en plantas crecidas a distintas concentraciones de NaCl, tanto en hojas (Redondo-Gómez et al., 2007, Benzarti et al., 2012, Duarte et al., 2013), como en raíces (Redondo-Gómez et al., 2007), se desconoce cuál es la actividad citoplasmática de ambos iones y cómo varían con la salinidad. Sería por tanto de gran valor poder obtener medidas de la concentración de ambos iones y determinar así el valor de la relación K+/Na+ citoplasmática a distintas concentraciones de NaCl, aspecto fundamental para la tolerancia a la salinidad (Amtmann y Sanders, 1999). Además, conocer la actividad citoplasmática de K+ y Na+ es fundamental para saber si estos iones penetran en la célula a través de un transporte activo o pasivo. Por otra parte, el análisis de la variación de la actividad citoplasmática del ión Na+ en presencia de inhibidores de la respiración, podría ser indicativo de la implicación de transportadores de tipo SOS1 en el mecanismo de tolerancia a la salinidad de esta especie. Este tipo de estudios puede realizarse utilizando técnicas electrofisiológicas que permiten medir no sólo el potencial de membrana, sino también la actividad citoplasmática de un ión determinado. H. portulacoides crece, entre otras zonas del Sur de la Penísula Ibérica, en el estuario del río Palmones (Algeciras, Cádiz). Las raíces de las especies que habitan en la marisma de este estuario son bañadas por el agua de mar, con distinta frecuencia según su posición en la marisma, y soportan concentraciones de Na+ y Clen el agua intersticial del sedimento donde viven de entre 500-1700 mM NaCl, según la época del año (Palomo, 2004). El pH del agua intersticial es ligeramente alcalino (8,3; Rubio et al., 2003), aunque presenta oscilaciones con la profundidad del sedimento (Palomo, 2004). Este agua intersticial presenta elevadas concentraciones de ciertos nutrientes, aunque bajas de algunos otros (Rubio et al., 2003). Entre los nutrientes que se presentan a mayor concentración, y que, en principio, no serían limitantes para el crecimiento de las plantas, se encuentra el amonio (0,3-1,5 mM NH4+) y el fosfato (6-112 !M Pi). Sin embargo, la concentración de nitrato es baja (0-9 !M NO3-), debido a las condiciones reductoras del sedimento durante la mayor parte del año (Palomo, 2004). Por otra parte, la concentración de K+ se sitúa entre 5 mM en la estación húmeda y 20 mM K+ en la estación seca. Así, en invierno, la concentración de K+ se encuentra en sus niveles más I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 18 bajos, mientras que los niveles de amonio pueden seguir siendo elevados, por encima de 1,5 mM (Palomo, 2004). Ello determina que, eventualmente, en situación de limitación de K+ las raíces de esta especie tendrían que incorporarlo a través de sistemas de alta afinidad, es decir, a través de transportadores de K+ dependientes de protones (Rodríguez-Navarro, 2000). Estos transportadores, como se ha indicado anteriormente, son sensibles a amonio, sin embargo los canales AKT, capaces también de incorporar K+ en el rango micromolar (Hirsch et al., 1998), no son sensibles a este ión (SantaMaría et al., 2000). Se plantea por tanto qué tipo de mecanismos de incorporación de K+ estarían presentes en H. portulacoides y cómo se verían influidos por el amonio externo. Por otra parte, dado que la concentración de K+ puede ser baja en el agua intersticial del sedimento, aún cuando la de Na+ se sigue manteniendo elevada, y se sabe que éste puede inhibir el transporte de K+ (Hasegawa et al., 2000), sería importante determinar qué ocurre también con la incorporación de K+ a concentraciones elevadas de Na+, dado que esta sería la situación habitual en el entorno de la planta. El análisis del transporte de K+ puede realizarse usando técnicas electrofisiológicas, dado que el flujo de iones a través de la membrana plasmática, se refleja en variaciones del potencial de la misma. Por otra parte, el uso de inhibidores del transporte de K+, mencionados anteriormente, así como el efecto de otros iones, puede ayudar a determinar la contribución de uno u otro sistema de transporte en la incorporación de K+ en H. portulacoides. La incorporación de Na+, necesario para el ajuste osmótico, se daría por definición a través de un transporte de baja afinidad en el medio donde se desarrolla esta especie. No obstante, como se ha indicado anteriormente, existe la posibilidad de que todas las plantas terrestres muestren la capacidad de incorporar este ión a concentraciones externas en el rango micromolar, es decir, con alta afinidad, a través de un transporte con características diferentes al transporte de K+. Dicho estudio puede realizarse igualmente mediante electrofisiología, pero es necesario trabajar con plantas que hayan estado sometidas a deficiencia tanto de Na+ como de K+, lo cual es más efectivo partiendo de plántulas obtenidas a partir de semillas. Igualmente, el estudio del transporte de K+ en deficiencia de este ión se facilita partiendo de plántulas cultivadas en deficiencia de K+. Dado que se pueden obtener plántulas de H. portulacoides a partir de semillas con un alto porcentaje de éxito en la germinación si éstas se germinan en agua destilada (Redondo-Gómez et al., 2007), la mayoría de los estudios presentados en KARIMA AIT HAMMOU I. Introducción 19 esta memoria se realizaron en plántulas obtenidas de semillas de H. portulacoides procedentes de plantas del estuario del río Palmones. Por otra parte, en todos los casos, las medidas electrofisiológicas se realizaron sobre células epidérmicas de la raíz, fundamentales en el proceso de incorporación de iones. Analizar y comprender el papel que la incorporación de K+ y la homeostasis citoplasmática de Na+ y K+ tienen en el mecanismo de tolerancia a la salinidad de H. portulacoides, utilizando técnicas electrofisiológicas, ha sido el objetivo principal del presente trabajo. Determinar la existencia o no de un transporte de alta afinidad para Na+ en esta especie y su relación con el transporte de K+, ha constituido un objetivo adicional que, sin embargo, puede contribuir a comprender el mecanismo de transporte de Na+ de esta especie, aspecto fundamental también en la tolerancia a la salinidad. I. Introducción KARIMA AIT HAMMOU 20 I.4. OBJETIVOS 1.- Estudiar las características del transporte de K+ en células radiculares de H. portulacoides y la contribución de canales o transportadores en dicho proceso, determinando los parámetros cinéticos de dicho transporte y analizando el efecto de inhibidores del transporte de K+ en plantas crecidas a salinidad creciente. 2.- Analizar y caracterizar el transporte de Na+ en el rango micromolar en células radiculares de H. portulacoides, determinando sus parámetros cinéticos y el efecto de inhibidores del transporte de Na+ y K+ sobre dicho transporte. 3.- Analizar el proceso de homeostasis citoplasmática de Na+ y K+ en células radiculares de H. portulacoides mediante la determinación de la permeabilidad relativa de la membrana plasmática a estos iones, el índice Na+/K+ citoplasmático y el estudio de la variación de la concentración citoplasmática de Na+ en plantas crecidas a distinta salinidad. KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 27 Las plántulas obtenidas tras la geminación de semillas se cultivaron habitualmente en placas de Petri sobre medio semisólido. Así, tras 2 o 3 días en agua destilada y una vez germinadas las semillas, las plántulas se transferían a placas de Petri que contenían un medio de cultivo simplificado compuesto por 2 mM CaCl2, 0,7% (p/v) de fitoagar y sales adicionales en función del diseño experimental (ver apartado II.3). El cultivo en medio semisólido se realizó en las mismas condiciones de luz y temperatura que las descritas para la germinación (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 25ºC). En experimentos de crecimiento (ver apartado II.3.3.1), las plántulas obtenidas de la germinación se cultivaron en hidroponía y se transfirieron a tubos de cristal (Sigma), soportándolas en una malla de plástico de manera que las raíces permanecían sumergidas en medio líquido mientras que la parte aérea se desarrollaba en ambiente seco (Fig. 5). En cada tubo se disponían tres plántulas y se rellenaba con 30 mL de medio Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950) diluido ! y ajustado a pH 7,3 con KOH con una determinada concentración de NaCl (Fig. 5). Las plántulas se cultivaron a 25ºC con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a una intensidad de luz de 30 µmol fotones m-2 s-1. Figura 5. Cultivo de las plántulas obtenidas tras la germinación de semillas en hidroponía II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 28 II.2. Electrofisiología El estudio de los procesos fisiológicos que generan flujos eléctricos a través de las membranas celulares se denomina Electrofisiología. Esta técnica permite la medida del potencial de membrana (Em), insertando un electrodo de diámetro pequeño (microelectrodo simple) en el interior celular (Felle, 1981) y también de actividades iónicas intracelulares utilizando microelectrodos dobles (Ammann, 1986). En cualquier caso, para que la punta del microelectrodo atraviese la membrana plasmática sin alterar el funcionamiento de la célula, el diámetro de su punta debe ser pequeño, en torno a 0,5 µm, permitiendo que, una vez perforada la membrana, ésta se selle alrededor del microelectrodo (Fig. 6). Figura 6. Microelectrodo introducido en una célula de la epidermis radicular de H. portulacoides. II.2.1 Medida del potencial de membrana La medida del Em se obtiene midiendo la diferencia de potencial eléctrico entre un microelectrodo insertado en la célula y un electrodo de referencia situado en el medio externo. Esta medida se realizó en células radiculares de H. portulacoides utilizando secciones de raíces de 1,5 cm de longitud desde la zona apical. Éstas se fijaban por los extremos con parafina fundida a una cámara de perfusión, la cual presentaba un volumen útil de aproximadamente 1,1 mL. KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 29 La cámara de perfusión con la sección de la raíz fijada se colocaba en la platina de un microscopio (Leitz, Laborlux S) y se conectaba a un sistema de tubos (Fig. 7B), que permiten hacer fluir el medio de ensayo desde un matraz situado por encima del microscopio (Fig. 7A). El medio cae impulsado por gravedad, con un flujo que se mantenía constante a 10 mL/min. El exceso de medio se retiraba mediante una aguja o una pipeta Pasteur conectada a una bomba de succión (Fig. 7B). El flujo continuo de medio asegura el mantenimiento de la temperatura y de la composición de iones y de gases en el medio de ensayo. Para la aplicación de un tratamiento determinado, se accionaba una llave de paso de tres vías que permitía el cambio de medio ensayo sin alteraciones de flujo. La medida del potencial de membrana se realizaba insertando dentro la célula de la raíz un microelectrodo (de medida) de vidrio relleno de una solución 0,5 M de KCl para permitir la conducción de la corriente eléctrica a través del mismo. Fuera de la célula se situaba el microeletrodo de referencia, o “tierra” (Felle, 1981). Éste presentaba un diámetro de punta mayor, y se rellenaba con 0.5 M KCl, solidificado con agar al 3 % (p/v). Los microelectrodos se fabricaron a partir de capilares de vidrio de borosilicato, con un diámetro interno de 0,75 ± 0,05 mm y el externo de 1,5 ± 0,05 mm (Hilgenberg, nº1103203). Dichos capilares de vidrio contienen un filamento interno sólido de 0,2 mm de diámetro, cuya función es facilitar el llenado de los microelectrodos con la solución. Los microelectrodos se fabricaron estirando capilares de una longitud aproximada de 5 cm en un estirador (“puller”) vertical (Narishge Instruments, modelo PE-21). El “puller” consta de un filamento enrollado que rodea al capilar de vidrio en la zona donde se forma la punta del microelectrodo. La longitud y el diámetro de las puntas dependen tanto de la temperatura que alcanza el filamento, como de la duración del estiramiento. Los microelectrodos de referencia se fabricaron a partir de microelectrodos de medida usados, a los que se rompía la punta. Para realizar las medidas del potencial de membrana los microelectrodos de medida y de referencia se colocan en portaelectrodos (o “holders”, Fig. 7B) que contienen una base de Ag-AgCl (Felle, 1981), permitiendo así el paso de la corriente desde el microelectrodo hasta una sonda conectada a un electrómetro diferencial de alta II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 30 impedancia (WPI; modelo Duo 773). Dicho electrómetro mide la diferencia de potencial eléctrico existente entre ambos microelectrodos. Esta señal se transfería a un registrador de papel (KIPP and ZONEN; modelo BD-12, Fig. 7A), obteniéndose una medida en continuo del potencial de membrana. Todo el proceso de inserción del microelectrodo en la raíz fue realizado bajo el microscopio y mediante la acción de un micromanipulador eléctrico (Narishige, MO109, Fig. 7A), que permite posicionar el microlectrodo a pocas micras de la célula, y un micromanipulador hidráulico de aceite (Narihige, MM-88), que permite la inserción posterior del microelectrodo en la célula. Todo el sistema, acoplado al microscopio, se monta sobre un tablero flotante, para evitar vibraciones, y dentro de una caja de Faraday, para eliminar las posibles interferencias de campos electromagnéticos (Fig. 7A). II.2.1.1. Medida del flujo de iones mediante la medida del potencial de membrana Puesto que tanto el ión motriz como los iones que se transportan a través de la membrana celular poseen una carga neta, cuando el balance de cargas es distinto de cero, el transporte de nutrientes a través de la membrana plasmática genera una señal eléctrica. Así, el cambio en el Em (generalmente despolarizaciones, "Em), asociado al movimiento de una cantidad de carga neta a través de la membrana como consecuencia del transporte de un ión o molécula, puede registrarse mediante la medida en continuo del Em con un microelectrodo insertado en una célula concreta, sometida a la adición de concentraciones crecientes de un nutriente determinado. De este modo, cuanto mayor sea la cantidad de sustrato que se transporte, mayor será la señal eléctrica que se genere y, por tanto, se registrará una mayor despolarización, pudiendo alcanzar un valor máximo (Dmax) en el caso de que el transporte se sature. Asimismo, si las despolarizaciones inducidas por concentraciones crecientes de un sustrato se ajustan al modelo de saturación de Michaelis-Menten, la Vmax o capacidad máxima del transportador es análoga a la Dmax (Glass et al., 1992) y la constante de semisaturación (Km) viene determinada por la concentración de sustrato que da lugar a una despolarización cuyo valor es la mitad de la Dmax. KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 31 Figura 7. Componentes de un puesto de electrofisiología (A) y detalle de la cámara de perfusión y microelectrodos (B). A. 1. Caja de Faraday; 2. Mesa antivibración; 3. Amplificador; 4. Registrador; 5.Macropanipulador; 6. Cámara de perfusión B. 1. “Holder” y microelectrodo de referencia; 2. “Holder” y microelectrodo de medida; 3. Aguja de succión; 4. Objetivo del microscopio; 5. Tubo de entrada de medio de ensayo; 6. Cámara de perfusión 1 6 4 3 2 5 II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 32 II.2.2. Medida de la actividad iónica: fabricación de microelectrodos selectivos para iones Los microelectrodos selectivos para un ión permiten la medida de la diferencia de potencial generada por la actividad de dicho ión en presencia de otros iones (Ammann, 1986). A diferencia de otras metodologías, los microelectrodos permiten realizar una medida en continuo de la actividad intracelular de un ión en células intactas (Amtman, 1986; Felle y Bertl, 1986; Felle, 1994; Walker et al., 1995; Miller et al., 2001; Carden et al., 2003; Rubio et al., 2005; Ait Hammou et al., 2014). Sin embargo, para aplicar correctamente esta técnica se deben satisfacer varios requisitos (Felle y Bertl, 1986); que no se vea alterada la actividad del ión que se mide por el uso del sensor; que el compuesto selectivo (sensor) no altere el metabolismo celular; que la calibración del sensor tenga en cuenta solamente asunciones demostrables; y que el método discrimine entre compartimentos. La medida de la actividad iónica intracelular requiere la medida simultánea del potencial de la membrana, por lo que se ha de trabajar con microelectrodos dobles. Estos microelectrodos selectivos para iones suelen fabricarse a partir de capilares dobles de vidrio de borosilicato. Una de las barras se rellena solamente con un electrolito, como en el caso de los electrodos simples (apartado II.2.1); mientras que la otra barra del capilar contiene, además del electrolito, un sensor selectivo para el ión cuya actividad se desea medir (Fig. 8). Cada una de las barras del microelectrodo doble se conecta al electrómetro y cuando el microelectrodo doble se introduce en una célula, el electrómetro registrará dos señales diferentes. Así, la barra del microelectrodo que sólo contiene el electrolito mide el Em (señal B) y la barra que alberga el sensor mide la suma del Em más la diferencia de potencial debida a la actividad del ión para el que es selectivo (señal A). Por tanto, la diferencia de las dos señales (A-B), que también es registrada por el electrómetro, es la diferencia de potencial eléctrico de dicho ión. Para que esta diferencia de potencial para un ión concreto pueda ser establecida, es necesario que el electrolito en contacto con el sensor contenga dicho ión. Así, según se explica en los apartados siguientes, cuando la punta del microelectrodo selectivo se introduce en una solución con una concentración determinada del ión para el que es selectivo, se transmite una señal eléctrica proporcional a la diferencia entre la actividad del ión entre KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 33 el exterior (solución) y el interior del microelectrodo, la cual puede ser calibrada frente a concentraciones externas conocidas del ión para el que el sensor es selectivo. Los microelectrodos dobles se obtuvieron a partir de vidrio de borosilicato de doble barra cuyos diámetros externos eran de 1,5 y 0,75 mm y los internos de 0,87 y 0,35 mm respectivamente (Hilgenberg, nº 1109104). Las dos barras contienen un filamento interno sólido que permite el llenado de las mismas fácilmente. Se cortaban trozos de capilar de unos 12 cm de longitud y se fijaban en un “puller” horizontal (Narishige, modelo PD-5). Del mismo modo que el “puller” vertical, el horizontal consta de un filamento enrollado que permite calentar el capilar de vidrio hasta una temperatura predeterminada. Una vez caliente, se giraba el capilar sobre sí mismo 180º, se estiraba lentamente y finalmente se separaba en dos partes con puntas similares. El diámetro de estas puntas depende de la temperatura alcanzada por el filamento, de la duración del estiramiento y de la fuerza con la que se produce la rotura. Una vez fabricados los microlectrodos, se cortaba la barra de menor diámetro para evitar la mezcla de los contenidos de las barras durante su llenado. La fabricación de los microelectrodos se produce en tres pasos (Felle y Bertl, 1986; Fernández et al., 1999): Deshidratación: Después de estirar el vidrio, los microelectrodos se colocan en una estufa (P-Selecta, modelo 208) a 180 Cº durante 30 - 45 minutos para deshidratarlos. Silanización: A los microelectrodos aún calientes, se les añade unas gotas de dimetildicloro-silano (DDS, Fluka nº40136) disuelto en benceno al 0,1 % (v/v) y se mantienen dentro de la estufa a 180 Cº durante una hora más. Tras la silanización, los microelectrodos se colocan en un cristalizador con gel de sílice hasta su enfriamiento. Llenado: La barra del microelectrodo de mayor diámetro se rellena con el sensor iónico. Para ello se procede a mezclar la resina selectiva con una solución de cloruro de polivinilo (PVC, Fluka nº 81392) disuelto en tetrahidrofurano (THF, Fluka nº 87369) al 4 % (p/v). Finalmente, los microelectrodos se colocan dentro de un cristalizador con gel de sílice en posición vertical a fin de permitir que THF se evapore. Así, la resina se adsorbe a las paredes internas del vidrio y se eliminan las burbujas de aire generadas durante el llenado. II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 34 II.2.2.1. Microelectrodos de potasio: medida de actividades de K+ Los microelectrodos selectivos para K+ se fabricaron siguiendo el protocolo descrito por Mithöfer et al., 2005, con pequeñas modificaciones (Leidi et al., 2010; Ait Hammou et al., 2014). La resina selectiva de K+ se preparó a partir del cóctel comercial Potasium Ionophore I cocktail B (Fluka Nº 60398). Se preparaba una disolución de PVC en THF, 4% (p/v) y la resina comercial se mezclaba con dicha en una proporción 30/70 (v/v) (Mithöfer et al., 2005, Leidi et al., 2010; Ait Hammou et al., 2014). Una vez que el THF se evaporaba, justo antes de usar el microelectrodo, se procedía con el llenado de cada una de las barras con el electrolito. La barra que contiene la resina se rellenaba con 500 mM KCl, y se insertaba en un portaelectrodos que se conectaba a la sonda A del electrómetro. Por otra parte, la barra de menor diámetro se rellenaba también con 500 mM KCl y se conectaba al canal B del electrómetro a través de un hilo de Ag clorinado en los extremos y recubierto de teflón en la zona en contacto con el aire (Fig. 8). Figura 8. Microelectrodo doble conectado a las sondas A y B del electrómetro. La punta del microelectrodo doble, así como la del electrodo de referencia, localizado a la izquierda de la imagen, se sitúa en el interior de la cámara de perfusión. Tras conectar el electrodo de referencia, la diferencia entre las dos señales (señal A - señal B) que se registra en el electrómetro corresponde a la diferencia de potencial eléctrico para K+. Dicha diferencia se calibraba, antes y después de utilizar los microelectrodos, con diferentes soluciones de KCl (de 1 a 500 mM), ajustadas a la misma fuerza iónica por la adición de MgCl2 (Walker et al., 1995). Antes de usarlos, los KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 35 microelectrodos se sumergían durante unos 30 minutos en una solución de 500 mM KCl. La calibración se realizó mediante el ajuste a un modelo lineal de la señal emitida por la barra del microelectrodo rellena con el sensor de K+ frente a concentraciones crecientes de K+. Así, la señal emitida por el microelectrodo (E) viene determinada, en mV, por el potencial de Nernst (ENj) para K+ (Ecuación 1) E = (RT / zF) ln ([K+]e / [K+]i) (Ecuación 1 ) donde R es la constante de los gases (8,31 J K-1 mol-1), T es la temperatura absoluta, z es la carga del K+ (+1), F la constante de Faraday (96,5 J mol-1 mV-1) y los subíndices “e”, “i” se refieren a la concentración de K+ en la solución de calibración y en el electrolito (interior del microelectrodo), respectivamente. Por ser fija la concentración de K+ del electrolito (500 mM K+) la ecuación anterior puede reescribirse como: E = E0 - S log [K+]e (Ecuación 2 ) donde E0 es el potencial del electrodo cuando la [K+]e = 1 M y S es la pendiente en mV que corresponde al incremento en la señal eléctrica cuando la concentración de K+ se incrementa en un orden de magnitud. La pendiente de las curvas de calibración de los microelectrodos de K+ utilizados fue próxima a 49 mV/pK+. La actividad citoplasmática de K+ se calculó multiplicando el valor de la concentración citoplasmática obtenido por el coeficiente de actividad de K+ (!). Dicho coeficiente se obtuvo de la pendiente del ajuste lineal de la actividad iónica correspondiente a cada concentración de K+ presente en las soluciones de calibración de los microelectrodos (Leidi et al., 2010). Las medidas de la actividad citoplasmática de K+ se realizaron en células epidérmicas de la raíz, fijando la raíces en la misma cámara de perfusión y utilizando el mismo sistema descrito para la medida de Em (apartado II.2.1). II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 36 II.2.2.1.1. Minielectrodos de K+ Los electrodos selectivos para K+ pueden utilizarse también para la medida de la concentración externa de dicho ión, denominandose entonces minielectrodos. La fabricación de dichos minielectrodos para uso externo es parecida a la descrita para los microelectrodos intracelulares, con algunas diferencias. Se usa vidrio simple, similar al empleado para las medidas de potencial de membrana, que se estira con un “puller” de patch-clamp (PC-10 Narishige), obteniéndose un diámetro de punta aproximado de 2 #m (Felle et al., 2000). Posteriormente las barras de vidrio se deshidratan, silanizan y rellenan con el sensor de K+ de la misma forma que se ha descrito para los microelectrodos de aplicación interna (Ait Hammou et al., 2014). Una vez evaporado el THF, los minielectrodos, almacenados en ambiente seco, se rellenan con la solución de electrolito (500 mM KCl) y se conectan al canal A del electrómetro, en el mismo sistema que el usado para las medidas de potencial de membrana. La punta del minielectrodo se sumerge en una cámara de perfusión, de $ 0,5 mL de volumen, en la que también se sumerge el electrodo de referencia, relleno con 0,5 M KCl solidificado con agar (0,03 %, p/v). La medida de la concentración de K+ externa se realiza haciendo fluir soluciones a través de la cámara de perfusión a una velocidad de 1 mL min-1. La señal del minielectrodo se registra en continuo, conectando el electrómetro de alta impedancia FD223a (WPI) al registrador en papel. Al igual que en el caso de los microelectrodos de uso interno, la señal de los minielectrodos de K+ se calibraba antes y después de realizar las medidas en el mismo medio en el que se deseaba conocer la concentración de K+ en presencia de concentraciones crecientes de este ión (de 0,1 a 10 mM KCl). En este caso, los valores de la pendiente de las curvas de calibración de los minielectrodos de uso externo fueron próximos a 42 mV/pK. II.2.2.2. Microelectrodos de sodio: medida de actividades de Na+ Los microelectrodos selectivos para Na+ se fabricaron siguiendo el protocolo descrito por Fernández et al., 1999 para microelectrodos selectivos para H+, con pequeñas modificaciones (Carden et al., 2001; Rubio et al., 2005). La resina selectiva de Na+ se preparó a partir del cóctel comercial de Fluka nº 71176, mezclado con la solución de PVC disuelto en THF (4 % p/v) en una proporción 1:6 (v/v). Al igual que en el caso de los microelectrodos de K+, la mezcla formada por el cóctel para Na+ y la solución de PVC se introducía en el interior de la barra de mayor KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 43 II.3.1.4.2. Efecto del pH Con el fin de estudiar el efecto del pH sobre el transporte de K+, se utilizó el mismo medio de crecimiento pero tamponado con 10 mM MES-Bis Tris propano, ajustando el pH a distintos valores (5,3; 7,3 y 9,3). El experimento se iniciaba con el medio tamponado a 7,3. Una vez conseguido un valor estable del potencial de membrana, se añadía 1 mM K+, registrándose la despolarización inducida. A continuación se cambiaba el medio de ensayo por otro medio tamponado a pH 5,3 ó 9,3. Se esperaba un tiempo a que el potencial de membrana se estabilizase tras el cambio de pH y se volvía a añadir la misma concentración de K+. El efecto del pH se analizó en plántulas crecidas a las distintas concentraciones de sodio indicadas más arriba (0, 100 y 300 mM NaCl), utilizando los medios correspondientes. II.3.1.4.3. Efecto del NH4+ Se ha demostrado en estudios previos que el amonio inhibe a los transportadores de K+ de tipo HAK (Santa-María et al., 2000; Bañuelos et al., 2002; Martínez-Cordero et al., 2004; Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006). Así, para averiguar si este transportador de K+ pudiera estar implicado en el transporte de dicho ión, se procedió al cultivo de plántulas en presencia o ausencia de amonio, pero también en presencia de otra fuente de nitrógeno, es decir, nitrato. En experimentos previos donde solo se añadía amonio al medio de crecimiento, se observaba que la presencia de dicho nutriente hacía disminuir mucho el potencial de membrana. No obstante, con la presencia el nitrato en el medio de crecimiento, se obtuvieron potenciales de membrana similares tanto en plantas crecidas en presencia como en ausencia de amonio. Tras la germinación en agua destilada, las plántulas se cultivaron durante 3 a 4 días en 2 mM Ca (NO3)2, condición control, o en el mismo medio con 1 mM NH4Cl. Además, se cultivaron plantas en este mismo medio pero con 300 mM NaCl. Las medidas del potencial de membrana se realizaron en el mismo medio de crecimiento pero tamponado con 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3. En este caso, se realizaron cinéticas de incorporación de K+ para cada una de las condiciones de crecimiento indicadas, según se indicó en el apartado II.3.1.2. II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 44 II.3.1.5. Medida de la actividad citoplasmática de K+. Cálculo del gradiente de potencial electroquímico para K+ Las medidas de la actividad citoplasmática de K+ (K+c) se realizaron en células epidérmicas de la raíz de plántulas obtenidas tras la germinación de semillas y cultivadas en ausencia o presencia de Na+ (300 mM NaCl). El medio de ensayo utilizado para las medidas fue el mismo que se ha descrito para las medidas de potencial de membrana, es decir, 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano (pH 7.3) sin o con Na+ (300 mM NaCl). El gradiente de potencial electroquímico, o fuerza ión-motriz, para un ión "j", en mV, viene determinado por la diferencia entre el potencial de membrana y el potencial de Nernst para el ión multiplicada por la carga del ión (Ecuación 4), %#/F = z (Em-ENj) (Ecuación 4) donde %#/F es el gradiente de potencial electroquímico expresado en mV, siendo F la constante de Faraday, z la carga del ión, Em el potencial de membrana y ENj el potencial de Nernst para el ión "j". Si el gradiente de potencial electroquímico para un ión toma valores positivos la entrada de dicho ión debe implicar un consumo de energía; en cambio, si el gradiente de potencial electroquímico toma valores negativos, el ión puede entrar en la célula de manera pasiva, impulsado por su propia fuerza ión-motriz. II.3.2. Caracterización del transporte de Na+ en H. portulacoides Se sabe que la incorporación de sodio de alta afinidad en glicófitos se detecta sólo cuando el medio de cultivo carece tanto de Na+ como de K+ (Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006; Haro et al., 2010). Por ello, la caracterización de este transporte se realizó siempre en plántulas germinadas en ausencia de dichos iones. Por otra parte, estudios previos sobre este transporte en distintas especies se han realizado habitualmente en medio de cultivo y ensayo ligeramente ácido (Haro et al., 2010), de modo que, en este caso, los medios de ensayo se tamponaron a pH 6. KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 45 II.3.2.1. Incorporación de Na+: experimentos de depleción en raíces Plántulas obtenidas de la germinación de semillas de H. portulacoides en agua destilada, se cultivaron en 2 mM CaCl2, 0,7 % fitoagar, durante 3 días. Las raíces se lavaron con el mismo medio de crecimiento tamponado con 1 mM MES-Bis Trispropano, pH 6 antes del experimento. Las raíces de diez plántulas (aproximadamente 0,03 g de Peso fresco total de las raíces) se sumergieron en 4 ml del mismo medio suplementado con 500 µM NaCl y se mantuvieron a 25ºC y agitación constante (90 rpm) durante diferentes períodos de tiempo (de 0,5 a 15 h). Una vez terminada la incubación, se congelaron las muestras de medio de ensayo y su concentración de determinó con un espectrofotómetro de absorción atómica (AANALYST 800) en los Servicios Centrales de Investigación de la Universidad de Málaga. La tasa de depleción de Na+ se calculó a partir de la reducción de la concentración de Na+ en el medio de ensayo por g de peso fresco de raíz. II.3.2.2. Caracterización electrofisiológica del transporte de Na+ en células radiculares II.3.2.2.1. Efecto de la adición de Na+ sobre el potencial de membrana Se germinaron semillas de H. portulacoides en agua destilada durante 2 a 3 días y se cultivaron en 2 mM de CaCl2 , 0,7 % fitoagar, durante otros 2 a 3 días. Para realizar las medidas de potencial de membrana se utilizó el mismo medio de cultivo pero tamponado a pH 6 (2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 6). Una vez conseguido un valor estable de potencial de membrana, se añadían secuencialmente al medio de ensayo concentraciones crecientes de NaCl (10, 20, 50, 200, 500, 1000, 2000 #M NaCl), con un paso previo de lavado con medio de ensayo sin Na+ entre cada concentración. II.3.2.3. Efecto de distintos inhibidores e iones sobre el transporte de Na+ Al objeto de caracterizar el transporte de Na+, se realizaron en primer lugar experimentos para determinar si dicho transporte podía distinguirse del transporte de K+. Para ello se analizó el efecto del Rb+, Cs+ y Ba2+, que son inhibidores conocidos del transporte de K+, sobre las despolarizaciones inducidas por Na+. Además, se sabe que el Ba2+ inhibe el trasporte de Na+ de alta afinidad en algunas especies de glicófitas II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 46 (Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006). Dado que, en este caso, los experimentos se hacían a pH 6, para poder comparar estrictamente el efecto de dichos inhibidores, se analizó al mismo tiempo el efecto sobre las despolarizaciones inducidas por K+. La concentración de Na+ y K+ utilizada en estos experimentos (500 #M) fue menor a la saturante para ambos iones, para permanecer así más próximos al rango micromolar. Por otra parte, para caracterizar aún más el transporte de Na+, se analizó el efecto del Li+, un análogo del Na+ e inhibidor competitivo del transporte del mismo (Serrano et al., 1999; Rubio et al., 2004; Wang et al., 2007). También se estudió el efecto del Ca2+, que es inhibidor de ciertos canales NSCC (Demidchik y Maathuis, 2007) y LCT1 (Amtmann et al., 2001), posibles vías de entrada del Na+ a la célula . Por otra parte, también se analizó el efecto del pH. Finalmente, dado que el transporte de alta afinidad de Na+ es dependiente de la presencia/ausencia de Na+ y K+ en el medio de cultivo, también se analizó si la presencia de estos iones afectaba a las despolarizaciones inducidas por Na+. II.3.2.3.1. Efecto del Rb+, Cs+ y Ba2+ Las plántulas se cultivaron en las mismas condiciones de cultivo mencionadas en el apartado II.3.2.2.1. Al objeto de conocer el efecto de estos tres inhibidores sobre las despolarizaciones inducidas por Na+ y K+, se procedió a la medida del potencial de membrana en 2 mM CaCl2, 10 mM de MES-Bis Tris propano, pH 6. El experimento se realizaba en dos fases. Una vez la medida del Em estaba estabilizada, se añadía 500 #M Na+ ó 500 #M K+ al medio de ensayo, lavando con medio sin estos iones, tras observar la despolarización. En la segunda fase, se cambiaba el medio de ensayo por otro que contenía una determinada concentración del inhibidor. Se esperaba unos 30 minutos hasta que se estabilizara el potencial de membrana, y se volvían a añadir 500 #M Na+ ó 500 #M K+, registrándose la despolarización inducida. Las concentraciones de inhibidores utilizadas fueron 500 #M Rb+, 500 #M Cs+ y 5 mM Ba2+. Todos se suministraron en forma de sal de cloruro. II.3.2.3.2. Efecto del pH Las plántulas se cultivaron como en el apartado anterior y para las medidas del potencial de membrana se prepararon medios de ensayo que contenían 2 mM de CaCl2, 10 mM de MES-Bis Tris propano ajustados a pH 5, 6 ó 9. Para la realización de los KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 47 experimentos se procedió de manera similar a la indicada en el apartado II.3.1.4.2, pero registrándose la despolarización inducida por 500 #M Na+. II.3.2.3.3. Efecto del Li+ y del Ca2+ Las plántulas se cultivaron en las mismas condiciones de cultivo mencionadas en el apartado II.3.2.2.1. Para conocer el efecto del Li+ sobre las despolarizaciones inducidas por Na+, se procedió a la medida del potencial de membrana en 2 mM CaCl2, 10 mM de MES-Bis Tris propano, pH 6. Una vez la medida del Em estaba estabilizada, se añadía 500 #M Na+ en el medio de ensayo, lavando con el medio inicial, tras observar la despolarización. Después se cambiaba el medio de ensayo inicial por otro que contenía además 500 #M LiCl, y se volvían a añadir 500 #M Na+, registrándose la despolarización inducida. Para determinar el efecto del Ca2+, se procedió de manera similar pero en este caso, en la segunda fase del experimento, el medio de ensayo inicial era sustituído por otro que contenía 10 mM CaCl2 en vez de 2 mM CaCl2. II.3.2.3.4. Efecto de la presencia de Na+ y K+ en el medio de cultivo Para efectivamente determinar si la presencia de Na+ y K+ influía en la incorporación de Na+, se cultivaron plántulas de H. portulacoides en presencia de cada uno de estos iones. Tras la germinación en agua destilada, las plántulas se mantuvieron durante 4 días en un medio que contenía 2mM CaCl2 más 500 #M NaCl o más 500 #M KCl. Con estas plántulas se realizaron experimentos de incorporación de Na+, tal y como se indicó en el apartado II.3.2.2.1 en el medio de ensayo habitual, 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 6. Además se determinó si la presencia de K+ en el medio de ensayo interfería o no en la incorporación de Na+. Así, se analizó el efecto sobre la despolarización inducida por 500 #M Na+ en presencia y ausencia de 200 #M K+ en el medio de ensayo, siguiendo el mismo procedimiento indicado en el apartado II.3.2.3.1. II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 48 II.3.2.4. Medida de la actividad citoplasmática de Na+. Cálculo del gradiente de potencial electroquímico para Na+ Para poder determinar el gradiente de potencial electroquímico, se procedió a la medida de la actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en las mismas condiciones en las que se realizó la caracterización del transporte de Na+. Así, las medidas con microelectrodos dobles sensibles a Na+ se realizaron en células radiculares de plántulas obtenidas tras la germinación de semillas en agua destilada y cultivadas de 3 a 5 días en ausencia de Na+ y K+ (2 mM CaCl2, 0.7% (p/v) fitoagar. El medio de ensayo utilizado para las medidas fue el mismo que se ha descrito para el caso de las cinéticas de incorporación de Na+, es decir, 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, excepto que se tamponó a pH 7.3. Para el cálculo del valor del gradiente de potencial electroquímico, se procedió de la misma manera indicada para el caso del K+ (ver apartado II.3.1.5) II.3.3. Homeostasis de Na+ en H. portulacoides En el estudio de los mecanismos de tolerancia a la salinidad es fundamental conocer cuál es la concentración de Na+ citoplasmática, y cómo esta varía o no en función de la concentración externa de Na+ en el medio. Así, además de realizar medidas puntuales en plantas cultivadas en ausencia de Na+ para determinar el gradiente de potencial electroquímico para este ión, también se procedió a su medida en plántulas cultivadas en presencia de Na+. Con estas medidas y con las del ión K+, mencionadas anteriormente, se pudo calcular el índice K+/Na+, fundamental también para entender la tolerancia a la salinidad. Además de estas medidas puntuales, se hicieron medidas en continuo de la concentración citoplasmática de Na+ a distintas concentraciones externas de este ión y aplicando inhibidores de la respiración. Por otra parte, se determinó la permeabilidad relativa Na+/K+ de la membrana plasmática de las células radiculares de plántulas crecidas con y sin Na+. Previamente, se realizó un estudio sobre el efecto de la salinidad en el crecimiento de plántulas y determinándose el contenido total de Na+ y K+ en los tejidos. II.3.3.1 Efecto de la salinidad sobre el crecimiento de plántulas Se tomaron seis plántulas con un tamaño de raíz de $ 1 cm y se colocaron en tubos Sigma que contenían 30 ml de medio Hoagland diluido ! y tamponado a pH 7,3, KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 49 a los cuales se añadieron distintas concentraciones de Na+ (0, 75, 150 y 300 mM NaCl). Las plántulas se sostenían dentro el tubo con ayuda de mallas de plástico esterilizadas. Se determinó el crecimiento de la raíz y del hipocótilo por separado. Para ello se hizo una medida de la longitud del hipocótilo y de la raíz al principio del experimento y, tras 7 días de tratamiento, y se calculó el incremento relativo de la longitud. II.3.3.2 Determinación de los contenidos totales de K+ y Na+ en tejidos de plántulas crecidas en ausencia y presencia de Na+ La determinación del contenido total de K+ y Na+ se realizó por espectrometría de absorción atómica, que consiste en la cuantificación de la absorción por los elementos K+ y Na+ después de atomizar las muestras, de la radiación emitida, de 589 nm para Na+ y 776,5 nm para K+. Para alcanzar el estado atómico de los elementos se sometieron las muestras a un tratamiento térmico gracias a un equipo de absorción atómico modelo AANALYST 800, que convierte sus componentes en átomos o iones elementales gaseosos. Las medidas se realizaron en plántulas de H. portulacoides obtenidas tras germinar semillas en placas de Petri con agua destilada y crecidas en cultivo hidropónico, tal y como se indicó en el apartado anterior (II.3.3.1) en ausencia o en presencia de 300 mM de NaCl durante 7 días. Se prepararon muestras desecadas de cotiledones, raíces y del hipocótilo a partir de muestras de peso fresco entre 0,05 – 0,5 g. Se separó cada parte de las plántulas y se incubaron en una estufa a 110 Cº durante 24 horas a fin de eliminar el contenido de agua. II.3.3.3 Determinación de la permeabilidad relativa de Na+ con respecto al K+ (PNa+/PK+ ) en ausencia y presencia de Na+ La permeabilidad relativa de la membrana se estimó basándose a la ecuación de Goldman (ecuación 5): RT PK+[K+]e+PNa+[Na+]e+PCl-[Cl-]i ED = ln (Ecuación 5) F PK+[K+]i+PNa+[Na+]i+PCl-[Cl-]e II. Material y Métodos KARIMA AIT HAMMOU 50 ED Potencial de difusión R Constante de los gases T Temperatura en Kº F Constante de Faraday PK+, PNa+, PClPermeabilidades de la membrana para los iones: K+, Na+ y Cl- [ ]e y [ ]i Concentraciones externa y interna de los iones Así, para determinar la permeabilidad relativa de Na+ con respecto a K+, PNa+/PK+ , se debe saber el valor del potencial de difusión (ED) en presencia de diferentes concentraciones de Na+ y K+ en el medio de ensayo (Fernández et al., 1999). Estas medidas se realizaron en plántulas procedentes de la germinación de semillas en agua destilada durante 3 días y cultivadas durante 3 a 4 días en 2 mM CaCl2, 1 mM KCl, 0.7 % fitoagar o en 2 mM CaCl2, 1mM KCl, 300 mM NaCl, 0,7% fitoagar. Las medidas se realizaron insertando microelectrodos simples en células epidérmicas de la raíz en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 1 mM KCl, 1 mM NaCl y ajustado a pH 7,3 con 10 mM MES-Bis Tris propano. Alcanzado un valor estable de Em, se añadían al medio 0,1 mM NaCN ó 0,1 mM KCN, inhibidor de la respiración, y 0,1 mM ácido salicil hidroxámico (SHAM), inhibidor de la respiración resistente a cianuro (Laties, 1982), con objeto de impedir la síntesis de ATP. De este modo se despolarizaba la membrana hasta alcanzar el valor de ED por desactivación de la H+- ATPasa (Fernández et al., 1999). Para determinar la permeabilidad de la membrana citoplasmática al Na+, se añadieron concentraciones crecientes de este ión (1, 5, 10, 25 y 50 mM NaCl), determinándose el valor del potencial de difusión para cada concentración. Para determininar la permeabilidad al K+, se añadieron 5, 10, 25 y 50 mM KCl, registrándose igualmente la variación del potencial de difusión. La adición de los dos inhibidores se hizo a partir de disoluciones concentradas de 0,2 M NaCN, 0,1 M KCN y 1 M SHAM. No obstante, la solución concentrada de NaCN o de KCN se preparó en agua destilada, mientras que la de SHAM se preparó en 2-metoxietanol (C3H8O2, Fluka Nº: 64720). KARIMA AIT HAMMOU II. Material y Métodos 51 II.3.3.4. Efecto de la concentración externa de Na+ sobre la actividad citoplasmática de este ión en plántulas crecidas con o sin Na+. Se realizaron medidas en plántulas cultivadas en ausencia o en presencia de 300 mM NaCl. Así, en el caso de las plántulas cultivadas en ausencia de Na+ se midió, en continuo, el efecto sobre la actividad citoplasmática de Na+ del incremento de la concentración externa de este ión, añadiendo secuencialmente 1, 10 y 60 mM NaCl al medio de ensayo (2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7.3). Finalmente, en presencia de 60 mM NaCl se añadía al medio de ensayo un cóctel inhibitorio de la respiración (0.1 mM NaCN/SHAM). En el caso de las plantas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl, las medidas de Na+c se realizaron, en continuo, disminuyendo la concentración de NaCl del medio de ensayo (2 mM CaCl2, 300 mM NaCl, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7.3) hasta 100 mM NaCl en presencia de 335 mM sorbitol para mantener la osmolaridad del medio. Asimismo, también se midió el efecto sobre el Na+c de la adición 0.1 mM NaCN/SHAM al medio de ensayo que contenía 300 mM NaCl. II.4. Tratamiento de los datos Los datos obtenidos se representaron gráficamente con el programa informático Kaleida graph 3.08 (Synergy software), que se utilizó también para la realización de ajustes lineales y para los ajustes al modelo de Michaelis-Menten. Se consideraron válidos los ajustes cuyo coeficiente de determinación (R2) era superior a 0,95. El error que aporta el programa junto a los parámetros del ajuste a la ecuación corresponden al error del ajuste. Los datos se representan como la media ± desviación estándar (SD) o error estándar de la media (SE) de al menos 3 réplicas independientes. Los datos se analizaron mediante test de comparación de medias (prueba t de Student) o análisis de la varianza (ANOVA) seguido de un test a posteriori (test de Tukey) considerando un nivel de significación (!) de 0,05 en todos los casos. Todos los análisis se realizaron usando el programa STATGRAPHICS Centurion v. XVI (Statpoint Technologies, Inc.). KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 59 Figura 13. Efecto del ión Rb+ sobre las despolarizaciones de membrana inducidas por K+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MESBis Tris propano, pH 7,3, en presencia de diferentes concentraciones de RbCl: 0 (círculos), 50 µM (cuadrados), 100 µM (diamantes) y 250 µM (triángulos). Los valores de las despolarizaciones, inducidas por el aumento de las concentraciones de K+ en presencia de cada concentración de Rb+, se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten. Los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 1. Los datos corresponden a la media ± SE de al menos 3 réplicas. La adición de Rb+ en el rango de 50-250 µM no alteró los valores de Dmax, pero produjo un aumento en la constante de semisaturación Km, que se duplicó en presencia de una concentración de tan sólo 50 µM Rb+ (Fig. 13, Tabla 1). Ello es indicativo de un proceso de inhibición que se analiza el siguiente apartado. Tabla 1. Efecto del Rb+ sobre la cinética de incorporación de K+. Los valores de la despolarización máxima (Dmax) y de la constante de semisaturación (Km) fueron obtenidos ajustando los valores de las despolarizaciones de la membrana (Fig. 13) al modelo de MichaelisMenten. Se indican también los valores medios del potencial de membrana (Em). Los datos de potencial de membrana corresponden a la media ± SD. Los valores de potencial de membrana en presencia de Rb+ no fueron significativamente distintos al valor observado en la situación control (ANOVA, P > 0,05). 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 2500 Control +50 µM Rb+ +100µM Rb+ +250 µM Rb+ Despolarización (mV) Concentración de K+ (µM) Rb+ (!M) Dmax (mV) Km (!M) Em (mV) 0 79 ± 1 296 ± 4 -204 ± 9 (n=8) 50 81 ± 6 683 ± 124 -204 ± 15 (n=6) 100 80 ± 4 994 ± 113 -205 ± 24 (n=4) 250 78 ± 5 1701 ± 187 -197 ± 11 (n=4) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 60 III.1.2.2.1.1. Tipo de inhibición. Cálculo de la Ki La variación de Km observada en la Tabla 1 es una característica de la inhibición competitiva, y ello fue corroborado por representaciones de dobles inversos de Lineweaver-Burk (Fig. 14). Así, se calculó el inverso de los valores de las despolarizaciones medias (1/"Em) inducidas por concentraciones crecientes de K+ en presencia de las distintas concentraciones de Rb+ y se representó frente al inverso de la concentración de K+ (Fig. 14). La representación gráfica indicó la existencia de una inhibición de tipo competitivo. Figura 14. Representación de Lineweaver-Burk del efecto de la presencia de Rb+. Representación de dobles inversos de las despolarizaciones medias obtenidas a distintas concentraciones de sustrato (K+) en presencia de diferentes concentraciones de RbCl: 0 (círculos), 50 µM (cuadrados), 100 µM (diamantes) y 250 µM (triángulos). La constante de inhibición (Ki) del Rb+ se calculó por el método “Km, app” mediante la representación del cociente Kmapp / Vmax frente a la concentración del inhibidor (Kakkar et al., 1999). Dicha representación aparece en la Figura 15, de modo que cuando y=0, [I]=-Ki. El valor obtenido fue de 65 !M Rb+. 0 1 2 3 0 0,03 0,06 0,09 0,12 0 !M Rb+ 50 !M Rb+ 100 !M Rb+ 250 !M Rb+ 1/!E m 1 / [K + ] ("M) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 61 Figura 15. Representación de Kmapp/Vmax frente a concentración del inhibidor (Rb+). Los datos de Kmapp y Vmax se obtuvieron tras el ajuste de los datos a la ecuación de MichaelisMenten (Tabla 1) y se justaron a un modelo lineal. III.1.2.2.2. Cinética de incorporación de K+ en presencia de Cs + Como en el caso del Rb+, se analizó el efecto del ión Cs+ sobre la incorporación de K+. De manera similar, se obtuvieron cinéticas de incorporación de K+ en diferentes medios de ensayo que contenían diferentes concentraciones de cesio (0, 50, 100, 250 µM Cs+). Las despolarizaciones inducidas por K+ obtenidas a diferentes concentraciones de Cs+ se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten (Fig. 16) y los parámetros cinéticos obtenidos se muestran en la Tabla 2. El valor del potencial de membrana (Em) no mostró diferencias significativas entre los distintos tratamientos (Tabla 2). A diferencia del Rb+, la presencia de 50 ó 100 µM de Cs+ en el medio externo no afectó a la cinética de incorporación de K+, y las Dmax y Km fueron similares al control (Fig. 16, Tabla 2). Sólo la adición de 250 µM Cs+ causó una disminución en el valor de la despolarización máxima. Así, aunque parece que el ión Cs+ no es transportado por las células de la raíz (como se ha indicado en el apartado III.1.2.1.1), este ión puede bloquear el transporte de K+ a concentraciones superiores a 250 µM. 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 y = 4,5307 + 0,069749x R2= 0,99077 Km app/Vmax Concentración de Rb+ (!M) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 62 Figura 16. Efecto del ión Cs+ sobre las despolarizaciones de membrana inducidas por K+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3, en presencia de diferentes concentraciones de CsCl: 0 (círculos negros), 50 µM (cuadrados), 100 µM (círculos blancos) y 250 µM (triángulos). Los valores de las despolarizaciones, inducidas por el aumento de las concentraciones de K+ en presencia de cada concentración de Cs+, se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten. Los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 2. Los datos corresponden a la media ± SE de al menos 3 réplicas. Tabla 2. Efecto del Cs+ sobre la cinética de incorporación de K+. Los valores de despolarización máxima (Dmax) y la constante de semisaturación (Km) fueron obtenidos ajustando los valores de las despolarizaciones de la membrana (Figura 16) al modelo MichaelisMenten. Se indican también los valores medios±SD del potencial de membrana (Em), que fueron similares entre los tratamientos (ANOVA, P > 0,05). III.1.2.3. Efecto del Na+ sobre el transporte de K+ Para evaluar el efecto del Na+ en el transporte de K+, se registraron las despolarizaciones inducidas por concentraciones crecientes de K+, en el medio de ensayo base, con distintas concentraciones externas de Na+ (25-300 mM Na+). Los valores obtenidos se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten (Fig. 17, Tabla 3). 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 2500 +0 µM Cs + +50 µM Cs + +100 µM Cs + +250 µM Cs + Despolarización (mV) Concentración de K+ (µM) Cs+ (!M) Dmax (mV) Km (!M) Em (mV) 0 79 ± 1 296 ± 4 -204 ± 9 (n=8) 50 74 ± 1 258 ± 16 -196 ± 17 (n=4) 100 79 ± 4 255 ± 41 -208 ± 3 (n=3) 250 53 ± 2 368 ± 52 -203 ± 14 (n=3) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 63 Figura 17. Efecto del ión Na+ sobre las despolarizaciones de la membrana inducidas por K+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3, en presencia de diferentes concentraciones de NaCl: 0 (círculos), 25 !M (cuadrados), 50 !M (diamantes), 100 !M (triángulos) y 300 !M (triángulos invertidos). Los valores de las despolarizaciones inducidas por el aumento de las concentraciones de K+ en presencia de distintas concentraciones de Na+, se ajustaron al modelo de MichaelisMenten. Los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 3. Los datos representan la media ± SE de al menos 3 réplicas. En primer lugar, la Dmax disminuyó ligeramente, entre el 15-30%, en presencia de hasta 100 mM Na+ mientras la Km aumentó progresivamente, estando por encima de 1 mM K+ a 100 mM Na+. En segundo lugar, la presencia de Na+ no tuvo un efecto claro sobre el potencial de membrana de las células en este rango de concentración, aunque se encontraron diferencias significativas a 50 mM Na+(Tabla 3). Por el contrario, cuando las células fueron expuestas a una concentración externa de 300 mM Na+, el potencial de membrana mostró valores más positivos, variando de -200 mV a -150 mV aproximadamente (Tabla 3). Los valores de la Km aumentaron ligeramente a aproximadamente 1,5 mM K+ y las despolarizaciones inducidas por K+ disminuyeron considerablemente (Tabla 3, Fig. 17). Así, los valores Dmax se redujeron en un 70 % en comparación con las condiciones control (sin Na+). Por lo tanto, la presencia de concentraciones milimolares Na+ induce una disminución en la afinidad por K+ y una disminución progresiva de la Dmax, que indicaría una inhibición de tipo acompetitivo. No obstante, se observa un efecto mucho mayor sobre la Dmax cuando la concentración externa alcanza 300 mM Na+, condición en la que el Em está despolarizado. 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 2500 Control + 25 mM Na + + 50 mM Na + + 100 mM Na + + 300 mM Na + Depolarización (mV) Concentración de K+(µM) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 64 Tabla 3. Efecto de la presencia de concentraciones milimolares de Na+ sobre la cinética de transporte de K+. La despolarización máxima (Dmax) y la constante de semisaturación (Km) fueron obtenidas ajustando los datos de la Figura 17 al modelo de Michaelis-Menten. Se indican también los valores medios ± SD del potencial de membrana (Em) a cada concentración de Na+. Letras diferentes indican diferencias significativas (Test de Tukey; P < 0.05). III.1.3. Transporte de K+ en células radiculares de plántulas crecidas en presencia de Na+: efecto de la salinidad. Para evaluar la influencia de la salinidad sobre la incorporación de K+, se cultivaron plantas a diferentes concentraciones de Na+, y se analizó el transporte K+ a las mismas concentraciones externas de Na+ que se utilizaron para el crecimiento. Como se observó anteriormente en plantas crecidas en ausencia de Na+ (control), concentraciones micromolares de K+ también dieron lugar a despolarizaciones de la membrana en las plantas cultivadas en 100 ó 300 mM Na+ (Fig. 18). Na+ (mM) Dmax(mV) Km (!M) Em (mV) 0 79 ± 1 296 ± 4 -204 ± 9 (n=8)a 25 66 ± 5 488 ± 90 -188 ± 7 (n=3)ab 50 62 ± 7 804 ± 213 -183 ± 5 (n=3)b 100 56 ± 4 1260 ± 185 -197 ± 10 (n=3)ab 300 25 ± 3 1429 ± 316 -146 ± 10 (n=3)c Figura 18. Despolarizaciones de membrana inducidas por K+ en plantas cultivadas a diferentes concentraciones de Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de las raíces de plántulas crecidas en ayuno de K+ y presencia de 0 (círculos), 100 mM (cuadrados) o 300 mM de NaCl (diamantes) en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3 y la misma concentración de Na+ utilizada para el crecimiento. Los valores de las despolarizaciones inducidas por la adición de concentraciones crecientes de K+ al medio de ensayo, se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten. Los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 4. Los datos representan la media ± SE de al menos 5 repeticiones. 0 20 40 60 80 100 0 500 1000 1500 2000 2500 0 mM Na+ 100 mM Na+ 300 mM Na+ Despolarización (mV) Concentración de K + (µM) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 65 Los valores de las despolarizaciones se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten y los parámetros cinéticos se muestran en la Tabla 4. Se puede observar que la despolarización máxima (Dmax) así como la afinidad por K+ disminuyeron al aumentar la concentración de Na+ en el medio de crecimiento. Tabla 4. Efecto de las concentraciones de Na+ usadas en el crecimiento sobre la cinética de transporte de K+. Los valores de las despolarizaciones de la Fig. 18 se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten, estimándose la despolarización máxima (Dmax) y la constante de semisaturación (Km). Se incluyen los valores medios ± SD del potencial de membrana (Em) en cada tratamiento; diferentes letras indican diferencias significativas (test de Tukey, P < 0,05). Los potenciales de membrana no cambiaron significativamente a 100 mM Na+ con respecto al control, sin embargo, cuando las plantas se cultivaron en medio con una mayor salinidad (300 mM Na+), los potenciales de membrana mostraron valores más positivos, con diferencias en torno a 20 mV (Tabla 4). Sin embargo, la variación en el potencial de membrana fue menor que la encontrada en las plantas cultivadas en ausencia de Na+ y sometidas a 300 mM Na+ en el medio de ensayo (sobre 60 mV, Tabla 3). Es decir, cuando las plantas se cultivan durante varios días en 300 mM Na+, las células de la raíz son capaces de mantener un potencial de membrana muy negativo (Tabla 4). Por otro lado, aunque la Dmax disminuyó en este tratamiento, la disminución fue menor (alrededor de 50 %) que la encontrada en las plantas cultivadas en ausencia de Na+ y sometidas a 300 mM Na+ (sobre un 70%). III.1.4. Efecto de distintos inhibidores e iones sobre el transporte de K+ en plántulas cultivadas a salinidad creciente Dado que se observaron diferencias en el transporte de K+ a distintas salinidades, se continuó con la caracterización del mismo analizando el efecto de diferentes inhibidores e iones sobre el transporte de K+. Así, se analizó el efecto de dichos inhibidores sobre la despolarización inducida por 1 mM K+ en plantas crecidas en 0, 100 y 300 mM NaCl. [Na+](mM) Crecimiento Dmax (mV) Km(!M) Em (mV) 0 79 ± 1 296 ± 4 -204 ± 9 (n=8)a 100 66 ± 5 840 ± 136 -191 ± 11 (n=7)ab 300 43 ± 11 1925 ± 772 -186 ± 13 (n=5)b IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 66 III.1.4.1. Efecto del Cs+ La adición de 1 mM de KCl al medio de ensayo (2 mM CaCl2,10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3) provocó una despolarización media en torno a 55 mV en células radiculares de plántulas cultivadas en ausencia de Na+ (Fig. 19). Posteriormente, al cambiar el medio de ensayo a un medio de la misma composición pero con 500 µM CsCl, la adición de 1 mM de KCl dio lugar una despolarización media en torno a 16 mV que resultó ser significativamente distinta a la control (Fig. 19). Es decir, se detectó una inhibición del transporte de K+ del 71 %. En los experimentos realizados de manera similar, pero en medios de ensayo que contenían de 100 ó 300 mM de NaCl, se observó el mismo efecto sobre el transporte de K+, de modo que se observaron diferencias significativas entre las despolarizaciones control y las obtenidas en presencia de Cs+ (Fig. 19). La inhibición en presencia de 100 mM Na+ fue del 77 % y en el caso de 300 mM Na+, la inhibición fue del 67 %. Figura 19. Efecto del Cs+ sobre las despolarizaciones de membrana inducidas por K+ en plantas cultivadas a diferentes concentraciones de Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y en presencia de 0, 100 y 300 mM NaCl en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3, más la misma concentración de Na+ utilizada para el crecimiento. Una vez estabilizado el potencial de membrana, se añadió 1 mM de KCl al medio y las despolarizaciones se registraron en ausencia (barras negras) o en presencia de 500 µM de CsCl (barras rayadas). Los datos representan la media ± SE de al menos 3 repeticiones. Las despolarizaciones en presencia de Cs+ se compararon con el valor control a cada concentración de Na+. Valores significativamente distintos de cada control se indican con un asterisco (t de Student, P < 0,05). La adición de 500 !M Cs+ no alteró de manera significativa el Em de las células epidérmicas en ninguno de los tratamientos, no observándose diferencias significativas 0 20 40 60 80 100 120 0 mM Na + 100 mM Na + 300 mM Na + 0 mM Cs + 0,5 mM Cs + * * * Despolarización (mV) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 67 entre el potencial de membrana medido en ausencia (control) y tras la adición de cesio en los medios con diferente concentración de Na+ (Tabla 5). Tabla 5. Potenciales de membrana (Em, en mV) de células radiculares en ausencia (control) y en presencia de 500 !M Cs+ en medios con diferente concentración de Na+. Estos potenciales se midieron antes de la adición de 1 mM KCl, en las mismas condiciones y medios de ensayo indicados en la Fig. 19.No se observaron diferencias significativas entre los valores en ausencia o en presencia de 500 !M Cs+ en cada condición de Na+ (t de Student, P > 0,05 en cada caso). III.1.4.2. Efecto del TEA+ En experimentos realizados de manera similar al apartado anterior, la adición del inhibidor al medio de ensayo, en este caso 5 mM TEA+, no afectó a las despolarizaciones inducidas por 1 mM K+ en todas las condiciones crecimiento analizadas (Fig. 20). Figura 20. Efecto del TEA+ sobre las despolarizaciones de membrana inducidas por K+ en plantas cultivadas a diferentes concentraciones de Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y en presencia de 0, 100 y 300 mM NaCl en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MESBis Tris propano, pH 7,3, más la misma concentración de Na+ utilizada para el crecimiento. Una vez estabilizado el potencial de membrana, se añadió 1 mM de KCl al medio y las despolarizaciones se registraron en ausencia (barras negras) o en presencia de 5 mM de TEA+ (barras rayadas). Los datos se representan como medias ± SE de al menos 3 repeticiones. Las despolarizaciones en presencia de TEA+ se compararon con el valor control a cada concentración de Na+ mediante una t de Student (P > 0,05 en todos los casos). 0 20 40 60 80 100 120 0 mM Na + 100 mM Na + 300 mM Na + 0 mM TEA + 5 mM TEA + Despolarización (mV) Na+ (mM) Em (mV) Control Em (mV), + 500 !M Cs+ 0 -196± 4 (n=4) -201 ± 14 (n=4) 100 mM -183 ± 2 (n=4) -182 ± 10 (n=4) 300 mM -182 ± 11 (n=3) -179 ± 6 (n=3) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 68 La presencia de TEA+ (5 mM) en los medios de ensayo que contenían diferente concentración de Na+ tampoco alteró de manera significativa el potencial de membrana Em de las células epidérmicas de la raíz de H. portulacoides (Tabla 6). Tabla 6. Potenciales de membrana (Em, en mV) de células radiculares en ausencia (control) y en presencia de 5 mM TEA+. Estos potenciales se midieron antes de la adición de 1 mM KCl, en las mismas condiciones y medios de ensayo indicados en la Fig. 20. Los valores corresponden a la media ± SD de al menos 3 réplicas. No se observaron diferencias significativas entre los valores del potencial de membrana medidos en ausencia o en presencia de TEA+ en ninguno de los tratamientos de Na+ (t de Student, P > 0,05, en todos los casos). III.1.4.3. Efecto del Ba2+ La adición de 5 mM Ba2+ al medio de ensayo inhibió casi por completo la despolarización inducida por 1 mM de K+ en todos los tratamientos (Fig. 21). En concreto la inhibición fue del 93 %, 91% y 100% en los tratamientos de 0, 100 y 300 mM NaCl, respectivamente. Figura 21. Efecto del Ba2+ sobre las despolarizaciones de membrana inducidas por K+ en plantas cultivadas a diferentes concentraciones de Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y en presencia de 0, 100 y 300 mM NaCl en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MESBis Tris propano, pH 7,3, más la misma concentración de Na+ utilizada para el crecimiento. Una vez estabilizado el potencial de membrana, se añadió 1 mM de KCl al medio y las despolarizaciones se registraron en ausencia (barras negras) o en presencia de 500 µM de BaCl2 (barras rayadas). Los datos representan la media ± SE de al menos 3 repeticiones. Las despolarizaciones en presencia de Ba2+ se compararon con el valor control a cada concentración de Na+. Valores significativamente distintos respecto a cada control se indican con un asterisco (t de Student, P < 0.05). 0 20 40 60 80 100 120 0 mM Na + 100 mM Na + 300 mM Na + 0mM Ba 2+ 5mM Ba 2+ * * Despolarización (mV) * Na+ (mM) Em (mV) Control Em (mV), + 5 mM TEA+ 0 206± 21 -205 ± 18 (n=5) 100 mM -196 ± 9 -192 ± 8 (n=6) 300 mM -184 ± 16 -168 ± 17 (n=3) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 75 Tabla 11. Efecto de la presencia de NH4+ en el medio de crecimiento sobre la cinética de transporte de K+ en presencia de 300 mM NaCl. La despolarización máxima (Dmax) y la constante de semisaturación (Km) fueron obtenidas ajustando los datos de la Figura 26 al modelo de Michaelis-Menten. Se incluyen también los valores del potencial de membrana, en los que no se observaron diferencias significativas entre ambos tratamientos (t de Student, P > 0,05). III.1.5. Actividad citoplasmática de K+ en las células radiculares. Cálculo del ! µ K+/F A diferencia del transporte a través de transportadores de K+ dependientes de protones, el transporte a través de canales se produce a favor de gradiente de potencial electroquímico. Así, se midió la actividad citoplasmática de K+ en las células radiculares para calcular el gradiente de potencial electroquímico para el K+ y poder discriminar entre transporte activo o pasivo. El potencial de membrana y la actividad citoplasmática de K+ de células epidérmicas de la raíz de plántulas crecidas en el medio control (2 mM CaCl2) o en el mismo medio más 300 mM Na+ se midieron con microelectrodos dobles selectivos para K+. Los potenciales de membrana fueron similares a los obtenidos con microelectrodos simples, siendo ligeramente positivos cuando las plantas se cultivaron a salinidad alta (Tabla 12), como se ha había observado previamente. Tabla 12. Actividad citoplasmática de K+ en células radiculares de plantas sometidas a deficiencia de K+ y cultivadas sin o con Na+. Células epidérmicas de la raíz de plantas cultivadas en ausencia o presencia de 300 mM NaCl fueron pinchadas con microelectrodos dobles selectivos para K+ que miden tanto el potencial de membrana (Em) como la actividad citoplasmática de K+ (K+c). Los medios de ensayo utilizados fueron los mismos medios utilizados para el crecimiento, pero tamponados con 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3. Los asteriscos indican diferencias significativas (t de Student, P < 0,05). Medio de crecimiento Dmax(mV) Km (!M) Em (mV) 2 mM Ca(NO3)2 + 300mM NaCl 132 ± 32 8135 ± 2362 -173±12 (n=4) 2 mM Ca(NO3)2 + 300mM NaCl + 1mM NH4+ 61 ± 6 2522 ± 362 -180±18 (n=3) [Na+] crecimiento mM Em (mV) K+c (mM) 0 -206±10 (n=5) 76±4 (n=5) 300 -160±18 (n=3)* 55±6 (n=3)* IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 76 La actividad citoplasmática de K+ fue mucho mayor (alrededor de 76 mM K+) en las plantas cultivadas en ausencia de Na+ que en las plantas cultivadas en 300 mM Na+ (en torno a 55 mM K+). Esto es, la presencia de una alta concentración externa de Na+ indujo una disminución en la actividad citoplasmática de K+ que, a su vez, podría afectar el gradiente del potencial electroquímico para K+. Así, se calculó el valor de este gradiente para diferentes concentraciones externas de K+ (Fig. 27). La transición de valores positivos a valores negativos de esta variable, que supone la posibilidad de un transporte a favor de gradiente, se encontró a diferentes concentraciones externas dependiendo del tratamiento. Es decir, que el transporte podría ser considerado pasivo a concentraciones alrededor o superiores a 22 µM K+ para plantas cultivadas en ausencia de Na+, pero a concentraciones por encima de 120 µM K+, para plantas cultivadas en presencia de 300 mM Na+. Figura 27. Gradiente de potencial electroquímico para K+ (!µK+/F, en mV) a concentraciones crecientes del mismo en plántulas cultivadas en ausencia o presencia de 300 mM NaCl. El cálculo de dicha variable se realizó considerando los valores de potencial de membrana y de actividad citoplasmática de K+ que aparecen en la Tabla 12. Los datos representan la media ± SE de al menos 3 repeticiones. -150 -100 -50 0 50 100 00,5 11,5 22,5 ∆µK+ /F (mV)_Control ∆µK+ /F (mV)_300Na+ ∆µK+/F (mV) [KCl] mM KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 77 III.2. Caracterización del transporte de Na+ en H. portulacoides III.2.1. Incorporación de Na+ en raíces Las raíces de plántulas cultivadas en ausencia de Na+ y K+ son capaces de incorporar Na+ a concentraciones externas en el rango micromolar (Fig. 28). Ello se observó en experimentos de depleción en los que la concentración inicial fue de 500 µM Na+. En dichos experimentos, se observó una disminución progresiva de la concentración externa de Na+ (Fig. 28), alcanzándose un valor de alrededor de 280 !M Na+ después de 15 horas de incubación. La tasa inicial de incorporación de Na+ se calculó en la fase lineal y se obtuvo un valor de 9,6 ± 1,9 !mol Na+ g Raiz PF-1h-1. Esta cifra dobla el valor medido para la incorporación de K+ en la misma especie (4,27 ± 1,7 !mol K+ g Raiz PF-1h-1, Ait Hammou et al., 2014); sin embargo, en este caso la concentración inicial de K+ en el experimento de depleción fue 250 !M. Figura 28. Incorporación de Na+ en raíces de H. portulacoides. Raíces de plántulas crecidas en ausencia de Na+ y K+ se sumergieron en una solución que contenía 2 mM CaCl2, 1 mM MES-Bis Tris propano pH 6. A tiempo 0, se añadió Na+ a una concentración de 500 !M NaCl. Las plántulas se incubaron a diferentes tiempos y la concentración de Na+ en el medio se analizó mediante espectrometría de absorción atómica. Los datos corresponden a la media ± SE (n = 3). 0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16 µmol Na+g pf raiz-1 Tiempo (h) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 78 III.2.2. Transporte de Na+ en células radiculares Para caracterizar la incorporación de Na+ en estas plantas, se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plantas cultivadas en ausencia de Na+ y K+, y se registró el efecto de la adición de Na+ al medio de ensayo. Estas células mostraron un potencial de membrana medio de -185 ± 24 mV (n = 12) y la adición de concentraciones micromolares de Na+ provocó despolarizaciones rápidas, que fueron mayores al aumentar las concentraciones de Na+ (Fig. 29). Figura 29. Despolarizaciones de la membrana inducidas por concentraciones crecientes de Na+. Las medidas de Em se realizaron en raíces de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+. El medio de ensayo contenía 2mM CaCl2, pH 6 (10 mM MES-Bis Tris propano). Las flechas superiores muestran el momento en el que se añadía NaCl al medio y las flechas inferiores muestran el momento en el que se retiraba del mismo. Las despolarizaciones de membrana, que son una estimación de la actividad del transporte, mostraron una cinética de saturación y se ajustaron al modelo de MichaelisMenten (Fig. 30), obteniéndose una despolarización máxima (Dmax) de alrededor de 70 mV (67 ± 2 mV) y una constante de semisaturación, Km, de alrededor de 600 µM Na+ (597 ± 47 µM Na+). -220 -200 -180 -160 -140 -120 Em (mV) 10 min 10µM 20µM 50µM100µM200µM 250µM 300µM 500µM 1000µM NaCl KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 79 Figura 30. Despolarizaciones de membrana inducidas por Na+ en células radiculares de H. portulacoides. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano, pH 6 y se añadieron concentraciones crecientes de Na+ como NaCl. Los valores de las despolarizaciones se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten y los parámetros cinéticos se indican en el texto. Los datos representan la media ± SE de al menos 3 réplicas. III.2.3. Efecto del Rb+, Cs+ y Ba2+ sobre el transporte de Na+ Como se había observado previamente que los iones Rb+, Cs+ y Ba2+ inhibían el transporte de K+ en H. portulacoides, se analizó y comparó el efecto de estos iones sobre las despolarizaciones inducidas por Na+ y por K+ a pH 6 (Fig. 31). Como se observó en experimentos realizados a pH 7,3, la adición de estos inhibidores no afectó al valor del potencial de membrana. Ni el Rb+ ni el Cs+, a una concentración de 500 µM, tuvieron un efecto significativo sobre el transporte de Na+ (Figs. 31 A y 31 B), mientras que sí se detectó una inhibición del transporte de K+, como se había observado previamente en experimentos realizados con K+ a pH 7,3 (Fig. 13 y Fig. 19). La adición de 5 mM Ba2+ tuvo un efecto significativo sobre el transporte de Na+ (Fig. 31C), produciendo una inhibición de alrededor de 30%. Sin embargo, este efecto inhibidor fue mucho mayor en el transporte de K+, que se inhibió casi completamente, como se observó a pH 7,3 (Fig. 21). Estos resultados sugieren que el transporte de Na+ no estaría mediado por los mismos sistemas de transporte usados por el K+. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 500 1000 1500 2000 2500 Despolarización (mV) Na + (µM) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 80 Figura 31. Efecto de Rb+ (A), Cs+ (B) y Ba2+ (C) sobre las despolarizaciones inducidas por Na+ y K+ en células radiculares de H. portulacoides. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano, pH 6. Una vez estabilizado el potencial de membrana, se añadía 500 !M NaCl ó 500 KCl en ausencia (barras negras) o en presencia del inhibidor (barras rayadas): 500 !M RbCl (A), 500 !M CsCl (B) or 5 mM BaCl2 (C). Los datos respresentan la media ± SE de al menos cuatro réplicas. Los asteriscos representan medias significativamente distintas con respecto a su control correspondiente (t de Student, P < 0.05). III.2.4. Efecto de la presencia de K+ y Na+ en el medio de crecimiento sobre el transporte de Na+ Dado que el transporte de Na+ de alta afinidad en plantas mediado por transportadores HKT es inhibido por la presencia tanto de K+ y Na+ en el medio de crecimiento (Garciadeblás et al., 2003, Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006, Horie et al., 2007), se analizó el efecto de la presencia de ambos cationes en el medio de cultivo de H. portulacoides sobre el transporte de Na+ (Fig. 32). 0 10 20 30 40 50 60 70 Control 500 µM Rb+ Despolarización (mV) Na+K+ * A 0 10 20 30 40 50 60 70 Control 500 µM Cs+ Despolarización (mV) Na+K+ * B 0 10 20 30 40 50 60 70 Control 5 mM Ba2+ Despolarización (mV) Na + K + * * C KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 81 Figura 32. Despolarizaciones de la membrana inducidas por Na+ en plantas crecidas en presencia de Na+ o K+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ (control, círculos negros), en presencia de 500 !M KCl (círculos blancos) o de 500 !M NaCl (cuadrados blancos) en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano, pH 6. En todos los casos se registraron las despolarizaciones inducidas por concentraciones crecientes de Na+, añadido al medio de ensayo como NaCl. Los valores de las despolarizaciones se ajustaron al modelo de Michaelis-Menten y los parámetros cinéticos se indican en el texto. Los datos representan la media ± SE de al menos 3 réplicas. Así, no se encontró ninguna inhibición del transporte de Na+ en plantas cultivadas durante tres días en presencia de 500 !M de Na+. De hecho, la despolarización máxima, obtenida tras el ajuste de los datos de despolarización a la ecuación de MichaelisMenten, fue ligeramente mayor (Dmax = 86 ± 11 mV), que en plantas control cultivadas en ausencia de Na+; sin embargo, la afinidad por Na+ aumentó en las plantas cultivadas con Na+ (Km = 488 ± 134 µM Na+). Por el contrario, se observó una ligera inhibición del transporte de Na+ en las plantas cultivadas con 500 !M K+ en el medio de crecimiento. La despolarización máxima disminuyó a 52 ± 7 mV, así como la afinidad por Na+ (Km = 738 ± 182 !M Na+). Sin embargo, en presencia de K+ en el medio de crecimiento, el potencial de membrana de las células radiculares fue más positivo (-147 ± 6; n = 4), aproximadamente 40 mV más positivo que en las plantas control cultivadas en ausencia K+. Por tanto, la disminución observada en el transporte de Na+ podría deberse a un menor valor del gradiente de potencial electroquímico para Na+, debido a que el Em es 0 10 20 30 40 50 60 70 0 200 400 600 800 1000 1200 Despolarización (mV) Concentración de Na+ (µM) IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 82 más positivo. Este efecto inhibidor también se observó cuando el medio de cultivo no contenía K+ pero se añadía K+ al medio de ensayo a una concentración de 200 !M (Fig. 33). Figura 33. Efecto de la presencia de K+ sobre las despolarizaciones inducidas por Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 6 . El efecto de la adición de 500 !M NaCl sobre el potencial de membrana se analizó en ausencia (control) o presencia de 200 !M KCl en el medio de ensayo. Los datos representan la media ± SE de 3 réplicas. El asterisco indica diferencias significativas a P < 0.05 (t de Student ) En este caso, el potencial de membrana se incrementó en 30 mV, pasando de una media de -199 ± 22 mV (n=3) en ausencia de K+ a -166 ± 13 mV (n=3) en presencia del mismo, observándose una inhibición significativa de casi el 60 % en el transporte de Na+ (Fig. 33). III.2.5. Efecto del Li+, Ca2+ y pH sobre la incorporación de Na+ Para caracterizar aún más el transporte de Na+ se comprobó el efecto del Ca2+, un inhibidor el transporte de este ión a través de los canales LCT1 (Amtmann et al., 2001) y algunos canales NSCC (Demidchik y Maathuis, 2007), y del Li+, considerado un análogo del Na+ e inhibidor competitivo del transporte del mismo (Serrano et al., 1999; Rubio et al., 2004; Wang et al., 2007). También se analizó el efecto de la concentración de protones, ya que se sabe que afectan a la actividad de algunos NSCC (Demidchik y 0 10 20 30 40 50 Control + 200 µM KCl Despolarización (mV) * KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados 83 Tester, 2002). Como puede observarse en la figura 34, la presencia de 500 mM Li+ o 10 mM Ca2+ no afectó significativamente al transporte de Na+. Figura 34. Efecto del Li+ y del Ca2+ sobre las despolarizaciones inducidas por Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 6 y se analizó el efecto sobre el potencial de membrana de la adición de 500 !M NaCl. Este mismo experimento se realizó en presencia de 500 !M LiCl en el medio de ensayo o en presencia de 10 mM Ca2+, añadido como CaCl2. Los datos representan la media ± SE (n=3). Los valores no presentaron diferencias significativas con respecto a su correspondiente control ( t de Student, P > 0.05 en cada caso). Además, no se observaron diferencias significativas entre los valores del Em obtenidos en presencia o ausencia de Li+, ni tampoco en presencia o ausencia de Ca2+ (Tabla 13). Tabla 13. Efecto del Li+ y del Ca2+ sobre los potenciales de membrana en plantas cultivadas en ausencia de K+ y Na+. Se midieron los Em antes de la adición de 500 µM LiCl ó 10 mM CaCl2 en las mismas condiciones y medios de ensayo indicados en la Fig. 34. Los valores corresponden a la media ± SD de 3 réplicas. No se observaron diferencias significativas entre los valores del potencial de membrana con respecto a su control correspondiente (t de Student, P > 0,05 en cada caso). 0 10 20 30 40 50 Despolarización (mV) +Li + control +Ca 2+ control Em (mV) Em (mV) Control -199 ± 6 Control -213 ± 7 + 500 µM LiCl -206 ± 13 +10 mM CaCl2 -211 ± 30 IIIResultados KARIMA AIT HAMMOU 84 Por otro lado, no se encontró ningún efecto significativo sobre las despolarizaciones inducidas por Na+ cuando el pH del medio de ensayo disminuyó a 5 o se incrementó a 9 (Fig. 35). Figura 35. Efecto del pH sobre las despolarizaciones inducidas por Na+. Se midió el potencial de membrana de células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia de K+ y Na+ en un medio que contenía 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 6, determinándose el efecto de la adición de 500 !M NaCl. Este mismo experimento se realizó en el mismo medio de ensayo pero tamponado a pH 5 o a pH 9. Los datos representan la media ± SE de al menos 3 réplicas. Los valores no presentaron diferencias significativas (ANOVA, P >0,05). III.2.6. Actividad citoplasmática de Na+ en células radiculares. Cálculo del ! µ Na+/F Se midió la actividad citoplasmática de Na+ en las células de la raíz con el fin de calcular el gradiente del potencial electroquímico para este ión, y discriminar así entre transporte activo o pasivo. Así, las células epidérmicas de la raíz de plántulas crecidas en ausencia de K+ y Na+ se pincharon con microelectrodos dobles selectivos para Na+. El potencial de membrana medido con estos microelectrodos fue similar al obtenido con microelectrodos simples (-193 ± 13 mV) y la actividad citoplasmática detectada fue de 25,9 ± 2,9 mM (n = 6). Con estos valores de potencial de membrana y actividad citoplasmática de Na+, se calculó el potencial electroquímico para dicho ión a diferentes concentraciones externas del mismo (Fig. 36). 0 10 20 30 40 50 Despolarización (mV) pH 5 pH 6 pH 9 KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados ! 91 Figura 39. Efecto de la variación de la concentración externa de Na+ sobre el Em y la actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en plántulas cultivadas en ausencia de Na+. Se muestra un registro simultáneo del potencial de membrana (trazo superior) y de la actividad citoplasmática de Na+ (trazo inferior). Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris propano (pH: 7,3). Las flechas superiores indican el momento de la adición al medio de ensayo de concentraciones crecientes de NaCl, las flechas inferiores el momento de su retirada. Se trata de un registro representativo de 3 a 5 experimentos independientes. Los valores medios del potencial de membrana y de la actividad citoplasmática de Na+ en función de la concentración externa de este ión, de un mínimo de tres réplicas, se muestran en la Tabla 16. Tabla 16. Valores de potencial de membrana y de actividad citoplasmática de Na+ en células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas en condiciones control. Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano (pH: 7,3) al que se le añadía la concentración de NaCl indicada. Se muestran los valores medios (± SD) del potencial de membrana (Em) y de la actividad citoplasmática de sodio (Na+c) estable en cada uno de los tratamientos de Na+ aplicados. Para cada variable, diferentes letras indican diferencias significativas (Test de Tukey; P < 0,05). -200 -190 -180 -170 -160 -150 -140 -130 Em (mV) 1 mM NaCl 10 mM NaCl 60 mM NaCl 20 30 40 50 60 Na+c (mM) 10 min Em (mV) Na+c (mM) 0 Na+ -193± 12a 26 ±3 (n=6) a 1 mM Na+ -159±12 b 31±2 (n=5) a,b 10 mM Na+ -148±11 b,c 38 ± 2 (n=3) b 60 mM Na+ -130± 3 c 51 ± 8 (n=3) c !!!"#$%&'()*+,&#####################################################################################################!!!!!!!!!!!!!!!"#$%&#!!#%'!(#&&)*! ! 92 Los resultados obtenidos sugieren que existe una entrada neta de Na+ al citoplasma en respuesta al incremento, en rango milimolar, de la concentración externa de este ión en el caso de plántulas cultivadas en ausencia de Na+. III.3.4. Efecto de la concentración externa de Na+ sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en presencia del mismo La actividad citoplasmática de Na+ medida en células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en presencia de 300 mM Na+ (2 mM CaCl2, 300 mM NaCl, 0,7 % fitoagar) fue mayor que la observada en el caso de las plántulas cultivadas en ausencia de Na+, descrita en el apartado anterior. El valor medio de la actividad citoplasmática de Na+ de las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl, medido en un medio similar al medio de crecimiento, tamponado con 10 mM MES-Bis Tris propano (pH 7,3) fue próxima a 70 mM (Tabla 17). El valor medio del potencial de membrana, medido simultáneamente, se situó en torno a -150 mV, valor similar al descrito para el caso de las medidas con microelectrodos de K+ en plántulas cultivadas en 300 mM NaCl (Tabla 12) y con microelectrodos simples (Tabla 4). Tabla 17. Valores de potencial de membrana y de actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas presencia de 300 mM NaCl. Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano (pH 7,3) en presencia de 300 mM NaCl o 100 mM NaCl y 355 mM sorbitol para mantener la osmolaridad del medio. Se muestran los valores medios (± SD) del potencial de membrana (Em) y de la actividad citoplasmática de sodio (Na+c) estable en cada uno de los tratamientos de Na+ aplicados. Para cada variable, el asterisco indica diferencias significativas (t de Student; P < 0,05). La disminución de la concentración externa de Na+ hasta 100 mM NaCl, en presencia de 335 mM sorbitol para mantener constante la osmolaridad del medio (0,567 OSM Kg-1) provocó la hiperpolarización de la membrana, hasta valores próximos a - Em (mV) Na+c (mM) 300 mM Na+ -153 ± 13 72 ± 5 (n=9) 100 mM Na+ -182 ± 2* 55 ± 8* (n=5) KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados ! 93 180 mV, al mismo tiempo que disminuía la actividad citoplasmática Na+, que alcanzó valores en torno a 55 mM (Fig. 40). La restauración de la concentración inicial de Na+ del medio (300 mM NaCl) provocó la despolarización de la membrana y el incremento de la actividad citoplasmática de Na+ hasta valores próximos a los iniciales (Fig. 40). Figura 40. Efecto de la variación de la concentración externa de Na+ sobre el Em y la actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en plántulas cultivadas en presencia de 300 mM Na+. Se muestra un registro simultáneo del potencial de membrana (trazo superior) y de la actividad citoplasmática de Na+ (trazo inferior). Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 300 mM NaCl, 10 mM MES-Bis Tris propano (pH: 7,3). La flecha superior indica el momento de la disminución de la concentración de Na+ del medio hasta 100 mM en presencia de 335 mM sorbitol; la flecha inferior indica el momento de la restauración del medio inicial. Se trata de un registro representativo de 5 experimentos independientes. Estos resultados indican que H. portulacoides muestra una mayor actividad citoplasmática de Na+ cuando crece en medios con una elevada concentración de este ión que en ausencia del mismo; no obstante, la disminución de la actividad citoplasmática de Na+, registrada al disminuir la concentración externa de este ión hasta 100 mM, sugiere que existe una salida neta desde el citoplasma de las células epidérmicas de la raíz. Ello indica que la concentración citoplasmática de Na+ es muy sensible a la concentración externa del mismo, lo que puede estar relacionado con la alta permeabilidad de la membrana a este ión. -200 -180 -160 -140 Em (mV) 100 mM NaCl 50 60 70 80 Na + c (mM) 10 min !!!"#$%&'()*+,&#####################################################################################################!!!!!!!!!!!!!!!"#$%&#!!#%'!(#&&)*! ! 94 III.3.5. Efecto de la adición de inhibidores de la respiración sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en ausencia o en presencia de Na+ Al objeto de determinar la implicación de mecanismos activos de transporte sobre el mantenimiento de la actividad citoplasmática de Na+ en las células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides se analizó el efecto de la adición de la mezcla de inhibidores de la respiración (0,1 mM NaCN-SHAM) sobre la actividad citoplasmática de Na+ en plántulas crecidas en ausencia o en presencia de 300 mM Na+. En el caso de las plántulas cultivadas en ausencia de Na+ las medidas se realizaron en medios de ensayo que contenían 60 mM Na+ (2 mM CaCl2, 60 mM NaCl, 10 mM MES-Bis Tris propano, pH 7,3). La adición de los inhibidores de la respiración provocó la despolarización de la membrana hasta el valor del potencial de difusión para esa concentración externa de Na+, (-72 ± 4 mV; n=3), mientras que no tuvo un efecto significativo (t de Student, P>0,05) sobre la actividad citoplasmática de Na+ que pasó de 51 ± 8 mM a 54 ± 7 mM (Fig. 41). Por otra parte, en el caso de las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM Na+ la adición de los inhibidores de la respiración al medio de ensayo (2 mM CaCl2, 300 mM NaCl, 10 mM MES-Bis tris propano, pH 7,3) provocó la despolarización de la membrana hasta un valor medio de potencial de difusión de -94 ± 13 mV (n=6), mientras que la actividad citoplasmática de Na+ disminuyó ligera aunque significativamente (t de Student P<0,05) desde 72 ± 5 mM hasta 65 ± 5 mM (Fig. 42). Los resultados obtenidos no parecen indicar una implicación relevante de los mecanismos de transporte activo sobre la homeostasis citoplasmática de Na+. KARIMA AIT HAMMOU IIIResultados ! 95 Figura 41. Efecto de la adición de inhibidores de la respiración sobre el Em y la actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas en ausencia de NaCl. Se muestra un registro simultáneo del potencial de membrana (trazo superior) y de la actividad citoplasmática de Na+ (trazo inferior). Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano (pH 7,3) en presencia de 60 mM de NaCl. La flecha superior indica el momento de la adición de los inhibidores de la respiración y la flecha inferior indica el momento de la restauración del medio inicial. Se trata de un registro representativo de 5 experimentos independientes. Figura 42. Efecto de la adición de inhibidores de la respiración sobre el Em y la actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) en células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas en presencia de 300 mM NaCl. Se muestra un registro simultáneo del potencial de membrana (trazo superior) y de la actividad citoplasmática de Na+ (trazo inferior). Las medidas se realizaron en 2 mM CaCl2, 10 mM MES-Bis Tris Propano (pH: 7,3) en presencia de 300 mM NaCl. La flecha superior indica el momento de la adición de los inhibidores de la respiración y la flecha inferior indica el momento de la restauración del medio inicial. Se trata de un registro representativo de 5 experimentos independientes. -140 -120 -100 -80 -60 Em (mV) 0,1 mM NaCN-SHAM 40 50 60 70 Na + c (mM) 10 min -160 -140 -120 -100 -80 Em (mV) 0,1 mM NaCN-SHAM 50 60 70 80 Na + c (mM) 10 min DISCUSIÓN KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 99 IV. DISCUSIÓN IV.1. Transporte de K+ Las raíces de H. portulacoides sometidas a deficiencia de K+ y cultivadas en ausencia de Na+ son capaces de incorporar K+ en un medio con bajas concentraciones de este ión (<250 µM K+) con una tasa inicial próxima a 4 µmol K+ gpf Raiz!1 h-1 (Fig. 9) . Esta tasa se encuentra en el rango observado en la planta halófita Spergularia marina en la que se han observado valores que se sitúan entre 2 y 7,5 µmol K+ gpf raiz!1 h-1 (Wickens y Cheeseman, 1991). De hecho, las células de la raíz de H. portulacoides muestran una actividad transportadora de K+, analizada por electrofisiología, que se satura a una concentración externa entre 1-2 mM K+, mostrando una Km en torno a 300 "M K+. Estas células tienen también la capacidad de transportar Rb+ con una afinidad inferior que para K+, y tienen una capacidad muy limitada de transportar Cs+. De hecho, el ión Rb+ muestra una inhibición competitiva con respecto al K+ (Fig. 14) con una Ki en torno a 65 "M, mientras que el ión Cs+ no inhibe la incorporación de K+ hasta que no alcanza concentraciones próximas a 250 "# (Fig. 16). Estas características son diferentes a las descritas para el transporte de K+ de alta afinidad mediado por los transportadores HAK, que discriminan muy poco entre K+, Rb+ y Cs+ (Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006). Por otra parte, la presencia de Na+ en el medio a concentraciones entre 25 y 100 mM Na+ induce una ligera disminución de la capacidad máxima del transporte de K+ (Dmax ) de entre un 15 a un 30 % y también aumenta la Km (Tabla 3). Este efecto sobre la Dmax es diferente a los resultados encontrados en raíces de la halófita Suaeda salsa (Mori et al., 2011), donde no se observaron diferencias en la tasa de incorporación de K+ en experimentos de depleción realizados a concentraciones crecientes de Na+ en el rango 0-100 mM Na+. No obstante, sí se ha observado este efecto inhibidor del Na+ en la incorporación de K+ (a 25 mM) en el caso de Atriplex nummularia cultivada a 100 mM Na+ (Ramos et al., 2004). Sin embargo, cuando la concentración externa de Na+ alcanza 300 mM Na+, el efecto sobre la Dmax es mucho mayor, ya que se reduce hasta un 70% con respecto al control. El efecto drástico de la adición de 300 mM Na+ sobre la incorporación de K+ se puede explicar en parte por la disminución en el potencial de membrana de las células, que no se observa a concentraciones más bajas de Na+ (Tabla 3). Esta despolarización reduce el gradiente de potencial electroquímico para K+, lo que podría afectar el transporte pasivo de este ión. IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 100 La afinidad por K+ observada en H. portulacoides, crecida en ausencia de K+ y Na+, es menor que la que generalmente se indica para el transporte de K+ de alta afinidad en las plantas (13-130 µM) (Maathuis y Sanders, 1996; Szczerba et al., 2009). Sin embargo, la mayoría de las plantas analizadas en la literatura son glicófitas. Por lo que se sabe, la única Km para K+ que se conoce para una planta halófita es la de la especie Thellungiella halophila, que se sitúa en torno a 5 µM (Alemán et al., 2009); no obstante, se ha discutido la relevancia de esta especie como modelo de una planta halófita (Flowers y Colmer, 2008). Sin embargo, cuando las plantas se someten a deficiencia de K+ pero se crecen en presencia de Na+, la Km para K+ aumenta hasta aproximadamente 800 µM K+ en plantas cultivadas en 100 mM NaCl y hasta casi 2 mM de K+ en plantas cultivadas en 300 mM NaCl (Fig. 18, Tabla 4), en presencia de las mismas concentraciones de Na+ utilizadas para el crecimiento. Estos valores de Km se sitúan claramente en el rango del transporte de baja afinidad para K+. H. portulacoides crece en un medio con una alta concentración de K+, que oscila entre 5 y 20 mM en el agua intersticial del sedimento donde se anclan las raíces (Rubio et al., 2003; Palomo, 2004), así como en una alta concentración de Na+ (por encima de 200 mM, Rubio et al., 2003; Palomo, 2004). Por tanto, los valores de Km observados en las plantas crecidas en ausencia de K+ son inferiores a las concentraciones de K+ existentes habitualmente en el medio ambiente de la planta. Sin embargo, parece que H. portulacoides ha conservado la capacidad de extraer K+ a partir de un medio con concentraciones mucho más bajas que las que suelen estar presentes en su hábitat, por lo menos cuando se cultivan en ausencia de Na+. La presencia de Na+ en el medio de crecimiento reduce la Dmax, si se compara con las plantas cultivadas en ausencia de este ión (Tabla 4). Este efecto es débil en 100 mM Na+ y la reducción es del 17%, pero es mucho más acusado en 300 mM Na+, cuando la Dmax disminuye un 50%. Sin embargo, este decremento es menor que el observado en plantas sometidas a 300 mM Na+, pero cultivadas en ausencia de dicho ión, cuya disminución fue de un 70%. Este efecto menor de la presencia de 300 mM Na+ en el medio de crecimiento se puede explicar de nuevo porque el potencial de membrana de las células epidérmicas de la raíz de estas plantas es más negativo KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 107 puede estar relacionada con la entrada de cargas positivas, esto es, de iones Na+. El ajuste de los valores de despolarización obtenidos a concentraciones crecientes de Na+ al modelo de Michaelis Menten dio lugar a un valor de Km próxima a 600 µM Na+ (Fig. 30), de magnitud similar al valor de Km para el transporte de K+ en la misma especie (aprox. 300 µM; Ait Hammou et al., 2014), pero que dobla su valor. Este valor de Km para el Na+ está lejos de los valores de Km descritos para el transporte de sodio de alta afinidad en especies glicófitas (15-60 µM; Garciadeblás et al., 2003) donde se ha demostrado la implicación de un transportador tipo HKT (Garciadeblás et al., 2003; Haro et al., 2005; Horie et al., 2007). Sin embargo, se han encontrado valores de Km más altos para la incorporación de Na+ en el briófito Physcomitrella pattens (120 µM), donde se ha propuesto la implicación de un transportador diferente a HKT para el transporte de alta afinidad de Na+ (Haro et al., 2010). Del mismo modo, la Km para K+ en H. portulacoides es mucho mayor que la descrita para el transporte de alta afinidad de potasio en glicófitas (13-130 µM; Maathuis y Sanders., 1996; Szczerba et al., 2009). Sin embargo, los valores de Km para Na+ y K+ son muy inferiores a las concentraciones habituales de Na+ y K+ en el medio ambiente de la planta. Así, parece que, como en el caso del K+ (Ait Hammou et al., 2014), H. portulacoides ha conservado la capacidad de extraer Na+ a concentraciones mucho más bajas que las que habitualmente están presentes en su medio natural. De hecho, esta capacidad no se ha encontrado en otra especie halófita presente en el mismo estuario, Sarcocornia perennis, utilizando las mismas técnicas electrofisiológicas y condiciones de cultivo (Elena et al., 2009). Esta diferencia podría estar relacionada con las diferentes estrategias para hacer frente a los ambientes salinos, ya que H. portulacoides es una especie inclusora que presenta vesículas de sal en sus hojas, mientras que S. perennis es una halófila suculenta que carece de dichas estructuras. El valor máximo de la despolarización inducida por Na+ fue de alrededor de 70 mV, mientras que en el caso de K+ fue de en torno a 80 mV. Aunque no hubo mucha diferencia entre las despolarizaciones máximas, obtenidas en el ajuste al modelo de Michaelis-Menten, los valores de las despolarizaciones inducidas por Na+ fueron siempre inferiores a las inducidas por K+ a la misma concentración (por ejemplo, para una concentración del ión de 1000 µM, 46 ± 2 mV y 61 ± 7 mV, inducidas por Na+ y K+, respectivamente). Esto indica una capacidad ligeramente menor para el transporte de Na+ que para el transporte de K+ hacia el interior de la célula en el rango micromolar. IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 108 Debido a las características cinéticas y las tasas de incorporación similares, la pregunta que se plantea es si el transporte de Na+ es diferente al transporte de K+, es decir, si está mediado por los mismos o por diferentes sistemas de transporte. Los diferentes efectos de Rb+ y Cs+, que inhiben claramente el transporte de K+, pero no afectan al transporte de Na+, indican que el transporte de Na+ es diferente al transporte de K+, como se ha demostrado para el transporte de alta afinidad de Na+ y K+ en glicófitas (Rodríguez-Navarro y Rubio, 2006). Estos resultados también sugieren que el transporte de Na+ no podría estar mediado por canales de tipo AKT1, ya que estos se han propuesto como vía mayoritaria de entrada de K+ en esta especie (Ait Hammou et al., 2014). Por otra parte, el ión Ba2+ inhibió tanto el transporte de Na+ como de K+, sin embargo, la inhibición fue mucho mayor en el caso del transporte de K+, que prácticamente se suprimió, mientras que la inhibición del transporte de Na+ fue de alrededor de 30%, lo que indica una vez más la diferencia entre los mecanismos de transporte de estos iones. Se sabe que el Ba2+ inhibe el transporte de sodio de alta afinidad a través de los transportadores de tipo HKT, así que esto podría ser una indicación de la implicación de este transportador en la entrada de Na+ al interior celular en H. portulacoides. Pero, por otra parte, una de las características del transporte de alta afinidad para Na+ mediado por HKT es que sólo se observa cuando las plantas se cultivan en ausencia de Na+ y K+. De hecho, la incorporación de alta afinidad de Na+ sólo se produce cuando se agota el K+ en el medio (Garciadeblás et al., 2003; Haro et al., 2010). En el caso de H. portulacoides la presencia de sodio en el medio de cultivo no inhibió el transporte de Na+ (Fig. 32). Y, aunque la presencia de K+ inhibió parcialmente el transporte de sodio, éste se mantuvo a una tasa considerable (Fig. 33). Este resultado también se ha observado en el caso del briófito Physcomitrella patens, en el que la presencia de 200 "M K+ sólo inhibió un 30% la incorporación de Na+; así, se ha propuesto que un transportador distinto a HKT estaría implicado en el transporte de sodio de alta afinidad en esta especie (Haro et al., 2010). Estos resultados indican que un transportador HKT, del tipo utilizado para el transporte de sodio de alta afinidad en algunas glicófitas, no podría estar implicado en el transporte de Na+ en H. portulacoides. De hecho, la función fisiológica propuesta para estos transportadores HKT es incorporar Na+ cuando el medio externo carece de K+, de modo que el ión Na+ pueda sustituir al K+ en algunas funciones fisiológicas (Rodríguez-Navarro et al. 2006, Horie et al. 2007), situación que KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 109 no ocurre en el medio donde vive H. portulacoides. Sin embargo, se ha propuesto que transportadores de tipo HKT podrían estar involucrados en la incorporación de Na+ de baja afinidad en halófitas. En concreto, se ha observado en S. maritima que, a concentraciones externas de 25 mM Na+, el transporte de Na+ se inhibía un 36% por Ba2+ (Wang et al., 2007), un porcentaje similar al observado en H. portulacoides (31%). Ello sugiere que transportadores de tipo HKT, de la familia que se ha relacionado en el transporte de Na+ de baja afinidad, podrían estar involucrados en la incorporación de Na+ en H. portulacoides. Otros sistemas de transporte que se han relacionado con la entrada Na+ son los canales LCT1 y NSCC independientes del voltaje (VI-NSCC), que se ha demostrado que son inhibidos por Ca2+ (Amtmann et al., 2001). Sin embargo, en el caso de H. portulacoides no se detectó ninguna inhibición del transporte de Na+ cuando la concentración de Ca2+ aumentó de 2 a 10 mM (Fig. 34). Este mismo resultado también se ha observado en la incorporación de Na+ de baja afinidad, tanto a concentraciones externas de 25 y 150 mM, en la halófita S. maritima (Wang et al. 2007). La falta de inhibición del Ca2+ parece entonces excluir la participación de LCT1 y VI-NSCC en la entrada de Na+ en H. portulacoides; sin embargo, se ha de tener en cuenta que esta especie se desarrolla en un medio donde la concentración de Ca2+ es siempre alta y que estos canales, si están presentes en esta especie, podrían estar regulados de manera diferente, como se ha propuesto para otros sistemas de transporte de Na+ y K+ en halófitas (Flowers y Colmer, 2008). Por otro lado, los VI-NSCC no se ven afectados por Cs+ y Li+, y una clase de VI-NSCC también puede ser parcialmente bloqueada por Ba2+ (Demidchick y Maathuis, 2007), resultados que se han encontrado en las despolarizaciones inducidas por Na+ en H. portulacoides. Parece entonces difícil establecer qué sistema estaría implicado en el transporte de Na+ en H. portulacoides, como se ha observado en el caso del transporte de Na+ en cebada utilizando sólo un análisis farmacológico (Schulze et al., 2012). Los valores de actividad citosólica de Na+ medidos en células de la raíz (26± 3 mM) indican que el transporte de Na+ por encima de 10 "M Na+ sería pasivo, como se ha demostrado también para concentraciones micromolares de K+ (Ait Hammou et al., 2014), es decir, tendría que estar mediado por canales. Sin embargo, este dato no puede IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 110 excluir totalmente la participación de los transportadores de tipo HKT, ya que es muy probable que éstos funcionen como canales (Benito et al., 2014). IV.3. Homeostasis citoplasmática de K+ y Na+ Tal como se ha descrito para halófitas dicotiledóneas (Flowers y Colmer, 2008), las plántulas de H. portulacoides muestran un mayor crecimiento cuando se cultivan en presencia de elevadas concentraciones de NaCl. Así, el crecimiento en ausencia de Na+ fue la mitad del observado tras 7 días de cultivo en presencia de 150 ó 300 mM NaCl (Figura 40). Estos resultados son similares a los descritos por Redondo y colaboradores (2007) para esta misma especie. Estos autores observaron como la tasa de crecimiento de plantas de tres meses se duplicaba tras 60 días de cultivo en presencia de 200 mM NaCl, respecto a condiciones sin tratamiento salino. No obstante, tal como se había descrito anteriormente (Jensen, 1985), la tasa de crecimiento relativa de dichas plantas mostraba una reducción drástica cuando se cultivaban en presencia de concentraciones superiores de sal (de 400 a 700 mM NaCl), sugiriendo que la salinidad óptima para el crecimiento de plantas de H. portulacoides estaría en torno a 200 mM NaCl (Jensen, 1985; Redondo et al., 2007). Los resultados obtenidos en este trabajo indican que las plántulas procedentes de la germinación de semillas de H. portulacoides pueden tolerar concentraciones algo mayores de NaCl, sin que se afecte su crecimiento en presencia de 300 mM NaCl. Este valor es superior al descrito para otras halófitas del mismo género como Atriplex amnicola, cuyo crecimiento disminuye a concentraciones mayores de 50 mM (Aslam et al., 1986) o Atriplex nummuralia cuyo crecimiento se inhibe por encima de 100 mM NaCl (Ashy y Beadle, 1957; Khan et al., 2000) y Atriplex. griffithii va. stocksii que muestra una reducción del crecimiento de la raíz por encima de 90 mM NaCl (Ramos et al., 2004). De manera general se ha propuesto que las halófitas utilizan la acumulación controlada y el secuestro de iones inorgánicos como mecanismo básico para ajustar su potencial osmótico y permitir la incorporación de agua por las raíces en medios con salinidad extrema (Munns, 2002). Así, se ha relacionado el grado diferencial de tolerancia a la salinidad con la capacidad para acumular iones involucrados en el ajuste osmótico (Flowers y Yeo, 1986; Munns y Tester, 2008). En trabajos previos con esta especie, se observó que en raíces de plantas de H. portulacoides de tres meses cultivadas 60 días a salinidad creciente, se producía un incremento del contenido total KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 111 de Na+, mientras que el contenido total de K+ permanecía constante. Ello daba lugar a un incremento de la relación Na+/K+ de 1,5 veces en plantas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl respecto al de las plantas cultivadas en ausencia de sal (Redondo et al., 2007). Sin embargo, en el caso de la raíz de plántulas, los resultados obtenidos en este trabajo muestran un incremento mayor del contenido total de Na+ tras 7 días en presencia de 300 mM NaCl respecto al contenido total de K+, que se reduce a la mitad, dando lugar a un incremento de la relación Na+/K+ de unas 14 veces respecto al valor obtenido en ausencia de sal (Tabla 14). Este comportamiento diferente respecto a la relación Na+/K+ y al mantenimiento del contenido total de K+ entre plantas de tres meses y plántulas de H. portulacoides cultivadas en presencia de elevadas concentraciones de sal podría explicarse como un mecanismo de ajuste osmótico en respuesta a la salinidad durante el crecimiento de las plántulas. Así, durante los primeros estadíos de crecimiento en presencia de altas concentraciones de Na+ las plántulas acumularían más Na+ que K+, cuya disponibilidad en el medio sería menor, permitiendo la incorporación de agua, esencial para la elongación celular en esa fase del crecimiento. Una respuesta iónica similar ha sido descrita para las hojas de Chenopodium quinoa cultivada en salinidades crecientes (de 0 a 300 mM NaCl), en las que la relación Na+/K+ aumenta 20 veces en hojas maduras, mientras que en hojas jóvenes el incremento de dicha relación es superior a 300 veces (Hariadi et al., 2011). Así también en el caso de H. portulacoides se ha observado un incremento de la relación Na+/K+ en cotiledones (Tabla 14), que es 70 veces mayor que el observado en plántulas crecidas en ausencia de sal. La acumulación de Na+ y Cl-, y por tanto el aumento de la relación Na+ respecto a K+, ha sido propuesta como un mecanismo de ajuste osmótico para algunas halófitas, particularmente las Chenopodiaceas, calificadas como especies inclusoras (Flowers y Colmer, 2008) frente a otras halófitas, generalmente monocotiledóneas, que restringen la entrada de Na+ a través de la raíz mediante una alta selectividad en la incorporación de K+ frente a Na+. En estas especies, como las halófitas monocotiledóneas Puccinellia peisonis o Festuca rubra (Marschner, 2012), la exclusión de sales contribuiría a la tolerancia a la salinidad, siendo ésta también una característica de especies glicófitas más tolerantes a medios salinos (Greenway y Munns, 1980; Shabala et al., 2014). No obstante, en realidad existe un continuo de diferentes grados de exclusión o inclusión, que difieren entre Na+ y Cl-, y entre partes y órganos de la planta (Marschner, 2012). En IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 112 el caso de las especies inclusoras, la presencia de glándulas y vesículas de sal, como las observadas en el género Atriplex (Schirmer y Breckle, 1982), funcionaría como un mecanismo eficiente para la excreción o secuestro del exceso de Na+ acumulado (Shabala et al., 2013). Sin embargo, la información sobre los mecanismos de incorporación y homeostasis de Na+ en las raíces de halófitos es muy escasa (Flowers y Colmer, 2008). En el caso de H. portulacoides los valores de permeabilidad relativa Na+/K+ de la membrana plasmática de las células epidérmicas de la raíz indican que las raíces de esta especie serían muy permeables a Na+. De hecho, en medidas de Na+c realizadas en continuo en plántulas crecidas en ausencia de Na+, se ha observado un incremento de casi el doble de la Na+c al pasar de concentraciones externas de 1 mM a 60 mM Na+. No obstante, el aumento de la permeabilidad relativa a K+ respecto a Na+ en plántulas cultivadas en 300 mM NaCl (Tabla 15) indica una selectividad próxima al 90% para los mecanismos de incorporación de K+ frente a Na+ en condiciones salinas. Ambas características coinciden con el carácter inclusor (presencia de glándulas de sal) que presenta esta planta y con la capacidad para incorporar K+ a concentraciones altas de Na+ observada en esta especie. Los valores de permeabilidad obtenidos en el caso de plántulas de H. portulacoides cultivadas en ausencia de tratamiento salino (PNa+/PK+ = 0,52) son similares a los descritos en la especie tolerante a la salinidad Plantago maritima (PNa+/PK+ $ 0,6) en condiciones de estrés moderado (25 mM NaCl; Maathuis y Prins, 1990). No obstante, el valor obtenido en las plántulas de H. portulacoides cultivadas en presencia de 300 mM NaCl (PNa+/PK+ = 0,12) es la mitad del descrito por esos mismos autores para la especie sensible a la salinidad, Plantago media, cultivada en presencia de 25 mM NaCl (Maathuis y Prins, 1990); precisamente, la sensibilidad de P. media se ha relacionado con la baja capacidad de excluir Na+ (Maathuis y Prins, 1990). Por otra parte, los valores de permeabilidad relativa obtenidos en H. portulacoides son varios órdenes de magnitud superiores a los descritos en la fanerógama acuática Zostera marina que muestra, en agua de mar natural (500 mM NaCl), una permeabilidad muy restringida a Na+ respecto a K+ tanto en hojas ( PNa+/PK+ = 0,003; Fernández et al., 1999), como en raíces (PNa+/PK+ = 0,046; Rubio, 2004). A diferencia de H. portulacoides, esta halófita monocotiledónea marina, tanto por sus valores de permeabilidad relativa como por la presencia de un antiportador Na+/H+ en el plasmalema (Rubio et al,. 2011), presentaría una adaptación al medio salino de tipo KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 113 exclusor. Asimismo, la alta permeabilidad al Na+ observada en las células epidérmicas de la raíz de H. portulacoides también es mayor que la observada en otra especie procedente de la marisma del estuario del Río Palmones, Sarcocornia perennis, cuya permeabilidad relativa a Na+ respecto a K+, en células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en ausencia o en presencia de 300 mM NaCl, es 0,07 y 0,009, respectivamente (Elena et al., 2009). No obstante, S. perennis no presenta glándulas de sal, pero sí muestra tallos de tipo suculento (Schirmer y Breckle, 1982), lo cual sugiere que posea mecanismos de tolerancia a la salinidad diferentes a los de H. portulacoides. Un aspecto clave en el proceso de tolerancia a la salinidad es el mantenimiento de una relación Na+/K+ baja en el citoplasma debido a los efectos nocivos del Na+ en los procesos metabólicos (Amtmann y Sanders, 1999; Munns y Tester, 2008). Así, la tolerancia a la salinidad se adquiere no sólo por la exclusión o compartimentación de Na+ sino por la retención eficiente de K+ en el citoplasma en condiciones de estrés salino (Shabala y Munns, 2012). Los resultados obtenidos en el presente trabajo, la primera vez que se mide la actividad citoplasmática de Na+ y K+ en una halófita terrestre utilizando microelectrodos selectivos para iones, muestran que se produce una disminución de la concentración citoplasmática de K+ en las células epidérmicas de la raíz de H. portulacoides cultivadas en tratamiento salino (Tabla 12). La actividad citoplasmática de K+ en células radiculares de H. portulacoides sometidas a deficiencia de K+ y Na+ se encuentra en torno a 76 mM K+, un valor en el mismo rango que el observado en algunas glicófitas, como Arabidopsis, cebada y tomate, cultivadas en condiciones de K+ limitantes (Walker et al., 1996; Carden et al., 2003; Leidi et al., 2010; Barragán et al., 2012; Huertas et al., 2013), aunque se han observado valores incluso más bajos, alrededor de 40 mM, en plantas de cebada sometidas a ayuno extremo de K+ (Walker et al., 1996). Sin embargo, cuando las plántulas de H. portulacoides se cultivaron en presencia de 300 mM Na+, el K+ citosólico disminuyó hasta valores en torno a 55 mM K+. Este resultado concuerda con la disminución del contenido total de K+, discutido anteriormente en el caso de las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl respecto a las cultivadas en ausencia de Na+. Asimismo, la reducción del K+ citosólico en presencia de una alta concentración externa de Na+ también se ha observado en plantas glicófitas cultivadas a concentraciones por encima de 100 mM Na+, utilizando la misma técnica electrofisiológica (Carden et al., 2003; Huertas et al., 2013). Así, en el caso de una variedad de cebada sensible a la salinidad la IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 114 actividad citoplasmática de K+ se reduce desde 60 mM hasta valores en torno a 39 mM tras 8 días de cultivo en 200 mM NaCl (Carden et al., 2003). En el caso de tomate (Solanum lycopersicum cv MicroTom) la disminución de la actividad citoplasmática de K+ es menor que la observada en H. portulacoides, habiéndose descrito una reducción de 75 a 68 mM K+ en las células epidérmicas de la raíz de plántulas cultivadas en presencia de 120 mM NaCl (Huertas et al., 2013). Parece entonces que los mecanismos de homeostasis del K+ citosólico en H. portulacoides tendrían un comportamiento parecido al observado en glicófitas. Por otra parte, los valores de actividad citoplasmática de K+ detectados en las plántulas de H. portulacoides cultivadas en condiciones salinas son menores a los estimados por otros métodos en células radiculares de otras especies del mismo género, en las que se ha descrito que la concentración de K+ oscilaría entre 120 y 225 mM en plantas crecidas entre 50 y 600 mM NaCl (Flowers et al., 2015). Aunque la disminución del K+ citosólico observada en H. portulacoides parece estar en contra de una eficiente capacidad para retener K+ en el citoplasma propuesta como mecanismo de tolerancia a la salinidad (Shabala y Munns, 2012), en el caso de H. portulacoides esta disminución del K+ citoplasmático, dado que al mismo tiempo se produce una despolarización de la membrana, determina que el valor del gradiente de potencial electroquímico para K+ (Fig. 27), permita impulsar la entrada pasiva de K+ desde concentraciones externas en torno a 0,1 mM K+. Estos resultados están en la misma línea que los descritos en el caso de plantas de tomate transformadas que sobreexpresan el antiportador LeNHX2 (Huertas et al., 2013), las cuales muestran una reducción a la mitad de la actividad citoplasmática de K+ (36 mM), pero mantienen un mayor transporte de K+ en condiciones de estrés salino respecto a las plantas no transformadas (Huertas et al., 2013). En este sentido, la mayor tolerancia a la salinidad podría explicarse por el mantenimiento de condiciones termodinámicas que garanticen la incorporación de K+ en presencia de elevadas concentraciones de Na+, tal como indican los resultados obtenidos en las plántulas de H. portulacoides. En relación con las condiciones termodinámicas un aspecto destacable observado en las células epidérmicas de la raíz de H. portulacoides, mencionado anteriormente, es el mantenimiento de un potencial de membrana muy negativo en presencia de 300 mM NaCl, en torno a -160 mV. Este valor es similar al descrito en la KARIMA AIT HAMMOU IV. Discusión 115 fanerógama acuática Z. marina (en torno a -156 mV) medido en agua de mar natural con una concentración de 500 mM NaCl (Fernández et al., 1999). Parece por tanto, que en el caso de las células epidérmicas de la raíz de H. portulacoides, a pesar de que la presencia de elevadas concentraciones de Na+ despolariza parcialmente la membrana, disminuyendo la capacidad para incorporar K+ en presencia de 300 mM Na+, como se ha discutido anteriormente, el gradiente de potencial electroquímico que impulsa la entrada pasiva de este ión puede ser suficiente para mantener la incorporación pasiva de K+ en condiciones parecidas a las del estuario. El incremento de los contenidos totales de Na+ observado en las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl, así como la elevada permeabilidad relativa Na+/K+ estimada en las células radiculares, se corresponde con la mayor actividad citoplasmática de Na+ medida en las células epidérmicas de la raíz cultivadas en presencia de 300 mM NaCl (72 mM Na+c), respecto al valor obtenido en las plántulas cultivadas en ausencia de tratamiento salino (26 mM Na+c). En ambos tratamientos la actividad citoplasmática de Na+ es mayor que la que se ha detectado en Z. marina, utilizando las mismas técnicas electrofisiológicas, tanto en las células de la raíz (alrededor de 11 mM, Rubio et al., 2005) como del mesófilo foliar (en torno a 13 mM; Rubio et al., 2011), medidas en presencia de una concentración externa de 500 mM Na+. Esta diferencia en la actividad citoplasmática de Na+ de ambas especies puede deberse, como se ha mencionado anteriormente, a la mayor permeabilidad al Na+ observada en H. portulacoides respecto a la descrita en Z. marina. Por otra parte, los valores medidos en las plántulas de H. portulacoides cultivadas en ausencia de tratamiento salino son similares a los descritos en una variedad de cebada tolerante a la salinidad citada anteriormente (28 mM Na+) cultivada en presencia de 25 mM NaCl durante 8 días (Carden et al., 2003). Asimismo, el valor de Na+c obtenido en las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl está en el rango de los valores estimados en raíces de halófitas terrestres utilizando técnicas indirectas, entre 70 y 200 mM Na+ en condiciones de cultivo entre 50 y 400 mM NaCl (Flowers y Colmer, 2008; Flowers et al., 2015). No obstante, las medidas directas realizadas por electrofisiología en H. portulacoides sugieren que la actividad citoplasmática de sodio estaría más bien en los valores inferiores del rango propuesto por estos autores. Sin embargo, son necesarias más medidas en especies halófitas para determinar cuál sería el rango habitual de actividades citoplasmáticas de Na+ y K+ en este grupo de plantas. IV. Discusión KARIMA AIT HAMMOU 116 Asumiendo que las medidas directas de actividades iónicas en el citoplasma son escasas, especialmente en la literatura de halófitos, recientemente Flowers y colaboradores (2015) han propuesto una relación Na+/K+ para el citoplasma de halófitas, basada en estimaciones, de 0,5 a 1. En el caso de H. portulacoides los resultados descritos en esta memoria muestran que esta relación es de 0,34 en las células de raíz de plantas cultivadas en ausencia de tratamiento salino y de 1,3 en las cultivadas en presencia de 300 mM (Tabla 18), valores dentro del rango propuesto. No obstante, este resultado indica que la ratio citoplasmática Na+/K+ se incrementa casi en cuatro veces en las células radiculares de las plántulas cultivadas en presencia de 300 mM NaCl respecto a condiciones sin sal. En comparación con el incremento en 16 veces de la relación Na+/K+ obtenida a partir de los contenidos totales de Na+ y K+ en las raíces de las plántulas cultivadas en las mismas condiciones, este resultado sugiere la existencia de un sistema de compartimentación que permitiría la acumulación de Na+ en las raíces de H. portulacoides, frente a mecanismos de extrusión de Na+ a través de la membrana plasmática observados en otras especies. Tabla 18. Índice Na+c/K+c, en células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas en ausencia o presencia de 300 mM NaCl. Los datos se calcularon con los valores de actividad citoplasmática de Na+ (Na+c) y K+ (K+c) mostrados en las tablas 12, 16 y 17. Na+c (mM) K+c (mM) Na+c / K+c 0 mM NaCl 26 ± 3 76 ± 4 0,34 300 mM NaCl 72 ± 5 55 ± 6 1,31 Considerando los valores negativos del potencial de membrana y dado que las concentraciones externas de Na+ son elevadas en un ambiente salino, termodinámicamente la extrusión de Na+ desde el citoplasma hacia el medio externo debe ser activa. Así, puesto que en plantas vasculares no se han encontrado bombas de Na+ (Garciadeblás et al., 2001), el principal mecanismo de transporte de la membrana plasmática involucrado en el mantenimiento de la homeostasis citoplasmática de Na+ se considera debida al antiportador Na+/H+, SOS1. Descrito inicialmente en Arabidopsis (Shi et al., 2000; Qiu et al., 2003), su presencia se ha relacionado con la tolerancia a estrés salino tanto en especies glicófitas (Mullan et al., 2007) como en halófitas (Chen et al., 2010). Si bien se ha descrito la expresión constitutiva de este antiportador en halófitos terrestres como Mesembryantemum cristalinum (Barkla et al., 2002) y CONCLUSIONES KARIMA AIT HAMMOU VConclusiones 125 V. Conclusiones 1. Las raíces de H. portulacoides cultivadas en ausencia de K+ y Na+ son capaces de incorporar K+ de soluciones externas que contienen concentraciones micromolares de este ión. Sin embargo, la afinidad de este transporte (Km!300 µM) no es tan alta como la descrita para el transporte de potasio de alta afinidad en glicófitos. 2. La afinidad por K+ y la velocidad máxima de transporte disminuyen en plantas cultivadas en condiciones salinas (300 mM Na+). No obstante, a estas concentraciones de Na+, próximas a los valores que se miden en el medio donde crece esta especie, las células de la raíz son capaces de mantener un potencial de membrana altamente negativo, lo cual es esencial para mantener la capacidad de absorción de K+ y de otros nutrientes. 3. Los efectos producidos por distintos inhibidores específicos del transporte de K+ y el cálculo del gradiente de potencial electroquímico de este ión sugieren que dicho transporte se produce principalmente a través de canales de potasio de tipo AKT, en plantas cultivadas tanto en presencia como en ausencia de sodio. Sin embargo, no se puede excluir que transportadores de tipo HAK puedan estar implicados de manera limitada en el transporte de K+ en plantas cultivadas en ausencia de sodio. 4. Las raíces de H. portulacoides cultivadas en ausencia de K+ y Na+ son capaces de incorporar Na+ de soluciones externas que contienen concentraciones micromolares de este ión. No obstante, la afinidad mostrada por este transporte (Km!600 µM) indica que esta especie carece de un transporte de sodio de alta afinidad como el descrito en plantas glicófitas. 5. La respuesta del transporte de Na+ y K+ frente a distintos inhibidores indica que el transporte de Na+ se produce a través de transportadores distintos a los usados por K+. Los valores del gradiente de potencial electroquímico indican que el transporte de Na+ sería pasivo, es decir, se produciría a través de canales cuya identidad no se ha podido determinar con el uso de inhibidores. VConclusiones KARIMA AIT HAMMOU 126 6. Las actividades citoplasmáticas de K+ y Na+ en las células epidérmicas de la raíz de plántulas de H. portulacoides cultivadas en ausencia de Na+ y de K+ son similares a las descritas en glicófitos (! 76 mM y !26 mM, respectivamente) y determinan un índice Na+/K+ citoplasmático próximo a 0,34. En estas mismas condiciones, la permeabilidad de la membrana al K+ es solo ligeramente mayor que la permeabilidad al Na+. 7. En plántulas cultivadas en tratamiento salino, la actividad citoplasmática de K+ disminuye en las células epidérmicas de la raíz (! 55 mM), como ocurre en glicófitos. En cambio, la actividad citoplasmática de Na+ aumenta en estas condiciones (! 72 mM), mostrando valores superiores a los observados en glicófitos en condiciones salinas. Ello se traduce en que el índice Na+/K+ en el citoplasma se multiplique por cuatro (1,3) en condiciones salinas. 8. Los valores de permeabilidad relativa, PNa+/PK+, de la membrana de células radiculares de esta especie son consistentes con un mecanismo de tolerancia a la salinidad de tipo inclusor. No obstante, la permeabilidad de la membrana al K+ es mucho mayor que al Na+ en condiciones salinas, lo que concuerda con la alta capacidad de incorporación de K+ observada en medio salino. 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