Implicación de la proteína clusterina y la actividad apoptótica en la transformación maligna y el pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Medicina Departamento de Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología Tesis Doctoral IMPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA CLUSTERINA Y LA ACTIVIDAD APOPTÓTICA EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA Y EL PRONÓSTICO DE LOS PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL Julia Alcaide García DIRECTORES Dr. D. Maximino Redondo Bautista Dr. D. Antonio Rueda Domínguez 2015 ! II! UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Facultad de Medicina Departamento de Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología TESIS DOCTORAL IMPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA CLUSTERINA Y LA ACTIVIDAD APOPTÓTICA EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA Y EL PRONÓSTICO DE LOS PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL DOCTORANDO Julia Alcaide García DIRECTORES Dr. D. Maximino Redondo Bautista Dr. D. Antonio Rueda Domínguez AUTOR: Julia Alcaide García https://orcid.org/0000-0002-9301-1387 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es ! IV! Tesis Doctoral IMPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA CLUSTERINA Y LA ACTIVIDAD APOPTÓTICA EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA Y EL PRONÓSTICO DE LOS PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL Tesis doctoral presentada por Dña. Julia Alcaide García, para optar al grado de Doctora por la Universidad de Málaga. Málaga Noviembre 2015 ! V! ! VI! D. MAXIMINO REDONDO BAUTISTA, Facultativo Especialista del Área de Laboratorio del Hospital Costa Del Sol de Marbella y Profesor Asociado del Departamento de Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología de la Universidad de Málaga, CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “IMPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA CLUSTERINA Y LA ACTIVIDAD APOPTÓTICA EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA Y EL PRONÓSTICO DE LOS PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL”, ha sido realizado bajo mi dirección por Dña. Julia Alcaide García, para optar al título de Doctora por la Universidad de Málaga. Y para que conste, firmo el presente certificado en Málaga a 19 de Octubre de 2015. Fdo. Dr. Maximino Redondo Bautista ! VII! ! VIII! D. ANTONIO RUEDA DOMÍNGUEZ, Doctor en Medicina y Director de Área de Oncología del Hospital Costa del Sol de Marbella, CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “IMPLICACIÓN DE LA PROTEÍNA CLUSTERINA Y LA ACTIVIDAD APOPTÓTICA EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA Y EL PRONÓSTICO DE LOS PACIENTES CON CÁNCER COLORRECTAL”, ha sido realizado bajo mi dirección por Dña. Julia Alcaide García, para optar al título de Doctora por la Universidad de Málaga. Y para que conste, firmo el presente certificado en Málaga a 19 de Octubre de 2015. Fdo. Dr. Antonio Rueda Domínguez ! IX! ! XVI! Índice de contenidos 1 INTRODUCCIÓN 1 1.1 Epidemiología del cáncer colorrectal 2 1.2 Factores pronósticos del cáncer colorrectal 4 1.2.1 Factores pronósticos clínico-patológicos 6 1.2.2 Factores pronósticos moleculares 10 1.3 Diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal 14 1.3.1 Signos y síntomas 14 1.3.2 Pruebas diagnósticas 14 1.3.3 Estadificación 15 1.3.4 Tratamiento 17 1.4 Carcinogénesis colorrectal. 18 1.5 El balance apoptosis-proliferación 21 1.6 Clusterina 24 1.6.1 El gen de la clusterina 26 1.6.2 Estructura de la clusterina 28 1.6.3 Formas de la clusterina 29 1.6.4 Funciones de la clusterina 31 1.6.5 Síntesis y regulación de la clusterina 35 1.6.6 Clusterina y cáncer 37 2 OBJETIVOS 43 3 MATERIAL Y MÉTODOS 45 3.1 Pacientes y muestras de tejido 45 3.2 Detección de apoptosis celular in situ (Ensayo TUNEL) 47 3.3 Estudio inmunohistoquímico de la clusterina 48 3.4 Análisis estadístico 49 ! XVII! 4 RESULTADOS 51 4.1 Expresión de clusterina 51 4.2 Valor pronóstico de clusterina 53 4.2.1 Clusterina y supervivencia libre de progresión 54 4.2.2 Clusterina y supervivencia global 55 4.3 Índice apoptótico 55 4.4 Valor pronóstico del índice apoptótico 57 4.4.1 Apoptosis y supervivencia libre de progresión 57 4.4.2 Apoptosis y supervivencia global 59 5 DISCUSIÓN 61 5.1 Clusterina 61 5.2 Apoptosis 64 6 CONCLUSIONES 69 7 BIBLIOGRAFÍA 70 ! XVIII! Lista de figuras Figura 1. Incidencia y mortalidad por cáncer en hombres. 2 Figura 2. Incidencia y mortalidad por cáncer en mujeres. 3 Figura 3. Estadios del cáncer colorrectal. 16 Figura 4. Vías de la carcinogénesis colorrectal. 19 Figura 5. Proliferación, diferenciación y apoptosis en la cripta intestinal. 21 Figura 6. Vías de señalización de la apoptosis. 23 Figura 7. Localización del gen de la clusterina en el cromosoma 8. 26 Figura 8. El gen de la clusterina y las variantes de ARNm. 27 Figura 9. Estructura de la clusterina. 29 Figura 10. Interacciones fisiológicas entre Ku70/80, clusterina y Bax. 30 Figura 11. Regulación de la apoptosis por clusterina dependiente de los iones de calcio. 33 Figura 12. Papel de sCLU en la progresión tumoral. 38 Figura 13. Escape de la apoptosis en la célula cancerosa. 40 Figura 14. Estudio inmunohistoquímico de clusterina. 52 Figura 15. Supervivencia libre de progresión de los pacientes agrupados según la expresión de clusterina. 54 Figura 16. Apoptosis detectada mediante TUNEL. 56 Figura 17. Supervivencia libre de progresión según el índice apoptótico (IA). 57 Figura 18. La supervivencia libre de progresión de los pacientes con tumores en estadio avanzado (estadios III y IV) según índice apoptótico (IA). 58 ! XIX! Lista de tablas Tabla 1. Factores pronósticos en el cáncer colorrectal localizado. 5 Tabla 2. Factores pronósticos en el cáncer colorrectal avanzado. 6 Tabla 3. Supervivencia causa-específica a los 5 años para el cáncer colorrectal localizado según el estadio TNM. 8 Tabla 4. Subtipos moleculares del cáncer colorrectal según la clasificación de consenso internacional. 13 Tabla 5. Agrupación de los estadios del cáncer colorrectal en la clasificación TNM. 16 Tabla 6. Sinónimos o proteínas homólogas de clusterina. 25 Tabla 7. Características de los pacientes con cáncer colorrectal. 46 Tabla 8. Correlación de la expresión de clusterina con los factores clínico-patológicos. 53 Tabla 9. Análisis multivariante de la supervivencia libre de progresión. 55 ! XX! Abreviaturas AJCC American Joint Committee on Cancer AP-1 Activator Protein-1 APC Adenomatous Polyposis Coli ApoJ Apolipoproteína J ARE Androgen Response Element ARNm ARN mensajero ASCO American Society of Clinical Oncology ATM Ataxia Telangiectasia-Mutated CCR Cáncer colorrectal CEA Antígeno carcinoembrionario CIMP CpG island methylator phenotype CIN Inestabilidad cromosómica CLE Clusterin Element CLI Inhibidor de la Lisis del Complemento CLU Clusterina CMS Consensus molecular subtype cTNM Estadio clínico TNM Cyt C Citocromo C DCC Deleted in Colon Carcinoma DE Desviación estándar dMMR Deficiencia en proteínas reparadoras de errores del ADN o mismatch-repair EEUU Estados Unidos EGF Epidermal Growth Factor EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EMT Epithelial-Mesenchymal Transition ER Retículo endoplásmico ESMO European Society for Medical Oncology G Grado histológico ! XXI! HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 HSEs Heat Shock Elements HSF Heat Shock Factor HSF1 Heat Shock Transcription Factor 1 GPIII Glicoproteína III GRE Glucocorticoid Response Element HDL Lipoproteína de alta densidad HR Hazard Ratio IA Índice apoptótico IC Intervalo de confianza IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1 IGF-1R Insulin-like Growth Factor 1 Receptor IGFBP2 Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 IHQ Inmunohistoquímica IL Interleucinas IMS Inestabilidad de microsatélites IRS Insulin Receptor Substrate LDH Lactato deshidrogenasa LDL Lipoproteína de baja densidad LOH Loss of heterozygosity o pérdida de heterocigosidad MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MRC Margen de resección circunferencial MSI-H Alta frecuencia de inestabilidad de microsatélites MSS Estabilidad de microsatélites NCBI National Center for Biotechnology Information nCLU Clusterina nuclear NF-κB Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells OMS Organización Mundial de la Salud PBS Phosphate Buffered Saline PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B psCLU Clusterina precursora secretada pTNM Estadio patológico TNM ! XXII! QT-RT Quimio-radioterapia sCLU Clusterina secretada SEER Surveillance, Epidemiology, and End Results Program SG Supervivencia global SGP-2 Glicoproteína Sulfatada-2 sHSP Small Heat-Shock Proteins SLP Supervivencia libre de progresión SLR Supervivencia libre de recidiva SP-1 Stimulatory Element-1 SP-40,40 Proteína Secretada asociada al complemento 40,40 SSCR ER Signal Sequence Coding Region STAT1 Signal Transducers and Activators of Transcription 1 StR Supervivencia tras la recidiva TCF T-Cell Factor TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase TGF-β Transforming Growth Factor-β TNFα Tumor Necrosis Factor-α TRPM2 Mensajero Prostático Represor de Testosterona-2 TS Timidilato sintasa TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling Ub Ubiquitin UICC Union for International Cancer Control UPR Unfolded Protein Response VLDL Lipoproteína de muy baja densidad XRT Radiación ! XXIII! ! 1! 1 Introducción El cáncer colorrectal (CCR) constituye un importante problema de salud pública en el mundo occidental, dada su incidencia y mortalidad. Esto ha motivado un gran esfuerzo colectivo por conocer mejor las bases biológicas y moleculares de esta neoplasia y mejorar el diagnóstico y tratamiento de los pacientes afectados. De hecho, en las últimas décadas ha tenido lugar un destacado avance, especialmente en los campos referidos a la técnica quirúrgica y al tratamiento sistémico. En este último, por ejemplo, se ha producido la incorporación de nuevos fármacos citotóxicos y agentes dirigidos contra dianas moleculares específicas. Estas innovaciones han permitido progresar en el manejo de los estadios localizados, pero sobre todo de los metastásicos. También se ha observado un aumento del diagnóstico precoz, y cada vez hay una mayor preocupación por encontrar técnicas diagnósticas que aumenten la aplicabilidad de los programas de cribado en la población general. Todo ello conjuntamente ha supuesto un beneficio en la supervivencia de los pacientes. Sin embargo, aún sigue siendo necesario profundizar en el conocimiento de la biología tumoral del CCR, base fundamental en la búsqueda de claves que nos guíen hacia la curación. ! 8! invasión a través de la pared intestinal, y no del tamaño como ocurre en otras neoplasias. El “N” (nódulos linfáticos) depende del grado de afectación tumoral de los ganglios regionales y el “M” (metástasis), de la existencia de enfermedad tumoral a distancia. En la tabla 3 podemos ver la supervivencia para cada estadio del CCR localizado, con o sin afectación ganglionar regional, según la séptima edición de la clasificación TNM, que incorpora un nuevo subestadio (estadio IIC: T4bN0M0) y redefine el estadio ganglionar según el número de ganglios afectos y la existencia de depósitos tumorales satélites (N1c). Tabla 3. Supervivencia causa-específica a los 5 años para el cáncer colorrectal localizado según el estadio TNM (14). Estadio tumoral (TNM) Supervivencia a 5 años (%) I 92.5 IIA 82.1 IIB 77.7 IIC 54.5 IIIA 83.8 IIIB 59.6 IIIC 29.7 La supervivencia se ve reducida drásticamente cuando el tumor se ha diseminado a distancia (estadio IV). Aproximadamente un 25% de los pacientes se diagnostican como estadio IV y hasta un 25% adicional de los pacientes con estadios localizados a la presentación desarrollarán metástasis a lo largo de la evolución de su enfermedad (6), siendo la localización preferente de dichas metástasis el hígado. Sólo el 11% de los pacientes con estadio IV permanecen vivos a los 5 años de su diagnóstico (15). ! 9! d) Grado de diferenciación: Dependiendo del componente glandular, la diferenciación tumoral puede estratificarse en tres o cuatro grados (16): - Grado 1 o bien diferenciado: más del 95% del tumor forma glándulas. - Grado 2 o moderadamente diferenciado: formación glandular en 50-95% del tumor. - Grado 3 o pobremente diferenciado: formación glandular en menos del 50% del tumor. - Grado 4 o indiferenciado: formación glandular en 0% del tumor. A pesar de la variabilidad interobservador que puede aparecer a la hora de catalogar el grado histológico, se ha comprobado el valor pronóstico del mismo (17). Si bien, en la mayoría de estudios han agrupado los cuatro grados en sólo dos categorías, tal y como recomienda la OMS (Organización Mundial de la Salud) (16) y la AJCC (13): - Bajo grado: bien y moderadamente diferenciado (50 - 100% de formación glandular). - Alto grado: pobremente diferenciado e indiferenciado (0 - 49% de formación glandular). De esta forma, se ha demostrado una peor supervivencia para los tumores de alto grado, siempre que no presenten IMS, ya que esta confiere un pronóstico más favorable, por lo que hay autores que proponen incorporarla en la gradación del CCR (18). e) Localización del tumor primario: Clásicamente se ha dicho que los tumores que asientan en el recto tienen un peor pronóstico, por la dificultad que entrañan para llevar a cabo una cirugía oncológica adecuada y por el alto porcentaje de recaídas locales que presentan, que incluso pueden ser tardías. Para afrontar estos ! 10! problemas se han implementado mejoras terapéuticas en los últimos años como la técnica quirúrgica para la escisión total del mesorrecto y los tratamientos complementarios, que incluyen radioterapia. No obstante, según una revisión de datos del SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results Program), aunque la supervivencia en los estadios más precoces es superior para el colon, no sucede así en estadios más avanzados (IIIC y IV), donde se obtienen mejores resultados para el recto (19). No sólo podemos hablar de un distinto pronóstico entre colon y recto, sino que a nivel biológico y molecular cada vez son más evidentes las diferencias existentes entre las diversas localizaciones del CCR, incluso con características particulares para cada parte del colon. Así, los tumores proximales (situados en ciego, colon ascendente, y ángulo hepático de colon) son más frecuentemente de tipo mucinoso, con IMS, hipermutadores y con mutación del protooncogén BRAF. En cambio, los tumores distales (ángulo esplénico de colon, colon descendente y sigma) asocian más a menudo inestabilidad cromosómica, amplificación de EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) o HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) y sobreexpresión de epirregulina (20). Estas diferencias tienen implicaciones pronósticas y terapéuticas. Por ejemplo, se ha observado que los tumores proximales presentan una peor supervivencia tras la recidiva, y que los tumores metastásicos de colon distal son los que más se benefician de los fármacos anti-EGFR y los que tienen una supervivencia más prolongada (21). También la localización ha sido una de las características a destacar en algunos de los subtipos de la clasificación molecular del CCR, recientemente publicada (22). 1.2.2 Factores pronósticos moleculares a) KRAS: El protooncogén RAS se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 12, codifica proteínas localizadas en la membrana celular y ! 11! actúa como iniciador del ciclo de proliferación. Ejerce su acción en la vía RAS-RAF-MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), dependiente del EGFR, siendo su mutación un evento precoz en el proceso de tumorigénesis colorrectal (23). Hoy en día, su valor predictivo está claramente establecido, y así, fármacos biológicos dirigidos contra el EGFR (cetuximab, panitumumab) vieron su indicación restringida a aquellos casos de CCR metastásicos que no presentasen mutaciones en los codones 12 y 13 de KRAS (lo que supone el 40% de los casos aproximadamente). Posteriormente, también se conoció que era necesario comprobar que no estuvieran mutados los codones 61 y 146 de KRAS, y también los codones 12, 13 y 61 de NRAS (18% de casos) (24). Por tanto, hoy día, estas terapias sólo se administran a pacientes con RAS nativo, dado que los pacientes con RAS mutado no responden o incluso pueden llegar a presentar un efecto deletéreo en su supervivencia si llegan a recibirlas, sobre todo al asociar combinaciones basadas en oxaliplatino (25,26). Se ha relacionado la presencia de mutaciones de KRAS con una mayor propensión a la diseminación pulmonar (24). Sin embargo, su significado pronóstico ha sido estudiado por diferentes autores con resultados no concluyentes, influyendo el tipo de mutación detectada, el estadio tumoral y la localización del tumor primario (23). b) BRAF: Las mutaciones de BRAF (principalmente V600E) definen un subtipo molecular de CCR (8 - 10%), que se caracteriza por afectar predominantemente a mujeres, de edad más avanzada, con tumores localizados en colon derecho, de alto grado, mucinosos, con IMS, fenotipo metilador o CIMP (CpG Island Methylator Phenotype) y una mayor frecuencia de metástasis peritoneales y ganglionares (27). Las mutaciones de BRAF y KRAS son mutuamente excluyentes (28). Al contrario que lo que ocurre en el caso de KRAS, la mutación de BRAF se asocia con un peor pronóstico, especialmente en metastásicos (29), pero su papel a la hora de predecir la respuesta a las terapias anti-EGFR no está tan claro. Para ! 12! algunos, aún no existen suficientes datos para establecer BRAF como un factor predictivo más a tener en cuenta (30). Pero revisiones exhaustivas como la de De Roock (28) o la de Pietrantonio (27), sugieren que debería determinarse previamente al inicio de estos tratamientos como hacemos con RAS, ya que no encuentran beneficio al administrar cetuximab o panitumumab en los casos con BRAF mutado. c) Inestabilidad de microsatélites: La IMS, causada por un déficit en el sistema de reparación de errores del ADN (dMMR), puede deberse a una mutación germinal en las proteínas reparadoras (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6), que da lugar al llamado síndrome de Lynch, o bien a la inactivación epigenética de MLH1, ligada al fenotipo CIMP. Es este segundo mecanismo de IMS, el esporádico, el que es más frecuente y el que suele asociar la mutación de BRAF (29). Para expertos como Fearon, la IMS es el factor molecular pronóstico más robusto (31). En estadios localizados, especialmente en estadios II (32), los casos con alta IMS presentan una mejor supervivencia, y también parecen beneficiarse menos del uso de 5-fluoruracilo adyuvante (31). En cambio, en el CCR metastásico la IMS no supone un mejor pronóstico (33). Además, el efecto protector de la IMS se ve atenuado en los casos que asocian mutación de BRAF (34). d) Clasificación molecular del cáncer colorrectal: Queda claro por lo descrito hasta ahora que el CCR es una enfermedad heterogénea, por lo que resulta de interés identificar subgrupos homogéneos para guiar las estrategias diagnósticas y terapéuticas. Existen múltiples clasificaciones moleculares, pero recientemente se ha propuesto un consenso internacional que hace una puesta en común de los datos de seis potentes grupos de investigación, y que gracias a herramientas informáticas para su análisis en conjunto, estratifica el CCR en cuatro subtipos principales, y un quinto subtipo compuesto por una miscelánea (Tabla 4) (22). ! 13! Tabla 4. Subtipos moleculares del cáncer colorrectal según la clasificación de consenso internacional (adaptado de Dienstmann et al. 2014). Subtipo (%) Características Pronóstico CMS1 (13%) Mujeres, edad avanzada, colon derecho, IMS, CIMP, hipermutación, mutación de BRAF, activación inmunitaria. Mejor SLR, SG intermedia, peor StR. CMS2 (35%) Colon izquierdo, epitelial, MSS, CIN, mutación de TP53, activación de WNT/MYC. SLR intermedia, mejor SG, mejor StR. CMS3 (11%) Epitelial, CIN/MSI, mutación de KRAS, amplificación de MYC, sobreexpresión de IGFBP2. SLR, SG y StR intermedia. CMS4 (20%) Edad más joven, estadios III/IV, mesenquimal, CIN/MSI, activación de TGF-β /VEGF, sobreexpresión de NOTCH3. Peor SLR, peor SG, StR intermedia. Miscelánea (21%) Mixto, con activación epitelialmesenquimal variable. SLR, SG y StR intermedia. CMS: Consensus molecular subtype; SLR: Supervivencia libre de recidiva; SG: Supervivencia global; StR: Supervivencia tras la recidiva; IMS: Inestabilidad de microsatélites; MSS: Estabilidad de microsatélites; CIN: Inestabilidad cromosómica; IGFBP2: Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2. Cada subtipo se caracteriza por un fenotipo particular, por la activación de determinadas vías moleculares patogénicas e incluso por distintas lesiones precursoras. Estas diferencias biológicas se traducen en diferencias en la supervivencia, y se está trabajando para establecer una correlación también con la sensibilidad a los tratamientos. Si bien es un importante esfuerzo para el avance del conocimiento del CCR, aún es una aproximación experimental. ! 14! 1.3 Diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal 1.3.1 Signos y síntomas A menudo los pacientes que se presentan con síntomas al diagnóstico padecen la neoplasia en un estadio más avanzado (36), siendo las manifestaciones clínicas secundarias al crecimiento endoluminal (trastornos del hábito intestinal, con diarrea o estreñimiento, e incluso obstrucción intestinal completa, con dolor abdominal y vómitos) o exofítico del tumor (masa abdominal palpable, perforación intestinal o infiltración de órganos adyacentes como la vejiga, pudiendo dar lugar a una fístula y a complicaciones infecciosas) o bien al sangrado de la lesión, ocasionando anemia ferropénica y astenia, u objetivándose en forma de rectorragia o hematoquecia (37). Cuando progresa la enfermedad y se disemina, lo hace preferentemente al hígado, pudiendo aparecer dolor en hipocondrio derecho y hepatomegalia a la exploración o síndrome constitucional con cansancio, pérdida de apetito y peso, y en algunos casos, fiebre paraneoplásica (38). Por este motivo, el cribado poblacional intenta detectar el CCR en estadios más precoces, en los que los pacientes se encuentran asintomáticos, y pueden obtener un tratamiento curativo y un mejor pronóstico (39). 1.3.2 Pruebas diagnósticas La principal es la colonoscopia, que permite no sólo detectar el tumor, localizarlo y biopsiarlo, sino también identificar otras posibles lesiones sincrónicas y la extirpación de pólipos (37). Además de una historia clínica completa, con anamnesis que incluya los antecedentes familiares y exploración física, se debe completar el estudio de extensión con una analítica con CEA, TAC de tórax y abdomen, y en el caso del cáncer de recto, también una RMN de pelvis para la estadificación local (6). ! 15! 1.3.3 Estadificación Una vez completado el estudio de extensión se puede establecer el estadio clínico de la enfermedad (cTNM). El estadio patológico, en cambio, es definido por el análisis histológico de la pieza quirúrgica (pTNM). La clasificación TNM, describe la profundidad de la invasión del tumor primario en la pared del intestino, la existencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales y de metástasis a distancia, y define los distintos estadios (Tabla 5) (13). T (Tumor primario): TX: No se puede evaluar el tumor primario. T0: No hay evidencia de tumor primario. Tis: Carcinoma in situ: intraepitelial o invasión de la lámina propia. T1: El tumor invade la submucosa. T2: El tumor invade la muscular propia. T3: El tumor invade a través de la muscular propia y llega hasta la subserosa, hasta los tejidos pericolorrectales. T4a: El tumor penetra en la superficie del peritoneo visceral. T4b: El tumor invade otros órganos o estructuras, o se adhiere a ellos. N (Ganglios linfáticos regionales): NX: No se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales. N0: No existen metástasis en los ganglios linfáticos regionales. N1: Metástasis en 1 - 3 ganglios linfáticos regionales. N1a: Metástasis en 1 ganglio linfático regional. N1b: Metástasis en 2 - 3 ganglios linfáticos regionales. N1c: Depósitos tumorales satélites en la subserosa o en tejidos no peritonealizados. N2: Metástasis en 4 o más ganglios linfáticos regionales. N2a: Metástasis en 4 - 6 ganglios linfáticos regionales. N2b: Metástasis en 7 o más ganglios linfáticos regionales. ! 16! M (Metástasis a distancia): MX: No se puede evaluar la metástasis a distancia. M0: No hay metástasis a distancia. M1: Metástasis a distancia. M1a: Metástasis a distancia en un órgano o localización. M1b: Metástasis a distancia en más de un órgano o localización o afectando al peritoneo. Figura 3. Estadios del cáncer colorrectal. Fuente: http://cancer-colon.euroresidentes.com/2012/11/estadios-del-cancer-de-colonii.html Tabla 5. Agrupación de los estadios del cáncer colorrectal en la clasificación TNM. Estadio T N M 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 T2 N0 M0 IIA T3 N0 M0 IIB T4a N0 M0 IIC T4b N0 M0 IIIA T1-T2 N1/N1c M0 T1 N2a M0 IIIB T3-T4a N1/N1c M0 T2-T3 N2a M0 T1-T2 N2b M0 IIIC T4a N2a M0 T3-T4a N2b M0 T4b N1-N2 M0 IVA Cualquier T Cualquier N M1a IVB Cualquier T Cualquier N M1b ! 17! 1.3.4 Tratamiento El plan terapéutico va a depender de factores relacionados con el paciente (edad, estado general, comorbilidades) y con el tumor, principalmente, la localización del primario y el estadio tumoral. Los casos con cáncer de colon localizado resecable son candidatos a cirugía radical, con una intención curativa, siendo luego valorados para quimioterapia postoperatoria o adyuvante (estadios III y II de alto riesgo) o seguimiento (estadios I y II de bajo riesgo). La quimioterapia adyuvante se basa en el 5fluoruracilo en infusión continua o fluoropirimidinas orales (capecitabina), que pueden administrarse en monoterapia o en combinación con oxaliplatino, siendo estándar el empleo de esquemas denominados FOLFOX o XELOX (37). En el cáncer de recto que invade más allá de la muscular propia o bien presenta afectación ganglionar está indicado el uso de tratamiento neoadyuvante (antes de la cirugía), con quimio-radioterapia concomitante (basada en 5-fluoruracilo o capecitabina) o bien con esquemas de radioterapia corta (5 sesiones) (40). Una vez se ha producido la diseminación a distancia, la curación habitualmente no es posible, y el tratamiento tiene una intención paliativa, dado que sólo un limitado número de pacientes (10-30%) podrá ser candidato a un abordaje radical que incluya la cirugía de metástasis (41). En las últimas décadas se han producido avances no sólo en los métodos para el diagnóstico precoz o en la técnica quirúrgica, sino también en el tratamiento sistémico, incorporándose nuevos fármacos. En primer lugar, se demostró una mayor eficacia y tolerancia con la infusión continua de 5-fluoruracilo frente a su administración en bolo, y posteriormente, la adición de leucovorin y la aparición de los esquemas en combinación con oxaliplatino e irinotecán ofrecieron mejores resultados frente a la monoterapia. De este modo, se logró pasar de los 4-6 meses de mediana de supervivencia con tratamiento de soporte hasta los 20 meses empleando esquemas de quimioterapia en combinación (42). Un ! 24! potenciales implicaciones pronósticas. Sin embargo, son muy pocos los trabajos que ponen de manifiesto el significado pronóstico de la apoptosis en el CCR, y sólo algunos investigadores han comunicado supervivencias más cortas para los casos con mayor IA (64,65). De ahí el interés por definir el papel de la apoptosis en la carcinogénesis colorrectal y su relación con la supervivencia del CCR. 1.6 Clusterina La clusterina (CLU), es una glicoproteína heterodimérica de 75-80 kDa ampliamente distribuida en el organismo de los mamíferos, donde podemos encontrarla en una amplia variedad de tejidos (especialmente en cerebro, retina, hígado, glándulas suprarrenales, próstata, testículos, riñón, pulmón y corazón) y en casi todos los fluidos fisiológicos (semen, leche materna, orina, líquido cefalorraquídeo y plasma) (66–69). Fue descrita por primera vez en células de Sertoli de ratas (70) y en el fluido de la rete testis de carnero (71,72). Dicho fluido es conocido por provocar la agregación de las células de Sertoli y los hematíes de varias especies. Por ello cuando los autores descubrieron a la proteína responsable, decidieron llamarla “clusterina” (que produce “clusters” o agrupaciones), haciendo destacar su papel en las interacciones célula-célula (Fritz et al. 1983). Aunque ha recibido también otros nombres, relacionados con el sistema estudiado por cada investigador (Tabla 6), se estableció por consenso la denominación de clusterina (CLU) en la reunión celebrada en Cambridge en Septiembre de 1992 (66). Actualmente sabemos que CLU interviene en múltiples procesos fisiopatológicos, como la maduración espermática, la muerte y la supervivencia celular, la regulación del ciclo celular, el transporte de lípidos, la reparación del ADN, la adhesión celular, la remodelación de tejidos, el reciclaje de membrana o el control del sistema inmune (73,74). Esto la ha convertido en el objeto de ! 25! numerosos estudios relacionados con la neurodegeneración (más concretamente con la enfermedad de Alzheimer), el envejecimiento, la aterosclerosis, la enfermedad cardiovascular o el cáncer, entre otros (69). Tabla 6. Sinónimos o proteínas homólogas de clusterina (adaptado de Bettuzzi 2009). Nombre Fuente Especie Función Referencia Clusterina Fluido de rete testis Carnero Reproducción (71) GPIII Médula adrenal Bovina Gránulos cromafines (76) TRPM-2 Próstata Rata Apoptosis (77) SGP-2 Próstata Rata Reproducción (78) T64 Células neuroretinianas Codorniz Transformación celular (79) SP-40,40 Suero (hígado) Humana Modulación del complemento (80) CLI Suero (hígado) Humana Modulación del complemento (81) ApoJ Sangre Humana Transporte de lípidos (82) NA1/NA2 Sangre Humana Transporte de lípidos (83) K661 Retina Humana Retinitis pigmentosa (84) GP III: Glicoproteína III; TRPM-2: Mensajero prostático represor de testosterona-2; SGP-2: Glicoproteína sulfatada 2; SP-40,40: Proteína secretada asociada al complemento 40,40; CLI: Inhibidor de la lisis del complemento; ApoJ: Apolipoproteína J. Todos estos procesos se caracterizan por una respuesta celular al estrés oxidativo, poniéndose en marcha la maquinaria protectora encargada de reparar el daño, lo que suele conllevar un freno en la actividad proliferativa y un incremento de la muerte celular. Por ello, algunos consideran a CLU como un sensor celular que se activa en situaciones de estrés como las inducidas por la hipoxia, las radiaciones ionizantes o el choque térmico (85). Se ha observado que su expresión se encuentra alterada en distintas neoplasias del ser humano ! 26! (73), detectándose generalmente una sobreexpresión en la mayoría de tumores analizados, como los de mama (86), laringe (87), vejiga (88), riñón (89), próstata (90), o pulmón (91). Los resultados no siempre han sido concluyentes, y algunos trabajos sugieren que CLU podría estar disminuida en ciertas neoplasias (92–95). A pesar de las investigaciones llevadas a cabo, aún sigue siendo considerada una “proteína enigmática”, con funciones contradictorias en relación con la apoptosis celular, la tumorigénesis, y la progresión tumoral (Shannan et al. 2006). 1.6.1 El gen de la clusterina El gen que codifica CLU en humanos se localiza en el cromosoma 8 del genoma humano (96), en la posición 8p21-p12 (97) (Figura 7). Figura 7. Localización del gen de la clusterina en el cromosoma 8. Fuente: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?id_type=entrezgene&id=1191 Se compone de 9 exones y 8 intrones. La longitud de los exones varía desde 47 pb (exón 1) hasta 412 pb (exón 5), y en el caso de los intrones, de 207 pb (intrón 8) a 4377 pb (intrón 6). En total comprende una región de 16,580 pb (98). En todas las especies donde se ha estudiado se ha visto que posee una sóla copia en el genoma y está altamente conservado (99). En la actualidad sabemos que codifica diferentes proteínas. Es decir, CLU no se refiere a una sola proteína, sino que comprende una familia de productos ! 27! proteicos, que han podido ser detectados mediante electroforesis debido a su distinto peso molecular (75). Se ha estudiado cómo surgen estas distintas formas de la proteína. Por una parte se habla de un procesamiento intracelular y maduración específicos para cada producto proteico. Pero también se han descrito tres transcritos o variantes de ARN mensajero (ARNm) derivadas del gen: CLU34, CLU35, CLU36 (100,101). Según la base de datos del National Center for Biotechnology Information de EEUU (NCBI), dichas variantes son: Variante 1: NM_001831.3 Variante 2: NR_038335.1 Variante 3: NR_045494.1 Todas tienen los 9 exones y 8 intrones. Comparten 8 exones, pero el primer exón es único para cada variante (1a, 1b, 1c), lo que sugiere un distinto lugar para el inicio de la transcripción (Figura 8). Las tres variantes de ARNm se han detectado en mucosa de colon normal, transformada y neoplásica (100), aunque con distintos niveles de expresión, y también en células prostáticas (69). Figura 8. El gen de la clusterina y las variantes de ARNm (69). ! 28! Algunos investigadores han encontrado una secuencia para la variante 1 más corta en su extremo 5´ que la propuesta por el NCBI (69,101,102), y sugieren que BC010514.1 sería más correcta como variante 1 (69). Adicionalmente, otra variante 1 [Δex2] se genera mediante splicing alternativo, por lo que carece de exón 2 y de la secuencia que codifica la señal del retículo endoplásmico (SSCR o ER Signal Sequence Coding Region) (103). 1.6.2 Estructura de la clusterina La cadena polipeptídica precursora de la principal forma de CLU se compone de 449 aminoácidos y es sintetizada a partir de un ARNm de unos 2 kb. Tras la traslación tiene lugar el procesamiento de la proteína que conduce a su maduración. El péptido señal guía a la proteína hacia el retículo endoplásmico (74), donde tiene lugar la separaración de dicho péptido señal, de 22 nucleótidos, mediante proteolisis. El fragmento restante se divide en dos cadenas: la cadena α (34-36 kDa, aminoácidos 206-427) y la cadena β (36-39 kDa, aminoácidos 1-205) (104). En el aparato de Golgi, tiene lugar el ensamblaje de las cadenas para formar el dímero y su glicosilación. Las dos cadenas se ensamblan en antiparalelo y sus centros, ricos en cisteína, se unen por cinco puentes disulfuro. A ambos lados de este núcleo central encontramos tres α-hélices anfipáticas y dos α-hélices enrolladas. Aproximadamente el 30% de la masa de la proteína madura está conformada por carbohidratos de estructura variable, que se unen a la proteína a través de los seis puntos de Nglicosilación (68,105,106) (Figura 9). ! 29! Figura 9. Estructura de la clusterina. La cadena polipeptídica precursora (en la parte superior) pierde el péptido señal (en color magenta) mediante proteolisis, y luego se divide en dos cadenas (entre los residuos 227 y 228): la cadena α (en color amarillo) y la cadena β (en color azul celeste). Estas se ensamblan en antiparalelo formando una molécula heterodimérica (en la parte inferior de la figura), donde los centros ricos en cisteína (en color rojo) se unen por cinco puentes disulfuro (elipses de color rojo) y son flanqueados por dos hélices enrolladas (en color verde) y tres hélices anfipáticas (en color azul oscuro). Los puntos de color amarillo claro marcan los seis sitios de Nglicosilación (68). 1.6.3 Formas de la clusterina Hemos visto que el mismo gen de CLU es capaz de generar varios transcritos de ARNm. No se conoce con claridad cómo estas variantes se relacionan con cada una de las formas de la proteína, pero sí intuimos que existen al menos dos productos proteicos, con diferentes características, localizaciones y funciones. Esto nos puede ayudar a explicar por qué a menudo se ha visto a CLU implicada en funciones aparentemente contradictorias, dado que en función de la forma predominante la balanza se inclina hacia un extremo u otro, por ejemplo en relación con la supervivencia o la muerte celular. ! 30! La primera de las formas de CLU es la que corresponde con la estructura descrita previamente. La forma precursora o psCLU, de 60 kDa, no glicosilada y localizada en el citoplasma, es madurada dando lugar a la forma secretada o sCLU, un heterodímero glicosilado de 75-80 kDa, que se encuentra presente en practicamente todos los fuidos fisiológicos (100,107,108). Se le asigna una función citoprotectora, dado que inhibe la apoptosis y por tanto promueve la supervivencia celular. También se la describe habitualmente como una chaperona extracelular independiente de ATP, por su capacidad para unirse a proteínas plegadas de forma errónea y estabilizarlas o eliminarlas, similar a la de las pequeñas proteínas de choque térmico o sHSP (Small Heat-Shock Proteins) (revisado en Wyatt et al. 2009) (Figura 8). La segunda forma es la de localización nuclear o nCLU, de 45-55 kDa. Su péptido precursor se sintetiza a partir de un segundo codón de inicio (AUG), que se ha localizado en el exón 3. Le falta el péptido señal, y esto hace que no sufra el proceso de división en dos cadenas ni el de glicosilación, a diferencia de sCLU (103). Cuando la célula se ve expuesta a estrés, nCLU se transloca del citoplasma al núcleo y actúa induciendo la apoptosis (103,108). En el núcleo se une al heterodímero Ku70/80, implicado en la reparación del ADN y la inducción de la apoptosis (Figura 10). Figura 10. Interacciones fisiológicas entre Ku70/80, clusterina y Bax. (A) En la célula normal, Bax está inactivo y se localiza en el citoplasma, interaccionado con Ku70. La proteína sCLU estabiliza esta interacción Ku70-Bax , actuando como citoprotectora. (B) Cuando ocurre un daño en el ADN, Ku70 libera a Bax. En este caso, nCLU coopera con Ku70 activando la translocación a la mitocondria de Bax, e induciendo la apoptosis (110). ! 31! Otras formas de la proteína sólo se han detectado mediante predicciones de programas informáticos, sin que hayan podido ser aisladas (111). 1.6.4 Funciones de la clusterina La función de CLU va a depender tanto del tipo de célula o tejido donde se encuentre, como de los factores que regulan su expresión y su localización dentro de la célula, así como de las circunstancias del entorno que rodea a esa célula (fisiológicas o patológicas). Se ha visto involucrada en enfermedades neurodegenerativas, síndromes metabólicos, glomerulonefritis, patología cardiovascular y cáncer. Esta influencia tan extensa y variada de la proteína se debe a su capacidad para interaccionar con una amplia variedad de moléculas: lípidos (82), proteínas amiloides (112), componentes del complejo de ataque de membrana (99), proteínas mal plegadas (113) o quimioterápicos como el paclitaxel (114), entre otras. Se le asignan, pues, múltiples funciones fisiológicas, entre las que destacan: a) Chaperona extracelular: CLU actúa como una chaperona extracelular independiente de ATP, con una estructura similar a la de las proteínas de choque térmico. Estas proteínas a menudo están sobrexpresadas en distintas neoplasias dado que son fundamentales para la supervivencia de las células cancerosas (115). Como ellas, CLU posee la capacidad de identificar aquellas proteínas que no se han plegado correctamente, unirse a su superficie hidrofóbica y favorecer su eliminación: se internan en las células mediante endocitosis y luego son degradadas en los lisosomas (109). Sabemos, por ejemplo, que una proteína de choque térmico, HSP27, y CLU se asocian para proteger a la célula de factores estresantes proapoptóticos (116). Esto la convierte en una proteína citoprotectora frente al estrés proteotóxico, pero también sabemos que actúa como sensor celular frente al estrés oxidativo, ejerciendo su función antioxidante a través de los grupos sulfhidrilos de los residuos de cisteína (117). ! 32! b) Transporte de lípidos: La mayoría de la CLU sérica, conocida en este contexto como apolipoproteína J, está contenida en complejos clusterinaapoA1 y circula como una lipoproteína de alta densidad (HDL) (82,83). Se ha descubierto que también puede unirse a lipoproteínas de baja (LDL) y muy baja densidad (VLDL) (118). CLU retira el colesterol de las membranas celulares que han sido dañadas y lo incorpora en las partículas HDL, siendo eliminado posteriormente mediante transporte inverso (119). CLU, una vez más, ejerce una función protectora, al favorecer la eliminación del exceso de lípidos y de los subproductos lipídicos tóxicos que se generan en situaciones de daño o remodelación tisular (67). c) Regulación del complemento: CLU fue detectada por primera vez en humanos en los depósitos inmunes del glomérulo de un paciente con glomerulonefritis membanosa, adoptando un patrón similar al de otros componentes del complemento (120). CLU se une a C5b-6, impidiendo la formación del complejo de ataque a membrana, y de esta forma inhibe la citolisis mediada por el complemento (80,81). d) Apoptosis: Respecto a la muerte celular, se ha establecido una funcionalidad dual para CLU. Por un lado, sCLU estabiliza la unión entre Ku70 y Bax, interfiriendo en la oligomerización de Bax e impidiendo la liberación del citocromo c y la activación de las caspasas (121). También es capaz de activar la vía de PI3K/AKT (Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B) y del IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1), así como de proteger a las células de la muerte mediada por TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) (122). Por tanto, una elevación de sCLU favorece la supervivencia celular. En cambio, una disminución en los niveles de sCLU conduce a la apoptosis, mediante la activación de p53 y la alteración de la ratio entre las proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia Bcl-2 (123). Por otra parte, nCLU estimula la apoptosis, a través del dominio BH3, situado en la región terminal-C, que secuestra a Bcl-xL, lo que libera a Bax y esto lleva a la liberación del citocromo c y a la activación de caspasa-3 (124,125). ! 33! Experimentos sobre la muerte celular tras la exposición a radiación ionizante, nos han revelado la capacidad de nCLU para interaccionar con Ku70, ya separado de Bax. Ku70 a su vez, forma heterodímeros con Ku80, fundamentales en la reparación de las roturas de doble cadena. Los complejos nCLU-Ku70/Ku80, localizados en el núcleo, afectan a la reparación del ADN, conduciendo a la inestabilidad genómica y la muerte celular (126). La actividad proapotótica de nCLU es dependiente de iones de calcio (Figura 11), y también se asocia con la inducción de TGF-β (Transforming Growth Factor-β) a través de la fosforilación de Smad2/3 (127). Figura 11. Regulación de la apoptosis por clusterina dependiente de los iones de calcio. El estrés oxidativo produce modificaciones en las proteínas de los canales de calcio, liberando iones de calcio de la mitocondria y el retículo endoplásmico, y también permitiendo su entrada desde el exterior de la célula. Se piensa que la regulación de la apoptosis depende de la concentración de iones de calcio: a elevadas concentraciones, sCLU se une a Ku70-Bax y promueve la supervivencia celular impidiendo la apoptosis; a bajas concentraciones, nCLU se une a Ku70, desestabilizando la interacción Ku70-Bax, y conduciendo a la apoptosis (128). ! 40! Figura 13. Escape de la apoptosis en la célula cancerosa. El predominio de la forma secretada de CLU frente a la forma nuclear, la pérdida de ku80 y la relocalización citoplasmática de Ku70 dan lugar a la interacción patológica de Ku70Bax-sCLU, que inhibe la muerte celular y favorece la progresión tumoral (110). Se han ideado oligonucleótidos antisentido que bloquean la síntesis de la proteína, para mejorar la eficacia de los citotóxicos. En efecto, los estudios preclínicos han mostrado cómo estos nuevos fármacos producen un aumento de la apoptosis inducida por la quimioterapia convencional (163,164). En la Universidad de Columbia Británica han desarrollado para su uso en humanos el custirsen (OGX-011), un inhibidor que actúa sobre el exón 2 del gen de CLU, con resultados prometedores en los ensayos clínicos fase I-II en cáncer de pulmón (165), y próstata (166,167), que han motivado la puesta en marcha de ensayos fase III (168). En el estudio SINERGY, según los datos comunicados en el último congreso anual de la Sociedad Americana de Oncología (ASCO), se ha obtenido un aumento de tres meses en la supervivencia global en el subgrupo de pacientes con peor pronóstico, afectos de cáncer de próstata metastásico resistente a castración, al asociar custirsen con docetaxel más prednisona (169). En cuanto a su aplicabilidad como marcador, en el reciente trabajo de Bertuzzi y colaboradores, encuentran niveles alterados de CLU en plasma incluso años antes de la detección del CCR, lo que puede ser de utilidad a la hora de seleccionar población de riesgo para los programas de prevención (170). Otros ! 41! destacan su alta sensibilidad y valor predictivo positivo para casos especialmente agresivos de CCR cuando se determina su presencia en heces (171). Incluso ya ha sido testada para monitorizar la respuesta a tratamientos anti-clusterina, observándose mejor supervivencia en los pacientes en los que se reducen los niveles séricos de CLU como respuesta al tratamiento combinado con quimioterapia y custirsen (172). ! 42! ! 43! 2 Objetivos 1. Estudiar la relación de la clusterina con la carcinogénesis y la progresión del cáncer colorrectal. Para ello se estudiará la expresión de esta proteína en tejido colónico normal, lesiones premalignas del colon (adenomas), y carcinomas colorrectales. 2. Analizar la relación entre la expresión de clusterina y los factores pronósticos clásicos, y la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal. 3. Estudiar la posible implicación de la actividad apoptótica en la carcinogénesis colorrectal y en la progresión tumoral del cáncer colorrectal. 4. Evaluar el significado pronóstico de la apoptosis, relacionándola con los factores pronósticos clásicos y la supervivencia en el cáncer colorrectal. ! 44! ! 45! 3 Material y Métodos 3.1 Pacientes y muestras de tejido Un total de 103 casos de CCR fueron incluidos en nuestro estudio. Todos habían sido sometidos sucesivamente a resección quirúrgica de su tumor primario en el Hospital Costa del Sol entre enero de 2006 y diciembre de 2007. Se excluyeron aquellos pacientes que habían sido tratados con quimioterapia y/o radioterapia previamente a la cirugía. Adicionalmente se estudiaron 31 muestras de adenomas colorrectales, así como 20 muestras correspondientes a tejido colónico normal. Las secciones de mucosa normal se obtuvieron de las piezas quirúrgicas, siempre de localizaciones alejadas del tumor, consideradas como normales por los patólogos. Por otra parte, las áreas de los tumores para el ensayo TUNEL fueron seleccionadas igualmente por patólogos expertos, siendo excluidas las áreas necróticas. Todas las muestras fueron procesadas de la manera convencional: fijadas en formol diluido al 10% e incluidas en bloques de parafina. Todos los carcinomas ! 46! estudiados se clasificaron según los estándares de la OMS y de la UICC/AJCC para el grado de diferenciación y el estadio TNM. Los datos clínicos se obtuvieron del registro de tumores y los informes médicos correspondientes. Se examinaron las neoplasias de 57 hombres y 46 mujeres, con una mediana de edad en el momento de la cirugía de 70 años (rango 45 - 91 años). Las principales características de los pacientes incluidos se describen en la tabla 7. Tabla 7. Características de los pacientes con cáncer colorrectal (n = 103). Variable Pacientes (n) % Género Masculino 57 55 Femenino 46 45 Edad (años) Mediana 70 Rango 45 - 91 Grado histológico I 16 16 II 56 54 III 31 30 Localización Ciego y colon ascendente 22 21 Colon transverso 11 11 Sigma y colon descendente 39 38 Recto 31 30 Estadio I 16 15 II 49 48 III 24 23 IV 14 14 Progresión tumoral No 57 55 Sí 46 45 El tiempo de seguimiento se calculó desde la fecha del diagnóstico anatomopatológico inicial hasta la fecha del último contacto con el paciente, siendo la mediana de 54 meses (rango 12 - 96 meses). El estudio recibió la ! 47! aprobación del Comité Ético de Investigación y se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. 3.2 Detección de apoptosis celular in situ (Ensayo TUNEL) Para estudiar la apoptosis utilizamos la técnica TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling), descrita por primera vez por Gavrieli y colaboradores (173). Este método se basa en el marcaje in situ de los extremos 3´ libres de los fragmentos de ADN generados por las endonucleasas relacionadas con la apoptosis. Para ello usamos el kit comercial para la detección de apoptosis (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Brevemente, las secciones desparafinadas e hidratadas se incubaron durante 15 minutos con 20 µg/ml de proteinasa K (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos). Tras varios lavados con PBS (Phosphate Buffered Saline), las preparaciones se cubrieron con la enzima TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase) más una mezcla de nucleótidos marcados con fluoresceína (Reactivo Tunel; In Situ Cell Detection Kit: Boehringer Mannheim. Alemania), a una dilución de 1:35, durante 60 minutos y a una temperatura de 37ºC. Tras nuevos lavados con PBS, se les aplicó un anticuerpo anti-fluoresceína, conjugado con fosfatasa alcalina. Una vez lavadas con PBS, las preparaciones se montaron de modo convencional para poder visualizar las células teñidas bajo la luz del microscopio. El pretratamiento de las secciones con DNasa nos sirvió como control positivo, mientras que la omisión de la enzima del procedimiento se empleó como control negativo. Dos patólogos evaluaron las muestras de forma independiente, sin que tuvieran acceso a los datos clínico-patológicos ni a la evolución de los pacientes del estudio. Los hallazgos morfológicos establecidos para identificar la apoptosis en las secciones de hematoxilina y eosina se emplearon en las preparaciones teñidas mediante TUNEL. Las células se consideraron ! 48! apoptóticas si el área nuclear presentaba tinción en su totalidad. Los cuerpos apoptóticos se definieron como pequeños cuerpos globulares marcados positivamente en el citoplasma de las células tumorales, pudiendo encontrarse de forma individual o en grupos. En total, para cada muestra se contabilizaron hasta 1000 células y de ellas, el número de celúlas teñidas, en campos sucesivos a gran aumento (400x), para así calcular el índice apoptótico (IA), expresado en forma de porcentaje. Usamos la media del porcentaje apoptótico en nuestras muestras (1%) (rango: 0 - 6%) como el valor de corte para los estudios de supervivencia. 3.3 Estudio inmunohistoquímico de clusterina Se obtuvieron secciones de 4 µm de los bloques de tejido incluido en parafina y se montaron en portaobjetos sialinizados. Posteriormente se rehidrataron mediante pases por xilol y alcohol. La peroxidasa endógena se bloqueó mediante la inmersión de los cortes, durante 15 minutos, en una solución al 3% de peróxido de hidrógeno en nitrato sódico al 0,1 N. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-cadena α de CLU, 05-354 (clona 41D) (Upstate-Millipore, Watford, Inglaterra). Se aplicó a una dilución de 1:400 y se incubó durante la noche a una temperatura de 4ºC. Luego se siguió el procedimiento estándar para la tinción, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dako, Glostrup, Dinamarca). Una vez realizada la incubación con el anticuerpo primario y tras varios lavados con tampón fosfato (PBS), se realizó una nueva incubación con el anticuerpo secundario (puente) biotinilado conjugado con peroxidasaestreptavidina, durante 10 minutos. Tras nuevos lavados con PBS, se utilizó una solución de diamenobenzidina como “revelador” de la tinción. Una vez contrateñidas con hematoxilina acuosa y deshidratadas mediante pases por xilol y alcohol, las preparaciones se montaron de manera convencional. La valoración de la expresión de clusterina, se realizó mediante la utilización de los siguientes criterios: ! 49! • Se consideraron negativas aquellas preparaciones histológicas en las que no se observaba tinción o esta era positiva en menos del 10% de las células neoplásicas. • En cambio, se consideraron positivas aquellas preparaciones en las que más del 10% de las células neoplásicas aparecían teñidas. Este anticuerpo ha sido empleado antes en otros trabajos con CCR (100,108). La especificidad del anticuerpo se comparó usando también en 40 muestras el anticuerpo policlonal H-330 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, Estados Unidos), que reconoce todas las formas de CLU, obteniéndose los mismos resultados. Además, existe una buena correlación con los resultados obtenidos mediante Western blot, tal como ha sido demostrado por Andersen y colaboradores (100). Como control positivo se usó una muestra de cáncer de mama con sobreexpresión conocida para CLU. Los controles negativos se obtuvieron omitiendo la aplicación del anticuerpo primario y continuando la realización de la técnica del modo anteriormente descrito. 3.4 Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos obtenidos se realizó con la aplicación del programa estadístico SPSS (SPSS. Inc., Chicago, IL, Estados Unidos). Se realizó análisis descriptivo utilizando media y desviación estándar (DE) para variables cuantitativas, y distribución de frecuencias para las cualitativas. Para estudiar la asociación entre CLU y la apoptosis y el resto de variables relacionadas con factores pronósticos del CCR, se empleó el test de Chicuadrado para las variables categóricas, o en los casos en que éste no procedía (resultados esperados inferiores a 5 en más de un 20% de los casos) mediante el test de Fisher. La comparación de medias respecto a una variable cualitativa dicotómica, se llevó a cabo mediante el test de la T de Student, una ! 56! Figura 16. Apoptosis detectada mediante TUNEL. En la mucosa normal las células teñidas fueron escasas (A), aumentaron en los pólipos adenomatosos (B) y especialmente en los adenocarcinomas de colon (C). Magnificación, 200x (A), 400x (B, C). Estos hallazgos nos indican que, efectivamente, la apoptosis juega un papel en la transformación neoplásica en el CCR. Con respecto al estadio tumoral, encontramos que los IAs fueron mucho más elevados en los casos metastásicos (estadio IV) que en los localizados (estadios I, II y III), con p = 0.017. En este caso, las tasas apoptóticas tampoco se correlacionaron con el género, la edad de los pacientes o el grado de diferenciación tumoral. ! 57! 4.4 Valor pronóstico del índice apoptótico 4.4.1 Apoptosis y supervivencia libre de progresión Al analizar la asociación entre el IA y la SLP pudimos demostrar que los pacientes con tumores con mayor IA (>1%) tenían una SLP significativamente inferior que los de IA menor (p = 0.020). En la figura 17 podemos ver las curvas de Kaplan-Meier para la SLP, comparando IA alto frente a IA bajo. La SLP a 5 años varió dependiendo del valor del IA. Así, para un IA bajo, la SLP a 5 años fue de 61.8 ± 8.1%, mientras que para un IA alto (> 1%) fue de 28.5 ± 9.6%, con p = 0.020. Figura 17. Supervivencia libre de progresión según el índice apoptótico (IA). La supervivencia de los pacientes con tumores que presentan IAs altos (línea roja) es significativamente inferior a la de los pacientes con tumores con IAs bajos (línea azul). ! 58! En el análisis multivariante, el IA también fue un factor pronóstico independiente para la SLP. Un IA alto se asoció significativamente con un aumento en la tasa de recidiva, con un HR de 2.03 (IC 95%: 1.04 - 4.14). De nuevo, el estadio tumoral avanzado se asoció con una peor SLP (HR 2.48; IC 95%: 1.10 - 5.59). En el análisis por estadios, observamos que un IA alto se relacionó con una SLP más corta en los casos con enfermedad más avanzada (estadios III y IV) (p = 0.004) (Figura 18). En cambio, esta asociación no estuvo presente en los estadios más tempranos. Figura 18. La supervivencia libre de progresión de los pacientes con tumores en estadio avanzado (estadios III y IV) según índice apoptótico (IA). Los pacientes con IAs altos (línea roja) presentan supervivencias más cortas que aquellos con IAs bajos (línea azul). ! 59! 4.4.2 Apoptosis y supervivencia global Un IA bajo se asoció con una SG más prolongada (SG a 5 años: 74.6 ± 8.8%), mientras un IA alto se correlacionó con un pronóstico desfavorable (SG a 5 años: 43.7 ± 11.9%, con p = 0.027). En el análisis multivariante, encontramos que tanto el IA como el estadio tumoral fueron factores pronósticos independientes para la SG, con HR de 2.18 (IC 95%: 1.08 - 4.37) y 2.41 (IC 95%: 1.20 - 4.85), respectivamente. ! 60! ! 61! 5 Discusión 5.1 Clusterina Varios estudios clínicos y experimentales han demostrado el importante papel de CLU a la hora de inhibir la muerte celular apoptótica (122,174) y otros han comunicado la sobreexpresión de CLU en neoplasias, observada mediante inmunohistoquímica. La mayoría de ellos ha señalado la sobreexpresión citoplasmática de CLU en las células tumorales como un hallazgo relevante (86,95,145,159). En CCR, algunos trabajos han encontrado una disminución en la expresión de CLU (175), aunque para llegar a esta conclusión, Chen y colaboradores se limitaron a comparar las muestras tumorales y sanas pareadas de 10 pacientes con cáncer de colon en estadio III. Predominan, al igual que en las neoplasias en general, los autores que señalan que esta proteína se encuentra elevada en adenomas y carcinomas (108,151,159). Un primer estudio, obtuvo niveles de ARN de CLU progresivamente mayores desde los microadenomas a los carcinomas invasores desarrollados en el intestino delgado de ratones Min (159). También analizaron 6 muestras de tejido colónico humano procedentes ! 62! de biopsias endoscópicas, incluyendo tejido normal, adenoma y carcinoma (en una muestra). Los adenomas tubulares y vellosos mostraron niveles altos de CLU, mientras que en los pólipos hiperplásicos la expresión de CLU fue débil. Posteriormente, el equipo de Pucci, estudió 30 casos, incluyendo material de biopsias y de resecciones quirúrgicas (108). Encontraron tinción nuclear para CLU tanto en el tejido normal como en adenomas, pero esta fue inexistente en los carcinomas. La tinción citoplasmática aumentó su intensidad progresivamente desde el tejido sano al tumoral, especialmente en los tumores metastásicos. El número de pacientes contemplado fue superior en el trabajo de Xie y colaboradores, con 85 CCRs resecados en el Hospital de la Universidad china Sun Yat-Sende, de estadios II, III y IV (151). En esta ocasión, disponemos de los porcentajes de las muestras con sobreexpresión de CLU, similares a lo hallado por nosotros: 17% en adenomas, 46% en tumores primarios y 57% en tumores metastásicos, tomando como referencia la expresión de CLU en la mucosa normal (con índices de tinción de 0 a 6). Tampoco detectaron una correlación con la edad, el género o la localización del tumor primario, sólo con el estadio tumoral avanzado. Además, el significado pronóstico de la sobreexpresión de CLU ha sido escasamente investigado hasta el momento. De hecho, sólo un trabajo había presentado resultados que asociaran CLU con pronóstico en CCR (160) con anterioridad a la publicación de nuestro estudio (176), aunque en el trabajo de Kevans y colaboradores sólo se abordaron los estadios II. Ellos analizaron las diferencias en SG en este estadio según la expresión de CLU (en cuanto a porcentaje e intensidad de la tinción, a nivel epitelial y estromal), si bien no comunicaron datos de SLP. Esto nos motivó a confirmar el papel de CLU en la carcinogénesis colorrectal, examinando no sólo tejido normal y adenomas, sino también una amplia serie de carcinomas, y también analizar la influencia de la expresión de CLU en la supervivencia de estos pacientes. En nuestra serie, CLU no estuvo presente en los tejidos normales, pero en adenomas se encontró en un 16% y en células tumorales del colon hasta en un 30% de los casos, de forma similar a lo ! 63! detectado en otras series (100,151), pero en el trabajo de Andersen la tinción citoplasmática para CLU fue superior en adenomas (60%) que en carcinomas (20% en tumores primarios y 18% en metástasis hepáticas) (100). Como hemos mencionado, otros dos trabajos previos también observaron el aumento progresivo de la expresión de CLU en la secuencia adenoma-carcinoma (108,151). Nuestros hallazgos sugieren que la hiperregulación de CLU está implicada en la tumorigénesis colónica desde el tejido normal a lesiones premalignas y malignas, tal como nuestro grupo investigador ha descrito para otras localizaciones (86,87). No detectamos la presencia de CLU en el epitelio normal del colon. De hecho, los estudios previos han encontrado una expresión de CLU en el epitelio normal escasa o inexistente (100,151,159). Sin embargo, Pucci y colaboradores (108) observaron la expresión de CLU nuclear en las células epiteliales normales. Tanto en nuestro trabajo como en el de Andersen y colaboradores (100), se empleó para el análisis el mismo anticuerpo que fue aplicado en el trabajo de Pucci y colaboradores (108). Los motivos para tal discrepancia no se conocen, aunque se sabe que la detección de nCLU puede no ser fácil, dado que que las células en las que predomina nCLU están condenadas a morir rápidamente, y por tanto a desaparecer (177). El hallazgo de CLU en los pólipos adenomatosos indica que la hiperregulación de CLU ocurre muy precozmente en las neoplasias humanas del colon. Por otro lado, la expresión de CLU en el citoplasma de las células tumorales y en las cavidades intercelulares señala que CLU es secretada por las células tumorales. La localización citoplasmática apical ha sido observada en otros estudios en CCR (100,151,159). Pocos trabajos han comunicado una relación entre la expresión de CLU y la supervivencia en tumores humanos. Cabía esperar que los tumores que expresaran CLU tendrían una tendencia a presentar un peor curso clínico que aquellos que no la expresan. Y de hecho, la mayoría de los estudios que han analizado la supervivencia de neoplasias CLU+ y CLUhan correlacionado la ! 64! positividad para CLU con un peor pronóstico (152–157). No obstante, también se ha comunicado un curso favorable (95,158). Se piensa que es posible que CLU ejerza diferentes papeles en función de los distintos tejidos o de las formas particulares de CLU que sean detectadas. En el presente estudio, encontramos que la expresión de CLU se asocia de forma significativa con la disminución de la SLP entre los pacientes con CCR, constituyendo un factor pronóstico independiente para la SLP. Estos resultados son similares a los obtenidos por el grupo de Kevans en estadios II de CCR (160), confirmándose que la expresión de CLU en el CCR se asocia con supervivencias inferiores. La determinación de CLU podría ayudar a identificar aquellos pacientes con mayor riesgo de recidiva tumoral, y por tanto subsidiarios de beneficiarse de tratamientos más intensivos. Además, el subgrupo de CCRs positivos para CLU puede constituir una población seleccionada candidata a terapias dirigidas contra CLU. De esta forma, el gen de CLU se convierte en una potencial diana terapéutica en el abordaje del CCR, tal como lo demuestran los estudios con oligonucleótidos antisentido que inhiben la expresión de CLU y producen un aumento en la tasa de apoptosis inducida por los tratamientos quimioterápicos convencionales (163–167,169). 5.2 Apoptosis Como hemos descrito, la homeostasis en el tejido normal se mantiene gracias al balance entre proliferación y apoptosis, procesos biológicos que tienen predilección por determinadas localizaciones dentro de la cripta intestinal. Una explicación para estos patrones de distribución reside en el papel de la muerte celular programada para el control del daño genético. La eliminación de células con mutaciones en su ADN, a través de la apoptosis, evita la replicación y expansión de estas células. Esta función protectora explica por qué encontramos más apoptosis en los tumores que en los tejidos sanos, ya que estos IAs elevados representan los intentos fisiológicos por eliminar ! 65! alteraciones genéticas que son frecuentes en las células neoplásicas. Es cierto que las células tumorales son capaces de desarrollar mecanismos para escapar de la apoptosis y convertirse en inmortales. Pero si sólo aquellas células neoplásicas con mutaciones que inhiben la apoptosis sobreviven y continúan proliferando, entonces la apoptosis sirve para seleccionar los especímenes más agresivos para formar parte del tumor. Además del daño genético, otros factores, como la falta de nutrientes, de factores de crecimiento o un déficit en el aporte de oxígeno, también pueden estimular la muerte celular programada. Sabemos que la hipoxia es un hallazgo común en la mayoría de tumores sólidos, porque las neoplasias de rápida proliferación a menudo sobrepasan la capacidad de los vasos existentes para proporcionarles oxígeno. Las células malignas tienen pues, que adaptarse a su microambiente, lo que les confiere un fenotipo más resistente, aumentando el riesgo de progresión tumoral (56,178). Como vemos, la relación entre muerte celular y carcinogénesis es estrecha. Otros autores han sugerido otra conexión entre ambos procesos. Han observado que las células apoptóticas pueden ejercer un efecto en el microambiente tumoral y en la respuesta inmune del estroma asociado, lo que da lugar a la activación de la progresión tumoral (179). La caspasa-3, un marcador de apoptosis, ha sido propuesta como la señal clave mediante la cual las células tumorales apoptóticas estimulan el crecimiento y la supervivencia del resto de células tras la acción de la radioterapia (180). Por todo ello decimos que proliferación y apoptosis son procesos íntimamente asociados. Sin embargo, mientras sabemos que la proliferación celular aumenta gradualmente con la progresión neoplásica, los estudios que hasta la fecha han intentado clarificar si el mismo fenómeno tiene lugar con la apoptosis han dado lugar a resultados discordantes. Para algunos, la fuente de estas discrepancias podría estar en la falta de uniformidad a la hora de seleccionar y preparar los tejidos, lo que influiría en las variables pre-análisis, especialmente en cuanto al tiempo de isquemia fría y el proceso de fijación en formol (181). ! 72! colorectal cancer: A pooled analysis of patients from nine first-line phase III chemotherapy trials. J Clin Oncol. 2011;29(20):2781–6. 9. O’Connell JB, Maggard M a, Liu JH, Etzioni D a, Livingston EH, Ko CY. Rates of colon and rectal cancers are increasing in young adults. Am Surg. 2003;69(10):866–72. 10. O’Connell JB, Maggard M a, Liu JH, Etzioni D a, Ko CY. 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