Perfil conductual de las drogas de diseño MBDB, MDEA y PMA en modelos animales de agresión y ansiedad

AUTOR: Ana Teresa Muela Mora http://orcid.org/0000-0002-4002-1186 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es PERFIL CONDUCTUAL DE LAS DROGAS DE DISEÑO MBDB, MDEA Y PMA EN MODELOS ANIMALES DE AGRESIÓN Y ANSIEDAD Ana Teresa Muela Mora Departamento de Psicobiología y Metodología de las Ciencias del Comportamiento Universidad de Málaga Directores: José Francisco Navarro Humanes y Mª Mercedes Martín López Málaga, noviembre de 2015 Mediante la presente se certifica que: La tesis doctoral: “Perfil conductual de las drogas de diseño MBDB, MDEA y PMA en modelos animales de agresión y ansiedad”, presentada por Ana Teresa Muela Mora ha sido supervisada por los profesores José Francisco Navarro Humanes y Mª Mercedes Martín López, del Departamento de Psicobiología y Metodología de las Ciencias del Comportamiento de la Universidad de Málaga, y cumple los requisitos para el grado de Doctor en Psicología. Málaga, noviembre de 2015 José Francisco Navarro Humanes Mª Mercedes Martín López A Antonio y A mis padres, Luis y Ana Agradecimientos Quiero agradecer la realización de esta Tesis Doctoral en primer lugar a mis directores, Dra. Mercedes Martín López y Dr. J. Francisco Navarro Humanes, por la confianza y el ánimo en cada fase de este proyecto. Su rigurosa guía y excepcional disposición han constituido una ayuda inestimable. Por supuesto, también he de agradecer a María Cavas y Juan Manuel Antúnez su valiosa colaboración en los experimentos, gracias a ellos los fines de semana en el laboratorio de Psicobiología de la Universidad de Málaga fueron más amenos. A Vanesa, por iniciarme en la evaluación conductual y compartir buenos momentos allá donde fueramos de congreso. Asi como a mis compañeros Natalia, Camino, Marta, Berto y Patricia, por la acogida que me dieron y lo mucho que me enseñaron durante mi estancia en la Universidad de Oviedo. Asimismo me gustaría agradecer a mis amigas y compañeras de carrera, Geno y Loli, por sus palabras de aliento y predisposición para ayudar en lo que fuera preciso. Finalmente, me gustaría dar las gracias a mis padres que han sido un apoyo incondicional en todo momento, a mis hermanos Mario y Diana por su confianza y el suministro inagotable de gominolas cuando más falta hacía. De igual forma, quiero agradecer a Antonio el haber compartido conmigo cada etapa de este trabajo, por saber comprenderme y apoyarme en todo momento, y ser mi fuente de inspiración para mejorar cada día. vi INDICE DE FIGURAS Figura 2.1 Estructura molecular de las feniletilaminas MBDB y MDMA ...................... 11 Figura 2.2 Metabolitos del MBDB en fase I ................................................................... 13 Figura 2.3 Estructura molecular de las feniletilaminas MDEA y MDMA ...................... 26 Figura 2.4 Metabolitos del MDEA en fase I .................................................................... 30 Figura 2.5 Estructura modelcular de las feniletilaminas PMA y MDMA ....................... 38 Figura 2.6 Metabolito del PMA ....................................................................................... 41 Figura 3.1 Circuito neuronal de la ansiedad .................................................................... 92 Figura 5.1 Cálculo de matrices de probabilidad de ocurrencia y de transición ............. 151 Figura 5.2 Categorías conductuales evaluadas en ratones durante el análisis etológico del modelo de agresión inducida por aislamiento .............................................. 153 Figura 5.3 Procedimiento del modelo de agresión inducida por aislamiento ............... 155 Figura 5.4 Categorías conductuales evaluadas en ratones durante el análisis etológico del modelo del laberinto elevado en cruz .......................................................... 162 Figura 5.5 Procedimiento del modelo del laberinto elevado en cruz ............................ 163 Figura 6.1 Perfil conductual agonístico tras la administración de MBDB .................... 183 Figuras 6.2-6.6 Mapa conductual diádico de los grupos tratados con MBDB y MDMA .............................................................................................................. 185 Figura 6.7 Evolución temporal del ataque tras el tratamiento con MBDB o MDMA .. 187 Figura 7.1 Medidas espaciales y etológicas en el laberinto elevado en cruz, tras la administración de MBDB y MDMA ................................................................. 209 Figura 8.1 Perfil conductual agonístico tras la administración de MDEA .................... 235 Figuras 8.2-8.5 Mapa conductual diádico de los grupos tratados con MDEA .............. 237 Figura 8.6 Evolución temporal del ataque tras el tratamiento con MDEA ................... 241 Figura 9.1 Medidas espaciales y etológicas en el laberinto elevado en cruz, tras la administración de MDEA .................................................................................. 255 Figura 10.1 Perfil conductual agonístico tras la administración de PMA ..................... 279 Figuras 10.2-10.6 Mapa conductual diádico de los grupos tratados con PMA ............. 281 Figuras 10.7 Evolución temporal del ataque tras el tratamiento con PMA ................... 285 Figura 11.1 Medidas espaciales y etológicas en el laberinto elevado en cruz, tras la administración de PMA ..................................................................................... 299 1. INTRODUCCIÓN Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido analizar el perfil conductual de las drogas de diseño emergentes metilbenzodioxolbutanamina (MBDB), metilenodioxietilanfetamina (MDEA) y parametoxianfetamina (PMA), en modelos animales de agresión y ansiedad. Estas sustancias son feniletilaminas sintéticas muy similares a la metilenodioximetanfetamina (MDMA), que es el principal compuesto presente en las pastillas distribuidas bajo la denominación de “éxtasis”. En la actualidad, el Observatorio europeo de drogas y toxicomanía (EMCDDA) emplea la nomenclatura oficial de drogas emergentes “Emerging drugs” o “New psychoactive substances” (NPS), para referirse a “los nuevos estupefacientes o drogas psicotrópicas, en su forma pura o preparada, que no están bajo control legal de la Convención Única de las Naciones Unidas de 1961 sobre estupefacientes, o en la Convención de 1971 sobre sustancias psicotrópicas, pero que pueden suponer una amenaza para la salud pública comparable a la planteada por las sustancias enumeradas en estas convenciones” (Decisión del Consejo 2005/387/JHA) (Eurosurveillance editorial team, 2012; Papaseit, Farré, Schifano, & Torrens, 2014). Existen otros términos relacionados que tienen diferentes connotaciones. Entre ellos, el concepto de “Drogas de Diseño”, introducido por el farmacéutico californiano Gary Henderson en 1960, hace referencia a un conjunto de nuevas drogas con fines recreativos y sintetizadas clandestinamente en laboratorio para escapar de las restricciones legales (Liechti, 2015). De forma similar, bajo la denominación de “Drogas de Síntesis” se alude al origen sintético y artificial de éstas. Otro término común es el de “Drogas Recreativas” que destaca el contexto habitual de consumo (Reid, Derry & Thomas, 2014), o el de “Legal Highs” que enfatiza el vacío legal en la venta on-line, desde hierbas a drogas de síntesis no expresamente prohibidas (Hillebrand, Olszewski, & Sedefov, 2010). Por otra parte, en el contexto de la investigación, resulta bastante frecuente el uso del término “Research chemicals” (RCs), en referencia al estudio científico de distintos aspectos de las drogas de abuso, tales como el grado de toxicidad, metabolismo, mecanismos de acción y efectos de su consumo. Además, existen evidencias de que bastantes RCs son estructuralmente similares a diversos neurotransmisores cerebrales, lo cual parece estar relacionado con su potencial psicoactivo y hace que sea especialmente relevante su uso como herramienta para avanzar en el conocimiento del sistema nervioso mediante 4 Introducción modelos animales (Liechti, 2015). No obstante, como ya indicábamos al inicio, se ha empleado de forma más reciente la nomenclatura de “drogas emergentes” en algunos documentos oficiales, en parte debido a que la amplitud de este concepto es suficientemente general como para abarcar la totalidad de las sustancias psicoactivas disponibles sin entrar en detalles de contexto, consumo, ilegalidad o tipo de síntesis. Además, este calificativo resulta especialmente interesante debido a que el concepto de emergente o nuevo no se refiere necesariamente al diseño de nuevas drogas, sino también a la moda como factor clave en la disponibilidad y consumo de drogas psicoactivas ya existentes, que aparecen, emergen y se redescubren de forma recurrente a lo largo de los años (Ministerio de Sanidad y Politica Social España, 2011; Papaseit et al., 2014). Este aspecto resulta clave en relación al “éxtasis” ya que, con ciertas fluctuaciones, ha sido una de las drogas de mayor disponibilidad y consumo durante los últimos treinta años. Sin embargo, lejos de identificarse con una composición estándar, las pastillas que se distribuyen bajo esta nomenclatura presentan una gran adulteración respaldada por pruebas forenses. Según el último informe realizado por el EMCDDA, se denomina habitualmente “éxtasis” a la sustancia sintética MDMA; aunque en los últimos años la pureza de esta sustancia parece haber mejorado un poco, los datos disponibles a finales de la última década informaban de una muy baja calidad y una gran adulteración (EMCDDA, 2015a; Tanner-Smith, 2006), por lo que, en definitiva, resulta bastante habitual que las pastillas distribuidas como “éxtasis” contengan nuevas sustancias psicoactivas análogas al MDMA, así como otros compuestos químicos no relacionados. Entre las sustancias psicoactivas afines se encuentran diversos compuestos estructuralmente similares como MBDB, MDEA, Metilenodianfetamina (MDA), y de una forma más ocasional PMA, o Parametoximetanfetamina (PMMA), así como otros adulterantes habituales pertenecientes a otros grupos farmacológicos tales como las piperacinas o catinonas sintéticas (Carter, Rutty, Milroy, & Forrest, 2000; Caudevilla González, & Fenoll, 2009; EMCDDA, 2012; Freudenmann & Spitzer, 2004; Ochoa Mangado, 2002; Schifano, 2004; Schifano, Corkery, Deluca, Oyefeso, & Ghodse, 2006; Vaiva et al., 2001; Velea et al., 1999; Vogels et al., 2009; Vollenweider et al., 2002). La inclusión de MBDB, MDEA o PMA en la composición de pastillas de “éxtasis” adulteradas puede deberse a su similitud estructural con el MDMA y también a que parecen compartir con esta molécula efectos psicotrópicos predominantemente de tipo entactógeno, como así indican algunos estudios de discriminación de drogas en animales Introducción 5 de experimentación (Boja & Schechter, 1987; Glennon & Misenheimer, 1989; Glennon, Young, Dukat, & Cheng, 1997; Glennon & Young, 2002; Nichols & Oberlender, 1989; Oberlender & Nichols, 1988; 1990; Sáez-Briones & Hernández, 2013; Vollenweider et al., 2002; Schechter, 1988). En este aspecto, el paradigma de discriminación de drogas resulta una herramienta adecuada para realizar una primera aproximación en el análisis de los efectos psicotrópicos de sustancias desconocidas. Estos efectos pueden ser esencialmente de cuatro tipos: estimulantes, alucinógenos, depresores y entactógenos/empatógenos. El citar en último lugar los efectos de tipo empatógeno/entactógeno obedece históricamente a que fueron los últimos en entrar en esta clasificación hace unos 25 años, precisamente cuando se empezó a constatar que los efectos conductuales del MDMA no llegaban a corresponderse abiertamente con ninguna de las categorías anteriormente citadas (Nichols & Oberlender, 1989; Oberlender & Nichols, 1988; 1990; Sáez-Briones & Hernández, 2013; Vollenweider, Liechti, Gamma, Greer, & Geyer, 2002). Respecto a esto, hay que tener en cuenta dos consideraciones relevantes. En esta nueva clase farmacológica denominada “Entactógenos” se incluyen diversas feniletilaminas sintéticas (MDMA, MBDB, MDEA, MDA, PMA, PMMA), pero también se han ido incorporando en esta categoría sustancias de diferentes grupos farmacológicos: catinonas sintéticas empatógeno-estimulantes (Metilona “β-keto MDMA”, o más recientemente la Mefedrona), aminoindanos (MDAI, MDMAI, 5-IAI, 2AI, NM-2AI), benzodifuranos de efecto empatógeno (6-APDB, 6-APB) y algunas piperacinas (Metroclopramida “mCPP”, Trifluorometilfenil-piperacina “TFMPP”). En segundo lugar, es necesario aclarar que las feniletilaminas sintéticas comúnmente denominadas anfetaminas de anillo sustituido (Ring-substituted amphetamines, “RSAs”) producen efectos psicotrópicos de lo más variado, pues aparte de las citadas sustancias empatógenas (MDMA, MBDB, MDEA, MDA, PMA, PMMA), existen compuestos que son claramente estimulantes (anfetamina, metanfetamina “Meth, Cristal”, sustancias 2C- [series] en dosis bajas); mientras que otras RSAs son de tipo alucinógeno, como el DOB o el DOM. Por tanto, aunque las primeras sustancias empatógenas fueran estructuralmente feniletilaminas sintéticas, este efecto psicotrópico no parece que se encuentre ligado de forma intrínseca a la estructura molecular de todas las RSAs, a la vez que puede observarse en compuestos relacionados con otros grupos farmacológicos (EMCDDA, 2015a; Liechti, 2015; Reid et al., 2014; Schifano, Orsolini, Duccio Papanti, & Corkery, 2015; UNODC, 2014). 6 Introducción El MDMA es una droga bien conocida, sobre todo en ambientes recreativos, por su capacidad para proporcionar una sensación de bienestar y apertura emocional que mejora y refuerza la comunicación empática, mitigando las dificultades para relacionarse y comunicarse de forma cercana, cálida o agradable (Hegadoren, Baker, & Bourin, 1999; Sáez-Briones & Hernández, 2013). Debido a estas características los jóvenes se sitúan en primera línea de riesgo, siendo la falta de reconocimiento de peligro un factor de riesgo importante (Velea, Hautefeuille, Vazeille, & Lantran-Davoux, 1999). La sensación subjetiva de facilitar la relación con los demás hace de estas drogas empatógenas (y otras legales como el alcohol), un recurso para sectores de la población especialmente vulnerables, por lo que el adecuado conocimiento de los efectos de estos compuestos es vital para elaborar planes de prevención y educación que sean eficientes. Además, resulta también evidente que el conocimiento de los efectos de compuestos ilegales fácilmente disponibles sin ninguna regulación es una cuestión de seguridad sanitaria. El consumo de esta droga es capaz de producir una serie de efectos adversos secundarios difíciles de predecir con exactitud en humanos, ya que son inusualmente sensibles a pequeñas variaciones en la dosis y factores ambientales (Sáez-Briones & Hernández, 2013). Se han descrito efectos secundarios motores (aumento de la actividad locomotora), psicológicos (cambios perceptuales, incapacidad de concentración, ansiedad, depresión, psicosis), y efectos tóxicos a nivel sistémico como la elevación aguda de la temperatura corporal, sudoración, escalofríos, pérdida del apetito y aumento de la sed, hipertensión, fallo renal, rabdomiolisis, temblores, bruxismo, dolores musculares, coagulación intravascular diseminada y colapso cardiovascular, que pueden tener consecuencias fatales (Gouzoulis-Mayfrank, Hermle, Kovar, & Sass, 1996; Sauer & Weilemann, 1997; Schifano, 2004; Velea et al., 1999; Vollenweider, Gamma, Liechti, & Huber, 1998). Muchos de estos efectos no deseados se deben al “síndrome serotoninérgico” que se produce en respuesta a las drogas que aumentan las concentraciones sinápticas de serotonina en el sistema nervioso central (Callaghan, 2008). La administración aguda de MDMA induce la liberación de neurotransmisores monoaminérgicos, principalmente serotonina (5-HT), y también dopamina (DA), en diversas regiones del sistema nervioso central tales como el estriado, núcleo accumbens, hipocampo y corteza prefrontal. Este incremento en la neurotransmisión monoaminérgica es resultado de la acción directa e indirecta sobre las proteínas transportadoras de 5-HT y DA (SERT y DAT, respectivamente), presentes en la membrana del terminal axónico. La Introducción 7 molécula de MDMA accede al interior de la neurona a través de las proteínas transportadoras, y una vez dentro altera el flujo monoaminérgico a varios niveles; por un lado invierte la función del transportador vesicular aumentando el nivel citoplasmático de monoaminas y, por otro lado, también invierte el flujo de los transportadores SERT y DAT facilitando la liberación no exocitótica de monoaminas al espacio sináptico e inhibiendo el proceso normal de recaptación (Halpin, Collins, & Yamamoto, 2014). Se ha descrito que la liberación de serotonina ejerce un efecto activador sobre la liberación de dopamina, y que estas monoaminas aumentan a su vez la actividad del sistema colinérgico. Además, la MDMA también incrementa la concentración extracelular de glucosa y lactato (Gudelsky & Yamamoto, 2008). El interés en el estudio de las sustancias psicoactivas entactógenas, tanto de sus efectos conductuales como su mecanismo de acción, puede suponer un avance en el conocimiento de los circuitos emocionales en el sistema nervioso central y una posible vía para el tratamiento de diversos trastornos del estado de ánimo. El particular mecanismo de acción del MDMA y sus propiedades entactógenas, han despertado el interés científico por su posible uso terapéutico en el manejo farmacológico de diversos trastornos neuropsiquiátricos (Sáez-Briones & Hernández, 2013; Sessa, 2007), como la depresión (Majumder, White, & Irvine, 2012; Riedlinger & Riedlinger, 1994), trastorno por estrés postraumático (Bouso, Doblin, Farré, Alcázar, & Gómez-Jarabo, 2008; Check, 2004; Doblin, 2002) o el autismo (Riedlinger, 1985), al tiempo que existe gran preocupación por extremar las precauciones debido a la elevada cantidad de efectos tóxicos agudos o crónicos (Guillot & Berman, 2007; Parrott, 2007). Aunque se han publicado un amplio número de estudios sobre el MDMA, apenas se dispone de información sobre el grado de toxicidad, mecanismos de acción y los efectos conductuales del consumo de las drogas MBDB, MDEA y PMA. Trabajos recientes realizados con animales de experimentación sugieren que el MDMA se asocia a un complejo perfil de efectos sobre la ansiedad y la agresión, produciendo a determinadas dosis un incremento de la ansiedad (Bhattacharya, Bhattacharya & Ghosal, 1998; Gurtman, Morley, Li, Hunt, & McGregor, 2002; Maldonado, Navarro, Cárdenas, Dávila, & Cavas, 2000; Navarro & Maldonado, 2002; Navarro, Rivera, Maldonado, Cavas, & De La Calle, 2004) y un efecto antiagresivo (Navarro & Maldonado, 1999; Maldonado & Navarro, 2001b). Sin embargo, hasta la fecha no existen estudios que evalúen el efecto 8 Introducción conductual de la administración de MBDB, MDEA y PMA sobre la conducta agresiva y la ansiedad. Por tanto, esta investigación pretende examiniar el perfil conductual de las drogas MBDB, MDEA y PMA en modelos animales de agresión y ansiedad. Este trabajo consta de dos partes diferenciadas: una teórica y otra experimental. En la primera parte, se presenta una revisión del perfil farmacológico y clínico de las tres sustancias objeto de estudio (aspectos farmacocinéticos, farmacodinámicos, efectos psicofarmacológicos, conductuales y fisiológicos más destacables), a continuación se expone una revisión del concepto de agresión y ansiedad, así como su forma de estudio desde la Psicobiología, ofreciendo una relación de los modelos animales de agresión y ansiedad disponibles, así como de las principales estructuras y sistemas de neurotransmisión implicados en los mismos. En la segunda parte se expone el trabajo experimental. Para ello se ha realizado en primer lugar una descripción de la metodología empleada en los experimentos de sendos modelos conductuales, la descripción del diseño experimental, el sistema de evaluación conductual utilizado y el análisis estadístico. Seguidamente, se exponen en bloques separados los seis experimentos, en los cuales se explican los aspectos metodológicos y se discuten los resultados. Para finalizar, se presenta una discusión general y se plantean las conclusiones más relevantes a las que se ha llegado en esta Tesis Doctoral. 2. DROGAS EMERGENTES 16 Metilbenzodioxolbutanamina (MBDB) “Edén” el nivel de serotonina y su metabolito 5-HIAA en la corteza frontal (Johnson & Nichols, 1989), en otros estudios también se observó lo mismo tan sólo 40 minutos tras la administración de MBDB (5 mg/kg) o MDMA (3 mg/kg) en ratas (Callaway, Johnson, Gold, Nichols, & Geyer, 1991). Esta reducción del nivel tisular de serotonina puede prevenirse con pretratamiento de fluoxetina (Callaway et al., 1991; Callaway & Geyer, 1992). 2) A diferencia del MDMA, el MBDB no interfiere en la liberación de dopamina en el núcleo caudado (Johnson et al., 1986; 1989), ni tampoco inhibe su recaptación en el estriado (Steele et al., 1987). Es cierto que el MBDB puede producir un ligero incremento en la liberación de dopamina extracelular pero con una potencia muchísimo menor que el MDMA y que en ningún caso resulta significativa (Nash & Nichols, 1991). Por otra parte, estudios algo más recientes evidencian que la administración de MBDB a nivel sistémico consigue potenciar débilmente la liberación estriatal de dopamina, en comparación con otras fenetilaminas (MDA>MDMA>MDEA>MBDB) (Lebsanft, Mayerhofer, Kovar, & Schmidt, 2003). El hecho de esta ausencia de relación con el sistema dopaminérgico es muy importante ya que la dopamina se relaciona con la neurotoxicidad serotoninérgica del MDMA y con las propiedades reforzantes de sustancias como la cocaína y las anfetaminas. 3) En cuanto a si el MBDB inhibe la recaptación de noradrenalina en la rata encontramos resultados mixtos. En estudios in vitro, se ha hallado que el MBDB puede producir una inhibición de la recaptación de noradrenalina en el hipocampo (Steele et al., 1987), así como en muestras mixtas de la corteza, hipocampo y núcleo caudado en menor medida que el MDMA (Johnson et al., 1991). Sin embargo, en estudios in vivo ni el MDMA ni el MBDB reducen el nivel de noradrenalina en la corteza cerebral de la rata (Johnson & Nichols, 1989; van Aerts et al., 2000). 2.1.4. Efectos fisiológicos agudos  Síntomas clínicos fisiológicos agudos en humanos. El consumo de MBDB en humanos se ha relacionado con alteración del estado de ánimo y a nivel sistémico con diversas alteraciones del sistema autónomo y fallo multiorgánico. Entre los efectos fisiológicos hay evidencias de un aumento notable de la temperatura corporal, alteraciones de la presión arterial y de la frecuencia cardiaca, coagulación intravascular diseminada, paro cardiaco, hemorragias intralveolares y Drogas emergentes 17 derrames pleurales, rabdomiolisis, daño en el bazo, fallo hepático y renal agudo, así como hipoglucemia, alteraciones en electrolitos (menos Ca2+, más K+), convulsiones y coma (Carter et al., 2000; Rojek et al., 2012; Schifano et al., 2006). Estos efectos en general son similares a los observados tras la administración de MDMA (Capela et al., 2009; Carvalho et al., 2012; Hysek, Vollenweider, & Liechti, 2010), entre los que se destacan por su frecuencia el aumento de la presión sanguínea, de frecuencia cardiaca y problemas de toxicidad cardiaca que puede derivar en valvulopatías (Baumann & Rothman, 2009). El MDMA también produce una alteración dosis dependiente de la temperatura central del cuerpo, induciendo una marcada respuesta de hipertermia en ambientes con una temperatura normal (20-22ºC) o elevada. Como consecuencia de esta respuesta hipertérmica se aumenta tanto la tasa metabólica como la perdida de agua por evaporación (Gordon, Watkinson, O'Callaghan, & Miller, 1991). Por este motivo una elevada temperatura ambiental tras la administración de esta sustancia suele ser un factor fatal para el consumidor. Por otra parte, también hay datos de que la administración de MDMA en un ambiente frío produce una respuesta de hipotermia significativa (Dafters, 1994; Gordon et al., 1991), pero en este caso no se observan alteraciones en la tasa metabólica (Gordon et al., 1991). Son muchos los estudios que muestran que las RSAs ejercen un efecto disfuncional sobre la termorregulación (Bexis, Phillis, Ong, White, & Irvine, 2004; Bexis & Docherty, 2006; Dafters, 1994; Hawrylak, Palepu, & Tremaine, 2006; Jaehne, Salem, & Irvine, 2005; Malpass, White, Irvine, Somogyi, & Bochner, 1999; Parrott et al., 2006; Parrott, 2012). En consumidores de éxtasis también se han descrito una serie de efectos secundarios que ordenados de mayor a menor incidencia son: bruxismo, sed y sequedad de boca, pérdida de apetito, dificultad de concentración, alteración del equilibrio y la marcha, fatiga, inquietud, palpitaciones, vértigo, temblores, tensión interna y disminución del umbral de dolor (Liechti & Vollenweider, 2000; Parrott, 2007). No obstante, hay que tener en cuenta que los efectos tóxicos del MBDB en humanos se han recogido en su mayoría de estudios postmortem por policonsumo de drogas (MDMA, metanfetaminas, THC y benzodiacepinas), lo que dificulta identificar los efectos propios de la Metilbenzodioxolbutanamina (Caldicott et al., 2003; Concheiro, Castro, Quintela, López-Rivadulla, & Cruz, 2006). 18 Metilbenzodioxolbutanamina (MBDB) “Edén”  Efectos fisiológicos agudos del MBDB en animales experimentales. En animales, el MBDB también es capaz de inducir alteración de la presión arterial (15 min. tras la inyección) y de la frecuencia cardiaca (5 min. tras la inyección), sin embargo lo que se ha observado es una disminución de estos parámetros (Li et al., 1996). En general, los datos fisiológicos del MBDB en animales son más limitados que los del MDMA. A nivel neurofisiológico, se ha estudiado los efectos de estas sustancias en la actividad eléctrica cerebral o potenciales evocados, mediante técnicas de radioelectroencafolgrafía cuantitativa (tele-stereo-EEG). Se ha observado que el patrón espectral generado por las sustancias S-MDMA y S-MBDB se caracteriza por una reducción general de la actividad eléctrica, en especial de las ondas alfa-2 y delta; mientras que las anfetaminas alucinógenas (DOM, DOB, DOI) incrementan la duración y frecuencia de la onda alfa-1 sobre todo en el estriado. Además, parece que existen diferencias entre ambos compuestos entactógenos, pues el MBDB reduce la actividad de la onda theta en la corteza frontal, mientras que el MDMA la aumenta (Dimpfel, Spuler, & Nichols, 1989). Por otra parte, hay evidencias de que los agnositas serotoninérgicos como el MBDB o MDMA producen una interrupción de la respuesta de inhibición prepulso (PPI), (una reducción normal de la respuesta de sobresalto cuando se realiza una pre-estimulación débil); mientras que los antagonistas serotoninérgicos 5-HT1B aumentan la PPI (Dulawa, Hen, Scearce-Levie, & Geyer, 1998; Dulawa, Scearce-Levie, Hen, & Geyer, 2000; Padich, McCloskey, & Kehne, 1996). Es posible que esta respuesta se encuentre mediada por receptores 5-HT2A, pues también se ha observado una interrupción de la PPI con alucinógenos como el 5-Meo-DMT (Krebs-Thomson, Ruiz, Masten, Buell, & Geyer, 2006) y el LSD (Ouagazzal, Grottick, Moreau, & Higgins, 2001).  Efectos sobre el sistema neuroendocrino En el ser humano se han demostrado efectos del MDMA sobre el ACTH, cortisol, prolactina, la presión arterial y la frecuencia cardiaca (Grob, Poland, Chang, & Ernst, 1995; Mas et al., 1999). En consumidores habituales, la abstinencia de esta sustancia durante tres semanas induce una disminución de la respuesta de cortisol y prolactina frente a la fenfluramina (Gerra et al., 1998). Esta respuesta también se observa en ratas pretratadas con MDMA (Poland et al., 1997). Además, la MDMA afecta a la liberación de vasopresina en el ser humano (Henry et al., 1998). Drogas emergentes 19 Los efectos neuroendocrinos del MBDB en la rata son muy similares a los del MDMA. La administración de MBDB (5 mg/kg, i.p.) eleva en tan solo diez minutos el nivel de hormona adrenocorticotropa (ACTH) y renina plasmática, mientras que la prolactina llega a su pico máximo después de 30 minutos. No obstante, los efectos neuroendocrinos del MBDB se pueden bloquear con fluoxetina (fármaco inhibidor de la recaptación de serotonina, ISRS), mientras que este mismo pretratamiento no tiene efecto sobre la secreción hormonal inducida por MDMA. Se ha sugerido que el MBDB influye en la secreción de estas hormonas a través de la interacción con el transportador de serotonina (SERT) encargado de mediar en su recaptación (Li et al., 1996). Por otra parte, el MBDB (5 mg/kg) no parece elevar la concentración de oxitocina plasmática, al contrario de lo que ocurre con otros agentes liberadores de serotonina como el MMAI y MTA, ni tampoco parece alterar el nivel de vasopresina en ratas (Li et al., 1996). No hay disponibles estudios sobre los efectos neuroendocrinos del MBDB en humanos. 2.1.5. Efectos conductuales del MBDB a) Estudios de discriminación de drogas El paradigma de discriminación de drogas ha sido una poderosa herramienta para caracterizar la farmacología conductual de los compuestos MDMA y MBDB, aunque en términos estrictos esta aproximación experimental no se debe considerar un modelo animal (Nichols & Oberlender, 1989). Las técnicas de discriminación de drogas consisten en el entrenamiento del animal mediante reforzamiento para que discrimine los efectos de la administración de una determinada droga de la administración de suero salino, y una vez establecida la señal discriminativa de la droga de entrenamiento, se procede a intentar sustituir el efecto de ésta con otros compuestos. En la medida en que se llegue a una sustitución completa y ésta se alcance en pocos ensayos, podemos suponer que los efectos de la droga de sustitución son similares a los de la droga de entrenamiento. Hace más de dos décadas, Nichols observó que la molécula de MBDB producía un perfil conductual en roedores sometidos al test de discriminación de drogas, que la situaban claramente fuera de la categoría de los alucinógenos y de los estimulantes, de forma similar a lo que observó con otras feniletilaminas como el MDEA (3,4metilenodioxietilanfetamina) y la MDMA. Se ha comprobado que la MDMA y MBDB no pueden sustituir la señal discriminativa generada por el entrenamiento con el alucinógeno ácido lisérgico (LSD) (Nichols, 1986), ni la generada por el entrenamiento 20 Metilbenzodioxolbutanamina (MBDB) “Edén” con el estimulante S(+)-Anfetamina (Oberlender & Nichols, 1988). Aunque los datos sobre la MDMA no son del todo concordantes, ya que otros estudios indican que no sustituye el efecto del alucinógeno DOM mientras que sí sustituye parcialmente el efecto del estimulante anfetamina (Glennon, Yousif, & Patrick, 1988), y también es capaz de generalizar el efecto del alucinógeno mescalina (Callahan & Appel, 1988). Por otra parte, se ha comprobado que las drogas alucinógenas o no sustituyen (DOM, mescalina), o bien no sustituyen completamente (LSD) 1 la señal discriminativa del entrenamiento con MBDB o MDMA (Nichols & Oberlender, 1989; Oberlender & Nichols, 1990). Mientras que el estimulante S-(+)-Anfetamina no generaliza los efectos del entrenamiento con MBDB, pero puede sustituir parcialmente el efecto del MDMA (Oberlender & Nichols, 1988) 2 (Glennon & Misenheimer, 1989) 3 o de forma completa (Nichols & Oberlender, 1989) 4 . En la misma línea, hay evidencias algo más recientes de que el estímulo discriminativo generado del MBDB es distinto del producido por el estimulante anfetamina o el alucinógeno LSD, lo que se ha utilizado para caracterizar el perfil conductual de otras sustancias (Marona-Lewicka, Rhee, Sprague, & Nichols, 1995; Monte, Marona-Lewicka, Cozzi, & Nichols, 1993). Además, también se ha comprobado que la MDMA y MBDB generalizan su señal completa y mutuamente, así como también son capaces de suplir el estímulo discriminativo del MMAI, una potente droga liberadora de serotonina carente de efectos estimulantes y alucinógenos (Marona-Lewicka & Nichols, 1994; 1998; Oberlender & Nichols, 1990). En conjunto, estos hallazgos sirvieron para argumentar sólidamente que la molécula de MBDB y MDMA pertenecían a una nueva clase farmacológica de RSAs con un efecto psicotrópico especial al que se denominó de tipo “Entactógeno”, capaz de facilitar la instrospección, la empatía y la comunicación, y que se diferenciaban de los efectos de otras RSAs de tipo estimulante o bien alucinógeno hasta ese momento conocidos (Nichols & Oberlender, 1989; Oberlender & Nichols, 1988; 1990; Sáez-Briones & Hernández, 2013; Vollenweider et al., 2002). Droga de entrenamiento (DE), Droga de sustitución (DS): 1 DE: MDMA.HCL (7.63 Mol/kg), DS: LSD (0.372 Mol/kg), sustitución parcial (78%). DE: MBDB.HCL (7.19 Mol/kg), DS: LSD (0.186 Mol/kg), sustitución parcial (57%). 2 DE: MDMA.HCL (1.75 mg/kg), DS: S-(+)-Anfetamina (1.2 mg/kg), sustitución parcial (83%). 3 DE: MDMA.HCL (1.5 mg/kg), DS: S-(+)-Anfetamina, sustitución parcial (49%). 4 DE: MDMA.HCL (7.63μMol/kg), DS: S-(+)-Anfetamina (4.2μMol/kg), sustitución completa Drogas emergentes 21 b) Efectos locomotores La administración de (RS)-(±)-MBDB racémico (5 o 10 mg/kg, s.c.) en ratas, produce un incremento de la actividad locomotora que dura alrededor de una hora, y que se acompaña de una supresión de la conducta exploratoria. La activación motora que produce el MBDB en el paradigma de conducta motora incondicionada “Behavioral Pattern Monitor” (BPM), es más moderada que la de su homólogo MDMA (Callaway & Geyer, 1992). Aunque existen evidencias de que una dosis intermedia-elevada de MDMA (5, 10 mg/kg) produce una disminución transitoria de la actividad motora los primeros diez minutos, tanto la MDMA como el MBDB en menor medida, inducen en general un incremento notable de la conducta motora horizontal en un amplio rango de dosis, lo que denota ciertas propiedades estimulantes (Gold, Geyer, & Koob, 1989). No obstante, ambas fenetilaminas muestran diferencias importantes respecto a los estimulantes típicos como la anfetamina, ya que a diferencia de ésta no incrementan sino que disminuyen, la conducta exploratoria vertical como la exploración elevada sobre las patas traseras “rearings” o la conducta de asomarse a los agujeros “holepokes”. La disminución de estas conductas junto con la evitación del área central son por otra parte características de los derivados de feniletilaminas o indolaminas de tipo alucinógeno (Callaway & Geyer, 1992; Gold et al., 1989). Por otra parte, el patrón locomotor inducido por el MBDB y la MDMA también son muy similares y se caracterizan en el BPM, por una elevada tigmostaxis que se manifiesta con una locomoción continua alrededor de la periferia del recinto en contacto o proximidad con las paredes (Gold, Koob, & Geyer, 1988; Gold & Koob, 1989; Gold et al., 1989; Paulus & Geyer, 1992; Risbrough et al., 2006). Congruentemente, se ha observado que el MBDB reduce del estadístico descriptivo espacial “δ” usado en geometría fractal, lo que refleja una reducción de la variedad del patrón locomotor describiendo una trayectoria con tendencias lineales, aunque puede diferir dependiendo de las propiedades geométricas del espacio donde se realice la prueba (Paulus & Geyer, 1991; 1997). El patrón locomotor inducido por otras drogas es muy distinto, por ejemplo, la anfetamina produce un patrón más complejo con frecuentes cambios direccionales y distribuido ampliamente por el recinto, el LSD y otros alucinógenos también se caracterizan por un aumento de la diversidad del patrón locomotor y no producen tigmostasis. Otros estimulantes como la cafeína o la nicotina producen hiperactividad sin 22 Metilbenzodioxolbutanamina (MBDB) “Edén” llegar a alterar significativamente el patrón locomotor (Gold et al., 1989). Por lo que en conjunto, el perfil conductual del MDMA y MBDB parece ser bastante singular. Aunque no hay datos disponibles acerca de si el efecto motor del MBDB depende de su configuración quiral, parece ser que el MDMA sí que presenta una alta quiralidad selectiva. En concreto, la administración aguda de S(+)-MDMA o del modo racémico producen un marcado efecto hiperlocomotor y su administración subcrónica conduce a una sensibilización en un periodo de habituación corto (Spanos & Yamamoto, 1989), a diferencia de la R(-)-MDMA que incluso parece disminuir la actividad locomotora tras un tratamiento subcrónico (von Ameln & von Ameln-Mayerhofer, 2010). Por otra parte, cuando se administran dosis elevadas de BDB (16 mg/kg) en pollos recién nacidos y otras especies, este metabolito del MBDB es capaz de inducir importantes efectos motores tales como temblores, problemas para extender las alas y problemas para realizar vocalizaciones o ruidos guturales para llamar a la madre, conductas que se parecen a las inducidas por fármacos alucinógenos y también por estimulantes. Además, es común observar una postura corporal anormal y movimientos bruscos hacia adelante típicos de los alucinógenos, así como una pérdida del reflejo de enderezamiento (righting réflex), un efecto típico de la d-anfetamina pero no de los alucinógenos (Bronson, Jiang, DeRuiter, & Clark, 1995). A diferencia de los múltiples efectos motores observados tras la administración directa de su metabolito, la administración de MBDB no produce pérdida del reflejo de enderezamiento, ni movimientos bruscos hacia adelante, ni temblores, y es menos potente que el BDB en cuanto al resto de efectos descritos (Bronson et al., 1995; van Aerts et al., 2000). La hiperactividad inducida por MDMA y MBDB es compleja en términos neuroquímicos y presenta componentes tanto dopaminérgicos como serotoninérgicos. Hay evidencias de que la administración de MBDB a nivel sistémico consigue potenciar débilmente la liberación estriatal de dopamina, algo que se aprecia de forma más evidente con otras RSAs (MDA>MDMA>MDEA>MBDB) (Lebsanft et al., 2003). La activación motora se encuentra relacionada con la activación del sistema dopaminérgico (Gold et al., 1989). En concreto, la activación del receptor dopaminérgico D1 podría relacionarse con el tipo de actividad motora (lineal vs. circunscrita), mientras que el receptor D2 parece que contribuye en la ejecución de conductas repetitivas cíclicas inducidas por MDMA (Risbrough et al., 2006). Sin embargo, cuando se administran estas drogas a nivel local directamente en el núcleo accumbens, se observa que a diferencia del MDMA, el MBDB Drogas emergentes 23 no es capaz de reproducir este efecto hiperlocomotor, por lo que en este caso no parece que la liberación de catecolaminas en el núcleo accumbens medie esta conducta (Callaway & Geyer, 1992). Por otra parte, se ha comprobado que el pretratamiento con fármacos inhibidores de la recaptación de serotonina (ISRS) es capaz de impedir el efecto hiperlocomotor del MBDB (Callaway et al., 1991), y también de reducir eficazmente la conducta de “circling” o rotacional característica de sustancias que producen una liberación alta o moderada de dopamina como la MDA y MDMA (Lebsanft et al., 2003; Lebsanft, Kovar, & Schmidt, 2005). Por lo que en esta línea, se ha sugerido que el efecto hiperlocomotor del MBDB y otras RSAs podría estar regulado por la activación indirecta del sistema dopaminérgico, a través del sistema serotoninérgico. El “síndrome conductual serotoninérgico” fue descrito por primera vez por GrahameSmith (Grahame-Smith, 1971b) tras la administración de fármacos inhibidores de la enzima metabolizadora (MAO) y precursores (L-triptófano) de la serotonina. Estudios posteriores muestran que este síndrome se puede producir también por agonistas 5-HT no selectivos (Grahame-Smith, 1971a; Green & Grahame-Smith, 1976), agonistas selectivos 5-HT1A (8-OH-DPAT) (Goodwin & Green, 1985) y compuestos liberadores de serotonina como el PCA (Green & Kelly, 1976). El síndrome serotoninérgico incluye hiperactividad, acompañado de movimientos laterales de cabeza, movimientos de boxeo de las patas delanteras, piloerección, erección y eyaculación, proptosis, salivación y defecación. Dado que el MBDB y la MDMA aumentan la liberación de serotonina en varias regiones cerebrales, no es sorprendente que la administración aguda de estas sustancias produzca una respuesta hiperlocomotora dosis dependiente (Green, Mechan, Elliott, O'Shea, & Colado, 2003). En este sentido, se ha comprobado que el efecto hiperlocomotor inducido por MDMA se relaciona con la liberación de serotonina (Callaway, Wing, & Geyer, 1990; Callaway et al., 1991) y con la activación de diversos receptores serotoninérgicos. En ratones, la actividad motora inducida por MDMA se encuentra mediada al menos en parte por los receptores 5-HT1B (Green et al., 2003; Scearce-Levie, Viswanathan, & Hen, 1999). En ratas, esta conducta motora se ha relacionado con la activación de receptores 5-HT1B (Green et al., 2003; McCreary, Bankson, & Cunningham, 1999), y 5-HT2A (Kehne et al., 1996; Sáez-Briones & Hernández, 2013; Schmidt, Black, Abbate, & Taylor, 1990; Schmidt, Abbate, Black, & Taylor, 1990); mientras que hay evidencias de los receptores 5-HT(2B/2C) podrían tener un papel inhibitorio en la respuesta motora mediada por 24 Metilbenzodioxolbutanamina (MBDB) “Edén” mecanismos tanto serotoninérgicos como dopaminérgicos (Bankson & Cunningham, 2002; Gold & Koob, 1988; Green et al., 2003). De hecho, se ha comprobado la implicación de los receptores 5-HT(2A/2C) en la actividad dopaminérgica (Navailles, Moison, Cunningham, & Spampinato, 2008; Palfreyman et al., 1993; Porras et al., 2002), ya que a pesar de la baja afinidad micromolar que muestra el MDMA por éstos (Battaglia, Brooks, Kulsakdinun, & De Souza, 1988), su bloqueo altera la relación funcional entre los neurotransmisores 5-HT y DA provocando una disminución del nivel de DA que reduce el efecto motor del MDMA (Schmidt et al., 1992; Schmidt, Fadayel, Sullivan, & Taylor, 1992; Schmidt, Sullivan, & Fadayel, 1994). En conjunto, estos hallazgos sobre el MDMA, podrían suponer una evidencia indirecta de que el efecto hiperlocomotor del MBDB también se encuentre mediado por un mecanismo de acción similar de ambos sistemas de neurotransmisión a través de los receptores de serotonina (Paulus & Geyer, 1992; van Aerts et al., 2000). c) Efectos sobre el refuerzo El test de condicionamiento de preferencia de lugar (CPL) es un modelo animal basado en el condicionamiento clásico que permite evaluar el refuerzo inducido por las sustancias psicoactivas. En este modelo se asocian señales contextuales con la experiencia producida por la droga, de forma que el estímulo contextual puede adquirir una valoración hedónica-apetitiva reforzante, o bien aversiva, en función de las propiedades motivacionales de la droga. Existen evidencias de que diversas sustancias psicoactivas como el MDMA o estimulantes típicos, son capaces de incrementar la ejecución de respuestas condicionadas que siguen un programa de reforzamiento de intervalo fijo (Miczek & Haney, 1994). En esta línea, se ha demostrado que el MBDB (10 mg/kg) produce condicionamiento de preferencia de lugar en ratas, con una potencia 2.5 veces menor que el MDMA (Marona-Lewicka, Rhee, Sprague, & Nichols, 1996). También en monos Rhesus, existen evidencias de que la administración del MBDB y MDMA aumenta la conducta de autoadministración, aunque con menor potencia que los estimulantes cocaína y metanfetamina (Fantegrossi, 2007). El efecto del MDMA y del MBDB sobre el condicionamiento parece seguir un patrón dosis-dependiente en forma de U invertida, exhibiendo propiedades reforzantes solo con dosis muy reducidas, en monos Rhesus (dosis efectivas: 0.1 mg/kg de MBDB y 0.03 mg/kg de MDMA, i.p.; dosis no efectiva: Drogas emergentes 25 0.3 mg/kg i.p. de MBDB o MDMA) y en ratones (dosis efectiva: 2.6 mg/kg de MDMA, i.v.; dosis no efectiva: 10 mg/kg de MDMA, i.v.) (Fantegrossi, 2007; Rodriguez-Alarcón, Canales, & Salvador, 2007). Por otra parte, existen evidencias de que la administración prolongada debilita el efecto reforzante de estas sustancias. Aunque, hay una serie de factores externos tales como la temperatura elevada (Cornish et al., 2003), el consumo de alcohol (Montagud-Romero et al., 2014) y el aislamiento social (Meyer, Mayerhofer, Kovar, & Schmidt, 2002b) que potencian los efectos reforzantes de éxtasis, aspectos que pueden resultar relevantes en consumidores humanos. Por otra parte, la sustancia MBDB carece del componente de activación dopaminérgica significativo en el núcleo accumbens (Marona-Lewicka et al., 1996; Nash & Nichols, 1991), que sí está presente en su homólogo. En este sentido, resulta congruente que el MBDB presente unas propiedades reforzantes en el test de preferencia de lugar más débiles que las del MDMA (2.5 veces menor como se ha indicado anteriormente). En relación a la vía dopaminérgica mesocortical, se ha comprobado que el MBDB es igualmente capaz de inducir un leve incremento no significativo en el nivel de dopamina cortical (Callaway et al., 1991; Marona-Lewicka et al., 1996), una respuesta no tan contundente como la producida por la MDMA. No obstante, los datos obtenidos de la microdiálisis in vivo no proporcionan en conjunto una explicación satisfactoria que relacione las moderadas propiedades reforzantes del MBDB con la ausencia de actividad dopaminérgica mesolímbica significativa. Para ello, se ha sugerido la hipótesis de que un incremento muy leve del flujo de dopamina en el núcleo accumbens podría ser suficiente para inducir refuerzo en el test de condicionamiento del lugar de preferencia (MaronaLewicka et al., 1996). Esta hipótesis, resulta congruente con estudios recientes sobre la reinstauración de la preferencia de lugar mediante una dosis priming de MDMA inferior a la empleada durante la fase de condicionamiento (Daza-Losada, Rodríguez-Arias, Aguilar, & Miñarro López, 2010). Además, también es acorde con la observación de que sustancias como la MMAI o la fenfluramina que producen aversión condicionada del lugar, no aumentan en absoluto los niveles de dopamina en el núcleo accumbens. 32 Metilenodioxietilanfetamina (MDEA) “Eva” naturales monoaminérgicas que son esenciales en la neurotransmisión. En concreto, hay evidencias de que tanto el MDEA y como el MDMA, tienen diversos mecanismos neurotóxicos interrelacionados que alteran la biosíntesis, liberación, recaptación y metabolización de monoaminas, así como también la activación de receptores, teniendo incluso en común un metabolito neurotóxico activo, la MDA (Capela et al., 2009; Carvalho et al., 2012; Freudenmann & Spitzer, 2004). La neurotoxicidad del MDEA y del MDMA también viene determinada por la fosforilación de proteínas por choque térmico, neuroinflamación, el incremento del estrés oxidativo aumentando la formación de radicales libres como especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) y la inducción de daño mitocondrial (Barbosa et al., 2012; Capela et al., 2009; Carvalho, 2011; Carvalho et al., 2012; Freudenmann & Spitzer, 2004; Karuppagounder et al., 2014; Parrott, 2012). Aunque en general, la investigación sobre el mecanismo de acción del MDEA, sea más limitada que la del MDMA, existen evidencias de que ambas drogas modulan varias fases del proceso de neurotransmisión serotoninérgico. Los estudios in vivo e in vitro revelan que la administración aguda de MDEA produce una importante liberación de serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) tan potente como otras RSAs análogas (MDMA o la MDA) e incluso más selectiva (Boja & Schechter, 1991; Colado, Granados, O'Shea, Esteban, & Green, 1999; Freudenmann & Spitzer, 2004; Johnson et al., 1987; Johnson et al., 1989; McKenna, Guan, & Shulgin, 1991; O'Loinsigh, Boland, Kelly, & O'Boyle, 2001; Schmidt, 1987; Series & Molliver, 1994). El mecanismo de acción farmacológica del MDEA sobre los terminales serotoninérgicos es similar al del MDMA (Capela et al., 2009). Ambas drogas son sustrato de los transportadores de serotonina situados en la membrana presináptica (SERT o 5-HTT) y los usan para entrar en el terminal neuronal, aunque en concentraciones altas pueden atravesar la membrana por difusión. Una vez dentro estas drogas producen una rápida liberación de serotonina almacenada en vesículas invirtiendo la función de los transportadores vesiculares (VMAT) y de los transportadores SERT, los cuales en vez de recaptar empiezan a expulsar el neurotransmisor del interior de las vesículas y de la célula. Los fármacos antidepresivos inhibidores de la recaptación de serotonina (ISRS) actúan bloqueando los transportadores SERT, y se ha demostrado que su administración previa atenúa el efecto de la MDA, MDMA y MDEA tanto en experimentos in vitro (Johnson et al., 1989; McKenna et al., 1991), como in vivo (Liechti, Baumann, Gamma, & Vollenweider, 2000). Por otra parte, el MDEA y MDMA pueden Drogas emergentes 33 actuar como agonistas débiles de los receptores postsinápticos 5-HT2, se ha detectado una preferencia esteroselectiva de los isómeros R-MDMA por este mecanismo de acción que parece mediar los débiles efectos alucinógenos del MDMA (Freudenmann & Spitzer, 2004). La droga MDEA también inhibe la biosíntesis y degradación de serotonina interfiriendo con la enzima triptófano-hidroxilasa (TPH) y la monoaminoxidasa (MAO) respectivamente, aunque con una potencia menor que el éxtasis o el MDA. Estos mecanismos de acción propician a medio-largo plazo que el MDEA y otras RSAs (MDMA, MDA, MBDB) mengüen los recursos de la neurona serotoninérgica limitando la producción, recaptación y metabolización de serotonina tras haber agotado inicialmente las reservas de la misma. Por lo que se produce una depleción dosis dependiente de diversos marcadores serotoninérgicos como el nivel tisular de serotonina (5-HT), del metabolito ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA), de la actividad de la TPH y del número lugares de recaptación de serotonina, no obstante, esta depleción parece ser unas cuatro veces menos potente que la producida por el MDMA (Carvalho, 2011; Freudenmann & Spitzer, 2004; Johnson et al., 1987; Johnson et al., 1989; Leonardi & Azmitia, 1994; Meyer et al., 2002a; Ricaurte et al., 1987; Ricaurte, Yuan, & McCann, 2000; Stone et al., 1987). Esta menor potencia podría explicar los resultados aparentemente contradictorios que indican que, a diferencia del MDMA y MDA, la administración aguda o crónica de MDEA no reduce a largo plazo todos los marcadores serotoninérgicos en la corteza cerebral de las ratas (Schmidt, 1987; Stone et al., 1987). En conjunto, parece ser que el efecto serotoninérgico del MDEA es menor que el de otras drogas como la MDMA o la MDA, por lo que se ha propuesto que el riesgo neurotóxico serotoninérgico a largo plazo es menor (Hegadoren et al., 1995). Por otra parte, la influencia del MDEA sobre otros sistemas de neurotransmisión no está tan clara. Los estudios iniciales sobre discriminación de drogas indican que la señal discriminativa del MDEA parece relacionarse con la activación del sistema serotoninérgico y dopaminérgico (Boja & Schechter, 1991). En consonancia, el MDEA parece producir una liberación de dopamina en el estriado de las ratas, aunque para detectarlo es necesario una concentración molar unas diez veces mayor (10-8M) que para detectar la liberación de serotonina (Schmidt, 1987). Sin embargo, hay evidencias de que el MDEA no interfiere en el nivel de dopamina y dependiendo del estudio, se ha detectado una reducción transitoria del nivel de su metabolito el ácido dihidroxifenilacético 34 Metilenodioxietilanfetamina (MDEA) “Eva” (DOPAC) (Johnson et al., 1987), o ninguna alteración de sus metabolitos (Stone et al., 1987). En esta misma línea, hay evidencias de que una dosis elevada de MDEA (40 mg/kg) no parece reducir la concentración ni de dopamina en el estriado, ni de noradrenalina en el hipocampo (Meyer et al., 2002a; Ricaurte et al., 1987). 2.2.4. Efectos fisiológicos agudos A nivel sistémico, los efectos tóxicos del MDEA (Freudenmann & Spitzer, 2004), se caracterizan por alteraciones en el sistema autónomo con aumento de la presión sanguínea, tasa cardiaca y un notable incremento de la temperatura corporal (Bexis & Docherty, 2006; Colado et al., 1999; Hawrylak et al., 2006; O'Loinsigh et al., 2001), así como disfunciones del sueño y alteraciones endocrinas con aumento de cortisol y prolactina en plasma (Gouzoulis-Mayfrank, Steiger, Ensslin, & Kovar, 1992; GouzoulisMayfrank, Von Bardeleben, Rupp, & Kovar, 1993; Gouzoulis-Mayfrank & Hermle, 1998; Gouzoulis-Mayfrank et al., 1999). El MDEA afecta a diversos órganos produciendo toxicidad cardiaca, hepática y renal (Colado et al., 1999; Fineschi, Centini, Mazzeo, & Turillazzi, 1999; Leung & Ballantyne, 1998), también se observan otras alteraciones tales como rabdomiolisis y coagulación intravascular diseminada (Colado et al., 1999; Dowling et al., 1987; Fineschi et al., 1999; Gouzoulis-Mayfrank et al., 1996; Iwersen & Schmoldt, 1996; Tsatsakis et al., 1997). Estos efectos también se han registrado tras la administración de MDMA (Capela et al., 2009; Carvalho et al., 2012). El aumento de la temperatura corporal dosis dependiente es uno de los efectos más constatados y dañinos de estas sustancias, no obstante parece ser que la potencia hipertérmica del MDEA es la mitad que la del MDMA (Colado et al., 1999). 2.2.5. Efectos conductuales del MDEA a) Estudios de discriminación de drogas Los primeros estudios sobre el perfil conductual del MDEA mediante el test de discriminación de drogas, mostraron que el estímulo discriminativo generado por esta sustancia es generalizado completamente por la MDMA (Boja & Schechter, 1987; Glennon & Misenheimer, 1989; Schechter, 1988), y también a la inversa (Schechter, 1998), por lo que hay una gran similitud en la señal interoceptiva que producen ambas drogas empatógenas. Por otra parte, existen evidencias de que el MDEA no puede sustituir la señal discriminativa generada por el entrenamiento con el alucinógeno DOM ni con el estimulante (+)-Anfetamina (Glennon et al., 1988). Además, algunos estudios Drogas emergentes 35 de discriminación de drogas ya sugerían que la señal interoceptiva del MDMA y MDEA parecía implicar una compleja interacción entre varios neurotransmisores, entre los que destacan la serotonina y la dopamina, mientras que la señal estimulante de la anfetamina es mediada por neuronas dopaminérgicas (Boja & Schechter, 1991; Schechter, 1991). En conjunto, los primeros estudios conductuales de discriminación de drogas indicaban que el MDEA era una feniletilamina con propiedades psicotrópicas similares a las del MDMA, que se distinguían claramente de los estimulantes y los alucinógenos, por lo que se clasificó como una sustancia “Entactógena” al igual que el MDMA o el MBDB. b) Efectos locomotores En el paradigma de conducta motora incondicionada “Behavioral Pattern Monitor” (BPM), las drogas MDMA y MDEA (≈1.0-10.0 mg/kg) producen un perfil de actividad motora que presenta similitudes con drogas clásicas psicoestimulantes, pero también ciertas diferencias. Estas RSAs incrementan notablemente la locomoción horizontal de las ratas de forma dosis dependiente, no obstante hay evidencia de que estas sustancias (3 y 10 mg/kg de MDEA, 2.5-10 mg/kg de MDMA) producen curiosamente una reducción temporal de la locomoción durante los primeros diez minutos, seguida de un incremento motor sostenido (Gold et al., 1988; 1989). Acorde con este efecto general hiperlocomotor, de menor potencia pero similar al de las anfetaminas, se ha observado que el índice temporal “α” de geometría fractal disminuye indicando una menor duración de los eventos o secuencias que suceden en el periodo de evaluación, lo que se relaciona de forma directa con una mayor actividad del sujeto (Paulus & Geyer, 1992). Sin embargo, al contrario que la anfetamina y otros simpaticomiméticos, la MDMA y MDEA reducen las conductas de actividad exploratoria de agujeros “holepokes” o de zonas elevadas “rearings”, aspectos que junto con la evitación del área central resultan más comunes en drogas con efectos alucinógenos (Gold et al., 1989). Asimismo, la administración aguda de una dosis mayor de MDEA o MDMA (20 mg/kg, i.p.) en el test del campo abierto, también produce una reducción de la conducta exploratoria vertical “rearings” y un aumento de conductas estereotipadas, cola erizada y movimientos laterales de cabeza (ésta última conducta incluso ligeramente más acentuada en ratas tratadas con MDEA) (O'Loinsigh et al., 2001). Mientras que la administración subcrónica de MDMA o MDEA (8 dosis de 20 mg/kg, i.p., repartidas en 36 Metilenodioxietilanfetamina (MDEA) “Eva” cuatro días), es capaz de aumentar la conducta motora de la rata, siendo el efecto motor del MDMA más destacado que el producido por el MDEA (O'Loinsigh et al., 2001). Además del efecto hiperlocomotor acompañado de hipoexploración, ambas sustancias entactógenas presentan un patrón de locomoción especial caracterizado por una evidente tigmostasis. Es decir, las ratas deambulan preferentemente muy próximas a las paredes de la jaula evitando el área central, lo que a su vez se refleja en la disminución del índice espacial “δ” en geometría fractal. Consecuentemente, todo esto conlleva una tendencia hacia un patrón más estereotipado y predecible conforme se incrementa la dosis, con un recorrido alrededor del perímetro en el que abundan los patrones rectos o lineales y en el que suele haber una dirección predominante (Gold et al., 1988; 1989; Paulus & Geyer, 1992). No obstante, no todos los estudios se muestran unánimes al respecto. De hecho algunos trabajos no encuentran alteraciones motoras tras la administración de MDEA (Hegadoren, Martin-Iverson, & Baker, 1995) o incluso de MDMA y MDEA (20 mg/kg, i.p.) (Bexis & Docherty, 2006). Por otra parte, se han hallado evidencias de que la molécula MDMA tiene propiedades quirales diferenciadas en cuanto a la actividad motora, ya que el dextroisómero S-(+)- MDMA y la forma racémica RS-(±)- MDMA son moléculas con un efecto estimulante motor más potente que el levoisómero (Glennon et al., 1988). Aunque no se han estudiado las propiedades quirales del MDEA respecto a su efecto locomotor, sí que se han detectado diferencias enantioselectivas en la metabolización de esta sustancia, la cual presenta al igual que la MDMA una mayor concentración del isómero S-(+)-MDEA en el cerebro (Meyer et al., 2002a). c) Efectos sobre el refuerzo La administración de MDMA, y en menor medida de MBDB, puede producir efectos reforzantes en ratas (Marona-Lewicka et al., 1996) y en monos rhesus (Fantegrossi, 2007), pero en este aspecto el efecto del MDEA es más confuso. Por una parte, ni la administración de MDEA racémica, ni la de ninguno de sus enantiómeros parece mostrar propiedades reforzantes en ratas evaluadas en el test de condicionamiento de preferencia de lugar (CPL) (Meyer et al., 2002b). Sin embargo, este compuesto sí muestra propiedades reforzantes en primates no humanos, que se autoadministraban esta sustancia Drogas emergentes 37 por vía intravenosa en un programa de reforzamiento fijo (Fantegrossi, 2007; Sannerud, Kaminski, & Griffiths, 1996). 38 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” 2.3. Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” 2.3.1. Clasificación La Parametoxianfetamina (PMA o M-AM) es una droga de síntesis o Research Chemicals (RCs) de la familia de las fenetilaminas sintéticas o anfetaminas de anillo sustituido (RSAs), y está clasificada como una sustancia de efecto empatógeno también con propiedades alucinógenas (Matsumoto et al., 2014). La estructura de la molécula de PMA es muy similar a la de otras fenetilaminas como el MDMA o éxtasis (Figura 2.5). La nomenclatura internacional IUPAC para la molécula de PMA es [(RS) 1 (pMehoxyphenyl)-2-aminopropane], pero también se encuentra en las bases de datos con otros nombres como “4-Methoxyamphetamine”, “p-Methoxyamphetamine”, “p-Methoxy-alpha-methylphenethylamine” o “1-p-Methoxyphenyl-2-propylamine”. Resulta de utilidad conocer el número de registro de la p-methoxyamphetamine (CAS RN: 64-13-1, o bien, 23239-32-9), para diferenciarlo de otra sustancia completamente distinta que es un promotor tumoral (phorbol-12-myristate-13-acetate, CAS RN: 1656129-8) y que se nombra con las mismas siglas. El PMA fue sintetizado por Alexander Shulgin cuando investigaba la relación entre la estructura y función de las anfetaminas de anillo sustituido sobre el funcionamiento del SNC (Shulgin, Sargent, & Naranjo, 1969). Este compuesto se ha introducido en la composición de las populares pastillas de éxtasis y es conocido popularmente con el nombre de “Dr. Death” por su frecuente presencia en casos de fallecimiento por consumo de éxtasis (Caldicott et al., 2003). Los primeros datos sobre la distribución del PMA constan en EEUU y Canadá a principios de la década de 1970 (Cimbura, 1974), después de una pausa reaparece en la década de los 90 en Australia, en donde llegó a ser Figura 2.5 a) Estructura general de las feniletilaminas, b) Molécula Parametoxianfetamina (PMA) o [4-Methoxyamphetamine], [p-Methoxyamphetamine] c) Molécula Metilenodioximetanfetamina (MDMA) o [3,4-methylenedioxy-N-methylamphetamine] Drogas emergentes 39 responsable de la mayoría de las muertes relacionadas con el consumo de éxtasis (Byard, James, Gilbert, & Felgate, 1999; Byard, Rodgers, James, Kostakis, & Camilleri, 2002; Caldicott et al., 2003; Chodorowski, Wiergowski, & Sein Anand, 2002; Felgate, Felgate, James, Sims, & Vozzo, 1998; James & Dinan, 1998; Ling, Marchant, Buckley, Prior, & Irvine, 2001; Martin, 2001). En la siguiente década, se registraron fallecimientos relacionados con el consumo de PMA en diversas zonas de Europa y Norteamérica, indicando una mayor propagación del uso de esta droga (Becker, Neis, Röhrich, & Zörntlein, 2003; Dams et al., 2003; Kraner, McCoy, Evans, Evans, & Sweeney, 2001; Lora-Tamayo, Tena, & Rodrıguez, 1997; Martin, 2001; Refstad, 2003), se han recogido datos mortales en Inglaterra, Bélgica, Alemania, Dinamarca (Becker et al., 2003; Galloway & Forrest, 2002; Johansen, Hansen, Müller, Lundemose, & Franzmann, 2003; Voorspoels et al., 2002), y más recientemente Taiwán (Lin, Liu, & Yin, 2007) e Israel (Lurie et al., 2012). Los primeros estudios sobre el potencial psicoactivo del PMA, indicaban que esta sustancia posee potentes propiedades psicotomiméticas o alucinógenas en humanos similares a las del LSD (Shulgin et al., 1969) y también en ratas sometidas a un modelo de evitación condicionada (Beaton, Smythies, Benington, Morin, & Clark Jr., 1968; Smythies et al., 1967; Winter, 1994). Además, el PMA también parece mostrar un perfil alucinógeno similar al de la mescalina en humanos (Shulgin et al., 1969), perros y monos, aunque no en roedores (Davis et al., 1978). Se ha señalado que la actividad alucinógena de esta sustancia podría estar determinada por la incorporación “para-metoxi”, es decir, el grupo metoxi presente en el carbono 4 del anillo fenil (Hitzemann, Loh, & Domino, 1971; Smythies et al., 1967). Por otra parte, el PMA es el análogo para-metoxi de la anfetamina y se puede sintetizar por metilación a partir de su metabolito primario, lo que ha llevado también a relacionar el PMA con las propiedades psicoestimulantes de estas sustancias y sugerir su posible implicación en la psicosis inducida por anfetamina (Smythies et al., 1967; Vaupel & Martin, 1977). Los estudios de discriminación de drogas 5 en roedores, indican sin embargo que el PMA tiene propiedades psicotrópicas que coinciden sólo en parte con ambas 5 Las técnicas de discriminación de drogas consisten en el entrenamiento del animal mediante reforzamiento para que discrimine los efectos de la administración de una determinada droga de la administración de suero salino, y una vez establecida la señal discriminativa de la droga de entrenamiento (DE), se procede a intentar sustituir el efecto de ésta con otros compuestos (DS). En la medida en que se 40 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” observaciones (ver apartado 2.3.5). En conjunto, el efecto del PMA en humanos se ha descrito como predominantemente alucinógeno, mientras que en animales no parece corresponderse completamente con ninguna de las dos categorías de efectos psicotrópicos, presentando un efecto muy similar al de sustancias entactógenas como la PMMA y un componente estimular común con el alucinógeno LSD, por lo que es común describirlo como como una sustancia entactógena con propiedades alucinógenas. 2.3.2. Farmacocinética  Absorción El PMA suele administrarse oralmente en forma de pastillas de éxtasis o en forma de cápsulas (Caldicott et al., 2003), aunque como aminas todas las RSAs son solubles en agua y alcohol por lo que pueden ser también inyectadas. Se ha sugerido que la dosis oral efectiva de PMA está entre los 50 y 80-100 mg (0.70 y 1.14-42 mg/kg), produciendo unos notables efectos alucinógenos en humanos y un aumento importante de la temperatura (Caldicott et al., 2003; EROWID, 2015; Shulgin, 1991). En otros animales, el PMA produce rápidos efectos en monos tanto si se administra por vía oral como parenteral, pero en estudios con ratas la conducta de autoadministración de esta sustancia es más eficiente por vía oral (Davis et al., 1978). A diferencia del MDMA, el PMA muestra una farmacocinética lineal simple en humanos, ratas, conejillos de indias y perros (Callaghan, 2008), pero no hay disponible mucha más información acerca de los diferentes parámetros farmacocinéticos in vivo de esta sustancia. Tan solo tenemos constancia de que el nivel en plasma de PMA en pacientes supervivientes varía entre 0.09-0.56 mg/L (Caldicott et al., 2003; Felgate et al., 1998. En un estudio reciente el pico incremento de serotonina se evidencia en los primeros 40 minutos, de forma similar al MDMA (40-60 minutos) (Golembiowska, Jurczak, Kaminska, Noworyta & Górska, 2015).  Distribución Se ha comprobado mediante estudios toxicológicos postmortem en humanos, que esta sustancia se distribuye ampliamente por varios órganos (hígado 8 mg/kg, riñones 4-5 mg/kg, bazo 4 mg/kg, cerebro 4 mg/kg, pulmones 3-4 mg/kg, corazón 2 mg/kg), así llegue a una sustitución completa y ésta se alcance en pocos ensayos, podemos suponer que los efectos de la droga de sustitución son similares a los de la droga de entrenamiento. Drogas emergentes 41 como por varios fluidos corporales (bilis 50 mg/kg, sangre 2-3 mg/kg, humor vítreo 2 mg/kg y en la orina <1 mg/kg) (Dams et al., 2003; Lurie et al., 2012; Martin, 2001). Además, sabemos que el PMA es un metabolito menor pero muy activo de la sustancia Parametoximetanfetamina (PMMA), y como tal se ha hallado distribuido por pulmones, cerebro, hígado y plasma (Rohanová & Balikova, 2009).  Metabolización Los estudios de la metabolización del PMA, mediante técnicas de espectrometría de masas de cromatografía de gases (GC-MS), espectrometría de masas de cromatografía de líquidos (LC-MS) o cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), indican que el PMA a diferencia del MDMA, MDEA y MBDB, tiene una ruta metabólica relativamente simple. Se ha comprobado que la ruta metabólica principal de la Parametoxianfetamina es la ODesmetilacion mediante isoenzimas del citocromo P450 en la mayoría de las especies de laboratorio (CYP2D1 en ratas, conejillos de indias) y en humanos (CYP2D6), proporcionando el metabolito “4-hidroxyamphetamine” (OH-AM, o POHA) del cual solo existe constancia de su neurotoxicidad en humanos (Caldicott et al., 2003; Kaminskas, Irvine, Callaghan, White, & Kirkbride, 2002; Kraner et al., 2001).  Excreción En ratas, el 70-80% del fármaco original se excreta como metabolito único en las 24 horas siguientes a la administración (Bach, Coutts, & Baker, 1999; Callaghan et al., 2007; Callaghan, 2008; Concheiro et al., 2007; Foster, Litster, & Lodge, 1991; Kitchen, Tremblay, & Andre, 1979). En humanos, la media de excreción de PMA por la orina fue del 6.7% de la dosis administrada en las primeras 24 horas, con un rango de 0.3-15%, puede que las variaciones en la excreción de PMA estén relacionadas con el PH de la orina (Schweitzer et al., 1971). Se ha indicado que es muy posible que la metabolización del PMA se encuentre inhibida en policonsumidores, prolongando así sus efectos (Bach Figura 2.6 Metabolito del PMA. 48 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death”  Efectos fisiológicos agudos del PMA en animales experimentales. Los primeros estudios sobre los efectos del PMA en animales iniciados en la década de los 70 informaban de alteraciones mixtas de la frecuencia cardiaca (taquicardias y bradicardias) en perros (Cheng, Long, Nichols, & Barfknecht, 1974; Vaupel & Martin, 1977), así como también de hipertermia aguda en ratas con un rango de dosis amplio, desde 10 mg/kg (Menon et al., 1976) hasta en dosis cercanas a la letal (60.7 mg/kg ≈ LD50) (Nichols et al., 1975). Estos trabajos iniciales no realizan un registro básico de la temperatura ambiente (Callaghan, 2008). Sin embargo, estudios más recientes han puesto de relieve que para determinar los efectos del PMA y el de otras alkilanfetaminas, es necesario tener en cuenta la temperatura ambiental junto con la dosis de sustancia administrada. En ratas expuestas a una temperatura ambiente alrededor de 20ºC, la administración de diferentes dosis de PMA (5-20 mg/kg) es capaz de inducir bradicardia, una leve disminución dosis dependiente de la presión sanguínea (Irvine, Toop, Phillis, & Lewanowitsch, 2001) y de la temperatura corporal (Daws et al., 2000). Estos datos parecen contradecir los obtenidos en humanos consumidores de PMA, y también parecen alejarse de los efectos simpaticomiméticos del MDMA como estimulante cardiaco (arritmias y taquicardias, vasoconstricción, aumento dosis dependiente de la presión arterial y tasa cardiaca) en roedores (Bexis et al., 2004; Fitzgerald & Reid, 1994; Gordon et al., 1991), y humanos (Capela et al., 2009; Vollenweider et al., 1998). Sin embargo, cuando se administra una dosis elevada de PMA (20 mg/kg) manteniendo al animal en una temperatura ambiente también elevada (30ºC), los resultados varían mostrando un claro incremento de la frecuencia cardiaca y una curva térmica inicialmente descendente seguida de una destacada hipertermia. No obstante, aunque la temperatura ambiente es un factor importante en la termorregulación, no hay una clara delimitación térmica que sea determinante. Esto se observa en otros experimentos, en los que una dosis intermedia de PMA o MDMA (10 mg/kg) tiende a elevar la curva de la temperatura corporal de forma no significativa cuando se mantiene al roedor en una temperatura ambiente de 22ºC (Freezer et al., 2005), mientras que también hay evidencias de que esta dosis produce una hipertermia significativa tanto a 22ºC como a 30ºC ambiente (Hewton et al., 2007; Stanley et al., 2007). En consonancia, en un estudio previo con MDMA, ya se había advertido que pequeñas variaciones en la temperatura ambiente son capaces de provocar notables Drogas emergentes 49 cambios en la neurotoxicidad e hipertermia inducida por esta sustancia (Malberg & Seiden, 1998). Por otra parte, aunque el efecto hipertérmico del PMA y del MDMA sea similar, parece existir una particularidad conductual clave. En diversos estudios, se ha señalado que tras la administración de PMA, las ratas no activan las conductas básicas de regulación de temperatura buscando lugares más frescos y tienden a permanecer preferentemente en ambientes templados lo que supone un factor de riesgo añadido para el potencial tóxico del PMA (Jaehne et al., 2005; Jaehne, Salem, & Irvine, 2007; Jaehne, 2010; Stanley et al., 2007). En conjunto estos estudios indican que una temperatura ambiental elevada constituye un factor de riesgo añadido tras el consumo de estas sustancias, y en particular la disminución de las conductas de regulación de la temperatura corporal que parece inducir el PMA, hace que se trate de un compuesto de riesgo especialmente en contextos calurosos. 50 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” 2.3.5. Efectos conductuales del PMA a) Efectos sobre la discriminación de drogas y sobre el refuerzo. Resulta bastante complejo caracterizar el perfil conductual que produce el PMA. Se ha sugerido que en humanos, el PMA posee unas propiedades psicotomiméticas o alucinógenas similares a las del LSD, así como una potencia cinco veces mayor que la mescalina (Shulgin et al., 1969). Algunos estudios en animales también indican que esta sustancia podría inducir un efecto similar al del LSD, por ejemplo, hay evidencias de que el PMA (1-3 mg/kg) posee actividad alucinógena en ratas en un modelo de alucinación basado en patrones de respuesta de evitación condicionada (Beaton et al., 1968; Smythies et al., 1967; Winter, 1994). En la misma línea, se ha comprobado que una dosis algo mayor de PMA (2-6 mg/kg), es capaz de anular completamente la conducta de presionar la palanca y facilitar la aparicición de conductas extrañas tales como caminar hacia atrás (efecto frecuente de la mescalina), mantener la posición de verticalidad golpeando en el aire a modo de boxeo y una respuesta de sobresalto exagerada (Smythies et al., 1967). La presencia de actividad alucinógena parece que viene determinada por la incorporación del grupo metoxi en el carborno cuarto del anillo fenil (Hitzemann et al., 1971; Smythies et al., 1967). En los estudios de discriminación de drogas hay evidencias de que el PMA no sustituye el estímulo discriminativo generado por el alucinógeno DOM en ratas (Glennon, Young, & Hauck, 1985; Glennon, Ismaiel, Martin, Poff, & Sutton, 1988). Sin embargo, respecto al LSD se logra una curiosa señal discriminativa intermedia 6 , que consiste en una sustitución parcial mutua de la señal PMA-LSD en torno al 50% (Winter, 1984); por lo que, aunque dichas señales interoceptivas sean considerablemente distintas, los autores indican que pueden tener un componente estimular común cuya naturaleza es una cuestión aún no esclarecida. El bloqueo que produce el antagonista serotoninérgico pizotilina, tanto de la señal del LSD como de los efectos intermedios de la sustitución con PMA en ratas entrenadas con LSD, sugiere que este componente común puede ser de naturaleza serotoninérgica. Sin embargo, la ausencia de efecto de la pizotilina en ratas entrenadas con PMA, indica que el componente serotoninérgico de la acción del PMA no 6 (Winter, 1984) DE: LSD (0.1 mg/kg). DS: PMA (1 mg/kg, sustitución del 48%) (Winter, 1984) DE: LSD (0.1 mg/kg). DS: PMA (3 mg/kg, sustitución del 75% enla mitad de los sujetos). (Winter, 1984) DE·: PMA (3 mg/kg). DS: LSD (0.1 mg/kg, sustitución del 51%; 0.3 mg/kg, 45%). Drogas emergentes 51 es esencial para la señal inducida por esta sustancia (Winter, 1984; Winter, 1994; Young & Glennon, 1986). Por otra parte, el PMA es el análogo para-metoxy de la anfetamina y se puede sintetizar por metilación a partir de su metabolito primario, lo que ha llevado también a relacionar el PMA con las propiedades psicoestimulantes de estas sustancias y sugerir su posible implicación en la psicosis inducida por anfetamina (Smythies et al., 1967; Vaupel & Martin, 1977). En estudios de discriminación de drogas, el PMA presenta propiedades psicotrópicas que o no coinciden, o bien sólo coinciden en parte con las propias de los estimulantes clásicos. Se ha comprobado que en roedores, el preparado racémico RS(±)- PMA 7 es capaz de sustituir parcialmente la señal interoceptiva generada por la danfetamina, pero para ello es necesario una dosis de 2 a 4 veces mayor y esta sustitución no se consigue en todos los sujetos (Glennon et al., 1985; Glennon et al., 1988; Huang & Ho, 1974). Otros trabajos concluyen que el PMA racémico no posee propiedades discriminativas de tipo anfetamínico 8 en ratas (Corrigall, Robertson, Coen, & Lodge, 1992), ni en monos rhesus (Woolverton & English, 1997). Tampoco los isómeros S(+)- PMA ni R(-)-PMA presentan propiedades anfetamínicas en ratas, tan solo la S(+)-PMA (0.75 mg/kg) es capaz de sustituir parcialmente la señal anfetamínica (1 mg/kg) con un máximo de efectividad del 33%, mientras que dosis ligeramente mayores de PMA no generalizan la señal en absoluto (Dukat, Young, & Glennon, 2002). En este sentido, se ha indicado que el PMA, a diferencia de la anfetamina, no produce conducta estereotipada en ratones (Menon et al., 1976; Tseng et al., 1976). Por otra parte, la conducta cuidado corporal o “grooming” se disminuye habitualmente en ratas tratadas con cocaína o metanfetamina; sin embargo tras la administración de PMA (40µm/kg; equivalente a 6.6 mg/kg), las ratas parecen mantener intacta esta conducta de autocuidado (Jaehne et al., 2007). Por último, tanto el R(-)-PMA como el entactógeno MBDB son capaces de generalizar la señal producida por el entrenamiento con el entactógeno PMMA (análogo N-metil7 (Huang, 1974) DE: d-anfetamina (0.8 mg/kg); DS: PMA (2 mg/kg, sustitución parcial “SP” 78%) (Glennon, 1985) DE: d-anfetamina (0.62 mg/kg) ; DS: PMA (2 mg/kg, SP 62% a los 15minutos), (Glennon, 1985) DE: d-anfetamina (0.62 mg/kg) ; DS: PMA (2.25 mg/kg; SP 89% a los 5 minutos), (Glennon, 1988) DE: d-anfetamina (1 mg/kg), DS: PMA (2.25 mg/kg, SP 83%) 8 (Corrigall, 1992) DE: d-anfetamina (1 mg/kg). DS: PMA (3 mg/kg; No sustitución 31%). (Woolverton, 1997) DE: d-anfetamina (0.69 mg/kg) DS: PMA (3 mg/kg). No sustitución (monos rhesus) 52 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” PMA) (Dukat et al., 2002; Rangisetty, Bondarev, Chang-Fong, Young, & Glennon, 2001). El efecto de estas sustancias es muy similar al del MDMA, pero sin las propiedades estimulantes de ésta (Glennon, Young, Dukat, & Cheng, 1997; Glennon & Young, 2002). Por lo que, es posible que el isómero R(-)-PMA pueda producir en humanos efectos similares a los del MDMA, pero sin efectos de tipo anfetamínico (Dukat et al., 2002). En conjunto, el efecto del PMA en humanos se ha descrito como predominantemente alucinógeno, mientras que en animales esta sustancia presenta un efecto muy similar al de sustancias entactógenas como la PMMA y un componente estimular común con el alucinógeno LSD, sin una similitud estimular con otros alucinógenos o estimulantes. Por último, señalar que los pocos datos disponibles sugieren que el PMA no tiene propiedades reforzantes en ratas (Corrigall et al., 1992). b) Efectos locomotores Los escasos estudios realizados con PMA sugieren que esta sustancia tiene un efecto hiperlocomotor en ratas menor que el éxtasis (Daws et al., 2000; Jaehne et al., 2005; Romero et al., 2006) o inapreciable en rata (Bustamante, Díaz-Véliz, Paeile, ZapataTorres, & Cassels, 2004; Hegadoren et al., 1995; Martin-Iverson et al., 1991), o en ratón (Glennon et al., 1988; Hitzemann et al., 1971). Incluso se ha indicado que en ratones albinos, el PMA podría provocar déficits en la conducta motora, a diferencia del aumento de la actividad motora descrito para el MDMA o la d-anfetamina (Hatoum & Davis, 1978). Los estudios en ratas parecen indicar que los discretos cambios que provoca el PMA sobre la actividad locomotora no parecen depender demasiado de la temperatura ambiental en la que se encuentra el individuo, contrastando con el notable efecto hipertérmico que induce esta sustancia. En concreto, hay evidencias de que un rango amplio de dosis de PMA (5, 10, 15 y 20 mg/kg) no tiene efectos sobre la actividad motora de la rata a 20ºC ambiente, y provoca un efecto hiperlocomotor bastante débil cuando el sujeto se encuentra a 30ºC. Este efecto hiperlocomotor modesto se observa sobre todo con las dosis altas de PMA, y contrasta con la gran activación motora que induce el MDMA en ambas temperaturas ambiente (Daws et al., 2000). Asimismo, se ha descrito que el efecto hiperlocomotor que exhiben las ratas tratadas con una dosis moderada de PMA (10 mg/kg), aún siendo algo más notable que en el experimento anterior, solo se aprecia durante la primera media hora (periodo de confinamiento a 30ºC), y luego se va Drogas emergentes 53 reduciendo hasta alcanzar niveles similares a los del grupo control en la siguiente media hora en la que se permite movilidad al sujeto. Esto sugiere, de nuevo que el PMA provoca en ratas un perfil hiperlocomotor muy moderado en comparación con la MDMA, sustancia que prolonga notablemente la actividad motora incluso una hora después del periodo de confinamiento (Jaehne et al., 2005). Como se ha indicado en apartados anteriores, el tratamiento con PMA parece inducir en la rata una cierta preferencia por los ambientes templados, lo que ha llevado a sugerir que las conductas básicas de regulación de temperatura tales como la búsqueda o exploración de lugares frescos podrían encontrarse alteradas (Jaehne et al., 2005; Jaehne et al., 2007; Jaehne, 2010; Stanley et al., 2007). No obstante, teniendo en cuenta los estudios citados, este posible efecto hipoexploratorio no parece que se deba a un déficit motor. De hecho, algunos estudios obtienen que el PMA (5-10 mg/kg) aumenta de forma dosis dependiente la actividad locomotora y la actividad mioclónica de la rata (Menon et al., 1976; Tseng et al., 1978). De forma semejante, en un estudio más reciente sobre el efecto de diversas RSAs sobre la conducta rotacional de ratas sometidas a una lesión unilateral de los ganglios basales mediante 6-hidroxidopamina (6-OHDA); se muestra que una dosis baja de PMA o de MDMA (2 mg/kg) produce un aumento significactivo de la conducta rotacional ipsilateral pero de corta duración y de baja intensidad, junto con síntomas serotoninérgicos como hipocinesia, exoftalmos, rigidez e hiperreflexia de las patas anteriores y reducción de la actividad exploratoria. Sin embargo, la dosis de 10 mg/kg de MDMA provoca una respuesta rotacional ipsilateral de mayor duración (> 3 h.), que parece relacionarse con una mayor eficacia del MDMA para liberar dopamina en el hemisferio intacto, en comparación con el PMA (Romero et al., 2006). Por otra parte, también se ha observado que la administración de PMA (2, 8 y 32 µmol/kg; es decir, 0.4, 1.6 y 6.4 mg/kg, respectivamente) no tiene efectos relevantes sobre la actividad locomotora de la rata (Hegadoren et al., 1995; Martin-Iverson et al., 1991). En esta misma línea, se ha observado que treinta minutos después de la administración de 8 mg/kg de PMA las ratas reducen de forma significativa la conducta de cuidado corporal, pero no muestran alteración de la conducta motora espontánea, ni la actividad exploratoria vertical (rearings), ni de la respuesta de evitación condicionada, así como tampoco se aprecian respuestas estereotipadas (olisquear, lamer y morder repetitivamente) (Bustamante et al., 2004). Sin embargo, se ha descrito que dosis pequeñas de PMA (3 o 10 mg/kg) no producen un incremento de la actividad motora de la rata, pero dosis 54 Parametoxianfetamina (PMA) “Dr. Death” mayores (30 mg/kg) si obtienen incrementos de la actividad locomotora.(Tseng & Loh, 1974). La investigación de los efectos motores del PMA en ratones es si cabe más escasa. Congruentemente con los estudios anteriores, en ratones tan sólo se muestra un aumento de la actividad motora y de la actividad mioclónica con dosis altas de PMA (30 mg/kg). Por el contrario, el uso de una dosis inferior de PMA (1, 3, 10 mg/kg) no provoca alteraciones en la actividad motora, aunque muestre una tendencia no significativa descendente (Glennon et al., 1988; Hitzemann et al., 1971; Tseng & Loh, 1974). Sin embargo, hay evidencias de que en ratones machos albinos ICR la administración de PMA (10 mg/kg) reduce la actividad motora, independientemente de su condición como agrupado o aislado, un efecto motor inhibitorio que se acentúa con el pretratamiento de depletores monoaminérgicos y que resulta opuesto al observado con la MDMA o la danfetamina (Hatoum & Davis, 1978). Por lo que estos datos indican, que en ratones el PMA podría tener efectos diferentes en cepas distintas. Drogas emergentes 55 2.4. Efectos de las RSAs empatógenas sobre la conducta agonística y las conductas relacionadas con la ansiedad A diferencia del MDMA, en la actualidad no hay disponibles estudios acerca de cómo influyen las feniletilaminas sintéticas MBDB, MDEA o PMA en la conducta agonística del ratón, ni tampoco en las conductas relacionadas con la ansiedad. En este aspecto, la MDMA es la única RSAs de tipo empatógeno en la que se han estudiado estos efectos conductuales emocionales, en modelos animales de agresión y ansiedad; por lo que en este apartado, solo es posible exponer una revisión de estos efectos del MDMA a modo de marco referencial. 2.4.1. Efectos del MDMA sobre la conducta agonística La administración de MDMA altera el perfil conductual de roedores evaluados en modelos de agresión. La administración aguda de esta sustancia produce una reducción de las conductas agonísticas agresivas. No obstante, este efecto suele describirse como inespecífico, ya que se acompaña de cambios en otras conductas defensivas y de exploración social. a) Efectos sobre la conducta social El MDMA produce un incremento de la sociabilidad y proximidad tanto en humanos como en animales. Los consumidores de éxtasis informan de una mayor facilidad para la proximidad social y de un aumento de los sentimientos de empatía, amor y bienestar, que son sin duda los efectos más buscados al consumir esta sustancia no en vano conocida como “love drug”. Estos efectos prosociales también se han observado en encuentros agonísticos entre roedores. En ratones aislados con un perfil agresivo elevado, la administración aguda de MDMA (2.5 y 10 mg/kg) reduce las conductas agresivas y aumenta las conductas de investigación social tales como olisquear, perseguir y subirse sobre el oponente durante el test de interacción social, sin embargo, este efecto no se muestra en dosis elevadas (30 mg/kg) ni en ninguna de las dosis empleadas en ratones no agresivos (Machalova, Slais, Vrskova, & Sulcova, 2012). En este sentido, estudios con ratones adolescentes también encuentran resultados mixtos dependiendo de la dosis, de forma que se detecta un aumento de investigación social solo a dosis baja de MDMA (5 mg/kg) (Daza-Losada et al., 2009). En ratas, existen evidencias más consistentes que 56 Efectos del MDMA sobre la conducta agonística respaldan la hipótesis del MDMA como facilitador de la interacción social, aumentando el tiempo en conductas de proximidad como tumbarse junto al oponente “adjacent lying” con dosis de 5 mg/kg de MDMA (Andó et al., 2006; Morley & McGregor, 2000; Morley, Arnold, & McGregor, 2005; Thompson, Callaghan, Hunt, Cornish, & McGregor, 2007), mientras que disminuye el olisqueo anogenital típico en la exploración social de congéneres desconocidos (Morley et al., 2005). Los correlatos neuronales indican que el efecto sobre la conducta social de la administración aguda de MDMA se encuentra mediado por los receptores serotoninérgicos 5-HT1A y posiblemente 5-HT(2B/2C), aunque el bloqueo de éstos últimos además de prevenir el aumento de la interacción social causa una notable tigmostasis (hiperactividad en la periferia y paredes del recinto) (Morley et al., 2005). En los últimos años se ha implicado a la oxitocina, un neuropéptido implicado en la regulación de las conductas filiativas, como mediador de los efectos prosociales del éxtasis. Al parecer, la señal interoceptiva del MDMA y la producida por un análogo de la oxitocina han resultado ser muy similares en el paradigma de discriminación de drogas (Broadbear, Tunstall, & Beringer, 2011). Estudios inmunohistoquímicos indican que el MDMA estimula las neuronas del núcleo supraóptico y paraventricular del hipotálamo que contienen oxitocina (Thompson et al., 2007), así como que la actividad de estas neuronas se encuentra mediada precisamente por receptores 5-HT1A (Hunt, McGregor, Cornish, & Callaghan, 2011). También se ha demostrado recientemente la implicación de los receptores de vasopresina V1Ars en la regulación de la conducta social inducida por éxtasis (Ramos et al., 2013). Resulta interesante señalar en este aspecto, que un contexto social enriquecido produce una mayor actividad de estas regiones tras el consumo de MDMA que una situación de aislamiento, lo que apoya la participación de la oxitocina en los efectos prosociales del éxtasis, y probablemente también las propiedades reforzantes de esta sustancia modulando el valor incentivo del estímulo social (Thompson, Hunt, & McGregor, 2009). Sin embargo, se han descrito también resultados opuestos a los anteriores, es decir, la reducción de las conductas de investigación social en encuentros agonísticos en ratones machos aislados, tratados con MDMA con dosis que van desde 5 a 20 mg/kg (Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 1999)y en ratones aislados de perfil tímidono agresivo (2.5, 10, 30 mg/kg) (Machalova et al., 2012). Además, ratones adolescentes tratados con una dosis alta de éxtasis (20 mg/kg) reducen la conducta social de forma Drogas emergentes 57 significativa, a diferencia de los resultados obtenidos con dosis bajas (Daza-Losada et al., 2009). En este mismo sentido, también se ha observado una reducción de la interacción social en ratas adultas tratadas con con una dosis aguda de 5 mg/kg de MDMA Y en ratas adolescentes, el pretratamiento subcrónico (5 mg/kg, cuatro veces durante dos días, 8 semanas antes de la prueba) produjo la disminución de la conducta de investigación social (Bull, Hutson, & Fone, 2004). Resulta probable que en muchos de estos estudios, tanto el contexto social cuya importancia se ha señalado anteriormente, como el uso de una dosis excesiva de MDMA, hayan sido factores claves en la obtención de este nivel bajo de interacción.Así, algunos estudios han descrito que el tratamiento con dosis altas y/o subcrónica de MDMA en ratas produce una reducción duradera del nivel de interacción social con una atenuación de los efectos prosociales de esta sustancia (Andó et al., 2006; Thompson, Callaghan, Hunt, & McGregor, 2008), algo que también se ha observado en conductas de juego social en ratas adolescentes (Homberg, Schiepers, Schoffelmeer, Cuppen, & Vanderschuren, 2007). b) Efectos sobre la conducta agonística agresiva Existen evidencias de que la administración aguda MDMA produce una disminución de la conducta agresiva (amenaza y ataque) sin incremento de la inmovilidad en roedores. Como así indican diversos estudios en ratones machos adultos en un amplio rango de dosis: 3, 6, 10 mg/kg de MDMA en el test residente-intruso (Miczek & Haney, 1994), 520 mg/kg (Navarro & Maldonado, 1999) y 8-15 mg/kg de MDMA (Maldonado & Navarro, 2001b) en el modelo de agresión inducida por aislamiento, así como tras la administración de 2.5 mg/kg de MDMA en ratones machos de perfil agresivo elevado sometidos al test de interacción social (Machalova et al., 2012). Por otra parte, también hay constancia de una disminución de las conductas agresivas en ratas tras la administración aguda de MDMA con dosis de 1.25-5 mg/kg (Morley & McGregor, 2000) y 15 mg/kg (Andó et al., 2006; Kirilly et al., 2006; Kirilly, 2010). Tras la administración subcrónica e intermitente de MDMA en ratones durante una semana, no se aprecian efectos de tolerancia o sensibilización a los efectos antiagresivos de esta droga (Navarro & Maldonado, 2004). Esta ausencia de tolerancia del MDMA, contrasta con la tolerancia descrita tras la administración subcrónica de d-anfetamina (Moro, Salvador, & Simon, 1997), un compuesto estructuralmente similar al MDMA. El análisis temporal del encuentro agonístico entre ratones, indica que el MDMA (3 mg/kg) disminuye rápidamente la frecuencia de ataques desde el primer minuto y de 64 Efectos del MDMA sobre la conducta relacionada con la ansiedad factor determinante en las diferencias halladas en el EPM (Palenicek et al., 2005). Por otra parte, en ratones tratados con 10 mg/kg de MDMA también se observa un aumento del tiempo en los brazos abiertos del EPM test y otros parámetros que correlacionan con un efecto ansiolítico en el test del campo abierto (Ferraz De Paula et al., 2011); sin embargo, estos autores concluyen que el MDMA parece tener un efecto más bien ansiogénico tras analizar otros tet conductuales y diversos correlatos fisiológicos. En conjunto, este tipo de resultados mixtos y dependiente de la dosis, se pueden interpretar de dos formas muy distintas, la primera posibilidad es que el MDMA tenga un efecto bifásico sobre la ansiedad en roedores de tal forma que dosis altas reducen la ansiedad, mientras que las dosis menores parecen tener un efecto más bien ansiogénico en roedores. Una segunda explicación es que la conducta de “freezing” o respuesta de miedo extrema paralizante, podría estar enmascarando los resultados del test EPM en aquellos animales que acumulasen tiempo en los brazos abiertos del laberinto por miedo a moverse en un contexto aversivo, por lo que en este caso el MDMA estaría induciendo con dosis elevadas un estado ansiogénico considerable y no fácilmente detectable en dosis elevadas de MDMA (Maldonado, 2000; Steimer, 2002). b) Efectos ansiogénicos Aunque hay algunos estudios que sugieren que el MDMA reduce la conducta de ansiedad en roedores, hay evidencias más numerosas y consistentes de que esta sustancia parece producir un perfil completamente opuesto. Una de las aproximaciones experimentales que apoyan la hipótesis de que el MDMA induce un estado ansiogénico, proviene de trabajos que documentan un aumento general de la locomoción junto con una reducción de conductas exploratorias, tales como el olisqueo (sniffing) y la exploración vertical (rearing) (Callaway et al., 1991; Callaway & Geyer, 1992; Compan, ScearceLevie, Crosson, Daszuta, & Hen, 2003; Gold et al., 1988; Gold & Koob, 1989; Paulus & Geyer, 1991; Paulus & Geyer, 1992; Piper et al., 2008). Otras evidencias de los efectos ansiogénicos del MDMA en roedores, provienen de trabajos que emplean el modelo de ansiedad del “Laberinto elevado en cruz” . De esta forma, hay diversos estudios en ratones que informan de las propiedades ansiogénicas del éxtasis en el laberinto elevado en cruz, con administraciones agudas de 4 mg/kg (Lin et al., 1999), 8 mg/kg (Navarro & Maldonado, 2002); así como con la administración subcrónica de MDMA (1 y 8 mg/kg; durante 5 días) (Navarro & Maldonado, 2002). Drogas emergentes 65 También hay pruebas de los efectos ansiogénicos de esta sustancia en ratas expuestas al test EPM. Por ejemplo, Bhattacharya et al. (1998), indicaron que las ratas tratadas con MDMA (5, 10 mg/kg) presentaban una conducta en el test EPM, muy similar a la que produce la Yohimbina, un conocido compuesto ansiogénico. En la misma línea, Morley & McGregor (2000), demostraron que la administración aguda de MDMA (1.255 mg/kg) produce un efecto ansiogénico en la rata, de forma similar, a los resultados obtenidos más tarde con una dosis de 7 mg/kg de MDMA en ratas (Ho et al., 2004), y también de forma semejante al efecto ansiogénico que produjo la administración aguda de tres dosis de 10 mg/kg de MDMA en 6 horas (Sumnall, O'Shea, Marsden, & Cole, 2004a). Asímismo hay constancia de que la administración subcrónica de MDMA (1.25, 2.5 y 5 mg/kg/día, durante una semana), especialmente la dosis intermedia, induce un estado ansiogénico en la rata evaluada en el test EPM (Jahanshahi, Nikmahzar, Babakordi, Khosravi, & Seid-Hosseini, 2013). En el test del “Campo Abierto”, un modelo conductual para la evaluación de la ansiedad de tipo exploratorio, la reducción de los cruces por el centro de la árena y de la exploración vertical (rearing), asi como el aumento de las defecaciones o de la inmovilidad, son parámetros que indican un perfil ansiogénico en ratas adultas tratadas con 5 o 10 mg/kg de MDMA (Bhattacharya et al., 1998). En otras pruebas exploratorias, como el “Test de preferencia Luz/Oscuridad”, la reducción de la exploración vertical y de transiciones hacia el área luminosa, indican igualmente un perfil ansiogénico en ratones con MDMA (8 y 15 mg/kg) (Maldonado, 2000) y en ratas adolescentes (Kolyaduke & Hughes, 2013). En la misma línea, la reducción de la exploración de los agujeros “head-dipping” y de zonas elevadas “rearing” en el test “Hole-Board”, también corrobora los efectos ansiogénicos del MDMA (10 mg/kg) en ratones y ratas (Ferraz De Paula et al., 2011; Piper et al., 2008). En el test de emergencia, el incremento de la latencia de salida y del tiempo que permanece oculto el animal, así como la reducción del número de salidas, son también indicadores de un aumento de ansiedad en ratas tratadas con éxtasis (Clemens et al., 2004; Morley & McGregor, 2000; Morley et al., 2001; Morley et al., 2005). Otro prueba muy usada en baterías para evaluar la ansiedad, es el “Test de interacción social” entre dos roedores, generalmente en un contexto no familiar. En este modelo se recogen determinadas conductas sociales como el sniffing (olfateo), grooming (aseo), following (seguimiento), kicking (golpeo), boxing, wrestling (lucha), jumping on (salto), 66 Efectos del MDMA sobre la conducta relacionada con la ansiedad crawling (echarse sobre el congénere) y adjacent lying (tumbarse junto al congénere), que pueden inhibirse cuando se incrementa la ansiedad. Además, como se ha visto en el apartado anterior, la evaluación etológica completa en el modelo de agresión inducida por aislamiento también es sensible a la alteración de las conductas de ansiedad. En esta línea basada en la evaluación de la interacción social, los trabajos realizados con ratones machos indican que la administración de 5-20 mg/kg de MDMA parace incrementar la ansiedad de los sujetos (Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 1999; Navarro et al., 2004). Lo que también se ha observado en tratamientos agudos en ratas (5 y 10 mg/kg de MDMA) (Bhattacharya et al., 1998) y después de diferentes pretratamientos subcrónicos en sujetos adultos y preadolescentes (5 mg/kg de MDMA durante dos dias, entre 6-12 semanas antes del test) (Bull et al., 2004; Gurtman et al., 2002; Morley et al., 2001). Por último, en el modelo de “Evitación del olor aversivo”, un modelo de ansiedad basado en la exposición a un predador potencial, se ha demostrado que la administración de MDMA en ratas y ratones (5 y 10 mg/kg, respectivamente) es capaz de incrementar la ansiedad provocando una mayor evitación de la zona aversiva y la reducción de las conductas de riesgo (Ferraz De Paula et al., 2011; Morley & McGregor, 2000). c) Efectos a largo plazo sobre la ansiedad Existe también una falta de concordancia respecto a los efectos a largo plazo del MDMA sobre las conductas relacionadas con la ansiedad de los roedores. En ratas adultas, la administración subcrónica moderada o elevada de MDMA puede incrementar el nivel de ansiedad 9 a largo plazo (de 2 semanas a 3 meses) (Gurtman et al., 2002; Morley et al., 2001), sin que se aprecien diferencias entre ambos sexos (Walker et al., 2007). Por otra parte, también hay evidencias de que la administración aguda de MDMA puede producir un perfil ansiogénico a medio-largo plazo en ratas (Cunningham, Raudensky, Tonkiss, & Yamamoto, 2009), sin embargo, en otro estudio se describe un efecto Tipo de administración de MDMA aguda (A), subcrónica (S), intermitente (I) y test conductual: 9 Gurtman (2002): 5 mg/kg en ratas; (S): 4 dosis al día durante 2 días. Test EPM 9 semanas después. Walker (2007): 15 mg/kg en ratas de ambos sexos; (S): 2 dosis al día durante 4 días. Test EPM 2 semanas. Morley (2001): 5 mg/kg en ratas; (S) régimen alto: 4 dosis al día durante dos días; régimen moderado: 1 dosis al día durante dos días. Test EPM tres meses más tarde. Cunningham (2009): 7.5 mg/kg en ratas. (A). Test EPM 21 días después. Drogas emergentes 67 ansiolítico 10 a largo plazo (Mechan et al., 2002b). Contrariamente a estas dos perspectivas, también hay constancia de que la administración de MDMA (generalmente aguda) no altera la ansiedad de las ratas a largo plazo 11 (Cassel et al., 2005; Ho et al., 2004; Mechan et al., 2002b; Sumnall, O'Shea, Marsden, & Cole, 2004b). En la última década, la atención se ha centrado también en los efectos a largo plazo del MDMA sobre la ansiedad de sujetos adolescentes, intentando simular en animales el consumo de fin de semana humano, mediante diversos patrones administración agudo, subcrónico y también intermitente. De esta forma, hay estudios que muestran que en roedores adolescentes, el MDMA puede producir un efecto ansiogénico 12 a largo plazo independientemente de que la administración sea aguda (Faria et al., 2006), subcrónica (Bull et al., 2004; Kolyaduke & Hughes, 2013), o intermitente (Rodriguez-Arias et al., 2011). Por otra parte, otros trabajos parecen indicar de forma opuesta, que una pauta de administración intermitente (Kindlundh-Högberg, Schiöth, & Svenningsson, 2007) o subcrónica de MDMA (Piper & Meyer, 2004), genera un estado ansiolítico 13 en roedores adolescentes. Mientras que muchos otros autores no hallan alteraciones en el nivel de ansiedad 14 tras la administración aguda o intermitente de MDMA (Kindlundh-Högberg et al., 2007), o incluso subcrónica en roedores adolescentes (Daza-Losada, RodriguezArias, Maldonado, Aguilar, & Minarro, 2008; Piper, Fraiman, & Meyer, 2005). Los diferentes resultados obtenidos probablemente se deban a diferencias metodológicas, incluyendo test conductuales, dosis y regímenes de administración del MDMA, como puede apreciarse en el detalle del pie de página. En un estudio reciente, se ha observado un efecto conductual ansiolítico del MDMA tan sólo en ratones que presentan un perfil bajo de búsqueda de novedad, por lo que el efecto del MDMA a largo 10 Mechan (2002): 12.5 mg/kg en ratas, (A). Test O.F. 80 días después. 11 Mechan (2002): 12.5 mg/kg en ratas, (A). Test O.F. 8 ó 29 días después. Ho, Y.J (2004): 7.5 mg/kg en ratas, (A), Test EPM 12 días después. Sumnall (2004): 10 mg/kg en ratas, (A): 3 dosis en 6 horas. Test EPM 14 días después Cassel (2005): 10 mg/kg en ratas, (S): 1 dosis al día durante 4 días. Test EMP test 19 días después 12 Faria (2006): 10m/kg en ratas, (A): 3 dosis en 6 horas. Test EPM 10 días después. Bull (2004): 5 mg/kg en ratas, (S): 4 dosis en 4 horas, durante 2 días. Test de interacción social 55 días. Rodríguez-Arias (2011): 20 mg/kg en ratones, (I): 8 dosis en 2 semanas (2 dosis/ días 1, 2, 9 y 10).Test EPM. Kolyaduke (2013): 10 mg/kg en ratas, (S): 1 dosis durante 10 días. Test OF. 13 Kindlunh (2007): 5 mg/kg en ratas, (I): 12 dosis en un mes (3 dosis/ días 1, 8, 15 y 22). Test O.F. Piper (2004): 10 mg/kg en ratas, (S): 2 dosis al día durante 5 días. Test EPM. 14 Kindlunh (2007): 5 mg/kg en ratones, (A): 3 dosis en nueve horas. Test O.F. Daza-Losada (2009): 5, 10 ó 20 mg/kg en ratones, (S): 2 dosis al día durante tres días, EPM test. 68 Efectos del MDMA sobre la conducta relacionada con la ansiedad plazo sobre la ansiedad podría depender además de variables individuales como el nivel de búsqueda de novedad previo del sujeto (Rodríguez-Arias et al., 2015). Por último, los correlatos neuronales indican que la administración de MDMA en roedores, aumenta la actividad c-Fos en la amígdala central y basolateral (Navarro et al., 2004), una región íntimamente ligada al procesamiento del miedo y la ansiedad. Además, el MDMA produce a largo plazo una depleción serotoninérgica que se observa también en áreas como la amígdala, hipocampo y estriado (Cunningham et al., 2009; Gurtman et al., 2002; McGregor et al., 2003; Walker et al., 2007), acompañada de una menor densidad de astrocitos en el hipocampo (Jahanshahi et al., 2013), así como de un incremento del nivel de dopamina estriatal y del nivel de corticosterona (Ferraz De Paula et al., 2011). Por lo que, en conjunto los correlatos neuronales que se han realizado en diversos estudios conductuales de la ansiedad a corto y largo plazo, parecen ser congruentes con la hipótesis de que el MDMA incrementa el nivel de ansiedad de los sujetos. 3. AGRESIÓN Y ANSIEDAD Psicobiología de la agresión y la ansiedad 71 3. PSICOBIOLOGÍA DE LA AGRESIÓN Y LA ANSIEDAD La ansiedad y la agresión se consideran emociones universales íntimamente ligadas a los recursos de supervivencia del individuo, cuyos orígenes filogenéticos se remontan a los del propio reino animal. Actualmente, cuando hablamos de emoción nos referimos a una respuesta compleja con tres componentes: cognitivo, fisiológico y conductual. Es decir, el complicado mundo de las emociones incluye una amplia gama de sentimientos y cogniciones privadas o subjetivas (durante bastante tiempo considerados como propios del ser humano); pero también implica cambios en el estado corporal (arousal fisiológico) y una gran variedad de respuestas conductuales que nos permiten examinar la emociones de una forma objetiva tanto en animales no humanos como seres humanos (Steimer, 2002). Al profundizar en el concepto de ansiedad y agresión, nos percatamos de las dificultades para definir estas emociones con exactitud y de forma unitaria. La investigación de estos estados emocionales ha dado lugar a diversas definiciones y tipologías, quizá una de las cuestiones más interesante al respecto sea la propia diferenciación entre procesos emocionales normales y patológicos. Actualmente, desde un punto de vista clínico supone un reto encontrar un modelo teórico comprehensivo que permita conectar el estudio los procesos emocionales y afectivos normales con el de las experiencias emocionales patológicas. Además, en esta línea, la alteración de la ansiedad y la agresión son un tema de gran actualidad debido en parte a su estrecha asociación con el consumo de drogas psicoactivas (Johansen & Krebs, 2009; Kamilar-Britt & Bedi, 2015; Rugani et al., 2012), así como también por su implicación en el estudio de los trastornos neuropsiquiátricos (Arregi, Azpiroz, Fano, & Garmendia, 2006). En el presente capítulo presentamos una aproximación a los conceptos, tipologías, modelos animales y mecanismos biológicos implicados en la ansiedad y la agresión. 3.1. Conceptos generales 3.1.1. El concepto de ansiedad en psicología El concepto de ansiedad, cuyo término proviene de latín “anxietas” (ansiedad, angustia), está relacionado en el vocabulario actual con una amplia variedad de términos, tales como angustia, tensión, estrés, intranquilidad, temor, miedo, pánico o frustración, entre otros, que poseen pequeñas variantes y matices. De esta forma, los términos de 72 El concepto de ansiedad en psicología tensión y estrés parecen tener más relación con la activación somática que caracteriza a la ansiedad (Ansorena Cao, Cobo Reinoso, & Romero Cagigal, 1983); mientras que desde un punto de vista etológico, el término miedo parece enfatizar aspectos motores y la activación de conductas defensivas o de evitación/huida ante amenazas muy concretas y puntuales (Steimer, 2002). Particularmente el concepto de miedo se ha presentado como un concepto casi indistinguible de la ansiedad; sin embargo, autores como Barlow (2000) argumentan que existen diferencias apreciables, pues aunque ambos constituyan señales de alerta, la ansiedad parece caracterizarse por ser más una respuesta generalizada ante una amenaza desconocida/futura o por un conflicto motivacional interno, mientras que el miedo se caracteriza por la existencia de un peligro objetivo, externo, conocido e inminente (Steimer, 2002). Esta diversidad terminológica, que puede llegar a inducir equívocos, es en parte reflejo de que la ansiedad es una respuesta emocional normal pero compleja y ampliamente aceptada en el lenguaje cotidiano. Los orígenes del concepto de ansiedad en el campo de la psicología se remontan al siglo XIX, cuando el filósofo existencialista Kierkegaard, considerado padre de la psicología humanista, publica su obra “El concepto de angustia” en 1844. Sin embargo, no es hasta principios del siglo XX, que el concepto de ansiedad se incorpora al ámbito de la psicología gracias a la obra de S. Freud “Inhibición, síntoma y ansiedad” en 1926; no obstante, desde el enfoque psicodinámico el significado de este término va modificándose con bastante ambigüedad (Ansorena Cao et al., 1983; Endler & Kocovski, 2001). Desde el ámbito de la Psicología, casi todas las escuelas tanto clínicas como experimentales, han intentado dar una explicación al complejo fenómeno de la ansiedad (Ansorena Cao et al., 1983; Endler & Kocovski, 2001; Tone, 2005). De esta forma, Watson y el conductismo clásico utilizan preferentemente los términos de “miedo” y “temor”, entendiéndolos como una respuesta conductual y fisiológica del sujeto ante una estimulación externa. En la década de los veinte, desde un enfoque experimentalconductista surgen los primeros intentos de explicar la ansiedad como una respuesta condicionada siguiendo los principios del condicionamiento clásico (Watson y Rainer, Paulov, Lidell, Grant y Cook), o bien de procedimientos de condicionamiento instrumental (Massermen, Cain, Maier y Wolpe) (Ansorena Cao et al., 1983). Por otra parte, Hull desde un enfoque experimental-motivacional desarrolla una de las primeras teorías del aprendizaje, influyendo en autores como Mowrer, Dollard y Miller. Psicobiología de la agresión y la ansiedad 73 Según la teoría motivacional de Hull (1920, 1943, 1952) la ansiedad se explica como el grado de excitación general del sujeto o “drive motivacional” que determina el nivel de ejecución (respuesta) ante una tarea o situación determinada. A partir de esta ebullición experimental, Mowrer (1939, 1950, 1960) unifica y formula su teoría de los dos procesos, ofreciendo una visión más completa de la ansiedad como conducta aprendida por medio de condicionamiento clásico; pero también como motivación para el aprendizaje de conductas por ensayo/error, que también puede reducirse mediante procedimientos instrumentales de evitación basados en el reforzamiento negativo. Por su parte, el trabajo de Dollar y Millner se centra en la intervención terapéutica por medio de las técnicas de reducción del “drive” (Ansorena Cao et al., 1983). En conjunto, el enfoque conductista ha contribuido a delimitar el constructo de ansiedad al considerarla como un estado o una respuesta emocional transitoria, y a operativizarlo en función de sus antecedentes (estímulos) y consecuentes (respuestas), explicando su adquisición y extinción mediante procedimientos de aprendizaje, pero a su vez descuidando elementos cognitivos. A partir de los años sesenta, se empieza a conformar el enfoque cognitivo-conductual. Surge la teoría internalista de los rasgos de personalidad y las nuevas técnicas psicométricas de análisis factorial, en las cuales se apoyará una nueva perspectiva del estudio de la ansiedad como rasgo de personalidad. Raimond Cattell y Scheier (1961) realizan el primer intento psicométrico de medir el constructo de ansiedad mediante su cuestionario de personalidad “16-PF” y formularon la primera teoría de ansiedad estadorasgo. Según esta teoría, la ansiedad-estado, hace referencia al estado emocional transitorio que manifiesta un individuo ante una situación de estrés determinada que percibe como amenazante; mientras que la ansiedad-rasgo es una característica persistente y duradera del individuo que indica una predisposición a percibir situaciones como peligrosas o amenazantes y responder a estas con ansiedad, por lo que se refiere a una forma de interacción con el ambiente (Ansorena Cao et al., 1983). Posteriormente y en respuesta a esta disyuntiva teórica (internalistas vs. situacionistas), surge la teoría interaccionista de la ansiedad “persona x situación” propuesto por Engel y Hunt (1969), según la cual la interacción de la persona con la situación ansiógena explica una mayor parte de la varianza total de la ansiedad que la situación en sí o las diferencias individuales. En la actualidad, es usual la distinción entre los conceptos de ansiedad-estado y ansiedad-rasgo, diversas investigaciones parecen indicar que existen cambios microestructurales morfológicos y neuroquímicos asociados 80 Los modelos animales en investigación o débil de las tres (Guo, 2009; Kumar et al., 2013; Treit et al., 2010), la documentación de los correlatos conductuales y fisiológicos asociados a la ansiedad (como el aumento de la vocalización, de la tigmostasis, el incremento de corticosteroides o de norepinefrina cerebral) es importante para reforzar y apoyar la validez predictiva de un modelo animal. La validez predictiva se refiere a la capacidad del modelo para predecir el éxito de un tratamiento farmacológico con efecto terapéutico en el ser humano. Un ejemplo son las benzodiacepinas, que se usan en el tratamiento de la ansiedad de pacientes y también reducen las conductas de ansiedad de roedores tanto en el test de la caja luz-oscuridad como en el test EPM. Este tipo de validez implica que el modelo debe discriminar entre sustancias farmacológicas que son clínicamente eficaces y aquellas que no lo son o bien tienen efectos opuestos (p.ej. entre compuestos “ansiolíticos”, “no ansiolíticos” y “ansiogénicos”) (Bourin et al., 2007). En este sentido, cuanto más falsos positivos acumula un supuesto modelo animal, menos validez predictiva o farmacológica tiene, y disminuye su utilidad potencial como prueba para detectar nuevos compuestos terapéuticos. Es por ello, que se debe prestar especial atención a los falsos positivos y negativos de un modelo animal y hacerlos objeto de revisión clínica (Treit et al., 2010). Podría decirse que la validez predictiva es una de las más importantes, pero su principal limitación sería la ausencia de tratamientos eficaces, ya que requiere de la existencia de un tratamiento ya validado clínicamente que pueda ser utilizado como referente en la validación del modelo animal (Hånell & Marklund, 2014). Por otra parte, la validez de constructo responde a la cuestión más básica de todas: “¿El modelo mide realmente o representa lo que está intentando medir o representar?”. Esta pregunta rara vez puede ser contestada sólo por datos experimentales, y debe evaluarse en el contexto de una teoría científica del constructo (Treit et al., 2010). Por lo tanto, la validez de constructo se refiere a la similitud entre los fundamentos teóricos que subyacen al modelo animal y al comportamiento humano, esto a su vez requiere una etiología subyacente similar (Bourin et al., 2007; Kumar et al., 2013). En el caso que nos ocupa, sería necesaria una teoría que explique la etiología de la ansiedad y sus mecanismos (psicológicos o neurobiológicos) antecedentes e intervinientes, de tal forma que exista una analogía entre el modelo animal y el fenómeno o trastorno humano (Escorihuela & Fernánadez-Teruel, 1998; Guo, 2009). En opinión de Treit et al. (2010), esto supone una tarea difícil ya que no existe una teoría científica ampliamente aceptada o establecida de la etiología de la ansiedad humana, y aunque ésta Psicobiología de la agresión y la ansiedad 81 existiera el juicio sobre este tipo de validez implica un proceso dinámico en evolución continua precisamente por su carácter teórico. Por último, y estrechamente relacionada con la anterior, la validez convergente o concurrente se refiere al grado con que un determinado modelo se correlaciona con otros que intentan medir o simular el mismo constructo. En cualquier caso se debe tener en cuenta, que los diferentes tipos de validez son hasta cierto punto independientes uno del otro, por ejemplo un modelo animal puede poseer validez predictiva y de constructo sin poseer validez aparente (Kumar et al., 2013). 3.2. El estudio de la ansiedad en modelos animales 3.2.1. Clasificación de los modelos animales de ansiedad Los modelos animales de ansiedad intentan representar algún aspecto de la etiología, sintomatología o tratamiento de la ansiedad humana para facilitar su estudio. El propósito principal de estos modelos es identificar nuevas sustancias ansiolíticas y estudiar los mecanismos biológicos por los cuales ciertos compuestos producen efectos ansiolíticos o ansiogénicos (Treit et al., 2010). Sabemos que la capacidad para responder a una amenaza o peligro es algo universal en el reino animal. En general, los animales reaccionan ante una amenaza potencial con una serie de respuestas autonómicas y conductuales seleccionadas evolutivamente que poseen un gran valor adaptativo y que además resultan ser cuantificables (Campos et al., 2013; Guo, 2009). Los modelos animales de ansiedad han llegado a ser una herramienta inestimable en el estudio de estas respuestas produciendo síntomas homólogos a la ansiedad normal o patológica humana, contribuyendo a profundizar en el conocimiento de las causas biológicas, ambientales o farmacológicas de la ansiedad (Kumar et al., 2013). La ansiedad ha sido estudiada extensamente mediante más de treinta modelos animales. En la Tabla 3.1 se presenta un compendio de diversos modelos animales de ansiedad “estado” o ansiedad normal, en los que mediante un procedimiento experimental protocolizado se registra la respuesta del animal en presencia de un estímulo ansiogénico (Belzung & Griebel, 2001). Algunos de estos modelos recurren a respuestas condicionadas y otros utilizan respuestas más naturales de la especie por lo que se consideran modelos etológicos o de respuestas no condicionadas (Bourin et al., 2007; Campos et al., 2013; Cárdenas & Navarro, 2002a; 2002b; Escorihuela & FernánadezTeruel, 1998; Guo, 2009; Kumar et al., 2013; Polanco, Vargas-Irwin, & Góngora, 2011). 82 Clasificación de los modelos animales de ansiedad Recientemente, Kumar y col. (2013), incluye una clasificación menos conocida de los modelos de ansiedad según el estímulo estresor sea exteroceptivo o interoceptivo, la cual también se recoge en la tabla.  Modelos de Respuesta Condicionada Los modelos de respuesta condicionada se basan en general en la capacidad de responder ante un estímulo neutro con la respuesta específica a otro estímulo usualmente aversivo, como un choque eléctrico, y de esta forma modelan reacciones a acontecimientos específicos aversivos o a estímulos emparejados con éstos (Polanco et al., 2011). Existen dos tipos dentro del grupo de modelos condicionados, los modelos basados en el condicionamiento pavloviano clásico o asociativo (p.ej. la respuesta emocional condicionada “REC” y el paradigma de la supresión condicionada), y por otra parte, los modelos basados en el condicionamiento operante o instrumental, el cual implica un conflicto aproximación-evitación, denominados modelos de conflicto. El procedimiento pavloviano de condicionamiento del miedo, ha sido una de las aproximaciones experimentales más investigadas y consiste en la asociación de un estímulo condicionado neutral a un estímulo incondicionado aversivo (EC-EI), mediante la cual el EC puede suscitar respuestas condicionadas (RC) defensivas como la inmovilidad, pero también conductas motivadas como la evitación activa instrumental (Acción – Recompensa). La respuesta condicionada es el resultado del aprendizaje de la asociación entre los dos estímulos, del almacenaje de esta asociación y de la posterior recuperación de la memoria en respuesta a la recepción del EC. Además, una vez se ha establecido esta asociación puede reducirse gradualmente mediante extinción, estableciendo una nueva asociación en la que el EC ya no sea percibido como peligroso y se inhiba la RC (Spampanato, Polepalli, & Sah, 2011). Como ya se ha indicado antes, un estímulo condicionado también puede fortalecer una respuesta de evitación activa instrumental en curso, lo que se conoce como Transferencia instrumental de Pavlov (“PIT”). Este procedimiento permite evaluar la capacidad de un EC de modular una acción instrumental que se ha entrenado de forma independiente (Campese et al., 2014). La etiología de la ansiedad bajo condicionamiento puede ser comparable a la ansiedad patológica en humanos, ya que implica una sobrerreacción a acontecimientos que no suceden en condiciones normales y podrían estar más cerca de ciertos trastornos de Psicobiología de la agresión y la ansiedad 83 ansiedad como las fobias, en las que existe una estrecha asociación entre un estímulo aversivo y un aprendizaje de evitación (Cárdenas & Navarro, 2002b). En general como ventajas, estos modelos gozan de un marco teórico amplio y consensuado (teorías de condicionamiento clásico como la Tª bifactorial de Mowrer o la Tª de Eysenck, y teorías de condicionamiento operante) y, además, posibilitan un elevado control experimental sobre las distintas variables que se analizan, pero también presentan algunas limitaciones. Al exponer a los sujetos a estímulos no habituales, se requiere que los animales sean entrenados previamente. Además, es común tener en cuenta en el diseño experimental varios grupos de sujetos control para descartar los efectos no específicos del tratamiento sobre aspectos como el aprendizaje, la memoria, apetito y las funciones motoras y perceptuales sobre el desarrollo del miedo condicionado (Polanco et al., 2011).  Modelos de Respuesta Incondicionada Los modelos animales de respuesta incondicionada se diseñan para medir conductas innatas de miedo o evitación ante diferentes formas de amenazas externas, simulando lo que ocurre en la naturaleza en condiciones de laboratorio, por ello estos modelos tiene una validez etológica elevada. La premisa básica de la mayoría de estos modelos es que son capaces de generar una situación de conflicto de aproximaciónevitación hacia una fuente potencial de peligro, creando en el individuo estados motivacionales opuestos de curiosidad y miedo de forma simultánea, que determinarán el conjunto de respuestas conductuales del animal. En roedores, la exposición al ambiente novedoso del modelo despierta en el animal el impulso exploratorio incondicionado, pero a su vez, éste se opone al impulso de evitación innato hacia los espacios desconocidos, elevados, abiertos y luminosos (Campos et al., 2013). Estos modelos, en general, poseen ciertas ventajas frente a los modelos condicionados, tales como una alta validez ecológica, la ausencia de largos procedimientos de aprendizaje y de condiciones tan aversivas como descargas eléctricas o la privación de alimento o de agua. (Polanco et al., 2011). Por otra parte, en estos modelos se deben diferenciar dos factores sobre todo cuando se usan como pruebas de screening, estos factores son la actividad locomotora y la actividad exploratoria del animal. Existe cierta dificultad en discernir estas actividades pues suelen superponerse, sin embargo es necesario considerar que: 1. La actividad locomotora entendida como desplazamiento es un componente importante pero no imprescindible de la exploración 84 Clasificación de los modelos animales de ansiedad espacial en roedores; 2. La actividad locomotriz puede verse influida por factores distintos al impulso de exploración, como la posible acción sedante del fármaco que se evalúa (Cárdenas & Navarro, 2002a); y a su vez, 3. La conducta exploratoria puede verse afectada por factores ajenos al “drive” motivacional, tales como la complejidad de la situación, el grado de novedad (el cual varía de mayor a menor a lo largo de la sesión), y el estado basal del animal (Campos et al., 2013). En la Tabla 3.1 se muestran los modelos de ansiedad incondicionada del ratón, entre los que se incluyen: 1. Modelos basados en la exploración como el Test del laberinto elevado en cruz o el test de la caja luz-oscuridad; 2. Modelos basados en la conducta social como el test de interacción social; 3. Modelos basados en la exposición a un predador como la Batería de test de defensa (MDTB); 4. Modelos basados en estresores físicos como el test de suspensión por la cola o el test de la respuesta de sobresalto acústica. Nos centraremos en el Test del laberinto elevado en cruz, el cual se ha escogido para evaluar la ansiedad en los experimentos que se exponen en capítulos posteriores. Psicobiología de la agresión y la ansiedad 85 Tabla 3.1 Clasificación de modelos de ansiedad en el ratón, en función del tipo de respuesta (Incondicionada/ Condicionada) y de que el tipo de estímulo estresor sea o no interoceptivo. (Adaptado de Belzung & Griebel, 2001; Campos et al., 2013; Cárdenas & Navarro, 2002a; Cárdenas & Navarro, 2002b; Escorihuela & Fernánadez-Teruel, 1998; Guo, 2009; Kumar et al., 2013). MODELOS DE RESPUESTA INCONDICIONADA Basados en exploración Test Laberinto elevado en cruz o “Elevated plus-maze test” (variantes: Y-maze, T-maze, zero-maze, EPM Inestable, EPM potenciado por estrés) Caja de dos compartimentos luz/oscuridad o “Light-dark box test” Test Tablero de agujeros u “Hole-board test” Test de Supresión de ingesta inducida por la novedad o “Noveltysuppressed feeding” Test de campo abierto u “Open field test” Test de exploración libre (*ansiedad-rasgo en cepas neofóbicas, y actividad locomotora en cepas no neofóbicas) Test del contraste negativo Test de la escalera* Test de la habitación con espejo Basados en conducta social Test de interacción social * Test de vocalizaciones ultrasónicas inducido por separación Test de conducta sexual en ratones subordinados Basados en exposición a Depredador (modelo PTSD) Batería de test de defensa en ratones (MDTB). Conductas agonísticas. Test de exposición rata o al olor de gato/ rata. Basados en estresores físicos Estrés por inmovilización Estrés por variación de temperatura, ritmos circadianos Estrés por electroschok en patas. Test de respuesta de sobresalto acústica Test de suspensión de la cola MODELOS DE RESPUESTA CONDICIONADA Basados en C. Operante Test de conflicto de Geller-Seifter (variantes: Cook-Davidson) Test de conflicto de Vogel Basados en C. Clásico Respuesta emocional condicionada (REC) Paradigma de Supresión condicionada Paradigma de evitación pasiva/activa Test de los cuatro discos Test de potenciación del reflejo de sobresalto Test de extinción del refuerzo parcial Test de retirada de señales de seguridad de Thiebot Enterramiento defensivo condicionado MODELOS DE ESTIMULACIÓN INTEROCEPTIVA Basado en E. eléctrica Escape inducido por estimulación eléctrica cerebral (dPAG) Basados en fármacos Ansiedad inducida por Anfetamina Ansiedad inducida por FG-7142 Ansiedad inducida por cafeína Ansiedad inducida por Yohimbina Ansiedad inducida por Flumazenil 86 Clasificación de los modelos animales de ansiedad Laberinto elevado en cruz o “Elevated Plus Maze” (EPM). Es uno de los modelos de ansiedad más populares actualmente y se encuadra como modelo de ansiedad estado incondicionada (Cárdenas & Navarro, 2002b; Walf & Frye, 2007). La prueba tiene su origen en el trabajo de Montgomery (1955), que diseñó un laberinto en forma de “Y” con calles abiertas y cerradas en el que las ratas mostraban una alta tasa de exploración y/o preferencia por los brazos cerrados, por lo que concluyó que los brazos abiertos del laberinto generaban miedo en estos sujetos. A principios de los años ochenta, el laberinto elevado en cruz “X” diseñado por Handley y Mithani (1984) se consolida como modelo animal para la ansiedad, validándose en ratas (Pellow, Chopin, File, & Briley, 1985), y posteriormente se adapta y valida para ratones (Lister, 1987), llegando a ser usado en multitud de especies como conejillos de indias, ratones salvajes, hamsters y jerbos (Polanco et al., 2011). El laberinto elevado en cruz consta en su diseño de una plataforma central y cuatro brazos situados perpendicularmente, dos de ellos cerrados por paredes y situados uno frente al otro, mientras que los otros dos brazos están abiertos o desprotegidos. El laberinto se eleva sobre el suelo de tal forma que se combinan elementos que resultan poco familiares, los espacios abiertos, la iluminación y la altura. El EPM se basa principalmente en generar un conflicto entre la tendencia del roedor a dirigirse a una zona oscura y protegida del laberinto evitando los espacios abiertos y elevados de los brazos abiertos (evitación) y su curiosidad o tendencia a explorar ambientes nuevos (proximidad) (Walf & Frye, 2007). En este modelo animal se evalúan dos tipos de medidas, los parámetros clásicos espaciotemporales y los etológicos. De forma tradicional se han empleado parámetros “espaciotemporales” que incluyen las medidas de frecuencia y tiempo de la actividad en los brazos abiertos y cerrados del laberinto; además, se mide el número total de entradas en los brazos como control de la actividad locomotora (Lister, 1987; Pellow et al., 1985). Posteriormente, la evaluación de parámetros etológicos iniciada por Rodgers & Johnson (1992; 1995), ha demostrado ser de gran utilidad mejorando la sensibilidad del test, su fiabilidad y validez (Cárdenas & Navarro, 2002b; Cruz, Frei, & Graeff, 1994; Treit et al., 2010). Los parámetros etológicos incluyen la evaluación de conductas no exploratorias (de aseo e inmovilidad), la latencia de entrada en cualquiera de los brazos, la conducta de “rear” o elevación sobre las patas traseras y un conjunto de conductas que se denominan de forma global “conductas de evaluación del riesgo” que se observan en situaciones de peligro potencial y que son particularmente sensibles a las fármacos que modulan la Psicobiología de la agresión y la ansiedad 87 ansiedad. Entre las conductas de evaluación del riesgo se incluyen los “Head-dips, HD” o movimientos de la cabeza por debajo del nivel del suelo del laberinto, así como la postura de atención extrema o “Stretch attend posture, SAP” que consiste en una elongación postural hacia adelante manteniendo las patas traseras fijas, y la conducta de regreso al brazo protegido. Además, teniendo en cuenta la importancia de la tigmostasis en la exploración de los roedores en el elevado en cruz, tanto las conductas de HD como las SAP se registran teniendo en cuenta la localización física del animal en el aparato en las zonas protegidas (pHD, pSAP) y en las zonas no protegidas o “unprotected” (uHD, uSAP) (Rodgers & Johnson, 1995; Treit, Menard, & Royan, 1993). De esta forma, la conducta de atención extrema puede desarrollarse en ambas áreas, indicando miedo y desconfianza en la exploración, siendo éste más pronunciado si se realiza desde el área protegida; por otra parte, el significado etológico de la conducta de head-dips depende de su localización indicando estados muy distintos de miedo/desconfianza si se realizan en el área protegida (pHD) y de cierta tranquilidad en la exploración y curiosidad por el entorno si se realiza en el área desprotegida (uHD) (Cárdenas & Navarro, 2002b; Mascarenhas, Gomes, & Nunes-de-Souza, 2013) Teniendo en cuenta los parámetros del laberinto elevado en cruz, la respuesta ansiolítica en este test se caracteriza por un aumento del tiempo y frecuencia de exploración de los brazos abiertos del laberinto y por un aumento de head-dips no protegido (uHD); mientras que correlacionan de forma negativa o se reducen la entrada en brazo cerrado, las conductas de riesgo protegidas (pHD y pSAP) y la conducta de regreso al brazo protegido (Cárdenas & Navarro, 2002b; Espejo, 1997; Treit et al., 2010). Los parámetros de entrada en brazo abierto, uHD, pHD y pSAP se consideran esenciales para el análisis de la ansiedad en el laberinto elevado en cruz (Espejo, 1997), mientras que otras medidas como la elevación sobre las patas traseras (Cruz et al., 1994; Espejo, 1997) y la frecuencia total de entradas en los brazos (Lister, 1987; Pellow et al., 1985) parecen ser más relevantes para evaluar la actividad motora. En conjunto, este modelo posee validez aparente, ya que la prueba mide lo que parece medir, esto es, la ansiedad o miedo a los espacios abiertos y elevados en roedores (Walf & Frye, 2007), y también tiene una buena validez externa y ecológica, dado que emplea estímulos naturales que pueden inducir ansiedad en humanos (Cárdenas & Navarro, 2002b). En este modelo, los roedores muestran de forma natural un patrón de conducta caracterizado por la evitación de los brazos abiertos y elevados del laberinto, limitando la 88 El circuito neuronal del miedo y la ansiedad mayor parte de su actividad a los brazos cerrados. Se cree que estos miedos podrían ser similares a la agorafobia y el vértigo, respectivamente, lo que sugiere un cierto grado de isomorfismo u homología. En los animales la evitación de los espacios abiertos puede haber evolucionado como una defensa contra los mamíferos más grandes y/o aves depredadoras (Treit et al., 2010). Por otra parte, el modelo también presenta una buena validez predictiva (Cárdenas & Navarro, 2002b). Las sustancias ansiolíticas, principalmente de tipo benzodiacepínico, tienden a suprimir esta respuesta de evitación de las áreas abiertas, mientras que las sustancias ansiogénicas la potencian (Belzung & Griebel, 2001; Walf & Frye, 2007). Este modelo muestra una sensibilidad elevada a sustancias ansiolíticas que actúan sobre el complejo receptor BZ/GABA y sobre el sistema glutamatérgico, aunque los resultados no son tan consistentes respecto a drogas que modulan la actividad serotoninérgica como la buspirona (agonista parcial 5-HT1A), los fármacos ISRS y fármacos ansiolíticos experimentales como los antagonistas del CRF (Carobrez & Bertoglio, 2005; Litvin, Pentkowski, Pobbe, Blanchard, & Blanchard, 2008; Menard & Treit, 1999; Treit et al., 2010). Además, se ha demostrado que el nivel de corticosterona plasmática aumenta con la exposición a los brazos abiertos y que correlaciona de forma positiva con conductas de evaluación del riesgo en el laberinto elevado en cruz (Walf & Frye, 2007), por lo que la incorporación de las medidas etológicas ha permitido incrementar la validez predictiva y de constructo de esta prueba 3.2.2. El circuito neuronal del miedo y la ansiedad La capacidad de detectar el peligro potencial antes de que ocurra es una clave evolutiva para la supervivencia que se encuentra íntimamente ligada a las emociones de miedo y ansiedad (Kim & Gorman, 2005). En apartados anteriores se indicaba que posiblemente el miedo y la ansiedad sean estados emocionales con ciertas características particulares, sin embargo esto no excluye que exista un solapamiento de los mecanismos cerebrales subyacentes y su expresión conductual; de hecho la ansiedad puede que se trate tan solo de una forma elaborada de miedo. Si este es el caso, podemos esperar que parte de los mecanismos que median el miedo desarrollados para proteger al individuo de un peligro inmediato, se hayan podido “reciclar” o evolucionar para protegernos de amenazas más distantes o virtuales (Steimer, 2002). Psicobiología de la agresión y la ansiedad 89 En las últimas décadas, se han investigado los mecanismos neurales implicados en el miedo y la ansiedad mediante estudios experimentales tanto en humanos, principalmente mediante técnicas de neuroimagen funcional, como en animales mediante lesión local, tratamientos farmacológicos, técnicas inmunohistoquímicas y electrofisiológicas. Se ha llegado a determinar que las estructuras cerebrales subyacentes a las medidas de ansiedad son similares en humanos (Boehme et al., 2014; Yassa, Hazlett, Stark, & Hoehn-Saric, 2012) y roedores (Duvarci, Bauer, & Pare, 2009; Moreira, Masson, Carvalho, & Brandao, 2007). Además, en la misma línea, se ha comprobado que las drogas ansiolíticas clínicamente eficaces en humanos disminuyen la evitación de los espacios abiertos y luminosos en roedores (File & Pellow, 1985; Schmitt & Hiemke, 1998; Walker & Davis, 1997a). Estas similitudes sugieren que el estudio de la ansiedad en roedores puede proporcionar conocimiento del circuito subyacente a la ansiedad humana (Adhikari, 2014). El reciente desarrollo de las técnicas optogenéticas constituye una versátil herramienta que está permitiendo avanzar firmemente en este sentido, al facilitar la manipulación específica de proyecciones y tipos celulares in vivo. Brevemente, la optogenética hace posible la activación o inhibición rápida y reversible de neuronas específicas mediante un haz de luz dirigido hacia elementos neurales, que han sido previamente manipulados para expresar opsinas (ChR2) sensibles a la luz (Belzung, Turiault, & Griebel, 2014; Janak & Tye, 2015), por lo que esta tecnología nos permite incrementar nuestra comprensión de la conexión funcional entre las conductas relacionadas con la ansiedad y diversos circuitos cerebrales implicados. De esta forma, se sabe que existe una red muy interconectada de regiones cerebrales corticales y subcorticales del sistema límbico, entre las que destaca particularmente el microcircuito del complejo amigdalino y sus conexiones con regiones más distales (Adhikari, 2014; Belzung et al., 2014). Este sistema cerebral organizado jerárquicamente incluye áreas implicadas en la generación del miedo y/o de la experiencia ansiogénica, tales como la amígdala, el hipocampo ventral, la denominada amígdala extendida o núcleo laminar de la estría terminal (BNST) y septum. Asimismo, incluye áreas que participan en la expresión de las respuestas de miedo/ansiedad autónomas, hormonales y conductuales tales como el hipotálamo, pituitaria y estructuras del tronco como la sustancia gris periacueductal (PAG) y el núcleo parabraquial (PB). Por último, señalar que también hay regiones 96 El circuito neuronal del miedo y la ansiedad pionero realizado en ratones expuestos a test conductuales de ansiedad como el EPM y open-field (Tye et al., 2011), se halló que la activación optogenética no específica o completa de la BLA era capaz de producir conductas ansiogénicas en el ratón; mientras que la fotoactivación selectiva de las proyecciones BLA-CeL ejerce un efecto ansiolítico y, por el contrario, su inactivación óptica produce un efecto conductual ansiogénico. Como se ha demostrado mediante manipulación optogenética con este experimento, las proyecciones específicas de una región del cerebro pueden codificar información que no es posible extraer de la activación o inhibición no específica de toda una región cerebral (Adhikari, 2014; Allsop, Vander Weele, Wichmann, & Tye, 2014). En este estudio, estos autores proponen que una proyección glutamatérgica específica del BLA hacia el CeL puede facilitar la ansiolisis. Aunque en el estudio citado se desconoce la identidad de las neuronas CeL activadas por la estimulación óptica de terminales BLA, se ha sugerido que podían ser del tipo CeLOFF: PKCδ+, ya que se ha demostrado que la fotoactivación de estas neuronas tiene un efecto ansiolítico en el test del laberinto elevado en cruz registrando un incremento del tiempo en brazo abierto (Cai, 2014; Janak & Tye, 2015). Esto está en consonancia con experimentos anteriormente expuestos realizados en el paradigma del miedo condicionado (Ciocchi et al., 2010; Haubensak et al., 2010), por lo que, en conjunto, el modelo actual parece indicar que diferentes poblaciones del complejo basolateral de la amígdala activan distintas poblaciones de neuronas del núcleo central lateral (CeL), que o bien promueven el miedo o bien reducen la ansiedad (Janak & Tye, 2015).  Núcleo medial (MeA). La detección de un estímulo olfatorio proveniente de un depredador activa un circuito neuronal que es en cierta forma independiente del expuesto anteriormente, y que implica en especial a los núcleos medial y corticales de la amígdala, desencadenando una respuesta de miedo innata particular (Adhikari, 2014; Canteras et al., 2010; Li, Maglinao, & Takahashi, 2004). Cuando el animal detecta el olor del predador, éste se procesa como una feromona-olor a través del bulbo olfatorio accesorioprincipal, respectivamente. La información olfativa en la amígdala se procesa por el núcleo medial (MeA) (Canteras et al., 2010; McGregor, Hargreaves, Apfelbach, & Hunt, 2004), mientras que la información auditiva y visual del depredador se procesa por el núcleo basal accesorio (BA) (Adhikari, 2014; Canteras & Blanchard, 2008). Las proyecciones eferentes del MeA se dirigen de forma directa al hipotálamo medial, principalmente al núcleo ventromedial y también de forma indirecta a través del BNST Psicobiología de la agresión y la ansiedad 97 (Canteras et al., 2010). Se ha comprobado que la exposición a la señal de un predador activa el llamado “circuito defensivo hipotalámico medial”, el cual constituye un circuito formado por el núcleo anterior (AH), la parte dorsomedial del núcleo ventromedial (VMHdm) y el núcleo premamilar dorsal (PMd) (Canteras, 2002; Martinez, CarvalhoNetto, Amaral, Nunes-de-Souza, & Canteras, 2008). A su vez, la sustancia gris periacueductal en su zona dorsomedial y dorsolateral (PAGdm) representa la región principal del tallo cerebral del sistema defensivo hipotalámico medial (Canteras & Goto, 1999; Canteras et al., 2010). Se ha comprobado que esta ruta amigdalo-hipotalámica se activa ante estímulos depredadores, tanto en ratas expuestas a gatos (Canteras, RibeiroBarbosa, & Comoli, 2001), como en ratones expuestos a ratas (Martinez et al., 2008), y también existen evidencias de que la lesión del circuito defensivo hipotalámico medial reduce de forma muy efectiva la respuesta defensiva antipredatoria (Blanchard et al., 2003; Canteras, Chiavegatto, Ribeiro Do Valle, & Swanson, 1997).  La amígdala extendida: BNST El núcleo laminar de la estría terminal (BNST) representa la base del concepto de “amígdala extendida” propuesto por Heimer y Aldeid para denominar a un conjunto de estructuras anatómica y funcionalmente relacionadas que incluyen el BNST, la sustancia innominada (SI) y los núcleos centromediales de la amígdala (Alheid & Heimer, 1988). Estos autores confirmaron que existe una continuidad directa entre el BNST y los núcleos amigdalinos central y medial, en los que se observa un perfil similar neuroquímico (Woodhams, Roberts, Polak, & Crow, 1983) y morfológico (McDonald, 1983), y que además se encuentran conectados por unos cordones celulares que forman parte de la sustancia Innominada. El BNST recibe bastantes proyecciones aferentes de la amígdala y, al igual que ésta, proyecta a diversos núcleos hipotalámicos y del tronco encefálico (Adhikari, 2014; De Olmos & Ingram, 1972; Dong, Petrovich, & Swanson, 2001; LeDoux, 2000). La división central de la amígdala extendida (CeA, BNSTl) proyecta principalmente al hipotálamo lateral y diversas zonas del tronco encefálico tales como la PAG, los núcleos parabraquiales, la formación reticular y el núcleo del tracto solitario. La división medial de la amígdala extendida (MeA, BNSTm) proyecta fundamentalmente al hipotálamo medial (Nieuwenhuys, Voogd, & Van Huijzen, 2009). Como sucede con la amígdala, el BNST se ha relacionado con la respuesta conductual de ansiedad. Los estudios de neuroimagen en humanos sugieren que la actividad del 98 Neuroquímica de la ansiedad BNST correlaciona con incremento del nivel de ansiedad (Somerville, Whalen, & Kelley, 2010; Yassa et al., 2012). Sin embargo, los resultados con estudios animales no son conclusivos, ya que se ha registrado con el test del laberinto elevado en cruz tanto una ausencia de efecto conductual tras la lesión (Treit, Aujla, & Menard, 1998) o estimulación (Van Dijk et al., 2013) del BNST, como un efecto ansiogénico (Duvarci et al., 2009); mientras que el bloqueo del BNST con un antagonista glutamatérgico usando el test del paradigma de sobresalto potenciado por luz parece producir un efecto ansiolítico ( Walker & Davis, 1997b). Una posible explicación para estos resultados dispares es que diferentes regiones del BNST regulen la ansiedad en sentidos opuestos, o bien, que exista una diferenciación funcional de las neuronas alojadas en un mismo núcleo. Dos recientes estudios optogenéticos parecen apoyar ambas hipótesis. Kim y cols. (2013) demostraron que la inactivación óptica de un subgrupo de neuronas con terminales en el núcleo oval del BNST ejerce un efecto ansiolítico (neuronas BLA/BNSTo), mientras que la inactivación del BNST anterodorsal (BLA/adBNST) parece inducir un efecto ansiogénico (Adhikari, 2014; Janak & Tye, 2015; Kim et al., 2013). Por otro lado, también se ha aportado evidencia de que las células del BNST difieren en su perfil neuroquímico (Adhikari, 2014; Jennings et al., 2013; Walter, Mai, Lanta, & Görcs, 1991). Recientes hallazgos indican que la activación optogenética de las neuronas glutamatérgicas BNST que proyectan al área tegmental ventral (BNSTglu/ATV) induce un efecto ansiogénico y se activan en presencia de un estímulo aversivo, mientras que la fotoactivación de las neuronas GABAérgicas que proyectan al ATV (BNSTgaba/ATV) induce un efecto ansiolítico y gratificante, inhibiéndose en presencia de estímulos aversivos (Jennings et al., 2013). Estos resultados sugieren que en el estudio del BNST, o de cualquier otra estructura que esté implicada en la regulación de la ansiedad, es necesario tener en cuenta tanto núcleos específicos, como la conectividad anatómica y funcionalidad de proyecciones específicas de estos núcleos, ya que de lo contrario se corre el riesgo de simplificar erróneamente la ajustada dinámica de la expresión de las características conductuales de la ansiedad (Janak & Tye, 2015). 3.2.3. Neuroquímica de la ansiedad Los circuitos anatómicos subyacentes a la respuesta de ansiedad se encuentran modulados por diferentes sistemas de neurotransmisión. Se ha identificado la participación de sustancias de naturaleza peptídica tales como el CRF, neuropéptido Y, CCK, opioides, hipocretinas y sustancia P; monoaminas como la serotonina, dopamina y Psicobiología de la agresión y la ansiedad 99 noradrenalina; y aminoácidos como el glutamato y el GABA. Estos sistemas tienen una función adaptativa al proporcionar al organismo la capacidad de responder ante una situación de peligro, ya que incrementa la activación y la vigilancia, movilizan recursos energéticos, elevan la función cardiovascular e incluso modulan la consolidación de las memorias en curso (Redolar, 2012). Sin embargo, no es posible sacar conclusión sobre su función concreta en la ansiedad, sin considerar su lugar de acción y los subtipos de receptores implicados (Steimer, 2002).  Noradrenalina Las primeras teorías biológicas sobre la ansiedad y los trastornos relacionados, a pesar de considerar posibles anomalías en otros sistemas, se centraban principalmente en la activación noradrenérgica central. El núcleus coeruleus (LC) contiene más del 50% de las neuronas noradrenérgicas del SNC, está situado en la protuberancia y proyecta a estructuras que están muy relacionadas con el sustrato de la ansiedad como la amígdala, el hipocampo y la neocorteza. Este núcleo ha sido objeto de atención en estudios experimentales con modelos animales, en los cuales tras su estimulación eléctrica se observa una marcada respuesta de miedo, mientras que su ablación quirúrgica disminuye la respuesta de miedo frente a la amenaza. También se ha comprobado que la exposición a estímulos que generan ansiedad o provocan estrés incrementan la actividad central noradrenérgica en el LC, en el hipocampo, en la amígdala, en el hipotálamo y en la corteza cerebral (Redolar, 2012; Steimer, 2002; Tanaka, Yoshida, Emoto, & Ishii, 2000). Los fármacos que aumentan la descarga del LC tienen generalmente propiedades ansiogénicas en animales y humanos, mientras que los que disminuyen la descarga tienen mayormente un efecto ansiolítico. En animales, se ha hallado que la administración de yohimbina (antagonista presináptico α2-adrenérgico) produce un incremento de NA con efectos ansiogénicos en ratas (Durant, Christmas, & Nutt, 2010; Steimer, 2002). En ratones, la ansiedad inducida por cocaína se ha relacionado con la activación de receptores β (Durant et al., 2010; Redolar, 2012). Por otra parte, varios síntomas recurrentes de trastornos de ansiedad humanos (tales como los ataques de pánico, insomnio, una elevada respuesta de sobresalto, signos subjetivos de ansiedad y activación crónica periférica simpática) se tratan clínicamente con fármacos que disminuyen el tono simpático (clonidina, propanolol, benzodiacepinas, etc.) (Durant et al., 2010; Redolar, 2012). En esta misma línea, el trastorno de pánico y el PTSD se han relacionado con aumentos de 100 Neuroquímica de la ansiedad la sensibilidad de los receptores adrenérgicos α2 y con una elevación en suero y orina de noradrenalina y de su metabolito, aunque con resultados no siempre consistentes. Asimismo, se ha observado que la exposición crónica a experiencias estresantes puede aumentar la respuesta de las neuronas del LC ante estímulos ansiogénicos (Arnau & Francisco, 2000). Sin embargo, resultan interesantes ciertas inconsistencias farmacológicas. Por ejemplo, se ha comprobado que la buspirona, un agonista parcial serotoninérgico que también eleva el tono simpático en locus coeruleus, tiene efectos ansiolíticos comprobados y usados en la clínica. También, llama la atención que la mirtazapina, un antagonista α2 que incrementa la actividad en el LC, tenga una eficacia ansiolítica demostrada (Durant et al., 2010). Se ha planteado que esta inconsistencia en los resultados puede deberse a la interacción de estos fármacos con otros receptores monoaminérgicos (Steimer, 2002); sin embargo, fármacos inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS) útiles en el tratamiento del trastorno de pánico, no parecen tener efectos sobre el sistema noradrenérgico. En realidad, todas estas evidencias, junto con diversos avances en el conocimiento de las bases psicobiológicas de la ansiedad, indican que el intento de explicar las alteraciones observadas como resultado de la hiper o hipoactividad de un sistema de neurotransmisión es una visión cuanto menos desacertada. Son varios los hallazgos en el estudio de la ansiedad que implican diversos sistemas de neurotransmisión, los cuales además interactúan entre sí de forma compleja.  Serotonina El sistema serotoninérgico participa estrechamente en la patofisiología y el alivio terapéutico de los trastornos relacionados con el estrés, tales como la ansiedad y la depresión. La modulación serotoninérgica de la respuesta aguda al estrés y la adaptación al estrés crónico se encuentran mediadas por una serie de moléculas que controlan el desarrollo de la neurona serotoninérgica (Pet-1), la síntesis de serotonina (triptófano hidroxilasa), empaquetado (transportador vesicular de monoaminas 2), la acción de receptores pre y post sinápticos (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT3A, 5-HT4, 5-HT5A, 5-HT6, 5-HT7), la recaptación de serotonina (proteína transportadora SERT) y su degradación (monoamino oxidasa-A). Diferentes evidencias experimentales han sugerido que podría existir una relación funcional entre el sistema de neurotransmisión serotoninérgico y la ansiedad. La exposición a estímulos que son capaces de inducir estrés Psicobiología de la agresión y la ansiedad 101 agudo altera los niveles de serotonina en la CPFmedial, en el núcleo accumbens, en la amígdala lateral y en el hipotálamo lateral. También se ha podido comprobar que la expresión del gen del receptor postsináptico 5-HT1A está regulada de manera inhibitoria por los glucocorticoides, de forma que en la respuesta de estrés a largo plazo se reduce el nivel de ARNm del receptor postsináptico 5-HT1A (Redolar, 2012). Los receptores 5-HT1 son metabotrópicos Gi/o (con proteína G acoplada negativamente a la encima adenilciclasa, y disminuye el AMPc), por lo que su activación produce hiperpolarización de la membrana y disminución de la excitabilidad en la neurona serotoninérgica. Este receptor se expresa en dos poblaciones diferentes de neuronas: como autorreceptor somatodendrítico en neuronas serotoninérgicas del rafe dorsal y como heterorreceptor en neuronas del prosencéfalo (principalmente hipocampo, septum lateral y amígdala central) (Redolar, 2012). En los últimos 25 años se ha investigado el receptor 5-HT1A, sin llegar a tener éxito en el desarrollo de ligandos selectivos con finalidad terapéutica ansiolítica (Olivier, 2015). Aunque es destacable el efecto ansiolítico de la Buspirona (agonista parcial 5-HT1A y antagonista D2) o de la sustancia spinosina (un flavonoide no selectivo que actúa sobre receptores 5-HT1A y GABA-, con efectos ansiolíticos en modelos animales EPM y OF) (Liu et al., 2015), sería interesante también estudiar los efectos de la droga F15599 (agonista 5-HT1A postsináptico) para ayudar a delimitar el papel del sistema serotoninérgico en la ansiedad (Olivier, 2015). Actualmente, a pesar de la falta de ansiolíticos que actúen mediante el receptor 5-HT1A, existen bastantes estudios que muestran la implicación de este receptor en la ansiedad, tanto preclínicos como clínicos (Akimova, Lanzenberger, & Kasper, 2009; Altieri, Garcia-Garcia, Leonardo, & Andrews, 2013; Garcia-Garcia, Newman-Tancredi, & Leonardo, 2014; Olivier, 2015), lo que parece indicar que la alteración del funcionamiento de este receptor es reflejo de un factor de vulnerabilidad en la psicopatología emocional (Garcia-Garcia et al., 2014). Además, en modelos animales también existen evidencias indirectas de que la acción ansiolítica del 5-HT se produce por mediación del receptor 5-HT1A, ya que su genoanulación en ratones produce un perfil ansiogénico no solo a nivel conductual (Gingrich & Hen, 2001; Olivier et al., 2001; Steimer, 2002), sino también a nivel de la respuesta autonómica (Pattij et al., 2002; Steimer, 2002), por lo que parece que existen argumentos sólidos a favor de que la expresión genética del receptor 5-HT1A tiene una función relevante en las conductas relacionadas con la ansiedad. 102 Neuroquímica de la ansiedad Por el contrario, la expresión del gen del receptor 5-HT2A se regula al alza con el estrés crónico o con la administración de glucocorticoides. Los receptores de la familia 5-HT2 son metabotrópicos Gq/11 (con proteína G acoplada positivamente a la enzima fosfolipasa-C “PLc” que produce liberación intracelular de inositol trifosfato “IP3”, ión calcio “Ca2+” diacilglicerol “DAG”), por lo que su activación produce despolarización de la membrana y aumento de la excitabilidad neuronal. Aunque se sabe que la serotonina está implicada en la regulación de la ansiedad, en general, los datos no muestran acuerdo respecto a si la potencia o la disminuye, probablemente porque la función de esta amina depende del tipo de receptor serotoninérgico implicado. Así, un agonista del receptor 5HT2C tal como la metaclorofenilpiperacina (mCPP) tiene efectos ansiogénicos en los seres humanos y pueden inducir ataques de pánico, obsesiones, y otros síntomas neuropsiquiátricos, mientras que inhibidores selectivos de la recaptación de 5-HT (ISRS) y fármacos selectivos del receptor 5-HT1A o 5-HT3 pueden tener efectos ansiolíticos en animales (Bagdy, 1998; Steimer, 2002). Sobre la base de los datos obtenidos de modelos animales, Graeff (1996; 1997) propuso una hipótesis serotoninérgica dual en la regulación del miedo, en la que sugiere que la inervación serotoninérgica de la amígdala y del hipocampo media los efectos ansiogénicos de la estimulación del receptor 5-HT2A, mientras que la expresión de los receptores 5-HT1A en el hipocampo y la corteza podría tener un efecto ansiolítico (Redolar, 2012). Este investigador afirmó que la vía serotoninérgica ascendente que procede del núcleo del rafe dorsal inerva la amígdala y la corteza frontal facilitando el miedo condicionado, mientras que la vía del DRN periventricular inerva la sustancia gris periacueductal (PAG) inhibiendo las reacciones innatas de lucha/huida ante un peligro inminente. Además, propuso que la vía que conecta el núcleo rafe medial (MRN) al hipocampo puede provocar resistencia al estrés crónico facilitando la transmisión de 5HT1A hipocampal. Estos resultados demuestran que no es posible sacar conclusiones sobre la función ansiogénica o ansiolítica del 5-HT, sin considerar su lugar de acción en el cerebro y los subtipos de receptores implicados.  Dopamina El estrés agudo incrementa la liberación de dopamina en múltiples regiones cerebrales. Las proyecciones dopaminérgicas al córtex prefrontal medial son más sensibles a este efecto en comparación con las proyecciones mesoaccúmbicas o las Psicobiología de la agresión y la ansiedad 103 nigroestriatales. La dopamina tiene un papel importante en el miedo y la ansiedad modulando el freno que la CPFm ejerce sobre la información ansiogénica que proviene de la amígdala. Además, ejerce una influencia importante en el microcircuito entre el núcleo basolateral y el núcleo central de la amígdala. Conductualmente, la administración intramigdalina de agonistas y antagonistas D1 produce efectos ansiogénicos y ansiolíticos, respectivamente, en modelos de miedo condicionado e incondicionado. Esto sugiere que los receptores D1 tiene una función ansiogénica en la amígdala. Sin embargo, el efecto de los fármacos agonistas y antagonistas D2 depende más bien de la naturaleza de la amenaza, por lo que puede ser que esté implicado en la creación de respuestas adaptativas frente a estímulos aversivos. Estos datos sugieren que los receptores dopaminérgicos de la amígdala tienen funciones distintas en la modulación de la ansiedad en animales (De La Mora, Gallegos-Cari, Arizmendi-García, Marcellino, & Fuxe, 2010). Además, se ha hallado que el sistema dopaminérgico se encuentra inhibido por otros sistemas de neurotransmisión como el del GABA y el 5-HT, lo que puede ser un factor esencial en los trastornos de ansiedad. En este sentido, una reducción de GABA-A, 5-HT1A y del transportador de serotonina (SERT) pueden ser que derive en un aumento de la actividad de la vía mesolímbica dopaminérgica y en una sensibilización del receptor D2 del estriado, debido al aumento de dopamina disponible (Nikolaus, Antke, Beu, & Müller, 2010). En consonancia, en pacientes con altos niveles de ansiedad generalizada y con frecuentes ataques de pánico se han encontrado altas concentraciones plasmáticas de HVA (metabolito DA), lo que indica una hiperfuncionalidad de este neurotransmisor en estos trastornos (Redolar, 2012).  GABA El ácido ɣ-Aminobutírico (GABA) es el neurotransmisor inhibidor más abundante en el cerebro. El receptor GABA-A es una compleja macromolécula acoplada a un canal de Clcon cinco dominios principales de unión a diferentes sustancias. Uno de estos dominios es el receptor en el que se unen las benzodiacepinas, de tal forma que el receptor GABA-A /BZD es el lugar de acción de diversas drogas ansiolíticas (Olivier, Vinkers, & Olivier, 2013; Steimer, 2002). Se ha comprobado que la administración de agonistas de este receptor, como el diacepam (Steimer, 2002), en regiones del sistema límbico y del tronco del encéfalo (como amígdala y PAG) reduce los síntomas de ansiedad en modelos animales. En 104 Neuroquímica de la ansiedad concreto, el efecto ansiolítico parece estar mediado por la subunidad ɑ2 del receptor GABA-A, pero no por las subunidades ɑ1 o ɑ3 (Redolar, 2012; Wislowska-Stanek et al., 2013). Por el contrario, los antagonistas del receptor GABA-A provocan ataques de pánico y aumento de la ansiedad anticipatoria en pacientes con trastorno de pánico. También se ha comprobado que la administración de agonistas inversos produce un claro perfil ansiogénico, como ocurre con las β-carbolinas (Steimer, 2002), que incrementan la presión sanguínea, la tasa cardíaca y los niveles de cortisol y de catecolaminas en sangre; o el de la sustancia L-655,708 (Navarro, Burón, & Martín-López, 2002) que reduce la exposición a los espacios abiertos en ratones expuestos al laberinto elevado en cruz. Este efecto ansiogénico podría estar mediado por la subunidad ɑ5 del receptor GABA-A, presente principalmente en el hipocampo y el bulbo olfatorio, regiones que han sido implicadas en la modulación de la ansiedad (Bailey, Tetzlaff, Cook, He, & Helmstetter, 2002; Navarro et al., 2002). En conjunto, la transmisión del GABA parece tener un papel fundamental en los trastornos relacionados con la ansiedad (Tasan et al., 2011).  Glutamato El glutamato, principal excitador del sistema nervioso, también participa en el procesamiento de la ansiedad y de sus trastornos relacionados (Cortese & Phan, 2005). Parece ser que existe una relación inversa entre el nivel de glutamato presente en el CPFm y el aumento de conductas de riesgo observado en ratas expuestas al EPM (Cortese et al., 2010). Otros estudios, han hallado una concentración elevada de glutamato en el sistema límbico en animales sometidos a un aprendizaje de miedo condicionado (Walker & Davis, 2002) y en ratones con un nivel de ansiedad rasgo elevado (Zhang et al., 2011). Por otra parte, las sustancias que alteran la transmisión del glutamato tienen efectos sobre las conductas relacionadas con la ansiedad (Cortese & Phan, 2005). En ratas expuestas al laberinto elevado en cruz, se ha encontrado una posible relación inversa entre la ejecución de conductas de riesgo y el nivel de glutamato en la corteza prefrontal medial, mientras que se observa una asociación positiva con el nivel de glutamato en el hipocampo (Cortese et al., 2010). En humanos sanos, se ha observado un incremento de la concentración de glutamato tras la inducción de pánico con colecistoquinina (Zwanzger et al., 2013). Otro estudio reciente, demuestra la relación entre alteraciones del glutamato Psicobiología de la agresión y la ansiedad 105 en ciertas regiones cerebrales (córtex cingulado anterior e hipocampo) y la respuesta de ansiedad en sujetos sanos (Modi et al., 2014).  Neuroesteroides neuroactivos (NAS) Los neuroesteroides neuroactivos (NAS) son esteroides que, independientemente de su origen, son capaces de modificar o modular la actividad neuronal. Los NAS se unen y modulan a diferentes tipos de receptores, por ejemplo, son esenciales en la modulación alostérica del receptor GABA-A, receptores sigma, así como receptores de la familia del glutamato (NMDA, AMPA, y kainatos), entre otros (Dubrovsky, 2005). Se ha demostrado que regulan el estado de ánimo, interfiriendo en trastornos de depresión, ansiedad, sueño y de memoria (Dubrovsky, 2005; Majewska, 1987). En concreto, los moduladores alostéricos positivos del GABA tales como la progesterona y la alopregnanolona, tienen efectos ansiolíticos en modelos animales. Los neuroesteroides son un importante neuromodulador endógeno en la fisiología y patofisiologia de la ansiedad y pueden constituir una línea de tratamiento para estos trastornos (Longone et al., 2011).  Neuropéptidos Hormona Adrenocorticotropa (CRH). En condiciones de estrés agudo, la activación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal produce un aumento de glucocorticoides en sangre. Estas sustancias suprimen la actividad del eje y reducen la expresión del CRH en el núcleo paraventricular del hipotálamo. Se ha demostrado que la retroalimentación positiva provocada por los glucocorticoides en la actividad extrahipotalámica del CRH, en la amígdala y en el núcleo del lecho de la estría terminal, contribuye a la producción de los síntomas de ansiedad que aparecen en diferentes trastornos, principalmente mediada por la estimulación de los receptores CRH-R1. Además, existe una interacción recíproca entre el eje HPA y la noradrenalina. Por una parte, la secreción de CRH aumenta la actividad neurona en el LC provocando un aumento de la liberación de NA en distintas regiones corticales y subcorticales. Por otra parte, la liberación de NA estimula la secreción del CRH en el núcleo paraventricular del hipotálamo. Colecistoquinina (CCK). Es un neuropéptido que se encuentra principalmente en la corteza, el hipocampo, la sustancia negra, los núcleos del rafe, la amígdala y la sustancia gris periacueductal. Se ha comprobado que los antagonistas de los receptores CCK tienen 112 Clasificación de los modelos animales de agresión Tabla 3.3 Clasificaciones de las conductas agresivas típica de la especie Clasificación de la agresión animal según el estímulo elicitador (Moyer, 1968; Valzelli, 1988) A. Predatoria Provocada por la presencia de una presa natural A. entre machos (Competitiva, según Valzelli) Provocada por la presencia de un competidor masculino de la misma especie. Cuando el animal establece jerarquías en una colonia también puede llamarse agresión jerárquica o dominante. A. inducida por miedo (Defensiva, según Valzelli) Provocada por el confinamiento o acorralamiento sin posibilidad de escape o por la presencia de algún agente amenazador A. Irritativa Provocada por la presencia de cualquier organismo u objeto atacable, o por estímulos especialmente nocivos o dolorosos (p.ej. “foot-shock”) A. Territorial Provocada por la necesidad de defensa de un área frente a los intrusos. Se vincula a las conductas de cortejo y reproducción. En muchas especies es estacional y se encuentra ligado a un fuerte control hormonal. A. Maternal Provocada por la proximidad de algún agente amenazador para las crías de la hembra. A. Sexual Provocada por estímulos sexuales ligados a la obtención de pareja. A.Instrumental Tendencia a comportarse agresivamente cuando en el pasado esta conducta ha sido particularmente reforzada. Clasificaciones dicotómicas de la agresión animal Afectiva vs. Predatoria (Ramírez & Andreu, 2006; Reis et al., 1973; Vitiello et al., 1990) -A.Afectiva: Agresión que se acompaña de una fuerte descarga simpática, por la presencia de diferentes estímulos que son percibidos como una amenaza. Incluye la agresión agonística tanto ofensiva como defensiva, y todos los tipos de agresión expuestos por Moyer a excepción de la A. predatoria. -A.Predatoria: Es la agresión provocada por la presencia de una presa natural y se caracteriza porque no se acompaña de activación simpática. Reactiva vs. Proactiva (Crick & Dodge, 1996; Dodge & Coie, 1987; Kempes et al., 2005) -A.Reactiva: En reacción a una agresión, provocación o amenaza percibida. -A.Proactiva: Iniciado intencionalmente para resolver un conflicto, conseguir un beneficio o recompensa, y que no implican que la motivación sea hacer daño a la víctima. Hostil-Impulsiva vs. Instrumental (Crick & Dodge, 1996; Kingsbury et al., 1997) Dependiendo de si la conducta agresiva se realiza porque ha sido reforzada, o por el contrario se trata de una conducta agresiva primaria. Impulsiva o “en caliente” vs. Premeditada o “en frio” (Barratt & Slaughter, 1998; Houston et al., 2003) Similar a la anterior enfatizando el componente cognitivo y la baja activación del sistema autónomo de la agresión premeditada o “en frio”. Defensiva vs. Ofensiva (Adams, 2006; Blanchard & Blanchard, 1989; Brain, 1979; Dodge & Coie, 1987; Parmigiani & Palanza, 1996; Pulkkinen, 1987; Wall, Blanchard, & Blanchard, 2003) Clasificación dicotómica de la conducta agresiva agonística que se produce en encuentros entre miembros de una misma especie. Psicobiología de la agresión y la ansiedad 113  Modelos animales de agresión basados en la manipulación ambiental Agresión inducida por aislamiento. El modelo de agresión inducida por aislamiento tiene una gran relevancia en el estudio de la conducta agonística del ratón macho. Después de un periodo de aislamiento el ratón macho adulto, como muchas otras especies de mamíferos, presentan un aumento de conductas agonísticas ofensivas cuando son confrontados con otro ratón macho (Miczek & Winslow, 1987). En general, se ha apreciado una correlación directa entre la duración del periodo de aislamiento y la proporción de animales que exhiben un aumento de la frecuencia e intensidad de la conducta agresiva (Miczek & Winslow, 1987; Valzelli, 1973). En ratones, este periodo de aislamiento dura varias semanas, aproximadamente un mes en la mayoría de los estudios, y el terreno para el encuentro agonístico suele ser una arena neutral. Por otra parte, es importante enfrentar al animal aislado a un oponente con una conducta estándar para evitar que la reacción de éste constituya una variable extraña en el modelo. Este paradigma ha mostrado una buena validez predictiva y se ha llegado a utilizar bastante en los estudios farmacológicos para el “screening” de compuestos que pueden reducir la agresión (Malick, 1979). Una cuestión que suele plantearse es si este paradigma representa una conducta agresiva anormal, o bien, si refleja un patrón conductual normal típico del ratón territorial que vive aislado de otros machos. Se ha comprobado que cuando se compara la conducta del ratón aislado con la de ratones alojados en grupo en el laboratorio, se observan diferentes perfiles conductuales y fisiológicos; sin embargo, cuando se compara con ratones homólogos fuera del laboratorio las diferencias se diluyen hasta apenas apreciarse (Brain, 1975; Miczek & Winslow, 1987; Scott, 1966). En el caso concreto de esta especie es así porque el ratón tiende a aislarse en la edad adulta en busca de un territorio propio del que pueda a excluir a otros machos en edad de procrear, por lo que el modelo aprovecha este factor de gran territorialidad presente en el repertorio natural del ratón y lo utiliza para incrementar el nivel de agresión de una forma controlada y natural. Agresión inducida por paradigma “intruso-residente”. Un modelo animal en el que se puede observar con fiabilidad la conducta agresiva de tipo territorial es el paradigma intruso-residente (Koolhaas & Bohus, 1991; Thurmond, 1975). En este paradigma se estudia la respuesta de un animal, normalmente una rata o un ratón, cuando en su propio territorio se introduce a un congénere intruso dando lugar a una lucha por el territorio que puede ser muy intensa (Blanchard & Blanchard, 1989). Aunque se pueden usar muchas 114 Clasificación de los modelos animales de agresión especies vertebradas, la mayoría de los estudios utilizan roedores porque se caracterizan por su elevada agresión territorial (Miczek et al., 2007). El termino agresión territorial se aplica a la conducta de un macho que controla un territorio exclusivo, en el cual procura atraer a las hembras fértiles y excluir o dominar a los demás machos adultos (Mackintosh, 1970; Miczek et al., 2007). Un aspecto atractivo del paradigma intruso-residente es que permite analizar el repertorio conductual agonístico completo de ambos participantes, siendo lo usual que el residente exhiba una conducta predominantemente ofensiva, mientras que la del intruso suele ser predominantemente defensiva. Agresión inducida por paradigma “intruso-colonia”. Este paradigma, aplicable tanto en ratas como en ratones, es una variación del paradigma intruso-residente en la que se trata de introducir un intruso en un grupo establecido (Litvin, Blanchard, Pentkowski, & Blanchard, 2007; Vandenbergh, 1967). La diferencia fundamental entre ambos paradigmas es que el primero es más típico de ciertas especies, mientras que el segundo es más fácilmente generalizable. Agresión maternal. El paradigma de agresión maternal se basa en la observación de que los roedores hembras con crías o en gestación muestran conductas ofensivas hacia una gran variedad de intrusos. Se ha comprobado que existe un periodo crítico para la agresión que va desde antes de la gestación hasta alcanzar un pico máximo una semana tras el parto durante la primera parte del periodo de lactancia, e incluye tanto conductas defensivas como ofensivas hacia intrusos (Haney, Debold, & Miczek, 1989; Hurst, 1987; Lonstein & Gammie, 2002; Noirot, Goyens, & Buhot, 1975; Sgoifo, Stilli, Musso, Mainardi, & Parmigiani, 1992). El uso de un paradigma de agresión femenina resulta bastante infrecuente pues requiere de una extensa planificación; sin embargo, en ratas hembra ha demostrado tener una validez predictiva comparable a la de paradigmas ofensivos en ratas machos (como el residente-intruso) y ratones machos (agresión inducida por aislamiento) (Olivier & Young, 2002). Agresión inducida por dolor. Este paradigma, normalmente utilizado en ratas y ratones, consiste en suministrar descargas eléctricas controladas en las patas traseras de dichos animales, permitiendo controlar variables como la intensidad, duración del shock y número de exposiciones (Dixon & Kaesermann, 1987). Tras la corriente, pueden darse diversa manifestaciones de conductas defensivas, como por ejemplo gritos, intentos de huida y posturas defensivas. Actualmente, se ha relegado el uso de este paradigma en pruebas de “screening” farmacológicas por el posible enmascaramiento del dolor debido Psicobiología de la agresión y la ansiedad 115 a efectos analgésicos de las sustancias evaluadas. Otro factor limitante es que el repertorio conductual observado en este paradigma es bastante reducido respecto a otros. Agresión predatoria. La agresión predatoria puede definirse como el tipo de ataque que se evoca mediante la presencia de una presa natural, y se puede observar típicamente en todas las especies carnívoras. El procedimiento experimental para provocar este tipo de conducta suele ser simple; en el caso del ratón éste permanece en su propia jaula y se evalúa la conducta tras introducción de una posible presa. Se ha discutido si el hecho de matar a una presa puede considerarse una forma de agresión (Koolhaas & Bohus, 1991; O'Boyle, 1974). Este tipo de conducta predatoria presenta diversas diferencias respecto a la conducta de lucha entre machos (Koolhaas & Bohus, 1991; Lynds, 1980), por lo que se deben extremar las precauciones con la extrapolación de la conducta predatoria a otras formas de conducta agresiva.  Modelos animales de agresión basados en manipulación biológica Agresión inducida por estimulación o lesión. Los primeros modelos animales de agresión patológica se vinculan a la lesión cerebral o a la estimulación de diversas regiones cerebrales (Haller & Kruk, 2006). En animales, se ha registrado un aumento de la agresión defensiva tras la lesión del área prefrontal (De Bruin, Van Oyen, & Van De Poll, 1983), del septum, el accumbens medial y el hipotálamo medial (Albert & Walsh, 1984). Por otra parte, la estimulación del hipotálamo mediolateral puede provocar una forma extrema de ataque no selectiva ya que entre otras cosas parece que afecta a la locomoción (Kruk, 1991). La estimulación de la zona ventral de la sustancia gris induce una agresión silenciosa característica de la predación, mientras que la zona dorsal participa en la ejecución de conductas defensivas. También se ha comprobado que la estimulación del núcleo basomedial de la amígdala y de la estría terminal es capaz de desencadenar reacciones agresivas duraderas pero sin direccionalidad, indicando que se trata más de un centro modulador de la agresión. El objetivo inicial de estos modelos ha sido el de analizar por separado las funciones locales de diferente áreas cerebrales para correlacionar la conexión de estas regiones con el comportamiento agresivo. Sin embargo, este enfoque ha sido criticado porque presenta grandes dificultades al explicar conductas tan complejas como la agresión, en la cual intervienen procesos sensoriales, motores y emocionales que obviamente no están localizados en una sola área cerebral. 116 Clasificación de los modelos animales de agresión Por ello, es más interesante tratar de comprender la organización funcional de los circuitos neurales interrelacionados que participan en la modulación de la agresión. Agresión inducida por sustancias. Las drogas pueden presentar efectos facilitadores o inhibidores de la agresión, dependiendo de su mecanismo de acción y de factores menos obvios como la pureza de la sustancia, la dosis, contexto en el que se suministren (Azpiroz, Garmendia, & Sánchez, 1988; Olivier & Young, 2002). Además, hay que tener en cuenta estos efectos sobre la agresión generalmente no son específicos, es decir, pueden alterar otras conductas del individuo, o bien producir una alteración general del sistema motor que interfiera en la ejecución de la conducta agresiva, por ejemplo el efecto sedante que inducen los neurolépticos. Actualmente, existe un gran interés en estudiar las sustancias con potencial para modular la conducta agresiva. Entre los modelos de agresión inducida por sustancias el uso de alcohol o de esteroides anabolizantes ha demostrado ser un modelo plausible de agresión escalada o patológica. Psicobiología de la agresión y la ansiedad 117 Tabla 3.4 Modelos animales de agresión según el tipo de manipulación y de agresión evaluada (Miczek et al., 2007; Olivier & Young, 2002; Takahashi, Quadros, De Almeida, & Miczek, 2011) Modelos con manipulación ambiental Test Tipo de agresión Sujetos Descripción Referencias Test de Agresión inducida por aislamiento “Intermale” o Territorial Ratones El macho aislado durante un tiempo normalmente 1 mes (aunque según el estudio varía de 24h-2 meses) se somete a un encuentro en un terreno neutro (“intermale” o competitiva) o a un encuentro intruso-residente (agresión territorial). También hay estudios en ratas, pero se suele realizan en ratones. (Cairns & Nakelski, 1971; Malick, 1979; Valzelli & Bernasconi, 1979; Wall, Fischer, & Bland, 2012) Test IntrusoResidente Territorial Ratones y hamsters Requiere un territorio establecido. En laboratorio, la jaula del macho experimental (residente) donde se empareja con una hembra. En la jaula se introduce un animal macho extraño (intruso) que ha estado previamente alojado con otros machos. (De Almeida, Rowlett, Cook, Yin, & Miczek, 2004; De Boer, Lesourd, Mocaer, & Koolhaas, 1999; Lumley et al., 2000; Miczek & O'Donnell, 1978; Nakamura, Kikusui, Takeuchi, & Mori, 2007) Test intrusocolonia Dominante Primates y ratas En una colonia estable donde la jerarquía está establecida se introduce un macho extraño (intruso) que ha estado previamente alojado en grupo con otros machos. (Litvin et al., 2007; Vandenbergh, 1967) Test del tubo (Agresión dominante) Dominante Ratones Dos ratones se colocan en extremos opuestos de un tubo estrecho. Se espera que el macho dominante fuerce al oponente a salir del tubo. (Wang et al., 2011) Test de agresión maternal Maternal Ratas, ratones y hamsters En una jaula con hembras con crías lactantes (en un periodo postparto de 1 a 7 días), se introduce un intruso que puede ser macho o hembra. (Haney et al., 1989; Hurst, 1987; Lonstein & Gammie, 2002; Noirot et al., 1975; Sgoifo et al., 1992) Test Footshock Irritativa Ratas, ratones El shock eléctrico en patas o en la cola es el estímulo nocivo más utilizado en los modelos irritativos. Se dispone de una jaula con suelo enrejado por el cual se aplica una corriente eléctrica. El sujeto se mueve enérgicamente en el compartimento y pueden adoptar una posición erguida de combate o “boxing”. Este modelo más bien evoca posturas defensivas que ofensivas, por lo que es de interés limitado. (Berkowitz, 1993; Fard, Bahaeddini, Shomali, & Haghighi, 2014; Kovacsics & Gould, 2010; Roliński & Herbut, 1981) Test de agresión entre hembras Sexual Ratas, Hamsters En la jaula de la hembra se coloca un macho adulto y se empareja. Después se introduce como intrusa a una hembra sexualmente adulta. (Bowler, Cushing, & Carter, 2002; Gutzler, Karom, Erwin, & Albers, 2010; Martín-Sánchez et al., 2015; Payne & Swanson, 1972; Stockley, Bottell, & Hurst, 2013) 118 Clasificación de los modelos animales de agresión Tabla 3.4. (Continuación) Test de agresión inducida por Instigación Social Agresión Escalada Ratas, ratones y hamsters El macho residente es expuesto en su jaula ante otro macho protegido por un cilindro de policarbonato perforado sin posibilidad de interacción directa. Después el macho residente se somete al test intruso-residente con otro macho. (Centenaro et al., 2008; Fish, Faccidomo, & Miczek, 1999; MartínLópez, Infante, Cavas, & Navarro, 2014; Nakamura, Kikusui, Takeuchi, & Mori, 2008) Test de Agresión inducida por frustración mediante extinción Agresión Escalada Ratas, ratones y hamsters Se entrena a un macho residente para obtener una recompensa. Se omite la recompensa antes de exponerlo al test intruso-residente. (Berkowitz, 1993; De Almeida & Miczek, 2002) Modelos con manipulación biológica Test Tipo de agresión Sujetos Descripción Referencias Agresión inducida por estimulación Agresión defensiva con ira Ratas y gatos Estimulación eléctrica (0.20.8mA, 63Hz, 1ms por medio ciclo de duración) en el hipotálamo medial o en la PAG. (Hess & Akert, 1955; Koolhaas, 1978; Kruk, 1991; Leyhausen & Tonkin, 1979; Roberts & Nagel, 1996; Siegel, Roeling, Gregg, & Kruk, 1999) Agresión inducida por alcohol Agresión Escalada Ratas y ratones Los animales reciben etanol (1 mg/kg) por vía oral o intraperitoneal antes de exponerlo al test intrusoresidente (Blanchard, Hori, Blanchard, & Hall, 1987; Brain, Miras, & Berry, 1993; De Almeida, Nikulina, Faccidomo, Fish, & Miczek, 2001; Faccidomo, Bannai, & Miczek, 2008; Fish et al., 1999; Heinz, Beck, Meyer-Lindenberg, Sterzer, & Heinz, 2011; Miczek, Weerts, Tornatzky, Debold, & Vatne, 1992; Miczek, Barros, Sakoda, & Weerts, 1998; Quadros, Miguel, Debold, & Miczek, 2009) Agresión inducida por depleción serotoninérgica Agresión Escalada Se reduce la serotonina mediante la dieta o administración de fármacos, antes de exponerlo al test intruso-residente (Bell, Abrams, & Nutt, 2001; Kantak, Hegstrand, Whitman, & Eichelman, 1980) Agresión inducida por depleción de glucocorticoides Agresión Escalada Ratas Los animales son adrenalectomizados y se les implanta un dispositivo depot con baja liberación de corticosterona. (Haller, Van De Schraaf, & Kruk, 2001; Haller, Halasz, Mikics, & Kruk, 2004) Agresión inducida por administración crónica de esteroides androgénicoanabolizantes (AAS) Agresión Escalada Ratas y hamsters La exposición crónica a AAS por vía subcutánea diaria durante un mes en la pubertad. (McGinnis, 2004; Melloni, Connor, Hang, Harrison, & Ferris, 1997; Melloni Jr & Ricci, 2010) Selección de cepas agresivas Agresión escalada Ratón Crianza selectiva de individuos altamente agresivos, en la siguiente generación se vuelven a analizar y seleccionar. (Cairns, MacCombie, & Hood, 1983; Gammie, Garland Jr, & Stevenson, 2006; Sandnabba, 1996; Van Oortmerssen & Bakker, 1981) Psicobiología de la agresión y la ansiedad 119 3.3.2. Neuroanatomía de la conducta agresiva Los circuitos cerebrales que se hallan activados en roedores durante los encuentros agresivos implican una serie de estructuras que se han identificado mediante estudios de resonancia magnética funcional y expresión c-Fos. Entre las áreas cerebrales implicadas en la conducta agresiva entre machos destacan: el córtex prefrontal (CPF), el área preóptica medial (MPOA), el septum lateral (LS), algunos núcleos hipotalámicos conocidos en general como el “Área de ataque hipotalámica” (HAA), el núcleo paraventricular del tálamo (PVN), la amígdala central y medial (CeA y MeA), el núcleo laminar de la estría terminal o amígdala extendida (BNST), así como diversas estructuras del tronco cerebral tales como la sustancia gris periacueductal (PAG), el locus coeruleus (LC) y el núcleo dorsal del rafe (DRN) (Takahashi & Miczek, 2014). Los estudios indican una superposición importante de las áreas relacionadas con la conducta agresiva entre machos y otros tipos de conducta agresiva como la maternal y la agresión escalada. No obstante, también se aprecian algunas diferencias, por ejemplo la activación de la PAG se ha registrado durante la agresión típica de la especie (tanto en la agresión entre machos como en la maternal), mientras que el nivel de activación de esta estructura parece inhibirse durante la agresión patológica o escalada. Es necesario aclarar que la actividad de las áreas cerebrales citadas no es específica de la conducta agresiva, pero en conjunto resultan esenciales para comprender el circuito de la agresión en roedores, así como en primates no humanos y en humanos (Nelson & Trainor, 2007; Takahashi & Miczek, 2014).  Hipotálamo El hipotálamo es una de las regiones cerebrales que se ha estudiado en mayor profundidad en relación con la agresión. El área de ataque hipotalámica (HAA) es una región que contiene diversos núcleos como el núcleo anterior (AH), el ventromedial (VMH) y el lateral (LH). Ya desde principios del siglo XX, los primeros estudios de estimulación del HAA en gatos sugerían que esta área estaba implicada en la conducta de ataque (Hess & Akert, 1955; Leyhausen & Tonkin, 1979). También se ha observado que la estimulación eléctrica de los núcleos VMH y LH induce un tipo de conducta agresiva anormal o patológica en ratas, que se caracteriza por dirigirse a las zonas más vulnerables y por no tener en cuenta características del oponente como el género o incluso si está muerto o anestesiado (Koolhaas, 1978; Kruk, 1991; Roberts & Nagel, 1996; Siegel et al., 120 Neuroanatomía de la conducta agresiva 1999). En esta misma línea, el reciente uso de técnicas optogenéticas en el hipotálamo de ratones machos (en particular la estimulación óptica de opsinas ChR2 expresadas de forma artificial en el VMHvl), parece provocar ataques hacia oponentes machos o hembras e incluso a objetos inanimados (Lin et al., 2011). Se ha llegado a sugerir que el VMHvl podría funcionar como un interruptor de la conducta de ataque; sin embargo, esta hipótesis resulta bastante aventurada y requeriría de estudios optogenéticos más exhaustivos sobre subpoblaciones neuronales específicas de esta área. La vasopresina arginina (AVP) es un neuromodulador de la actividad del hipotálamo y se ha demostrado que la activación de los receptores V1aR de esta región aumenta la conducta agresiva en roedores machos, mientras que su bloqueo la reduce (Falkner, Dollar, Perona, Anderson, & Lin, 2014).  Corteza prefrontal (CPF) La corteza prefrontal es una región que está conectada funcionalmente con varias áreas ligadas a la agresión como el hipotálamo, la amígdala y el DRN (Takahashi & Miczek, 2014). Existen evidencias de la relevancia del córtex prefrontal en el control inhibitorio de la agresión en estudios con roedores y primates, incluyendo humanos (Nelson & Trainor, 2007). En concreto, se ha relacionado la actividad de dos subregiones del CPF, la CPF medial y orbitofrontal (CPFm y COF), con la regulación de diversas formas de agresión típica de la especie: agresión entre machos en ratones y ratas (Halasz, Toth, Kallo, Liposits, & Haller, 2006; Haller & Kruk, 2006; Wall et al., 2012), agresión de tipo dominante en test específicos de dominancia social en ratones (Wang et al., 2011) y agresión inducida por aislamiento en ratas (Wall et al., 2012). En relación con la COF, algunos estudios indican que la lesión bilateral de esta área es capaz de producir un incremento de agresión entre machos en ratas (De Bruin et al., 1983). Por su parte, estudios con técnicas farmacológicas apuntan a que la serotonina y los receptores 5-HT1B desempeñan un papel importante en la modulación de la corteza prefrontal y, por tanto, en la inhibición de la conducta agresiva. Existen evidencias de que la administración de agonistas serotoninérgicos de los receptores 5-HT1B en el COFv es capaz de inhibir la agresión entre machos, además de otros tipos de agresión como la maternal o incluso la agresión inducida por instigación (Centenaro et al., 2008; De Almeida et al., 2006; Veiga, Miczek, Lucion, & Almeida, 2007). Psicobiología de la agresión y la ansiedad 121 En el CPFm también se ha observado que la activación de los receptores 5-HT1B es capaz de disminuir la agresión territorial típica de la especie (Faccidomo, Quadros, Takahashi, Fish, & Miczek, 2012). Sin embargo, cuando la estimulación se realiza bajo los efectos del alcohol, se da lugar a un aumento de la conducta agresiva que no se observa en idénticas condiciones en el área COF (Faccidomo et al., 2008). Mediante técnicas de microdiálisis in vivo se ha comprobado que el nivel extracelular de 5-HT en el CPFm se reduce durante y después de encuentros agresivos típicos de la especie en ratas (Van Erp & Miczek, 2000). Estos hallazgos parecen indicar que las neuronas serotoninérgicas del área CPFm están especialmente implicadas en la regulación de la conducta agresiva típica de la especie. Por otra parte, existen evidencias de que los ratones dominantes alojados en grupo presentan una actividad c-Fos mayor en las neuronas glutamatérgicas CPFm, y que la manipulación de receptores AMPA se relaciona directamente con cambios en el rango social (Wang et al., 2011). El uso de la técnica optogenética para modular la actividad de las neuronas excitadoras del PFCm durante los encuentros agresivos en ratones machos parece indicar que la activación del CPFm inhibe la conducta agresiva entre machos específicamente, sin afectar a otras conductas del repertorio agonístico.  Núcleo Dorsal del Rafe El núcleo del rafe es una estructura mesencefálica del sistema nervioso de los mamíferos que se considera clave en la producción del neurotransmisor serotonina. En concreto, el núcleo del rafe dorsal (DRN) contiene la mayor parte de los cuerpos celulares de las neuronas serotoninérgicas, y envía proyecciones eferentes hacia regiones límbicas y el córtex. Desde su descubrimiento, la serotonina se ha considerado un neurotransmisor clave en el neurocircuito que controla la agresión en varias especies animales. Por ejemplo, en ratas se ha detectado un aumento de la actividad c-Fos de neuronas serotoninérgicas del DRN después de encuentros agonísticos (Van Der Vegt et al., 2003). En los primeros estudios clínicos y preclínicos, la mayoría de las hipótesis sobre la conducta agresiva, hostil o violenta, se relacionaban con un déficit serotoninérgico. Estos individuos podían beneficiarse de tratamientos farmacológicos que aumentaban de forma fásica el nivel extracelular de serotonina mediante inhibición de transportador 5-HT (usando ISRSs), la activación de receptores 5-HT1A (buspirona) o el bloqueo de receptores 5-HT2A (risperidona). Sin embargo, la naturaleza de esta relación no es simple y aún en la actualidad es patente la dificultad que conlleva desentrañar el papel preciso 128 Neuroquímica de la conducta agresiva 5-HT3, inhibiendo posiblemente a neuronas serotoninérgicas (Melloni Jr & Ricci, 2010; Ricci, Grimes, & Melloni, 2004), por lo que en este ejemplo de modulación presináptica, la presencia de serotonina inhibe en vez de activar la transmisión serotoninérgica de la neurona postsináptica, relacionando directamente la presencia/ausencia de serotonina con el aumento/inhibición de la respuesta agresiva. Este fenómeno explicaría la regulación al alza del receptor 5-HT3 en la agresión inducida por cocaína (Ricci et al., 2004), y también sería un mecanismo plausible para explicar algunos efectos de la administración crónica de ISRSs como la fluoxetina (Ricci & Melloni, 2012). El control de la conducta agresiva también parece depender de la interacción entre el sistema serotoninérgico y el sistema vasopresina arginina (AVP). La cantidad de datos conductuales, farmacológicos, neurofisiológico y neuroanatómicos sugieren que la serotonina y las estructuras sensibles a la serotonina son los responsables principales de la conducta agresiva asociada con la actividad del sistema AVP (Morrison & Melloni, 2014). El hipotálamo parece cumplir la función de “hub” para las interacciones AVP/5HT y constituir el lugar de convergencia más importante en cuanto a anatomía conservada evolutivamente que regula la conducta agresiva.  GABA El ácido gamma – aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio en el sistema nervioso central, mientras que el glutamato es su principal neurotransmisor excitatorio. Los estudios genéticos y farmacológicos muestran que casi todos los subtipos de los receptores GABA (GABA-A GABA-B) y los receptores de glutamato (NMDA, AMPA, kainato y mgluRs) están implicados en la agresión. Resulta evidente que existe una relación entre el balance de estos neurotransmisores con la regulación de la conducta agresiva típica de la especie (Garcia-Garcia et al., 2009; Herman, Mueller, & Figueiredo, 2004; Miczek et al., 2007; Takahashi & Miczek, 2014). Sin embargo, aún estamos lejos de determinar la naturaleza y dirección de esta relación ya que los estudios no son coincidentes. En este aspecto, la poca variedad de ligandos selectivos disponibles supone una dificultad añadida para abordar de forma sistemática el estudio farmacológico de estos receptores sobre la agresión, máxime teniendo en cuenta que se expresan en la mayoría de las neuronas cerebrales y que además presentan una elevada heterogeneidad. Se estima que la función de cada uno de estos receptores puede variar dependiendo de la composición de sus subunidades, su localización y el tipo de conducta agresiva estudiada. Psicobiología de la agresión y la ansiedad 129 Receptores GABA-A. La implicación de los receptores GABA-A en la conducta agresiva está bastante fundamentada, pero delimitar su efecto es complicado dada la gran heterogeneidad de su composición. El receptor de GABA-A es el receptor gabaérgico que se encuentra más extendido en el sistema nervioso de los mamíferos. Es un receptor ionotrópico complejo con cinco subunidades que conforman un canal de cloro, por lo que su activación induce una hiperpolarización de la membrana. Se han encontrado siete tipos principales de familias de subunidades (α, β, γ, δ, ε, θ, π), y algunas familias son además isomorfas (α1-6, β1-3, γ1-3). Este receptor presenta lugares de reconocimiento para el GABA (α-β), también para moduladores alostéricos positivos que aumentan la eficiencia del receptor tales como las benzodiacepinas (α[1,2,3,5]- γ), barbitúricos, neuroesteroides o el etanol, y también para moduladores alostéricos negativos como el flumacenil. Además, se ha observado que la distribución del GABA-A en la membrana neuronal difiere en función de su composición, de forma que los receptores con subunidades ɑ[1,2,3] presentan una localización sináptica y son responsables de la inhibición fásica cerebral, mientras que los que portan las subunidades ɑ[4,5,6] están presentes en las zonas extrasinápticas mediando la inhibición tónica GABAérgica (Martín-López & Navarro, 2010). Son diversos los estudios que apoyan la hipótesis de que un déficit del control inhibitorio del GABA en diversas áreas cerebrales puede ser la base del mecanismo subyacente de la conducta agresiva (Takahashi & Miczek, 2014):  Diversos estudios confirman que en el modelo de agresión inducida por aislamiento (4 semanas) se produce una disminución de la función del GABA-A. Esta hipofuncionalidad parece que viene ligada tanto a una reducción del neuroesteroide alopregnanonlona (modulador alostérico presente en CPF, HPC y amígdala BSL en ratones macho) (Pinna, Dong, Matsumoto, Costa, & Guidotti, 2003), como a una baja sensibilidad de este receptor a diversos moduladores alostéricos tras el aislamiento (Matsumoto et al., 1999; Serra et al., 2000). Además, tras el periodo de aislamiento se ha observado una reducción de la expresión de subunidades GABA-A del hipocampo (α1) y cortex prefrontal (α1, α2, γ2), y el aumento de otras subunidades en el cortex prefrontal (α4, α5) (Pinna et al., 2006).  Estudios en animales altamente agresivos han detectado un bajo nivel de GABA y de su enzima sintetizadora, el ácido glutámico descarboxilasa (GAD), en regiones como el bulbo olfatorio, el estriado y la amígdala (Guillot & Chapouthier, 1996; Guillot & 130 Neuroquímica de la conducta agresiva Chapouthier, 1998; Potegal, Perumal, Barkai, Cannova, & Blau, 1982; Simler, Puglisi-Allegra, & Mandel, 1982).  El receptor GABA-A está implicado en el control hipotalámico de las conductas agresivas. En gatos, se ha demostrado la existencia de neuronas GABA en el hipotálamo medial y lateral que ejercen un control inhibitorio del ataque predatorio u ofensivo (Siegel et al., 1999). En ratas, se ha identificado una densidad importante de neuronas GABAérgicas denominada “área hipotalámica de ataque” (HAA) (Hrabovszky et al., 2005), cuyo bloqueo farmacológico con antagonistas GABA-A es suficiente para generar conductas agresivas de ataque (Adams et al., 1993; Roeling, Kruk, Schuurmans, & Veening, 1993). En humanos, la destrucción quirúrgica del hipotálamo posteromedial produce una eliminación de las conductas violentas (Sano, Yoshioka, Ogashiwa, Ishijima, & Ohye, 1966).  El receptor GABA-A está implicado en el control de la corteza prefrontal de las conductas agresivas. En ratas con niveles altos de agresión se observa una reducción significativa en la actividad de neuronas GABAérgicas tanto en el área infralímbica y medial orbital (áreas que curiosamente solo están activas en ratas agresivas), como en la ínsula agranular y corteza orbital ventral (Halasz et al., 2006).  Varios estudios farmacológicos con moduladores alostéricos positivos de baja selectividad por las subunidades α del receptor GABA-A muestran en general una acción antiagresiva. Entre estas sustancias distinguimos compuestos benzodiacepínicos como clobazam, bentacepam, midazolam (Martín-López & Navarro, 1996; Martín-López & Navarro, 1998; Navarro & López, 1999), o el diacepam y el clordiacepoxido que en el modelo de agresión inducida por aislamiento (Da Vanzo, Daugherty, Ruckart, & Kang, 1966; Krsiak, 1979; Sulcova & Krsiak, 1989) y el modelo intruso-residente (Mitchell & Redfern, 1992), muestran efectos antiagresivos a veces acompañados de efectos motores. Los compuestos no benzodiacepínicos como la zoplicona muestran una acción antiagresiva más específica en modelos de agresión inducida por shock eléctrico (Julou, Bardone, Blanchard, Garret, & Stutzmann, 1983) y conducta muricida en ratas (Ueki, 1987).  En varios estudios farmacológicos con compuestos de afinidad selectiva se ha observado que el zolpidem (agonista selectivo total ɑ1-GABA-A) tiene un efecto antiagresivo en modelos de residente-intruso (De Almeida et al., 2004) y en la Psicobiología de la agresión y la ansiedad 131 agresión inducida por aislamiento (Martín-López & Navarro, 2002). El compuesto L655,708 (agonista selectivo parcial inverso ɑ5-GABA-A) presenta un perfil más ansiogénico que antiagresivo (a dosis altas reduce la conducta agresiva sin afectación motora, pero también aumenta la evitación/huida y la exploración no social), que se confirma en el test elevado en cruz (Casula et al., 2001; Navarro et al., 2002). Sin embargo, la administración del benzotiopeno SB-205384 (agonista selectivo total ɑ3GABA-A) no parece tener efectos sobre la conducta agresiva en el modelo de agresión inducida por aislamiento, a pesar de que la distribución de estos receptores abarca diversas áreas cerebrales implicadas en la regulación de la agresión (Navarro, Buron, & Martín-López, 2008). Por el contrario, también se han descrito efectos proagresivos de moduladores alostéricos del GABA-A en ratones y primates no humanos, de forma similar al efecto “paradójico” descrito en humanos (DiMascio, 1973; Gourley, Debold, Yin, Cook, & Miczek, 2005). Estos estudios informan de que si bien las dosis altas de benzodiacepinas inhiben la agresión, las dosis bajas o moderadas pueden aumentar la conducta agresiva entre machos y la agresión maternal en roedores (Miczek et al., 2007). Por último, señalar que el alcohol, modulador alostérico positivo del GABA-A, está ligado a la violencia y agresión en humanos y es capaz de inducir agresión escalada en aproximadamente un 30% de los roedores machos que lo ingieren (Faccidomo et al., 2008; Fish, Faccidomo, Debold, & Miczek, 2001; Heinz et al., 2011; Miczek et al., 1992; Miczek et al., 1998), potenciando su efecto proagresivo en combinación con el agonista muscimol (Takahashi et al., 2010). Receptores GABA-B. Son receptores metabotrópicos acoplados a una proteína G que media las respuestas de inhibición más lentas y prolongadas del GABA (Jacob, Moss, & Jurd, 2008). Aún no ha sido estudiada en profundidad la función de este receptor metabotrópico en la conducta agresiva. Los estudios disponibles indican que la activación de este receptor con baclofen (agonista GABA-B) parecen reducir en ratas la agresión inducida por electro-shock, etanol o apomorfina (File, Zharkovsky, & Gulati, 1991; Rodgers & Depaulis, 1982; Rudissaar, Pruus, Skrebuhhova-Malmros, Allikmets, & Matto, 2000). Por el contrario, otros autores han hallado que la administración sistémica de baclofen tiene un efecto dosis-dependiente sobre la agresión territorial en ratones macho: a dosis bajas-moderada aumenta la agresión, mientras que en dosis elevadas 132 Neuroquímica de la conducta agresiva disminuye la conducta agresiva y se acompaña de incoordinación motora (Takahashi et al., 2012). La administración intracerebral de baclofen en DRN produce un incremento de la conducta agresiva escalada en ratones, que se puede prevenir con antagonistas GABA-B. Parece ser que este efecto proagresivo está mediado por la interacción con el sistema serotoninérgico a nivel del cortex (Takahashi et al., 2010; Takahashi et al., 2012).  Glutamato En roedores, se ha localizado actividad glutamatérgica en diversas regiones cerebrales implicadas en la conducta agresiva incluyendo el hipotálamo, la amígdala medial o el núcleo dorsal del rafe (Navarro, De Castro, & Martín-López, 2010; Takahashi & Miczek, 2014). Por ejemplo, en ratas, la denominada “área de ataque hipotalámica” (ATH) posee una densa actividad glutamatérgica (Hrabovszky et al., 2005), y la infusión del agonista l-glutamato en ratas y en una región homóloga hipotalámica en el gato activa una respuesta agresiva (Brody, DeFeudis, & DeFeudis, 1969; Haller, 2013; Takahashi & Miczek, 2014). También en estudios inmunohistoquímicos en modelos de agresión inducida por esteroides androgénico anabolizantes durante la adolescencia (AAS), se halló una actividad c-Fos elevada en el hipotálamo anterior de hamsters machos (Carrillo, Ricci, & Melloni, 2009; Carrillo, Ricci, & Melloni, 2011; Fischer, Ricci, & Melloni, 2007). Además, estudios de microdiálisis in vivo muestran un nivel elevado de glutamato liberado en el DRN en ratones que participan en encuentros agonísticos (Takahashi & Miczek, 2014). La naturaleza excitatoria del sistema glutamatérgico sobre la agresión ha sido ligada a la acción del glutamato en receptores ionotrópicos NMDA, AMPA y kainato, así como a receptores metabotrópicos. Receptores NMDA. Los receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) son un tipo de receptor glutamatérgico ionotrópico que controla un canal de Ca2+ mediante dos coagonistas, para los lugares de unión de la glicina y el glutamato. El receptor NMDA tiene forma de tetrámero y hay hasta siete subunidades conocidas (NR1, NR2A-D, NR3A-B). La mayoría de los estudios de glutamato y agresión con fármacos selectivos se han centrado en estos receptores, pero no muestran una relación tan clara como se podría suponer. Los primeros estudios farmacológicos indican que el bloqueo de los receptores NMDA tienen un efecto bifásico dosis-dependiente sobre la agresión. La administración sistémica de dosis altas de antagonistas no competitivos NMDA, como la Psicobiología de la agresión y la ansiedad 133 fenciclidina (PCP) o dizocilpina (MK-801), suprime la conducta agresiva alterando también la motricidad. Sin embargo, se observa una tendencia proagresiva cuando estas sustancias se administran a dosis bajas (Belozertseva & Bespalov, 1999; Miczek & Haney, 1994; Musty & Consroe, 1982; Tyler & Miczek, 1982). Belozerteseva & Bespalov (1999), también corroboraron estos resultados con antagonistas NMDA en el modelo de agresión inducida por aislamiento. Además, se ha descrito que la administración sistémica de antagonistas NMDA (memantina, neramexane) en combinación con la ingesta de alcohol, aumenta de forma específica la agresión territorial en ratones machos (Newman et al., 2012), mientras que reduce o bloquea la agresión inducida por la retirada de morfina en ratones (Navarro et al., 2010; Sukhotina & Bespalov, 2000; Takahashi & Miczek, 2014). Otras líneas farmacológicas terapéuticas, se centran en la inhibición de la enzima sintetizadora del glutamato (NAALADasa) mediante el antagonista GPI-2232, el cual produce un efecto antiagresivo en el modelo de agresión inducida por aislamiento (Lumley et al., 2004; Navarro et al., 2010). Estudios más recientes señalan que posiblemente distintos modelos de agresión se relacionen con alteraciones del receptor NMDA, que difieren en tipo de subunidad y localización. De esta forma, se ha hallado que en modelos de agresión inducida por aislamiento aumenta la expresión de subunidades NR2A y NR2B en el hipocampo, y se reduce la subunidad NR2A en el PFC (Zhao et al., 2009). En el modelo de agresión inducida por esteroides (AAS), disminuye la subunidad NR2A en el hipocampo e hipotálamo, pero no en el córtex de ratas machos (Le Greves et al., 1997). La agresión inducida en ratones knockout MAO-A por déficit de la monoamino oxidasa-A produce a lo largo del desarrollo un nivel de aminas elevado y una sobreexpresión de subunidades NR2A y NR2B en la corteza prefrontal. Se ha comprobado que en este modelo de agresión knockout MAO-A el bloqueo de receptores NMDA en la corteza prefrontal reduce la agresión (Bortolato et al., 2012). Receptores AMPA. El receptor glutamatérgico AMPA es también de tipo ionotrópico y controla un canal de Na+, el cual está formado por cuatro familias de subunidades (GluR1-4). El receptor AMPA ha sido también implicado en la regulación de la conducta agresiva. En concreto, en un primer estudio, Vekovischeva et al. (2004) encontraron una reducción de la conducta agonística en ratones machos que carecían de la subunidad GluR1 de este receptor. La subunidad GluR1 parece jugar un destacado papel en la facilitación de la agresión, habiéndose descrito expresión ARNm para dicha proteína en 134 Neuroquímica de la conducta agresiva regiones hipotalámicas y límbicas, incluyendo los núcleos hipotalámicos anterior, medial y ventrolateral, septum lateral, y núcleos amigdaloides. Asimismo, los receptores que contienen la subunidad GluR1 se localizan en neuronas que expresan el receptor androgénico en el hipotálamo y estructuras límbicas (Diano, Naftolin, & Horvath, 1997). Diversos fármacos antagonistas AMPA han demostrado efectos antiagresivos, junto con un aumento de la ansiedad en encuentros agonísticos (Vekovischeva, Aitta-aho, Verbitskaya, Sandnabba, & Korpi, 2007). De esta forma en ratones con diferentes niveles de ansiedad innata, los antagonistas competitivos poco selectivos (CNQX y NBQX) disminuyen el componente “morder” de la conducta de ataque, mientras que antagonistas no competitivos y muy selectivos (GYKI 52466) disminuyen todos los componentes de la conducta de ataque. Asimismo, otros fármacos que actúan (al menos parcialmente) modulando la actividad de los receptores AMPA, como el topiramato, han demostrado también efectos antiagresivos en modelos animales (Navarro, Buron, & Martín-López, 2007; Navarro et al., 2010). Receptores mglu. En contraste con los receptores ionotrópicos, el posible papel de los receptores metabotrópicos de glutamato (mGlu) en la modulación de la agresión es menos conocido. Recientemente, se ha comprobado que la administración aguda de antagonistas selectivos de los receptores mglu5 (MPEP; 5-25 mg/kg, ip) y mglu1 (JNJ16259685; 0.125-8 mg/kg) produce una potente reducción de las conductas ofensivas (amenaza y ataque), sin afectar a la motilidad, en un modelo animal de agresión inducida por aislamiento, indicando un papel de dichos receptores en la regulación de la agresión (Navarro, Postigo, Martín, & Buron, 2006; Navarro, De Castro, & Martín-López, 2008). Asimismo, los resultados obtenidos en dos experimentos con ligandos selectivos de los receptores mglu2/3 (LY379268) y mglu7 (AMN082) sugieren que estos receptores podrían estar también implicados en la agresión (Navarro, Luque, & Martín-López, 2009; Navarro, De Castro, & Martín-López, 2009). 4. PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL Planteamiento experimental 137 4. PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL MBDB, MDEA y PMA son tres drogas de diseño, estructuralmente similares al MDMA (“éxtasis”), que se han identificado en la composición de pastillas distribuidas como “éxtasis” en entornos recreativos a lo largo de los últimos treinta años. Se ha descrito que estas feniletilaminas sintéticas presentan un perfil psicotrópico de tipo entactógeno, es decir, son compuestos con capacidad para facilitar la proximidad, el contacto y la comunicación empática, generando a su vez en el individuo un singular estado de introspección y bienestar. Acorde a ello, existen evidencias de que estas sustancias son capaces de generar en animales una señal interoceptiva que resulta muy similar a la del MDMA en el modelo de discriminación de drogas, lo que ha llevado a clasificarlas como drogas entactógenas y sustancialmente diferenciadas de los estimulantes, alucinógenos y sedantes. Los escasos estudios clínicos publicados han advertido de la presencia de estas sustancias en numerosas complicaciones toxicológicas por consumo de “éxtasis”, que no en pocos casos han llegado a ser letales. Más allá de lo expuesto, la información experimental disponible de estos tres compuestos es más bien exigua y se limita a algunos estudios sobre su metabolismo, su posible mecanismo de acción, la evaluación de algunos efectos conductuales (p. ej., relativos a la motricidad) y, en algunos casos, sus posibles propiedades como agentes reforzadores (ver apartados 2.1, 2.2 y 2.3). En contraste, el MDMA ha sido objeto de un creciente interés científico, generando diversos focos de debate sobre aspectos tales como su potencial neurotóxico y el efecto de su consumo en el desarrollo de trastornos psicopatológicos. Además, el MDMA es, hasta la fecha, la única sustancia con un perfil entactógeno en la que se han investigado sus efectos conductuales en modelos animales de agresión y ansiedad, si bien sus resultados no siempre coinciden (ver apartado 2.4). Aunque existen algunas evidencias de que el MDMA puede tener efectos ansiolíticos cuando se usan dosis elevadas en animales de laboratorio (Lin et al., 1999; Morley & McGregor, 2000), en otros estudios los resultados se han asociado con alteraciones conductuales y correlatos neuroquímicos que sugieren un efecto ansiogénico (Bhattacharya et al., 1998; Gurtman et al., 2002). Así, estudios previos indican que el MDMA (en un rango amplio de dosis) provoca efectos ansiogénicos en ratones machos, utilizando diferentes modelos experimentales de ansiedad tales como el “test del laberinto elevado en cruz” (Navarro & Maldonado, 2002), el “test de luz-oscuridad”(Maldonado & Navarro, 2000) y el “test de interacción social” Experimento 3: Resultados 241 Figura 8.6. Frecuencia y porcentaje de frecuencia de ataques en la primera y segunda parte del test, en cada grupo de tratamiento. Experimento 3: Discusión. 243 8.3. Discusión. En este estudio se ha evaluado el efecto de la administración aguda de tres dosis de Metilenodioxietilanfetamina o MDEA (5, 10 y 20 mg/kg), sobre la conducta agonística exhibida por ratones machos SWISS OF.1. Para ello se ha utilizado el modelo de agresión inducida por aislamiento, un modelo animal que permite analizar los componentes ofensivo y defensivo del comportamiento agonístico del ratón, además de otras conductas menos habituales pero también presentes durante el enfrentamiento con otro macho de su especie, con el objetivo de evaluar el perfil conductual agonístico del MDEA en ratones machos. Los resultados obtenidos muestran que la administración aguda de MDEA produce un efecto antiagresivo potente en todas las dosis evaluadas, de forma que esta sustancia retrasa y reduce tanto las conductas de amenaza como las de ataque, sin que se aprecien alteraciones en inmovilidad. El análisis de la conducta de ataque revela que la dosis intermedia de MDEA además de reducir, facilita la acumulación del ataque al final de la prueba, mientras que la dosis mayor anula el ataque por completo. En la misma línea, se observa una pérdida de la relevancia de la diada de “amenaza ↔ ataque” en todos los grupos de tratamiento de MDEA respecto al grupo control (GC: 37%; GEMDEA (5.10.20): ≈8%, <1% y 0%), por lo que los resultados sugieren que el efecto antiagresivo de esta sustancia puede ser dosis dependiente. Además, el análisis secuencial parece indicar que esta importante pérdida del componente agonístico ofensivo es predominantemente cuantitativa en todos los grupos; quizá con la única particularidad de que tras una dosis alta de MDEA (20 mg/kg), la conducta de amenaza no se precede de ataque ni de exploración no social, diferenciándose en este aspecto del grupo control. Estos resultados parecen indicar que el MDEA tiene un claro efecto antiagresivo en un rango de dosis similar al que muestra el MDMA en estudios con el mismo modelo de agresión (Maldonado, 2000; Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 1999). Además, el efecto antiagresivo obtenido en el primer experimento con 8 mg/kg de MDMA, parece tener características intermedias al que se obtiene con las dosis de 5 y 10 mg/kg de MDEA, por lo que es posible que ambas sustancias muestren una potencia muy similar en este aspecto. Este tipo de análisis del repertorio conductual agonístico completo, resulta especialmente apropiado para evaluar la especificidad de las alteraciones conductuales 244 Experimento 3: Discusión. que induce un compuesto (Navarro & Luna, 2005). En este sentido, se ha observado que que el efecto antiagresivo del MDEA es inespecífico en todas las dosis evaluadas. Los resultados indican que esta sustancia no solo altera la conducta ofensiva, sino también la conducta exploratoria y la defensiva. En concreto, se observa un aumento de la investigación social (IS) con la dosis menor de MDEA (5 mg/kg), algo menos potente con la dosis intermedia (10 mg/kg) y una tendencia no significativa con la dosis mayor. A su vez, la dosis más baja de MDEA produce un aumento discreto pero significativo de tiempo empleado en explorar a distancia al oponente (EAD), mientras que las dosis intermedia y más alta aumentan notablemente la exploración no social (ENS). Los resultados obtenidos en investigación social sobre todo con la dosis menor de MDEA (5 mg/kg), son coherentes con el efecto entactógeno que se ha descrito de esta sustancia en estudios de discriminación de drogas, distinguiéndolo claramente tanto de las drogas estimulantes como de los compuestos alucinógenos (Boja & Schechter, 1991; Glennon et al., 1988; Schechter, 1991). Sin embargo, el incremento de la conducta social se ha relacionado en diversos estudios con un perfil ansiolítico, mientras que el aumento en la vigilancia a distancia de oponente y de la exploración no social, suelen describirse como alteraciones propias de un perfil ansiogénico (File & Seth, 2003; Gendreau, Petitto, Petrova, Gariepy, & Lewis, 2000; Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 2004; Redolat, Oterino, Carrasco, & Brain, 2002). Asimismo, todos los grupos muestran un aumento muy notable de las conductas agonísticas de defensa/sumisión y de evitación/huida, así como una reducción de las conductas de cuidado corporal y de escarbar. El incremento de las conductas agonísticas de defensa y evitación sugiere la presencia de un efecto ansiogénico en todos los grupos de tratamiento (Brain et al., 1991; Maldonado & Navarro, 2001b). Por otra parte, existen evidencias que vinculan el aumento de la conducta de escarbar en un encuentro agonístico con el perfil de algunas drogas ansiolíticas (Redolat et al., 2005), por lo que la reducción de esta conducta también parece estar en consonancia con un efecto ansiogénico. Como puede apreciarse, la dosis menor de MDEA (5 mg/kg) parece generar un conflicto de aproximación-evitación al oponente, que recuerda bastante al observado con la dosis de 8 mg/kg MBDB, pero con un mayor nivel de acercamiento al oponente. No obstante, el aumento progresivo de la probabilidad de transición desde investigación Experimento 3: Discusión. 245 social a evitación (PT [IS→EH]: 0.15, 0.29 y 0.35), sugiere que el conflicto que experimenta el sujeto aumenta a medida que aumenta la dosis. Además, en el repertorio conductual las diadas “ENS ↔ EAD” son las que más destacan con la dosis menor e intermedia de MDEA, mientras que al aumentar la dosis también se observa un predominio evidente de las diadas que incluyen evitación/huida “EH ↔ ENS ↔ EAD”. Por otra parte, la conducta de exploración no social tiene un componente motor importante, por lo que estos resultados podrían indicar que el MDEA (10, 20 mg/kg; y 5 mg/kg n.s.) exhibe propiedades estimulantes motoras de forma similar a lo observado con el MDMA. De acuerdo con estos resultados, existen evidencias de que la administración de MDEA (3 y 10 mg/kg) en ratas produce un efecto hiperlocomotor sostenido de menor potencia que el del MDMA y la d-anfetamina, en el que abundan los patrones lineales y se caracteriza por una elevada tigmostasis (Gold et al., 1988; 1989; Paulus & Geyer, 1992). No obstante, otros autores señalan que a diferencia del éxtasis, el MDEA no parece alterar la conducta locomotora de la rata en dosis pequeñas (32 µm/kg ≈ 6.6 mg/kg) (Hegadoren et al., 1995); mientras que otros no hallan alteración motora para dosis elevadas de MDEA o MDMA (20 mg/kg) (Bexis & Docherty, 2006). En conjunto, el MDEA parece tener unas propiedades antiagresivas y ansiogénicas notables incluso en dosis pequeñas, mientras que las posibles propiedades entactógenas de esta sustancia se limitan a las dosis más bajas. Además, se observa un efecto estimulante motor en todas las dosis evaluadas. 9. EXPERIMENTO 4: Efectos de la administración de MDEA sobre la ansiedad evaluada en el test del laberinto elevado en cruz en ratones Experimento 4: Resultados 249 9. EXPERIMENTO 4: EFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE MDEA SOBRE LA ANSIEDAD EVALUADA EN EL TEST DEL LABERINTO ELEVADO EN CRUZ EN RATONES MACHOS. El objetivo de este experimento fue examinar los efectos de la administración aguda de MDEA sobre la ansiedad evaluada en ratones machos mediante la prueba conductual del “laberinto elevado en cruz”. 9.1. Procedimiento Para realizar este experimento se utilizaron un total de 48 ratones machos albinos de la cepa SWISS-OF.1 (CRIFFA, Barcelona, España), con un rango de peso inicial de entre 25-30 g. Tras su llegada fueron alojados en jaulas en grupos de cinco y se mantuvieron unas condiciones ambientales óptimas y controladas (véase apartado metodología). En este estudio se tuvieron en cuenta tres grupos experimentales con una dosis creciente de MDEA (5, 10 y 20 mg/kg), y un grupo control al cual se le administró suero salino, la asignación de los animales a los distintos grupos se realizó de forma aleatoria. La administración aguda de estas sustancias se realizó vía intraperitoneal (i.p.) y de forma proporcional al peso del animal con un volumen constante de 10ml/kg. 9.2. Resultados En la Tabla 9.1 se muestran los valores de mediana con rangos en cada una de las medidas espaciotemporales y etológicas evaluadas en ratones machos que realizaron el test del laberinto elevado en cruz, tras la administración aguda de MDEA (5, 10 y 20 mg/kg) o suero salino. Los parámetros que se han evaluado para cada medida han sido tiempo acumulado (T), frecuencia (F) y latencia (L). Además, para la medida espaciotemporal de brazo abierto se ha evaluado el porcentaje de entrada en brazo no protegido respecto al total de entradas en brazos. Los datos recogidos no cumplían los criterios de normalidad y homocedasticidad, por lo que se han analizado mediante las pruebas no paramétricas H-Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney, con un criterio de significación estadística de p<.05. A continuación se exponen los resultados para cada categoría conductual y grupo de tratamiento. Experimento 4: Discusión 257 9.3. Discusión En este experimento se ha evaluado el efecto de la administración aguda de tres dosis de MDEA (5, 10 y 20 mg/kg), sobre la conducta de ansiedad exhibida por ratones machos SWISS OF.1. Para ello se ha utilizado el modelo de ansiedad del laberinto elevado en cruz, un modelo ampliamente aceptado y que ha demostrado una buena validez para evaluar la ansiedad incondicionada en roedores ante estímulos naturales (Carobrez & Bertoglio, 2005; Haller & Alicki, 2012; Handley & Mithani, 1984; Hogg, 1996; Holmes et al., 2000; Lister, 1987; Pawlak et al., 2012; Pellow et al., 1985). Esta investigación se ha realizado con el objetivo de mejorar la comprensión del perfil conductual del MDEA y aclarar las posibles propiedades farmacológicas de este compuesto sobre la ansiedad, ya que en la actualidad no tenemos constancia de que se hayan realizado estudios conductuales sobre el MDEA en el test EPM, ni en ningún otro modelo animal de ansiedad. En este modelo, se tienen en cuenta diferentes parámetros espaciales y etológicos que muestran una gran sensibilidad a posibles alteraciones en la ansiedad. Entre ellos, las medidas de tiempo, frecuencia y más aún, el porcentaje de frecuencia en los brazos abiertos del laberinto, así como la actividad de head-dipping en el área desprotegida (uHD), son índices conductuales robustos que correlacionan negativamente con el nivel de ansiedad. Mientras que las medidas conductuales de riesgo en las áreas protegidas (pHD y pSAP) parecen guardar una relación directa con la ansiedad que experimenta el sujeto (Brunner et al., 1999; Carola et al., 2002; Cruz et al., 1994; Espejo, 1997; Rodgers & Johnson, 1995). Según estas premisas, el efecto del MDEA en la conducta exhibida en el laberinto elevado en cruz resulta bastante ambivalente. Las dosis de 10 y 20 mg/kg de MDEA reducen de forma discreta pero significativa la frecuencia de entrada de los brazos abiertos, indicando que el MDEA en dosis moderadas o altas podría producir un cierto estado ansiogénico (Brunner et al., 1999; Cruz et al., 1994; Espejo, 1997; Rodgers & Johnson, 1995). No obstante, la reducción de esta variable por una parte contrasta con la tendencia ascendente que se observa en el grupo tratado con la dosis menor de MDEA, y por otra parte, no se han hallado alteraciones en otros parámetros espaciales típicamente asociados a un efecto ansiogénico, como el porcentaje de frecuencia y el tiempo en brazos abiertos. Esto puede ser indicativo de que este efecto ansiogénico es relativamente débil, 258 Experimento 4: Discusión en comparación con los resultados obtenidos anteriormente en el modelo de agresión. Teniendo en cuenta esto, resulta curioso que la dosis mayor de MDEA reduzca notablemente la conducta de head-dipping (pHD) y retrase ambas conductas de riesgo en los brazos protegidos (pHD y pSAP), alteraciones conductuales que suelen relacionarse con un menor nivel de ansiedad (Carola et al., 2002; Espejo, 1997), lo que sugiere que los resultados en este aspecto parecen ser en realidad poco concluyentes. Sin embargo, resulta preciso indicar que tanto el tiempo como el porcentaje de entrada en los brazos abiertos, son parámetros que aumentan su variabilidad, de forma que muestran una dispersión significativa de los datos hacia valores muy extremos tanto altos como bajos, enmascarando el significado de las medidas de tendencia central (como la media o la mediana), además de dificultar la interpretación de conductas que dependen de la localización del animal en el laberinto. Por ejemplo, se da la situación de que el grupo tratado con la dosis mayor de MDEA muestra una reducción significativa de la frecuencia de entrada en el área abierta junto con una tendencia no significativa tanto a reducir la permanencia en este brazo, como a aumentar la actividad de head-dipping en el área no protegida (uHD); aspectos no significativos pero que resultan bastante incongruentes entre sí ya que no contemplan que la dispersión de la actividad en el brazo abierto aumenta de forma dosis dependiente. Teniendo en cuenta esto, resulta de mayor interés señalar que la reducción de la conducta de riesgo “Unprotected stretched attend posture” (uSAP) que se aprecia con la dosis de 20 mg/kg de MDEA independientemente de la dispersión de los datos recogidos de permanencia en el área abierta, podría corresponder a dos perfiles conductuales diferenciados. Por una parte, la reducción de uSAP para los sujetos que muestran un tiempo de permanencia elevado en el área abierta parece indicar un cierto efecto ansiolítico, que no sería extensible a aquellos que presentan una reducción extrema del tiempo en los brazos desprotegidos. Es decir, la reducción de uSAP nos conduce a que algunos sujetos experimentan una reducción del nivel de conflicto que genera el modelo a la vez que puntúan alto en la permanencia en área abierta (menos conflicto en área abierta y menos ansiedad,), mientras que por el contrario, en otros sujetos la reducción de la conducta uSAP podría deberse a un desplazamiento del conflicto desde las áreas abiertas a las protegidas (menos conflicto en área abierta y mayor ansiedad), lo que conductualmente también se reflejaría en un aumento de la conducta de retorno a Experimento 4: Discusión 259 protegido. En este aspecto, el análisis de la conducta de retorno a brazo protegido no muestra signos evidentes de alteración en ninguno de sus parámetros, pero esta variable clave para interpretar el factor “conflicto” muestra una gran dispersión de los datos hacia valores extremos en todas las dosis, como también se observaba con el porcentaje de frecuencia en brazos abiertos a su vez clave en el factor “ansiedad” de este modelo. Por lo que a pesar de los resultados aparentemente no significativos en estas dos variables, la evaluación de ambos factores sugiere congruentemente que se pueden observar dos perfiles conductuales diferenciados tras la administración de la dosis mayor de MDEA. No obstante, la reducción discreta de la frecuencia en el área abierta sugiere que el efecto predominante de esta sustancia en el modelo EPM parece ser ansiogénico, a pesar de la elevada dispersión observada en variables muy sensibles al nivel de ansiedad y de conflicto. Normalmente, los investigadores en conducta animal intentan evitar la varianza en sus resultados. Las desviaciones de la homogeneidad de los resultados o los valores atípicos (outliers) han sido a menudo evitados, omitidos o en el mejor de los casos tolerados en el informe final (Pawlak et al., 2012). Sin embargo, durante varias décadas el análisis sistemático de la variabilidad ha sido el objetivo de algunos investigadores de la conducta animal, estableciendo metodologías para evaluar los rasgos conductuales en animales y diferenciar entre congéneres de una determinada especie. En este contexto el “rasgo” se define como un patrón de conducta específica, que difiere entre individuos, pero que presenta una constancia relativa en el sujeto a lo largo del tiempo y en distintas situaciones. Por lo que este término se suele utilizar en la investigación conductual de forma equivalente a la “personalidad” en humanos (Pawlak et al., 2012). En relación con esto, y teniendo en cuenta la dispersión gradual que muestra una variable de ansiedad tan robusta como el porcentaje de frecuencia de entrada en el área abierta, podría resultar relevante examinar el efecto del MDEA en modelos genéticos de ratones que exhiban un perfil elevado o bajo de ansiedad rasgo. Ya que una posible explicación para estas diferencias es que el efecto de este fármaco dependa del nivel de ansiedad rasgo del individuo. Otra posible hipótesis de trabajo, sería que el MDEA podría estar alterando otra dimensión distinta a la que estamos evaluando, pero que a su vez interfiere en la conducta relacionada con la ansiedad. En este sentido, dado el incremento en la latencia de entrada en el área protegida así como en las actividades de riesgo en el área protegida, 260 Experimento 4: Discusión sería por ejemplo interesante intentar dilucidar cómo influye el MDEA en la impulsividad del ratón. Una dimensión que se ha relacionado estrechamente con la conducta de ansiedad, sin que realmente se haya alcanzado un consenso en la naturaleza de esta relación (Pawlak et al., 2012). Por otra parte, una alteración que sí resulta consistente en todas las dosis de MDEA, es la reducción de la exploración vertical (rearings). Estos resultados parecen ser congruentes con los pocos estudios disponibles sobre el perfil conductual de esta sustancia, los cuales sugieren un efecto hipoexploratorio debido principalmente a la reducción de la conducta de rearing, tanto con una dosis elevada de MDEA (20 mg/kg) en el test del campo abierto (junto a un aumento de la conducta estereotipada) (O'Loinsigh et al., 2001), como en un rango de MDEA inferior (3 y 10 mg/kg) en la conducta de ratas evaluada en el test BPM (Gold et al., 1989). Este último estudio es especialmente relevante por dos motivos, en primer lugar indica que el efecto hipoexploratorio se observa tanto por la reducción de la exploración vertical, como por la reducción de la conducta “holepokes” (Gold et al., 1989). En cierta forma, la conducta de holepokes es bastante similar a la de head-dipping, por lo que es posible que su reducción responda a un efecto hipoexploratorio más que ansiolítico. En segundo lugar, estos autores indican que el MDEA produce un efecto hipoexploratorio a la vez que aumenta la evitación del área central paradigma de conducta motora “Behavioral Pattern Monitor” (BPM), unos efectos conductuales que suelen observase más comúnmente en drogas de tipo alucinógeno. Por lo que, teniendo en cuenta el efecto hipoexploratorio y la reducción de la conducta de entrada en los brazos abiertos del laberinto elevado en cruz, es posible que esta sustancia exhiba propiedades alucinógenas en ratones. Otro aspecto importante relacionado con la reducción de la actividad exploratoria vertical, es que se ha descrito que podría constituir un indicio de déficit motor (Brunner et al., 1999; Carola et al., 2002; Cruz et al., 1994; Espejo, 1997). Sin embargo, esta hipótesis resulta poco probable debido a que también se observa una reducción de las conductas no exploratorias o estáticas, especialmente significativa con la dosis mayor de MDEA. Además, no se aprecian alteraciones en variables que se consideran sensibles a cambios motores como la frecuencia de entrada en ambos brazos, o la frecuencia total de conductas. Experimento 4: Discusión 261 Este aspecto, los escasos estudios disponibles sobre los efectos locomotores del MDEA son bastante contundentes en la ausencia de un déficit motor, ya que o bien indican una ausencia de alteración motora en el test BPM “Behavioral Pattern Monitor” con dosis elevadas de MDEA (20 mg/kg) (Bexis & Docherty, 2006; Hegadoren et al., 1995); o bien, indican un efecto hiperlocomotor algo menor que el del MDMA en ratas sometidas tanto a un tratamiento agudo (3 y 10 mg/kg de MDEA) (Gold et al., 1988; 1989; Paulus & Geyer, 1992), o bajo un tratamiento subcrónico (8 dosis de 20 mg/kg, i.p., durante 4 días) (O'Loinsigh et al., 2001). Por lo que en conjunto, parece razonable descartar la influencia de un problema motor en la reducción en exploración vertical que se aprecia todos los grupos de tratamiento, y de forma específica en el grupo tratado con la dosis menor de MDEA. Por lo que en conjunto, podemos concluir que de acuerdo con los estudios conductuales hasta el momento disponibles, el MDEA (5, 10, 20 mg/kg) parece provocar un estado de hipoexploración apreciable en todas las dosis evaluadas y especialmente con la dosis mayor, sin que se aprecien problemas a nivel motor. Los hallazgos obtenidos en este experimento no permiten dilucidar con claridad el efecto del MDEA sobre la conducta del ratón relacionada con la ansiedad; además no disponemos de estudios en modelos animales en los que se haya evaluado la acción del MDEA sobre la ansiedad, por lo que no podemos establecer comparaciones. No obstante, la dispersión hallada en algunos parámetros clave principalmente con dosis elevadas de MDEA, sugiere que podría haber dos perfiles conductuales diferenciados, de los cuales el de tipo ansiogénico parece ser predominante ya que a pesar de la elevada dispersión, se aprecia una reducción significativa de la frecuencia de entrada en los brazos abiertos. 10. EXPERIMENTO 5. Efectos de la administración de PMA sobre la conducta agonística en ratones Experimento 5: Resultados 265 10. EXPERIMENTO 5: EFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PMA SOBRE LA CONDUCTA AGONÍSTICA EN RATONES MACHOS. El objetivo de este estudio ha sido analizar los efectos conductuales de la administración aguda de cuatro dosis de PMA (2, 4, 8, 12 mg/kg) sobre la conducta agonista en ratones machos de la cepa OF.1 en el modelo de agresión inducida por aislamiento. Este objetivo se divide a su vez en tres específicos: 1) Analizar los parámetros clásicos (tiempo, frecuencia y latencia) de las categorías conductuales descritas en el modelo, 2) Realizar un análisis de secuencias conductuales para examinar si existen diferencias en la estructura conductual global, especialmente en los patrones conductuales que conducen a las conductas agonísticas agresivas, y por último, 3) Analizar la evolución temporal de las conductas agonísticas agresivas en función del tratamiento administrado. 10.1. Procedimiento Para analizar el efecto del PMA sobre la conducta agonística, se utilizaron en este experimento un total de 128 ratones machos albinos de la cepa SWISS OF.1 (CRIFFA, Barcelona, España), la mitad de los cuales (64) se emplearon como animales experimentales, siendo el resto utilizado como oponentes anósmicos. Para este experimento se tuvieron en cuenta tres grupos experimentales con una dosis creciente de PMA (2, 4, 8, 12 mg/kg), y un grupo control al cual se le administró suero salino. La administración aguda de estas sustancias se realizó vía intraperitoneal (i.p.) y de forma proporcional al peso del animal con un volumen constante de 10ml/kg. 10.2. Resultados 10.2.1. Análisis de los parámetros etológicos Se han evaluado los parámetros clásicos de tiempo acumulado, frecuencia y latencia, para cada una de las categorías conductuales del modelo de agresión inducida por aislamiento. En la Tabla 10.1, se muestran los valores de mediana con rangos para cada uno de los parámetros y variables evaluados mediante las pruebas no paramétricas HKruskal-Wallis y U de Mann-Whitney, con un criterio de significación estadística de p<.05 para todas las pruebas. 272 Experimento 5: Resultados Tabla 10.2 Tabla 10.2 PRECEDENTE CONSECUENTE PO PT PO PT PO PT PO PT PO PT Cuidado corporal Exp. no social 2,35 0,85 3,48 0,90 3,76 * 0,82 1,06 * 0,82 2,45 0,88 Cuidado corporal Amenaza 0,11 0,04 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 Total de la categoria Cuidado corporal 2,76 1,00 3,86 1,00 4,57 1,00 1,3 * 1,00 2,78 1,00 Escarbar Exp. no social 3,50 0,89 2,31 0,91 0,69 ** 0,92 0,31 ** 0,87 0,11 ** 1,00 Escarbar Amenaza 0,16 0,04 0 * 0,00 0 * 0,00 0 * 0,00 0 * 0,00 Total de la categoria Escarbar 3,91 1,00 2,53 1,00 0,74 ** 1,00 0,36 ** 1,00 0,11 ** 1,00 Exp. no social Cuidado corporal 2,48 0,09 3,32 0,08 4,23 * 0,10 1,21 * 0,03 2,36 0,06 Exp. no social Escarbar 3,60 0,13 2,37 0,06 0,68 ** 0,02 0,36 ** 0,01 0,11 ** 0,00 Exp. no social Exp. a distancia 13,54 0,50 21,32 ** 0,53 21,06 ** 0,51 25,02 ** 0,61 22,01 ** 0,54 Exp. no social Investigación social 2,06 0,08 9,74 ** 0,24 6,57 * 0,16 5,8 ** 0,14 8,26 ** 0,20 Exp. no social Amenaza 4,78 0,18 0,57 ** 0,01 0,28 ** 0,01 0 ** 0,00 0,12 ** 0,00 Exp. no social Evitación/Huída 0,19 0,01 2,06 ** 0,05 4,26 ** 0,10 3,56 ** 0,09 3,82 ** 0,09 Exp. no social Inmovilidad 0,00 0,00 0,18 0,00 3,24 ** 0,08 4,32 ** 0,11 3,59 ** 0,09 Total de la categoria Exp. no social 26,89 1,00 40,33 ** 1,00 40,93 ** 1,00 40,95 ** 1,00 40,96 ** 1,00 Exp. a distancia Escarbar 0,13 0,01 0,06 0,00 0,06 0,00 0 * 0,00 0 * 0,00 Exp. a distancia Exp. no social 6,00 0,38 10,98 ** 0,47 11,9 ** 0,51 16,26 ** 0,57 13,45 ** 0,54 Exp. a distancia Investigación social 2,71 0,17 8,02 ** 0,34 5,85 ** 0,25 5,7 * 0,20 5,77 ** 0,23 Exp. a distancia Amenaza 6,72 0,42 0,92 ** 0,04 0,55 ** 0,02 0,17 ** 0,01 0,2 ** 0,01 Exp. a distancia Evitación/Huída 0,17 0,01 2,82 ** 0,12 4,4 ** 0,19 5,6 ** 0,20 4,56 ** 0,18 Exp. a distancia Defensa/Sumisión 0,03 0,00 0,34 * 0,01 0,45 * 0,02 0,49 * 0,02 0,48 ** 0,02 Total de la categoria Exp. a distancia 15,98 1,00 23,36 * 1,00 23,49 ** 1,00 28,4 ** 1,00 25,05 ** 1,00 Valores de probabilidad de ocurrencia promedio (PO ) y probabilidad de transición (PT) correspondientes a las diadas de categorias conductuales evaluadas en ratones macho (precedente-consecuente), después de la administración aguda de PMA (2,4,8,12 mg/kg) o salino. Salino 2 mg/kg de PMA 4 mg/kg de PMA 8 mg/kg de PMA 12 mg/kg de PMA Experimento 5: Resultados 273 Tabla 10.2. (Continuación) PRECEDENTE CONSECUENTE PO PT PO PT PO PT PO PT PO PT Investigación social Exp. no social 4,24 0,64 15,74 ** 0,83 11,3 ** 0,84 9,31 * 0,77 12,62 ** 0,86 Investigación social Exp. a distancia 0,28 0,04 0,6 0,03 0,24 0,02 0,88 * 0,07 0,2 0,01 Investigación social Amenaza 1,92 0,29 1,09 * 0,06 0,08 ** 0,01 0,05 ** 0,00 0,04 ** 0,00 Investigación social Evitación/Huída 0,19 0,03 1,1 ** 0,06 1,42 ** 0,11 1,55 ** 0,13 1,41 ** 0,10 Total de la categoria Investigación social 6,65 1,00 18,95 ** 1,00 13,46 ** 1,00 12,03 * 1,00 14,75 ** 1,00 Amenaza Escarbar 0,15 0,01 0,05 0,02 0 * 0,00 0 * 0,00 0 * 0,00 Amenaza Exp. no social 9,84 0,35 1,54 ** 0,51 0,61 ** 0,48 0,09 ** 0,42 0,16 ** 0,44 Amenaza Exp. a distancia 1,86 0,07 0,1 ** 0,03 0,2 ** 0,16 0 ** 0,00 0 ** 0,00 Amenaza Investigación social 1,68 0,06 0,62 ** 0,21 0,09 ** 0,07 0 ** 0,00 0 ** 0,00 Amenaza Ataque 14,54 0,51 0,42 ** 0,14 0,28 ** 0,22 0 ** 0,00 0 ** 0,00 Total de la categoria Amenaza 28,39 1,00 3 ** 1,00 1,28 ** 1,00 0,21 ** 1,00 0,37 ** 1,00 Ataque Amenaza 14,60 1,00 0,42 ** 1,00 0,32 ** 0,89 0 ** 0,00 0 ** 0,00 Total de la categoria Ataque 14,60 1,00 0,42 ** 1,00 0,36 ** 1,00 0 ** 0,00 0 ** 0,00 Evitación/Huída Exp. no social 0,50 0,78 4,95 ** 0,76 8,65 ** 0,81 9,5 ** 0,84 8,15 ** 0,77 Evitación/Huída Exp. a distancia 0,00 0,00 1,11 ** 0,17 0,82 ** 0,08 1,12 ** 0,10 1,62 ** 0,15 Evitación/Huída Investigación social 0,07 0,12 0,3 0,05 0,74 ** 0,07 0,36 * 0,03 0,38 0,04 Total de la categoria Evitación/Huída 0,64 1,00 6,47 ** 1,00 10,64 ** 1,00 11,25 ** 1,00 10,57 ** 1,00 Defensa/Sumisión Exp. no social 0,10 0,58 0,44 0,49 0,76 0,66 0,49 0,52 0,56 * 0,45 Defensa/Sumisión Evitación/Huída 0,00 0,00 0,35 * 0,39 0,18 0,15 0,23 0,24 0,42 ** 0,34 Total de la categoria Defensa/Sumisión 0,18 1,00 0,89 1,00 1,15 1,00 0,93 1,00 1,24 * 1,00 Inmovilidad Exp. no social 0,00 0,00 0,18 1,00 2,52 ** 0,75 3,17 ** 0,70 2,78 ** 0,67 Inmovilidad Exp. a distancia 0,00 0,00 0 0,00 0,52 * 0,16 1 ** 0,22 1,01 * 0,24 Total de la categoria Inmovilidad 0,00 0,00 0,18 1,00 3,38 ** 1,00 4,56 ** 1,00 4,17 ** 1,00 Diferencias con respecto al grupo control salina, Test U-Mann-Whiney: * p <.05; ** p <.01 Salino 2 mg/kg de PMA 4 mg/kg de PMA 8 mg/kg de PMA 12 mg/kg de PMA 274 Experimento 5: Resultados  Grupo tratado con 2 mg/kg de PMA. En el grupo tratado con la dosis menor de PMA las conductas con una probabilidad de ocurrencia mayor son muy distintas a las del grupo control, de forma que se muestra un aumento en las categorías de exploración no social (ENS [40.33%]: p<.01, |δ|≈1), exploración a distancia (EAD [23.36%]: p<.05, |δ|>0.50), investigación social y evitación/huida (IS [18.9%], EH [6.5%]: p<.01, |δ|>.90); mientras que se reducen con un tamaño del efecto muy alto ambas conductas agresivas (AM [3%], AT [0.42%]: p<.01, |δ|≈1). Las diadas agonísticas muestran las siguientes alteraciones: 1) Las conductas de amenaza y ataque se alteran de forma cuantitativa, pues las respectivas diadas precedentes y consecuentes son las mismas que las observadas en el grupo control y en general disminuyen junto a la conducta objetivo. Se observa reducción de las diadas formadas por conductas que preceden a la amenaza (IS [1.1%]: p<.05; EAD [0.9%], ENS [0.6%], ataque [0.4%]: p<.01) y diadas con conductas posteriores a la amenaza (ENS [1.5%], IS [0.6%], ataque [0.4%], EAD [0.1%]: p<.01). 2) La estructura de las conductas agonísticas de evitación y defensivas se encuentra alterada de forma cualitativa, ya que se producen incrementos en diadas que no son representativas en el grupo control(c). Estas diadas implican conductas exploratorias precedentes a la Evitación/huida (EAD [2.8%]: p<.01, |δ|1; ENS [2.1%] y IS [1.1%]: p<.01, |δ|>0.70), conductas posteriores a la Evitación/Huida (ENS [5%]: p<.01, |δ|>0.90, EAD [1.1%]: p<.01, |δ|>0.65), conductas precedentes de la Defensa/sumisión (EAD [0.3%]: p<.05, |δ|>0.25), conductas posteriores a la Defensa/sumisión (Evitación/huida [0.35%]: p<.05, |δ|≈0.30). En este grupo son muy improbables los patrones observados en el grupo control. La diada más probable implica conductas exploratorias y junto a su inversa acumulan más del 30% del repertorio conductual (“ENS-EAD” [21.32%], “EAD-ENS” [10.98%]: p<.01, |δ|>0.60), formando un patrón conductual muy activo “ENS↔EAD” (POC: 40.3%, PT: 0.53-0.47), que puede derivar en conductas de interés opuesto como la investigación social (“ENS-IS”[9.7%], EAD-IS”[8%]: p<.01, |δ|>0.75), y en menor medida, la evitación/huida [≈2%]. Todas las conductas exploratorias muestran cambios cualitativos, pues su incremento se produce, junto a la reducción de algunas de sus secuencias. Experimento 5: Resultados 275  Grupo tratado con 4 mg/kg de PMA. Las categorías conductuales incrementadas respecto al grupo control son: exploración no social (ENS [40.9%]: p<.01, |δ|≈1), exploración a distancia (EAD [23.5%]: p<.01, |δ|>0.50), la investigación social (IS [13.5%]: p<.01, |δ|>.60), evitación/huida (EH [10.6%]: p<.01, |δ|=1), y por primera vez la inmovilidad (INM [3.4%]: p<.01, |δ|>0.60). Por otra parte, se reducen con un tamaño del efecto muy alto ambas conductas agresivas (AM [1.3%], AT [0.4%]: p<.01, |δ|≈1) y de escarbar (ESC [0.7%]: p<.01, |δ|>0.60). Las diadas agonísticas muestran las siguientes alteraciones: 1) Se producen cambios cuantitativos en la estructura conductual de la amenaza y el ataque, cuyas diadas relacionadas se vuelven prácticamente inexistentes (<1%): diadas con conducta precedente a la amenaza (EAD[0.5%]: p<.05; ataque[0.3%], ENS[0.3%], IS[0.1%]: p<.01, |δ|>0.90) y diadas con conducta posterior a la amenaza (ENS[0.6%], ataque[0.3%], EAD[0.2%], IS[0.1%]: p<.01, |δ|>0.90), así como las precedentes y posteriores a escarbar (ENS[0.7%]: p<0.1, |δ|>0.60). 2) Por otra parte, el análisis muestra que la estructura de las conductas de evitación y defensa, se encuentran alterada de forma cualitativa, ya que se producen incrementos en diadas que no son representativas en el grupo control(c). Estas diadas implican conductas exploratorias precedentes a la Evitación/huida (EAD [4.4%], ENS [4.3%]: p<.01, |δ|≈1; e IS [1.4%]: p<.01, |δ|>0.70), posteriores a la Evitación/Huida (ENS [8.7%]: p<.01, |δ|=1; EAD [0.8%], IS[0.7%]: p<.01, |δ|>0.60) y precedentes a la Defensa/sumisión (EAD [0.4%]: p<.05, |δ|>0.25), En este grupo la diada más probable implica conductas exploratorias y junto a su inversa acumulan más del 30% (“ENS-EAD”[21.06%, “EAD-ENS”[11.90%]: p<.01, |δ|>0.60), formando un patrón conductual muy activo “ENS↔EAD” (POC: 40.9%, PT: 0.51-0.51), que puede derivar a su vez en investigación social (ENS-IS”[6.6%], “EAD-IS”[5.9%]: p<.01, |δ|>0.50), pero también en menor medida en evitación/huida [≈4%], como se ha indicado anteriormente. Todas las conductas exploratorias muestran cambios cualitativos, pues su incremento se produce junto a la reducción de algunas de sus secuencias, pero también porque aumentan diadas hasta ahora no registradas relacionadas con la inmovilidad (“ENS-INM” [3.4%], “INM-ENS” [2.52%]: p<.01, |δ|>0.60; “INM-EAD” [0.5%]: p<.05, |δ|>0.30). 276 Experimento 5: Resultados  Grupo tratado con 8 mg/kg de PMA. En este grupo las categorías conductuales incrementadas respecto al grupo control son de nuevo: exploración no social (ENS [41%]: p<.01, |δ|≈1), exploración a distancia (EAD [28.4%]: p<.01, |δ|≈1), investigación social (IS [12%]: p<.05, |δ|≈0.50), evitación/huida (EH [11.2%]: p<.01, |δ|=1) e inmovilidad (INM[4.5%]: p<.01, |δ|>0.80). Por otra parte, se reducen con un tamaño del efecto muy alto ambas conductas agresivas especialmente el ataque que se anula completamente (AM [0.2%], AT [0%]: p<.01, |δ|≈1), la conducta de escarbar (ESC [0.7%]: p<.01, |δ|>0.70) y el cuidado corporal (CC [1.3%]: p<.05, |δ|≈0.50). Se aprecian los siguientes cambios en las diadas agonísticas: 1) La estructura conductual de la agresión muestra cambios cuantitativos y cualitativos, ya que la amenaza no se precede de ataque, de exploración no social ni de investigación social; y el resto de secuencias precedentes y posteriores a la amenaza se encuentran muy reducidas (“EAD-AM” [0.17%], “AM-ENS”[0.1%]: p<.01, |δ|≈1). 2) Las conductas de evitación y defensa, se encuentran alteradas de forma cualitativa, ya que se producen incrementos en diadas que no son representativas en el grupo control(c). Estas diadas implican conductas exploratorias precedentes a la Evitación/huida (EAD [5.6%], ENS [3.5%], IS [1.5%]: p<.01, |δ|>0.60), posteriores a la Evitación/Huida (ENS [9.5%], EAD [1.1%]: p<.01, |δ|=0.60; IS[0.4%]: p<.05, |δ|>0.30) y precedentes a la Defensa/sumisión (EAD [0.4%]: p<.05, |δ|>0.25). En este grupo, la diada más probable implica conductas exploratorias y con su inversa acumulan más del 40% con un tamaño del efecto muy elevado (“ENS-EAD” [25.02%, “EAD-ENS”[16.26%]: p<.01, |δ|>0.90), formando un patrón conductual muy activo “ENS↔EAD” (POC: 41%, PT: 0.61-0.57), que puede derivar a su vez en investigación social “ENS-IS”[5.8%],”EAD-IS”[5.7%]: p<.05, |δ|>0.50), y con una probabilidad similar en evitación/huida (“EAD-EH” [5.6%], “ENS-EH” [3.5%]: p<.01, |δ|>0.60), como ya se ha indicado. Todas las conductas exploratorias muestran cambios cualitativos, pues su incremento se produce junto a la reducción de algunas de sus secuencias, y también porque aumentan diadas hasta ahora no registradas relacionadas con la inmovilidad (“ENS-INM” [4.3%], “INM-ENS” [3.2%]: p<.01, |δ|>0.80; “INM-EAD” [1%]: p<.01, |δ|>0.50). Experimento 5: Resultados 277  Grupo tratado con 12 mg/kg de PMA. La dosis mayor de PMA produce cambios en el mismo sentido que dosis inferiores. Se aprecia un aumento de las categorías conductuales de exploración no social (ENS [41%]: p<.01, |δ|≈1), exploración a distancia (EAD [25%]: p<.01, |δ|>0.60), investigación social (IS [14.8%]: p<.01, |δ|>0.60), evitación/huida (EH [10.6%]: p<.01, |δ|=1), inmovilidad (INM[4.2%]: p<.01, |δ|>0.60) y por primera vez aumenta la probabilidad de ocurrencia de defensa/sumisión (DS[1.2%]: p<.05, |δ|≈0.50). Por otra parte, se reducen con un tamaño del efecto muy alto la conducta de escarbar (ESC [0.7%]: p<.01, |δ|>0.70) y ambas conductas agresivas especialmente el ataque (AM [0.3%], AT [0%]: p<.01, |δ|≈1). Las diadas agonísticas presentan las siguientes alteraciones: 1) La estructura conductual de la agresión muestra cambios cuantitativos y cualitativos, ya que la amenaza no se precede de ataque, de exploración no social ni de investigación social; y el resto de secuencias precedentes y posteriores a la amenaza se encuentran muy reducidas (“EAD-AM”[0.2%], “AM-ENS”[0.2%]: p<.01, |δ|≈1). 2) Las conductas de evitación y defensa, se encuentran alteradas de forma cualitativa, ya que se producen incrementos en diadas que no son representativas en el grupo control(c). Estas diadas implican conductas exploratorias precedentes a la Evitación/huida (“EAD-EH”[4.56%], “ENS-EH”[3.82%], “IS-EH”[1.41%]: p<.01, |δ|>0.60), posteriores a Evitación/huida (“EH-ENS”[8.15%], “EH-EAD”[1.62%]: p<.01, |δ|≈1), precedentes a la Defensa/sumisión (EAD [0.5%]: p<.01, |δ|>0.30) y posteriores a ésta (ENS [0.5%], EH[0.4%]: p<.05-.01 respectivamente, |δ|>30). En este grupo, la diada más probable implica conductas exploratorias y con su inversa acumulan más un 35% con un tamaño del efecto elevado (“ENS-EAD”[22%, “EAD-ENS”[13.5%]: p<.01, |δ|>0.70),, formando un patrón conductual algo menos activo que con la dosis anterior “ENS↔EAD” (POC: 41%, PT: 0.54-0.54), que puede derivar a su vez en investigación social (“ENS-IS”[8.26%], “EAD-IS”[5.77%]: p<.01, |δ|>0.60),, y con una probabilidad menor en evitación/huida (“EAD-EH”[4.56%], “ENS-EH”[3.82%]: p<.01, |δ|≈1). Todas las conductas exploratorias muestran cambios cualitativos, pues su incremento se produce junto a la reducción de algunas de sus secuencias, y también porque aumentan diadas hasta ahora no registradas relacionadas con la inmovilidad (“ENS-INM” [3.6%], “INM-ENS” [3.2%]: p<.01, |δ|>0.60; “INM-EAD” [1%]: p<.05, |δ|>0.30;), con una probabilidad similar al grupo anterior. 278 Experimento 5: Resultados 10.2.3. Evolución temporal de la conducta ofensiva de ataque Se ha realizado la prueba de independencia χ2-cuadrado, para analizar la asociación entre el tratamiento y el minuto de la prueba en el que se produce la conducta de ataque, en concreto se diferencia entre la primera parte de la prueba (0-5 minutos) y la segunda parte (5-10 minutos). En nuestro conjunto de datos, los grupos tratados con las dosis 8 y 12 mg/kg de PMA presentan una constante cero en el número de ataques realizados, por lo que no pueden incluirse en el analisis. Los resultados parecen indicar que existen diferencias significativas en la distribución temporal de la conducta de ataque en función del tratamiento [χ2 (2, N=575)=6.432; p=.034], por lo que ambas variables parecen estar relacionadas con un grado de asociación muy débil según el coeficiente de contingencia (C=0.105; p=.034). Sin embargo, la interpretación de esta prueba no está indicada debido a que más del 20% de las casillas presentan una frecuencia inferior o igual a cinco, por lo que no se cumple el mimino de frecuencia requerido. En conjunto, la gran reducción de la conducta de ataque tras la administración de cualquiera de las dosis de PMA (figura 10.7), no permite obtener conclusiones relevantes sobre la distribución de esta conducta. Además, a diferencia de lo observado en los experimentos 1 y 3, la distribución de ataques en el grupo control no es homogénea y se acumula principalmente en la segunda parte de la prueba. Figura 10.1. Perfil conductual agonístico tras la administración de PMA. Diferencias respecto al grupo control salina. Test U de Mann-Whitney: * p < 0.05; ** p < 0.01 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ** ** ** ** * EVITACIÓN/HUIDA DEFENSA/SUMISIÓN 0 50 100 150 200 250 ** ** ** ** ** ** ** ** AMENAZA ATAQUE Frecuencia 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ** EXP. A DISTANCIA INVESTIGACIÓN SOCIAL Tiempo (sg) 0 100 200 300 400 500 600 ** ** ** ** EXP. NO SOCIAL 0 10 20 30 40 50 60 ** ** ** ** ** ** CUIDADO CORPORAL ESCARBAR Tiempo (sg) Salino PMA 2mg/kg PMA 8mg/kg PMA 4mg/kg PMA 12mg/kg 0 20 40 60 80 100 120 ** ** ** INMOVILIDAD Experimento 5: Resultados 279 Experimento 5: Resultados 281 Figuras 10.2 y 10.3. Mapa conductual del grupo control y del grupo tratado con la dosis de 2 mg/kg de PMA, donde se indica la probabilidad de ocurrencia de la conducta (interior del globo) y de la diada mediante el grosor de la flecha de línea continua (1-5%, 5-10%, 10-20% y >20%), así como la probabilidad de transición desde la conducta precedente a la consecuente (al lado de la flecha). Los incrementos significativos se indican en rojo y las reducciones en azul. 288 Experimento 5: Discusión MDMA, la metanfetamina o la cocaína que la reducen (Jaehne et al., 2007). Aunque estos estudios en ratas resulten contradictorios entre sí, ambos podrían guardar cierta coherencia con los resultados que hemos obtenido en ratones, ya que tan solo se observa una reducción de la conducta de grooming a partir de una dosis de 8 mg/kg de PMA. El comportamiento de autocuidado como lamer la piel y el pelaje son típicos en animales que no pueden sudar (Jaehne et al., 2007), por lo que se ha sugerido que las variaciones en esta conducta podrían reflejar alteraciones en la termorregulación del sujeto. En este sentido, existen evidencias de que el PMA produce una respuesta de hipertermia aguda (Hewton et al., 2007; Menon et al., 1976; Nichols et al., 1975; Stanley et al., 2007). Sin embargo, aunque tanto el PMA como el MDMA elevan la temperatura corporal de forma semejante en un rango de dosis amplio (4-80 µmol/kg), las ratas tratadas con PMA tienden a permanecer preferentemente en ambientes templados, por lo que se ha sugerido que las conductas básicas de regulación de temperatura que implican desplazamiento, tales como la búsqueda o exploración de lugares frescos podrían encontrarse alteradas (Jaehne et al., 2005; Jaehne et al., 2007; Jaehne, 2010; Stanley et al., 2007). De acuerdo con esto, una posible explicación para los resultados obtenidos es que la conducta de “grooming” pueda actuar como mecanismo compensatorio de regulación de la temperatura a dosis bajas de PMA; mientras que una dosis elevada de esta sustancia podría suponer un compromiso más severo de la termorregulación. Además, se ha descrito que la dosis de 8 mg/kg de PMA produce un efecto antinociceptivo en la rata, es decir, inhibe el procesamiento de estímulos potencialmente dañinos (Bustamante et al., 2004), por lo que es posible que el sujeto no ponga en marcha mecanismos conductuales de autorregulación de la temperatura, debido a una baja sensibilidad a estímulos tanto interoceptivos como externos indicadores de un nivel de temperatura aversivo. En este sentido, la alteración de los procesos sensoriales parece ser coherente con los efectos alucinógenos que se han descrito tras la ingesta de PMA en humanos (Shulgin et al., 1969), así como en ratas, perros y monos (Beaton et al., 1968; Davis et al., 1978; Smythies et al., 1967; Winter, 1994). Por otra parte, nuestros resultados indican que determinadas dosis de PMA (4, 8 y 12 mg/kg) aumentan el nivel de inmovilidad de los ratones, por lo que esta sustancia podría tener un cierto efecto sedante a nivel motor. No obstante, si bien ésta es una explicación posible para la reducción de todas estas conductas citadas anteriormente Experimento 5: Discusión 289 (amenaza, ataque, escarbar y autocuidado), hemos podido comprobar en experimentos anteriores que otras feniletilaminas entactógenas producen igualmente una reducción de estas conductas sin que exista un déficit motor, por lo que dichas alteraciones no tendrían por qué guardar una relación causal entre sí. De hecho, la mayoría de los estudios disponibles sobre los efectos motores del PMA, parece indicar que esta sustancia ejerce un efecto hiperlocomotor en ratas más bien modesto en comparación con el “éxtasis” (Daws et al., 2000; Jaehne et al., 2005; Romero et al., 2006); o bien, que no produce alteración motora en ratas (Bustamante et al., 2004; Hegadoren et al., 1995; MartinIverson et al., 1991), o en ratones (Glennon et al., 1988; Hitzemann et al., 1971). No obstante, hay constancia de que en ratones albinos ICR tanto agrupados como aislados, el PMA (10 mg/kg) podría provocar déficits considerables en la conducta motora, al contrario que el incremento hallado con MDMA o con d-anfetamina (Hatoum & Davis, 1978). Sin embargo, aunque en este estudio el tratamiento con PMA (4, 8, 12 mg/kg) aumente la inmovilidad del ratón, el análisis de secuencias indica que esta conducta representa entre un 3.3-4.5%, por lo que no parece muy representativa del comportamiento del sujeto durante la prueba. De hecho, tanto con la dosis menor de PMA (2 mg/kg) como con aquellas que muestran un aumento de la inmovilidad (4, 8 y12 mg/kg), se observa un incremento significativo de otra serie de conductas del repertorio conductual que requieren de un cierto nivel de activación motora, tales como las conductas exploratorias y las defensivas. En concreto, la dosis de 2 mg/kg de PMA produce un aumento del tiempo y frecuencia de las conductas de investigación social, que no se mantiene al aumentar la dosis, lo que sugiere que el efecto entactógeno del PMA podría ser apreciable tan solo a dosis muy bajas. En contraste, se aprecia un aumento de las conductas de evitación y huida con todas las dosis de PMA, así como un aumento del tiempo empleado en exploración no social. Estos resultados sugieren que una dosis baja de PMA es capaz de inducir un conflicto de aproximación-evitación social, de forma similar a lo observado con dosis moderadas de MDEA (5-10 mg/kg). Conforme se incrementa la dosis de PMA (4, 8, 12 mg/kg) ganan relevancia las conductas de exploración no social y de evitación del oponente, mientras que la dosis más 290 Experimento 5: Discusión alta de PMA aumenta además las conductas de defensa y sumisión; estas alteraciones conductuales parecen ser indicadores de que el PMA provoca en el ratón un estado predominantemente ansiogénico (Brain et al., 1991; Maldonado & Navarro, 2001b). En el análisis de secuencias del PMA, el aumento de la probabilidad de transición “IS-EH” (PTc: 3%; PTPMA: 6%, 11%, 13% y 10 %) no es tan evidente como el nivel de conflicto que produce el fármaco MDEA. Sin embargo, la probabilidad de transición desde exploración a distancia “EAD-EH” (PTc: 1%; PTPMA: 12%, 19%, 20% y 18 %) es mayor en todas las dosis. El hecho de que el animal evite cuando mantiene contacto visual supone una evitación anticipada de que se produzca contacto físico, por lo que el estado ansiogénico que produce el PMA podría ser incluso mayor al de otras sustancias evaluadas. Además, estas alteraciones cualitativas del repertorio conductual del ratón, también parecen apuntar a que el conflicto de aproximación-evitación se intensifica con la administración de dosis elevadas de PMA. En conclusión, el PMA muestra un efecto antiagresivo no específico en ratón, acompañado de una reducción muy notable de la conducta de autocuidado que se observa tan solo a partir de la dosis de 8 mg/kg de PMA, y que podría estar relacionada con las alteraciones de la termorregulación conductual y el efecto hipertérmico que se ha constatado para esta sustancia. El débil efecto sedante a nivel motor, resulta acorde con un estudio realizado también en ratones albinos; sin embargo, no es congruente con la mayoría de los estudios sobre los efectos motores de esta sustancia en ratas y ratones (Bustamante et al., 2004; Daws et al., 2000; Glennon et al., 1988; Hegadoren et al., 1995; Hitzemann et al., 1971; Jaehne et al., 2005; Martin-Iverson et al., 1991; Romero et al., 2006). Además, el PMA parece inducir un aumento de las conductas de investigación social con la dosis menor, un aumento de la evitación y de la exploración no social en todas las dosis, y un aumento de la defensa/sumisión con la dosis mayor. Estas alteraciones parecen indicar un incremento del conflicto de aproximación-evitación y reflejan posiblemente un estado ansiogénico en el ratón. 11. EXPERIMENTO 6: Efectos de la administración de PMA sobre la ansiedad evaluada en el test del laberinto elevado en cruz en ratones Experimento 6: Resultados 293 11. EXPERIMENTO 6: EFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PMA SOBRE LA ANSIEDAD EVALUADA EN EL TEST DEL LABERINTO ELEVADO EN CRUZ EN RATONES MACHOS. El objetivo de este experimento fue examinar los efectos de la administración aguda de MDEA sobre la ansiedad evaluada en ratones machos mediante la prueba conductual del “laberinto elevado en cruz”. 11.1. Procedimiento Para realizar este experimento se utilizaron un total de 48 ratones machos albinos de la cepa SWISS-OF.1 (CRIFFA, Barcelona, España), con un rango de peso inicial de entre 25-30 g. Tras su llegada fueron alojados en jaulas en grupos de cinco y se mantuvieron unas condiciones ambientales óptimas y controladas (véase apartado metodología). En este estudio se tuvieron en cuenta tres grupos experimentales con una dosis creciente de PMA (4, 8 y 12 mg/kg), y un grupo control al cual se le administró suero salino. La asignación de los animales a los distintos grupos se realizó de forma aleatoria y la administración aguda de estas sustancias se realizó vía intraperitoneal (i.p.) y de forma proporcional al peso del animal con un volumen constante de 10ml/kg. 11.2. Resultados En la Tabla 11.1, se muestran los valores de mediana con rangos en cada una de las medidas espaciotemporales y etológicas evaluadas en ratones machos que realizaron el test del laberinto elevado en cruz, tras la administración aguda de PMA (4, 8 y 12 mg/kg) o suero salino. Los parámetros que se han evaluado para cada medida han sido tiempo acumulado (T), frecuencia (F) y latencia (L). Además, para la medida espaciotemporal de brazo abierto se ha evaluado el porcentaje de entrada en brazo no protegido respecto al total de entradas en brazos. Los datos recogidos no cumplían los criterios de normalidad y homocedasticidad, por lo que se han analizado mediante las pruebas no paramétricas H-Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney, con un criterio de significación estadística de p<.05. A continuación se exponen los resultados para cada categoría conductual y grupo de tratamiento. 294 Experimento 6: Resultados Tabla 11.1 Tabla 11.1 Salino Mdn (Rango) p* δMdn (Rango) p* δMdn (Rango) p* δ Medidas Espaciales Brazos Cerrados T 126,88 (82,4-168,7) 162,32 (0-246,8) 191,46 (42,4-267,2) 150,41 (55,5-296,7) F †† 12 (9-16) 9 * (0-21) .032 -0.45 12 (3-22) 6 ** (1-24) .001 -0.73 L 54,35 (0,7-109,7) 2,51 (0,4-300) 32,55 (0,5-80,4) 17,74 (0,4-85,8) Brazos Abiertos T 33 (18,8-136,1) 23,32 * (0-154,8) .029 -0.47 13,64 * (0-172,7) .014 -0.55 29,13 (0-140,8) F 4 (1-16) 2 * (0-7) .039 -0.43 2 (0-12) 1,5 (0-11) L 3,58 (0,3-47,3) 63,03 * (0,8-300) .025 0.48 4,9 (0,5-300) 39,25 * (0,8-300) .024 0.48 % F 26,67 (10-55,2) 19,32 (0-100) 14,29 (0-52,2) 15,76 (0-69,2) Plaforma Central T 124,21 (75,3-160,7) 116,65 (50,4-156,8) 78,46 (23,9-244) 84,12 (3,3-228,8) F † 17 (10-29) 10,5 * (4-22) .04 -0.43 19 (4-28) 10 ** (1-29) .003 -0.67 L 3,35 (0,3-47,3) 1,05 (0,4-20,1) 1,38 (0,5-63,1) 2,89 (0,4-20,9) Medidas Etológicas T 1,21 (0-8,5) 0,55 * (0-4,7) .037 -0.44 0,55 (0-6) 2,18 (0-16,6) F 3 (0-12) 1 * (0-9) .029 -0.46 1 (0-7) 3,5 (0-25) L 7,42 (2,2-300) 155,29 * (2,3-300) .034 0.45 100,16 * (2,6-300) .05 0.41 94,1 * (2,5-300) .026 0.48 T 6,18 (0,7-14,9) 7,95 (0,6-29,5) 4,96 (0,5-21,2) 6,41 (0-16,8) F 9 (1-16) 9,5 (1-24) 7 (1-22) 9 (0-29) L 10,84 (0,4-56) 25,96 (0,6-198,4) 22,19 * (1,2-147,3) .049 0.42 60,86 * (0,6-300) .016 0.53 Valores de mediana con rangos de los parámetros asignados a las medidas espaciotemporales y etológicas evaluadas en ratones machos, después de la administración aguda de PMA (4, 8 y 12 mg/kg) o suero salino, en el test del laberinto elevado en cruz (EPM). 4 mg/kg de PMA 8 mg/kg de PMA 12 mg/kg de PMA Unprotected Head-dipping (uHD) Protected Head-dipping (pHD) Ambos Brazos Experimento 6: Resultados 295 Tabla 11.1 (Continuación) Salino Mdn (Rango) p* δMdn (Rango) p* δMdn (Rango) p* δ Medidas Etológicas T 11,73 (2-26) 27,16 * (2,9-90,6) .022 0.5 14,64 (5,9-50,3) 9,77 (0,6-46,5) F 9 (2-18) 14,5 (3-26) 14 * (5-35) .036 0.45 8 (1-27) L 9,4 (1,2-43,7) 14,52 (2,3-51) 24,04 (1,8-70,5) 9,21 (0,7-128,1) T 5,36 (0-19,5) 1,77 * (0-21,5) .049 -0.41 0,94 (0-20,9) 1,6 (0-18,7) F 4 (0-14) 1 (0-16) 1 (0-21) 1,5 (0-19) L 16,76 (2,8-300) 93,88 (2,3-300) 86,23 (1,5-300) 111,88 (4,2-300) T 0 (0-2,2) 1,79 * (0-9,1) .042 0.41 1,6 (0-10,1) 0,91 (0-13,2) F 0 (0-3) 2,5 (0-12) 2 (0-14) 1,5 (0-21) L 300 (53-300) 136,96 (11,7-300) 178,1 (21,7-300) 219,13 (17,7-300) T † 6,48 (0-35,1) 0,88 ** (0-13,6) .003 -0.67 0,71 ** (0-12,2) .004 -0.65 6,13 (0-31,4) F † 6 (0-25) 1 ** (0-12) .003 -0.66 1 ** (0-9) .005 -0.63 8,5 (0-29) L 112,01 (1-300) 216,81 (7,5-300) 215,47 (11,8-300) 47,97 (4,2-300) T 0 (0-30) 2,15 (0-58) 0 (0-9,5) 0 (0-56) F 0 (0-7) 1 (0-10) 0 (0-2) 0 (0-10) L 300 (44,9-300) 235,43 (102,3-300) 300 (149,3-300) 300 (39,1-300) Parámetros de tiempo (T), frecuencia (F), porcentaje de frecuencia (%F) y latencia (L). Tamaño del efecto Cliff´s Delta alto |δ|> 0.50 Test Kruskal-Wallis: † p<.05; ††p<.01. Test U de Mann-Whitney, diferencias respecto al grupo control salina: * p<.05; **p<.01. Unprotected Stretched Attend Posture (uSAP) Vuelta a protegido Exploración vertical (Rearing) Cond. no exploratoria Protected Stretched Attend Posture (pSAP) 4 mg/kg de PMA 8 mg/kg de PMA 12 mg/kg de PMA 296 Experimento 6: Resultados 11.2.1. Efectos del PMA sobre las medidas espaciotemporales evaluadas en el test laberinto elevado en cruz. El análisis de las medidas espaciotemporales mediante el test de Kruskal-Wallis indica que entre los grupos existen diferencias significativas en la frecuencia de entrada en los brazos cerrados del laberinto (p<.01) y en la frecuencia total de entradas en cualquiera de los brazos (p<.05). En la Figura 11.1, se exponen en concreto cuales son las diferencias de cada grupo experimental respecto al grupo control, en cada una de las medidas espaciotemporales evaluadas mediante el test no paramétrico U de Mann-Whitney. El grupo tratado con la dosis de 4 mg/kg de PMA muestra una reducción del tiempo y frecuencia con aumento de latencia de entrada en brazos abiertos (T-F: p<.05, L: p<.05; |δ|≈0.50). Además, disminuye la frecuencia de entrada en los brazos protegidos (F: p<.05; |δ|≈0.50), y el número total de entradas en cualquier brazo (F: p<.05; |δ|≈0.50). Tras el análisis del grupo tratado con la dosis de 8 mg/kg de PMA, se observa en la misma linea que el grupo anterior, una reducción significativa del tiempo acumulado en los brazos abiertos del laberinto (T: p<.05; |δ|>0.50), sin embargo no se producen diferencias significativas en otros parámetros conductuales. Por último, los resultados indican que la dosis de 12 mg/kg de PMA reduce la frecuencia de entrada en brazos abiertos e incrementa de su latencia (F: p<.01; L: p<.05; |δ|≈>0.50), y además reduce del número total de entradas en los brazos del laberinto (F: p<.01; |δ|>0.50). En todas las dosis de PMA, los resultados del test de Moses indican un incremento significativo general de la variabilidad de los parámetros de tiempo acumulado en brazos abiertos (4 y 12 mg/kg de PMA, T: p<.05; 8 mg/kg de PMA, T: p<.01), así como de tiempo y frecuencia en brazos protegidos (todas las dosis de PMA, T-F: p<.01), con una dispersión de los datos hacia valores extremos altos y bajos. Efectos del PMA sobre las medidas etológicas evaluadas en el test laberinto elevado en cruz El análisis de las medidas etológicas mediante el test de Kruskal-Wallis indica que existen diferencias significativas en el tiempo y frecuencia empleados en exploración vertical (T: p<.05; F: p.01). A continuación, se exponen los resultados hallados en las medidas etológicas para los diferentes grupos experimentales. Experimento 6: Resultados 297 La administración de la dosis menor de PMA (4 mg/kg) produce una reducción de las conductas de riesgo (Head-dipping y Stretched attitude posture). La conducta de headdipping (HD) consiste en la inclinación de la cabeza hacia el exterior por debajo del nivel del suelo del laberinto, mientras que la conducta Stretched attitude posture (SAP) es una conducta de atención extrema que consiste en el estiramiento del cuerpo hacia deltante manteniendo la posición de las patas traseras seguido del regreso a la postura original. En concreto, con esta dosis se aprecia una reducción del tiempo y frecuencia con retraso de la latencia en head-dipping en brazos no protegidos (uHD; T-F: p<.05, L: p<.05; |δ|≈0.50) y del tiempo en conductas de atención extrema indistintamente de la posición del sujeto en el laberinto (uSAP, T: p<.05; |δ|>0.50) (pSAP, T: p<.05; |δ|>0.35). También disminuye el tiempo y frecuencia empleados en la exploración en posición vertical (T-F: p<.01; |δ|>0.50) y en volver al brazo protegido (T: p<.05; |δ|>0.35). En el grupo que recibió la dosis intermedia de PMA (8 mg/kg) destaca la reducción de tiempo y frecuencia empleados en exploración vertical (T-F: p<.01; |δ|>0.50). Además, se reduce la la frecuencia de las conductas de atención extrema en brazos protegidos (pSAP, F: p<.05; |δ|≈0.50) y se retrasa la aparición de la conducta de head-dipping en ambos brazos (pHD y uHD, L: p<.05; |δ|>0.40). Mientras que, en el grupo tratado con la dosis de 12 mg/kg de PMA, los resultados indican un retraso de las conductas de head-dipping en ambos brazos del laberinto (pHD y uHD, L: p<.05; |δ|>0.50), pero no se hallan alteraciones significativas en otros parametros conductuales. 12. DISCUSIÓN GENERAL Discusión General 307 12. DISCUSIÓN GENERAL MBDB, MDEA y PMA son tres drogas de diseño, estructuralmente similares al MDMA (“éxtasis”), que se han identificado en la composición de pastillas distribuidas como “éxtasis” en entornos recreativos a lo largo de los últimos treinta años. Se ha descrito que estas feniletilaminas sintéticas presentan un perfil psicotrópico de tipo entactógeno, es decir, son compuestos con capacidad para facilitar la proximidad, el contacto y la comunicación empática, generando a su vez en el individuo un singular estado de introspección y bienestar. Acorde a ello, existen evidencias de que estas sustancias son capaces de generar en animales una señal interoceptiva que resulta muy similar a la del MDMA en el modelo de discriminación de drogas, lo que ha llevado a clasificarlas como drogas entactógenas y sustancialmente diferenciadas de los estimulantes, alucinógenos y sedantes (Nichols & Oberlender, 1989; Sáez-Briones & Hernández, 2013;). Los escasos estudios clínicos publicados han advertido de la presencia de estas sustancias en numerosas complicaciones toxicológicas por consumo de “éxtasis”. Más allá de lo expuesto, la información experimental disponible de estos tres compuestos es más bien exigua y se limita al análisis de su proceso de metabolización, su posible mecanismo de acción, la evaluación de algunos efectos conductuales (p. ej., relativos a la motricidad) y, en algunos casos, sus posibles propiedades como agentes reforzadores (ver apartados 2.1, 2.2 y 2.3) (Award et al., 2010; Caldicott et al., 2003; Callaghan, 2005, 2008; Freudenmann & Spitzer, 2004; Meyer et al., 2002a,b, 2009; Nakagawa et al. 2009; Thigpen et al, 2008; van Aerts et al., 2000). En contraste, el compuesto MDMA ha sido objeto de estudio en numerosas investigaciones, siendo hasta la fecha la única RSAs con un perfil entactógeno cuyos efectos conductuales han sido investigados en modelos animales de agresión y ansiedad, si bien con resultados a veces discrepantes (ver apartado 2.4) (Ferraz De Paula et al., 2011; Ho et al., 2004; Kindlundh-Högberg et al., 2009; Lin et al., 1999; Navarro & Maldonado, 2002). Esto ha llevado a plantear la necesidad de profundizar en el estudio de las denominadas sustancias entactógenas, y examinar de forma más exhaustiva su capacidad para alterar diversos procesos emocionales. En la presente Tesis Doctoral, se han presentado seis experimentos con el objetivo de establecer el perfil conductual de las sustancias psicoactivas MBDB, MDEA, PMA en modelos experimentales de agresión y ansiedad. Para ello, en los experimentos primero, 308 Discusión general Tabla 12.1 CONDUCTAS (M. de Agresión) T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L Cuidado corporal Escarbar Exp. No social Exp. A una distancia Investigación social Amenaza Ataque Evitación/huida Defensa/sumisión Inmovilidad CONDUCTAS (M. de Ansiedad) T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L T F L Brazos Cerrados Brazos Abiertos Porcentaje B. Abiertos (F) Centro (T)/ Brazos (F, L) uHD pHD pSAP uSAP Retorno a brazo protegido Elevarse Conducta no exploratoria Diferencias significativas respecto al grupo control, en el sentido que indica la flecha: Flecha larga p<.01; Flecha corta p<.05 12mg/kg Tabla 12.1. Efectos de la administración de las fenetilaminas MDMA (8 mg/kg), MBDB (2-8 mg/kg), MDEA (5-20 mg/kg) y PMA (2-12 mg/kg), en el repertorio conductual de ratones machos evaluados en el modelo de agresión inducida por aislamiento y en el modelo de ansiedad del laberinto elevado en cruz. MDMA MBDB MDEA PMA 8mg/kg 2mg/kg 4mg/kg 8mg/kg 5mg/kg 10mg/kg 20mg/kg 2mg/kg 4mg/kg 8mg/kg Discusión General 309 tercero y quinto, se evaluó el efecto de estas sustancias en la conducta agonística del ratón macho utilizando un modelo de agresión inducida por aislamiento; por otra parte, en los experimentos segundo, cuarto y sexto, se analizó el efecto de las mismas sobre la ansiedad en el modelo del laberinto elevado en cruz. En la Tabla 12.1, se presentan a modo de resumen, los principales resultados obtenidos. MBDB  En el primer experimento, se analizó el efecto de tres dosis de MBDB (2, 4 y 8 mg/kg) y una dosis de MDMA (8 mg/kg) sobre la conducta del ratón macho adulto en el modelo de agresión inducida por aislamiento. En conjunto, los resultados muestran que el MBDB es un compuesto con un efecto antiagresivo notable, pero de menor potencia que el MDMA, que no parece inducir alteraciones motoras al igual que su homólogo. Las dosis más altas de estas sustancias producen una reducción del componente agonístico ofensivo que también se evidencia en el análisis de secuencias, de forma que la probabilidad de las diadas de “amenaza↔ataque” disminuye progresivamente desde un 30% en el grupo control, hasta alrededor del 10% con la dosis más alta de MBDB (8 mg/kg), y se reduce por debajo del 1% con la misma dosis de MDMA. Además, las dosis mayores de MBDB y MDMA tienden a acumular el ataque en la segunda mitad de la prueba, a diferencia del grupo control que distribuye esta conducta a lo largo de todo el periodo. En referencia al efecto antiagresivo observado principalmente con la dosis de 8 mg/kg de MBDB, los escasos estudios realizados con esta sustancia indican que su principal mecanismo de acción implica un aumento de la liberación de serotonina con una inhibición de su recaptación en el córtex, y otras estructuras como el hipocampo y el núcleo caudado (Van Aerts et al., 2000;), de forma similar a lo observado con el MDMA, MDEA y PMA (Golembiowska et al., 2015; Freudenmann & Spitzer, 2004). A este aspecto, existen evidencias de que la activación de los receptores serotoninérgicos 5-HT1B en la corteza frontal (CPFm y COFv) es capaz de inhibir diversos tipos de agresión (Centenaro et al., 2008; De Almeida et al., 2006; Faccidomo et al., 2012; Veiga et al., 2007). Asimismo, se ha demostrado que la activación optogenética del CPFm inhibe la conducta agresiva entre roedores machos sin alterar otras conductas del repertorio agonístico (Wang et al. 2011). Por lo que los datos disponibles parecen ser 310 Discusión general congruentes con el efecto antiagresivo hallado para las sustancias, y sugieren que dicho efecto podría estar regulado por la activación serotoninérgica de la corteza prefrontal. No obstante, esta acción antiagresiva resulta también muy inespecífica. Por otro lado, el efecto de la dosis menor de MBDB (2 mg/kg) merece ser comentado aparte. Aunque no se observe una reducción de la conducta ofensiva, el análisis de secuencias sugiere que esta dosis es capaz de alterar el patrón conductual de la amenaza, pues dicha conducta tiende a producirse en mayor proximidad social que en el grupo control, a la vez que es seguida de una mayor conducta de evitación. Estos cambios cualitativos en la conducta de amenaza, parecen indicar un aumento del conflicto de “aproximación-evitación” y por tanto que el MBDB podría ser capaz de facilitar la ansiedad incluso a dosis muy bajas. En contraste, el análisis clásico muestra un aumento de la investigación social que es específico y especialmente intenso con esta dosis, el cual también se observa en menor medida y de forma inespecífica con dosis mayores de este compuesto. En conjunto, esto sugiere que el MBDB produce un posible efecto “entactogénico” en el ratón promoviendo la proximidad social, especialmente a dosis bajas. Este resultado es coherente con el perfil entactógeno del MBDB descrito en humanos y en experimentos de discriminación de drogas con animales (Kronstrand, 1996; Nichols, 1986; Nichols, 1987; van Aerts et al., 2000). Sin embargo, según lo expuesto, no es posible relacionar abiertamente este efecto entactógeno específico a dosis bajas de MBDB, con un menor nivel de ansiedad en el sujeto, aspecto que retomaremos en la discusión más adelante. La administración de MDMA no se acompañó de cambios en la conducta de investigación social, como se ha observado en otros estudios. Así, se ha descrito, por un lado, una reducción de esta conducta en trabajos que emplean el mismo modelo de agresión (Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 1999), observándose también una disminución de la investigación social en ratones con un perfil de agresión bajo (Machalova et al., 2012), en ratones adolescentes (Daza-Losada et al., 2009) y en ratas (Clemens et al., 2004). Y, por otro lado, también se ha descrito un aumento de la investigación social en ratones con un perfil de agresión elevado (Machalova et al., 2012), en ratones adolescentes (Daza-Losada et al., 2009) y en ratas (Andó et al., 2006; Morley & McGregor, 2000; Morley et al., 2005; Thompson et al., 2007). Esta disparidad podría sugerir que el efecto entactógeno del MDMA quizá no sea tan visible en roedores como Discusión General 311 en humanos. No obstante, en cualquier caso nuestros resultados sobre la evaluación de una sola dosis de MDMA no nos permite pronunciarnos al respecto. Como señalábamos anteriormente, el efecto antiagresivo observado para ambas sustancias es inespecífico. La dosis más elevada de MBDB (8 mg/kg) reduce las conductas de escarbar y cuidado corporal, mientras que aumenta otras conductas tales como evitación, defensa, exploración a distancia, exploración no social e investigación social), que en conjunto denotan la presencia de un conflicto de aproximación-evitación y sugieren un nivel de ansiedad elevado en el ratón. En esta misma línea, la reducción de la latencia de evitación-huida en todas las dosis parece indicar de nuevo que incluso la dosis menor de MBDB presenta ciertas propiedades ansiogénicas. Esto concuerda con lo observado en el análisis de secuencias para la dosis menor de MBDB, por lo que este tipo de análisis parece ser útil para desvelar efectos conductuales que se manifiestan en un análisis clásico utilizando dosis mayores. Estos resultados complementan el perfil entactógeno del MBDB, describiendo un efecto ansiogénico dosis-dependiente que no se ha descrito hasta el momento, y que a igualdad de dosis parece ser similar al producido por el MDMA. A su vez, el efecto ansiogénico hallado con la dosis de MDMA, es coherente con diversos estudios que refieren un aumento de las conductas de exploración a distancia y evitación en el mismo modelo (8-15 mg/kg; 5-20 mg/kg; 5 mg/kg) (Maldonado & Navarro, 2001b; Navarro & Maldonado, 1999; Navarro et al., 2004), así como con el aumento de la exploración a distancia en el test de interacción social a determinadas dosis (10 mg/kg, pero n.s. 5 ó 20 mg/kg) (Daza-Losada et al., 2009); o el aumento de las conductas de evitación y sumisión del ratón con dosis elevadas de MDMA (10, 30 mg/kg) (Machalova et al., 2012). Asimismo, la administración aguda de MDMA también produce efectos ansiogénicos en ratas evaluadas con el test de interacción social (Bhattacharya et al., 1998; Bull et al., 2004; Gurtman et al., 2002; Morley et al., 2001). Por otra parte, aunque la conducta de escarbar no resulta determinante para la valoración de los resultados, su reducción se ha vinculado al efecto de sustancias que, como el MDMA, elevan el nivel de ansiedad (Maldonado, 2000), lo que parece reforzar el perfil ansiogénico del MBDB y MDMA obtenido en este experimento. Es necesario señalar que ambas feniletilaminas (8 mg/kg) exhiben propiedades estimulantes motoras, ya que el aumento de la exploración no social tiene un componente 312 Discusión general motor importante. Esto resulta congruente con la observación de que ambas sustancias, especialmente el MDMA, aumentan la activación motora en el test “Behavioral Pattern Monitor” (BPM) (Callaway & Geyer, 1992; Gold et al., 1989), con un patrón locomotor caracterizado por una elevada tigmostasis y una locomoción continua por la periferia del recinto (Gold et al., 1988, 1989; Gold & Koob, 1989; Paulus & Geyer, 1992; Risbrough et al., 2006). No es sorprendente que la administración aguda de estas sustancias aumente la respuesta motora (Green et al., 2003), pues ambas facilitan la liberación de serotonina (Johnson et al., 1986; Johnson et al., 1991; Steele et al., 1987; Van Aerts et al., 2000). En concreto, se ha sugerido que el MBDB produce este efecto hiperlocomotor influyendo indirectamente en el sistema dopaminérgico a través de la activación de receptores serotoninérgicos (5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C), de forma similar a lo descrito con el MDMA (Paulus & Geyer, 1992; van Aerts et al., 2000). Por otra parte, el análisis visual ha permitido detectar la conducta repetitiva de giro denominada “circling” tan solo en algunos sujetos tratados con MDMA. Esta conducta de circling es más bien característica de sustancias que producen una liberación moderada o alta de dopamina como la MDMA o la MDA (Lebsanft et al., 2003; Lebsanft et al., 2005). En concreto, se ha relacionado con la activación de receptores dopaminérgicos D2, mientras que la ejecución de patrones lineales por la periferia del recinto y la elevada tigmostasis se ha vinculado con la activación de receptores D1 (Risbrough et al., 2006). Por lo que esta observación cualitativa parece ser congruente con el perfil neuroquímico de estas sutancias, ya que la liberación de dopamina del MBDB es bastante débil en comparación con la MDMA (Van Aerts et al., 2000).  En el segundo experimento se examinó el efecto del MBDB (2, 4, y 8 mg/kg) y MDMA (8 mg/kg) sobre la conducta de ansiedad en el laberinto elevado en cruz (EPM). Los resultados indican que todas las dosis de MBDB reducen el tiempo y la frecuencia de entrada en los brazos abiertos, lo que sugiere que esta sustancia en general aumenta el nivel de ansiedad del ratón. No obstante, la dosis menor de MBDB (2 mg/kg) muestra un efecto ansiogénico más bien leve, ya que no disminuye el porcentaje de entrada en el área abierta, uno de los parámetros espaciales más sensibles a la ansiedad. En esta línea, la evaluación de las medidas etológicas muestra que la dosis menor no altera tampoco otros parámetros relacionados con la ansiedad. En este aspecto, la dosis intermedia de MBDB (4 mg/kg) es la más interesante ya que no solo altera todas las Discusión General 313 medidas clásicas de actividad en el área abierta, sino que además reduce consistentemente las conductas de riesgo uHD y uSAP, indicando un nivel de ansiedad elevado y un aumento del nivel de conflicto que produce la prueba (Carola et al., 2002; Espejo, 1997). Por su parte, la dosis mayor de MBDB, genera un perfil que podría describirse como ansiogénico en tanto que reduce el porcentaje de entrada en brazos abiertos. No obstante, el hecho de que esto se deba más a un aumento de entrada en el área protegida que a una reducción en el área abierta es congruente con la pequeña reducción de las conductas de riesgo en los brazos abiertos (uHD), pero no con un aumento del nivel de ansiedad tan apreciable como el de la dosis intermedia de MBDB. Por otro lado, podemos descartar que el MBDB induzca algún tipo de efecto sedante sobre la locomoción pues, aunque la dosis menor muestre una reducción leve de la frecuencia de entrada en ambos brazos, los grupos tratados con la dosis de 8 mg/kg de MBDB o MDMA aumentan la actividad en el área protegida sugiriendo un posible efecto estimulante motor, congruente con los resultados hallados en el primer experimento. El cambio en el perfil conductual de la dosis de 8 mg/kg MDMA es similar, pero más intenso, que el de la dosis intermedia de MBDB, lo que sugiere un efecto ansiogénico más notable. Por otra parte, el tratamiento con MDMA reduce la conducta pHD, una alteración que se ha relacionado con propiedades ansiolíticas (Carrasco et al., 2013; Espejo, 1997; Mascarenhas et al., 2013; Rodgers & Johnson, 1995; Wall & Messier, 2000). Sin embargo, otra posibilidad es que la reducción de las conductas de head-dipping en ambas áreas se deba a un efecto hipoexploratorio. En este sentido, se ha descrito que la combinación de un efecto hipoexploratorio y la evitación de las áreas abiertas es propia de drogas con efectos alucinógenos (Gold et al., 1989). Ambas alteraciones se han observado en el grupo tratado con MDMA, el cual también muestra un aumento de la tigmostasis o contacto con superficies verticales determinado por el incremento del tiempo en los brazos protegidos. En cualquier caso, la interpretación de la reducción de esta conducta concreta (uHD) resulta bastante confusa en relación al resto de alteraciones conductuales. En conjunto, el perfil conductual de la dosis de 8 mg/kg de MDMA está en consonancia con estudios previos que hallan un efecto ansiogénico en el modelo del laberinto elevado cruz utilizando dosis similares, tanto en ratones (4-8 mg/kg) (Lin et al., 1999; Navarro & Maldonado, 2002), como en ratas (1.25-10 mg/kg) (Bhattacharya et al., 320 Discusión general Tseng et al., 1978); o bien señalan que el PMA no altera la locomoción en ratas (Bustamante et al., 2004; Hegadoren et al., 1995; Martin-Iverson et al., 1991) y en ratones (Glennon et al., 1988; Hitzemann et al., 1971). Tan solo en un estudio con ratones albinos, se informa de que esta sustancia puede inducir inmovilidad (Hatoum & Davis, 1978), por lo que es posible que la selección de la cepa de ratón sea un factor que influya en los efectos del PMA sobre la locomoción. Los escasos estudios neuroquímicos realizados con PMA sugieren que su principal mecanismo de acción es la liberación e inhibición de la recaptación de serotonina en el córtex, y en menor medida de dopamina, de forma similar pero con menor intensidad que el MDMA (entre 1.5 y 2 veces menor) (Golembioswka et al., 2015). Como indicábamos al inicio, la activación de receptores 5-HT1B de la corteza frontal (CPFm y COFv) se ha relacionado con la inhibición de diversos tipos de agresión (Centenaro et al., 2008; De Almeida et al., 2006; Faccidomo et al., 2012; Veiga et al., 2007); y especialmente la activación del CPFm parece estar implicada en la inhibición de la conducta agresiva entre machos (Wang et al. 2011), por lo que aunque aún no hay estudios al respecto, es posible que este potente efecto antiagresivo del PMA se encuentre regulado por la activación serotoninérgica del CPFm. En el estriado, el PMA también libera DA alrededor de 1.5 veces menos que el MDMA, mientras que multiplica por tres la liberación estriatal de serotonina respecto al MDMA (Golembioswka et al., 2015); por lo que es posible que la desregulación 5-HT/DA en esta área medie los efectos motores de esta sustancia, siendo necesarios más estudios al respecto. En cualquier caso, el efecto del PMA sobre la conducta agresiva y la locomoción es notablemente inespecífico. Todos los grupos de tratamiento muestran un aumento muy destacado de las conductas de evitación-huida (|δ|≈1) y del tiempo en exploración no social (|δ|≈0.80), lo que sugiere que el PMA eleva la ansiedad en el ratón. Además, el aumento de la conducta de defensa/sumisión con la dosis mayor de PMA (12 mg/kg) indica que este efecto ansiogénico puede ser mayor con dosis elevadas de este compuesto. Por otra parte, la dosis menor de PMA (2 mg/kg) aumentó notablemente la investigación social, pero este posible efecto entactógeno parece diluirse al aumentar la dosis, de forma similar a lo observado con el MBDB y MDEA. En relación con esto, el análisis de secuencias muestra que las diadas predominantes son las que conectan “exploración no social↔exploración a distancia”, así como las que conectan éstas con investigación social Discusión General 321 (2 mg/kg PMA), o con investigación social y evitación/huida (4, 8 y 12 mg/kg de PMA). Esto pone de relieve que existe un aumento del conflicto aproximación-evitación en un amplio rango de dosis de PMA y también sugiere que este fármaco induce un estado ansiogénico en el ratón. En relación al nivel de conflicto y en comparación con otras RSAs evaluadas, el PMA tiende a aumentar la probabilidad de transición de la diada “EAD-evitación”, mientras que el MDEA muestra un aumento más notable y progresivo de la probabilidad de transición de la diada “IS-evitación”, y el MBDB aumenta de forma leve y similar ambas diadas. Estos resultados sugieren que el estado ansiogénico que produce el PMA podría ser incluso mayor que el de otras sustancias evaluadas, pues aumenta la probabilidad de que el sujeto evite al oponente con tan solo establecer contacto visual. Por otra parte, el PMA reduce otras conductas del repertorio agonístico del ratón, como la conducta de escarbar en todos los grupos de dosis y la de autocuidado con dosis elevadas (8 y 12 mg/kg). En contraste, las dosis inferiores muestran una tendencia no significativa a aumentar el tiempo dedicado al autocuidado. Los estudios previos tampoco se muestran muy acordes respecto al efecto del PMA en el “grooming” (Bustamante et al., 2004; Jaehne et al., 2007). Sin embargo, es posible que las variaciones de esta conducta, respondan a los efectos en la termorregulación (Jaehne et al., 2005; Jaehne et al., 2007; Jaehne, 2010; Stanley et al., 2007) y la nocicepción (Bustamante et al., 2004), que se han descrito para esta sustancia. En conjunto, el PMA (2-12 mg/kg) exhibe unas propiedades antiagresivas bastante notables pero inespecíficas, mientras que el posible efecto entactógeno de esta sustancia parece limitarse a dosis muy bajas (2 mg/kg). Además, el PMA parece inducir un nivel de ansiedad elevado en todas las dosis que viene determinado por el aumento general y notable de las conductas agonísticas de evitación, así como de las defensivas con la dosis mayor. En este aspecto, se ha comprobado que aumenta la aproximación al oponente seguida de evitación (como el MDEA), pero produce un aumento incluso más notable de la vigilancia a distancia seguida de evitación, lo que sugiere un estado ansiogénico muy elevado. Por otra parte, esta sustancia altera la conducta motora aumentando la inmovilidad en ratones albinos, mientras que en otras especies de ratón o de ratas no hay evidencias de que produzca alteración motora alguna, e incluso se ha señalado un leve 322 Discusión general efecto hiperlocomotor, por lo que sería necesario delimitar mejor el efecto motor de este fármaco.  En el sexto experimento se evaluó el efecto de la administración aguda de PMA (4, 8 y 12 mg/kg) sobre la conducta de ansiedad en el test del laberinto elevado en cruz. Los resultados sugieren que las dosis bajas de PMA (4 y 8 mg/kg) tienen un efecto ansiogénico discreto y reducen la exploración. En concreto, la reducción de la frecuencia de entrada en los brazos que produce la dosis menor y de la conducta de exploración vertical con ambas dosis, sugiere que el PMA podría tener un efecto hipoexploratorio en el ratón. Además del efecto hipoexploratorio, se observa un aumento del nivel de ansiedad principalmente con la dosis más pequeña (4 mg/kg), la cual reduce las medidas espaciales de actividad en los brazos abiertos y la conducta de riesgo uHD, además de incrementar levemente la conducta pSAP; mientras que la dosis intermedia de PMA (8 mg/kg) tan solo altera de forma discreta el tiempo en los brazos abiertos y la frecuencia pSAP. En relación con ambos efectos, se ha descrito que la hipoexploración junto con la evitación de las áreas abiertas son alteraciones conductuales comunes en drogas con propiedades alucinógenas (Gold et al., 1989). En este aspecto, los efectos del PMA se asemejan a los del MDEA examinados anteriormente en el modelo del elevado en cruz. En esta misma línea, la reducción de la conducta de riesgo en brazos abiertos uSAP, junto con el aumento del retorno al brazo protegido, sugiere que la dosis más baja de PMA (y en menor medida la dosis intermedia sin alcanzar significación estadistica), es capaz de desplazar la zona de conflicto del área abierta a la protegida, lo que también sugiere que el PMA eleva la ansiedad. No obstante, este efecto ansiogénico en general parece basarse en alteraciones conductuales más bien moderadas, y no llega a alterar índices conductuales típicos de la ansiedad como el porcentaje de entrada en los brazos abiertos (como tampoco produce dispersión de esta variable u otras hacia valores extremos, a diferencia del MDEA). Además, en contraste con lo sugerido en el modelo de agresión, las dosis más pequeñas de PMA son las que parecen mostrar una alteración mayor en las conductas relacionadas con la ansiedad en el test EPM. Discusión General 323 En este modelo, la dosis mayor de PMA (12 mg/kg) no altera los parámetros conductuales de la ansiedad. En lugar de ello, su efecto parece restringirse a una reducción notable de la frecuencia de entrada en cualquiera de los brazos, principalmente en los brazos cerrados, que también puede observarse con la dosis menor. Esto sugiere que el PMA es capaz de producir alteración motora en un rango de dosis amplio (4-12 mg/kg), de forma similar a lo observado en el modelo de agresión. En contraste, los estudios previos indican que una dosis elevada de PMA (30 mg/kg) puede inducir un aumento de la actividad motora y de la actividad mioclónica, mientras que a dosis menores (1, 3, 10 mg/kg) esta sustancia no altera la locomoción (Glennon et al., 1988; Hitzemann et al., 1971; Tseng & Loh, 1974). Por otro lado, es preciso comentar que quizá no sea adecuada la práctica habitual en el test EPM de agrupar la conducta de inmovilidad y de autocuidado en una única variable de “conducta no exploratoria”, pues dado que ambas conductas presentan cambios en sentidos opuestos en el modelo de agresión es muy posible que de esta forma estemos restando significado etológico y utilidad a la evaluación de la categoría de conducta no exploratoria. Por último, hemos de indicar que a nivel cualitativo advertimos la presencia de conductas motoras extrañas en algunos animales tratados con PMA, tales como rotaciones corporales consecutivas (circling) en el área protegida, así como de sacudida de cabeza (head-twitch) prevalentemente en el área abierta que resultaron bastante llamativas. En este aspecto, hay evidencias de que el PMA (2, 10 mg/kg) es capaz de inducir un aumento de la conducta rotacional de rata, en menor medida que otras sustancias como la danfetamina o el MDMA (Romero et al., 2006). Es posible que este aumento de la conducta rotacional de la rata tras la administración de PMA pueda estar relacionado con la liberación desproporcionada de 5-HT y DA en los ganglios basales (2000% y 300% de la línea base, respectivamente), en comparación con el aumento de la liberación más equilibrado que produce el MDMA (600% y 500%) (Golembioswka el al., 2015). 13. CONCLUSIONES GENERALES Conclusiones Generales 327 13. CONCLUSIONES GENERALES 1. MBDB, MDEA y PMA comparten un perfil antiagresivo inespecífico en el modelo de agresión inducido por aislamiento, exhibiendo el MBDB (8 mg/kg) un patrón antiagresivo similar al MDMA (8 mg/kg). La falta de especificidad se debe, en unos casos, al aumento de las conductas de inmovilidad producido por PMA (4-12 mg/kg), que podría estar interfiriendo en el repertorio conductual de estos animales. Y, por otra parte, a las propiedades ansiogénicas mostradas durante la interacción social desarrollada en este modelo, que se aprecia particularmente en el rango de dosis más altas de MDEA (5-20 mg/kg) y PMA (2-12 mg/kg). Las dosis más bajas parecen sugerir un posible efecto entactógeno de estas sustancias. 2. Además, estas drogas parecen alterar el patrón conductual agonístico ofensivo (MBDB y MDEA) y defensivo (MBDB, MDEA y PMA), produciendo cambios diádicos que resultan coherentes con un aumento del nivel de conflicto y de ansiedad. Este tipo de análisis secuencial ha demostrado ser especialmente útil para definir el perfil conductual de estas sustancias, permitiendo detectar sus propiedades psicoactivas con dosis más bajas de las requeridas para observar cambios en los parámetros clásicos conductuales. 3. El estudio de la ansiedad con el modelo animal del laberinto elevado en cruz indica que el MBDB (4-8 mg/kg) produce un aumento de la ansiedad, aunque menor que el observado con MDMA (8 mg/kg), en consonancia con lo observado durante la interacción social en el modelo de agresión. Sin embargo, MDEA (5-20 mg/kg) y PMA (4-8 mg/kg) parecen generar un estado de hipoexploración, y tan solo la dosis mayor de MDEA (20 mg/kg) y la menor de PMA (4 mg/kg) muestran alteraciones discretas en ciertos parámetros conductuales aislados que sugieren un efecto ansiogénico débil, exhibiendo en estos casos un perfil conductual diferente al observado en el modelo de agresión. Además, este perfil de hipoexploracion y evitación de áreas abiertas podría guardar cierta similitud con las alteraciones conductuales que producen los compuestos alucinógenos. 328 Conclusiones generales 4. El perfil antiagresivo y ansiogénico observado en la interacción social durante el encuentro agresivo concuerda solo parcialmente con el patrón conductual que MDEA y PMA han mostrado en el modelo de ansiedad del laberinto elevado en cruz. Sería necesario evaluar la ansiedad en otros modelos experimentales para comprobar si el efecto ansiogénico tiene relación directa con la presencia de un oponente en la prueba, así como examinar el efecto de dosis más bajas de las empleadas en este estudio sobre la agresión. 14. REFERENCIAS 336 Referencias Brunnenberg, M., & Kovar, K. A. (2001). Stereospecific analysis of ecstasy-like N-ethyl-3,4methylenedioxyamphetamine and its metabolites in humans. Journal of Chromatography. B., 751(1), 9-18. Brunnenberg, M., Lindenblatt, H., Gouzoulis-Mayfrank, E., & Kovar, K. A. (1998). Quantitation of N-ethyl-3,4-methylenedioxyamphetamine and its major metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography and fluorescence detection. 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