Posibles funciones de la familia génica de la glutamato descarboxilasa en Populus

UNIVERSIDAD DE MÁLAGA Departamento de Biología Molecular y Bioquímica TESIS DOCTORAL POSIBLES FUNCIONES DE LA FAMILIA GÉNICA DE LA GLUTAMATO DESCARBOXILASA EN POPULUS Alicia Garrido Aranda Noviembre 2015 AUTOR: Alicia Garrido Aranda http://orcid.org/0000-0003-4275-2756 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Dpto Biología Molecular y Bioquímica Facultad de Ciencias Universidad de Málaga Campus de Teatinos 29071 Málaga Dr. Fernando Gallardo Alba, profesor del departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga, y el Dr. Juan Jesús Molina Rueda, Investigador post-doctoral de la Universidad de Málaga Certifican: Que la Tesis Doctoral titulada “Posibles funciones de la familia génica de la glutamato descarboxilasa en Populus”, presentada por la licenciada Alicia Garrido Aranda para optar al grado de Doctor por la Universidad de Málaga con mención internacional, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga y reúne los requisitos exigidos para su defensa ante el tribunal En Málaga, a 17 de Septiembre de 2015 Fdo.: Fernando Gallardo Alba Fdo.: Juan Jesús Molina Rueda Dpto Biología Molecular y Bioquímica Facultad de Ciencias Universidad de Málaga Campus de Teatinos 29071 Málaga Memoria de la tesis doctoral presentada por Alicia Garrido Aranda Para optar al grado de doctor en Biología con mención internacional por la Universidad de Málaga Directores: Dr. Fernando Gallardo Alba y Dr. Juan Jesús Molina Rueda Lugar: Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga Proyectos que la han financiado: AGL200911404 del Plan Nacional I+D+i Málaga, 17 de Septiembre de 2015 Fdo.: Fernando Gallardo Alba Fdo.: Juan Jesús Molina Rueda A mi familia A Raúl Abreviaturas AAT aspartato aminotransferasa ACS aminociclopropanocarboxilato sintasa (ACC sintasa) ACO ACC oxidasa ADH alcohol deshidrogenesa AMT1.2 transportador de amonio de alta afinidad AtGAD glutamato descarboxilasa de Arabidopsis ATP adenosín trifosfato BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programa de análisis de similitud de secuencias BLASTP BLAST con secuencias de proteínas CaM calmodulina CaMBD dominio de unión de calmodulina cDNA ADN complementario Ciclo GS/GOGAT ciclo glutamina sintetasa/ glutamato sintasa Cq ciclo al cual aumenta la intensidad de emisión del fluoróforo respecto al ruido de fondo GAD glutamato descarboxilasa GABA acido gamma-aminobutírico GABP permeasa de GABA GABA-T GABA transaminasa GAT transportador mitocondrial de GABA GDH glutamato deshidrogenesa GHB ácido gamma-hidroxibutírico GLYR glioxilato reductasa GRF (Growth-Regulating Factor) Factor regulador del crecimiento IDH isocitrato deshidrogenasa mRNA ARN mensajero MS medio de Murashige y Skoog NAD+ nicotinamida adenina dinucleótido forma oxidada NADH NAD+ reducido NH4+ amonio NO3nitrato NiR nitrito reductasa NR nitrato reductasa NRT transportador de nitrato (NTR1.2: de baja afinidad; NRT2.1: de alta afinidad) PAL fenilalanina amonio liasa PLP piridoxal 5´fosfato PLPBD dominio de unión de PLP PT-AAT Aspartato aminotransferasa de origen procariota PtaGAD GAD de Populus tremula x Populus alba PtGAD GAD de Populus trichocarpa qPCR PCR en tiempo real ROS especies reactivas de oxígeno SSA semialdehído succínico SSADH semialdehído succínico deshidrogenasa Z1 región meristemática en la raíz Z2 región de elongación en la raíz Z3 región de absorción en la raíz Z4 región de predominancia de raíces laterales en la raíz Z5 región de transporte en la raíz 3´UTR (untranslated región) región 3´ no traducida del gen Capítulo 1 Introducción general Este capítulo es una versión en castellano del trabajo: Molina-Rueda JJ, Garrido-Aranda A, Gallardo F (2015) Glutamate decarboxylase. Capítulo 7 en Amino Acid in Higher Plants, Ed.JPF D´Mello. CAB international, Oxfordshire, UK, pp 139-141 (ISBN 9781780642635) Contribución de Alicia Garrido Aranda a la publicación: Planteamiento del capítulo, búsqueda de información y redacción. CAPITULO 1 3 Aunque hace más de 50 años que se describió que la glutamato descarboxilasa (GAD) lleva a cabo la descarboxilación del glutamato para producir GABA, y en animales ha sido muy estudiada debido al papel del GABA como neurotransmisor, la información disponible sobre las GADs de plantas es aún limitada, conociéndose sólo algunos aspectos de la regulación por calcio de su actividad enzimática o de expresión de algunos de los genes de su familia génica. El GABA es un metabolito que tradicionalmente se ha asociado a estrés, pero su papel en plantas todavía no está claro. En las últimas dos décadas los resultados experimentales obtenidos sobre la GAD y el GABA, destacando las alteraciones fenotípicas mostradas por plantas tratadas con GABA y por plantas transgénicas para GAD, han generado preguntas interesantes sobre el posible papel de este metabolito y la enzima en señalización en plantas. En esta introducción se desarrollaran los siguientes puntos: 1) características de los dominios de las GADs en plantas, incluyendo el dominio de unión a calmodulina (CaMBD) y su adquisición durante la evolución; 2) la familia génica GAD de diferentes especies de plantas y su regulación; 3) transporte y metabolismo del GABA; y 4) papeles del GABA en plantas como metabolito, considerando sus propiedades físicoquímicas y su posible papel como molécula señal. También se discute un posible papel de la GAD y el GABA en el desarrollo vascular de plantas leñosas. Características de las GADs en plantas La GAD es una enzima citosólica que cataliza la descarboxilación del glutamato para producir CO2 y GABA mediante el consumo de protones, lo que ha sido considerado relevante para el control del pH citosólico. El GABA se ha asociado tradicionalmente con el estrés en plantas, y algunos tipos de estrés conllevan una acidificación citosólica, siendo el consumo de protones de la reacción catalizada por la GAD un mecanismo celular para hacer frente al estrés. La familia génica GAD se ha estudiado en muy pocas especies de plantas, la mayoría de los estudios se han desarrollado en angiospermas aunque también se han realizado algunos trabajos en nuestro laboratorio en una gimnosperma (pino). La actividad GAD de plantas está regulada por pH y por la unión a calmodulina (CaM) en presencia de calcio (Ca2+) (Crawford y col., 1994; Arazi y col., 1995; Bouche y Fromm, 2004). La enzima es más activa a pH ácido (ej. 5,8) que a pH neutro, siendo la activación a pH ácido (inferior a 6,5) casi independiente de Ca+2/CaM, aunque a pH neutro es esencial la presencia de Ca2+/CaM para su activación (Snedden y col., 1996). La existencia de diversos procesos CAPITULO 1 4 fisiológicos y señales medioambientales que activan vías de transducción de señales que disminuyen el pH citosólico y/ó aumentan los niveles de Ca2+ podrían afectar a la actividad GAD y la producción de GABA. La GAD está codificada por una pequeña familia de genes nucleares (Akama y col., 2001). En animales se han descrito dos tipos de GADs de pesos moleculares diferentes, 65 y 67 kDa (Ueno y col., 2012), en cambio en plantas hasta el momento sólo se ha detectado una forma GAD y su tamaño se sitúa entre los 43 y 62 kDa (Shelp y col., 2012a). Todas las secuencias GAD de plantas disponibles en la base de datos GenBank poseen un dominio central que lleva a cabo la catálisis e interacción con el cofactor, piridoxal 5´-fosfato (PLP). Este dominio está muy conservado en las GADs y posee la secuencia conservada SSEA (serina-serina-ácido glutámico-alanina) típica en descarboxilasas involucrada en la interacción con el PLP, además de un residuo de aspartato y una secuencia conservada SGHK (serina-glicina-histidina-lisina) en el centro activo (Fig. 1; Sukhareva y Mamaeva, 2002). Por otro lado, la mayoría de las secuencias GAD de plantas contiene un dominio de unión a CaM en el extremo carboxilo (CaMBD) ausente en las secuencias GAD de animales (Molina-Rueda y col., 2010; Fig. 1). Esta región está menos conservada que el dominio central PLP. El CaMBD posee unos 28 aminoácidos, con algunos residuos conservados, como las lisinas flanqueantes al dominio y un triptófano localizado en la región central del dominio en una secuencia WKK (triptófano-lisina-lisina), siendo claves para la unión de CaM al dominio (Baum y col., 1996; Arazi y col., 1995; Molina-Rueda y col., 2010). El CaMBD posee una estructura secundaria, qué ha sido identificada por programas de reconocimiento de estructuras secundarias (O´Neil y DeGrado, 1990), que consiste en una hélice alfa anfipática en la que el triptófano conservado se localiza en la mitad longitudinal hidrofóbica y los residuos cargados en la mitad longitudinal hidrofílica. CaMBD actúa como un dominio autoinhibidor de la actividad enzimática ocupando el centro activo, y su liberación mediante la unión a Ca2+/CaM activa la enzima. Aunque es importante destacar que no todas las GADs de plantas están reguladas por la unión Ca2+/CaM, ya que se ha descrito que algunos CaMBD de GADs no unen CaM, como es el caso de una GAD de arroz (Akama y col., 2007). Aquellas GADs que no poseen un CaMBD funcional se ha visto que muestran un menor grado de conservación del extremo carboxilo respecto a las que sí lo presentan. La interacción de GAD con Ca2+/CaM también se ha descrito como un posible mecanismo del ensamblaje de la holoenzima, pero hasta la fecha sólo unos pocos CAPITULO 1 5 trabajos han considerado la caracterización de la holoenzima. Las holoenzimas nativas GAD poseen un tamaño entre 550 y 340 kDa (Shelp y col., 2012a; Zik y col., 2006), pero las aproximaciones clásicas de la purificación de la proteína y el uso de anticuerpos específicos para determinar las características de la holoenzima no han sido concluyentes. Figura 1. Comparación de los polipéptidos GAD de organismos de los diferentes reinos. El dominio de unión a PLP (PLPBD), el dominio de unión a calmodulina (CaMBD) y la secuencia conservada HK en el PLPBD se muestran en la figura. Animales: Homo sapiens HsGAD67 (número de acceso: Q99259.1; 594 aa, 66.9 kDa) y HsGAD65 (Q05329.1; 585 aa, 65.4 kDa); Plantas: Petunia hybrida, PhGAD (Q07346.1; 500 aa, 56.7 kDa); Bacteria: Escherichia coli, EcGADa (P69908.1; 466 aa, 52.7 kDa); Archaea: Halobacterium sp. HaGAD (Q07346.1; 355 aa, 37.4 kDa). Los datos para definir los dominios y la localización se obtuvieron de Sukhareva y Mamaeva (2002). Familia génica de la glutamato descarboxilasa A pesar de que el GABA es una molécula ubicua presente tanto en procariotas como en eucariotas, la GAD está codificada por sólo uno o dos genes, a excepción de las plantas, en que el número de genes que codifican para GAD es más variable (Sukhareva y Mamaeva, 2002; Tabla 1), desde sólo un gen en el genoma de Aquilegia coerulea hasta diez en el genoma de Glycine max (Phytozome v9.0). El genoma de Arabidopsis thaliana ha sufrido una reducción importante durante la evolución (Yang y col., 2013), aún así todavía en su genoma hay cinco genes que codifican GAD. Tal y como ocurre en A. thaliana, en la mayoría de las plantas la presencia de varios genes que codifican GAD sugieren que ha podido ocurrir un fenómeno de especialización pudiendo ejercer cada GAD un papel diferente. La duplicación génica que afecta a los genes GAD de plantas probablemente se ha producido durante la evolución antes y después de la especialización ya que, el árbol filogenético correspondiente a las CAPITULO 1 6 proteínas GAD de especies de los diferentes grupos taxonómicos de plantas principales mostró posibles ortólogos (Fig. 2, Pt1, At5, Eg3, Sl1, Zm4 y Gm 1 y 10), y también ramas con varias GADs de la misma especie, parálogos (Fig. 2, Gm5,6,7 y8; Pt2 y 3, o Pt5 y 6). Además, el número de exones se mantiene relativamente constante en los genes GADs de plantas (de 5 a 7 exones en la mayoría de ellos; Tabla 1.), en cambio se ha observado la perdida ó acortamiento en los intrones de los genes dentro de la misma especie. Figura 2. Análisis filogenético de las GADs de plantas. Las secuencias de aminoácidos de GADs de organismos que representan los principales grupos taxonómicos de plantas (Phytozome v9; Tabla 1.1) fueron alineados con Clustal X (v2.1) y visualizados con TreeView (v1.6.6). Ac, Aquilegia coerulea At, Arabidopsis thaliana; Eg, Eucalyptus grandis; Gm, Glycine max; Os, Oryza sativa; Pp, Physcomitrella patens; Pt, Populus trichocarpa; Sl, Solanum lycopersicum; Sm, Selaginella moellindorffii; Zm, Zea mays. CAPITULO 1 7 Tabla 1.Identificación de los genes GADs en los genomas de plantas secuenciados (Phytozome v9.0: www.phytozome.net) Grupo taxonómico Especie Gen/transcrito Nº exones Proteína Fabidae Populus trichocarpa Potri.012G039000.1 6 Pt1 Potri.004G075200.1 7 Pt2 Potri.T059200.1 7 Pt3 Potri.004G075300.1 7 Pt4 Potri.008G141100.1 7 Pt5 Potri.010G100500.1 7 Pt6 Glycine max Glyma16g34450.1 6 Gm1 Glyma08g09650.1 6 Gm2 Glyma08g09670.1 6 Gm3 Glyma05g26660.1 6 Gm4 Glyma14g39170.1 7 Gm5 Glyma02g40840.1 7 Gm6 Glyma18g04940.1 7 Gm7 Glyma11g33280.1 5 Gm8 Glyma08g09660.1 6 Gm9 Glyma09g29900.1 6 Gm10 Malvidae Arabidopsis thaliana At5g17330.1 8 At1 At1g65960.2 6 At2 At2g02000.1 6 At3 At2g02010.1 6 At4 At3g17760.1 6 At5 Eucalyptus grandis Eucgr.B02632.1 8 Eg1 Eucgr.F02900.1 7 Eg2 Eucgr.H00595.1 6 Eg3 Asterid Solanum lycopersicum Solyc03g098240.2.1 5 Sl1 Solyc05g054050.2.1 7 Sl2 Solyc11g011920.1.1 7 Sl3 Solyc04g025530.2.1 7 Sl4 Solyc01g005000.2.1 7 Sl5 Eudicot Aquilegia coerulea Aquca_002_01342.1 6 Ac1 Grass Oryza sativa LOC_Os03g13300.1 5 Os1 LOC_Os04g37500.1 4 Os2 LOC_Os08g36320.1 6 Os3 Zea mays GRMZM2G098875_T01 5 Zm1 GRMZM2G017110_T02 6 Zm2 GRMZM2G355906_T01 5 Zm3 GRMZM2G101069_T01 7 Zm4 GRMZM2G826838_T01 7 Zm5 Tracheophyte Selaginella moellindorffii 164618 7 Sm1 Embryophyte Physcomitrella patens Pp1s68_116V6.1 5 Pp1 Pp1s34_308V6.2 5 Pp2 Pp1s8_163V6.1 6 Pp3 Pp1s10_153V6.1 7 Pp4 CAPITULO 1 8 Figura 3. Alineamiento de la región C-terminal dónde se encuentra el CaMBD en las proteínas GAD de plantas. Las lisinas (K) flanqueantes (++) y el triptófano (W) conservado (*) se indican en la parte superior del alineamiento. Los residuos idénticos o similares están marcados en negro y gris, respectivamente. En la secuencia consenso de angiospermas (Angiosp) los residuos marcados con una X hace referencia a que en esa posición se han encontrado cuatro o más residuos distintos en las diferentes especies (Molina-Rueda y col., 2010). El guión representa un hueco que se ha introducido para optimizar el alineamiento. Os2 y Ppa1 que carecen de CaMBD. At, Arabidopsis thaliana; Eg, Eucalyptus grandis; Gm, Glycine max; Os, Oryza sativa; Ph, Petunia × hybrid; Ppa, Physcomitrella patens subsp. patens; Ppi, Pinus pinaster; Pt, Populus trichocarpa; Sm, Selaginella moellindorffii; Sl, Solanum lycopersicum; Zm, Zea mays. La tabla 1.1 muestra el número de acceso de las secuencias mostradas CaMBD no sólo está presente en las GADs de dicotiledóneas sino también se encuentra en monocotiledóneas (Oryza sativa y Zea mays) y gimnospermas (Pinus pinaster) (Fig. 3). Nuestro grupo de investigación ha detectado que este dominio está conservado en la GAD de Selaginella moellindorffii perteneciente al filo Lycopodiophyta, un grupo ancestro de las plantas vasculares cuyo origen se remonta a 400 millones de años atrás. Esto demuestra que la unión de CaM al dominio de las GADs de plantas, y por lo tanto su regulación por el calcio, fueron adquisiciones muy antiguas durante la evolución de las plantas. Expresión de los genes GAD Durante años, la expresión de los genes GAD ha sido estudiada en varias especies de plantas vasculares. Los niveles de transcritos GAD cambian frente a estímulos externos habiendo recibido especial atención debido a la implicación del GABA en respuestas a estrés. En condiciones normales de crecimiento, algunos genes GAD poseen patrones de expresión parcialmente constitutivos y con relativos altos niveles de transcritos en toda la planta, mientras que otros muestran una expresión órgano-específica o unos CAPITULO 1 15 También se ha observado variación en los niveles de GABA durante el desarrollo de las plantas. Así, altos niveles de GABA en Arabidopsis se han correlacionado con una reducción en la dominancia apical, provocando un alto grado de ramificación y una reducción en el tamaño de las silicuas y de una menor producción de semillas (Mirabella y col., 2008). En tabaco, Stellaria, arroz y arabidopsis, altas concentraciones de GABA o del ratio GABA/glutamato se han correlacionado con la inhibición de la elongación del tallo o enanismo (Baum y col., 1996; Kathiresan y col., 1998; Akama y Takaiwa, 2007; Renault y col., 2011). Recientemente, varios estudios se han centrado en otros posibles papeles del GABA en plantas como son el transporte iónico y en señalización. El hecho de que el GABA regule el transporte iónico en animales plantea la hipótesis de que también puede tener un papel similar en plantas. Lemna minor incrementó su crecimiento de 2 a 3 veces cuando se le añadió 5 mM de GABA en el medio en cultivo in vitro. Este crecimiento se asoció al incremento en el contenido mineral de las plantas tratadas, y fue inhibido con bicuculina y picrotoxina, que son antagonistas competitivo y no competitivo respectivamente de los receptores del GABA en el sistema nervioso central (Kinnersley y Lin, 2000). En plántulas de Arabidopsis crecidas in vitro, se observó que el GABA promueve la absorción de NO3en condiciones limitantes de NO3-, pero el GABA inhibe esta adquisición en altas concentraciones de NO3- (Barbosa y col., 2010). Estos hallazgos soportan el papel del GABA como modulador potencial del transporte iónico en plantas. Aunque, de momento no se han identificado receptores de GABA en plantas homólogos a los receptores de GABA de animales, sí se han descrito que los receptores de glutamato (GLRs) podrían utilizar el GABA como un ligando modulador (Yu y col., 2006; Lacombe y col., 2001), por lo que esto afirmaría el papel del GABA como molécula señal. La producción de un gradiente de GABA puede estar involucrado en la orientación y el crecimiento del tubo polínico en Arabidopsis (Palanivelu y col., 2003), y podría potenciar la absorción de nitrato a través de la vía de señalización a larga distancia en Brassica napus (Beuve y col., 2004). Otros trabajos han relacionado al GABA con el etileno. Kathiresan y col., 1997 observaron que el GABA provocaba el incremento de los niveles de transcritos de la ácido 1-aminociclopropano-1-carboxilico sintasa (ACC sintasa) y de la oxidasa (ACC oxidasa), enzimas implicadas en la biosíntesis del etileno en plantas. Por otro lado, los estudios de Reggiani (2006) indican que tanto la señal de etileno como su síntesis son necesarias para inducir la acumulación de GABA en arroz. Además, Shi y col., (2010) mostraron que el GABA incrementaba CAPITULO 1 16 los niveles de ACC sintasa y de la ACC oxidasa en raíces de Caragana en condiciones de estrés salino, y que además alteraba los niveles de transcritos de genes relacionados con la transducción de señales, regulación transcripcional, con ROS y con el metabolismo de poliaminas. Lancien y Roberts (2006) observaron que el GABA disminuye la expresión de un gran set de genes de la familia 14-3-3 en plántulas de Arabidopsis en una manera dependiente de calcio, etileno y ácido abscísico (ABA). Las 14-3-3 son proteínas reguladores ubicuas que funcionan por la interacción directa con un amplio rango de proteínas diana, normalmente de manera dependiente de fosforilación. Varias enzimas claves en el metabolismo del nitrógeno y del carbono son diana de las 14-3-3 incluyendo la nitrato reductasa (NR), la glutamina sintetasa (GS), almidón sintasa III y la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH), por lo que sugiere que el GABA forma parte del control del balance C/N en la planta. Por último, el GABA también se le ha asociado con procesos de xilogénesis en árboles. Molina-Rueda y col., (2010) observaron que los niveles de GAD y GABA se asociaban al desarrollo vascular del hipocótilo en pino, y que después de un estrés mecánico, en el que se induce madera de reacción, se alteran los niveles de expresión de la GAD de pino a la vez de genes relacionados con la síntesis de etileno. Además, el GABA se localiza en tejidos vasculares incluyendo xilema en diferenciación (MolinaRueda y col., 2015). Durante la xilogénesis se produce una muerte celular programada (PCD) que implica una entrada de Ca+2 que provoca una ruptura vacuolar y la disminución del pH citosólico. Ambos factores incrementan la actividad GAD. 4. Populus como especie modelo La especie modelo por excelencia para la investigación vegetal ha sido Arabidopsis debido a que posee un tiempo de generación corto, un genoma pequeño, es fácil de crecer en el laboratorio debido a su porte pequeño y fácil de transformar para generar plantas transgénicas. Pero al tratarse de una especie herbácea anual no la hace idónea para el estudio de procesos tales como formación de madera o tolerancia a estrés por tiempos prolongados. En cambio, las plantas leñosas poseen un crecimiento secundario en el que se forma la madera, y que le proporciona el sostén necesario para desarrollar un mayor porte. En este estudio se utilizó como especie modelo un árbol perteneciente al género Populus por varias razones: 1) posee un genoma compacto, sobre unas 50 veces más pequeño que el genoma de pino (Tuskan y col., 2006), y la secuencia del genoma CAPITULO 1 17 completo de la especie P. trichocarpa se encuentra disponible (www.phytozome.net); 2) desde el punto de vista taxonómico es una especie relativamente próxima a Arabidopsis, ya que ambas se tratan de angiospermas dicotiledóneas pertenecientes a la clase Magnoliopsida que comparten sobre un 75% de ESTs, ayudando al estudio de los genes mediante genómica comparativa (Sterky y col., 2004); 3) es un buen modelo del estudio del proceso de formación de madera y como fuente de materias primas ligno-celulósicas para biocombustibles, ya que presenta un rápido crecimiento, es fácil de propagar vegetativamente y de transformar; 4) permite el estudio del transporte a larga distancia de agua y nutrientes, señalización sistémica, estudios del ciclo del nitrógeno y almacenaje de este en plantas perennes, adaptación a condiciones de estrés, etc. (Jansson y Douglas, 2007). Mediante la generación de especies híbridas de Populus se han mejorado las características de éstas para la investigación. A día de hoy, es muy utilizado el híbrido P. tremula x P. alba (INRA clon 717-1-B4) que presenta un rápido crecimiento, además de ser una especie muy susceptible a la infección por Agrobacterium tumefaciens (Leplé y col., 1992), permitiendo usarlo como vector para generar plantas transgénicas resistentes a plagas o a condiciones ambientales extremas, y para la caracterización funcional de genes. OBJETIVOS DEL ESTUDIO 19 Objetivos del estudio A diferencia de lo que ocurre en animales y en otros organismos, la GAD de plantas posee un dominio de unión a CaM lo que pone de manifiesto la relevancia de su regulación e implicación en diferentes procesos celulares (Turano y Fang, 1998; Zik y col., 1998; Yevtushenko y col., 2003; Oh y col., 2005), debido a que el Ca2+ y la CaM son componentes de muchos sistemas de transducción de señales (Bush, 1995; Yang y Poovaiah, 2003). A la posible implicación de la GAD en varios procesos, se añade la redundancia en el número de genes que codifican la proteína debido a duplicaciones génicas que han tenido lugar durante la evolución (Sukhareva y Mamaeva, 2002) y su posible especialización de funciones durante la diversificación de las plantas vasculares. Esta tesis responde al interés en determinar las funciones biológicas de la GAD en plantas superiores, que es compartida por varios grupos de investigación que están abordando este interesante reto en los diferentes modelos. Los estudios descritos en este trabajo se realizan en Populus, unos de los principales modelos de investigación de plantas de interés forestal (Taylor, 2002), usado previamente por el grupo investigador en varios trabajos anteriores (Gallardo y col., 1999 y 2003; Fu y col., 2003; El Katib y col., 2004; Jing et al., 2004; Pascual y col., 2008a; Molina-Rueda, 2009; Merino y col., 2014) y en el que se sospecha que la síntesis de glutamato y GABA, sustrato y producto de la reacción catalizada por la GAD, es relevante en el desarrollo vascular en base a los trabajos previos realizados en coníferas (Palomo y col., 1998; Pascual y col., 2008b, Molina-Rueda y col., 2010 y 2015). Los objetivos específicos de este trabajo son los siguientes: 1) Estudiar la adquisición del dominio de unión a calmodulina (CaMBD) de las GADs de plantas vasculares. 2) Asignar posibles funciones a la familia génica GAD de P. tremula x P. alba (PtaGAD) en condiciones normales de crecimiento y en condiciones de estrés. 3) Analizar el efecto del glutamato y del GABA en la arquitectura radicular de P. tremula x P. alba. Capítulo 2 Presence of GABA in differentiating xylem and evolution of the calmodulin binding domain in glutamate decarboxylases support a role for GABA in plant xylem development Manuscript title: Presence of GABA in differentiating xylem and evolution of the calmodulin binding domain in glutamate decarboxylases support a role for GABA in plant xylem development Authors: Juan Jesús Molina-Rueda, Alicia Garrido-Aranda, Estefanía ChapmanLópez, José Pisarra y Fernando Gallardo Alba. Manuscript in preparation Contributions of Alicia Garrido Aranda to the manuscript: Performed the experiments and wrote the paper. CAPITULO 2 23 Introduction γ-aminobutyric acid (GABA) is a non-proteinogenic amino acid widely distributed among living organisms from all kingdoms. GABA is mainly synthetized through decarboxylation of glutamate by glutamate decarboxylase (GAD), and it is degraded sequentially by the enzymes GABA transaminase (GABA-T) and succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH). These three enzymes catalyze a bypass of the Krebs cycle known as GABA shunt. GABA and GABA shunt have been reported to play roles in diverse processes such as acid tolerance in bacteria (Feehily and Karatzas, 2013), thermotolerance in fungi (Cao et al., 2013), and modulating neuronal activity in animals (Watanabe, 2014). In plants, several roles have been proposed for GABA metabolism such as component in carbon and nitrogen primary metabolism (Fait et al., 2008), protection against reactive oxygen species (Liu et al., 2011), gene expression regulation including the regulation of hormone related genes (Kathiresan et al., 1997; Shi et al., 2010; Lancien and Roberts, 2006) and signaling as long distance signal (Beuve et al., 2004) and as a gradient driving pollen tube growth and guidance (Palanivelu et al., 2003). We have previously reported a novel putative role for GABA in vascular differentiation in pine seedlings (Molina-Rueda et al., 2010, 2015b). According to this role, results showed a differential expression of pine GAD during vascular alterations associated with reaction wood development. Reaction wood in gymnosperm is called compression wood and it is specifically produced in the underside of branches and bent stems of gymnosperm species in order to return the axis to the normal vertical position or to maintain a certain angular orientation of a branch. Vascular alterations in compression wood include generally much shorter tracheids with thicker cell walls containing more lignin and less cellulose than in the opposite side (Timell, 1986). Transcript profile of genes coding for enzymes involved in the biosynthesis of ethylene (ACC synthase and oxidase), an hormone that plays clear roles in vascular development in gymnosperms, correlated with GAD transcript profile during vascular differentiation in hypocotyl and stem of pine seedlings (Molina-Rueda et al., 2010). Furthermore, in agreement with a role for GABA during vascular development, GABA was immunolocalized in differentiating xylem in pine hypocotyls (Molina-Rueda et al., 2015b). Here, to test whether the proposed GABA role in the gymnosperm might be applicable to other vascular plants, we investigated in bent poplar plants the response of CAPITULO 2 24 GAD expression to vascular alterations associated with the reaction wood development, which is called tension wood and is specifically produced in the upper-side of branches and bent stems of angiosperms. Additionally, the presence of GABA was analyzed in stem sections of poplar by GABA immunolocalization. Considering the importance of the roles described for GABA production in living beings (Molina-Rueda et al., 2015a), a fine regulation of its production is expected. It has been described that GAD activity can be modulated by phosphorylation in its N-terminal in humans (Wei et al., 2004) and by pH through a regulatory mechanism mediated by its C-terminal in bacteria (Gut et al., 2009; Shin et al., 2014). Plant GAD activity not only increases by acidic pH, as described in bacteria, but also by calcium/calmodulin (Ca2+/CaM). So far, only angiosperms, with the exception of the fungi Saccharomyces cerevisiae (Coleman et al., 2001), have been reported to present GADs with calmodulin binding domain (CaMBD) in their C-termini. Calcium is one of the most prominent secondary messenger in eukaryotic cells. The regulatory network mediated by Ca2+/CaM not only has a principal role in responses against a wide range of biotic and abiotic stresses in plants (Yang and Poovaiah, 2003; Bouché et al., 2005; Bender and Snedden, 2013; Cheval et al., 2013), but also plays a crucial role in wood formation (Fromm, 2010) and in triggering programmed cell dead during xylogenesis (Bollhöner et al., 2012). We had reported the presence of a functional CaMBD in a pine GAD (Molina-Rueda et al., 2010), disclosing that the regulation of GAD by calcium had occurred in the evolution before the split between angiosperm and gymnosperm (360 mya), and suggesting a noticeable importance of calcium regulation of GADs during land plant evolution. However, when the evolutionary acquisition of CaMBD in the green lineage occurred, and weather this event played a role in the vascular plants evolution, are questions that had not received clear answers yet. Here, in order to shed some light on these intriguing issues, we also investigate the presence of CaMBDs in GADs of the principal green lineage taxa. CAPITULO 2 31 Figure 4. Potential CaMBD at C-termini in GADs across green lineage taxa. A. Phylogenetic relationships of green plant taxa. Branches in brown represent vascular plant lineage. B. Alignment of C-terminal end among GADs from the taxa in A (Atr, Amborella trichopoda; Ppi, Pinus pinaster; Sm, Selaginella moellindorffii; Ppa, Physcomitrella patens; Kf, Klebsormidium flaccidum; Cs, Coccomyxa subellipsoidea; Gs, Galdieria sulphuraria; Sy, Synechocystis). Accession numbers and additional information for the sequences are shown in Supplementary Table S1. The sequence on the top correspond to a consensus of 35 GADs across the principal taxa in the Magnoliophyta taxon (Supplementary Table S2). C. Alignment of the three most similar C-termini among the C-termini shown in B (similarity percentages among all the Ctermini are shown in Supplementary Table S3). Grey and red arrows show left and right flanking lysines (K) respectively, and the blue arrow the central tryptophan (W) present in functional CaMBDs. Black and grey boxes in alignments represent identical and similar residues respectively when compared to the sequence on top of each alignment. “H” in red and “E” in yellow represent predicted α-helix and β-strand respectively. D. Percentages of similarity in soybean CaM1 and its orthologues, GADs and GAD C-termini versus the corresponding angiosperm consensus across green plant taxa (consensus sequences are shown in Supplementary table S4, Figure 4B, and Supplementary table S2 respectively). Green lineage taxa have been sorted in X-axe based on the putative diversification time (million years ago) of the taxon according to Pires and Dolan (2012). Taxa names and area in brown represent vascular plants. CAPITULO 2 32 Conservation degrees of both the GAD carboxy-terminus and CaM across green lineage taxa were analyzed and compared to that of GADs (Fig. 4D). Consensus sequence for CaM1 of soybean and its angiosperm orthologues (Supplementary Table S4) was compared with the orthologues in the different green lineage taxa (Fig. 4D). CaM1 and its orthologues were selected in the study as soybean CaM1 showed to highly activate petunia GAD when compared with other CaMs (Lee et al., 2000). Results showed that CaM1s have been highly conserved during evolution across green lineage taxa, presenting percentages of similarities higher than 96% for taxa with diversification times of 1000 million years ago (Cs in Fig. 4D), which match to the high conservation degree described for plant CaMs (Ranty et al., 2006). On the contrary, when GAD carboxy-termini of the green lineage taxa were compared with the angiosperm CaMBD consensus much lower similarity percentages were observed (Fig. 4D), and they were also lower than the corresponding similarity values for the entire GAD sequences, revealing a relatively low conservation degree of the carboxy end in GAD sequences. These results suggest a lack of coevolution at primary protein sequences between CaM1s and CaMBDs in GADs, and that evolution has rather been acting on certain residues at conserved positions in the GAD carboxy-terminus possibly to improve the enzyme activity regulation by CaM in higher plants. The fact that the lycophyte S. moellendorffii is a member of the ancient vascular plants places the origin of the CaMBD in GADs at least in the carboniferous period (425 mya). Additionally, the charophyte K. flaccidum is a filamentous algae with primary factors for plant terrestrial adaptation such as production of plant hormones including ethylene and auxin (Hori et al., 2014), which are hormones with crucial roles in vascular differentiation (Sorce et al., 2013). The development of vascular tissues was critical for plant terrestrial colonization as an efficient water and mineral nutrient acquisition and transport from pre-soils was required to the adaptation to an emerged habitat with lower water availability (Lucas et al., 2013). Interestingly, recent studies have highlighted that plant calcium signaling was also shaped during land colonization (Edel and Kudla, 2014). Therefore, the production of the stress-metabolite GABA, and the regulation of GAD by Ca2+/CaM, might be consider as part of the adaptation process to cope with the stress associated with the evolution of vascular structures during the colonization of Earth’s terrestrial environment by plants. Moreover, GAD catalyzes a proton-consuming reaction allowing cells and tissues to balance pH, a critical issue during lignin deposition and cell death and also as a component in the adaptation to the CAPITULO 2 33 GS/GOGAT cycle GAD + Programmed cell death Ca2+-influx Vacuolar collapse Carbon metabolism + GABA Glutamate Lignification Phenylalanine Phenyl-propanoids 2oxoglutarate NH4 + Cambium zone Differentiating xylem Mature xylem Ethylene acidic pre-soils at the time of land colonization due to high atmospheric CO2 concentrations (Willis and McElwain, 2002; Molina-Rueda et al., 2010). Figure 5. Model for GAD regulation and GABA production during programed cell death in xylogenesis, and GABA immunolocalization in differentiating xylem cells. In differentiating tracheary cells, programmed cell death (PCD) occur as part of xylogenesis. In PCD, a calcium flux trigger death, including vacuolar collapse causing cytosolic acidification. Both calcium and acid pH induce GAD activity increasing GABA synthesis. GABA production through GAD is metabolically connected to ammonium assimilation and carbon metabolism by the GS/GOGAT cycle which has a relevant role in re-assimilating the nitrogen released during lignification (Castro-Rodríguez et al., 2011). GABA has been referred to induced ethylene production in sunflower (Kathiresan et al., 1997) and to regulate the expression of genes (Lancien and Roberts, 2006; Shi et al., 2010) including cell wall related genes (Renault et al., 2011). Ethylene promotes cambium activity and xylem differentiation in poplar (Love et al., 2009). Regulation of GABA production by calcium and pH during programmed cell death in differentiating xylem cells and a dual role for GABA in nitrogen metabolism and signaling during xylogenesis in vascular plants is proposed. CAPITULO 2 34 Conclusions Based on this work and on previous ones in a gymnosperm (Molina-Rueda et al., 2010, 2015b), GAD expression is shifted during xylem differentiation associated with the production of reaction wood. GABA is localized in the xylem region of pine seedlings (Molina-Rueda et al., 2015b) and poplar saplings (this work), and specifically in radial parenchyma cells and axial differentiating cells. The production of GABA may have a dual role as it may represent a N-reservoir to recover ammonia produced during lignin synthesis, and a signal derived from Ca2+ influx and acidification produced by vacuolar collapse during cell death of conducting xylem cells (Figure 5). The pattern of GAD expression in stem of poplar and pine plants (Molina-Rueda et al., 2010) was similar to the expression of ACO genes suggesting the existence of a cross-talk between GABA and ethylene in vascular development as already proposed for other tissues in herbaceous plant studies (Kathiresan et al., 1997; Shi et al., 2010). These features seem ancient in the green lineage as they appear in both angiosperms and gymnosperms. Homologous CaMBD in GAD sequences from higher plants are found in lycophytes and charophytes suggesting that regulation of GAD by Ca2+/CaM was also shaped as well as the complex calcium signaling network during the concomitant evolution of xylem and land colonization by plants. In conclusion, GAD seems to have been an agent in the evolution of vascular land plants during the development of an efficient water transport system, possibly to cope with the stress during adaptation to acidic presoils and water scarcity in emerged lands. Capítulo 3 Posibles papeles de los genes glutamato descarboxilasa de Populus en condiciones normales de crecimiento CAPITULO 3 37 Introducción El ácido -aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteinogénico presente tanto en organismos procariotas como eucariotas (Shelp y col., 1999). En la última década, diversos estudios han mostrado que el GABA puede participar en numerosos procesos fisiológicos. En animales, el GABA es el neurotransmisor inhibidor más importante del sistema nervioso central, por lo que alteraciones en los niveles normales de este aminoácido se han relacionado con enfermedades neurológicas tales como la epilepsia (Wong y col., 2003). En plantas, son varias las posibles funciones que le han sido asignadas pudiendo actuar como osmolito compatible, tamponador del pH citosólico, reservorio de nitrógeno, regulador del balance C/N (Bouché y Fromm, 2004) y secuestrador de especies reactivas de oxigeno (Liu y col., 2011). Aunque la síntesis del GABA puede ocurrir por varias vías, la actividad glutamato descarboxilasa (GAD, EC 4.1.1.15) está considerada como la principal fuente de GABA. La reacción de síntesis de GABA por la GAD se sitúa en una ruta conocida como GABA shunt. El GABA shunt es un baipás del ciclo de Krebs compuesto por tres reacciones enzimáticas. La primera reacción de la ruta está catalizada por la GAD; la segunda, por la GABA transaminasa (GABA-T), que cataliza la transaminación del GABA generando semialdehído succínico (SSA), y este SSA es sustrato de la tercera reacción, llevada a cabo por la semialdehído succínico deshidrogenasa (SSADH) generando succinato que finalmente entraría al ciclo de Krebs (Bown y Shelp, 1997, Capítulo 1, Fig.4). La GAD está ampliamente representada en los seres vivos estando presente en animales, hongos, arqueas, bacterias y plantas (Sukhareva y Mamaeva, 2002). La GAD cataliza la reacción irreversible de -descarboxilación del glutamato produciendo CO2 y GABA mediante el consumo de protones. Es una enzima dependiente de piridoxal 5´- fostato (PLP), que actúa como cofactor. El dominio de unión de la GAD a su cofactor presenta un alto grado de conservación. La actividad GAD puede estar regulada por pH, presentando su máxima actividad a pH ácido (5.8; revisado por Kinnersley y Turano, 2000). En plantas, la actividad GAD también puede estar modulada por Ca+2 mediante su unión a calmodulina (CaM) debido a la presencia de un dominio de unión a calmodulina que se encuentra casi exclusivamente en GADs de plantas. Este dominio está menos conservado que el dominio de unión al cofactor y está localizado en el CAPITULO 3 38 extremo C-terminal, actuando como dominio autoinhibitorio en ausencia de interacción con Ca+2 /CaM (Baum y col., 1993; Arazi y col., 1995). En animales, las GADs están codificadas por uno o dos genes, en cambio en plantas el número de genes GAD suele ser mayor y variable entre especies (Sukhareva y Mamaeva, 2002; Capítulo 2). La existencia de un número mayor de genes GAD en plantas y la diversidad de funciones que se le atribuyen al GABA en plantas sugieren fenómenos de especialización génica. En los últimos años se han realizado estudios de expresión con el fin de conocer y asignar posibles papeles a las GADs, siendo mayoritarios los estudios realizados en plantas herbáceas, como Petunia (Baum y col., 1993), Arabidopsis (Turano y Fang, 1998; Miyashita y Good, 2008), tomate (Gallego y col., 1995), arroz (Akama y col., 2001), tabaco (Yevtushenko y col., 2003), judía (Johnson y col., 1997), y escasos en leñosas, habiendo datos disponibles en manzano (Trobacher y col., 2013), naranjo (Liu y col., 2014) y pino marítimo (Molina-Rueda y col., 2010). La familia génica GAD mejor caracterizada hasta ahora es la de Arabidopsis (AtGAD), la cual consta de cinco genes, que presentan patrones de expresión diferentes (Miyashita y Good, 2008). Aunque hasta la fecha se desconocen sus funciones, se ha sugerido que AtGAD1 puede participar en la asimilación primaria de nitrógeno en la raíz manteniendo el balance C/N (Bouché y col., 2004), y AtGAD4 podría participar en respuesta a estreses medioambientales, ya que presenta niveles bajos de mensajeros en plantas en condiciones normales de crecimiento y altos en respuesta a diferentes tipos de estrés como hipoxia (Miyashita y Good, 2008), sal (Renault y col., 2010), sequía (Urano y col., 2009) y frío (Kaplan y col., 2007). En los últimos años también se ha descrito que la GAD y el GABA podrían estar implicados en el desarrollo vascular de las plantas. Molina-Rueda y col. (2010) observaron que la expresión GAD se correlaciona con el desarrollo vascular del hipocótilo en plántulas de pino. Además, la localización de GABA revela su presencia en tejidos vasculares en esta gimnosperma, especialmente en xilema en diferenciación (Molina-Rueda y col., 2015). La posible existencia de genes GAD implicados en desarrollo vascular hace interesante la caracterización de la familia génica GAD en árboles. En la última década, Populus ha surgido como especie modelo de leñosas (Taylor, 2002; Jansson y Douglas, 2007) ya que a diferencia de otros árboles se dispone de la secuencia completa de su genoma (Tuskan y col., 2006), posee un crecimiento rápido, es fácil de transformar y de regenerar in vitro (Leplé y col., 1992), además de ser una especie de gran interés en la industria maderera y para la generación de CAPITULO 3 39 biocombustibles (Jansson y Douglas, 2007). Además, existen pruebas de la existencia de transcritos de GAD específicamente asociados al xilema (Sjödin y col., 2009). En este capítulo se describe la caracterización in silico y el análisis de expresión de los genes GADs del híbrido Populus tremula x P. alba (PtaGADs), así como la localización del GABA en diferentes órganos, con el objetivo de determinar las posibles funciones de las GADs en Populus. CAPITULO 3 40 Resultados Genes que codifican la glutamato descarboxilasa en Populus trichocarpa La caracterización in silico de la familia génica GAD se realizó utilizando el genoma de Populus trichocarpa, debido a que es el único genoma secuenciado de este género (Tuskan y col., 2006). Se identificaron seis genes en el genoma cuya anotación funcional corresponde a GAD, y se les denominaron PtGAD seguido de un número del 1 al 6. Los genes PtGAD presentan una estructura formada por siete exones y seis intrones, excepto PtGAD1, el cual posee un intrón menos ya que los exones cuatro y cinco se encuentran fusionados (Fig. 1). El tamaño de los exones está conservado menos el del último exón que contiene el posible dominio de unión a calmodulina (CaMBD). En cambio, el tamaño de los intrones es más variable, cabe destacar por ejemplo la mayor longitud del segundo intrón de PtGAD2, PtGAD3 y PtGAD4 que en el resto de genes PtGAD. Figura 1. Estructuras génicas de los genes GAD de Populus trichocarpa. Los exones se simbolizan con un rectángulo y los intrones, con una línea. Las regiones homólogas aparecen con el mismo color. PtGAD1 PtGAD2 PtGAD3 PtGAD4 PtGAD5 PtGAD6 500 nt CAPITULO 3 47 mayor expresión en xilema que en corteza. Por el contrario, la menor expresión GAD se encontró en hojas. La expresión de cada uno de los genes PtaGAD en las diferentes muestras se obtuvo mediante qPCR utilizando cebadores específicos para cada gen. Expresión de los genes PtaGAD y localización de GABA en tallo y peciolos. La expresión relativa de los diferentes genes PtaGAD se midió en dos regiones del tallo. El tallo se dividió en apical (región del tallo situada entre los nudos 4 y 10) y basal (región entre los nudos 10 y 14). Además, de una parte más basal del tallo (entre los nudos 14 y 20) se analizaron dos regiones por separado, por un lado la corteza y por otro lado el resto (xilema + médula). Se detectaron mensajeros de los genes PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3 en tallo, no habiéndose encontrado niveles detectables de transcritos de los genes PtaGAD4, PtaGAD5 y PtaGAD6 en este órgano. El PtaGAD2 fue el que presentó mayores niveles de transcriptos en tallo (Fig. 6), no habiéndose encontrado diferencias significativas de niveles de mensajeros del gen PtaGAD2 entre la parte apical y basal. La expresión de PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3 fue superior en xilema que en corteza. Figura 5. Perfil de la expresión global de los genes PtaGAD en las diferentes regiones de P. tremula x P. alba. Se muestran los niveles globales relativos de transcritos en hojas (posición 45, 6-8, 9-10 y 11-13), de peciolos de estas hojas, tallo (del nudo 4 al 10 y del 10 al 14), corteza y xilema (tallo del 14 al 20), raíz basal (región más lignificada de la raíz) y apical (parte más joven de la raíz), y flor femenina no fecundada y fecundada en estadio de fruto. Las barras muestran el error estándar de tres muestras biológicas. Por otro lado, se midió los niveles de mensajeros de los genes PtaGAD en peciolos en diferentes fases de desarrollo (peciolos de las hojas 4 y 5, de la 6 a la 8, 9 y 10, y de la 11 a la 13) (Fig. 7). PtaGAD2 varío sus niveles de transcritos según el 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4-5 6-8 9-10 11-13 4-5 6-8 9-10 11-13 4-10 10-14 14-20 14-20 Basal Apical Joven Madura Hojas Peciolos Tallo Corteza Xilema Raiz Flor Niveles de transcritos relativos CAPITULO 3 48 estadio de desarrollo del peciolo, presentando altos niveles en peciolos jóvenes (peciolos de las hojas 4 y 5) y cada vez menores para peciolos de estadios de desarrollo más avanzados. PtaGAD1 mostró un patrón de expresión similar al de PtaGAD2 en peciolos pero menos acentuado. Por el contrario, los niveles PtaGAD3 no se vieron afectados por el desarrollo del órgano. Del resto de genes PtaGAD no se detectaron transcritos en peciolos. Figura 6. Perfil de expresión de los genes PtaGADs en tallo apical y basal, en xilema y corteza de P. tremula x P. alba. Se muestra el error estándar de tres muestras biológicas. Figura 7. Perfil de expresión de los genes PtGAD en peciolos de P. tremula x P. alba. Se muestra el error estándar de tres muestras biológicas. 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4-10 10-14 14-20 14-20 Tallo Corteza Xilema Niveles de transcritos relativos GAD1 GAD2 GAD3 GAD4,GAD5,GAD6 no detectados 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 4-5 6-8 9-10 11-13 Peciolos Niveles de transcritos relativos GAD1 GAD2 GAD3 GAD4,GAD5,GAD6 no detectados CAPITULO 3 49 Con el objetivo de conocer en qué tejidos se encuentra el producto de la reacción catalizada por la GAD, se realizaron inmunolocalizaciones de GABA en cortes transversales de la región apical del tallo (entrenudo 7-8) y de peciolos (de la hoja 4 y 6). Mediante la tinción general con azul de toluidina se observó que los cortes presentaban una estructura íntegra. Los cortes de tallo revelaron un cambium vascular secundario continuo, con un xilema de grosor irregular como consecuencia del desarrollo en cordones del crecimiento primario. También se puede observar el floema y abundantes fibras floemáticas dispuestas en islotes (Fig. 8A). Durante el proceso de inmunolocalización se realizaron en paralelo, y en cortes consecutivos, controles (ausencia de anticuerpo primario), en los que se observó únicamente autofluorescencia típica de la pared secundaria de las células muertas procedentes de las fibras floemáticas y de los vasos lignificados del xilema (Fig. 8B). En cortes transversales de tallo la señal de GABA predominó en el cilindro vascular, observándose una mayor intensidad en el parénquima radial y en las células en diferenciación del xilema y floema (Fig. 8C), obteniendo además señal en las células sub-epidérmicas y en las células de la médula. Figura 8. Inmunolocalizaciones de GABA en tallo apical de P. tremula x P. alba. A) Tinción con azul de toluidina del corte transversal de tallo. B) Control sin anticuerpo primario. C) Localización de GABA. EP, epidermis; FF, fibras floemáticas; PR, parénquima radial; F, floema; XD, xilema en diferenciación; XP, xilema primario; XS, xilema secundario; CV, cambium vascular; M, médula. La tinción con azul de toluidina permitió observar un anillo vascular en el centro y dos semi-anillos adaxiales en los peciolos de hojas jóvenes. Los dos semi-anillos empiezan a dividirse para formar nuevos cilindros vasculares a medida que el peciolo se va desarrollando (Fig. 9A y D). El tejido vascular está rodeado por un tejido de sostén denominado colénquima que permite que el peciolo soporte el peso de la hoja. Los controles negativos de las inmunolocalizaciones de GABA en cortes de peciolos PR XSXDCV XP M F FF EP PR XSXD CV XP M F FF EP PR XS XD CV XP M F FF EP AB C 200 μm 200 μm CAPITULO 3 50 mostraron una autofluorescencia típica de los vasos lignificados del xilema (Fig. 9B y E). La señal de GABA en peciolos jóvenes se localizó principalmente en el sistema vascular, aunque también se detectó en epidermis, sub-epidermis y colénquima (Fig. 9B y C). En cambio, en los peciolos más desarrollados la señal queda restringida al sistema vascular, detectándose en parénquima radial, floema, cambium vascular y xilema en diferenciación (Fig. 9C y F). En general, la señal de GABA fue de mayor intensidad en peciolos jóvenes que en peciolos más maduros. Figura 9. Inmunolocalizaciones de GABA en peciolos de P. tremula x P. alba. En la mitad superior se sitúan los cortes de peciolo joven (localizado en el nudo 4) teñidos con azul de toluidina (A), control sin anticuerpo primario (B) e imnunolocalización de GABA (C). En la mitad inferior los cortes corresponden a peciolo más maduro (localizado en el nudo 6) sometidos a los mismos tratamientos que hoja joven (D, azul de toluidina; E, control sin anticuerpo primario; F, señal de GABA, además se muestra un detalle de la seña de GABA en el cilindro vascular de mayor tamaño). PA, parénquima angular; EP, epidermis; F, floema; X, xilema; P, parénquima. Expresión de los genes PtaGAD y localización de GABA en hojas En hojas se realizaron dos experimentos diferentes para analizar la expresión de los genes PtaGADs. Por un lado, se utilizaron plantas crecidas en invernadero bajo luz natural y se tomaron cuatro grupos de hojas en diferentes fases de desarrollo para observar si los niveles de mensajeros de estos genes varían en función del desarrollo de la hoja (Fig. 10A). Por otro lado, se utilizaron plantas crecidas en condiciones DE F EP PA F X P EP PA F X P PA FX P PA F X P EP PA F X P EP PA F X P Adaxial 200 μm 200 μm 200 μm 200 μm AB C EP EP Abaxial PR XS XD CV F 50 μm CAPITULO 3 51 controladas de luz y se recolectaron hojas de posiciones 4-6 y 8-9, separando zonas de la hoja enriquecida en mesófilo y zonas ricas en nervadura para verificar si la expresión de los genes PtaGADs se asocia a tejidos específicos de la hoja (Fig. 10B). De los seis genes sólo se detectaron mensajeros de los genes PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3 en hojas (Fig. 10A). PtaGAD1 fue el que mostró mayores niveles de transcritos en hojas jóvenes, y PtaGAD2 los niveles más bajos. PtaGAD1 y PtaGAD2 presentaron mayores niveles de mensajeros en hojas jóvenes que en maduras. PtaGAD3 obtuvo altos niveles de mensajeros en hojas de plantas crecidas en luz natural, en cambio sus niveles disminuyeron en hojas expuestas a luz artificial. PtaGAD1 y PtaGAD3 no mostraron diferencias de transcritos relativos entre el mesófilo y la nervadura, por el contrario PtaGAD2 se detectó mayoritariamente en nervadura (Fig. 10B). Figura 10. Expresión relativa de los genes PtaGAD en hojas de P. tremula x P. alba. En las graficas se muestra los niveles de mensajeros relativos en: A) en hojas en diferentes posiciones. B) nervios y mesófilo de hojas en posiciones 4-6 y 8-9. Se muestra el error estándar de tres muestras biológicas. Los cortes histológicos de hojas muestran la sección transversal del nervio principal formado por un haz vascular rodeado de colénquima (Fig. 11A y D). A su vez, se observa el mesófilo de la hoja compuesto por dos tipos de parénquimas: el parénquima en empalizada o clorofílico en el haz de la hoja, y el parénquima esponjoso en la parte del envés de la hoja. Se realizó la inmunolocalización de GABA en cortes de hoja y se detectó una señal generalizada por todo el corte, aunque de mayor intensidad 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 4-5 6-8 9-10 11-13 Hojas Niveles de transcritos relativos A B 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Nervios Mesófilo Nervios Mesófilo Hojas 4-6 Hojas 8-9 Niveles de transcritos relativos GAD4,GAD5,GAD6 no detectados CAPITULO 3 52 alrededor del haz vascular (Fig. 11C y F). El mesófilo mostró una alta fluorescencia asociada a las clorofilas presentes en los numerosos cloroplastos (Fig. 11B y E) siendo difícil observar el marcaje de GABA, aunque se detectó mayor intensidad de señal en las células del parénquima en empalizada y en el parénquima esponjoso respecto a los controles. Tal y como se observó en peciolos, la señal de GABA fue más baja en hojas maduras respecto a hojas jóvenes. Figura 11. Inmunolocalizaciones de GABA en hojas de P. tremula x P. alba. En la mitad superior se sitúan los cortes de hoja joven (posición 4) teñidos con azul de toluidina (A), control sin anticuerpo primario (B) e imnunolocalización de GABA (C). En la mitad inferior los cortes corresponden a hojas maduras sometidos a los mismos tratamientos que hoja joven (D, azul de toluidina; E, control sin anticuerpo primario; F, señal de GABA). Expresión de los genes PtaGAD y localización de GABA en raíz En raíz se tomaron dos regiones: una región apical, enriquecida en raíces poco lignificadas, y otra basal que corresponde a raíces de mayor grosor y lignificadas (Fig. 12). Los resultados de expresión mostraron que el gen PtaGAD3 fue el que presentó mayores niveles de mensajeros en raíces, mientras PtaGAD1 y PtaGAD2 mostraron niveles más bajos. Aunque no se detectaron transcritos del gen PtaGAD5 en los órganos aéreos, sí que se detectaron en raíces, aunque mostrando una gran variación de una réplica biológica a otra. EP PF X P X P 200 μm 200 μm EP F X P P PES PEM F X P EP F X P P PES PEM EP F XP P PES PEM P PES PEM EP F P PES 200 μm Abaxial Adaxial E F PES PEM EP PEM 200 μm D ABC CAPITULO 3 53 Figura 12. Expresión relativa de los PtGADs en la parte basal y apical de raíces de plantas P. tremula x P. alba. Se muestra el error estándar de tres muestras biológicas. Figura 13. Inmunolocalizaciones de GABA en raíz de P. tremula x P. alba. A) Tinción con azul de toluidina de un corte transversal B) Control sin anticuerpo primario C) Localización de GABA. EP, epidermis; EX, exodermis; PX, protoxilema; F, floema; EN, endodermis; P, periciclo; C, córtex; E, estela. La tinción con azul de toluidina de cortes transversales de raíces apicales revela la presencia de la epidermis, la estela que contiene el sistema vascular, y el córtex que se sitúa entre la epidermis y la estela. (Fig. 13A). En el control sin anticuerpo de las inmunolocalizaciones de GABA se observó una señal leve en la estela debido a la autofluorescencia de las paredes celulares de los vasos (Fig. 13B). La señal de GABA se concentró exclusivamente en la estela, y dentro de ésta, alrededor del protoxilema lignificado y en diferenciación, y en el floema (Fig. 13C). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Apical Basal Niveles de transcritos relativos GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GAD4 y GAD6 no detectados CAPITULO 3 54 Expresión de los genes PtaGAD en flores femeninas El álamo es una especie dioica con pies masculinos y femeninos. En este trabajo sólo se disponía de pies femeninos de P. tremula x P. alba. Las flores femeninas se disponen en inflorescencias laterales colgantes de tipo amento. Se recolectaron flores en un estadio temprano después de la fecundación, y flores fecundadas que han formado el fruto y poseen las semillas con largos pelos algodonosos que pueden ser transportados por el viento. Los datos de expresión mostraron una expresión diferencial de los genes PtaGADs entre ambos estadios (Fig. 14). En general, todos los genes analizados aumentaron sus mensajeros en el estadio de flor joven frente al estadio de fruto, a excepción del gen PtaGAD2 que el patrón de expresión fue inverso. También se detectaron transcritos de PtaGAD5 en flores en ambos estadios, aunque al igual que ocurría en raíces, se observa una gran variación de una réplica biológica a otra. Figura 14. Expresión relativa de los PtGADs en diferentes estadios de flores femeninas de plantas P. tremula x P. alba. Se muestra el error estándar de tres muestras biológicas. Relación entre la expresión de los genes PtaGAD y otros genes implicados en el metabolismo del GABA en P. tremula x P. alba El estudio del patrón de expresión de genes de la misma o de otras rutas relacionadas con los genes PtaGAD puede ayudar a descifrar las posibles funciones que pueden desempeñar las proteínas codificadas por estos genes. Para ello, se midió los valores relativos de mensajeros de varios genes en los diferentes órganos del híbrido y 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Joven Madura Flor Niveles de transcritos relativos GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GAD4 y GAD6 no detectados CAPITULO 3 55 se representaron en un mapa de calor (Fig. 15). Los genes se agruparon en función de sus patrones de expresión. En un grupo se situaron los genes del GABA shunt junto con el gen IDHc, la permeasa de GABA (GABP) y PtaGAD3. Este grupo se caracterizó por mostrar una alta expresión en órganos en los que el tejido vascular es muy representativo como tallo y peciolos, aunque su máxima expresión se encontró en raíces, siendo mayor en raíz apical que basal, y la expresión más baja se asoció a hojas. Por otro lado, se agruparon los genes PtaGAD1, PtaGAD2 y la expresión global de GAD (GAD cons), que también mostraron sus máximos niveles de mensajeros en peciolos y tallo, y mayor expresión en xilema que en corteza. Por último, los genes más alejados del resto fueron los glioxilato reductasas (GLYRs) con altos niveles de mensajeros en hojas y flores, siendo mínimos los niveles de mensajeros en órganos dónde el tejido vascular es más abundante. Figura 15. Mapa de calor de los perfiles de expresión de los genes PtGADs y los genes implicados en el metabolismo del GABA en las diferentes muestras del híbrido analizadas. En el mapa se representa el logaritmo en base dos del ratio entre el valor medio de expresión de tres replicas biológicas para un gen en ese tejido y el valor de expresión medio del gen en todos los tejidos. Los valores positivos (naranja-rojo) representan valores de mensajero superiores a la expresión media del gen en todas las muestras. Por el contrario, los valores negativos (gris-azul) para un gen representan valores de expresión inferiores a la media del gen en todas las muestras. En la parte superior del mapa de calor se sitúan las imágenes de las diferentes partes analizadas de la planta. El árbol (izquierda) refleja el grado de correlación entre los perfiles de transcritos de los genes en las muestras. El mapa de calor se realizó con el programa Heatmapper (www.bar.utoronto.ca). El árbol se realizó con el programa Cluster v3.0 y se visualizó con el programa Java Treeview. Hojas Peciolos Tallo Corteza Xilema Raíz Flor Femenina 4-5 6-8 9-10 11-13 4-5 6-8 9-10 11-13 4-10 10-14 14-20 14-20 Basal Apical Joven Madura SSADH -0,1 -0,4 -0,5 -0,5 0,3 0,1 0,06 -0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,4 0,07 0,03 IDHc -0,2 -0,3 -0,5 -0,5 0,07 -0,1 -0,2 -0,3 0,2 0,2 -0,2 0,9 0,3 0,7 0,01 0,1 GABP -0,4 -0,3 -0,2 -0,2 -0,4 0,05 0,1 0,1 0,05 0,1 0,1 0,03 0,3 0,7 -0,1 0,2 GABA-T -0,3 -0,4 -0,4 -0,4 -0,1 0,3 0,3 0,2 0,06 0,03 0,05 0,1 0,1 0,4 -0,1 0,1 PtaGAD3 -0,2 -0,2 -0,2 -0,2 -0,3 -0,2 -0,2 -0,2 0 0 -0,3 0,2 1 1,4 -0,3 0,05 GAT1 -0,2 -0,1 -0,1 -0,1 -0,06 0,3 0,4 0,5 -0,1 -0,07 -0,2 0,2 -0,04 -0,02 -0,2 -0,1 PtaGAD5 0,1 0,06 -0,4 0,2 PtaGAD2 -0,4 -0,5 -0,5 -0,5 0,4 0,09 -0,2 -0,4 0,8 0,8 0,2 0,9 -0,1 0,02 0,07 -0,3 GAD cons -0,2 -0,3 -0,3 -0,3 0,4 0,2 0 -0,1 0,5 0,3 0,04 0,4 -0,2 -0,1 -0,08 -0,08 PtaGAD1 0,04 0,1 -0,1 -0,2 0,4 0,6 0,4 0 0 0,1 -0,1 0,5 -0,9 -0,8 -0,3 0,06 GLYR1 0,08 0,7 0,8 0,8 -0,3 -0,1 -0,2 -0,2 -0,2 -0,3 -0,2 -0,3 -0,2 -0,1 0,03 0,06 GLYR2 1,3 0,7 0,4 0,4 -0,2 -0,3 -0,3 -0,3 -0,3 -0,3 -0,3 -0,4 -0,3 -0,3 0,06 0,2 0.73 0.55 0.46 -0.2 0.25 0.91 >0.8 0 Mayorque 0 Menorque 0 CAPITULO 3 56 Discusión GADs en Populus En plantas, la GAD presenta un alto grado de conservación, aunque el número de genes que codifican las GADs es variable (Capítulo 2; Sukhareva y Mamaeva, 2002). La caracterización de la familia génica GAD en plantas ha revelado la importancia de estos genes en diferentes procesos fisiológicos. Gran parte de los estudios basados en la caracterización de las GADs de plantas se han llevado a cabo en herbáceas, siendo muy escasos en leñosas. Este hecho ha limitado su estudio en procesos propios de plantas leñosas como el desarrollo vascular y la tolerancia a estreses abióticos o bióticos en tiempos prolongados. Trabajos recientes sugieren una posible participación de la GAD en desarrollo vascular (Molina-Rueda y col., 2010; Capítulo 2). Por ello, en este capítulo se realizó la caracterización in silico de la familia GAD en un árbol, Populus, debido a que se considera una especie modelo en leñosas (Taylor, 2002; Jansson y Douglas, 2007), y posee una gran importancia en el sector maderero y de la bioenergía. La caracterización de la familia génica GAD se realizó en P. trichocarpa ya que es el único genoma disponible de este género completamente secuenciado, y la caracterización molecular se llevo a cabo en el híbrido P. tremula x P. alba, debido a que es un genotipo de rápido crecimiento y muy susceptible a la transformación mediada por Agrobacterium (Leplé y col., 1992). Los resultados in silico revelaron la presencia de seis genes GAD en P. trichocarpa. Las proteínas codificadas por los PtGADs presentan todos los residuos claves para llevar a cabo la catálisis (Sukhareva y Mamaeva, 2002), y el triptófano y las lisinas flanqueantes en el posible domino de unión a CaM (CaMBD) requeridos para su regulación (Arazi et al., 1995), por lo que las seis PtGADs son aparentemente funcionales. Los análisis filogenéticos realizados en este trabajo revelan que la familia génica PtGAD es el resultado de varios eventos de duplicación intraespecífica sugiriendo fenómenos de especialización génica. A continuación, se discutirán los posibles papeles de cada uno de los genes GAD de Populus en base a la caracterización molecular realizada en este trabajo. Posible papel de la PtaGAD2 en el desarrollo vascular Recientemente se han publicado varios indicios que muestran que la GAD puede estar implicada en el desarrollo vascular. Estos indicios son: 1) niveles de mensajeros GAD elevados en tejidos vasculares en Populus (Sjödin y col., 2009), 2) presencia de ESTs de GAD de pino en cambium vascular (Cantón y col., 2004) y 3) la expresión y Capítulo 4 Efectos del glutamato y el GABA sobre el desarrollo y crecimiento de la raíz en Populus y expresión de los genes GAD CAPITULO 4 65 Introducción La mayoría de las plantas terrestres poseen raíces subterráneas cuyas funciones principales son dar anclaje y soporte mecánico a la planta, actuar como interfaz entre la planta y factores bióticos y abióticos en el suelo, y captar agua y nutrientes (Smith y De Smet, 2012). Las plantas presentan la habilidad de cambiar su estructura radicular para aclimatarse a las condiciones cambiantes del suelo (Aiken and Smucker, 1996); por ejemplo, el desarrollo de la raíz se ve afectado por la disponibilidad de nutrientes en el sustrato (Ericcson, 1995). Uno de los casos más estudiados es el cambio morfológico de la raíz frente a una fuente de nitrógeno inorgánico. El nitrato (NO3-) regula el desarrollo de la raíz, habiéndose observado que un aumento localizado de NO3provoca la proliferación de raíces laterales en Arabidopsis para colonizar la zona rica en nutrientes; aunque esta respuesta depende de la etapa de desarrollo en la que se encuentren estas raíces (Zhang y Forde, 1998; Zhang y Forde, 2000). No sólo el nitrógeno inorgánico puede alterar la arquitectura radicular, en los últimos años se ha demostrado que el tratamiento exógeno con aminoácidos también puede alterarla (Walch-Liu y col., 2006). La presencia de glutamato en zonas del suelo cercanas al ápice de la raíz provoca la inhibición del crecimiento de la raíz principal y estimula la ramificación en la región apical de la raíz en Arabidopsis (Walch-Liu y col., 2006). El ácido gammaaminobutírico (GABA) también provoca cambios en la arquitectura de la raíz, aunque los cambios dependen de su concentración y de la especie en estudio, pudiendo ejercer un efecto positivo o negativo en el crecimiento radicular (Roberts, 2007; Mirabella y col., 2008). La acumulación de GABA intracelular, por alteraciones de la expresión de genes implicados en la biosíntesis o metabolismo del GABA, induce la inhibición de la elongación celular de órganos de la planta como el tallo y la raíz, considerándose al GABA como un factor involucrado en el control del crecimiento (Baum y col., 1996; Akama y Takaiwa, 2007; Renault y col., 2011). De esta manera, tanto el GABA como el glutamato provocan cambios en la estructura de la raíz siendo importante la modulación de la producción de ambos aminoácidos para el desarrollo correcto de la misma. Alteraciones en la actividad GAD, enzima responsable de la biosíntesis de GABA por la descarboxilación de glutamato, implican cambios en los niveles de GABA y glutamato, y como consecuencia anomalías fenotípicas en las plantas (Baum y col., 1996; Akama y Takaiwa, 2007). La familia génica GAD en plantas está compuesta por CAPITULO 4 66 varios genes (Sukhareva y Mamaeva, 2002). Aunque se ha sugerido algún papel para las GADs en raíces, por ejemplo el de la asimilación de nitrógeno de la GAD1 de Arabidopsis (Bouché y col., 2004), la información disponible de los genes GADs que se expresan en raíces es muy escasa. En Populus, la familia génica GAD está formada por seis genes, los cuales presentan patrones de expresión diferentes a lo largo de la planta, sugiriendo que cada GAD puede realizar una función diferente (Capítulo 3). En el híbrido Populus tremula x P. alba cuatro de los seis genes PtaGAD se expresan en raíces (PtaGAD1, PtaGAD2, PtaGAD3 y PtaGAD5), siendo PtaGAD3 el que presenta mayores niveles de mensajeros en este órgano y una expresión mayoritaria en raíz de entre las diferentes regiones analizadas (Capítulo 3). La raíz posee regiones bien diferenciadas tanto por estadio de desarrollo como por función, lo que a priori permite estudiar los posibles papeles de genes que presenten expresión diferencial durante el desarrollo y diferenciación del órgano. En la raíz, y desde la región apical, se pueden observar cinco regiones funcionales: 1) región meristemática, que posee el centro quiescente formado por un conjunto de células madre (Nawy y col., 2005), 2) región de elongación, que se caracteriza porque cesa la división celular y aumenta la elongación celular (Ishikawa and Evans, 1995), 3) región de absorción, encargada de la captación de agua y minerales por la presencia de pelos radiculares microscópicos, 4) región de raíces laterales, requerida para dar anclaje y para la captación de agua y nutrientes del suelo, y 5) región de transporte, que corresponde a una zona madura y lignificada de la raíz encargada del transporte de sustancias entre la raíz y la parte aérea de la planta. Los objetivos de este capítulo son el estudio de la arquitectura radicular P. tremula x P. alba en respuesta a diferentes aminoácidos, y esclarecer los posibles papeles de los diferentes genes PtaGAD en éste órgano. CAPITULO 4 67 Resultados y discusión El glutamato favorece el crecimiento de la raíz principal, y el GABA fomenta el desarrollo de raíces secundarias en plántulas P. tremula x P. alba in vitro. El cultivo “in vitro” permite estudiar la alteración de la arquitectura radicular por la adición de sustancias al medio. En este trabajo, se ha estudiado como afecta la presencia de los aminoácidos glutamato, aspartato, GABA y alanina a la morfología de las raíces de plántulas del híbrido P. tremula x P. alba. La elección de estos aminoácidos se basó en que el glutamato y el GABA son sustrato y producto de la reacción catalizada por la GAD y se han descrito como aminoácidos que afectan al crecimiento de las raíces en herbáceas (Walch-Liu y col., 2006; Mirabella y col., 2008; Barbosa y col., 2010); y el aspartato y la alanina como controles del efecto del glutamato y el GABA respectivamente. Los resultados mostraron que la arquitectura radicular de la planta varió dependiendo del aminoácido presente en el medio, observándose cambios tanto en el crecimiento de la raíz primaria como en el número y la longitud de las raíces laterales (Fig. 1A). Las raíces del híbrido expuestas a 2 mM de glutamato indujeron el crecimiento de la raíz principal (Fig. 1A). En cambio, en otros estudios han obervado que el glutamato tienen un efecto contrario en raíces de herbáceas, es decir un efecto inhibidor (Filleur y col., 2005; Walch-Liu y col., 2006; Forde y Lea, 2007). No obstante, el efecto inhibitorio del glutamato puede verse anulado por la presencia de nitrato en el medio (Roberts, 2007; Walch-Liu y Forde, 2008). Así, la presencia de nitrato en el medio empleado en este trabajo apoya la ausencia de inhibición frente al aminoácido, pero no una inducción en el crecimiento de la raíz. Estos resultados indican que la adición de glutamato en el medio de cultivo ejerce un efecto positivo en el crecimiento de la raíz principal en plántulas del híbrido en presencia de nitrato, pudiendo ser un efecto de inducción propio de la especie. El aspartato se eligió como control del efecto del glutamato en la raíz debido a que ambos pertenecen al grupo de los aminoácidos ácidos, por lo que poseen carga negativa a pH fisiológico. En el híbrido, el tratamiento exógeno con aspartato provocó la inhibición significativa del crecimiento de la raíz primaria después de 21 días de tratamiento (Fig. 1B). Análisis previos en nuestro laboratorio mostraron que la adición de una concentración superior de aspartato (10 mM) al medio provoca la inhibición total CAPITULO 4 68 de la generación de raíces tras 28 días de cultivo (datos no mostrados). En cambio, en Arabidopsis se ha descrito que las raíces no muestran cambios aparentes en su morfología radicular en presencia de aspartato a una concentración de 50 M (WalchLiu y col., 2006). No obstante, en radículas de embriones de maíz se ha observado inhibición de la raíz principal tras el tratamiento con aminoácidos que se sintetizan a partir del aspartato, como la lisina y la treonina, a una concentración de 1mM (Green y Donovan, 1980). Así, el tratamiento exógeno en el híbrido con glutamato o aspartato provoca efectos distintos pudiéndose descartar que se deba a la naturaleza ácida del aminoácido. Además, la inhibición en el crecimiento de la raíz principal del híbrido provocada por el aspartato a las concentraciones ensayadas podría deberse al aumento de aminoácidos sintetizados como consecuencia de su metabolismo. Figura 1. Efecto del tratamiento con aminoácidos en raíces de plántulas P. tremula x P. alba “in vitro”. A) Fenotipo de raíces crecidas en glutamato, aspartato, GABA y alanina a 2 mM. Las plántulas controles se crecieron en 1/2 del medio Murashige y Skoog (MS) a pH 5,8 siendo la concentración final de nitrato y amonio de 1 mM y 0,5 mM respectivamente B) En la gráfica se representan las medias y los errores estándar de las longitudes de las raíces principales de un mínimo de 10 plantas (n=10-15) en tratamientos control, glutamato, aspartato, GABA y alanina. C) Densidad de raíces laterales (número de raíces laterales por cm de raíz principal) en plantas en medio control y en medio con GABA y glutamato. Las barras muestran los errores estándar. Uno o dos asteriscos (*) marcan valores significativos (t-student) a niveles 0,1 y 0,05 respectivamente. A BC Control AspartatoGlutamato GABA Alanina 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 7 14 21 28 Longitud raíz principal (cm) Días de tratamiento Control Glutamato Aspartato GABA Alanina * ** * 0 1 2 3 4 5 6 21 días 28 días Nº de raices laterales por cm de raíz principal ** CAPITULO 4 69 En el híbrido, la presencia de GABA (2 mM) en el medio no produjo ningún efecto significativo en la raíz principal respecto al control, pero sí indujo la proliferación de raíces laterales (Fig. 1). La elongación de la raíz principal tampoco se ve afectada en plantas de Arabidopsis a concentraciones de 1 mM o 5 mM de GABA, aunque a concentraciones superiores (de 10 a 100 mM) sí que se observa un incremento en la longitud de la raíz principal (Mirabella y col., 2008; Barbosa y col., 2010), pero no un aumento en la ramificación de las raíces en la herbácea (Barbosa y col., 2010). Así, Arabidopsis y el híbrido de Populus muestran una respuesta diferente al GABA reflejando la existencia de mecanismos reguladores propios de estas especies frente a estos aminoácidos. El aumento en raíces secundarias es un efecto que cabría esperar al añadir un exceso de nutrientes, efecto que se ha descrito en una gran variedad de especies de plantas (Robinson, 1994). Que el etileno sea uno de los principales reguladores del desarrollo de las raíces laterales (Clark y col., 1999; Schiefelbein, 2000) y que la aplicación exógena de GABA provoque la acumulación de etileno en girasoles debido a un aumento en la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de la hormona (Kathiresan y col., 1997), plantean la hipótesis de que el efecto causado en las raíces del híbrido por el tratamiento de GABA podría deberse a una respuesta mediada por etileno. La alanina se utilizó como control del efecto del GABA debido a que puede ser sintetizada por transaminación de GABA a través de la GABA-T, y a priori, permitiría determinar si el efecto observado en la raíz se produce por el GABA de forma directa o bien por su metabolismo inmediato a alanina. El tratamiento con alanina no provocó cambios en el crecimiento en longitud de la raíz primaria, aunque sí en el desarrollo de las raíces secundarias (Fig. 1), como el GABA. No obstante, los efectos producidos por GABA y alanina son diferentes, ya que el GABA causó un aumento en la densidad de raíces laterales (Fig. 1C), y el tratamiento de alanina afectó al crecimiento en longitud de las mismas (Fig. 1A). Que ambos aminoácidos posean efectos diferentes en las raíces laterales sugiere que la respuesta a GABA no se debe a la acumulación de alanina derivada del catabolismo del GABA. Distribución de la señal de GABA en las diferentes regiones de la raíz El sistema radicular de las plantas consiste en una raíz principal, formada durante la embriogénesis, y raíces laterales, que se desarrollan con posterioridad. Para CAPITULO 4 70 estudiar la localización de GABA en este órgano, la raíz principal se dividió en cinco zonas (de la parte apical a la basal): meristemática (Z1), de elongación (Z2), de absorción (Z3), de ramificación (Z4) y de transporte (Z5) (Fig. 2A). Las imágenes de campo claro mostraron que las zonas previamente definidas presentaban diferente desarrollo vascular. Z1 es la menos desarrollada, con un sistema vascular incipiente típico de zonas meristemáticas. En Z2 empiezan a formarse los primeros núcleos vasculares, que en Z3 continúan desarrollándose, encontrándose fusionados en Z4. Finalmente, en la región más basal (Z5) se observa un desarrollo vascular secundario (Fig. 2A). En paralelo a la inmunolocalización de GABA se realizaron controles sin anticuerpo primario que mostraron una autofluorescencia típica asociada a los vasos lignificados en los diferentes cortes (Fig. 2B). La señal de GABA en los diferentes cortes de la raíz fue más intensa en las zonas jóvenes (Z1, Z2 y Z3) que en zonas maduras (Z4 y Z5) (Fig. 2C) estando presente en la estela y ausente en el resto (córtex y epidermis), como se ha observado previamente en plántulas de pino (Molina-Rueda y col., 2015). Estos resultados sugieren que el GABA puede jugar un papel importante en el establecimiento del sistema vascular en el órgano debido a que se localiza en regiones dónde empiezan a aparecer los primeros vasos vasculares y zonas con una sistema vascular poco desarrollado en forma de haces vasculares. Figura 2. Localización de GABA en las diferentes zonas de la raíz (Z1 a Z5). Se muestran cortes de la región central de cada una de las zonas (Z1, zona meristemática; Z2, zona de elongación; Z3, zona de absorción; Z4, zona de raíces laterales; Z5, zona de transporte). A) 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm A B C Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 P E X F C EP P E X F C P E XF C EP EEP CA SXM XD FF C CAPITULO 4 71 Imágenes en campo claro. B) Control negativo (sin anticuerpo primario). En la imagen se observan en colores amarillentos la autofluorescencia típica de las paredes lignificadas. C) Señal de GABA (en verde) en las diferentes regiones de la raíz. EP, epidermis; CA, caliptra; C, córtex; E, endodermis; P, periciclo; X, xilema; F, floema; FF, fibras floemáticas; S, estela. Figura 3. Detalle de la localización de GABA en Z5. XM, xilema maduro; XD, xilema en diferenciación; FF, fibras floemáticas; PR, parénquima radial; EP, epidermis. En las zonas maduras de la raíz (Z4 y Z5), la señal de GABA se detectó en células del xilema en diferenciación, cambium vascular, floema y parénquima radial (Fig. 3). El parénquima radial pone en contacto el xilema, el cambium y el floema y se encarga de la comunicación radial entre estos tejidos, la epidermis y la médula, pudiéndose deber la presencia de GABA en parénquima radial a su transporte entre tejidos. La distribución de la señal del GABA en raíces maduras es similar a la descrita en tallo de Populus (capítulo 3) y pino (Molina-Rueda y col., 2015), estando asociada a la diferenciación de los tejidos vasculares en las zonas maduras de la raíz. Niveles de mensajeros de los genes PtaGAD en las regiones de la raíz Mediante qPCR y cebadores específicos se midió los niveles de mensajeros relativos de los seis genes PtaGAD, aunque sólo se detectaron mensajeros de tres de ellos (PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3) (Fig. 4). En el capítulo 3 se detectaron mensajeros de PtaGAD5 en raíces pero con grandes variaciones de una réplica biológica a otra, lo que sugiere que PtaGAD5 podría expresarse en tejidos muy específicos o en una etapa de desarrollo en concreto. El patrón de expresión del gen PtaGAD2 fue similar al de PtaGAD3, aunque los niveles de mensajeros del primero (PtaGAD2) fueron inferiores al segundo (PtaGAD3) y presentaron menos diferencias entre las regiones. Los genes PtaGAD2 y PtaGAD3 presentaron su mayor expresión en Z2, región con un sistema vascular incipiente. Como ocurre en otros órganos de la planta 50 µm XD XM PR 200 µm Señal de GABA XM XD FF EP 50 µm XD XM PR Señal de GABA Control CAPITULO 4 72 (Capítulo 3), se observa que PtaGAD2 muestra mayores niveles de mensajeros en órganos pocos desarrollados y su expresión disminuye a medida que se va a adquiriendo un mayor desarrollo vascular (Fig. 4 y capitulo 3). PtaGAD1 mostró diferencias menos acusadas en los niveles de mensajeros entre las regiones de la raíz, con mayor expresión en regiones más maduras cuya función principal se relaciona con la adquisición de agua y nutrientes (Fig. 4), sugiriendo un papel en este proceso. Figura 4.Patrón de expresión de los genes PtaGAD del híbrido P. tremula x P. alba en diferentes regiones de la raíz (Z1-Z5). La descripción de las regiones se detalla en la figura 2. En la gráfica se muestra la expresión relativa de los genes PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3. Los valores representados corresponden a la media de dos réplicas biológicas constituidas cada una por un grupo de 10 a 15 raíces de 3 plantas diferentes. Se representa la desviación estándar de la media. Los valores de expresión se normalizaron con tres genes de referencia. Posibles papeles de los genes PtaGAD en raíces de P. tremula x P. alba y expresión de genes relacionados En raíz se midieron los niveles de mensajeros de genes relacionados con el metabolismo del GABA, genes implicados directamente en el transporte y metabolismo del nitrógeno, genes relacionados con lignificación y genes que codifican proteínas con funciones características de las diferentes regiones de la raíz, para elucidar el posible papel de las PtaGADs en raíz. Los genes se agruparon en base a la correlación entre los patrones de expresión. Aquellos genes que presentaron sus máximos niveles de mensajeros en la región 0,0 0,5 1,0 1,5 Niveles de transcritos relativos GAD1 GAD2 GAD3 Z2 Z3 Z4 Z5Z1 0.3 12.5 4.5 9.5 11.5 16.5 18.5 cm 0 Z2 Z3 Z4 Z5Z1 Capítulo 5 Expresión de la familia génica glutamato descarboxilasa de Populus tremula x P. alba frente a estreses abióticos CAPITULO 5 81 Introducción De acuerdo con el informe del Grupo Intergubernamental de Expertos sobre el Cambio Climático (IPCC), la temperatura media mundial aumentará 0,3ºC por década (Jones y col., 1999). Los efectos del calentamiento global no se limitan a aumentar las temperaturas medias anuales en todo el mundo, sino que dará lugar a períodos calientes y fríos más extremos y más frecuentes. A su vez, las predicciones apuntan a que el cambio climático provocará una alteración en el patrón de las precipitaciones, provocando periodos de precipitaciones abundantes que pueden desencadenar anegaciones de zonas cercanas a ríos, o por el contrario, periodo de escasas lluvias, disminuyendo la disponibilidad de agua. Altas temperaturas y la disminución del contenido del agua en el suelo pueden provocar un aumento en la concentración de sales del suelo siendo contraproducentes para los seres vivos. Así, el cambio climático será el responsable del aumento en la frecuencia de exposición de las plantas a estreses medioambientales tales como calor, frío, inundación, sequía y sal. Las plantas son organismos sésiles que ante las fluctuaciones ambientales deben desarrollar mecanismos de tolerancia a diferentes tipos de estrés para sobrevivir. El estudio de las respuestas de las plantas frente a condiciones de estrés puede generar información útil para la selección y/ó generación de plantas tolerantes a las mismas. Un mecanismo de respuesta a estrés muy extendido entre las plantas es el aumento en las concentraciones de GABA en los diferentes órganos (Kinnersley y Turano, 2000). El GABA puede estar involucrado en la regulación de numerosos mecanismos de respuesta a estrés tales como el balance de C/N, el potencial osmótico, la eliminación de radicales libres, la regulación del pH, el crecimiento de la planta y el desarrollo de las raíces (Kinnersley y Turano, 2000; Bouche y Fromm, 2004). Aunque existen diferentes tipos de estreses abióticos, todos presentan como respuesta común el incremento en los niveles de calcio (Sanders y col., 1999) y algunos de ellos la disminución en el pH (Aurisano y col., 1995). Ambos factores, pH ácido y el incremento de Ca+2, aumentan la actividad de la enzima glutamato descarboxilasa (GAD) (Ramputh y Bown, 1996) y como consecuencia los niveles de GABA. Estudios de expresión de los genes GAD en condiciones de estrés se han llevado a cabo en diversas especies herbáceas como Arabidopsis (Miyashita y Good, 2008; Renault y col., 2010), Nicotiana sylvestris (Ackay y col., 2012), Panax ginseng (Lee y col., 2010) y Solanum lycopersum (Mae y col., 2012). Aunque se ha descrito que las GADs de CAPITULO 5 82 plantas están codificadas por varios genes, no todos responden de la misma manera a las diferentes situaciones ambientales. Un ejemplo de ello es la familia génica GAD de Arabidopsis, de los cinco genes GAD que posee, AtGAD4 se ha descrito como el más susceptible a estrés ya que responde aumentando su expresión frente a hipoxia (Miyashita y Good, 2008), sal (Renault y col., 2010), sequía (Urano y col., 2009) y frío (Kaplan y col., 2007). La mayoría de los estudios de expresión de GADs realizados en condiciones adversas se han llevado a cabo en especies anuales, que viven sólo durante unos meses del año teniendo que hacer frente a cambios climatológicos durante un tiempo limitado. En cambio, los árboles viven durante décadas y tienen que soportar cambios estacionales, y periodos prolongados de condiciones adversas. En este trabajo se ha utilizado como especie modelo un árbol, Populus tremula x P. alba, debido a su importancia económica en la industria maderera y en el desarrollo de biocombustibles. El mejoramiento de esta especie para tolerar las condiciones adversas despierta un gran interés con el objetivo de evitar o minimizar en lo posible pérdidas en su producción. En este capítulo se ha caracterizado mediante análisis de expresión relativa la familia génica GAD de P. tremula x P. alba (PtaGADs) frente a frio, calor, inundación de raíces, sequía y sal. Los resultados mostraron que los PtaGADs presentan diferentes perfiles de expresión poniendo de manifiesto una regulación diferencial de estos genes frente a los distintos tipos de estrés. En este trabajo se proponen diferentes papeles para cada uno de los genes de la familia génica GAD en situaciones de estrés. CAPITULO 5 83 Resultados y discusión Estrés por calor El estrés por temperatura se define como el aumento ó descenso en la temperatura respecto a un umbral durante un tiempo suficiente para causar daños irreversibles en el crecimiento y el desarrollo de la planta (Wahid y col., 2007). Este umbral va a depender de cada especie, pero en general un aumento de 10-15ºC por encima de su temperatura de crecimiento normal se considera estrés por calor (Wahid y col., 2007). Así, teniendo en cuenta que la temperatura de crecimiento normal del híbrido P. tremula x P. alba es de 24ºC (Leplé y col., 1992), se expusieron las plantas a 39ºC durante 72h. En regiones dónde es habitual el cultivo de Populus pueden alcanzarse estas temperaturas debido a los ciclos diurnos y estacionales, por lo que el tratamiento de las plantas representó condiciones habituales de estrés por calor. Las altas temperaturas van a producir cambios en las estructuras de las membranas biológicas, en la naturaleza de las proteínas y en la organización de microtúbulos (Howarth, 2005; Smertenko et al., 1997). Además, el calor provoca cambios en el desarrollo y el crecimiento de la planta (Vollenweider y GunthardtGoerg, 2005). La disminución del crecimiento medio en altura se observó en plantas del híbrido expuestas a 39ºC frente a las plantas en condiciones control (Fig. 1A). Las altas temperaturas también provocan cambios fenotípicos en las plantas como la pérdida de turgencia en hojas que puede conducir a la senescencia de las mismas (Vollenweider y Gunthardt-Goerg, 2005). Las hojas jóvenes de las plantas del híbrido tratadas presentaron síntomas de pérdida de turgencia tras 24h de tratamiento, mostrando daños más severos tras 72h ya que las hojas se encontraban totalmente plegadas sobre sí mismas (Fig. 1B). Para comprobar la respuesta de la planta a nivel molecular se midió la expresión de un gen ortólogo a un marcador del estrés por calor descrito previamente (MBF1C). MBF1C es un co-activador transcripcional de la familia MBF que aumenta su expresión durante este estrés (Suzuki y col., 2005 y 2008). En nuestro estudio, se observó un aumento de la expresión de MBF1C en todos los órganos de la planta tras el tratamiento de estrés (Fig. 1C). Los datos de altura, apariencia de la hoja y la expresión de MBF1C muestran que las plantas de P. tremula x P. alba presentaron una respuesta fenotípica y molecular al estrés por calor. CAPITULO 5 84 Figura 1. Efecto del tratamiento de calor al crecimiento, el fenotipo y la expresión de los genes del metabolismo del GABA en P. tremula x P. alba. A) Crecimiento medio en altura de plantas expuestas a calor (39ºC) frente a controles (24ºC). Los datos de altura se tomaron a las 24h y 72 h del tratamiento. En la figura se muestra la media del crecimiento (cm/día) de al menos tres réplicas biológicas. B) Fenotipo de las plantas durante el tratamiento por calor. C) Mapa de calor de los valores de expresión relativa de los genes PtaGADs, GABP y GABA-T y del gen marcador MBF1C en estrés por calor. Los valores representados corresponden al log2 del ratio de la media de la expresión relativa en dos plantas tratadas entre la media de la expresión relativa en dos plantas controles. Así, si el gen presenta mayor expresión en plantas tratadas frente a las controles su valor será positivo y se representa con un color de la gama del rojo y naranja, por el contrario, si el gen presenta menor expresión en plantas tratadas que en las controles el valor del log será negativo y se representa en la gama del azul y gris. Los valores en amarillo reflejan que la expresión del gen en plantas tratadas y controles es similar. Todos los resultados de expresión están normalizados frente a tres genes de referencia (materiales y métodos). En negro se muestran los valores con un p-valor menor de 0,05 (ANOVA de dos vías), en gris los de un p-valor menor de 0,1 y en blanco aquellos que muestran un p-valor mayor de 0,1. GAD, glutamato descarboxilasa; GABA-T, GABA transaminasa; GABP, permeasa de GABA. Efecto del calor en los niveles de mensajeros de los genes PtaGAD y los genes implicados en el metabolismo de GABA Tradicionalmente, se ha observado que el GABA aumenta en tejidos de plantas sometidas a diferentes tipos de estreses medioambientales (revisado en Kinnersley y 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Control 39ºC cm/día 1 h 8 h 24 h 72 h MBF1C GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GABP GABA-T Hoja jóven 1h 5,7 -0,8 -0,4 -2,4 -0,1 -0,4 8h 4,5 -0,9 -0,5 -0,9 -1,1 0,2 24h 3,6 -1,5 -1,4 -1,6 -0,5 0,6 0,4 72h 3,2 -1,2 -1,1 1,2 1,8 1,3 0,8 Hoja madura 1h 4,9 -0,3 -0,2 -2,1 -1,6 -0,5 8h 3,8 -1 -1,8 -0,4 -1,9 -0,1 24h 3,5 -0,8 -0,5 -0,2 -1 1,1 0,5 72h 3,6 0 -0,2 0 0,4 1,6 1,1 Tallo 1h 7,6 0,1 0,1 -0,5 -0,2 0,1 8h 5 -0,9 -1 -1 -2 0,3 24h 4 -1,3 -2 -0,9 1,4 0,3 -0,1 72h 4,5 0,1 -3,2 -2 3,6 1 0,1 Raíz 1h 6,7 0,2 -0,7 -0,7 -0,5 0 8h 5,5 -0,7 -0,7 -1,6 -1,8 -0,8 24h 4 -0,1 -0,8 -0,6 0,1 -1,6 -0,3 72h 4 1,4 -1,8 -1,5 0,5 -0,4 -0,6 A B C 0 >2,5 Inducción Represión CAPITULO 5 85 Turano, 2000) con diferentes patrones de acumulación de GABA en función de la especie (Molina-Rueda y col., 2015). Por ejemplo, en respuesta a calor los niveles de GABA aumentan hasta 5 veces tras 1h de tratamiento y 18 veces tras 24h en cultivos celulares de judías respecto al control (Revisado en Kinnersley y Turano, 2000), y en raíces de Arabidopsis estos niveles aumentan 10 veces tras 2h de tratamiento (Bouché y col., 2004). Varios trabajos han puesto de manifiesto que existe una buena correlación entre los niveles de GABA y los niveles de mensajeros de los genes GAD durante los tratamientos de estrés (Kaplan y col., 2007; Renault y col., 2010; Molina-Rueda y col., 2010; Ackay y col., 2012), lo que indica que cambios en la expresión génica de la familia GAD suele implicar cambios en los niveles de GABA. En este estudio, además de analizar los niveles de mensajeros de los genes PtaGAD en el tratamiento de calor, se ha incluido la expresión de otros genes relacionados con el metabolismo del GABA como la permeasa mitocondrial de GABA (GABP), que media el transporte del GABA a la mitocondria, y el de GABA transaminasa (GABA-T). Los niveles de mensajeros de los genes PtaGAD disminuyeron en general en todas las muestras y tiempos ensayados en plantas del híbrido expuestas a 39ºC (Fig. 1C). Estos resultados concuerdan con lo observado en Arabidopsis, ya que también se ha observado una respuesta general de represión en raíz y tallo frente a los tratamientos de estrés por calor (revisado en Shelp y col., 2012b) sugiriendo que los genes GADs son susceptibles a la regulación por altas temperaturas. De forma específica, el tratamiento de calor provocó una disminución general en los niveles de mensajeros de PtaGAD1, PtaGAD2 y PtaGAD3 en todos los tejidos ensayados (Fig. 1C). El gen PtaGAD1 mostró un patrón de expresión en hojas y tallo similar al de PtaGAD2 en altas temperaturas (Fig. 1C), pudiendo ambos genes presentar mecanismos similares de regulación frente a estas condiciones. Los estudios filogenéticos sugieren que PtaGAD3 y AtGAD1 son ortólogos, siendo ambos los genes GAD que se expresan mayoritariamente en raíces en sus respectivas especies (capítulo 3: Miyashita y Good, 2008). Los niveles de transcritos de AtGAD1 tampoco incrementaron en raíces de Arabidopsis en respuesta a calor (Shelp y col., 2012d), aunque la GAD codificada por este gen podría ser la responsable del aumento de los niveles de GABA en raíces en altas temperaturas (Bouché y col., 2004). El gen PtaGAD5 fue el único que aumentó los niveles de transcritos de forma significativa en tallo mostrando un incremento de hasta 12 veces respecto al control tras 72h de tratamiento (Fig. 1C). Esta inducción puede deberse a que PtGAD5 es el gen que CAPITULO 5 86 posee mayor número de posibles elementos cis de respuesta a calor en su promotor (4 elementos cis HSE; capítulo 3).Estos datos apuntan a que PtaGAD5 puede jugar un papel importante en la respuesta a estrés por calor, especialmente en tallo. Los niveles de transcritos de GABP y GABA-T aumentaron en hojas y tallo a las 24h y 72h del inicio del tratamiento (Fig. 1C) indicando un mayor metabolismo del GABA en respuesta a calor en estos órganos. El incremento en los niveles de mensajeros de PtaGAD5 en tallo, y en hojas de PtaGAD3 y PtaGAD5, podría conducir a un incremento en los niveles de GABA en estos órganos y por lo tanto la activación de la ruta del GABA shunt, que podría ser importante para mitigar los efectos del estrés por varios motivos: 1) para eliminar la acumulación de ROI provocada por los tratamientos de calor (Cao y col., 2013) ya que la activación del GABA shunt disminuye la acumulación de especies reactivas (Bouché y col., 2003); y 2) para el reciclaje del nitrógeno durante el proceso de senescencia en hojas, teniendo en cuenta que tras 72h de tratamiento las hojas presentaban síntomas de una severa pérdida de turgencia, además, se ha publicado que GABA-T aumenta su expresión durante la senescencia de hojas de arroz para mantener el balance de C/N (Ansari y col., 2005). Estrés por frío Las bajas temperaturas provocan rigidez en las membranas biológicas, despolimerización de microtúbulos y por lo general una desaceleración de los procesos metabólicos que conlleva a desequilibrios en el balance entre la energía lumínica y la energía química, provocando la acumulación de ROS (Ruelland y Zachowski, 2010) y como consecuencia, la inhibición en el crecimiento de la planta. En este trabajo, las plantas del híbrido se expusieron a 10ºC durante 72h y mostraron una disminución significativa del crecimiento respecto a las plantas controles (Fig. 2A), sin alteraciones en el fenotipo ya que sólo algunas hojas habían perdido turgencia pero sin signos de marchitez (Fig. 2B). Estos resultados concuerdan con trabajos previos también en Populus pero en este caso a una temperatura inferior (4ºC) (Renault y col., 2014). Los genes CBF (factores de unión a repeticiones C) son genes de respuesta a frío que pertenecen a una familia de activadores transcripcionales que se unen a elementos reguladores conocidos como CRT (repeticiones C) y DRE (elemento de respuesta a deshidratación) (Stockinger y Gilmour & Thomashow, 1997). En trabajos previos se ha observado que los CBFs en Populus se inducen en frío, y en concreto el CBF3 aumenta sus niveles de mensajeros en hojas y tallo en las primeras horas de tratamiento CAPITULO 5 87 (Benedict y col., 2006). En este trabajo, como marcador de estrés por frío, se midió la expresión del gen CBF3 y se observó un aumento general de sus niveles de mensajeros tras 1h y 8h del tratamiento (Fig. 2C), reflejando una respuesta molecular a estrés por bajas temperaturas en el híbrido. Efecto del frío en la expresión relativa de los genes PtaGAD y de los genes implicados en el metabolismo de GABA En general, la expresión de los genes PtaGAD aumentó en los diferentes órganos de P. tremula x P. alba en respuesta a frío (10ºC), siendo más importante este aumento en la parte aérea de la planta (Fig. 2C), Los genes PtaGAD mostraron patrones de expresión diferentes frente a frío (Fig. 2C). El patrón de expresión de PtaGAD5 fue el más diferente al resto de genes PtaGAD, con inducciones significativas sólo en hojas jóvenes. El gen AtGAD4, posible ortólogo de PtGAD5, también aumenta sus mensajeros en la parte aérea de Arabidopsis en respuesta a frío (Kaplan y col., 2007). Los genes PtaGAD1 y PtaGAD3 presentaron un patrón de expresión similar, aunque PtaGAD3 tuvo mayores inducciones de sus mensajeros en todos los tejidos. PtaGAD3 junto con el gen PtaGAD2 fueron los genes PtaGAD que obtuvieron un mayor incremento de mensajeros en tallo en frío respecto a sus niveles iniciales en condiciones normales de crecimiento, pudiendo ser los principales responsables de la síntesis de GABA en tallo en respuesta a frío. El patrón de expresión de PtaGAD2 fue muy similar al gen marcador CBF3, presentando altas inducciones de sus mensajeros a tiempos cortos (1 y 8h) en frío. El aumento de los niveles de mensajeros de los genes GAD a tiempos cortos en frío se ha observado en especies herbáceas, como Panax ginseng, en la que se detecta un aumento de la expresión de genes GAD a 4ºC, alcanzando los máximos niveles tras 8h de tratamiento (Lee y col., 2010); o en Arabidopsis, en la que se registra inducción del gen AtGAD2, posible ortólogo de PtaGAD2 (Capítulo 3), en la parte área de la planta alcanzando máximos niveles de transcritos tras 12h y 24h de tratamiento (Kaplan y col., 2007). En estas condiciones de estrés, también aumentan los niveles de GABA alcanzando la máxima concentración tras 24h de tratamiento (Kaplan y col., 2007). Los niveles de GABA pueden aumentar hasta 20 veces en frío respecto a los valores iniciales, observándose a su vez un incremento rápido y transitorio de calcio citosólico (Wallace y col., 1984). Durante el estrés por frío se ha demostrado que ocurre un incremento de Ca+2 en la célula que es el que provoca la acumulación de GABA debido al aumento en CAPITULO 5 88 la actividad de la GAD por la unión de Ca+2 – calmodulina (CaM) al dominio de unión a CaM (CaMBD) (Cholewa y col., 1996). El GABA puede proteger las proteínas y membranas de los daños provocados por las bajas temperaturas actuando como osmolito compatible (Uemura y col., 2003; Wanner y Junttila, 1999), pudiéndose explicar de esta manera que las plantas del híbrido responden a estrés por frío aumentando la expresión de GAD para, en última instancia, aumentar los niveles de GABA por sus propiedades crioprotectoras. Figura 2. Efecto del tratamiento de frío en el crecimiento, el fenotipo y expresión de los genes del metabolismo del GABA de P. tremula x P. alba. A) Crecimiento medio en altura de plantas expuestas a frío (10ºC) frente a controles (24ºC). Los datos se tomaron a las 24h y 72h y se representó la media del crecimiento (cm/día) de al menos tres réplicas biológicas. El asterisco indica que los resultados de ANOVA muestra un valor p <0,05 respecto al control. B) Fenotipo de plantas representativas durante el tratamiento por frío. C) Mapa de calor de los valores de expresión relativa de los genes en estrés por frío y del gen marcador de frío, CBF3. Los valores fueron tratados de la misma forma que los mostrados en la figura 1. Los genes GABA-T y GABP no mostraron cambios relevantes de expresión durante el tratamiento de frío, sólo se observó una disminución de sus niveles en 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Control 10ºC cm/día * 8 h 24 h CBF3 GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GABP GABA-T Hoja jóven 1h 1,4 0 1,4 0,2 1 -0,1 0 8h 0,8 0,9 2,4 1,5 1,3 -1,2 -0,6 24h -0,3 -0,5 0,5 0 0,1 72h -0,3 -0,2 0,6 0 0,4 Hoja madura 1h 1,9 0 2,7 0,7 -0,4 0,1 0 8h 0,8 1 1,3 1,4 -0,7 -0,8 -0,8 24h -0,2 0,1 1,7 1,2 -0,5 72h 1 0,3 0,1 0,2 0,7 Tallo 1h 0,6 0,1 1 0,9 -0,2 -0,3 -0,2 8h -0,1 0,6 1,1 1,5 0 0,7 -0,1 24h -1,2 0,2 -0,2 0,8 -0,2 72h -1,2 0 -0,8 0,1 0,2 Raíz 1h 0,7 0,1 0,6 0,7 0,4 0 0 8h 1,2 -0,4 0,6 0,2 0,9 0,1 0 24h 0,3 1,1 0 0,8 0,4 72h -0,1 0,5 0,1 -0,4 -0,4 A B C 0 >2,5 Inducción Represión CAPITULO 5 95 Niveles de mensajeros relativos de los genes del GABA shunt en sequía: GAD, GABA-T y SSADH En estrés por sequía se induce la biosíntesis de ABA (Shinozaki y Yamaguchi, 2000) y se produce cambios en la expresión génica regulados por la hormona (Shinozaki y Yamaguchi, 1997). Se han descrito dos rutas que permiten la expresión de genes en respuesta a ABA mediante, 1) la unión de factores de transcripción bZIP que se unen a elementos de respuesta a ABA, denominados elementos ABRE, que poseen un núcleo G-box con una secuencia consenso ACGT (Ueno y col., 2000) y, 2) las proteínas MYC y MYB que interactúan con los elementos MYCR/MYBR y que se han encontrado en promotores de genes de respuesta a deshidratación como RD22 (Abe y col., 1997). En genes GAD de naranjo cuya expresión aumenta en respuesta a ABA (Zhuang y col., 2010; Liu y col., 2014) se ha detectado la presencia de varias cajas de respuesta de ABA en sus promotores (Liu y col., 2014). El análisis in silico de las secuencias promotoras de los genes PtGAD reveló que, PtGAD1 es el gen que posee más elementos tipo ABRE (3 elementos), aunque los genes PtGAD5 y PtGAD2 también presentan este elemento (2 y 1 elemento respectivamente) (Capítulo 3). Además, PtGAD1 y PtGAD2 poseen un posible elemento MYCRD22 y PtGAD5 un elemento MYBRD22. Estos resultados sugieren que a priori PtGAD1, PtGAD2 y PtGAD5 podrían presentar una respuesta a estrés hídrico dependiente de ABA. PtaGAD1 fue el gen PtaGAD que presentó la mayor inducción en los niveles de mensajeros en sequía (Fig. 5A). PtaGAD1 aumento sus mensajeros paulatinamente durante el tratamiento. El patrón de expresión de PtaGAD1 durante el tratamiento de sequía fue muy similar al que sigue un gen GAD (ZmGAD1) de maíz cuando se inyecta ABA a la planta (Zhuang y col., 2010). Además ZmGAD1, al igual que PtaGAD1, presenta en su secuencia promotora posibles elementos cis ABRE (Zhuang y col., 2010), de respuesta a fitohormonas como el ABA. Estos resultados apoyan la existencia de una posible regulación transcripcional de PtaGAD1 por ABA, y por lo tanto la inducción de sus mensajeros en sequía debido a las altas concentraciones de la fitohormona. PtaGAD1 se postula como la responsable principal de la producción de GABA en hojas, cuya función puede estar relacionada con la regulación del transporte iónico en las células guardas del estoma en condiciones normales de crecimiento (Capítulo 3). En condiciones de déficit de agua, una de las primeras respuestas que se producen es el cierre de estomas (Schroeder y col., 2001), proceso regulado por ABA (Zhang y col., CAPITULO 5 96 1987; Daszkowska-Golec y Szarejko, 2013). La disminución de GABA en la planta como consecuencia del silenciamiento de genes GADs en Arabidopsis también provoca una alteración en el flujo iónico de las plantas y como consecuencia alteraciones tanto en el cierre estomático como en el número de estomas (Worku, 2012). Teniendo en cuenta estos resultados, PtaGAD1, regulada por ABA, podría ser la responsable de la producción de GABA en hojas para la regulación del movimiento estomático durante el estrés hídrico. Figura 5. Mapa de calor de los niveles de mensajeros relativos de los genes del GABA shunt en plantas de P. tremula x P. alba sometidas a estrés por sequía a corto y largo plazo. A) Niveles de mensajeros relativos de XERICO y de los genes del GABA shunt a corto plazo (72h) y B) a largo plazo (35 días). Los datos de expresión de largo plazo corresponden a la media de tres réplicas biológicas. Los datos fueron tratados como se explica en la figura 1. En negro se muestran los valores con un p-valor menor de 0,05 (ANOVA de dos vías), en gris los de un p-valor menor de 0,1 y en blanco aquellos que muestran un p-valor mayor de 0,1. GAD, glutamato decarboxilasa; GABA-T, GABA transaminasa; SSADH, semialdehído succínico deshidrogenasa. Los resultados obtenidos para PtaGAD2 en hojas jóvenes son muy similares a los de PtaGAD1, la tendencia de sus mensajeros fue aumentar frente a sequía (Fig. 5A). Por el contrario, el patrón de expresión de PtaGAD1 y PtaGAD2 en el resto de muestras fue diferente. En tallo ambos genes mostraron tanto a corto como a largo plazo patrones de expresión diferentes, observándose una inducción de la expresión de PtaGAD1 XERICO GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GABA-T SSADH Hoja jóven 1h 3,1 0,9 0,1 -0,5 0,1 0,5 0 8h 1,4 1,1 1 0 0 0,5 0,5 24h 4,1 0,8 0,4 0 -1,5 0,7 0,4 72h 3,5 1,9 1,1 1,2 0,2 0,7 0,6 Hoja madura 1h 2,5 0,4 -0,8 -1,3 -0,9 1,3 0,2 8h 1,2 1,1 0,2 0 0,3 0,3 0,6 24h 1,9 0,5 -0,3 -0,2 -0,9 0,7 0 72h 2 1,1 0,3 -0,1 -0,9 0,6 0,1 Tallo 1h 3,2 0,8 0,9 -0,8 0,8 0 -0,1 8h 0,8 1,6 0,2 -0,6 -0,1 -0,7 0,3 24h 3,4 0,8 0,8 0 2,1 0,5 0,3 72h 2,2 2,2 0 -0,7 -0,9 0,5 0,5 Raíz 1h 2,6 0,6 -0,3 -1 -2,4 -0,1 0 8h 1 1 0 -0,7 0 0 0,2 24h 2,5 0,7 0 -0,3 0,4 0,2 0,1 72h 0,7 1,8 -0,1 -0,6 -0,6 0,4 0,3 Tallo 35 días 2,8 0,4 -0,7 0 0,9 A B 0 >2,5 Inducción Represión CAPITULO 5 97 mientras que se observó una represión en la expresión de PtaGAD2 (Fig. 5B). Estos resultados indican que ambos genes poseen diferentes mecanismos de regulación transcripcional, al menos en respuestas a largo plazo en condiciones de sequía. El gen PtaGAD5 mostró un aumento en los niveles de mensajeros en tallo tanto a corto (72h) (Fig. 5A) como a largo plazo (35 días) (Fig. 5B) en tratamientos de sequía. Estos resultados concuerdan con los mostrados en Arabidopsis dónde AtGAD4 aumenta su expresión en tallo y en raíz por sequía (Shelp y col., 2012d). Además, Urano y col. (2009) describen que AtGAD4 es un gen clave en el GABA shunt en estrés por deshidratación y su expresión fue mayor en transgénicos deficientes de una proteína clave para la biosíntesis de ABA, por lo que se considera que este gen puede ser ABAindependiente (Urano y col., 2009). Los genes GABA-T y SSADH aumentaron sus niveles de mensajeros en sequía especialmente en hojas (Fig. 5A). Aunque en otras especies no se han observado cambios de estos genes en tratamientos de sequía (Shelp y col. 2012d) sí se observó un aumento de los niveles de succinato (Urano y col., 2009), siendo por lo tanto coherente el aumento de la expresión de los genes encargados del catabolismo del GABA. El incremento del GABA shunt podría deberse a la acumulación de GABA. Como han mostrado los datos de expresión, los PtaGADs aumentan su expresión en sequía, pero además durante estreses abióticos se va a producir un aumento de los niveles de Ca+2 que van a estimular la actividad GAD a través de calmodulina provocando la síntesis de GABA (Bouche y Fromm, 2004). Estrés por sal Sobre el 20% de los cultivos de regadío sufren estrés por salinidad (Flowers y Yeo, 1995). Al igual que en sequía, los tratamientos salinos en plantas van a disparar diversas respuestas como la inhibición del crecimiento del tallo (Zhu y col., 2001; Chaves y col., 2003; Zhang y col., 2011). En este trabajo las plantas del híbrido regadas con 300 mM de cloruro sódico inhibieron su crecimiento significativamente tras 72h de tratamiento (Fig. 3). Este efecto también se ha observado en experimentos similares en sésamo (Bor y col., 2009), soja (Yin y col., 2014), y tabaco (Zhang y col., 2011). Para verificar la respuesta molecular al estrés por sal se midió la expresión del ortólogo ATAF1 de Arabidopsis en Populus (Potri.002G081000), un factor de transcripción de la familia NAC que se ha relacionado con la tolerancia a estrés salino en plantas (Wu y col., 2009). En este trabajo se observó aumento en la expresión de CAPITULO 5 98 ATAF1 en todos los órganos de plantas tratadas, siendo superior en tallo (Fig. 6). Estos resultados muestran que las plantas de P. tremula x P. alba presentaron una respuesta fenotípica y molecular típica al estrés salino. Niveles de mensajeros relativos de los genes del GABA shunt en estrés por sal .Las plantas poseen una respuesta similar en sal y sequía debido a que el tratamiento de sal además de provocar un estrés iónico al competir directamente por la captación del ión potasio, también genera un ambiente hipertónico en el que se provoca deshidratación celular. Ambos tratamientos generan un déficit de agua en la planta induciéndose respuestas similares para tolerar dichos estreses (Zhu y col., 2001). PtaGAD1 fue el único gen de la familia que mostró un aumento significativo de sus mensajeros en todas las muestras analizadas durante estrés salino (Fig. 6A), sugiriendo que éste puede ser el gen responsable de la mayor parte de la producción de GABA durante el estrés. El aumento de los niveles de mensajeros de PtaGAD1 también en tratamientos de sal apoya la hipótesis que puede estar regulado por ABA, ya que como se ha mencionado anteriormente la cascada de señalización que siguen para tolerar o revertir el estrés son muy similares. El resto de genes PtaGAD no mostraron inducciones de sus mensajeros tan claras. PtaGAD2 aumentó su expresión en hojas jóvenes y tallo durante tratamientos salinos (Fig. 6A). Este resultado es similar a la expresión de AtGAD2 en Arabidopsis, aunque los autores proponen que este aumento en el nivel de transcritos no es una respuesta especifica a sal ya que no responde a diferentes concentraciones de NaCl, sino que podría tener un papel en el ajuste del metabolismo del nitrógeno durante los tratamientos salinos (Renault y col., 2010). PtaGAD5 disminuyó sus mensajeros respecto a los controles en la mayoría de los órganos excepto en el tallo, en el que mostró una inducción a las 8 y 24h del tratamiento de sal (Fig. 6A). Su posible ortólogo AtGAD4 también aumentó sus mensajeros por la presencia de NaCl (Renault y col., 2010). PtaGAD3 disminuye sus mensajeros en todos los órganos al igual que ocurría en tratamientos de sequía (Fig. 6A). El gen cuya expresión es mayoritaria en raíz de Arabidopsis (AtGAD1), también disminuyó su expresión en estrés salino (Renault y col., 2010). Estos resultados sugieren que la expresión de PtaGAD3 se ve afectada en los estreses que conllevan una deshidratación celular. CAPITULO 5 99 Figura 6. Mapa de calor de los niveles de mensajeros relativos de los genes del GABA shunt en las diferentes muestras de las plantas de P. tremula x P. alba sometidas a estrés por sal a corto y largo plazo. A) Niveles de mensajeros relativos del marcador de sal, ATAF1 y de los genes del GABA shunt en estrés por sal (300 mM de NaCl) a corto plazo (72h) y B) a largo plazo (35 días) a las concentraciones de 60 mM y 137 mM de NaCl de los genes GAD. Los datos fueron tratados como se explica en la figura 1. En negro se muestran los valores con un p-valor menor de 0,05 (ANOVA de dos vías), en gris los de un p-valor menor de 0,1 y en blanco aquellos que muestran un p-valor mayor de 0,1. GAD, glutamato decarboxilasa; GABAT, GABA transaminasa; SSADH, semialdehido succínico deshidrogenasa; Mutantes en GABA-T son muy sensibles al estrés por sal lo que da una idea de la relevancia del metabolismo del GABA en estas condiciones (Renault y col., 2010). En este estudio se observó leves inducciones en los niveles de los mensajeros del gen GABA-T en tratamiento con sal (Fig. 6A) al igual que se ha descrito por Zhang y col. (2011). En Arabidopsis se ha registrado inducciones sutiles en los mensajeros de GABAT y SSADH en tallo y raíz (Shelp y col., 2012d; Renault y col., 2010). Los resultados sugieren la importancia de la coordinación del funcionamiento de GABA-T y SSADH para evitar que se produzca la acumulación de SSA debido a su alta toxicidad. El buen funcionamiento del GABA shunt durante condiciones estresantes va a ser primordial para evitar que se produzca la acumulación de aminoácidos, de moléculas tóxicas o que ATAF1 GAD1 GAD2 GAD3 GAD5 GABA-T SSADH Hoja jóven 1h 0,1 0,6 0,6 -1,1 0,6 0,4 0,6 8h 0,9 0,8 0,5 -0,5 -0,3 0,2 0,2 24h 0,5 0,4 0 0 -2,4 0 0 72h 1,3 0,7 0,3 0,3 -0,5 0,1 0,5 Hoja madura 1h 0,3 0,6 -0,5 -1 -1,1 0,7 0,1 8h 0,8 0,8 0 -0,3 0 0 0,2 24h 0 0,2 -0,3 -0,6 -0,6 0,2 0,2 72h 1 0,6 0,1 -0,1 -1,4 0 0,8 Tallo 1h 0,8 0,8 1,5 -0,4 -1 0 -0,1 8h 2,4 0,6 0 -0,3 0,5 -0,2 0,3 24h 1,1 0,4 0,9 -0,1 0,8 0 -0,2 72h 0,9 1 -0,1 -0,6 -0,6 0,2 0 Raíz 1h 0 0,4 -0,4 -1,3 -2,2 -0,2 -0,3 8h 1,7 0,6 -0,1 -0,2 0,2 -0,1 0 24h 1,4 0,2 0 -0,5 -1,1 0 0 72h 1,1 1 0,1 0 0,5 0 0 Tallo 35 días 1,6 -0,5 -1,5 -0,8 2,1 60mM 2,5 -1 -3,4 0,6 4,8 137mM A B 0 >2,5 Inducción Represión CAPITULO 5 100 se altere el balance redox, además siendo necesario el catabolismo de GABA para el balance C/N para tolerar el estrés (Renault y col., 2010). Expresión relativa de los genes del GABA shunt en tallo de P. tremula x P. alba en estrés por sal a diferentes concentraciones a largo plazo Para observar si el tiempo del tratamiento y la concentración de sal influyen en la expresión de los genes del GABA shunt, se realizó un experimento a diferentes concentraciones de sal y diferentes tiempos. Al igual que en los tratamientos de sequía a largo plazo, sólo se tuvo en cuenta el tallo de las plantas debido al interés económico de la madera de Populus. Akcay y col. (2012) observaron que tanto a corto (24h) como a largo plazo (21 días) se produce la acumulación de GABA en plantas de tabaco frente a estrés salino. En nuestros experimentos se utilizaron soluciones con concentraciones de NaCl menores (60 y 137 mM) que la ensayada a corto plazo (300 mM), para que las plantas no se vieran demasiado afectadas al final del tratamiento. Los resultados mostraron que PtaGAD1, cuya expresión aumentó en tallo frente a estrés por sal a corto plazo, presenta una disminución de expresión a largo plazo respecto al control a 60 y 137 mM de NaCl (Fig. 6B). Igual ocurre con PtaGAD2, que experimenta una mayor inhibición de expresión que PtaGAD1. En cambio, PtaGAD3, que no mostró un aumento de sus mensajeros frente a estrés por sal en el tratamiento de 72h, sí muestra un aumento de expresión después de 5 semanas a la concentración de 137mM NaCl respecto al tratamiento control. Estos datos indican que PtaGAD1 y PtaGAD2 sólo responden a estrés a corto plazo, en cambio PtaGAD3 responde dependiendo de la intensidad del estrés. PtaGAD5 es el único que aumenta su expresión en tallo en tratamientos de sal tanto a corto como a largo plazo, siendo su expresión superior después de 5 semanas de tratamiento y mostrando una expresión dependiente de la dosis (Fig. 6B). En Arabidopsis, la expresión de AtGAD4 también se ha descrito como dependiente de la dosis en estrés salino (Renault y col., 2010). Conclusiones Los estreses abióticos alteran los patrones de expresión de los genes GADs de P. tremula x P. alba. La respuesta de estos genes va a depender del tipo y la duración del estrés. Se ha observado que PtaGAD1 se induce principalmente en los estreses abióticos que provocan deshidratación celular (frío, inundación, sal y sequía). PtaGAD1 es CAPITULO 5 101 también el que presenta más elementos de respuesta a ABA en su promotor. Teniendo en cuenta que los estreses abióticos que provocan deshidratación disparan la producción de ABA, los cambios en expresión del gen PtaGAD1 pueden estar mediados por ABA en las situaciones estudiadas en este trabajo. PtaGAD2 se postula como uno de los genes más susceptibles a estrés por temperatura, aunque su respuesta es diferente en estrés por calor, donde disminuye su expresión, y en estrés por frío donde aumentan sus niveles de mensajeros. En nuestro estudio, sólo se muestra inducciones de la expresión de PtaGAD2 en algunos estreses y órganos a corto plazo, inhibiéndose a largo plazo, lo que sugiere que PtaGAD2 podría activarse como consecuencia de los cambios metabólicos producidos en respuesta al estrés abiótico y, por tanto no estaría implicado en la producción directa de GABA con el fin de mitigar los efectos del estrés. El gen PtaGAD3 inhibe su expresión en diferentes tipos de estrés como calor, sequía y sal. En cambio, en frío y en inundaciones aumenta su expresión en los tejidos más afectados por el estrés. Su patrón de expresión fue diferente al resto de los genes PtaGAD ante los diferentes tipos de estrés abióticos sugiriendo que presenta un mecanismo de regulación distinto. PtaGAD5 presenta una respuesta muy similar en la mayoría de los tratamientos ensayados, aumentando su expresión casi exclusivamente en tallo. La proteína codificada por este gen se propuso en el capítulo 3 que podría cumplir una función similar a AtGAD4 que se ha descrito en varios trabajos como el gen GAD de respuesta a la mayoría de los estreses medioambientales. Así en base a estos resultados se sugiere que PtaGAD5 es ortólogo de AtGAD4, aunque durante la evolución ha podido adquirir nuevos elementos en su promotor que le han proporcionado una respuesta más específica en tallo frente a condiciones adversas. Capítulo 6 General conclusions CAPITULO 7 111 GAD and silencing genes involved in GABA catabolism accumulates GABA in rice grain and the consumption of this product may prevent moderate hypertension in humans due to its role as inhibitory neurotransmitter (Tsuchida et al., 2003). The reaction catalyzed by GAD is situated in the GABA shunt pathway together with GABA transaminase (GABA-T) and succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH). GABA acts as a bypass connecting the Krebs cycle (carbon metabolism) and nitrogen metabolism, being glutamate the starting substrate and succinate the final product of this shunt. The pathway starts with the decarboxylation of glutamate to produce GABA and CO2 in the cytosol (Baum et al., 1993; Fait et al., 2008). GABA is then presumably transported to the mitochondria by a GABA permease (GABP), where it is converted to succinic semialdehyde (SSA) by the second enzyme of GABA shunt (GABA-T). Subsequently, SSA is converted either to succinate by SSADH (the last step of GABA shunt). SSADH activity is inhibited under excess NADH being favored the reaction SSA to 4-hydroxybutyrate GHB by glyoxylate reductases (GLYR) (Fait et al., 2007). Reduction of SSA by GLYR is a way to decrease the level of SSA, which present toxic effect due to its reactive aldehyde group, and consume reducing power, which is at high level often under stress conditions. Additionally, GABA synthesis can also occur via polyamine degradation, putrescine and spermidine (Fait et al, 2008; Shelp et al, 2012b) and possibly by a nonenzymatic reaction from proline under oxidative stress (Signorelli et al., 2015). GABA is a four carbon non-proteinogenic amino acid. Due to its physicochemical properties it can participate in various processes in plants (reviewed in Shelp et al., 1999). As zwitterion, GABA may play a role as compatible osmolyte support as it reaches high concentrations (mM) in the cell without apparent toxic effects. GABA can protect and stabilize membranes from freeze damage, exceeding the cryoprotective properties of proline and glycine betaine at the same concentrations (Heber et al., 1971). Furthermore, the ability of GABA as a scavenger of superoxide anion, hydrogen peroxide and singlet oxygen is significantly higher than proline, suggesting a possible role in reducing ROS production in water deficit conditions (Liu et al., 2011). Finally, GABA might participate in the defense response of the plant against attack by pathogens, acting as inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of phytophagous insects (Ramputh and Bown, 1996). The presence of GABA transporters, both low affinity (AAP3, PROT1 and PROT2) and high affinity (GAT1), located in the plasma membrane suggests that CAPITULO 7 112 GABA can be transported to exert their role in different parts of the plant. Although there are no conclusive studies about existence of GABA receptors, it is believed that GABA can join glutamate receptors and participate in signaling (reviewed in Kinnersley and Turano, 2000; Michaeli y Fromm, 2015). A signaling role for GABA in plants is continuously suggested and discussed (Bouché and Fromm, 2004; Häusler et al., 2014). For example, GABA as signal molecule could regulate the expression of several genes such as ACC synthase and oxidase (Kathiresan et al., 1997), arginine decarboxylase (Turano et al., 1997), genes encoding nitrate transporters (Beuve et al., 2004 ), 14-3-3 gene family (Lancien and Roberts, 2006) and genes encoding cell wall-related proteins (Renault et al., 2011). Furthermore, GABA might modulate the ion flux in plants since exogenous GABA treatment causes mineral ion concentration in Lemna cells (Kinnersley and Lin, 2000). Recently, it has been reported that GABA modulates Ca2+ channels to regulate process such as the proper pollen tube growth in plants (Yu et al., 2014) or stomatal movement (Schroeder and Hagiwara, 1989). Additionally, the presence of GABA in differentiating xylem may be related to its potential role in the regulation of Ca2+, which has an important function during xylogenesis, or acting on the regulation of the expression of cell wall related genes (Molina-Rueda et al., 2015). The characterization of GAD families in woody plants are scarce and, considering the roles described for GAD and GABA in herbaceous and their putative roles in vascular development in pine, the study of the GAD gene family in the model tree poplar will presumably reveal helpful information about relevant functions of the gene family in woody species. Populus tremula x P. alba has been used as a modelplant in this thesis. Populus is a suitable model for study tree species because it has a small genome respect to other trees, the genome sequence is available, it is a fast growing species, easy to propagate vegetatively and susceptible to transform. Aims of the study This thesis has focused on the in silico characterization and analysis of the relative expression of GAD gene family in poplar under different growth conditions. Furthermore, immunolocalization of GABA has been performed in different plant organs. Finally, changes in poplar root architecture in response to various amino acids have been studied. Consequently, the specific objectives of this study were: 1) To study the acquisition of CaMBD in plant GADs. CAPITULO 7 113 2) To assign possible functions of Populus GADs (PtaGADs) under normal growth conditions and under environmental stresses. 3) To analyze the effect of glutamate and GABA in the root architecture of P. tremula x P. alba. CAPITULO 7 115 Chapter 2 γ-aminobutyric acid (GABA) is a non-proteinogenic amino acid widely distributed among living organisms from all kingdoms. Its metabolism has been related to biotic and abiotic stress tolerance in bacteria, fungi and plant species. More recently, several roles including the regulation of gene expression and signal molecule has also been attributed to GABA in plants. GABA is mainly synthetized by glutamate decarboxylase (GAD). We have previously reported a novel role for GABA production in vascular development in pine seedlings. Here, we investigate an angiosperm species (poplar) to test whether the proposed role in the gymnosperm might be applicable to other vascular plants. Results showed that a poplar GAD was differentially expressed in response to reaction wood generation triggered by gravitational stimulation, and that its transcript profile was similar to that of an ACC oxidase which expression is induced in reaction wood-forming tissues. Additionally, GABA was immunolocalized mainly in differentiating xylem and ray parenchyma cells in xylematic areas in poplar stem sections. Clear similarities are observed between the results in the angiosperm and previous results in the gymnosperm, suggesting a common role of GABA production in vascular development in plants. Angiosperm GAD is regulated by pH and calcium/calmodulin, two critical factors for programmed cell dead during xylogenesis. We have previously reported that calcium/calmodulin regulation of GAD is not only present in angiosperm, but also in pine. To investigate the appearance of calcium regulation in plant GAD during evolution, calmodulin binding domains (CaMBDs) in GADs from species across the green lineage have been studied. Essential residues described in functional CaMBDs of plant GADs are conserved in a GAD of the ancient member of vascular plant Selaginella moellendorffii, and absent in GADs of nonvascular plants. CaMBDs have probably evolved from a homologue region to the carboxy termini found in a GAD of Klebsormidium flaccidum, the ancestor of current terrestrial plants. A dual role for GABA production in nitrogen recycling and signaling during xylogenesis in vascular plants is proposed. CAPITULO 7 117 Chapter 3 GADs are encoded by one or two genes in animals, whereas the number of GAD genes is more variable and usually higher (up to ten) among plant species (Sukhareva and Mamaeva, 2002). The existence of several GAD genes in plants indicates that gene duplication and specialization events occurred during plant evolution. To date, GAD gene families have been characterized mainly in herbaceous plants, and just a few studies have been carried out in trees as plant model. In this chapter, as a first attempt in the characterization of the GAD family in a tree species, in silico studies and expression analysis of this gene family has been accomplished in P. tremula x P. alba. Additionally, immunolocalization of GABA have been performed in order to shed some light on GABA location at tissular level in this tree species. Six GADs genes were identified on the sequenced poplar genome (P. trichocarpa). All of them had a similar gene structure with the same numbers of exons and introns, except for PtGAD1, which showed an intron less due to fusion of two exons. The GAD proteins encoded by these genes have molecular masses and isoelectric points similar to those described in other plant species. They are apparently functional since the key residues to perform catalysis are conserved in all of them (Sukhareva and Mamaeva, 2002). Moreover, essential residues required for binding CaM (Arazi et al., 1995) were detected in CaM binding domain of the six GAD poplar proteins, which it suggests a relevant role of calcium regulation in driving GAD activity in this tree species. To characterize at transcriptional level the GAD gene family in P. tremula x P. alba, were used each specific gene primers and also primers for global expression of all GAD genes. The overall expression of PtaGADs was associated to petioles and stem, being GAD transcript levels higher in xylem when compared to bark, this fact match with a role of GAD in vascular development, role previously suggested for GAD in a gymnosperm tree species (Molina-Rueda y col., 2010). The expression of the six GAD genes was measured individually to provide hints in deciphering putative specialization event in this gene family. PtGAD1 not only has a different gene structure, but also it presents more substitutions in the amino acid sequence when compared to the other poplar GAD proteins. This substitutions lead to higher number of serine and threonine residues in PtGAD1, suggesting that the protein activity might be differentially modulated by phosporilation. Regulation of GAD activity by phosporilation has been CAPITULO 7 118 previously proposed in Arabidopsis, rice and Medicago (Nakagami et al., 2010). In agreement with a putative role in vascular development, results of this chapter showed that petioles and xylem presented the highest PtaGAD1 transcript levels among all the analyzed organs and tissues. However, in leaves, in which PtaGAD1 showed the highest transcript level among all the PtaGADs, no differences in expression were detected between mesophyll and leaf ribs, and furthermore, “in silico” promoter studies revealed a relatively high number of cis-elements involved in response to light in its promoter. These facts suggest that GABA production from PtaGAD1 might also be involved in a role in photosynthetic tissues. Although no specific role for GABA in leaves has been published so far, certain roles already described for GABA production might be specially relevant in photosynthetic tissues. GABA can affect ion flux (Kinnersley and Lin, 2000) by joining Ca+2 channels (Yu et al., 2014) and modulate the concentration of potassium ions (Schroeder and Hagiwara, 1989). Additionally, GABA can regulate the expression of aquaporin (Renault et al., 2011), which may affect cell turgor. These two factors, modulation of ion flux and cell turgor, are essential for stomata movement, which point out a putative role for GABA production associated to these specialized cells in leaves. PtaGAD2 was expressed mainly in organs in which the vascular tissue is especially abundant such as petioles and stems since transport function is one of the main roles in these organs. Unlike PtaGAD1, PtaGAD2 transcript levels were higher in leaf ribs than in mesophyll in leaf samples. PtaGAD2 was preferentially expressed in xylem and cis elements that induce expression in xylem were found in its promoter. Altogether, these results suggest that PtaGAD2 might be involved in vascular development in poplar. During xylogenesis, induction of GAD activity is expected since elevated Ca+2 concentration and a decrease in pH are common and necessary events during the program cell death in the maturation of tracheary elements. GABA may participate in various processes in the vascular system. It has been reported that GABA can modulate the expression of genes involved in extensibility and cell elongation during vascular development (Renault et al, 2011;. Kathiresan et al. 1997; Kathiresan et al, 1998) and genes involved in ethylene biosynthesis, a hormone with roles in vascular development in poplar (Love et al., 2009). PtaGAD3 expression was predominantly found in roots of Populus. Its high expression in roots was positively correlated with that of other genes of the GABA shunt pathway and mitochondrial GABA permease gene (GABP). Phylogenetic studies CAPITULO 7 119 showed that PtaGAD3 and PtaGAD2 derive from duplication so these two genes could be paralogs suggesting that PtaGAD3 might also participate in vascular development. Furthermore, according to the results of phylogenetic studies, PtaGAD2, PtaGAD3 and PtaGAD4 may be orthologues of AtGAD1. It has been proposed that AtGAD1 might be involved in GABA synthesis from glutamate derived from primary nitrogen assimilation (Bouche et al., 2004). In this context, GABA production might be involved in nitrogen assimilation metabolizing the glutamate from the GS/GOGAT cycle and providing succinate to the Krebs cycle, maintaining the balance of nitrogen and carbon metabolism in root. Next chapter will focus in depth on the putative role of PtaGAD3 and GABA shunt in roots. PtaGAD5 messengers were detected only in roots and flowers but with large variations between replicates. However, PtaGAD6 expression was not detected in any of the analyzed samples. The common phylogenetic origin of PtaGAD5 and PtaGAD6 with their Arabidopsis orthologues AtGAD4 and AtGAD3 suggests that they might have retained similar functions in the two species. Miyashita and Good (2008) did not detect AtGAD3 messengers under normal growth conditions and AtGAD4 is found at low levels in certain organs. However, the expression levels of AtGAD4 increase under stress conditions (Miyashita and Good, 2008; Kaplan et al., 2007; Urano et al., 2009; Renault et al., 2010) suggesting that AtGAD4 is involved in response to those environmental stresses. In chapter 3, the expression of PtaGADs in different abiotic stresses is analyzed in order to see if PtaGAD5 and PtaGAD6 respond to stress. GABA immunolocalization in different organs of Populus support the importance of GABA synthesis in the vascular system in stem and root. GABA signal is primarily located in differentiating xylem supporting the hypothesis that GABA is involved in xylogenesis. This signal is usually higher in young regions of the organs (apical stem and roots). Furthermore, the localization of GABA in the radial parenchyma and phloem suggest that GABA transport exist between tissues and organs. Additionally, GABA signal was observed in leaf mesophyll which may support the hypothesis of GABA synthesis associated to other cell processes such as ion flux regulation or as protective role in photosynthetic tissues. CAPITULO 7 127 temperatures in poplar leaves, which has been described previously in thylakoid membranes of tobacco (Heber et al., 1971),. Poplar usually grows near river banks, so adaptive mechanism to flooding stress is supposed to be evolved in this species. Limiting oxygen by soil flooding of plant roots (Subbaiah and Sachs, 2003) induces fermentative metabolism (Kennedy et al., 1992) and causes a decreased of growth in plants. Decrease in height growth and increasing in the expression of alcohol dehydrogenase (ADH) gene were observed in poplar plants after 72 hours of flooding treatment, indicating that fermentative metabolism is enhanced in poplar plants under this treatment. Besides an increased expression of ADH, previous studies also observed an induction of GAD gene expression in hypoxic environment in Arabidopsis (Miyashita and Good, 2008). It has been proposed that induction of GAD expression may be a mechanism to mitigate the cytosolic acidosis (Roberts et al., 1984; Aurisano et al., 1995) caused by flood stress since protons are consumed in the reaction catalyzed by GAD (reviewed in Kinnersley y Turano, 2000). Hybrid poplar plants subjected to flood stress also showed induction of some PtaGAD genes. PtaGAD5 and PtaGAD3 showed similar expression patterns than ADH, an increase of their transcript levels in roots and stems, indicating, as expected, that these are the organs most affected by the stress. So, PtaGAD5 and PtaGAD3 genes showed a clear response to stress by flooding, being PtaGAD5 more sensitive to stress as showed greater induction respect to control than PtaGAD3. On the contrary, PtaGAD2 gene showed an opposite expression pattern to PtaGAD3 and PtaGAD5 genes during treatment. PtaGAD2 and PtaGAD5 genes show opposite expression patterns in stem both under normal and stress conditions, suggesting that there may be a negative effect PtaGAD2 on PtaGAD5 as PtaGAD2 is the majority in stem in normal growth and PtaGAD5 is not expressed, and when PtaGAD2 expression decreases during stress PtaGAD5 expression increases. It has been reported that, at metabolic level, the catabolism of GABA is occurring during hypoxia, but without changes at transcriptional level of GABA-T (Miyashita and Good, 2008). The results also showed a decrease in gene expression of GABA shunt in Populus. The drought and salt treatments cause very similar responses in plants because both of them trigger cellular dehydration. The decrease of height growth of plants is a response caused by these conditions (Bharvaga y Sawant, 2013). Drought and salt stress in poplar caused similar phenotypic responses decreasing growth in height, and molecular responses in the stress marker genes used (ATAF1 in salt treatments and CAPITULO 7 128 XERICO in drought). Another plant mechanism in response to dehydration stress is to increase ABA levels (Thomashow, 1999). ABA is a plant hormone capable of regulating gene expression. Certain GAD genes of orange tree presented several regulatory sequences of ABA response in their promoters (Liu et al., 2014), whose expression increases in response to ABA (Zhuang et al., 2010; Liu et al., 2014). In agreement with this, the in silico analysis of the promoters of the poplar GADs genes showed that PtGAD1, PtGAD2 and PtGAD5 have several possible ABA response ciselements, so these genes might be potential targets of stresses that cause an increase in ABA levels. PtaGAD1 gene expression increased in all organs and times analyzed being the most susceptible PtaGAD gene to dehydration stress. The increased of PtaGAD1 gene expression in stresses which cause an increase of ABA may be due to PtaGAD1 is a PtaGAD with the greatest number of ABA response elements in its promoter, suggesting that its expression is ABA-dependent. The rest of PtaGADs did not show significant changes in their expression except PtaGAD5 and PtaGAD2, which increased their expression in stem under salt and drought treatments in short-term, but only PtaGAD5 showed high expression in long-term treatments. In addition, PtaGAD5 gene expression varies depending on the intensity of stress, so a higher salt concentration in the medium increased expression of PtaGAD5. PtaGAD5 showed a dose-dependent response as was proposed previously considering its possible orthologue of Arabidopsis (AtGAD4) (Renault et al., 2010). These results suggest that PtaGAD5 might increase its expression in response to stress to help mitigate damages and not as a result of metabolic disturbance caused by the treatment. Dehydration stress can not only cause changes at the transcriptional level, but it also induce an increase of intracellular calcium (Kinnersley and Turano, 2000), that could lead to an increase in GAD activity. GABA produced by this activation might accumulate to act as compatible osmolyte or it might be catabolized through the GABA shunt. Our results showed an increased in transcript levels for the GABA shunt genes under salt and drought stress. Renault et al., (2010) postulated that GABA accumulation does not appear responsible for salt stress tolerance, if not the proper functioning of the GABA shunt may provide stress tolerance. So, to tolerate dehydration stress is important GABA production by GAD due to its physicochemical properties, as the proper functioning of the GABA shunt. Capítulo 8 Materiales y métodos CAPITULO 8 131 Estudios bioinformáticos: búsqueda de secuencias GADs y realización de los árboles filogenéticos La única especie del género Populus de la que se dispone la secuencia completa de su genoma es la de Populus trichocarpa, por ello todos los estudios bioinformáticos se realizaron con la versión 3.0 de este genoma disponible en la base de datos Phytozome v10.3 (www.phytozome.net). Los análisis de búsqueda de los genes PtGADs se realizaron mediante BLASTs (Altschul y col., 1997) utilizando una secuencia consenso de GAD de angiospermas obtenida del alineamiento de las secuencias de aminoácidos de treinta y cinco GADs pertenecientes a los principales grupos taxonómicos de angiospermas (GAD angiospermas). Adicionalmente, se utilizaron secuencias proteicas de GADs conocidas y caracterizadas previamente (Arabidopsis thaliana y Oryza sativa). El gen PtGAD1 posee varios productos génicos pero sólo la secuencia de uno de ellos (Potri.012G039000.2) corresponde a los ESTs encontrados en la base de datos del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). El punto isoeléctrico y la masa molecular de cada una de las proteínas codificadas por los PtGADs se estimaron en Expasy (Expert Protein Analysis System) disponible en www.expasy.es. Mediante el programa MEGA (v6.06) (Tamura y col., 2013) y seleccionando el algoritmo Muscle se realizaron los alineamientos entre las secuencias aminoacídicas GADs. Las cajas de identidad añadidas en los alineamientos se realizaron con el programa Boxshade (v3.2), las cajas negras reflejan identidad y las cajas grises, similitud. Los árboles filogenéticos se generaron a partir del análisis de reconstrucción de filogenia mediante el método estadístico de Maximun Likelihood en MEGA. Los valores boostrap se obtuvieron a partir de 1000 combinaciones posibles. Análisis de las secuencias promotoras La presencia de elementos reguladores en los promotores de los genes PtaGADs fueron analizados en secuencias de 1500 nucleótidos corriente arriba desde el ATG que marca el inicio de la transcripción. Los posibles elementos cis de las secuencias promotoras fueron identificados con los programas de bases de datos de elementos reguladores en plantas denominados PLACE (Higo y col., 1999) y PlantCARE (Lescot y col., 2002). Se tuvieron en cuenta, en su mayoría, cajas promotoras de un tamaño mayor de 6 nucleótidos, ya que la probabilidad de encontrarlas al azar una vez en la secuencia promotora escogida (1500 pb) era (0,37) menor a 1. CAPITULO 8 132 Análisis de las secuencias CaMBD Las secuencias GAD de los diferentes taxones pertenecientes al linaje verde fueron localizadas por BLASTP (de proteínas) (Altschul et al., 1997) en el sitio web del NCBI. Todas las secuencias consideradas GAD fueron validadas por la presencia de motivos y residuos claves de las GADs de plantas (Molina-Rueda et al., 2010 y referencias allí). Las predicciones de estructura secundaria se realizaron por Jpred3 (Cole et al., 2008). El porcentaje de similitud entre las proteínas se calculó por alineamientos por parejas de secuencias utilizando el algoritmo “Needle” en EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Material biológico Para este estudio se han empleado plantas del híbrido Populus tremula x P. alba (clon INRA 717-1B4). Se tomaron esquejes de plantas adultas y se transfirieron a vermiculita (sustrato inerte de silicatos). Las plantas se regaron con solución de Hocking (Hocking, 1971) suplementada con 1mM de NH4NO3, ya que en estudios previos se ha considerado como una concentración de nitrógeno adecuada para el crecimiento normal de Populus (Cooke y col., 2005; Pitre y col., 2007). La mayoría de las plantas se mantuvieron en invernadero con luz natural (horario de primavera en hemisferio norte) con temperatura controlada (16-30ºC) hasta que alcanzaron una altura media de 80 cm. Las muestras se recolectaron en el mes de julio del 2013. Varias plantas se mantuvieron en condiciones controladas de temperatura (24ºC) y de luz (ciclo de 16h de luz a 150 μmoles de fotones.m-2.s-1 y 8 h de oscuridad) en el laboratorio. Estas plantas se utilizaron para recolectar nervadura y mesófilo de las hojas (Capítulo 3). Recolección de muestras de Populus en condiciones normales Para recolectar las diferentes muestras se ha considerado que la hoja 1 es la primera hoja (desde el ápice) que mide al menos 0,5 cm en su parte más ancha, siendo el entrenudo 1 la región del tallo entre los nudos 1 y 2 que vienen definidos por las hojas 1 y 2 respectivamente. Teniendo en cuenta este criterio, para analizar la expresión de las GADs y otros genes se recolectaron las siguientes muestras: 1) cuatro grupos de hojas, hojas jóvenes de los nudos 4 y 5, del 6 al 8, 9 y 10 y por último las hojas más maduras situadas en los nudos que van de la posición 11 a la 13; 2) cuatro grupos de peciolos correspondientes a las hojas recolectadas descritas en el punto 1; 3) región del CAPITULO 8 133 tallo de los nudos 4 al 10 y de los nudos 10 al 14; 4) de la región del tallo situada entre los nudos 14 y 20, se separó la corteza del xilema (xilema más médula); 5) raíces apicales, que corresponden a aquellas más blanquecinas y por lo tanto menos lignificadas, y raíces basales, más lignificadas; y 6) flores femeninas de árboles adultos dispuestas en amentos con las cápsulas cerradas (flor joven) y flores femeninas en la que las cápsulas de los amentos están abiertas y se observan las semillas (flor madura). Todos estos tejidos fueron recolectados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC hasta su procesamiento. Adicionalmente, de plantas crecidas en el laboratorio, se tomaron hojas 4 y 6, y hojas 8 y 9 para separar el nervio principal y nervios secundarios de mayor grosor de las zonas del mesófilo (región que aún contenía algunos nervios de menor rango) Tratamientos de estreses abióticos En los experimentos de estrés se recolectaron las siguientes muestras: 1) dos tipos de hojas, hojas 4 y 5, correspondiendo a hojas en desarrollo y expansión, denominadas hojas jóvenes, y hojas 9 y 10, que son hojas maduras totalmente expandidas; 2) región del tallo entre los nudos 4 y 10; y 3) raíz enriquecida en regiones jóvenes poco lignificadas. Los experimentos se realizaron a corto plazo siendo los puntos de muestreo 1, 8, 24 y 72h. Por cada punto de muestreo se recolectaron las muestras arriba indicadas de dos plantas tratadas y dos plantas controles. Los tejidos recolectados se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80ºC hasta que fueron procesados. El estrés por temperatura se realizó en cámaras de crecimiento (Ibercex). Plantas de 80 cm se aclimataron durante 1 semana a las nuevas condiciones de luz (ciclo de 16h de luz a 150 μmoles de fotones.m-2.s-1 y 8 h de oscuridad) a 24ºC. Las plantas se expusieron a 39ºC para generar el estrés por calor. Estas se regaron con solución de Hocking 1mM NH4NO3 para evitar que se produjera otros tipos de estrés como estrés salino, debido a la concentración de sales en el sustrato, y/o sequía provocada por la evaporación de agua en altas temperaturas. Para el estrés por frío las plantas se mantuvieron a 10ºC durante las 72h del experimento. En paralelo, por cada punto de muestreo del estrés por calor y frío, se recolectaron los mismos tejidos de dos plantas controles (24ºC). Así, en total se recolectaron muestras de 8 plantas sometidas a 39ºC, 8 plantas a 10ºC y 8 plantas a 24ºC. CAPITULO 8 134 El resto de tratamientos de estrés se realizaron en el invernadero con luz natural y a una temperatura media de aproximadamente 24 ºC. Para simular el estrés por inundación, los maceteros de las plantas fueron sumergidos en agua hasta rebasar en 2 ó 3 cm el nivel superior del sustrato. El estrés por sal se generó regando las plantas con solución de Hocking (1mM de NH4NO3) más 300 mM de NaCl. En el estrés por sequía, las plantas fueron transferidas a maceteros con vermiculita seca. Crecimiento de raíces en cultivo in vitro A partir de plántulas de P. tremula x P. alba de aproximadamente 10 cm de altura crecidas en cultivo in vitro, se tomaron fragmentos del tallo, que contenían 2 nudos, y se colocaron en placas controles, con medio ½ Murashige y Skoog (MS; Murashige y Skoog, 1962) con una concentración final 1mM de nitrato, 0,5 mM de amonio, 3% de sacarosa y pH 5.8, y en placas con el mismo medio que las controles suplementadas con glutamato, GABA, alanina o aspartato a una concentración final 2 mM y pH 5.8. Las placas se colocaron en vertical y se mantuvieron durante 28 días en ciclo de 16h de luz a 150 μmoles de fotones.m-2.s-1 y 8 h de oscuridad a 24ºC. Las raíces se midieron a los 7, 14, 21 y 28 días. Extracción de ARN y análisis de los mensajeros mediante qPCR La extracciones de ARN se realizaron a partir del tejido pulverizado en nitrógeno liquido y siguiendo el protocolo de Chang et al. (1993). La integridad del ARN se observó en geles de agarosa, además de tener en cuenta los ratios de 260/280 obtenidos por el Nanodrop 2000. Para asegurarse que las muestras de ARN no contiene ADN genómico, se trataron con DNasa (RQ1 RNase-Free DNase, Promega corporation) siguiendo el protocolo del fabricante. La síntesis de cDNA se llevo a cabo con el kit High-Capacity cDNA reverse transcription (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del kit. La reacción de cDNA incluye pequeños cebadores (random primers), pero además se añadió oligo dT anclado (Eurogentec) a una concentración final de 2,5 M, de esta manera se asegura que las regiones 3´ de los mensajeros se retrotranscriben a cDNA, ya que los cebadores para el análisis de los genes de estudio se encuentran diseñados en esta región. Los análisis de expresión mediante PCR en tiempo real (qPCR) se llevaron a cabo con el termociclador LightCycler 480 (Roche Applied Science, Indianapolis IN) usando SYBR Green I Master mix (Roche). Las reacciones se realizaron acorde a las instrucciones del fabricante, en las que se añadió 10 ng de cDNA CAPITULO 8 135 en un volumen final de 20 l. De cada muestra se realizaron tres réplicas técnicas, y por cada pareja de cebadores se introdujo un control negativo (sin cDNA), para comparar las curvas de melting entre las muestras y el control negativo y observar que el producto obtenido es resultado de la amplificación del mensajero. Los tamaños de los amplicones de cada gen y los controles negativos se comprobaron en geles de agarosa. El programa de qPCR consiste en 45 ciclos de: desnaturalización a 95ºC durante 10 segundos, hibridación de los cebadores a 60ºC durante 15 seg y extensión a 72ºC durante 12 seg, en cada ciclo. Los cebadores de los genes fueron diseñados teniendo en cuenta la secuencias de P. trichocarpa y los ESTs disponibles de cada uno de los genes en diferentes genotipos de Populus, entre ellos y preferentemente el del híbrido utilizado, P. tremula x P. alba. El cebador sentido se diseñó en la región codificante del gen y el antisentido en la región 3´UTR. Para el diseño de cebadores se utilizó el programa Primer3plus (www.primer3plus.com) (Tabla 1). El tamaño de los amplicones oscila entre 70 y 200 pb. Tabla 1. Información de los cebadores empleados en los estudios de expresión. Gen Cebador sentido (5´3´) Cebador antisentido (5´3´) GAD consenso TGGTGGATGAGAACACAATCTG CCCACTGACATTGATACTCTTCAC PtaGAD1 (Glutamato descarboxilasa 1) CTGTACTGGAGGCGGCTTGC AGCAGGATGAGATTGATGCTCAGA PtaGAD2 (Glutamato descarboxilasa 2) AACAAGAGAGATTATTACAGCTTGG AGGA GATTGATTAGCAACACTAGCTCAACA TCA PtaGAD3 (Glutamato descarboxilasa 3) AGAAGGAAGCTGCGGCCAATA CCAGCTCAATCCATCATGATCTTTCC PtaGAD4 (Glutamato descarboxilasa 4) GAAAACTGCTCTAGAGACCCAGAG G AATATAATCACAACCACACCGGCATT T PtaGAD5 (Glutamato descarboxilasa 5) TCTCTAGAAGGAAAGAATGGCACT GT ACGCAGTAGCTAGGCAGATCTAACA PtaGAD6 (Glutamato descarboxilasa 6) GCCGCTGAAACGCAAAGGGA TTTGAGCAGGGTTCTCTTTCAATCG GABA-T (GABA transaminasa) TGGCACCTTTCACTGCTGGC GTGCACCAAAGACCAGCAAGAG GABP (Permeasa mitocondrial de GABA) GCTTGCTGGTCCTAATTGGGCA ACACTGGTTGTAACAGCCCACTG CAPITULO 8 136 SSADH (Succínico semialdehído deshidrogenasa) TGGACGGGAAGGCTCCAAGT TGCCCTGTTTGCTGGTCATCT GLYR1 (Glioxilato reductasa 1) AGAAGGCCAGAAGCATGGGATTG AGGGCTGCAAACCAAGTCCG GLYR2 (Glioxilato reductasa 2) CCCACTCCAATTGCAGCAGCT ACACGAGTTTGCTCAGGATTGCA GAT1 (Tranportador plasmático de GABA) GCGGTTGCAGCGGTAAGACA GCTACTAATAATGTGAGCCCATATGC C MBF1C TGGAGAGAGTGCTAGGCGTGA TCGAAGGTAATTGGGGTTGCCC ADH (Alcohol deshidrogenasa) GGGTCTGAGGTGCATTATTCGCA TCGAAAGCCAAGGCCTCCATG XERICO TACATGCCCTCTTTGCAGGACT GCCCGATGCACTCACGTAAA ATAF1 AGAAGAACAGCTTAAGGCTGGATG CGTCGGATTCGCTTTCTTGACG HK1 (Ribonucleoproteina nuclear) AGTGGTGCGAGTGGCTTTCAAC TCAGACGAACCACAGGAAAGGG HK3 (Elongina C) CGAGTTCGTGATCCACAAGGAAGC CTGGAGAAGTGAGCATGTTGCG HK11 (proteina dedo de zinc tipo C2H2) TAGCAGCAGCTATGTGGCTGAG TCAGCAGTGTTGGCCATGTCAC HK17 (familia proteica endonucleasa/exonucleasa/ fosfatasa ) TTCGCTGCAAGCCTAGACCAAG TCCAGGTCGGTCATTCATTGCC GS1.2 (Glutamina sintetasa 1.2) GGAATTGAGTATTGGAAGATGATG G TATGTTCATAAATGATCAACAGCC PAL (Fenilalanina amonio liasa) GTCCCATTATCCTACATTGCTGG ACCATGGAAGCCAAACCAGAACC ASN3 (Asparragina sintetasa 3) AGACCCTGCTTCTGGAGACC ATGCCGTCCAACATGTCC AAT(Aspartato aminotransferasa) TACCAGGGTTTTGCTAGTGGT TGCACCATGAATAGGTGGATT PT-AAT (Aspartato aminotransferasa origen procariota) GCTTCGAGTTGCAATTTGTC GGGTTGCATCAGCCAGCC IDHc(Isocitrato deshidrogenasa citosólica) GGAGGTTATGTATGGGCATG CTGTTTGTGCTGGTTTCACC