Implicación de las células mesenquimales multipotenciales derivadas del tejido adiposo humano en la patogénesis del síndrome metabólico

Tesis Doctoral Wilfredo Oliva Olivera Málaga, Febrero de 2016 Universidad de Málaga Facultad de Medicina Departamento de Medicina y Dermatología Implicación de las células mesenquimales multipotenciales derivadas del tejido adiposo humano en la patogénesis del síndrome metabólico AUTOR: Wilfredo Oliva Olivera http://orcid.org/0000-0003-3473-7898 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es UNIVERSIDAD DE MÁLAGA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y DERMATOLOGÍA TESIS DOCTORAL IMPLICACIÓN DE LAS CÉLULAS MESENQUIMALES MULTIPOTENCIALES DERIVADAS DEL TEJIDO ADIPOSO HUMANO EN LA PATOGÉNESIS DEL SÍNDROME METABÓLICO Memoria presentada por Wilfredo Oliva Olivera para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Málaga, Febrero 2016 El trabajo de investigación que se expone en la presente Tesis ha sido realizado por el licenciado en biología WILFREDO OLIVA OLIVERA en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de Málaga (IBIMA) durante los años 2011-2015, contratado por el CIBERobn y bajo la dirección de: Dr. FRANCISCO JOSÉ TINAHONES MADUEÑO Dra. RAJAA EL BEKAY RIZKY Este trabajo fue cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo RegionalFEDER y financiado por las subvenciones del Ministerio de Sanidad de España (PI13/02628; PI12/02355; FIS PI14/00696; PI12/01373) y del Ministerio Regional de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía (PII-CTS-08181; CTS-7895). Índice 1 ÍNDICE Abreviaturas ..................................................................................................... 5 Resumen ........................................................................................................... 8 Índice de Tablas y Figuras …………………………………………………..…...9 I-PLANTEAMIENTO GENERAL Y JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO ............ 11 II-INTRODUCCIÓN 1-Definición, Nicho e Identidad de las Células Mesenquimales Multipotenciales…. ........................................................................................... 14 2-Propiedades Funcionales de las Células Mesenquimales Multipotenciales .. 26 3-Determinación, Diferenciación Adipogénica y Celularidad Adiposa .............. 38 4-Condicionantes Tisulares Asociados a la Disfunción Tisular Adiposa: estrés oxidativo, hipoxia e inflamación. ....................................................................... 47 5-Deterioro Adipogénico del Tejido Adiposo .................................................... 55 6-Deterioro Microvascular en la Obesidad ....................................................... 60 7-Fibrosis Tisular Adiposa ................................................................................ 65 III-HIPÓTESIS y OBJETIVOS .......................................................................... 71 IV-MATERIALES Y MÉTODOS 1-Reclutamiento y Agrupamiento de los Sujetos .............................................. 74 2-Aislamiento y Expansión de la Fracción Vascular Estromal Derivada del Tejido Adiposo Visceral y Subcutáneo ............................................................. 75 3-Caracterización Inmunofenotípica por Citometría de Flujo............................ 77 4-Diferenciación Adipogénica ........................................................................... 78 5-Ensayo de Susceptibilidad a la Apoptosis ..................................................... 79 Índice 2 6-Determinación del Tiempo de Doblaje Poblacional ....................................... 80 7-Ensayo de Unidades Formadoras de Colonias Fibroblásticas ...................... 81 8-Ensayo de Formación de Túbulos Endoteliales por las ASCs ...................... 82 9-Ensayo de Quimiotaxis de las ASCs Inducido por el SDF1α ........................ 82 10-Obtención del Medio de Cultivo Condicionado por las ASCs ...................... 83 11-Evaluación de la Bioactividad del Medio Condicionado por las ASCs sobre la Supervivencia y Formación de Túbulos por las HUVECs. ............................... 84 12-Determinación de la Concentración de Citoquinas Secretadas por las ASCs… ............................................................................................................ 86 13-Extracción del RNA ..................................................................................... 87 14-Síntesis del DNA Complementario y qPCR ................................................. 88 15-Extracción de Proteínas Citoplasmáticas y Western Blot ............................ 90 16-Análisis Estadístico ..................................................................................... 92 V-RESULTADOS 1-Implicación de las ASC Visceral y Subcutáneo en la Remodelación Tisular Adiposa ........................................................................................................... 93 1.1-Caracterización antropométrica y perfil metabólico de los sujetos.......... 93 1.2-Disminución de los niveles de expresión del RNAm GLUT4 en las ASC visceral y subcutáneo de sujetos SM ............................................................ 93 1.3-La disminución del RNAm GLUT4 en las ASC visceral y subcutáneo está correlacionada con el incremento de los niveles de expresión de proteínas fibróticas. ....................................................................................................... 98 1.4-Menor susceptibilidad a la apoptosis, pero mayor tiempo de doblaje poblacional en las ASC de sujetos SM ....................................................... 101 Índice 3 1.5-Incremento del potencial clonogénico y de la concentración del FGF2 retenido en la superficie de las ASC subcutánea de los sujetos NoSM ...... 104 2-Contribución de las ASC Visceral y Subcutáneo a la Disminución de la Capacidad Angiogénica del Tejido Adiposo ................................................... 106 2.1-Disminución de la capacidad de formación de túbulos e incremento de los niveles de expresión de NADPH oxidasa en las ASC visceral y subcutáneo de sujetos SM ............................................................................................. 106 2.2-Disminución de los niveles de secreción del VEGF por las ASC subcutáneo de los sujetos SM durante la diferenciación adipogénica ........ 110 2.3-Incremento transcripcional de citoquinas inflamatorias durante la diferenciación adipogénica de las ASC subcutáneo de los sujetos SM ...... 113 2.4-Efectos del medio de cultivo condicionado por las ASC visceral y subcutáneo sobre la supervivencia y tubulogénesis de células endoteliales….. ........................................................................................... 116 3-Efectos de la Hipoxia sobre la Respuesta Neovascular e Inflamatoria de las ASC Visceral según el Perfil Metabólico de los Sujetos ................................. 118 3.1-Capacidad de formación de túbulos y niveles de secreción del VEGF y HGF en las ASC visceral bajo condiciones de hipoxia................................ 118 3.2-Las ASC visceral de sujetos SM mostraron un incremento del porcentaje de células CD140b+ y de la capacidad de migración bajo condiciones de hipoxia ......................................................................................................... 120 3.3-Alteraciones en los niveles de expresión de miembros de la familia NADPH oxidasa y de citoquinas inflamatorias en las ASC visceral expuestas a condiciones de hipoxia ............................................................................. 122 3.4-Bioactividad del medio condicionado por las ASC visceral cultivadas bajo hipoxia ......................................................................................................... 124 Índice 4 VI-DISCUSIÓN 1-Las ASC podrían contribuir a la remodelación tisular adiposa observada en sujetos obesos resistentes a la insulina: posible papel protector del FGF2 ... 127 2-Deterioro de las propiedades neovasculares de las ASC visceral y subcutáneo de sujetos obesos con resistencia a la insulina .......................... 132 3-Las ASC visceral de sujetos SM evidencian una respuesta neovascular deficiente bajo condiciones de hipoxia ........................................................... 138 VII-CONCLUSIONES ..................................................................................... 143 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 144 ABREVIATURAS Abreviaturas 5 ABREVIATURAS ADN Deoxyribonucleic acid APC Allophycocyanin ARN Ribonucleic acid ASCs Multipotent adipose tissue-derived mesenchymal stem cells BMI Body mass index C/EBPα CCAAT/enhancer binding protein CD Cluster of differentiation cDNA Complementary DNA ChREBP Carbohydrate-responsive element-binding protein Col1a1 Collagentype I alpha 1 DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA The enzyme-linked immunosorbent assay FABP4 Fatty acid binding protein 4 FBS Fetal bovine serum FCS Fetal calf serum FITC Isotiocianato de fluoresceína FN1 Fibronectin 1 GFP Green fluorescent protein HDL cholesterol High-density lipoproteincholesterol. HGF Hepatocyte growth factor HIF Hypoxia-inducible factor HLA Human leukocyte antigen HOMA-IR Homeostasis model assessment to quantify insulin resistance HUVECs Human umbilical cord vein endothelial cells Abreviaturas 6 IBIMA Instituto de Investigaciones Biomédicas de Málaga ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule-1 IgG Immunoglobulin G IL Interleukin LDL cholesterol Low-density lipoproteincholesterol. LPL Lipoprotein lipase MCP1 Monocytes chemoattractant protein MHC Major histocompatibility complex miRNAs Micro RNAs MSC Mesenchymal stem cell NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase NF-kβ Nuclear factor-kβ NG2 Neural/glial antigen 2 NoSM Sin síndrome metabólico NOX Subtipo de NADPH oxidasa Np Sujetos normopesos P S Presión sanguínea PBS Phosphate-buffered saline PDGF-D Platelet derived growth factor-D PDT Population doubling time PE Phycoerythrin PECAM Platelet endothelial cell adhesion molecule PE-Cy7 Phycoerythrin Cyanine7 tandem fluorochrome Pg picogramos PI Propidium iodide PPARγ Peroxisome proliferator actived receptor-γ R Coeficiente Rho de Spearman Abreviaturas 7 RNS Reactive nitrogen species ROS Reactive oxygen species RPL13A Ribosomal protein L13a RQ Relative quantification RT-qPCR Real-time quantitative PCR SASP Senescence associated secretory phenotype SDF1α Stromal cell-derived factor-1α siRNA Small interfering RNA SM Con síndrome metabólico SMA Smooth muscle actin SOD1 Superoxidedismutase 1 cytoplasmic SOD3 Superoxidedismutase 3 extracellular Sub Tejido adiposo subcutáneo SVF Stromal Vascular Fraction TGFβ1 Transforming growth factor β1 TGFβ-R Transforming growth factor β receptor TNFα Tumor necrosis factor-α TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling VCAM Vascular cell adhesion protein VEGF Vascular endotelial growth factor Vis Tejido adiposo visceral Índice de Tablas y Figuras 9 Tabla 1. Criterios para el diagnóstico clínico del síndrome metabólico. 74 Tabla 2. Genes evaluados por qPCR, con su respectivo código y secuencia de referencia según instrucciones de Applied Biosystem. 89 Tabla 3. Características biológicas y clínicas de los sujetos normopesos, pacientes sin síndrome metabólico y pacientes con síndrome metabólico. 94 Figura 1. Aislamiento y expansión de la fracción vascular estromal derivada del tejido adiposo. 76 Figura 2. Morfología y diversidad de tamaños de las colonias generadas por el cultivo a baja densidad de las ASCs. 81 Figura 3. Caracterización inmunofenotípica de las ASC visceral y subcutáneo en pase tres de sujetos con perfiles metabólicos diferentes. 95 Figura 4. Diferenciación adipogénica de las ASC visceral y subcutáneo durante 21 días. 97 Figura 5. Niveles de expresión del RNAm Glut4 y proteínas asociadas a la fibrosis tisular adiposa. 99 Figura 6. Expresión de proteínas involucradas en la señalización TGFβ. 100 Figura 7. Inducción de la apoptosis celular en las ASC visceral y subcutáneo de sujetos obesos con perfiles metabólicos diferentes cultivadas durante 24 horas en medio libre de suero sin y con 100 ng/mL del TNFα. 102 Figura 8. Tiempo de doblaje poblacional (PDT) de las ASC visceral y subcutáneo de sujetos normopesos y obesos con perfiles metabólicos diferentes. 103 Figura 9. Potencial clonogénico y retención del FGF2 en la superficie de las ASC visceral y subcutáneo. 105 Figura 10. Capacidad de formación de túbulos por las ASC visceral y subcutáneo. 107 Índice de Tablas y Figuras 10 Figura 11. Expresión de proteínas involucradas en el balance redox celular en las ASC visceral y subcutáneo. 109 Figura 12. Diferenciación adipogénica de las ASC visceral y subcutáneo durante seis días. 111 Figura 13. Concentración del VEGF en el medio adipogénico condicionado por las ASC visceral y subcutáneo. 112 Figura 14. Concentración del HGF en el medio adipogénico condicionado por las ASC visceral y subcutáneo. 114 Figura 15. Expresión de citoquinas inflamatorias por las ASC visceral y subcutáneo. 115 Figura 16. Bioactividad del medio condicionado adipogénico por las ASC visceral y subcutáneo. 117 Figura 17. Capacidad de formación de túbulos y secreción de citoquinas angiogénicas por las ASC visceral expuestas a hipoxia. 119 Figura 18. Caracterización inmunofenotípica de las ASC visceral cultivadas durante 72 horas bajo condiciones de normoxia (21 % O2 (g)) o hipoxia (1 % O2 (g)). 121 Figura 19. Efectos del SDF1α sobre la migración de las ASC visceral cultivadas previamente bajo condiciones de normoxia (21 % O2 (g)) o hipoxia (1 % O2 (g)). 122 Figura 20. Expresión de NOX4 y NOX5 en las ASC visceral sometidas durante 72 horas al 1 % O2 (g). 123 Figura 21. Expresión de citoquinas inflamatorias por las ASC visceral cultivadas durante 72 horas al 1 % O2 (g). 125 Figura 22. Bioactividad del medio condicionado por las ASC visceral cultivadas durante 72 horas al 1 % O2 (g). 126 PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Planteamiento General y Justificación del Estudio 11 Planteamiento General y Justificación del Estudio. El síndrome metabólico es considerado actualmente como una serie consecutiva de trastornos caracterizado por un exceso de tejido adiposo en la cavidad abdominal, hipertensión arterial, hiperglucemia en ayunas, disminución del colesterol unido a la lipoproteína de alta densidad y aumento de los triglicéridos en la sangre (Guyton y Hall, 2011). Este trastorno metabólico está estrechamente vinculado a la incidencia de diabetes tipo 2, a las enfermedades cardiovasculares (Hajer et al, 2008) y se estima que su prevalencia en los países más industrializados es de aproximadamente el 20 % de la población, llegando a superar el 40 % en las personas mayores de 60 años (Lechleiterer, 2008). Si bien el síndrome metabólico se ha concebido como una entidad no uniforme, cuya sintomatología podría ir desde un conjunto de factores de riesgo no relacionados a una constelación de factores de riesgo vinculados a través de un mecanismo subyacente común (Grundy et al, 2005), cada vez más estudios sugieren que la obesidad podría ser el factor subyacente por el que se manifiestan los componentes del síndrome metabólico (Khan, 2007). De hecho, se piensa que el incremento poblacional de la obesidad es el principal responsable de la prevalencia del síndrome metabólico y especialmente de la resistencia a la insulina que acompaña a la hiperglucemia (Grundy et al, 2004). Sin embargo, ha sido admitido que entre el 3 % y el 57 % de los sujetos obesos no desarrollan trastornos metabólicos asociados con la obesidad (Primeau et al, 2011; Plourde et al, 2014) y existen sujetos que sin ser obesos padecen de resistencia a la insulina (Conus et al, 2004; Scott et al, 2014). Planteamiento General y Justificación del Estudio 12 Es ampliamente reconocido que durante períodos de balance energético positivo, en los que la ingesta calórica supera al gasto, la mayor parte del exceso de energía generado se almacena en el tejido adiposo blanco, que tiene la propiedad de expandirse mediante el aumento del número (hiperplasia) y del tamaño (hipertrofia) de los adipocitos. De éste modo se ha sugerido que el riesgo de desarrollar síndrome metabólico probablemente no depende de la cantidad absoluta de grasa acumulada sino más bien de que la ingesta calórica sobrepase la capacidad de expansión del tejido adiposo y en consecuencia se almacene en otros órganos no adiposos como el hígado, páncrea y músculo, causando resistencia a la insulina por un mecanismo lipotóxico (Sethi y Puig, 2007). Este planteamiento, conocido como hipótesis de la expandibilidad del tejido adiposo, presupone que la capacidad máxima de expansión del tejido adiposo varía entre los sujetos y está determinada por múltiples factores como el número de preadipocitos preexistentes, los programas genéticos de adipogénesis, vasculogénesis así como la funcionalidad de otros componentes celulares dentro del tejido adiposo (Yew y Vidal-Puig, 2008; Virtue y Vidal-Puig, 2008). Aunque la resistencia a la insulina que acompaña al síndrome metabólico involucra en efecto a los tejidos adiposo, muscular esquelético y hepático, múltiples evidencias indican que la disfunción del tejido adiposo blanco también juega un papel crucial en el origen, progresión y desarrollo de la resistencia a la insulina asociada a la obesidad (Shoelson et al, 2006; Goossens, 2008; Guilherme et al, 2008). De éste modo, se ha sugerido que la preservación de la arquitectura y funcionalidad del tejido adiposo también podría contribuir a que Planteamiento General y Justificación del Estudio 13 no todos los individuos obesos desarrollen trastornos metabólicos y cardiovasculares asociados a la obesidad (Blϋher, 2009). Considerando que la funcionalidad del tejido adiposo blanco depende del estado de sus células precursoras, que va a garantizar tanto la renovación a largo plazo de los adipocitos como la disponibilidad a corto plazo de nuevas generaciones celulares comprometidas con el linaje adipogénico, la descripción de las propiedades de las células mesenquimales multipotenciales derivadas del tejido adiposo (ASCs) de sujetos con perfiles metabólicos diferentes podría contribuir a la comprensión de la patogénesis del síndrome metabólico y a prevenir los efectos a largo plazo de los tratamientos farmacológicos contra ésta patología. Debido a la alta prevalencia de la obesidad en la sociedad actual y futura (Bessesen, 2008), el grado de implicación de las ASCs en la patogénesis del síndrome metabólico podría proporcionarnos información sobre la viabilidad del tejido adiposo como fuente alternativa de células para el desarrollo de aplicaciones relacionadas con la terapia celular autóloga. INTRODUCCIÓN Introducción 19 fundamentalmente por su positividad para CD36 y negatividad para CD106 (Bourin et al, 2013). El estroma o mesénquima es un término anatómico que hace referencia al tejido conjuntivo de cualquier órgano, y está asociado a la función trófica y de sostén de los tipos celulares especializados de los órganos que se encuentran formando el parénquima (Bianco et al, 2008). Se han desarrollado numerosos estudios dirigidos a dilucidar la localización precisa y el nicho de las MSC dentro del estroma. El nicho representa el conjunto de elementos que rodean inmediatamente a las células troncales cuando están en su estado nativo e incluye células no troncales, que podrían estar en contacto directo con ellas, así como matriz extracelular y moléculas solubles (Kolf et al, 2007). De éste modo, para que un determinado sitio sea definido como nicho necesariamente tiene que proveer señales a las células troncales residentes y no limitarse a representar simplemente una localización física (Zeve et al, 2009). En general, al nicho se le considera como un microambiente dinámico que equilibra la actividad de las células troncales hacia el mantenimiento de la homeostasis y reparación tisular (Morrison y Spradling, 2008; Voog y Jones, 2011). Se ha sugerido que las MSC podrían ocupar un nicho perivascular y su identidad es la del pericito (da Silva et al, 2008). Los pericitos, también conocidos como células murales, están asociadas abluminalmente con todos los capilares vasculares y vénulas poscapilares; están implicados en la regulación del flujo sanguíneo y se ha descrito que pueden diferenciarse hacia adipocitos, osteoblastos y fagocitos (Hirschi y Introducción 20 DÀmore, 1996). Así, células perivasculares humanas derivadas del músculo esquelético, páncreas, tejido adiposo, placenta, médula ósea, que expresan marcadores reconocidos de MSC (SSEA-4; HLA-CLI; CD:10; 13; 44; 73; 90; 105; 108; 109; 164; 166; 318; 340), se han identificado prospectivamente como pericitos debido a la expresión de CD140b, CD146, NG2 y a la ausencia de expresión de marcadores de células hematopoyéticas, endoteliales y musculares (Crisan et al, 2008; Crisan et al, 2009). De hecho, se ha observado que el número de unidades formadoras de colonias fibroblásticas, cuyo valor generalmente se asocia con la presencia de células progenitoras (Bianco et al, 2008), se correlaciona positivamente con la densidad de vasos sanguíneos en el tejido adiposo equino (da Silva et al, 2009). En el caso particular del tejido adiposo, el mesénquima está contenido en lo que se conoce como fracción vascular estroma (SVF) y cuya definición más bien operativa hace referencia a una mezcla heterogénea de células que son aisladas por disociación enzimática y separada por densidad de los adipocitos que flotan durante la centrifugación (Zeve et al, 2009). La SVF adiposa está compuesta de poblaciones celulares heterogéneas que no sólo incluyen células precursoras, sino también eritrocitos, leucocitos circulantes, macrófagos residentes, pericitos, fibloblastos, células endoteliales, células musculares lisas vasculares (Shäffer y Büchler, 2007; Bunnell et al, 2008). Además, su composición final podría ser influida por las técnicas usadas para su aislamiento, la caracterización inmunofenotípica (Astori et al, 2007); así como por las condiciones de cultivo celular, alejadas de la arquitectura tisular nativa (Zeve et al, 2009) y capaces de alterar los perfiles de transcripción génica Introducción 21 (Boquest et al, 2005) e introducir cambios temporales en los marcadores de superficie celular según los pases de cultivo (Mitchell et al, 2006). Una estrategia implementada para minimizar dichas limitaciones es disociar el tejido adiposo, clasificar las células según los marcadores de superficie celular y, después de aislar fracciones celulares específicas, describir el potencial de diferenciación de las diferentes fracciones tanto in vitro como in vivo (Zeve et al, 2009). Así se ha llegado a conocer que las ASC humanas tienen un fenotipo de expresión similar al de las células estromales derivadas de la médula ósea e incluye marcadores como CDs: 9; 10; 13; 29; 34; 44; 49d; 49e; 54; 55; 59; 105; 106; 146; 166 (Gronthos et al, 2001). Usando modelos de ratones creados genéticamente para aislar progenitores adiposos, junto con métodos inmunohistoquímicos combinados con técnicas de marcaje GFP, también se ha demostrado que las células progenitoras adiposas residen en el compartimento de la célula mural de la vasculatura adiposa, coexpresando marcadores de células murales SMA, CD140b, NG2 (Tang et al, 2008; Zeve et al, 2009). Interesantemente, en estos estudios también se demostró que las células CD140b+ de la vasculatura adiposa, pero no la de otros órganos, tienen un potencial adipogénico alto y considerablemente mayor que el de las células CD140b- . Otro estudio independiente también ha sugerido la identidad pericítica de las ASC porque corroboró la presencia de una población de células estromales adiposas CD34+CD31-CD144multipotenciales que comparten marcadores de superficie celular mesenquimales (CD10; 13; 90), pericíticos (NG2, CD140a; CD140b) y estuvieron localizadas sobre la superficie exterior de los vasos del Introducción 22 tejido adiposo (Traktuev et al, 2007). Además, los experimentos de cocultivo de células CD34+CD31-CD144con células endoteliales microvasculares humanas desarrollados en este estudio permitieron confirmar la formación de redes endoteliales estables, en las que las ASC se localizaron preferentemente sobre el lado abluminal de los cordones vasculares y desarrollaron interacciones paracrinas mediadas por la secreción de citoquinas angiogénicas VEGF, HGF y FGF2. La localización perivascular de las ASC también se ha corroborado in vivo mediante el marcaje inmunofluorescente de secciones de tejido adiposo humano, en el cual se ha constatado la presencia de células STRO1+CD146+3G5+ alrededor de los vasos sanguíneos, y cuyo aislamiento y caracterización por citometría de flujo confirmó un inmunofenotipo STRO1+CD44+CD90+CD105+CD146+CD166+CD14-CD31-CD45- (Zannettino et al, 2008). Sin embargo, en otro estudio más exhaustivo, donde se caracterizaron cuatro poblaciones celulares asociadas a los vasos sanguíneos del tejido adiposo humano, se constató que los pericitos (CD146+CD34-) son las células de mayor potencial adipogénico, las células supradventiciales (CD146-CD34+) son las más abundantes, mientras que otra subpoblación (CD146+CD34+) representa más bien una población de transición entre pericitos y las células supraadventiciales (Zimmerlin et al, 2010). A pesar de que estas evidencias sugieren que los pericitos sean ASC, estudios inmunohistoquímicos indican que los pericitos son células CD34componentes del nicho y que las ASC pueden residir en la adventicia de las arterias y arteriolas comportándose más bien como células troncales vasculares en varios estados de diferenciación hacia células endoteliales y musculares lisas Introducción 23 vasculares (Lin et al, 2008). De éste modo, se piensa que las ASC existen como células CD34+CD31-CD140b-SMAen los capilares adiposos (coexistiendo con pericitos CD34-CD140b+SMA+ y células endoteliales CD34+CD31+) y en la adventicia de los vasos mayores comportándose como células troncales vasculares (Lin et al, 2010). Aunque CD34 es un marcador de célula progenitora hematopoyética reconocido ampliamente, se ha demostrado que los preadipocitos derivados del tejido adiposo subcutáneo humano están incluido en la fracción celular CD34+CD31-, que muestra características diferentes a las de las células troncal hematopoyética y mesenquimática de la médula ósea porque no forma colonias de células sanguíneas ni expresa CD105 respectivamente (Sengenès et al, 2005). Por otra parte, el monitoreo in vivo de la reconstitución de la masa grasa ha permitido identificar una subpoblación de células CD24+ progenitora de adipocitos residente en el tejido adiposo adulto (CD29+CD34+CDSca1+CD24+), que al ser inyectada a ratones lipodistróficos pudieron reconstituir los depósitos adiposos y revertir el fenotipo diabético (Rodekeffer et al, 2008). Evidencias posteriores a éste estudio han revelado que la fracción CD24- (CD29+CD34+CDSca1+CD24-), generada a partir de las células CD24+, también puede ser precursora de adipocitos ya que al dejar de expresar CD24 quedan comprometidas hacia el linaje adipogénico (Berry y Rodekeffer, 2013). La revelación del marcador o perfil de marcadores por el que se pueda identificar a las ASC aún está pendiente debido, por una parte, a que la mayoría de los marcadores no están relacionados directamente con las células troncales y son expresados sobre linajes no progenitores (Cawthorn et al, 2012) y, por otra parte, a su variabilidad temporal in vitro (Mitchell et al, 2006) Introducción 24 así como a las variaciones en la expresión de marcadores dentro del mismo linaje (Tárnok et al, 2010). La localización perivascular de las ASC y los preadipocitos parece complejizar aún más el asunto porque da lugar a la posibilidad de que el precursor para estas células pueda derivar desde fuera del tejido adiposo (Crisan et al, 2008; Cawthorn et al, 2012). Se ha sugerido que las células residentes en la vasculatura adiposa y que expresan marcadores de células endoteliales-mural (CD140b, SMA, NG2) podrían estar relacionadas con los mesoangioblastos, es decir, con células troncales pluripotenciales semejantes a las mesenquimales derivadas de pericitos asociados a las paredes de los vasos (Majka et al, 2011). A dichas células se les atribuye la generación de células progenitoras endoteliales residentes en los vasos sanguíneos pequeños del tejido dérmico, adiposo y muscular esquelético (Grenier et al, 2007). Aunque estas células no expresan marcadores hematopoyéticos, se ha confirmado la existencia de progenitores mesodérmicos primitivos (CD45-KDR+CD105+) dentro de la SVF adiposa capaces de generar colonias hematopoyéticas y a los que se les ha reconocido como hemangioblasto (Miñana et al, 2008). Aunque poco abundantes, los hemangioblastos detectados en estado posnatal tienen un potencial proliferativo a largo plazo y capacidad de diferenciación hematopoyética y endotelial tanto in vitro como in vivo (Pelosi et al, 2002). Múltiples evidencias indican que progenitores no residentes en el tejido adiposo podrían contribuir a la población de adipocitos blancos, dentro de los que destacan las células hematopoyéticas con características mesenquimales (Majka et al, 2011) y en especial las células multipotenciales derivadas de monocitos (Seta y Kuwana, 2010). Estas células podrían ser inducidas a Introducción 25 diferenciarse hacia células no fagocíticas en presencia de instrucciones asociadas al daño tisular masivo, generando células específicas del tejido y liberando varios mediadores solubles que promueven la angiogénesis y reparación tisular (Seta y Kuwana, 2007). Se ha constatado que los monocitos sanguíneos periféricos CD14+ pueden generar fibrocitos, que en sujetos sanos comprenden el 0.1-1 % de las células mucleadas circulantes (Keeley et al, 2009). Los fibrocitos son una población de progenitores semejantes a fibroblastos que han mostrado capacidad para diferenciarse hacia linajes mesenquimáticos, incluyendo adipocitos, miofibroblastos, fibroblastos (Hang et al, 2005; Hong et al, 2007) y participan en la remodelación tisular produciendo proteínas de la matriz extracelular (colágeno I, colágeno III, vimentina), secretando metaloproteinasas matriciales así como citoquinas inflamatorias, quimioquinas y factores de crecimiento que median la fibrosis (Keeley et al, 2009). Estas células también expresan un conjunto de receptores de quimoquinas, dentro de las que se encuentran CCR7 y CXCR4 (Hong et al, 2005), que parecen ser responsables del incremento en el número de adipocitos derivados de progenitores de la médula ósea descrito en ratones tratados con rosiglitazona o sometidos a dieta con contenido alto en grasa (Crossno et al, 2006). Se piensa que los fibrocitos son los precursores de la población de células derivadas del linaje mieloide observada en el estroma adiposo, acumulados preferentemente en los depósitos de grasa visceral y cuyo nivel de expresión de citoquinas inflamatorias es superior al de adipocitos blancos convencionales (Majka et al, 2011). Ha quedado demostrado que el potencial adipogénico de los fibrocitos puede ser inhibido en presencia del TGFβ y en condiciones de baja densidad de Introducción 26 cultivo en matriz extracelular de fibronectina (Hong et al, 2005). De hecho, experimentos in vitro sugieren la existencia de un circuito de señalización, asociado a la señalización SPAK/JNK, que involucra el balance delicado entre vías de diferenciación adipogénica (activadas por PPARγ) y miofibroblástica (activadas por TGFβ), y cuyo estado de activación dependerá del nicho bajo el que se encuentren las células (Hong et al, 2007). Desbalances entre estas vías podrían ser responsables de que los niveles elevados de fibrocitos circulantes se hayan visto asociados con el incremento de la fibrosis en estados patológicos pulmonar y cardiaco (Keeley et al, 2011). 2-Propiedades Funcionales de las Células Mesenquimales Multipotenciales. Propiedades Inmunomoduladoras. Se piensa que la localización perivascular de las células mesenquimales pluripotenciales refuerza su función in vivo como estabilizadoras de los vasos sanguíneos, que ante una interrupción de la vasculatura pueden proliferar y secretar factores bioactivos dirigidos a proteger y reparar el daño tisular (da Silva et al, 2008). Algunos estudios sugieren que la secreción de citoquinas por las MSC podría tener un papel más relevante para la reparación y el mantenimiento de la homeostasis que la propia diferenciación celular (Phinney y Prockop, 2007). Evidencias procedentes de las MSC derivadas de la médula ósea han confirmado que su influencia paracrina sobre la migración y proliferación de las células endoteliales está acompañada por efectos sobre el reclutamiento específico de macrófagos CD4+CD80+ durante la cicatrización (Chen et al, Introducción 27 2008). De hecho, las MSC también poseen propiedades inmunosupresoras asociadas a la inhibición de la proliferación y función de la mayoría de las poblaciones de células inmunes incluyendo células T, células B, células NK, células T reguladoras y células dendríticas (Shi et al, 2011). Aunque se ha constatado que las ASC secretan citoquinas similares a las de las MSC derivadas de la médula ósea (Kilroy et al, 2007), dentro de las que se incluyen las citoquinas con efectos inmunosupresores (Puissant et al, 2005), parece ser que su influencia inmunomoduladoras sobre la diferenciación de las células dendríticas humanas es más potente (Ivanova-Todorova et al, 2009). Estudios in vivo han corroborado que la administración de ASC en la encefalomielitis autoinmune experimental crónica no sólo induce la neurogeneración local incrementando el número de progenitores oligodendrocitos endógenos, sino también suprimiendo la respuesta autoinmune mediante el ajuste de la citoquina tipo Th2 secretada por los linfocitos T (Constantin et al, 2009). Experimentos in vitro también han demostrado que las ASC pueden inhibir la proliferación y la producción de citoquinas inflamatorias por los linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+, mientras estimulan la generación de linfocitos T reguladores CD4+CD25+ capaces de suprimir las respuestas específicas de los linfocitos T ante colágenos asociados al desarrollo de la artritis reumatoide (González-Rey et al, 2010). Por otra parte, las ASC son capaces de activar el estado anti-inflamatorio e inducir la secreción de IL10 por los macrófagos porque la infusión sistémica de macrófagos, previamente cultivados en interacción con las ASC o en el medio condicionado derivado del cultivo de las mismas, inhibe la colitis crónica y Introducción 28 protege de la sepsis severa a los ratones experimentales (Anderson et al, 2012). Propiedades Neovasculares. Los estudios dirigidos a esclarecer la identidad de las ASC también han puesto de manifiesto el papel de estos precursores celulares en la remodelación microvascular mediante su función neovascular. Así, las ASC humanas que han sido aisladas, expandidas en cultivo celular, marcadas con fluorocromos e inyectadas hacia el mesenterio de ratas han evidenciado no sólo un inmunofenotipo perivascular (según la expresión de marcadores de pericitos vasculares: SMA y NG2), sino también han contribuido a incrementar la densidad vascular después de 60 días de su inyección (Amos et al, 2008). El potencial neovascular de las ASC también se ha constatado después de su trasplante a los modelos de extremidad isquémica de ratones, donde han inducido el incremento del flujo sanguíneo, la densidad capilar y han contribuido a la recuperación del daño muscular (Moon et al, 2006). Cada vez más estudios confirman la capacidad que tienen las ASC para influir sobre el comportamiento de las células del linaje endotelial. A diferencia del medio condicionado procedente del cultivo de células estromales derivadas de médula ósea humana, el de células estromales adiposas puede estimular la proliferación de las HUVECs aún cuando en ambos medios se detectan citoquinas como el HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) e inhibidores de metaloproteinasas 1 y 2 (Verseijden et al, 2010). Las interacciones paracrinas que establecen las células precursoras adiposas con las células del linaje endotelial pueden contribuir a la reparación endotelial, pues se ha observado Introducción 35 Al parecer, los miembros de la familia de receptores nucleares PPAR están involucrados en la activación génica durante la expresión VEGF pues en modelos de cocultivo de células endoteliales/intersticiales se ha corroborado que la activación farmacológica de PPARα y PPARγ conduce a la formación de túbulos endoteliales a través de un mecanismo dependiente del VEGF (Biscetti et al, 2008). Quizás por ello se ha observado que la inhibición de la diferenciación adipogénica, también dependiente del PPARγ, en los preadipocitos murinos implantados aborta no sólo la formación del tejido adiposo sino también la formación de nuevos vasos sanguíneos (Fukumura et al, 2003). Experimentos a nivel de organismo han constatado que la masa de tejido adiposo puede ser regulada mediante la vasculatura, pues el tratamiento con agentes anti-angiogénicos conduce a la pérdida del tejido adiposo y reducción del peso de forma reversible y dosidependiente (Rupnick et al, 2002). Interesantemente, la inhibición de la angiogénesis por anticuerpos que bloquean al VEGFR2 en el modelo in vivo de cámara en la piel dorsal de ratón (Fukumura et al, 2003) o por la administración subcutánea de anticuerpos monoclonales anti-VEGF en ratones a partir de los cuales se desarrolla un modelo ex vivo de tejido adiposo intacto (Nishimura et al, 2007) reduce la angiogénesis y la diferenciación de los preadipocitos. Parece ser que éste fenómeno depende de un mecanismo que incluye la interrupción de la señalización VEGF-VEGFR2 en las células endoteliales (Fukumura et al, 2003) y el bloqueo de las interacciones que probablemente tienen lugar entre los vasos sanguíneos, las células CD34+/CD68+ y los preadipocitos (Nishimura et al, 2007). En efecto, el cocultivo de células endoteliales HUVECs con Introducción 36 preadipocitos 3T3-L1 ha confirmado que la potenciación mediada por las células endoteliales sobre la diferenciación adipogénica de los preadipocitos requiere la activación previa del VEGFR2 en las células HUVECs (Lai et al, 2009). Aunque se desconoce el mecanismo por el que las células endoteliales podrían ejercer sus efectos potenciadores de la diferenciación en un contexto adipogénico, estudios anteriores han corroborado la influencia que ejercen las células endoteliales sobre el comportamiento de los preadipocitos. Desde los años noventa se ha constatado que el medio condicionado derivado del cultivo de células endoteliales estimula la proliferación de los preadipocitos (Lau et al, 1990), sin que existan diferencias entre los efectos proliferativos ejercidos por las células endoteliales microvasculares derivadas del tejido adiposo omental y subcutáneo (Hutley et al, 2001). También se ha corroborado que las células endoteliales microvasculares liberan componentes de la matriz extracelular que promueven la diferenciación de los preadipocitos (Varzaneh et al, 1994), pero que a su vez biomoléculas como la endotelina-1 inhiben de una manera dosidependiente el almacenamiento de lípidos así como la expresión de la enzima lipogénica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa durante la diferenciación adipogénica de las células precursoras humanas (Hauner et al, 1994). La influencia dual, tanto inhibitoria como estimuladora, de las células endoteliales sobre la adipogénesis de las células precursoras sugiere que las células endoteliales pudieran ejercer una función moduladora dependiente de contexto sobre las células precursoras durante los períodos de balance energético positivos/negativos del organismo. De hecho, se ha observado que la disminución significativa en la diferenciación adipogénica de las células Introducción 37 estromales adiposas cocultivadas con células endoteliales está acompañada por el incremento de la expresión de factores involucrados en la señalización Wnt, especialmente del ligando Wnt1 (Rajashekhar et al, 2008), que es reconocida ampliamente por su implicación en la especificación de linajes. Quizás por ello las células endoteliales bajo condiciones de hipoxia liberan citoquinas, distintas al VEGF, que sostienen la viabilidad de los preadipocitos (Frye et al, 2005) u otras como el SDF1 que estimula la quimiotaxis y diferenciación de las células CD34+/CD31derivadas del tejido adiposo humano hacia el linaje endotelial, contribuyendo de éste modo al desarrollo de la red vascular durante la expansión tisular adiposa (Sengenès et al, 2007). Cada vez más evidencias corroboran que la función del endotelio va más allá de representar una barrera permeable entre la sangre y los órganos, pues también actúa como un regulador maestro del crecimiento y desarrollo de los óganos (Tirziu y Simons, 2009). Además, ha sido ampliamente reconocido que, debido a la propiedad del tejido adiposo de crecer durante la mayor parte de la vida adulta, la microcirculación tisular adiposa es única dentro del sistema vascular (Crandall et al, 1997), llegando a ser lo suficientemente extensa como para que cada adipocito sea rodeado por uno o más capilares (Lijnen, 2008). Estudios de microscopía electrónica in vivo han corroborado que la diferenciación capilar concurre durante los estados tempranos de adipogénesis en los preadipocitos perivasculares (Hausman y Richardson, 2004), pues parece ser que la angiogénesis es necesaria para contrarrestar la hipoxia surgida como resultado de la expansión tisular adiposa (Rutkoski et al, 2009). De éste modo, la neovascularización y la adipogénesis son actualmente reconocidos como procesos acoplados espacial y temporalmente durante toda Introducción 38 la vida del organismo (Cao, 2007) y cuya coordinación garantiza la plasticidad del tejido adiposo o propiedad de éste tejido para evidenciar expansión y regresión durante la vida adulta según el balance energético del organismo (Christiaens y Lijnen, 2010). 3-Determinación, Diferenciación Adipogénica y Celularidad Adiposa. Determinación Adipogénica. Antes que las células adquieran sus características especializadas mediante la diferenciación, tienen que comprometerse con cierta vía de diferenciación y destino celular a través de la determinación celular (Alberts et al, 2004). Sólo recientemente se ha comenzado a dilucidar algunos de los factores implicados en la determinación celular adipogénica. Así, se ha identificado a la proteína dedos de zinc Zfp 423 como un regulador transcripcional de la determinación hacia preadipocitos (Gupta et al, 2010). La aplicación de técnicas inmunohistoquímicas para la expresión de GFP conducida por Zfp 423 in vivo ha confirmado su relevancia para la determinación hacia preadipocitos y el origen perivascular de los mismos (Gupta et al, 2012). Otras proteínas dedos de zinc parecen estar involucradas en el compromiso de las MSC hacia los linajes mesenquimáticos. Se ha demostrado que Zfp 521 actúa como un regulador clave del compromiso y diferenciación adipogénica inhibiendo la expresión de Zfp 423 y favoreciendo la conversión hacia el linaje osteogénico (Kang et al, 2012), como también se ha demostrado para Zfp 467 mediante la aplicación de técnicas de RNA interferencia (You et al, 2012). Aunque estudios puntuales han documentado los efectos activadores del micro RNA-143 (Esan etal, 2004) e inhibitorios del micro RNA-27 (Lin et al, 2009) y Introducción 39 micro RNA-138 (McGregor y Choi, 2011) sobre los propios factores de transcripción adipogénicos, la descripción de perfiles moleculares han permitido vincular a los micro RNAs con la determinación celular mesenquimal porque han revelado 18 micro RNAs que podrían promover la adipogénesis reprimiendo la señalización WNT y otros 29 micro RNAs que parecen tener el efecto contrario (Qin et al, 2010). Múltiples evidencias indican que la señalización WNT tiene un papel destacado en controlar la adipogénesis; como por ejemplo, WNT 10B que mantiene a los preadipocitos en un estado indiferenciado a través de la inhibición de factores de transcripción adipogénicos (Laudes, 2011). Diferenciación Adipogénica. Una vez que las células precursoras se han comprometido con el programa adipogénico, ante señales específicas se activa una cascada transcripcional que conduce al estado de diferenciación terminal asociado con la expresión de genes metabólicos (FABP4, Glut4) y adipoquinas (leptina y adiponectina) característicos del adipocito (Cristancho y Lazar, 2011). Ha quedado establecido que el control transcripcional de la adipogénesis incluye la activación secuencial de los C/EBPs y PPARγ; donde la función fundamental de C/EBPβ y δ es inducir la expresión del PPARγ mediante la unión de los C/EBPs a sitios del promotor PPARγ, cuyo gen es responsable de inducir a C/EBPα y del establecimiento de un lazo de retroalimentación positiva dentro de la cascada en la que la expresión de PPARγ y C/EBPα se refuerzan mutuamente, garantizando el mantenimiento del estado diferenciado (Rosen y Spiegelman, 2000). Introducción 40 De éste modo, PPARγ no solamente es crucial para la adipogénesis sino también es requerido para el mantenimiento del estado diferenciado; mientras que C/EBPα es necesario para la adquisición de la sensibilidad a la insulina, pero no para la acumulación de lípidos (Rosen y MacDouald, 2006). Estudios genómicos de los adipocitos maduros han confirmado que PPARγ y C/EBPα están presentes en el 60 % de todos los genes inducidos durante la diferenciación terminal (Cristancho y Lazar, 2011). Aunque experimentos in vitro han comprobado que los preadipocitos derivados del tejido adiposo humano pueden no requerir de la división celular para entrar en la diferenciación adipogénica (Entenmann y Hauner, 1996), actualmente se reconoce que la expansión clonar es un requisito para la subsecuente diferenciación (Farmer, 2006). Se piensa que la adipogénesis requiere dos rondas de divisiones celulares para reorganizar la cromatina facilitando la inducción de genes adipogénicos o debido a que componentes de la maquinaria del ciclo celular son necesarios para la expresión de genes adipogénicos (Farmer, 2006). Celularidad Adiposa. Ha quedado establecido que la proliferación y diferenciación adipogénica asociada a la expansión acelerada del tejido adiposo humano presenta uno de sus valores máximos después del nacimiento, seguido por otro menor antes de la pubertad, entre los nueve y los 13 años de edad (Frühbeck, 2008). Sobrepasada estas etapas, se estima que la tasa media anual de recambio de adipocitos es de 8,4 ± 6,2 % y que la mitad de los adipocitos son reemplazados cada 8,3 años (Kirsty et al, 2008). Introducción 41 En el caso particular del tejido adiposo parece ser que sus células precursoras no sólo garantizan la renovación celular y el reemplazamiento de las células diferenciadas que han concluido su ciclo de vida, sino que además participan directamente en la función tisular adiposa al ser reclutados durante períodos de balances energéticos positivos del organismo. De hecho, es ampliamente reconocido que la expansión del tejido adiposo es resultado tanto del incremento del tamaño de los adipocitos (hipertrofia) como del aumento del número de adipocitos debido al reclutamiento de células precursoras (hiperplasia). Esta propiedad lo convierte en el único tejido capaz de cambiar su masa en varios órdenes de magnitud durante la etapa adulta, pudiendo variar desde 2-3 % del peso corporal en atletas de élite hasta el 60-70 % del peso corporal en sujetos obesos masivamente (Hausman et al, 2001). Así, un hombre normopeso de 70 kilogramos de peso corporal tendría unos 15 kilogramos de tejido adiposo; mientras que uno obeso de 140 kilogramos habría aumentado su tejido adiposo hasta los 80 kilogramos (Nelson y Cox, 2009). Debido en parte a la capacidad que tienen los adipocitos de variar en tamaño desde 20 micrómetros a 200 micrómetros de diámetros con volúmenes que van desde unos picolitros a aproximadamente 3 nanolitros, se estima que 1 gramo de tejido adiposo contiene aproximadamente 800 miligramos de triacilglicerol y 100 miligramos de agua, (Frühbeck, 2008). Sin embargo, estudios morfológicos del tejido adiposo durante los períodos de incremento y bajada de peso corporal inducido por la dieta han sugerido que, una vez alcanzado el tamaño medio del adipocito, se activan eventos que favorecen el incremento del número de adipocitos ya que los animales que retornan a sus pesos normales Introducción 42 mediante una dieta de adelgazamiento lo hacen disminuyendo el tamaño medio de sus adipocitos y manteniendo el número de adipocitos alcanzado durante el período de ganancia de peso (Faust et al, 1978). La aplicación de técnicas radioautográficas ha permitido demostrar que el incremento del número de adipocitos en la grasa epididimal y retroperitoneal de ratas alimentadas con dietas de alto contenido de azúcares y lípidos es resultado de la proleferación y diferenciación de los precursores de adipocitos (Miller et al, 1984). Parece ser que los adipocitos hipertrofiados secretan citoquinas que inducen la proliferación de los preadipocitos, pues se ha encontrado una correlación positiva entre la gama de tamaños de adipocitos de los tejidos inguinales y epididimales de ratas obesas y la capacidad de su medio condicionado para estimular la proliferación de los preadipocitos (Marques et al, 1998). La aplicación de un sistema de cultivo en cámaras de gradiente, que facilitó compartimentar células 3T3-L1 según su grado de diferenciación, ha permitido corroborar que los adipocitos maduros y de mayor tamaño secretan citoquinas mediante las que activan la adipogénesis de los preadipocitos vecinos (Lai et al, 2012). Mientras que estudios in vivo en modelos de ratón ob/ob han confirmado que la tasa de proliferación se incrementa significativamente hasta un 4.8 % (Rigamonti et al, 2011). Se estima que la formación de nuevos adipocitos humanos desde los precursores tiene lugar una vez que los adipocitos alcanzan la capacidad máxima de hipertrofia de unos 1000 picolitros (Frühbeck, 2008). De éste modo, ha quedado aceptado que tanto la hipertrofia del adipocito como la hiperplasia ocurre en asociación con el balance energético positivo durante el crecimiento normal y el desarrollo de la obesidad, Introducción 43 con la hipertrofia precediendo cíclicamente a la hiperplasia (Hausman et al, 2001). Si bien se ha demostrado que la ganancia aproximada de 1,6 kilogramos de tejido adiposo subcutáneo de la región inferior del cuerpo de jóvenes normopesos conduce a la generación de 2,6 billones de nuevos adipocitos en ocho semanas, también se han constatado diferencias regionales en los mecanismos celulares asociados al incremento de la masa adiposa durante la sobrealimentación (Tchoukalova et al, 2010). En efecto, los sujetos emparejados por su índice de masa corporal pueden diferir considerablemente respecto a la distribución de su grasa corporal (Thomou et al, 2010). En general, el tejido adiposo está distribuido en múltiples depósitos en el cuerpo y los adipocitos no sólo se distribuyen subcutáneamente e internamente sino también adyacentes o embebidos en nódulos linfáticos y músculo esquelético (Trayhurn, 2007). Aproximadamente el 80 % de toda la grasa corporal está en el área subcutánea, fundamentalmente en la región del fémur, glúteos y en la pared abdominal anterior y posterior; mientras que la grasa visceral representa entre el 10-28 % de la grasa total en los hombres y el 5-8 % en las mujeres premenopaúsica, pero suele incrementar durante el envejecimiento en ambos sexos (Ibrahim, 2009). La grasa subcutánea, que no está limitada por restricciones anatómicas, puede expandirse hacia el exterior, tiende a crecer por el incremento del número de células adiposas y su función de almacenamiento energético es más a largo plazo, asociada al embarazo; mientras que la grasa visceral, más restringida anatómicamente, suele expandirse más por el aumento del tamaño de sus células adiposas, cuya Introducción 44 función de almacenamiento lipídico es más a corto plazo, y se ha vinculado a las actividades de caza durante la evolución humana (Thomou et al, 2010). Teniendo en cuenta que el tamaño de un órgano depende del número y volumen de las células que contiene así como de la cantidad de fluido y matriz extracelular (Conlon y Raff, 1999), considerando que en el tejido adiposo la matriz extracelular se limita a la lámina basal que rodea al adipocito (Ross y Pawlina, 2006), entonces podría pensarse que la masa tisular adiposa es en última instancia resultado del número y tamaño de sus células adiposas. Por consiguiente, los condicionantes implicados en las variaciones regionales de la expansión adiposa deben ejercer sus efectos influyendo tanto en el tamaño como en la tasa de supervivencia y proliferación celular. La aplicación de técnicas de formación de colonias (en los que cada colonia fue derivada de una única célula precursora) ha permitido demostrar durante los años ochenta que las células perirrenales derivadas del tejido adiposo de ratas se replican más rápidamente, independientemente de la edad del animal, que los precursores epididimales (Djian et al, 1983). Esta variabilidad dependiente de los subtipos poblacionales inherentes a cada depósito, y no tanto a influencias extrínsecas al tejido, también se ha visto confirmada en la grasa omental humana cuando se clonaron dos subtipos de preadipocitos que se distinguieron por su velocidad de proliferación (Kirkland et al, 1993). Además, el índice apoptótico de los preadipocitos omentales cultivados en ausencia de suero y bajo los efectos del TNFα fue mayor que el de los preadipocitos derivados de los depósitos subcutáneo (Niesler et al, 1998). El análisis de colonias derivadas una sola célula ha confirmado que la proporción de células diferenciadas, la acumulación de lípidos, la actividad de la glicerol-3-fosfato Introducción 51 llegar a representar el 8,8 ± 1,1 % (Clèment et al, 2004) y el 11 % de la fracción vascular estromal (Curat et al, 2004). Aproximadamente el 90 % de todos los macrófagos del tejido adiposo de sujetos obesos está localizado en los sitios de muerte necrótica de los adipocitos (Harford et al, 2011) y una pérdida drástica de peso puede conducir a una disminución significativa en el número de macrófagos y al mejoramiento del perfil inflamatorio de los pacientes (Cancello et al, 2005). Los adipocitos parecen contribuir a la infiltración de los macrófagos hacia el tejido adiposo ya que se ha corroborado que la incubación de las células endoteliales derivadas del tejido adiposo con medio condicionado de adipocitos conduce a una sobreexpresión de moléculas de adhesión de células endoteliales e incremento de la quimiotaxis de los monocitos sanguíneos (Curat et al, 2004). Sin embargo, experimentos en modelos de ratones obesos alimentados con dieta de alto contenido graso han corroborado que la infiltración de linfocitos T hacia el tejido adiposo precede a la acumulación de macrófagos (Kintscher et al, 2008; Nishimura et al, 2009). Se piensa que los linfocitos T CD4+ (Kintscher et al, 2008) y linfocitos T CD8+ (Nishimura et al, 2009) promueven el reclutamiento y la activación de los macrófagos en el tejido adiposo. Interesantemente, los macrófagos reclutados hacia el tejido adiposo durante los períodos de balance energético positivo representan una subclase de macrófagos con propiedades diferentes a los que residen en el tejido, caracterizados por sobreexpresión de genes que codifican para IL-6, sintasa inducible óxido nítrico (iNOS) y receptor 2 de quimioquina CC (CCR2) (Lumeng et al, 2007). Mientras que los macrófagos detectados en el tejido adiposo subcutáneo de pacientes sometidos a pérdida drásticade peso fueron marcados positivamente para la proteína anti-inflamatoria IL-10 Introducción 52 (Cancello et al, 2005). Evidencias reveladas a partir de experimentos in vitro han permitido confirmar que los macrófagos pueden ajustar reversiblemente su fenotipo funcional asociado a la expresión de CD163 y CD206 (Porcheray et al, 2005), según la composición de citoquinas (IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10), la combinación de citoquinas y otros estímulos activadores como los lipopolisacárido (Mosser and Edwards, 2008). Actualmente los macrófagos se clasifican en dos grandes grupos que se diferencian en la composición de las moléculas presentes en su superficie celular, los estímulos que los activan y en su comportamiento pro-inflamatorio y anti-inflamatorio (Rees, 2010). Los macrófagos clásicos (M1) son estimulados por IFNγ sólo o en combinación con lipopolisacáridos, produciendo citoquinas inflamatorias (IL-1, IL-6, TNFα), especies reactivas de oxígeno e induciendo respuesta de células T Th1; los macrófagos activados alternativamente (M2) son inducidos por IL-4, IL-13, producen IL-10, TGFβ y receptor antagonista de IL-1 (IL-1Ra), dirigidas a disminuir la respuesta inflamatoria y promover la respuesta de células Th2 (Zeyda and Stulnig, 2007). Además, los macrófagos M2 secretan TGFβ1 y PDGF que inducen la diferenciación de los fibroblastos hacia los miofibroblastos, estimulan su proliferación y la síntesis de colágeno fibrilar intersticial (Murray y Wynn, 2011). Si bien la caracterización funcional de los subtipos de macrófagos ha quedado relativamente establecida, su identificación inmunofenotípica a través de marcadores de superficie celular permanece elusiva. Aunque se ha propuesto que proteínas como CD206, CD209 y CD163 sean consideradas marcadores de macrófagos M2, se debe tener en cuenta que macrófagos catalogados como M2 por expresar integrina α5β5, CD1b, CD1c (Zeida and Stuling, 2007) Introducción 53 también son capaces de producir citoquinas inflamatorias que podrían contribuir al desarrollo de la resistencia a la insulina (Zeyda et al, 2007). Además, no se han encontrado cambios significativos en el número de macrófagos CD163+ y CD206+ por la obesidad, sino más bien un incremento en la proporción de macrófagos CD40+ respecto a los CD163+ y a los CD206+ (Aron-Wisnewsky et al, 2009). Por otra parte, un estudio llevado a cabo en mujeres obesas ha detectado la presencia de macrófagos CD11+ CD206+ proinflamatorios asociados con la resistencia a la insulina, con niveles elevados de expresión de moléculas presentadoras de antígeno, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα y ligando-3 de quimioquina CC (Wentworth et al, 2010). De éste modo, los miles de receptores de superficie que presentan los macrófagos, la multiplicidad de estímulos bajo cuya influencia se encuentran los mismos y la posibilidad de que los propios macrófagos modifiquen su comportamiento mediante mecanismos autocrinos limitan las aproximaciones actuales sobre el estudio de los subtipos poblacionales de macrófagos (Rees, 2010). Por ello, se piensa que los macrófagos representan un espectro de fenotipos activados más bien que unas subpoblaciones discretas estables (Murray y Wynn, 2011). Si bien los macrófagos son necesarios durante la iniciación de la inflamación en el tejido adiposo inducida por la dieta, parece ser que el mantenimiento de la inflamación durante la obesidad depende de la inmunidad adaptativa (Chawla et al, 2012). La presencia de linfocitos T CD4+, unido al hecho de que la mayoría de los macrófagos infiltrados en el tejido adiposo fueron positivos al HLA-DR, ha puesto de manifiesto la contribución de los linfocitos T CD4+ al estado de activación de los macrófagos mediante la secreción de IFNγ (Kintscher et al, 2008). Las células T efectoras CD8+ también parecen contribuir Introducción 54 al reclutamiento de macrófagos y a la inflamación del tejido adiposo en la obesidad, pues estudios in vivo han corroborado que tanto el agotamiento inmunológico como genético de células T CD8+ en ratones obesos alimentados con dieta alta en grasa disminuye la infiltración de macrófagos y los niveles de expresión de citoquinas proinflamatorias Il-6 y TNFα (Nishimura et al, 2009). Mientras que otro estudio in vivo ha revelado la participación de las células T CD4+ en la progresión de las anormalidades metabólicas asociadas a la obesidad, pues cuando son transferidas hacia ratones con obesidad, inducida por dieta y libre de linfocitos, pueden revertir la ganancia de peso y la resistencia a la insulina fundamentalmente a través de células TH2 (Winer et al, 2009). Por consiguiente, el tejido adiposo parece ser un sitio activo donde los macrófagos llevan a cabo la presentación de antígenos a las células T CD8+ y células T CD4+ mediada por moléculas MHC clase I y clase II respectivamente (Chawla et al, 2012). De acuerdo a todas estas evidencias, la acumulación de especies reactivas del oxígeno, la hipoxia tisular y la inflamación del tejido adiposo son condicionantes tisulares asociados a la obesidad, imbricados estrechamente y cuya permanencia a largo plazo contribuye a la disfunción tisular adiposa. Así, la expansión del tejido adiposo conlleva la formación de áreas tisulares hipóxicas (Regazzetti et al, 2009), generadores de especies reactivas de oxígeno mitocondrial (Carriére et al, 2004). El propio incremento en los niveles de ácidos grasos acumulados durante la expansión tisular adiposa estimula la producción de ROS en las células adiposas a través de la activación de la NADPH oxidasa (Furukawa et al, 2004). A su vez, especies reactivas como el H2O2 inducen en los preadipocitos la expresión de citoquinas inflamatorias Introducción 55 como el TNFα y MCP-1 dependiente de la activación del NF-kβ por mediación de p53 (Minamino et al, 2009). Tanto las condiciones prooxidativas como los altos niveles de TNFα e hipoxia pueden suprimir fuertemente la expresión de GPx3 adiposa y en consecuencia generar un círculo vicioso por el que se expande la acumulación de ROS (Sok et al, 2008), promoviendo aún más la inflamación (Iozzo, 2009). 5-Deterioro Adipogénico del Tejido Adiposo. Es bien conocido que el establecimiento del estrés oxidativo, la hipoxia tisular y la inflamación afecta el funcionamiento del tejido adiposo y especialmente su capacidad de expansión. Múltiples evidencias han corroborado los efectos negativos de dichas condiciones tisulares en el mantenimiento del estado diferenciado de los adipocitos y en la generación de nuevas células adiposas. Así, la infiltración de macrófagos hacia el tejido adiposo puede afectar la expansión tisular a través de su influencia paracrina sobre la diferenciación adipogénica ya que tanto los preadipocitos (Lacasa et al, 2007) como en particular las células CD34+/CD31- (Bourlier et al, 2008) tratados con medio condicionado procedente de macrófagos muestran una reducción marcada de la adipogénesis. Parte de estos efectos podrían ser atribuido al TNFα, pues desde hace más de una década se ha venido corroborando que es uno de los principales mediadores implicados no sólo en la inducción de la desdiferenciación y delipidación de la célula grasa madura sino también en la inhibición de la diferenciación adipogénica (Petruschke and Hauner, 1993; Prins et al, 1997; Hube and Hauner, 2000; Kras et al, 2000) por un mecanismo dependiente de Wnt 10b (Isakson et al, 2009). Introducción 56 El TGFβ es otra de las citoquinas implicadas en la disminución de la diferenciación adipogénica, como ha quedado demostrado en cultivos primarios de células precursoras de adipocitos humanos (Petruschke et al, 1994). Según un estudio desarrollado en células estromales de médula ósea humana, la inhibición hipóxica de la adipogénesis requiere la activación de la señalización TGFβ/Smad (Zhon et al, 2005). Además, la hipoxia puede inhibir la diferenciación adipogénica reprimiendo la activación del promotor de PPARγ2 por mediación de la expresión del factor de transcripción CHOP-10/GADD153 estimulada por la generación de especies reactivas del oxígeno mitocondrial (Carriére et al, 2004). Existen evidencias en las que se ha corroborado que la generación de ROS afecta a la diferenciación adipogénica influyendo sobre los niveles de expresión de factores transcripcionales adipogénicos ya sea directa o indirectamente por la activación de proteínas de señalización intracelulares sensibles a redox (Gummerbach et al, 2009) y la estimulación de la secreción del TNFα por las propias células precursoras (Minamino et al, 2009). Por otra parte, variaciones en los perfiles de expresión de micro RNAs de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2 han puesto de manifiesto la implicación de 11 micro RNAs durante la disminución de la diferenciación adipogénica (Ortega et al, 2010). El deterioro funcional del tejido adiposo parece estar acompañado por la remodelación de la arquitectura tisular, fundamentalmente asociada con alteraciones en los porcentajes de adipocitos con tamaños diferentes. De éste modo se ha constatado que el incremento en los niveles de citoquinas inflamatorias como el TNFα, IL6 y en la sensibilidad a la proteína-c-reactiva que presentan los pacientes obesos diabéticos está correlacionada positivamente Introducción 57 con el volumen medio de los adipocitos (Bahceci et al, 2007). Mientras la secreción de éstas y otras citoquinas inflamatorias como la IL-8, proteína quimioatrayente de monocitos-1, proteína-10 inducible por interferón-γ, proteína 1β inflamatoria de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos, IL-1ra está correlacionada positivamente con el incremento del volumen de los adipocitos (Skurk et al, 2007). Otro estudio más reciente ha evidenciado que aunque los tamaños de las células adiposas se distribuyen bimodalmente, con un 47 % en una población celular grande y las restantes en una población celular pequeña, el diámetro medio de las células adiposas grandes no está asociada con la expresión de genes inflamatorios sino más bien es la fracción de células adiposas pequeñas la que se correlaciona positivamente con la expresión de genes inflamatorios, fundamentalmente en los individuos resistentes a la insulina (McLaughlin et al, 2010). La disminución de la expresión de genes que codifican para las proteínas adipogénicas PPARγ1, PPARγ2, Glut4 se ha visto asociada con el aumento en el porcentaje de adipocitos pequeños/grandes detectada en sujetos obesos resistentes a la insulina en (McLaugklin et al, 2007), que en pacientes diabéticos tipo 2 puede incrementarse hasta un 27 % (Pasarica et al, 2009). Estudios funcionales in vivo han confirmado que la tasa baja de generación de adipocitos se asocia con la hipertrofia del tejido adiposo, de modo tal que los sujetos con hipertrofia generan 70 % menos adipocitos por año (Arner et al, 2010). De hecho, la disminución de adipocitos totales descrita en pacientes diabéticos tipo 2 está asociada tanto al aumento del porcentaje de adipocitos hipertrofiados como al incremento en la fracción de adipocitos pequeños (Pasarica et al, 2009). Quizás por todo ello es que el tamaño de los adipocitos Introducción 58 subcutáneos permite predecir la incidencia de la diabetes tipo 2 en la vida adulta (Weyer et al, 2000; Lönn et al, 2010) y que los efectos beneficiosos de los tratamientos con pioglitazona sobre la sensibilidad a la insulina se han visto asociados no sólo al incremento de la gama de tamaños celulares dentro de la categoría de adipocitos hipertrofiados sino también al aumento en un 25 % del número absoluto de adipocitos pequeños (McLaughlin et al, 2010). Por otra parte, parece probable que la remodelación del tejido adiposo subcutáneo pueda tener implicaciones para el funcionamiento y celularidad del tejido adiposo visceral y la distribución de la grasa corporal en general. En efecto, un estudio llevado a cabo en mujeres obesas resistentes a la insulina ha constatado que el diámetro de las células grandes del tejido adiposo subcutáneo se correlacionó significativamente con el incremento en la proporción de células pequeñas tanto en el tejido adiposo subcutáneo como en el visceral (Liu et al, 2009). Otro estudio desarrollado en adolescentes obesos también ha confirmado que los sujetos con obesidad visceral presentan mayor proporción de adipocitos pequeños y mayor hipertrofia que los sujetos con obesidad periférica (Kursawe et al, 2010). Parece ser que la masa grasa y la distribución de grasa corporal tienen más influencia sobre el perfil metabólico de los sujetos que el tamaño de los adipocitos (Mundi et al, 2010). Múltiples evidencias indican que independientemente de la masa grasa corporal total, el incremento en la acumulación de grasa visceral y la disfunción del tejido adiposo están asociadas con la obesidad resistente a la insulina (Klöting et al, 2010). De éste modo, el hecho de que no todos los pacientes con obesidad desarrollen diabetes tipo 2 se ha atribuido en parte al sitio donde se acumula la grasa Introducción 59 (Eckel et al, 2011). Así quedó corroborado en un estudio donde se describe que la grasa del tronco confirió, a diferencia de la grasa corporal inferior, una correlación positiva con los factores de riesgos asociados a la obesidad fundamentalmente en los hombres (Vega et al, 2006). Otro estudio de seguimiento desarrollado durante 10-11 años en americanos japoneses no diabéticos evidenció que el área grasa intraabdominal permanece como un predictor significativo de la resistencia a la insulina futura (Hayashi et al, 2008). Se ha sugerido que uno de los principales vínculos entre la obesidad y la resistencia a la insulina es la capacidad limitada de expansión del tejido adiposo subcutáneo respecto a la expansión de otros depósitos grasos y la deposición de grasa ectópica en el músculo esquelético e hígado (Huffman and Barzilai, 2009). Los resultados obtenidos en experimentos desarrollados en ratones transgénicos ob/ob han sugerido que la expansión inapropiada del tejido adiposo subcutáneo es un fenómeno subyacente a la resistencia a la insulina, pues la sobre-expresión de adiponectina en los ratones trangénicos permitió que el incremento de sus adiposidad tuviera lugar fundamentalmente en los depósitos subcutáneos, acompañado de una disminución tanto de la infiltración de macrófagos como de la inflamación sistémica (Kim et al, 2007). Experimentos in vivo, usando técnicas de trasplante tisular, han demostrado que la adición de grasa subcutánea hacia la cavidad visceral mejora significativamente la tolerancia a la glucosa; mientras que la de grasa visceral a la cavidad visceral tiende a deteriorar la tolerancia a la glucosa (Thien et al, 2008). Estos resultados han permitido a sus autores proponer que la grasa subcutánea es intrínsecamente diferente de la grasa visceral y produce sustancias que pueden actuar sistémicamente para mejorar el metabolismo de Introducción 60 la glucosa. Además refuerzan la opinión más generalizada de que la grasa visceral presenta mayor carácter proinflamatorio que la grasa subcutánea (Huffman and Barzilai, 2009). Quizás por ello se ha recomendado identificar los factores que controlan la angiogénesis del tejido adiposo y la deposición de tejido adiposo hacia depósitos grasos diferentes para dilucidar la patogénesis que vincula la obesidad y la diabetes tipo 2 (Eckel et al, 2011). 6-Deterioro Microvascular en la Obesidad. La rarefacción, las alteraciones en la proporción pared/lumen y las alteraciones en el tono vasomotor son los tres fenómenos que generalmente se incluyen en la disfunción microvascular, y que contribuyen al incremento de la resistencia vascular periférica asociada a la hipertensión (Jonk et al, 2007; Serné et al, 2007). Las alteraciones en el tono vasomotor, a las que se les suele denominar disfunción endotelial, son definidas como una reducción en la disponibilidad de óxido nítrico, vinculada a modificaciones en la señalización insulínica de las células endoteliales que favorecen el desbalance entre el agente vasodilatador óxido nítrico y el vasoconstrictor endotelina-1 (Jansson, 2007). En el caso particular de las células endoteliales microvasculares subcutáneas de sujetos diabéticos tipo 2, se ha corroborado que dichas alteraciones incluyen al substrato receptor insulínico-1, a la vía fosfatidil inositol 3 quinasa así como incrementos en la actividad MAPK (Gagg et al, 2009). Al parecer, uno de los mecanismos fisiopatológicos implicados en la disfunción microvascular asociada a la obesidad podrían ser los efectos inhibitorios de los ácidos grasos libres y el TNFα sobre la cascada de señalización de la insulina (Jonk et al, 2011) ya que se ha corroborado que la aplicación del TNFα e IL6 a la grasa Introducción 67 et al (2009), y su expresión en el tejido adiposo subcutáneo abdominal estuvo correlacionada positivamente con el índice de masa corporal y la masa grasa corporal (Pasarica et al, 2009). En otro estudio, durante el que se evaluó la fibrosis según los niveles de los isotipos de colágenos 1a1, 3a3 y 6a1 teniendo en cuenta su distribución alrededor del adipocito (fibrosis pericelular) y en el conjunto del tejido (fibrosis total), se pudo constatar que la fibrosis pericelular tanto del tejido adiposo subcutáneo como del omental de los sujetos obesos es superior a la de los normopesos; mientras que la fibrosis total de los obesos sólo llega a ser mayor que la de los normopesos en el depósito omental (Divoux et al, 2010). Si bien se ha corroborado que el colágeno VI es un componente importante de la membrana basal del adipocito ya que se une fuertemente al colágeno IV, mediando el anclaje de la membrana basal a las células e interactuando con otras proteínas matriciales como los proteoglucanos y la fibronectina (Mariman y Wang, 2010), también se ha constatado que su sobre-expresión, particularmente del Col 6a3, incrementa la rigidez tisular y se opone a la hipertrofia del adipocito (Halberg et al, 2009). De hecho, experimentos desarrollados en modelos de ratón por estos autores han permitido proponer que la hipoxia tisular generada durante la expansión del tejido adiposo actúa como un iniciador de la disfunción tisular adiposa induciendo el estado local de fibrosis ya que incrementa los niveles de expresión del HIF1α y que éste, en lugar de estimular la respuesta angiogénica mediante la secreción del VEGFa y la Angiopoyetina-2, activa el programa fibrótico por mediación de la proteína secretada LOX, que estabiliza las interacciones y el entrecruzamiento de los colágenos I, III y la elastina en el espacio extracelular. La restricción de la Introducción 68 hipertrofia de los adipocitos por la acumulación de colágeno fibrilar podría tener como consecuencia directa la deposición ectópica de grasa, alteraciones de la señalización de la insulina y la apoptosis del adipocito hipertrofiado debido a la activación de la vía C-jun N-terminal Kinase (JNK) asociada a las nuevas interacciones entre los componentes de la matriz extracelular y el adipocito hipertrofiado (Divoux y Clément, 2011). Quizás por ello se ha detectado una correlación fuertemente negativa de la fibrosis omental tanto con el tamaño de los adipocitos como con los niveles de triglicéridos de hombres obesos (Divoux et al, 2010). Debido a que la matriz extracelular es crucial no sólo para el mantenimiento de la integridad estructural y funcional del adipocito, sino también para la adipogénesis (Khan et al, 2009; Mariman y Wang, 2010; Divoux y Clément, 2011), las alteraciones en los patrones de síntesis y deposición de proteínas matriciales implicadas en las interacciones célula-matriz extracelular también podrían contribuir a la disminución de la diferenciación adipogénica y expansión del tejido adiposo. En efecto, se ha corroborado que los preadipocitos humanos que incrementan el contenido de colágeno formador de fibras y la rigidez de la matriz extracelular también comprometen la diferenciación adipogénica (Chun et al, 2006). Además, la inhibición in vitro de la síntesis de los Colágenos V y VI puede bloquear la adipogénesis y la acumulación de triglicéridos de un modo dependiente de la dosis (Mariman y Wang, 2010). Por otra parte, mediante experimentos in vitro también se ha demostrado que niveles endógenos de SPARC de 200 ng/mL y exógenos de 2 µg/mL pueden inhibir la adipogénesis afectando los niveles de expresión de los factores de transcripción adipogénicos PPARγ, C/EBPα y C/EBPβ, mientras que Introducción 69 simultáneamente aumenta los del factor de transcripción osteogénico RUNX2 y del gen osteocalcina (Nie y Sage, 2009). En éste mismo estudio los autores demuestran que SPARC también puede inhibir la adipogénesis potenciando la deposición de fibronectina e inhibiendo la de laminina por un mecanismo dependiente de la señalización ILK/β catenina, que aumenta los niveles de expresión del receptor de fibronectina (la integrina α5) y disminuye los del receptor de la laminina (la integrina α6). Evidencias procedentes de estudios in vivo ponen de manifiesto la contribución de la fracción vascular estromal a la fibrosis tisular adiposa, pues se ha constatado que el 80 % de muerte de los adipocitos de ratones alimentados con dieta alta en grasa no sólo coincide con la expresión máxima de genes inflamatorios y del marcador de macrófagos CD11C, sino también con la deposición extensa de colágeno (Strissel et al, 2007). Al parecer, las células de la fracción vascular estromal procedente de los depósitos visceral y subcutáneo de sujetos obesos pueden llegar a expresar de cuatro a doce veces más Col1a1, Col 3a1 y Col 6a1 que la fracción adiposa (Divoux et al, 2010). Los macrófagos podrían contribuir a dichas diferencias ya que pueden expresar la mayor parte de los colágenos, especialmente el isotipo VI (Schnoor et al, 2008), y la mayoría de los macrófagos observados en el tejido adiposo de sujetos obesos resistentes a la insulina han estado asociados a las áreas fibróticas (Spencer et al, 2010). Además, se ha observado que los niveles de expresión del Col 6a3 se correlacionan positivamente con la quimiotaxis de los macrófagos hacia el tejido adiposo y con el número de macrófagos CD68+/CD163+/MAC2+ por adipocitos (Pasarica et al, 2009). Introducción 70 Los preadipocitos también parecen contribuir significativamente a la acumulación de componentes de la matriz extracelular en el tejido adiposo, pues un estudio in vivo ha evidenciado que mientras los adipocitos del tejido adiposo sometidos a isquemia mueren a los 28 días, las células troncales/progenitoras sobreviven, se activan y contribuyen a la reparación del tejido adiposo mediante la generación de áreas fibróticas (Suga et al, 2010); que sin embargo, también podrían suprimirse por las propias células precursoras mediante la secreción del HGF inducida por el FGF2 liberado desde el tejido dañado (Suga et al, 2010) o por la activación más específica de las células precursoras CD34+CD31que proliferan, migran, forman túbulos, e incrementan la densidad capilar bajo los efectos de una mezcla de factores de crecimiento asociados al daño tisular adiposo (Eto et al, 2011). Los análisis de expresión génica indican que los preadipocitos pueden expresar más fibronectina y Col1a1 que los adipocitos y macrófagos, especialmente los derivados del tejido adiposo subcutáneo de sujetos obesos (Keophath et al, 2009). Se ha constatado que los preadipocitos tratados con medio condicionado por macrófagos evidencian una reducción marcada de la adipogénesis asociada con el mantenimiento de una matriz rica en fibronectina (Lacasa et al, 2007) e incrementan la expresión de más de 5 200 genes representativos de todas las clases de componentes matriciales, especialmente de colágeno I y fibronectina (Henegar et al, 2008; Keophiphath et al, 2009). HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis y Objetivos 71 Estímulos transitorios pueden generar respuestas celulares sostenidas, que permanecen a lo largo de generaciones celulares aún en ausencia del estímulo que las provocó (Burrill and Silver, 2010). La generación y mantenimiento de patrones heredables de transcripción génica no sólo es una característica del desarrollo de los organismos pluricelulares (Peterson, 2010) sino que también podría acontecer durante la remodelación del tejido adiposo. De hecho, evidencias recientes indican que la expresión génica del tejido adiposo subcutáneo de sujetos ex obesos no es restaurada completamente aún después de una pérdida de peso extensiva, estable, y de la diminución de la hipertrofia y la inflamación (Cancello et al, 2013). Cada vez más estudios corroboran la disminución in vitro, fuera del ambiente tisular adiposo, de la capacidad de diferenciación adipogénica de las células precursoras residentes en el tejido adiposo de sujetos obesos (van Harmelen et al, 2003; Permana et al, 2004; Isakson et al, 2009; Fernández et al, 2010; Roldan et al, 2011; Park et al, 2012). Esta alteración intrínseca en la capacidad de diferenciación adipogénica durante la obesidad parece estar acompañada por una reducción de su capacidad de diferenciación hacia otros linajes mesenquimáticos (Roldan et al, 2011; De Girolamo et al, 2013; Frazier et al, 2013; Oliva-Olivera et al, 2015), por señales de senescencia celular prematura (Tchkonia et al, 2010; Roldan et al, 2011) y por el agotamiento de las ASCs proangiogénicas (Oñate et al, 2012). Es por todo ello que mediante el desarrollo del presente estudio nos propusimos corroborar la siguiente hipótesis, llevando a cabo los objetivos que acontinuación se anunciarán: Hipótesis y Objetivos 72 Hipótesis: Las condiciones tisulares asociadas a los períodos de balance energético positivo podrían generar alteraciones en los patrones heredables de transcripción génica mediante los que las ASCs quedan predispuestas a favor del fenotipo fibrótico e inflamatorio, en detrimento de su función adipogénica y neovascular. Objetivos Generales y Específicos: 1-Dilucidar la implicación de las ASC visceral y subcutáneo en la remodelación tisular adiposa que tiene lugar en sujetos con perfiles metabólicos diferentes. 1.1-Corroborar la contribución de las ASCs a la generación de adipocitos con niveles reducidos de expresión del transportador de glucosa GLUT4. 1.2-Evaluar los niveles de expresión de proteínas fibróticas y componentes de la señalización TGF-β en las ASCs. 1.3-Describir la susceptibilidad a la apoptosis, el potencial proliferativo, clonogénico y retención superficial del FGF2 en las ASCs. 2-Revelar la contribución de las ASC visceral y subcutáneo a la disminución de la capacidad angiogénica que caracteriza al tejido adiposo durante el empeoramiento del perfil metabólico de los sujetos. 2.1-Confirmar si el empeoramiento del perfil metabólico de los sujetos está acompañado por la disminución de la capacidad de formación de túbulos por las ASCs y la alteración transcripcional de proteínas implicadas en el desbalance redox celular asociado al síndrome metabólico. Hipótesis y Objetivos 73 2.2-Describir los niveles de secreción del VEGF y el HGF durante la diferenciación adipogénica y la repercusión de la diferenciación adipogénica sobre la expresión de citoquinas inflamatorias por las ASCs. 2.3-Evaluar los efectos del medio condicionado por las ASCs, durante su diferenciación adipogénica, sobre la supervivencia y tubulogénesis endotelial. 3-Esclarecer los efectos de la hipoxia sobre la respuesta neovascular e inflamatoria de las ASC visceral de sujetos con perfiles metabólicos diferentes. 3.1-Describir la capacidad de formación de túbulos, la secreción de citoquinas angiogénicas, el inmunofenotipo y la capacidad migratoria de las ASC visceral sometidas a hipoxia. 3.2-Constatar que el incremento de los niveles de expresión de NADPH oxidasa en las ASC visceral hipóxicas está acompañado por alteraciones en los niveles transcripcionales de citoquinas inflamatorias según empeora el perfil metabólico de los sujetos. 3.3-Evaluar los efectos del medio condicionado por las ASC visceral hipóxicas sobre la supervivencia y tubulogénesis endotelial. Materiales y Métodos 77 Transcurridas aproximadamente 16 horas después de su siembra, se ejecutó el primer cambio de medio a las células adheridas en pase cero (Figura 1F) y se les permitió proliferar hasta el octavo día desde su siembra (Figura 1G). El número de células necesarias para llevar a cabo los diferentes ensayos se alcanzó mediante subcultivo celular hasta pase dos o tres, en cuyos pases se ejecutaron la mayoría de los experimentos incluidos en el estudio. La proliferación asociada a la expansión celular transcurrió en todo momento bajo condiciones estándares de cultivo a 37ºC en atmósfera húmeda y 5 % de CO2(g), con dos o tres cambios de medio por semana y hasta el 90 % de confluencia. Una vez que los cultivos alcanzaban dicha confluencia, se procedía a su subcultivo, durante los cuales las células fueron lavadas con solución salina PBS, despegadas con solución tripsina/EDTA (pH 7.0-7.6) (Sigma T-3924), cuantificadas según la técnica de exclusión con azul de tripano (0.4 %) (Sigma, T-8154) en cámara de Neubauer (Brand, 718605) y resembradas a una densidad entre 1 x 104 -1.5 x 104 células/cm2. 3-Caracterización Inmunofenotípica por Citometría de Flujo. Las células de la fracción vascular estromal cultivadas en pase dos o tres fueron caracterizadas inmunofenotípicamente por citometría de flujo según los marcadores de superficie celular CD31 (Miltenyi, 130-092-653), CD34 (eBioscience, 11-0349-42), CD44 (Miltenyi, 130-095-195), CD45 (eBioscience, 25-0459), CD73 (BD 550257), CD105 (Miltenyi, 130-094-926), CD140B (RD, FAB 1263P), CD184 (BD, 560669). Brevemente, 1 x 106 células/mL fueron resuspendidas en tampón bloqueador, compuesto por PBS suplementado con BSA al 3.0 %, e incubada durante diez minutos sobre hielo. Se alicuotaron 1 x 105 células por tubo de polipropileno y se les añadió, de acuerdo a las Materiales y Métodos 78 instrucciones del fabricante, 5.0 µL ó 10 µL de solución de anticuerpos monoclonales de ratón contra los respectivos marcadores de superficie celular, unido con su correspondiente fluorocromo PE, APC, FITC, PE-Cy7. Uno de los tubos fue destinado para el marcaje de los correspondientes controles de isotipo (IgG1-PE, Miltenyi 130-092-212; IgG1-APC, Miltenyi 130-092-214; IgG1FITC, Miltenyi 130-092-213; IgG1-PE-Cy7, eBioscience 25-4714; IgG2a PECy7 BD 557907). Todos los tubos fueron incubados durante 30 minutos sobre hielo y protegidos de la luz. Las células fueron lavadas dos veces con tampón bloqueador y finalmente resuspendidas en 1000 µL de PBS para la adquisición de 1 x 1041.3 x 104 eventos por tubo mediante un citómetro CyAnTM ADP High-speed Analyzer (Beckman Coulter). 4-Diferenciación Adipogénica. Las ASC visceral y subcutánea en pase dos o tres fueron sembradas a una densidad de 1 x 104 / cm2 en placas de 24 (Corning, 3526) y seis pozos (Corning, 3516) y se les permitió proliferar hasta el 90 % de confluencia. El medio de mantenimiento fue reemplazado por medio adipogénico, compuesto por DMEM/F12 suplementado con FBS (0.1 mL/ mL), estreptomicina (100 µg/mL), penicilina (100 U/mL), L-glutamina (2 mM), Insulina (10 µM) (Sigma, I 9278), Isobutilmetilxantina (0.5 mM) (Sigma, I5879), Dexametasona (1.0 µM) (Sigma, D8893), Pioglitazone (10 µM) (Sigma, E 6910), Rosiglitazone (0.5 µM) (Sigam, R 2408), Biotina (33 µM) (Sigma, B 4501), Pantetonato (17 µM). (Sigma, P5155). Transcurridas 72 horas, éste medio fue reemplazado durante el lapso restante de diferenciación con otro compuesto por DMEM/F12 suplementado con FBS (0.1 mL/ mL), estreptomicina (100 µg/mL), penicilina (100 U/mL), L-glutamina (2 mM), Insulina (10 µM), Dexametasona (1.0 µM), Materiales y Métodos 79 Pioglitazone (10 µM), Rosiglitazone (0.5 µM). La confirmación del estado adipogénico a los seis y 21 días se llevó a cabo mediante la tinción de los depósitos intracelulares de lípidos con solución Rojo Nilo (3 % en PBS), preparada a partir de una solución stock AdipoRed (Lonza, PT-7009), y solución de Oil Red O (30 % en PBS) (Alfa Aesar, A12989), preparada a partir de una solución stock de Oil Red O al 0.5 % en isopropanol, respectivamente. 5-Ensayo de Susceptibilidad a la Apoptosis. Las ASC visceral y subcutánea fueron resuspendidas en medio de mantenimiento y sembradas en placas de seis y 96 pozos (Corning, 3596) a una densidad de 1 x 104 / cm2. Después de ocho días bajo condiciones estándares de cultivo, se indujo la apoptosis durante 24 horas sustituyendo el medio de mantenimiento por medio α Minimum Essential Eagle´s (Sigma, M2279) libre de FBS o suplementando éste medio con 100 ng/mL de TNFα (MBL, JM-1050-10). Los efectos apoptóticos de ambas condiciones se confirmaron mediante el método TUNEL usando el kit de detección celular in situ (Roche, 11 684 817 910) y se cuantificaron por citometría de flujo a través del marcaje de fosfatidilserina con anexina V conjugada a FITC (Miltenyi Biotec, 130-092-052). Durante la aplicación del método TUNEL, las células cultivadas en placas de 96 pozos se lavaron con PBS, secaron al aire y fijaron durante una hora a temperatura ambiente con formalina neutra tamponada (Sigma, HT5011). Posteriormente se volvieron a lavar con PBS e incubaron durante cinco minutos sobre hielo con solución permeabilizadora recién preparada 0.1 % Triton X-100 (Sigma, T8787) en 0.1 % citrato de sodio (Sigma, 71497). Después de volverse Materiales y Métodos 80 a lavar con PBS, se añadió la mezcla reacción TUNEL (compuesta por nucleótidos marcados con fluoresceína y la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal) e incubó durante una hora a 37ºC en una atmósfera húmeda en la oscuridad. Finalmente, se volvió a lavar con PBS, se marcaron los núcleos con DAPI (Sigma, D9542) y se observaron mediante el microscopio de fluorescencia. Para la cuantificación por citometría las células cultivadas en placas de seis pozos fueron despegadas con solución tripsina/EDTA, lavadas con tampón de lavado y centrifugadas a 300xg durante diez minutos. El precipitado celular se resuspendió en 100 µL de tampón de lavado, se le añadió 10 µL de Anexina VFITC e incubó durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Finalmente, la células se volvieron a lavar y centrifugar a 300xg durante diez minutos, se resuspendieron en 500 µL de tampón de lavado y marcaron con 5.0 µL de solución Ioduro de Propidio inmediatamente antes del análisis por citometría de flujo. 6-Determinación del Tiempo de Doblaje Poblacional. Las ASC visceral y subcutánea en pase dos fueron sembradas por duplicado a una densidad de 3 000 células/cm2 en placas de doce pozos (Corning, 3513). Las células fueron despegadas con solución tripsina/EDTA (pH 7.0-7.6) a los cuatro, seis y ocho días de cultivo, y cuantificadas mediante la técnica de exclusión con azul de tripano en cámara de Neubauber. El tiempo de doblaje poblacional (PDT) fue calculado usando la fórmula PDT = 48/ log2 (N2/N1), donde N1 y N2 es el número de células en el día seis y ocho, respectivamente, después de la siembra. Materiales y Métodos 81 7-Ensayo de Unidades Formadoras de Colonias Fibroblásticas. Las ASC visceral y subcutánea en pase uno o dos fueron sembradas por duplicado a una densidad de 50/cm2 en placas de seis pozos y se incubaron bajo condiciones estándares de cultivo celular de 37⁰C en atmósfera húmeda de aire con 5 % CO2 (g). Transcurrido 14 días, se fijaron y tiñeron durante 15 minutos con solución de cristal violeta (0.5 % en metanol) (Panreac; 131762), se lavaron con agua destilada y secaron al aire. Durante el recuento se consideraron como colonias las agrupaciones con más de 50 células (Figura 2). Figura 2. Morfología y diversidad de tamaños de las colonias generadas por el cultivo a baja densidad de las ASCs. Transcurridos 14 días bajo condiciones estándares de cultivo celular, las colonias fueron fijadas con metanol y teñidas con cristal violeta. Barra = 250 µm. Materiales y Métodos 82 8-Ensayo de Formación de Túbulos Endoteliales por las ASCs. Se añadió 50 µL/cm2 de matrigel empobrecido en factores de crecimiento (BD, 356231) a placas de cultivo celular de 48 pozos (Corning, 3548) pre-enfriadas a 4°C e incubó durante 30 minutos a 37°C para permitir la solidificación del matrigel. Las ASC visceral y subcutánea se resuspendieron en medio basal endotelial (PromoCell; C-22220) suplementado con FCS (0.05 mL/ mL) (PromoCell, C-37350), se sembraron por duplicado a una densidad de 1 x 105 células/cm2, e incubaron durante seis horas bajo condiciones estándares de cultivo a 37ºC en atmósfera húmeda y 5 % de CO2 (g) o bajo condiciones de 1 % O2 (g), 94 % de N2 (g) y 5 % de CO2 (g) proporcionadas por el incubador de hipoxia (Thermo Scientific 3141 Series II Water Jacket) en los experimentos en los que se describe la capacidad de las ASCs visceral para formar estructuras tubulares bajo hipoxia. Transcurridas las seis horas, se procedió a examinar los túbulos por microscopía de contraste de fase fluorescente (Nikon, Japón) con objetivo 4X, seleccionando aleatoriamente y fotografiando cuatro campos por réplica. Posteriormente se cuantificaron las estructuras tubulares con ayuda del procesador de imágenes NIS Elements Nikon, considerando como túbulos aquellas cuya longitud superaron cuatros veces el ancho. 9-Ensayo de Quimiotaxis de las ASCs Inducido por el SDF1α. Las ASC visceral incubadas previamente durante 72 horas bajo condiciones de normoxia (21 % de O2 (g)) o hipoxia (1 % de O2 (g)) fueron resuspendidas en medio basal endotelial (PromoCell; C-22220) suplementado con FCS (0,05 mL/ mL) y se distribuyeron por duplicado 3 X 104 células sobre la cámara superior de las placas transwell 6,5 mm con tamaño de poro 8 µM (Corning, 3422). El espacio inferior de las cámaras estuvo ocupado o bien por medio basal Materiales y Métodos 83 endotelial suplementado con FCS (0.05 mL/ mL) y 100 ng/mL de SDF1α (RD Systems, 350-NS-010) o bien por medio basal endotelial suplementado solamente con FCS (0.05 mL/ mL). Posteriormente, se les permitió que migraran incubándolas durante 24 horas en condiciones estándares de cultivo celular. Transcurrido éste lapso, se eliminaron cuidadosamente las células no migratorias retenidas en la superficie superior de la cámara migratoria mediante un bastoncillo de algodón (cotton tip applicator) y las céluas que migraron hacia la superficie inferior de la cámara transwell fueron lavadas con PBS y fijadas incubándolas con formalina neutra tamponada durante 15 minutos. Finalmente, se marcaron los núcleos incubando las células con DAPI (2.0 µg/mL) (Sigma, D9542) y se procedió a examinar las células migradas mediante el uso del microscopio de contraste de fase fluorescente (Nikon, Japón) con objetivo 10X, seleccionando aleatoriamente y fotografiando cinco campos por réplica. El número de células migradas por condición experimental se determinó mediante el procesador de imágenes NIS Elements Nikon y las células que migraron bajo los efectos quimiotácticos del SDF1α se calculó dividiendo el número de células detectadas en presencia del SDF1α respecto a las observadas en ausencia del SDF1α tanto para las células cultivadas previamente bajo la condición de normoxia como de hipoxia. 10-Obtención del Medio de Cultivo Condicionado por las ASCs Las ASCs fueron resuspendidas en medio de mantenimiento, sembradas en placas de seis pozos a una densidad de 1.5 X 104 células/cm2 y mantenidas en condiciones estándares de cultivo durante siete-diez días. Posteriormente se Materiales y Métodos 84 substituyó dicho medio por los respectivos medio de cultivo según los diferentes ensayos. Transcurridas 72 horas, se recolectó el medio condicionado procedente del cultivo de las ASCs en las respectivas condiciones experimentales, se centrifugó a 300xg durante cinco minutos y se reservó en alícuotas de 450 µL en -80ºC hasta su uso en los experimentos de bioactividad sobre las HUVECs o para la cuantificación mediante ELISAs de las citoquinas secretadas por las ASCs. Para determinar los niveles del FGF2 presentes en la superficie celular de las ASCs, asociados a la señalización autocrina (Zaragosi et al, 2006), se lavaron las células con una solución 2.0 M NaCl (20 mM HEPES, pH 7.4) durante cinco segundos y se recolectó dicho medio de lavado según el procedimiento descrito para el medio condicionado. 11-Evaluación de la Bioactividad del Medio Condicionado por las ASCs sobre la Supervivencia y Formación de Túbulos por las HUVECs. Los efectos del medio condicionado por las ASCs, cultivadas en las diferentes condiciones experimentales, sobre la supervivencia de las células endoteliales se determinaron sembrando las HUVECs (PromoCell, C-12200) a una densidad de 1 x 104 células/ cm2 en placas oscuras de 96 pozos (Sigma, CLS 3916) en medio basal endotelial suplementado con FCS (0.05 mL/ mL) e incubándolas durante 24 horas en condiciones estándares de cultivo celular. Transcurrido éste tiempo, las HUVECs se lavaron con PBS y su medio de cultivo se substituyó por 200 µL de medio condicionado por las ASCs usando dos réplicas según las diferentes condiciones experimentales. Pasadas 72 horas de cultivo en el medio condicionado, se desecharon las células muertas mediante lavado con PBS, las que sobrevivieron y mantuvieron adheridas a la superficie de cultivo se reservaron a -80ºC durante al menos una semana para Materiales y Métodos 85 su posterior cuantificación mediante la aplicación del kit Cyquant Cell Proliferation (Invitrogen, C7026). Durante la cuantificación se descongelaron las placas oscuras de 96 pozos, se añadió 200 µL de tampón de lisis celular (Invitrogen, buffer CyQUANT/Cell Lysis) mezclando suavemente, se incubó la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente y protegida de la luz, y finalmente se midió la fluorescencia usando un lector de microplaca fluorescente (Biotek FLX800) equipado con filtro de excitación 480 nM y emisión 520 nM. La viabilidad celular se estimó por intensidad de fluorescencia, dividiendo el valor de fluorescencia emitido en los pozos donde las HUVECs se cultivaron en el medio condicionado respecto a la emitida en los pozos donde las HUVECs se cultivaron en el medio no condicionado. Para la descripción de los efectos del medio condicionado sobre la formación de túbulos por las HUVECs se procedió a recubrir placas pre-enfriadas de 96 pozos (Corning, 3596) con 25 µL de matrigel empobrecido en factores de crecimiento e incubarlas durante 30 minutos a 37ºC. A cada pozo se le añadió 90 µL del medio de cultivo condicionado por las ASCs, según las respectivas condiciones experimentales, y 25 X 103 HUVECs resuspendidas en 10 µL Medio Basal de Células Endoteliales (0 % FCS). Las células se cultivaron en condiciones estándares durante 24 horas, transcurridas las cuales se procedió a examinar los túbulos endoteliales usando microscopio de contraste de fase fluorescente (Nikon, Japón) con objetivo 4X, seleccionando aleatoriamente y fotografiando cuatro campos por duplicado para cada condición experimental. Posteriormente se cuantificaron las estructuras tubulares, considerando como túbulos aquellas cuya longitud superara cuatros veces el ancho, con ayuda del procesador de imágenes NIS Elements Nikon. Materiales y Métodos 86 12-Determinación de la Concentración de Citoquinas Secretadas por las ASCs. La secreción del FGF2, HGF, VEGF por las ASCs en los diferentes ensayos desarrollados en el estudio fue cuantificada mediante los respectivos Kits ELISAs sándwich disponibles comercialmente (R&D Systems, DFB50; DHG00; DVE00, respectivamente). Brevemente, una microplaca de 96 pozos fue recubierta por el fabricante con un anticuerpo monoclonal específico para la citoquina en cuestión. Se preparó una solución estándar a partir de diluciones sucesivas de concentración conocida que, junto con las muestras de medio condicionado o lavado, fueron pipeteados hacia los pocillos. La citoquina presente en las respectivas muestras fue unida por el anticuerpo inmovilizado (dos horas de incubación a temperatura ambiente) y, después de desechar por lavado cualquier sustancia no unida, se adicionó a los pozos un anticuerpo policlonal proporcionado por el fabricante, unido a enzima, y específico para la citoquina en cuestión (dos horas de incubación a temperatura ambiente). Después del lavado aplicado para remover cualquier reactivo enzimático no unido al anticuerpo, se añadió a los pocillos una solución de substrato (20 minutos de incubación a temperatura ambiente y en la oscuridad), que desarrolló un color en proporción a la cantidad de citoquina unida al anticuerpo monoclonal. La intensidad del color o densidad óptica de cada pozo se cuantificó usando un lector de placa (Versamax Microplate Reader) a una longitud de onda 450 nm. Los valores de concentración de las respectivas citoquinas fueron generados a partir de la curva estándar construida con los valores de concentración de la solución estándar (sobre el eje-X) y sus respectivos valores de absorbancia (sobre el eje-Y), usando el programa RESULTADOS Resultados 93 1-Implicación de las ASC Visceral y Subcutáneo en la Remodelación Tisular Adiposa. 1.1-Caracterización antropométrica y perfil metabólico de los sujetos. La Tabla 3 muestra las características clínicas de los sujetos. Los pacientes con (SM) y sin síndrome metabólico (NoSM) tuvieron significativamente mayor índice de masa corporal (BMI), circunferencia de la cintura, relación cintura cadera, ácido úrico y menor colesterol-HDL respecto a los sujetos normopesos. Los sujetos SM evidenciaron mayor deterioro en su perfil metabólico porque, exceptuando la presión sanguínea sistólica, la creatinina y la urea, todas las variables metabólicas evaluadas en estos pacientes mostraron diferencias estadísticamente relevantes respecto a uno de los grupos o a los dos grupos restantes de pacientes. 1.2-Disminución de los niveles de expresión del RNAm GLUT4 en las ASC visceral y subcutáneo de sujetos SM. Estudios desarrollados en modelos de ratón manipulados genéticamente han demostrado que la disminución de las cantidades del transportador de glucosa GLUT4 sobre la superficie del adipocito es un fenómeno lo suficientemente relevante como para provocar alteraciones en el estado metabólico de los organismos (Huang y Czech, 2007). De hecho, desde hace varias décadas se ha venido corroborando que la disminución de los niveles transcripcionales y proteicos de GLUT4 en el tejido adiposo está estrechamente vinculado a la resistencia a la insulina (Garvey et al, 1991). Resultados 94 Table 3. Características biológicas y clínicas de los sujetos normopesos (Np), pacientes sin síndrome metabólico (NoSM) y pacientes con síndrome metabólico (SM). Variable Np (n=11) NoSM (n=24) SM (n=34) Edad, años 40.73 ± 2.30 40.92 ± 1.92 44.79 ± 1.35 BMI, Kg/m2 23.39 ± 0.38 35.52 ± 1.78* 38.86 ± 1.89* Circunferencia Cintura, cm 80.55 ± 2.13 113.25 ± 3.83* 119.46 ± 4.06* Relación Cintura Cadera 0.862 ±0.02 0.922 ± 0.01* 0.948 ± 0.01* HOMA-IR 1.70 ± 0.19 2.37 ± 0.22 4.23 ± 0.28*† Insulina, μIU/mL 7.10 ± 0.78 9.92 ± 0.93 16.15 ± 1.05*† Glucosa, mg/dL 95.55 ± 2.60 92.33 ± 2.31 106.38 ± 2.39*† Triglicéridos, mg/dL 96.09 ± 14.98 109.88 ± 6.57 181.88 ± 20.70*† Colesterol-HDL, mg/dL 59.91 ± 3.83 48.75 ± 3.06* 41.68 ± 2.76*† Colesterol-LDL, mg/dL 97.18 ± 5.72 106.30 ± 7.33 134.90 ± 4.45*† Colesterol-Total, mg/dL 178.09 ± 7.15 176.63 ± 7.69 210.53 ± 7.16*† P S Sistólica, mm Hg 119 ± 5.04 127 ± 2.66 130 ± 3.10 P S Diastólica, mm Hg 73 ± 3.65 78 ± 2.03 84 ± 1.95*† Hemoglobina Glicada, % 5.36 ± 0.12 5.28 ± 0.07 5.62 ± 0.06† Apoproteína A, mg/dL 176.09 ± 7.99 155.13 ± 5.64 152.47 ± 7.53* Apoproteína B, mg/dL 80.38 ± 4.45 88.23 ± 4.88 117.99 ± 4.45*† Creatinina, mg/dL 0.71 ± 0.06 0.69 ± 0.05 0.79 ± 0.04 Urea, mg/dL 24.40 ± 1.63 27.17 ± 1.33 29.38 ± 1.61 Ácido Úrico, mg/dL 3.29 ± 0.19 4.52 ± 0.23* 5.22 ± 0.29* Valores medios ± error estándar. * Valores significativamente diferentes (MannWhitney; P < 0.05) respecto al de los sujetos Np. † Valores significativamente diferentes (Mann-Whitney; P < 0.05) respecto al de los sujetos NoSM. Resultados 95 Figura 3. Caracterización inmunofenotípica de las ASC visceral y subcutáneo en pase tres de sujetos con perfiles metabólicos diferentes. A: Porcentaje de células endoteliales CD34+CD31+ en las ASC visceral (2.59 ± 0.47) y en las ASC subcutáneo (1.71 ± 0.23). B: Porcentaje de macrófagos CD34-CD45+ en las ASC visceral (1.93 ± 0.36) y en las ASC subcutáneo (1.49 ± 0.17). C: Elevado porcentaje de células coexpresando los marcadores comúnes de células mesenquimales multipotenciales CD73 y CD105, tanto en las ASC visceral (94.49 ± 1.03) como en las ASC subcutáneo (95.82 ± 0.99) (n=11). Resultados 96 Para verificar la posible contribución de las ASC a la generación de adipocitos con niveles inferiores de expresión de GLUT4, aislamos la fracción vascular estromal adiposa según procedimientos ampliamente establecidos e indujimos la diferenciación adipogénica in vitro de las ASC visceral y subcutáneo de sujetos con perfiles metabólicos diferentes. La caracterización inmunofenotípica de las ASC visceral y subcutáneo en pase tres confirmó la ausencia de contaminación por células endoteliales CD34+CD31+ (Figura 3A) y macrófagos CD34-CD45+ (Figura 3B). Además, el número de células que coexpresaron los marcadores de células mesenquimales multipotenciales CD73 y CD105 superó el 90 % en las ASCs derivadas de ambos tejidos (Figura 3C). La tinción con rojo oleoso confirmó la acumulación citoplasmática de lípidos en las ASCs cultivadas durante 21 días en medio adipogénico (Figura 4A). El análisis de expresión génica reveló una correlación negativa estadísticamente significativa del RNAm GLUT4 de las ASC visceral y subcutáneo con el BMI y HOMA-IR de los pacientes (Figura 4B). Relevantemente, sólo las ASC visceral y subcutáneo de los sujetos SM mostraron una disminución significativa en los niveles de expresión GLUT4 respecto a las ASCs de los sujetos Np, que no estuvo acompañada por diferencias estadísticamente significativas en las cantidades de RNAm de los factores transcripcionales PPARγ y C/EBPα (Figura 4C). Además, las diferencias significativas en los niveles de expresión GLUT4 entre las ASCs de sujetos SM y NoSM se limitaron a las observadas entre las ASC subcutáneo (Figura 4C). Resultados 97 Figura 4. Diferenciación adipogénica de las ASC visceral y subcutáneo durante 21 días. A: Tinción con rojo oleoso de los lípidos acumulados en el citoplasma de las ASCs después de 21 días de cultivo en medio adipogénico. Barra = 100 μm. B: Correlación de los niveles de expresión del RNAm Glut4 con el BMI y el HOMA-IR de los sujetos. C: Niveles de expresión del RNAm Glut4, CEBPα y PPARγ en las ASCs de sujetos agrupados según su perfil metabólico. Los valores del RNAm de Glut4, CEBPα y PPARγ fueron determinados por qPCR y normalizados respecto al RNAm RPL13A. (Np = 5; NoSM = 6; SM = 9). *, Resultados significativamente diferentes (Mann-Whitney; P < 0.05) al de los sujetos Np; †, resultados significativamente diferentes (Mann-Whitney; P < 0.05) al de los sujetos NoSM. Resultados 98 1.3-La disminución del RNAm GLUT4 en las ASC visceral y subcutáneo está correlacionada con el incremento de los niveles de expresión de proteínas fibróticas. Experimentos in vitro han demostrado que las alteraciones en el patrón de expresión de proteínas de la matriz extracelular pueden afectar la expresión de genes del linaje adipogénico (Chun et al, 2006; Mariman y Wang, 2010). Por ello seguidamente examinamos los niveles de RNAm de algunas de las proteínas involucradas en el incremento de la fibrosis tisular asociada a la obesidad. Los niveles de expresión de FN1 y Col1a1 se correlacionaron negativamente con los niveles transcripcionales de GLUT4 tanto en las ASC visceral como en las ASC subcutáneo (Figura 5A), pero solamente las ASC subcutáneo incrementaron significativamente los niveles del RNAm Col1a1 con el aumento del BMI y el HOMA-IR de los pacientes (Figura 5B). Por otra parte, si bien no observamos diferencias significativas en los niveles de expresión de los receptores de la señalización TGFβ, detectamos niveles de RNAm Smad7 significativamente elevados en las ASC subcutáneo de sujetos NoSM (Figura 6A). Además, el análisis por western blot nos permitió constatar un incremento signficativo en los niveles proteico de Smad7 en la fracción citoplasmática de las ASC subcutáneo de los sujetos NoSM respecto a la de los sujetos SM (Figura 6B). Resultados 99 020 40 60 80 100 0 20 40 60 R=-0.402 P=0.079 A FN1 mRNA (RQ) ASC vis Glut4 mRNA (RQ) ASC vis 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 ASC vis: R=0.192; P=0.416 ASC sub:R=0.289; P=0.217 B BMI (kg/m2) FN1 mRNA (RQ) 020 40 60 80 0 50 100 150 R=-0.430 P=0.058 FN1 mRNA (RQ) ASC sub Glut4 mRNA (RQ) ASC sub 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 ASC vis: R=0.269; P=0.251 ASC sub:R=0.105; P=0.659 HOMA-IR FN1 mRNA (RQ) 020 40 60 80 100 0 20 40 60 R=-0.448 P=0.048 Col1a1 mRNA (RQ) ASC vis Glut4 mRNA (RQ) ASC vis 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 ASC vis: R=0.223; P=0.346 ASC sub:R=0.508; P=0.022 BMI (kg/m2) Col1a1 mRNA (RQ) 020 40 60 80 100 0 50 100 150 R=-0.457 P=0.043 Col1a1 mRNA (RQ) ASC sub Glut4 mRNA (RQ) ASC sub 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 ASC vis: R=-0.008; P=0.975 ASC sub:R=0.478; P=0.033 HOMA-IR Col1a1 mRNA (RQ) Figura 5. Niveles de expresión del RNAm Glut4 y proteínas asociadas a la fibrosis tisular adiposa. A: Correlación de los niveles de expresión del RNAm Glut4 con FN1 y Col1a1 en las ASCs de sujetos con perfiles metabólicos diferentes. B: Correlación de los niveles transcripcionales de FN1 y Col1a1 en las ASCs con el BMI y HOMA-IR de los sujetos. Los valores son registrados como media ± error estándar (Np = 5; NoSM = 6; SM = 9). Resultados 106 2-Contribución de las ASC Visceral y Subcutáneo a la Disminución de la Capacidad Angiogénica del Tejido Adiposo. 2.1-Disminución de la capacidad de formación de túbulos e incremento de los niveles de expresión de NADPH oxidasa en las ASC visceral y subcutáneo de sujetos SM. Debido a la implicación del FGF2 en la formación de capilares (Kanda et al, 2003), es probable que el FGF2 retenido por las ASCs no sólo repercuta en su potencial proliferativo y clonogénico sino también en su capacidad de formación de túbulos. De hecho, la densidad de vasos sanguíneos del tejido adiposo se ha visto correlacionada positivamente con el número de colonias generadas por las ASCs aisladas del propio tejido (da Silva et al, 2009). El ensayo de formación de túbulos en matrigel empobrecido en factores de crecimiento confirmó la propiedad de las ASC visceral y subcutáneo de generar estructuras semejantes a capilares (Figura 10A) y reveló una correlación positiva estadísticamente significativa entre la longitud de túbulos generados por las ASC de ambos depósitos adiposos. (Figura 10B). No observamos diferencias significativas entre la longitud de las estructuras semejantes a capilares generadas por las ASCs de los sujetos obesos y Np. Sin embargo, tanto las ASC visceral como las ASC subcutáneo de los sujetos SM evidenciaron una disminución estadísticamente significativa de la capacidad de formación de túbulos respecto a la de los sujetos NoSM (Figura 10C). Resultados 107 Figura 10. Capacidad de formación de túbulos por las ASC visceral y subcutáneo. A: Generación de estructuras semejantes a capilares por las ASCs cultivadas bajo condiciones estándares durante seis horas en placas de 48 pozos recubiertas con 50 µL/cm2 de matrigel empobrecido en factores de crecimiento. Barra = 250 μm. B: Correlación entre la longitud de estructuras tubulares generadas por las ASCs de ambos tejidos. C: Valores de longitud de túbulos generados por las ASCs de sujetos agrupados según su perfil metabólico. (Np = 6; NoSM = 7; SM = 9). †, Resultados significativamente diferentes (Mann-Whitney; P < 0.05) al de los sujetos NoSM. Resultados 108 Experimentos in vitro e in vivo han demostrado que las células precursoras tratadas con oxidantes disminuyen su capacidad de formar túbulos (Ingram et al, 2007), sugiriendo que el estrés oxidativo podría afectar sus propiedades neovasculares. Teniendo en consideración que el estrés oxidativo está estrechamente vinculado al síndrome metabólico (Bashan et al, 2009) y como ha sido demostrado que NADPH oxidasa es una de las principales fuentes de producción de ROS en el tejido adiposo de sujetos obesos (Furukawa et al, 2004), examinamos los niveles de expresión de varios miembros de la familia NADPH oxidasa. Observamos correlaciones estadísticamente significativas entre los niveles de expresión de NOX5 en las ASC visceral (Figura 11A) y NOX4 en las ASC subcutáneo (Figura 11B) con variables que describen el perfil lipídico de los sujetos. La aplicación de la técnica qPCR también nos permitió corroborar que tanto las ASC visceral como las ASC subcutáneo de los sujetos obesos evidenciaron un incremento de los RNAm NOX5 y NOX4. En particular, los niveles de expresión de NOX4 en las ASC subcutáneo de los sujetos SM fueron significativamente elevados respecto a los sujetos Np (Figura 11C). Seguidamente evaluamos la expresión de enzimas antioxidantes involucradas en catalizar la dismutación del superóxido derivado de la actividad NADPH oxidasa. Observamos una asociación positiva entre los niveles transcripcionales de SOD1 y SOD3 con el RNAm NOX4 expresado por las ASC derivadas de ambos tejidos, que sólo fue estadísticamente relevante para las ASC subcutáneo (Figura 11D). Resultados 109 0200 400 600 800 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ASC vis: R=0.476; P=0.025 ASC sub:R=0.214; P=0.338 A Triglicéridos (mg/dL) NOX5 mRNA x 10-3(RQ) 0200 400 600 800 0 10 20 30 ASC vis: R=0.188; P=0.402 ASC sub:R=0.190; P=0.396 B Triglicéridos (mg/dL) NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) Np NoSM SM 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ASC vis ASC sub C NOX5 mRNA x 10-3 (RQ) 20 40 60 80 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ASC vis: R=-0.552; P=0.008 ASC sub:R=-0.275; P=0.215 Colesterol-HDL (mg/dL) NOX5 mRNA x 10-3 (RQ) 20 40 60 80 100 0 10 20 30 ASC vis: R=-0,229; P=0.305 ASC sub:R=-0.663; P=0.001 Colesterol-HDL (mg/dL) NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) Np NoSM SM 0 5 10 15 20 ASC vis ASC sub * NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) 50 100 150 200 250 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ASC vis: R=0.669; P=0.001 ASC sub:R=0.171; P=0.446 Colesterol-LDL (mg/dL) NOX5 mRNA x 10-3 (RQ) 50 100 150 200 250 0 10 20 30 ASC vis: R=0.340; P=0.121 ASC sub:R=0.744; P=0.0001 Colesterol-LDL (mg/dL) NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) 0 5 10 15 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 SOD1 ASC vis: R=0.159; P=0.481 SOD3 ASC vis: R=0.099; P=0.662 D NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) SOD mRNA (RQ) 200 300 400 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ASC vis: R=0.539; P=0.010 ASC sub:R=0.145; P=0.519 Colesterol-Total (mg/dL) NOX5 mRNA x 10-3 (RQ) 200 300 400 0 10 20 30 ASC vis: R=0.274; P=0.216 ASC sub: R=0.362; P=0.098 Colesterol-Total (mg/dL) NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) 010 20 30 0.0 0.2 0.4 0.6 SOD1 ASC sub: R=0.554; P=0.007 SOD3 ASC sub: R=0.452; P=0.035 NOX4 mRNA x 10-3 (RQ) SOD mRNA (RQ) Figura 11. Expresión de proteínas involucradas en el balance redox celular en las ASC visceral y subcutáneo. A-B: Correlación de los niveles transcripcionales del RNAm NOX5 (A) y NOX4 (B) con variables que describen el perfil metabólico de los pacientes. C: Niveles de expresión del RNAm NOX5 y NOX4 en las ASCs de sujetos agrupados según su perfil metabólico. D: Correlación de los niveles de expresión del RNAm NOX4 con SOD1 y SOD3 tanto en las ASC visceral como en las ASC subcutáneo. (Np = 6; NoSM = 7; SM = 9). *, Resultados significativamente diferentes (Mann-Whitney; P < 0.05) al de los sujetos Np. Resultados 110 2.2-Disminución de los niveles de secreción del VEGF por las ASC subcutáneo de los sujetos SM durante la diferenciación adipogénica. Técnicas de microscopía in vivo han revelado que la diferenciación adipogénica de los preadipocitos implantados está acompañada por la formación de nuevos vasos sanguíneos (Fukumura et al, 2003) e interacciones entre múltiples tipos celulares que favorecen el acoplamiento entre la adipogénesis y la angiogénesis (Nishimura et al, 2007). Sin embargo, también ha sido admitido que durante la adipogénesis se generan ROS que interactúan con la propia diferenciación de los preadipocitos (Gummersbach et al, 2009). Creemos que el estrés oxidativo asociado a la obesidad (Furukawa et al, 2004) no sólo podría afectar la capacidad de formación de túbulos por las ASCs sino también la secreción de citoquinas implicadas en la neovascularización adipogénica. Para corroborar ésta hipótesis cultivamos las ASCs en medio adipogénico durante seis días y recolectamos el medio de cultivo condicionado por las ASC visceral y subcutáneo durante las últimas 72 horas. Después de seis días en medio adipogénico, confirmamos la acumulación citoplasmática de lípidos mediante el marcaje fluorescente con solución Rojo Nilo (Figura 12A). Como se puede apreciar en la Figura 12B, las ASC visceral y subcutáneo cultivadas en medio adipogénico incrementaron los niveles de expresión de los factores transcripcionales C/EBPα y PPARγ respecto a las cultivadas en medio no adipogénico pero sin existir diferencias significativas entre los grupos de sujetos. Resultados 111 Figura 12. Diferenciación adipogénica de las ASC visceral y subcutáneo durante seis días. A: Marcaje con AdipoRed de los lípidos acumulados en el citoplasma de las ASCs después de seis días de cultivo en medio adipogénico. Barra = 100 μm. B: Niveles de expresión del RNAm CEBPα y PPARγ en las ASCs de sujetos agrupados según su perfil metabólico. Los valores del RNAm CEBPα y PPARγ fueron determinados por qPCR y normalizados respecto al RNAm RPL13A. (Np = 4; NoSM = 5; SM = 8). Resultados 112 La cantidad secretada del VEGF a los seis días de diferenciación adipogénica por las ASC de ambos tejidos se correlacionó negativamente con el BMI (Figura 13A) y la concentración del Colesterol-LDL plasmático (Figura 13B), pero sólo los niveles secretados por las ASC subcutáneo revelaron una correlación estadísticamente significativa. Cuando comparamos con los sujetos Np, solamente las ASC subcutáneo de los sujetos SM disminuyeron significativamente la concentración del VEGF secretada hacia el medio de cultivo adipogénico (Figura 13C). 20 30 40 50 60 0 5000 10000 15000 AR=-0.105 P=0.687 BMI (kg/m2) VEGF (pg/ millón de ASC vis) 20 30 40 50 60 0 1000 2000 3000 R=-0.603 P=0.010 BMI (kg/m2) VEGF (pg/ millón de ASC sub) 100 150 200 250 0 5000 10000 15000 BR=-0.353 P=0.165 Colesterol-LDL (mg/dL) VEGF (pg/ millón de ASC vis) 100 150 200 250 0 1000 2000 3000 R=-0.588 P=0.013 Colesterol-LDL (mg/dL) VEGF (pg/ millón de ASC sub) Np NoSM SM 0 2000 4000 6000 8000 10000 C VEGF (pg/ millón de ASC vis) Np NoSM SM 0 500 1000 1500 2000 2500 * VEGF (pg/ millón de ASC sub) Figura 13. Concentración del VEGF en el medio adipogénico condicionado por las ASC visceral y subcutáneo. Los niveles del VEGF secretados por las ASCs durante las últimas 72 horas de los seis días de diferenciación adipogénica fueron cuantificados mediante ELISA y normalizados respecto a 1 x 106 ASCs según el número de células presentes en el momento de recolección del medio. (Np = 4; NoSM = 5; SM = 8). *, Resultados significativamente diferentes (MannWhitney; P < 0.05) al de los sujetos Np. Resultados 113 Contrario al VEGF, la concentración del HGF tendió a ser mayor en el medio adipogénico condicionado por las ASC visceral y subcutáneo de los dos grupos de sujetos obesos (Figura 14A). De hecho, sus niveles de secreción ascendieron significativamente en las ASC visceral con el aumento del BMI de los pacientes (Figura 14B) y en las ASC subcutáneo con el incremento de la concentración de triglicéridos plasmáticos. (Figura 14C). Relevantemente, observamos una asociación negativa entre los niveles de secreción de ambas citoquinas por las ASCs de los respectivos tejidos, cuya significancia estadística es alcanzada solamente por las ASC visceral (Figura 14D). 2.3-Incremento transcripcional de citoquinas inflamatorias durante la diferenciación adipogénica de las ASC subcutáneo de los sujetos SM Ha quedado ampliamente establecido que el desbalance redox puede influir sobre la señalización NF-kβ implicada en la activación transcripcional de citoquinas inflamatorias (Morgan y Liu, 2011) y en la senescencia tisular adiposa vinculada a la obesidad (Minamino et al, 2009). Por ello, seguidamente evaluamos los niveles de expresión de algunas citoquinas que forman parte del fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). Resultados 114 Np NoSM SM 0 1000 2000 3000 A HGF (pg/ millón de ASC vis) Np NoSM SM 0 100 200 300 400 HGF (pg/ millón de ASC sub) 20 30 40 50 60 0 2000 4000 6000 BR=0.555 P=0.021 BMI (kg/m2) HGF (pg/ millón de ASC vis) 20 30 40 50 60 0 200 400 600 800 R=0.112 P=0.668 BMI (kg/m2) HGF (pg/ millón de ASC sub) 50 100 150 200 0 2000 4000 6000 CR=0.268 P=0.298 Triglicéridos (mg/dL) HGF (pg/ millón de ASC vis) 50 100 150 200 0 200 400 600 800 R=0.563 P=0.019 Triglicéridos (mg/dL) HGF (pg/ millón de ASC sub) 5000 10000 15000 0 2000 4000 6000 R=-0.644 P=0.005 D VEGF (pg/ millón de ASC vis) HGF (pg/ millón de ASC vis) 01000 2000 3000 0 200 400 600 800 R=-0.287 P=0.264 VEGF (pg/ millón de ASC sub) HGF (pg/ millón de ASC sub) Figura 14. Concentración del HGF en el medio adipogénico condicionado por las ASC visceral y subcutáneo. Los niveles del HGF secretados por las ASCs durante las últimas 72 horas de los seis días de diferenciación adipogénica fueron cuantificados mediante ELISA y normalizados respecto a 1 x 106 ASCs según el número de células presentes en el momento de recolección del medio. (Np = 4; NoSM = 5; SM = 8). Resultados 115 Los mayores valores de expresión de RNAm IL1β, IL8 y MCP1 fueron observados tanto en las ASC visceral como en las ASC subcutáneo de los sujetos SM, pero sin alcanzar la significancia estadística (Figura 15A). Aunque observamos una correlación positiva entre la concentración de glucosa plasmática y los niveles de expresión de dichas citoquinas en las ASC visceral (Figura 15B), sólo en las ASC subcutáneo detectamos una correlación positiva estadísticamente significativa (Figura 15C). Np NoSM SM 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 ASC vis ASC sub A IL1 mRNA (RQ) Np NoSM SM 0.00 0.05 0.10 0.15 ASC vis ASC sub IL8 mRNA (RQ) Np NoSM SM 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 ASC vis ASC sub MCP1 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.000 0.005 0.010 0.015 R=0.061 P= 0.815 B Glucosa (mg/dL) ASC vis IL1 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 R=0.022 P=0.933 Glucosa (mg/dL) ASC vis IL8 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.00 0.05 0.10 0.15 R=0.038 P=0.886 Glucosa (mg/dL) ASC vis MCP1 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.000 0.002 0.004 0.006 R=0.492 P=0.045 C Glucosa (mg/dL) ASC sub IL1 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 R=0.605 P=0.010 Glucosa (mg/dL) ASC sub IL8 mRNA (RQ) 60 80 100 120 140 160 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 R=0.643 P=0.005 Glucosa (mg/dL) ASC sub MCP1 mRNA (RQ) Figura 15. Expresión de citoquinas inflamatorias por las ASC visceral y subcutáneo. A-C: Expresión del RNAm de citoquinas inflamatorias en las ASCs de sujetos agrupados según su perfil metabólico (A) y correlación con la concentración de glucosa plasmática tanto en las ASC visceral (B) como en las ASC subcutáneo (C). Los niveles de RNAm de la IL1β, IL8, MCP1 expresados por las ASCs a los seis días de diferenciación adipogénica fueron determinados mediante qPCR y normalizados respecto al RNAm RPL13A. (Np = 4; NoSM = 5; SM = 8).