Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA1

Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA1 Memoria de Tesis presentada por D. PEDRO FERNÁNDEZ-LLEBREZ ZAYAS para optar al grado de Doctor por la Universidad de Málaga Málaga 2016 AUTOR: Pedro Fernández-Llebrez Zayas http://orcid.org/0000-0003-3316-3757 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Este trabajo se ha realizado al amparo del grupo de investigación del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI, Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo; Junta de Andalucía), código CTS643,Neuropsicofarmacología de los Transmisores Lipídicos. Génesis neural y conducta, dirigido por el Dr. Guillermo Estivill Torrús, y establecido en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA) en Hospital Universitario Regional de Málaga, así como del grupo de investigación Neuropsicofarmacología de la adicción (CTS433, PAIDI), dirigido por el Dr. Fernando Rodríguez de Fonseca, del mismo centro, y en colaboración con el grupo de Investigación dirigido por el Dr. Pedro FernándezLlebrez y del Rey, del Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga. Igualmente, ha contado con la colaboración del Dr. Jerold Chun, del Departamento de Neurociencia Celular y Molecular en el Centro Dorris de Neurociencia, en el Instituto de Investigación Scripps en La Jolla, Estados Unidos; la del Dr. José Angel Aguirre, del Departamento de Fisiología Humana y Educación Físico-Deportiva de la Universidad de Málaga; y la del Dr. Francisco Tejedor Rescalvo, director del Grupo de Neurogenética Molecular en el Instituto de Neurociencias (Universidad Miguel Hernández-Consejo Superior de Investigaciones Científicas) de Alicante. El estudio se ha realizado en las siguientes instalaciones y Estructuras Comunes de Apoyo la Investigación (ECAI): - Laboratorios de Investigación (ECAI de Servicios Generales) y Unidad de Microscopía (ECAI de Imagen), Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Hospital Universitario Regional de Málaga. - ECAI Centro de Experimentación Animal, Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Universidad de Málaga. - Laboratorio del Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga. RESUMEN El ácido lisofosfatídico (LPA) es un fosfolípido sencillo con propiedades de señalización extracelular mediadas por receptores de membrana específicos acoplados a proteínas G. Actualmente se conocen hasta 6 tipos de receptores diferentes para el LPA. El receptor LPA1se expresa en la zona neurogénica del cerebro en desarrollo, en la zona ventricular (VZ), lo que sugiere su implicación en la neurogénesis. A pesar de los numerosos estudios farmacológicos que han aportado datos de los efectos del LPA en el sistema nervioso central (SNC) utilizando modelos in vitro, no es sino hasta que se dispuso de animales carentes del receptor, cuando se avanzó en el estudio de la función específica del receptor. Los primeros ratones obtenidos que permitían el estudio de pérdida de función del receptor LPA1mostraron una alta mortalidad perinatal pero abrían una puerta excelente a nuevos estudios de caracterización del SNC en ausencia de vías específicas de señalización por LPA. En el presente trabajo se muestran resultados que demuestran una función destacada del receptor LPA1en los precursores neuronales corticales durante el desarrollo cerebral, resultantes del análisis de la neurogénesis en una variante, que hemos venido a denominar Málaga, de un ratón nulo para-LPA1. Esta variante surge de forma espontánea durante la expansión de la colonia original y porta un fenotipo con defectos observables en el SNC, a la vez que muestra una viabilidad perinatal casi completa, lo que ha permitido su caracterización. Nuestros resultados muestran alteraciones significativas en la neurogénesis cortical embrionaria, en el patrón proliferativo de la zona ventricular, afectando al tipo de división y la posterior diferenciación, con expresión de marcadores neuronales de forma prematura en la capa cortical y alteración de la expresión de factores de transcripción. Estos defectos de la neurogénesis en ausencia de la vía de señalización por LPA1se asocian con defectos en el patrón migratorio neuronal, indicativos de alteraciones de tipo estructural y funcional, y que generan, en última instancia, una reducción del grosor de la pared cortical y del número de neuronas en diferentes capas corticales, especialmente las profundas donde se detecta, además, un nivel inusualmente mayor de apoptosis. Los resultados que mostramos en esta memoria reflejan, con ello, la necesidad del receptor LPA1para el desarrollo normal cerebral y acentúan el importante papel que el modelo de animal nulo para LPA1de la variedad Málaga ha representado para el estudio de la señalización mediada por este receptor. A la fecha actual, el uso de este ratón ha permitido un avance muy significativo en el campo y sigue siendo objeto de estudio por nuestro grupo de investigación y por diferentes colaboradores a nivel nacional e internacional. ÍNDICE 1. INTRODUCCION 1.1 El ácido Lisofosfatídico (LPA) 2 1.1.1 Sintesis y Metabolismo del LPA 3 1.1.2 Receptores de LPA 7 1.1.3 Tipos de receptores de LPA 10 1.2 Neurogénesis cortical y desarrollo del sistema nervioso central (SNC). 13 1.2.1. Formación del tubo neural. 13 1.2.2. El epitelio germinativo. Zona ventricular y subventricular 16 1.2.3. Migración nuclear intercinética. 18 1.2.4. Tipos de divisiones: simétricas y asimétricas 20 1.2.5. Estructura de la corteza cerebral 22 1.2.6. Factores reguladores de la neurogénesis cortical analizados en este estudio. 26 1.3. Efectos biológicos del LPA e implicación en el desarrollo del SNC 29 1.4. El ratón nulo para el receptor LPA1y la variedad Málaga. Neurogénesis e implicaciones en el ratón adulto. 39 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 45 3. MATERIAL Y MÉTODOS 49 3.1. Animales de experimentación 51 3.2. Genotipado 54 3.3. Fijación y procesamiento del material para microscopía óptica 56 3.3.1. Fijación del tejido y procesamiento en parafina para microtomo convencional 56 3.3.2. Fijación del tejido y procesamiento para microtomo de congelación 57 3.3.3. Fijación del tejido y procesamiento de secciones para criostato 58 3.3.4. Fijación del tejido y procesamiento de secciones para vibratomo 58 3.4. Histoquímica e inmunohistoquímica 59 3.4.1. Tinción de hematoxilina – eosina 59 3.4.2. Inmunohistoquímica 59 3.4.2.1. Antígenos analizados y anticuerpos usados para su detección 59 3.4.2.2. Tinción inmunohistoquímica 62 3.4.2.3. Inmunodetección y cuantificación de la bromodeoxiuridina 64 3.4.2.4. Inmunodetección y cuantificación neuronal. Estereología 66 3.5. Análisis de la muerte celular por apoptosis durante el desarrollo 67 3.6. Hibridación in situ 69 3.6.1. Marcaje de sondas 69 3.6.2. Procesamiento e hibridación 71 3.6.3. Detección de la sonda 72 3.7. Análisis in vitro: cultivos celulares e inmunocitoquímica 73 3.7.1. Variables analizadas. Morfología celular 75 3.7.2. Variables analizadas. Marcaje con bromodesoxiuridina y cinética celular 76 3.7.3. Variables analizadas. Detección de bromodesoxiuridina y marcadores de diferenciación 77 3.7.4. Tinción inmunocitoquímica 78 3.8. Electroforesis, transferencia e inmunotinción de proteínas 81 3.8.1. Extracción de proteínas 82 3.8.2. Electroforesis de proteínas 84 3.8.3. Transferencia e Inmunodetección 85 3.9. Análisis estadístico de los datos y edición de imágenes 87 3.10. Anexo I 89 4. RESULTADOS 93 4.1. Fenotipo de los ratones Málaga nulos para LPA194 4.2. Características generales del cerebro de los ratones Málaga nulos para LPA199 4.2.1. Anatomía del encéfalo en ausencia del receptor LPA199 4.2.2 Expresión del receptor LPA1en el encéfalo de los ratones maLPA1-nulos 101 4.3. Análisis de la zona proliferativa cortical en los ratones Málaga nulos para LPA1103 4.3.1. Alteración del patrón de proliferación y diferenciación cortical en ausencia del receptor LPA1103 4.3.2. Expresión anómala de genes reguladores de neurogénesis cortical en ausencia del receptor LPA1110 4.3.3. Inversión de la proporción del tipo de división adoptado por los precursores corticales apicales en ausencia del receptor LPA1112 4.3.4. Dinámica de proliferación y diferenciación de neuroblastos corticales en ausencia del receptor LPA1114 - Respuesta a LPAen neuroblastos corticales de ratones en E14.5 115 - Proliferación y diferenciación en neuroblastos corticales de ratones en E14.5 116 - Cinética del ciclo celular en neuroblastos corticales de ratones en E14.5 118 4.4. Alteraciones en la formación cortical en los ratones Málaga nulos para LPA1120 4.4.1. Migración cortical y diferenciación anómalos en ausencia del receptor LPA1120 4.4.2. Apoptosis cortical embrionaria y postnatal en ratones maLPA1-nulos 127 4.4.3. Reducción neuronal en la corteza cerebral de ratones maLPA1-nulos 129 5.- DISCUSIÓN 133 6.- CONCLUSIONES 143 7. BIBLIOGRAFÍA 147 Relación de figuras Figura 1. Modelo molecular espacial y estructura química del LPA. Figura 2. Vías de producción extracelular de LPA. Figura 3. Vías de señalización intracelular asociadas a los receptores de LPA. Figura 4. Filogenia y distribución de los receptores LPA. Figura 5. Imágenes de la neurulación en el embrión. Figura 6. Esquema de desarrollo cortical. Figura 7. Migración nuclear intercinética en los progenitores apicales. Figura 8. Huso mitótico y división en los progenitores apicales. Figura 9. Evolución del tipo de división celular durante la neurogénesis. Figura 10. Estructura de la corteza cerebral . Figura 11 Formación de capas corticales. Figura 12. Corticogénesis durante los estadios de desarrollo de ratón . Figura 13. Expresión del gen Lpar1 en la zona ventricular telencefálica. Figura 14. Acción propuesta para el LPA durante la neurogénesis cortical. Figura 15. Posibles funciones del LPA en las neuronas postmitóticas. Figura 16. Expresión temporal y celular de los diferentes receptores de LPA. Figura 17. Alteraciones morfológicas y defectos neuronales en ratones adultos nulos para el receptor LPA1. Figura 18. Esquema de la deleción del gen Lpar1 en la cepa original de ratones nulos para LPA1 Figura 19. Vista de embriones de ratón tras su extracción. Figura 20. Esquema del ensayo de detección de la deleción de Lpar1 en los animales de experimentación. Figura 21. Región utilizada para el aislamiento de neuroblastos corticales en embrión de ratón de estadio E14.5. Figura 22. Esquema de áreas de recuento celular en hemocitómetro. Figura 23. Representación usada para el cálculo de parámetros de cinética celular. Figura 24. Representación de la placa de 96 pocillos utilizada para la determinación de la concentración de proteínas de las muestras a través del ensayo de Bradford. Figura 25. Esquema de la colocación del gel y la membrana para la electrotransferencia. Figura 26. Reducción de masa corporal en ausencia del receptor LPA1en los ratones maLPA1nulos. Figura 27. Reducción de tamaño corporal en los ratones maLPA1-nulos. Figura 28. Ausencia de defectos de amamantamiento en los ratones maLPA1-nulos. Figura 29.Anatomía y peso del cerebro en la variedad Málaga nula para LPA1. Figura 30. Histología general y de la corteza cerebral de los ratones Málaga nulos para LPA1. Figura 31. Corteza cerebral de ratones Málaga nulos para LPA1en edad P0. Figura 32.Detección del receptor LPA1en la zona ventricular durante el desarrollo. Figura 33. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E11.5 para ratones Málaga normales, heterocigotos y nulos para LPA1 Figura 34. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E14.5 para ratones Málaga normales, heterocigotos y nulos para LPA1 Figura 35. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E16.5 para ratones Málaga normales y nulos para LPA1. Figura 36. Reducción del número de mitosis en ausencia del receptor LPA1. Figura 37. Patron de expresión de Pax6, Tbr2, Tis21, Ngn1 yNgn2 en la neurogénesis cortical temprana de ratones normales y nulos para LPA1. Figura 38. La ausencia del receptor LPA1en los precursores neurales invierte la proporción del tipo de orientación del plano de división. Figura 39. Efecto de la adición de LPA en cultivos celulares de neuroblastos corticales obtenidos de embriones normales y nulos para LPA1. Figura 40. Análisis in vitro de los precursores neurales de ratones maLPA1-nulos. Figura 41. Cinética del ciclo celular de los precursores neurales de ratones maLPA1-nulos. Figure 41. Figura 42. Migración cortical temprana alterada en ausencia del receptor LPA1. Figura 43. Migración anómala a capas superiores en ausencia del receptor LPA1. Figura 44. Conexión talamocortical y corticotalámica en ausencia del receptor LPA1. Figura 45. Deficiencia cortical de GAP-43 como consecuencia de las alteraciones de desarrollo en ratones nulos para LPA1. Figura 46. Aumento de apoptosis en la corteza cerebral de ratones Málaga nulos para LPA1. Figura 47. Reducción neuronal en la corteza cerebral de ratones maLPA1-nulos Relación de tablas Tabla 1. Resumen de las funciones identificadas de los receptores de LPA en enfermedades relacionadas con el SNC y periférico. Tabla 2. Análisis del genotipado de la camada de ratones maLPA1-nulos según el genotipo específico parental. Tabla 3. Cuantificación estereológica del número de neuronas corticales en los ratones adultos de los diferentes genotipos estudiados. 1. INTRODUCCIÓN 0 1 1 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Si tuviéramos que elegir una estructura biológica en la que tuviéramos aún más preguntas por responder a día de hoy, seguramente elegiríamos el sistema nervioso central (SNC). De entre todas las cuestiones en las que nos planteamos incógnitas, una de las más importantes es la formación de nuevas células neuronales. En mamíferos, incluido el propio ser humano, la formación de nuevas neuronas es parte constitutiva del desarrollo cerebral y las alteraciones de la misma pueden tener repercusiones no sólo en edades tempranas sino durante el resto de la vida del individuo dando lugar a diferentes patologías. Además, la neurogénesis no es un proceso restringido al desarrollo, sino que tiene lugar también en determinadas áreas del cerebro adulto. La neurogénesis adulta es esencial en respuestas plásticas ante diferentes acontecimientos de variado origen, participando en procesos esenciales para el correcto funcionamiento cerebral y representado, por otra parte, una diana terapéutica para diferentes patologías de índole neurodegenerativo y neuropsiquiátrico, como en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, los trastornos de tipo emocional o la adicción. Es, por ello, preciso conocer cómo se regulan todos estos procesos. Aún estando claramente diferenciadas, la neurogénesis adulta y la que tiene lugar durante el desarrollo guardan similitudes en numerosos aspectos, entre ellos, determinados factores intrínsecos y extracelulares que afectan, de manera común, a la morfología, división, migración y supervivencia celular ( Urban y Guillemot, 2014; Zhang y Jiao, 2015). La lista de estos factores reguladores que modulan la neurogénesis ha ido creciendo de manera continuada. De entre todos estos posibles factores, hace unos años se identificó al ácido lisofosfatídico (LPA, del inglés lysophosphatidic acid), una molécula lipídica de pequeño tamaño que se ha demostrado tener un papel significativo en la regulación del SNC. En esta introducción desarrollaremos la estructura y modo de acción del mismo e, igualmente, revisaremos el desarrollo del sistema nervioso central y la implicación de esta molécula en los procesos de desarrollo del SNC, de manera preliminar a la exposición de los objetivos del presente trabajo de investigación. Es importante destacar que la presente memoria refleja una investigación llevada a cabo durante el período transcurrido entre los años 2003 y 2007, parte de la cual ha sido ya difundida en revistas del área de estudio. A objeto de no generar confusión en la memoria y dar sentido al desarrollo de hipótesis y objetivos, se han excluido de la introducción las aportaciones fruto de esta investigación, aún cuando buena parte de los trabajos en 8 8 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 3. Vías de señalización intracelular asociadas a los receptores de LPA. Los receptores de LPA1-6 se acoplan, en la cara interna de la superficie de la membrana celular, a proteínas G, heterotrímeros que constan de una unidad Gα y las correspondientes subunidades Gβγ asociadas. Un receptor puede unirse a diferentes tipos de unidad Gαpara activar una determinada red de señalización (Tomado de Gonzalez-Gil et ál., 2014). Los receptores de LPA pueden clasificarse en dos subgrupos en función al grado de homología presente en su estructura química (Choi et ál., 2010). En el primer subgrupo se encuentran los receptores LPA1, LPA2y LPA3. Dentro de esta familia también se hallan los receptores para la esfingosina-1-fosfato (S1P, del inglés, sphingosine-1-phosphate) molécula altamente relacionada estructuralmente con el LPA, compartiendo un 50 % de los aminoácidos que conforman la estructura química con el receptor LPA1(Aoki et ál., 2008). En el segundo subgrupo se incluyen los receptores LPA4, LPA5, y LPA6, quienes comparten entre sí aproximadamente un 35% de homología, no así con los receptores LPA1-3 (Aoki et ál., 2008). La Figura 4 muestra la relación filogenética entre los distintos receptores, así como una gráfica de la expresión de los distintos receptores en órganos y tejidos en el ratón y en el hombre. 9 9 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 4. Filogenia y distribución de los receptores LPA. Panel superior: Relación filogenética de los receptores LPA en función de su grado de homología (representado entre paréntesis). Se representa entre paréntesis el porcentaje de homología de aminoácidos que comparten con el receptor LPA1.Panel inferior: Expresión de los receptores LPA1-5 en ratón (R) y humano (H). (Ambas imágenes cedidas por la Dra. Rosell del Valle y modificada de Choi y Chun, 2013). 10 10 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Actualmente, ambos, los receptores de LPA y los de S1P, han sido identificados como imprescindibles para el desarrollo del SNC (Choi y Chun, 2013) y están implicados en diferentes neuropatologías como la esclerosis múltiple (Brinkmann et ál., 2010; Chun y Brinkmann, 2011), la hipoxia fetal e hidrocefalia (Harrison et ál., 2003; Brinkmann et ál., 2010; Chun y Brinkmann, 2011; Herr et ál., 2011; Yung et ál., 2011), el dolor neuropático (Inoue et ál., 2004; Nagai et ál., 2010; Lin et ál., 2012), la isquemia cerebral (Li et ál., 2008; Czech et ál., 2009), los traumatismos (Goldshmit et ál., 2010), la pérdida de audición (MacLennan et ál., 2001; Herr et ál., 2011; Kono et ál., 2007), la convulsiones (MacLennan et ál., 2001; Trimbuch et ál., 2009; Akahoshi et ál., 2011) y en la enfermedad de Sandhoff (Wu et ál., 2008). 1.1.3 Tipos de receptores de LPA Receptor LPA1 El gen del receptor LPA1fue el primer gen de un receptor de LPA que fue clonado (Hecht et ál., 1996). Es una proteína con siete dominios transmembrana, masa molecular de aproximadamente 42 kDa y con 364 aminoácidos (Choi et ál., 2010). Existe una variante del receptor, MREC1.3, que presenta 18 aminoácidos menos en el extremo N-terminal (Contos y Chun, 1998), pero su significado biológico aún no ha sido evaluado. El receptor LPA1muestra una alta afinidad para un amplio rango de especies de LPA, tanto ligadas a ácidos grasos saturados como a insaturados (Bandoh et ál., 2000). El receptor LPA1se acopla a tres tipos de proteínas G: Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13, activando las vías de señalización MAPK, (del inglés, mitogen-activated protein kinases), fosfolipasa C, Akt, Rho, e inhibición de la adenilciclasa (Choi et ál., 2010). Se pueden, a su vez, distinguir dos vías principales de activación del receptor LPA1, en función de la sensibilidad a la inhibición de la toxina del bacilo Bordetella pertussis (PTX, del inglés, pertussis toxin). Distinguimos asi una via PTX-sensible y una via PTXinsensible. (Goetzl y Tigyi, 2004; Anliker y Chun, 2004) El receptor LPA1activa específicamente al subtipo PTX-sensible Gαi/o y PTX-insensible Gαq/11/14 y Gα12/13 (Fukushima, 2004). La cascada de señalización desemboca en variadas respuestas celulares, siendo las más relevantes, las de proliferación, diferenciación, supervivencia y migración celular, cambios en el citoesqueleto y movilización de calcio intracelular (Fukushima et ál., 2001; Goetzl et ál., 2002; Lynch y Macdonald, 2002; Ye et ál., 2002; Fujiwara et ál., 2003; Ankiler y Chun, 2004; Pilpel y Segal, 2006; Rhee et ál., 2006; Noguchi et ál., 2009; Choi et ál., 2010). Las respuestas biológicas más comunes del LPA afectan la división celular y la activación de elementos de respuesta a sueros (Perkins et ál., 1994). Además, la vía dependiente de Rho actúa sobre el 11 11 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 citoesqueleto celular (Ridley, 1994). El LPA induce la formación de fibras de estrés y reorganización de los filamentos de actina del citoesqueleto (Sayas et ál., 2002). Estos resultados de la acción de la activación del receptor son precisos para entender el funcionamiento de procesos como el de la esfericidad celular (cell rounding) y el de migración nuclear intercinética. Desarrollaremos este punto en los siguientes apartados. El receptor LPA1 muestra una alta afinidad para un amplio rango de especies de LPA, tanto ligadas a ácidos grasos saturados como a insaturados (Bandoh et ál., 2000). La expresión del receptor LPA1, tanto en ratones como humanos, está ampliamente distribuida en diferentes tejidos y tipos celulares (Contos et ál., 2000; Ye et ál., 2002; Choi et ál., 2010), aunque inicialmente se observó de manera destacada en la zona ventricular de la corteza embrionaria, región donde fue originalmente descubierto (Hecht et ál., 1996). Entre las funciones de este receptor en los diferentes sistemas, tiene especial relevancia las que lleva a cabo en el sistema nervioso. Hasta la fecha de realización de los estudios en desarrollo cerebral presentados en esta memoria de tesis se había demostrado que el receptor LPA1presentaba una alta expresión en la zona ventricular durante el periodo de neurogénesis (et ál. (Hecht et ál., 1996). Asimismo, también presenta una elevada expresión en el bulbo olfatorio (Contos et ál., 2000; Yan et ál., 2003) y en los oligodendrocitos (Weiner et ál., 1998) y las células de Schwann durante el periodo de mielinización (Li y et ál., 2003). La expresión del receptor disminuye gradualmente conforme la neurogénesis cortical llega a su fin, lo cual ocurrirá justo antes del nacimiento. Por su relevancia en el SNC dedicaremos primero un capítulo a analizar los procesos que tienen lugar durante el desarrollo cortical para, después, detallar los estudios que muestran la vía mediada por el receptor LPA1esencial para el SNC. Receptor LPA2 Se trata de una proteína de alrededor de 39 kDa de masa molecular y con 348 aminoácidos (Contos y Chun, 2000; Choi et ál., 2010). Si comparamos su grado de expresión frente al receptor LPA1, vemos que está más restringida en ratones adultos y en humanos. Al igual que el receptor LPA1, el receptor LPA2se expresa en el cerebro embrionario y su expresión disminuye considerablemente en el adulto. El receptor LPA2se acopla a las proteínas Gα12/13, Gαi/o y Gαqi/11 activando las respuestas asociadas a estas vías (Ishii et ál., 2004). La activación del receptor LPA2se ha relacionado con procesos de supervivencia, migración celular y cambios morfológicos (Choi et ál., 2010). Además, se ha relacionado, junto al receptor LPA3, con la invasión y metástasis de células cancerosas de ovario, de endometrio, de mesotelioma y de colon (Shida et ál., 2003; Jeong et ál., 2008; Hope et ál., 2009). En estudios in vivo e in vitro, se 12 12 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 ha mostrado su sobreexpresión en varios tipos celulares cancerígenos (Shida et ál., 2003; Kitayama et ál., 2004; Shida et ál., 2004, Lee y Yun, 2010). Los ratones nulos para LPA2no muestran ninguna alteración de su fenotipo anatómico o cerebral (Contos et ál., 2000a). A diferencia del LPA1, el receptor LPA2no parece ser limitante para el desarrollo normal. Receptor LPA3 Es un receptor acoplado a proteína G, de aproximadamente 40 kDa, que comparte un 50 % de aminoácidos con los receptores LPA1y LPA2(Bandoh et ál., 1999; Im et ál., 2000; Choi et ál., 2010). Se expresa principalmente, en pulmón, riñones, testículos, sistema reproductor femenino, y en menor medida, cerebro (Choi et ál., 2010). En el útero, su expresión se relaciona con la fase de implantación del óvulo y está regulada por estrógenos y progesterona (Choi et ál. 2010). El receptor LPA3se acopla a las proteínas Gαi/o y Gαqi/11 para mediar activación de la vía de la fosfolipasa C, movilización de calcio, activación o inhibición de la adenilciclasa y activación de MAPK (Ishii et ál., 2000). Los ratones nulos para el receptor LPA3son viables, pero las hembras presentan alteraciones en la reproducción, ya que se ve alterada la implantación y localización del embrión, así como al tamaño de la camada (Ye et ál., 2005). A pesar de que se ha encontrado expresión del receptor LPA3en estructuras cerebrales como el hipocampo, la corteza prefrontal y la amígdala, los animales nulos para el receptor LPA3no muestran ninguna alteración observable en el sistema nervioso (Choi et ál., 2010). Receptor LPA4 Presenta una masa de 42 kDa y 370 aminoácidos (Janssens et ál., 1997). Se expresa principalmente en el ovario y, en menor medida, en el cerebro embrionario, el corazón, el timo y el páncreas. Se acopla a proteínas Gα12/13, Gαi/o, Gαqi/11 y Gαs (Lee et ál., 2007), derivando en respuestas tales como esfericidad celular, formación de fibras de estrés o movilización de calcio intracelular (Choi et ál., 2010). Los ratones nulos para LPA4no presentan alteraciones evidentes (Lee et ál., 2008) aunque hay una disminución de la supervivencia prenatal causada por hemorragias relacionadas con anomalías de desarrollo vascular, así como afectación del sistema linfático (Sumida et ál., 2010). El receptor LPA4se ha demostrado relacionado con la osteogénesis, donde parece actuar contrarrestando la acción de LPA1(Liu et ál., 2009, 2010). Receptor LPA5 El receptor LPA5es estructuralmente diferente a los receptores LPA1-3, compartiendo un 35 % de homología con el receptor LPA4. Se identificó por primera vez en el año 2006, a partir de un receptor huérfano de 41 kDa y 372 aminoácidos que demostró tener afinidad por el LPA (Kotarsky et ál., 2006; Joo et ál., 2007). Se ha visto expresión del receptor en el cerebro 13 13 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 embrionario de ratones, implicando un papel durante el neurodesarrollo (Ohuchi et ál., 2008). A través de su unión a las proteínas Gα12/13 y Gαq (Lee et ál., 2006), induce la retracción de neuritas, formación de fibras de estrés e incremento del calcio intracelular. Igualmente, promueve el incremento de los niveles de calcio intracelular y la acumulación de AMPc (Lee et ál., 2006). Los ratones nulos para el receptor LPA5muestran una reducción del umbral nociceptivo y exhiben un fenotipo comportamental menos ansioso que los ratones normales, por lo que parece tratarse de un receptor fundamental en la regulación de la nocicepción y la hipersensibilidad al dolor, así como de la conducta emocional (Callaerts-Vegh et ál., 2012). Receptor LPA6 El receptor de LPA más recientemente identificado. Su vía media cambios en la morfología celular y en la acumulación de AMPc (Yanagida et ál., 2009). Tiene mayor afinidad por las formas saturadas del LPA y necesita de concentraciones más altas (superiores a 10 μM) para tener un efecto, en comparación con la concentración del orden nanomolar necesaria para activar al resto de los receptores de LPA (Yanagida et ál., 2009). Se ha relacionado con el desarrollo del folículo piloso y su acción parece tener relación con evitar la pérdida del cabello (Pasternack et ál., 2008; Shimomura et ál., 2009; Nahum et ál., 2011) 1.2. Neurogénesis cortical y desarrollo del SNC 1.2.1. Formación del tubo neural En los vertebrados, la línea media del ectodermo dorsal embrionario es el origen de todo el sistema nervioso central. La notocorda subyacente, de origen mesodérmico, es el principal emisor de las señales inductoras que inician la formación del tubo neural. La región medial y dorsal del ectodermo embrionario, llamada placa neural, se invagina y pliega hasta el punto que acaban fusionándose sus extremos dorsales, formando un tubo cuyas paredes interiores, por un proceso de proliferación y migración, darán lugar a todas las estructuras del sistema nervioso central (SNC) en un proceso denominado neurulación (Fig. 5) (Kandel et ál., 2000; Squire et ál., 2008). 14 14 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 5. Neurulación en el embrión. Formación del tubo neural en un embrión humano, a partir de la cuarta semana de gestación. (A) Esquema del plegamiento del neuroectodermo para dar lugar al tubo neural. (B) El cierre del tubo es asimétrico, la parte anterior se cierra antes que la posterior. (C) Sobre la imagen, en el círculo rojo se observa el cierre del tubo, formando una abertura denominada neuroporo. (Fuente: https://locosporlabiologia.wordpress.com/2011/06/10/autoconstruccion-en-35fotogramas/) La primitiva luz del tubo neural es el origen de las cavidades del sistema ventricular del SNC, a la vez que las células neuroepiteliales del tubo serán la fuente de todas las células del SNC. Mediante diferentes tipos de división, migración y diferenciación, se originarán neuronas y células gliales (astrocitos, oligodendrocitos y ependimocitos). Otros elementos del SNC, tales como son las células microgliales y vasos sanguíneos, tienen un origen mesodérmico externo al tubo neural. La región más anterior del tubo neural se caracteriza por el desarrollo temprano de tres vesículas de paredes gruesas que darán lugar a las distintas regiones del encéfalo adulto. Estas tres regiones son, en sentido rostro-caudal, el prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo. La zona posterior del tubo neural dará lugar a la médula espinal. La producción, diferenciación y muerte de las distintas células que constituyen el SNC es consecuencia de un complejo programa dirigido por la expresión de genes específicos en el interior de cada célula. En este programa confluyen factores internos y externos. Existen factores inductores, que pueden difundirse libremente entre las células por los espacios intercelulares, y factores de transcripción que se expresan en el interior celular, normalmente por mediación de activación de receptores de superficie que responden a otros estímulos. Por lo tanto el destino de una célula viene determinado, en parte, por las señales a las que se ve expuesta que, a su vez, son consecuencia de su localización en el embrión y, en parte, por el perfil de los genes expresados. A B C 15 15 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 La identidad de los factores endógenos inductores ha sido investigada durante decenios. Hoy día, conocemos algunos factores inductores importantes en la determinación de los ejes dorso-ventral y antero-posterior. La señalización ejercida por Sonic hedgehog (SHH) y las proteínas morfogenéticas de hueso (BMP, del inglés, bone morphogenetic protein) estructuran el tubo neural a lo largo de su eje dorsoventral (Ulloa y Briscoe, 2007). La notocorda y la placa basal del tubo neural son dos estructuras que secretan SHH. El ectodermo epidérmico y la placa tectal del tubo neural secretan BMP. La señalización ejercida por estos factores proviene, en primera instancia, de células no neurales (notocorda y epidermis) que se encuentran cerca de la placa basal y tectal del tubo neural. Por su parte, el eje rostrocaudal del tubo neural se estructura progresivamente durante los varios estadios del desarrollo. Una vez en el estadio de tres vesículas anteriores, el romboencéfalo se organiza en unidades segmentarias. Los genes responsables de estas segmentaciones, denominadas rombómeros, son los genes Hox (Narita y Rijli, 2009; Tümpel et ál., 2009). Estos genes codifican proteínas que tienen un dominio de unión al ADN de sesenta aminoácidos muy conservado, denominado homeodominio. Los genes Hox de los vertebrados se expresan en dominios que se superponen a lo largo del eje anteroposterior del rombencéfalo y la médula espinal en desarrollo. El mesencéfalo se encuentra más allá del límite rostral de la expresión de los genes Hox y, a diferencia del rombencéfalo, no está dividido en segmentos. El patrón celular del mesencéfalo está controlado por la acción de largo alcance de señales procedentes del istmo, que es un centro de organización secundario situado en la unión entre el mesencéfalo y el metencéfalo. Las células del istmo secretan dos moléculas de señalización, Wnt-1 y FGF8, que controlan la diferenciación del mesencéfalo (Canning et ál. 2007). Las neuronas del prosencéfalo de los mamíferos intervienen en las funciones cognitivas más avanzadas. El prosencéfalo comprende la corteza cerebral, los ganglios basales, el hipotálamo y el tálamo. En contraste con otras regiones del SNC, los fenómenos moleculares responsables del desarrollo del prosencéfalo son menos conocidos. Sin embargo, todo indica que la configuración precoz de esta área está controlada de manera similar a la de los niveles más caudales del tubo neural. El prosencéfalo se divide a lo largo del eje rostrocaudal en dominios organizados de forma transversal. A estos dominios se los conoce como prosómeros. Como sucede en el rombencéfalo, los límites de los prosómeros coinciden con los de expresión de señales inductoras y de factores de transcripción (Puelles y Rubenstein, 2003). En esta área se han identificado procesos migratorios de células progenitoras y señalas que modulan el 16 16 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 proceso migratorio. Algunas neuronas de la neocorteza se desarrollan a partir de células que emigran desde la subdivisión estriada del telencéfacalo. Estas células progenitoras expresan dos proteinas con homeodominio, DLX-1 y DLX-2. En ausencia de estas proteínas, las células neuroprogenitoras del estriado no migran a la corteza (Eisenstat et ál., 1999). En el prosencéfalo seguimos conservando el principio de que señales inductoras podrán ejercer control sobre la expresión de genes con homeodominio implicados en el desarrollo. 1.2.2. El epitelio germinativo. Zona ventricular y subventricular Como hemos comentado, en las primeras fases del desarrollo, el tubo neural está formado por una sola capa de células neuroepiteliales con carácter germinativo, a partir del cual se originaran todas las futuras células neuronales y gliales que formarán la totalidad del SNC, con excepción de la microglía y el endotelio vascular (Sidman et ál., 1959; Squire et ál. 2003). La proliferación de este neuroepitelio desemboca en la formación de una pared multicelular, adyacente a los ventrículos, denominada zona ventricular (ZV), con capacidad de división mitótica y que originará las células del SNC (Noctor et ál., 2004) y, en última instancia, la futura corteza cerebral (Caviness et ál., 1995; Takahashi et ál., 1999; Rakic, 2002). Los progenitores neurales se localizan en la zona ventricular (ZV), en la que se producen la gran mayoría de las divisiones mitóticas y en otra zona adyacente, justo por encima de ella, la zona subventricular (ZSV), generada a partir de la ZV. A pesar de que la zona ventricular posee un mayor protagonismo, en la ZSV también se producen divisiones celulares activas de células neuroprogenitoras (Noctor et ál., 2004), siendo, hoy día, una de las zonas más importantes en la neurogénesis en estadios postnatales y adultos (Luskin, 1993, Alvarez-Buylla y GarcíaVerdugo, 2002; Götz y Huttner, 2005; Merkle y Alvarez-Buylla, 2006). En el proceso de formación de la corteza encontraremos dos factores igualmente necesarios: una intensa actividad neurogénica y unos masivos procesos de migración. Durante las primeras fases del desarrollo, se crea una población suficiente de células progenitoras, precursores neuronales, en la ZV, con morfología bipolar que contactan con el líquido cefalorraquídeo embrionario (LCR) apicalmente y con la membrana limitante externa del tubo neural en la zona basal, mediante una, más o menos larga, prolongación (Sidman y Racik, 1973). La división simétrica que tiene lugar en las etapas tempranas generará a partir de las células neuroepiteliales dos células hijas y cuya población se expanderá lateralmente y radialmente transformándose, en este último caso, en las denominadas (por razones históricas) células de la glia radial (CGR) (Fig. 6). Las largas prolongaciones de estas células se 17 17 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 expandirán por el neuroepitelio y servirán de guía para la migración de las neuronas formadas (Noctor et ál., 2004; Götz y Huttner, 2005; Tan y Shi, 2013). A B Figura 6. Esquemas de desarrollo cortical. (A) Esquema de un corte transversal de la corteza cerebral en desarrollo. En la zona ventricular (VZ) las células neuroepiteliales (en azul) en diversos estadios del ciclo celular (G1, S, G2 y M) ocupan diferentes niveles. En la zona subventricular (ZSV) continúa la actividad mitótica. Los precursores migran desde la ZV y ZSV hacia la superficie pial por las prolongaciones de la glia radial (en verde) y se diferencian en neuronas que ocupan las diferentes capas de la corteza (tomado de Herrup y Yang, 2007). (B) Esquema mostrando los diferentes tipos de células progenitoras en relación al curso del desarrollo. Los progenitores se clasifican de acuerdo a la localización de su fase de mitosis. Así, al comienzo de la neurogénesis son apicales en incluyen los precursores neuroepiteliales de origen y los de fase corta, además de las células de la glía radial (CGR). Conforme madura la corticogénesis, la glia radial se dividirá directamente , de forma asimétrica, para dar lugar a más glía radial y neuronas, o indirectamente, generando progenitores basales, intermedios que también darán lugar a neuronas desde posiciones más basales (modificado de Laguesse et ál., 2015). 24 24 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 oligodendrocitos, penetrarán en la corteza por medio de migración tangencial (Marín 2013; Marín y y Rubenstein, 2013). A medida que una rápida división celular ensancha la capa proliferativa en la zona ventricular, la primitiva estructura cortical va avanzando desde ser un simple neuroepitelio monocapa hasta formar una estructura mucho más compleja (Kandel et ál., 2000; Squire et ál., 2008). Dentro de este proceso, en primer lugar distinguimos una preplaca, en la que ya no observamos movimientos de los núcleos celulares en la dinámica de la migración nuclear intercinética. Asimismo, se observa otra intermedia en la que solo vemos axones provenientes del tálamo. Por lo tanto, en un primer estadio del desarrollo distinguimos una zona ventricular, en la que se localizan las células que están proliferando, una zona intermedia, en la que sólo encontramos axones, y una preplaca en la que se ubican los precursores neuronales postmitóticos (Fig. 11) (Kandel et ál., 2000; Squire et ál., 2008). Más tarde podemos distinguir una primitiva corteza embrionaria que formará la placa cortical que irá agrandándose y albergando las diferentes capas de la corteza. Alrededor de E18 la corteza embrionaria presenta ya varias capas bien diferenciadas (Fig. 12). La placa cortical es la precursora de la mayoría de la corteza. Casi la totalidad de las neuronas de la placa cortical se han generado entre los dias 11 y 17 del desarrollo embrionario (Molnár et ál., 2006). Así pues, esta capa en estadios tardíos del desarrollo (Ej. 18 dias de gestación) nos puede servir de indicativo para intuir cómo será la futura corteza cerebral adulta. Como se mencionó anteriormente (Fig. 11) la preplaca, en los primeros estadios del desarrollo embrionario, se subdivide en una zona marginal ,futura capa I de la corteza, y una subplaca (Fig.s 11 y 12), entre ambas, la incorporación de las células a la placa cortical formará las restantes capas desde la II a la VI. (De Carlos y O’leary, 1992). La temprana diferenciación de la subplaca llevó a pensar que las neuronas de esta zona podían jugar un papel importante en el desarrollo cortical. La relación que existe entre la zona marginal y la subplaca constituye el primer circuito funcional identificado en el desarrollo de la corteza en mamíferos (Kostovic y Rakic, 1990). Se ha sugerido que las células de la subplaca actuan en la diferenciación neuronal y la conexión de circuitos en la placa cortical (Friauf et ál., 1990) incluido el cuerpo calloso. Las neuronas de la subplaca parecen participar en las conexiones eferentes y aferentes entre la corteza y estructuras subcorticales, de hecho, las proyecciones eferentes de la corteza proceden exclusivamente de las capas V y VI (De carlos y O’leary, 1992). La función de la subplaca en el desarrollo de los sistemas de proyección cortical es de vital importancia. 25 25 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 11.Formación de capas corticales. (A) La mayoría de las neuronas corticales y las de proyección glutaminergicas se generan en la zona ventricular (VZ) y migran radialmente sobre prolongaciones de la glía radial a través de la zona intermedia (IZ) para agregarse en la placa cortical (CP, del inglés, cortical plate). (B) La mayoría de las interneuronas GABAérgicas corticales se generan en las eminencias ganglionares (GE, del inglés, ganglionic eminence) y migran tangencialmente a través de la IZ y la zona marginal (MZ, del inglés, marginal zone) para distribuirse en el neocortex. (C) Desarrollo de las capas corticales en roedores. Las primeras neuronas generadas en la VZ se agregan en la zona cercana a la superficie pial y forman la preplaca (PP) que más tarde se divide para formar la zona marginal (MZ) y la subplaca (SP) quedando separadas por las neuronas de la placa cortical (CP) generadas posteriormente. Las neuronas de la CP se van incorporando siguiendo un esquema de dentro hacia afuera, en el que las neuronas nacidas antes forman las placas más profundas mientras que las más recientes migran sobrepasándolas para formar progresivamente las capas más superficiales. WM, sustancia blanca (del inglés, white matter). (D) Estadios de desarrollo de la corteza de ratón según los diferentes días del desarrollo embrionario (E8.5, E10, E12) y en adulto. La zona subventricular germinativa (SVG, del inglés subventricular germinal zone) es patente desde el estadioE12 (o E13 según los autores). Tomado, con modificación, de O´Leary y Nakagawa, 2002) 26 26 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 12. Corticogénesis durante los estadios de desarrollo de ratón. CP, placa cortical; FL, capa fibrosa; MZ, zona marginal; SP, subplaca; SVZ, zona subventricular (proliferativa); VZ, zona ventricular (proliferativa). Tomado de Molnár et ál., 2006. 1.2.6. Factores reguladores de la neurogénesis cortical analizados en este estudio Durante el desarrollo cortical están presentes una amplia gama de moléculas que controlan los procesos de migración, laminación, y de la formación de las capas corticales. A su vez, los diferentes linajes celulares generan una amplia diversidad celular a lo largo del proceso que se caracteriza por expresar una serie de marcadores celulares que diferencia cada tipo específico celular del conjunto de progenitores neurales. No es propósito de esta tesis, por motivos de extensión, profundizar en este apartado en la acción de cada uno de ellos pero sí queremos mencionar específicamente alguno de los que se han estudiado en este trabajo y que han permitido caracterizar mejor la función del receptor LPA1en esta etapa del desarrollo. -Pax6. El factor de transcripción Pax6 pertenece a un grupo relativamente pequeño de factores de transcripción que ejercen un control esencial en el desarrollo cortical y cuya deleción o mutación en el embrión causa defectos cerebrales y una amplia variedad de alteraciones del neurodesarrollo. Presenta un alto grado de conservación y se expresa en gradiente en la corteza en desarrollo, siendo esencial para la corticogénesis (revisado en Manuel et al., 2015). Durante el período neurogénico Pax6 se expresa en los progenitores apicales de la ZV en gradiente elevado en sentido rostrolateral y bajo en sentido caudal-medio. Los progenitores apicales que dan lugar a los progenitores basales expresan, de manera transitoria el factor de transcripción proneural Neurogenina 2 (Ngn2; Britz et al., 2006). Pax6 no se expresará en los progenitores basales que, sin embargo, se caracterizarán por expresar otro factor de transcripción, Tbr2. De esta manera, en la corticogénesis del ratón (en primates existe un mayor solapamiento y una estructura diferente de cada área), tendrá lugar una secuencia de 27 27 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 expresión que caracteriza la transición de un progenitor apical a un progenitor basal y de éste a una neurona postmitótica, siendo ésta: Pax6 → Ngn2→ Tbr2 → Tbr1. A nivel celular Pax6 es un factor esencial para la regulación de al proliferación de los progenitores corticales. Como hemos mencionado, la regulación de la proporción de división simétrica/asimétrica es esencial en la neurogénesis. La longitud del ciclo celular de los progenitores apicales de ratón se incrementa desde 8h (en estadio embrionario E10) a 18h en el final de la neurogénesis (E18) debido al aumento de duración de la fase G1 (Takahashi et ál., 1995; Estivill-Torrús et ál., 2002).El alargamiento de la duración de G1 actúa promoviendo el número de progenitores basales, que muestran un ciclo celular más largo (Arai et al., 2011). Pax6 es crítico para el control espacial y temporal de la duración del ciclo celular en los progenitores corticales. Su pérdida durante la corticogénesis termina por acortar la duración del ciclo celular de los progenitores, forzando su salida de ciclo y maduración temprana, aumentando el número de divisiones asimétricas y el de neuronas postmitóticas (Estivill-Torrús et ál., 2002). Su función afecta igualmente a la posición laminar final así como al subtipo de neuron de proyección cortical ya que son dependientes del tiempo empleado por los progenitores para salir del ciclo celular. Pax6 ejerce una acción represiva sobre la progresión del ciclo celular en los progenitores corticales, estando sus niveles de expresión correlacionados con la duración de ciclo, siendo los de mayor expresión en las áreas donde la duración de ciclo es mayor, y los de menor expresión, en las de ciclo celular más corto (Mi et ál., 2013). Además, su acción no sólo se restringe al control de ciclo sino que se ha demostrado como un determinante de destino neuronal en los progenitores corticales (Heins et ál., 2002). - Tbr2. De la misma manera que Pax6 caracteriza a los progenitores apicales, la expresión del factor de transcripción Tbr2 lo hace en los progenitores intermedios basales, marcando el final de expresión del primero y el comienzo de la del segundo, la transición de génesis de un progenitor a otro. La relación entre ambos es tal que la pérdida de expresión de Pax6 genera pérdida de expresión de Ngn2 en la ZV y una bajada de expresión de Tbr2 en la ZSV; a su vez, una sobreexpresión de Pax6 termina en aumento de expresión de Ngn2 yTbr2 (Sansom y Livesey, 2009). Los estudios usando animales con deleción de Tbr2 han mostrado una disminución del grosos de las capas corticales, similar tanto en las capas profundas como las más superficiales, y pérdida de progenitores intermedios (Sessa et ál., 2008). Por contra, su sobreexpresión aumenta las células positivas al marcador de células en fase de mitosis fosfohistona H3, el grosor de la ZV y ZSV, y la proporción de progenitores intermedios basales (Vasistha et al., 2015) 28 28 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 - Neurogeninas 1, 2 (Ngn1 y Ngn2). Al igual que acabamos de citar con Ngn2, Ngn1 es un factor proneural, cuyo gen pertenece a la familia de factores de transcripción caracterizada por el motivo estructural de dos hélices alfa conectadas por un bucle, expresado como "hélicebucle-hélice" básico (bHLH, del inglés, basic helix-loop-helix). Ngn1 participa igualmente durante la especificación de destino neuronal en el progenitor, y activa simultáneamente el programa de determinación neurogénica, a la vez que inhibe la determinación de tipo astrogliogénica por medio del secuestro e inhibición de coactivadores y reguladores génicos progliales. Durante la neurogénesis, entre E12-E15 en el ratón, los niveles de expresión de Ngn1 permanecen elevados, mientras que están muy reducidos durante la astrogliogénesis (P0-P4, siendo estos, días postnatales) (Sun et ál., 2001; He et ál., 2005). - p27kip1 (también llamada p27) La progresión durante el ciclo celular en mamíferos está regulada y dirigida por la activación secuencial de los complejos ciclina-quinasas dependientes de ciclina (Cdk, del inglés, cyclin dependent kinase).La actividad de las Cdk está regulada negativamente por la famiia de proteínas Cip/kip, proteínas inhibidoras de Cdk, que incluye p21, p27 y p57, las cuales se asocian a complejos de cliclina-Cdk inhibiendo su actividad quinasa en puntos de control de transición de fases del ciclo celular G1/S y G2/M, siendo el punto G1/S donde actúa p27kip1 para impedir la progresión de la fase G1 (Sherr y Roberts, 1999). El potencial neurogénico de los precursores apicales viene medido por la proporción de células que salen del ciclo celular frente a las que permanecen proliferando, reentrando en ciclo. Durante la corticogénesis la proporción de salida de ciclo aumenta a expensas de la segunda, en un control orquestado por diferentes mecanismos capaces de controlar y activar el modo de división en un momento dado, entre ellos p27kip1, de manera que las alteraciones de su expresión tendrían efectos inmediatos en la neurogénesis. Así, la sobreexpresión de p27kip1 provoca un incremento en la proporción de células de la ZV que salen del ciclo celular y migran a las capas superciales, alterando la laminación cortical (Tarui et ál., 2005).Además, p27kip1 también participaen funciones adicionales a las propias de ciclo celular, interactuando con Ngn2 para inducir la activación de sus genes diana, o bien promoviendo la migración y la morfología de las neuronas postmitóticas a través de la reorganización del citoesqueleto de actina mediante la formación de complejos e interacciones con Cdk5 y conexina 43 (Kawauchi et ál., 2013). - Tis21.Tis21 (Tis21 en ratón; PC3 en rata; BTG2 en humano) es un gen antiproliferativo implicado en el control de la progresión del ciclo celular, en la transición de la fase G1 a S y que, durante el periodo de corticogénesis se asocia con la longitud de ciclo celular y las divisiones neurogénicas de los progenitores, no expresándose hasta que comienza la 29 29 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 neurogénesis y haciéndolo, además, en la fase de división asimétrica, marcando selectivamente los progenitores neurogénicos, no los proliferativos, así como tampoco las neuronas postmitóticas (Iacopetti et ál., 1999). Prácticamente todas las neuronas tempranas derivan de progenitores apicales que expresaban Tis21, y la mayoría de progenitores basales que expresan Tis21 terminan por generar una división neurogénica, sin embargo, se ha observado que las células que expresan Tis21 no suelen generar neuronas directamente, sino que generan progenitores basales que darán lugar a neuronas (Attardo et ál., 2008, 2010). En el desarrollo del ratón, entre E10.5-E18.5, las divisiones de progenitores apicales son más numerosas que las de los basales, pero éstas son más neurogénicas (10%-20% son neurogénicas en apicales vs. 40%-80% en basales) (Kowalczyk et ál., 2009. A efectos de su uso como marcadores las divisiones de células que expresan Pax6, apicales en su mayoría, son más numerosas, pero las de células que expresan Tbr2, basales, son más neurogénicas. A su vez, la mayoría de todas las células con división asimétrica (es decir, presumiblemente neurogénicas) quedarían señaladas por la expresión de Tis21. De manera llamativa, la mayoría de los progenitores intermedios producen la mayor parte de la interneuronas de proyección en la preplaca así como en las capas profundas y superficiales de la corteza (Kowalczyk et ál., 2009). 1.3. Efectos biológicos del LPA e implicación en el desarrollo del SNC La participación de la señalización mediada por LPA en el SNC ha sido ampliamente documentada durante la última década. El LPA actúa sobre la mayoría de los tipos celulares del SNC y participa en una amplia variedad de procesos tanto del desarrollo como en el adulto o en condiciones patológicas, incluyendo neurogénesis, dolor neuropático, daño neural, esquizofrenia, epilepsia o déficit cognitivo (revisado en Frisca et ál., 2012; Choi y Chun 2013; Yung et ál., 2015). Como hemos mencionado, la expresión Lpar1 en la ZV durante el desarrollo sugería un papel relevante en el desarrollo cortical (Hecht et ál., 1996; Figura 13). La caracterización de animales carentes del receptor LPA1(LPA1-nulos) ha permitido demostrar fenotipos neurales asociados específicamente al receptor. Desde un punto de vista de desarrollo cortical, determinados modelos de deleción de LPA1generan un 50% de muerte perinatal asociada con defectos olfatorios y algunos defectos de sistema nervioso (Contos et ál., 2000; Harrison et ál., 2003). Además, la administración exógena de LPA genera un aumento del grosor cortical en cultivos de corteza de ratón debida, no a efectos proliferativos, sino a la inhibición de muerte celular, aumentando de manera notable la población postmitótica 30 30 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 neuronal (Kingsbury et ál., 2003). En ese sentido, también se ha descrito una acción supresora de apoptosis del LPA en estudios in vitro en células H197, una línea celular embrionaria de progenitores hipocampales Sun et ál., 2013). El LPA tiene múltiples efectos sobre los progenitores neurales. Los primeros estudios demostraban cambios en la conductancia a calcio mediados por el receptor LPA1en respuesta a glutamato y GABA (revisado en Dubin et ál., 2010), cambios que son bien conocidos por ser relevantes para la proliferación, diferenciación y funcionalidad de las células. También, se ha propuesto su participación, a través de cambios citoesqueléticos, en la migración nuclear intercinética, activando el LPA la fase de esfericidad de los progenitores apicales durante este proceso e induciendo desplazamiento mitotico, incrementando el porcentaje de células mitóticas en posición basal (Fukushima et ál., 2000; Kingsbury et ál., 2003; Herr et ál., 2011; Yung et ál., 2011). Figura 13. Expresión del gen Lpar1 en la zona ventricular telencefálica. Imágenes de hibridación in situ con una ribosonda de Lpar1 sobre corte sagital (A) y coronal (B) del cerebro embrionario de ratón en estadio E14 mostrando la expresión del receptor en la ZV (flechas). VL: ventrículo lateral, BO. Bulbo olfatorio, Est: Estriado, TA: Tálamo, P: Puente, CB: Cerebelo, M: Médula, TV: tálamo ventral (Hecht et ál., 1996). En relación a su papel en procesos proliferativos también se ha demostrado su papel en neuroesferas de ratón obtenidas en período perinatal, donde el LPA induce la proliferación y diferenciación clonal (Svetlov et ál., 2005). La participación del LPA no sólo se restringe a la división sino que también actuaría sobre la migración celular. Así, en estudios in vitro en la línea celular B103, progenitores corticales y explantes de corteza cerebral, ambos de ratón en E12, se observó que el LPA, a través de la vía dependiente de Rho, y las fibras de retracción de F-actina, inducía en ellos la retracción de conos de crecimiento y lamelipodios (Fukushima et ál., 2002). Los estudios in vitro de administración exógena de LPA sobre neuroblastos permitieron proponer a las neuronas postmitóticas como fuente exógena de LPA que actuaría 31 31 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 sobre los precursores neurales a modo de control por retroalimentación (Fukushima et ál., 2000) (Fig. 14). Los receptores LPA1y LPA2son los únicos que median efectos sobre el citoesqueleto, por medio de las vías de activación de la subunidades de proteína G, Gαi/0 y Gα12/13 (Fukushima, 2004). La reorganización del citoesqueleto está regulada por las Rho-GTPasas, en concreto RhoA, Cdc42 y Rac (Ridley, 1994; Moolenaar et ál., 2004). Estas enzimas ejercen su acción sobre los microfilamentos y la polimerización de filamentos de actina (Sayas et ál., 2002). Los dominios citoplasmáticos de los conos de crecimiento axonal están compuestos de filamentos de actina (F-actina) y complejos de proteínas ligadoras de actina. La estimulación de la via de Rho y la consiguiente activación de las proteínas ROCK producen una fosforilación de cadenas ligeras de miosina y activan, al mismo tiempo, a la miosina fosfatasa, la cual retira residuos de fosfato de la las cadenas de miosina, teniendo por resultado final el incremento de la reorganización de filamentos de actina y la contracción celular (Fukushima, 2004). El LPA, como citamos a continuación, también favorece la retracción de fibras del citoesqueleto ya que actúa sobre los microtúbulos, polímeros de /tubulina, principal componente de la parte central del cono de crecimiento axonal y esenciales para la formación y mantenimiento de las prolongaciones axonales y neuritas, favoreciendo a los microtúbulos dinámicos frente a los estables. Figura 14. Acción propuesta para el LPA durante la neurogénesis cortical. El LPA extracelular producido por neuronas postmitóticasinteractuaría con alta afinidad sobre los receptores de LPA presentes en los neuroblastos de la ZV. Esto, activaría la 32 32 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 señalización conduciendo a la retracción de prolongaciones celulares, la esfericidad celular y la migración nuclear. (Modificado de Fukushima et ál., 2000). A nivel neuronal la administración de LPA, a través de la vía Gαi/0 promueve la diferenciación a linaje neuronal (Kingsbury et ál., 2003; Fukushima et ál., 2007), y, vía Gα12/13, la reorganización citoesquelética (Fukushima et ál., 2002; Fukushima y Morita, 2006) y la retracción de neuritas, siendo esta mediada, cuando menos, por la vía de señalización de ROCK (Tigyi et ál., 1996) y por los receptores transitorios TRMP2 (del inglés, transient receptor potential channel, subfamily M, member 2) y, con ello, actuando, igualmente, sobre el cono de crecimiento axonal, la morfología, y la movilidad de las neuronas postmitóticas (Fukushima et ál., 2004; Moolenaar et ál., 2004; Yamazaki et ál., 2008) (Fig. 15). Figura 15. Posibles funciones del LPA en las neuronas postmitóticas.El LPA causa retracción de neuritas y esfericidad celular en neuronas jóvenes, mientras que en neuronas más viejas causa una parada del cono de crecimiento axonal y una modulación de su orientación. (Modificado de Fukushima, 2004). El papel del LPA en el desarrollo no se circunscribe únicamente a procesos proliferativos o estructurales sino que actúa también sobre la diferenciación funcional de la neurona joven. Así, en cultivo de neuronas hipocampales induce la ramificación neurítica, proceso éste fundamental para el desarrollo de las redes neuronales (Furuta et ál., 2012) e incluso condiciona la polaridad de la neurona, induciendo cambios en la localización del aparato de Golgi y en la posición del inicio del axón (Yamane et ál., 2010). En este sentido y, dada la 33 33 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 necesidad de trabajar con modelos in vivo, más allá de lo que supone la administración exógena de LPA, los estudios con modelos de ratones nulos para el receptor LPA1de la variedad Málaga han demostrado, en esta misma línea, la necesidad del receptor LPA1para la neurogénesis hipocampal así como para el correcto desarrollo del árbol dendrítico en las nuevas neuronas que se forman a nivel hipocampal, tanto en condiciones normales como patológicas (Matas-Rico et ál., 2008; Castilla-Ortega et ál., 2010). Además de en roedores, las funciones del LPA se han descrito en cultivos de células troncales y progenitores neurales humanos tanto de origen embrionario como de células troncales pluripotentes inducidas, demostrándose que el LPA inhibía, en ambas poblaciones, la formación de neuroesferas, su expansión y diferenciación neuronal, induciendo también la retracción de neuritas, y que dicha actividad antidiferenciadora era mediada a través de las rutas de activación por Rho/ROCK, PI3K y Akt ( Frisca et ál., 2013). No obstante, las condiciones de cultivo pueden determinar variaciones de efecto ya que, años antes, Hurst et ál. (2008) demostraban en una línea celular humana neuroepitelial derivada de células troncales embrionarias que el LPA inducía proliferación y esfericidad celular. En el momento en que los trabajos expuestos en esta memoria se llevaron a cabo se acababa, con ello, de dar un paso adelante al poner de manifiesto, por primera vez, aspectos concretos del papel del receptor LPA1en el desarrollo del SNC en modelos in vivo. Sin embargo aún quedaban por analizar numerosos aspectos, entre ellos, la participación del receptor en relación a otras poblaciones celulares como los astrocitos, oligodendrocitos o, incluso, microglia. Los astrocitos expresan mayoritariamente el receptor LPA1, si bien en cultivo amplían el rango de receptores (LPA1-5), y, durante el desarrollo, el LPA, cuando es administrado, induce en ellos proliferación, generación de especies de oxígeno reactivas, reorganización citoesquelética, y la expresión, entre otros, del factor de crecimiento nervioso (NGF, del inglés, nerve growth factor) y de las interleucinas (IL), IL-1β, IL-3, y IL-6 (Tabuchi et ál., 2000; Shano et ál., 2000; Spohr et ál., 2008). Especialmente interesante es la inducción de diferenciación neuronal y de crecimiento axonal que ejercen, en cultivo, los astrocitos activados por LPA, por medio de proteínas de matriz extracelular, sobre progenitores corticales (Spohr et ál., 2011). También han tenido especial desarrollo los estudios de señalización por LPA en las poblaciones de células mielinizantes. Durante el desarrollo del sistema nervioso, el receptor LPA1se expresa en precursores neuronales localizándose en la zona subventricular embrionaria donde tiene lugar la neurogénesis cortical (Hecht et ál., 1996; Estivill-Torrús et ál., 2008). Tras el nacimiento, esa expresión disminuye pero continúa en los oligodendrocitos y las 40 40 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 sináptico, donde la enzima, que actúa como un regulador clave en la potenciación a largo plazo y la excitabilidad neuronal (Lisman et ál., 2002), modula la transmisión glutamatérgica. En dicho trabajo se demostró que, a nivel postsináptico, los ratones nulos para el receptor LPA1 mostraban cambios en la interacción de la enzima con los receptores glutamatérgicos ionotrópicos NMDA y de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico, AMPA (del inglés, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid). Como consecuencia, los receptores AMPA mostraron una conductancia alterada y una reducción de la respuesta en las vías de señalización intracelular por NMDA (Lisman et ál., 2002). Asimismo, a nivel presináptico la carencia del receptor en estos animales genera una acumulación de los denominados complejos de proteínas SNARE, mediadores de la fusión de las vesículas sinápticas y que tienen relevancia en algunas patologías como en la esquizofrenia (Lisman et ál., 2002). En relación con la modulación glutamatérgica hipocampal, es preciso señalar que la señalización mediada por LPA implica no solo al receptor LPA1sino también al receptor LPA2, el cual se ha detectado en terminales presinápticos glutamatérgicos (Trimbuch et ál., 2009). Muchos de los mecanismos que regulan la formación de la memoria y la potenciación a largo plazo son activados y regulados por modificaciones en el estado de fosforilación de diferentes proteínas quinasas, como la quinasa activada por estímulos extracelulares, Erk (del inglés, extracelular signalregulated kinases) y CaMKII cuya actividad puede ser también modulada por neurotransmisores como la serotonina (Cammarota et ál., 2008). De esta forma, el LPA por medio de sus receptores, principalmente el LPA1, confiere un importante papel sobre estos procesos. En el año 2002 y, durante la expansión de la colonia de la línea original nula para Lpar1 (Contos et ál., 2000) cedida por el Dr. Jerold Chun del Departamento de Neurociencia Celular y Molecular en el Centro Dorris de Neurociencia, en el Instituto de Investigación Scripps (La Jolla, Estados Unidos), nuestro grupo de investigación obtuvo, de manera espontánea una variante viable y estable que fue denominada Málaga (maLPA1, Estivill-Torrús et ál., 2008). Además de exhibir características morfológicas similares a sus predecesores, el análisis de la corteza cerebral de los ratones maLPA1-nulos reveló una serie de datos que demostraban el papel del receptor en el desarrollo cortical y que son los que se exponen en esta memoria. A partir de este momento se caracterizó de manera intensiva este ratón dando, como resultado una extensa variedad de trabajos que ha permitido avanzar en el conocimiento de la función del receptor LPA1por tratarse, precisamente, de los primeros estudios, en muchos casos, que mostraban la función in vivo del receptor. Así, nuestro grupo demostró que el receptor LPA1era necesario para la neurogénesis adulta, tanto para la presente en la zona subventricular (Matas Rico, 2009) como para la 41 41 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 hipocampal localizada en el giro dentado, área en la que la carencia del receptor reducía significativamente la neurogénesis, tanto en condiciones basales como tras la estimulación por la combinación de la exposición al enriquecimiento ambiental y al ejercicio físico voluntario, afectándose también la supervivencia y la maduración dendrítica, así como niveles de factores neurotróficos (Matas-Rico et ál., 2008; Figura 17), defectos éstos que quedaban agravados ante reguladores negativos como el estrés (Castilla-Ortega et ál., 2011).. Recientemente, estudios desarrollados también por nuestro grupo de investigación han mostrado que los ratones maLPA1-nulos presentan una hiperactividad neuronal a nivel hipocampal y prefrontal en condiciones basales (Castilla-Ortega et ál., 2012). Esta alteración podría estar relacionada con las variaciones en la transmisión glutamatérgica hipocampal (Blanco et ál., 2012) y en modelos similares con ausencia del receptor, que muestran alteración de la densidad y la actividad de varios receptores de glutamato (Musazzi et ál., 2011), acumulación de los complejos de SNARE y aumento de la fosforilación de la proteína CaMKII (Musazzi et ál., 2011). Otra evidencia destacable de los ratones maLPA1-nulos es la reducción del número de neuronas GABAérgicas que expresan proteínas ligadoras de calcio tanto en el hipocampo (Matas Rico, 2009) cómo en amígdala (Pedraza et ál., 2014). En este sentido, recientemente, y en colaboración con el grupo del Dr. Álvarez Dolado en el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), se ha demostrado que, en el hipocampo, el trasplante de precursores GABAérgicos derivados del fenotipo silvestre o normal del ratón (en inglés, wild-type) permite compensar el déficit de interneuronas y rescatar los defectos observados en los animales nulos para LPA1(en inglés, null), demostrando la especificidad de la señalización en el desarrollo de los precursores interneuronales (Rosell del Valle, 2014). Junto a estos defectos, la caracterización del ratón Málaga maLPA1-nulo nos ha permitido demostrar la participación del receptor en la diferenciación de oligodendrocitos, así como en la mielinización, resultando necesario para el transporte de las proteínas a la membrana celular para la formación de la mielina (García-Díaz et ál., 2007). También ha permitido determinar mejor la localización del receptor en el cerebro, mediante técnicas de autorradiografía funcional realizadas sobre el animal control normal de fenotipo salvaje y el animal nulo, así como la distribución anatómica de diferentes especies de LPA y de algunos de sus fosfolípidos precursores (González de San Román et ál., 2015). 42 42 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 17. Alteraciones morfológicas y defectos neuronales en ratones adultos nulos para el receptor LPA1.(A) En el animal adulto de fenotipo silvestre [(+/+)] la expresión del receptor LPA1se localiza en las fibras de mielina corticales radicales y del cuerpo calloso (cs) y en la zona del giro dentado (gd) del hipocampo (izquierda), donde se expresa en los precursores neuronales (derecha, arriba) como demuestra la colocalización del receptor con el antígeno doblecortina, específico de progenitores neuronales inmaduros (derecha, abajo). La imagen central corresponde al animal nulo para el receptor [(-/-)], sin reactividad detectable para LPA1.(B) A nivel hipocampal y en comparación con los animales normales, la ausencia del receptor genera una menor neurogénesis adulta (detectada por estudios con bromodesoxiuridina) y una proliferación incompleta (detectada por la inmunohistoquímica para la doblecortina) en el giro dentado, particularmente tras la estimulación con enriquecimiento ambiental y ejercicio (Matas-Rico et ál., 2008; Castilla-Ortega et ál., 2011). Cc: cuerpo calloso, cm: capa molecular, cg: capa granular, zsg: zona subgranular, GD: giro dentado. La señalización por LPA no sólo regula procesos durante el desarrollo y la etapa adulta sino que, como se ha demostrado por la administración de fármacos agonistas y antagonistas de los receptores, interviene en procesos más complejos (revisado en Kihara et ál., 2015; Llona- 43 43 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Minguez et ál., 2015). De manera similar, el uso del ratón nulo para el receptor LPA1ha permitido demostrar en el SNC y en relación con la neurogénesis, la implicación específica del mismo en diversas funciones complejas, a nivel neurológico y psiquiátrico. Además de caracterizar la neurogénesis cortical durante el desarrollo, y la que tiene lugar en el adulto, a nivel hipocampal, y en relación a la plasticidad estructural, morfológica y neuroquímica nuestro grupo de investigación también realizó un exhaustivo análisis neurológico de estos animales durante los años posteriores a los resultados plasmados en esta tesis y que, en cierto modo, refuerzan los resultados y acentúan su relevancia funcional normal e incluso en condiciones patológicas. En el ratón en etapa adulta la ausencia del receptor viene acompañada de déficits moderados de tipo olfativo, somestésicos y motores, sin presentar alteraciones funcionales en la retina ni en los potenciales evocados auditivos (Santín et ál., 2009). Estos déficits sensoriomotores podrían deberse, al menos en parte, a las alteraciones en el neurodesarrollo que afectan a la mielinización (Contos et ál., 2000; García-Díaz et ál., 2007) y a la organización de regiones cerebrales tales como el bulbo olfatorio (Contos et ál., 2000) y la corteza motora (Estivill-Torrús et ál., 2008). En los últimos años, nuestro grupo ha examinado en los ratones maLPA1-nulos el comportamiento exploratorio, las conductas emocionales, la memoria relacional y aversiva, entre otras (Santín et ál., 2009; Castilla-Ortega et ál., 2010; Blanco et ál., 2012; Castilla-Ortega et ál., 2012; Pedraza et ál., 2014; Castilla-Ortega et ál., 2014), demostrando la relevancia de este ratón como modelo para el estudio de trastornos psicopatológicos, además de hacer evidente el papel que desempeña la señalización mediada por el receptor LPA1en la conducta normal (revisado en Estivill-Torrús et ál., 2013). En consonancia con el trabajo inicial de Harrison et ál. (2003), en ausencia del receptor LPA1, y por comparación con el fenotipo silvestre, los ratones maLPA1-nulos manifiestan un claro déficit exploratorio cuando son expuestos a contextos espaciales novedosos en la prueba de campo abierto, así como un aumento del comportamiento de tipo ansioso en la prueba del laberinto en cruz elevado (Santín et ál., 2009). Los estudios experimentales realizados por nuestro grupo de investigación han mostrado claramente la importancia del receptor LPA1en el aprendizaje de tareas dependientes del hipocampo, tales como el aprendizaje y la memoria espacial a través de la prueba del laberinto acuático de Morris, demostrando un claro déficit en la memoria espacial a largo plazo de los ratones maLPA1-nulos junto a un uso anómalo de las estrategias de búsqueda (Santín et ál., 2009). Estos resultados demuestran la importancia de este receptor en la memoria espacial y permiten inferir que, en experimentos de administración intrahipocampal de LPA, la mejora del aprendizaje espacial inducida por LPA (Dash et ál., 44 44 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 2004), puede deberse a la estimulación del receptor LPA1. El uso de diferentes estrategias de estudio de conducta, como el laberinto de hoyos, permitió demostrar que los animales carentes del receptor del LPA1, presentan un grave déficit en la memoria de referencia espacial, déficit que fue mayor conforme aumentaba la dificultad de la tarea descrita, y que mostraban dificultad en aprender las reglas de la tarea de la memoria de trabajo, un componente asociado, de nuevo, con la memoria a largo plazo de tipo espacial (Castilla-Ortega et ál., 2010). En este mismo estudio, se demostró que tanto la ansiedad como el aprendizaje estaban afectados de manera específica e independiente, por la ausencia del receptor LPA1 (Castilla-Ortega et ál., 2010). Igualmente hemos descrito defectos en memoria episódica (Castilla-Ortega et ál., 2012) o, más recientemente, hemos vinculado por primera vez el receptor LPA1con la capacidad para extinguir asociaciones complejas y dependientes del hipocampo, en modelos de miedo condicionado contextual (Pedraza et ál., 2014), o en el establecimiento de las asociaciones droga-contexto, una forma de memoria contextual dependiente del hipocampo (Blanco et ál., 2012). Los estudios llevados a cabo hasta la fecha por nuestro grupo y otros equipos de investigación hacen pensar que, al igual que sucede con otros receptores en el sistema nervioso, la actividad de los receptores de LPA1funciona a demanda. Así, en el hipocampo, la estimulación neurogénica mediante el ejercicio y el enriquecimiento ambiental es la que acaba por hacer evidente el requerimiento del receptor en los procesos que precisan de una respuesta neurogénica (Matas-Rico et ál., 2008). De manera similar, moduladores negativos de la neurogénesis hipocampal, como el estrés, terminan por generar un cuadro dramático en ausencia de la vía de señalización por LPA1(Castilla-Ortega et al, 2011; García-Fernandez et ál., 2012) agravando el patrón neurogénico y conductual que mostraban los animales nulos (Castilla-Ortega et ál., 2010) y demostrando, una vez más, cómo la señalización por LPA1es capaz de regular de manera tan exquisita estos sistemas. En resumen, los estudios conductuales desarrollados hasta la fecha, demuestran la importancia del receptor LPA1para el correcto desarrollo de funciones cerebrales, especialmente las asociadas a procesos de neurogénesis. Los estudios mostrados en el trabajo experimental vinculado a esta memoria han representado el primer paso para un número ciertamente amplio de estudios que no han venido sino a acentuar la relevancia de la señalización mediada por LPA y que, a día de hoy, han permitido el desarrollo de modelos experimentales así como, dada su implicación en diferentes patologías de índole neurológico y neuropsiquiátrico (Tabla 1), desarrollar fármacos reguladores y estudios terapéuticos. 45 45 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 46 46 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 47 47 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Como hemos mencionado, el ácido lisofosfatidico (LPA) ha demostrado ser una molécula reguladora que interviene, por medio de receptores específicos (LPA1-6), en procesos esenciales como la proliferación, diferenciación, y supervivencia celular. Los estudios realizados hasta la fecha en que se inició este trabajo habían puesto de manifiesto numerosas funciones para el LPA en el sistema nervioso central (SNC) y, a nivel cerebral, en neuroblastos corticales, oligodendrocitos, astrocitos, explantes de corteza cerebral, o cultivos de fibras nerviosas, entre otros y, si bien eran capaces de inferir alguna de las funciones citadas, no podían discriminar específicamente el receptor que intervenía en cada una de ellas. Ante la ausencia de agonistas y antagonistas específicos, la aparición en el paisaje experimental de animales con deleción específica del receptor LPA1abría una vía de estudio novedosa y que guardaba la ventaja de poder estudiar específicamente la función del receptor. Sin embargo, los defectos perinatales que mostraba dicha cepa de ratón le conferían poca utilidad, además de que ésta no mostraba defectos claros, como se presumía, en el SNC. La expansión de la colonia del ratón nulo receptor LPA1en las instalaciones de que disponíamos, tras un período de cruzamiento y cría amplio, terminó aportando una variedad de dicha cepa que, conservando la deleción del receptor mostraba tasas de supervivencia altas y se reproducía adecudamente por lo que, por tanto, permitía estudiarlo en detalle. Dadas las funciones atribuídas a la señalización por LPA y la expresión específica, y tan destacada, del receptor LPA1 en la zona ventricular durante el desarrollo cortical, propusimos que, en consecuencia, este animal nulo para el receptor era un modelo de ratón en el que deberían estar afectados todos aquellos procesos de señalización por LPA sugeridos y mediados por el receptor LPA1y, por ello, de una manera u otra, los presentes en la zona ventricular, es decir, los procesos de proliferación y diferenciación que tienen lugar en la zona ventricular durante la neurogénesis. Por todo ello, propusimos los siguientes objetivos: 1) Analizar el efecto que la deleción del receptor LPA1de ácido lisofosfatídico genera en la neurogénesis cortical que tiene lugar durante el desarrollo en la zona ventricular del ratón nulo para LPA1de la variedad Málaga. 2) Determinar los efectos que dicha deleción en la variedad Málaga del ratón nulo para LPA1 produce en la diferenciación y migración de las neuronas durante la corticogénesis. 3) Determinar los efectos corticales que en el ratón adulto de la variedad Málaga nulo para LPA1puedan ser consecuencia de una neurogénesis alterada en el desarrollo. 48 48 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 49 49 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 3. MATERIAL Y MÉTODOS 56 56 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 20. Esquema del ensayo de detección de la deleción de Lpar1 en los animales de experimentación. (A). Esquema de detección mediante PCR para la amplificación de los fragmentos correspondientes a la región que lleva el exón 3 en el genotipo normal (+/+) y a la que presenta la deleción (–/–). (B). Imagen de las bandas resultantes de la electroforesis en gel de agarosa de ambos fragmentos y en el que observamos las bandas correspondientes al genotipo normal (+/+) y al genotipo heterocigoto (+/–) y homocigoto (–/–) mutante para el receptor. 3.3. Fijación y procesamiento del material para microscopía óptica 3.3.1. Fijación del tejido y procesamiento en parafina para microtomo convencional El procesamiento en parafina se realizó para todos los estudios histológicos generales e inmunohistoquímicos en muestras de embriones y de ratones de estadio perinatal. Para estos estudios se realizó fijación por inmersión. Se sacrificaron los animales por decapitación y, una vez extraído el cerebro en tampón fosfato salino 0,1 M, ph 7,4 a 4°C (Anexo I), se fijó por inmersión en mezcla fijadora de Bouin [(Chamberlain 1932; Baker 1946); ácido acético al 5 %, formaldehído al 9 % y ácido pícrico al 0,9 %; Sigma-Aldrich; ver Anexo I] durante 48h a temperatura ambiente. Posteriormente, y tras lavado, se incluyeron en parafina mediante el uso de un procesador automático de tejidos en carrusel (modelo 120P; MYR S.L.; A B 57 57 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Tarragona) cuyo protocolo de inclusión contemplaba pasos sucesivos de alcoholes, de gradación creciente [70 % (v/v), 2 x 1 h; 80 % (v/v), 1 h, 96 % (v/v), 2 x 1 h; 100 % (v/v), 2 x 1 h], xileno (2 x 1,5 h), y parafina (2 x 1,5 h). La obtención del bloque previo al tallado se realizó en un centro de inclusión de tejidos (modelo EG1150H; Leica Microsytems; Leica Microsistemas SA; Barcelona). Los bloques de parafina se dejaron enfriar en placa fría y, tras su solidificación, se cortaron con un microtomo Leica RM2255 (Leica Microsistemas SA; Barcelona) a 10 m de grosor según el plano deseado. Los cortes se montaron en portaobjetos tratados con poli-LLisina (Sigma-Aldrich) (ver Anexo I). 3.3.2. Fijación del tejido y procesamiento para microtomo de congelación Este proceso se empleó para la inmunodetección del receptor LPA1en el tejido embrionario. En este caso, tras decapitación y extracción del cerebro, se realizó fijación por inmersión (24 h) en una mezcla fijadora de paraformaldehído-peryodato-lisina (PLP) descrita por McLean y Nakane (1974), consistente en paraformaldehído (Merck Millipore Corporation, Madrid; en adelante Merck) al 4 %, lisina (Panreac Química S.A.U; Barcelona; en adelante, Panreac) 0,075 M, peryodato sódico (Panreac) 0,01 M, en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 (ver Anexo I). Igualmente, se empleó para los estudios de estereología en animales adultos de 12 semanas de edad. En este caso los ratones se anestesiaron intraperitonealmente con una solución de clorhidrato de ketamina (Imalgene®1000; Merial Laboratorios S.A., Barcelona) al 20 % e hidrocloruro de xilacina (Rompún®; Bayer S.A., Sant Joan Despí, Barcelona) al 10%, en de suero fisiológico. La anestesis se realiza de acuerdo a su peso, y correspondería a 80mg/Kg peso del animal, de ketamina y 12 mg/Kg de peso del animal, de xilacina. Tras comprobar que los animales estaban totalmente anestesiados (ausencia de respuesta a estimulación dolorosa) se perfundieron transcardiacamente primero, con una solución de lavado, tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (Anexo 1), durante 15 minutos y, después, con paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,4 (Anexo I) con la ayuda de una bomba de perfusión (Masterflex® L/S® Digital economic drive, Cole-Parmer, Chicago, Estados Unidos). Una vez perfundidos y tras decapitación, se extrajo el cerebro. Los cerebros se sometieron a 24 h de fijación en paraformaldehído al 4 % con agitación. En ambos casos y, previo a su corte, se realizó una criopreservación del tejido en sacarosa (Panreac) al 30 % para evitar que éste se dañara con las bajas temperaturas. La encastración se realizó colocando el cerebro sobre la placa de corte del microtomo y cubriéndolo poco a poco 58 58 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 con sacarosa al 30 %. Posteriormente se realizaron criosecciones de 60 µm (para la detección del receptor LPA1) o de 30 µm (para la cuantificación estereológica) con un microtomo de congelación Modelo Microm HM450, Microm Laborgerate S.L., Barcelona; parte de Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). Las secciones se recogieron de manera seriada en pocillos de placas multipocillo con tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (Anexo I), para su procesamiento posterior en flotación. 3.3.3. Fijación del tejido y procesamiento de secciones para criostato Este procedimiento se utilizó para el análisis de la apoptosis en embriones y ratones jóvenes (P7). Tanto en el caso de los embriones, como los ratones jóvenes, se sacrificaron los animales por decapitación y, una vez extraído el cerebro, se fijó por inmersión durante 24 h en una solución de paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,4 (Anexo I). Para evitar que el tejido se dañase con las bajas temperaturas, se llevó a cabo una criopreservación previa del tejido, en este caso con O.C.T. (Tissue-Tek® O.C.T.™Compound; Sakura Finetek Japan Co., Japón). La inclusión se realizó colocando la pieza de tejido sobre la placa de corte y cubriéndola poco a poco con O.C.T. Se realizaron cortes de 30 µm de grosor, mediante el uso de un equipo Microm HM550P (Microm Laborgerate S.L., Barcelona; parte de Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Massachusetts, Estados Unidos), que se montaron en portaobjetos tratados con poli-L-Lisina (Sigma-Aldrich) (Anexo I) y guardaron a -80°C hasta su uso. 3.3.4. Fijación del tejido y procesamiento de secciones para vibratomo Este procedimiento se utilizó para el estudio de hibridación in situ en embriones. Para ello se sacrificaron los animales por decapitación y, una vez extraído el cerebro, se fijó por inmersión durante 24 h en una solución de paraformaldehído (Merck) al 4 % en tampón fosfato salino 0,1 M a pH 7,4 (Anexo I) a 4°C y se guardaron deshidratados a dicha temperatura, para su uso posterior, en una solución de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Tween®20 (Sigma-Aldrich) al 0,1 % y metanol al 25 %. Se realizaron pasos graduales, con lavados de 10 min en el mismo tampón con metanol al 50 %, y al 75 %, hasta deshidratar y guardar en metanol 100 %. Para la obtención de la secciones, tras la rehidratación (lavados en el mismo tampón, con concentraciones decrecientes de metanol, al 75 %, 50 %, 25 %, y sin metanol) se encastraron en bloques con una solución de albúmina y gelatina y se obtuvieron secciones de 200 μm de 59 59 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 grosor con el uso de un vibratomo (modelo MA752, Campden Instruments, Loughborough, Reino Unido). Las secciones se deshidrataron, como anteriormente, mediante pasos de 5-10 minutos por soluciones crecientes de metanol en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Tween®20 (Sigma-Aldrich) al 0,1 % y se guardaron a -20°C hasta su uso. 3.4. Histoquímica e inmunohistoquímica 3.4.1. Tinción de hematoxilinaeosina Al menos 8 muestras fueron analizadas por cada genotipo para animales en estadio E18.5 y P0. Para la observación general de los tejidos se realizó tinción de hematoxilina - eosina siguiendo el siguiente protocolo: - Hidratación de las secciones procedentes de inclusión en parafina mediante pasos de incubación en xileno (Panreac) (2 x 15 min), seguidos de alcoholes en porcentaje decreciente [100 % (v/v), 2 x 15 min; 96 % (v/v), 2 x 15 min; 70 % (v/v), 10 min] y lavado final en agua destilada. - Tinción con incubación por inmersión de las secciones en solución de Hematoxilina de Harris (Panreac Química S.A.U; Barcelona; en adelante, Panreac) durante 1 min, seguido de incubación en una solución de alcohol 96 % (v/v) + ácido acético (Panreac) 0,1 % (v/v) 5 min, lavado en agua corriente durante 5 min, e inmersión en solución de eosina hidroalcohólica (Panreac) 10 s. - Deshidratación en pasos sucesivos de alcoholes, de gradación creciente [70 % (v/v), 5 min; 96 % (v/v), 2 x 5 min; 100 % (v/v), 2 x 10 min] y xileno (2 x 10 min). - Montaje con Eukitt ® (Panreac). Para el contrastado de secciones se omitió el paso por eosina hidroalcohólica. 3.4.2. Inmunohistoquímica 3.4.2.1. Antígenos analizados y anticuerpos usados para su detección Para analizar el desarrollo de la región proliferativa de la zona ventricular, se estudiaron los siguientes antígenos como marcadores de proliferación celular, ciclo celular, o maduración: 60 60 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 - PCNA. Es el antígeno nuclear de células proliferantes (del inglés, proliferating cell nuclear antigen), una subunidad de la ADN polimerasa (delta), de 36 kD de peso molecular, esencial para la replicación en la fase S del ciclo celular. La proteína está presente en el nucleoplasma de células que se encuentran activamente en división. Durante la fase G1 comienza a acumularse, y es en la fase S donde es más abundante, disminuyendo su cantidad en las fases G2 y M, y con un patrón diferenciado de distribución de la proteína intranuclear (la que se une al ADN) según la fase del ciclo (Bravo y MacDonald-Bravo, 1987). La proteína PCNA tiene una secuencia conservada, con muchas homologías entre diferentes mamíferos. En este estudio se usó para identificar células en fase S, es decir, como un marcador de células en proliferación, por tratarse de uno de los marcadores más comunes a la hora de identificar células en división y que se expresa en precursores neurales (Ino y Chiba, 2000) y, de manera clara, en la zona ventricular, donde su análisis permitió, hace ya bastante tiempo, estudios de duración de ciclo celular en los precursores neuronales (Takahashi y Caviness, 1993). Para su detección se empleó un anticuerpo monoclonal, obtenido en conejo, con referencia P8825, Clon PC 10 (Sigma-Aldrich) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina. -Histona H3 fosforilada. Esta proteína de 17 kD participa en el empaquetamiento del ADN durante la división celular (Hendzel et ál., 1997), siendo usada como marcador de células que se encuentran en mitosis. El ADN se asocia con las histonas y otras proteínas para quedar empaquetado y formar los cromosomas. Los cambios en la cromatina todavía difusa se inician en la fase G2 del ciclo celular, siendo las histonas H1 y H3 las principales responsables del plegamiento y empaquetamiento de las fibras de la cromatina. En contraste con la hiperfosforilación de la Histona H1, la fosforilación específica del residuo 10 de serina en la histona H3 ocurre exclusivamente durante la mitosis, quedando, tras esta, desfosforilada rápidamente, permaneciendo así durante toda la interfase (Wolffe, 1992). Para su detección se empleó un anticuerpo policlonal, obtenido en conejo, con referencia 06-570 (Upstate Inc., Lake Placid, New York) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina.. --III tubulina. La tubulina es el componente principal de los microtúbulos. La tubulina de clase III (-III tubulina) es una proteína sintetizada exclusivamente por neuronas en vertebrados superiores. Su expresión en las áreas proliferativas asociadas a la neurogénesis, en ratón, tiene lugar en E13-E14, tan pronto como aparece la placa cortical y, desde ese momento, se comienza a expresar en la interfase entre la zona proliferativa y la de diferenciación neuronal, diferenciando poblaciones neuronales postmitóticas, tanto las que 61 61 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 permanecerán indefinidamente en la zona proliferativa, como las que migran para constituir las capas corticales (Menezes y Luskin, 1994). Se usó en este trabajo como marcador de neuronas que ya entran en un proceso de maduración y migración. La detección se llevó a cabo con un anticuerpo monoclonal obtenido en ratón con referencia T8660, Clon SDL.3D10 (Sigma-Aldrich) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina. -Tbr2. Como se ha mencionado anteriormente, la expresión del factor de transcripción Tbr2 caracteriza los progenitores intermedios basales y su inicio de expresión a la transición de génesis desde glia radial a progenitores intermedios, estando su expresión en equilibrio de secuencia temporal y correspondencia inversa con la del factor de transcripción Pax6 (Sansom y Livesey, 2009). Para su detección se usó un anticuerpo policlonal, de referencia ab23345, obtenido en conejo (Abcam plc., Cambridge, Reino Unido) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina. -GAP-43. La proteína GAP-43 (del inglés, growth-associated protein-43) es una fosfoproteína que se encuentra exclusivamente en el sistema nervioso, central y periférico (Skene, JH. 1989) Es una de las principales proteínas de los conos de crecimiento axónico (Meiri et ál., 1986), no estando presente en las regiones de crecimiento de dendritas. GAP-43 se expresa durante el desarrollo, en neuronas postmitóticas y en subpoblaciones mitóticas con plano horizontal de división (Stricker et ál., 1993), y está implicada en el trazado y guía axonal, la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica (Jacobson et ál., 1986). En este estudio se utilizó a objeto de inferir defectos de guía axonal y de tipo neurofuncional derivados de la alteración de la división de los precursores neurales. Para su detección se usó un anticuerpo monoclonal, de referencia G 9264, Clon GAP-7B10, obtenido en ratón (SigmaAldrich) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina. - Parvalbúmina: proteína ligadora de calcio que marca subpoblaciones de interneuronas gabaérgicas. En la corteza cerebral las neuronas inhibitorias GABAérgicas positivas para la parvalbúmina (que constituyen alrededor del 40%) proceden, en su mayoría, de precursores basales situados en la eminencia ganglionar media y que, por migración tangencial terminan por alcanzar su localización en las capas corticales (Xu et ál., 2004, 2010). La detección se realizó con un anticuerpo policlonal, obtenido en conejo, de referencia PV28 (Swant® Swiss Antibodies; Bellinzona, Suiza) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora de Bouin y en secciones en parafina. 62 62 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 -5’-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) es un análogo sintético del nucleótido timidina. Tras su administración por vía intraperitoneal se incorpora (aproximadamente a lo largo de las 2 h siguientes a su administración), en el ADN nuclear de las células que se encuentran en proliferación, concretamente en la fase S, permaneciendo en su material genético y permitiendo así su seguimiento y destino, detectándose igualmente en las células hijas (Taupin, 2007). El anticuerpo utilizado para detectar este antígeno fue el anticuerpo monoclonal obtenido en ratón referido como G3G4 (Ref.:G3G4 (Anti-BrdU; Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB, University of Iowa; Iowa, Estados Unidos), con procesamiento inmunohistoquímico sobre material fijado con paraformaldehído al 4 % en secciones de parafina. -Receptor LPA1: La detección se realizó con un anticuerpo policlonal, obtenido en conejo, de referencia PA1-1041 (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) e inmunohistoquímica sobre material fijado con mezcla fijadora PLP (paraformaldehido-lisina-peryodato) y en criosecciones de microtomo de congelación. -Proteína nuclear específica neuronal (NeuN): es una proteína neuronal nuclear que se expresa en la mayoría de las células neuronales del sistema nervioso incluidas las constitutivas del cerebelo, corteza cerebral, tálamo e hipocampo (Mullen et ál., 1992) y usada comúnmente como marcador de neuronas maduras. Junto a su expresión nuclear, ampliamente descrita, se ha identificado una isoforma, responsable de reactividad citoplasmática, reguladora de Fox-3 (Kim et ál., 2009). Para detectar este antígeno se ha usado el anticuerpo monoclonal antiNeuN MAB377 (Ref.: MAB377; Merck Millipore Corporation, Madrid) sobre material fijado con paraformaldehído al 4 % en secciones de microtomo de congelación. 3.4.2.2. Tinción inmunohistoquímica Para el procedimiento, se partió, bien de secciones de tejido cerebral procedentes de inclusión en parafina (detección de PCNA, histona H3 fosforilada, -III tubulina, GAP-43, parvalbúmina), o bien de criosecciónes en flotación (LPA1, NeuN). Las secciones de parafina se procesaron en portaobjetos y las criosecciones en pocillos (placas de 24 pocillos), en flotación. Se siguió el siguiente protocolo que, salvo indicación, siempre tuvo lugar a temperatura ambiente y en agitación: -Hidratación de las secciones (cuando procedieran de inclusión en parafina) mediante pasos de incubación en xileno (Panreac) (2 x 15min), seguidos de alcoholes en 63 63 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 porcentaje decreciente [100 % (v/v), 2 x 15 min; 96 % (v/v), 2 x 15 min; 70 % (v/v), 10 min] y lavado final en agua destilada. Este paso se omitió para secciones en flotación. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (Anexo I) en tres pasos de 10 min. -Inactivación de la peroxidasa endógena con solución de peróxido de hidrógeno (Merck) al 3 % y metanol (Merck) al 10 % (v/v) en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 durante 30 min en oscuridad. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Bloqueo de la biotina endógena con solución comercial (Zymed® Laboratories Inc.; California, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del proveedor. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Incubación durante 12-18 h en cámara húmeda con el anticuerpo primario correspondiente, diluido a 1: 1000 en una solución compuesta de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, suero animal al 2,5 % (según corresponda; Biolink2000 S.L., Barcelona), Triton X100 (Panreac) al 0,5 %, y azida sódica (Sigma-Aldrich) al 0,01 % (p/v), como preservante. El suero animal fué obtenido en conejo, cuando el anticuerpo primario era de origen murino, y obtenido en cerdo, cuando se trataba de un policlonal obtenido en conejo. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Incubación durante 2,5 h, en cámara húmeda en la solución del anticuerpo secundario biotinilado correspondiente (anti IgG de ratón, obtenido en conejo, o anti IgG de conejo, obtenido en cerdo, ambos policlonales, biotinilados, con referencias E0464 y E0353, respectivamente; Dako Diagnósticos, S.L.U., Barcelona), diluido a 1: 800 en una solución de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con suero de cabra al 2,5 % (Biolink2000 S.L., Barcelona), Triton X100 (Panreac) al 0,5 %, y azida sódica (SigmaAldrich) al 0,01 % (p/v), como preservante. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Incubación durante 1 h, en oscuridad, en solución de Extravidin® (avidina conjugada a peroxidasa, Sigma-Aldrich) diluida 1: 1000 en tampón fosfato salino 0,1 M pH 7,4. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Revelado de la actividad peroxidasa durante 15-25 min y en oscuridad con una solución, preparada en el momento, de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina 64 64 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 (DAB, Sigma-Aldrich) al 0,05 %, en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 y perhidrol (Merck) al 0,03 %. -Lavado exhaustivo en agua destilada. -Deshidratación de los cortes y aclarado por inmersión en pasos sucesivos de alcoholes, de gradación creciente [70 % (v/v), 5 min; 96 % (v/v), 2 x 5 min; 100 % (v/v), 2 x 10 min] y xileno (2 x 10 min). Montaje con Eukitt® (Panreac) o DPX (Sigma-Aldrich). - La observación se realizó en un microscopio Olympus BX51 equipado con objetivos UPLSAPO 4x, 10x, 20x, 40x, 100x de 0,16, 0,4, 0,75, 0,90, y 1,40 de apertura numérica, respectivamente, y cámara digital Olympus DP70 (Olympus España S.A.; Barcelona). Cuando fue preciso, el número de células se estimó con el programa Image J versión 1.37v (Instituto Nacional de Salud, Estados Unidos; disponible en http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). La detección por inmunohistoquímica se llevó a cabo en 12 animales de cada genotipo y edad. Para la cuantificación de células positivas para la histona H3 fosforilada se analizaron, al menos, 200 células por sección en un área de 150 µm x 150 µm en la zona ventricular y subventricular y en un total de 4 secciones por embrión y 8 embriones por genotipo. Se expresaron los porcentajes respecto al total de células, contrastadas con hematoxilina. La cuantificación de células positivas para bromodesoxiuridina y para NeuN, se detallan en cada sección correspondiente. 3.4.2.3. Inmunodetección y cuantificación de la bromodesoxiuridina Se administró intraperitonealmente bromodesoxiuridina (BrdU, Sigma-Aldrich) a ratones hembra, preñadas, con el objetivo de observar la incorporación de BrdU en el cerebro de los embriones y realizar el seguimiento de las poblaciones celulares. La BrdU, como se citó, es un análogo del nucleótido timidina que, al incorporarse en el ADN nuclear durante la fase S del ciclo celular permite el seguimiento de los procesos de división celular, ampliamente usada en los estudios de neurogénesis (Taupin, 2007). Se prepararon alícuotas de BrdU a una concentración de 10 mg/ml en agua destilada y que, una vez diluidas 1:2 en suero salino fisiológico estéril se usaron para realizar una única inyección intraperitoneal (en una proporción de 70 g BrdU/gr de peso del animal) a hembras preñadas con embriones correspondientes a un estadio E14.5. Las hembras inyectadas se 65 65 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 sacrificaron, para obtener los embriones, transcurridos 45 minutos, a las 12 horas, y en el estadio E18.5, tras la inyección. Los embriones se extrayeron quirúrgicamente, se extrajo el cerebro en cada uno de ellos y, tras fijación en paraformaldehído a 4 %, se procesó para la obtención de secciones en parafina (ver apartado anterior). La incorporación de la bromodesoxiuridina al ADN obliga, para su detección, a un procedimiento para la apertura y el acceso a la hebra de ADN. Para ello se sometieron las secciones a una digestión del tejido en una solución de proteinasa K (Sigma-Aldrich) a concentración de 5 μg/ml, durante 30 min a 37°C. Tras ello, se realizaron tres lavados de 10 min con tampón Tris-fosfato salino 0,01 M, pH 7,8 (ver en Anexo I) y se desnaturalizó el ADN por incubación en una solución 2N de ácido clorhídrico (Panreac) durante 30 min, a 37°C. Tras neutralizar el ácido mediante dos lavados de 10 min en tampón borato 0,1 M, pH 8,5 (ver Anexo I), se realizó lavado con tampón Tris-fosfato salino 0,01 M, pH 7,8 y se siguió con el protocolo convencional de inmunohistoquímica, si bien, tanto los anticuerpos primario y secundario, como los pasos de lavado, se realizaron usando, como base, tampón Tris-fosfato salino 0,01 M, pH 7,8. Para la cuantificación de las células positivas a BrdU se clasificaron éstas en células con marca densa, es decir, aquellas donde se marca más de la mitad del núcleo, y células con marca ligera, con menor marca en el núcleo, indicativa de que han sufrido más de un ciclo de división tras el marcaje (Gillies y Price, 1993; Taupin, 2007). La pared cortical del telencéfalo se analizó en profundidad, por capas corticales, en secciones coronales no adycentes tomadas en la porción media cortical. En cada sección se analizarón bandas radiales de 100 µm de ancho, divididas en diferentes compartimentos correspondientes a las distintas capas corticales de acuerdo al siguiente esquema: La posición de cada célula marcada se asignó a un compartimento determinado para generar histogramas de densidad celular media y según profundidad. Los cálculos fueron resultado de analizar 8 secciones por embrión y por genotipo. En cada compartimento se calculó el número de células, expresado como el porcentaje del número total de células marcadas en el total de la banda, y se analizaron las medias para compararlas estadísticamente. 72 72 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Tras la hibridación propiamente dicha se realizaron, en la denominada posthibridación, varios lavados de las muestras con el fin de eliminar los híbridos no específicos que se hayan podido formar: dos lavados de 30min a 70°C en Solución I (Anexo I), seguido de un lavado de 10min a 70°C en una mezcla a partes iguales de soluciones I y II (Anexo I), y tres de 5 min en solución II (Anexo I). A continuación se destruyeron los fragmentos de ARN libres por incubación de 30 min a 37°C en soluciónn de ARNsa a 100 µg/ml en solución II, seguida de tres lavados, un primer lavado en solución II 5 min a temperatura ambiente, y dos de 30 min a 65°C en solcuión III (Anexo I). 3.6.3. Detección de la sonda Para la detección de la sonda se utilizó un anticuerpo primario anti-digoxigenina acoplado a fosfatasa alcalina (Roche). Previo a la detección los cortes fueron preincubados en una solución de levamisol para inactivar la fosfatasa alcalina endógena (Tampón Tris salino con Tween®20 1X - levamisol , Anexo I; 3 pasos de 5 min a temperatura ambiente), seguido de una incubación en una solución de albúmina sérica bovina al 3 % en Tampón Tris salino con Tween®20 1X - levamisol (Anexo I), durante 90 min, a temperatura ambiente, para eliminar fondo. La Incubación con el anticuerpo anti-digoxigenina se realizó durante al menos 18 h, a 4°C y en agitación, con el anticuerpo diluido 1:2000 en la solución de albúmina sérica bovina al 3 % en Tampón Tris salino con Tween®20 1X - levamisol. Tras la incubación se lavó varias veces a temperatura ambiente con Tampón Tris salino con Tween®20 1X - levamisol (3 x 5 min + 5 x 30 min y agitación) y NTMT-levamisol (Anexo I) (3 x 10 min, con agitación) para eliminar el exceso de anticuerpo. Para el revelado de la actividad de la fosfatasa alcalina se empleó el sistema NBT/BCIP (Roche) que usa nitroazul de tetrazolio (NBT, del inglés, Nitro blue tetrazolium) y 5-Bromo-4cloro-3-indolil fosfato (BCIP, del inglés, 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) como sustratos de la enzima, diluidos en el tampón NTMT-levamisol (Anexo I). Para 10 ml de NTMT se añadió 45 l de solución de NBT a 75 mg/ml y 35 l de solución de BCIP a 50 mg/ml. La reacción de estos sustratos mediada por la fosfatasa alcalina produce un precipitado de color azul-púrpura fácilmente identificable en las preparaciones. La reacción se realizó en oscuridad, prolongándose durante 4 horas. Una vez terminada la técnica, los cortes se lavaron en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Tween®20 (Sigma-Aldrich) al 0,1 %, y se deshidrataron en concentraciones crecientes de glicerol (glicerol al 50 % y al 80 % en dicho tampón). Quedaron almacenados en Glicerol al 80% 73 73 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 en oscuridad y a una temperatura de 4°C. Los cortes se montaron en portaobjetos, con un medio de glicerina-gelatina (Anexo I) y se almacenaron en oscuridad y a 4°C. Las muestras fueron analizadas utilizando una cámara digital Canon Powershot (Leica Microsytems; Leica Microsistemas SA; Barcelona) acoplada a un microscopio invertido Leica DM IL (Leica Microsytems; Leica Microsistemas SA; Barcelona) equipado con objetivos 10x y x40, con apertura numérica 0,20 y 0,50, respectivamente. 3.7. Análisis in vitro: Cultivos celulares e inmunocitoquímica. A objeto de analizar la dinámica proliferativa se realizaron cultivos de neuroblastos corticales procedentes de embriones de estadio E14.5. Para ello, se aisló quirúrgicamente la zona cortical de la parte medial del telencéfalo del embrión (Fig. 21) y, a continuación, se disoció el tejido mediante incubación en papaína con un kit comercial y siguiendo las instrucciones del proceedor (Papain Dissociation System, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, New Jersey). Figura 21. Región utilizada para el aislamiento de neuroblastos corticales en embrión de ratón de estadio E14.5. Se indica la zona (línea de puntos) en el embrion entero (A) y en corte coronal del mismo estadio (B). De acuerdo a las instrucciones del preparado comercial (http://www.worthingtonbiochem.com/PDS/default.html), tras triturar suavemente el tejido mediante pipeteo (aspiración/expulsión) se sometió al tejido a una incubación a 37°C durante media hora con agitación, en una solución de papaína a una concentración de 20 unidades/ml en medio salino B A 74 74 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 tamponado de Earle (EBSS, del inglés, Earle's balance salt solution) con L-cisteína a 1 mM, EDTA a 0,5 mM, y 0,005% de ADNasa. Transcurrida la digestión, se disgregó suavemente la solución tisular mediante pipeteo y se centrifugó (5 min, 300 xg) para obtener un precipitado celular con el que se realizó una suspensión con albúmina e inhibidor de ovomucoide ambos a 10 mg/ml, y 0,005% de ADNasa, en medio EBSS. La suspensión celular se depositó sobre la superficie de una capa de medio con inhibidor ovomucoide para efectuar una centrifugación en gradiente (6 min, 70 xg) que permitió separar las células viables de restos de membrana. El precipitado se resuspendió en medio de cultivo Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, del inglés, Dulbecco's modified Eagle's medium; Sigma-Aldrich, D0547) libre de suero y las células en suspensión se dispusieron, en dicho medio y a una densidad celular aproximada de 1,5 x 105células/cm2en sistemas multicámaras de cultivo sobre portaobjetos (Nunc ®Lab-Tek ®II Chamber Slides , Thermo Fisher Scientific Corp.; Waltham, Massachusetts, Estados Unidos; en adelante, Thermo Fisher) tratados con poly-L-Lisina (Sigma-Aldrich, P8920). Las condiciones del cultivo fueron 37°C y un 5 % de CO2. La viabilidad del cultivo se comprobó por el método de exclusión de azul de tripano con el uso de una solución de azul de tripano al 0,4 % (Sigma-Aldrich). Tras mezclar 100 µl de solución de azul tripano, 200 µl de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, y 100 µl de la suspensión celular (lo que supone una dilución celular 1:4), se esperó 3 -5 min y se realizó recuento celular empleando un hematocitómetro o cámara de Neubauer para calcular el porcentaje de células viables (aquellas que excluyeron el colorante) de acuerdo a las siguientes indicaciónes: - Conteo del número de células por cuadrado (4 cuadrados) y cálculo de la media de los cuadrados. Dado que un cuadrado tiene un área de 1 mm2y 0,1mm de alto, su volúmen es 0,1 mm3, es decir, 10-4 cm3. Siendo 1cm3equivalente a 1ml, 1 cuadrado tendrá un volúmen de 10-4 ml. Por tanto, para obtener el nº de células/ml basta multiplicar x 104el nº de células/cuadrado. Habrá que considerar el factor de dilución (1:4) y multiplicar x4 para obtener el nº de células/ml definitivo. El mismo procedimiento, pero con las equivalencias correspondientes, se puede usar con la sección cuadrada central de la retícula (señalada en el círculo), considerando que el menor de los cuadrados tiene un volúmen de 1 nl. 75 75 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 22. Esquema de áreas de recuento celular en hemocitómetro.Un detalle de las explicaciones se puede obtener en las direcciones: http://www.celeromics.com/es/resources/Technical%20Notes/neubauer-chambercell-concentration/formula-camara-neubauer-concentracion.php http://celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-Camara-Neubauer.pdf 3.7.1. Variables analizadas. Morfología celular Como se ha citado en la introducción, la esfericidad celular y compactación son respuestas celulares al LPA cuando éste es añadido de manera exógena. Para corroborar la funcionalidad de la señalización del receptor LPA1en los cultivos celulares de neuroblastos procedentes de ratones normales, frente a los carentes del receptor LPA1, se trataron ambos con una solución de oleil LPA ó 1-oleil-2-hidroxi-sn-glicerol-3-fosfato (en forma de sal sódica) (Avanti®Polar Lipids Inc.; Alabaster, Alabama; Estados Unidos) a 100 nM, diez veces superior a la concentración de eficacia media (CE50) del oleil-LPA para el receptor LPA1 (CE50 = 11,7 nM, Heise et ál., 2001; Choi et ál., 2010) y demostrada eficaz para generar una respuesta de compactación celular en neuroblastos corticales (Fukushima et ál., 2000). El LPA fue disuelto en una solución de albúmina bovina sérica libre de ácidos (Sigma-Aldrich) a una concentración final del 3 % en suero fisiológico. El grupo control, en ambos genotipos, se trató únicamente con dicho vehículo. Se realizó observación a microscopio invertido de la dinámica celular a tiempo cero, antes de añadir el fármaco, y 15 min después, usando una cámara digital Canon Powershot acoplada a un microscopio invertido Leica DM IL (Leica Microsytems) equipado con objetivos 10x y x40, con apertura numérica 0,20 y 0,50, respectivamente. 76 76 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Los cultivos se analizaron a diferentes tiempos (12-24 h) tras inicio del mismo, cada uno de ellos repetido 4 veces en experimentos separados y en cultivos procedentes de 8 embriones por genotipo. Para el análisis se cuantificaron, en 6 campos del microscopio elegidos al azar, 800 - 1500 células viables por cultivo. 3.7.2. Variables analizadas. Marcaje con bromodesoxiuridina y cinética celular Para analizar el patrón de proliferación y de ciclo celular en condiciones normales y en ausencia del receptor LPA1, se recurrió al estudio de marcadores inmunocitoquímicos y al de marcaje y seguimiento con bromodesoxiuridina (BrdU) segun protocolos descritos por EstivillTorrús et ál. (2002). Para el cálculo del índice de marcaje, o porcentaje de células marcadas con BrdU, a las 12 h de establecer el cultivo de neuroblastos corticales (t = 12 h) se añadió BrdU al medio de cultivo a una concentración final de 10 M. Para ello, se prepararon alicuotas de BrdU (Sigma-Aldrich) disuelta en solución salina estéril a una concentración de 10 mg/ml. A partir de éstas, se diluían 1:3000 en medio de cultivo (DMEM) para obtener una concentración final de BrdU de 10 M. Este medio, una vez filtrado (0,2 µM) se usaba para reemplazar al presente en cada cámara de cultivo (multicámaras de cultivo sobre portaobjetos). A los 45 minutos (pulso de BrdU) el medio de cultivo con BrdU fue retirado y sustituido por medio fresco. Las células se fijaron durante 30 min a temperatura ambiente con una solución de paraformaldehido (Panreac) al 4 % en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. La fijación tuvo lugar inmediatamente después de este pulso de BrdU (t = 12, 75 h tras cultivo) y a las 18 h, 24 h, y 36 h. Transcurrida la fijación de 30 min a cada tiempo se retiró el fijador y se lavó en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 varias veces, almacenando en dicho tampón y a 4°C hasta su uso. Para estudiar la cinética celular se recurrió al método de marcaje acumulativo con BrdU (Nowakowski et ál., 1989; Estivill-Torrús et ál., 2002) mediante el cual se somete a un cultivo a pulsos de BrdU a diferentes tiempos, gradualmente en aumento, a objeto de detectar la incorporación acumulada en una población celular. Una vez establecida la proporción de células marcadas respecto a la longitud del pulso de BrdU y, de acuerdo a Nowakowski et ál. (1989) es posible calcular la fracción de crecimiento (FC; células marcadas), el tiempo de la fase de síntesis del ciclo celular (Ts), y el tiempo o longitud del ciclo celular (Tc) tal como se indica en la Figura 23. 77 77 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 23. Representación usada para el cálculo de parámetros de cinética celular.La intersección del eje yrepresenta FC x (Ts/Tc); el tiempo en el que se alcanza la mayor FC (Tm) = Tc-Ts; la tasa de aumento de la proporción de células marcadas viene representada por la pendiente de la recta, siendo igual a FC/Tc (Nowakowski et ál., 1989; gráfico modificado de Estivill-Torrús et ál., 2002) 3.7.3. Variables analizadas. Detección de bromodesoxiuridina y marcadores de diferenciación. Los estudios anteriormente citados requirieron, como en la histoquímica, de la inmunocitoquímica para la detección de la BrdU añadida a los cultivos. Para ello se utilizó el mismo anticuerpo monoclonal que se usó en inmunohistoquímica (Ref.:G3G4; DSHB), detallado en la sección 3.4.2.1. Además, se utilizó inmunocitoquímica para la detección de otros dos marcadores celulares, expresados a continuación, que permitieron caracterizar los procesos de proliferación y diferenciación: -Ciclina A. La regulación de la progresión del ciclo celular en eucariotas depende de la expresión de ciclinas. Complejos de ciclinas y ciclinas dependiente de quinasas ejercen un control sobre el ciclo celular (Pines y Hunter, 1991). La ciclina A es una proteína nuclear que se expresa durante la fase S del ciclo celular. Antes de la metafase desaparece su expresión. Se une formando complejos activos con cdk2, para intervenir, principalmente, en la transición de las fases G1/S (Woo y Poom, 2003; Kaldis y Aleem, 2005). Su detección permitió determinar la proporción de neuroblastos mayoritariamente en fase S y se realizó con un anticuerpo monoclonal obtenido en ratón, de referencia C 4710, clon CY-AI (Sigma-Aldrich). 78 78 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 - p27kip1 (también llamada p27). El potencial neurogénico de los precursores apicales viene medido por la proporción de células que salen del ciclo celular frente a las que permanecen proliferando, reentrando en ciclo. Durante la corticogénesis la proporción de células en salida de ciclo y diferenciación aumenta respecto a la proporción que permanece en proliferación, en un control orquestado por diferentes factores, entre ellos p27kip1, una proteína inhibidora de complejos ciclina-quinasas dependientes de ciclina. La expresión de p27kip1 induce un incremento en la proporción de células de la ZV que salen del ciclo celular y migran a las capas superciales (Tarui et ál., 2005) promoviendo, además, la migración y la morfología de las neuronas postmitóticas a través de la reorganización del citoesqueleto de actina mediante la formación de complejos e interacciones con Cdk5 y conexina 43 (Kawauchi et ál., 2013). Su detección se realizó usando un anticuerpo monoclonal producido en ratón, de referencia 610241, clon 57 (BD Transduction Laboratories; BD Biosciences; Becton, Dickinson and Company©; Franklin Lakes, New Jersey, .Estados Unidos; BD Biosciences Europe; San Agustin de Guadalix, Madrid). Además, de manera rutinaria, se realizó tinción de contraste para la caracterización del cultivo neural con anticuerpos dirigidos a antígenos de linaje neuronal como la -III tubulina (mencionada en el apartado 3.4.2.1; anticuerpo monoclonal obtenido en ratón, con referencia T8660, clon SDL.3D10; Sigma-Aldrich) o la proteína asociada a microtúbulos MAP2 (anticuerpo monoclonal obtenido en ratón, con referencia M 4403, clon HM-2; Sigma-Aldrich); de linaje astrocitario, en este caso a la proteína ácida fibrilar glial GFAP (del inglés glial fibrillary acidic protein; anticuerpo policlonal obtenido en conejo, con referencia G 9269; Sigma-Aldrich); y de linaje oligodendrocitario, siendo el antígeno la proteína La 2´ 3´-nucléotido cíclico 3´- fosfodiesterasa o CNPasa (del inglés 2', 3' -cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase; anticuerpo monoclonal obtenido en ratón, con referencia C 5922, clon 11-5B; Sigma-Aldrich). 3.7.4. Tinción inmunocitoquímica. Las células se fijaron, en las multicámaras de cultivo sobre portaobjetos, durante 30 min a temperatura ambiente con una solución de paraformaldehido (Panreac) al 4 % en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. La fijación tuvo lugar inmediatamente después del mencionado pulso de BrdU (t = 12, 75 h tras cultivo) y a las 18 h, 24 h, y 36 h. Transcurrida la fijación de 30 min a cada tiempo se retiró el fijador y se lavó en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 varias veces, almacenando en dicho tampón y a 4°C hasta su uso. 79 79 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 De manera general, el protolo de detección sobre las multicámaras contempló los siguientes pasos, todos ellos con agitación suave y a temperatura ambiente , salvo que se indique lo contrario: -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (Anexo I) en dos pasos de 10 min, seguido de lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Triton X100 (Panreac) al 0,5 %, en dos pasos de 10 min. -Inactivación de la peroxidasa endógena con solución de metanol (Merck) al 90 % (v/v) en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 durante 10 min, seguido de lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en dos pasos de 10 min. -Incubación en una solución 2N de ácido clorhídrico (Panreac) durante 30 min, a 37°C. (Sólo en el caso de detección de BrdU). -Lavado en tampón borato 0,1 M, pH 8,5 (ver Anexo I), durante 10 min, seguido de lavados en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en dos pasos de 10 min, y lavados en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Triton X100 al 0,5 %, en otros dos pasos de 10 min. (Sólo en el caso de detección de BrdU). -Incubación durante 1 h en una solución compuesta de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, suero animal al 2,5 % (según corresponda; Biolink2000 S.L., Barcelona), Triton X100 (Panreac) al 0,5 %, y azida sódica (Sigma-Aldrich) al 0,01 % (p/v), como preservante. El suero animal fué obtenido en conejo, cuando el anticuerpo primario era de origen murino, y obtenido en cerdo, cuando se trataba de un policlonal obtenido en conejo. -Incubación durante 12-18 h en cámara húmeda con el anticuerpo primario correspondiente, diluido a 1: 1000 en la citada solución compuesta de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, suero animal (según correspondiera) al 2,5 %, Triton X100 al 0,5 %, y azida sódica. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en dos pasos de 10 min, seguido de una nueva incubación durante 1 h en solución de tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, suero animal al 2,5 %, Triton X100 al 0,5 %, y azida sódica. -Incubación durante 2,5 h, en la solución del anticuerpo secundario biotinilado correspondiente (anti IgG de ratón, obtenido en conejo, o anti IgG de conejo, obtenido en cerdo, ambos policlonales, biotinilados, con referencias E0464 y E0353, respectivamente; Dako Diagnósticos, S.L.U., Barcelona), diluido a 1: 800 en solución de 80 80 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con suero de cabra al 2,5 % (Biolink2000 S.L., Barcelona), Triton X100 al 0,5 %, y azida sódica al 0,01 % (p/v). -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 con Triton X100 (Panreac) al 0,5 %, en dos pasos de 10 min, seguido de un lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, y de incubación 20 min, en oscuridad, en solución de Extravidin® (avidina conjugada a peroxidasa, Sigma-Aldrich) diluida 1: 1000 en tampón fosfato salino 0,1 M pH 7,4. -Lavado en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 en tres pasos de 10 min. -Revelado de la actividad peroxidasa durante 15-25 min y en oscuridad con una solución, preparada en el momento, de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB, Sigma-Aldrich) al 0,05 %, en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 y perhidrol (Merck) al 0,03 %. -Lavado exhaustivo en agua destilada. Desmontado de la cámara sobre portaobjetos hidratación y aclarado por inmersión en pasos sucesivos de alcoholes, de gradación creciente [70 % (v/v), 5 min; 96 % (v/v), 2 x 5 min; 100 % (v/v), 2 x 10 min] y xileno (2 x 10 min). Montaje con Eukitt® (Panreac) o DPX (Sigma-Aldrich). Para los experimentos con contraste o doble marcaje, tras el revelado del primer anticuerpo primario con DAB, según lo expuesto, los cultivos se lavaron y se les añadió metanol al 90% (v/v) para inhibir la actividad peroxidasa del primer marcaje. El segundo marcaje fue realizado usando anticuerpos primarios de manera convencional, como la citada, sustituyendo los anticuerpos secundarios biotinalados por conjugados a fosfatasa alcalina, revelando esta actividad enzimática con el sistema NBT/BCIP (Roche; ref. 1 681 451). De manera similar a lo mencionado en la sección 3.6.3. Este sistema usa nitroazul de tetrazolio (NBT) y 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) como sustratos de la enzima. Para ello, una vez incubado el anticuerpo primario de contraste (12-18 h en cámara húmeda, anticuerpo diluido a 1: 1000 en tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4, suero animal correspondiente al 2,5 %, Triton X100 al 0,5 %, y azida sódica) y, efectuados los lavados correspondientes, se realizaron los siguientes pasos a temperatura ambiente: -Lavado en tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0, 15 M, pH 7,5 (Anexo I), 10 min. -Inactivación de fosfatasa alcalina endógena mediante incubación en tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0, 15 M, pH 7,5, con levamisol (Sigma-Aldrich) a 2 mM, 30 min, seguido de lavado en tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0, 15 M, pH 7,5, tres pasos de 10 min. 81 81 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 -Incubación durante 10 min, en la solución del anticuerpo secundario correspondiente conjugado a fosfatasa alcalina (anti IgG de ratón, obtenido en conejo, o anti IgG de conejo, obtenido en cabra, ambos policlonales, con referencias A1902 y A8025, respectivamente), diluido a 1: 200 en tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0, 15 M, pH 7,5. -Lavado en tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0, 15 M, pH 7,5, dos pasos de 10 min, seguido de incubación durante 1 h, en oscuridad, en solución de preparado comercial (Roche) de 18,75 mg/ml NBT y 9,4 mg/ml BCIP, diluida (200 µl) en 10 ml de tampón Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl20,05 M, pH 9,5. -Lavado en agua destilada y diferenciación de intensidad de color en etanol al 70° y 96°. -Desmontado de la cámara sobre portaobjetos hidratación y aclarado por inmersión en pasos sucesivos de alcoholes, de gradación creciente [70 % (v/v), 5 min; 96 % (v/v), 2 x 5 min; 100 % (v/v), 2 x 10 min] y xileno (2 x 10 min). Montaje con Eukitt® (Panreac) o DPX (Sigma-Aldrich). Como se ha mencionado, los cultivos se analizaron a diferentes tiempos (12-24 h) tras inicio del mismo, cada uno de ellos repetido 4 veces en experimentos separados y en cultivos procedentes de 8 embriones por genotipo. Para el análisis se cuantificaron, en 6 campos del microscopio elegidos al azar, 800 - 1500 células viables por cultivo. 3.8. Electroforesis, transferencia e inmunotinción de proteínas Desde que la técnica de electrotransferencia e inmunotinción o Western Blot fuese introducida en 1979 (Towbin et ál., 1979), se ha convertido en rutinaria en los laboratorios para detectar cantidades baja de proteínas específicas de una muestra determinada. En esta técnica las proteínas son electrotransferidas desde un gel de poliacrilamida a una membrana específica para detectar a través de inmunotinción con anticuerpos la proteína de interés. En este trabajo, esta técnica fue desarrollada para cuantificar la expresión de la proteína GAP-43. Como hemos mencionado, la proteína GAP-43 se encuentra en el sistema nervioso, central y está implicada en el trazado y guía axonal, la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica (Jacobson et ál., 1986). En este estudio se utilizó en inmunohistoquímica para determinar defectos de guía axonal y de tipo neurofuncional derivados de la alteración de la 88 88 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 En cada caso correspondiente el error estándar de la media de cada grupo se calculó dividiendo la desviación típica entre la raíz cuadrada del número de sujetos. Todas las imágenes se han editado con el programa informático Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, California, Estados Unidos) sin modificar el contenido de la fotografía. 89 89 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 3.9. Anexo I A1. Generalidades - Tampón fosfato 0,2 M, pH 7,4 NaH2PO4.H2O (Merck) 6,90 g Na2HPO4.2H2O (Merck) 26,70 g Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 7,4 y almacenar a 4 °C. - Tampón fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 Na2HPO4. 2H2O (Merck) 1,90 g KH2PO4(Merck) 0,43 g NaCl (Panreac) 7,22 g Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 7,4 y almacenar a 4 °C. - Tampón Tris-fosfato salino 0,01 M, pH 7,8 Na2HPO4.2H2O (Merck) 1,48 g KH2P04(Merck) 0,48 g NaCl (Panreac) 7 g Tris (Hidroximetil) Aminometano (Merck) 5 g Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 7,8 y almacenar a 4 °C. - Tampón borato pH 8,5 Na2B4O7.10H2O (Merck) 50 ml Solución de HCl (Merck) 0,1 M 15,20 ml Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 8,5 y almacenar a 4 °C. - Tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5. NaCl (Panreac) 8,76 g Tris (Hidroximetil) Aminometano (Merck) 6,05 g Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 7,5 con HCl 1 M y almacenar a 4 °C. - Tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5, con levamisol a 2mM - Tampón Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5. 25 ml - Solución de levamisol 500mM (*) 100 µl Ajustar el pH a 7,5 con HCl 1 M y almacenar a 4 °C. (*) Solución de levamisol 500mM : diluir 1,20g hidrocloruro de levamisol (Sigma-Aldrich) en 5ml agua destilada. - Tampón Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl20,05 M pH 9,5. NaCl (Panreac) 5,84 g MgCl2(Panreac) 4,76 g Tris (Hidroximetil) Aminometano (Merck) 12,10 g Agua destilada hasta 1000 ml Ajustar el pH a 9,5 con HCl 10 M y almacenar a 4 °C. -Preparación de portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina 90 90 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Se colocaron los portaobjetos limpios y desengrasados en cestillas de plástico y se sumergieron en una solución de Poli-L-Lisina (Sigma-Aldrich) al 10 % (v/v) en agua destilada durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se dejaron secar durante 1 h a 60 ºC, o bien, durante 24 h a temperatura ambiente. - Solución de inactivación de la peroxidasa endógena Para la inactivación de la peroxidasa endógena, los cortes se incubaron en una solución de peróxido de hidrógeno (Merck) al 3 % y metanol (Merck) al 10 % (v/v) en tampón fosfato salino (PBS), durante 15-25 min. A2. Fijadores - Mezcla fijadora de Bouin (Chamberlain 1932; Baker 1946) Para 1000ml: añadir 750 ml de solución saturada de ácido pícrico (Panreac), 250 ml de solución de formaldehido al 35 % (Panreac), y 50 ml de ácido acético (Merck). Filtrar y guardar. La saturación del ácido pícrico es aproximadamente de 13g/L a 20 ºC. Se dispone igualmente de preparados comerciales de mezcla fijadora de Bouin (SigmaAldrich) compuesto de ácido acético al 5 %, formaldehído al 9 % y ácido pícrico al 0,9 %. - Paraformaldehído 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 (PAF) Para 200 ml: disolver 8 g de paraformaldehído (Merck) en 50 ml de agua destilada calentada previamente a 60°C, con agitación. Puede ser necesario añadir 1-2 gotas de NaOH (Panreac) al 2,5% para que se disuelva completamente. Acabado este paso, se filtra y se completa hasta 100 ml con agua destilada, dejando enfriar. Finalmente, se añaden 100 ml de tampón fosfato salino 0,2 M, pH 7,4. - Paraformaldehído 4%, lisina 0,075 M, Peryodato sódico 0,01 M, pH 7,4 (PLP) (McLean y Nakane, 1974) Para 200 ml: disolver 8 g de paraformaldehído (Merck) en 50 ml de agua destilada a 60ºC, con agitación. Puede ser necesario añadir 1-2 gotas de NaOH (Panreac) al 2,5% para que se disuelva completamente. Filtrar y completar hasta 100 ml con agua destilada, dejando enfriar. Finalmente, se añaden 100 ml de tampón fosfato 0,2 M, pH 7,4 en los que se han disuelto previamente 2,74 g de lisina (L-lisina monoclorhidrato, Merck) y 0,428 g de meta-peryodato sódico (NaIO4; Panreac). A3. Preparaciones para la hibridación in situ. - Tampón de hibridación. Formamida 100% desionizada (Sigma-Aldrich) 5 ml SSC 20X 2,5 ml ARN de levadura (10 mg/ml) (Sigma-Aldrich) 50 µl Solución de SDS al 20% 500 µl Heparina (Sigma) (5000 U/ml = 156,25mg/ml) 3,2 µl Agua destilada estéril 2 ml - SSC 20X NaCl (Sigma-Aldrich) 175,3 g Citrato sódico (Sigma-Aldrich) 88.2 g Agua destilada 800 ml Ajustar pH hasta 7.5 con HCl 1N o NaOH 10N, según el caso. Esterilizar en autoclave. 91 91 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 - ARN de levadura 10 mg/ml Disolver ARN de levadura (Sigma-Aldrich) a concentración de 10 mg/ml en agua destilada estéril. Alicuotar y guardar a -20°C. - SDS 20%. Añadir 20 g de SDS (Sigma-Aldrich, grado electroforesis) completando con agua destilada hasta 100 ml. Calentar a 68°C para diluir. No ajustar pH. No autoclavar. - Solución I Formamida 100% desionizada (Sigma-Aldrich) 50 ml SSC 20X 25 ml SDS 20 % 5 ml agua destilada 20 ml - Solución II NaCl 5M 10 ml Tris-HCl 1 M pH7,5 1ml Tween®20 (Sigma-Aldrich) 100 ml agua destilada 88,9 ml - Solución III Formamida 100% desionizada (Sigma-Aldrich) 50 ml SSC 20X pH 7,5 10 ml agua destilada 40 ml - Tampón Tris salino con Tween®20 20X NaCl 80 g ClK 2 g Tris-HCl 1M pH7,5 250 ml Tween®20 (Sigma-Aldrich) 10 ml Agua destilada 500 ml - Tampón Tris salino con Tween®20 1X - levamisol Tampón Tris salino con Tween® 20 20X 5 ml (1X). Levamisol 0,050g (2mM). Agua destilada hasta 100ml. - NTMT-levamisol NaCl 5 M 2 ml (100 mM) Tris-HCl 1 M 10 ml (100 mM) Cl2Mg 5 ml (50 mM) Tween®20 (Sigma-Aldrich) 100 l (0.1%) Levamisol 0,050 g (2mM) Agua destilada hasta 100 ml - Stock de 50 mg/ml BCIP: añadir 0,050 g de BCIP (Roche) en 1 ml de dimetilformamida (Sigma-Aldrich) al 100%. Almacenar a 4°C. - Stock de 75 mg/ml NBT: añadir 0,075 g de NBT (Roche) en 1 ml de dimetilformamida (Sigma-Aldrich) al 70%. Almacenar a 4°C. - Stock ARNsa a 50mg/ml: disolver 100 mg de ARNsaA en 2 ml de agua y añadir 20 l Tris HCl (10 mM) y 6l NaCl 5M (15mM). - Medio de montaje glicerina-gelatina Disolver 7 g de gelatina en hojas (Sigma-Aldrich) en 42 ml de agua destilada caliente durante 2 h. Después añadir 50 g de glicerina (Sigma-Aldrich) y 0.5 ml de fenol (SigmaAldrich). Se calienta la mezcla hasta disolución al baño María. Guardar a 4°C. Para montar cortes meter la solución al baño a 65°C unos minutos antes y a continuación montar. 92 92 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 93 93 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4. RESULTADOS 94 94 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4.1. Fenotipo de los ratones Málaga nulos para LPA1 Como previamente hemos detallado, la variedad Málaga de ratones nulos para el receptor LPA1se obtuvo de manera espontánea, a partir de la expansión natural y por retrocruzamiento de la colonia original descrita por Contos et ál. (2000). Expandidos durante numerosas generaciones, son estables, viables, y portan la misma deleción del exón 3 del receptor que sus predecesores (Estivill-Torrús et ál., 2008). El análisis de segregación de la deleción del gen en la progenie de una misma camada, medido en diferentes camadas y mediante genotipado basado en la reacción en cadena de la polimerasa, demostró que la variedad Málaga nula para LPA1guardaba los principios mendelianos de proporción de individuos homocigotos de genotipo normal [maLpar1 (+/+) ], heterozigoto [maLpar1 (+/–)] y de homozigoto maLPA1-nulos o nulos para Lpar1 [maLpar1 (–/–)] (Tabla 2). Progenie resultante Observado en etapa embrionaria (E14.5 – E18.5) esperado Parental ( + / + ) ( + / - ) ( - / -) ( - / -) +/+ +/35 (49 %) 37 (51 %) 0 (0 %) 0 +/  +/21 (26 %) 41 (51 %) 19 (23 %) 21 +/  /0 (0 %) 36 (52 %) 33 (48 %) 36 Observado tras destete (P21) esperado Parental ( + / + ) ( + / - ) ( - / -) ( - / -) +/+ +/191 (49 %) 198 (51 %) 0 (0 %) 0 +/  +/80 (28 %) 141 (50 %) 61 (22 %) 70 +/  /0 (0 %) 193 (55 %) 159 (45 %) 193 Proporción de sexo (hembra:macho) 131:140 254:278 99:121 Tabla 2. Análisis del genotipado de la camada de ratones maLPA1-nulos según el genotipo específico parental. Se expresa el número de individuos totales, todos ellos obtenidos cada vez de una misma camada y el porcentaje correspondiente. Los resultados son representativos de diferentes camadas analizadas, todas con similar tendencia, mostrando únicamente una ligera pérdida de animales nulos tras nacimiento. 95 95 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Como ha sido mencionado, entre los rasgos más llamativos de la cepa original nula para el receptor LPA1descrita por Contos et ál. (2000) destacan la marcada mortalidad en los neonatos, aproximadamente del 50 %, y su incapacidad para amamantar correctamente. Una de las primeras características destacadas observadas en la variedad Málaga, a diferencia de la cepa original, fue la ausencia de defectos en el amamantamiento y el aumento de la tasa de supervivencia, cercana al 95 %, que les permite alcanzar la edad adulta, siendo fértiles y con capacidad de reproducirse. De acuerdo a lo que también se observaba en la cepa original, los ratones nulos para el receptor LPA1, tanto machos como hembras, presentaron un menor peso, tanto en la edad adulta como en estadios embrionarios (Fig. 26), siendo el peso de los ejemplares maLPA1nulos significativamente menor que el observado en los genotipos salvaje y heterocigoto. Los animales nulos también mostraron un menor tamaño, detectable desde estadios embrionarios, y marcadamente diferente en adultos (Fig. 27). No se observaron diferencias significativas entre los pesos de los individuos salvajes y de los heterocigotos. Figura 26. Reducción de masa corporal en ausencia del receptor LPA1en los ratones maLPA1-nulos. Masa corporal, desde su nacimiento hasta edad adulta, a 12 semanas de edad, en ratones macho (izquierda) y hembra (derecha) normales [maLpar1 (+/+)], heterocigotos [maLpar1 (+/–)] (círculo vacío, o) y nulos homocigotos [maLpar1 (–/–)] (círculo relleno,). Datos comparados de individuos de una misma camada provenientes de cruces de padres heterocigotos [maLpar1 (+/–)maLpar1 (+/–)]. Los datos de los ejemplares normales y los heterocigotos se solaparon por lo que no son mostrados para una mayor claridad. () p= 0,05, (n=14). 96 96 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Además del menor peso y tamaño, todos los ejemplares nulos de la variedad Málaga, como en la cepa original (Contos et ál., 2000) presentaron un dimorfismo craneal característico, consistente en la presencia de un hocico reducido y una mayor distancia entre los ojos (Fig. 27). Este fenotipo fue, y es, reproducible en la totalidad de ejemplares nulos homocigotos de nuestra colonia. No se observaron otras alteraciones destacables en la anatomía externa de los animales o en su comportamiento general (alimentación, vigiliasueño). A pesar de que el reconocimiento fenotípico de los ejemplares nulos era sencillo, cada ejemplar del estudio fue genotipado de igual manera para confirmar su genotipo. Figura 27. Reducción de tamaño corporal en los ratones maLPA1-nulos. Fotografías de ejemplares de ratones adultos, machos, de 12 semanas de edad (A - D) y embriones en estadio E14.5 (E, F), de genotipos normal [maLpar1 (+/+)] (A, C, E) y nulo homocigotos [maLpar1 (–/–)] (B, D, F). Obsérvese el dimorfismo craneal característico en los individuos nulos, presentando un hocico más corto y unos ojos mas espaciados entre sí. El menor tamaño y peso corporal de los animales carentes del receptor funcional frente a los de genotipo salvaje es patente. Datos comparados de individuos de una misma camada provenientes de cruces de padres heterocigotos [maLpar1 (+/–)maLpar1 (+/–)]. 97 97 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Los ratones de la cepa original descrita por Contos et ál. (2000) mostraban una acusada letalidad perinatal, con una supervivencia postnatal de tan sólo un 50%. Según estos autores, la alta mortalidad podría ser consecuencia de una atrofia en el desarrollo de las capacidades olfatorias lo que impediría un correcto amamantamiento de las crías que, de hecho, era claramente observable en sus ejemplares. En el caso de la variedad Málaga los animales no mostraron la misma mortalidad perinatal. La observación directa de la camada por parte de diferentes observadores mostró siempre que, aparentemente, no había dificultad alguna apreciable a la hora del amamantamiento (Fig. 28 A). Para comprobar si efectivamente era así, que no existían problemas durante la lactancia, o bien si un posible defecto de la toma de leche podría ser parte de la razón de un desarrollo deficiente y de las diferencias de tamaño y peso observadas posteriormente, se realizó un análisis de la cantidad de leche ingerida en ratones de tres días de edad (P3) de acuerdo a Contos et ál. (2000), clasificando las crías según la cantidad de leche observada en el estómago de los lactantes, (-) en caso de ausencia de leche, (+) con medio estómago lleno, (++) en caso de estómago lleno (Fig. 28 B, C). Los resultados mostraron que el genotipo no era determinante, es decir, no existían diferencias significativas entre individuos de los diferentes genotipos (Fig. 28 C, D) y, de manera predominante, las crías mostraban el estómago con el mayor contenido de leche, demostrando una lactancia normal y, de manera notable, una diferencia sustancial en la variedad Málaga respecto a los déficits descritos en la cepa original. A 104 104 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 una expresión ectópica y prematura de -III tubulina en la ZV incluso en células localizadas en la superficie más próxima al ventrículo (Fig. 33 F, L; flechas), indicativos de una maduración neuronal temprana antes de haber alcanzado su emplazamiento definitivo. Los individuos heterocigotos presentaron también dichas alteraciones aunque en menor grado (Fig. 33 C, D, H, K) Figura 33. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E11.5 para ratones Málaga normales, heterocigotos y nulos para LPA1. Expresión de PCNA (A,C,E,G-I) y - III tubulina (B, D, F, J-L)en secciones coronales (A-F; ampliados x10 los recuadros en G-L) del telencéfalo de embriones en el estadio E11.5 de animales de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A, B, G, J) , y de genotipo heterozigoto [maLpar1 (+/–)] (C, D, H, K) u homozigoto [maLpar1 (–/–)] (E, F, J, L). pp, preplaca; zv, zona ventricular. Barra de escala en (A-F), 250 µm; (G-L), 55 µm. En el estadio E14.5 la corteza embrionaria en desarrollo ya posee una arquitectura cortical que comprende dos capas proliferativas: la zona ventricular (ZV) y la zona subventricular (ZSV), una primitiva zona intermedia (ZI) con migración radial de neuronas y una placa cortical (PC) con neuronas en diferenciación y conexiones tanto aferentes como eferentes de la corteza embrionaria. De manera similar a lo observado en E11.5, la corteza del ratón de genotipo normal mostró una pared cortical claramente diferenciada en una capa germinativa (ZV/ZSV) de progenitores neurales con expresión de PCNA (Fig. 34 A, G) y una segunda capa (ZI/ PC), por encima de esta, constituída por células postmitóticas inmunorreactivas a -III tubulina (Fig. 34 B, J). En el animal nulo para LPA1se observó una clara reducción de la zona proliferativa 105 105 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 inmunorreactiva a PCNA que llega a presentar casi la mitad de su grosor normal (Fig. 34 E, I) correlacionada con un aumento muy significativo y proporcional de la capa de células con expresión prematura de -III tubulina así como del número de células con expresión de dicho marcador neuronal (flecha en Figura L) en la presunta área germinativa (ZV/ZSV)(Fig. 34 F, L). Además, se pudo observar numerosas fibras de células con expresión de -III tubulina con orientación ordenada y paralela a la superficie ventricular (punta de flecha en Figura L). Los ratones de genotipo heterocigoto mostraron un patrón proliferativo gradual e intermedio entre lo observado en ratones normales y nulos (Fig. 34 C, H), igualmente correlacionado con la expresión de -III tubulina (Fig. D, K). También el animal heterocigoto mostró células postmitóticas con fibras ordenadas y paralelas a la superficie ventricular (punta de flecha en Figura 34 K) y expresión ectópica de -III tubulina en la zona germinativa (flecha en Figura 34 K). Figura 34. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E14.5 para ratones Málaga normales, heterocigotos y nulos para LPA1. Expresión de PCNA (A,C,E,G-I) y - III tubulina (B, D, F, J-L)en secciones coronales (A-F; ampliados x10 los recuadros en G-L) del telencéfalo de embriones en el estadio E14.5 de animales de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A, B, G, J) , y de genotipo heterozigoto [maLpar1 (+/–)] (C, D, H, K) u homozigoto [maLpar1 (–/–)] (E, F, J, L). pc, placa cortical; zi, zona intermedia; zv/zsv, ventricular/ zona subventricular. Barra de escala en (A-F), 300 µm; (G-L), 65 µm. 106 106 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 . El estadio E16.5 del ratón representa ya una fase muy avanzada de neurogénesis cortical en el ratón (Takahashi et ál., 1995; Miyama et ál., 1997). Al observar, de manera similar, el marcaje para los antígenos citados, no se encontraron diferencias tan evidentes como en los estadios anteriores, siendo, las variaciones en el patrón de expresión de PCNA y -III tubulina entre los diferentes genotipos muy sutiles, apenas identificables en el caso de los individuos heterocigotos (Fig. 35). El anticuerpo contra PCNA mostró un grosor de ZV / ZSV similar para los genotipos estudiados (Fig. 35 A, C, E, G). Sin embargo, sí que se observaron diferencias en un área que presenta una actividad neurogénica activa en este período, el bulbo olfatorio, con una reducción en el grosor de la capa proliferativa ventricular ZV de los ratones nulos para LPA1 respecto a los normales (Fig. 35 I-L). Esta variación en el bulbo olfatorio es realmente interesante. A pesar de ello, nuestro estudio se ha centrado en la neurogénesis cortical, no en el bulbo olfatorio. El hecho de que existieran mayores diferencias en estadios E11.5 y E14.5 respecto a E16.5 sugiere alteraciones específicas en los períodos en los que la neurogénesis es muy activa. De manera análoga, el marcaje con -III tubulina mostró menos diferencias en este estadio (Fig. 35 B, D, F, H). Aun así, en los embriones nulos continuó observándose un mayor número de células con expresión de -III tubulina próximas a la luz del ventrículo en comparación con los embriones normales (flecha en Figura 35 H). También se observa una mayor laxitud en la capa neuronal más externa y, en la zona intermedia, las fibras positivas paralelas al ventrículo se encuentran más desorganizadas que respecto a las del ratón normal (punta de flecha en Figura 35 F, H). En estadios posteriores a E16.5, tales como E18.5 ó P0, la mayor parte de la neurogénesis se ha completado y el análisis de las capas proliferativas y de la distribución de las neuronas, no aportó nuevos datos discutibles en nuestro estudio (no mostrado). 107 107 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 35. Patron proliferativo y postmitótico cortical en estadio E16.5 para ratones Málaga normales y nulos para LPA1. Expresión de PCNA (A,C,E,G, I-L) y -III tubulina (B, D, F, H) en secciones coronales del telencéfalo a nivel medio (A-D; ampliados x2 en EH) y del bulbo olfatorio (I, K, ampliados x2 en J, L) de embriones en el estadio E16.5 de animales de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A, B, E, F, I, J) , y de genotipo nulo homozigoto [maLpar1 (–/–)] (C, D, G, H, K, L). zv/zsv, ventricular/ zona subventricular. Barra de escala en (A-D), 300 µm; (E-H), 150 µm; (I, K), 250 µm; (J, L), 125 µm. Considerando las anomalías en el patrón de expresión de PCNA en ausencia del receptor LPA1, especialmente en los estadios iniciales, que sugerían una pérdidad de identidad de células precursoras en beneficio de una mayor proporción de células diferenciadas, se optó por comprobar si los procesos de división tenían lugar correctamente y si la reducción de expresión de PCNA se correlacionaba con alteraciones de mitosis. A nivel histológico y, con el objetivo de estudiar el número de células que se encuentran, en un momento dado, en mitosis en las regiones proliferantes, se recurrió al estudio de expresión de la forma fosforilada de la proteína Histona H3, que marca núcleos que se encuentran en la fase mitótica de 108 108 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 condensación del material genético, desde G2 hasta el momento preciso de la división mitótica, siendo su mayor expresión en metafase (Hendzel et ál., 1997). Se seleccionó el estadio E14.5 como el más representativo para estudiar el patrón de células positivas a Histona H3 fosforilada. Las imágenes demostraron, una vez más, que la ausencia del receptor LPA1se correlacionaba con una disminución del potencial proliferativo durante la neurogénesis, dismiuyendo el número de células positivas al marcador a nivel de la superficie ventricular (Fig. 36). Es a nivel apical donde tienen lugar las mitosis en un correcto patrón de migración nuclear intercinética (Hollyday, 2001; Miyata et ál. 2004; Miyata, 2008) y así, es importante hacerlo notar, se pudo observar en ambos genotipos, no concurriendo ninguna división ectópica dentro de la ZV en ausencia del receptor LPA1(Fig.36 B, D, G) y limitándose el defecto al número de procesos de división en un momento dado. La cuantificación de las células arrojó cifras con una reducción significativa de hasta un 32% del número de células en mitosis apicales en la ZV de los animales nulos para LPA1respecto a los normales (Fig. 36 H) y que se correlacionaban, de manera lógica, con la reducción de expresión de PCNA observada. Los individuos heterocigotos, de nuevo, mostraron un patrón intermedio, entre ambos genotipos. Además, el análisis de las mitosis localizadas en la ZSV, a nivel apoventricular, demostró, de igual manera, que dichas divisiones, aún cuando se presenten en menor medida, seguían reducidas significativamente en heterocigotos y nulos homocigotos respecto a los individuos normales (Fig. 36 H) 109 109 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 36. Reducción del número de mitosis en ausencia del receptor LPA1. (A-G) Expresión de Histona H3 fosforilada en secciones coronales corticales de la zona proliferativa (VZ/ SVZ) en ratones de estadio E14.5 de genotipo normal [maLpar1 (+/+)], heterocigoto nulo [maLpar1 (+/–)], y nulo [maLpar1 (–/–)]; (A, B, aumentados en detalle en C, D). Se apreció una reducción del número de celulas histona H3-positivas en los ejemplares nulos para LPA1, reducción que afectó no sólo a las mitosis junto a la luz del ventrículo (los tres genotipos en E-G), sino también a las células en mitosis en región apoventricular, en ZSV (flechas en C y D). Barra de escala (A, B) 300 m,(C, D) 100 m, (E,) 45 m. (H) La gráfica muestra el porcentaje de células en las zona ventricular (ZV) y subventricular (ZSV) que expresaban histona H3 fosforilada en cada genotipo frente al número total de células en la sección analizada. (n=8; **, p = 0,01). 110 110 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4.3.2. Expresión anómala de genes reguladores de neurogénesis cortical en ausencia del receptor LPA1. Diferentes estudios previos han mostrado que el factor de trasncripción Pax6 está implicado en la regulación del ciclo celular durante la neurogénesis en estadios tempranos de desarrollo cerebral (Warren et ál., 1999; Estivill-Torrús et ál., 2000), período éste en el que la expresión de manera secuencial de los factores de transcripción Pax6 yTbr2 termina en la diferenciación de los precursores neurales hacia progenitores intermedios de la ZSV (Englund et ál., 2005; Vasistha et ál., 2005; Quinn et ál., 2007). A fin de profundizar en la influencia de la señalización mediada por LPA1y determinar si las alteraciones observadas en la corteza cerebral de los ratones carentes del receptor LPA1se correlacionaban con alteraciones en la expresión de Pax6 yTbr2 se analizaron secciones coronales corticales de cada genotipo por hibridación in situ e inmunohistoquímica a edades similares a las estudiadas. El estudio no solo se restringió a estos dos factores sino que, por su participación en estos procesos de diferenciación, además, se analizó la expresión de Ngn1, factor proneural, implicado en la especificación de destino neuronal en el progenitor (Sun et ál., 2001; He et ál., 2005) y de Tis21, factor implicado en el control de la progresión del ciclo celular, y que se expresa en la fase de división asimétrica, marcando selectivamente los progenitores neurogénicos, no los proliferativos, así como tampoco las neuronas postmitóticas (Iacopetti et ál., 1999). Su expresión es de especial interés ya que se ha observado que las células que expresan Tis21 no suelen generar neuronas directamente, sino que generan progenitores basales que darán lugar a neuronas (Attardo et ál., 2008, 2010). Para nuestro estudio, por tanto, usamos Pax6 como marcador de progenitores neurales en división, apicales en su mayoría, si bien las divisiones de los intermedios, que expresan Tbr2, son más neurogénicas. A su vez, la mayoría de todas las células con división asimétrica que dieran lugar a progenitores basales neurogénicos quedarían señaladas por la expresión de Tis21. El estudio de expresión de Pax6 en ratones de genotipo normal permitió comprobar que, en la neurogénesis, en una fase temprana/media como E14.5, la expresión de Pax6 se encuentra localizada en la ZV y ZSV, donde es expresado por la mayoría de los precursores neurales (Walther y Gruss, 1991), delimitando claramente la región germinativa (Fig. 37 A). Al examinar la corteza de los animales carentes del receptor LPA1se pudo observar una reducción muy clara de la región con expresión de Pax6 (Fig. 37 B), de acuerdo, por otra parte, con las imágenes de expresión de PCNA anteriormente mostradas. De manera equivalente, la región que en los ratones maLPA1-nulos presuntamente debía ser proliferativa pero que, en 111 111 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 dicho estadio, mostraba una expresión de -III tubulina anómala y prematura, no presentaba niveles detectables de expresión de Pax6, de manera consistente con la pérdida de identidad de célula precursora (Fig. 37 B). En este mismo estadio, E14.5, Tbr2, como hemos mencionado, se expresaba en genotipo control normal (Fig. 37 C) en las células destinadas a actuar como progenitores intermedios en la ZSV, a nivel apoventricular, basal, así como en algunas neuronas postmitóticas recién diferenciadas, delimitando la ZSV, próximo al límite de expresión de Pax6, más apical (Englund et ál., 2005; Vasistha et ál., 2005; Quinn et ál., 2007). De acuerdo a la disminución de expresión de PCNA y Pax6 en la presunta ZV/ ZSV del embrión nulo para LPA1, se esperaría una disminución en la región positiva a Tbr2. Sin embargo, los resultados mostraron, de manera ciertamente interesante, que, a excepción de ligeras variaciones, no había apenas diferencias entre el genotipo normal y el nulo carente del receptor (Fig. 37 C, D). Estos resultados, considerando que la identidad de los progenitores intermedios de la ZSV viene determinada, como hemos mencionado, por una regulación al alza de Tbr2 y otra, a la baja de Pax6 (Englund et ál., 2005), sugerían una salida de ciclo prematura por parte de los precursores neurales y la inmediata adquisición de identidad de progenitor intermedio en ZSV. Esta salida prematura quedaría confirmada además, por la alteración de la expresión de Tis 21 yNgn1 yNgn2. Así, frente al comportamiento normal en el que, en E14.5 hay una fracción destacada de progenitores con expresión de Tis21, merced a la necesidad de generar progenitores intermedios neurogénicos (Fig. 37 E), la ausencia del receptor LPA1se acompaña de una reducción considerable de la expresión de Tis21 (Fig. 37 F), lo que sugiere, al no haber diferencias en la expresión de Tbr2, que se ha evitado u obviado este paso prematuramente de alguna manera. En el animal nulo este patrón anómalo de orquestación de expresión génica vino acompañado, además, de un desequilibrio en la expresión de los genes proneurales ya que, si bien en E14.5 tenía lugar un descenso de expresión de Ngn1 (Fig. 37 G, H), pero no de Ngn2 (Fig. 37 I, J), poco más tarde, a E16.5, era la expresión de Ngn2 la que quedaba muy reducida en comparación con el embrión de genotipo normal (Fig. 37 K, L) 112 112 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 37. Patron de expresión de Pax6, Tbr2, Tis21, Ngn1 y Ngn2 en la neurogénesis cortical temprana de ratones normales y nulos para LPA1. Expresión de Pax6 (A,B), Tbr2 (C,D), Tis21 (E,F), Ngn1 (G,H)y Ngn2 (I-L) a estadios E14.5 (A-J) y E16.5 (K, L) en secciones coronales del telencéfalo de embriones de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A, C, E, G, I, K) , y nulo [maLpar1 (–/–)] (B, D, F, H, J, L). En (A-D) se incluyen ampliados x2 en zona inferior. zv/zsv, ventricular/ zona subventricular. Barra de escala en (A-J), 400 µm (a excepción de cada ampliado –x2en A-D); (K, L), 500 µm. 4.3.3. Inversión de la proporción del tipo de división adoptado por los precursores corticales apicales en ausencia del receptor LPA1. Como mencionamos al inicio de este trabajo, el modo de división de las células progenitoras apicales en la zona proliferativa ventricular condiciona y permite la corticogénesis. Cuando la orientación del huso mitótico y, con ello, el plano de división celular, es vertical (perpendicular a la superficie ventricular), producen un modo de división simétrica, 113 113 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 generando dos células precursoras hijas idénticas que permanecen en la zona ventricular, mientras que, por el contrario, el plano de división aproximadamente horizontal, (paralelo o ligeramente oblicuo a la superficie ventricular), corresponde a una división asimétrica que genera dos células hijas diferentes, la más próxima al ventrículo se mantendrá como progenitora mientras que la otra migrará hacia la placa cortical para contribuir a la formación diferenciada de la corteza cerebral o bien dara lugar un progenitor intermedio (Haydar et ál. 2003). En un indivíduo normal las divisiones simétricas predominan en las fases tempranas del desarrollo para incrementar la población proliferativa en la VZ mientras que, conforme la neurogénesis avanza, aumenta el porcentaje de divisiones asimétricas que darán lugar a neuronas y celulas gliales (Chenn y McConnell, 1995; Hatten, 1999; Haydar et ál. 2003; Noctor et ál., 2004; Gotz y Huttner, 2005; Merkle y Alvarez-Buylla, 2006; Paridaen y Huttner, 2014). Si, como sugerían los resultados, la ausencia de LPA1podía generar una salida prematura de ciclo con expresión temprana de marcadores de diferenciación, el tipo de división de los precursores nulos para LPA1pudiera estar marcadamente desplazado hacia la asimetría, ya que es la, a priori, salida natural para generar progenitores intermedios y neuronas. El huso mitótico de los progenitores rota durante la metafase pero se detiene en anafase, lo que permite detectar una medida exacta del plano de división (Adams, 1996). Por ello realizamos un análisis, a diferentes estadios, mediante tinción histológica convencional con hematoxilina, para observar con detalle la presencia y el tipo de división en la ZV de ambos genotipos normal y nulo ya que con esta tinción sencilla se pueden identificar y cuantificar claramente las células en anafase y telofase, cuando los cromosomas condesados se separan.Las células se clasificaron según la orientación de su plano de división (Estivill-Torrús et ál., 2000), diferenciando plano vertical (división simétrica) y planos intermedio (oblicuo) y horizontal (división asimétrica ambos, si bien el oblicuo suele ser mayoritario en mamíferos) (Fig. 38 A), a objeto de demostrar mejor la posible alteración en el animal nulo para el receptor. Así, de acuerdo a lo descrito en condiciones normales, el ratón normal en estadio E14.5 (neurogénesis temprana/media) prácticamente las dos terceras partes de todas las divisiones eran con orientación vertical, es decir, dirigidas a división simétrica, siendo las de tipo asimétrico mayormente con plano oblícuo o intermedio (Fig. 38 B). La proporción de divisiones simétricas se redujo ligeramente en E16.5 (Fig. 38 B). Sin embargo, al analizar el ratón maLPA1nulo, en ambos estadios, E14.5 y E16.5 los resultados mostraron, especialmente a E14.5, unos valores muy elevados, y significativos respecto a los individuos normales, de divisiones de tipo asimétrico, cercanos al 65 %, y mayoritariamente por orientación horizontal, (Fig. 38 B) lo que 120 120 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4.4. Alteraciones en la formación cortical en los ratones Málaga nulos para LPA1 4.4.1. Migración cortical y diferenciación anómalos en ausencia del receptor LPA1. Los defectos observados hasta ahora por la ausencia del receptor LPA1permiten inferir un papel sustancial del mismo para el correcto desarrollo de la neurogénesis cortical, cuando menos, a nivel del equilibrio de los procesos de división/diferenciación en los estadios iniciales de la corticogénesis. Para valorar el efecto de estas alteraciones y, por ello, el papel del receptor LPA1en la formación de la corteza cerebral, en la correcta migración neuronal y la constitución de las diferentes capas corticales, y, en última instancia, en la funcionalidad cerebral, fue preciso examinar la corteza cerebral a objeto de buscar defectos que pudieran afectar la organización cortical postnatal. En primer lugar, considerando las alteraciones a nivel histológico, se estudió el comportamiento migratorio de los precursores neurales mediante la administración intraperitoneal de BrdU (en una proporción de 70 g BrdU/gr de peso del animal) a hembras preñadas con crías en edad E14.5, para así marcar las células corticales que nacieran en ese preciso momento, y poder, a posteriori, examinar su distribución en estadio E18.5. Se calculó el porcentaje de células marcadas según su localización, respecto al total de marcadas (ver sección 3.4.2.3.), lo cual permitió estimar su migración (Gillies y Price, 1993; Estivill-Torrús et ál, 2000). Las células positivas a BrdU se clasificaron en células con marca densa, donde se marcaba más de la mitad del núcleo, y células con marca ligera, con menor marca en el núcleo (apariencia punteada), indicativa de que han sufrido más de un ciclo de división tras el marcaje (Gillies y Price, 1993; Taupin, 2007). Se pudo observar cómo, inmediatamente después del pulso de BrdU, los embriones en estadio E14.5 de ambos genotipos, normal y maLPA1-nulo, mostraron patrones de marcaje similares cualitativamente, con la totalidad de células marcadas localizadas en la ZV y ZSV (no mostrado). A las 12h de la administración de BrdU su inmunodetección en las secciones coronales corticales de los embriones normales en E14.5 mostró una amplia distribución de células marcadas en la pared cortical que ocupaba ambas, ZV y ZSV, y la ZI, donde pse localizaban en una proporción my significativa (Fig. 42 A). Por el contrario, en los animales nulos para el receptor las células marcadas estaban prácticamente ausentes de la ZI y, las de posiciones más apicales se localizaban, mayoritariamente, en ZSV (Fig. 42 B). La cuantificación de las células en 121 121 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 las diferentes zonas confirmó la reducción significativa de células marcadas en la ZI y que afectaba tanto a células marcadas de manera densa, como a las de marca ligera, procedentes de divisiones anteriores (Fig. 42 C), lo que, en conjunto, parecía indicativo de deficiencias de migración en estadios iniciales. Figura 42. Migración cortical temprana alterada en ausencia del receptor LPA1. (A,B) Inmunodetección de BrdU en células marcadas en E14.5 ,12h tras su administración. La imagen muestra el patrón de marca en secciones coronales corticales de embriones de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A), y de genotipo nulo [maLpar1 (–/–)] (B), este último sin apenas marcaje en la zona intermedia (zi). (C) Gráficas mostrando el porcentaje de células marcadas de acuerdo a tipo de marca y localización cortical (zi vs. zv/zsv), en ambos genotipos, normal y nulo. El animal nulo mostró un número apenas significativo de células con BrdU en la zona intermedia.pc, placa cortical; zi, zona intermedia; zv, zona ventricular; zv/zsv, ventricular/ zona subventricular. Barra de escala en (A-B), 100 µm. Cuando el análisis se efectuó en estadio E18.5, al final del periodo neurogénico, con un placa cortical conveniente formada, ambos genotipos, normal y maLPA1-nulo, presencia de células generadas en E14.5, marcadas densamente, en las capas más superficiales de la pared cortical (Fig. 43 A, B), indicando que la ausencia del receptor no incapacita a las neuronas para zi zi ligera 122 122 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 migrar. Sin embargo, y siempre respecto al genotipo normal, llamaron la atención dos hechos en los animales maLPA1-nulos, esto es, las pocas células presentes en la ZI y, de manera evidente y significativa, la acumulación de células marcadas (de ambas marcas, densa y ligera) en las capas más profundas de la corteza cerebral (Fig. 43 C), sugiriendo, en principio, defectos de posicionamiento, sin que pudiéramos descartar aún la influencia, igualmente, de muerte celular. Figura 43. Migración anómala a capas superiores en ausencia del receptor LPA1. (A, B) Inmunodetección de BrdU en células marcadas en E18.5 ,4 días tras su administración. La imagen muestra el patrón de marca en secciones coronales corticales de embriones de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A), y de genotipo nulo [maLpar1 (–/–)] (B), este último con acumulación de células marcadas en las capas más profundas (punta de flecha). Se muestra insertada el sistema de compartimentos usado para el conteo. (C) Gráficas mostrando el porcentaje de células marcadas de acuerdo a tipo de marca y localización (en cada compartimento según profundidad cortical), en ambos genotipos, normal y nulo. El animal nulo mostró una acumulación significativa en las capas situadas a mayor profundidad en la pared cortical. zm, zona marginal; pc, placa cortical; zi, zona intermedia;.Barra de escala en (A-B), 100 µm. 123 123 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 La acumulación de células marcadas con BrdU podría deberse a diferentes causas. La anómala división y diferenciación sufrida por los progenitores en la ZV podría ser la más pausible para explicar los defectos de migración en sentido radial. Sin embargo es posible que otros factores influyeran en el resultado, tanto para la migración como, especialmente, la diferenciación final de las neuronas postmitóticas, especialmente por los resultados en la ZI. La ZI es una región particular por ser receptora de la migración tangencial de células, en particular las interneuronas de tipo GABAérgico. Desde E14.5 y durante el desarrollo embrionario, la eminencia ganglionar media, en el telencéfalo basal, es la fuente principal de dichas interneuronas corticales, incluyendo los subtipos que expresan parvalbúmina, que viajan por medio de migración tangencial hasta su destino final en la corteza y muy presentes en las capas más profundas de la corteza cerebral (Xu et ál., 2004, 2010; Wonders y Anderson, 2005). En este sentido se trató de detectar anomalías en las vías tangenciales, no sólo en relación a la diferenciación de interneuronas corticales en destino, sino también en los tractos que se forman durante el desarrollo tangencialmente. El análisis de la expresión de GAP-43, una proteína que se expresa durante el desarrollo y que está implicada en el desarrollo de tractos axonales, la liberación de neurotransmisores, y la plasticidad sináptica (Jacobson et ál., 1986), permitió, observar los tractos tempranos que en sentido talamocortical se han desarrollado (López-Bendito et ál., 2003). Los resultados demostraron que, tanto en el embrión de genotipo normal, como en el nulo para el receptor LPA1, la inmunorreactividad de GAP-43 definía perfectamente las fibras talamocorticales, que cruzaban los límites del palio/subpalio, desde las eminencias ganglionares hacia la ZI (Fig. 44 A, B). Por otra parte, el análisis mediante hibridación in situ, de la expresión de TAG-1, molécula de adhesión que se expresa durante el desarrollo selectivamente en los axones corticofugales e influye en la migración tangencial de las neuronas (Denaxa et ál., 2001), tampoco demostró diferencia alguna entre ambos genotipos (Fig. 44 C, D). Sin embargo, cuando se realizó inmunodetección de las neuronas que expresaban parvalbúmina, ya en la edad adulta, se pudo observar una reducción de éstas en las capas más profundas (V y VI) de la corteza de los ratones maLPA1-nulos (Fig. 44 E), respecto a lo observado en el genotipo normal (Fig. 44 F), lo cual, en conjunto sugería defectos locales en su destino, más que anomalías en la migración de las células durante el desarrollo. 124 124 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 44. Conexión talamocortical y corticotalámica en ausencia del receptor LPA1. (A,B) Inmunodetección de GAP43 en fibras talamocorticales en secciones coronales corticales de embriones en E14.5 de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A), y de genotipo nulo [maLpar1 (–/–)] (B). (C,D) Expresión de TAG-1 en fibras corticofugales en secciones similares. En ambos casos no se apreciaron diferencias que pudieran poner de manifiesto alteraciones en las vías tangenciales en ausencia del receptor. (E,F) Secciones coronales de corteza motora de ratones adultos (3 meses) de genotipo normal (E) y nulo (F) inmunoteñidas para detección de parvalbúmina. El animal nulo mostró menor número de neuronas con expresión de parvalbúmina en las capas corticales (indicadas en números romanos) situadas a mayor profundidad (punta de flecha) en la pared cortical. ctx, corteza cerebral; eg, eminencias ganglionares; Barra de escala en (A, B) 300 µm;(C, D) 350 µm;(E, F), 100 µm. 125 125 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 A pesar del patron normal de inmunorreactividad a GAP-43 exhibido por ambos genotipos en el desarrollo cortical, más allá de los tractos axonales, la expresión de esta proteína demostró un defecto acusado en la corteza de ratones maLPA1-nulos en edad perinatal y que volvía a poner de manifiesto fallos en la diferenciación celular final en destino. En estadio P0, la detección de GAP-43 en secciones coronales corticales del animal normal mostró su expresión en neuronas distribuidas en todas las capas corticales (Fig. 45 A). Por el contrario, la corteza de los animales nulos para el receptor apenas detectó GAP-43 en la capa cortical II (Fig. 45 B), lo que sugería defectos en diferenciación neuronal. Estos defectos no impedieron, no obstante, que las células corticales de esta capa conservaran su identidad neuronal como se puso de manifiesto mediante tinción para la detección de β-III tubulina (Fig. 45 C, D). A objeto de poder cuantificar la expresión de dicha proteína en la zona se recurrió a su detección en electrotransferidos tras electroforesis de extractos de proteína de muestras corticales de las regiones dorsales superior y media, comprendiendo las capas corticales II/ III, indicadas ambas regiones en la figura como “1” (dorsal superior) y “2” (dorsal media) respectivamente. Este análisis de las citadas regiones confirmó lo observado en inmunohistoquímica. La Fig. 45 E muestra un resultado representativo de muestras corticales de ambos genotipos, normal y nulo, procesados para la inmunodetección de GAP-43. Se detectó una banda de proteína de aproximadamente 46 kDa correspondiente a GAP-43. La cuantificación de la intensidad de la banda mediante densitometría mostró una reducción significativa de los niveles de GAP-43 en la capa II de la corteza cerebral de los ratones nulos para el receptor LPA1, por comparación con el genotipo normal (Fig. 45 F) lo que, junto a los resultados mencionados hasta ahora, venía a sugerir que los defectos durante los procesos proliferativos en ausencia del receptor LPA1afectaban, en última instancia, a la diferenciación en destino generando, en este caso, una deficiencia en la expresión de GAP-43, es decir, alteraciones relacionadas con plasticidad y, en definitiva, una incorrecta formación de la corteza. 126 126 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 45. Deficiencia cortical de GAP-43 como consecuencia de las alteraciones de desarrollo en ratones nulos para LPA1.(A, B) Expresión de GAP-43 detectada por inmunohistoquímica en secciones coronales de ratones de edad P0 de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A), y de genotipo nulo [maLpar1 (–/–)] (B). El recuadro (en blanco, siendo x3 del señalado en negro) muestra la reducción significativa de marcaje en las capas corticales superficiales (en números romanos) de los ejemplares nulos en comparación con los de genotipo normal.(C, D) Marcaje para la β-III tubulina en secciones similares. Barra de escala en (A-B), 300 µm; (C, D) 175 µm. (E) Detección de GAP-43 en muestras proteicas electrotransferidas obtenidas por disección de las áreas corticales 1 y 2 (mostradas en A, B) en ratones normales y nulos de estadio P0. Obsérvese la reducción en el marcaje de los ratones maLPA1-nulos, especialmente en la zona 1 correspondiente al área mas superficial de la capa cortical II. (F) Cuantificación de la intensidad de las bandas mediante densitometría confirmando la menor expresión de GAP-43 en ausencia del receptor LPA1en ambas capas (indicadas 1, 2) (n=8; **, normal 1 vs. nulo 1, p < 0,001; *, normal 2 vs. nulo 2). 127 127 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4.4.2. Apoptosis cortical embrionaria y postnatal en ratones maLPA1-nulos Diferentes trabajos han demostrado, con anterioridad, los efectos antiapoptóticos de la señalización mediada por LPA (Ye et ál., 2002; Kingsbury et ál., 2003). De especial relevancia fueron los desarrollados por Kingsbury et ál. (2003), en explantes de corteza, donde la inbihición de apoptosis durante la neurogénesis resulta en un incremento sustancial del grosor cortical (Kingsbury et ál., 2003). Resulta razonable pensar, por tanto, que, al ser eliminada la via de señalización del receptor LPA1, pueda tener lugar un aumento en los niveles de apoptosis, lo cual podría explicar la reducción en tamaño del encéfalo de los ratones maLPA1nulos así como las diferentes anomalías en el patrón migratorio o de diferenciación en destino. Por ello, decidimos analizar los niveles corticales de apoptosis mediante una técnica de detección colorimétrica basada en la técnica TUNEL (ver sección 3.5). El análisis se realizó en la corteza cerebral de embriones y en ejemplares postnatales. Los estadios elegidos para el experimento fueron dos representativos que permitieran observar tanto defectos tempranos tras las primeras fases de neurogénesis, como a largo plazo, en período postnatal, siendo por tanto E15.5, por tratarse, además, del estadio donde tiene lugar la mayor presencia de procesos de apoptosis durante el desarrollo (Thomaidou et ál., 1997) y P7, ya en periodo postnatal donde la corteza está más formada y que coincide con la mayor presencia de apoptosis (periodo P4-P7) (Gohlke et ál., 2004). No obstante, es preciso considerar la diferencia entre la muerte celular que tiene lugar durante el desarroll, y la que tiene por objeto optimizar el número final de neuronas y las conexiones sinápticas, más restringida al periodo de sinaptogénesis, entre P0 y P14 en ratón (Blaschke et ál., 1998; Gohlke et ál., 2004). Tras realizar la técnica en secciones transversales de ejemplares E15.5, apreciamos un aumento significativo de células apoptóticas en la corteza de embriones carentes del receptor LPA1, especialmente en la ZSV, respecto a los de genotipo salvaje (Fig. 46 A, B). El porcentaje de núcleos apoptóticos en los embriones maLPA1-nulos fué prácticamente el doble respecto a los de genotipo normal (Fig, 46 E). Dadas las diferencias observadas y, por las alteraciones postnatales que se detectaron, se analizaron animales de edad P7 lo que, una vez más, vino a confirmar los mismos resultados, con aumento de apoptosis en la corteza de los ratones maLPA1-nulos (Fig. 46 C), respecto a los de genotipo normal (Fig. 46 D), y que, si bien afectaba a las diferentes capas corticales, se daba de manera más pronunciada en las más profundas, V y VI, como demostraba, igualmente, la cuantificación realizada (Fig. D, E). 128 128 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 Figura 46. Aumento de apoptosis en la corteza cerebral de ratones Málaga nulos para LPA1.(A, B , D, E) Fotografías representativas de criosecciones coronales de la corteza cerebral de embriones de edad E15.5 (A, B) y corteza, a nivel dorsomedial, de ratones adultos de edad P7 (D, E) de genotipo normal [maLpar1 (+/+)] (A, D), y de genotipo nulo [maLpar1 (–/–)] (B, E) mostrando núcleos apoptóticos detectados por fluorescencia usando el sistema DeadEndtm fluorometric TUNEL System. Zsv, zona subventricular. Barra de escala en (A-B), 150 µm; (D, E) 115 µm. (C, F) Cuantificación del porcentaje de núcleos apoptóticos detectados en las áreas corticales mencionadas. Aunque las diferencias entre cada genotipo para cada región fueron significativas, con aumento del número de células en apoptosis en ausencia del receptor LPA1la mayor presencia de apoptosis se presentó en E15.5 y en las capas profundas de la corteza en estadio postnatal. (n= 8*; P<0.005 en normal vs. nulo, P7 capas II/III, **; P<0.001 en normal vs. nulo, en E15.5 y P7 capas V/VI). 129 129 Análisis de la neurogénesis cortical en el desarrollo cerebral de ratones carentes del receptor de ácido lisofosfatídico LPA 1 4.4.3. Reducción neuronal en la corteza cerebral de ratones maLPA1-nulos Dadas las alteraciones de proliferación y diferenciación, la aparente reducción de interneuronas, y el aumento de muerte celular, era preciso verificar si el menor tamaño cerebral de la corteza de los ratones Málaga nulos para LPA1era debido a pérdida neuronal. Para ello decidimos cuantificar la densidad numérica de las neuronas (Nv), detectadas de acuerdo a la presencia del marcador neuronal NeuN (Mullen et ál., 1992), en la corteza motora primaria (Fig. 47 A, B, rectángulo negro) y en la corteza somatosensorial (Fig. 47 A, B, rectángulo blanco) de indivíduos adultos (12 semanas) utilizando el método disector óptico (West, 1993). La cuantificación se reailzó en los tres genotipos, para poder detectar mejor cualquier diferencia atribuible a la presencia/ausencia del receptor. La corteza motora primaria se caracteriza por presentar una capa V bien destacada, que contiene una densidad relativamente baja de las grandes neuronas piramidales, y una capa IV estrecha que contiene neuronas granulares dispersas, tal y como se puede observar en el ratón de genotipo normal (Fig.47 D). En ausencia del receptor LPA1la corteza cerebral era más delgada de lo normal pero las capas corticales se encontraban definidas aunque sus límites fueran menos precisos. El cálculo del número de neuronas por unidad volúmen (Nv) mostró que no había diferencias significativas entre los genotipos normal y nulo en las capas corticales I y IV (Tabla 3). Sin embargo, las capas II/III, V y VI del genotipo nulo presentaban una reducción significativa en el número de neuronas respecto al ratón normal, bien llamativa a nivel de las capas más profundas, Vy VI, y en consonancia con los datos que mostraban mayor proporción de muerte celular en dichas capas (Tabla 3). Además, las comparaciones post hoc permitieron detectar diferencias más sutiles, demostrando diferencias significativas entre los ratones Málaga heterocigotos y homocigotos nulos en la capa cortical V, y, en las capas II/III y VI entre los ratones heterocigotos y normales (Tabla 3). El análisis de la corteza somatosensorial (Fig. 47 E, F; Tabla 3) demostró, una vez más, la reducción muy significativa de neuronas en el genotipo nulo respecto al normal, muy drástico en las capas profundas, en este caso en la capa V, y, de manera similar a la corteza motora, en las capas II/III. En conjunto, los datos demostraron la necesidad del receptor LPA1para el correcto mantenimiento del número de neuronas corticales.