Estudio neuropatológico del hipocampo y giro parahipocampal en la enfermedad de Alzheimer: de modelos transgénicos a humanos
Abstract
La actual ausencia de tratamientos efectivos para la enfermedad de Alzheimer (AD) pone de manifiesto la necesidad urgente de caracterizar la evolución de la patología en muestras de pacientes para así entender mejor los mecanismos de la enfermedad y desarrollar buenos modelos animales con valor predictivo para la experimentación preclínica. En esta Tesis Doctoral, se han analizado mediante técnicas celulares y moleculares las principales características histopatológicas (placas amiloides, patología fosfo-tau, respuesta inflammatoria y pérdida neuronal) en el hipocampo y giro parahipocampal de muestras humanas post mortem desde estadios Braak II (asintomáticos) a Braak V-VI (dementes). En paralelo, se han analizado características patológicas similares en el modelo PS1M146L/APP751SL con objeto de comparar los resultados con los obtenidos he pacientes. Los resultados más relevantes son: 1) la patología fosfo-tau es mucho más prominente que la patología amiloide en los pacientes; además, la progresión de la patología amiloide muestra una gran variabilidad regional e inter-individual en pacientes con afectación del hipocampo sólo en etapas avanzadas. Los altos niveles de fosfo-tau en contraste con el bajo contenido de Aβ en la fracción soluble sugiere que son las formas solubles de fosfo-tau las responsables del proceso neurodegenerativo en humanos. 2) hay una limitada activación microglial junto con un proceso significativo de disfunción/degeneración de esta población celular en los pacientes en etapas avanzadas de la enfermedad, mientras que en modelos animales la microglía se activa y prolifera gradualmente durante la progresión de la enfermedad. Por tanto, el concepto clásico de la respuesta microglial citotóxica asociada con esta enfermedad en los pacientes debe ser reevaluado, un hecho que se ve reforzado por el fracaso de las estrategias terapéuticas anti-inflamatorias probadas hasta la fecha en pacientes. En este sentido, proponemos que la prevención de la disfunción/degeneración microglial podría ser una novedosa y potencial estrategia terapéutica. Por otra parte, y en contraste a la respuesta microglial atenuada, hay una patente hiperactivación de los astrocitos, células gliales además altamente resistentes a el proceso degenerativo; 3) existe una pérdida sustancial de interneuronas que expresan somatostatina y parvalbúmina en los pacientes de AD. Una pérdida similar ha sido documentada previamente por nuestro grupo en el hipocampo y corteza entorrinal del modelo APP/PS1, y ahora aquí hemos extendido estos resultados a la corteza perirrinal; 4) el humo del tabaco produjo un aumento significativo de las lesiones neuropatológicas asociadas con la enfermedad (carga amiloide, la fosforilación de tau y el proceso de neuroinflammatorio) en un modelo animal APP/PS1. Estos resultados indican que el humo del cigarrillo podría acelerar la progresión de la patología siendo un potencial factor de riesgo ambiental para esta enfermedad. En general, estos resultados muestran que los modelos que sobreexpresan APP y desarrollan placas amiloides no mimetizan los principales aspectos de la patología humana, especialmente la respuesta inflamatoria asociada con las células microgliales. Por tanto, sería necesario desarrollar nuevos modelos, o mejorar los ya existentes, mediante la disminución de la respuesta inmune innata para imitar así mejor lo observado en los pacientes.
Full text
Dpto. Biología Celular, Genética y Fisiología
Área de Biología Celular, Facultad de Ciencias
Universidad de Málaga
Tesis Doctoral
ESTUDIO NEUROPATOLÓGICO DEL HIPOCAMPO Y GIRO
PARAHIPOCAMPAL EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER: DE MODELOS
TRANSGÉNICOS A HUMANOS
Elisabeth Sánchez Mejías
Directoras:
Dra. Antonia Gutiérrez Pérez
Dra. Inés Moreno González
Málaga 2015
AUTOR: Elisabeth Sánchez Mejías
http://orc id.org/0000- 0001-6708- 6708
EDIT A: Publicac iones y Di vulg ación Científica. Un iversidad de Má laga
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obras deriv adas.
Esta Tesis Docto ral est á de positada en el Repositorio Institucional de la Universid ad de
Málaga (RI UMA): rium a.um a.es
Facult ad de C ienci as
Departam ento de Bio logía C elular, G enéti ca y Fisi ología
Ár ea de Biología Celular
Dra. Antonia G utiérrez Pérez
Dra. Dña. Ant onia Gut iérrez Pérez , Cate drática del De partamento d e Biología Cel ular,
Genética y Fisiología de l a Facultad de Ciencias de la Universi dad de Má laga,
Dra. Dña . Iné s More no Gonzá lez , Assistan t Professor a t Depa rtm ent o f Neur olog y o f t he
Un iversity of Texas Healt h Sc ienc e C en ter a t H ous ton (E EUU ),
INFORM A N
Que la Licencia da Dña . Elisabe th Sá nc he z Mejí a s ha realizad o bajo su dirección el trab ajo
experimental que ha llevado a l a redacción de la presen te memoria de T esis Doctoral ,
titulada “ Est udi o n eur opa t o ló gic o d el hi poc ampo y gi ro par ahi p ocamp al en l a enf erm edad
de Al zhei mer: de modelos transgén ic os a human os ” .
Y para q ue as í c ons te y s u rta los efect os opo rtunos, firman el pr ese nte docu men to e n
Málaga, a 6 de julio de 2015 .
Fdo.: Anton ia Gutiér rez Pér ez Fdo.: I nés Mo reno Go nzál ez
Campus Univers itario de Teatinos, s/n 29071 Málaga Tlf.: 952133344 [email protected]
Facult ad de C ienci as
Departam ento de Bio logía C elular, G enéti ca y Fisi ología
Á rea d e Biología Ce lular
Dr. D . José Bec err a Rati a , Catedrático de Biología Celular y Director del Departamento de
Biología Celular, G enética y Fisiología de la Facult ad de Ciencias de la U niversidad de Málag a,
INFORM A
Que la Licenciada Dña . Elisabeth Sánchez Mejías ha realizado el trabajo experimental que ha
llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis Do ctoral, en los laboratorios del Área
de Biología Celular del Departamen to de Biología Celular, Ge nética y Fisiol ogía de la Facul tad
de Ciencias de la Univers ida d de Málaga.
Y para que así conste y surta los efectos opor tunos, firmo el presente d ocumento en Málaga,
a 6 de jul io d e 2 015 .
Fdo.: José Becerra Ratia
Campus Univers itario de Teatinos, s/n 29071 Málaga Tlf.: 952131956
Proyec tos
E l presente trabajo de Tesis Doctor al se ha f inanci ado por lo s siguientes proyect os de
investigación :
Centro de Investigación B iomédica en Red en Enfermedades Neurodegene rativas (CIBERNED).
Programa 1 : Enfermedad de Al zheimer y otras de mencias degenera tiv as . Entidad fi nancier a:
Instituto de Salud C arlos III. M inisterio de Ciencia e Innovació n, Ref. gru po CB06/05/1116.
IP: Dra. Anto nia Guti érrez. D uración: 20 07 - 2015 (renovable).
Mecanismos de señalización d e la resp uesta inflamatoria en la enfermed ad de Al zh eimer: control
de la activación microgli al como estra tegia terapéuti ca neuroprotectora. Enti dad fina nciera:
Instituto de Salud C arlos III, Minister io de Ci encia e I nnovació n, Ref. P I09/09 9. IP: Dra.
Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010 - 201 2.
Oligómer os tóxicos del Abeta como a gentes causantes d e la disfunción d el citoesqueleto y lo s
procesos proteolíticos en la e nfermedad de Al zheimer: búsqueda de nu evas dianas
terapéu ticas . Entidad financier a: Insti tuto d e Salud Carlos III. Minist erio d e Economía y
C ompetitividad, Ref. PI12/01431. IP: Dra. Antonia Gu tiérrez Pérez. Duración: 20 13- 2015.
Activación glial en el proceso n euroinflamatorio: una potencial di ana ter apéutica para la
enfermedad de Alzh eimer. Subproyect o 02 del Pro yecto Colabo rativo Intramural. Entida d
financiera: Centro d e Investigación Bio médica en Red en E nfermedades Neuro degenerativas
(CIBER NED ). Proyecto In tramural Cola borativo . Ref. PI2010/08. IP Subproyecto 02 : Dra.
Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010 - 2013.
Propiedades emergent es de la relac ión neurona - glia que subyacen a neurodegenera ción y
demencia en la enfermedad d e Alzheimer. C entro de Inv estigación Biomédica en Red sobr e
Enfermedades Neurode generativas (CIB ERNED). Proyecto Intram ural Colaborativo . Entidad
financiera: Ref. 2013/01 . IP Subproyecto 05 : Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Dur ación: 2013-
2015.
Evaluación in vivo de un compuesto d e interés. Desa rrollo preclínico y estudio previo de entr ada a
fases clínicas de un nuevo fármaco (Pro yecto OTRI). Enti dad fi nanciera: Neuron Bioph arma,
Ref. Contrato OTRI 8.06/5.02.3621. IP: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010 - 2013.
Dñ a. Elisabeth S ánchez Mejía s , dura nte este ti empo h a disf rutado d e una beca de
Formación del Pro fesorado Universitari o (FPU) del Minist erio de Ed ucació n (c o nvocatoria 2008 ), y
un contrato d e Investi ga ción co n carg o a P royecto de In vestiga ción.
Agr adeci mien tos
Quiz ás l a t are a m ás co m pli cad a se a es cr ibi r y t r an smi ti r s in d atos cuant if i cabl es , ni m edi d as, n i
desviaciones, ni porcentajes, todo mi agradecimiento a las pers onas que han hec ho posibl e este trabajo. Porque no
es solo mío, sino vuest ro también.
Muchas gracias Antoni a (¡jefa!) por t odo lo que h as hecho por mí desde el pri mer día que pisé tu
despacho para pedirte conse jo. Desde entonces me has apoyado y motivado, me has prevenido y a la vez cuida do,
me has ay uda d o y me has guiado, como un a jefa y t am bién co mo una m ad re. P or que cada vez que me he veni do
abajo tú has sabido cómo impuls arme. Sin toda tu dedicación y confi anza no hubiera podido llegar hasta aquí .
E sta te sis es d e las dos.
A mi cod ir ector a , In és, mi com pañ era d e gru po y ami ga t ambién. Gracias por toda la dedicación que me
ofr ecis te co m o par te del gr upo y en los t res mes es de es t ancia, me col m ast e de ayu d a diar i ament e y m e gu ias te en
mis investigaciones.
A José Carl os, mi s egundo j efe, gr aci as p or t u cercan í a, tu n oblez a y tu s ga nas de ayud ar . Que subi era s por
esas esc aleras para f ormar par te d el grup o ha sid o una de las mejor es cos as que nos podí a pasar .
C omo no hay dos sin t res, a mi terce r jefe, Javier. M uc has gracias por haber hec ho posible este trabajo
compartiendo parte de v uestro e sfue rzo co n noso tro s, y porqu e l as la rga s c harl as sobr e “¿qu é le pas a a la
micr oglí a?” han sup uest o un alici ente extra. Mi s a grad ecimi entos se ext ienden a tod o el eq uipo de la Uni versid ad
de Sevilla que ha trab ajado para co mpl etar y fort ale cer l os resulta dos d e esta Tesi s.
Al di rect or d el dep artame nto de Bi ologí a Celular , el Dr . Jos é Bece rra, po r perm itirme rea lizar e l trabajo de
inves tigaci ón en l as in stalac iones del depart ament o y por apoyar s iempr e a todos l os que le solicitamos. Grac ias
por su c ompleta dis ponibilidad.
Much as gra cias tamb i én a t odos lo s compañ eros d el depar tament o de Bi olo gí a Celul ar, pr ofes ores y
bec ario s, por pres tarme vue str a ayuda c uando l a he req ueri do. ¡Gra cias An a! Por t u paci en cia c ad a vez q ue nos
metemo s en l íos de p apel eo, sie mpre e stás d ispuesta a soc orrern os. No me olvido de Pedro, al otro lado del
pasillo, que nos acomp aña en n uest ros in stantes de so sie go; ni de Kirill, que nos contenta c on sus tartas y dulces
rusos.
L legó el moment o más des eado, el que im aginaba a l o lejo s cas i a diari o cu ando e ntre r is as y r eflexion es
nos reuníamos en corri llo t odas las “niñas” y “ niños ” de l a sal a de be cari os , en un intento d e adivinar qué
posición nos ganaríamos en los t an esperados agrade cimientos. Y porque sois mi familia, os ag rad ezco: a L aura,
mi com p añera a pie d e guer ra, mi amiga , graci as p or estar si empr e dis puest a a ayu d arme, por tu pacien cia inf in ita
y por no haber te esc uch ado jam ás un a mala contes taci ó n; a R aquel, mi co mpañer a, mi h erman a, por qu e si hubi ese
tenido una her mana, habr ía quer ido que f uera co m o tú , no exi sten let ras capa ces de d ar f orm a a todo lo que tengo
que agr adecer te ; a Van essa, mi co mpañ era, mi p rin ces a, la qu e me ll ena de ab razos y bes itos cuando m ás lo
ne c esito; a Rub é n, mi com pañe ro, nuestr o protector of icial, porque aunque t e llamemos “protestón” , tú siempre
nos cuidas y nos mimas; a Juanjo, mi compañero, mi acompañante cuando me quedo sola en el hospital, y porque
t u s onris a es imbo rr able; a Merc edes, mi co mp añera, mi paño de lágrimas , la que te hace cambiar la decepción por
l a i l usi ón, mu chas graci a s por tantos inst antes inolvidables ; a Án g ela, mi com pañ era, mi ases ora y l a más boni ta,
g r a ci as por ha cerme s entir que pu ed o c ont ar siemp r e cont igo, q ué su erte h aber te enc ontr ado ; a Cr isti na, mi
compañ era y mi ayudante, la que me ofrece una mano incondi c ional en e l laborat orio, ¡gracias!; a Alejandra, mi
compañ era, mi consejer a, m uchas graci as por preo cupa rte d e mí y por dem ost rarm e que un a ami ga no es la que
dice s ino l a que h ace. Jose, mi amigo, mu chas gr aci as p or t ransm itir me tu al egría y tu posit ividad, y por hac erme l a
vida más f ácil, solo qui ero r odearm e de g ente como tú , te e c ho mucho de menos. Tr a bajar con t odos vosotros ha
supuesto que la faena se con vierta en descanso y que los días duros pasen d e l argo, ¡gr acias f amilia!
P or supuesto a todos l os qu e pasaron por esta sala, mis antiguos compañeros de gr upo Dav id, Juan Félix ,
Inés, gracias por enseñarm e a investigar y por todo vues tro tiempo y paci encia en l os torpes comienzos. A D i ana,
Mariló, Julia y Lu is, graci as po r adopt arm e como un a m ás, por vues tros consejo s y po r tod as las car cajadas en tre
experimento y pasillo.
A tod os mis amigos , muchas gr aci as por apoyarme, comprenderm e y compartir conmigo momentos
inol vidabl es. E specialm ent e, quier o agrad ecer te Silvia t u amistad incondicion al , tus cuidados, tus ánimos
constantes, sin l os que no p odr ía hab er ll egado h ast a aq uí.
Fin alment e, mi más sincer o agr adecimi ento , a toda mi familia. A mi yaya, mi yayo, mi m adrina, m i
ahijada, a Pili, Juan, Antonio, T rini, Laura, Daniel y Ana, por animar me a con tinuar estu di ando y por estar
siempre ahí cuando os he n ecesit a do. Gracias mamá po r tu continuo apoyo y ayuda , por tus buenos cons ejos, p or
transm itirm e g ran des va lores, por c onf iar y c reer en m í siemp re y sobre todo, por no dej a rme nu nca tirar la to alla,
solo quiero q ue estés or gullosa de mi. ¡Graci as mam á!
A mi fa milia
A mi madre
Abreviaturas
A β : β‐ amiloide
AAC : Angiopatía Amiloide Cerebral
AD: Enfermedad de Alzheimer, del inglés
Alzheimer’s Disease
ADAM : del inglés, A Disintegrin And
Metalloprotease
ADDLs : Ligandos difusibles derivados del β‐
amiloide, del inglés, Amyloid beta Derived
Diffusible Ligands
ADEVA : Análisis de la varianza
AICD : Dominio intracelular del APP, del inglés,
APP IntraCellular Domain
AMPA : α‐ amino ‐ 3 ‐ hidroxi ‐ 5 ‐ metilisoazol ‐ 4 ‐
propionato
ANOVA : Analysis of Variance
APLP : del inglés amyloid precursor ‐ like
proteína
ApoE : Apolipoproteína E
APP : Proteína precursora β‐ amiloide
BACE : Enzima de corte del APP en el sitio β
CA : Asta de Ammón
CaBP : Proteína ligadora de calcio
CB : Calbindina
CCK : Colecistoquinina
Cdk : Proteín quinasa dependiente de ciclina
CDR : del inglés clinical dementia rating
CE : Corteza entorrinal
ChaT : Colín acetil transferasa
CLU : Clusterina
CP: Corteza Perirrinal
CPH : Corteza ParaHipocampal
CR : Calretinina
CTF : Fragmento C ‐ terminal
DAB : 3 ‐ 3’ ‐ diaminobencidina
tetrahidroclorídrico
DABCO : 1,4 ‐ diazabiciclo [2.2.2.] ‐ octano
DEPC : Dietil pirocarbonato
DMEM ‐ F12 :
DN : Densidad numérica
DPX : Dibutil ftalato
EA : Enfermedad de Alzheimer
EAE : encefalomielitis autoinmune
ECE: Enzima convertidora de endotelina
EDTA: Ácido etilendiamino tetraacético
FAD : Enferm edad de Alzheimer Familiar, del
inglés Familial Alzheimer’s Disease
FADD : Dominio de muerte asociado a Fas
FAIM L : Molécula inhibidora de la apoptosis
mediada por Fas en su forma larga
FASL : Ligando de Fas
fMRI : Neuroimagen de resonancia magnética
funcional
FS : del inglés, fast spiking
GABA : Ácido gamma amino butírico
GAPDH : del inglés glyceraldehyde ‐ 3 ‐
phosphate dehydrogenase
GD : Giro dentado
GFAP : Proteína glial fibrilar ácida, del inglés,
Glial Fibrillar Acidic Protein
GPH : Giro ParaHipocampal.
GSD : del inglés, G lobal Scale Deterioration
GSK3 ‐β : Quinasa glucógeno sintasa 3
GWAS: del inglés, Genome Wide Association
Studies
HIF1a: Factor 1 inducible por hipoxia , del
inglés, Hypoxia Inducible Factor
HIPP: del inglés, H ilar Interneurons with axons
innervating the terminal zone of the Perforant
Pathway
HLA: Antígeno lecucocitario humano, del
inglés Human Leucocyte Antigen
HMG ‐ CoA: Hidroxi ‐ Metil Glutaril CoEnzima A
Iba1 : del inglés Ionized calcium Binding
Adapter molecule 1
IDE : Enzima degradante de insulina, del inglés,
Insulin ‐ Degrading Enzyme
IFN ‐γ : Interferón gamma
IGF ‐ 1 : Factor de crecimiento insulinotrópico,
del inglés, Insuline Growth Factor
IL : Interleuquina
Abreviaturas
iNOS : Enzima sintasa de óxido nítrico
inducible
KI : Knock ‐ in
KO : Knock ‐ out
LCR: Líquido cefalorraquídeo
LDL: Lipoproteína de baja densidad (del inglés
Low density Lipoprotein )
LDLR : Receptor de lipoproteínas de baja
densidad
LEnt : Corteza entorrinal lateral
LPS : Lipopolisacáridos
LTD : Depresión a largo plazo
LTP : Potenciación a largo plazo, del inglés,
Long Term Potentiation
M1 : Microglía clásica
M2 : Microglía alternativa
MAP : Proteína asociada a microtúbulos
MCI: deterioro cognitive leve , del inglés Mild
Cognitive Impairment
MHC : Complejo mayor de histocompatibilidad
MMSE : Mini examen del estado mental
MRC ‐ 1: Receptor de manosa, del inglés,
Mannose Receptor ‐ 1
MRI : Neuroimagen de resonancia magnética,
del inglés, Magnetic Resonance Imaging
MSR : del inglés macrophage scavenger
receptor
NADPH : Nicotiamida ‐ adenina dinucleótido
fosfato
NeuN : Núcleos neuronales
NF : Neurofilamento
NFTs : Ovillos neurofibrilares, del inglés,
Neurofibrillary tangles
NMDA : Ácido N ‐ metil ‐ D ‐ aspártico
NO : Óxido nítrico
NOS : Especies reactivas de nitrógeno
iNOS : Sintasa del óxido nítrico inducible
nNOS : Sintasa del óxido nítrico neuronal
NPY : Neuropéptido Y
NTs: Hebras neuropílicas, del inglés, neuropil
threads
PaS : parasubículo
PB : Tampón fosfato
PBS : Tampón fosfato salino
PCR : Reacción de la polimerasa en cadena
PET : Tomografía de emisión de positrones
PHF : Filamentos apareados helicoidales
PI3K : Fosfoinositol 3 quinasa
PICALM: del inglés, Phospatidyl Inositol ‐
binding Clathrin Assembly protein
PLP : Paraformaldehído, L ‐ lisina, Meta ‐
peryodato sódico
PaS: parasubículo
PrS: presubículo
PrP: Proteína Priónica
PS1 : Presenilina 1
PS2 : Presenilina 2
PV : Parvalbúmina
RAGE : del inglés, Receptor for Advanced
Glycation Endproducts
ROS : Especies reactivas de oxígeno
RT ‐ PCR : Reacción de la polimerasa en cadena
a tiempo real
S: subículo
S1: fracción de proteínas soluble aislada
bioquímicamente
sAPP : Fracción APP alfa soluble
sAPP β : Fracción APP beta soluble
SD: desviación estándar
SIRP β 1: del inglés, Signal Regulatory Protein
β 1
sl: stratum lucidum
slm: Stratum lacunosum ‐ moleculare
SNAREs: del inglés, Soluble NSF Attachment
protein REceptors
SNC : Sistema nervioso central
SNP : Sistema nervioso periférico
SOD : Superóxido dismutasa
SOM : Somatostatina
Abreviaturas
TBE : Tampón tris, ácido bórico, EDTA
Tc : Linfocito T citotóxico
TCR : Receptores de células T
Te v : Corteza temporal ventral
TGF : Factor de crecimiento transformante
Th : Linfocito T helper
Th1 : Linfocito T helper pro ‐ inflamatorio
Th2 : Linfocito T helper anti ‐ inflamatorio
TioS : Tioflavina S
TLRs : del inglés, T oll Like Receptor
TNF ‐α : Factor de necrosis tumoral alfa
TNFR : Receptor del factor de necrosis tumoral
TPBS: Tampón fosfato salino
TRAIL : Ligando inductor de la apoptosis
relacionado con TNF
TREM2: del inglés, Triggering Receptor
Expressed on Myeloid cells 2
UPR : Respuesta a proteínas mal plegadas (del
inglés, Unfolding Protein Response )
VGAT : Transportador vesicular GABA
VGluT : Transportador vesicular de glutamato
VIP : Polipéptido intestinal vasoactivo
WB : western blot
WT : Genotipo salvaje, del inglés, W ild Type
Índice
Índice
Índice
Índice
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 3
1.1.1.Tipos de Alzheimer 4
1.1.2.Factores de riesgo 4
1.1.3.Neuropatología 6
1.2. PROTEÍNA TAU HIPERFOSFORILADA 12
1.3. PÉPTIDO β‐ AMILOIDE 13
1.3.1. La proteína precursora amiloide (APP) 13
1.3.2. Presenilina 1 y Presenilina 2 14
1.3.3. Generación, eliminación y agregación del β‐ amiloide 15
1.3.4. La hipótesis clásica de la cascada amiloide y nuevas
posturas 19
1.4. NEURODEGENERACIÓN:
PATOLOGÍA NEURÍTICA, PÉRDIDA NEURONAL Y SINÁPTICA 20
1.4.1. Patología neurítica 20
1.4.2. Pérdida neuronal y sináptica 21
1.5. RESPUESTA NEUROINFLAMATORIA 22
1.5.1 Microglía 23
1.5.2. Células mieloides del sistema inmune cerebral 26
1.5.3. Astroglía 27
1.6. MODELOS TRANSGÉNICOS MURINOS DE LA ENFERMEDAD DE
ALZHEIMER 28
1.6.1. Modelos monogénicos 29
1.6.2. Animales bigénicos y trigénicos 29
1.7. FORMACIÓN HIPOCAMPAL 33
1.7.1. Conexiones del hipocampo 34
1.8. GIRO PARAHIPOCAMPAL 36
1.8.1. Corteza perirrinal 36
Índice
1.9. PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO Y OBJETIVOS 39
2. MATERIALES Y MÉTODOS 43
2.1. SUJETOS DE ESTUDIO 45
2.1.1. Muestras humanas post mortem 45
2.1.2. Animales de experimentación 45
2.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y DELIMITACIÓN DE LAS ÁREAS
CEREBRALES
48
2.2.1. Procesamiento de los cerebros de ratón 48
2.2.2. Delimitación y situación de las regiones cerebrales de ratón 49
2.2.3. Procesamiento de las muestras humanas 49
2.2.4.Delimitación y situación de las regiones cerebrales de las
muestras humanas
51
2.3. TINCIONES HISTOLÓGICAS 51
2.3.1. Violeta de cresilo 51
2.3.2. Tioflavina 6 6S 53
2.4. TINCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA 53
2.4.1. Procedimiento general para microscopía óptica de campo claro 53
2.4.2.Procedimiento general para microscopía convencional de
fluorescencia y microscopía láser confocal
57
2.4.3. Controles de la técnica inmunohistoquímica 59
2.5. OBTENCIÓN DE IMÁGENES MICROSCÓPICAS 59
2.6. TÉCNICAS ESTEREOLÓGICAS DE RECUENTO CELULAR:
DENSIDAD NUMÉRICA
60
2.7. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE IMAGEN PARA LA CARGA AMILOIDE Y LA
CARGA GLIAL
62
2.8. ANÁLISIS DE LA COMPACTACIÓN DE LAS PLACAS DE A β 63
2.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 64
Índice
2.10. APÉNDICE 64
MATERIALES Y MÉTODOS SUPLEMENTARIOS
2.11. ESTUDIOS BIOQUÍMICOS 6
7
2.11.1. Aislamiento de ARN y proteínas a partir de muestras de
cerebro
67
2.11.2. Comprobación de la integridad del ARN purificado 69
2.11.3 Aislamiento de proteínas totales 69
2.11.4. Retrotranscripción 70
2.11.5. RT ‐ PCR en tiempo real 71
2.11.6. Western ‐ Blot 74
2.11.7. Aislamiento de proteínas solubles (S1) 76
2.12. ESTUDIOS IN VITRO 7
7
2.12.1. Cultivos de líneas celulares 77
2.12.2. Cultivos celulares primario 77
2.12.3. Tratamiento de Estimulación de cultivos celulares con fracción
S1 de humanos
78
2.12.4. Determinación de la toxicidad de las fracciones solubles S1 de
hipocampo humano y modelos APP/PS1 mediante citometría de flujo
79
2.12.5. Determinación de la toxicidad de las fracciones solubles S1 de
hipocampo de ratón APP/PS1 sobre cultivos neuronales primarios
79
2.13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 79
3. RESULTADOS 81
3.1. PROGRESIÓN DE LA PATOLOGÍA NEUROFIBRILAR EN EL HIPOCAMPO Y
GIRO PARAHIPOCAMPAL DE MUESTRAS HUMANAS
87
3.2. PROGRESIÓN DE LA PATOLOGÍA AMILOIDE EN EL HIPOCAMPO Y GIRO
PARAHIPOCAMPAL DE MUESTRAS HUMANAS
108
3.2.1. Patrón de distribución espacio temporal de la patología
amiloide
108
3.2.2.Caracterización de las placas amiloides y la degeneración 119
Índice
neurítica asociada
3.2.3. Angiopatía cerebral amiloide asociada a la enfermedad de
Alzheimer
137
3.3. REACTIVIDAD GLIAL EN EL HIPOCAMPO Y GIRO PARAHIPOCAMPAL DE
MUESTRAS HUMANAS Y PROGRESIÓN DE LA PATOLOGÍA DEL ALZHEIMER
141
3.3.1. Limitada activación microglial asociada a las placas de A β en
los pacientes de Alzheimer
141
3.3.2. Estrecha interacción de la microglía activada con los depósitos
de A β indicando un posible papel fagocítico y/o en la
formación/compactación de las placas
149
3.3.3. Escasa infiltración de macrófagos y linfocitos en los pacientes
de Alzheimer
156
3.3.4. Degeneración microglial en el hipocampo y giro dentado de los
pacientes de Alzheimer (Braak V ‐ VI)
166
3.3.5. Las fracciones solubles de hipocampo de pacientes de
Alzheimer, y no de modelos APP/PS1, son tóxicas para la microglía in
vitro
191
3.3.6.Reactividad astroglial asociada al AB en el hipocampo giro
parahipocampal de los pacientes de Alzheimer
192
3.4. NEURODEGENERACIÓN EN EL HIPOCAMPO Y GIRO PARAHIPOCAMPAL
DE MUESTRAS HUMANAS Y DEL MODELO MURINO APP/PS1
207
3.4.1. Degeneración de interneuronas SOM y PV en el hipocampo y
corteza perirrinal de los individuos dementes Braak V ‐ VI
207
3.4.2. Diferente vulnerabilidad al proceso degenerativo de las
poblaciones de interneuronas SOM y PV en la corteza perirrinal del
modelo transgénico APP/PS1
214
3.5. EFECTO DE LA INHALACIÓN DEL HUMO DEL TABACO SOBRE LAS
ALTERACIONES NEUROPATOLÓGICAS QUE PRESENTA EL MODELO
TRANSGÉNICO DE ALZHEIMER APPSWE/PS1DE9
233
Smoking Exacerbates Amyloid Pathology in a Mouse Model of
Alzheimer’s Disease
234
Índice
4. DISCUSIÓN 253
Limitaciones del estudio 258
4.1. LA PATOLOGÍA ASOCIADA A FOSFO ‐ TAU ES MÁS PROMINENTE QUE LA
PATOLOGÍA A β EN EL HIPOCAMPO Y GIRO PARAHIPOCAMPAL HUMANO 259
4.1.1. Las lesiones neurofibrilares asociadas a fosfo ‐ tau progresan
según el patrón espacio ‐ temporal topográfico característico de los
estadios de Braak
4.1.2. Los pacientes de Alzheimer acumulan formas solubles de tau
hiperfosforilado
260
4.1.3. La progresión de la patología amiloide muestra una gran
variabilidad regional e interindividual en los pacientes, con afectación
del hipocampo solo en las fases más avanzadas de la enfermedad
262
4.1.4. El hipocampo de los pacientes de Alzheimer desarrolla placas
neuríticas
263
4.1.5. El giro hipocampal de los pacientes presenta una variedad de
depósitos amiloides
265
4.1.6. Las placas amiloides podrían ser una fuente de A β oligomérico
soluble
266
4.1.7. Los enfermos de Alzheimer desarrollan una extensa patología
amiloide asociada a los vasos sanguíneos
268
4.2. DISFUNCIÓN DE LA HOMEOSTASIS GLIAL EN LAS MUESTRAS HUMANAS
CON PATOLOGÍA TIPO ALZHEIMER 269
4.2.1. Existe una limitada activación microglial en los pacientes2
contraposición a la extensa reactividad microglial de los modelos
transgénicos de amiloidosis
270
4.2.2. Posible papel de la microglía actividad en la dinámica de
formación/compactación y/o eliminación de los depósitos fibrilares
272
4.2.3. Las células microgliales activadas no tienen un origen periférico 274
4.2.4. Existe un marcado proceso degenerativo de la microglía en
pacientes, mientras que en modelos animales la microglía se activa y
prolifera con el avance de la patología
275
4.2.5. Existe una marcada reactividad astroglial asociada al A β en el
hipocampo y giro hipocampal de los pacientes de Alzheimer
282
Índice
4.3. EL PROCESO NEURODEGENERATIVO AFECTA SEVERAMENTE A LAS
INTERNEURONAS SOM Y PV EN LOS PACIENTES, MIENTRAS QUE EN EL
MODELO APP/PS1 MUESTRAN UNA VULNERABILIDAD DIFERENCIAL 285
4.3.1. Las interneuronas SOM se encuentran gravemente afectadas en
los pacientes Braak V ‐ VI así como en el modelo transgénico APP/PS1
285
4.3.2. Las interneuronas PV son muy sensibles al proceso degenerativo
en pacientes, mientras que en los ratones APP/PS1 esta población
GABAérgica es resistente al proceso de la patología
291
5. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS 295
6. SUMMARY 301
7. BIBLIOGRAFÍA 325
8. ANEXO 349
Índi ce de Fig uras y Tabl as
1. INTRODUCCIÓ N
Fi gura 1 .1 . Dibujo es quemático compa rativo de un cer ebr o humano sano y
otr o de u n p ac ient e de Alz hei mer
7
Figura 1.2 . Estadios de Braak I - VI
8
Figura 1.3. Di fer ent es t ipo s de p l acas se niles que desarr ollan los paciente s
de Alz hei mer 10
Figura 1 .4. La acu mulación de agregados de Abe ta y fo sfo - tau si gue un
patrón top ogr áfico det ermin a do 11
Figura 1.5. O villos n eurofibril ares int racelular es en una sec ci ó n d e cereb ro
de un pac iente de A lzhe imer Braak V - VI 12
Figura 1.6 . Repr ese ntaci ón esquemát ica de la pr oteí na APP
14
Figura 1. 7. Esquema de las vías de procesamiento post - tradu cciona l del
APP 1
6
Figura 1.8 . Hipót esis de la cas cada amiloide
19
Figura 1. 9 . Diferente s fenot ipos de act ivación de la microgl í a
24
Figura 1. 10. Célu la s m ielo i des d el Si stema Ner vio so Cent ral y su s
marca do re s esp ecí ficos en est a do qu iescen te y a cti vado 26
Figura 1.1 1. Esque ma de las c onexio nes del circu ito tr isináp tico
35
Tabla 1.1. Modelos mur inos trans géni cos para el es tudio de la e nferme dad
de Alz hei mer 31
2. MATE RI AL E S Y MÉT ODO S
Figura 2.1. Esquema de las muta cione s que conti ene la s ec uenc ia
amin o acíd ica de la pr oteína APP751 h umana en lo s rat ones trans génico s
APP/PS1 47
Figura 2.2. Delimita ción d e la corteza p erirrinal y del hipoca mpo en los
rat ones e mpl ead os en el p res ent e estu di o 50
Figura 2.3. D elimitaci ón y situ ación del lóbu lo tem poral me dial que
contien e la formaci ón hip ocampa l y la regió n para hipo campal d e las
mue str as humanas empl eadas e n este estudi o 52
Figura 2 .4. Repr esen tación d e la t écnica ester eológica d el dise ctor óp tico
con la q ue se ll evó a ca bo el a nálisis de la den s idad numé rica de difere ntes
tipos celula res 61
Figura 2. 5 . Proceso de binarización con e l program a de anális is de im agen
Visilog 6.3. 62
Figura 2. 6. An áli sis en cu adrícu la de la d istribuci ón diferencia l de las célula s
Iba1 - posi tivas en el g iro de ntado 63
Figura 2. 7 . Cuantifica ci ón de la compactación de las placas
63
Índi ce de Fig uras y Tabl as
Tabla 2.1. R elación de l os casos humanos analizados en el presente
est udio, y los datos asoci ados de edad, sexo, tiempo post mor tem ,
clasificaci ó n de Braak, s ínto mas cl ínicos de de mencia y causa de la mue rte 45
Tabla 2.2. Marcadores analizados en los estudios i nmunohist oquím icos y
sus caract erística s 54
Tabla 2.3. Relación de anticuerpos primarios empleados para los est udios
inmunohi st oquími cos d e microscopía ó ptica 55
Tabla 2.4. An ticu erpos secund arios utiliz ados en lo s est ud io s
inmuno histoq uímico s de microscop ía óp tica d e campo clar o 57
Tabla 2.5. Relac ión de an ticu erpos secundar ios u tilizad os en los e studio s
inmuno histoq uímico s de microscop ía d e fluo re scen cia 58
Tabl a 2. 6. Pa sos para la purificación de l ARN usando el sistema ABI Pri sm
6100 Nuc leic Acid PrepStation 68
Tabl a 2. 7. R eactivos utilizados para la preparac ión de la mezcla de reacc ión
2X (Retromix) 70
Tabl a 2. 8. R elación de lo s re ac t ivo s empl e ados para la a mplifica ción p or
PCR a t iemp o r eal emp l ean do SYBR - gr een I
71
Tabl a 2. 9. Relació n de lo s re activos e mplead os p ara la a mp lificació n po r
PCR a t iempo real empleando sondas Taqman
72
Tabl a 2. 10 . P ro gra ma p red et ermin ad o d e a mpl ifi caci ón para PCR a tiempo
real
72
Tabl a 2. 11 . Sec uenci a de cebado res empl eados en la PC R
73
Tabl a 2. 12 . Sondas Taqman para PCR
73
Tabl a 2. 13 . R elac ión de r ea ct ivos y vo l úmen es n ec esa ri os pa ra o bt ener
geles de pol iacrila mida - S DS (1 4% d e acrila mida ) en tampón Tricina
75
Tabl a 2. 14 . R elac ión de r ea ct ivos y vo l úmen es n ec esa ri os pa ra o bt ener
geles de pol iacrila mida - S DS (10% de a crila mida) en ta mpón Glicina
75
Tabl a 2. 15 . Mar cadores detectados me diante Weste rn - Blot
76
3. RESULTADOS
Figura 3. 1.1 . Progre sión de la p atologí a neuro fibrilar en las muestra s
humanas cl asificadas según los es tadios de Braak 89
Figura 3. 1.2 . Afectació n de la pato logía n eurofibrila r en el giro den tado de
indiv iduos en es tadios tempr anos de l a enf erme dad de A lzheime r 9
1
Figura 3. 1.3 . Afectació n de la pato logía n eurofibrila r en el giro den tado de
indiv iduos en es tadios av anzados de l a enf erme dad de Alzheime r 93
Figura 3.1 . 4. Variabilid ad en el grad o de afectació n de la pa tología d e t au
en indi vi duos de un mism o estadio B raak 94
Figu r a 3.1 .5 . C ambi os neuro fib rilares en las regio nes CA1/ CA2 dura n t e el
cur so d e la en f erm edad de A lzh eimer 95
Figura 3 .1.6 . El su bíc ulo se en cu en tra grav em ente a fectad o p or l a
progresión d e la pat ología n eu rofibrila r 97
Figura 3.1. 7. Progresión de los cambio s neu rofibrila res en el giro
99
Índi ce de Fig uras y Tabl as
parahipoc ampal de mue str as humanas en las etapas iniciales de la
enfer meda d
Figura 3.1. 8 . Progresión de los cambio s neu rofibrila res en el giro
parahipoc ampal de mues tras hum anas en estadios avanzados de la
enfer meda d 100
Figura 3. 1. 9. A T8 reconoc e una mayor cantidad de fosfo - tau acumulado en
el hipocam po de muestras humanas en comparación con AT 100 103
Figura 3 .1. 10 . AT 8 reconoce una mayor cantidad de fosf o - tau acumul ado
en e l gir o parahipoc ampal de mue str as humanas en c
omparación c on
AT10 0 104
Figura 3.1. 11 . Inmuno histoq u ímica para AT100 en e l gir o dentado , CA1 y
giro parahipocam pal de p acie n tes con la en fer meda d d e Al zhei mer (Braa k
V- VI ) 105
Figura 3. 2. 1. Patr ón de dis tribució n espa cial de A β oligo mérico, m edian te
inmunot inción c on OC, e n el hi pocam po y giro pa rahi pocam pal de
mues tras humanas e n estadi o Braak II 112
Figura 3.2 . 2. Patr ón de dis tribución e spac ial de A β oli gomérico , media nte
inmunot inción c on OC, e n el hi pocam po y giro pa rahi pocam pal de
muest ra s h u manas e n estadio Braak III - IV 113
Figura 3. 2 .3. Patr ón de dis tribución e spac ial de A β oligo mérico, media nte
inmunot inción c on OC, e n el hi pocam po y giro pa rahi pocam pal de
paciente s Braak V - VI 114
Figura 3.2. 4. El anticuer po OC reconoc e una mayor cantidad de de pósi tos
de A β en co mparació n con el an ticuerpo 4G8 115
Figura 3. 2.5 . Los anim ales trans génic os APP/PS 1 presentan una mayor
acumula ción extrac elular de A β
con la edad, en comparación con los
pac ient es de A lz heim er 116
Figura 3. 2. 6. La a fectació n de la p atologí a ami loi de en el gi ro
parahipoc ampal prese nta una gran v aria bilidad entr e indivi duos con el
mismo es tadio Braak 118
Figura 3. 2. 7. La acu mulació n extracelul ar de A β en el hipocampo s igue un
patrón espac io - temporal a lo lar go de los estadios de B raak 120
Figura 3. 2 .8. La a cumulació n extracelula r de A β en el hipocam po humano
pres enta una distribuc ión laminar , al ig ual que ocurre e n el hipo camp o d e
model os APP/PS1 121
Figura 3.2 . 9. Estudio inm unohis toquím ico de las placas se niles que se
encue ntran en la ca pa mo lecu l ar d el GD d e pa cient es d e A lzh eimer 122
Figura 3 .2.1 0 . Estudio i nmunohistoquím ico de las pl acas seni les que se
encuentra n en la ca pa p olimórfica (hi lio) del GD de paci entes de Alzh eim er 1 25
Figura 3. 2. 11 . Acumulació n diferencia l de A β en l as regio ne s del
hipocam po propio (CA ) de pac ientes dement es Bra ak V - VI 1 26
Figura 3. 2 .1 2. Estudio inm unohistoquí mico de los dife rentes tipos de
1 27
Índi ce de Fig uras y Tabl as
placas se niles que se encuentr an en la r egión C A1 de l hipocam po de
individuos Braak V - VI
Figura 3. 2.13 . Análisis comparativo de la ac umulación de A β con el
anticu erpo OC en la s diferentes re gione s del giro pa rahip ocampa l
(pres ubículo, corteza e ntorrinal, y corteza perirrinal ) de p acien te s en
est adios Braak II - III 128
Figura 3. 2.14 . Aná lisis comp arati vo de la acumu la ción d e A β con el
anticue rpo OC
en las dif erentes region es del g iro p arahip ocampa l
( pres ubículo, corteza entorrinal y corteza perir rinal) d e pacien tes con la
enfer meda d d e Alz hei mer 129
Figura 3 .2.1 5 . El giro parahip ocampal de pacientes con Alzheime r (Braak V -
VI) presenta una gran v aria bilidad en la p roporció n de p lacas neuríticas 130
Figura 3.2 .16 . Estudio inm unohist oquímic o comparativ o de los diferentes
tipos de plac a s se niles que se encue ntran e n la co rte za del giro
parahipocampal de pacientes deme ntes Braak V - VI 1 32
Figura 3.2 .1 7. Aná lisis co mparat ivo de los tipo s de d epó sito s amiloid es que
se encuentran e n dife rentes regiones del hipoc ampo y gir o parahipocam pal
de un caso B raak V - VI con mo derad a pato logía n eurítica 1 33
Figura 3.2 .1 8. An ál isi s co mpa ra tivo d e lo s tip o s d e de pó si t os amiloid es que
se encuentran e n dife rentes regiones del hipoc ampo y gir o parahipocam pal
de un caso B raak V - VI c on abundante pat ología ne urític a 1 34
Figura 3 .2.1 9 . A difer en cia d e lo q ue o cur r e en el mo delo tra nsg én ico
APP/PS1, el grad o de compa cta ción d e l os d epó sit os d e A β d e los pacient es
de Al zheimer no cambi a con la progre sió n de la enfe rmedad 1 35
Figura 3. 2. 20 . La corteza perirrinal de los pac ientes dementes Braak V - VI
pres enta una mayor deposic ión amiloi de extracelular 1 36
Figura 3.2 . 21. Estu dio co m parativ o de los diferente s tipos de placas seniles
entr e ratones tr ansgénicos APP/PS1 y paciente s Braak V - VI medi ant e doble
marca je flu ore sc ent e para OC y A β fibrilar ( T io S) e in mu notin ción p ara
A β 42 1 38
Figura 3. 2. 22 . El hipocampo y giro parahipocampal de l a mayoría de l a s
mues tras humanas Braak IV - V I desarrol lan una seve ra angiopatía cerebral
amiloide 1 39
Figura 3.2 .23 . Placa s neurítica s clási cas a sociada s a los vaso s sanguín eos
1 40
Figura 3. 3.1. Patr ón de dis tribución de las células micro gl iales e n el GD,
CA1 y GP H a lo largo de los estadios de Braak 143
Fi gura 3. 3 .2 . Estudi o mor foló gico de lo s dif erente s fenot ip os mi croglial es
(es tado quie scente y est ado activ ado), hall ados e n las m uestr as humanas
analizadas 1 45
Figura 3. 3 .3. L as agrupaciones de células mi croglial es acti vad as asociada s a
las placas son positivas para el m arcador CD68 1 47
Figura 3. 3 .4. Las ag rupacione s de cé lulas microgliales activadas asociadas a
148
Índi ce de Fig uras y Tabl as
las placas d e la región hip ocampal CA1 son p ositiva s para e l marcado r CD68
Fig ura 3. 3.5. Iba 1 y CD68 se sob reexpre san en la microg lía rea ctiva
1 51
Fi gura 3. 3.6. La s célula s micro gliale s reactiva s que se encue ntra n asociad as
a las plac as presentan A β en su inte rior , indicando una po si ble acti vi dad
fagocítica 1 53
Fi gura 3. 3.7. La interacc ión d e la microglía react iva co n los d epósito s de A β
sugiere un posible p apel de e stas célu las en la for mación /comp actació n de
las placas am iloid es 1 54
Figura 3. 3 .8. Relación de la mi croglía react iva con las placa s amiloi des
155
Figura 3. 3.9. Asociació n micr oglía /placa en mu estras humanas en est adio
Braak IV - VI y en el mod elo AP P/PS1 1 57
Fi gura 3.3.10 . Rela ción microglía /pla ca en el hip ocampo y giro
parahipocampa l de un pa cien te de A lzh ei mer Bra ak V - VI 159
Figura 3.3. 11 . En el modelo tra nsgénico APP/P S1 el ma rcado r CD45 se
expre sa en l a micr oglía activada que rodea las placas de A β y en linfocito s T
(CD3 - positi vos) infiltra dos 1 61
Figura 3.3 .12 . Moderada inmu no r reactivida d pa ra CD45 en el GD y CA 1 del
hipocam po de pacie nte s dement es Bra ak V - VI 1 62
Figura 3.3 . 13 . En el hipoca mpo y giro parahipo cam pal de los pacie ntes de
Alzh eim er s e produ ce una esc asa infiltr ación d e macró fago s y lin focitos 1 63
Figura 3.3. 14 . El gi ro dent ado del m ode lo tr ansg énico A PP/PS1 prese nta un
aumento de la reactivida d mi croglial con la edad , en contra posición a lo
obser vado en p aci en tes d e Al z heimer 168
F igura 3.3. 15 . Disminución de la po blació n de célula s microgliales Ib a1 -
positiva s en el giro dentad o de los p acien t es d e A lzh ei mer B raa k V - VI en
comparaci ón con los i ndividuos en estadio B raak II 1 70
Figura 3 .3. 16 . Degeneración microgli al en el giro d enta do de pacie ntes
Braak V - VI 17 1
Figura 3.3. 17 . Estudio compa rativo d e la pob lación de células microgl iale s
en las regio nes CA3, CA1 y GPH de indi vi duos B raak I I y p aci ent es de ment es
Braak V - VI 1 72
Figura 3 .3. 18 . El giro d entado y CA3 son la s region es más afectadas por la
degenerac ión microgl ial en lo s individu os Braak V - VI 1 73
Figura 3.3. 19. El giro de ntado de los pac iente s de A lzheimer (Br aak V - VI)
pres enta áreas despobladas de m icroglía, incl uso en las zonas más
próximas a las placas de A β 1 76
Figura 3.3 . 20 . Al i gual que ocurre en e l g iro dentado, en al gunas re giones
del hipocam po propio y del giro parahipocampal de pacie ntes Braak V - VI se
encuentran ár eas des pobladas de m icroglía, incl uso en las zonas más
próximas al A β 177
Figura 3. 3. 21. E fect o d el A β sobre la población microglia l en el Presub ículo
de un indi vi duo Bra ak V - VI 178
Figura 3 .3.2 2 . P2ry12 es un marcador de la poblac ión de microglía no
reactiva 179
Índi ce de Fig uras y Tabl as
Figura 3.3. 23 . Las células microglial es activadas as ociadas a los depós itos
amiloides son negativas para el marcador P2r y12 180
Figura 3.3. 2 4. La pob lación microglial P2ry 12 - positiva se enc uentra
afec tada en el hipocampo y giro parahipocampal de los pacientes
demen te s Braa k V - VI 183
Figura 3. 3.2 5. R educid a rea ctividad microgli al en los pac iente s de
Alzh eim er 18 6
Figura 3.3 .26 . La microglía de l giro dent ado d e la mayor ía de los pa ciente s
de Alzheim er pre senta caract erísti cas mor fológica s degen erat ivas 1 87
Figura 3.3. 2 7. La exp re sión de fer riti na s e in cre ment a en la reg ión CA1 a lo
largo de l os estadios de Braak 1 88
Figura 3.3. 2 8. La mic roglía asociada a los depós itos ami loides expresa una
gran c antidad de fer ritina e n las muestr as post mortem de pacie ntes de
Alzh eim er y mo del o s APP/ PS 1 190
Figura 3. 3.2 9. Esca sa pro liferació n c elular en el hip o campo y giro
par ah ipo camp al d e lo s enfe r mos de A lzh ei mer 193
Figura 3. 3. 30 . El hipocampo y el giro parahipocampal de los pacie ntes de
Alzheime r presentan un aumento de l a reactividad astrocit aria en
comparaci ón con los individ u os de estad io s le ve s 19 7
Figura 3.3. 31. Patr ón de dis tribución de la as troglía GFAP - positiva en el GD ,
CA1 y GP H d e ca sos d emen te s Br aa k V - VI y ca so s l eve s Br aa k II 1 98
Figura 3.3 . 32 . El hipoc ampo de los pacie ntes de Alz heimer des arrol la una
respuesta astroglial in fl ama to ria 1 99
Figura 3.3.3 3 . Estudio com parativo entr e el cl ásico marcador de astr oglía
GFAP y el marca dor co nstitut ivo ALDH 1L1 200
Figura 3.3 .34 . Relació n de la a stroglía reacti va con la s placa s amilo ide s
20 2
Figura 3. 3.3 5. Lo s astr ocitos del hipocamp o y giro pa rahip ocampa l de lo s
enfer mos d e A lzh eim er pr od ucen TNF α 20 3
Figura 3. 3.36 . El hipo campo del mode lo tra nsgén ico AP P/PS1 de sarrolla
una extens a respuesta as trocitaria a lo larg o del enveje cimiento, al ig ual
qu e ocu rre en los en fer mo s d e Alz hei me r 204
Fi gura 3.3.37 . Intera cción gl í a/pl aca de A β en el hi poc ampo del mod elo
transgénico APP/P S1 y en los pa cien tes de A l zhei mer 205
Figura 3 .4.1 . Red ucción signif icativa d e in tern eurona s SO M - po sit i vas en e l
hipocam po de indi viduos deme ntes 209
F igura 3 .4.2 . Disminuci ón de la población de interne uronas SOM - p o sit iva s
en la r egi ón CA1 del hipocampo de indivi duos deme ntes Braak V - VI 211
Figura 3. 4.3 . Disminu ción sign ificativa d e int erneuron as S OM - p osit i va s en
la corteza perirrina l de indi vidu os deme nt es 212
Figura 3.4. 4 . Inmuno histoquí mica para PV e n el g iro dent ado de indi viduos
en est adio Braak II y Braak V - VI 215
Figura 3.4 . 5. Reducción signif icativa d e la pob lación de int erneuro nas PV -
216
Índi ce de Fig uras y Tabl as
posi tiv as en e l hipoc ampo de indiv iduos deme ntes
Figur a 3.4 .6 . Reducció n signifi cativa de la p obla ción de in t erneuron as PV -
positiva en la cort eza p erirr inal d el giro par ahipo campa l de in dividuo s
demen te s 217
Figura 3.4 . 7. Limitada patología tau e n las inte rneuronas SOM - po siti va s
219
Figura 3. 4.8 . Ausencia de patolog ía tau e n la pobl ación de inte rne uronas
PV - posi ti va s 220
Figura 3.4 .9 . D elimita ción an atómica de la cort eza p erirrin al en el c erebro
del ratón WT y transgénico AP P/PS1 223
Figura 3.4 .1 0. D egenerac ión de la po blaci ón de i nter neuro nas S OM -
po sit i vas en la corteza p erirri nal de lo s transgénico s APP /P S1 d esde ed ades
tempr an as 224
Figura 3.4. 1 1. Redu cción sig nificativa d e interneuro na s SOM - posi ti va s e n
las capas profundas de la corteza e ntorrinal de ratones transgé nicos
APP/ PS1 d esd e lo s 6 m eses d e ed ad 225
Figura 3.4. 1 2. La s ubpoblac ión de ne urona s S OM - pos it ivas que e xpre s an
nNOS no se encuentra afectada en la corteza per irrinal del modelo
APP/PS1 228
Figura 3.4. 1 3. Progresión con la edad d e la patología amiloide extracelula r
en la corteza perirri nal de los animale s transgénico s APP/P S 1 229
Figura 3. 4.14 . La població n de int erne uronas PV - po sit iva s es r esi st en t e a l
proceso degen erativo en la co rteza p erirrin al d el mod elo trans génico
APP/PS1 231
Fi gura supl ementa ria 3. 1 . Acum ulaci ón de m onóm e ros y oligó meros de
fosfo - tau en e l hipoc ampo de indiv iduos deme ntes B raak V - VI 106
Fi gura supl ementa ria 3.2 . Aumento si gni fic ati vo d e la s fo rma s
monomé ricas fosforiladas de tau en la fracción soluble del hipocam po de
indiv iduos deme ntes B raak V - VI 107
Fi gura supl ementa ria 3. 3 . Wester n Blot de hipoc ampo de indiv iduos Br aak
V- VI y de rat ones APP/P S1 i ncubadas con e l ant icue rpo 6 E10 11 1
Fi gura supl ementa ria 3.4 . Análisis cu anti tativo d e la expre sión de ARN m de
marcador es gen erales de microglía (CD11b e
Iba1) y marcadores
específico s de acti vación (C D4 5 y CD68 ) 1 52
Fi gura supl ementa ria 3. 5 . La microglía acti vada exp resa un perfil de
marcadores similar al de macrófagos periféricos 1 64
Fi gura supl ementa ria 3.6 . La expresi ón de marcadores de microglía no
r
eactiva se reduce signi ficat ivamente en el hip oc ampo y giro
parah ipoca mpal de los p acien tes de Alzhe imer 1 85
Fi gura supl ementa ria 3. 7. La fracció n S 1 del hip oca mpo de ind ividuos
Braak V - VI prod uce un ef ecto tóxico específi co sobre la micr oglía 1 94
Figur a supl ementa ria 3.8 . Expre si ón de A RNm de los m arc adores
neurona les SO M, NPY y PV en e l hipoc ampo de m ues tras humanas cont rol 218
Índi ce de Fig uras y Tabl as
y Braak II, III - IV y V - VI
Fi gura supl ementa ria 3.9 . La s in ter n eu ro na s pa rva lb ú min a so n r esi st en te s
in vitro a l a p resencia d e Aβ sol uble pr ocedent e de cerebr o de m odelos
APP/PS1 232
Tabla 3 .2.1 .
Relación de los cas os humanos analizados e n el pres ente
es tudio, para l a caracterización de la patolog ía amiloide y los y los datos
refer ent es a la eda d, sexo , t i empo post mortem , cl asificación de Braak,
síntomas clínicos d e dem enci a y neuropatolog ía amiloide d e las mu est ra s 109
1. Introd ucción
3
Introducción
1.1. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
La enfermedad de Alzheimer (AD) es una proteinopatía neurodegenerativa progresiva e
irreversible caracterizada por la acumulación de depósitos extracelulares de péptidos ‐ amiloide (A β )
y la aparición de ovillos intracelulares neurofibrilares, formados por la proteína tau hiperfosforilada,
junto con un proceso neuroinflamatorio así como pérdida de sinapsis y muerte neuronal selectiva en
regiones cerebrales superiores responsables de los procesos de memoria y aprendizaje (revisado en
Castellani et al. 2010; Perl 2010; Reitz et al. 2011; Serrano ‐ Pozo et al. 2011; Karch et al. 2014). Desde
el punto de vista clínico, la enfermedad empieza con una fase “preclínica" asintomática, seguida de
una fase "prodrómica" (llamada generalmente de deterioro cognitivo leve o MCI, del inglés mild
cognitive impairment ) y por último una fase de ‘’demencia’’. La ausencia actual de terapias efectivas
que modifiquen el curso natural de la AD, y el rápido crecimiento de su prevalencia, plantea la
necesidad urgente de profundizar en el estudio de los mecanismos moleculares y celulares de dicha
enfermedad.
La pérdida de memoria (manifestada como la dificultad de recordar hechos recientemente
aprendidos y de adquirir nueva información) es el primer, y más característico, síntoma de esta
enfermedad. Otros síntomas que también aparecen durante su evolución son apraxia (incapacidad
de realizar movimientos o gestos aprendidos a pesar de tener la capacidad física), afasia (alteración
del lenguaje), agnosia (incapacidad de reconocimiento de personas u objetos), desorientación
espacio ‐ temporal y disminución del razonamiento. El declive cognitivo, así como el empeoramiento
en la sintomatología en general, progresa gradualmente a lo largo de las fases leve, moderada y
grave de la enfermedad. Finalmente, en la fase terminal los afectados acaban en un estado
vegetativo y la muerte suele producirse por causas secundarias, siendo la neumonía la más común
(Castellani et al. 2010; McKhann et al. 2011; Webster et al. 2014).
La AD es el tipo de demencia de mayor incidencia y la más común entre las personas mayores
de 65 años con una estimación de 44 millones de afectados a nivel mundial. Se estima, teniendo en
cuenta el envejecimiento progresivo de la población, que este número se duplique para 2030 y
triplique para 2050 (World Alzheimer Report 2014; http://www.alz.co.uk/research/world ‐ report ‐
2014 ). Se calcula además, que en España padecen esta enfermedad actualmente entre 500.000 y
800.000 personas (Lilly S.A., 2012).
Desde que Alois Alzheimer, neuropatólogo y psiquiatra alemán, describiera por primera vez
en 1906 las características clínicas y patológicas de esta enfermedad (Alzheimer 1907), han sido
muchos los hallazgos científicos que han permitido conocer parte de los mecanismos celulares que
desencadenan esta patología. Sin embargo, actualmente todavía se desconoce la causa o causas
exactas que la originan, no existe un test pre mortem para un diagnóstico concluyente, y tampoco
existe ningún tratamiento farmacológico efectivo que modifique el curso de la enfermedad (los que
actualmente están aprobados son solo de carácter sintomático).
4 Introducción
1.1.1 Tipos de Alzheimer
La AD se puede dividir en dos tipos según la edad de inicio, su incidencia y su principal causa
de aparición. No obstante, ambas formas de Alzheimer cursan con los mismos síntomas y lesiones
histopatológicas:
‐ Alzheimer Familiar (de inicio temprano) o FAD (del inglés Familial Alzheimer’s Disease ) : Se
caracteriza por su aparición a edades tempranas (entre los 35 y 40 años de edad) (Ringman et al.
2015). Este tipo de Alzheimer se transmite genéticamente con carácter autosómico dominante y
representa el 1% de todos los casos de Alzheimer. Actualmente, sólo se conocen tres genes que
estén directamente implicados en el desarrollo de esta enfermedad (ver revisiones O’Brien y Wong
2011; Karch et al. 2014; Calero et al. 2015): el gen de la presenilina 1 (PS1), localizado en el
cromosoma 14, cuya mutación es la causa más común de las formas familiares de la AD (Sherrington
et al. 1995), conociéndose 185 mutaciones distintas, entre ellas la F176L que portaba Auguste Deter
(Müller et al. 2013); el gen de la presenilina 2 (PS2), con una alta homología con la PS1, localizado en
el cromosoma 1 (Rogaev et al. 1995) y del que se han descrito alrededor de 14 mutaciones asociadas
con el Alzheimer; y el gen de la proteína precursora β
‐ amiloide (APP), que se encuentra en el
cromosoma 21 (Goate et al. 1991) y para el quse han descrito 32 mutaciones relacionadas con la EA
(para detalle ver www.molgen.ua.ac.be/ADmutations/ ).
‐ Alzheimer esporádico (de inicio tardío): Esta forma de Alzheimer la padecen el 95 ‐ 98% de los
afectados y su incidencia es baja hasta los 60 ‐ 65 años de edad, afectando a menos del 5% de la
población. Sin embargo, a partir de esta edad, el porcentaje de incidencia se duplica cada 5 años, lo
que supone que una de cada tres personas por encima de los 85 años la padecen (Jahn 2013). Las
causas que conllevan a la aparición de Alzheimer esporádico no se conocen, y se le otorga un origen
multifactorial, aunque el principal factor de riesgo es el envejecimiento.
1.1.2. Factores de riesgo
‐ Edad : Es el factor de mayor importancia para desarrollar el Alzheimer esporádico, ya que la
prevalencia de la EA aumenta con la edad y se duplica cada 5 años entre los 65 y 85 años de edad
(Katzman 1976). Se desconoce de qué manera está asociada con este factor, aunque se cree que
puede tener relación con el daño producido por los radicales libres del metabolismo celular, que
generan estrés oxidativo en los lípidos y proteínas de membrana, contribuyendo a la muerte celular
(Castellani et al. 2010)
‐ Genes : Hasta el momento se han identificado tres genes relacionados con la enfermedad de
Alzheimer, que están directamente involucrados en la aparición de la forma familiar (PS1, PS2 y APP).
5
Introducción
Además, la AD se asocia con determinados polimorfimos genéticos (revisado en Beltran et al.
2010; Ballard et al. 2011; Karch et al. 2014; Calero et al. 2015)
Apolipoproteína E (ApoE): localizada en el cromosoma 19. Es una proteína polimórfica, con 3
alelos ( ε 2, ε 3, ε 4), siendo ε 4 el que más eleva el riesgo de padecer la forma esporádica de AD. De
hecho, la isoforma E4 de la APOE está considerada el mayor factor de riesgo de la AD esporádica tras
la edad, incrementando su riesgo tres veces en individuos que portan una copia de este alelo y en 15
veces en individuos homocigotos. Por otro lado, el alelo ε 2, parece tener un papel protector (Corder
et al. 1994). Una de sus funciones básicas es servir de ligando a receptores de LDL ( low density
lipoprotein ), que median la asimilación de colesterol por parte de las neuronas. Su implicación en la
AD se relaciona con su capacidad de interaccionar con las placas de A β , desencadenándose una
cadena de eventos que favorecen su formación o dificultan su eliminación (Kim et al. 2014).
CLU: codifica para una región de la cadena ‐β de la clusterina, y se localiza en el cromosoma 8.
En ciertas regiones cerebrales de pacientes de AD, su expresión se ve aumentada (Calero et al. 2000;
Björkhem et al. 2010). Su actividad chaperona prevendría la oligomerización/fibrilización del A β ,
formando complejos que atravesarían la barrera hematoencefálica. Las mutaciones en el gen
propiciarían la formación de las placas (Bagyinszky et al. 2014).
PICALM ( phosphatidyl inositol ‐ binding clathrin assembly protein ): ubicado en el cromosoma
11. Codifica para un adaptador de clatrinas que regula la formación de la envoltura de coatómeros
en la membrana plasmática. Regula la endocitosis de algunas SNAREs (Moreau et al. 2014) por lo que
se piensa que podría influir en el procesamiento de APP a través de la ruta endocítica y de
eliminación del A β (Harold et al. 2009). También afecta a los procesos de autofagia a través de
proteínas de adhesión a microtúbulos como tau (Moreau et al. 2014)
TREM2 ( Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 ): Distintas variantes de este gen
confieren un alto riesgo de desarrollar la AD. Este gen codifica para un importante modulador de la
función inmune celular. En el cerebro, los receptores de esta proteína se expresan exclusivamente en
células mieloides, en concreto en macrófagos derivados de monocitos circulantes. En la enfermedad
de Alzheimer, TREM2 aumenta su expresión de manera dependiente de la edad. Además, la
deficiencia en TREM2 reduce algunas alteraciones histopatológicas de la EA (neuroinflamación,
deposición de A β en el hipocampo e hiperfosforilación de la proteína tau) (Jay et al. 2015).
La lista de genes implicados en la AD es aún mayor (ver revisión Calero et al. 2015): α 2 ‐
macroglobulina (Flachsbart et al. 2010), fosfolipasa A2 (Cordeiro et al. 2010), sortilina ‐ 1 (Rogaeva
et al. 2007) , ADAM10 (Kim et al. 2009), fosfolipasa D3 ( PLD3 ) (Cruchaga et al. 2014) , etc., aunque no
entraremos a analizarlos todos en el presente trabajo.
6 Introducción
Por último, hay otros factores no genéticos que también modifican la incidencia de padecer
AD como:
‐ Género : La mujer tiene un riesgo mayor que el hombre de padecer la enfermedad de Alzheimer
(Reiman y Caselli 1999; Ampuero et al. 2008) aunque el motivo de ello es desconocido. Han sido
propuestos factores hormonales, ya que los estrógenos poseen un papel neuroprotector, por lo que
su pérdida con la edad en la mujer podría incrementar las posibilidades de desarrollar la enfermedad
(Maccioni et al. 2001). Además, se ha visto que los estrógenos disminuyen la producción de β
‐
amiloide ( A β ) en cultivos celulares (Turner 2001). También las gonadotropinas, principalmente la
hormona luteinizante, podrían estar relacionadas con la mayor susceptibilidad de las mujeres a
padecer la AD (Webber et al. 2007).
‐ Enfermedades cardiovasculares : Actualmente se sabe que la hipertensión, la ateroesclerosis, el
infarto o la isquemia cerebral incrementan la probabilidad de desarrollar la AD, además de poder
desencadenar demencia vascular, la segunda causa de demencia tras el Alzheimer (van Norden et al.
2012). También se ha descrito que las enfermedades cardiacas y los infartos incrementan el
deterioro de los pacientes de Alzheimer y pueden contribuir al inicio de la enfermedad (Regan et al.
2006; de la Torre 2006). Además, la AD suele aparecer asociada a una extensa angiopatía amiloide
cerebral o AAC (depósitos de A β en los vasos sanguíneos cerebrales).
‐ Otras enfermedades : No sólo las enfermedades cardiovasculares son factores de riesgo para la AD,
sino también otras, como son la diabetes mellitus tipo II (De Felice y Ferreira 2014), el síndrome de
Down (presenta trisomía del cromosoma 21 en el que se encuentra el gen que codifica para el APP)
así como otras dolencias asociadas a procesos inflamatorios.
‐ Exposición a metales : El aluminio es una sustancia neurotóxica que se asocia con la aparición de
AD, posiblemente debido a una exposición a aluminio monomérico orgánico en el agua de beber
(Gauthier et al. 2000; Di Paolo et al. 2014). Altos niveles de hierro, cobre, zinc, mercurio y plomo
también representan factores de riesgo.
‐ Otros factores , como la dieta (Blennow et al. 2006; Otaegui ‐ Arrazola et al. 2014); el nivel
educacional (reserva cognitiva) (Reiman y Caselli 1999; Blennow et al. 2006), o el nivel de actividad
física (Scarmeas et al. 2009) también se han relacionado con la incidencia de AD.
1.1.3. Neuropatología
‐ Cambios a nivel macroscópico
El cerebro de los pacientes de Alzheimer sufre atrofia cortical, adelgazamiento de las
circunvoluciones, ensanchamiento de los surcos, engrosamiento de las meninges, dilatación de los
7
Introducción
ventrículos y disminución del peso y volumen cerebral. La atrofia afecta principalmente al giro
parahipocampal del lóbulo temporal, aunque también afecta al lóbulo frontal y parietal (Fig. 1.1).
Este patrón de cambios puede reconocerse mediante imágenes de resonancia magnética (MRi) de
los pacientes de Alzheimer, y se comprueba que, efectivamente, la atrofia cortical e hipocampal se
correlaciona con los resultados post mortem asociados a la enfermedad (Castellani et al. 2010; Perl
2010). En la figura 1.1 puede observarse que las alteraciones macroscópicas que ocurren en un
cerebro afectado por la AD en comparación con un cerebro sano.
Por lo general, estos cambios vienen acompañados de una patología cerebrovascular, por lo
que también son característicos los micro infartos, infartos lacunosos en los ganglios basales así
como desmielinización de la sustancia blanca periventricular (Serrano ‐ Pozo et al. 2011).
‐ Cambios a nivel microscópico
Las principales marcas histopatológicas de la enfermedad de Alzheimer son las lesiones
neurofribilares que se forman en el interior de las neuronas y la acumulación extracelular de
depósitos amiloides. Además, se produce una extensa pérdida neuronal y sináptica, junto con un
proceso inflamatorio caracterizado por activación microglial y astroglial. Por último, se observa la
presencia de cuerpos de Hirano, que son inclusiones citoplasmáticas caracterizadas por la presencia
de filamentos de actina y otras proteínas asociadas, como la proteína tau (Hirano 1994).
Ovillos neurofibrilares
Los ovillos neurofibrilares o NFTs (del inglés neurofibrillary tangles ) es una de las principales
marcas histopatológicas que caracterizan la AD y fueron descritos por primera vez por Alois
Alzheimer como inclusiones intraneuronales filamentosas en el citoplasma de las neuronas
piramidales. Los NFTs están formados por agregados fibrilares de la proteína tau hiperfosforilada.
Pueden encontrarse en tres estadios morfológicos: pre ‐ NFTs o NFTs difusos ( pre tangles ), en los que
la neurona todavía conserva su apariencia sana; NTFs intracelulares, en los que las fibras desplazan al
núcleo y aparecen tortuosidades en la dendrita apical y en el segmento proximal del axón; y NFTs
extracelulares ( ghost tangles ), en los que las fibras se localizan en el exterior celular tras la muerte
Figura 1.1. Dibujo esquemático comparativo
de un cerebro humano sano (hemicerebro
izquierdo) y otro de un paciente de
Alzheimer (hemicerebro derecho). El
cerebro afectado por AD posee menor
volumen y presenta dilatación ventricular. La
atrofia afecta a los lóbulos temporales,
frontales, parietales y occipitales. Las
regiones donde residen las funciones de
memoria (hipocampo) y lenguaje (áreas de
Broca y de Wernicke) son las más afectadas.
8 Introducción
neuronal (revisado en Serrano ‐ Pozo et al. 2011). Además, los agregados de tau hiperfosforilado
pueden acumularse no solo en el soma neuronal sino también en los procesos neuríticos, en forma
de filamentos (hebras) de neuropilo o NTs (del inglés neuropil threads ) y neuritas distróficas. Los NTs
(Braak et al. 1986) aparecen siempre asociadas a NFTs, y se interpretan como segmentos de
dendritas y axones de las neuronas que contienen ovillos. Contribuyen considerablemente a la carga
total de patología neurofibrilar.
La distribución topográfica de las lesiones neurofibrilares presenta un patrón de progresión
determinado a lo largo de la enfermedad, pudiéndose distinguir seis estadios o etapas, llamados
estadios de Braak (Braak y Braak 1991; Braak et al. 2006)(ver figura 1.2). Los primeros NFTs se
desarrollan en la corteza perirrinal (región transentorrinal) y entorrinal del giro parahipocampal
(estadio I), éstos se extienden a la región CA1 del hipocampo (estadio II), después los ovillos se
acumulan en regiones límbicas como el subículo (estadio III), la amígdala, el tálamo y el claustro
(estadio IV), hasta que, finalmente, los NFTs se extienden por todas las áreas isocorticales, afectando
más temprana y severamente las áreas asociativas (estadio V) que las áreas sensoriales primarias,
motoras y visuales (estadio VI). Además, esta degeneración sigue un patrón también laminar dentro
de cada región, de manera que se encuentran afectadas primeramente las capas superficiales II, III y
IV de la corteza perirrinal y entorrinal, el estrato piramidal de CA1 y subículo, y las capas III y V de las
áreas isocorticales (McKhann et al. 2011; Braak et al. 2006).
Figura 1.2. Estadios de Braak I ‐ VI. Secciones coronales de hemicerebros de individuos que muestran las seis
estadios en los que progresan los cambios neurofibrilares asociados a la proteína tau hiperfosforilada,
detectados mediante inmunotinción para fosfo ‐ tau. Tomado de Braak et al. 2006.
9
Introducción
Placas seniles
Las placas seniles o amiloides son agregados proteicos extracelulares formados
mayoritariamente por el péptido β ‐ amiloide, que se deposita tanto en el parénquima cerebral como
en la pared de los vasos sanguíneos debido a sus propiedades hidrofóbicas y de agregación. Otros
componentes de las placas son proteoglucanos, moléculas inflamatorias, moléculas séricas, iones
metálicos, moléculas amiloidogénicas (como ApoE), proteasas, proteínas de defensa antioxidante y
colinesterasas (Atwood et al. 2002).
Las placas seniles se clasifican en varios tipos según su morfología, composición o si
presentan o no distrofias neuríticas asociadas, y aunque son muy diversas las clasificaciones
propuestas (Thal et al. 2006, 2008; revisado en Duyckaerts et al. 2009; D’Andrea y Nagele 2010;
Castellani et al. 2010; Perl 2010; Serrano ‐ Pozo et al. 2011), se pueden resumir los diferentes tipos en
(Fig. 1.3):
‐ Placas neuríticas: Los depósitos amiloides que se forman en los pacientes de Alzheimer pueden
estar asociados con distrofias en axones y dendritas del neuropilo circundante que, por efecto tóxico
probablemente de la placa, éstos se curvan y se engrosan formando lo que se conoce como neuritas
distróficas. Las placas neuríticas suelen estar asociadas al reclutamiento de células microgliales
reactivas y además, se relacionan con el deterioro cognitivo, encontrándose mayoritariamente este
tipo de placas en los pacientes dementes. Las neuritas distróficas pueden acumular en su interior
APP, ubiquitina, fosfo ‐ tau, vesículas autofágicas, vesículas sinápticas, etc., debido al fallo en el
transporte axonal que se produce en consecuencia a la desestabilización de la red del citoesqueleto.
Estas neuritas distróficas pueden tener un origen glutamatérgico, gabaérgico así como colinérgico.
Las placas conocidas como placas clásicas son un tipo de depósito neurítico compuesto por un núcleo
denso de A β 42 fibrilar (por la conformación en lámina β que adquiere la estructura amiloide) y un
halo de amiloide difuso. Las placas primitivas son esféricas y presentan una inmunotinción
homogéneaestán, están también compuestas por amiloide fibrilar y se asocian con neuritas
distróficas.
‐ Placas difusas: También denominadas pre ‐ amiloides, no son fibrilares. Son estructuras amorfas, con
límites poco definidos y sin núcleo compacto. Tampoco se observan ni glía ni neuritas distróficas a su
alrededor. Individuos control sin síntomas de demencia pueden presentar una gran carga de amiloide
difuso en la corteza.
A diferencia de lo que ocurre con los ovillos neurofibirlares, las placas se acumulan
principalmente en la corteza. Y aunque el patrón espacio temporal de progresión del amiloide es más
variable, se podría decir que en general, la alocorteza (que incluye la corteza entorrinal, perirrinal y la
formación hipocampal) está menos afectada que la corteza asociativa. Pese a la pobre predicción de
la deposición de A β , se han propuesto dos sistemas diferentes de clasificación, el propuesto por
10 Introducción
Braak y Braak (1991) y el propuesto por Thal y colaboradores en 2002 (Thal et al. 2002). Braak y
Braak distinguen tres fases: fase A, los depósitos extracelulares afectan a las porciones basales de los
lóbulos frontal, temporal y occipital; fase B, el A β se extiende hacia todas las áreas isocorticales de
asociación, mientras que el hipocampo se encuentra someramente afectado y la corteza sensorial,
motora y visual primaria se encuentran libres de depósitos: en la fase C, el A β finalmente se deposita
en las áreas isocorticales primarias, en la capa molecular del cerebelo así como en el estriado,
tálamo, hipotálamo y núcleo subtalámico.
Sin embargo Thal y colaboradores definen cinco fases o estadios: estadio 1 o isocortical;
estadio 2, con depósitos también en regiones alocorticales (corteza perirrinal, corteza entorrinal,
hipocampo, amígdala y corteza insular y cingulada); estadio 3, con implicación también del estridado,
los núcleos colinérgicos, el tálamo, hipotálamo y la sustancia blanca; estadio 4, caracterizado por
afectar a la sustancia negra, la formación reticular, el bulbo raquídeo y el colículo superior e inferior;
por último, en el estadio 5, los depósitos se expanden hasta el puente (formación reticular, núcleo
del rafe y el locus ceruleus ) y la capa molecular del cerebelo. Estas cinco fases de Thal se pueden
resumir en la fase isocortical, la fase límbica o alocortical, y la fase subcortical (Fig. 1.4).
Figura 1.3. Diferentes tipos de placas seniles que desarrollan los pacientes de Alzheimer. Las placas
neuríticas pueden ser de tipo fibrilar (o placas primitivas) (A1 y A2), o clásicas (B1 y B2) con núcleo denso
compuesto principalmente por Abeta42 (B2) y un halo difuso. Las placas difusas (C) no provocan distrofias
neuríticas (C1) y presentan una morfología indefinida (C2). Inmunohistoquímica doble para A β (azul) y fosfo ‐
tau (marrón) (A1 ‐ C1) e inmunotinción simple para A β 42 (A2 ‐ C2).
11
Introducción
Diversos estudios han puesto de manifiesto la existencia de lesiones histopatológicas
características de la AD en una proporción relevante de individuos asintomáticos (Schneider et al.
2009; Wharton et al. 2011; SantaCruz et al. 2011; Perez ‐ Nievas et al. 2013). Dichas lesiones se
presentan de acuerdo con un patrón progresivo que sugiere la existencia de fases neuropatológicas
sucesivas, previas a la manifestación clínica de la enfermedad (Jicha et al. 2012). Así mismo, se han
definido distintos biomarcadores que permiten detectar la patología preclínica de la AD (niveles
proteicos en el líquido cefalorraquídeo –LCR ‐ , y estudios de neuroimagen por resonancia magnética
nuclear –MRI ‐ , y tomografía por emisión de positrones o PET). En este contexto, el International
Working Group for New Research Criteria for the Diagnosis of Alzheimer’s Disease (Cummings et al.
2013) ha propuesto designar mediante el término “enfermedad de Alzheimer” la totalidad de la
enfermedad in vivo , incluyendo sus fases preclínicas, y referirse a los casos confirmados mediante
estudio histológico (ante o post mortem) como “AD comprobada neuropatológicamente”. De forma
similar, el National Institute of Aging ‐ Alzheimer’s Association de Estados Unidos recomienda el
término “cambio neuropatológico de AD” para referirse a los hallazgos histopatológicos
característicos de la enfermedad, independientemente del estado cognitivo del individuo (Montine
et al. 2012; Hyman et al. 2012).
Figura 1.4. La acumulación de agregados de Abeta y fosfo ‐ tau siguen un patrón topográfico determinado. A,
según Thal, las placas amiloides aparecen primero en la neocorteza (fase isocortical), seguida de la alocorteza
(fase límbica) y por último en regiones subcorticales (fase subcortical). B, según Braak, los ovillos
neurofibrilares se desarrollan primero en la corteza perirrinal, se extienden a la amígdala e hipocampo hasta
interconectar con las regiones neocorticales. Tomado de Jucker y Walker, 2011.
12 Introducción
1.2. PROTEÍNA TAU HIPERFOSFORILADA
Los ovillos neurofibrilares (NFTs) (Fig. 1.5) son estructuras histopatológicas localizadas en el
interior neuronal, a modo de red compacta, constituidas por pares de filamentos helicoidales (PHF)
cuyo principal componente es la proteína tau hiperfosforilada (ver revisión Ballatore et al. 2007;
Gendron y Petrucelli 2009).
Tau es una proteína asociada a los microtúbulos
(MAP) que interviene en el ensamblaje y estabilización de
éstos, además de servir de unión a otros filamentos del
citoesqueleto, por lo que es una proteína crítica en la
supervivencia celular, ayudando a mantener la estructura
interna de la célula. En el cerebro sano, el equilibrio entre
fosforilaciones y desfosforilaciones de tau modula la
estabilidad del citoesqueleto y por tanto, la morfología y el
transporte axonal. Sin embargo, en el cerebro de un paciente
de Alzheimer, la proteína tau se encuentra hiperfosforilada,
presentando modificaciones estructurales y
conformacionales, lo que afecta a su unión con la tubulina y,
por lo tanto, al ensamblaje de los microtúbulos y forma agregados intracelulares que provocan
disfunción neuronal. Las principales kinasas implicadas en la fosforilación anómala de tau son la
quinasa dependiente de ciclina (Cdk5/p35) y la quinasa glucógeno sintasa (GSK3 β ) (ver revisones
Maccioni et al. 2001; Blennow et al. 2006; Ballatore et al. 2007; Kolarova et al. 2012; Gendreau y Hall
2013).
El A β , el estrés oxidativo o factores como p25, inducen un cambio en la ruta de señalización
que conduce a una desregulación de la quinasa Cdk5, lo que conlleva la fosforilación anómala de tau.
Cdk5 controla también indirectamente la fosforilación de tau al regular a la quinasa GSK3 ‐β , y a su
vez ciertos tipos de fosforilación de tau por parte de Cdk5 incrementan la acción de GSK3 ‐β (Castr o ‐
Alvarez et al. 2014). En definitiva, la hiperfosforilación de tau evita su incorporación a los
microtúbulos, favoreciendo la formación de pares de filamentos helicoidales y, finalmente, los ovillos
neurofibrilares (NFTs o tangles ) (ver revisiones Maccioni et al. 2001; Blennow et al. 2006; Ballatore
et al. 2007). Esto provoca la degeneración del transporte axonal y la consiguiente pérdida sináptica,
generación de neuritas distróficas y muerte neuronal (Iqbal y Grundke ‐ Iqbal 2008; Iqbal et al. 2010;
Frost et al. 2015).
Las enfermedades que presentan agregados intracelulares de tau se denominan tautopatías
y se pueden diferenciar según la composición y morfología de los filamentos y la distribución de los
mismos dentro del cerebro. Para formar los ovillos, la proteína tau hiperfosforilada se disocia de los
microtúbulos y se trasloca del axón al soma y las dendritas, donde se ensambla en forma de pares de
Figura 1.5. Ovillos neurofibrilares
intracelulares en un sección de cerebro
de un paciente de Alzheimer Braak V ‐ VI.
Tinción con Tioflavina S.
13
Introducción
filamentos helicoidales que constituyen las unidades estructurales de los ovillos. Son muchas las
evidencias que sugieren que la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer es debida a una
alteración en el citoesqueleto, y se relaciona la muerte neuronal con la presencia de ovillos
neurofibrilares (Spires ‐ Jones et al. 2009) y por lo tanto, con la demencia (Nelson et al. 2012). De
hecho, en los enfermos de Alzheimer existe un patrón de deposición de los ovillos, que comienza en
la corteza entorrinal y avanza hacia el hipocampo y corteza asociativa, afectándose en estadios
avanzados las áreas sensoriales primarias (Braak y Braak 1991). Sin embargo, cada vez son más los
estudios que atribuyen las propiedades tóxicas de la proteína tau a las formas solubles oligoméricas
de ésta más que a los agregados fibrilares en forma de NFTs. Los modelos de tauopatías además de
presentar fallos en el transporte axonal y dendrítico por la desestabilización de la red microtubular,
cursan con una gran cantidad de déficits a nivel sináptico que incluyen pérdida sináptica, disminución
de la densidad de espinas dendríticas, disminución de proteínas sinápticas y del receptor de
glutamato AMPA y NMDA, así como disfunción de la transmisión LTP. Aunque los mecanismos en los
que se produce esta degeneración sináptica en las tauopatías neurodegenerativas no están claro, hay
muchas evidencias de que los oligómeros solubles de fosfo tau están directamente implicados. De
hecho, estas especies agregadas solubles y tóxicas se acumulan en los sinaptosomas (fracción
sináptica soluble aislada bioquímicamente) en los estadios tempranos de la enfermedad de
Alzheimer, incluso antes de que se desarrollen los primeros ovillos neurofibrilares.
Por lo tanto, las formas oligoméricas solubles de fosfo tau, al igual que los oligómeros de A β
(ver más adelante) pueden causar disfunción sináptica y muerte celular independientemente a la
agregación fibrilar, con una gran implicación sobre la función sináptica y el deterioro cognitivo que
cursa de manera común en todas las enfermedades neurodegenerativas y en especial, en la
enfermedad de Alzheimer.
1.3. PÉPTIDO β‐ AMILOIDE
1.3.1. La proteína precursora amiloide (APP)
El gen que codifica para APP está constituido por 18 exones que por splicing alternativo dan
lugar a 10 isoformas de entre 563 y 770 aminoácidos (Evin y Weidemann 2002). Las tres principales
son la APP695, APP751 y APP770, siendo la primera la que encontramos con mayor frecuencia en el
sistema nervioso (Nalivaeva y Turner 2013). APP pertenece a su vez a una familia de proteínas con
una secuencia muy conservada entre las que se encuentran APLP1 y APLP2 (del inglés, Amyloid
precursor ‐ like protein ).
El APP (Fig. 1.6.) es una glucoproteína integral de membrana que posee un dominio
extracelular N ‐ terminal globular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular corto (Turner
et al. 2003). La región que forma el A β tras el procesamiento del APP se encuentra tanto en el
dominio extracelular como en el transmembrana, lo que provoca que el β
‐ amiloide tenga
propiedades agregativas, ya que una parte de la molécula tiene características hidrofóbicas.
14 Introducción
SP Ectodomi nio DC
DTM
Dominio globular
P P
Sitios co rte secretasas
βα γ
A β
KPI OX-2 Exón
15
DH DCu DZn Regió n
acídi ca FPC DH DCO
CH GA G DCu
DZn
PP
G
0
SP Ectodomi nio DC
DTM
Dominio globular
P P
Sitios co rte secretasas
βα γ
A β
KPI OX-2 Exón
15
DH DCu DZn Regió n
acídi ca FPC DH DCO
CH GA G DCu
DZn
PP
G
0
Esta proteína puede localizarse en la membrana plasmática, en la red trans Golgi, en el
retículo endoplasmático, los lisosomas o la membrana mitocondrial (revisado en Rajendran y
Annaert 2012). La función fisiológica de APP se desconoce hasta el momento, entre otros motivos
por la redundancia de función de APLP1 y APLP2 aunque existen evidencias de que podría estar
implicado en el crecimiento de neuritas, en la migración neuronal, la homeostasis del calcio, la
potenciación a largo plazo (LTP) y la señalización intracelular (Hoe y Rebeck 2008; Hiltunen et al.
2009). Además, se ha descrito que el APP puede tener un papel tanto neuroprotector como
antioxidante, ya que es capaz de reducir el Cu 2+ a Cu + (Evin y Weidemann 2002; Müller y Zheng
2012).
Las mutaciones en este gen que desencadenan el Alzheimer familiar provocan la
modificación en el procesamiento del APP, y un consiguiente incremento en la producción de la
isoforma A β 1 ‐ 42, la cuales se agregan, se acumulan en el espacio extracelular y generan las placas
seniles (Evin y Weidemann 2002; Pera et al. 2013).
1.3.2. Presenilina 1 y Presenilina 2
La presenilina 1 (PS1) y la presenilina 2 (PS2) son proteínas integrales de membrana con 6 ‐ 8
dominios transmembranales y los dominios N ‐ y C ‐ terminal citosólicos. Se localizan tanto en el
retículo endoplasmático como en el aparato de Golgi, aunque también se han detectado en la
membrana plasmática (Suh y Checler 2002) y en compartimentos endocíticos (Vetrivel y Zhang
2006). Entre ambas proteínas existe un 65% de homología, siendo la PS1 la que se expresa
mayoritariamente.
Entre sus funciones destacan el control de la apoptosis, la inducción de señales intercelulares
cuando se encuentran unidas a APP, homeostasis del calcio, crecimiento neurítico, plasticidad
Figura 1.6. Representación esquemática de la proteína APP. Se muestra el dominio A β , varios dominios
funcionales y los sitios de corte de las secretasas. PS, péptido señal; DTM, dominio transmembrana; DC,
dominio citosólico; DH, dominio de unión a heparina; DCu, dominio de unión a Cobre; DZn, dominio de
unión a Zinc; FPC, factor promotor de crecimiento; DCO, dominio de unión a colágeno; CH, sitio de
incorporación de carbohidratos; GAG, sitio de incorporación del glicosaminoglicano condroitín sulfato; G o
,
sitio de unión de la proteína heterotrimérica G 0 ; KPI, dominio inhibidor de serina proteasa tipo Kunitz; OX ‐
2, secuencia que se encuentra en APP 770 . Figura adaptada de Evin y Widemann 2002.
15
Introducción
sináptica e intervienen en las rutas autofagocíticas/lisosomales (Lee et al. 2010) y en el
procesamiento del APP. Además, poseen otros sustratos, como los homólogos del APP, Notch y sus
homólogos, y un largo etcétera (revisado en Vetrivel y Zhang 2006). En concreto, las presenilinas
actúan como subunidades catalíticas de la γ ‐ secretasa o secretosoma, un complejo proteico de alto
peso molecular formada por PS y otras proteínas.
Las mutaciones asociadas a la AD en los genes de la PS1 y PS2 son autosómicas dominantes y
altamente penetrantes, causando un incremento en la producción de A β 1 ‐ 42 y la formación de los
fragmentos insolubles que se acumulan en forma de placas seniles.
1.3.3. Generación, eliminación y agregación del β‐ amiloide
El péptido A β , es un péptido soluble de 4 KDa, que se genera por proteólisis de la proteína
precursora amiloide (APP) mediante la acción de la β ‐ y γ ‐ secretasas, y que circula a baja
concentración tanto en sangre como en el líquido cefalorraquídeo.
No solo se genera A β a partir del procesamiento del APP, sino que se producen múltiples
moléculas a las que se les ha atribuido una gran variedad de funciones. El procesamiento post ‐
traduccional del APP puede llevarse a cabo a partir de dos vías alternativas (Fig. 1.7): la vía no
amiloidogénica, en la que no se genera A β , y la vía amiloidogénica o patogénica, en la que se forman
los péptidos A β 1 ‐ 40 y A β 1 ‐ 42.
‐ Ruta no amiloidogénica: Es la ruta principal de procesamiento del APP. La proteólisis se
produce dentro de la región que da lugar al A β , evitándose así su producción. El APP es fragmentado
por acción proteolítica de la α
‐ secretasa que está anclada a la membrana, generando sAPP α , un
fragmento soluble que se libera dentro del lumen vesicular o al espacio extracelular y al que se le
atribuyen propiedades neuroprotectoras y neurotróficas (Mattson et al. 1993). Además, se genera un
fragmento C ‐ terminal denominado C83 (de 83 aminoácidos), que queda unido a la membrana, y que
posteriormente es sustrato de la γ
‐ secretasa. La γ ‐ secretasa es un complejo enzimático del que
forma parte la presenilina, que actúa dentro de la membrana, dando lugar a los péptidos p3 y AICD
(dominio intracelular del APP, llamado también p7). Este último péptido es citosólico, por lo que
podría tener un papel en la regulación de la transcripción génica.
‐ Ruta amiloidogénica: Es una ruta alternativa del procesamiento del APP, minoritaria en la
mayoría de los tipos celulares (excepto en las neuronas), que genera péptidos A β . Esta vía no se
produce únicamente como un proceso patológico, sino también de forma normal; de hecho A β es
detectado tanto en el plasma como en el fluido cerebroespinal de individuos sanos.
Esta vía comienza con la acción de la actividad β
‐ secretasa presente en la enzima BACE1
(enzima de corte del APP en el lugar β ), una aspartil proteasa transmembrana, presente
principalmente en las neuronas, específicamente en los endosomas y el aparato de Golgi,
compartimentos en los que se produce el A β . La acción de esta enzima produce el fragmento sAPP β y
el péptido C99 (fragmento C ‐ terminal de 99 residuos), que permanece unido a la membrana y que
16 Introducción
contiene la secuencia completa del A β , hasta que es sustrato de la γ‐ secretasa, que libera el A β de 40
ó 42 aminoácidos y el AICD (ver revisiones Selkoe 2001, 2008). Estudios recientes han determinado
que el fragmento N ‐ APP, que se produce en una situación de privación trófica a partir del producto
sAPP β , puede interaccionar con el receptor de muerte 6 (DR6) e inducir degeneración axonal y
neuronal (Nikolaev et al. 2009).
El péptido A β puede formarse en cualquiera de los compartimentos celulares y, o bien
quedarse en el interior celular, o bien salir al exterior ya se forme en la membrana celular o en la ruta
secretora, la cual parece ser la vía predominante. Los endosomas, son un sitio probable de
generación de amiloide, ya que la enzima BACE1 necesita un pH ácido para su actividad óptima, por
lo que el APP podría ser internalizado por endocitosis desde el exterior, sin procesar, y sufrir la
proteólisis en el interior del sistema endosomal.
Durante el envejecimiento normal, y de forma más acusada en la AD, se originan péptidos de
A β insolubles que forman las placas seniles. El péptido A β suele terminar en Val40 (A β 1 ‐ 40) en el
extremo C ‐ terminal, pero un pequeño porcentaje lo hace en Ala42 (A β 1 ‐ 42), lo que hace que sea un
Figura 1.7. Esquema de las vías de procesamiento post ‐ traduccional del APP. El APP puede ser
procesado por la α‐ o la β ‐ secretasa, según la vía, y posteriormente, la enzima γ ‐ secretasa genera
varios productos derivados del APP, como el fragmento N ‐ APP, el A β y el AICD, los cuales realizan
distintas funciones fisiológicas. Durante la enfermedad de Alzheimer, el procesamiento del APP se ve
incrementado y alterado por factores genéticos como mutaciones en el APP y las PS1 y PS2 u otros
mecanismos esporádicos. El resultado es un incremento en la producción de A β 1 ‐ 42 y N ‐ APP, los
cuales inician una cascada de eventos neurodegenerativos. Modificado de Kim y Tsai 2009
17
Introducción
péptido más hidrofóbico y que tienda a agregarse y formar fibrillas. El A β 1 ‐ 40 es más frecuente y es
soluble en agua, mientras que el A β 1 ‐ 42, que sólo constituye un 10% del A β total en los animales
estudiados, es el componente mayoritario de las placas y es la forma más tóxica. Es de destacar que
se ha descrito que el A β 1 ‐ 42 puede interaccionar con proteínas priónicas celulares (PrP), y
desencadenar una vía de señalización que puede causar neuropatología (Laurén et al. 2009).
Eliminación del péptido β‐ amiloide
El A β puede ser degradado por diversos tipos de proteasas (revisado en De Strooper 2010):
La neprilisina es una zinc ‐ metaloproteasa endopeptidasa que se encuentra anclada a la membrana
plasmática, capaz de eliminar el A β insoluble asociado a la membrana, tanto en su forma
monomérica como oligomérica, reduciendo así la formación de placas (Marr y Hafez 2014). La
disminución de los niveles de neprilisina, que ocurre durante el envejecimiento (Farris et al. 2007)
genera un aumento de A β .
La enzima degradadora de insulina o IDE es una tiol metaloproteasa que reconoce sustratos
con estructura en hoja β ‐ plegada y aparece como una proteína soluble citosólica, aunque también
puede encontrarse tanto en la superficie celular como en membranas intracelulares. Es capaz de
degradar el A β , pero sólo en su forma monomérica.
Las enzimas convertidoras de endotelina (ECE1 y ECE2) actúan en compartimentos
subcelulares como los endosomas tardíos y los autolisosomas. Su mal funcionamiento conduce a un
aumento en los niveles de A β , aunque aún no está claro su mecanismo de acción (Pacheco ‐ Quinto y
Eckman 2013). La catepsina B , localizada en los lisosomas, parece estar implicada en la degradación
de formas monoméricas y fibrilares (Mueller ‐ Steiner et al. 2006; De Strooper 2010).
Por último, se ha implicado también a las células gliales (microglía y astroglía), que reducirían
los niveles de A β mediante fagocitosis y la secreción de enzimas proteolíticas (Lee y Landreth 2010).
El péptido A β no sólo puede eliminarse vía degradación enzimática por proteasas, sino que
puede ser transportado a través de la barrera hematoencefálica y ser absorbido por la sangre
mediante el receptor de LDL (LDLR); el drenaje perivascular junto con otros solutos del líquido
intersticial a lo largo de los capilares y arterias juega también un papel importante en la eliminación
del A β cuando el mecanismo vía LRP falla o cuando los niveles de neprilisina se reducen (ver revisión
Weller et al. 2008). Con la edad, los niveles de neprilisina, IDE y LDLR disminuyen, y el drenaje
perivascular falla por los cambios que acontecen en las paredes de los vasos sanguíneos, por lo que
se produce un incremento en la difusión de A β hacia los espacios extracelulares.
Agregación del β‐ amiloide
Los monómeros de A β (especialmente de la isoforma A β 1 ‐ 42), tienden a agregarse
secuencialmente en dímeros, trímeros, oligómeros y protofibrillas, a medida que se acumulan. Los
18 Introducción
oligómeros solubles , también llamados ADDLs ( Amyloid ‐β derived diffusible ligands) , son estructuras
no fibrilares, hidrosolubles y con propiedades neurotóxicas (Lambert et al. 1998). Una vez que las
estructuras prefibrilares superan los límites de solubilidad, se depositan en forma de fibrillas
amiloideas y placas seniles.
Se ha descrito que las placas, ante determinados cambios en el ambiente que las rodea,
pueden comportarse además como entes dinámicos liberadores de las formas oligoméricas solubles
tóxicas (Martins et al. 2008; Koffie et al. 2009).
Actualmente, está establecido que la carga de placas amiloides no se correlaciona bien con la
severidad de la patología, es decir, con el deterioro cognitivo del paciente. Sin embargo, se ha
descrito la existencia de formas tóxicas solubles y difusibles de A β oligomérico, capaces de difundir
por el parénquima cerebral, provocando pérdida sináptica y neuronal y conllevando a fallos
cognitivos severos, incluso podrían ser causantes de los daños más tempranos de la AD (Haass y
Selkoe 2007; Viola y Klein 2015). Los agregados extracelulares insolubles amiloides parecen estar
rodeados por un gran número de oligómeros más pequeños y difusibles (Martins et al. 2008), por lo
que ambos tipos de amiloide podrían estar implicados en los daños neuronales y las disfunciones
sinápticas.
Existen varios tipos de A β oligomérico soluble, como las protofibrillas, que son formas
intermedias que pueden polimerizar a fibras o despolimerizarse a oligómeros más pequeños, con
estructura de lámina β
plegada (Walsh et al. 1997); las estructuras anulares, con forma de anillo,
distinguibles de los anteriores sólo a microscopía electrónica de alta resolución (Lambert et al. 1998);
y los ligandos difusibles derivados del A β (ADDLs), que son hexámeros, octámeros y dodecámeros
(Lambert et al. 1998); los cuales han sido obtenidos de pacientes de AD en muestras post mortem y
cuyos niveles se correlacionan bien con los fallos cognitivos.
Estas formas oligoméricas solubles de A β pueden inhibir el mantenimiento de la LTP en el
hipocampo e interferir en la señalización de los receptores NMDA o AMPA en la membrana sináptica
provocando internalización de los receptores NMDA mediante endocitosis (Haass y Selkoe 2007;
Viola y Klein 2015). Además, pueden inducir cambios en la membrana neuronal y glial, conllevando a
la alteración de las vías de señalización, perturbación de la homeostasis del calcio, producción de
especies reactivas de oxígeno, provocar cascadas inflamatorias y disfunciones mitocondriales.
1.3.4. La hipótesis clásica de la cascada amiloide y nuevas posturas
La teoría de la cascada amiloide clásica (Hardy y Allsop 1991; Hardy y Higgins 1992) propone
que el depósito del péptido β ‐ amiloide es el evento inicial en la AD y el que desencadena la
patología, provocando la formación de los ovillos neurofibrilares, la muerte celular, y finalmente, la
demencia (Fig. 1.8). Sin embargo, existen pacientes que aunque no tienen deterioro cognitivo,
presentan una gran acumulación de placas amiloides (Perez ‐ Nievas et al. 2013). Además, la aparición
tanto de placas seniles como de los ovillos se produce en momentos y áreas cerebrales diferentes.
Los ovillos aparecen antes en la corteza entorrinal y el hipocampo que en el resto de zonas afectadas,
19
Introducción
mientras que en otras regiones aparecen en primer lugar los depósitos de A β , lo que podría indicar
que se desarrollan de forma independiente (Armstrong 2006).
Según la hipótesis de la cascada amiloide (Fig. 1.8), determinados cambios en el metabolismo
del A β incrementarían los niveles de A β 1 ‐ 42 (por sobreproducción y/o fallo en la eliminación), que
tiende a oligomerizarse. Dichos oligómeros tienen capacidad de difusión y actividad cito ‐ y
sinaptotóxica, por lo que se producen alteraciones sinápticas y celulares. Conforme se van formando
las primeras fibrillas de péptido β ‐ amiloide se daría la aparición de neuritas distróficas. Ante estos
estímulos, se activa una respuesta neuroinflamatoria mediada principalmente por astroglía y
microglía. Además, la actividad de determinadas quinasas (por ejemplo GSK3 ‐β ; (Krafft y Klein 2010))
también se ve afectada por el A β , siendo una de las consecuencias la hiperfosforilación de la proteína
tau provocando, por un lado, su acumulación en NFTs y por otro, fallos en el transporte axonal,
también responsable de la patología neurítica y disfunción sináptica. Por último, la cascada finalizaría
con la muerte neuronal y un estado progresivo de demencia (revisado en Haass y Selkoe 2007).
Figura 1.8. Hipótesis de la cascada amiloide. La acumulación gradual de A β en el cerebro, ya sea en la
enfermedad de Alzheimer de tipo familiar o de tipo esporádico, desencadena una serie de eventos
patológicos conocidos como la cascada amiloide . Las placas amiloides y los oligómeros de A β provocan
alteraciones que llevan a la activación de la respuesta inflamatoria, a la formación de ovillos
neurofibrilares y a una pérdida sináptica y neuronal, lo cual causa deterioro cognitivo progresivo.
Modificado de Blennow et al. 2010.
20 Introducción
Actualmente, la hipótesis original, que concedía un papel central al efecto de la deposición
extracelular, ha sido revisada otorgándole mayor importancia al rol que juegan estos oligómeros
tóxicos. Por último, el descubrimiento de la presencia de estas formas oligoméricas asociadas a la
periferia de los depósitos extracelulares, y del carácter dinámico de las placas (Martins et al. 2008;
Koffie et al. 2009), está promoviendo la reconsideración de las formas fibrilares como
reservorio/fuente de oligómeros tóxicos al medio, dando pie a la reconciliación entre la hipótesis
clásica y la oligomérica.
1.4. NEURODEGENERACIÓN: PATOLOGÍA NEURÍTICA,
PÉRDIDA NEURONAL Y SINÁPTICA
1.4.1. Patología neurítica
Las neuritas distróficas, definidas como prolongaciones neuronales engrosadas o irregulares,
consecuencia de una alteración del citoesqueleto y fallo en el transporte, son una de las principales
lesiones neurodegenerativas encontradas en los cerebros de pacientes de la enfermedad de
Alzheimer, y se las ha correlacionado con la demencia característica de este proceso
neurodegenerativo. En humanos se ha descrito ampliamente como las neuritas distróficas están
clásicamente asociadas a las denominadas placas compactas (Geddes et al. 1986; Masliah et al.
1991; Su et al. 1993; Dickson et al. 1999). Estas distrofias rodean las placas neuríticas. Los estudios de
inmunotinción y ultraestructurales sugieren que la mayor parte de las distrofias son de origen axonal
ya que se tiñen con neurofilamentos pero no con MAP2, y contienen marcadores sinápticas. Además,
datos de nuestro grupo han revelado la naturaleza presináptica de muchas de estas distrofias
(Sanchez ‐ Varo et al. 2012).
En concreto, la aparición de distrofias axonales ha sido extensamente descrita en el hipocampo
y la corteza entorrinal de pacientes de AD, tanto en estadios tempranos como tardíos (Su et al. 1993;
Dickson et al. 1999; Dickson y Vickers 2001; Bell y Claudio Cuello 2006). Estos procesos alterados han
mostrado ser inmunopositivos para un gran abanico de marcadores relacionados con todo tipo de
funciones neuronales (proteínas sinápticas, citoesqueléticas, APP, ubiquitina, y un largo etcétera)
(Cras et al. 1991; Dickson et al. 1999).
Del mismo modo, la presencia de estas neuritas distróficas también ha sido observada en
muchísimos modelos de la AD (Boutajangout et al. 2004; Delatour et al. 2004; Adalbert et al. 2009;
Dawson et al. 2010) incluyendo el modelo APP/PS1 empleado en este trabajo (Blanchard et al. 2003;
Ramos et al. 2006; Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Baglietto ‐ Vargas et al. 2010; Sanchez ‐ Varo et al.
2012; Torres et al. 2012; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014).
Además, estudios a nivel ultraestructural en muestras de pacientes de AD han demostrado la
existencia de grandes acúmulos de vesículas de naturaleza autofágica (vía endocítica ‐ autofágica ‐
lisosomal) a nivel de estas neuritas distróficas, fenómeno que ha sido igualmente observado en
21
Introducción
algunos modelos animales (Nixon 2007; Nixon y Yang 2011; Sanchez ‐ Varo et al. 2012; Torres et al.
2012; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014). Todo ello apunta a la disfunción en estos sistemas como un evento
contribuyente a esta patología.
Sin embargo, el mecanismo de formación de estas distrofias así como su relación con los
depósitos extracelulares de A β no han sido esclarecidos aún. De este modo, existen autores que
consideran su aparición previa a la de las placas (Gouras et al. 2005; Stokin 2005; Fiala 2007),
mientras que otros datos apuntan hacia el orden cronológico inverso (Geddes et al. 1986; Meyer ‐
Luehmann et al. 2008).
1.4.2.Pérdida neuronal y sináptica
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la pérdida de neuronas y sinapsis en la
corteza cerebral y en ciertas regiones subcorticales. Existe una importante disminución del número
de neuronas, que afecta principalmente al área CA1 del hipocampo (Price et al. 2001; Hof et al. 2003)
y a la capa II de la corteza entorrinal (Gomez ‐ Isla et al. 1996; Kordower et al. 2001; Price et al. 2001;
Hof et al. 2003). El lóbulo temporal es especialmente susceptible a la AD, mientras que las áreas
motoras y sensoriales permanecen sin daños (Thompson et al. 2003). Otras regiones donde se ha
establecido pérdida neuronal son el bulbo olfatorio y el núcleo olfatorio anterior, la amígdala, el
núcleo basal de Meynert (grupo colinérgico que inerva el hipocampo, la amígdala y la neocorteza), la
parte medial de la sustancia negra, la parte rostral del locus cerúleo (grupo noradrenérgico que
conecta con la corteza entorrinal y el hipocampo), y el núcleo del rafe serotoninérgico (ver revisiones
Mufson et al. 2003; Heneka y O’Banion 2007; Duyckaerts et al. 2009; Castellani et al. 2010). La causa
de esta muerte neuronal selectiva es materia aún de controversia. La formación de ovillos
neurofibrilares intracelulares ha sido asociada con la pérdida neuronal, al igual que la toxicidad del
A β (ver revisión Duyckaerts et al. 2009; Spires ‐ Jones y Hyman 2014).
Los modelos animales transgénicos para la enfermedad de Alzheimer recapitulan algunas de
las características histopatológicas observadas en los pacientes, pero no todas, ya que la mayoría de
estos modelos presentan escasa muerte neuronal (ver revisiones Philipson et al. 2010; Ashe y Zahs
2010; Perl 2010). Sin embargo, sí que se ha encontrado pérdida neuronal en los modelos murinos
empleados en este estudio (descrito en apartado 1.6. de modelos murinos transgénicos). Por otro
lado, la pérdida de estos tipos neuronales en los animales transgénicos coincide con la
neurodegeneración que se produce en los pacientes de AD.
La pérdida de los terminales sinápticos en la enfermedad de Alzheimer se correlaciona mejor
con los déficits cognitivos que con la carga de β
‐ amiloide extracelular o la pérdida neuronal,
especialmente en las fases iniciales de la patología (Arendt 2009; Bayer y Wirths 2010; Palop y Mucke
2010). Los análisis neuropatológicos han confirmado una pérdida de inmunorreactividad de
sinaptofisina en los terminales sinápticos en la capa molecular externa del giro dentado y en la
corteza frontal de pacientes de Alzheimer. De todas las áreas analizadas, el hipocampo parece ser la
22 Introducción
más afectada por la pérdida de proteínas sinápticas mientras que la corteza occipital es la menos
vulnerable. Es de destacar que la reducción en las proteínas de las vesículas sinápticas en la EA se
relaciona con los primeros síntomas clínicos de demencia (Terry et al. 1991; Dickson et al. 1995;
Masliah et al. 2001; Chang et al. 2013). La patología sináptica en los pacientes de Alzheimer se refleja
en una pérdida de los principales componentes de las vesículas sinápticas que alojan a los
neurotransmisores, junto con la disminución de componentes moleculares de compartimentos pre ‐ y
post ‐ sinápticos y grandes cambios patológicos de la sinapsis (ver revisión Arendt 2009). Estas
alteraciones de la maquinaria sináptica también han sido descrita en distintos modelos de la
enfermedad (Rutten et al. 2005; Sanchez ‐ Varo 2011; Mitew et al. 2013).
Se ha demostrado que el A β oligomérico está involucrado en la reducción de la densidad de
espinas dendríticas en pacientes y en modelos transgénicos (Moolman et al. 2004; Jacobsen et al.
2006), así como en la pérdida y disfunción sináptica en general tanto in vivo como in vitro (Shankar
et al. 2007; Shankar y Walsh 2009; Viola y Klein 2015).
1.5. RESPUESTA NEUROINFLAMATORIA
En la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la AD, se produce una
reacción neuroinflamatoria mediada principalmente por componentes de la respuesta inmune
innata, en la que participan la microglía (macrófagos del cerebro) y la astroglía (Latta et al. 2014;
Heneka et al. 2014, 2015a, 2015b; Heppner et al. 2015). La respuesta inmune adaptativa y la
infiltración de linfocitos T se da en menor grado en la enfermedad de Alzheimer. Cuando el agente
desencadenante es un patógeno o una célula dañada, esta respuesta inflamatoria es necesaria para
la supervivencia del organismo; pero cuando se produce de manera aberrante o crónica, puede llegar
a causar graves daños. Sin embargo, los tipos celulares y moléculas que intervienen en la inflamación
tienen otras funciones fuera de esta respuesta, variando el sentido de moléculas pro ‐ y anti ‐
inflamatorias (Rubio ‐ Perez y Morillas ‐ Ruiz 2012; Zhang y Jiang 2015). Estudios genéticos, realizados
en miles de pacientes (GWAS), han demostrado una clara asociación entre la AD y mutaciones en
genes directamente implicados en la respuesta inmune (Karch et al. 2014). Dentro de los genes
candidatos, y aparte del locus de APOE, estos estudios han identificado mutaciones en TREM2, CD33
y HLA (ver revisión Lambert et al. 2013). Tanto TREM2 como CD33 están implicados en la activación
y/o internalización microglial del Abeta (Bradshaw et al. 2013; Guerreiro et al. 2013; Lue et al. 2014;
Griciuc et al. 2013; Hickman y El Khoury 2014) por lo que su alteración podría suponer una
disminución en la capacidad de fagocitosis de este péptido. Sin embargo, el papel que desempeña la
activación microglial en el desarrollo de la patología no es conocido (Streit et al. 2014). Queda por
determinar si la neuroinflamación es una consecuencia secundaria al proceso patológico que ocurre
en la AD, o es una de las causas que podrían provocar su aparición y desarrollo.
23
Introducción
1.5.1.Microglía
El SNC presenta su propio sistema inmune, formado por células inmunocompetentes propias
denominadas células microgliales o microglía. Son células de soporte y protección de las neuronas y
constituyen, aproximadamente, un 10% de las células del SNC. La microglía un importante papel en
el cerebro no solo en proteger de los posibles patógenos sino que también interviene en el
mantenimiento de los circuitos neuronales, contribuyendo a la protección y remodelación de las
sinpasis. Una vez que son activadas por eventos patológicos, como el daño neuronal o agregados
proteicos, la microglía es capaz de migrar hacia la zona dañada e iniciar una respuesta inmune. En la
AD, las células microgliales son capaces de unirse a las formas solubles oligoméricas de A β así como a
las fibras amiloides a través de receptores de membrana como SCARA1, CD36, CD14, α 6 β integrina,
CD57, y TLRs (del inglés t oll ‐ like receptors ). Se piensa que este proceso forma parte de la reacción
inflamatoria que tiene lugar en la AD. Una vez que el A β se ha unido a las células microgliales a través
de estos receptores, comienza una reacción en cadena que comienza con la producción de factores
proinflamatorios como citoquinas y quimiocinas (ver revisiones Zhang y Jiang 2015; Cai et al. 2015;
Heppner et al. 2015; Heneka et al. 2015a, 2015b)
Eliminación del A β
En respuesta a esta unión receptor ‐ ligando, la microglía comienza el proceso de fagocitosis
en un intento de eliminar las fibras de A β (Lee y Landreth 2010; Doens y Fernández 2014; Tang y Le
2015). Las fibras de A β entrarían al interior celular por la ruta endolisosomal, sin embargo, son
resistentes a la degradación enzimática. El péptido A β soluble sí que puede degradarse mediante
proteasas extracelulares, como la neprilisina o la enzima degradadora de insulina (IDE) (ver revsión
De Strooper 2010), que son las más importantes. En la AD, que se acumula una gran cantidad de
placas seniles, capacidad microglial fagocítica es insuficiente, por lo que se piensa que la disminución
en la expresión de receptores de fagocitosis provoca el incremento en la concentración de
citoquinas. De hecho, en apoyo a esta hipótesis se han identificado varias mutaciones con pérdida de
función en TREM2, receptor de la microglía implicado en la fagocitosis, como factor de riesgo de la
AD (Guerreiro et al. 2013; revisiones Hickman y El Khoury 2014; Lue et al. 2014). De la misma
manera, mutaciones en el receptor de superficie de la microglía CD33 provoca una reducción en los
procesos fagocíticos así como un incremento en la acumulación de A β (Griciuc et al. 2013; Bradshaw
et al. 2013; ver revisón Heppner et al. 2015).
Activación microglial
Las células de la microglía se activan rápidamente ante cualquier daño y pueden
diferenciarse a distintos fenotipos, un fenotipo alternativo (M2), inducido por diferentes mediadores,
como IL ‐ 4 e IL ‐ 13 y caracterizado por las funciones de fagocitosis y por la producción de citoquinas
con capacidad neuroprotectora; y un fenotipo clásico (M1), caracterizado por la producción de
24 Introducción
citoquinas inflamatorias (IL1 β , TNF α ) y especies reactivas de oxígeno (revisado en Mosher y Wyss ‐
Coray 2014; Li et al. 2014; Cai et al. 2015). A día de hoy existen dudas sobre si la microglía adopta
estrictamente un solo fenotipo, y sobre los factores que hacen que la microglía cambie de un
fenotipo a otro (Gomez ‐ Nicola y Perry 2014).
Activación microglial clásica o proinflamatoria (M1)
Las células microgliales activadas clásicamente, en respuesta a la secreción de las citoquinas
IFN γ TNF α producen una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno, óxido
nítrico (NO) y citoquinas y quimiocinas proinflamatorias (TNF α , IL1 β , IL6, IL12, IFN γ , FASL, TRAIL y
CH3L1 (Varnum y Ikezu 2012). La finalidad de esta respuesta es el mantenimiento de una inflamación
proinflamatoria tóxica para acabar con el agente patógeno causante de la activación. Sin embargo, el
mantenimiento prolongado en el tiempo de esta respuesta puede provocar citotoxicidad neuronal y
crear un círculo vicioso en el que implicarían distintas células del sistema inmune innato,
potenciando la respuesta clásica proinflamatoria (ver revisiones Cherry et al. 2014; Tang y Le 2015).
Activación microglial alternativa o antiinflamatoria (M2)
La respuesta alternativa inhibe la activación clásica y promueve la reparación del tejido y la
recuperación de la homeostasis, mediante la liberación de moléculas antiinflamatorias y factores de
crecimiento (Imai et al. 2007; Chhor et al. 2013). Según los mediadores responsables de su activación
y los marcadores característicos que expresan las células microgliales, el fenotipo M2 se clasifica a su
vez en tres subtipos (ver revisiones Colton et al. 2006; Cherry et al. 2014; Latta et al. 2014; Tang y Le
2015) (ver figura representativa 1.9).
25
Introducción
‐ M2a: se induce por IL4 e IL13 a través de los receptores TLR, generando un aumento en la expresión
de marcadores como Arg ‐ 1 (Arginasa ‐ 1, enzima hidrolasa que participa en el ciclo de la urea,
extinguiendo el sustrato de la enzima NOS e inhibiendo así la producción de NO), IGF ‐ 1 ( Insulin
growth factor ‐ 1 ), IL ‐ 4, IL ‐ 13 y MRC ‐ 1 ( Mannose receptor ‐ 1 ) entre otros. Todos estos marcadores
evitan que se genere una respuesta inflamatoria y mantienen un entorno neuroprotector. Este
fenotipo además se caracteriza por presentar capacidad fagocítica, necesaria para la eliminación del
patógeno y de los restos celulares que hayan quedado como resultado de una respuesta inflamatoria
citotóxica. Algunos de los receptores implicados en la fagocitosis son MSR ‐ 1 ( macrophage scavenger
receptor 1 ), SiRP β 1 ( Signal Regulatory Protein β‐ 1 ) y CD36.
‐ M2b: la activación de este fenotipo es dependiente del inmuno ‐ complejo, los TLRs y/o el receptor
IL1R (revisado por Boche et al., 2013). Se caracteriza por la falta de expresión de marcadores típicos
M2, aunque presentan una expresión alta de IL10 y baja de IL12, característico de una polarización
M2. Este fenotipo, además, se ha relacionado con la activación de linfocitos Th2.
‐ M2c: esta activación se produce en respuesta a IL10 y TGF β , dos potentes citoquinas
antiinflamatorias. La actividad de estas células se asocia a una función remodeladora y reguladora de
la respuesta inmune, que se pone en marcha una vez que las células polarizadas a M1 han hecho su
función. TGF β además se ha asociado a una mayor capacidad fagocítica de la microglía. A pesar de
estar dividido en tres grupos, el fenotipo M2 tiene una función conjunta que es neutralizar al agente
causante de la lesión sin dañar al tejido cerebral.
En humanos y en animales transgénicos de la AD se ha observado la existencia de distintos
tipos de activación microglial, pudiendo ocurrir un cambio durante la progresión de la enfermedad
(Hanisch y Kettenmann 2007; Jimenez et al. 2008). En este sentido, nuestro grupo de investigación ha
descrito la existencia de un cambio, dependiente de la edad, del fenotipo microglial en el hipocampo
del modelo APP/PS1, de modo que a edades tempranas, los depósitos amiloides inducen una
activación microglial alternativa, antiinflamatoria, con función, posiblemente, neuroprotectora; y a
edades avanzadas, la microglía que no está asociada a las placas, se activa de forma clásica,
expresando factores citotóxicos como el TNF α (Jimenez et al. 2008). La activación clásica es
coincidente en el tiempo con la neurodegeneración de las neuronas piramidales en el hipocampo de
este modelo animal. Es de destacar que en la corteza entorrinal de este modelo transgénico, la
respuesta inflamatoria es de naturaleza citotóxica a edades tempranas (6 meses de edad) y que
coincide también con la muerte de las neuronas principales en esta región cortical (Moreno ‐ Gonzalez
et al. 2009). El hecho de que a una misma edad cronológica la respuesta inflamatoria tenga un perfil
totalmente distinto en dos de las regiones cerebrales más afectadas por la patología amiloide
(neuroprotectora en el hipocampo y citotóxica en la corteza entorrinal) podría ser la base de los
Figura 1.9. Diferentes fenotipos de activación de la microglía. La microglía puede variar su estado fenotípico
de activación (clásico o alternativo) en función del tipo de respuesta neuroinflamatoria que se necesite. IgG:
Inmunoglobulina G, IL: Interleucina, TNF α : factor de necrosis tumoral alfa, IFN γ : interferón ‐ gamma, ROS:
especies reactivas de oxígeno. Modificado de Latta et al. 2014.
26 Introducción
datos contradictorios obtenidos con el tratamiento con fármacos antiinflamatorios en pacientes de
Alzheimer (Meinert et al. 2009; Breitner et al. 2011; Jaturapatporn et al. 2012). Sin embargo,
actualmente existe información contradictoria sobre el balance entre los procesos pro y
antiinflamatorios que se producen en los enfermos de Alzheimer o acerca de la inducción celular y
temporal de la cascada inflamatoria producida por el péptido A β .
1.5.2. Células mieloides del sistema inmune cerebral
El SNC presenta una gran cantidad de componentes inmunológicos a parte de las células
microgliales derivados de células mieloides, como los macrófagos de las meninges y del plexo
coroideo así como los macrófagos y monocitos perivasculares (ver revisiones Ransohoff y Cardona
2010; Heneka et al. 2015b; Walker y Lue 2015; Greter et al. 2015; Heppner et al. 2015).
Recientemente, se ha descrito que los macrófagos perivasculares presentan también un papel
importante en la eliminación del péptido de A β para proteger de la patología amiloide (Butovsky
et al. 2014; Jay et al. 2015) . Los macrófagos perivasculares, al contrario que la microglía, en la edad
adulta éstos se están continuamente renovando a partir del pool de monocitos circundantes. Son
muchos los estudios que han demostrado que estas células mieloides perivasculares son capaces de
activarse y promover la fagocitosis de las placas limitando la acumulación de Abeta alrededor de los
vasos (revisado en Heppner et al. 2015). Por lo tanto, en la actualidad se piensa que los macrófagos
infiltrados, derivados de monocitos perivasculares, podrían también contribuir y modular la patología
de Alzheimer.
27
Introducción
Diferenciar la microglía según su morfología o fenotipo del resto de poblaciones de células
mieloides es complicado debido a un origen común, por lo que la mayoría de marcadores
comúnmente empleados en el estudio de la respuesta inflamatoria son expresados tanto por células
microgliales como por monocitos/macrófagos periféricos. Sin embargo recientemente, el
transcriptoma y los análisis de epigenética han identificado determinados genes que son expresados
y regulados por las poblaciones de macrófagos, y viceversa (ver figura 1.10) (Hickman et al. 2013;
Butovsky et al. 2014; Greter et al. 2015).
1.5.3. Astroglía
Otro tipo celular implicado en los procesos neuroinflamatorios es la astroglía, células gliales
del SNC que se caracterizan por expresar la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), vimentina y nestina
(revisado en Sofroniew y Vinters 2010; Verkhratsky et al. 2014; Phillips et al. 2014; Heppner et al.
2015). Entre sus funciones principales se encuentran proporcionar soporte metabólico a las neuronas
y participar en el mantenimiento y desarrollo de las sinapsis. También intervienen en la reparación
del tejido nervioso dañado cuando se produce una lesión, aislándola, y cooperando con la microglía.
Además, los astrocitos rodean a los capilares sanguíneos en el cerebro, regulando las propiedades de
la barrera hematoencefálica, y conformando la lámina glial que se interpone entre las meninges y el
tejido nervioso (Sofroniew y Vinters 2010).
La activación de los astrocitos también es característica de la AD (Phillips et al. 2014; Heneka
et al. 2014; Heppner et al. 2015; Heneka et al. 2015a, 2015b); se manifiesta desde los primeros
estadios de la enfermedad (Carter et al. 2012) y progresa significativamente a medida que lo hace la
patología amiloidea y tau. Sin embargo, la función de los astrocitos reactivos es, a día de hoy,
bastante desconocida. El término “reactivo” es insuficiente para definir si los astrocitos contribuyen a
la patología de la AD mediante ganancia o pérdida de función tóxica, o si, por el contrario son
protectores, o incluso tienen funciones diferentes en función del estado de la patología y/o de su
localización regional, o de la distancia de los astrocitos respecto a las placas de A β . Estudios
preclínicos en modelos transgénicos han demostrado resultados contradictorios. La
inhibición/depleción de alpha1 ACT (Mucke et al. 2000), calcineurina (Furman et al. 2012; Fernandez
et al. 2012), CD40L (Tan et al. 2002), o TNFalpha (Green y LaFerla 2008) revierten la formación de
placas y su toxicidad asociada, indicando que la activación de los astrocitos implica aumento de
toxicidad. Por el contrario, la supresión de la expresión de GFAP/vimentina, en vez de disminuir la
patología neuronal la incrementa, produciendo un aumento en el número de neuritas distróficas
alrededor de las placas. Estos últimos datos sugieren un papel neuroprotector.
Figura 1.10. Células mieloides del Sistema Nervioso Central y sus marcadores específicos en estado
quiescente y activado. Los macrófagos periféricos pueden distinguirse de la microglía por su fenotipo
CCR2 + /CD45 high (entre otros). La microglía a su vez, en estado quiescente presenta un fenotipo
CD45 lo /CX3CR1 hi /P2ry12 + . La microglía reactiva además, puede regular la expresión de estos marcadores y
presentar un fenotipo diferente, caracterizado por CD45 int /CX3CR1 hi /P2ry12 ‐ . Tomado de Greter et al. 2015.
28 Introducción
Los astrocitos están implicados en la eliminación del A β y forman una barrera protectora
entre los depósitos del péptido β ‐ amiloide y las neuronas. En la AD, la presencia de un gran número
de astrocitos asociados a las placas amiloides sugiere que el tejido dañado genera moléculas
quimiotácticas que median el reclutamiento de astrocitos, los cuales secretan moléculas pro ‐
inflamatorias al igual que la microglía (Morales et al. 2014). Por otro lado, los astrocitos también
pueden contribuir a la deposición extracelular del A β , ya que sobreexpresan BACE1 en respuesta a un
estrés crónico. Por lo tanto, aunque todavía no se ha puesto de manifiesto si la activación astroglial
contribuye a la generación de las placas o a su eliminación, sí que se ha demostrado que contribuyen
a la inflamación. Además, la astroglía expresa la enzima sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS), por
lo que consecuentemente, contribuye a la neurotoxicidad medida por el óxido nítrico (NO) (ver
revisión Heneka y O’Banion 2007).
Por otra parte, recientemente se ha sugerido que los astrocitos pueden desempeñar un
papel relevante en el denominado “sistema glinfático” (Nedergaard 2013), encargado de generar
flujos de líquido intersticial, proveniente del espacio perivascular, desde las ramas arteriales hasta las
ramas venosas. Este flujo “glinfático” estaría encargado de drenar el exceso de proteínas
extracelulares, como por ejemplo A β evitando su acumulación.
Por tanto, estas células gliales podrían adoptar un espectro de fenotipos funcionales
dependiendo del contexto patológico.
1.6. MODELOS TRANSGÉNICOS MURINOS DE LA
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
La búsqueda de un modelo apropiado para desentrañar los mecanismos y encontrar
tratamientos para la enfermedad de Alzheimer, ha llevado a los investigadores a trabajar con una
gran variedad de modelos animales (desde gusanos a osos polares). Así, se han generado modelos de
EA con invertebrados que presentan una vida media de dos meses, y hasta con grandes mamíferos
como primates no humanos con una vida media de 50 años en cautividad. Sin embargo, ha sido el
ratón el que ha proporcionado mayores hitos científicos en la AD.
Actualmente, no existe ningún modelo animal de la forma esporádica de la AD, que
representa más del 95% de los casos, por lo que una buena aproximación es el empleo de animales
transgénicos que porten las mutaciones encontradas en los pacientes de la forma familiar, ya que
ambos tipos de Alzheimer cursan con las mismas características neuropatológicas. Los más
empleados son los modelos transgénicos murinos, que comenzaron a generarse en 1990, y continúan
a día de hoy siendo esenciales en la investigación de esta enfermedad (ver revisiones Woodruff ‐ pak
2008; Lee y Han 2013; Webster et al. 2014; Bilkei ‐ Gorzo 2014). Estos modelos animales, permiten
estudiar la evolución de la enfermedad desde los estadios más tempranos, y conocer así los cambios
29
Introducción
neuropatológicos y los mecanismos celulares y moleculares que podrían desencadenar la
enfermedad.
En el caso de los humanos, basta una única mutación en el gen del APP o las PS para padecer
la enfermedad. Sin embargo, todavía no existe un modelo de ratón que albergue una única variante
genética ligada a la enfermedad de Alzheimer y que por sí sola desarrolle un déficit cognitivo
progresivo, placas, ovillos neurofibrilares y la pérdida neuronal característica de humanos. Aunque
no se disponga de un modelo completo de la AD, existen modelos de ratón muy valiosos como
herramienta para el estudio de su patogénesis (ver los más utilizados en la Tabla 1.1 ; ver revisiones
Duyckaerts et al. 2008; Kokjohn y Roher 2009; Morrissette et al. 2009; Elder et al. 2010; Bilkei ‐ Gorzo
2014; Webster et al. 2014).
1.6.1. Modelos monogénicos
Tras el descubrimiento de las mutaciones inductoras de la FAD, se generaron diversos
modelos basados en la sobreexpresión de transgenes con dichas mutaciones, y controlados por
distintos promotores. El primer modelo desarrollado para la AD fue PDAPP, basado en la expresión
del transgen APP humano que contenía la mutación Indiana (V717F). Independientemente, pero con
un enfoque similar, se generó después el modelo Tg2576 que sobreexpresaba un transgén APP
humano con la mutación swedish (K670N/M671L). Los modelos basados en mutaciones en APP
manifiestan la típica patología amiloide, con placas neuríticas, aunque su inicio es algo tardío, y no
suelen presentar muerte neuronal (Elder et al. 2010)
A su vez, existen varias líneas transgénicas que se basan en mutaciones en los genes de PS1
y PS2 Los ratones transgénicos para PS muestran notables elevaciones de A β 1 ‐ 42, y sin embargo, no
desarrollan placas. El por qué no está claro, pero podría relacionarse con los niveles generalmente
bajos de A β en comparación con las líneas de APP. También puede estar relacionado con las
propiedades de agregación diferentes del A β de ratón frente al de origen humano.
Por otro lado, para poder estudiar la relación de la enfermedad con los NFTs, ha sido necesario
desarrollar modelos murinos con el gen de la proteína tau humana mutada (paradójicamente no
existen mutaciones de tau asociadas con el desarrollo de AD, aunque sí con otras enfermedades
como la demencia frontotemporal y el Parkinson). Éstos sí desarrollan NFTs, pérdida de memoria y
fallos motores. Los modelos knock ‐ out para la proteína tau no presentan trastorno aparente (Van
Dam y De Deyn 2011).
1.6.2. Animales bigénicos y trigénicos
La generación de los modelos APP y PS1 también ha permitido la creación de las líneas de
dobles transgénicos o bigénicos APP/PS ; en estos casos, las mutaciones de las PS provocan que la
formación de placas sea más temprana y severa que en los modelos monogénicos APP (Elder et al.
2010). Por ejemplo, el modelo AP/PS (Borchelt et al. 1997) presenta la doble mutación APP sueca
30 Introducción
bajo el promotor de prión murino y la forma humana de la presenilina 1 mutada (hPS1 ‐ A246E). Este
modelo a los 9 meses presenta la misma cantidad de depósitos extracelulares que los animales que
portan sólo la mutación APP sueca a los 18 meses de edad.
En este apartado únicamente describiremos en profundidad los dos modelos bigénicos APP/PS
que se han empleado en este trabajo:
‐ APP 751S L /PS1 M146L : generado por Blanchard y col., en 2003, al cruzar los transgénicos PS1 (M146L,
bajo el promotor HMG ‐ CoA reductasa) con ratones APP (hAPP751 con la doble mutación Swedish
(K670N y M671L) y la mutación London (V717I) bajo el promotor Thy1) (Blanchard et al. 2003). Este
modelo animal se caracteriza por presentar un inicio bastante temprano de la aparición de depósitos
extracelulares (3 ‐ 4 meses) principalmente en hipocampo, corteza entorrinal y subículo (Ramos et al.
2006; Caballero et al. 2007; Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014), así como una
respuesta inflamatoria con astrogliosis y microgliosis desde los 4 ‐ 6 meses (Jimenez et al. 2008;
Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014). La patología neurítica ocurre a edades
tempranas (4 ‐ 6 meses) siendo principalmente de tipo axonal/presináptico (Sanchez ‐ Varo et al. 2012;
Trujillo ‐ Estrada et al. 2014, 2013) y está acompañada de la alteración de los sistemas de proteólisis
intracelular dependiente de lisosomas y del proteasoma (Torres et al. 2012). Aunque hasta la fecha
no se han encontrado NFTs en este modelo al menos hasta los 18 meses de edad), sí que presenta
tau hiperfosforilada desde los 4 meses de edad (Sanchez ‐ Varo et al. 2012; Torres et al. 2012; Trujillo ‐
Estrada et al. 2013, 2014). Las deficiencias cognitivas aparecen antes de los 9 meses de edad (Trujillo ‐
Estrada et al. 2013). A diferencia de la mayoría de los modelos, presenta una muerte neuronal
temprana y selectiva de interneuronas GABAérgicas desde los 4 ‐ 6 meses de edad (Ramos et al. 2006;
Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Baglietto ‐ Vargas et al. 2010; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014). Además,
también ocurre la muerte de neuronas piramidales a edades tempranas(Moreno ‐ Gonzalez et al.
2009; Trujillo ‐ Estrada et al. 2014), y en el caso del hipocampo a los 17 meses, en los últimos estadios
cuando hay una fuerte presencia de formas oligoméricas solubles (Jimenez et al. 2008, 2011).
‐ APP/PS1dE9: En este modelo (Jankowsky et al. 2004), l os depósitos extracelulares de A β aparecen a
partir de los 4 ‐ 6 meses de edad, aumentando progresivamente durante el envejecimiento, siendo
abundantes en el hipocampo y en la corteza a los 9 meses de edad, y aumentando hasta los 12
meses (Garcia ‐ Alloza et al. 2006). Este modelo también presenta astrogliosis y microgliosis desde
edades muy tempranas (4 ‐ 6 meses), especialmente alrededor de las placas (Ruan et al. 2009) así
como déficits cognitivos a los 12 meses de edad (Volianskis et al. 2010). Aunque no desarrolla ovillos
neurofibrilares intracelulares y la muerte neuronal es modesta, sí que presenta anormalidades
neuríticas (Garcia ‐ Alloza et al. 2010), pérdida de actividad neuronal localizada (Meyer ‐ Luehmann
et al. 2009) y déficits en la transmisión sináptica colinérgica y glutamatérgica (Minkeviciene et al.
2008; Machová et al. 2010).
Por último, con el objetivo de estudiar de poder estudiar de forma más profunda la relación
entre tau y las otras proteínas, se han desarrollado ratones dobles transgénicos APP/tau y triples
31
Introducción
APP/PS1/tau en los cuales las placas aparecen antes que los ovillos, apoyando la hipótesis de la
cascada amiloide (Oddo et al. 2003).
Tipo de
animal Línea Mutación Características
APP
PDAPP APP I Placas desde los 6 meses. Neuritas distróficas y pérdida
sináptica. Astrogliosis y microgliosis. No NFTs. No
pérdida neuronal.
Tg2576
APP695 S
( KM 670/671 NL )
Placas desde 9 ‐ 11 meses. Pérdida sináptica y de
memoria. No NFTs. No pérdida neuronal.
APP23 APP751 S
( KM 670/671 NL )
Placas desde los 6 meses. Neuritas distróficas,
hiperfosforilación de tau. Gliosis. Afectación aprendizaje
y memoria espacial. Muerte neuronal en hipocampo.
No NFTs.
C3 ‐ 3 APP S Sin placas amiloides
CRND8 APP SI Placas desde los 3 meses. Incremento de A β 42 /A β 40
APP Dutch hAPP751 D
Incremento de A β 42 /A β 40 . Angiopatía amiloide cerebral,
hemorragias; microgliosis y astrogliosis perivascular.
Neuritas distróficas. No NFTs.
hAPP695 hAPP695SL inducible Con la inhibición génica el tamaño de los depósitos
amiloides no se reduce.
SweDI hAPP SDI
Angiopatía amiloide cerebral a los 3 meses. Microgliosis
y astrogliosis. Niveles elevados de citoquinas
proinflamatorias. Fallos cognitivos tempranos.
APParc hAPParc En ratones viejos, depósitos congofílicos vasculares y
parenquimáticos. Las hembras presentan déficits en
aprendizaje y memoria espacial, y una acelerada
patología amiloide.
PS1
S9 PS1dE9 Incrementa la formación de placas
S8 ‐ 4 HuPS1 Sin depósitos extracelulares
N ‐ 5 hAPP A246E Sin depósitos extracelulares
PS1 KO Sin PS1 Inviable
ALZ27
Sobreexpresión de 4
repeticiones de tau
(4R)
Axonopatía. No NFTs
32 Introducción
Tipo de
animal Línea Mutación Características
TAU
8c Expresión de tau
humana
Tau en neuritas y sinapsis, no en somas
hTau TauKOx8c Muerte neuronal. Sin NFTs
P301L Tau P301L Sin muerte celular. NFTs de aparición temprana
P301S Tau P301S Fallos sináptico (3 meses) Microgliosis. Muerte celular.
NFTs a edades tempranas
V337M 4R V337M NFTs desde los 6 meses
rTg4510 4R P301L inducible NFTs y pérdida neuronal
DM ‐ hTau 2 ‐ 3 ‐ 4R Tau
K257T/P301S
NFTs desde los 6 meses
APP/PS
AP/PS C3 ‐ 3xN ‐ 5 APP S Y
HuPS1 A246E Depósitos extracelulares desde los 9 meses
PSAPP Tg2576 (695 S ) y PS1
(M146L)
Con placas desde los 6 meses de edad, en lugar de a los
9 meses como el Tg2576
APP/PS1 PS1 (M146L) y APP SL
Depósitos extracelulares desde los 3 ‐ 4 meses.
Patología neurítica. Gliosis. Muerte de neuronas
piramidales e interneuronas.
APP SL PS1 KI APP (751 SL ) y PS1 KI
(M233T/L235P)
Patología muy agresiva. Pérdida de neuronas en CA1 a
los 10 meses.
5xFAD
APP S , APP F , APP L ,
PS1 (M146L y L286V)
Niveles altos de A β 42 (1,5 meses). Placas extracelulares
(2 meses). Pérdida neuronal (9 meses)
PS1dE9/APP S PS1 ( Δ exón9) y APP
( KM 670/671 NL )
Depósitos extracelulares desde los 4 ‐ 6 meses. Gliosis.
Muerte neuronal.
APP/
TAU
TAPP Tg2576 x TauJNPL3 Placas desde 8,5 meses. NFTs.
APP S /tau VLW APPs x tau Placas desde los 9 meses. NFTs desde los 25 meses.
Muerte neuronal a los 16 meses.
APP/
PS1/
TAU
3xTg ‐ AD PS1 KI (M146L), APP S ,
tau (P301L)
NFTs desde los 9 meses. Placas desde los 6. A β
intracelular en neuronas piramidales de CA1. Disfunción
sináptica.
PS1/APP/tau PS1(M146L),
APP751 SL , hTau (3R)
Acumulación somatodendrítica de tau. Depósitos
extracelulares a los 2,5 meses. Axones distróficos. No
NFTs.
33
Introducción
Tabla 1.1 Modelos murinos transgénicos para el estudio de la enfermedad de Alzheimer (modelos empleados
para este estudio destacados en negrita). AD: Alzheimer´s disease, D: mutación Dutch, hAPP: APP humano, I:
Mutación Indiana, INs: interneuronas, KI: Knock in, KO: Knock out, NFT: ovillos neurofibrilar intracelular, S:
Mutación Swedish, SL: mutaciones Swedish y London, SDI: Swedish, Dutch e Iowa, SFL: Swedish, Florida y
London, 4R: isoforma de tau con 4 repeticiones.
1.7. FORMACIÓN HIPOCAMPAL
La formación hipocampal consta de las áreas CA1, CA2, CA3 y CA4 (del latín Cornu Ammonis )
del hipocampo propio, el giro dentado (GD) y el subículo, todos los cuales constituyen la alocorteza o
arquicorteza de Brodmann. Estas regiones están altamente interconectadas y se diferencian del giro
parahipocampal en que sólo poseen 3 láminas (Witter et al. 2000). El subículo de la formación
hipocampal es el área de transición entre el hipocampo y la corteza entorrinal.
El giro dentado y el hipocampo propio están constituidos por tres capas, lo que es
característico de la arquicorteza. La capa externa del GD se llama capa molecular y contiene axones
aferentes y dendritas de las células intrínsecas de cada estructura. En el hipocampo propiamente
dicho esta capa ha sido tradicionalmente dividida en dos estratos, el stratum radiatum y stratum
lacunosum ‐ moleculare . La capa media, denominada capa granular en el giro dentado y capa
piramidal en el hipocampo, contiene las neuronas principales de cada estructura. La capa interna,
denominada capa multiforme, posee los axones de las células piramidales y granulares, neuronas
intrínsecas y muchos elementos de glía. Esta capa también recibe el nombre de stratum oriens en el
hipocampo y de hilio en el giro dentado. La parte más interna del hipocampo es una capa de axones
mielínicos que surgen de los cuerpos celulares situados en el subículo y en el hipocampo. Esta capa,
llamada alveus , se continúa con la fimbria del hipocampo, que a su vez se convierte en el fórnix. El
fórnix es la principal vía de conexión entre el hipocampo y otras estructuras cerebrales (revisado en
Per Andersen, 2007; van Strien et al. 2009).
El hipocampo propio puede dividirse en cuatro regiones a partir de diversos criterios
citoarquitectónicos. Estas áreas se designan como CA1 a CA4 (de acuerdo con Lorente de Nó, 1934) .
El área CA1 se localiza en el límite entre el subículo y el hipocampo. Las áreas CA2 y CA3 están
situadas dentro del hipocampo. El área CA4 se encuentra en la unión del hipocampo con la
circunvolución dentada, pero dentro del hilio de esta última y es prácticamente indistinguible en la
formación hipocampal del ratón.
A partir de ahora, denominaremos como hipocampo al conjunto formado por el hipocampo
propio y el giro dentado.
El subículo se encuentra entre el área CA1 del hipocampo propio y la corteza entorrinal, y al
igual que el hipocampo, presenta una organización en tres capas (Witter y Amaral 2004): capa
polimórfica (la más interna, donde se encuentran las dendritas basales de las neuronas piramidales;
34 Introducción
capa de células piramidales (donde se encuentran los somas de las neuronas piramidales o
principales, con un empaquetamiento menor que el estrato piramidal del hipocampo propio); y capa
molecular (la más externa del subículo, donde se encuentran las dendritas apicales de las células
piramidales).
1.7. 1. Conexiones del hipocampo
Conexiones intrínsecas del hipocampo : La corteza entorrinal (CE) constituye la mayor inervación
cortical del hipocampo, y lo hace mayoritariamente a través de dos vías, descritas por Cajal
(1901,1911): una que discurre a través del alveus (vía alvear), predominante a niveles septales y que
es la principal ruta por la que las fibras de la CE alcanzan su blanco en CA1. Estas fibras se desvían
bruscamente en el alveus , perforan la capa de células piramidales y finalmente terminan en el slm de
CA1 y CA3. Sin embargo, el principal flujo de información a través del hipocampo se produce
mediante el llamado circuito trisináptico, que comienza con la proyección desde la CE al hipocampo
propio y principalmente al giro dentado (vía perforante; Witter et al. 2000; Witter y Amaral 2004;
Ahmed y Mehta 2009). De forma breve podemos decir que desde el GD pasa a CA3 y de aquí a CA1
(revisado en Amaral y Witter 1989; van Strien et al. 2009). El circuito finaliza con la proyección desde
CA1 a la CE, bien directamente o a través del subiculum .
Continuando con el circuito desde el GD, los axones de las células granulares, las fibras
musgosas ( mossy fibers ), forman haces colaterales en el hilo y a continuación penetran en CA3,
donde establecen sinapsis en passant en las dendritas proximales de las células piramidales. La
región de CA3 localizada justamente superior a la capa piramidal, donde se encuentran las fibras
musgosas provenientes del hilio, recibe el nombre de stratum lucidum (sl). Además, las células del
hilio dan lugar al menos a dos sistemas de conexiones de asociación que terminan en el giro dentado.
Las células piramidales de CA3 poseen axones altamente colateralizados que por un lado
constituyen proyecciones de asociación que terminan en CA3 (haz longitudinal de asociación), y por
otro dan lugar a la mayor proyección hacia CA1, el haz colateral de Schaffer. Las células piramidales
de CA1 más cercanas a CA3 reciben información de un subconjunto de células CA3 cercanas a CA2.
Por el contrario, las células de CA1 más cercanas al subículo reciben inputs de las células de CA3 más
cercanas al GD. Así, aunque en un principio el circuito ha sido descrito como una secuencia simple de
conexiones excitadoras de una región a la siguiente formando un circuito cerrado, en realidad existen
varios circuitos solapados (por ejemplo, de CE a CA3, de modo que todo se vuelve mucho más
complejo) (revisado en van Strien et al. 2009).
35
Introducción
Aferencias del hipocampo : El hipocampo no recibe información directa desde la corteza sensitiva
primaria, sino indirectamente desde las cortezas asociativas. Además, al hipocampo llega
información desde regiones asociadas con la atención, la emoción y la memoria por lo que se le
considera como un área cerebral implicada en la integración de la información sensorial, de
asociación y que participa en diferentes tipos de memoria. Así, las principales aferencias a la
formación hipocampal proceden de la CE (como ya hemos comentado, a través de la vía perforante,
detallado en (van Groen et al. 2002; Witter et al. 2000; van Strien et al. 2009) y de otras estructuras
límbicas como la región septal y la amígdala (ver Fig. 1.12). Más concretamente, el hipocampo recibe
aferencias colinérgicas desde el encéfalo basal anterior, que provienen del septum y del núcleo
vertical de la banda diagonal de Broca (Schäfer et al. 1998). Una de las principales funciones de esta
proyección es la regulación de la actividad hipocampal, concretamente de la generación y
mantenimiento de los ritmos theta, y desempeña un papel importante en los procesos de memoria y
aprendizaje (Dutar y Bassant 1995).
Por otro lado, el hipocampo recibe inervación desde varios núcleos del tronco cerebral que
también se encuentran afectados en la AD, e igualmente ocurre con la amígdala (Pitkänen et al.
2000), que con sus aferencias participa en la correcta estructuración de los comportamientos más
adecuados en función de la información sensorial disponible. Además, el hipocampo también recibe
CE
Par a
Pr e
Sub
CA 1
CA 2
CA 3
GD
Fimbria
Haz angul ar
Col a teral de
S c h a ffe r Fi bras
m u sg osas
I- III
IV- V I
Vía
pe r f ora n t e
CE
Para
Pre
Sub
CA 1
CA 2
CA 3
GD
Fimbria
Haz angul ar
Colateral de
Scha ffer Fibras
musgosas
I-III
IV-VI
Vía
perforant e
Figura 1.11. Esquema de las conexiones del circuito trisináptico. Las neuronas de la capa II de la CE proyectan
hacia el GD y CA3 a través de la vía perforante. Las neuronas de capa III de la CE proyectan hacia CA1 y el
subículo a través de la vía perforante y alvear. Las célula s granulares del GD contactan con CA3 a través de las
proyecciones de las fibras musgosas. Las neuronas piramidales de CA3 viajan a CA1 a través de las colaterales
de Schaffer. Las células piramidales de CA1 proyectan hacia el subículo. Tanto CA1 como el subículo proyectan
hacia las capas profundas de la CE a través del haz angular . CE: corteza entorrinal; números romanos: capas de
la CE; CA1, CA2, CA3: regiones del hipocampo propio; GD: giro dentado; Sub: subículo; Para: parasubículo; Pre:
p
resubículo. Modificado de Andersen 2007 .
36 Introducción
proyecciones catecolaminérgicas, como por ejemplo, terminales noradrenérgicos provenientes del
locus ceruleus . La afectación de estas vías en los pacientes de AD está bien documentada (ver
revisiones Mufson et al. 2003; Heneka y O’Banion 2007; Duyckaerts et al. 2009; Castellani et al.
2010).
Otra fuente importante de aferencias son las fibras comisurales del hipocampo contralateral
que penetran en la fimbria y se agrupan en el fórnix, los cuales están conectados dorsalmente por la
comisura hipocampal.
Eferencias del hipocampo : Las proyecciones eferentes de la formación hipocampal se originan
principalmente en las células del subículo y, en menor medida, en las células piramidales del HP. En
ambos casos, los axones de estas neuronas entran en el alveus , confluyen para formar la fimbria de l
hipocampo y luego continúan su camino constituyendo el fórnix. Estas fibras glutamatérgicas
atraviesan toda la longitud del fórnix, aunque algunas cruzan la línea media en la decusación de l
hipocampo justo delante al esplenio del cuerpo calloso. La mayor parte de estas fibras terminan en el
núcleo mamilar medial, aunque otras llegan al hipotálamo y al tálamo. También existen proyecciones
eferentes desde el subículo que se dirigen a la CE, hacia la corteza cingulada y la amígdala.
1.8. GIRO PARAHIPOCAMPAL
El giro parahipocampal (GPH) está formado por la corteza entorrinal (CE), la corteza perirrinal
(CP) y la corteza parahipocampal (CPH, nombre que recibe en primates, o corteza postrinal, como se
denomina en ratas) presubículo (PrS) y parasubículo (PaS). Estas áreas, a diferencia de las anteriores,
poseen 6 láminas (Witter et al. 2000; van Strien et al. 2009; Blaizot et al. 2010). Cada una de estas
áreas recibe conexiones de múltiples áreas neocorticales de asociación y, por lo tanto, constituye un
importante lugar de convergencia de las aferencias neocorticales al hipocampo.
1.8.1. Corteza perirrinal
La corteza perirrinal (CP) forma parte de la región parahipocampal o giro parahipocampal
dentro del lóbulo temporal medial, junto con la corteza postrinal (o parahipocampal), la corteza
entorrinal y el pre y parasubículo. En los últimos años, la corteza perirrinal ha sido objeto de estudio
en la investigación de la memoria, ya que juega un papel esencial en la memoria de reconocimiento y
en el flujo de información entre el hipocampo y la neocorteza (Suzuki 1996; Burwell 2000; Suzuki y
Amaral 2003; Suzuki y Naya 2014).
En 1909, Brodmann describió las cortezas que rodean al hipocampo y las distinguió como
áreas 28, 35 y 36, también llamadas corteza entorrinal, perirrinal y ectorrinal respectivamente.
Posteriormente se incluyeron dos nuevas regiones en la formación parahipocampal de primates,
37
Introducción
llamadas TF y TH, conocidas hoy día conjuntamente como la corteza parahipocampal. En roedores,
se ha denominado a las áreas 35 y 36 conjuntamente como corteza perirrinal y se ha redesignado la
porción caudal de las áreas 35 y 36 como corteza postrinal, estructura homóloga a la corteza
parahipocampal de primates (revisado en Burwell et al. 1995; Burwell 2001).
La corteza perirrinal de roedores ocupa ambos lados de la mitad caudal del surco rinal, se
localiza dorsalmente a la corteza entorrinal y rostralmente a la corteza postrinal. El límite rostral de
esta corteza está marcado por el claustro y el límite dorsal por la corteza temporal ventral. Además,
la corteza perirrinal está formada por dos regiones, una dorsal correspondiente al área 36 y otra
ventral correspondiente con el área 35, que pueden distinguirse por sus características
citoarquitectónicas como el grosor de las diferentes capas y la densidad celular (revisado en Burwell
et al. 1995; Burwell 2001).
La corteza perirrinal ha sido clasificada como “perialocorteza”, ya que representa una
transición filogenética de la alocorteza (o arquicorteza) a la neocorteza (Furtak et al. 2007a).
Conexiones corticales de la corteza perirrinal (revisado en Furtak et al. 2007b)
‐ Conexiones corticales del área 36 : aproximadamente la mitad de todas las aferencias del área 36 de
la corteza perirrinal provienen de estructuras corticales, sobretodo de la corteza temporal, la cual
proporciona la mayor entrada de conexiones (Burwell y Amaral 1998). La mayoría de las
proyecciones de la corteza temporal se originan en la corteza temporal ventral que se encuentra
anatómicamente adyacente al área 36 y proporciona información sensorial (auditiva, olfativa y
visual). El área 36 también recibe aferencias de las regiones auditivas de la corteza temporal. Estas
proyecciones de la corteza temporal terminan en todos los niveles del área 36. La corteza insular
también proyecta moderadamente hacia la región rostral del área 36 representando,
aproximadamente, la quinta parte de las aferencias (Burwell y Amaral 1998; Burwell 2001). Aunque
la corteza occipital no conecta de manera importante con el área 36, supone un tercio de todas las
entradas a la región caudal, además, una gran porción de estas proyecciones surgen de regiones de
asociación visual.
En cuanto a las eferencias, el área 36 conecta de manera importante con la corteza parietal,
temporal y frontal. La proyección más destacada del área 36 parte de la región rostral y termina en
la corteza somatosensorial.
‐ Conexiones corticales del área 35: al igual que ocurre en el área 36, en el área 35,
aproximadamente la mitad de todas aferencias provienen de regiones corticales. El área 35 se
encuentra altamente conectada con la corteza piriforme e insular (Burwell y Amaral 1998). Las
proyecciones de la corteza piriforme terminan en la porción rostral y caudal del área 35, mientras
que la corteza insular inerva toda la extensión rostro ‐ caudal de esta región. En comparación con el
38 Introducción
área 36, el área 35 recibe menos aferencias de la corteza temporal y éstas terminan
preferentemente a nivel medio del eje rostro ‐ caudal.
El área 35 proyecta, de manera más débil que el área 36, a estructuras corticales, siendo las
proyecciones más abundantes las que terminan en las áreas frontales e insulares, aunque también
proyecta de manera más moderada hacia la corteza parietal.
Conexiones hipocampales de la corteza perirrinal (revisado en Furtak et al. 2007b)
‐ Conexiones hipocampales del área 36: el sistema hipocampal proyecta de forma muy débil hacia el
área 36 de la corteza perirrinal, y es la región parahipocampal la que proporciona las entradas más
importantes dentro del sistema hipocampal. La corteza postrinal y entorrinal representan la fuente
de la mayoría de las aferencias del área 36. La conexión proveniente de la corteza postrinal termina
principalmente en niveles medios y caudales del área 36 mientras que las proyecciones de la corteza
entorrinal lo hacen sobre niveles más rostrales. En cuanto a las aferencias que provienen del
hipocampo, la mayoría se originan en la región CA1 de la división ventral del hipocampo, ya que las
entradas que proporciona la división dorsal del hipocampo son prácticamente despreciables.
Las eferencias del área 36 hacia la formación hipocampal también son modestas, y éstas
contactan con la región CA1 y el subículo del hipocampo dorsal y ventral. Por el contrario, el área 36
proyecta fuertemente hacia la corteza entorrinal y modestamente hacia la corteza postrinal.
‐ Conexiones hipocampales del área 35: al igual que ocurre con el área 36, el área 35 de la corteza
perirrinal recibe muy pocas aferencias del sistema hipocampal. Sin embargo, la corteza entorrinal
proporciona unas tres cuartas partes de todas las entradas provenientes del sistema hipocampal y
que terminan en todos los niveles del eje rostrocaudal de área 35. Además, la región caudal del área
35 recibe una modesta cantidad de conexiones provenientes de la corteza postrinal. En cuanto a las
proyecciones originadas en el hipocampo, éstas surgen en CA1 y en el subículo, y terminan en la
región caudal del área 35, y son más densas las provenientes del hipocampo ventral que las del
hipocampo dorsal.
Todo el eje rostro caudal del área 35 proyecta fuertemente hacia la corteza entorrinal, sin
embargo, la corteza postrinal recibe una conexión moderada que se origina en la región caudal del
área 35. Además, el área 35 también proyecta hacia el subículo, especialmente hacia el subículo
ventral.
39
Introducción
1.9. PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO Y OBJETIVOS
Actualmente, existen en España alrededor de 800.000 personas afectadas por la enfermedad
de Alzheimer, y 36 millones a nivel mundial, aunque teniendo en cuenta que tan solo 1 de 4 casos
son diagnosticados, esta cifra es sin duda aún mayor ( www.ceafa.es ). La prevalencia de la
enfermedad está por debajo del 1% en individuos menores de 65 años, pero muestra un incremento
casi exponencial con la edad, y en personas de 85 años la incidencia está alrededor del 40%. Con el
incremento de la esperanza de vida y la ausencia de una terapia efectiva (los escasos tratamientos
disponibles son exclusivamente sintomáticos produciendo un beneficio cognitivo modesto sin
efectos sobre el curso patológico de la enfermedad) se calcula que en el año 2050 esta enfermedad
neurodegenerativa afectará a 130 millones de personas en todo el mundo ( www.alz.org,
www.alz.co.uk ) convirtiendo a la AD un gran problema social, sanitario y económico que afecta no
solo a los pacientes sino también a cuidadores y familiares. El hecho de que las numerosas dianas
terapéuticas potenciales que se han ido definiendo, fundamentalmente alrededor de la hipótesis
patogénica de la “cascada amiloide”, no se hayan traducido en tratamientos eficaces, pone de
manifiesto la necesidad por un lado de entender mejor los mecanismos de la enfermedad y por otro
lado de disponer de modelos animales que mimeticen mejor la patología de los pacientes. Uno de los
mecanismos patogénicos que ha ido ganando reconocimiento en los últimos años es el jugado por las
células gliales (en especial las células microgliales) en los procesos inflamatorios asociados a
enfermedades neurodegenerativas en general y en especial a la AD. Hasta la fecha, las estrategias
terapéuticas dirigidas a modular esta respuesta inflamatoria no han tenido éxito en los pacientes.
Una posible explicación a este fracaso traslacional de los datos preclínicos obtenidos en modelos a la
clínica humana posiblemente sea debido a la existencia de diferencias entre modelos animales y
humanos.
Nuestro grupo de investigación, perteneciente a Centro de Investigación Biomédica en Red
sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED) del Instituto de Salud Carlos III, y al Instituto de
Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), ha caracterizado a nivel celular y molecular modelos
transgénicos de la enfermedad de Alzheimer con objeto de estudiar 1) mecanismos
celulares/moleculares implicados en los cambios neurodegenerativos y 2) identificar potenciales
biomarcadores de utilidad diagnóstica así como dianas terapéuticas para el desarrollo de farmácos.
En colaboración con la industria farmacéutica Sanofi (Francia), durante la última década el grupo ha
estudiado en mayor detalle un modelo transgénico que sobre ‐ expresa las formas mutadas de dos
proteínas implicadas en el desarrollo del Alzheimer familiar, PS1 M146L y APP 751SL . Estos animales
transgénicos APP/PS1 presentan acumulación de A extracelular desde edades muy tempranas (2
meses de edad en el subículo, Trujillo ‐ Estrada et al. 2014; 3 ‐ 4 meses de edad en el hipocampo y la
corteza cerebral, Ramos et al. 2006; Moreno ‐ González el al. 2009, respectivamente). Al igual que se
40 Introducción
ha descrito en pacientes, la formación de placas amiloides se encuentra asociada a una respuesta
inflamatoria con activación microglial y astroglial. A edades tempranas, se produce una activación
microglial neuroprotectora o alternativa M2 alrededor de las placas, mientras que a edades
avanzadas además se produce una activación de células microgliales en las regiones interplaca, en
este caso con fenotipo citotóxico o clásico M1 caracterizado por la producción de citoquinas pro ‐
inflamatorias como TNFalfa (Jimenez et al. 2008; Moreno ‐ González et al. 2009). Es de destacar que
existe un incremento en los niveles de A oligomérico soluble con la edad que acompaña a este
proceso neuroinflamatorio citotóxico (Jimenez et al. 2011). Estas formas solubles de los modelos,
además de estimular a la microglía, afectan directamente a las neuronas incrementando su
vulnerabilidad (Carriba et al. 2015). En base a estos hechos, parece que la microglía ejercería un
papel citotóxico para las neuronas en la patología de la AD.
A diferencia de la mayoría de otros modelos de la AD, este modelo APP/PS1 presenta
procesos neurodegenerativos tempranos (4 ‐ 6 meses de edad) que afectan, específicamente, a
determinados tipos neuronales del sistema GABAérgico. En particular, en el hipocampo, en el
subículo y en la corteza entorrinal, las interneuronas que expresan el neuropéptido SOM son
altamente vulnerables mientras que la población que expresa la proteína ligadora de calcio
parvalbúmina no se encuentra afectada (Ramos et al. 2006; Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Trujillo ‐
Estrada et al. 2014). Además, las interneuronas que expresan calretinina, otra proteína ligadora de
calcio, también son vulnerables desde edades tempranas en el hipocampo (Baglietto ‐ Vargas et al.
2010). Por otra parte, este modelo presenta degeneración de las neuronas piramidales en el subículo
(Trujillo ‐ Estrada et al. 2014) y en la corteza entorrinal (Moreno ‐ González et al. 2009) a edades
tempranas en tanto que en el hipocampo la pérdida de neuronas glutamatérgicas ocurre a edades
avanzadas, 17 meses de edad (Schmitz et al. 2004; Jimenez et al. 2008). Es de destacar que en este
modelo existe también degeneración de neuronas colinérgicas en el telencéfalo basal al igual que
ocurre en pacientes de EA (Trujillo ‐ Estrada 2015, Tesis Doctoral, datos no publicados). Además, el
hipocampo de estos ratones presenta una importante patología neurítica de naturaleza
axonal/presináptica asociada a los depósitos amiloides con acumulación de formas hiperfosforiladas
de tau y vesículas de tipo autofágico (Sánchez ‐ Varo et al. 2012; Torres et al. 2012) tal y como se ha
descrito en humanos (Nixon 2007; Nixon y Yang 2011). Este modelo APP/PS1, por tanto, recapitula
varias de las lesiones y procesos neurodegenerativos descritos en pacientes de Alzheimer, por lo que
es de un gran valor para avanzar en el conocimiento de los procesos patogénicos implicados en esta
enfermedad, identificar dianas terapéuticas y evaluar posibles tratamientos que frenen o retrasen el
curso de la enfermedad.
La mayoría de la información a nivel molecular y/o celular sobre la evolución de la patología
de la EA, ha sido obtenida principalmente en modelos transgénicos de la enfermedad. Por tanto, el
objetivo principal de este trabajo de Tesis Doctoral es realizar un estudio histopatológico del
hipocampo y el giro parahipocampal de muestras postmortem de pacientes en varios estadios de la
enfermedad (Braak II a Braak VI) para, por una parte, avanzar en el conocimiento de los mecanismos
41
Introducción
implicados en el desarrollo de la patología y, en segundo lugar, comparar los datos con los obtenidos
en modelos transgénicos con el fin de contribuir en la selección y/o mejora de los modelos de la
patología. Además, se propone seguir con el estudio y caracterización de modelos transgénicos para
desde una perspectiva traslacional identificar posibles dianas de interés terapéutico que puedan ser
utilizadas en el desarrollo de nuevas estratégicas protectoras.
Para este estudio proponemos los siguientes objetivos específicos:
Objetivo 1. Realizar una caracterización histopatológica preliminar de la progresión de la patología
neurofibrilar, producida como consecuencia de la hiperfosforilación de la proteína tau (ovillos
neurofibrilares o NFTs, filamentos del neuropilo o NTs, y neuritas distróficas,) y de la patología
amiloide en el hipocampo y giro parahipocampal de pacientes en estadio leve (Braak II), estadio
moderado o posible Alzheimer prodrómico (Braak III ‐ IV) y dementes (Braak V ‐ VI) .
Se estudiará la expresión de fosfo ‐ tau en diferentes estadios de fosforilación y agregación a
nivel de soma (pre ‐ NFTs, típicos NFTs intracelulares y NFTs extracelulares o ghost tangles ) y a nivel
dendrítico/axonal (NTs y neuritas distróficas). En este objetivo se utilizarán técnicas
inmunohistoquímicas, empleando los anticuerpos específicos AT8 (fosfo Ser199 ‐ 202, Thr205) en los
diferentes estadios Braak, y AT100 (fosfo Ser199 ‐ 202, Thr205, Thr212, Ser214) en pacientes
dementes.
Para la patología amiloide se analizará 1) la expresión extracelular de las diferentes formas
de β ‐ amiloide (A β 1 ‐ 42, A β prefibrilar y A β fibrilar) así como los principales tipos de placas a los que
dan lugar (fibrilares, de núcleo denso con halo no fibrilar, y difusas) en el giro dentado, hipocampo
propio (CA3, CA2, CA1) y giro parahipocampal (PrS, PaS, CE y CP/CPH); 2) la degeneración neurítica
asociada al A β y su posible relación espacial con específicos tipos de placas; y 3) la angiopatía
cerebral amiloide (CAA) asociada a la progresión de la enfermedad. Se aplicarán tinciones
histológicas, técnicas inmunohistoquímicas específicas, para microscopía óptica convencional y
fluorescencia confocal, y análisis de imagen para los estudios cuantitativos.
Adicionalmente, se emplearán muestras de ratones APP/ PS1 de 4, 6 y 12 meses de edad con
el fin de comparar los resultados obtenidos en las muestras de pacientes de Alzheimer con los datos
observados en el modelo animal.
Objetivo 2. Caracterizar la respuesta inflamatoria en el hipocampo y giro parahipocampal de
pacientes durante la progresión de la patología desde estadios Braak II a Braak V ‐ VI. Para ello, se
determinará 1) el patrón regional de progresión fenotípico (quiescente, activado o senescente) de las
células microgliales en relación a las placas seniles; y 2) la respuesta astroglial que acompaña a la
patología amiloide y neurofibrilar. Para ello, se emplearán técnicas inmunohistoquímicas para
marcadores específicos de fenotipo para ambas poblaciones gliales, estudios de microscopía láser
confocal así como análisis morfométricos y esterológicos.
42 Introducción
Al igual que el objetivo 1, se emplearán muestras de ratones APP/PS1 de 4, 6 y 12 meses de
edad con el fin de comparar los resultados obtenidos en pacientes de Alzheimer con los datos
observados en este modelo animal.
Objetivo 3. Determinar la vulnerabilidad de diferentes poblaciones neuronales del hipocampo y giro
parahipocampal de pacientes Braak II, Braak III ‐ IV y Braak V ‐ VI. Se analizarán las principales
poblaciones de interneuronas GABAérgicas (SOM y PV) en el giro dentado, CA1 y corteza perirrinal.
El grupo de investigación ha caracterizado con anterioridad a estas poblaciones neuronales en el
hipocampo y corteza entorrinal del modelo transgénico APP/PS1. Sin embargo, la corteza perirrinal
no ha sido objeto de estudio previo, por ello se plantea en este objetivo incluir el análisis de esta
región cerebral con objeto de comparar los resultados con los obtenidos en los pacientes y así validar
el valor predictivo de este modelo animal. En este objetivo serán necesarias técnicas estereológicas
de recuento celular así como inmunotinciones específicas.
Objetivo 4. Analizar el efecto de la inhalación del humo de tabaco sobre las principales alteraciones
neuropatológicas que presenta un modelo transgénico APP/PS1. Este objetivo pretende estudiar el
impacto de un factor ambiental modificable de gran repercusión en la sociedad humana, como es el
caso del tabaco, sobre la progresión de la patología en un modelo animal transgénico para la
enfermedad de Alzheimer. Para ello, se estudiarán los principales aspectos patológicos analizados en
los objetivos anteriores, como la carga amiloide, la respuesta inflamatoria, la fosforilación de tau y la
neurodegeneración, en el hipocampo y la corteza de ratones expuestos a diferentes dosis de humo
de tabaco. Se emplearán técnicas histológicas, inmunológicas, estereológicas y análisis
morfométricos cuantitativos. Este objetivo específico se llevó a cabo en colaboración con el
laboratorio del Dr. Soto y la Dra. Moreno ‐ González (EEUU) y será presentado en forma de publicación
científica.
2. Materiales
y métodos
45
Materiales y métodos
2.1. SUJETOS DE ESTUDIO
2.1.1. Muestras humanas post mortem
Las muestras post mortem de cerebro humano (hipocampo y giro parahipocampal) fueron
obtenidas de los Biobancos de Barcelona (Instituto de Neuropatología, Servicio de Anatomía
Patológica, perteneciente al IDIBELL ‐ Hospital Universitario de Bellvitge dirigido por el Dr. Isidro
Ferrer) y de Madrid (Banco de Tejidos BT ‐ CIEN, perteneciente a la Fundación CIEN del Instituto de
Salud Carlos III, y dirigido por el Dr. Alberto Rábano), siguiendo las normas generales de la legislación
española y del comité ético local. Tras la autopsia de los pacientes, el tejido se procesó y se examinó
para su clasificación de acuerdo a la patología de tau según los estadios de Braak (Braak y Braak,
1991), una vez identificados los signos y cambios neuropatológicos asociados a la enfermedad de
Alzheimer. Los cerebros controles procedieron de individuos sin ninguna enfermedad
psiquiátrica/neurológica conocida y no se observaron lesiones ni síntomas neurológicos tras realizar
el examen neuropatológico. La edad, el sexo, el intervalo de tiempo post mortem y el estadio de
Braak de cada uno de los casos empleados en el presente estudio quedan reflejados en la tabla 2.1.
Además, se incluyen los datos referentes a la existencia o no de síntomas clínicos de demencia (única
característica clínica disponible) y la causa de fallecimiento en aquellos casos en los que se disponía
dicho dato.
Tabla 2.1. Relación de los casos humanos analizados en el presente estudio (sujetos control y sujetos con
neuropatología asociada a la enfermedad de Alzheimer) y los datos asociados de edad, sexo, tiempo post
mortem , clasificación de Braak, síntomas clínicos de demencia y causa de la muerte. TPM, intervalo de tiempo
post mortem; Braak, clasific ación en los estadios de Braak (0 ‐ VI), según la distribución topográfica de ovillos
neurofibrilares; M, mujer; H, hombre; EPOC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica; *: tejido procedente del
Biobanco de Barcelona (I. Ferrer); **: tejido procedente del Biobanco de Madrid (A. Rábano).
Sujeto Código Edad Sexo TPM Braak Demencia Causa de la muerte
Control 1 * A06 191 46 M 14 h 5 min 0 No Parada cardiorespiratoria. Shock
cardiogénico.
Control 2 * A12 52 58 H 3 h 10 min 0 No ‐
Control 3 * A12 79 72 M 6 h 10 min 0 No ‐
Control 4 * A12 35 35 H 3h 15 min 0 No
Caso 1 * A07 07 79 H 4 h 15 min II No Insuficiencia respiratoria y cardíaca.
EPOC.
Caso 2 * A08 05 86 M 4 h 15 min II No Asistolia. Infarto agudo de miocardio
anterior extenso.
Caso 3 * A08 30 77 H 2 h 55 min II No Insuficiencia cardíaca y respiratoria.
Caso 4 * A08 114 83 M 3 h 25 min II No ‐
Caso 5 * A06 172 77 M 11 h II No Proceso linfoproliferativo.
Insuficiencia respiratoria.
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47
Materiales y métodos
β ‐ secretasa α ‐ secre tasa γ ‐ secre tasa
NL
1 10 20 30 40 I
670/671
Swedi sh
717
London
NH
2
‐‐‐ TEEISEV KM DAEFRHDSGYEVHHQKL VFF AEDVGSNK GAIIGLMVGGVVIA T V IVITL VMLKKK ‐‐ ‐ C OOH
A β
2.1.2. Animales de experimentación
Los animales de experimentación empleados en el presente trabajo fueron ratones macho,
de entre 4 y 18 meses de edad, de las siguientes líneas transgénicas:
‐ Ratones doble transgénicos APP/PS1 con fondo genético C57BL/6 obtenidos por cruce de
ratones transgénicos homocigotos PS1 M146L (sobreexpresan la forma humana mutada
PS1 M146L del Alzheimer familiar bajo el control del promotor HMG ‐ CoA reductasa) con
ratones heterocigotos de la línea transgénica APP 751SL (caracterizada por las mutaciones del
Alzheimer familiar swedish [KM670/671NL] y london [V717I] en el gen de la proteína
precursora amiloide humana, hAPP, bajo el control del promotor Thy1).
La generación y caracterización inicial de estos ratones transgénicos APP 751SL /PS1 M146L ha sido
previamente descrita (Blanchard et al. 2003; Ramos et al. 2006; Caballero et al. 2007;
Jimenez et al. 2008, 2011; Moreno ‐ Gonzalez et al. 2009; Sanchez ‐ Varo et al. 2012; Torres
et al. 2012; Trujillo ‐ Estrada et al. 2013, 2014). Las colonias de los parentales PS1 M146L y
APP 751SL fueron suministradas por la industria farmacéutica SANOFI (París, Francia) a través
de Charles ‐ River Laboratories (Francia). Los animales se mantuvieron estabulados en los
Servicios Centrales de Investigación de la Universidad de Málaga, bajo condiciones de
temperatura media controlada de 21±1 o C y un fotoperiodo de 14 horas de luz y 10 de
oscuridad. Durante el tiempo de permanencia en el estabulario los ratones tuvieron libre
acceso al agua y a una alimentación estándar.
‐ Ratones doble transgénicos PS1 dE9 /APP S (B6C3 ‐ Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) de origen
comercial ( Jackson Laboratory; Bar Harbor, Maine). Estos ratones dobles transgénicos
expresan una proteína precursora de amiloide quimérica humana/ratón que contiene la
mutación Swedish (Mo/HuAPP695swe) y el gen PS1 que presenta una deleción del exón 9
Figura 2.1. Esquema de las mutaciones que contiene la secuencia aminoacídica de la proteína APP751
humana en los ratones transgénicos PS1/APP. La proteína hAPP de nuestro modelo transgénico
presenta las mutaciones Swedish (que afecta a los aminoácidos 670 y 671) y London (en el aminoácido
717). La secuencia sombreada en turquesa representa los aminoácidos que forman el péptido β
‐
amiloide (A β ) tras el procesamiento del APP. La zona violeta es la región transmembrana, y las flechas
indican las zonas de corte de las enzimas implicadas en el procesamiento.
48 Materiales y métodos
(PS1 dE9 ) . Estos ratones fueron utilizados para el Objetivo 4, que fue realizado durante una
estancia en el laboratorio de la Dra. Inés Moreno ‐ González y el Dr. Claudio Soto en Houston
(EEUU). Los animales fueron mantenidos en el estabulario de la School of Medicine (Houston,
EEUU) y alojados en grupos de hasta 5 en jaulas ventiladas individualmente en condiciones
estándar (22 °C, 12 h luz ‐ oscuridad ciclo) recibiendo alimentos y agua ad libitum . Todos los
experimentos con estos animales se llevaron a cabo de acuerdo con las normas del National
Institute of Health (NIH).
‐ Además, como controles se han utilizado ratones no transgénicos ( wildtype , WT) del mismo
fondo genético y edad.
Todos los experimentos se llevaron a cabo en la Universidad de Málaga de acuerdo con el
Real Decreto 1201/2005 del 10 de octubre (BOE 21/10/2005) para el mantenimiento y uso de
animales de laboratorio, y de acuerdo con el Real Decreto 53/2013 del 1 de febrero (BOE 8/02/2013)
para la protección de los animales utilizados en experimentación. Además, los experimentos fueron
aprobados por el Comité de Uso de Animales para la Investigación de la Universidad de Málaga. El
número de animales empleados, así como el estrés y sufrimiento de éstos durante la manipulación y
experimentación, fueron reducidos al máximo.
2.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y DELIMITACIÓN DE LAS ÁREAS
CEREBRALES
2.2.1. Procesamiento de los cerebros de ratón
Para la fijación del cerebro por perfusión vascular, los ratones se anestesiaron previamente
mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (Dolethal®, Vetequinol; 60 mg/Kg) y
posteriormente se perfundieron transcardialmente con ayuda de una bomba de perfusión (Dinko,
D25V). Primero, se lavó todo el sistema vascular con tampón fosfato salino (PBS) a 0,1 M y pH 7,4
(ver apéndice 2.8.1.) durante un minuto. Una vez drenada toda la sangre, se perfundió durante 30
min con 180 mL de solución fijadora, compuesta por paraformaldehído (1.04005, Merck) al 4%, lisina
75 mM (1.05700, Merck) y metaperyodato sódico 10 mM (1.06597, Merck) en tampón fosfato (PB) a
0,1 M y pH 7,4 (ver apéndice 2.8.1. y 2.8.2.). A continuación, se extrajeron los cerebros y se
postfijaron por inmersión, en la misma solución fijadora, durante una noche a 4 o C.
Tras la postfijación, los cerebros se lavaron 3 veces durante 10 minutos con tampón PBS y se
sumergieron en una solución crioprotectora de sacarosa (131621, Panreac) al 30% (ver apéndice
2.8.3.) hasta que se hundieron por completo en dicha solución. Finalmente, los cerebros se
congelaron con nieve carbónica y se almacenaron a ‐ 80 o C hasta su posterior procesamiento.
49
Materiales y métodos
Los cerebros se cortaron rostro ‐ caudalmente en secciones coronales de 40 µm de grosor con
ayuda de un micrótomo de congelación (Leica, CM ‐ 1325). Dichas secciones se almacenaron en free ‐
floating de manera seriada en placas multipocillo (7 series por placa) que contenían PBS y 0,02% de
azida sódica (122712.1608, Panreac). De esta manera, dos cortes consecutivos pertenecientes a una
misma serie distan entre sí 280 µm y cada pocillo contiene una representación rostrocaudal de 1/7
del total del cerebro. Las placas con el tejido se almacenaron a 4 o C hasta su uso.
2.2.2. Delimitación y situación de las regiones cerebrales de ratón
La delimitación de la corteza perirrinal se realizó en relación a las estructuras corticales
adyacentes a ésta, contrastando siempre con el atlas de ratón (Paxinos y Franklin 2013)(Fig. 2.2 A1 ‐
A3). La corteza perirrinal forma parte de la región parahipocampal dentro del lóbulo temporal
medial. En secciones coronales, la corteza perirrinal se sitúa entre ‐ 1,34 mm y ‐ 4,60 mm según las
coordenadas de Bregma. Las áreas 35 y 36 se pueden delimitar también por los cambios en la
intensidad de neuropilo marcado al emplear anticuerpos contra calretinina (Fig. 2.2 B2) o
parvalbúmina (Fig. 2.2 B3). Además, el anticuerpo 6E10 contra β
‐ amiloide muestra un patrón de
expresión diferencial en ambas regiones, de modo que en el área 35, se marcan fuertemente las
capas II ‐ III y por el contrario, en el área 36, la capa V es la más inmunorreactiva en comparación con
las capas II ‐ IV, que se tiñen débilmente (Fig. 2.2 B1).
En cuanto al hipocampo (Fig. 2.2 A1 ‐ A3 y C), en secciones coronales se sitúa entre las
coordenadas de Bregma ‐ 0,94 mm hasta ‐ 3,88 mm. Aparece dorsalmente tras los niveles de los
núcleos septales, delimitado inferiormente por el tálamo dorsal, superiormente por el cuerpo calloso
y dorsolateralmente por el córtex parietal. Posteriormente se curva y se extiende ventralmente hacia
el área amigdaloide, con las cortezas perirrinal y entorrinal, entre otras, definiendo sus límites
laterales a estos niveles.
2.2.3.Procesamiento de las muestras humanas
Tras la extracción del cerebro en la autopsia, el personal del Biobanco correspondiente
procedió a la disección de las distintas regiones cerebrales. Un hemisferio cerebral fue fijado por
inmersión en paraformaldehído al 4% en PB 0,1M pH 7,4 y tras 2 horas, se cortó en pequeños
bloques que se post ‐ fijaron durante 24 ‐ 48 h a 4 o C. Después, parte de las muestras fue procesada
para inclusión en parafina y otras se crioprotegieron en soluciones de sacarosa crecientes y se
almacenaron a ‐ 80 o C. El otro hemisferio cerebral fue congelado, sin fijar, para posteriores estudios
bioquímicos/moleculares.
Una vez recibidas las muestras en nuestro laboratorio, el tejido fijado y crioprotegido se
cortó en secciones coronales de 30 µm de grosor en un microtomo de congelación (Leica, CM ‐ 1325),
las secciones se almacenaron en free ‐ floating de manera seriada en placas multipocillo (6 series por
placa) con PBS 0,1M pH 7,4 y 0,02% de azida sódica, y se conservó a 4 o C hasta su uso. Las muestras
incluidas en parafina fueron cortadas en un microtomo de deslizamiento (Leica RM2235) en
Figura 2.2. Delimitación de la
corteza perirrinal y del
hipocampo en los ratones
empleados en el presente
estudio. Se establecieron las
coordenadas estereotáxicas de
las secciones coronales,
comparando un atlas de
cerebro de ratón (A1 ‐ A3), con
el inmunomarcaje obtenido
con los anticuerpos para β‐
amiloide (B1), Calretinina (B2)
y Parvalbúmina (B3). Se
muestra una representación
rostrocaudal del hipocampo,
resaltado en verde en tres
niveles distintos (A1 ‐ A3). (C)
Sección coronal con
hipocampo teñido con violeta
de cre silo. Distancia de
Bregma según Frankli n y
Paxinos, 2008). AuV, corteza
auditiva secundaria ventral;
Cpu, estriado; Ent, corteza
entorrinal; hp, hipocampo; rs,
s u l c or i n a l ;T e A ,c o r t e z a
asociativa temporal. CA:
C u e r n od eA m ó n ;C t x :c ó r t e x ;
GD: Giro dentado; T: t álamo.
51
Materiales y métodos
secciones coronales de 10 µm de grosor y colocadas seriadamente sobre portaobjetos gelatinados.
Los sujetos control y aquellos con patología tipo Alzheimer se procesaron de la misma manera y en
paralelo para los estudios inmunohistoquímicos.
2.2.4. Delimitación y situación de las regiones cerebrales de las muestras humanas
La delimitación del hipocampo y de la región parahipocampal se realizó en relación a las
estructuras corticales adyacentes a éstas siguiendo el atlas de cerebro humano de Mai y
colaboradores ( Atlas of the Human Brain, 2008 ) (Fig. 2.3 A1 ‐ A3), el atlas de cerebro Allen ( Allen Brain
Atlas , disponible en la web www.brain ‐ map.org), y también por los cambios en la intensidad de
neuropilo marcado al emplear anticuerpos contra parvalbúmina (Fig. 2.3 B1 ‐ B3) o tau fosforilado.
La formación hipocampal está comprendida por el hipocampo propio (CA1, CA2, CA3 y GD) y
el subículo (S) y en secciones coronales se sitúa entre las coordenadas estereotáxicas 6,7 mm y 44,9
mm. La región parahipocampal integra al presubículo (PrS), parasubículo (PaS), corteza entorrinal
(CE), corteza perirrinal (CP) y corteza parahipocampal (CPH) y se sitúa entre las coordenadas
estereotáxicas ‐ 10 mm y 50,3 mm. Ambas regiones forman parte del lóbulo temporal medial. Debido
a la limitación en el grosor del tejido empleado en el presente estudio así como a las diferencias en el
nivel a lo largo del eje rostro ‐ caudal, solo pudieron ser examinadas las áreas comprendidas entre las
coordenadas 17 mm y 35 mm. Regiones como la corteza entorrinal, de gran importancia
neuropatológica para la enfermedad, no pudieron ser analizadas a nivel cuantitativo por su pobre
representación en las muestras cedidas. Los estudios cuantitativos de la región cortical no
hipocampal se llevaron a cabo en la corteza perirrinal y corteza parahipocampal dentro del giro
parahipocampal.
2.3. TINCIONES HISTOLÓGICAS
2.3.1. Violeta de Cresilo
El violeta de cresilo (C 18 H 15 N 3 O 3 ) es un colorante básico que tiñe de color azul ‐ violeta
moléculas de naturaleza ácida como los ácidos nucleicos, presentes en el núcleo celular, así como
acúmulos de retículo endoplasmático rugoso y polirribosomas conocidos como grumos de Nissl.
Para proceder a la tinción con este colorante, las secciones incluidas en parafina fueron
primero desparafinadas en xileno e hidratadas, mientras que las almacenadas free floating se
montaron sobre los portaobjetos gelatinizados (ver apéndice 2.8.4.), que una vez secos, se dejaron
en una estufa a 37 o C durante toda una noche. Al día siguiente, se hidrató el tejido introduciéndolos
20 minutos en agua destilada seguido de otros 20 minutos en tampón PBS 0,1 M pH 7,4. A
continuación, se sumergieron los cortes en el colorante violeta de cresilo (1.15940, Merck)
preparado al 1% en agua destilada, previamente filtrado, y con unas gotas de ácido acético glacial
Figura 2.3. Delimitación y situación del lóbulo temporal medial que contiene la formación hipocampal y la región
parahipocampal de las muestras humanas empleadas en este estudio. Las coordenadas estereotáxicas de los cortes
coronales fueron e stablecidas a lo largo del eje ro stro ‐ caudal según el atlas de cerebro humano (A1 ‐ A3) y por las
diferencias en la intensidad de neuropilo marcado con anti ‐ PV, que ayudaro n a establece r los límites entr e las
re giones adyacentes (B1 ‐ B3). Las muestras cedidas se situaron entre los niveles 17 m m y 35 mm, por lo que solo las
se cciones más rostrales (A1, B1) contenían corteza entorrinal . alv, alveo; CA, cuerno de Amón; c os, sulco colateral; DG,
gi ro dentado; Ent, corteza entorrinal; fi, fimbria; FuG, giro f usiforme; PaS, parasubiculo; PrS, presubículo; PHG, giro
p arahipocampal; rs, sulco rinal. S, subículo.
53
Materiales y métodos
(141008.1611, Panreac) como mordiente, durante 7 minutos. Posteriormente, las secciones se
deshidrataron en etanol de 70 o durante 2 minutos, etanol de 96º (más unas gotas de ácido acético
glacial), durante 2 minutos, etanol de 100 o durante 5 minutos y, finalmente, se aclararon con xileno
(141769.2711, Panreac) durante 10 minutos. Para el montaje de los cubreobjetos se usó un medio de
montaje miscible en xileno, como el DPX (360294H, BHD).
2.3. 2. Tioflavina S
La Tioflavina S (TioS) es una fluoresceína verde que se une de forma específica a los
agregados fibrilares de β ‐ amiloide que poseen una conformación de lámina β plegada, y también a
los ovillos neurofibrilares. Esta tinción se observa a microscopía de fluorescencia. La tinción con TioS
se llevó a cabo lavando durante 10 minutos (tres veces) con PBS 0,1 M pH 7,4 para posteriormente
incubar los cortes durante 5 minutos en la solución de TioS (T1892; Sigma ‐ Adrich) al 0,025% en
etanol al 50%, en oscuridad y agitación constante. Tras esta incubación, las secciones se lavaron dos
veces en etanol al 50% durante 5 minutos y dos veces en agua destilada durante también 5 minutos.
Posteriormente, las muestras se montaron en portaobjetos gelatinizados y se colocó el cubreobjetos
usando un medio de montaje específico para mantener la fluorescencia de las muestras (PBS 0,1M y
glicerina a una proporción 1:1, más el 3% de 1,4 ‐ diazabiciclo [2.2.2.] ‐ octano o DABCO (D ‐ 2522,
Sigma ‐ Aldrich) (ver apéndice 2.8.7.). Finalmente, las secciones se conservaron a 4 o C y en oscuridad
hasta su estudio.
2.4. TINCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA
2.4.1.Procedimiento general para microscopía óptica de campo claro
En primer lugar, las secciones incluidas en parafina fueron desparafinadas en xileno e
hidratadas mientras que las almacenadas free floating, con el fin de eliminar los restos de sales de
azida sódica del tejido, se lavaron con tampón PBS 0,1 M pH 7,4 (10 minutos 3 veces). A
continuación, para aumentar o mejorar la señal inmunohistoquímica, se llevó a cabo un
pretratamiento de los cortes con calor, introduciendo el tejido en tampón citrato sódico (131655,
Panreac) a 50 mM y pH6 (ver apéndice 2.8.1.) a 80 o C en un baño termostático (Unitronic, 320 OR;
Selecta) durante 30 minutos, pasados los cuales, se dejaron enfriar las secciones en el mismo tampón
unos 10 minutos y se lavaron de nuevo en tampón PBS durante 10 minutos. Para la inactivación de la
peroxidasa endógena se incubó el tejido en una solución con peróxido de hidrógeno (1.07210,
Merck) al 3% y metanol (141091.1211, Panreac) al 10% en PBS durante 20 minutos. Tras tres nuevos
lavados se bloquearon la avidina y la biotina endógenas, así como las proteínas unidas a biotina,
empleando el kit de bloqueo avidina ‐ biotina (SP ‐ 2001, Vector Labs) durante 15 minutos en cada una
de las dos soluciones, con un lavado de 10 minutos entre ambas incubaciones. A continuación, para
evitar reacciones inespecíficas, se bloquearon las secciones con suero normal de cabra (G9023, Sigma
54 Materiales y métodos
Aldrich) o de caballo (H0146, Sigma ‐ Adrich) (cuando el anticuerpo primario estaba producido en
cabra) al 5% en PBS durante 1 hora y, seguidamente los cortes se incubaron en el correspondiente
anticuerpo primario entre 24 y 72 horas y a una concentración y temperatura determinada para cada
uno de los diferentes anticuerpos (ver marcadores utilizados, anticuerpos primarios y condiciones de
incubación en las tablas 2.2 y 2.3), todos ellos diluidos en tampón PBS 0,1 M pH 7,4 con azida sódica
al 0,1% y Tritón X ‐ 100 (T9284, Sigma Aldrich) al 0,2%.
Tabla 2.2. Marcadores analizados en los estudios inmunohistoquímicos y sus características.
APP Proteína precursora amiloide. Tras su procesamiento se genera el péptido β ‐ amiloide. El
anticuerpo empleado reconoce el extremo C ‐ terminal desde el aminoácido 676 al 695.
β‐ amiloide
Fragmento peptídico de entre 39 y 43 aminoácidos generado tras el procesamiento del APP.
El anticuerpo 4G8 reconoce los aminoácidos situados entre las posiciones 17 ‐ 24 y se empleó
para el marcaje del A β total, aunque también puede reconocer formas precursoras. El
anticuerpo 6E10 reconoce los primeros 17 residuos aminoacídicos del péptido A, y por
tanto también reconoce formas precursoras.
β‐ amiloide 1 ‐ 42 Péptido amiloide de 42 aminoácidos con gran capacidad de agregación. Principal
componente de las placas extracelulares.
β‐ amiloide
oligomérico
Formas oligoméricas del β ‐ amiloide de pequeño tamaño. Son las especies a las que se les
atribuyen las propiedades más tóxicas. El anticuerpo OC reconoce la conformación que
adquieren las fibras de oligómeros.
ALDH1L1 Del inglés aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1 . Proteína de la familia de las
aldehído deshidrogenasas. Marcador específico de astroglía.
CD3 Complejo proteico que actúa como receptor de membrana en los linfocitos T.
CD45 Receptor de membrana plasmática expresado por linfocitos, macrófagos y microglía,
implicado en la activación de las células T. Marcador de macrófagos infiltrados y microglía.
CD68
Proteína perteneciente a la familia de las glucoproteínas de membrana asociadas a
lisosomas/endosomas (LAMP) y también a la familia de los receptores scavenger de los
macrófagos (MSR). Se encuentra en los lisosomas, endosomas y superficie celular
interviniendo en la fagocitosis y en la activación de macrófagos. Marcador de microglía y
macrófagos activados M1.
CX3CR1 Receptor de la proteína fractalquina, proteína transmembrana y quimiocina implicada en la
adhesión y migración de macrófagos y células microgliales. Marcador de microglía.
Ferritina
Proteína implicada en el almacenamiento del hierro intracelular compuesta por 24
subunidades de cadenas pesadas (H) y ligeras (L), presente en todos los tipos celulares. La
microglía senescente expresa gran cantidad de L ‐ ferritina.
GFAP Proteína glial fibrilar acídica que forma los filamentos intermedios de células astrogliales.
Marcador específico de astrocitos.
Iba 1
Del inglés ionized calcium binding adapater molecule . Molécula del citoesqueleto de
membrana implicada en los cambios morfológicos que se producen en la microglía y en los
macrófagos. Marcador de microglía y macrófagos.
MRC ‐ 1 Receptor de manosa 1. Lectina de tipo C presente en la superficie de macrófagos y microglía
que interviene en procesos de endocitosis. Marcador M2.
55
Materiales y métodos
NeuN Proteína nuclear presente en las neuronas. Marcador específico neuronal.
nNOS Sintasa de óxido nítrico neuronal que está presente en una subpoblación de interneuronas
GABAérgicas que colocaliza con SOM.
P2ry12 Receptor purinérgico expresado por las células microgliales. Marcador específico de
microglía.
PV Parvalbúmina. Proteína ligadora de calcio presente en una subpoblación de interneuronas
GABAérgicas que realizan una fuerte inhibición de las neuronas principales.
SOM Somatostatina. Neuropéptido presente en una subpoblación de interneuronas GABAérgicas
que se encuentra gravemente afectada por la EA.
Tau fosforilada
Proteína asociada a microtúbulos (MAP) que interviene en la estabilización de éstos. En la EA
se encuentra hiperfosforilada, lo que provoca la desestabiliz ación del citoesqueleto y la
consiguiente formación de los ovillos neurofibrilares. El anticuerpo AT8 reconoce la
secuencia de fosforilación Ser199, Ser202 y Thr205; el anticuerpo AT100 reconoce la
secuencia de epítopes fosforilado s en Ser199, Ser202, Thr205, Thr212 y Ser214.
TNF α
Factor de necrosis tumoral alfa. Es una citoquina pro ‐ inflamatoria producida por célula s
gliales y por neuronas, que promueve la activación de la micro glía y la producción de
sustancias citotóxicas proinflamatorias. Marcador de microglía activada M1.
Tabla 2.3. Relación de anticuerpos primarios empleados en los estudios inmunohistoquímicos de microscopía
óptica. *Los anticuerpos primarios producidos en ratón son monoclonales; el resto de anticuerpos son
policlonales.
Anticuerpo primario Dilución de
uso
Incubación (tiempo
y temperatura)
Animal de
obtención Casa comercial; Referencia
Anti ‐ APP ‐ C 1:20000 24h; 22 o C Conejo Sigma ‐ Aldrich; A 8717
Anti ‐ A β 17 ‐ 24 (4G8) 1:2000 48h; 22 o C Ratón* Covance; SIG 39220
Anti ‐ A β 42 1:1000 48h; 22 o C Conejo Merck ‐ Millipore; AB5078P
Anti ‐ A β oligomérico
(OC) 1:5000 24h; 22 o C Conejo Merck ‐ Millipore; AB2286
Anti ‐ PHF ‐ Tau (AT8) 1:500 48h; 22 o C Ratón* Pierce Biotech; MN 1020
Anti ‐ PHF ‐ Tau (AT100) 1:500 48h; 22 o C Ratón* Autogen Bioclear; 90209
Anti ‐ ALDH1L1 1:2000 48h; 22 o C Ratón* Merck ‐ Millipore; MABN495
Anti ‐ CD45 1:1000 48h; 22 o C Conejo Abcam; ab10558
Anti ‐ CD68 (PG ‐ M1) 1:1000 48h; 22 o C Ratón* Dako; M0876
Anti ‐ CD3 1:100 48h; 22 o C Hamster BD; 550277
Anti ‐ Ferritina 1:500 48h; 22 o C Conejo Sigma ‐ Aldrich, F6136
Anti ‐ GFAP 1:2000 24h; 22 o C Pollo Chemicon; AB5541
Anti ‐ GFAP 1:10000 24h; 22 o C Conejo Dako; Z0334
Anti ‐ Iba1 1:1000 24h; 22 o C Conejo Wako Chemicals; 019 ‐ 19741
56 Materiales y métodos
Anticuerpo primario Dilución de
uso
Incubación (tiempo
y temperatura)
Animal de
obtención Casa comercial; Referencia
Anti ‐ Iba1 1:2000 24h; 22 o C Cabra Abcam; ab5076
Anti ‐ MRC1 1:1000 48h; 22 o C Conejo Sigma ‐ Aldrich; HPA004114
Anti ‐ NeuN 1:1000 48h; 22 o C Ratón Merck ‐ Millipore; MAB377
Anti ‐ nNOS 1:1000 48h; 22 o C Conejo Sigma ‐ Aldrich; N7280
Anti ‐ P2ry12 1:200 48h; 22 o C Conejo Sigma ‐ Aldrich; HPA014518
Anti ‐ PV 1:5000 48h; 22 o C Conejo Swant; PV ‐ 28
Anti ‐ SOM (D ‐ 20) 1:1000 24h; 22 o C Cabra Santa Cruz Biotech; sc ‐ 7819
Anti ‐ TNF α (M ‐ 18) 1:500 48h; 22 o C Cabra Santa Cruz Biotech; sc ‐ 1348
Inmunohistoquímica simple para campo claro
Transcurrido el periodo de incubación en el anticuerpo primario, las secciones se lavaron de
nuevo con tampón PBS (10 minutos 3 veces) y se incubaron en el anticuerpo secundario biotinilado
correspondiente, a una concentración de 1/500 en el mismo tampón que el anticuerpo primario,
durante 75 minutos a temperatura ambiente (ver tabla 2.4). A continuación, tras lavar de nuevo (10
minutos 3 veces) se incubaron los cortes en el complejo estreptavidina ‐ peroxidasa de rábano
(Extravidin®; E ‐ 2886, Sigma ‐ Adrich) a una dilución 1/2000 en tampón PBS con Tritón al 0,2 % durante
90 minutos y a temperatura ambiente. Se lavaron las secciones en PBS (10 minutos 3 veces) y,
finalmente, el producto de la inmunorreacción se visualizó introduciendo el tejido en una solución de
3 ‐ 3’ ‐ diaminobencidina tetrahidro ‐ clorhídrico (DAB) (D5637, Sigma ‐ Aldrich) al 0,05% en tampón Tris
clorhídrico (Trizma®;T1503, Sigma ‐ Aldrich), conteniendo 0,03% de sulfato amónico de níquel
(464545, Farmitalia Carlo Erba) para intensificar el producto de la reacción de la peroxidasa
(precipitado de color azul) y, 0,03% de peróxido de hidrógeno como sustrato de la enzima (ver
apéndice 2.8.5.). El tiempo de revelado varió en función del anticuerpo utilizado a fin de conseguir la
intensidad de inmunomarcaje deseada, la cual se monitorizó bajo el microscopio.
Todos los pasos de incubación y lavado se llevaron a cabo en agitación constante (agitador de
rotación circular Nahita 6845). Además, las secciones de cerebro de los diferentes individuos se
procesaron siempre en paralelo, utilizando las mismas soluciones, tampones y condiciones de
incubación (excepto las secciones empleadas como control negativo, que no se incubaron en el
anticuerpo primario).
Para la conservación y estudio posterior del tejido, las secciones se lavaron con tampón PBS
(10 minutos 2 veces) y las secciones en free floating se montaron en portaobjetos gelatinados que se
secaron en una estufa a 37 o C durante una noche. Posteriormente, las secciones se deshidrataron en
etanol de graduación creciente (50 o , 70 o , 96 o y 100 o ) (ver apéndice 2.8.6.) hasta aclarar las
secciones con xileno y, finalmente, se colocaron los cubreobjetos empleando DPX.
57
Materiales y métodos
Tabla 2.4. Anticuerpos secundarios utilizados en los estudios inmunohistoquícos de microscopía óptica de
campo claro.
Anticuerpo secundario Dilución de
uso
Incubación (tiempo y
temperatura)
Animal de
obtención
Casa comercial;
Referencia
Anti ‐ IgG de cabra 1:500 70 min; 22 o C Caballo Vector Lab.; BA ‐ 9500
Anti ‐ IgG de conejo 1:500 70 min; 22 o C Cabra Vector Lab.; BA ‐ 1000
Anti ‐ IgG de pollo 1:500 70 min; 22 o C Cabra Vector Lab.; BA ‐ 9010
Anti ‐ IgG de rata 1:500 70 min; 22 o C Cabra Vector Lab.; BA ‐ 9400
Anti ‐ IgG de ratón 1:500 70 min; 22 o C Cabra Vector Lab.; BA ‐ 9200
Inmunohistoquímica doble y triple para campo claro
El inmunomarcaje múltiple empleando dos ó tres anticuerpos primarios consistió en varios
procesos de revelado consecutivos en los cuales el producto de la reacción de cada uno de los
marcajes inmunohistoquímicos presentó un color diferente (azul, marrón y violeta). Este tipo de
inmunotinción fue posible solo cuando los anticuerpos primarios reconocían antígenos de tipos
celulares diferentes o estructuras con distinta localización.
Se procedió con el protocolo general, es decir, el tejido se pretrató con calor y
posteriormente se bloqueó la peroxidasa endógena así como la avidina y la biotina endógena; a
continuación, se incubó en el primero de los anticuerpos primarios, seguido del anticuerpo
secundario correspondiente, y la estreptavidina. Finalmente, se reveló la actividad de la enzima
empleando los mismos reactivos que se detallan en el apartado anterior, precipitando el producto de
la reacción en un color azul (DAB más níquel). Tras el revelado, se lavaron las secciones con PBS (10
minutos 3 veces), se incubaron en suero normal de cabra o de caballo, y de nuevo en el siguiente
anticuerpo primario, que fue revelado de la misma manera omitiendo la adición de níquel a la
solución de DAB, por lo que el marcaje se visualizó en marrón. En los casos en los que se
inmunomarcó con un tercer anticuerpo primario, éste fue visualizado empleando el kit de revelado
VECTOR VIP Peroxidase Substrate Kit (SK ‐ 4600, Vector Labs.) que tintó de color violeta, siguiendo las
instrucciones recomendadas por el fabricante. Por último, los cortes se montaron en portaobjetos
gelatinizados, se dejaron secar en la estufa a 37 o C durante una noche y se deshidrataron al día
siguiente en soluciones de alcohol de graduación creciente, se aclararon con xileno y se cubrieron
con DPX.
2.4.2.Procedimiento general para microscopía convencional de fluorescencia y
microscopía láser confocal
Para realizar la técnica de inmunofluorescencia no fue necesario bloquear la peroxidasa
endógena, puesto que no se empleó un sistema de revelado acoplado a la dicha enzima. De la misma
58 Materiales y métodos
manera, cuando se emplearon anticuerpos secundarios acoplados directamente a un fluorocromo,
tampoco fue necesario bloquear la biotina endógena. Por ello, tras lavar las secciones con tampón
PBS (10 minutos 3 veces), incrementar la antigenicidad del tejido con calor (en el caso en el que fuera
necesario) y bloquear con suero normal de cabra o de caballo, se incubaron los cortes en el
anticuerpo primario correspondiente a una concentración, tiempo y temperatura determinada para
cada uno de los diferentes anticuerpos, todos ellos diluidos en tampón PBS 0,1M con azida sódica al
0,1% y Tritón X ‐ 100 al 0,2%. A diferencia de la inmunohistoquímica doble para campo claro, para
fluorescencia los anticuerpos primarios se incubaron en días consecutivos, lavando siempre tres
veces entre ellos.
Tras lavar de nuevo con PBS (10 minutos 3 veces), la unión del anticuerpo primario a su
antígeno fue detectada incubando los cortes secuencialmente con los anticuerpos secundarios
correspondientes Alexa Fluor® 568 y Alexa Fluor® 488 (acoplados directamente a un fluorocromo,
emitiendo en rojo o en verde, respectivamente)(ver tabla 2.5), ambos diluidos en tampón PBS con
0,2% de Tritón X ‐ 100 a una concentración de 1/1000, durante 75 minutos, a temperatura ambiente
y en oscuridad. Entre ambas incubaciones se procedió a lavar el tejido con PBS (10 minutos 3 veces).
En las ocasiones en las que se empleó un tercer anticuerpo primario o no fue posible utilizar
dos anticuerpos secundarios acoplados directamente a un fluorocromo, se incubó con un anticuerpo
secundario biotinilado seguido de una estreptavidina conjugada a un flurocromo (Alexa Fluor® 405),
a una dilución 1/1000 en tampón PBS 0,1 M con 0,2% de Tritón X ‐ 100, durante 90 minutos a
temperatura ambiente y en oscuridad.
Para eliminar la autofluorescencia del tejido humano, debido a la acumulación con la edad de
gránulos de lipofucsina autofluorescentes, se sumergieron los cortes, previamente montados sobre
portaobjetos gelatinizados, en alcohol de 70 o durante 5 minutos y seguidamente, en una solución
comercial ( Autofluorescence Eliminator Reagent ; 2160, Merck ‐ Millipore), siguiendo el protocolo
predeterminado por el fabricante.
Por último, las secciones se cubrieron usando un medio de montaje específico para mantener
la fluorescencia de las muestras (PBS 0,1M y glicerina a una proporción 1:1, más el 3% de 1,4 ‐
diazabiciclo [2.2.2.] ‐ octano o DABCO) (ver apéndice 2.8.7.), y se almacenaron en oscuridad a 4 o C
hasta su visualización en un microscopio láser cofocal (Leica SP5).
Tabla 2.5. Relación de anticuerpos secundarios utilizados en los estudios inmunohistoquímicos de
microscopía de fluorescencia . Alexa Fluor ® 488 * 1 , la longitud de onda de absorción es de 495 nm y la de
emisión de 519 nm (verde); Alexa Fluor ® 568* 2 , la longitud de onda de absorción es de 578 nm y la de emisión
de 603 nm (rojo); Alexa Fluor ® 405* 3 , la longitud de onda de absorción es de 402 nm y la de emisión es de 421
nm (UV).
Reactivo Flurocromo Especie de
obtención Dilución Casa comercial; Referencia
Anti ‐ IgG de conejo Alexa Fluor ® 488* 1 Burro 1:1000 Molecular Probes; A21206
Anti ‐ IgG de conejo Alexa Fluor ® 488* 1 Cabra 1:1000 Molecular Probes; A11008
Anti ‐ IgG de ratón Alexa Fluor ® 488* 1 Burro 1:1000 Molecular Probes; A21202
59
Materiales y métodos
Anti ‐ IgG de cabra Alexa Fluor ® 488* 1 Burro 1:1000 Molecular Probes; A11055
Anti ‐ IgG de pollo Alexa Fluor ® 488* 1 Cabra 1:1000 Molecular Probes; A11039
Anti ‐ IgG de conejo Alexa Fluor ® 568* 2 Burro 1:1000 Molecular Probes; A10042
Anti ‐ IgG de conejo Alexa Fluor ® 568* 2 Cabra 1:1000 Molecular Probes; A11011
Anti ‐ IgG de ratón Alexa Fluor ® 568* 2 Burro 1:1000 Molecular Probes; A10037
Anti ‐ IgG de cabra Alexa Fluor ® 568* 2 Burro 1:1000 Molecular Probes; A11057
Estreptavidina Alexa Fluor ® 405* 3 ‐ 1:1000 Molecular Probes; S32351
2.4.3. Controles de la técnica inmunohistoquímica
Para demostrar la especificidad de los anticuerpos empleados en los experimentos de la
técnica inmunohistoquímica, se procesaron simultáneamente secciones que no fueron incubadas con
el anticuerpo/s primario/s correspondiente/s, sino que se sustituyó este paso por una incubación del
tejido en la solución diluyente. En ningún caso los controles negativos presentaron inmunotinción.
2.5. OBTENCIÓN DE IMÁGENES MICROSCÓPICAS
La mayoría de los preparados de los experimentos inmunohistoquímicos para microscopía
óptica a campo claro fueron escaneados mediante un sistema de microscopía virtual Olympus VS120
acoplado a un sistema óptico (Olympus BX61VS), a dos cámaras (Olympus VC50, color; Olympus VS ‐
XM10, monocromo) y a un ordenador que ejecuta el programa VS (Olympus). Con este sistema se
pudo obtener una base de datos de preparaciones virtuales con una resolución de 0,17 µm/pixel
(objetivo 40X) con acceso remoto a través del servidor NetImage Server SQL (Olympus) y desde
cualquier ordenador que tuviera instalado el programa Olyvia 2.6 (Olympus), empleado para el
visionado de las muestras y la toma de imágenes (en formato .vsi o .jpg con un tamaño de 1786x
877).
Otras imágenes de inmunohistoquímica para microscopía óptica de campo claro se
obtuvieron con un microscopio convencional Nikon modelo Eclipse 80i, provisto de una cámara
fotográfica digital Nikon DS ‐ 5M de 5 megapíxeles, conectada a un ordenador que ejecuta el
programa ACT ‐ 2U (Imaging Software, Nikon Corporation 2004), tomadas con un tamaño de
2560x1920 en formato JPEG.
También se empleó un microscopio Olympus BX61 con una cámara acoplada (Olympus DP71)
y el programa Cell ‐ A (Olympus), para la toma de imágenes de inmunohistoquímica para campo claro,
así como para la toma de imágenes de epifluorescencia, gracias a una fuente de fluorescencia
(Olympus U ‐ RFL ‐ T) acoplada al microscopio.
Por otro lado, las imágenes de fluorescencia a microscopía confocal se obtuvieron con el
microscopio láser confocal Leica SP5 acoplado a un ordenador. Este microscopio permite conocer la
colocalización de dos o más moléculas en una misma célula, entre otras aplicaciones, al obtenerse
60 Materiales y métodos
secciones ópticas muy finas, con un plano focal de 0,4 µm. Las fotos se adquieren con un tamaño
1024x1024 en formato .tif y son procesadas mediante el programa LAS AF Lite (Leica).
Finalmente, para el procesamiento de las imágenes digitales se utilizó el programa
informático Adobe PhotoShop CS (7.0) y se montaron con el programa Microsoft Office PowerPoint
(2010).
2.6. TÉCNICAS ESTEREOLÓGICAS DE RECUENTO CELULAR: DENSIDAD
NUMÉRICA
La estereología es una técnica que combina la probabilidad geométrica y la estadística para
cuantificar las propiedades geométricas tridimensionales de objetos de interés, utilizando
información adecuadamente muestreada y basándose en principios generales de análisis sencillos
(Howard y Reed 2004).
La técnica estereológica del disector óptico permite estimar el número de células por
volumen (células/mm 3 ) o densidad numérica (DN) y está considerada como el mejor método de
muestreo para una estimación precisa de la densidad numérica de células.
Dicho procedimiento se empleó en el presente trabajo de Tesis Doctoral para cuantificar la
densidad celular de las poblaciones neuronales que expresan SOM y PV y la población de células
microgliales, en el hipocampo y giro parahipocampal de muestras humanas con patología de tipo
Alzheimer y muestras control. La densidad numérica de las subpoblaciones de interneuronas PV y
SOM en la corteza perirrinal de los ratones transgénicos, así mismo, se analizó también mediante
estereología.
La aplicación de este método requirió un sistema de computación interactivo que comprende
un microscopio convencional (Olympus BX61), una cámara digital (Olympus DP71), el programa
informático NewCast (Olympus) con el sistema VIS 2.61.1.0. (Visiopharm Integrator System,
Visiopharm®) y un microcator (Prior ProScan), que monitoriza los movimiento del eje Z.
Para poder llevar a cabo esta técnica los objetos de interés (en nuestro caso cuerpos
celulares inmunomarcados) han de ser muestreados de manera uniforme, es decir, que en un área
determinada cada objeto debe tener la misma probabilidad de ser contado. Es necesario delimitar el
área de la región a medir y determinar el porcentaje de la muestra que se quiere estudiar (entre el 20
y el 50% del total), para que el programa realice un muestreo de la zona y seleccione al azar el primer
punto, de manera que los puntos de muestreo consecutivos, equidistantes, también son
seleccionados al azar, mediante un muestreo en forma de meandro (del inglés meander sampling )
(ver figura 2.4). El área se selecciona manualmente con el objetivo de 2X o 4X y el muestreo se realiza
con un objetivo de mayores aumentos (20X, 40X o 100X).
61
Materiales y métodos
Para el análisis del tejido humano, se empleó una media de 6 secciones seriadas por
individuo, separadas entre ellas por una distancia de 180 µm (ya que se muestreó una fracción de
1/6 y los cortes presentaron 30 µm de grosor), obteniendo así una representación global entre las
coordenadas 17 mm y 35 mm del eje rostro ‐ caudal de la región cuantificada. La corteza perirrinal de
los animales de experimentación se estudió a lo largo de todo el eje rostro ‐ caudal, con una media de
7 ‐ 8 secciones por animal, distanciadas por 280 µm (fracción de 1/7 x 40 µm de grosor).
Para estimar la densidad numérica, el programa emplea disectores, cuadrículas o ventanas
de conteo con un área conocida, que al multiplicarla por el grosor del corte, nos da el volumen de
referencia necesario para la estimación del número de perfiles celulares mediante el método del
disector óptico.
Finalmente, teniendo en cuenta el área de la región seleccionada, el grosor del corte y el
número de perfiles celulares contados, se puede determinar el número de células por unidad de
volumen o densidad numérica (DN), según la ecuación:
DN= ∑ Q / ∑ A x h,
Donde ∑ Q es el número de perfiles somáticos, ∑ A es el sumatorio de las áreas (área de la
ventana multiplicado por el número de ventanas cuantificadas), y h es la altura del disector o, en
nuestro caso, el grosor del corte.
De este modo, se obtuvo la densidad numérica de cada una de las secciones y la media de las
secciones se utilizó para obtener el valor correspondiente del sujeto y, posteriormente, de la media
de los diferentes sujetos se halló la densidad numérica de cada grupo, presentando junto con estos
datos la desviación estándar del grupo.
A B
Figura 2.4. Representación de la técnica estereológica del disector óptico con la que se llevó a cabo el análisis
de la densidad numérica de diferentes tipos celulares. A, el muestreo sistemático permite cuantificar las
partículas contenidas en ventanas de conteo que se encuentran distribuidas al azar y equidistantes, y que
ocupan una parte de la región de interés (no más del 50%); B, solo aquellos perfiles celulares que se encuentran
en el interior del disector o en contacto con las aristas verdes son contados.
62 Materiales y métodos
Figura 2.5. Proceso de binarización con el programa de análisis de imagen Visilog 6.3. En la imagen de la
izquierda (A) se puede observar la fotografía original sin procesar de una sección de corteza perirrinal humana
inmunoteñida con el anticuerpo OC para AB oligomérico, en medio (B) la imagen transformada en
monocromática y con el área de interés seleccionada; y, a la derecha (C), la misma imagen tras el proceso de
binarización. La inmunotinción aparece de color azul
2.7. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE IMAGEN PARA LA CARGA AMILOIDE Y LA
CARGA GLIAL
Para la cuantificación de la carga amiloide (% del área ocupada por los depósitos amiloides
extracelulares OC ‐ positivos, respecto a un área de referencia) y de la carga microglial (% del área
ocupada por células microgliales positivas para Iba1 o P2ry€12, respecto a un área de referencia) en
el tejido humano, se obtuvieron imágenes del hipocampo y del giro parahipocampal de preparados
inmunoteñidos para dichos marcadores, a través del sistema de microscopía virtual Olympus VS120
explicado anteriormente en el apartado, empleando el objetivo 4X.
Las imágenes fueron procesadas con el programa de análisis de imagen Visilog 6.3 (Noesis).
Primero se calibraron y transformaron en monocromáticas. Posteriormente, tras delimitar el área de
referencia, la imagen de trabajo fue binarizada para permitir su análisis (eligiendo un umbral entre 0 ‐
255) (Fig. 2.5), de manera que al sumar el área seleccionada y la imagen binaria, se obtuvo una nueva
imagen binaria con un punteado correspondiente al inmunomarcaje de la región de referencia.
Finalmente, para la estimación del % del área inmunomarcada (carga), se calculó una relación entre
el área inicial (100%) y la obtenida tras la binarización.
Además de la cuantificación del área ocupada por la microglia en el hipocampo y en el giro
parahipocampal, se estudió también la distribución del espacio ocupado por las células microgliales
Iba1 ‐ positivas en el giro dentado mediante un análisis en cuadrícula. Para ello, las imágenes fueron
procesadas de la misma manera y, una vez binarizadas, se aplicó una cuadrícula a cada imagen con
un tamaño de cuadrado de 125000 µm 2 (ver figura 2.6), tomando el área del cuadrado como área de
A B
C
C
63
Materiales y métodos
referencia, y los valores del espacio cubierto por la microglía en cada cuadrado fueron representados
como un histograma de distribución.
Para la cuantificación de la carga astroglial (% del área ocupada por células GFAP ‐ positivas, respecto
a un área de referencia) en el hipocampo y en la región parahipocampal, se empleó el mismo
procedimiento que para la carga microglial, salvo que las imágenes fueron tomadas con el
microscopio de epifluorescencia.
2.8 . ANÁLISIS DE LA COMPACTACIÓN DE LAS PLACAS DE A β
El análisis de la compactación de las placas de A β se llevó a cabo en las muestras humanas. Las
secciones inmunoteñidas con OC (fibras de oligómeros) se fotografiaron utilizando un microscopio
Nikon Eclipse 80i (ver Apdo. 2.5.1), con el objetivo de 10x. Se cuantificaron tres secciones por
individuo, utilizando el programa de análisis de imagen Visilog 6.3 (Noesis, Francia).
Figura 2.6. Análisis en
cuadrícula de la distribución
diferencial de las células
Iba1 ‐ positivas en el giro
dentado. Tras obtener las
imágenes monocromáticas y
binarias, se insertó una
cuadrícula (de 125000 µm 2
cada cuadrado) en cada
imagen y se analizó el
espacio ocupado de las
células microgliales en cada
cuadrado de la plantilla.
64 Materiales y métodos
Figura 2.7 . Cuantificación de la compactación de las placas. Mediante el programa Visilog, las imágenes de la
inmunohistoquímica para OC reveladas con DAB (con este método de revelado se aprecian mejor la s
diferencias en la compactación que con DAB ‐ níquel, que enmascara dichas diferencias) se pasaron a escalas de
grises. Mediante un umbral se determinó la marca positiva que se utilizó para determinar la densidad óptica de
cada una de las placas.
La densidad de inmunotinción para OC se identificó mediante un umbral que se mantuvo a lo largo
de todo el experimento (Fig. 2.7). La imagen, en escala de grises, se binarizó para estimar su densidad
óptica que fue definida como los píxeles por unidad en relación al tamaño de la placa (en mm 2 que se
midió utilizando el mismo programa).
2.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos obtenidos en el presente estudio se representaron con la media del grupo ± la
desviación estándar (SD).
Todos los análisis estadísticos se realizaron introduciendo los datos en el programa Sigma
Stat32 3.5 (Advisory Statistics for Scientists) y GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Para
determinar la existencia de diferencias significativas entre los diferentes grupos de datos a comparar
se aplicaron diferentes test estadísticos según si los datos seguían o no una distribución normal. Para
los grupos de datos que presentaron una distribución normal se aplicaron test paramétricos como la
prueba de análisis de varianza (ADEVA) de una vía seguido de un test de comparaciones múltiples
( Tukey o Bonferroni ) o la prueba t de student para comparaciones independientes entre dos grupos.
Para los grupos de datos que no presentaron una distribución normal, se aplicaron pruebas no
paramétricas ( Kruskal ‐ Wallis para comparaciones múltiples o Mann ‐ Whitney en comparaciones
independientes entre dos grupos). El nivel de significación en las pruebas fue de p<0,05 (*), p<0,01
(**) o p<0,001 (***).
2.10. APÉNDICE
Tampones para la inmunohistoquímica
Tampón fosfato (PB) 0,4 M, pH 7,4
NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O (1.06346, Merck) 13,8 g
NaHPO 4 ∙ 2H 2 O (1.06580, Merck) 53,4 g
H 2 O desionizada hasta 1000mL
Disolver y ajustar el pH a 7,4
Tampón fosfato salino (PBS) 0,1 M, pH 7,4
NaCl (131659, Panreac) 9 g
PB 0,4 M, pH 7,4 250 mL
65
Materiales y métodos
H 2 O desionizada hasta 1000 mL
Disolver y ajustar el pH a 7,4.
Tampón citrato sódico, pH 6
C 6 H 5 Na 3 O 7 .2H 2 O (131655, Panreac) 1,47 g
H 2 O desionizada hasta 100mL
Disolver y ajustar el pH a 6.
Solución de fijación
Paraformaldehído 4%, L ‐ lisina 75 mM, metaperyodato sódico 10 mM (PLP) en PB 0,1 M, pH
7,4
Paraformaldehído (1.04005, Merck) 4 g
L ‐ lisina monoclorhidrato (1.05700, Merck) 1,37 g
Metaperyodato sódico (1.06597, Merck) 0,21 g
PB 0,4 M, pH 7,4 50 mL
H 2 O desionizada hasta 100 mL
Modo de preparación:
1. Disolver 4 g de paraformaldehído en 30 ‐ 35 mL de agua desionizada previamente
calentada a 60 o C. Si es necesario, añadir unas gotas de NaOH para su completa
disolución.
2. Filtrar y enrasar con agua desionizada hasta 50 mL, y dejar enfriar.
3. Añadir 1,37 g de L ‐ lisina y 0,21 g de metaperyodato sódico disueltos en 50 mL de PB 0,2
M, pH 7,4.
Solución crioprotectora
Sacarosa 30%
Sacarosa (131621, Panreac) 30 g
PBS 0,1 M pH 7,4 hasta 100 mL
Portaobjetos gelatinizados
Solución de gelatina
Gelatina oro (251336, Panreac) 1 g
Sulfato de cromo y potasio (141284, Panreac) 0,1 g
H 2 O desionizada 200 mL
Modo de preparación:
1. Se desengrasan los portaobjetos en una mezcla de alcohol absoluto y éter (1:1) durante
al menos un día.
2. Secar los portaobjetos.
66 Materiales y métodos
3. Disolver la gelatina en agua desionizada calentada a 60 o C y añadir el alumbre de cromo
posteriormente hasta su disolución.
4. Sumergir los portaobjetos en la solución de gelatina durante 15 segundos, dejar secar y
sumergir de nuevo durante 15 segundos más en agitación.
5. Dejar secar en la estufa a 37 o C durante 24 horas. Tras el gelatinado de los portaobjetos,
éstos son viables durante al menos dos meses desde su preparación.
Solución de revelado para microscopía de campo claro
Solución de 3 ‐ 3’ ‐ diaminobencidina (DAB) tetrahidro ‐ clorhídrico 0,05% ‐ Níquel 0,03%:
DAB (D5637, Sigma ‐ Aldrich) 0,3 g
Tris 50 mM (Trizma®, T1503, Sigma ‐ Aldrich) 0,06 g
HCl hasta ajustar pH
Níquel Sulfato amónico (464545, Farmitalia Carlo Erba) 0,012 g
PBS 0,1 M pH 7,4 15 mL
H 2 O desionizada 50 mL
Modo de preparación:
1. Añadir 0,06 g de Tris 50mM en 50 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 7,4 con unas
gotas de ácido clorhídrico.
2. Disolver 0,3 g de DAB en el tampón Tris ‐ Clorhídrico.
3. Filtrar y almacenar la solución en alícuotas de 500 µL a 20 o C.
4. Para la preparación de la solución de revelado, diluir previamente 0,012 g de níquel en
15 mL de PBS, y a continuación añadir una alícuota de DAB ‐ Tris previamente
descongelada. Por último, filtrar de nuevo antes de usar y añadir el peróxido de
hidrógeno (0,03 % en la solución final).
Protocolo de deshidratación y montaje
PBS 0,1 M pH 7,4 10 min
H 2 O desionizada 10 min
Etanol 70 o 10 min
Etanol 96 o 10 min
Etanol 100 o 10 min
Disolvente natural (Xileno) ( 141769.2711, Panreac) 15 min
Montaje con DPX (360294H, BHD)
Medio de montaje para inmunohistoquímica fluorescente
DABCO (1,4 ‐ diazabiciclo[2.2.2.]octano) 3% para inmunohistoquímica fluorescente
DABCO (Sigma ‐ Aldrich, D ‐ 2522) 3g
67
Materiales y métodos
Glicerol (141339, Panreac) 50 mL
PBS 0,1 M pH 7,4 50 mL
Mantener la solución a 4 o C y en oscuridad.
MATERIALES Y MÉTODOS SUPLEMENTARIOS
Para complementar los resultados obtenidos con las técnicas inmunohistoquímicas se han
realizado estudios bioquímicos (PCR a tiempo real, western ‐ blot ) y estudios in vitro en colaboración
con el laboratorio del Dr. Javier Vitorica (Universidad de Sevilla; IBIS).
2.11. ESTUDIOS BIOQUÍMICOS
Las muestras humanas utilizadas (hipocampo) en los estudios bioquímicos proceden de los
mismos individuos que las utilizadas para los estudios inmunohistoquimicos (ver Tabla 2.1), y han
sido cedidas por los mismos biobancos ( Banco de Tejido para Investigación Neurológica de Madrid, y
del Banco de Tejidos Neurológicos del Servicio de Anatomía Patológica IDIBELL ‐ Hospital Universitario
de Bellvitge de Barcelona ). El uso de las mismas muestras humanas en ambos laboratorios (de la
Universidad de Málaga y de la Universidad de Sevilla) ha permitido una mejor correlación e
interpretación de los datos con las diferentes técnicas. Mientras que para los estudios
inmunohistoquímicos las muestras fueron previamente fijadas, para los estudios bioquímicos las
muestras una vez extraídas se congelaron directamente a ‐ 80ºC hasta su uso, para evitar la
degradación de proteínas y ARN. Posteriormente, se dividieron aun congeladas en porciones de 70 ‐
90 mg para la extracción de proteínas, ARN o fracción soluble
Por otro lado, las muestras de hipocampo de ratones transgénicos APP/PS1 se obtuvieron
por disección una vez anestesiados los animales con pentobarbital sódico (Dolethal®, 60 mg/Kg) y
perfundidos transcardialmente con tampón fosfato salino (PBS) 0,1 M pH 7,4 durante 5 minuto a un
flujo continuo de 10 ml/minuto, utilizando una bomba de perfusión (DINKO Mod. D ‐ 25V). Las
muestras obtenidas se conservaron a –80 °C hasta su posterior uso.
2.11.1. Aislamiento de ARN y proteínas a partir de muestras de cerebro
La técnica de aislamiento de ARN y proteínas se basa en la diferente solubilidad que tienen
las distintas biomoléculas (ARN, ADN, proteínas y lípidos) en disolventes orgánicos como el fenol y el
cloroformo. El procedimiento consiste en pesar las muestras en una balanza de precisión. A
continuación, se pasan a un tubo de 2 ml autoclavado. Seguidamente se añade 1 ml del reactivo
Tripure ® (tiocianato de guanidina, un agente caotrópico que desnaturaliza las proteínas, incluyendo
proteasas, ADNasas y ARNasas, y que rompen las membranas) por cada 50 ‐ 100 mg de tejido que
hemos pesado y se homogeniza la muestra con un polytron durante 20 segundos. Para que haya una
68 Materiales y métodos
disociación completa de los complejos núcleo ‐ proteínas, se deja incubar el homogenizado obtenido
durante 5 minutos a temperatura ambiente. Con posterioridad, se añaden 0,2 ml de cloroformo por
cada ml de Tripure ® usado inicialmente. Esta mezcla se agita y se deja incubar durante 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación, se realiza una centrifugación a 4 °C a 12000g durante 15
minutos, obteniéndose una solución con 3 fases: la fase superior acuosas, donde está presente el
ARN; la interfase con el ADN; y la fase inferior, que contiene las proteínas.
En el proceso de extracción del ARN es muy importante que tanto el material de trabajo
como los reactivos estén libres de ARNasas, por lo que se ha tratado el agua con dietilpirocarbonato
(DEPC) al 0,1% (p/v) (Fedorcsák y Ehrenberg 1966) y posteriormente para eliminar el DEPC, ya que
éste por carboximetilación puede inactivar el ARN, se ha autoclavado el agua.
Con la finalidad de aislar el ARN, extraemos la fase superior, de la cual se recupera éste por
precipitación con isopropanol (0,5 ml de isopropanol por ml inicial de Tripure® ) durante 10 minutos,
que lo insolubiliza. Por último, el ARN precipitado es purificado usando el sistema ABI Prism 6100
Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems). Este sistema es capaz de purificar hasta 96 muestras
simultáneamente y consiste en una bomba de vacío que aspira las muestras haciéndolas pasar por
unos filtros en los que el ARN queda retenido. Finalmente, éste se disuelve con agua libre de
ARNasas. La purificación del ARN y su posterior recuperación usando este sistema se ha realizado
siguiendo los pasos que se indican en la Tabla 2.6. El ARN purificado se cuantifica posteriormente
usando un espectofotómetro. Una vez se ha purificado y cuantificado, el ARN se almacena a –80°C
hasta su posterior uso.
Tabla 2.6. Pasos para la purificación de ARN usando el sistema ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation
(Applied Biosystems). Se indican los pasos seguidos en este protocolo, así como el tiempo y volumen de
reactivo utilizado.
Paso Acción Volumen Tiempo Vacío Posición
‐ Humedecer pocillos con agua con DEPC 40 μ l ‐ ‐ ‐
1 Cargar muestras 0,5 ml 180 s 80% Desechar
2 Añadir etanol absoluto 4ºC 0,5 ml 180 s 80% Desechar
3 Añadir etanol absoluto 4ºC 0,4 ml 180 s 80% Desechar
4 Añadir etanol absoluto 4ºC 0,3 ml 120 s 60% Desechar
5 Añadir etanol absoluto 4ºC 0,3 ml 120 s 60% Desechar
6 Aplicar vacío pre ‐ elución ‐ 300 s 90% Desechar
7 Suave agitación de la placa ‐ ‐ ‐ Desechar
8 Eluir con agua con DEPC 150 μ l 120 s 40% Eluir
9 Suave agitación de la placa ‐ ‐ ‐ Eluir
69
Materiales y métodos
2.11.2. Comprobación de la integridad del ARN purificado
Para comprobar la integridad del ARN purificado untilizamos Agilent RNA 6000 Nano Kit
como soporte electroforético y Agilent 2100 Bioanalyzer como instrumento de detección y análisis .
Este sistema permite llevar a cabo una electroforesis en gel mediante el uso de un chip, sobre el cual
se carga la matriz del gel, el fluoróforo que permitirá llevar a cabo la visualización del RNA y la
muestra correspondiente. Tras la electroforesis el sistema de análisis recoge la fluorescencia emitida
por la muestra, previamente estimulada con láser, creando un electroferograma
(fluorescencia/tiempo). El electroferograma permite conocer la calidad del RNA generando,
mediante el uso de un software específico, el RIN ( RNA Integrity Number ; Número de Integridad del
ARN). El RIN establece una clasificación numérica de la calidad del RNA que comprende valores del 1
al 10, siendo 1 el RIN de un ARN totalmente degradado y 10 el RIN de un ARN perfectamente
conservado. Tras llevar a cabo el análisis de integridad de ARN de nuestras muestras hemos obtenido
un RIN medio de 2,54, indicando una muy baja calidad del ARN utilizado en este trabajo.
2.11.3. Aislamiento de proteínas totales
A partir de la interfase y la fase orgánica que hemos obtenido en el proceso de
homogenización con el reactivo Tripure®, procedemos a extraer las proteínas totales. Estas proteínas
están desnaturalizadas y se han utilizado para estudios de Western ‐ blot .
Con la finalidad de obtener las proteínas totales, se ha llevado a cabo en primer lugar la
precipitación del ADN para así evitar la contaminación de la muestra de proteínas. Esta precipitación
se ha realizado añadiendo etanol al 100% (0,3 ml de etanol por ml de Tripure® usado), mezclándolo
con la muestra e incubando durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después, la muestra se
centrifuga a 2000 g durante 5 minutos a 4°C. A continuación, el sobrenadante se retiró y se pasó a un
tubo nuevo donde las proteínas fueron precipitadas con isopropanol (1,5 ml de isopropanol por cada
ml de Tripure® ). Esta mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a
12000 g durante 10 minutos a 4°C. El precipitado de proteínas se lavó con 0,3M guanidina en 95%
(v/v) etanol (2 ml de guanidina por cada ml de reactivo Tripure® ) y se incubó durante 20 minutos a
temperatura ambiente, para después centrifugar a 7500 g durante 5 minutos a 4 °C. Este proceso se
repitió dos veces más y luego se realizó un último lavado con 2 ml de etanol absoluto, para así
eliminar los restos de guanidina. Finalmente, se dejó secar el precipitado a temperatura ambiente
hasta que se evaporó todo el alcohol.
Para solubilizar las proteínas, el precipitado se resuspendió en urea 8M ‐ SDS 4% tamponado
con Tris ‐ HCl pH 7,4. Se incubó toda la noche en agitación a temperatura ambiente, tras lo cual se
procedió a la determinación de la cantidad de proteína mediante el método de Lowry (Lowry y col.,
1951). Las proteínas solubilizadas se almacenaron a –40 °C hasta su posterior uso.
70 Materiales y métodos
2.11.4. Retrotranscripción
El ARN es una biomolécula muy inestable debido a la alta afinidad que tiene las ARNasas por
su sustrato. Por este motivo, hemos trabajado con ADNc en nuestros análisis moleculares. Este ADNc
se consigue a partir de la enzima transcriptasa inversa, que sintetiza una hebra de ADN
complementaria a un molde de ARN en presencia de un cebador complementario. Después de este
proceso obtenemos un híbrido ARN ‐ ADN que, por degradación del ARN, quedará como ADN
monocatenario.
En este trabajo hemos empleado el kit High ‐ Capacity cDNA Archive de retrotranscripción
suministrado por Applied Biosystems que viene provisto de random primers (pd(N) 6 ). La combinación
de los reactivos del kit da lugar a una mezcla de reacción 2X (Retromix) detallada en la Tabla 2.7, que
se mezcla con la muestra en una proporción 1:1 para llevar a cabo la retrotranscripción.
Una vez preparada la mezcla de reacción 2X, preparamos 4 ug de ARN de nuestras muestras
en un volumen final de 50 ul de agua tratada con DEPC al 0,1% (p/v). Posteriormente, se
desnaturaliza el ARN a 65°C durante 10 minutos, y se enfría en hielo para evitar la re ‐ naturalización.
Finalmente, añadimos 50 ul de la mezcla de reacción 2X (proporción 1:1 mezcla:muestra) a cada tubo
de reacción, y se lleva al termociclador (MasterCycler Gradient, Eppfendor; Hamburgo, Alemania)
para efectuar un ciclo de temperatura a 25 °C durante 10 minutos (para permitir el apareamiento de
los cebadores con sus secuencias complementarias), seguido de 2 horas a 37°C (para que la
retrotranscriptasa sintetice el ADNc) y un calentamiento final a 85°C durante 30 segundos (para
favorecer la degradación de las hebras de ARN). El ADNc así obtenido se conserva a –40 °C hasta su
uso.
Tabla 2.7. Reactivos utilizados para la preparación de la mezcla de reacción 2X (Retromix). En la tabla se
indican el reactivo y las cantidades necesarias para una reacción.
Reactivos Volumen (µl) Concentración final
Tampón RT 10X 10 2X
Mezcla de cebadores (Random Primers RT) 10X 10 2X
Desoxinucleótidos (dNTP) mix 25X 4 2X
MultiScribe RT (50U/ µL) (transcriptasa inversa) 5 5 U/µL
Agua + DEPC 21
Total 50 (Volumen Final Retromix)
Con el fin de comprobar que la cantidad de ADNc obtenida tras la reacción de
retrotranscripción es la misma en todas las muestras, llevamos a cabo la amplificación de un gen
housekeeper (GAPDH, del inglés glyceraldehyde ‐ 3 ‐ phosphate dehydrogenase ) y comparamos los
niveles de este gen en todas ellas. Normalmente, se obtuvo la misma expresión de este gen con poca
variabilidad en todas las muestras independientemente de su origen.
71
Materiales y métodos
2.11.5. RT ‐ PCR en tiempo real
Se denomina RT ‐ PCR cuando se parte de ADN obtenido a partir de ARNm mediante
retrotranscripción. En la PCR a tiempo real, a diferencia de otras técnicas convencionales de PCR, el
análisis de las muestras amplificadas se produce durante la misma reacción, monitorizando una señal
fluorescente asociada al producto de PCR. En este trabajo hemos utilizado el termociclador ABI 7900
HT Fast Real ‐ Time PCR System (Applied Biosystems).
El sistema ABI ‐ Prism 7900 de Applied Biosystems combina un termociclador, un detector de
fluorescencia y un software específico de amplificación. Es capaz de detectar fluorescencia entre 500
nm y 660 nm. Para inducir la fluorescencia durante la PCR, una luz proveniente de una lámpara de
tungsteno ‐ halógena es distribuida simultáneamente a los 96 pocillos a través de una matriz de fibras
ópticas. La fluorescencia resultante vuelve de forma secuencial a través de las fibras y se dirige hacia
un espectrógrafo con una cámara CCD ( charge ‐ coupled device ).
Se han empleado dos métodos para asociar el producto de PCR específico amplificado a una
señal fluorescente. Uno de ellos consiste en el uso de cebadores específicos junto con el fluoróforo
de unión al ADN bicatenario SYBR ‐ green I . El otro método empleado para detectar el producto
específico amplificado por fluorescencia es Taqman Gene Expression Assay® Mix 20X (denominado
comúnmente como Sondas Taqman). El procedimiento a seguir para preparar la PCR a tiempo real es
ligeramente diferente en función de qué método usemos para detectar la amplificación de la diana
estudiada.
En el caso de que empleemos SYBR ‐ green I, junto con un par de cebadores específicos
diseñados para una diana en concreto, se debe hacer en primer lugar un ensayo preliminar con
diferentes cantidades de partida de ADNc. Además, se debe llevar a cabo un protocolo de disociación
del producto de PCR obtenido para conocer la especificidad de nuestros cebadores durante la
reacción. Una vez comprobada dicha especificidad y la eficiencia de la reacción en el ciclo threshold
(ciclo de PCR en el que la curva de amplificación de la diana en cuestión se distingue del ruido de
fondo o fluorescencia background) , pasaremos a cuantificar la expresión de la diana deseada con
respecto al housekeeper (GAPDH) tanto en las muestras problemas como controles, empleando la
ecuación de Livak y Schmittegen (2 ‐ΔΔ Ct ), para calcular la expresión relativa de la diana en cuestión
(Livak y Schmittgen, 2001). Para preparar las reacciones de PCR empleando SYBR ‐ green I seguimos
los volúmenes especificados en la Tabla 2.8.
72 Materiales y métodos
Tabla 2.8. Relación de los reactivos empleados para la amplificación por PCR a tiempo real empleando SYBR ‐
green I. En la tabla se indica el componente de la reacción y las cantidades necesarias para una reacción.
Componentes de la reacción Volumen (µl)
FastStart SYBR ‐ Green® Master Mix 2X 10
Cebadores (Sentido/Antisentido) 0,6 (de cada cebador)
ADNc producto de retrotranscripción 1
Agua + DEPC 7,8
Total 20
En el caso de usar Sondas Taqman, no es necesario llevar a cabo tales comprobaciones antes
de la cuantificación, pues esta sondas suministradas por Applied Biosystemns han pasado
previamente controles pertinentes que nos garantizan tanto su especificidad como la eficiencia de
amplificación para la diana en el ciclo threshold . El detalle de los componentes de esta reacción se
especifica en la Tabla 2.9.
Tabla 2.9. Relación de los reactivos empleados para la amplificación por PCR a tiempo real empleando
sondas Taqman. En la tabla se indica el componente de la reacción y la s cantidades necesarias para una
reacción.
Componentes de la reacción Volumen (µl)
Taqman® Universal PCR Master Mix 2X 10
Taqman Gene Expression Assay® Mix 20X 1
ADNc producto de retrotranscripción 1
Agua + DEPC 8
Total 20
Una vez preparadas las reacciones según la mezcla de volúmenes detallada en placas de 96
pocillos compatibles con alguno de los termocicladores empleados para PCR a tiempo real, pasamos
a realizar la amplificación siguiendo el programa detallado en la Tabla 2.10. La señal fluorescente
emitida por los productos de la PCR fue detectada por el lector acoplado en el termociclador y su
intensidad es proporcional a la cantidad de copias generadas durante la reacción. Para poder
cuantificar las cantidades iniciales presentes de una diana determinada mediante RT ‐ PCR en tiempo
real, nos basamos en el concepto de Cycle threshold , ciclo threshold o Ct, punto en el que la
fluorescencia alcanza un umbral a partir del cual el incremento en la cantidad de ADN amplificado es
exponencial. El valor umbral o threshold se determinó automáticamente por el software SDS v1.7 o
v3.2. En la Tabla 2.11 se muestra la secuencia de los cebadores empleados y en la Tabla 2.12 las
sondas Taqman utilizadas.
73
Materiales y métodos
Tabla 2.10. Programa predeterminado de amplificación para PCR a tiempo real. Estas condiciones han sido
previamente establecidas por Applied Biosystems.
Etapas iniciales 40 ciclos
Activación de Taq ‐ polimerasa Desnaturalización ADNc Desnaturalización ADNc Hibridación/
Elongación
2 minutos 50 ºC 10 minutos 95 ºC 15 segundos 95 ºC 1 minuto 60 ºC
Tabla 2.11. Secuencia de cebadores empleados en la PCR. En esta tabla se muestra el marcador analizado, la
denominación de los cebadores murinos up y low y la secuencia específica empleada para la realización de la
RT ‐ PCR a tiempo real y el número de acceso.
Proteína Nombre Secuencia (5’ → 3’) Nº acceso
β‐ actina
B ‐ ACTup AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC
NM_007393.2
B ‐ ACTlo AGCTCATCGTACTCCTGCTTGC
GDNFlo GCACCCCCGATTTTTGC
GFAP
GFAPup CTCCAACCTCCAGATCCGAG NM_010277
GFAPlo TCTGACACGGATTTGGTGTCC
NPY
NPYmmUP CATCAATCTCATCACCAGACAGA NM_023456
NPYmmLO AAGGGTCTTCAAGCCTTGTTC
SOM
SOMmmUP AGGATTTGCCCCAGGCAGCT NM_009215
SOMmmLO TGCAGCCAGCTTTGCGTTCC
Tabla 2.12. Sondas Taqman para RT ‐ PCR . Se indican las sondas Taqman de Applied Biosystems, con su
referencia, utilizadas para humano o ratón en el análisis de expresión de ARNm mediante RT ‐ PCR Real Time .
Sonda (humano) Referencia Sonda (ratón) Referencia
CCL2 Hs00234140_m1 TNFalfa Mm00443258_m1
CCR2 Hs00704702_s1 GAPDH Mm99999915_g1
CD11b Hs00355885_m1 P2ry12 Mm01950543_s1
CD36 Hs01567185_m1 CX3CR1 Mm02620111_s1
CD3E Hs01062241_m1 CD45 Mm01293577_m1
CD45 Hs04189704_m1 Iba ‐ 1 Mm00479862_g1
CD68 Hs02836816_g1 CD68 Mm03047340_m1
CX3CR1 Hs01922583_s1 CD11b Mm00434455_m1
FAS ‐ L Hs00181225_m1 GFAP Mm01253033_m1
GAPDH Hs03929097_g1
GDNF Hs00181185_m1
GFAP Hs00909236_m1
74 Materiales y métodos
Sonda (humano) Referencia Sonda (ratón) Referencia
IBA ‐ 1 Hs00610419_g1
Ki67 Hs01032443_m1
MRC ‐ 1 Hs00267207_m1
MSR ‐ 1 Hs00234007_m1
NPY Hs00173470_m1
P2ry12 Hs01881698_m1
Pu.1 Hs02786711_m1
PV Hs00161045_m1
SIRP β 1 Hs01092173_m1
SOM Hs00356144_m1
TNF ‐α Hs00174128_m1
β‐ Actina Hs99999903_m1
Para comprobar que durante el proceso de amplificación con sondas Taqman no se habían
producido dímeros de cebadores, que la secuencia amplificada era la correcta y que existía una
cantidad detectable, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Una vez en la cubeta de
electroforesis que contiene el tampón TBE 10x, se cargaron las muestras junto con tampón de carga
y un marcador de 100 pares de bases (10 ng/ml; Superladder ‐ low 100bp ladder, Gensura
Laboratories INC.) como patrón. Se cargaron 8 µl de patrón junto con 4 µl de tampón de carga, así
como 5 µl de muestra y 5 µl de tampón de carga y se inició la electroforesis a un voltaje constante de
190 V. Finalmente, los geles fueron visualizados bajo la luz ultravioleta y se fotografiaron con una
cámara Polaroid®.
2.11.6. Western ‐ Blot (WB)
Esta técnica permite la cuantificación de proteínas específicas presentes en el tejido.
Comienza con la electroforesis de las proteínas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida ‐ SDS o
poliacrilamida ‐ SDS ‐ Urea, para separarlas en relación su movilidad electroforética. Dicha separación
depende del tamaño de la proteína en cuestión: las proteínas de mayor peso molecular migran una
menor distancia que aquellas con menor peso molecular, y se separan entre ellas más o menos
dependiendo de la concentración de acrilamida del gel de corrido. La realización del gel será
diferente en función del tamaño de la proteína a visualizar, de manera que para proteínas de gran
peso molecular se utilizará un porcentaje bajo de poliacrilamida (el gel poseerá poros de mayor
tamaño) y viceversa. Los geles de poliacrilamida ‐ SDS usados en el presente trabajo han variado del
10 ‐ 14% de acrilamida.
75
Materiales y métodos
El gel de poliacrilamida ‐ SDS puede realizarse en tampón glicina o en tampón tricina, en
función del peso molecular de las proteínas a separar. En este trabajo se han utilizado geles de tricina
al 14% y geles de glicina al 10%. Las cantidades de reactivos utilizados para preparar dichos geles se
especifican en la Tabla 2.13 y en la Tabla 2.14.
Tabla 2.13. Relación de reactivos y volúmenes necesarios para obtener geles de poliacrilamida ‐ SDS (14% de
acrilamida) en tampón Tricina.
Reactivos Gel de corrido ( running ) Gel de empaque ( staking )
Acrilamida + Bisacrilamida (49,5%) 1,52 ml 202 µl
Tris ‐ HCl 2,5M pH 8.45 1,8 ml 620 µl
Agua 1,72 ml 1,64 ml
SDS (10%) 47 µl 30 µl
TEMED 10 µl 5 µl
Persulfato Amónico (50%) 10 µl 15 µl
Tabla 2.14. Relación de reactivos y volúmenes necesarios para obtener geles de poliacrilamida ‐ SDS (10% de
acrilamida) en tampón Glicina.
Reactivos Gel de corrido ( running ) Gel de empaque ( staking )
Bis/Acrilamida (40%) 2,5 ml 0,5 ml
Running Buffer 2,5 ml 1,26 ml
SDS (10%) 100 µl 25 µl
Agua 4,86 ml 3,18 ml
TEMED 20 µl 5 µl
Persulfato Amónico (50%) 20 µl 10 µl
Antes de comenzar con la electroforesis, las muestras se prepararon ajustando la cantidad de
proteína a cargar y se mezclaron con el tampón de disociación 8X, que contiene 2,3% de SDS, 10% de
β‐ mercaptoetanol, 20% de glicerol y 0,005% de azul de bromofenol en un tampón de 10 mM Tris ‐ HCl
a pH 6,8. Posteriormente, estas muestras fueron cargadas en los geles y se corrieron a un voltaje
constante de 90 V, en el caso de usar el tampón tricina, o de 160V, si el tampón era glicina.
Una vez terminada la electroforesis, se transfirieron las proteínas desde el gel hasta una
membrana de nitrocelulosa o PVDF (si la electroforesis es con gel SDS ‐ Urea). La transferencia se llevó
a cabo usando el sistema en sándwich (Bio ‐ Rad), en una cubeta de trampón de transferencia,
durante 90 min. a 310 mA. Una vez terminada la transferencia, lavamos la membrana con PBS, y
bloqueamos con leche al 5% en 0,1% (v/v) de Tween ‐ 20 en PBS 0,1 M (TPBS) pH 7,4 durante 30
minutos. Las proteínas transferidas a la membrana se observan mediante tinción con rojo Ponceau’s
al 0,1% en ácido acético 5%.
76 Materiales y métodos
A continuación, incubamos la membrana con el anticuerpo primario (en TPBS ‐ leche al 1,5%)
durante toda la noche a 4 °C. La relación de los anticuerpos empleados y sus características más
relevantes se detallan en la Tabla 2.15. Terminada la incubación, lavamos la membrana con TPBS (3 x
5 minutos) e incubamos en el anticuerpo secundario acoplado a la enzima peroxidasa de rábano,
capaz de procesar un sustrato (ECL ‐ plus) originando un producto quimioluminiscente cuya señal será
proporcional a la cantidad de proteína específica de la muestra. La señal quimioluminiscente
obtenida se revela en cuarto oscuro utilizando películas fotográficas (Hyperfil ‐ ECL, Amersham;
revelador y fijador Kodad). Todos los anticuerpos secundarios se incuban como mínimo durante 1
hora a temperatura ambiente en TPBS. La señal quimioluminiscente es recogida con el sistema de
captación IQ LAS 4000 mini gold. Finalmente, la intensidad de las bandas de las películas se
determinará utilizando el software PCBAS v2.0 sobre las imágenes escaneadas (Epson 3200).
Tabla 2.15. Marcadores detectados mediante Western ‐ blot . Se indica la dilución de uso, el tamaño de la
banda reconocida, el animal de obtención y la referencia junto a la casa comercial.
Anticuerpo primario Dilución de uso Banda reconocida Animal de
obtencion Referencia
Anti ‐ A β (6E10) 1:5000 4,5 kDa (1 mer) Ratón Signet; Ref.: 6E10
AT8
Fosfo ‐ Tau (Ser199/202 ‐ Thr205) 1:1000 79 kDa Ratón Thermo ‐ Scientific;
ab34719
AT100
Fosfo ‐ Tau (Thr212 ‐ Ser214) 1:1000 79 KDa Ratón Innogenetics
NeuN Ratón
B ‐ actina 1:1000 42 KDa Ratón Sigma ‐ Aldrich
2.11.7. Aislamiento de proteínas solubles (S1)
Otra técnica empleada para la obtención de proteínas es la que se lleva a cabo en medio
acuoso en ausencia de detergentes. El uso de esta técnica de basa en la necesidad de usar tejido
fresco para ciertas aproximaciones bioquímicas. Este método de solubilización nos permite separar la
fracción soluble de proteínas extracelulares y citosólicas del contenido de membranas lipídicas del
tejido procesado, por ultracentrifugación diferencial.
Para la obtención de fracción soluble S1 hemos utilizado tejido de hipocampo de humanos. En primer
lugar disgregamos el tejido en tampón isotónico tris ‐ salino (1:5 p/v) al que añadimos un cocktail de
inhibidores de proteasa y fosfatasa. La disgregación se lleva a cabo usando las tijeras apropiadas
hasta que el tejido queda totalmente fraccionado; seguidamente pasamos la suspensión de tejido
resultante a un homogenizador Dounce´s (Wheaton) y lo sometemos a 15 pases con el pistilo de
menor diámetro (paso de luz: 0.089 ‐ 0.14mm) y 15 pases con el de mayor diámetro (paso de luz:
0.025 ‐ 0.076 mm). El homogenado obtenido se centrifuga a 100000 xg durante 1 hora a 4ºC (Optima
Max, Beckman Coulter). El sobrenadante que obtenemos de esta ultracentrifugación es lo que
77
Materiales y métodos
consideramos fracción proteíca soluble o S1 y el precipitado serán los restos de membranas,
agregados proteicos y proteínas insolubles. Ambas fracciones se guardan por separado a ‐ 80ºC hasta
su uso.
2.12 ESTUDIOS IN VITRO
2.12.1 Cultivos de líneas celulares
Línea microglial BV2 / Línea astroglial WJE
Las células microgliales de la línea BV2 y las células astrogliales de la línea WJE son cultivadas
de forma rutinaria en medio DMEM ‐ F12 (PAA) suplementado con glutamina 2 mM, suero fetal
bovino (10%), 100 U/ml de penicilina (PAA) y 100 μ g/ml de estreptomicina (PAA) e incubadas a 37ºC,
5% CO2. Estas células se subcultivan 2 veces por semana para mantener un grado de confluencia
adecuado al crecimiento celular. Mediante un rascador se recogen las células del frasco de cultivo y
se resuspenden en medio de cultivo correspondiente haciendo diluciones 1:10 antes de sembrar en
un frasco nuevo. El número de células y soporte utilizado en cada ensayo van a depender de las
condiciones experimentales empleadas.
2.12.2. Cultivos Celulares Primarios
Cultivos microgliales primarios
Los cultivos primarios microgliales se realizan según se describe en Jimenez et al, 2008
utilizando ratones neonatales (2 ‐ 3 días). Los cerebros diseccionados se tratan, 5 min a 37ºC, con
tripsina ‐ DMEM ‐ EDTA (Biowhittaker, Cambrex, Belgium). El tratamiento se detiene utilizando medio
completo DMEM ‐ F12 + 10% FBS y las células se disocian mecánicamente. Después de la disociación,
los restos celulares se eliminan por filtración y las células se siembran (a una densidad aproximada de
250000 células/ml) en placas tratadas con poli ‐ D ‐ lisina y conteniendo DMEM ‐ F12 + 10% FBS (con
glutamina, aninoácidos no esenciales y 1% penicilina ‐ estreptomicina). La incubación se realiza a 37ºC
en atmósfera humidificada y a 5% de CO2. El medio se remplaza cada 4 ‐ 5 días. Después de 15 días en
cultivo, los astrocitos se retiran por disociación suave, y las células microgliales se estimulan
mediante incubación durante 3h con LPS. Una vez estimuladas, la expresión de los distintos
marcadores se realiza mediante qPCR a partir de cDNA preparado a partir de los RNAs de los
distintos cultivos.
Para la preparación de células microgliales adultas se utilizan cerebros obtenidos de ratones
WT de 3 meses de edad. Las células son disociadas como se indica arriba, y la microglia se aísla
mediante centrifugación en gradiente discontinuo de Percoll (37% y 25%) seguido por el aislamiento
cell ‐ shorting utilizando anti ‐ CD11b ‐ APC. Una vez aisladas, las células son estimuladas, 3h, con LPS
siguiendo el protocolo anterior.
78 Materiales y métodos
Cultivos neuronales primarios
Los cultivos neuronales primarios de la línea celular N2a se realizaron según se describe en
(Jimenez et al. 2014). Brevemente, Las células N2a se siembran en una densidad de 25000
células/cm2 en un medio rico en glucosa DMEM/OptiMEM (50% ‐ 50%) suplementado con un 2mM de
glutamina y un 5% de suero fetal bovino en presencia penicilina y estreptomicina (100 unidades/mL y
0,01 mg/ml, respectivamente). La incubación se realiza a 37ºC en atmósfera humidificada y a 5% de
CO2.
2.12.3. Tratamiento de Estimulación de Cultivos Celulares con Fracción S1 de
Humanos
Para llevar a cabo el tratamiento con S1 humanos utilizamos cultivos de línea microglial N13,
y cultivos primarios procedentes de ratón de microglía y astrocitos (descritos previamente).
En el caso de los cultivos microgliales de N13, sembramos 90.000 células por pocillo en una
placa de 24 pocillos (área de cultivo: 1,8 cm2). Para el uso de células procedentes de cultivos
primarios, sembramos 500.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Tras el mantenimiento
y crecimiento de los cultivos (24 h para la línea N13 y 15 días para los cultivos primarios) llevamos a
cabo el tratamiento de los mismos utilizando la fracción soluble S1 obtenida de las muestras
humanas. Para ello, tras haber retirado el medio de cultivo antiguo y haber añadido medio nuevo,
añadimos un volumen de S1 manteniendo una proporción 1/10 v/v que dejaremos durante 3 horas
de tratamiento. El medio de cultivo utilizado será el especifico de la línea celular/primaría tratada
(detallado anteriormente). Transcurridas las 3 horas de tratamiento, retiramos el medio de cultivo y
recogemos las células utilizando el reactivo Trisure, ayudándonos de un rascador levantamos las
células de la placa y las pasamos a un tubo de plástico donde el proceso a seguir para la extracción de
ARN y proteínas será el mismo utilizado para la obtención de ARN y proteínas a partir de tejido de
hipocampo humano. Una vez obtenido el ADNc pasamos a medir todos aquellos marcadores de
interés mediante western blot y RT PCR Real Time.
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