Actividad del Sistema Renina-Angiotensina en relación con sus polimorfismos genéticos

Departamento de Bioquímica, Biología Molecular, Inmunología y Química Orgánica. LUIS MORCILLO HIDALGO ACTIVIDAD DEL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA EN RELACIÓN CON SUS POLIMORFISMOS GENÉTICOS MÁLAGA 2000 AUTOR: Luis Morcillo Hidalgo EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está sujeta a una licencia Creative Commons: Reconocimiento - No comercial - SinObraDerivada (cc-by-nc-nd): Http://creativecommons.org/licences/by-nc-nd/3.0/es Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es DR. D. ARMANDO REYES ENGEL, Proferor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Inmunología y Química Orgánica de la Universidad de Málaga y, DR. D. PEDRO ARANDA LARA, Jefe de la Unidad de Hipertensión y Valoración de Riesgo Vascular del Hospital Universitario Carlos Haya de Málaga CERTIFICAN que la Tesis de Doctorado que presenta D. Luis Morcillo Hidalgo, Licenciado en Medicina y Cirugía, ha sido realizada bajo nuestra dirección, con el título "Actividad del sistema renina-angiotensina en relación con sus polimorfismos genéticos", para su lectura y defensa ante el tribunal designado por la Comisión de Doctorado de la Universidad de Málaga. Una vez redactado el presente trabajo, ha sido revisado encontrándose conforme para ser defendido y aspirar al grado de Doctor en Medicina. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, se expide el siguiente certificado. Lo que se firma en Málaga a 11 de Octubre del 2000. Fdo: Armando Reyes Engel. Fdo: Pedro Aranda Lara. Agradecimientos: Al profesor Armando Reyes Engel, por haber aceptado la realización de la tesis bajo su dirección. Le agradezco su amabilidad, experiencia y continua dedicación, su disposición a ayudarme en todo momento y resolver las dudas que le planteé, así como su paciencia y dedicación a la hora de valorar los resultados. Al doctor Pedro Aranda Lara por introducirme en el mundo de la investigación guiarme con su ejemplo, prestarme su apoyo, así como aconsejarme en todos los aspectos y codirigir mi tesis, poniendo su dilatada experiencia a mi disposición. A ambos por enriquecerme humanamente con su esfuerzo y estímulo. Agradezco al profesor Carlos Ferrario, y a su equipo investigador, como experto en la materia y “padre” del descubrimiento de los efectos de la angiotensina-(1-7), su inestimable contribución tanto en la clarificación de los objetivos a estudiar como en la determinación de los niveles de los péptidos de la angiotensina en su laboratorio. A “Nani” por su ayuda en la realización del trabajo de campo y laboratorio, su buen hacer y constante ánimo. A Pedro Muñoz por su inestimable ayuda en la realización técnica y estadística de este estudio, y por los buenos ratos pasados juntos. A “Chechu” por su colaboración y por hacer el trabajo más agradable. A Manuel Muñoz por su voluntad y buena disposición. Al Profesor D. Miguel Morell por el interés mostrado en mi trabajo y formación. A D. Javier Aranda Lara por su estimada colaboración y ayuda en el manejo estadístico de la tesis. Al profesor Dr. José Luis Diéguez Lucena por iniciarme en el conocimiento del trabajo de laboratorio. A todos y cada uno de los alumnos y amigos, que participaron en el estudio de una forma desinteresada y sin los cuales éste no existiría. A Pedro Aranda Granados, amigo, que ha hecho más llevaderas las dudas y los largos años de estudio compartiendo mis ilusiones. Al Dr Néstor Zurita, compañero de fatigas al que tanto me une humana y profesionalmente, por los buenos y malos ratos pasados juntos. A Rocío que pone ilusión en mi vida. A mis padres y hermanos por estar a mi lado en todo momento y a quienes debo lo que de bueno hay en mí. A “Rosi” y otras tantas personas por crear un ambiente agradable en el que trabajar. El trabajo presentado en esta memoria ha podido realizarse gracias a la experiencia y ayuda de otras muchas personas a las que estoy sinceramente agradecido. A mis Padres y Hermanos ÍNDICE: INTRODUCCIÓN 1 1.1. Sistema Renina-Angiotensina. 2 1.2. Angiotensinógeno. 2 1.2.1. Polimorfismos del angiotensinógeno e HTA. 5 1.2.1.1. Mutación M235T 6 1.3. Renina. 7 1.3.1. Bioquímica de la formación de renina. 8 1.3.2. Mecanismos de acción. 9 1.3.3. Control de secreción de renina. 10 1.3.3.1. Señales hemodinámicas. 10 1.3.3.2. Señales neurogénicas. 10 1.3.3.3. Señales humorales y hormonales. 11 1.4. Enzima convertidor de la angiotensina I. 13 1.4.1. Polimorfismos de la ECA y su relación con varias patologías. 15 1.5. Angiotensina II. Células diana y funciones fisiológicas. 18 1.6. Angiotensinasas y péptidos derivados de la angiotensina II 21 1.6.1. Angiotensinasas. 21 1.6.2. Péptidos derivados de la angiotensina II. 21 1.6.2.1. Angiotensina III. 22 1.6.2.2. Angiotensina-(1-7). 22 1.6.2.3. Angiotensina-(1-5). 25 1.6.2.4. Angiotensina IV. 25 1.7. Receptores de la angiotensina. 25 1.7.1. Mecanismos celulares de acción de la angiotensina II. 25 1.7.2. Heterogeneidad del receptor de angiotensina II. 28 1.7.3. Clasificación de los subtipos. 30 1.7.4. Receptor AT1. 32 1.7.4.1. Clonaje del receptor AT1. 33 1.7.4.2. Polimorfismos genéticos del gen del AT1 y su relación con la génesis de la HTA y otras enfermedades. 34 1.7.4.3. Subtipos del receptor AT1. 35 1.7.4.4. Regulación de la expresión del ARNm del receptor AT1. 37 1.7.4.5. Desensibilización del receptor AT1. 39 1.7.5. Receptor AT2. 40 1.7.5.1. Subtipos del receptor AT2. 40 1.7.5.2. Regulación de la expresión del receptor AT2. 40 1.7.6. Efectos fisiológicos mediados por los receptores AT1 y receptores AT2. 41 1.8Relación entre los polimorfismos de los genes del SRA con los niveles plasmáticos de los componentes del eje bioquímico. 43 1.8.1Polimorfismos del gen del angiotensinógeno. 43 1.8.2Polimorfismos del gen de la ECA. 44 1.8.3Polimorfismos del gen del receptor AT1. 45 OBJETIVOS 46 MATERIAL Y MÉTODOS 49 3. 1. Reactivos. 50 3. 2. Materiales. 51 3. 3Métodos. 51 3.3.1Preparación y extracción de la muestra para la determinación de los péptidos de la angiotensina. 51 3.3.1.1Fabricación de la solución inhibidora de la proteasa. 51 3.3.1.2Protocolo de extracción de sangre para la medición. de los péptidos de la angiotensina. 52 3.3.2Determinación de los niveles plasmáticos de los péptidos de la angiotensina. 53 3. 3. 3Obtención y preparación de la sangre para la determinación de los polimorfismos. 54 3.3.3. aMétodo corona de linfocitos. 54 3.3.3. bMétodo de sangre total 54 3. 3. 4Extracción de DNA. 55 3. 3. 5Digestión de DNA. 55 3. 3. 6Reacción en cadena de la polimerasa(PCR). 55 3. 3. 6.1Protocolo de PCR para el polimorfismo I/D del gen de la ECA 55 3. 3.6.2Protocolo de PCR para el polimorfismo A1166C del gen del receptor AT1 de la angiotensina II. 57 3. 3.6.3Protocolo de PCR para el polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno. 58 3. 3. 7Electroforesis en gel de agarosa. 59 3. 3. 8Colocación de las muestras en el gel de agarosa. 59 3. 3. 9Visualizacion de las bandas. 59 3. 3.10Composición y fabricación de los productos usados para la determinación última de los polimorfismos. 60 3.3.11Tratamiento estadístico de los datos. 62 RESULTADOS 63 4.1Datos descriptivos de la población del estudio. 64 4.2-Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la población a estudio. 66 4.3Comparación entre los Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la muestra a estudio dependiendo de los polimorfismos del gen del Angiotensinógeno, de la ECA y del AT1R. 66 4.3.1Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la muestra a estudio en relación a los distintos genotipos del polimorfismo M235T del gen del Angiotensinógeno 66 3 plasma. Presenta cierta heterogeneidad variando su peso molecular entre 60 y 65 kD, lo que podría corresponder con las formas precursoras, o con diferentes grados de glicosilación de dicha glicoproteina. Siendo el tamaño mínimo necesario para su reconocimiento y rotura por la renina el de un octapéptido. Actualmente se conoce la secuencia nucleotídica completa del ARNm del angitensinógeno humano (Kageyama y cols, 1984), se han conseguido aislar clones de cDNA del mismo e incluso se ha llegado a poder sintetizar por E. coli in vitro (Kunapuli y cols, 1987). La producción de angiotensinógeno ocurre fundamentalmente en el hígado, si bien existen síntesis locales de variantes del angiotensinógeno que apoyan la idea de la existencia de un SRA independiente, tanto en el sistema nervioso central (Murakami y cols,1984; Lippoldt y cols,1995), como en el riñón, el corazón y la vasculatura (Campbell y Habener, 1986), y en el tejido adiposo humano. Además varios estudios de Fried y Simpson (1986) y de Dzau y cols (1988) han demostrado la existencia de ARNm de angiotensinógeno en cortex y médula renal de rata y ratón, así como en células del túbulo proximal, lo que indicaría, que es sintetizado por estas células y secretado al intersticio cortical, donde la renina actúa sobre él para producir angiotensina I. El control en la producción de angiotensinógeno, es realizado principalmente por hormonas que modulan la concentración de su ARNm en los tejidos a través de la regulación de su transcripción. La función principal de estas hormonas (Deschepper,1994) es la de mantener la producción del angiotensinógeno en la fase de rápido consumo del mismo por altos niveles de renina en plasma; puesto que el angiotensinógeno es un factor limitante en la actividad enzimática de la renina. La concentración de angiotensinógeno está aumentada por los estrógenos, los glucocorticoides, las hormonas tiroideas y tras nefrectomía. Así, en el mismo sentido, la AII estimula la síntesis de angiotensinógeno por el hígado en un mecanismo de retroalimentación positivo. 4 Esquema 1: Eje Renina-Angiotensina ANGIOTENSINÓGENO ANGIOTENSINA I ANGIOTENSINA II AT1 ANGIOTENSINA -(1-7) ECA RENINA CHIMASA ANGIOTENSINA -(1-5) PRORENINA BRADIQUININA BRADIQUININA -(1-5) PROLIL ENDOPEPTIDASA NEPRILISINA ENDOPEPTIDSA NEUTRA 24.14 PROLILENDOPEPTIDA PROLILCARBOXIPEPTIDASA 5 1.2.1. Polimorfismos del angiotensinógeno e HTA: El gen del angiotensinógeno humano contiene 5 exones (Gaillard y cols, 1989) y se encuentra en el cromosoma 1 (Abonia y cols, 1993) en la región 1q42-43 (Gaillard-Sánchez y cols, 1990; Isa y cols, 1989,1990). La secuencia de aminoácidos que produce es parecida a la de la alfa-1antitripsina y a la de la antitrombina III. La evidencia más sólida de una relación entre la HTA esencial y un gen en humanos la obtuvieron Jeunemaitre y cols en 1992 mediante un estudio con hermanos con dos poblaciones geográficamente diferentes, encontrando asociación genética entre HTA esencial y el gen del angiotensinógeno; asociación entre hipertensión y ciertas variantes moleculares del gen del angiotensinógeno; y unos niveles elevados de angiotensinógeno plasmático en sujetos hipertensos portadores de una variante del gen del angiotensinógeno fuertemente asociada a hipertensión. Evidencia que ha sido posteriormente refrendada por otros investigadores. Sin embargo esta relación también ha sido negada por otros autores, como Niu y cols (1998) mediante un estudio en población china. Se han identificado 15 variantes moleculares del angiotensinógeno encontrándose una asociación significativa de dos de ellas con la HTA esencial, la mutación M235T y la T174M la –1074t, la C532T y la G-6A (Jeunemaitre y cols, 1992) encontrándose ambas en una completa relación de desequilibrio. Siendo de ellas la M235T la determinada en nuestro estudio y la que merezca más nuestra atención. Hegele y cols (1994) encontraron asociación entre variaciones en la presión arterial sistólica y la mutación T174M en varones de una población "cerrada" como los Hutterites de Norteamérica. Si bien Niu y cols (1999) no hallan tal relación en una población china. Además existe una variante en el promotor proximal del gen del AGT (angiotensinógeno), consistente en una sustitución de Guanina por 6 Adenina 6 pares de bases por encima del punto de inicio de la transcripción, que está en estrecha relación de desequilibrio con el alelo T235, y afecta a su ritmo basal de transcripción, pudiendo predisponer al desarrollo de HTA esencial (Inoue y cols, 1997). 1.2.1.1. Mutación M235T: Consiste en la substitución de aminoácidos, en la posición 235, de una Metionina (Met) por una Treonina (Thr). En el estudio de Jeunemaitre y cols (1992), antes referido, es esta variante del gen la que guarda una mayor relación con la hipertensión (junto con la mutación T174M). En el mismo sentido apunta el estudio de Hata y cols (1994) que encuentra asociada la mutación M235T con la hipertensión en población japonesa, y el de Tiret y cols (1998) que encuentra el alelo T235 más frecuente en varones y mujeres con HTA. La frecuencia de esta mutación varía en los distintos grupos étnicos, así como lo hace la frecuencia de la HTA esencial. En la población caucásica las frecuencias del homocigoto T235, del heterocigoto M235T y del homocigoto M235 son respectivamente del 12% , del 46% y del 42% ; siendo en la población afroamericana del 70, 28 y 2% respectivamente según los datos aportados por Lifton y cols (1993) y en la población china de 70%, 25% y 5% respectivamente según los datos de Young y cols (1998). Teniendo presente que la incidencia de HTA esencial en negros es mayor que en blancos. A su vez Bloem y cols (1995) comparando dos grupos de niños, negros y blancos, encontró que la frecuencia del alelo T235 era del 81% en los primeros, y del 42% en blancos, siendo a su vez los niveles de AGT el 19% mayores en el grupo de niños negros. En la población japonesa esta mutación también ha sido encontrada más frecuente que en la caucásica (Hata y cols, 1994). 7 Es más, según Niu y cols (1998), la pertenencia a un grupo étnico puede marcar una diferencia en el papel que juegan varios genes en ciertos rasgos complejos. Sin embargo otros investigadores no encontraron asociación significativa entre el M235T y el desarrollo de HTA esencial, como Fornage y cols (1995), Niu y cols (1998) y como Caulfield y cols (1994 y 1995). En el mismo sentido Frossard y cols (1998) en una población étnica caracterizada por la abstinencia del tabaco y del alcohol, como es la de los Emiratos Árabes Unidos, tampoco encontró dicha relación con la HTA, ni con la hipertrofia ventricular izquierda, la enfermedad isquémica cardíaca o el infarto de miocardio; pero sí encontró el alelo T235 más frecuente en el grupo de hipertensos esenciales y menos frecuente en el de supervivientes de IAM, así como un descenso en su frecuencia con la edad. Sin embargo Fernandez-Arcas y cols (1999) encuentran el genotipo MM (así como el homocigótico para el C1166 del receptor AT1 de la AII) como factor de riesgo para el desarrollo de IAM. La mutación del gen del AGT, M235T ha sido asociada así mismo con otras patologías, como la preeclampsia y eclampsia a través de varios estudios (Ward y cols, 1993; Arngrimsson y cols, 1993) en mujeres caucásicas y japonesas. Y con la enfermedad coronaria cardíaca, como hicieron Katsuya y cols (1995), que concluyeron que el T235 es un factor de riesgo independiente que multiplica por dos el riesgo de enfermedad coronaria. Sin embargo, Jeunemaitre y cols (1997) no encuentran relación del polimorfismo M235T (ni del A1166C del AT1, ni del I/D del ECA) con la arteriosclerosis. 1.3. Renina: En 1934 Goldblatt y cols constataron que la ligadura parcial de la arteria renal provocaba una hipertensión arterial mediante la liberación de una sustancia presora en sangre arterial. Pero no fue hasta 1940, cuando 8 Page y Helmer demostraron que se trataba de una enzima que actuaba sobre un substrato (el angiotensinógeno) para dar lugar a un principio activo (la angiotensina) al cual ellos denominaron “angiotonina”. De esta forma la renina actua sobre el angiotensinógeno liberando un decapéptido, la angiotensina I (Esquema 1). La mayor parte de la renina circulante se produce en el riñón, como confirma el hecho de que tras la nefrectomía bilateral los niveles de renina caigan a valores indetectables. Además se ha demostrado que el riñón es el único tejido con la capacidad de convertir la prorrenina (forma inactiva) en renina, y secretarla a la circulación, o bien, almacenarla en gránulos (von Lutterotti y cols,1994). Si bien se ha encontrado ARNm e isoenzimas de la renina en otros tejidos, como cerebro, glándula adrenal, grandes vasos,útero, placenta y glándula submandibular de ratón y de rata (Dzau y cols,1988 y 1994). 1.3.1. Bioquímica de la formación de renina: La renina es una aspartil-proteinasa, sintetizada como una preproteina, que es un precursor inactivo y es convertida en prorrenina, una forma también inactiva, pero más pequeña, que es finalmente procesada en renina, la forma activa. En el plasma humano la renina circula en ambas formas, activa e inactiva (Sealey y cols, 1983) siendo los niveles de prorrenina, la forma inactiva, considerablemente mayores que los de renina, la forma activa, en condiciones normales. La renina se produce en células modificadas de la musculatura lisa de la arteriola aferente al glomérulo renal, las llamadas células yuxtaglomerulares. Allí es almacenada en gránulos intracelulares, desde donde es liberada al torrente sanguíneo mediante el proceso de degranulación, que consiste en la fusión de los gránulos a la membrana celular. Pero antes de esta liberación la renina sufre una serie de procesos moleculares. 9 La secuencia génica de nucleótidos es conocida y consiste en diez exones interrumpidos por nueve intrones, que se corresponden con un ARNm de 1500 bases, siendo en total 12000 bases (Hobart y cols, 1984). El producto primario de la traducción del ARNm, la preprorrenina, contiene un péptido señal, que es eliminado rápidamente por por el retículo endoplásmico, dando lugar al zimógeno prorrenina. La prorrenina es empaquetada en los gránulos de almacenamiento donde se lleva a cabo la maduración postraduccional, que incluye la activación de la prorrenina a renina mediante una rotura proteolítica y una glicosilación aún muy poco conocidos. La renina es posteriormente eliminada de los gránulos secretorios o transportada a través de la membrana hacia la sangre. Hay muchos puntos de posible control de la sintesis de renina y de su secreción. Recientes investigaciones sugieren que muy probablemente la estimulación del SRA ocurre transcripcionalmente, con la rápida liberación de la renina recién sintetizada y, en todo caso, sólo limitado por la cantidad almacenada. Existen también mecanismos postraduccionales (Nakamura y cols, 1985), que excluyen posibles efectos en la velocidad del transporte por la membrana o en la liberación del gránulo. 1.3.2. Mecanismos de acción: Como otras aspartilproteinasas, la renina contiene dos grupos carboxilos en el sitio activo, provinientes de ácido aspártico, que son esenciales para su función catalítica, sin embargo difiere de otras aspartilproteinasas en muchos aspectos: es activa a pH neutro, contiene grupos sulfidrilos libres y es altamente selectiva por su sustrato, el agiotensinógeno. La renina renal tiene un peso molecular entre 37000 y 40000 , según la especie, su punto isoeléctrico se encuentra entre 5.2 y 5.8 y su pH óptimo de actuación es 6.0 (Dzau y cols, 1988). Mediante modelos estructurales diseñados por ordenador se observa que el sitio catalítico de la renina está formado por una hendidura entre dos lóbulos de la molécula 10 enzimática. Dicho hueco liga el sustrato acomodando 6-8 aminoácidos de la molécula de angiotensinógeno. El acoplamiento del sustrato y el enzima permite la hidrólisis entre los residuos Leu-Leu, rindiendo el decapéptido agiotensina I.. 1.3.3. Control de secreción de renina : La secreción de renina está controlada por tres principales clases de señales (Freeman y cols 1983): hemódinámicas, neurogénicas y humorales . 1.3.3.1. Señales hemodinámicas : Las células yuxtaglomerulares son sensibles a la eslasticidad de la arteriola glomerular aferente de tal modo que, una disminución de la elasticidad conlleva un incremento de la liberación de la renina y viceversa. Maniobras que favorezcan el estancamiento de la sangre en las extremidades inferiores (ortoestatismo) ó inducir la centralización del volumen sanguíneo (como la inmersión en agua) dan lugar a la estimulación y a la inhibición de la liberación de renina respectivamente. Condiciones caracterizadas por un descenso del volumen circulante efectivo (fallo cardíaco, cirrosis hepática, enfermedad de Addison, hemorragia o pérdida de gran volumen extracelular, etc.) se acompañan de una marcada estimulación del SRA. De hecho, la medida de la actividad plasmática de renina es considerada como el mejor medio de conocer el volumen circulante efectivo. Cuando existe un estrechamiento anatómico de la arteria renal se puede producir hipertensión arterial mediada por la exagerada liberación de renina, causada por la caida de la presión arterial renal, que puede ser tratada mediante intervención quirúrgica o por inhibición farmacológica del SRA. 1.3.3.2. Señales neurogénicas : Los receptores adrenérgicos de las células yuxtaglomerulares reaccionan frente a señales neurogénicas, ya sea directamente por los nervios renales o por las catecolaminas sistémicas circulantes. La secreción 11 de renina es estimulada por mecanismos beta-adrenérgicos, aunque persiste la controversia de si en este mecanismo participan los receptores beta-1 , beta-2, o un receptor beta no selectivo. Las catecolaminas circulantes liberadas a apartir de la médula adrenal estimulan la secreción de renina a través de la activación de los receptores beta-adrenérgicos. Una mínima estimulación de los nervios renales con una intensidad que no altera la hemodinámica renal ni la excreción urinaria de sodio, aumenta la tasa de secreción de renina. Esta respuesta es mediada a través de la activación de los receptores beta-adrenérgicos sobre la células yuxta-glomerulares (Fray y cols , 1987). Por el contrario una activación directa de los receptores alfaadrenérgicos sobre estas células, produce la inhibición de la secreción de renina. El papel de la estimulación alfa-adrenérgica en la supresión de la liberación de renina es aún ambigüa y puede ser más complicado que un papel dual de los receptores presinápticos alfa-2 inhibiendo la liberación de renina y los postsinápticos alfa1 estimulando su liberación. El éxito de los inhibidores beta-adrenérgicos disminuyendo la presión arterial elevada se explica en parte por la inhibición de la liberación de renina. 1.3.3.3. Señales humorales y hormonales : Las células yuxtaglomerulares responden ante un gran número de señales hormonales e iónicas del ambiente , además de a las catecolaminas. La somatostatina interfiere la liberación de renina mediante señales neurogénicas (Brosihan y Ferrario, 1983). El péptido intestinal vasoactivo (VIP) estimula la liberación de renina (Porter y cols, 1983). La hormona paratiroidea (PTH) y el glucagón estimulan la liberación de renina, mientras que la AII y el factor atrial natriurético (ANF) inhiben la secreción de renina (Laragh, 1985) .Aunque la significación de la PTH, el glucagón y el VIP es aún incierta y la del ANF puede reflejar bien una acción directa sobre la mácula densa y cels yuxtaglomerulares o bien una consecuencia directa de su respuesta natriurética (Cottier y cols, 1988), la de la AII es claramente importante. Esta última representa un típico 12 mecanismo de retroalimentación, que puede ser interrumpido por los bloqueantes del ECA: la inhibición de la formación de AII disminuye la presión arterial y se acompaña de un marcado aumento de la liberación de renina. Pero más importante aún es que las células yuxtaglomerulares responden también a influencias iónicas. La mácula densa es un conjunto de células especializadas localizadas en la conjunción del final del asa de Henle y el comienzo del túbulo distal. Se propone que la mácula densa detecta disminuciones en la carga de sodio en la parte ascendente del asa de Henle y envía señales a las células yuxtaglomerulares para incrementar la liberación de renina (Skott y Briggs, 1987). Esto supone que la tasa de excreción de renina está inversamente relacionada con la carga de cloruro sódico en la mácula densa. El mecanismo por el cual ocurre esta interacción permanece incierto, pero puede ser debido a influencias supresoras de señales provinientes de las células de la mácula densa. Las arteriolas aferentes aisladas con segmentos de mácula densa adheridos producen una menor cantidad de renina que las arteriolas sin mácula densa, según demostraron Itoh y cols en 1985. También la estimulación-secreción de renina muestra una influencia iónica. En el caso del calcio, la secreción de renina es estimulada por la disminución de calcio intracelular, mientras que un aumento del calcio intracelular la inhibe (Fray y cols, 1987). El magnesio tiene el efecto inverso. Al contrario que en la mayoría de las células endocrinas, las células yuxtaglomerulares parecen liberar renina cuando se hiperpolarizan, o bien cuando disminuye el calcio intracelular por acción de las catecolaminas o la PTH, efecto antagonizado por ouabaína, una concentración depolarizante de K, la ADH, la angiotensina y la noradrenalina. 19 importante de la secreción de aldosterona. Una infusión prolongada de angiotensina induce en el humano una hipertensión con un balance positivo de sodio debido al hiperaldosteronismo secundario. La conservación del volumen esta además asegurada por el papel intrarrenal del SRA. La angiotensina liberada localmente constriñe la arteriola aferente y el mesangio glomerular, además de su acción directa en los túbulos distales. Por ello, la angiotensina juega un papel en el balance tubulo-glomerular, desvía el flujo sanguíneo a la corteza interna y a la médula, reduce el flujo renal total y la filtración glomerular. Bajo las mismas circustancias (e.g. shock), una formación prolongada de angiotensina llevaría a un fallo renal, aunque no sea un mecanismo de seguridad para preservar la función renal. Ésta se asegura por la estimulación vasodilatadora de las prostaglandinas (principalmente PGE2), que restablecen el flujo sanguíneo y la filtración glomerular . Cuando la presión de perfusión renal se reduce, la fracción residual de filtración glomerular puede ser principal o exclusivamente mantenida por la acción constrictiva de la angiotensina en la arteriola aferente. Un balance adecuado entre el SRA-Aldosterona y el sistema calicreina-quininaprostaglandina es un pre-requisito para el mantenimiento de un tono vascular ideal y el balance de sodio en condiciones fisiopatológicas . El péptido atrial natriurético puede reperesentar un sistema adicional responsable para una regulación fina del equilibrio homeostático vasoconstrucción-volumen gracias a sus efectos natriurético y vasodilatador y su capacidad de inhibir la liberación de renina y la secreción de aldosterona (Cottier y cols, 1988). Además de esta acción sobre las células del músculo liso de la arteriola, células yuxtaglomerulares y células de la zona glomerulosa de la glándula adrenal, la angiotensina actúa en células relacionadas: células del músculo liso del útero, induciendo la contracción, y en las células de zona fasciculada de la glándula adrenal, induciendo la biosíntesis de cortisol. 20 La angiotensina tiene otras acciones relacionadas con la homeostasis de la presión sanguínea. Induce la descarga simpática y la liberación de catecolaminas de la médula adrenal. También suprime el reflejo inhibitorio de la contracción cardíaca mediado por los baroreceptores durante la hipertensión sin afectar a la taquicardia producida en la hipotensión. Esto podía estar relacionado con el hecho de que la angiotensina excita a las neuronas simpáticas y suprime las neuroras motoras vagales cardíacas, y podría explicar por qué la disminución de la presión sanguínea producida por los inhibidores del ECA no se acompaña de una taquicardia refleja. Secundariamente, se ha demostrado una actividad presora central, mediada por los receptores de la angiotensina localizados en el hipotálamo anterior y en la región AV3V, incluyendo el órgano vasculoso de la lámina terminalis y el órgano subfornical. Todas estas localizaciones carecen de barrera hemato-encefálica, por lo que la angiotensina circulante puede alcanzarlas, además de la angiotensina generada en el propio cerebro. Es por esto que el SRA juega un papel en la regulación central de la presión sanguínea (Ganong, 1984). Se ha demostrado que la angiotensina aumenta el apetito de sodio y la sed, y promueve la liberación de vasopresina (ADH), actuando en el órgano subfornical y existiendo una relación neurofisiológica entre la regulación hormonal del agua, asegurada por la vasopresina, y la de sodio ejercida por el SRAaldosterona. De nuevo, parece que la angiotensina circulante, así como el SRA, juegan un importante papel cerebral . Otra acción central de la angiotensina, de importancia fisiológica incierta, reside en su capacidad de estimular directamente, in vitro ,la liberación de ACTH de las células corticotrofas de la glándula pituitaria anterior. Finalmente, los receptores de angiotensina hepáticos actúan en la glucogenolisis y la gluconeogénesis. 21 1.6. Angiotensinasas y péptidos derivados de la angiotensina II: 1.6.1. Angiotensinasas La angiotensina II es rápidamente metabolizada por varias enzimas proteolíticas no específicas llamadas angiotensinasas (Ledingham y Leary, 1974 ). Habiéndose descrito tres tipos de actividad angiotensinasa: 1) Aminopeptidasa o angiotensinasa A. Actúa sobre el extremo NH2-terminal de la molécula de AII. 2) Endopeptidasa o angiotensinasa B. Actúa sobre la unión Tyr4Ile5 para formar dos tetrapéptidos. 3) Carboxipeptidasa o angiotensinasa C. Actúa sobre el extremo COOH-terminal de la molécula. 1.6.2. Péptidos derivados de la angiotensina II La vida media de la AII es muy corta (menos de 1 minuto) debido a la degradación por las angiotenginasas , y la mayoría de la AII desaparece en un único paso a través de los lechos vasculares en varias regiones y órganos de la circulación sistémica. También se ha comprobado que aproximadamente, el 90% de la AII liberada sistémicamente es degradada en un único paso a través del riñón (Rosivall y cols, 1987). La vida media de la AII in vivo es considerablemente más corta que la vida media en sangre o plasma in vitro, esto implica que las 22 angiotensinasas del tejido juegan un papel predominante en la degradación de la AII invivo (Ledinham y Leary , 1974). Recientemente, se ha demostrado que algunos péptidos derivados de la AII como la angiotensina III, angiotensina-(1-7), angiotensina-(1-5) y angiotensina-(3-8) (Ang IV), pueden mediar acciones biológicas del SRA (Brosnihan y cols, 1988; Campagnole-Santos y cols, 1992). 1.6.2.1. Angiotensina III La angiotensinasa A libera el resíduo de ácido aspártico del extremo NH2-terminal de la AII para formar angiotensina III (des-Asp1-AII) La angiotensina III se encuentra en muy bajas concentraciones en la circulación en humanos, pero en rata, los niveles son mucho más altos. La angiotensina III presenta una alta potencia para estimular la liberación de aldosterona a partir de la glándula adrenal por el contrario, su potencia presora es relativamente baja comparada con la de AII (25%). 1.6.2.2. Angiotensina-(1-7): La formación de Angiotensina-(1-7) tiene dos posibles vias de origen, en una la angiotensinasa C libera el resíduo de fenilalanina del extremo COOH-terminal de la molécula de AII, dando lugar a la angiotensina-(1-7); pero la via más importante es la que procede directamente desde la AI, sin pasar por AII, mediante la participación de tres enzimas, la endopeptidasa neutra 24.11 (Neprilisina), la endopeptidasa neutra 24.15 y la prolilendopeptidasa 24.26. Dos de ellas, la neprilisina y la endopeptidasa 24.15, también contribuyen a la degradación de la bradicinina y del péptido atrial natriurético (Welches y cols, 1993; Ferrario y cols, 1998). Además la Angiotensina-(1-7) es un importante substrato de la ECA, que la degrada a Angiotensina 1-5 (Chappell y cols, 1998), existiendo además otros péptidos relacionados con la angiotensina(A)-(1-7), como la A-(2-7), A- (3-7), A-(4-7), A-(1-6) y la A-(1-5). 23 Comparándola con la angiotensina II, la Angiotensina-(1-7) tiene efectos iguales (estimula la liberación de ADH y prostanoides) y contrarios (no produce sed, VSC, HTA, ni liberación de Aldosterona), favoreciendo en conjunto una disminución de la presión sanguínea, por lo que se considera juega un papel importante en el control de la presión y por tanto en la HTA esencial, siendo por ello uno de los parámetros determinados en este estudio (Ferrario y cols, 1991; Chappell y cols, 1998). La Ang-(1-7) produce efectos biológicos importantes y muy selectivos, incluyendo la liberación de vasopresina in vitro (Schiavone y cols, 1988) y efectos cardiovasculares similares a los producidos por la AII cuando es microinyectada dentro de la médula dorsal-medial o de la médula ventrolateral (Campagnole-Santos y cols, 1989; Silva y cols, 1993). Sin embargo, la Ang-(1-7) carece de efecto presor tras administrarse periférica o intracerebro-ventricularmente (Campagnole-Santos y cols, 1992). Así es que su función, a un nivel bioquímico, es la estimulación de la síntesis y liberación de prostaglandinas vasodilatadoras y de óxido nítrico mientras que aumentan las acciones metabólicas de la bradicinina (Marcic y cols, 1999; Deddish y cols, 1998), además de alterar la reabsorción tubular de sodio y bicarbonato, mientras que a un nivel fisiológico, disminuye la actividad Na-K ATP-asa, induce la diuresis (Santos y Baracho, 1992), y ejercer un efecto vasodilatador (aparentemente nunca de forma aislada), bien bloqueando el efecto vasoconstrictor de la AII (Ueda y cols,2000), bien aumentando el efecto vasodilatador de la bradicinina (Li y cols, 1997; Paula y cols, 1999) (efecto únicamente contradicho por los resultados de Davie y cols, 1999, en cardiópatas en tratamiento con IECAs), o bien inhibiendo la ECA (Roks y cols, 1999). Además de estos efectos, experimentos recientes demuestran que la angiotensina-(1-7) tiene una acción antiproliferativa sobre las células musculares lisas vasculares, inhibiendo las acciones tróficas de la AII y disminuyendo la la expresión de los efectos mitogénicos del suero normal y del factor de crecimiento derivado plaquetario (Tallant y cols, 1999). 24 La ejecución de todos estos efectos parece estar mediada, según indican los datos disponibles, por un subtipo especial de receptor no-AT1-AT2, epecífico de la Angiotensina-(1-7) (Regitz-Zagrosek y cols, 1996; Nickenig y cols, 1997), que no activa a la fosfolipasa C ni aumenta los niveles intracelulares de calcio (Tallant y cols, 1991). Los niveles de la A-(1-7) se ha demostrado aumentan en la terapia con inhibidores de la ECA (Luque y cols, 1996; Santos y cols, 1992; Kohara y cols, 1993), pudiendo deberse, bien a un aumento en su producción (por un aumento de AI), o bien, a una disminución en su degradación, como apuntan Chappell y cols, (1998 y 2000). ESQUEMA 2.: Eje Renina-Angiotensina Modulación y retroalimentación ANGIOTENSINÓGENO ANGIOTENSINA I ANGIOTENSINA II AT1 ANGIOTENSINA -(1-7) ECA RENINA ANGIOTENSINA -(1-5) ESTRÓGENOS GLUCOCORTICOIDES HH. TIROIDEAS CATECOLAMINAS AGT 235T ECA D AT1 R C 25 Finalmente en estudios con sujetos normotensos e hipertensos esenciales, se ha demostrado la relación inversa de la concentración urinaria de A-(1-7) con la presión arterial sistólica, diastólica y media (Ferrario y cols, 1998). 1.6.2.3. Angiotensina-(1-5): Procede de la degradación de la A-(1-7) por la acción de la ECA (Chappell y cols, 1998), y a su vez también inhibe la actividad plasmática de la ECA, pero no tiene efecto en la contractilidad arterial (Roks y cols, 1999). 1.6.2.4. Angiotensina IV: Cuando la AII pierde los dos primeros residuos de aminoácidos del extremo NH2-terminal (Asp1 y Arg2) da lugar a la angiotensina IV o angiotensina-(3-8). Entre las respuestas fisiológicas mediadas por la angiotensina-(3-8) están las de mediar alteraciones del flujo sanguíneo cerebral y renal, procesos cognitivos (Wright y cols, 1993) y regulación del crecimiento de componentes dentro del sistema cardiovascular (Baker y Aceto, 1990). La infusión de angiotensina IV dentro de la arteria renal produce un aumento del fluido sanguíneo cortical (Coleman y cols, 1992). 1.7. Receptores de la angiotensina Para comprender los mecanismos moleculares responsables de la gran diversidad de efectos de la angiotensina II es necesario un estudio detallado de sus receptores, moléculas que unen angiotensina II y traducen sus efectos fisiológicos. 1.7.1. Mecanismos celulares de acción de la angiotensina II Los receptores de AII presentan un patrón común con la estructura de receptores proteicos, con 7 dominios transmembrana y acoplados a proteína G. Este patrón es común al de la superfamilia de receptores que incluye los receptores de aminas biógenas, fotopigmentos visuales, receptores de 26 hormonas glicoproteicas, receptores de autacoides derivados de lípidos y receptores de péptidos neurales. Esta convergencia de tantos tipos diferentes de receptores para mediadores químicos tan distintos se debe a que todos comparten un mecanismo común, la transducción de la estimulación del ligando mediante la activación de proteínas triméricas, que unen GTP y que actúan como intermediarios de los efectores intracelulares. Se ha demostrado la existencia de receptores específicos de alta afinidad para angiotensina II en músculo liso vascular, cortex y médula adrenal, corazón, cerebro, hígado, útero y riñón (Catt y Aguilera, 1980; Smith, 1986; Douglas, 1987). Tanto el número como la afinidad de los receptores están modulados por cationes divalentes y monovalentes (Douglas, 1987). Cationes divalentes, como el magnesio y el calcio, aumentan la concentración de los receptores de AII, mientras que los cationes monovalentes, como el sodio y el potasio, aumentan la afinidad del receptor por el péptido. El número de receptores es también modulado por la concentración de angiotensina II. El aumento de la concentración de AII disminuye (regulación a la baja) el número de receptores en el músculo liso vascular y en las células mesangiales, mientras que la disminución de los niveles de AII aumenta (regulación a la alta) el número de receptores en estos tejidos. Por el contrario, el aumento de los niveles de AII aumenta (regulación a la alta) el número de receptores de AII en la glomerulosa adrenal y en el túbulo proximal, y a la inversa (Douglas, 1987). La alteración del número de receptores de AII modula la sensibilidad o correspondencia de los tejidos diana a la AII. La interacción de la angiotensina II con su receptor acoplado a proteína G da como resultado la activación de la fosfodiesterasa fosfolipasa C. La fosfolipasa C degrada el fosfatidílinositol 4,5-bifosfato (PIP2) unido a la membrana para dar lugar a inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol. El inositoltrifosfato se une a receptores específicos en los calciosomas (almacenes intracelulares de calcio), liberando calcio y, por lo tanto, aumentando el nivel 27 de calcio libre citosólico. En presencia de estos elevados niveles de calcio intracelular, el diacilglicerol activa a distintas proteinas quinasas, entre ellas a la proteína quinasa C (Griendling y cols, 1989; Tsuda y cols, 1993). La AII induce la despolarización celular por inhibición del transporte de potasio (Brauneis y cols, 1991), lo cual parece estar mediado por la proteína quinasa C y conduce a la entrada de calcio a través de los canales T. El aumento en la entrada de calcio extracelular y la movilización del calcio almacenado intracelularmente (mediado por el IP3) da como resultado el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular, lo cual induce la contracción del músculo liso vascular y de las células mesangiales glomerulares (Smith, 1986; Douglas, 1987; Kremer y cols, 1989; Kocsis y cols, 1995) y también estimula la biosíntesis y secreción de aldosterona a través del diacilglicerol que activa la translocación de la proteína quinasa C en las células de la zona glomerulosa (Lang y cols, 1991). La AII activa a la fosfolipasa D en células del músculo liso vascular (Lassègue y cols, 1991) y esta activación da como resultado una prolongada liberación de ácido fosfatídico y colina a partir de la fosfatidílcolina. El ácido fosfatídico es convertido a diacilglicerol por una fosfohidrolasa, resultando una sustancial acumulación de diacilglicerol (Lassègue y cols, 1993) y por lo tanto, se prolonga la activación de la proteína quinasa C. Varios estudios han indicado que la AII puede también activar un canal de cloro en las células mesangiales e inducir despolarización. La despolarización producida en las células mesangiales por la AII a través de la activación de los canales de cloro puede ocurrir por mecanismos Ca2+- dependientes e independientes (Kremer y cols, 1989). En células del túbulo proximal, la AII estimula la liberación del ácido araquidónico a través de la activación de la fosfolipasa A2 (Douglas y cols, 1987; Morduchowicz y cols, 1991) y por lo tanto, se observa un incremento de la producción de prostaglandinas (Douglas, 1987). Este aumento en la producción de prostaglandinas, por ejemplo PGE2 y PGI2, puede modular la 28 acción constrictora de la angiotensina II sobre el músculo liso vascular y las células mesangiales glomerulares (Schlondorff y cols, 1987). Y también, el aumento en la producción de PGE2 mediado por AII puede modular la función de transporte en las células tubulares. Otro mecanismo de acción es el encontrado en el hígado, riñón, musculatura lisa aórtica y zona glomerulosa de la adrenal, donde la estimulación por la AII inactiva la adenilato ciclasa, presumiblemente mediante la interacción con una proteína G inhibidora (Gi), y por lo tanto, disminuye la generación del segundo mensajero AMPc (Pobiner y cols, 1985), mientras que los guanilnucleótidos modulan la unión de la AII (Capponi y cols, 1985). Ya que la ACTH induce la esteroidogénesis en la zona glomerulosa gracias a la activación de la adenilato ciclasa y la subsiguiente formación de AMPc, está claro que estos dos principales sistemas de mensajeros intracelulares están implicados en la estimulación de la biosíntesis de aldosterona y que ambos interactúan. La AII inhibe la producción de AMPc también en las células glomerulares y células del túbulo proximal (Douglas, 1987). Como el AMPc induce la relajación de las células mesangiales e inhibe el volumen de absorción por el túbulo proximal, los efectos de la AII sobre la contracción de la célula mesangial glomerular y la reabsorción tubular proximal pueden ser mediados, al menos en parte, por la inhibición de la adenilato ciclasa y consiguiente reducción de los niveles de AMPc (Douglas y cols, 1990). Los distintos mecanismos de acción de la AII sobre sus células diana están representados en la fig. 4. 1.7.2. Heterogeneidad del receptor de angiotensina II Evidencias tanto fisiológicas como farmacológicas apoyaban en un principio la teoría de la diversidad en la población de receptores. 35 IAM pero sí de forma débil con la aterosclerosis coronaria; en sentido contrario, Gardemann y cols (1998) no encuentran relación con la patología isquémica cardíaca, ni Stangl y cols con las complicaciones tras intervenciones coronarias. En relación con otras patologías, se ha demostrado el desarrollo de autoanticuerpos estimuladores contra el AT1 en mujeres preeclámpticas (Wallukat et al, 1999), la disminución de arritmias ventriculares por reperfusión cuando se administran antagonistas del AT1 en ratones (Harada et al, 1998) y el aumento de la actividad del promotor del AT1 en células miocárdicas de corazones hipertróficos de rata (Herzig et al, 1997). 1.7.4.3. Subtipos del receptor AT1 A partir del clonaje inicial de los receptores AT1 vasculares y adrenales se realizaron una gran cantidad de estudios que resultaron en el aislamiento de variantes de los receptores AT1 ( Elton y cols, 1992; Iwai e Inagami, 1992) y de los cDNAs que codifican para los receptores AT1 humanos (Bergsma y cols, 1992; Furuta y cols, 1992). Estudios del genoma y estudios comparativos de los cDNAs han demostrado que existen, al menos, tres subtipos del receptor AT1, dos de los cuales están coexpresados en rata y ratón. Utilizando librerías genómicas cribadas con fragmentos de cDNA del AT1 o amplificando por PCR con primers basados en la secuencia del AT1, se observa la existencia de dos clones distintos (Elton y cols, 1992; Shanmugan y cols, 1994), llamados AT1A y AT1B. Los receptores AT1A y AT1B son los dos subtipos principales del receptor AT1 identificados actualmente en mamíferos, estando presentes en rata, ratón y humanos. La principal diferencia en la secuencia proteica entre los subtipos AT1A y AT1B se localiza en el extremo carboxi-terminal de la molécula; este extremo parece ser que es el que con más probabilidad se encuentra envuelto en la interacción receptor-efector. Los ARNs mensajeros de AT1A y AT1B 36 codifican proteínas con idénticas propiedades (Iwai e Inagami, 1992; Kakar y cols, 1992). Las afinidades de ambos receptores por los antagonistas sar1-ile8AngII, sar1-ala8-AngII, losartan y PD123177 son idénticas. La angiotensina II tiene una alta afinidad por ambos subtipos, y su unión es sensible a GTPgS (Chiu y cols, 1993). Las únicas diferencias observadas son una menor afinidad del AT1B por AI (Kakar y cols, 1992) y una menor respuesta a altas concentraciones de AII. Funcionalmente, ambos subtipos están acoplados a fosfolipasa C (Kakar y cols, 1992). Mediante Southern análisis se demuestra la existencia en el ADN genómico de rata y ratón de dos genes para el receptor AT1, los receptores AT1A y AT1B descritos anteriormente, (Elton y cols, 1992). Estos dos genes han sido localizados en distintos cromosomas en ratas: AT1A se encontró en el cromosoma 17, mientras que el gen que codifica para AT1B se encontró en el cromosoma 2 (Lewis y cols, 1993;Szpirer et al, 1993; Tissir y cols, 1995). En el genoma humano, por el contrario, aparece un sólo gen para el receptor AT1 (Bergsma y cols, 1992; Tissir y cols, 1995), que ha sido localizado mediante varios estudios en el cromosoma 3, en la región 3q21-q25 (Gemmill and Drabkin, 1991; Curnow et al, 1992; Szpirer et al, 1993),encontrándose en dicho gen variaciones que podrían explicar el desarrollo de HTA. La distribución en los distintos tejidos de los dos subtipos del receptor AT1 ha sido estudiada a nivel del ARNm. Ambos subtipos son expresados por igual en bazo y glomérulo renal (Kakar y cols, 1992). Sin embargo, AT1A predomina en el hígado, túbulos proximales, músculo liso vascular, corazón, pulmón, hipotálamo y ovario (Sandberg y cols, 1992; Llorens-Cortes y cols, 1994; Clauser y cols, 1996). El subtipo AT1B es el más importante en la pituitaria anterior, glándula adrenal y útero (Iwai e Inagami, 1992). Dentro del cerebro, el receptor 37 AT1A es predominante, pero el AT1B es preferentemente expresado en el órgano subfornical y órgano vasculoso de la lámina terminal (Kakar y cols, 1992). Además en corazón y glándula adrenal la expresión de los dos receptores está regulada de manera diferente. La función del subtipo AT1A es requerida para la respuesta vascular y hemodinámica a AII (Ito y cols, 1995). Estudios recientes en tejidos fetales de ratas han demostrado que la expresión de estos subtipos en los tejidos fetales es distinta de la de los tejidos adultos. Esta distinta distribución tanto tisular como temporal sugiere que la angiotensina II podría actuar como un factor de diferenciación durante la ontogénesis (Shanmugam y cols, 1994). 1.7.4.4. Regulación de la expresión del ARNm del receptor AT1 Con la disponibilidad de sondas de ARNm y anticuerpos contra el receptor, es posible determinar las bases moleculares que explican las modificaciones de la expresión proteica del receptor de la AII provocadas por distintos factores (Kakar y cols, 1992; Sato y cols, 1994). Existen distintos factores que regulan la transcripción del receptor AT1, por ejemplo, la existencia de un sitio de unión a factor de transcripción, AP-1, en la región 5´ del gen del receptor AT1 sugiere que los activadores de la proteína quinasa C (enzima que regula la actividad AP-1) pueden regular la transcripción de este receptor. De forma similar, la presencia de un elemento de respuesta a AMPc indica que los activadores de la proteína quinasa A deben estar envueltos en la regulación transcripcional. Conforme a estos datos, tanto el forskolin, activador exógeno de la adenilato ciclasa, como el dibutiril AMPc, disminuyen la expresión del ARNm del receptor AT1 en músculo liso vascular (Lassègue y cols, 1992) y en células mesangiales (Makita y cols, 1992). Uno de los factores más potentes que afectan la expresión proteica del receptor AT1 es la propia angiotensina II (Kitamura y cols, 1986; Bouscarel y cols, 1988). 38 Para determinar si esta regulación ocurre a nivel de transcripción o de traducción se utilizaron sondas de ARNm del receptor AT1. A las 6 horas de tratamiento con AII, se observa una disminución del 50% del ARNm en células de músculo liso vascular (Lassègue y cols, 1992) y del 70% en células mesangiales (Makita y cols, 1992), mientras que un largo tiempo de exposición a AII en la zona fasciculada reticular adrenal produce una disminución del 2050% (Naville y cols, 1993). Mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales estan envueltos en la regulación de los niveles de ARNm por la AII. Se realizaron distintos estudios para observar el efecto de la AII sobre la expresión del receptor AT1 en modelos animales a los que se les modificó el sistema renina-angiotensina. La estimulación del SRA con una dieta baja en sodio durante 4 semanas (Iwai y cols, 1991) o la infusión de AII durante 2 semanas (Iwai e Inagami, 1992) estimulaba la expresión del ARNm del AT1 de dos a tres veces mayor en la glándula adrenal (Iwai y cols, 1991). Inversamente, la supresión del SRA mediante nefrectomía bilateral o mediante administración de un antagonista del AT1, disminuye el nivel de ARNm adrenal cerca del 85% (Iwai e Inagami, 1992). Estas observaciones demuestran que los receptores AT1 adrenales presentan una regulación a la alta por angiotensina II, mientras que en músculo esquelético presentan una regulación a la baja. Se ha observado que los estrógenos también regulan la expresión del receptor en la pituitaria anterior. Cuatro semanas después de la ovariectomía, se observa un gran incremento de los niveles de ARNm del AT1B, pero no de los del AT1A en la glándula pituitaria de rata. Este efecto puede ser invertido por la administración de estrógenos, pero no por progesterona (Kakar y cols, 1992), confirmando la función reguladora de los estrógenos sobre los receptores AT1 en la pituitaria. Esta mayor sensibilidad en la expresión de los receptores AT1B a los estrógenos coincide con la observación de que el gen del AT1B contiene más elementos de respuesta a estrógenos que el gen del AT1A. También se han observado alteraciones en la expresión del receptor AT1 durante el desarrollo fetal con respecto a la expresión en el adulto, por 39 ejemplo, los niveles de ARNm del receptor AT1 en hígado y riñón son mayores en el feto y en el recién nacido que en el adulto (Iwai y cols, 1991; TufroMcReddie y cols, 1993 ; Shanmugan y Sandberg, 1996). 1.7.4.5. Desensibilización del receptor AT1 Muchos tejidos muestran taquifilaxia a la angiotensina II; esto es, la respuesta fisiológica a la AII es momentánea y el tejido se hace refractario a mayor estimulación por el agonista. Este comportamiento puede ser explicado por el proceso de secuestro e internalización del receptor. Por analogía con la familia del receptor β-adrenérgico, se podría predecir la existencia de una quinasa del receptor β-adrenérgico la cual, por fosforilación del receptor, regula la interacción receptor-proteína G (Lefkowitz, 1993). Aunque se ha demostrado que la AII es capaz de fosforilar el receptor AT1 en músculo liso vascular, la quinasa responsable de esta fosforilación no ha sido identificada. El secuestro y la internalización del receptor han sido demostrados utilizando técnicas de unión a radioligandos (Ullian y Linas, 1990) y por microscopía electrónica (Anderson y cols, 1993). Inicialmente, se une el agonista al receptor AT1 en la superficie celular. Se produce la migración en el plano de la membrana concentrando el complejo receptor-agonista en vesículas revestidas. Los complejos son internalizados en pequeñas vesículas y, después de 60 min se encuentran asociados con lisosomas (Anderson y cols, 1993). Aproximadamente, el 25% de los receptores internalizados son reciclados hacia la membrana plasmática y, el resto, son degradados (Ullian y Linas, 1990; Reagan y cols, 1993). La internalización del complejo receptor-agonista desensibiliza la célula ante una nueva exposición al agonista. 40 La internalización del AT1 es necesaria para la activación de la proteína quinasa C, pero no para la liberación del inositol trifosfato en las células de la zona glomerulosa adrenal estimuladas por AII (Kapas y cols, 1994). 1.7.5. Receptor AT2 Dos grupos de investigadores han llevado a cabo el aislamiento del cDNA que codifica al receptor tipo 2 de la angiotensina II (AT2) ( Mukoyama y cols, 1993; Kambayashi y cols, 1994). Este receptor clonado se caracteriza por la unión específica a los antagonistas no peptídicos descritos anteriormente como específicos del subtipo AT2, la afinidad de unión está aumentada por el ditiotreitol y presentan una expresión tisular específica. 1.7.5.1. Subtipos del receptor AT2 Está generalmente aceptado que los receptores AT1, pero no los AT2, son sensibles a los nucleótidos de guanina. Sin embargo, existen datos que indican que los receptores AT2 del núcleo cerebral de rata son sensibles a estos nucleótidos (Tsutsumi y Saavedra, 1992). Estos resultados sugieren que hay, al menos, dos subtipos de receptores AT2 y que la sensibilidad a las proteinas G no es un buen criterio de diferenciación entre receptores AT1 y AT2. Los receptores AT2 fueron identificados por su alta afinidad a los antagonistas selectivos CGP42112. La unión de este antagonista, al igual que la de 125I-Sar1-ile8-AII al cerebro, pero no a los homogenizados de glándula adrenal, era aumentada por el b-mercaptoetanol, ésto sugiere la existencia de 41 dos diferentes subtipos de receptores AT2 en cerebro y glándula adrenal de rata (Speth, 1993). 1.7.5.2. Regulación de la expresión del receptor AT2 En cultivos de células granulosas de ovario de rata, las cuales sólo expresan receptores AT2, la unión de angiotensina II era regulada a la baja por ella misma. Sin embargo, en estas células, el efecto de regulación a la baja por angiotensina II era imitado por un ionóforo del calcio, pero no por ésteres de forbol (Pucell y cols, 1988), este resultado es contrario al observado en el receptor AT1 vascular. Otros trabajos han señalado los factores que controlan la alta expresión de receptores AT2 en el tejido fetal (Johnson y Aguilera, 1991). Habiéndose observado que los receptores AT2 están altamente expresados en el desarrollo fetal y, existe una disminución después del nacimiento (Viswanathan y cols, 1991; Tsutsumi y Saavedra, 1991; Feuillan y cols, 1993). El número de receptores AT2 parece estar regulado por factores de crecimiento (Dudley y Summerfelt, 1993). Aún no hay acuerdo sobre los mecanismos de señales intracelulares que median las acciones producidas por la unión de la angiotensina II al receptor AT2. Existen evidencias del acoplamiento al GMPc (Bottari y cols, 1992), a canales de potasio (Kang y cols, 1993) y a tirosín fosfatasas (Bottari y cols, 1992) en tipos celulares específicos. 1.7.6. Efectos fisiológicos mediados por los receptores AT1 y receptores AT2 La presencia y proporción de los receptores AT1 y AT2 varía en los diferentes tejidos/órganos de la misma especie y en el mismo tejido/órgano de diferentes especies. El subtipo AT1 se encuentra en la mayoría de los tejidos vasculares. El AT2 se encuentra en la médula adrenal de rata, el útero, las 42 células de la granulosa del ovario y otras líneas celulares. En la mayoría de los tejidos, como la corteza adrenal, riñón y corazón, ambos receptores están presentes. La distribución tisular de los subtipos del receptor se muestran en la tabla II (Timmermans y cols, 1992). La existencia de estos subtipos del receptor puede representar la explicación molecular de la diversidad de efectos producidos por la AII. Casi todas las funciones conocidas de la angiotensina II son mediadas por el receptor AT1, la contracción inducida por AII en células mesangiales de rata y aorta de conejo, la movilización de calcio en cardiomiocitos de rata, la síntesis proteica en células de músculo liso vascular, liberación de aldosterona e inhibición de la adenilato ciclasa en hígado de rata (Dudley y cols, 1990; Sachinidis y cols, 1993). Incluso en tejidos ricos en receptores AT2 como útero humano, la contracción inducida por AII era reducida por losartan y no era afectada por el antagonista PD123319, específico del receptor AT2 (Dudley y cols. 1990). De manera similar, los antagonistas AT1, pero no los antagonistas AT2, reducen la presión sanguínea en ratas con hipertensión renal. En ratas inyectadas intracerebroventricularmente con renina, el losartan inhibe los cambios en el comportamiento respecto a la bebida (Barbella y cols, 1993). Encontrándose la respuesta presora a la estimulación eléctrica del órgano subfornical también inhibida por el losartan (Li y cols, 1993). De acuerdo con estas observaciones, estudios histológicos y de unión demuestran que los receptores AT1 predominan en el nucleo circumy paraventricular, hipotálamo, centros de control autonómico de la médula oblongata, áreas envueltas en la regulación de la presión sanguínea, balance de fluido y electrolitos y secreción de hormonas pituitarias (Tsutsumi y Saavedra, 1991; Barnes y cols, 1993). Los receptores renales AT2 no tienen efecto sobre el flujo renal total, pero ajustan la relación presión-natriuresis demostrando su 43 importancia en la regulación del fluido corporal y de la presión sanguínea (Lo y cols, 1995). Varios estudios en roedores (Oliverio et al, 1998) sugieren el papel promotor del crecimiento somático y mantenimiento de la estructura renal normal del receptor AT1 (AT1A y AT1B). Otras observaciones indican que los receptores AT2, junto con los AT1, participan en el control de la función cardiovascular. La rápida inhibición de los efectos intracerebroventriculares producidos por la angiotensina II por los antagonistas del AT1, también se observó con los antagonistas de AT2 (Toney y Porter, 1993). Los antagonistas AT2 producen una lenta, pero mantenida inhibición de los efectos de la AII. Se ha definido una función de los receptores AT2 como mediadores de la corriente de potasio en células neuronales (Kang y cols, 1993), aunque las consecuencias fisiológicas son aún desconocidas. Los receptores AT2 se encuentran en gran proporción en los recién nacidos e indivíduos jóvenes, decreciendo ésta de forma importante en las fases adultas, lo que sugiere un papel en el crecimiento y diferenciación celular. También se ha relacionado la estimulación de los receptores AT2 con la liberación de prostaglandinas. 1.8Relación entre los polimorfismos de los genes del SRA con los niveles plasmáticos de los componentes del eje bioquímico: Pese a la gran cantidad de bibliografía existente sobre el SRA y sus polimorfismos son pocos los estudios que investiguen la relación de dichos polimorfismos con los niveles plasmáticos de las sustancias del eje. 1.8.1Polimorfismos del gen del angiotensinógeno: El polimorfismo T235 ha sido relacionado varias veces con un incremento en los niveles plasmáticos del angiotensinógeno(AGT), bien solo o 44 bien en combinación con otros polimorfismos con los que se encuentra en completa relación de desequilibrio. Bloem y cols (1994 y 1996) encontraron una relación clara, en niños y adolescentes blancos y negros, entre el alelo – 1074;T235 (ambos en completa relación de desequilibrio) y los niveles de AGT plasmático (p< 0.0092 en negros y p< 0.0001 en blancos), pero no con la presión arterial sistólica (aunque la relación fue casi significativa con la presión diastólica). Danser y cols (1998) en un estudio sobre hombres y mujeres encontró relación significativa entre el alelo T235 y un incremento en los niveles plasmáticos de angiotensinógeno, a la vez que una disminución en los de prorrenina y renina, no afectando sin embargo a los niveles de ECA ni aldosterona circulantes. Y Paillard y cols (1999) estudiaron la relación entre el ya conocido polimorfismo M235T, junto a otros dos nuevos también del angiotensinógeno, el C532T y el G6A, con los niveles plasmáticos de AGT, ECA, AII, aldosterona y renina; encontrando en los T235 solo una tendencia no significativa al incremento del AGT, en los T532 un incremento muy significativo del AGT y una disminución poco significativa de ECA, y en los los G6A ninguna relación con ninguno de los parámetros estudiados. Hasta la fecha no hay ningún estudio que intente relacionar los polimorfismos del angitensinógeno con los niveles plasmáticos de A-(1-7). 1.8.2Polimorfismos del gen de la ECA: El polimorfismo I/D de la ECA ha sido relacionado claramente con los niveles plasmáticos de la ECA, demostrando un incremento en sus niveles con el alelo D. Danser y cols mediante dos estudios (1998 y 1999) demostraron un incremento de la ECA circulante en el alelo D, si bien no encontraron ninguna relación con la transformación de AI a AII (razón AII/AI, que es un índice de actividad in vivo de la actividad de la ECA), ni con los niveles de renina, prorrenina, AGT ni aldosterona. 51 3. 2. Materiales 3. 2. 1. Selección de sujetos. Muestra del estudio. Los sujetos de este estudio fueron seleccionados de entre alumnos voluntarios de la Facultad de Medicina de Málaga. El grupo a estudio está formado por un total de 93 sujetos sanos, de los cuales 43 son varones y 50 son mujeres (46.24% y 53.76% respectivamente), con una media de edad de 20.67 años, una desviación típica de 2.75, un mínimo de 17 y un máximo de 30 y un intervalo de confianza (p<0.05)= 20.11-21.22 años. La talla media en metros (precisión en centímetros) es de 1.71 metros con una desviación típica de 0.09 y un intervalo de confianza (p<0.05) de 1.69-1.73 metros; y un peso medio en kilogramos (Kgrs) de 65.01 Kgrs, desviación típica de 12.83 y un intervalo de confianza (p<0.05)= 62.41-67.62 Kgrs. 3. 3Métodos 3.3.1Preparación y extracción de la muestra para la determinación de los péptidos de la angiotensina: 3.3.1.1Fabricación de la solución inhibidora de la proteasa: Su función es evitar la degradación de los péptidos de la angiotensina por las proteasas presentes en la sangre, evitando de esta manera errores en la determinación. Los pasos para su obtención se enumeran a continuación: A).-Mezclar 0.018 gr de o-PT (1,10-fenantrolina) con 5.75 mL de agua ultrapura en un agitador magnético durante 4 o 5 horas. B).-Mezclar 0.0151 gr de pepstatina A con 3mL de etanol en un matraz cerrado durante 4 o 5 horas en un agitador magnético. C).-Verter la solución de o-PT en la suspensión de pepstatina A y continuar mezclando, el resultado será una suspensión espesa blanca. D).-Añadir 0.066 gr de NaHMB (almacenado a temperatura ambiente) al matraz y mezclar con el agitador magnético durante 5 minutos más. 52 E).-Mientras se mezcla alicuotear en tubos de cristal y almacenar en el refrigerador hasta que sea necesario. F).-Añadir 0.35 mL de la mezcla resuspendida a cada tubo EDTA de extracción de 7 mL (o 50uL por mL de sangre). Nosotros usamos una jeringa de 1 cc para medir la cantidad de inhibidor e insertamos la aguja a través del tapón de goma del vacutainer. Los vacutainers retienen el vacío durante varios días. 3.3.1.2Protocolo de extracción de sangre para la medición de los péptidos de la angiotensina: A).-Previo a la extracción de sangre, lavar la jeringa y la aguja que se van a utilizar con una solución de EDTA al 15%. B).-Añadir la cantidad adecuada del “inhibidor de la angiotensina” (su composición y fabricación se detallan en el apartado anterior), bien mezclado, a un tubo violeta de extracción sanguínea de acuerdo con los siguientes volúmenes: mL de sangre mL de inhibidor 1.0 0.05 2.0 0.10 3.0 0.15 4.0 0.20 5.0 0.25 6.0 0.30 7.0 0.35 C).-Enfriar el tubo de extracción, antes de recoger la muestra, en un baño de agua con hielo. D).-Recoger la muestra y mezclar bien por inversión. Poner el tubo inmediatamente en el baño de hielo. E).-Centrifugar la muestra durante 10 minutos en una centrifugadora refrigerada a 2000 rpm. 53 F).-Transferir el plasma a un tubo cónico de centrifugadora previamente enfriado y centrifugar otros 10 minutos en frío a 2000 rpm de nuevo. G).-Recoger el plasma en tubos de polipropileno, identificar al paciente, y conservar a –80ºC hasta que esté listo para ser mandado al laboratorio de referencia para la determinación de los péptidos de la angiotensina. H).-El envío de las muestras se realiza con hielo seco para su conservación. 3.3.2Determinación de los niveles plasmáticos de los péptidos de la angiotensina: La determinación de los péptidos de la angiotensina se realizó en el “Hypertension Core Laboratory” de la Wake Forest University School of Medicine en el Medical Center Blvd. Box 1056 de Winston-Salem, Carolina del Norte (EEUU), gracias a la colaboración del Dr Ferrario y su equipo de investigación. Y se realizó mediante la separación de las muestras con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) seguida de radioinmunoensayo (RIA). 3.3.2.aSeparación de las muestras mediante la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Los péptidos fueron fraccionados en un sistema HPLC LKB (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) con un columna NovaPak C18 (3.9 x 150 mm, Water Associates, Milford, MA). La fase móvil estaba compuesta por ácido heptafluorobutírico (HFBA)(Sequanol Grade, Pierce, Rockford, IL) v/v en agua (buffer A) y 80% de acetonitrilo (Burdick and Jackson, Muskegon, MI) en 0.13% HFBA (buffer B). La columna fue diluida con un gradiente de convexidad 30-50% de buffer B (curva # 13 del Controlador Programable del Gradiente LKB) durante 30 minutos a un flujo de 1 mL/min. 54 3.3.2.bCuantificación de los péptidos de la angiotensina mediante radioinmunoensayo (RIA): Las fracciones obtenidas por HPLC fueron sometidas a RIAs para la A-(1-7), la AII y la AI, respectivamente. Tres antisueros distintos que reconocen un epítope diferente de la molécula de angiotensina fueron usados. El anticuerpo contra la angiotensina I (New England Nuclear, Boston, MA) tiene un 100% de reactividad cruzada con la AI, la angiotensina-(2-10) y la angiotensina-(3-10), pero presenta menos de un 0.1% de unión con los fragmentos de AII y de A-(1-7). El anticuerpo contra la angiotensina II obtenido en el laboratorio tiene un 100% de reactividad cruzada con la AII y su fragmento C-terminal, pero presenta menos de un 0.01% de reactividad cruzada con los fragmentos de AI y de A-(1-7). El anticuerpo contra la A-(1-7) obtenido en el laboratorio muestra un 100% de reactividad cruzada con la A- (1-7) y la angiotensina-(2-7), mientras que reacciona cruzadamente menos de un 0.01% con la AI y la AII. 3. 3. 3Obtención y preparación de la sangre para la determinación de los polimorfismos: 3.3.3. aMétodo corona de linfocitos: Se les extrae 3 ml de sangre venosa que se deposita en un vacutainer con EDTA como anticoagulante. Se centrifuga 15 minutos a 3.500 rpm y a una temperatura de 4ºC, posteriormente y mediante una pipeta estéril, se recoge el plasma (se conserva a -20oC) y el anillo de células blancas, formado fundamentalmente por células mononucleares de sangre periférica(CMSP) que se congela a -20oC, excepto 25 microlitros, que se trasfieren a un eppendorf con 450 microlitros de TE. Todo el proceso debe ser realizado entre 0-4oC para evitar la degradación de la muestra. El sedimento restante se desprecia por su alto contenido en hematíes. 3. 3.3. bMétodo de sangre total: Se realiza mediante punción en dedo índice, depositándose una gota - equivale aproximadamente a 50 microlitros de sangre totalen un eppendorf 55 conteniendo 450 microlitros de TE. 3. 3. 4Extracción de DNA: A los 450 microlitros de TE con CMSP o gota de sangre, se despega la base más densa, agitándola manualmente, posteriormente se pasa por el vórtex durante 5 segundos y se centrifuga a 12.000 revoluciones por minuto, durante 10 segundos. El sobrenadante resultante se elimina(decanta) sobre papel secante y el precipitado se resuspende en 450 microlitros de TE. Todo el proceso se repite, hasta observar que el sobrenadante en el papel sea transparente(4 veces, suele ser suficiente), pasando a secar el tubo con papel secante sin llegar a tocar el pellet (precipitado). 3. 3. 5Digestión de DNA: Poner 100 microlitros de la solución de digestión enzimática, en cada eppendorf (contiene el pellet). La digestión enzimática, rompe las cadenas proteicas, fundamentalmente las histonas que son las que empaquetan el DNA, formando los nucleosomas y por tanto liberando la doble hélice. La temperatura de acción de la proteinasa es a 56oC durante 45 minutos y un pH de 8,3, precisando en el medio para su acción MgCl2. Posteriormente se eleva la temperatura a 95oC, durante 10 minutos, para inactivar la proteinasa, evitando que interfiera en procesos posteriores. El DNA digerido puede conservarse a -20ºC. 3. 3. 6Reacción en cadena de la polimerasa(PCR): Se realiza con las condiciones previamente optimizadas, para tiempos y volúmenes, descritas para cada gen. El producto de PCR puede conservarse a –20ºC. 3. 3. 6.1Protocolo de PCR para el polimorfismo I/D del gen de la ECA : 3. 3. 6.1. aOligonucleótidos específicos: sentido: 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3' antisentido: 5'-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3' 56 3. 3. 6.1. bOptimización de volúmenes: Se necesita para cada 5 microlitros(50 nanogramos) de DNA digerido (muestra a determinar): 5 microlitros de Buffer PCR 10x, 6 microlitros de MgCl2, 1 microlitro de dNTPs, 0,5 microlitros de oligonucleótido sentido, 0,5 microlitros de oligonucleótido antisentido y 0,25 microlitros de Taq polimerasa, se le añade 31,75 microlitros de agua libre de DNasa-RNasas. Una vez preparada y mezclada la disolución se le añaden los 5 microlitros del DNA, obteniendo un volumen final aproximado de 50 microlitros. Antes de ponerla en el termociclador se le echa una gota de aceite mineral. 3. 3. 6.1. cProtocolo del termociclador: - 2 minutos 94o C - 1 minuto 94o C - 1 minuto 58o C 35 ciclos - 2 minutos 72o C El producto tiene 287 bp. 3. 3. 6.1.dPosteriormente y debido a la existencia de falsos negativos para la inserción, el producto se reamplifica con primers específicos para la secuencia inserción y con 1 microlitro del producto del primer PCR sentido: 5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3' antisentido: 5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3' 3. 3. 6.1. eProtocolo de termociclador para reamplificación - 2 minutos 94o C - 1 minuto 94o C - 1 minuto 67o C 35 ciclos - 2 minutos 72o C El producto tiene 335 bp en caso de inserción y negativo si no existe 57 3. 3.6.2Protocolo de PCR para el polimorfismo A1166C del gen del receptor AT1 de la angiotensina II: Los genotipos del receptor AT1 de la AII se estudiaron mediante PCR por una estrategia "nested" . 3. 3. 6.2.aOligonucleótidos utilizados para el PCR externo es: sentido: 5'-GTGAAAGAAGGAGCAAGAGAACATTC-3' antisentido: 5'-TCGAGCAGCCGTCATCTGTCTAATGC-3' 3. 3. 6.2.bOptimización de volúmenes Se necesita para cada 7 microlitros de DNA digerido (muestra a determinar): 5 microlitros de Buffer PCR 10x, 4 microlitros de MgCl2, 1 microlitro de dNTPs, 0,5 microlitros de oligonucleótido sentido, 0,5 microlitros de oligonucleótido antisentido y 0,25 microlitros de Taq polimerasa, se le añade 31,75 microlitros de agua libre de DNasa-RNasas. Una vez preparada y mezclada la disolución se le añaden los 7 microlitros del DNA, obteniendo un volumen final aproximado de 50 microlitros. Antes de ponerla en el termociclador se le echa una gota de aceite mineral. 3. 3. 6.2. cProtocolo del termociclador-PCR Externo - 2 minutos 94o C - 1 minuto 94o C - 1 minuto 53o C 20 ciclos - 2 minutos 72o C El producto del PCR externo es 200 bp 3. 3. 6.2. dEn la segunda vuelta, PCR interno, se realiza con un microlitro del producto anterior que sirve como molde, siendo válido para distinguir entre los alelos A y C, utilizando los oligonucleótidos: sentido: 5'- CTACCAAATGAGCC/A-3' antisentido:5'- GCTTTGCTTTGTCT-3' 58 3. 3. 6.2. eProtocolo del termociclador PCR interno - 2 minutos 94o C - 1 minuto 94o C - 1 minuto 61o C 35 ciclos - 2 minutos 72o C El producto del PCR interno es 125 bp 3.3.6.3Protocolo de PCR para el polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno: 3. 3. 6.3. aOligonucleótidos utilizados sentido: 5'-TGGATGCGCACAAGGTCCTGTCTGC-3' antisentido: 5'-CAGGGTGCTGTCCACACTGGCTCGC-3' 3. 3. 6.3. bOptimización de volúmenes Se necesita para cada 7 microlitros de DNA digerido (muestra a determinar): 5 microlitros de Buffer PCR 10x, 3 microlitros de MgCl2, 1 microlitro de dNTPs, 0,5 microlitros de oligonucleótido sentido, 0,5 microlitros de oligonucleótido antisentido y 0,25 microlitros de Taq polimerasa, se le añade 32,75 microlitros de agua libre de DNasa-RNasas para completar aproximadamente 43 microlitros. Una vez preparada y mezclada la disolución se le añaden los 7 microlitros del DNA, obteniendo un volumen final de 50 microlitros. Antes de ponerla en el termociclador se le echa una gota de aceite mineral. 3. 3. 6.3. cProtocolo del termociclador - 2 minutos 94o C - 1 minuto 94o C - 1 minuto 61o C 35 ciclos - 2 minutos 72o C El producto de PCR se digiere con un enzima de restriccion Sfa una hora a 37o C, si está mutado no se corta dando una banda de 305 bp ,y si es el salvaje se corta dando 2 bandas una de 268 y otra de 37 bp. 59 3. 3. 7Electroforesis en gel de agarosa: Para realizar la electroforesis en geles de agarosa son útiles las cubetas horizontales. En éstas el gel queda sumergido justo debajo de la superficie del tampón de electroforesis Se utiliza agarosa Bio-Rad, generalmente a una concentración del 3%. Es necesario calentar hasta la ebullición, para conseguir la disolución completa de la agarosa. Se deja enfriar de forma homogénea, manteniendo el recipiente en movimiento, para evitar que se formen grumos de agarosa. Añadir a 50ºC bromuro de etidio. Verter en el portageles, en el cual se ha colocado un peine para formar los pocillos, donde se depositarán las muestras. Una vez solidificado el gel, se extrae el peine y se introduce el gel en la cubeta de electroforesis y se cubre con el tampón de electroforesis. 3. 3. 8Colocación de las muestras en el gel de agarosa: Poner en una gradilla los eppendorf necesarios según el número de muestras, añadir 4 microlitros de colorante azul de bromoferol, al que se le añaden 20 microlitros de la muestra de PCR. Mezclar y coger 20 microlitros, que se depositan en cada uno de los pocillos del gel. Dejar correr la muestra aproximadamente 20 minutos a 100 mV. El colorante sirve de control del recorrido del DNA. 3. 3. 9Visualizacion de las bandas: Cuando las bandas del colorante, se situen en la parte media del gel, extraer el gel del aparato de eletroforesis y colocarlo en el transiluminador. Observar las bandas a luz ultravioleta. 60 3. 3. 10Composición y fabricación de los productos usados para la determinación última de los polimorfismos: -TE: -10 mM Tris Cl a pH 7,4 -1mM EDTA a pH 8 Llevar a pH 7,4 -SOLUCIÓN DE DIGESTIÓN ENZIMÁTICA: Buffer PCR(10x) 10 microlitros Cl2Mg PCR 6 microlitros Proteinasa K(20mg/microlitro) 0,5 microlitros Agua libre de DNasa-RNasas 83,5 microlitros. Obteniendo un volumen total de DNA digerido por pellet de 100 microlitros -GEL DE AGAROSA: - PEQUEÑO (60 mililitros aproximadamente): Agarosa 1,8 gramos Agua milli Q 58,2 mililitros TAE 50x 1,8 mililitros Este gel es útil para un número de muestras menor de 12. Cuando esté a 50ºC, durante el enfriamiento, se le añaden 10 microlitros de bromuro de etidio. - GRANDE (120 mililitros aproximadamente) Agarosa 3,6 gramos Agua milli Q 116,4 mililitros TAE 50x 3,6 mililitros 67 0 50 100 Valore s Me dios Gene rale s AI AII A-(1-7) 0 0,5 1 1,5 Valores Medios Generales de los Ratios AII/AI A-(1-7)/AI A-(1-7)/AII 0 20 40 60 80 100 120 II ID DD AA AC CC MM MT TT Valores Medios por genotipos AI AII A-(1-7) 0 0,5 1 1,5 2 II ID DD AA AC CC MM MT TT Valores Medios de los Ratios por genotipos AII/AI A-(1-7)/AI A-(1-7)/AII Fig 2.1 Fig 2.2 Fig 3.1 Fig 3.2 68 Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 25.47 ± 10.51 pgr/mL en los MM, de 33.99 ± 31.69 pgr/mL en los MT y de 33.67 ± 31.79 pgr/mL en los TT, observándose un incremento de los valores de A-(1-7) en los MT y TT respecto a los MM, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos del gen del angiotensinógeno son de 0.45 ± 0.34 en los MM, de 0.40 ± 0.27 en los MT y de 0.40 ± 0.29 en los TT, observándose un incremento de los valores en MM con respecto a MT y TT (0.45 vs 0.40), entre los que no se observan diferencias, no encontrándose significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI son de 0.58 ± 0.47 en los MM, de 0.64 ± 0.75 en los MT y de 0.82 ± 0.94 en los TT, observándose un incremento de los valores en TT con respecto a MT, y de éste con respecto a los MM (0.82 vs 0.65 vs 0.58 respectivamente), no encontrándose significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.33 ± 0.44 en los MM, de 1.50 ± 1.16 en los MT y de 1.81 ± 1.30 en los TT, observándose un incremento de los valores en TT con respecto a MT, y de éste con respecto a los MM (1.81 vs 1.50 vs 1.33 respectivamente), no encontrándose significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según el polimorfismo del angiotensinógeno: En los MM (n = 27): entre AI y AII el coeficiente de correlación (R) es de 0.301 (p = 0.128), entre AI y A-(1-7) R= 0.022 (p = 0.915), y entre AII y A-(1-7) R= 0.561 (p < 0.01). En los MT (n = 50): entre AI y AII R= 0.618 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.044 (p = 0.761), y entre AII y A-(1-7) R= 0.260 (p = 0.068). En los TT (n = 16): entre AI y AII R= 0.123 (p < 0.651), entre AI y A-(1-7) R= 0.327 (p = 0.217), y entre AII y A-(1-7) R= 0.333 (p < 0.208). 69 4.3.2Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en relación con el polimorfismo I/D del gen de la ECA ( Tabla 2.2, 2.7,2.8 y 2.9; y Figs 3.1 y 3.2): Los valores obtenidos de AI según los genotipos I/D de la ECA son de 95.23 ± 106.83 pgr/mL en los II (n = 26), de 85.52 ± 110.00 pgr/mL en los ID (n = 37) y de 98.67 ± 90.07 pgr/mL en los DD (n = 30), observándose un incremento de los valores de AI en los DD respecto a los II, y de éstos con respecto a los ID, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de AII son de 23.67 ± 10.94 pgr/mL en los II, de 19.70 ± 7.61 pgr/mL en los ID y de 24.48 ± 11.27 pgr/mL en los DD, no observándose diferencias en los valores de AII de los DD con respecto a los II, pero sí de losDD con respecto a los ID, siendo significativa esta diferencia (24.48 vs 19.70). Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 29.46 ± 19.16 pgr/mL en los II, de 31.72 ± 22.78 pgr/mL en los ID y de 32.87 ± 37.41 pgr/mL en los DD, no observándose diferencias apreciables entre los tres genotipos. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos de la ECA son de 0.42 ± 0.31 en los II, de 0.43 ± 0.31 en los ID y de 0.40 ± 0.26 en los DD, no observándose diferencias reseñables en sus valores. Los valores obtenidos de A-(1-7)/AI según los polimorfismos de la ECA son de 0.62 ± 0.71 en los II, de 0.78 ± 0.78 en los ID y de 0.55 ± 0.65 en los DD, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AI en los ID respecto a los II, y de éstos con respecto a los DD (0.78 vs 0.62 vs 0.55 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.40 ± 1.00 en los II, de 1.65 ± 0.90 en los ID y de 1.39 ± 1.21 en los DD, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AII en los ID respecto a los II, y de éstos con respecto a los DD (1.65 vs 1.43 vs 1.39 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según el polimorfimo de la ECA: En los II (n = 26): entre AI y AII R= 0.597 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.027 (p = 0.897), y entre AII y A-(1-7) R= 0.250 (p = 218). 70 En los ID (n = 37): entre AI y AII R= 0.350 (p = 0.034), entre AI y A-(1-7) R= 0.106 (p = 0.533), y entre AII y A-(1-7) R= 0.450 (p < 0.01). En los DD (n = 30): entre AI y AII R= 0.777 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.118 (p = 0.535), y entre AII y A-(1-7) R= 0.264 (p < 0.159). 4.3.3Valores plasmáticos de los péptidos del SRA relacionados con los genotipos del polimorfismo A1166C del gen del AT1 (Tabla 2.3, 2.10, 2.11 y 2.12; y Figs 3.1 y 3.2): Los valores obtenidos de AI según polimorfismo del AT1 son de 98.01 ± 123.30 pgr/mL en los AA (n = 48), de 91.56 ± 76.57 pgr/mL en los AC (n = 40) y de 46.76 ± 32.30 pgr/mL en los CC (n = 5), observándose un incremento de los valores de AI en los AA respecto a los AC, y en mayor magnitud, de éstos con respecto a los CC, siendo únicamente significativa la diferencia entre AC y CC (91.56 vs 46.76, p < 0.05). Los valores obtenidos de AII son de 21.62 ± 10.56 pgr/mL en los AA, de 23.32 ± 9.93 pgr/mL en los AC y de 21.62 ± 3.40 pgr/mL en los CC, no observándose diferencias entre los genotipos. Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 27.86 ± 15.76 pgr/mL en los AA, de 36.48 ± 37.37 pgr/mL en los AC y de 25.82 ± 12.99 pgr/mL en los CC, observándose un incremento claro de los valores de A-(1-7) en los AC respecto a los AA, y de éstos, en una menor magnitud, con respecto a los CC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos del AT1 son de 0.41 ± 0.31 en los AA, de 0.40 ± 0.27 en los AC y de 0.60 ± 0.27 en los CC, observándose un incremento de la razón en los CC con respecto a los AA y AC (0.60 vs 0.41 vs 0.40),no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de A-(1-7)/AI según los polimorfismos del AT1 son de 0.61 ± 0.60 en los AA, de 0.72 ± 0.86 en los AC y de 0.65 ± 0.42 en los CC, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AI en los AC respecto a los CC, y de éstos con respecto a los AA , no siendo significativa ninguna de las diferencias. 71 Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.40 ± 0.64 en los AA, de 1.64 ± 1.39 en los AC y de 1.20 ± 0.57 en los CC, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AII en los AC respecto a los AA, y de éstos con respecto a los CC (1.64 vs 1.42 vs 1.20 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según el polimorfimo del AT1: En los AA (n = 48): entre AI y AII R= 0.554 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.059 (p = 0.690), y entre AII y A-(1-7) R= 0.394 (p < 0.01). En los AC (n = 40): entre AI y AII R= 0.620 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.026 (p = 0.872), y entre AII y A-(1-7) R= 0.267 (p = 0.096). En los CC (n = 5): entre AI y AII R= 0.521 (p = 0.368), entre AI y A-(1-7) R= 0.458 (p = 0.438), y entre AII y A-(1-7) R= 0.349 (p = 0.565). 4.4Descripción de los valores plasmáticos de los péptidos del SRA en Hombres (Tabla 4.1): Los valores obtenidos de los distintos péptidos del SRA en hombres (n = 43) son de 82.29 ± 101.03 pgr/mL (media ± desviación típica) para la AI, 21.40 ± 8.71 pgr/mL para la AII, 37.76 ± 36.47 pgr/mL para la A-(1-7), 0.42 ± 0.26 para la razón AII/AI, 0.79 ± 0.85 para la razón A-(1-7)/AI, y de 1.80 ± 1.32 para la razón A-(17)/AII. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina en Hombres (n = 43): Entre AI y AII R= 0.412 (p < 0.01), entre AI y A-(1-7) R= 0.026 (p = 0.871), y entre AII y A-(1-7) R= 0.337 (p = 0.027). 4.4.1Comparación de los valores plasmáticos de los péptidos del SRA entre genotipos en Hombres: 4..1.1Genotipos del polimorfismo M235T del angiotensinógeno en hombres (Tabla general 4.2, y pormenorizadas 4.3.1, 4.3.2 y 4.3.3, Figs 4.1 y 4.2): Los valores obtenidos de AI según los polimorfismos del gen del angiotensinógeno en varones son de 63.51 ± 46.63 pgr/mL en los MM (n = 12), de 91.52 ± 129.54 pgr/mL en los MT (n = 24) y de 82.87 ± 45.74 pgr/mL en los TT (n = 7), observándose un incremento de los valores de AI en los MT respecto a los TT, y 72 en mayor magnitud de éstos con respecto a los MM, no siendo, sin embargo, significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de AII son de 17.88 ± 5.23 pgr/mL en los MM, de 23.99 ± 9.85 pgr/mL en los MT y de 18.54 ± 6.97 pgr/mL en los TT, observándose un incremento de los valores de AII en los MT respecto a los TT, y de éstos, aunque en pequeña magnitud con respecto a los MM, siendo únicamente significativa la diferencia entre MT y MM (23.99 vs 17.88, p < 0.05). Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 24.83 ± 10.48 pgr/mL en los MM, de 43.87 ± 41.78 pgr/mL en los MT y de 38.98 ± 43.97 pgr/mL en los TT, observándose un incremento de los valores de A-(1-7) en los MT respecto a los TT, y de éstos muy importante con respecto a los MM, siendo significativa la diferencia entre MT y MM (43.87 vs 24.83, p< 0.05), no siendo, sin embargo, significativa ninguna de las demás diferencias. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos del gen del angiotensinógeno son de 0.39 ± 0.23 en los MM, de 0.48 ± 0.28 en los MT y de 0.27 ± 0.16 en los TT, observándose un incremento claro de los valores en MT con respecto a MM, y de estos con respecto a TT, siendo no significativas ninguna de las diferencias. 73 0 20 40 60 80 100 pgr./ml. II ID DD AA AC CC MM MT TT Varones Valores Medios por genotipos AI AII A-(1-7) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 pgr./ml. II ID DD AA AC CC MM MT TT Varones Valores Medios los Ratios por genotipos AII/AI A-(1-7)/AI A-(1-7)/AII Fig 4.1 Fig 4.2 Fig 4.2 74 Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI son de 0.51 ± 0.35 en los MM, de 0.92 ± 0.91 en los MT y de 0.80 ± 1.17 en los TT, observándose un incremento de los valores en MT con respecto a MM, siendo casi significativa la diferencia entre los MT y los MM (0.92 vs 0.51, 0.05 < p < 0.1), y no significativas el resto de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.43 ± 0.49 en los MM, de 1.90 ± 1.47 en los MT y de 2.12 ± 1.76 en los TT, observándose un incremento de los valores en TT con respecto a MT, y de éste con respecto a MM (2.12 vs 1.90 vs 1.43 respectivamente), no encontrándose significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según los genotipos del polimorfimo M235T del angiotensinógeno en hombres: En los MM (n = 12): entre AI y AII R= 0.189 (p = 0.556), entre AI y A-(17) R= 0.454 (p = 0.138), y entre AII y A-(1-7) R= 0.378 (p < 0.226). En los MT (n = 24): entre AI y AII R= 0.422 (p = 0.040), entre AI y A-(1-7) R= 0.021 (p = 0.923), y entre AII y A-(1-7) R= 0.304 (p = 0.148). En los TT (n = 7): entre AI y AII R= 0.516 (p = 0.236), entre AI y A-(1-7) R= 0.442 (p = 0.321), y entre AII y A-(1-7) R= 0.267 (p = 0.563). 4.4.1.2.- Genotipos delo polimorfismo I/D de la ECA en hombres (Tabla general 4.2, y pormenorizadas en 4.3.4, 4.3.5 y 4.3.6; Figs 4.1 y 4.2 ): Los valores obtenidos de AI según polimorfismo de la ECA en varones son de 81.63 ± 65.82 pgr/mL en los II (n = 10), de 98.61 ± 147.41 pgr/mL en los ID (n = 17) y de 65.37 ± 46.84 pgr/mL en los DD (n = 16), observándose un incremento claro de los valores de AI en los ID respecto a los II, y de éstos con respecto a los DD, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de AII son de 25.17 ± 12.86 pgr/mL en los II, de 19.41 ± 7.20 pgr/mL en los ID y de 21.16 ± 6.64 pgr/mL en los DD, observándose un incremento en los II con respecto a los DD, y de estos con respecto a los ID, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 34.57 ± 24.12 pgr/mL en los II, de 38.52 ± 28.29 pgr/mL en los ID y de 38.95 ± 50.13 pgr/mL en los DD, observándose 75 un pequeño incremento de los valores de A-(1-7) en los DD e ID con respecto a los II, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos de la ECA son de 0.44 ± 0.33 en los II, de 0.40 ± 0.25 en los ID y de 0.44 ± 0.22 en los DD, observándose un leve incremento de los II y DD con respecto a los ID, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de A-(1-7)/AI según los polimorfismos de la ECA son de 0.75 ± 0.85 en los II, de 0.92 ± 0.94 en los ID y de 0.67 ± 0.77 en los DD, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AI en los ID respecto a los II, y de éstos con respecto a los DD (0.92 vs 0.75 vs 0.67 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.65 ± 1.38 en los II, de 2.00 ± 1.11 en los ID y de 1.69 ± 1.54 en los DD, observándose un incremento importante de los valores de A-(1-7)/AII en los ID respecto a los DD, y en menor magnitud, de éstos con respecto a los II (2.00 vs 1.69 vs 1.65 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según los genotipos del polimorfismo I/D de la ECA en hombres: En los II (n = 10): entre AI y AII R= 0.681 (p = 0.030), entre AI y A-(1-7) R= 0.224 (p = 0.534), y entre AII y A-(1-7) R= 0.067 (p = 0.855). En los ID (n = 17): entre AI y AII R= 0.513 (p = 0.035), entre AI y A-(1-7) R= 0.104 (p = 0.691), y entre AII y A-(1-7) R= 0.417 (p = 0.096). En los DD (n = 16): entre AI y AII R= 0.395 (p = 0.130), entre AI y A-(1-7) R= 0.403 (p = 0.122), y entre AII y A-(1-7) R= 0.622 (p < 0.01). 4.4.1.3Genotipos del polimorfismo A1166C del AT1R en hombres (Tabla general 4.2, y pormenorizadas en 4.3.7, 4.3.8 y 4.3.9; Figs 4.1 y 4.2): Dado el pequeño tamaño de la muestra para varones con el genotipo CC (n = 2), no se pueden realizar las comparaciones para hallar la significación con respecto a los otros dos polimorfismos, AA y AC (n = 21 y n = 20, respectivamente), que sí pueden ser comparados entre sí. 76 Los valores obtenidos de AI según polimorfismo del gen del AT1 en varones son de 93.92 ± 133.50 pgr/mL en los AA, de 74.83 ± 57.93 pgr/mL en los AC y de 34.85 pgr/mL en los DD, observándose un incremento claro de los valores de AI en los AA respecto a los AC, no siendo significativa la diferencia. Los valores obtenidos de AII son de 19.74 ± 7.43 pgr/mL en los AA, de 23.22 ± 10.13 pgr/mL en los AC y de 20.6 pgr/mL en los CC, observándose un incremento en los AC con respecto a los AA, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de A-(1-7) son de 30.60 ± 17.64 pgr/mL en los AA, de 47.31 ± 49.15 pgr/mL en los AC y de 17.4 pgr/mL en los CC, observándose un incremento de los valores de A-(1-7) en los AC con respecto a los AA, y de estos con respecto a los CC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón AII/AI según los polimorfismos del AT1 son de 0.40 ± 0.30 en los AA, de 0.42 ± 0.23 en los AC y de 0.60 en los CC, observándose un incremento de los CC con respecto a los AA y AC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de A-(1-7)/AI son de 0.67 ± 0.66 en los AA, de 0.94 ± 1.04 en los AC y de 0.50 en los CC, observándose un incremento de los valores de A-(1-7)/AI en los AC respecto a los AA, y de éstos con respecto a los CC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII son de 1.63 ± 0.72 en los AA, de 2.08 ± 1.76 en los AC y de 0.86 en los CC, observándose un incremento importante de los valores de A-(1-7)/AII en los AC respecto a los AA,y de éstos con respecto a los CC (2.08 vs 1.63 vs 0.86 respectivamente), no siendo significativa ninguna de las diferencias. -Correlación entre los péptidos de la angiotensina según los genotipos del polimorfimo del AT1R en hombres: En los AA (n = 21): entre AI y AII R= 0.408 (p = 0.066), entre AI y A-(1-7) R= 0.047 (p = 0.840), y entre AII y A-(1-7) R= 0.391 (p = 0.080). En los AC (n = 20): entre AI y AII R= 0.695 (p < 0.001), entre AI y A-(1-7) R= 0.055 (p = 0.817), y entre AII y A-(1-7) R= 0.302 (p = 0.196). En los CC: No se puede realizar ninguna correlación puesto que n = 2 (R=1.00 pero p = infinito). 83 4.7Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la muestra a estudio por Sexos en los distintos genotipos de cada polimorfismo (Hombre vs. Mujer) (Figs 6.1 a 6.6): 4.7.1Polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno (Tabla 6.2): 4.7.1.aGenotipo MM (Tabla 6.3.1 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo MM son de 63.51 ± 46.63 pgr/mL en varones (n = 12) y 86.50 ± 77.36 en mujeres (n = 15), observándose un incremento claro de AI en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo MM son de 17.88 ± 5.23 pgr/mL en varones y 22.17 ± 8.95 en mujeres, observándose un incremento claro de AII en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el polimorfismo MM son de 24.83 ± 10.48 pgr/mL en varones y 25.98 ± 10.87 en mujeres, no observándose diferencias significativas por sexos. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los MM por sexos son de 0.39 ± 0.23 en varones y de 0.49 ± 0.41 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los MM por sexos son de 0.51 ± 0.35 en varones y de 0.64 ± 0.55 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los MM por sexos son de 1.43 ± 0.49 en varones y de 1.24 ± 0.40 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. 4.4.1.bGenotipo MT (Tabla 6.3.2 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo MT son de 91.52 ± 129.54 pgr/mL en varones (n = 24) y 122.28 ± 123.15 en mujeres (n = 26), observándose un incremento claro de AI en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo MT son de 23.99 ± 9.85 pgr/mL en varones y 25.29 ± 12.90 en mujeres, observándose un incremento leve de AII en mujeres respecto a los varones no significativo. 84 Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo MT son de 43.87 ± 41.78 pgr/mL en varones y 24.86 ± 13.52 en mujeres, observándose un incremento importante de A-(1-7) en varones respecto a mujeres significativo (43.87 vs 24.86). Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los MT por sexos son de 0.48 ± 0.28 en varones y de 0.33 ± 0.25 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los MT por sexos son de 0.92 ± 0.91 en varones y de 0.38 ± 0.44 en mujeres, observándose un incremento muy significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (0.92 vs 0.38, p < 0.01). Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los MT por sexos son de 1.90 ± 1.47 en varones y de 1.10 ± 0.55 en mujeres, observándose un incremento significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (1.90 vs 1.10, p < 0.05). 4.7.1.cGenotipo TT (Tabla 6.3.3 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo TT son de 82.87 ± 45.74 pgr/mL en varones (n = 7) y 65.00 ± 64.03 en mujeres (n = 9), observándose un incremento claro de AI en varones respecto a mujeres no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo TT son de 18.54 ± 6.97 pgr/mL en varones y 18.73 ± 6.63 en mujeres, no observándose diferencias significativas entre sexos. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo TT son de 38.98 ± 43.97 pgr/mL en varones y 29.54 ± 20.03 en mujeres, observándose un incremento de A-(1-7) en varones respecto a mujeres no significativo. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los TT por sexos son de 0.27 ± 0.16 en varones y de 0.49 ± 0.34 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. 85 Valores Medios de AI por genotipos comparando sexos 0 20 40 60 80 100 120 140 160 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujeres Valores Medios de AII por genotipos comparando sexos 0 5 10 15 20 25 30 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujeres Valores Medios de A-(1-7) por genotipos comparando sexos 0 10 20 30 40 50 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujeres Fig 6.1 Fig 6.2 Fig 6.3 86 Valores Medios de AII/AI por genotipos comparando sexos 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujeres Valores Medios de A-(1-7)/AI por genotipos comparando se x os 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujer es Valores Medios de A-(1-7)/AII por genotipos comparando se x os 0 0,5 1 1,5 2 2,5 II ID DD AA AC CC MM MT TT Hombres Mujeres Fig 6.4 Fig 6.5 Fig 6.6 87 Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los TT por sexos son de 0.80 ± 1.17 en varones y de 0.85 ± 0.80 en mujeres, observándose un leve incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los TT por sexos son de 2.12 ± 1.76 en varones y de 1.56 ± 0.84 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. 4.7.2Polimorfismo I/D del gen de la ECA (Tabla 6.2): 4.7.2.aGenotipo II (Tabla 6.3.4 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo II son de 81.63 ± 65.82 pgr/mL en varones (n = 10) y 103.72 ± 127.36 en mujeres (n = 16), observándose un incremento claro de AI en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo II son de 25.17 ± 12.86 pgr/mL en varones y 22.73 ± 9.85 en mujeres, observándose un incremento de AII en varones respecto a las mujeres no significativo. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo II son de 34.57 ± 24.12 pgr/mL en varones y 26.27 ± 15.33 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de A-(1-7) en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los II por sexos son de 0.44 ± 0.33 en varones y de 0.41 ± 0.31 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en hombres respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los II por sexos son de 0.75 ± 0.85 en varones y de 0.53 ± 0.63 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los II por sexos son de 1.65 ± 1.38 en varones y de 1.25 ± 0.68 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. 88 4.4.2.bGenotipo ID (Tabla 6.3.5 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo ID son de 98.61 ± 147.41 pgr/mL en varones (n = 17) y 74.39 ± 65.92 en mujeres (n = 20), observándose un incremento claro de AI en varones respecto a las mujeres no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo ID son de 19.41 ± 7.20 pgr/mL en varones y 19.95 ± 8.12 en mujeres, no observándose diferencias significativas entre sexos. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo ID son de 38.52 ± 28.29 pgr/mL en varones y 25.94 ± 15.26 en mujeres, observándose un incremento importante de A-(1-7) en varones respecto a mujeres no significativo. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los ID por sexos son de 0.40 ± 0.25 en varones y de 0.45 ± 0.36 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a hombres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los ID por sexos son de 0.92 ± 0.94 en varones y de 0.65 ± 0.60 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (0.92 vs 0.65). Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los ID por sexos son de 2.00 ± 1.11 en varones y de 1.35 ± 0.54 en mujeres, observándose un incremento claro significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (2.00 vs 1.35). 4.4.2.cGenotipo DD (Tabla 6.3.6 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo DD son de 65.37 ± 46.84 pgr/mL en varones (n = 16) y 136.73 ± 112.44 en mujeres (n = 14), observándose un incremento claro significativo de los valores de AI en mujeres respecto a varones (136.73 vs 65.37, p < 0.05). Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo DD son de 21.16 ± 6.64 pgr/mL en varones y 28.28 ± 14.26 en mujeres, observándose un incremento de AII en mujeres respecto a varones no significativo. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo DD son de 38.95 ± 50.13 pgr/mL en varones y 25.92 ± 11.21 en mujeres, observándose un incremento claro de A-(1-7) en varones respecto a mujeres no significativo. 89 Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los DD por sexos son de 0.44 ± 0.22 en varones y de 0.35 ± 0.29 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los DD por sexos son de 0.67 ± 0.77 en varones y de 0.41 ± 0.45 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los DD por sexos son de 1.69 ± 1.54 en varones y de 1.04 ± 0.52 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. 4.7.3Polimorfismo A1166C del gen del AT1 (Tabla 6.2): 4.7.3.aGenotipo AA (Tabla 6.3.7 y Figs 6.1-6.6): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo AA son de 93.92 ± 133.50 pgr/mL en varones (n = 21) y 101.19 ± 117.25 en mujeres (n = 27), observándose un incremento claro de AI en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo AA son de 19.74 ± 7.43 pgr/mL en varones y 23.09 ± 12.41 en mujeres, observándose un incremento de AII en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo AA son de 30.60 ± 17.64 pgr/mL en varones y 25.73 ± 14.12 en mujeres, observándose un incremento no significativo de A-(1-7) en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los AA por sexos son de 0.40 ± 0.30 en varones y de 0.42 ± 0.33 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los AA por sexos son de 0.67 ± 0.66 en varones y de 0.56 ± 0.56 en mujeres, observándose un incremento claro no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los AA por sexos son de 1.63 ± 0.72 en varones y de 1.23 ± 0.52 en mujeres, observándose un incremento claro significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (1.63 vs 1.23). 90 4.7.3.bGenotipo AC (Tabla 6.3.8 y Figs 6.1-6.6 ): Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo AC son de 74.83 ± 57.93 pgr/mL en varones (n = 20) y 108.27 ± 89.95 en mujeres (n = 20), observándose un incremento claro de AI en mujeres respecto a los varones no significativo. Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo AC son de 23.22 ± 10.13 pgr/mL en varones y 23.41 ± 10.00 en mujeres, no observándose diferencias significativas entre sexos. Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo AC son de 47.31 ± 49.15 pgr/mL en varones y 25.65 ± 14.27 en mujeres, observándose un incremento importante de A-(1-7) en varones respecto a mujeres casi significativo (47.31 vs 25.65). Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los AC por sexos son de 0.42 ± 0.23 en varones y de 0.37 ± 0.32 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en hombres respecto a mujeres. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los AC por sexos son de 0.94 ± 1.04 en varones y de 0.50 ± 0.60 en mujeres, observándose un incremento no significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (0.94 vs 0.50). Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los AC por sexos son de 2.08 ± 1.76 en varones y de 1.19 ± 0.68 en mujeres, observándose un incremento claro significativo de los valores de la razón en varones respecto a mujeres (2.08 vs 1.19, p < 0.05). 4.7.3.cGenotipo CC (Tabla 6.3.9 y Figs 6.1-6.6): Debido al pequeño tamaño de la muestra para varones CC (n = 2), no se puede realizar una comparación estadística con el grupo de mujeres CC (n = 3). Los valores obtenidos de AI en el grupo de sujetos con el genotipo CC son de 34.85 ± 3.32 pgr/mL en varones y 54.7 ± 42.96 en mujeres, observándose un incremento claro de los valores de AI en mujeres respecto a varones (54.7 vs 34.85). Los valores obtenidos de AII en el grupo de sujetos con el genotipo CC son de 20.6 ± 3.53 pgr/mL en varones y 22.30 ± 3.90 en mujeres, observándose un incremento leve de AII en mujeres respecto a varones. 91 Los valores obtenidos de A-(1-7) en el grupo de sujetos con el genotipo CC son de 17.4 ± 1.70 pgr/mL en varones y 31.43 ± 14.76 en mujeres, observándose un incremento claro de A-(1-7) en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón AII/AI en los CC por sexos son de 0.60 ± 0.16 en varones y de 0.59 ± 0.37 en mujeres, no observándose diferencias apreciables. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AI en los CC por sexos son de 0.50 en varones y de 0.75 ± 0.57 en mujeres, observándose un incremento claro de - los valores de la razón en mujeres respecto a varones. Los valores obtenidos de la razón A-(1-7)/AII en los CC por sexos son de 0.86 ± 0.23 en varones y de 1.42 ± 0.66 en mujeres, observándose un incremento claro de los valores de la razón en mujeres respecto a varones. A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 92 5-TABLAS: A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 99 Tabla 4.1 Valores medios de los Hombres SEXO AI AII A-(1-7) AII/AI AI/A-(1-7) AII/A-(1-7) HOMBRE MEDIA N D. TIP 82.29 43 101.02 21.39 43 8.71 37.76 43 36.47 0.42 43 36.47 0.79 43 0.85 1.80 43 1.32 Tabla 4.2 Valores medios de los Hombres por genotipos A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * ECA 81,6300 25,1700 34,5700 ,4372627 ,7535561 1,655697 10 10 10 10 10 10 65,8258 12,8631 24,1179 ,3359457 ,8554369 1,381012 98,6118 19,4059 38,5176 ,3984182 ,9166729 1,998384 17 17 17 17 17 17 147,4085 7,1908 28,2904 ,2551054 ,9370644 1,107508 65,3687 21,1562 38,9500 ,4384301 ,6705652 1,690534 16 16 16 16 16 16 46,8366 6,6447 50,1262 ,2259633 ,7738501 1,542768 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. ECA II ID DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * AT1 93,9190 19,7381 30,6000 ,4027454 ,6702478 1,627679 21 21 21 21 21 21 133,5030 7,4260 17,6366 ,2974503 ,6618773 ,725770 74,8300 23,2200 47,3150 ,4252819 ,9387189 2,083393 20 20 20 20 20 20 57,9288 10,1268 49,1554 ,2264020 1,0376623 1,762065 34,8500 20,6000 17,4000 ,5986642 ,4992308 ,864462 2 2 2 2 2 2 3,3234 3,5355 1,6971 ,1585405 1,09E-03 ,230747 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. AT1 AA AC CC A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * AGT 63,5083 17,8833 24,8333 ,3914787 ,5110124 1,432402 12 12 12 12 12 12 46,6283 5,2312 10,4771 ,2342794 ,3497477 ,493456 91,5167 23,9875 43,8667 ,4808311 ,9221687 1,898193 24 24 24 24 24 24 129,5369 9,8475 41,7791 ,2828834 ,9125651 1,469203 82,8714 18,5429 38,9857 ,2747041 ,7976922 2,118941 7 7 7 7 7 7 45,7435 6,9735 43,9692 ,1573679 1,1746837 1,764021 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. AGT MM MT TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 100 Tabla 4.3.1 Prueba t-Student: HOMBRES MM VS. MT Estadísticos de grupo 12 63,5083 46,6283 13,4604 24 91,5167 129,5369 26,4416 12 17,8833 5,2312 1,5101 24 23,9875 9,8475 2,0101 12 24,8333 10,4771 3,0245 24 43,8667 41,7791 8,5281 12 ,3914787 ,2342794 6,763E-02 24 ,4808311 ,2828834 5,774E-02 12 ,5110124 ,3497477 ,1009635 24 ,9221687 ,9125651 ,1862766 12 1,432402 ,493456 ,142449 24 1,898193 1,469203 ,299900 AGT MM MT MM MT MM MT MM MT MM MT MM MT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 4.3.2 Prueba t-Student: HOMBRES MM VS. TT Estadísticos de grupo 12 63,5083 46,6283 13,4604 7 82,8714 45,7435 17,2894 12 17,8833 5,2312 1,5101 7 18,5429 6,9735 2,6357 12 24,8333 10,4771 3,0245 7 38,9857 43,9692 16,6188 12 ,3914787 ,2342794 6,763E-02 7 ,2747041 ,1573679 5,948E-02 12 ,5110124 ,3497477 ,1009635 7 ,7976922 1,1746837 ,4439887 12 1,432402 ,493456 ,142449 7 2,118941 1,764021 ,666737 AGT MM TT MM TT MM TT MM TT MM TT MM TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * * ° A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 101 Tabla 4.3.3 Prueba t-Student: HOMBRES MT VS. TT Estadísticos de grupo 24 91,5167 129,5369 26,4416 7 82,8714 45,7435 17,2894 24 23,9875 9,8475 2,0101 7 18,5429 6,9735 2,6357 24 43,8667 41,7791 8,5281 7 38,9857 43,9692 16,6188 24 ,4808311 ,2828834 5,774E-02 7 ,2747041 ,1573679 5,948E-02 24 ,9221687 ,9125651 ,1862766 7 ,7976922 1,1746837 ,4439887 24 1,898193 1,469203 ,299900 7 2,118941 1,764021 ,666737 AGT MT TT MT TT MT TT MT TT MT TT MT TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 4.3.4 Prueba t-Student: HOMBRES II VS. ID Estadísticos de grupo 10 81,6300 65,8258 20,8160 17 98,6118 147,4085 35,7518 10 25,1700 12,8631 4,0677 17 19,4059 7,1908 1,7440 10 34,5700 24,1179 7,6267 17 38,5176 28,2904 6,8614 10 ,4372627 ,3359457 ,1062354 17 ,3984182 ,2551054 6,187E-02 10 ,7535561 ,8554369 ,2705129 17 ,9166729 ,9370644 ,2272715 10 1,655697 1,381012 ,436714 17 1,998384 1,107508 ,268610 ECA II ID II ID II ID II ID II ID II ID A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 102 Tabla 4.3.5 Prueba t-Student: HOMBRES II VS. DD Estadísticos de grupo 10 81,6300 65,8258 20,8160 16 65,3688 46,8366 11,7091 10 25,1700 12,8631 4,0677 16 21,1563 6,6447 1,6612 10 34,5700 24,1179 7,6267 16 38,9500 50,1262 12,5315 10 ,4372627 ,3359457 ,1062354 16 ,4384301 ,2259633 5,649E-02 10 ,7535561 ,8554369 ,2705129 16 ,6705652 ,7738501 ,1934625 10 1,655697 1,381012 ,436714 16 1,690534 1,542768 ,385692 ECA II DD II DD II DD II DD II DD II DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 4.3.6 Prueba t-Student: HOMBRES ID VS. DD Estadísticos de grupo 17 98,6118 147,4085 35,7518 16 65,3688 46,8366 11,7091 17 19,4059 7,1908 1,7440 16 21,1563 6,6447 1,6612 17 38,5176 28,2904 6,8614 16 38,9500 50,1262 12,5315 17 ,3984182 ,2551054 6,187E-02 16 ,4384301 ,2259633 5,649E-02 17 ,9166729 ,9370644 ,2272715 16 ,6705652 ,7738501 ,1934625 17 1,998384 1,107508 ,268610 16 1,690534 1,542768 ,385692 ECA ID DD ID DD ID DD ID DD ID DD ID DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 103 Tabla 4.3.7 Prueba t-Student: HOMBRES AA VS. AC Estadísticos de grupo 21 93,9190 133,5030 29,1327 20 74,8300 57,9288 12,9533 21 19,7381 7,4260 1,6205 20 23,2200 10,1268 2,2644 21 30,6000 17,6366 3,8486 20 47,3150 49,1554 10,9915 21 ,4027454 ,2974503 6,491E-02 20 ,4252819 ,2264020 5,063E-02 21 ,6702478 ,6618773 ,1444335 20 ,9387189 1,0376623 ,2320284 21 1,627679 ,725770 ,158376 20 2,083393 1,762065 ,394010 AT1 AA AC AA AC AA AC AA AC AA AC AA AC A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 4.3.8 Prueba t-Student: HOMBRES AA VS. CC Estadísticos de grupo 21 93,9190 133,5030 29,1327 2 34,8500 3,3234 2,3500 21 19,7381 7,4260 1,6205 2 20,6000 3,5355 2,5000 21 30,6000 17,6366 3,8486 2 17,4000 1,6971 1,2000 21 ,4027454 ,2974503 6,491E-02 2 ,5986642 ,1585405 ,1121050 21 ,6702478 ,6618773 ,1444335 2 ,4992308 1,0879E-03 7,692E-04 21 1,627679 ,725770 ,158376 2 ,864462 ,230747 ,163163 AT1 AA CC AA CC AA CC AA CC AA CC AA CC A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 104 Tabla 4.3.9 Prueba t-Student: HOMBRES AC VS. CC Estadísticos de grupo 20 74,8300 57,9288 12,9533 2 34,8500 3,3234 2,3500 20 23,2200 10,1268 2,2644 2 20,6000 3,5355 2,5000 20 47,3150 49,1554 10,9915 2 17,4000 1,6971 1,2000 20 ,4252819 ,2264020 5,063E-02 2 ,5986642 ,1585405 ,1121050 20 ,9387189 1,0376623 ,2320284 2 ,4992308 1,0879E-03 7,692E-04 20 2,083393 1,762065 ,394010 2 ,864462 ,230747 ,163163 AT1 AC CC AC CC AC CC AC CC AC CC AC CC A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * # A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 105 Tabla 5.1 Valores medios en Mujeres SEXO AI AII A-(1-7) AII/AI AI/A-(1-7) AII/A-(1-7) MUJER MEDIA N D. TIP 101.23 50 103.25 23.17 50 11.01 26.04 50 13.98 0.41 50 0.32 0.54 50 0.57 1.23 50 0.58 Tabla 5.2 Valores medios de las Mujeres por genotipos A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * ECA 103,7250 22,7313 26,2750 ,4123452 ,5324207 1,246725 16 16 16 16 16 16 127,3581 9,8880 15,3275 ,3126503 ,6274191 ,683057 74,3950 19,9550 25,9450 ,4513566 ,6491352 1,345748 20 20 20 20 20 20 65,9206 8,1226 15,2581 ,3614144 ,5972334 ,542141 136,7286 28,2786 25,9214 ,3486372 ,4119602 1,039428 14 14 14 14 14 14 112,4368 14,2658 11,2121 ,2913726 ,4555609 ,517799 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. ECA II ID DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * AT1 101,1889 23,0926 25,7333 ,4198356 ,5585463 1,231424 27 27 27 27 27 27 117,2510 12,4132 14,1199 ,3299026 ,5628442 ,518480 108,2750 23,4150 25,6550 ,3691680 ,4966032 1,195495 20 20 20 20 20 20 89,9518 10,0018 14,2733 ,3163652 ,5976765 ,682367 54,7000 22,3000 31,4333 ,5955512 ,7520206 1,418729 3 3 3 3 3 3 42,9578 3,8974 14,7595 ,3661286 ,5669770 ,664208 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. AT1 AA AC CC A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 * AGT 86,5000 22,1667 25,9800 ,4911734 ,6424611 1,242521 15 15 15 15 15 15 77,3642 8,9514 10,8737 ,4111619 ,5522507 ,398627 122,2769 25,2923 24,8692 ,3352585 ,3853067 1,103987 26 26 26 26 26 26 123,1549 12,8969 13,5214 ,2482253 ,4409204 ,550700 65,0000 18,7333 29,5444 ,4912506 ,8459986 1,563674 9 9 9 9 9 9 64,0309 6,6289 20,0334 ,3406021 ,7981327 ,838573 Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. Media N Desv. típ. AGT MM MT TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 106 5.3.1 Prueba t-Student: MUJERES MM (1) VS. MT (2) Estadísticos de grupo 15 86,5000 77,3642 19,9753 26 122,2769 123,1549 24,1527 15 22,1667 8,9514 2,3112 26 25,2923 12,8969 2,5293 15 25,9800 10,8737 2,8076 26 24,8692 13,5214 2,6518 15 ,4911734 ,4111619 ,1061615 26 ,3352585 ,2482253 4,868E-02 15 ,6424611 ,5522507 ,1425905 26 ,3853067 ,4409204 8,647E-02 15 1,242521 ,398627 ,102925 26 1,103987 ,550700 ,108001 AGT 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 5.3.2 Prueba t-Student: MUJERES MM VS. TT Estadísticos de grupo 15 86,5000 77,3642 19,9753 9 65,0000 64,0309 21,3436 15 22,1667 8,9514 2,3112 9 18,7333 6,6289 2,2096 15 25,9800 10,8737 2,8076 9 29,5444 20,0334 6,6778 15 ,4911734 ,4111619 ,1061615 9 ,4912506 ,3406021 ,1135340 15 ,6424611 ,5522507 ,1425905 9 ,8459986 ,7981327 ,2660442 15 1,242521 ,398627 ,102925 9 1,563674 ,838573 ,279524 AGT MM TT MM TT MM TT MM TT MM TT MM TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 107 Tabla 5.3.3 Prueba t-Student: MUJERES MT VS. TT Estadísticos de grupo 26 122,2769 123,1549 24,1527 9 65,0000 64,0309 21,3436 26 25,2923 12,8969 2,5293 9 18,7333 6,6289 2,2096 26 24,8692 13,5214 2,6518 9 29,5444 20,0334 6,6778 26 ,3352585 ,2482253 4,868E-02 9 ,4912506 ,3406021 ,1135340 26 ,3853067 ,4409204 8,647E-02 9 ,8459986 ,7981327 ,2660442 26 1,103987 ,550700 ,108001 9 1,563674 ,838573 ,279524 AGT MT TT MT TT MT TT MT TT MT TT MT TT A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 5.3.4 Prueba t-Student: MUJERES II VS. ID Estadísticos de grupo 16 103,7250 127,3581 31,8395 20 74,3950 65,9206 14,7403 16 22,7313 9,8880 2,4720 20 19,9550 8,1226 1,8163 16 26,2750 15,3275 3,8319 20 25,9450 15,2581 3,4118 16 ,4123452 ,3126503 7,816E-02 20 ,4513566 ,3614144 8,081E-02 16 ,5324207 ,6274191 ,1568548 20 ,6491352 ,5972334 ,1335454 16 1,246725 ,683057 ,170764 20 1,345748 ,542141 ,121226 ECA II ID II ID II ID II ID II ID II ID A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - <0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 ° A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 108 Tabla 5.3.5 Prueba t-Student: MUJERES II VS. DD Estadísticos de grupo 16 103,7250 127,3581 31,8395 14 136,7286 112,4368 30,0500 16 22,7313 9,8880 2,4720 14 28,2786 14,2658 3,8127 16 26,2750 15,3275 3,8319 14 25,9214 11,2121 2,9966 16 ,4123452 ,3126503 7,816E-02 14 ,3486372 ,2913726 7,787E-02 16 ,5324207 ,6274191 ,1568548 14 ,4119602 ,4555609 ,1217538 16 1,246725 ,683057 ,170764 14 1,039428 ,517799 ,138388 ECA II DD II DD II DD II DD II DD II DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 5.3.6 Prueba t-Student: MUJERES ID VS. DD Estadísticos de grupo 20 74,3950 65,9206 14,7403 14 136,7286 112,4368 30,0500 20 19,9550 8,1226 1,8163 14 28,2786 14,2658 3,8127 20 25,9450 15,2581 3,4118 14 25,9214 11,2121 2,9966 20 ,4513566 ,3614144 8,081E-02 14 ,3486372 ,2913726 7,787E-02 20 ,6491352 ,5972334 ,1335454 14 ,4119602 ,4555609 ,1217538 20 1,345748 ,542141 ,121226 14 1,039428 ,517799 ,138388 ECA ID DD ID DD ID DD ID DD ID DD ID DD A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * * A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 115 Tabla 6.3.5 Prueba t-Student: ID: HOMBRE (1) VS. MUJER (2) Estadísticos de grupo 17 98,6118 147,4085 35,7518 20 74,3950 65,9206 14,7403 17 19,4059 7,1908 1,7440 20 19,9550 8,1226 1,8163 17 38,5176 28,2904 6,8614 20 25,9450 15,2581 3,4118 17 ,3984182 ,2551054 6,187E-02 20 ,4513566 ,3614144 8,081E-02 17 ,9166729 ,9370644 ,2272715 20 ,6491352 ,5972334 ,1335454 17 1,998384 1,107508 ,268610 20 1,345748 ,542141 ,121226 SEXO 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 6.3.6 Prueba t-Student: DD: HOMBRE (1) VS. MUJER (2) Estadísticos de grupo 16 65,3688 46,8366 11,7091 14 136,7286 112,4368 30,0500 16 21,1563 6,6447 1,6612 14 28,2786 14,2658 3,8127 16 38,9500 50,1262 12,5315 14 25,9214 11,2121 2,9966 16 ,4384301 ,2259633 5,649E-02 14 ,3486372 ,2913726 7,787E-02 16 ,6705652 ,7738501 ,1934625 14 ,4119602 ,4555609 ,1217538 16 1,690534 1,542768 ,385692 14 1,039428 ,517799 ,138388 SEXO 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * * A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 116 Tabla 6.3.7 Prueba t-Student: AA: HOMBRE (1) VS. MUJER (2) Estadísticos de grupo 21 93,9190 133,5030 29,1327 27 101,1889 117,2510 22,5650 21 19,7381 7,4260 1,6205 27 23,0926 12,4132 2,3889 21 30,6000 17,6366 3,8486 27 25,7333 14,1199 2,7174 21 ,4027454 ,2974503 6,491E-02 27 ,4198356 ,3299026 6,349E-02 21 ,6702478 ,6618773 ,1444335 27 ,5585463 ,5628442 ,1083194 21 1,627679 ,725770 ,158376 27 1,231424 ,518480 9,97815E-02 SEXO 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media Tabla 6.3.8 Prueba t-Student: AC: HOMBRE (1) VS. MUJER (2) Estadísticos de grupo 20 74,8300 57,9288 12,9533 20 108,2750 89,9518 20,1138 20 23,2200 10,1268 2,2644 20 23,4150 10,0018 2,2365 20 47,3150 49,1554 10,9915 20 25,6550 14,2733 3,1916 20 ,4252819 ,2264020 5,063E-02 20 ,3691680 ,3163652 7,074E-02 20 ,9387189 1,0376623 ,2320284 20 ,4966032 ,5976765 ,1336445 20 2,083393 1,762065 ,394010 20 1,195495 ,682367 ,152582 SEXO 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 * * ° A1= Angiotensina I (AI), A2= Angiotensina (AII), A17= Angitensina A-(1-7). AG2AG1= AII/AI, AG17AG1= A-(1-7)/AI, AG17AG2=A-(1-7)/AII 117 Tabla 6.3.9 Prueba t-Student: CC: HOMBRE (1) VS. MUJER (2) Estadísticos de grupo 2 34,8500 3,3234 2,3500 3 54,7000 42,9578 24,8017 2 20,6000 3,5355 2,5000 3 22,3000 3,8974 2,2502 2 17,4000 1,6971 1,2000 3 31,4333 14,7595 8,5214 2 ,5986642 ,1585405 ,1121050 3 ,5955512 ,3661286 ,2113845 2 ,4992308 1,0879E-03 7,692E-04 3 ,7520206 ,5669770 ,3273443 2 ,864462 ,230747 ,163163 3 1,418729 ,664208 ,383481 SEXO 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 A1 A2 A17 AG2AG1 AG17AG1 AG17AG2 N Media Desviación típ. Error típ. de la media * - p<0.05 # - p<0.01 ° - p ≈ 0.05 118 5-DISCUSIÓN: 119 5DISCUSIÓN: 5.1Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la población a estudio (Tabla 1 y Figs 2.1 y 2.2): El estudio de los niveles peptídicos del sistema renina-angiotensinaaldosterona, ha representado siempre un problema en tres vertientes: una de ellas debido a la labilidad de estos pequeños péptidos en fluidos biológicos, atacables por muy distintas y poco específicas proteasas, por lo que requieren para su estudio de la composición y fabricación de una mezcla de inhibidores de estas enzimas (ver apartado de Métodos 3.3.1 y 3.3.2); una segunda cuestión, metodológica, que consiste en la elección de los métodos de extracción de la muestra y sistema de análisis y detección para una correcta discriminación de los distintos péptidos (Kohara y cols, 1991; Nakamoto y cols, 1995); y una tercera debida a la variabilidad fisiológica en sus niveles, que son muy influenciables ante distintas condiciones (Workman y cols, 1979; Matsui y cols, 1999). Estas características metodológicas llevan a diferencias significativas en cuanto a los resultados obtenidos por distintos investigadores, adquiriendo, quizás, más relevancia no tanto los valores absolutos de los niveles peptídicos, sino las diferencias que se obtienen debido a tratamientos (Murphey y cols, 2000), entre distintos genotipos (Bloem y cols, 1996; Paillard y cols, 1999; Danser ycols 1998 y 1999) o actividades ezimáticas del eje ( Yamada y cols, 1998; van Dijk y cols, 2000). Por otro lado los índices que reflejan los cocientes peptídicos AII/AI, A-(17)/AI y A-(1-7)/AII, podrían asimilar mejor los resultados entre los distintos investigadores, ya que los péptidos aludidos interaccionan en una relación substrato/producto. A pesar de la gran cantidad de bibliografia sobre el tema, existen pocos estudios en humanos de los niveles de los péptidos de la angiotensina, en especial de la A-(1-7). Workman y cols (1979) en una muestra de 88 sujetos hipertensos encontró que los niveles de AI oscilaban desde un mínimo de 12 pgr/mL a un máximo de 1990 pgr/mL, siendo el valor medio en posición supina de 220 pgr/mL. Matsui y cols (1999) en una muestra de 13 varones japoneses no encontró diferencias en los niveles de AI ni AII entre los sanos y los que tenían una HTA leve en 120 posición supina, encontrando unos niveles de AI de 304 ± 43 fmol/mL y de AII de 32 ± 6 fmol/mL. Paillard y cols (1999) describen en su estudio sobre una muestra de 114 sujetos normotensos, 87 hombres y 27 mujeres, un nivel medio de AII de 7.6 ± 6.5 pgr/mL, sin discriminar por sexos. En el mismo sentido Shimamoto y cols (1990) encuentran unos niveles de AII de 12.0 pgr/mL en sujetos sanos. La razón AII/AI se considera un indicador indirecto de la actividad de la ECA circulante, ya que pese a que existe otra enzima conversora de AI a AII llamada Quimasa (Voors y cols, 1998), su acción en el torrente circulatorio según Saris y cols (2000) es despreciable. Danser y cols (1999) inyectando I125-AI intravenoso en el antebrazo de 12 mujeres y 17 hombres (de 24 a 67 años de edad) describieron una conversión de I125AI a I125-AII de 38 ± 4 %, 30 ± 3 % y 31 ± 6 % en sujetos DD ,ID y II respectivamente, no encontrando asociación entre las variantes del polimorfismo ECA I/D y dicha conversión. Por su parte Saris y cols (2000) inyectando AI y AII intraarerialmente en el antebrazo de 14 varones normotensos encontraron una conversión de AI a AII del 36% (rango del 18 al 57%) en la sangre arterial. En nuestro estudio los valores medios de los péptidos de la angiotensina obtenidos son de 92.47 ± 102.11 pgr/mL de AI, 22.35 ± 10.00 pgr/mL de AII y 31.46 ± 27.31 pgr/mL de A-(1-7). Los valores medios de la conversión de AI a AII (AII/AI) obtenidos en nuestro estudio son de 0.41 ± 0.29, de AI a A-(1-7) (A-(1-7)/AI) son de 0.65 ± 0.71 pgr/mL, y de AII a A-(1-7) (A-(1-7)/AII) de 1.49 ± 1.03 pgr/mL. Se observó una gran desviación en todas las determinaciones que concuerdan con los diferentes trabajos publicados. 121 5.2Comparación entre los Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en la muestra a estudio en relación con los polimorfismos del gen del Angiotensinógeno, de la ECA y del AT1R. 5.2.1Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en relación con el polimorfismo M235T del gen del Angiotensinógeno (Tablas 2.1, 2.4, 2.5 y 2.6; y Figs 3.1 y 3.2): En el caso de la AI se observan mayores niveles en MM que en TT, no siendo significativas ninguna de las diferencias. Según la bibliografía previa el alelo T está asociado a unos mayores niveles de AGT (Bloem y cols, 1996; Danser y cols, 1998; Pratt y cols, 1998; Paillard y cols 1999), sin embargo también está asociado a su vez con una disminución en la actividad de la renina (PRA) y sus niveles según Danser y cols (1999), lo que explicaría el hecho de que AI sea mayor en los MM que en los TT (si bien esta diferencia en nuestro estudio no es significativa ni de mucha magnitud). Por otra parte Bohlender y cols (2000), sostienen en su estudio que un aumento en los niveles de AGT produce una disminución del aclaramiento de renina y, por tanto, un aumento de su vida media. En el caso de la AII los mayores niveles se encuentran mayores niveles en MM que en TT, siendo exclusivamente significativa la diferencia entre MT y TT (24.66 ± 11.43 vs 18.65 ± 6.54, p < 0.05). Por ser la AII la molécula presora más importante del eje se podría considerar que unos mayores niveles de ésta se asocian con una mayor respuesta presora y por tanto con mayor riesgo. Si bien la mayor parte de la bibliografía previa apunta a un aumento del riesgo con el alelo T (Jeunemaitre y cols, 1992; Hata y cols,1994; Tiret y cols,1998), algunos estudios señalan al alelo M como el de riesgo para sujetos sin otros factores de riesgo clásicos cardiovasculares (Fernadez-Arcas y cols; 1999; Vasku y cols, 1998), como es el caso de este estudio al utilizar una población joven (edad = 20.67 ± 2.75 años) y sana. Los mayores niveles de A-(1-7) se encuentran en el alelo T en definitiva, y los menores en los MM (alelo M)(33.98 vs 25.47), siendo clara pero no significativa la diferencia. El efecto final de la A-(1-7) se considera actualmente, de forma unánime, como vasodepresor (Porsti y cols, 1994; Li y cols, 1997; Ferrario y cols, 1998; Paula y cols, 1999; Roks y cols, 1999), jugando un papel contrarregulador de la AII (Ferrario y cols, 1997; Chappell y cols, 1998), y pudiendo considerarse por tanto como un factor protector cardiovascular (Ferrario y cols, 1998). Teniendo en cuenta este hecho, el alelo 122 T sería el protector en este caso, coincidiendo con lo publicado por Fernández-Arcas (1999). En la razón AII/AI los mayores niveles se encuentran en los MM, y los menores en los TT, sin embargo ninguna de las diferencias es significativa (0.44 vs 0.39, en MM y TT respectivamente). La razón AII/AI es un índice indirecto in vivo de la actividad de la ECA, considerándose los niveles plasmáticos de la ECA como un factor de riesgo (Cambien y cols, 1994). En el caso de la razón A-(1-7)/AI, indicador de la conversión de AI a A-(1-7), los mayores niveles se encuentran en los TT, y los menores en los MM, siendo llamativas pero no significativas las diferencias (0.82 vs 0.58, respectivamente). Y en la razón A-(1-7)/AII, indicador de la conversión de AII a A-(1-7), los mayores niveles se encuentran en los TT, y los menores en los MM, aunque las diferencias son evidentes no llegan a la significación (1.80 vs 1.32, respectivamente). 5.2.2Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en relación con el polimorfismo I/D del gen de la ECA (Tabla 2.2, 2.7,2.8 y 2.9; y Figs 3.1 y 3.2): En el caso de la AI los mayores niveles se encuentran en los DD y en los II, siendo la diferencia mínima (98.67 vs 95.22), y los menores en los ID (85.52), no siendo significativa ninguna de las diferencias. En el polimorfismo I/D de la ECA el alelo D determina un aumento en la actividad de la ECA (Young y cols, 1998; Murphey y cols, 2000) y su concentración (Rigat y cols, 1990), por lo que cabría esperar un mayor paso de AI a AII, una menor concentración de AI y mayor de AII en el alelo D, así como lo opuesto en el alelo I. Sin embargo en la bibliobrafía previa sólo se ha conseguido relacionar con los niveles y actividad de la ECA, pero no con los niveles de AI, AII ni A-(1-7) (Danser y cols,1999 y 1998), lo que se corresponderse con nuestrosresultados. Danser y cols mediante dos estudios (1998 y 1999) demostraron un incremento de la ECA circulante en el alelo D, si bien no encontraron ninguna relación con la transformación de AI a AII, ni con los niveles de renina, prorrenina, AGT ni aldosterona. En la AII los mayores niveles se encuentran en los DD y en los II, siendo la diferencia mínima (24.48 vs 23.67), y los menores en los ID (19.70), siendo únicamente significativa la diferencia entre ID y DD (19.70 vs 24.48, p < 0.05). Pese al intento de relacionar los polimorfismos I/D de la ECA con los niveles de AII no se ha conseguido detectar el aumento en los DD que sería de esperar, más aún, no se produce una 123 disminución de la AII en el tratamiento crónico con inhibidores de la ECA, sino sólo un aumento en AI y A-(1-7) (Luque y cols, 1996). En el caso de la A-(1-7) no hay diferencias significativas, siendo ligeramente mayores en DD (32.87 vs 29.46, en DD e II respectivamente). Cabiendo esperar unos mayores niveles en II y menores en DD, debido a la disminución de la actividad de la ECA en los II, lo que desviaría el eje hacia la formación de A-(1-7). En la razón AII/AI tampoco existen diferencias. Cabiendo esperar una mayor razón en los DD y menores en II, debido a la mayor actividad de la ECA con el alelo D (Rigat y cols, 1990; Young y cols, 1998; Murphey y cols, 2000). Y en el caso de las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII los mayores niveles se encuentran en los ID, siendo levemente mayores en los II que en los DD. Dichas razones pretenden representar la conversión de AI y AII a A-(1-7), paso llevado a cabo por varias enzimas. 5.2.3Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en relación con el polimorfismo A1166C del gen del AT1 (Tabla 2.3, 2.10, 2.11 y 2.12; y Figs 3.1 y 3.2): El escaso número de individuos CC comparado con los otros dos genotipos, que coincide con estudios de prevalencia previos, dificulta el hallazgo de significaciones. No hay ningún estudio previo que halla conseguido relacionar el polimorfismo A1166C del gen del AT1 con los niveles en plasma de AI, AII ni A-(1-7), sólo con la mayor expresión del receptor AT1 y una mayor respuesta a la AII (Van Geel y cols, 1998 y 2000; Spiering y cols, 2000) en el alelo C. En el caso de la AI los mayores niveles se encuentran en los AA, seguido de los AC, encontrándose los menores niveles en los CC, siendo únicamente significativa la diferencia entre AC y CC (91.55 vs 46.76, p < 0.05). Teniendo en cuenta que la AII provoca a través del receptor AT1 unos mayores niveles de AGT (feedback positivo) (Brasier y cols, 1996; Jamaluddin y cols, 2000) y que el alelo C se ha asociado a una mayor respuesta a la AII (van Geel y cols, 1998 y 2000), en el alelo C los niveles de AGT deberían ser mayores, y por tanto los de AI también, lo que no coincide con nuestros resultados. En la AII los mayores niveles se encuentran en los AC, siendo iguales en los AA y CC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. 124 Respecto a la A-(1-7) los mayores niveles se encuentran en los AC (36.48 pgr/mL), siendo un poco mayores en los AA que en los CC (27.86 vs 25.82 pgr/mL), no siendo significativa ninguna de las diferencias. En la razón AII/AI los mayores niveles se encuentran en los CC, intermedios en los AA y menores en los AC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Indicando una mayor conversión en los CC. En el caso de la razón A-(1-7)/AI los mayores niveles se encuentran en los AC, intermedios en los CC y menores en los AA, no siendo significativa ninguna de las diferencias; y en la razón A-(1-7)/AII los mayores niveles se encuentran en los AC, intermedios en los AA y menores en los CC, no siendo significativa ninguna de las diferencias. Indicando una mayor conversión en los AC. 5.3Descripción de los valores plasmáticos de los péptidos del SRA en Hombres (Tabla 4.1): Los valores obtenidos de los distintos péptidos del SRA en hombres (n = 43) son de 82.29 ± 101.03 pgr/mL (media ± desviación típica) para la AI, 21.40 ± 8.71 pgr/mL para la AII, 37.76 ± 36.47 pgr/mL para la A-(1-7), 0.42 ± 0.26 para la razón AII/AI, 0.79 ± 0.85 para la razón A-(1-7)/AI, y de 1.80 ± 1.32 para la razón A-(1-7)/AII. 5.3.1Valores plasmáticos de los péptidos del SRA en Hombres en relación a los distintos genotipos: 5.3.1.1Genotipos del polimorfismo M235T del angiotensinógeno en hombres (Tabla general 4.2, y pormenorizadas 4.3.1, 4.3.2 y 4.3.3; Figs 4.1 y 4.2): En el caso de la AI los niveles son mayores en TT con respecto a MM (82.87 vs 63.50) pero no significativos. Así el alelo T tiene en varones aumento de AI, que no se observaba cuando se consideraba toda la muestra (incluyendo a las mujeres), y que se puede explicar aparentemente por la mencionada relación entre el alelo T y una mayor producción de AGT (Bloem y cols, 1996; Danser y cols, 1998; Pratt y cols, 1998; Paillard y cols 1999) y el aumento en la actividad de la renina que se produce en varones (Wagner y cols, 1990, en ratones). En la AII en varones los mayores niveles se encuentran en MT, siendo casi iguales en TT y MM (18.54 vs 17.88), y encontrándose únicamente significativa la diferencia entre MM y MT (17.88 vs 23.98, p < 0.05). 131 las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo si consideramos el nivel de actividad del SRA en el plano teórico podríamos decir que los varones, debido a un aumento de la PRA (Danser y cols, 1998) y a un aumento de actividad de la ECA (comparado con mujeres), presentarían una mayor tendencia a tener una AII más elevada que las mujeres, hecho que podría verse compensado por un aumento del paso de AII a A-(1-7); como así se demuestra por la diferente significación de la razón A-(1-7)-AII (1.80 vs 1.22, p < 0.01, en varones y mujeres respectivamente). Para la razón AII/AI no hay diferencias significativas entre hombres y mujeres (0.42 vs 0.41), lo que coincide con los resultados de Gandhi y cols (1998), que no encuentra diferencias en los niveles de AII/AI, AII, ni de P.R.A. entre sexos. Para las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII hay una diferencia a favor de los varones, que se hace muy significativa en la A-(1-7)/AII (1.80 vs 1.22, p < 0.01), lo que indica que el paso a A-(1-7) en varones ocurre desde AI y AII, pero desde el último es mayor. Así el mayor nivel de A-(1-7) en varones respecto a mujeres se podría llevar a cabo desde AII, lo que a su vez explicaría que la cantidad de AII sea la misma en ambos sexos. - ¿Cómo afectan los genotipos de los polimorfismos estudiados a las relaciones de los niveles peptídicos cuando se distribuye la población según por sexos?: 5.6Valores plasmáticos de los péptidos del SRA por Sexos en relación a los distintos polimorfismos (Hombre vs. Mujer) (Figura 6.1 a 6.6): 5.6.1Genotipos del polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno (Tabla 6.2): 5.6.1.aGenotipo MM (Tabla 6.3.1 y Figs 6.1 a 6.6): En el genotipo homocigótico MM se mantienen unos valores altos de AI en mujeres sobre hombres que se refleja también en unos mayores niveles de AII de forma no significativa; aunque este último no se corresponde con lo hallado por sexos en general donde no había diferencias, contraponiéndose a los resultados de Gandhi y Gallagher (Gandhi y cols, 1998; Gallagher y cols, 1999). Para A-(1-7) no hay diferencias significativas entre hombres y mujeres (24.83 vs 25.98). La razón AII-AI presenta un aumento no significativo en mujeres que no cabría esperar según ningún estudio previo. 132 Para la razón A-(1-7)/AI hay un aumento no significativo en mujeres respecto a hombres, que no concuerda con los resultados por sexos en general (sin tener en cuenta polimorfismos). Sin embargo para la razón A-(1-7)/AII se mantiene el aumento relativo de los varones con respecto a las mujeres, lo que confirma que la mayor fuente del aumento del A-(1-7) en varones procede de la AII (y no de la AI). Los resultados obtenidos en este genotipo concuerdan con un patrón que parte de una menor síntesis de AGT (“patrón hombre”) y que conlleva un aumento de la PRA compensatoria. Se podría decir que las mujeres MM son más parecidas a los hombres (sin tener en cuenta polimorfismos) en el equilibrio del SRA. 5.6.1.bGenotipo MT (Tabla 6.3.2 Figs 6.1 a 6.6): En el caso de los heterocigóticos MT los valores de AI y AII no se diferencian de los valores obtenidos en la general por sexos. Y en la A-(1-7) se mantiene la diferencia significativa a favor de los hombres (43.86 vs 24.86, p < 0.05). Para la razón AII/AI hay aumento en varones respecto a mujeres no significativo, que no cabría esperar. Respecto a las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII hay una diferencia a favor de los varones, que se hace significativa en la A-(1-7)/AII (1.89 vs 1.10, p < 0.05), y muy significativa en la A-(1-7)/AI (0.92 vs 0.38, p < 0.01), lo que coincide con los resultados por sexos en la población general de la muestra. El genotipo MT asociado a unos valores de AGT intermedios presenta la relación de niveles peptídicos más similares a los de población general dividida por sexos, así como unos índices peptídicos y unas correlaciones acordes con lo esperado, en contraposición a los genotipos homocigóticos de este polimorfismo. 5.6.1.cGenotipo TT (Tabla 6.3.3 Figs 6.1 a 6.6): Paradójicamente los niveles de AI son mayores en varones, aunque de forma no significativa, lo que se contrapone con lo esperado según la diferencia entre sexos en la población general, y con estudios previos, en los que el varón presenta menores niveles de AGT (Pratt y cols, 1998; Brosnihan y cols, 1999) y mayor actividad de ECA respecto a la mujer (Gallagher y cols, 1999). En el caso de la AII no hay diferencia significativa, siendo iguales en el hombre y la mujer (18.54 vs 18.73). Según el estudio de Gandhi y cols (1998) no hay 133 diferencias de AII entre sexos, ni de la conversión de AI a AII, lo que coincidiría con nuestro resultados para este genotipo y por sexos en general. Respecto a los valores de A-(1-7) hay una clara diferencia no significativa a favor de los hombres (38.98 vs 29.54), lo que coincide con los resultados por sexos en general. En el caso de la razón AII/AI hay un paradójico aumento en mujeres respecto a hombres, pero no significativo, que no cabría esperar según los estudios previos. Para la razón A-(1-7)/AI hay un aumento no significativo en mujeres respecto a hombres (0.84 vs 0.79), que no concuerda con los resultados por sexos en general sin tener en cuenta polimorfismos. Sin embargo para la razón A-(1-7)/AII se mantiene el aumento relativo de los varones con respecto a las mujeres, lo que confirma que la mayor fuente del aumento del A-(1-7) en varones procede de la AII (y no de la AI). 5.6.2Genotipos del polimorfismo I/D del gen de la ECA (Tabla 6.2): 5.6.2.aGenotipo II (Tabla 6.3.4 Figs 6.1 a 6.6): En el caso de AI los valores son claramente mayores en mujeres (103.72 vs 81.63) de forma no significativa; en el de la AII los valores son similares en varones que en mujeres (25.17 vs 22.73); y en el caso de la A-(1-7) hay una diferencia no significativa a favor de los hombres (34.57 vs 26.27), correspondiéndose todo ello con lo esperado por sexos en general. En el caso de la razón AII/AI no existen diferencias entre sexos; y en el de las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII hay una diferencia no significativa a favor de los varones, lo que coincide también con los resultados por sexos en la población general de la muestra. Así se puede concluir que el genotipo II no plantea diferencias en el equilibrio del SRA en relación a la comparación entre sexos en la población general. 5.6.2.bGenotipo ID (Tabla 6.3.5 Figs 6.1 a 6.6): En el caso de la AI los valores presentan un aumento no significativo en varones (98.61 vs 74.39), lo que no se corresponde con lo esperado por sexos en general, ni con lo esperado en los estudios previos, debido a los menores valores de angiotensinógeno (Pratt y cols, 1998; Brosnihan y cols, 1999), y mayor actividad relativa de la ECA (Gallagher y cols, 1999) en los varones. 134 En la AII no hay diferencia significativa, siendo iguales en el hombre y la mujer. Según el estudio de Gandhi y cols (1998) no hay diferencias de AII entre sexos, ni de la conversión de AI a AII, lo que coincidiría con nuestro resultado y nuestros resultados por sexos en general. Respecto a la A-(1-7), hay diferencias no significativas a favor de los hombres (38.51 vs 25.94). Lo que coincide con los resultados por sexos en general. En la razón AII/AI hay un leve, pero paradójico aumento, no significativo, en mujeres respecto a hombres (0.45 vs 0.39), que no cabría esperar según los estudios previos. En el caso de las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII hay una clara diferencia a favor de los varones, que se hace significativa en la A-(1-7)/AII (1.99 vs 1.34, p < 0.05), lo que indica que el mayor paso a A-(1-7) en varones ocurre desde AII para este genotipo. Así el mayor nivel de A-(1-7) en varones respecto a mujeres se podría llevar a cabo desde AII, lo que a su vez explicaría que la cantidad de AII sea la misma en ambos sexos, y no mayor en varones. Por tanto el genotipo heterocigótico ID presenta una única variación respecto a las diferencias por sexos en la población general, que son los mayores niveles de AI en hombres, una posible explicación a este hecho podría establecerse en que una actividad intermedia de la enzima conversora nos llevaría a unos niveles más equilibrados de AII, y por tanto a una mayor estabilidad en la regulación de la PRA. 5.6.2.cGenotipo DD (Tabla 6.3.6 Figs 6.1 a 6.6): En el caso de la AI los valores son mayores en mujeres de forma significativa (136.72 vs 65.36, p < 0.05), lo que se corresponde con lo esperado por sexos en general, siendo aún mayor el nivel de AI en este grupo de DD, lo que se podría explicar por estar asociada a una mayor actividad de la ECA (Murphey y cols, 2000). En la AII los valores son mayores en mujeres (28.27 vs 21.15) de forma no significativa, lo que no se corresponde con lo esperado por sexos en general (donde no había diferencia), ya que según la bibliografía previa no hay diferencias por sexo (Gandhi y cols,1998), o bien, son menores en mujeres (Gallagher y cols, 1999). Respecto a la razón AII/AI hay aumento en varones respecto a mujeres no significativo (0.43 vs 0.34), que no cabría esperar según Gandhi y cols (1998) que no hallan diferencias por sexo, pero sí según Gallagher y cols (1999) que hallan el mismo tipo de diferencia. 135 En la valoración de los niveles de A-(1-7) y de las razones A-(1-7)/AI y A-(17)/AII, hay una diferencia no significativa a favor de los varones (38.95 vs 25.92, para la A-(1-7)), lo que coincide con los resultados por sexos en la población general de la muestra. Para el genotipo DD son dignos de mención los altos niveles de AII en mujeres. Este efecto puede explicarse teniendo en cuenta que los mayores niveles de AI en la mujer, pueden dar lugar, debido al aumento de la actividad de la ECA en los sujetos DD, a una mayor eficiencia de este paso. Contrastando este valor con el gran aumento no significativo de la razón AII/AI en hombres respecto a mujeres (0,43 vs 0,34), atribuible a los altos niveles de AI en las mujeres DD. La explicación a los altos niveles de AI y AII en mujeres DD puede venir mediada por un efecto sinérgico entre la estimulación de la síntesis de AGT vía AII (y su receptor), y el efecto de los estrógenos sobre el mismo (que también aumentan la síntesis de AGT). 5.6.3Genotipos del polimorfismo A1166C del gen del AT1 (Tabla 6.2): 5.6.3.aGenotipo AA (Tabla 6.3.7 Figs 6.1 a 6.6): Los valores de la AI son superiores en mujeres (101.18 vs 93.91) y los valores de A-(1-7) son mayores en varones (30.60 vs 25.73), ambos de forma no significativa, lo que se corresponde con lo esperado por sexos en general. En el caso de la AII los valores son levemente mayores en mujeres, de forma no significativa (23.09 vs 19.73), lo que no se corresponde con lo esperado por sexos en general (donde no había diferencia), ni con los estudios previos en los que no hay diferencias por sexo (Gandhi y cols,1998), o bien, son menores en mujeres (Gallagher y cols, 1999). En la razón AII/AI no hay diferencias significativas entre hombres y mujeres, lo que coincide con los resultados de Gandhi y cols (1998), que no encuentra diferencias en los niveles de AII/AI, AII, ni de PRA entre sexos. Y en las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII hay una clara diferencia a favor de los varones, que se hace significativa en la A-(1-7)/AII (1.62 vs 1.23, p < 0.05), lo que indica que el mayor paso a A-(1-7) en varones ocurriendo desde AI y AII, desde el último es mayor. 136 5.6.3.bGenotipo AC (Tabla 6.3.8 y Figs 6.1 a 6.6): Los valores de AI son mayores en mujeres (108.27 vs 74.83) de forma no significativa; en los valores de AII no hay diferencia significativa, siendo iguales en el hombre y la mujer; y en los de A-(1-7) hay una diferencia casi significativa a favor de los hombres (47.31 vs 25.65, p < 0.06), coincidiendo todo ello con nuestros resultados por sexos en general. En el caso de la razón AII/AI, existe un aumento en varones respecto a mujeres no significativo (0.42 vs 0.36), que no cabría esperar según Gandhi y cols (1998) que no hallan diferencias por sexo, pero sí según Gallagher y cols (1999) que hallan el mismo tipo de diferencia. Y en las razones A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII, hay una clara diferencia a favor de los varones, que se hace significativa en la A-(1-7)/AII (2.08 vs 1.19, p < 0.05). Coincidiendo con los valores generales por sexos. 5.6.3.cGenotipo CC (Tabla 6.3.9 y Figs 6.1 a 6.6): Considerando el grupo de sujetos con el genotipo CC (n = 5) de la población general, y comparando hombres (n = 2) con mujeres (n = 3), no se pueden realizar comparaciones estadísticas significativas. Se observa un aumento de los valores en mujeres respecto a hombres para AI, A-(1-7), A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII, siendo similares en AII y AII/AI. Así, se puede concluir que, para el polimorfismo A1166C del gen del AT1, se mantienen los valores obtenidos para la población general entre sexos, por lo cual no podemos deducir que la variabilidad funcional del receptor producida por este genotipo afecte a las diferencias entre los dos sexos. 5.7Correlaciones de los péptidos de la angiotensina: Los péptidos de SRA analizados en este estudio se relacionan entre ellos en la forma de substratos y productos y a la vez por la acción de enzimas comunes. Así la AI es substrato tanto de la AII como de la A-( 1-7), la AII es substrato de la A(1-7), y la ECA actúa sobre la AI y sobre la A(1-7) (Chappell y cols, 1998). Esto podría significar que los niveles de los distintos péptidos se relacionan de forma lineal, cuando el número 137 de variables que controlan un determinado paso enzimático no sea excesivo, o bien muy dominante. Otro aspecto, en este sentido, a tener en cuenta y quizás el más importante, será si existe o no regulación de la acción enzimática en los distintos pasos. Así la actividad de la renina está limitada por la concentración del angiotensinógeno y regulada por los niveles de AII, mientras que la actividad de la ECA no está regulada por el propio SRA, sino que sus niveles dependen de factores más generales como poliformismos (Cambien y cols, 1988; Rigat y cols, 1990; Tiret y cols , 1992), u hormonas como los estrógenos (Gallager y cols, 1999; Brosnihan y cols, 1999). Todo esto nos lleva a plantear que las correlaciones lineales de los niveles peptídicos en función de las distintas variables en estudio, sexo y polimorfismos, nos pueden ayudar a entender nuevos aspectos del SRA. Las correlaciones entre los niveles peptídicos en toda la población se muestran significativas entre los valores de AI y AII (R = 0.554), no observándose correlación entre las demás combinaciones peptídicas. Este hecho se puede explicar por las características de la acción de la ECA, que significa una vía enzimática cuya actividad es independiente del SRA, y además de una forma muy predominante respecto a otras enzimas que actúan en el mismo paso (quimasa)(Saris y cols, 2000). Existe una débil correlación de los valores entre la AII y la A(1-7) en la población general, que nos indica cierta especificidad enzimática (prolilendopeptidasa y prolilcarboxipeptidasa) del paso. Sin embargo no se observa ninguna correlación entre AI y A(1-7), quizás por ser un paso muy inespecífico en cuanto a acción enzimática (prolilendopeptidasa, neprilisina, endopeptidasa neutra 24.15)(Ferrario y cols, 1991,1997 y 1998). Las correlaciones entre péptidos del tipo substrato-producto se producirán siempre que la enzima no esté regulada por los mismos péptidos, u otros derivados de los mismos. En el caso de la renina una concentración potencialmente alta de AGT como es el caso de los homocigóticos TT del polimorfismo M235T (Jeunemaitre y cols, 1992), llevaría a una disminución de la actividad de la renina plasmática en el estado basal lo que implicaría paradójicamente menores niveles de AI manteniéndose los niveles de AII, ya que la AI no es limitante respecto a la ECA. Por otro lado, los homocigóticos MM presentan una menor producción de AGT que aportaría, en un estado inicial, un nivel menor de AII que llevaría a un aumento de la actividad de renina (Fernández- 138 Arcas y cols,1999), y por tanto un aumento de AI y un mantenimiento de AII en estado de equilibrio. Como se puede deducir si la la AII se mantiene estable, lo que es el fin básico del sistema, la AI varía en función de la actividad plasmática de la renina, que a su vez se ve influida por los distintos genotipos que afectan a la síntesis de AGT. Los genotipos homocigóticos MM y TT no producen correlación entre la AI y la AII; sin embargo el genotipo heterocigótico MT presenta unos niveles de actividad plasmática de la renina intermedios y la correlación AI con AII es significativa (0.618, p<0.01). Lo contrario ocurre en un paso no regulado como en el caso de los sujetos distribuidos por genotipos ECA. En este caso la ECA siempre tiene AI para pasar a AII y no se encuentra regulada por péptidos del sistema, por lo que la correlación es siempre significativa, aunque se hace más evidente en los genotipos de mayor (DD) y menor (II) actividad enzimática (R = 0.777 y 0.597, respectivamente). El caso del polimorfismo A1166C del receptor AT1 para la AII es semejante al caso del polimorfismo ECA, pues aunque se ha observado que la síntesis de AGT puede estar mediada por el efecto de la AII usando como intermediario el receptor AT1 (Brasier y cols, 1996; Jamaluddin y cols, 2000), hasta ahora no podemos considerar este mecanismo como dominante en la síntesis de AGT, y no se conoce cómo este polimorfismo puede actuar en este caso. Por las correlaciones de los tres genotipos entre AI y AII, que son significativas, excepto en los CC por su escaso número, no parece que este polimorfismo afecte a la regulación del sistema. Las diferencias entre sexos se establecen en mejores correlaciones en los péptidos en mujeres que en hombres; mientras que en estos últimos las distintas correlaciones descienden respecto a la población general, en las mujeres se acentúan con valores de R = 0.647 entre AI y AII, y de 0.441 entre AII y A-(1-7) ambos con p < 0.01. Sin embargo, sigue sin hallarse correlación entre AI y A-(1-7). Estas diferencias pueden deberse al aumento de la actividad de la renina promovida por la testosterona (Wagner y cols, 1990; Danser y cols, 1998) o al aumento de la síntesis de angiotensinógeno al que dan lugar los estrógenos (Pratt y cols, 1998; Brosnihan y cols, 1999). Se puede por tanto decir que los polimorfismos actúan en el SRA manteniendo distintos equilibrios peptídicos y que este equilibrio del SRA es mayor en las mujeres valorado desde las correlaciones de los péptidos estudiados. 139 6CONCLUSIONES: 140 6CONCLUSIONES: Ø No existen diferencias significativas en los niveles de los péptidos de la angiotensina analizados en la población distribuida por genotipos. Ø Los niveles de A-(1-7), al igual que las razones de conversión A-(1-7)/AI y A-(17)/AII, son significativamente mayores en varones que en mujeres en sangre circulante. Los niveles de A-(1-7) fueron de 37.76 pgr/mL en varones y de 26.04 pgr/mL en mujeres, siendo en general mayores que los de AII. Así mismo se observa la tendencia en las mujeres a tener unos mayores niveles de AI. Ø Considerando la población a estudio dividida por sexos y comparando entre genotipos observamos un aumento significativo de A-(1-7) en varones con el alelo T, con respecto al alelo M, del polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno. En el caso de las mujeres hallamos un aumento significativo de AI y AII con el genotipo DD del polimorfismo I/D del gen de la ECA. Ø Considerando la población a estudio dividida por genotipos y comparando entre sexos observamos un aumento significativo tanto de la A-(1-7), como de sus índices A-(1-7)/AI y A-(1-7)/AII, en varones respecto a mujeres mediado por el alelo T del polimorfismo M235T del gen del angiotensinógeno; un aumento significativo de A- (1-7)/AII en hombres respecto a mujeres y de AI en mujeres respecto a hombres, mediados ambos por el alelo D del polimorfismo I/D del gen de la ECA; y por último, un aumento significativo de la razón A-(1-7)/AII en varones respecto a mujeres mediado por el alelo A del polimorfismo del gen del AT1. Ø Los polimorfismos influyen de forma distinta en los valores medios de los péptidos de la angiotensina en hombres y en mujeres, produciendo equilibrios diferentes. Por este motivo deberían ser siempre analizados en relación al sexo. Ø Se propone la determinación de la correlación lineal de los péptidos en orden sustrato-producto como un parámetro estimativo "per se" de la regulación del SRA.