Preparación y caracterización de biomateriales híbridos de hidroxiapatito con fosfonato (2-Hidroxi fosfonoacetato)

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA INFORMÁTICA INGENIERÍA DE LA SALUD PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BIOMATERIALES HÍBRIDOS DE HIDROXIAPATITO CON FOSFONATO (2-HIDROXI FOSFONOACETATO) PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF PHOSPHONATE-HIDROXYAPATITE HIBRID COMPOUNDS FOR USE AS BIOMATERIALS Realizado por Carmen Méndez Ramos Tutorizado por Pascual Olivera Pastor Departamento Química Inorgánica, Cristalografía y Minerología UNIVERSIDAD DE MÁLAGA MÁLAGA, Septiembre de 2015 Fecha defensa: El Secretario del Tribunal Resumen: El hidroxiapatito es el biomineral de los tejidos duros de los mamíferos y por ello ha sido ampliamente estudiado como biomaterial en cementos óseos, recubrimientos de metales implantables y scaffold en ingeniería de tejidos. En este trabajo, se estudia un proceso síntesis y caracterización de un derivado de este material, donde el ion fosfonato: 2hidroxifosfonoacetato sustituye parcialmente al ion fosfato [1-10%]. El proceso de síntesis de hidroxiapatito consiste en dos etapas: (1)una reacción a 100ºC entreel ácido fosfórico (añadido lentamente) y una mezcla de hidróxido de calcio + 2-hidroxifosfonoacetato de calcio (Relación Ca/P=1.67). (2) un tratamiento térmico de los sólidos obtenidos en (1) a 150ºC. Los productos finales se han caracterizado mediante análisis químico, análisis termogravimétrico, difracción de rayos-X con análisis de Rietveld, microscopía SEM y determinación de la superficie específica y porosidad. En las fases cristalinas, el grado de pureza de los hidroxiapatitos oscila entre 91-100%. Todos presentan estructura monoclínica, en contraste con la estructura hexagonal que habitualmente se obtiene aplicando métodos de síntesis similares. Esta variación se atribuye a la presencia de fosfonato. El contenido de éste también influye en la morfología y en la porosidad de los materiales, siendo las muestras con más fosfonato las más porosas. Los materiales, al menos aquellos con una cantidad menor o igual 5% de fosfonato, muestran una biocompatibilidad similar a un material de hidroxiapatito de referencia. Palabras Clave: Hidroxiapatito, Fosfonato, Biomaterial, Biocompatibilidad, Análisis de Rietveld. Abstract: Hydroxyapatite is the biomineral of mammals’ hard tissues and has therefore been extensively studied as a biomaterial in bone cements, coatings of implantables metals and scaffolds in tissue engineering. In this work, a synthesis procedure and characterization of hydroxyapatite derivatives containing 2-hidroxyphosphonoacetate substituting partially for phosphate group [1-10%] are reported. The hydroxyapatite synthesis process consists of two stages: (1) a reaction at 100 ° C between the phosphoric acid (added slowly) and a mixture of calcium hydroxide + 2-hidroxyphosphonoacetate calcium (Ca/P ratio = 1.67). (2) Heat treatment of the solids obtained in (1) at 150ºC. The final products have been characterized by chemical analysis, thermogravimetric analysis, X-ray diffraction with Rietveld analysis, SEM and specific surface and porosity determinations. In the crystalline phases, the purity degree of the hydroxyapatites ranges from 91-100%. All hydroxyapatite structures were monoclinic, in clear contrast to the hexagonal symmetry, which is usually obtained using similar synthetic methods. This behaviour is attributed to the presence of phosphonate. The phosphonate content also influences the morphology and porosity of the materials, the phosphonate higher loading samples being the most porous solids. Materials with equal or lower amount of phosphonate than 5% showed similar biocompatibility to a reference hydroxyapatite material. Keywords: Hydroxyapatite, Phosphonate, Biomaterial, Biocompatibility, Rietveld refinement , Índice 1. Introducción................................................................................................... 1 Introducción histórica......................................................................................... 1 Ortofosfatos de calcio........................................................................................ 1 Hueso................................................................................................................ 3 Dientes .............................................................................................................. 7 Biomateriales de fosfato de calcio................................................................... 10 Hidroxiapatito (HA) denso y poroso................................................................. 11 Injertos óseos .................................................................................................. 13 Implantes óseos............................................................................................... 14 Electroforesis................................................................................................... 15 Relleno facial................................................................................................... 15 Acción farmacológica de los fosfonatos........................................................... 15 2. Motivación y Objetivos................................................................................. 17 2.1 Motivación............................................................................................. 17 2.2 Objetivos............................................................................................... 17 3. Técnicas instrumentales.............................................................................. 19 3.1 Análisis elemental C, N y H (CNH) ....................................................... 19 3.2 Análisis térmico diferencial y termogravimétrico (ATD-TG) .................. 20 3.3 Difracción de rayos X............................................................................ 21 3.4 Análisis de Rietveld............................................................................... 22 3.5 Espectroscopía infrarroja (FTIR)........................................................... 23 3.6 Microscopía electrónica de barrido (SEM)............................................ 23 3.7 Análisis de superficie............................................................................ 24 4. Materiales y Métodos .................................................................................. 25 4.1 Reactivos.............................................................................................. 25 4.1.1 Preparación del reactivo hidroxifosfoacetato de calcio: Ca(HO3PCHOHCOO)·3H2O (CaHPAA)............................................................ 25 4.2 Muestras............................................................................................... 26 4.2.1 Preparación de las muestras.......................................................... 26 4.2.1.1 Síntesis mecanoquímica ............................................................. 26 4.2.1.2 Síntesis por adición lenta de ácido fosfórico ............................... 26 4.2.2 Tratamiento térmico de las muestras ............................................. 27 4.2.3 Preparación de pastillas................................................................. 27 4.2.4 Caracterización de las muestras.................................................... 27 4.2.4.1 Estudio de biocompatibilidad....................................................... 27 5. Resultados y Discusión............................................................................... 29 5.1 Síntesis de los materiales..................................................................... 29 5.2 Análisis químico.................................................................................... 32 5.3 Difracción de Rayos-X.......................................................................... 33 5.4 Morfología y superficie específica......................................................... 37 5.5 Espectroscopía infrarroja...................................................................... 42 5.6 Estudio de biocompatibilidad ................................................................ 43 6. Conclusiones............................................................................................... 45 Futuras líneas de trabajo................................................................................. 45 7. Bibliografía .................................................................................................. 47 Agradecimientos ................................................................................................. 51 TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 1 1. Introducción Dentro de la ingeniería biomédica, el uso de biomateriales cerámicos ha adquirido gran interés para reparación y/o reconstrucción de tejido óseo, aplicado en medicina regenerativa de tejidos. El biomaterial hidroxiapatito (Ca10(PO4)6(OH)2) y sus derivados presentan la ventaja de ser biocompatibles, bioactivos y bioabsorbibles, ya que su composición y estructura química se asemeja a la fase mineral contenida en el esqueleto. Introducción histórica El término apatito (del griego απατείν, apatein: “engañoso”) fue acuñado por el geólogo alemán Abraham Werner en 1788 al describir una serie de fosfatos minerales. A finales del siglo XVIII, los químicos Proust y Klaproth postulan que el apatito es el principal componente inorgánico de los huesos. La fórmula química del fluorapatito natural (Ca10(PO4)6F2, FA) se determinó en 1873. En 1891, Gluck describe el uso del marfil, un fosfato de calcio de origen biológico, para la sustitución de articulaciones (Epinette and Manley, 2004).Posteriormente, De Jong et al,. (1926) presentó, mediante difracción de rayos-X, la primera evidencia de la similitud de la sustancia inorgánica de los huesos con el mineral apatito. Ortofosfatos de calcio Todos los ortofosfatos de calcio están compuestos mayoritariamente por calcio (Ca2+), fosforo y oxígeno (éstos dos en forma de anión ortofosfato, PO43-). Los tres elementos químicos están entre los 20 más abundantes de la superficie terrestre: 47% (oxígeno), 3.3-3.4% (calcio) y 0.8-0.12% (fósforo). Muchos ortofosfatos de calcio contienen otros iones, tales como HPO42- (hidrógenofosfato), H2PO4- (dihidrógenofosfato), OH-(por ejemplo, en Ca10(PO4)6(OH)2) y/o agua incorporada (por ejemplo: CaHPO4·2H2O). Además de ortofosfatos, también existen metafosfatos (PO3-), pirofosfatos (P2O74-) y polifosfatos [(PO3)nn-]. Los ortofosfatos de calcio son escasamente solubles o insolubles en agua a pH neutro o básico, pero son solubles en medio ácido. Los compuestos puros son de color blanco, de mediana dureza, mientras que los minerales naturales presentan color debido a impurezas. Los ortofosfatos de calcio (apatitos) formados biológicamente son los principales componentes de los tejidos calcificados de los vertebrados; mientras que los formados a través de procesos geoquímicos (fluorapatitos presentes en rocas sedimentarias denominadas fosforitas) son la materia prima para la producción de fertilizantes. TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 2 La estructura del hidroxiapatito se representa en la Figura 1.1: Figura 1.1 Estructura 3D del hidroxiapatito donde los iones Ca2+ están coordinados por OHy grupos PO43en dos entornos diferentes de coordinación: Ca1 (CaO9) y Ca2 (CaO7) http://www.chemtube3d.com/solidstate/SShydroxyapatite.htm El hidroxiapatito (HA) es el segundo ortofosfato de calcio más estable y el menos soluble después del fluorapatito. La primera descripción detalla de la estructura del HA se presentó en 1964 (Kay et al., 1964) y su formación en disolución acuosa se interpretó en términos de agregación de clusters con estequiometría Ca9(PO4)6 (Posner and Betts, 1975). En la forma hexagonal, el grupo hidróxilo está orientado en dos direcciones distintas en cada columna mientras que en la forma monoclíclina, obtenida normalmente a T>1000ºC, se orientan en la misma dirección, alternándose en cada columna. Algunas impurezas, como la substitución parcial de hidróxido por fluoruro o cloruro, estabilizan la estructura hexagonal del HA a temperatura ambiente. Por esta razón, el HA hexagonal pocas veces se encuentra en forma estequiométrica. La estructura de apatito admite numerosas sustituciones en las posiciones del Ca2+, del grupo fosfato y del ion OH-, usualmente en cantidades pequeñas, pero pueden ser posibles en el intervalo completo de composición (disoluciones sólidas) entre algunos sustituyentes (por ejemplo, F-y OH-). Además, en algunas estructuras pueden aparecer defectos cristalográficos dando lugar a compuestos no estequimétricos. Excepto pequeñas partes del oído interno, todos los tejidos duros del cuerpo humano, incluso muchas calcificaciones patológicas, están constituidos por ortofosfatos de calcio, fundamentalmente en la forma de hidroxiapatito. Desde el punto de vista estructural, el apatito biológico es de baja cristalinidad, no estequiométrico y parcialmente sustituido con Na+, Mg2+ y carbonato (CO32-), con cierto parecido al mineral natural dahllita. TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 3 Hueso Los huesos humanos están compuestos por una fase mineral, hidroxiapatito, una fase orgánica, formada mayormente por colágeno tipo I y otros componentes minoritarios, y, finalmente, agua. Las proporciones relativas de estas fases varían con la edad, el sitio, el género y estado de salud (Boskey, 2015). La composición media de la masa total de un hueso de adulto es aproximadamente: 65% de hidroxiapatito, 25% de agua y 10% de matriz orgánica. (https://depts.washington.edu/bonebio/ASBMRed/structure.html).Como se refleja en la Tabla 1.1 el calcio y el fósforo son elementos mayoritarios del hueso, lo que es previsible al ser los elementos principales del hidroxiapatito. El hueso, como la dentina de los dientes, tiene capacidad de auto-reparación a través de la intervención de sus células asociadas, que se clasifican en dos categorías según su función: osteoclastos que disuelven el hueso (resorción) y la familia de osteoblastos (osteoblastos, osteocitos y células de revestimiento), las cuales favorecen la formación y el mantenimiento óseo. COMPOSICIÓN DEL HUESO DE LOS ADULTOS CALCIO FÓSFORO SODIO 34.8 15.2 0.9 MAGNESIO 0.72 POTASIO 0.03 CARBONATOS 7.4 FLUOR 0.03 CLORO 0.13 PIROFOSFATOS OTROS ELEMENTOS 0.07 0.04 Tabla 1.1 Además de la fase mineral, colágeno y agua, otras sustancias orgánicas minoritarias, como proteínas, polisacáridos y lípidos están presentes en la materia ósea. El colágeno del tejido óseo forma fibrillas de 100 - 2000mm de diámetro. El componente mineral del hueso es parecido al hidroxiapatito pero contiene además fluor, magnesio, sodio y otros iones como impurezas. (Orlovskii et al., 2002) El tejido óseo es un tejido conectivo especializado que se caracteriza por su permeabilidad y vascularización además de una arquitectura compuesta por una parte externa compacta (cortical) y una parte interna esponjosa (trabecular). La estratificación células y las distintas capas del hueso se reflejan en la Figura 1.2: TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 10 Biomateriales de fosfato de calcio Los fosfatos de calcio forman un conjunto de diferentes fases, la mayoría de las cuales han sido estudiadas como biomateriales (Tabla 1.2): Fórmula, Abreviatura Nombre Relación molar Ca/P Existencia en tejidos biológicos Ca10(PO4)6(OH)2, HA Hidroxiapatito 1.67 Hueso, dentina, esmalte, Cálculos dentales y urinarios, placas arterioescl Ca10-xHx(PO4)6(OH)2-x , CDHA Hidroxiapatito deficiente en calcio 1.5 No encontrado Ca8H2(PO4)6·5H2O, OCP Fosfato octacálcico 1.33 Cálculos dentales y urinarios Ca3(PO4)2,-TCP -Fosfato tricálcico 1.5 Cálculos dentales y urinarios, Calcificaciones en tejidos blandos Ca3(PO4)2,-TCP -Fosfato tricálcico 1.5 No encontrado Cax(PO4)y·nH2O, ACP Fosfato de calcio amorfo 1.2-2.2 Calcificaciones en tejidos blandos CaHPO4·2H2O, DCPD Fosfato dicálcico dihidrato 1.0 Cálculos dentales y urinarios CaHPO4, DCPA Fosfato dicálcico anhidro 1.0 No encontrado Tabla 1.2 Distintos tipos de fosfatos de calcio y su relación con tejidos biológicos El desarrollo de materiales avanzados para aplicaciones biomédicas constituye uno de los ejes fundamentales de la ingeniería de materiales. El mayor potencial para la reparación y diseño de sustitutos óseos proviene de los materiales derivados de hidroxiapatito (Aoki, 1991), los cuales, por sus características intrínsecas, pueden desarrollar fuertes interacciones con el tejido óseo, tienen un destacado comportamiento osteoconductivo, resisten la bioresorción y no muestran efectos adversos sobre el organismo humano. El comportamiento biológico de las cerámicas de hidroxiapatito depende de muchos factores, en particular de su historia química, microestructura y porosidad (Orlovskii et al., 2002). En la Tabla 1.3, mostrada a continuación, se comparan las propiedades mecánicas de hidroxiapatito con las del hueso cortical humano: TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 11 PROPIEDAD HUESO CORTICAL HUMANO HIDROXIAPATITO DENSIDAD (G/CM3) 1.5-2.0 3.16 MÓDULO DE YOUNG (GPA) 7-30 70-120 DUREZA (KNOOP) 130-170 2000-3500 RESISTENCIA A LA TENSIÓN (MPA) 50-150 40-100 RESISTENCIA A LA COMPRESIÓN (MPA) 100-230 100-900 RESISTENCIA A LOS FRACTURA (MPA M0.5) 2-12 0.8-1.2 Tabla 1.3 Comparación de las propiedades mecánicas del hueso cortical humano y el hidroxiapatito (Helch and Wilson, 1999) La naturaleza quebradiza del hidroxiapatito lo hace inadecuado para aplicaciones ortopédicas en las que se deban soportar grandes cargas. Sin embargo, para recubrimientos de implantes metálicos con fosfatos de calcio es posible combinar la resistencia mecánica del metal con la compatibilidad biológica del mineral. Los estudios clínicos han confirmado la eficacia de los implantes ortopédicos recubiertos con hidroxiapatito (Best, 2012) Hidroxiapatito (HA) denso y poroso Se han utilizado diversas técnicas de recubrimientos de metales con hidroxiapatito dependiendo de la microestructura deseada y propiedades del material. En implantes que deben resistir cargas mecánicas, la estrategia es usar cerámicas densas, con mejor resistencia que las cerámicas porosas. En este caso, las cerámicas contienen partículas de tamaño pequeño que, de acuerdo con la ecuación de Hall-Petch [1], da lugar a una mayor resistencia mecánica comparado con de materiales de tamaño de grano más grande donde 0y b son constantes y d es el tamaño de grano. Las características fundamentales de las cerámicas densas son la resistencia a la flexión, a la tensión y a la fractura. Los valores de la resistencia a la flexión, a la compresión y a la tensión se encuentran dentro de los intervalos 38-250, 120-150 y 38-300MPa respectivamente. La gran dispersión se debe a la distribución aleatoria de la carga y los efectos de la microporosidad residual, el tamaño del grano, las impurezas, etc. (Orlovskii et al., 2002) El módulo de Weibull del hidroxiapatito denso oscila entre 5-18, característico de los materiales frágiles. El coeficiente de propagación de grietas se encuentra entre 26 y 80 en atmosferas secas y entre 12 y 49 en atmosferas húmedas indicando una gran sensibilidad de la propagación de grietas. (Orlovskii et al., 2002). El módulo de Young  =0+ bd-1/2 [1] TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 12 del hidroxipatito denso varía entre 35 a 120GPa, dependiendo de la porosidad residual y de las impurezas. El módulo de Young de la flexión se encuentra entre 44 y 88GPa. La resistencia al desgaste y el coeficiente de fricción es comparable con los del esmalte. Entre las aplicaciones más importantes de HA denso se encuentran los dispositivos hipodérmicos para diálisis intestinal ambulante a largo plazo, la medida de la presión arterial y el azúcar en sangre y los exámenes ópticos de los tejidos internos. Las cerámicas densas de HA muestran una excelente biocompatibilidad con la piel, muy superior al de silicona caucho, material ampliamente utilizado para estos fines. (Hench, 1991) El hidroxiapatito poroso es más atractivo que el hidroxiapatito denso para ciertas aplicaciones, como por ejemplo para el recubrimiento de superficies articulares o para dispositivos de liberación de medicamentos. Para asegurar el suministro de sangre y el crecimiento hacia el interior y la fijación del hueso, el diámetro de poros interconectados debe ser al menos 100-135 mm. También son necesarios los poros más pequeños, que favorecen la adsorción de proteínas y adhesión de las células osteogénicas. Por lo tanto, la distribución de tamaño de poro en cerámicas porosas debe ser bimodal. (Wojciech Suchanek, 1997) Figura 1.8 Resistencia a la tensión en función de la porosidad en los hidroxiapatitos. Adaptación de (Wojciech Suchanek, 1997) PROPIEDADES MECÁNICAS DE LOS TEJIDOS DUROS Tejido Resistencia a la compresión, MPa Resistencia a la tensión, MPa Módulo de elasticidad, GPa Tejido cortical 88-164 89-114 3.9-11.7 Dentina 295 52 18.2 Esmalte 384 10 82.4 Tabla 1.4 El hidroxiapatito densa tiene una resistencia a la flexión, a la compresión y a la tensión de 38-250, 120-150 y 38-300MPa respectivamente, que coinciden significativamente con las propiedades mecánicas del tejido cortical, aunque no así con las de la dentina y el esmalte. En cambio su módulo de Young es similar al del esmalte, así como su resistencia al desgaste y su coeficiente de fricción. (Orlovskii et al., 2002) TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 13 Considerando que la resistencia a la compresión de la cerámica porosa es suficientemente alta (2-100 MPa), su resistencia a la flexión (2-11 MPa) es menor que el nivel necesario en un factor de 2-3. Con el aumento de la porosidad, la fuerza de la cerámica disminuye bruscamente (Figura 1.8). Los efectos de la porosidad P en la resistencia a la compresión σ y en el Módulo de Young E del HA cerámico producida por sinterización a 1.100 ° C se estudiaron en (Metsger et al., 1999). Tanto σ como E decrecieron a medida que aumenta la porosidad. Injertos óseos El injerto óseo es un procedimiento quirúrgico en el que se reemplaza una parte del hueso para de reparar fracturas o lesiones complejas, que suponen un riesgo para la salud del paciente o por falta de curación apropiada. El hueso tiene la capacidad de regenerarse pero, para ello, necesita una estructura soporte. Los injertos pueden ser autógenos o autoinjertos, (del propio paciente), aloinjertos (de un banco de huesos) y sintéticos (hidroxiapatito u otros materiales biocompatibles) con propiedades mecánicas similares a las del hueso (Laurencin et al., 2006). En la mayoría de los casos, los injertos se reabsorben a medida que el hueso va regenerándose. Para que el injerto cumpla su propósito debe reunir una serie de características: osteoconducción (capacidad de guiar el crecimiento del hueso en reparación), osteoinducción (favorecer la diferenciación celular para generar nuevos osteoblastos) yosteogénesis (contribución de las células vivas del injerto a la remodelación del hueso). Esta última solo se da en autoinjertos y aloinjertos. Recientemente se han desarrollado composites flexibles de hidrogeles con hidroxiapatito, con una composición mineral/matriz orgánica parecida a la del hueso humano. Además, se puede fabricar hueso artificial a partir de cerámicas, tales como fosfato de calcio (HA y fosfato tricálcico), bioglass y sulfato cálcico, que son biológicamente activas dependiendo de su solubilidad en el ambiente fisiológico. Estos materiales se combinan con factores de crecimiento, con iones como Sr2+, que aumentan la densidad de masa ósea y la proliferación de osteoblastos, o se mezclan con médula ósea para incrementar la actividad biológica (Kumar et al., 2013). Desde la década de los 80, diversos materiales cerámicos de HA han sido utilizados en cirugía ortopédica, dental o craneofacial (Matsumine et al., 2004). El HA poroso con una resistencia adecuada se ha estado investigando como un sustituto óseo ideal mucho tiempo (Simon et al., 2008) y(Yoshikawa et al., 2009). Recientemente se ha desarrollado una cerámica con porosidad interconectada adecuada para la ingeniería de tejido óseo, debido a que facilita la introducción de células mesenquimales, agentes osteotrópicos y la vascularización en los poros (Yoshikawa et al., 2009) TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 14 Implantes óseos A la hora de elegir un material para implantes óseos se debe tener en cuenta las condiciones biológicas a las que va a estar sometido, las propiedades del mismo, la respuesta que se espera del material y, por supuesto, su coste. También se debe tener en cuenta que no produzca una respuesta inmune o rechazo, ya que el sistema inmune actúa sobre todo material externo que no sea biocompatible. La carcinogénesis en células colindantes al implante también debe ser considerada. Los materiales no sólo han de tener un mínimo impacto negativo en el cuerpo sino también que sean, a ser posible, bioactivos y ayuden al crecimiento y reparación de los tejidos. Las idoneidad de las propiedades de los materiales dependen mucho del tipo de implante, ya que, por ejemplo, las propiedades mecánicas de una prótesis de rodilla son muy diferentes a las de cadera o codo. Por último, el coste es un factor clave a la hora de elegir los materiales a utilizar, ya que un precio muy elevado, aunque posea unas propiedades sobresalientes, hace inviable la comercialización del implante. Para fijar las prótesis tradicionalmente se ha utilizado como cemento óseo un polímero, el polimetimetacrilato (PMMA), que permite distribuir la carga de manera más uniforme entre el hueso y el implante a la vez que fija este en su lugar. Sin embargo este material presenta algunos efectos secundarios notables. Por ejemplo, durante su endurecimiento (entrecruzamiento de las cadenas del polímero) se libera una gran cantidad de calor que puede causar necrosis en el hueso y alargar el periodo de recuperación. Otra alternativa a la fijación con PMMA es recubrir la superficie del implante con una capa de material poroso, lo que fomenta la interacción con el tejido al permitir que el hueso crezca en los poros. Por tanto, favorece la osteointegración del implante, definido como “una conexión directa, estructural y funcional entre el hueso vivo, ordenado, y la superficie de un implante sometido a carga funcional”. (http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/bones/structure.php) La función del hidroxiapatito (Faig-Martí and Gil-Mur, 2008) en las prótesis articulares consiste en acelerar el proceso de formación ósea. La capa de biomaterial de hidroxiapatito acelera la señalización celular y la adsorción de proteínas de la matriz extracelular, para después producirse la adhesión, proliferación y diferenciación de osteoblastos alrededor del material. En este tipo de prótesis recubiertas de HA se utiliza el metal, debido a la resistencia mecánica y tenacidad de éste (acero inoxidable, aleaciones de titanio o aleaciones de cromo-cobalto) con función específicamente estructural, y la capa bioactiva, cuya misión es hacer más rápida la fijación biológica de la prótesis. El revestimiento se realiza a una temperatura elevada, pero tiene el inconveniente de que HA se enfría a distinta velocidad que el implante metálico, debido al mayor coeficiente de expansión térmica del primero con respecto a la mayoría de los materiales metálicos utilizados. Esto puede generar tensiones térmicas y causar agrietamiento de la superficie del implante, por ello se está estudiando nuevas TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 15 aleaciones metálicas, como las aleaciones con manganeso, para que los coeficientes de expansión térmica sean más coincidentes. Electroforesis EL hidroxiapatito tiene muchas más aplicaciones además de las ya mencionadas, en particular es muy útil para la purificación y el fraccionamiento cromatográfico del ADN. La doble hélice de ADN se une al hidroxiapatito con mayor fuerza que otras moléculas. Por tanto, puede aislarse fácilmente ADN a partir de una suspensión de material celular, haciéndolo pasar a través de una columna de hidroxiapatito. A continuación, se lava dicha columna con una disolución amortiguadora de pH de baja concentración en fosfato, para eliminar solo RNA y proteínas. Finalmente, el ADN se puede eluir con una solución más concentrada de fosfato. Además, el ADN de cadena simple se eluye del hidroxiapatito a una concentración menor de fosfatos que el ADN de doble hélice (Voet and Voet, 2006). Relleno facial EL hidroxiapatito también se utiliza como relleno facial semipermanente (Aced Jiménez et al., 2013). Para este tipo de aplicaciones el hidroxiapatito se presenta en gránulos de 25-45μm en un gel formado en una mezcla de agua, glicerina y carboximetilcelulosa. A pesar de las propiedades presentadas en los tejidos óseos no se describen calcificaciones ni osteogénesis en el área de inyección. Este tratamiento es efectivo en surcos y depresiones profundas como mejillas o mentón. En un primer momento el hidroxiapatito desempeña una función de relleno (0-3 meses), después, de manera indirecta, el aumento de volumen se produce debido a la formación de colágeno por parte de los fibroblastos. El hidroxiapatito puede perdurar 18-24 meses antes de ser reabsorbido. Acción farmacológica de los fosfonatos Químicamente, los fosfonatos y los ácidos fosfónicos son compuestos organofosforados que contienen grupos [C-PO(OH)2] o [C-PO(OR)2]. Estas sustancias son poco solubles en disolventes orgánicos pero suelen ser bastante solubles en agua. Algunos bisfosfonatos sintéticos (con uniones químicas P-C-P) se han empleado desde hace tiempo como fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades de los huesos, entre otras la enfermedad de Paget, hipercalcemia maligna y osteoporosis (Rodan and Fleisch, 1996). Estas sustancias ejercen un control en la formación y disolución de fosfatos de calcio in vitro, así como en la mineralización y resorción del hueso in vivo. Se unen fuertemente al mineral del hueso, hidroxiapatito, además el grupo P-C-P es resistente a la hidrólisis enzimática lo que explica por qué los bisfosfonatos se excretan sin alteración bioquímica. La acción farmacológica clave de los bisfosfonatos es la inhibición de la resorción del hueso. El mecanismo de esta acción todavía no sido dilucidado y puede variar de un fosfonato a otro. TFGCarmen Méndez Ramos Introducción 16 En el presente trabajo se ensaya una variante de la síntesis de hidroxiapatito convencional (Ca10(PO4)6(OH)2), incorporando cantidades variables de P como 2hidroxifosfonoacetato (Ca2H5O6P) (Figura 1.9) en distintas proporciones (1-10% molar), con respecto al P total, manteniendo las proporciones estequiméticas Ca/P del hidroxiapatito, es decir Ca/P = 10/6. El objetivo principal es estudiar la influencia de este fosfonato en las propiedades del hidroxiapatito, su compatibilidad química y su viabilidad en el uso médico. Esta sustancia no ha demostrado ningún efecto nocivo al medio ambiente, es muy barata y los productos de degradación química carecen de toxicidad (Bazaga-Garcia et al., 2012). Figura 1.9 Ácido 2-hidroxifosfoacético (HPAA) y diferentes ligandos fosfonatos derivados del ácido (A, B y C) TFGCarmen Méndez Ramos Motivación y Objetivos 17 2. Motivación y Objetivos 2.1Motivación Este trabajo es una introducción a la investigación en Ciencia de Biomateriales dentro del campo de la Ingeniería de la Salud. La importancia actual del hidroxiapatito ha quedado sobradamente demostrada por sus numerosas aplicaciones en biomedicina y sus propiedades farmacológicas. Aquí se estudia el efecto de la adición de un fosfonato (2-hidroxifosfoacetato) [1-10%] en las propiedades fisicoquímicas del hidroxiapatito y su biocompatibilidad de cara a evaluar sus posibles aplicaciones como biomaterial. 2.2Objetivos 1. Preparar materiales derivados de hidroxiapatito para uso médico. 2. Determinar el papel estructural del fosfonato en la red de hidroxiapatito. 3. Estudiar la influencia del fosfonato: 2-hidroxifosfoacetato en las propiedades de hidroxiapatito y su compatibilidad química. 4. Estudiar la viabilidad de los materiales híbridos obtenidos TFGCarmen Méndez Ramos Motivación y Objetivos 18 TFG - Carmen Méndez Ramos Técnicas instrumentales 19 3. Técnicas instrumentales 3.1Análisis elemental C, N y H (CNH) El análisis elemental es una técnica que proporciona la cantidad relativa de carbono, hidrógeno, nitrógeno y azufre presente en un amplio rango de muestras de naturaleza orgánica e inorgánica tanto sólidas como líquidas. La técnica está basada en la completa e instantánea oxidación de la muestra mediante una combustión con oxígeno puro a una temperatura aproximada de 1000ºC. Los diferentes productos de combustión CO2, H2O y N2, son transportados mediante diferentes técnicas (columna cromatográfica, infrarrojos) y son medidos teniendo en cuenta el peso de la muestra y los datos obtenidos por la muestra patrón. Equipo experimental: Se han realizado los análisis elementales de CNH en un analizador Perkin-Elmer 240 (Figura 3.1) situado en los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la UMA: Para producir la combustión total de los compuestos, las muestras fueron calcinadas por encima de los 1000ºC en una atmósfera rica en oxígeno. Figura 3.1 Analizador Perkin Elmer 240 TFG - Carmen Méndez Ramos Materiales y Métodos 26 4.2Muestras 4.2.1 Preparación de las muestras En la síntesis de los materiales de apatito se ha empleado distintos porcentajes de fosfonato (Tabla 4.1) en relación con el fósforo total de las muestras, para comprobar el efecto del fosfonato en las propiedades de los productos resultantes. Muestra (Fosfonato/P total) x100 AP-1% 1 AP-3% 3 AP-5% 5 AP-7% 7 AP-10% 10 Tabla 4.1 Proporciones de fosfonato/fósforo total en las distintas muestras 4.2.1.1Síntesis mecanoquímica Los reactivos se mezclaron en un molino planetario Fritsch Pulverisette 7 (Figura 4.1) aplicando ciclos de molienda de 30 min durante 24 h, con periodos de reposo de 2 min., manteniendo la proporcionalidad estequiométrica dada en la ecuación [3]. La molienda se realizó en reactores cerámicos con bolas de circona (ZrO2). 4.2.1.2 Síntesis por adición lenta de ácido fosfórico Valoración lenta (gota a gota) de una mezcla de Ca(OH)2y CaHPAA con H3PO4(85%) a 90-100ºC, en proporciones estequiométricas [4]. Una vez finalizada la reacción, los sólidos se separaron por centrifugación a 8000 rpm. A continuación se lavaron con agua destilada hasta pH neutro del agua de lavado y se secaron en estufa a 60ºC. + + · 3 → , = 0.06 − 0.6 . [3] Figura 4.1 Molino planetario Fritshc Pulverisette 7 TFG - Carmen Méndez Ramos Materiales y Métodos 27 + + · 3 + → · = 0.06 − 0.6 . [4] 4.2.2 Tratamiento térmico de las muestras Las muestras sintetizadas por adición lenta de ácido fosfórico fueron sometidas a dos tratamientos térmicos: -Secado a 60ºC: Se lleva a cabo en una estufa durante aproximadamente 24 horas tras la centrifugación y el lavado de las muestras. Muestras AP-1%-60 a AP-10%-60. -Tratamiento térmico a 150ºC: Este tratamiento se realiza en horno durante 24h para eliminar el exceso agua de las muestras existente tras el secado a 60ºC. Este tratamiento no produce degradación de fosfonato presente en las muestras. Muestras AP-1%-150 aAP-10%-150. -Tratamiento térmico a 900ºC: Se realiza la calcinación a esta temperatura por 1 hora para eliminar todos los componentes volátiles y la materia orgánica y poder estudiar así su efecto. Muestras AP-1%-900 aAP-10%-900. 4.2.3 Preparación de pastillas Para la realización del estudio de biocompatibilidad, así como obtener imágenes SEM, se preparan las muestras en forma de pastillas, para una mayor comodidad en su manipulación. Para el estudio de biocompatibilidad se preparan tres pastillas de cada muestra tratada a 150 grados, teniendo un total de 15 pastillas de 5mm de diámetro y con unos pesos comprendidos entre 0.0988 y 0.0706g. Se aplica una fuerza de 2 Pa en repetidas ocasiones para asegurar la compactación de las pastillas. Para el análisis de microscopía SEM se prepararon de pastillas de las muestras tratadas a 150ºC y de las muestras AP-10%-60 yAP-10%-900 de igual tamaño y peso. 4.2.4 Caracterización de las muestras 4.2.4.1Estudio de biocompatibilidad El estudio de biocompatibilidad se lleva a cabo con lo sólidos AP-X%-150. En la primera parte del proceso se preparan y esterilizan las muestras. Para la esterilización son tratados nuevamente a 150ºC. Las muestras en forma de pastillas estériles (se ponen en presencia de células mesenquimales de rata durante 3 días a 37ºC con una humedad del 90% y un 5% de CO2. Utilizamos 80000 células por cada muestra, incluyendo la muestra control de HA, en 3 ml de medio formado por 10% de suero, 1% de penicilina y esterotomicina, 0.5% de fungizona, 1.25% de glutamina y 87.25% de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium). Todo este proceso se realizó en el departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología bajo la supervisión de J. A. Andrades Gomez y de S. Claros Gil. TFG - Carmen Méndez Ramos Materiales y Métodos 28 TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 29 5. Resultados y Discusión 5.1Síntesis de los materiales Es bien conocido que, desde un punto de vista estructural y químico, el hidroxiapatito es el material más similar al componente mineral de huesos y dientes. Por lo cual, el desarrollo de nuevas técnicas preparativas y la introducción de innovaciones en sus propiedades, con vistas a su aplicación en el campo de la biomedicina, son objetivos prioritarios. Por esta razón, se intentó, en primer lugar, obtener hidroxiapatito por síntesis mecano-química. Este procedimiento es atractivo porque evita el uso de disolventes y temperaturas de síntesis elevadas. El procedimiento se basa en una reacción de estado sólido, mediante molienda en molino de bolas, de una mezcla de los reactivos: Ca(OH)2(hidróxido de calcio), CaHPAA (2-hidroxifosfonoacetato de calcio) y CaHPO4·2H2O (hidrogenofosfato de calcio dihidrato). Después de 24 h de molienda, los reactivos seguían prácticamente intactos, sin apenas aparición del producto deseado. Por consiguiente, se modificaron las condiciones de síntesis con el objeto de obtener el producto de hidroxiapatito con un alto rendimiento. Para ello, se aplicó una variante del método recomendado por Mcdowell et al., (1977). El método utilizado en este trabajo para la síntesis de los materiales de hidroxiapatito, conteniendo cantidades variables de fosfonato (1, 3, 5, 7 y 10%, en moles respecto del fósforo total), consiste básicamente en gotear lentamente desde una bureta una disolución diluida de H3PO4sobre una suspensión acuosa que contiene una mezcla de Ca(OH)2y CaHPAA, mientras se agita vigorosamente. La relación molar final Ca/P fue la estequiométrica, es decir Ca/P = 10/6 = 1,67. Para obtener un alto rendimiento de hidroxiapatito, la temperatura durante la reacción se mantuvo muy próxima a 100ºC (Boanini et al., 2010). Después de la reacción, los sólidos se separaron por centrifugación y se lavaron 3 veces con agua destilada. A continuación se secaron en estufa a 60ºC. Una vez secos, los sólidos se sometieron a diferentes análisis de rutina con el fin de determinar su grado de pureza y su contenido de agua. En la Figura (5.1) aparece el difractograma de una muestra representativa de los productos obtenidos en estas condiciones. Los resultados indican que el producto es una mezcla de dos fases cristalinas: hidroxiapatito y brusita (Ca(HPO4)·2H2O). Este último es un fosfato de calcio de naturaleza ácida, que se forma cuando el pH de la reacción no se mantiene suficientemente alto. No se estableció ningún control de pH con el objeto de no añadir iones extraños al medio de reacción. Consecuentemente, no es de extrañar esta mezcla de fases. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 30 Figura 5.1 Difractograma de la muestra AP-10%-60 en el que se observan las líneas de difracción características tanto de apatito como de brusita Con el objeto de incrementar aún más el rendimiento en hidroxiapatito, se decidió someter los sólidos a un tratamiento térmico a 150ºC. Así, el mineral brusita, por su naturaleza reactiva, reacciona con la fracción amorfa que contiene el material y aumenta a su expensa la fase de hidroxiapatito. Esta temperatura se considera adecuada puesto que además se elimina agua, disminuye la fracción amorfa y es suficientemente baja para no degradar el ligando de fosfonato presente en el producto. Los materiales tratados a 150ºC son denominados a partir de aquí con el acrónimo AP-X%-150 para distinguirlos de los recién sintetizados que se mencionarán como: AP-X%-60, donde X representa el porcentaje molar de fosfonato (con relación al fósforo total) y el segundo número indica la temperatura a la que se trataron los sólidos preparados. En las Figuras 5.2 y 5.3 se muestran las curvas de análisis termogravimétrico (TG) de los materiales AP-1%-60 yAP-10%-60 obtenidos. A partir de este análisis se observa un diferente grado de hidratación de las muestras, que depende no solo de la composición de las mismas, sino también de su exposición a las condiciones ambientales. Por tanto, las muestras de referencia en las que nos centraremos a partir de ahora serán las denominadas AP-X%-150, las cuales tienen una composición constante, menos agua y son más puras en hidroxiapatito. . TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 31 Figura 5.2 Curva TG correspondiente al material AP-1%-60 mostrando un 7,43 % de pérdida de masa a 1000ºC. . Figura 5.3 Curva TG correspondiente al material AP-10%-60 mostrando un 15,5 % de pérdida de masa a 1000ºC. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 32 5.2Análisis químico En la Tabla 5.1 se recogen los datos de análisis químicos para los materiales sintetizados y en la Tabla 5.2 se presentan las fórmulas empíricas correspondientes. Muestra % C Exp. Teórico %H Exp. Teórico AP-1%-60 0,316 0,32 0,631 0,61 AP-3%-60 0,570 0,57 0,843 0,82 AP-5%-60 * 0,538 – 4,451 – AP-7%-60 0,712 0,71 1,654 1,65 AP-10%-60 1,262 1,29 1,116 1,2 Tabla 5.1 Porcentajes de carbono e hidrógeno experimental y calculado para las muestras sintetizadas 60ºC Muestra Fórmula AP-1%-60 Ca9,90 (HPO4)0,03 (PO4)5,78[HO3P-CH(OH)-CO2]0,09(CO3)0,1(OH)2·2H2O AP-3%-60 Ca9,85 (HPO4)0,1 (PO4)5,6[HO3P-CH(OH)-CO2]0,2(CO3)0,1(OH)2·3H2O AP-5%-60 * ----------------------------------------- AP-7%-60 Ca9,81 (PO4)5,66[HO3P-CH(OH)-CO2]0,34 (OH)2·8H2O AP-10%-60 Ca9,7 (PO4)5,4[HO3P-CH(OH)-CO2]0,6 (OH)2·5H2O Tabla 5.2 Fórmulas empíricas derivadas de las muestras sintetizadas *No calculada por exceso de hidratación de la muestra A partir de los datos de análisis químico se puede afirmar que los materiales sintetizados y secos en estufa a 60ºC son todavía de naturaleza química compleja, destacando su no estequiometría con relación a la fórmula del hidroxiapatito de referencia, Ca10(PO4)6(OH)2. Además de ser ligeramente deficientes en calcio, en general contienen gran cantidad de agua y en algunos casos la fórmula requiere la presencia de pequeñas cantidades de hidrogenofosfato y carbonato para mantener la electroneutralidad del compuesto. La presencia de carbonato en hidroxiapatito es bastante frecuente en preparaciones de laboratorio (Markovic et al., 2004). Esta complejidad no es rara en estos materiales, ya que la composición, las propiedades fisicoquímicas, tamaño de cristal y la morfología de los apatitos sintéticos son extremadamente sensibles a las condiciones de preparación (Markovic et al., 2004). Por esta razón y con el objeto de obtener materiales más puros, las muestras secas a 60ºC se sometieron a un tratamiento térmico a 150 ºC durante 24 h. El resultado de este tratamiento se muestra en la siguiente sección, donde se analizan las muestras por difracción de rayos-X. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 33 5.3Difracción de Rayos-X Los diagramas de difracción de rayos-X se muestran en las Figuras 5.4-5.8. Asimismo los datos estructurales obtenidos por afinamiento de Rietveld aparecen en la Tabla 5.3. Figura 5.4 Difractogramas de rayos-X experimental (―), calculado (―) y curva diferencia (― abajo) obtenidos por afinamiento de Rietveld para la muestra AP-1%-150. Los principales picos de la fase cristalina minoritaria (monetita) aparecen marcados en verde. Figura 5.5 Difractogramas de rayos-X experimental (―), calculado (―) y curva diferencia (― abajo) obtenidos por afinamiento de Rietveld para la muestra AP-3%-150. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 34 Figura 5.6 Difractogramas de rayos-X experimental (―), calculado (―) y curva diferencia (― abajo) obtenidos por afinamiento de Rietveld para la muestra AP-5%-150. Figura 5.7 Difractogramas de rayos-X experimental (―), calculado (―) y curva diferencia (― abajo) obtenidos por afinamiento de Rietveld para la muestra AP-7%-150. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 35 Figura 5.8 Difractogramas de rayos-X experimental (―), calculado (―) y curva diferencia (― abajo) obtenidos por afinamiento de Rietveld para la muestra AP-10%-150. Los principales picos de la fase cristalina minoritaria (brusita) aparecen marcados en gris. Datos cristalográficos de hidroxiapatito Muestras AP-X%-150 X=1 X=3 X=5 X=7 X=10 Grupo espacial P 1 21/c 1 P 1 21/c 1 P 1 21/c 1 P 1 21/c 1 P 1 21/c 1 a/ Å 9.392 9.388 9.384 9.386 9.389 b/ Å 6.8904 6.8911 6.8927 6.8937 6.8893 c/ Å 18.829 18.834 18.819 18.825 18.827 alpha/ ° 90 90 90 90 90 beta/ ° 119.81 119.78 119.72 119.71 119.73 gamma/ ° 90 90 92 90 90 V/ 106pm3 1057.38300 1027.47200 1057.06200 1057.97600 1057.46300 Rwp / % * 9.01868 8.92760 9.81971 8.71351 8.51310 Tabla 5.3 Datos cristalográficos seleccionados para la fase de hidroxiapatito en los diversos materiales obtenidos *Rwp: Índice de acuerdo (weighted profile). El afinamiento es correcto si Rwp<10% Los datos de difracción de rayos-X revelan que todos los materiales son altamente cristalinos con una pequeña fracción amorfa, detectada por las ondulaciones y la intensidad de la señal de fondo en los difractogramas. Entre las fases cristalinas, la de hidroxiapatito es, con gran diferencia, la mayoritaria. Sólo los materiales AP-1%- 150 yAP-10%-150 contiene una fase cristalina adicional en muy pequeña proporción. El primero contiene monetita (CaHPO4) en un 8,7% y el segundo brusita (CaHPO4·2H2O) en un 2,9%. Mientras que los materiales de composición intermedia solo contienen hidroxiapatito como fase cristalina. Las fases cristalinas minoritarias, TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 42 5.5Espectroscopía infrarroja El espectro FTIR de un material representativo de la serie de compuestos sintetizados se muestra en la Figura 5.18. En la región de vibración de tensión (36003000 cm-1) aparece una banda ancha sin picos definidos sobre 3400 cm-1, que es debida a la vibración de tensión, (H–OH) de la molécula de agua. Una vibración de tensión supone un cambio en la distancia interátomica a lo largo del eje del enlace entre dos átomos. Las bandas que aparecen a 2500-2200 cm-1 son características de grupos hidrogenofosfonatos, tensiónPOH o (POH), (Ma et al., 2013) lo cual indica que el ligando fosfonato no se encuentra totalmente desprotonado. En esa región se encuentran también los sobretonos y combinaciones de los modos ydel grupo PO4(Markovic et al., 2004). La débil banda sobre 1620 cm-1 se debe a la vibración de flexión (deformación) de la molécula de agua, (H–OH). Las vibraciones de flexión se caracterizan por un cambio en el ángulo entre dos enlaces. Como esta banda es ancha puede contener también señales características del grupo C=O del carboxilato del fosfonato, que generalmente se encuentran en la región 1730-1470 cm-1; mientras que las correspondientes al grupo C-O,  C-O aparecen a más baja frecuencia (Ayi et al., 2014). No obstante, las señales son tan débiles que resulta difícil su identificación en el espectro. Ello es debido a que el ligando fosfonato se encuentra bastante diluido en el material y, además, la masa de la muestra (impuestas por las condiciones experimentales de trabajo del aparato) sujeta al haz IR era muy pequeña. Las vibraciones de tensión del grupo P=O junto con las del grupo –P-O (1200-900 cm1) tanto del ligando fosfato (PO4) como del fosfonato (C-PO3) aparecen superpuestas en una banda intensa asimétrica centrada aproximadamente a 1000 cm-1. En resumen, el espectro FTIR de los materiales contiene bandas características de fosfato y fosfonato y, por tanto, los materiales se pueden considerar globalmente como fosfatos-fosfonatos de calcio. Figura 5.17 Espectro infrarrojo para la muestra AP-10%-60 TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 43 5.6Estudio de biocompatibilidad El estudio de biocompatibilidad se muestra en las Figuras 5.19 y 5.20. En primer lugar cabe destacar la presencia de los materiales de hidroxiapatito no modifica el medio de cultivo celular, ya que no se aprecian cambios en la coloración del mismo ni diferencias con respecto al hidroxiapatito de control (C). Cuando los sólidos modifican el ambiente celular se aprecia un cambio de color inmediato del rosa al amarillo, lo cual no se ha observado para ninguna de las muestras estudiadas (Figura 5.19). Figura 5.18 Fotografía del medio de cultivo celular utilizado en este trabajo. Por comparación se muestra también el correspondiente a una muestra de control de hidroxiapatito. En la Figura 5.20 se observan imágenes de la viabilidad celular en presencia de pastillas prensadas y esterilizadas de las muestras estudiadas. De estas imágenes se deduce que la viabilidad está relacionada con el contenido de fosfonato de los materiales. Los mejores resultados para células mesenquimales de rata se dan en las muestras AP-1%-150 yAP-3%-150, con un comportamiento similar al del material de control tanto en número como en proximidad de las células a las pastillas. Las muestras de mayor contenido en fosfonato, AP-7%-150 yAP-10%-150 revelan una caída de la biocompatibilidad debido a la disminución de células vivas en torno a la pastilla del material. La muestra AP-5%-150 tiene un comportamiento intermedio. TFG - Carmen Méndez Ramos Resultados y Discusión 44 Figura 5.19 Mosaico de imágenes de viabilidad celular a 10 aumentos de células mesenquimales de rata en presencia de pastillas prensadas y esterilizadas de hidroxiapatito. Las regiones oscuras representan las pastillas de las muestras preparadas. La biocompatibilidad se compara con una muestra de control (HA-CONTROL). En consecuencia, los hidroxiapatitos sintetizados con un contenido en fosfonato del 5% o inferior muestran una biocompatibilidad similar a un material de hidroxiapatito de referencia, utilizado en estudios de viabilidad celular. Por lo cual estas composiciones podrían ser utilizadas en procesos de recubrimiento de metales para implantes óseos. Los resultados, no obstante, deben ser considerados todavía como preliminares y son necesarios más estudios en profundidad con el objeto de determinar su biocompatibilidad como biomateriales. TFG - Carmen Méndez Ramos Conclusiones 45 6. Conclusiones 1. Se han sintetizado, en dos etapas, una serie de materiales de hidroxiapatito con un alto grado de pureza, conteniendo cantidades variables [1-10%] de fósforo en forma de fosfonato. La primera etapa es una reacción hidrotermal y la segunda es un tratamiento térmico de los sólidos a 150ºC. 2. Los materiales constan de una fase cristalina mayoritaria de hidroxiapatito (>91%) y una fase amorfa minoritaria no cuantificada. 3. La fase cristalina de hidroxiapatito, con un grado de pureza de 91-100% tiene una estructura monoclínica que la diferencia de la estructura hexagonal normalmente obtenida en condiciones similares. Dado que esta fase monoclínica es termodinámicamente más estable, ello puede reportar un beneficio añadido para el uso como biomaterial; puesto que ésta es la estructura que posiblemente pueda existir en los tejidos duros. 4. La estructura morfológica y la superficie específica se ve modificada por la presencia variable de fosfonato, de tal manera que las muestras con mayor contenido en fosfonato son las que presentan mayor porosidad. 5. El estudio preliminar de biocompatibilidad revela que los hidroxiapatitos con un contenido en fosfonato no superior al 5% muestran un comportamiento con respecto a la viabilidad celular similar al de una muestra de referencia de hidroxiapatito. Futuras líneas de trabajo Completar los estudios de biocompatibilidad. Realizar estudios de propiedades mecánicas. Estudiar las propiedades de estos materiales como recubrimiento para implantes metálicos. Estudiar la viabilidad de los materiales como “Scaffolds” en ingeniería tisular a partir de sólidos preparados con porosidad controlada. Determinar los límites de tolerancia de fosfonato en los materiales biocompatibles de hidroxiapatito. TFG - Carmen Méndez Ramos Conclusiones 46 TFG - Carmen Méndez Ramos Bibliografía 47 7. Bibliografía Aced Jiménez, E., Ruiz de León, G., Hernández-Pacheco, E., Torres-Lagares, D., and Gutiérrez-Pérez, J.L. (2013). Actualización en microimplantes de relleno perioral atendiendo a su permanencia. 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Agradecer su dedicación y paciencia a Juan Félix López Tellez, técnico especialista en Microscopía Electrónica de Bionand, por realizar unas fotos maravillosas que, a pesar de que no se encuentren todas en la memoria, no quedarán olvidadas. Dar las gracias también al Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología, especialmente a J. A. Andrades y Silvia Claros Gil por su predisposición a ayudarnos y por sus células que tanto nos han servido. Por supuesto nunca agradeceré como se merece a Pascual por sus recomendaciones, correcciones, artículos, ideas y por una incontable cantidad de horas que han hecho que de este trabajo una realidad. Por último agradecer a mis amigos y familiares, los presentes y los ausentes, por aguantarme y escucharme a pesar de no entender nada de lo que decía.