Estudio del mecanismo de acción y efecto sinérgico de la proteína supresora de silenciamiento p22 del crinivirus Tomato chlorosis virus

AUTOR: Yazmín Mónica Landeo Ríos http://orcid.org/0000-0001-5391-7005 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE DOCTORADO DE BIOTECNOLOGÍA AVANZADA Tesis Doctoral Estudio del mecanismo de acción y efecto sinérgico de la proteína supresora de silenciamiento p22 del crinivirus Tomato chlorosis virus Memoria de Tesis Doctoral presentada por la Licenciada en Agricultura Yazmín Mónica Landeo Ríos para otorgar al grado de Doctora en Biología por la Universidad de Málaga Directores: Dra. Mª Carmen Cañizares Nolasco Prof. Inv. Enrique Moriones Alonso Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (IHSM-UMA-CSIC) Málaga, Noviembre de 2015 Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea "La Mayora" 29750 Algarrobo-Costa, Málaga (SPAIN) Tel/ (+34)952548990 (ext. 132); Fax (+34)952552677 email: [email protected] http// www.eelm.csic.es Doña M. CARMEN CAÑIZARES NOLASCO, Doctora en Ciencias Biológicas, Investigadora Postdoctoral del Consejo Superior de Investigaciones Científicas en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (Universidad de Málaga-Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Don ENRIQUE MORIONES ALONSO, Doctor Ingeniero Agrónomo, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (Universidad de MálagaConsejo Superior de Investigaciones Científicas). CERTIFICAN: que Doña Yazmín Mónica Landeo Ríos, Licenciada en Agricultura, ha realizado en el Laboratorio de Virología del Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (IHSM-UMA-CSIC), bajo su dirección, el trabajo que con título “Estudio del mecanismo de acción y efecto sinérgico de la proteína supresora de silenciamiento p22 del crinivirus Tomato chlorosis virus” presenta para optar al grado de Doctora en Biología. Y que para que así conste y produzca los efectos oportunos donde proceda, firman el presente certificado en Algarrobo-Costa (Málaga) a 13 de noviembre de 2015. Fdo. Dra. M. Carmen Cañizares Nolasco Fdo. Prof. Inv. Enrique Moriones Alonso Doña CARMEN BEUZÓN LÓPEZ, Profesora titular de genética del Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga, RATIFICA: que Doña Yazmín Mónica Landeo Ríos ha realizado en el Laboratorio de Virología del Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (IHSM-UMA-CSIC), el trabajo que con título “Estudio del mecanismo de acción y efecto sinérgico de la proteína supresora de silenciamiento p22 del crinivirus Tomato chlorosis virus” presenta para optar al grado de Doctora en Biología. Y que para que así conste y produzca los efectos oportunos donde proceda, firman el presente certificado en Algarrobo-Costa (Málaga) a 13 de noviembre de 2015. Fdo. Dra. Carmen Beuzón López Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Virología del Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” (Universidad de Málaga – Consejo Superior de Investigaciones Científicas, IHSM-UMA-CSIC) gracias a una beca predoctoral MAEC/AECID del Ministerios de Asuntos Exteriores y de Cooperación de España, asociada al proyecto AGL2010-22287-C02-01/AGR y AGL2013-48913-C2-1R del Ministerio de Economía y Competitividad de España, co-financiado por FEDERFSE. Paco, Anabel, de todos he aprendido un poco, pero sobre todo hemos compartido buenos momentos. Gracias a los que han estado de paso, Ishtiaq, Leo, Nevine, Pedro, Alejandro, Pierre, con todos ustedes he compartido buenos momentos en el lab y en la residencia y hasta de viaje nos hemos ido. No olvidaré el viaje a Portugal, ni la guitarra de Pedro, ni la marcha del francés. Por mi cuartito han pasado varias chicas, Loudi, Pao, Lidia, Camila, cuantas cosas vividas, cuantas risas, cafés, estrés, agobios, ha sido un gusto haber compartido sitio con ustedes. Gracias Pao por siempre darme ánimos, eres increíble, siempre preocupándote por mi, gracias. Lidia, aunque ya no estás, has dejado un gran vacío, te echamos de menos y te esperamos de vuelta. Camila, siempre con una sonrisa, con optimismo, gracias por los buenos momentos, ya sabes que siempre me tendrás como amiga para lo que necesites. Gracias a la nueva gente que se queda, Elisa, Edu, Happiness. Gracias Eli, una tía estupenda, en poco tiempo te has hecho querer, espero que sigamos en contacto. Gracias a mi gente de la resi, Jorge siempre estás en las buenas y en las malas, te voy a echar de menos, nunca olvidaré lo mucho que me has ayudado. Gracias Rida por compartir tantas cosas, Amanda eres un encanto, que pena que hayamos compartido solo unos de meses, espero nos volvamos a ver pronto, gracias Quique por siempre echarnos una mano cuando hace falta. Gracias a Ro, a Xavi, ¡¿cómo olvidar las rutas de senderismo?!, gracias. Nerea y Vero, gracias por compartir conmigo y por escucharme, por los paseos perrunos y las conversaciones. Gracias Vero por tu compañía, al final nuestros perros se han hecho grandes amigos, y nosotras también gracias a ellos. Olaya, gracias por toda la ayuda en el trabajo, siempre acudes a mis llamados de desesperación cuando algo no funciona, gracias, pero sobre todo por todos los momentos compartidos. Gracias a Carlitos, que ahora está en México y a Liz, grandes amigos, Ares y yo les echamos de menos, nos lo hemos pasado muy bien con ustedes. Gracias Jota, siempre venías a echar unas risas al cuartito, espero que estés bien por esas tierras gauchas. Gracias Antonio por toda la ayuda prestada. La portada de esta tesis ha sido cortesía de mi gran amiga Cris, gracias Cris, me ha encantado. Mis chicas de Lima, que en la distancia siempre están, Lili y Andreita, gracias por los karaokes tan liberadores. Gracias a mi amiga Maricarmen, que siempre me ha apoyado incondicionalmente, gracias tía, eres una gran amiga. Gracias mamá, gracias papá, han estado siempre apoyándome, aconsejándome y aguantándome, gracias por ayudarme a cumplir mis metas. Gracias Susan, eres la mejor hermana del mundo, me has apoyado desde que tengo memoria y sigue siendo así, gracias Arturo. Gracias a mis sobrinos, alegran mis días con su cariño, mis hermanos Iván y Omar y por supuesto, gracias a mi perro, que me obliga a caminar cada día, a respirar aire puro, pero sobre todo me obliga a sonreír, me ha cambiado la vida. Gracias familia, son lo mejor que tengo. Hugo no puedes faltar, ¿qué hubiera hecho yo sin ti? no hubiera llegado hasta el final. Has estado “detrás de cámaras” apoyándome, éstas breves líneas te las dedico, es lo mínimo que puedo hacer por alguien que ha hecho tanto por mi. Discúlpenme si me olvido de alguien, espero que no, todos de alguna manera u otra han formado parte de esta etapa. Gracias por compartirla conmigo. “Puede que lo que hacemos no traiga siempre la felicidad, pero si no hacemos nada, no habrá felicidad”. Albert Camus. ÍNDICE ÍNDICE ACRÓNIMOS RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN 1. Los virus de plantas 1.1. Características generales 1.2. Ciclo infeccioso de los virus de plantas 1.3. Mecanismo de defensa antiviral en plantas 2. Silenciamiento por RNA 2.1. Aspectos generales y breve historia 2.2. Mecanismos moleculares del silenciamiento por RNA en plantas 2.3. Silenciamiento por RNA como mecanismo de defensa antiviral en plantas 2.4. Supresión viral del silenciamiento 2.4.1. Características generales 2.4.2. Mecanismos moleculares de supresión del silenciamiento 2.4.3. Supresores virales como determinantes de patogenicidad. Sinergismo viral 3. Familia Closteroviridae 3.1. Características generales 3.2. Organización genómica 3.3. Mecanismo de expresión génica 3.4. Ciclo de infección de los closterovirus 3.5. Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae 3.6. Supresores del silenciamiento génico en la familia Closteroviridae 4. Tomato chlorosis virus (ToCV) 4.1. Propiedades biológicas y modo de inoculación 4.2. Organización genómica 4.3. Diversidad genética de ToCV OBJETIVOS CAPÍTULO I. Genetic diversity and silencing suppression activity of the p22 protein of Tomato chlorosis virus isolates from tomato and sweet pepper 1 9 15 21 23 23 25 27 30 30 31 34 36 36 37 48 51 51 54 59 61 62 63 66 66 68 70 73 77 CAPÍTULO II. The p22 RNA silencing suppressor of the crinivirus Tomato chlorosis virus preferentially binds long dsRNAs preventing them from cleavage CAPÍTULO III. The p22 RNA silencing suppressor of the crinivirus Tomato chlorosis virus is dispensable for local viral replication but important for counteracting an antiviral RDR6-mediated response during systemic infection CAPÍTULO IV. The heterologous expression of the p22 RNA silencing suppressor of the crinivirus Tomato chlorosis virus from TRV and PVX induces a drastic synergistic effect but does not complement suppressor defective mutant viruses DISCUSIÓN GENERAL CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 105 135 155 179 193 197 ACRÓNIMOS Acrónimos 3 Acrónimos de virus ACLSV: Apple chlorotic leaf spot virus AgMV: Agropyron mosaic virus AV-2: Asparagus virus 2 AV3: Asparagus virus 3 BdMoV: Burdock mottle virus BMYV: Beet mild yellowing virus BNYVV: Beet necrotic yellow vein virus BPYV: Beet pseudoyellows virus BSBMV: Beet soil-borne mosaic virus BSMV: Barley stripe mosaic virus BuYV: Burdock yellows virus BWYV: Beet western yellows virus BYDV: Bean yellow disorder virus BYSV: Beet yellow stunt virus BYV: Beet yellows virus BYVaV: Blackberry yellow vein-associated virus CABMV: Cowpea aphid-borne mosaic virus CABYV: Cucurbit aphid-borne yellows virus CaMV: Cauliflower mosaic virus CCYV: Cucurbit chlorotic yellows virus CfMV: Cocksfoot mottle virus CGMMV: Cucumber green mottle mosaic virus CIRV: Carnation italian ringspot virus CLRDV: Cotton leafroll dwarf virus CMV: Cucumber mosaic virus CNFV: Carnation necrotic fleck virus CNV: Cucumber necrosis virus CPMV: Cowpea mosaic virus Cr-TMV: Crucifer-infecting tobacco mosaic virus CSDV: Citrus sudden death-associated virus CTV: Citrus tristeza virus CVB: Chrysanthemum virus B Resumen 11 Tomato chlorosis virus (ToCV) pertenece al género Crinivirus dentro de la familia Closteroviridae donde se engloban los virus de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva de mayor tamaño y complejidad entre los virus de RNA de plantas. ToCV posee un genoma bipartito, donde el RNA1 codifica las proteínas implicadas en replicación viral y el RNA2 las implicadas en encapsidación, movimiento y transmisión. Aunque ambos RNAs son necesarios para obtener una infección productiva en planta, el RNA1 puede replicarse independientemente. Por su parte, el RNA2 es completamente dependiente de las proteínas codificadas en el RNA1 para su replicación. Como ha sido descrito para otros miembros de esta familia, ToCV codifica en su genoma hasta tres proteínas con actividad supresora del silenciamiento por RNA. Así, mientras que en el RNA2 esta función se lleva a cabo por las proteínas estructurales CP y CPm, en el RNA1 esta actividad es realizada por una proteína que parece específicamente dedicada a ello, la proteína p22. Esta proteína esta codificada en el extremo 3´ del RNA1 de ToCV y ha sido descrita como una de las proteínas cuya actividad supresora del silenciamiento por RNA es de las más duraderas a lo largo del tiempo en ensayos de expresión transitoria en planta (Cañizares, et al., 2008). En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de la proteína p22, donde la finalidad última ha sido conocer el modo en que, por su mediación, ToCV es capaz de hacer frente a una respuesta defensiva de la planta basada en el silenciamiento por RNA, estando interesados en conocer también el papel de p22 cuando se expresa a partir de virus heterólogos. Para todo ello, y dado que en este grupo de virus la región del genoma donde se localiza p22 tiene implicaciones evolutivas, en primer lugar hemos realizado un estudio de la variabilidad genética de la región del RNA1 que codifica p22 en aislados de ToCV de tomate y pimiento. Los resultados obtenidos han mostrado que se trata de una región muy conservada, en donde la poca variabilidad existente se concentra en la región carboxilo terminal de la proteína. Aunque altamente conservadas, el análisis filogenético mostró una clara separación de las secuencias de p22 en dos grupos denominados tipo I y tipo II. Ensayos de supresión de silenciamiento realizados con proteínas p22 pertenecientes a cada uno de estos grupos, mostraron que ambas proteínas poseían una actividad supresora de silenciamiento duradera a lo largo del tiempo. Parece, por tanto, que la presencia de un supresor de silenciamiento con actividad supresora de larga duración es una característica conservada entre los aislados de ToCV. Resumen 12 Una vez confirmado que codificar una proteína con actividad supresora de larga duración parece ser importante para las poblaciones de ToCV, el siguiente objetivo consistió en conocer el posible mecanismo de acción responsable de la misma. Así, la realización de ensayos de unión in vitro mostró que p22 une preferentemente RNAs de doble hebra (dsRNAs) de tamaño largo, interfiriendo con la acción de corte de Dicer, inhibiéndose de este modo la generación de RNAs pequeños (sRNAs). La actuación de p22 en este punto temprano de la cascada de silenciamiento, podría ser una de las razones de esta actividad supresora de larga duración, ya que se bloquearía desde un primer momento la generación de sRNAs. Estos resultados in vitro se correlacionaron con los obtenidos en ensayos de supresión de silenciamiento inducidos por construcciones en horquilla in planta. Una vez conocido uno de los posibles mecanismos de acción de p22 cuando ésta se encontraba aislada de su contexto viral, el siguiente objetivo consistió en conocer cómo p22 podía mediar frente a una respuesta defensiva de la planta basada en el silenciamiento por RNA durante el ciclo de infección viral. Ya que, entre los componentes de la cascada de silenciamiento, RDR6 juega un papel fundamental en defensa antiviral, se comenzó estudiando si RDR6 tenía algún papel en defensa frente a ToCV. El incremento notable en los niveles de acumulación de ToCV observado en plantas de Nicotiana benthamiana defectivas para la expresión de RDR6 (plantas RDR6i), comparado con los de plantas silvestres, indicaba la importancia de este factor en la defensa de la planta frente a la infección viral. Para conocer si durante el proceso de infección viral, p22 tenía algún papel frente a este componente de la cascada de silenciamiento, se creó un mutante de deleción de p22 de ToCV (ToCV∆p22). Así, en primer lugar se pasó a estudiar el papel de p22 durante el ciclo de infección viral en ensayos a nivel local. Curiosamente, los resultados mostraron que la ausencia de p22, además de no afectar a la replicación del RNA1, estaba asociada con la desregulación del ratio de cadenas positivas y negativas del virus, aumentando estas últimas, no teniendo RDR6 ningún efecto apreciable a este nivel. En el caso de ToCV∆p22 el incremento en cadenas negativas correspondientes al RNA1, que resulta en un aumento de los niveles de acumulación de cadenas positivas a partir de las cuales las proteínas requeridas para la replicación podrían traducirse, no se correlacionó con un incremento en los niveles de acumulación del RNA2. Por otra parte, a nivel sistémico se observó que aunque el mutante ToCV∆p22 tenía reducida la capacidad de infectar plantas de N. Resumen 13 benthamiana silvestres, esta capacidad era rescatada en plantas RDR6i, lo que indicaba la existencia de una conexión entre p22 y RDR6. Por último, y ya que las proteínas supresoras de silenciamiento están frecuentemente asociadas a interacciones de tipo sinérgico, el último objetivo de esta tesis consistió en estudiar el efecto de la expresión heteróloga de p22 a partir de los virus Tobacco rattle virus (TRV) y Potato virus X (PVX). Los resultados mostraron que, aunque se produjo un fuerte sinergismo en síntomas que conducía a la muerte de la planta cuando p22 se expresaba a partir de ambos virus, sólo en el caso de TRV, éste iba acompañado de un aumento en los niveles de acumulación viral. La expresión heteróloga de p22 no era capaz, sin embargo, de complementar a mutantes de virus defectivos en la expresión de proteínas con actividad supresora del silenciamiento. Resumen 14 SUMMARY Summary 17 Tomato chlososis virus (ToCV; genus Crinivirus) is a member of the complex family Closteroviridae, in which the largest RNA genomes among plant viruses are found. ToCV has a bipartite single stranded, positive-sense RNA genome with RNA1encoding proteins involved in viral replication and RNA2-encoding proteins involved in encapsidation, movement, and host transmission. Although both RNAs are required for the effective infection of plants, RNA1 can replicate independently, whereas RNA2 depends on RNA1 for its replication. Similar to other members of the family Closteroviridae, ToCV adopts the strategy of encoding multiple RNA silencing suppressors. Thus, while ToCV RNA2 has delegated its suppressor function to the structural proteins CP and CPm, RNA1 encodes a dedicated suppressor protein at its 3´- proximal end, p22, which exhibits no apparent homology to any other reported protein. It has been shown that p22 suppresses very efficiently local RNA silencing induced either by sense RNA or by dsRNA, having one of the longest lasting local suppression activities when assayed in Nicotiana benthamiana plants. Thus, the p22 protein is the focus of our work, where the final goal is to know how ToCV, by mediation of this protein, confront a plant defense response based on RNA silencing, also being interested in knowing the effect of the expression of ToCV p22 from heterologous viruses. First of all, since the 3´-end of RNA1 in bipartite crinivirus where the p22 silencing suppressor of ToCV is located, has evolutionary implications, we have undertaken a study to evaluate the genetic diversity of this gene in ToCV isolates collected in Spain from tomato and sweet pepper. These results have shown that the p22 amino acid sequences are highly conserved having few variable positions mainly located at the C-terminal part of the protein. Although highly conserved, phylogenetic analyses of the p22 amino acid sequences clearly showed two separated groups, called type I and type II. Comparison of the silencing suppression activities of both ToCV p22 protein types showed a similar lasting local suppression activity. Thus, our findings provide experimental evidence that the presence of a “strong” silencing suppressor at the 3´-end of the RNA1, is an important and conserved feature for ToCV isolates. Once confirmed that the presence of a “strong” silencing suppressor is important for ToCV populations, the next objective consisted in knowing its mechanism of action. Thus, by performing in vitro binding assays we showed that p22 very efficiently binds long dsRNA molecules preventing their cleavage into sRNAs by RNase III Dicer Summary 18 homologue. The blocking of the silencing process at early steps by hindering the generation of sRNAs could be one of the reasons of the long lasting silencing suppression activity observed. The efficient ability of p22 to suppress RNA silencing, triggered by hairpin transcripts transiently expressed in planta, supports the relationship between its ability to bind dsRNA in vitro and its ability to inhibit RNA silencing in vivo. After knowing the p22 mechanism of action when isolated form the viral context, the next objective was to determine how ToCV, by mediation of p22, counteracted a plant defense response based on RNA silencing. Among the RNA silencing components, RDR6 has a relevant role in virus defense. Therefore, we started studying if RDR6 played an antiviral role in plant defense against ToCV. The significant increase in ToCV RNA accumulation levels in plants where RDR6 was constitutively silenced (RDR6i plants) compared with wild type plants, showed that this was the case. To know if during the viral infection process, p22 had a role counteracting this component of the RNA silencing pathway, we created a p22-deficient ToCV infectious mutant clone (ToCV∆p22). First of all, we studied the p22 role during the viral infection cycle in local assays. These results showed that although p22 does not appear to be necessary for local RNA1 replication, it may influence the equilibrium between the positive and negative strands of the virus during the infection process. In the case of ToCV∆p22, the increased accumulation of negative strands which might result in increased accumulation of positive strands from which the replication associated proteins are translated, did not correlate with increased RNA2 accumulation. On the other hand, the finding that ToCV∆p22 systemic accumulation was impaired in wild type N. benthamiana but not in NbRDR6i plants suggests a role for p22 in counteracting an RDR6-mediated antiviral response of the plant during systemic infection. Finally, since suppression of RNA silencing and the ability to induce a synergistic response are closely associated, we analyzed the effect of the expressing p22 from the heterologous viruses Tobacco rattle virus (TRV) and Potato virus X (PVX). These results showed that although a drastic disease synergism leading to plant death was observed when ToCV p22 was expressed from both viruses, only in the case of TRV this was linked to an increase in the viral accumulation levels. The heterologous Summary 19 expression of ToCV p22, however, could not complement suppressor defective mutant viruses. Introducción 26 RNA de cadena sencilla y polaridad negativa [ssRNA(-)], se sintetiza en primer lugar la hebra de polaridad positiva mediante la RdRp encapsidada en el propio virión, que servirá como mRNA para la traducción de las proteínas virales, y como molde para la síntesis de nuevas cadenas negativas que constituirán el genoma de la progenie. En el caso de los virus de RNA de doble cadena (double-stranded RNA, dsRNA) la RdRp, también encapsidada, llevará a cabo la síntesis de los mRNA de las proteínas virales y de los dsRNAs. En el caso de los virus de DNA de cadena sencilla (single-stranded DNA, ssDNA) la replicación tiene lugar en el núcleo, mediada por la DNA polimerasa dependiente de DNA del huésped (DNA-dependent DNA polymerase, DdDp). En el caso de los virus de DNA de doble hebra (double-stranded DNA, dsDNA), se generan nuevos genomas de dsDNA a partir del mRNA viral mediante retrotranscripción mediada por una DNA polimerasa dependiente de RNA (RNA-dependent DNA polymerase, RdDp) viral. Encapsidación de nuevas partículas virales Las subunidades de proteínas de cubierta (coat proteins, CP) codificadas por el genoma viral reconocen las moléculas de DNA o RNA viraly se ensamblan formando nuevas partículas virales que contienen y/o protegen el genoma del virus. Movimiento y dispersión viral El virus se propaga dentro de la planta mediante un movimiento a corta distancia o célula a célula a través de los plasmodesmos, y un movimiento a larga distancia o sistémico a través del tejido vascular. El movimiento célula a célula está mediado por proteínas virales de movimiento que actúan modificando el tamaño del plasmodesmo (Niehl y Heinlein, 2011). En el movimiento a larga distancia se produce normalmente a través de los tubos cribosos del floema que se alcanzan tras un pase sucesivo a través de los haces vasculares, las células del parénquima vascular y las células acompañantes. Una vez transportado a zonas distales de la planta, el virus debe ser capaz de salir de los elementos cribosos para iniciar nuevos focos de infección y así propagarse por toda la planta (Hipper et al., 2013) (Figura 3). La dispersión a otras plantas se producirá a través de vectores biológicos, polen o material de propagación vegetativa, o por el contacto físico entre plantas. Introducción 27 Figura 3: Movimiento viral célula a célula y a larga distancia a través de los tejidos vegetales (adaptado de Hipper et al., 2013). 1.3. Mecanismos de defensa antiviral en plantas Frente a las infecciones virales, las plantas se defienden estableciendo varias líneas de resistencia que se pueden clasificar en: resistencia dominante, resistencia recesiva, resistencia basada en el silenciamiento por RNA y resistencia mediada por hormonas (Nicaise, 2014). Resistencia dominante. La mayoría de los genes de resistencia dominante (genes R) identificados en las interacciones virus-planta pertenecen a la clase NBS-LRR (nucleotide binding site-leucine rich repeat class), que reconocen de manera específica un factor de avirulencia (avr) del virus, a través del establecimiento de la llamada interacción “gen a gen”. Aunque inicialmente se había sugerido una interacción directa entre los productos génicos avr y R, actualmente se considera como más probable que el reconocimiento se produzca según el modelo de la “hipótesis de guardia” (Soosaar et al., 2005). Tras el reconocimiento específico avr-R, se inicia una cascada de señales de Introducción 28 transducción a nivel local (Loebenstein, 2009; Carr et al., 2010) mediante la cual la planta puede limitar la multiplicación y dispersión del patógeno. Esta respuesta suele estar asociada a un tipo de muerte celular programada, denominada respuesta hipersensible (hipersensitive response, HR) (Hammond-Kosack y Jones, 1997). Estudios recientes indican que el proceso de resistencia y la activación de una HR son rutas fisiológicas distintas, aunque ambas pueden trabajar juntas (Bendahmane et al., 1999; Bai et al., 2012). Los genes R también pueden inducir otro tipo de resistencia denominada resistencia sistémica adquirida (systemic acquired resistance, SAR), que a diferencia de la HR, proporciona una resistencia que se transmite a tejidos distales no infectados y es efectiva frente a posteriores ataques del patógeno y a varios patógenos al mismo tiempo (Carr et al., 2010). Resistencia recesiva. Aproximadamente la mitad de los 200 genes de resistencia conocidos que tienen como diana los virus de plantas, se heredan de forma recesiva (Díaz-Pendón et al., 2004), lo que sugiere que esta forma de resistencia es más común frente a virus que frente a otros patógenos de plantas. La resistencia recesiva puede ser el resultado de la ausencia de un factor del huésped necesario para que el virus complete su ciclo de vida. Un gran número de los genes de resistencia recesiva clonados codifican factores de iniciación de la traducción. Entre ellos, el factor de iniciación de la traducción 4E (eIF4E) es de especial interés en el caso de virus de la familia Potyviridae, aunque mutaciones de genes de este grupo también confiere resistencia frente a otros grupos de virus (Robaglia y Caranta, 2006). Resistencia basada en el silenciamiento por RNA. Este mecanismo de defensa se induce por la presencia de moléculas de doble hebra, activándose una cascada de procesos enzimáticos que tiene como consecuencia la inhibición o supresión de moléculas de ácidos nucleicos a través de interacciones específicas. Para contrarrestar este mecanismo de defensa los virus codifican en su genoma proteínas supresoras del silenciamiento (Voinnet, 2005). En los siguientes apartados explicaremos más en detalle este proceso. Resistencia mediada por hormonas. Las hormonas vegetales juegan un papel importante en la regulación de la red de señalización implicada en la defensa de la planta. Como hemos visto, durante la activación de la resistencia mediada por genes R, las respuestas celulares iniciadas en el sitio de infección son emitidas a tejidos distales Introducción 29 no infectados de la planta, dando como resultado una respuesta o estado reducido de susceptibilidad que puede permanecer de manera eficiente durante varias semanas (Fu y Dong, 2013) o SAR. No está claro cómo la SAR se mantiene durante tanto tiempo, pero parecen fundamentales modificaciones epigenéticas como la metilación del DNA y la remodelación de la cromatina, para mantener esta señal (Spoel y Dong, 2012). Además, durante una infección viral, esta resistencia a las enfermedades a lo largo del tiempo y de amplio espectro requiere la acumulación endógena de ácido salicílico (salicilic acid, SA), lo que resulta en la reprogramación de una batería de genes que codifican proteínas relacionadas con la patogenicidad (Tsuda et al., 2008; Yi et al., 2014). La señal emitida desde el foco de infección para proteger los tejidos no infectados contra la invasión del virus, podría circular como un heterocomplejo, donde el metil-SA se uniría a derivados de lípidos y proteínas transportadoras de lípidos, moviéndose a través del floema al resto de la planta. El ácido jasmónico (jasmonic acid, JA) está también fuertemente implicado en defensa de la planta frente a virus. Así, la respuesta HR iniciada en las interacciones avr-R resulta en una modulación de SA y JA. Aunque el SA actúa como un regulador positivo de la resistencia de la planta frente a virus, el papel del JA es controvertido y aún no se ha aclarado completamente. Por ejemplo, el JA, parece ser un regulador negativo de la resistencia a nivel local de Tobacco mosaic virus (TMV) en plantas de tabaco (Oka et al., 2013), pero es esencial para la resistencia sistémica a TMV en plantas de Nicotiana benthamiana (Zhu et al., 2014). Es probable que el equilibrio entre JA y SA juegue un papel clave en la determinación del grado de resistencia de manera similar a lo observado en patosistemas que implican a patógenos no virales de planta (Thaler et al., 2012). Curiosamente, los virus de plantas han evolucionado interviniendo en rutas hormonales, a menudo aprovechándose de las interacciones antagónicas entre las rutas del SA y JA (Kazan y Lyons, 2014). Aunque, su función en las interacciones virus-planta sigue siendo poco comprendida, estudios recientes indican que otras hormonas vegetales pueden modular los mecanismos de resistencia antiviral, especialmente el ácido abscísico (Chen et al., 2013; Alazem et al., 2014; Seo et al., 2014), el etileno (Fischer y Dröge-Laser, 2004; Love et al., 2007; Zhang et al., 2009; Chen et al., 2013) y los brasinosteroides (Ali et al., 2014). Introducción 30 2. Silenciamiento por RNA 2.1. Aspectos generales y breve historia El silenciamiento por RNA es un sistema de regulación mediado por RNAs pequeños que causan la inhibición o supresión de moléculas de ácidos nucleicos a través de interacciones específicas. Este proceso está altamente conservado en organismos eucariotas, donde además de en plantas está presente en hongos y animales (Wang y Metzlaff, 2005). Este fenómeno fue descubierto en plantas transgénicas de petunia, donde la introducción de una copia foránea de un gen endógeno que se quería sobreexpresar resultó en la co-supresión de ambos, el transgén y el gen endógeno (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990). Posteriormente en diferentes sistemas virales se demostró que, en contra del modelo propuesto, no era necesaria la expresión de proteínas virales para obtener resistencia frente a virus sino que era suficiente con una secuencia viral no traducible (Lindbo et al., 1992; van der Vlugt et al., 1992). La observación de que un transgén GUS silenciado podía prevenir la acumulación viral de Potato virus X (PVX) portador de una secuencia GUS, indicaba que se trataba de un mecanismo de defensa antiviral específico de secuencia (English et al., 1996). Otra evidencia que indicaba que se trataba de un mecanismo general de respuesta de la planta frente a la infección viral, fue el hallazgo de que en planta no sólo se encontrara resistencia frente a un virus inoculado inicialmente, sino también frente a otros virus que portaran secuencias homólogas (Ratcliff et al., 1997). La prueba inequívoca que explicaba la extrema especificidad de secuencia del proceso de silenciamiento por RNA fue el hallazgo de que en plantas que contenían un transgén silenciado, se acumularan RNAs pequeños de aproximadamente 24 nt de tamaño con secuencias idénticas a la del transgén (Hamilton y Baulcombe, 1999). El posterior descubrimiento de que los genomas virales codificaban proteínas supresoras de silenciamiento, capaces de bloquear o interferir con este proceso de silenciamiento por RNA, confirmó su implicación en defensa antiviral (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau y Carrington, 1998). Introducción 31 2.2. Mecanismos moleculares del silenciamiento por RNA en plantas En plantas, el silenciamiento por RNA engloba una serie de procesos que pueden actuar a nivel transcripcional (transcriptional gene silencing, TGS) o posttranscripcional (posttranscriptional gene silencing, PTGS). Ambos procesos tienen en común el reconocimiento específico de secuencias de DNA o RNA por pequeñas moléculas de RNA. Este mecanismo está implicado en procesos, tales como el mantenimiento de la integridad del genoma, la regulación de procesos del desarrollo y/o la defensa frente a ácidos nucleicos invasores, tales como transgenes, transposones y virus (Voinnet, 2001; Vaucheret, 2006; Ruiz-Ferrer y Voinnet, 2009). El silenciamiento por RNA se induce por la presencia de moléculas de dsRNA que podrían derivar de la replicación viral, de repeticiones invertidas, de la transcripción convergente de transgenes y transposones, de locis endógenos con una alta estructura secundaria, o bien generarse por la acción de RNAs polimerasas dependientes de RNA (RDR) a partir de ssRNA. Estas moléculas son procesadas por RNasas de tipo III denominadas en planta DCLs (Dicer-like), en pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de doble hebra de entre 19 y 25 nt que presentan 2 o 3 nt protuberantes en el extremo 3´ de ambas cadenas (Elbashir et al., 2001). DCL requiere de la acción de DRB (dsRNA binding protein), para que el procesamiento del dsRNA se produzca de un modo preciso y eficiente (Hiraguri et al., 2005; Eamens et al., 2012 a, b). La metilación de los sRNAs generados mediada por la metil transferasa HEN1 (Boutet et al., 2003), los protege de la degradación. Una de las hebras del sRNA es incorporada a un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RNA induced-silencing complex, RISC) que contiene, entre otros componentes, una endonucleasa llamada Argonauta (AGO). Una vez ensamblado, en el caso del PTGS, este complejo es guiado por el sRNA hasta un mRNA diana de secuencia complementaria al que se une induciendo la inhibición de su traducción o su degradación. En el TGS, este complejo es guiado hasta un DNA de secuencia complementaria al que se une, induciendo su metilación y bloqueando su transcripción. Existe un proceso de amplificación de la señal de silenciamiento mediado por RNAs polimerasas dependientes de RNA (RDR), que resulta en la generación de nuevas moléculas de dsRNA que son procesadas en sRNAs secundarios (Figura 4). Introducción 32 Figura 4: Ruta del silenciamiento por RNA en plantas. La molécula de dsRNA es reconocida y procesada por DCL, generando dúplex de sRNAs que serán metilados por la acción de HEN1. Una de las hebras del sRNA es incorporada en el complejo RISC cuyo componente principal es AGO, llevándose a cabo a continuación la degradación de los RNAs diana. Las RNA polimerasas dependientes de RNA (RDR) generan nuevas moléculas de dsRNA que serán nuevamente procesados por DCL, dando lugar a la formación de sRNAs secundarios. En plantas, existen tres rutas básicas del silenciamiento por RNA: i) la ruta de los microRNA (miRNA), ii) la ruta de degradación mediada por pequeños RNAs interferentes (small interfering RNAs, siRNAs), y iii) la ruta de metilación del DNA mediada por RNA (RNA-directed DNA methylation, RdDM). En la ruta de los miRNAs, la transcripción de los genes MIR da lugar a un miRNA primario, que forma una estructura secundaria parcialmente plegada, que es procesada por DCL1, una de las cuatro proteínas DCL de Arabidopsis thaliana, para dar lugar a una estructura precursora tipo horquilla de la que serán escindidos los dúplex de miRNA de 21 a 24 nt (Kim et al., 2005). Otros factores, como la proteína en dedo de zinc SERRATE y las Introducción 33 proteínas de unión a dsRNA DRB1 o HYL1, también están implicadas en la biogénesis de los miRNAs. Los miRNAs juegan un papel crítico en el control del desarrollo de la planta, reprimiendo o controlando la expresión de genes reguladores tales como los factores de transcripción. Los miRNAs de planta tienen principalmente como diana las regiones codificantes de los mRNAs y, aunque funcionan predominantemente mediante la acción de corte del RNA, se ha visto que también pueden actuar mediante represión traduccional (Brodersen et al., 2008). En la ruta de degradación mediada por siRNAs, dsRNAs de tamaño largo endógenos o exógenos, o estructuras en horquilla son procesados por DCL4 y DCL2 en siRNAs de 21 y 22 nt, respectivamente. El dsRNA largo endógeno precursor de esos siRNAs es sintetizado por la RNA polimerasa dependiente de RNA 6 (RDR6), una de las seis RDRs de A. thaliana, usando ssRNA como molde. Los siRNAs endógenos conocidos como trans-acting siRNAs (tasiRNAs) juegan un papel muy importante durante el desarrollo de la planta y en las respuestas a estrés. Sin embargo, parece que una de las funciones principales de esta ruta es la defensa antiviral de la planta (ver el siguiente apartado). Por su parte, la ruta RdDM juega un importante papel en el silenciamiento de transposones y elementos de DNA repetitivos manteniendo así la estabilidad e integridad del genoma (Matzke et al., 2009; Haag y Pikaard 2011). Esta ruta también parece tener un papel importante en la defensa de la planta frente a virus de DNA. Los siRNAs de 24 nt implicados en esta ruta son procesados por DCL3 a partir del dsRNA sintetizado por la RNA polimerasa IV dependiente de DNA (Pol IV) y RDR2 (Xie et al., 2004; Henderson et al., 2006). Aunque los detalles moleculares de la RdDM no están del todo claros, como resultado de su actuación, se produce la metilación de novo del DNA por mediación de la DNA metiltransferasa DRM2 (Cao y Jacobsen, 2002; Henderson et al., 2010), inhibiéndose de este modo la transcripción. En plantas, la activación del silenciamiento en una célula induce el silenciamiento de la misma secuencia en células adyacentes y en tejidos distales. Así, se han descrito tres tipos de movimiento de la señal de silenciamiento que ocasionarían un silenciamiento a corta distancia, un silenciamiento local extensivo y un silenciamiento sistémico (Kalantidis et al., 2008; Dunoyer et al., 2010). El movimiento de la señal de silenciamiento a través de la planta presenta un patrón similar al del movimiento viral, moviéndose célula a célula a través de los plasmodesmos, y a larga distancia a través del floema desde tejidos fuente a tejidos sumidero (Voinnet, 2008). Aunque no se conoce la naturaleza exacta de la señal de silenciamiento, los datos disponibles indican que se Introducción 34 trata de un ácido nucleico (Dunoyer et al., 2010; Molnár et al., 2010), habiéndose propuesto posibles modelos de como ocurre el mismo. Así, mientras la proteína RDR6 parece jugar un papel crucial en la amplificación de la señal y su movimiento a largas distancias (Schwach et al., 2005), DCL4, en las células acompañantes, estaría implicada en la generación de sRNAs de 21 nt que son capaces de moverse 10-15 células más allá del límite del floema (Dunoyer et al., 2005). Estudios recientes han demostrado que tanto siRNAs como miRNAs tienen la capacidad de moverse de una célula a otra y alcanzar el tejido vascular (Melnyk et al., 2011). 2.3. Silenciamiento por RNA como mecanismo de defensa antiviral en plantas En plantas, el silenciamiento por RNA también funciona como mecanismo de defensa antiviral (Baulcombe, 2004; Burgyán y Havelda, 2011). Las infecciones virales en planta están asociadas con la acumulación de siRNAs virales (viral small interfering RNAs, vsiRNAs) que pueden, a su vez, actuar silenciando el propio genoma viral. Por esta razón, los virus son tanto inductores como dianas del silenciamiento por RNA. Mientras que en virus de DNA, los vsiRNAs podrían provenir de dsRNAs generados durante la transcripción bidireccional de sus genomas (Chellappan et al., 2004), en virus de RNA, los vsiRNAs podrían generarse a partir de dsRNAs generados durante el proceso de replicación viral. En este último caso se ha propuesto también que la presencia de regiones del genoma altamente estructuradas, podría constituir una fuente de generación de vsiRNAs (Molnár et al., 2005). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la mayor parte de los vsiRNAs se generarían por la acción de RDR celulares, siendo por tanto su biogénesis similar a la descrita para los siRNAs endógenos (Díaz-Pendón et al., 2007; Donaire et al., 2008; Qi et al., 2009; García-Ruiz et al., 2010; Wang et al., 2010). En A. thaliana, las cuatro proteínas DCL identificadas están involucradas en la biogénesis de vsiRNAs. En el caso de virus RNA, el papel esencial en defensa antiviral lo tienen DCL4 y DCL2 (Ding y Voinnet, 2007) generando vsiRNAs de 21 y 22 nt, respectivamente. De las dos, DCL4 parece tener un papel dominante, ya que los vsRNAs de 21 nt son generalmente más abundantes que los de 22 nt. Esta predominancia de DCL4 sobre DCL2 podría también ser debida a un efecto más potente en silenciamiento antiviral de los vsiRNAs de 21 nt con respecto a los de 22 (Wang et al., 2011). En el caso de DCL3, aunque hay indicaciones que sugieren que puede Introducción 35 contribuir en defensa antiviral, especialmente si DCL4 es inactivada (Díaz-Pendón et al., 2007; Qu et al., 2008; Donaire et al., 2008; García-Ruiz et al., 2010) esta contribución parece no ser muy relevante (Deleris et al., 2006; García-Ruiz et al., 2010). También la contribución de DCL1 a la generación de vsiRNAs parece ser minoritaria (Dunoyer et al., 2005; Deleris et al., 2006; García-Ruiz et al., 2010). En el caso de virus DNA, las cuatro proteínas DCL están implicadas en la biogénesis de vsiRNAs (Blevins et al., 2006; Moissiard y Voinnet, 2006). Los vsiRNAs generados se asocian con el complejo antiviral RISC del que AGO forma parte, produciéndose el reconocimiento de las dianas virales y su corte. De entre los 10 miembros de AGO identificadas en A. thaliana, AGO1 parece ser el más importante en defensa antiviral, aunque también se ha descrito la participación de AGO2, AGO3, AGO4, AGO5 y AGO7 (Morel et al., 2002; Qu et al., 2008; Chiu et al., 2010; Jaubert et al., 2011; Brosseau and Moffett, 2015). Se ha propuesto que AGO1 formaría parte de una primera línea de defensa antiviral, mientras que otras proteínas AGO actuarían en una segunda fase (Harvey et al., 2011; Qu et al., 2008). De los vsiRNAs producidos durante el proceso de silenciamiento, sólo una pequeña fracción resulta de la acción de corte de DCL sobre la diana inicial. Existe un proceso de amplificación de la señal de silenciamiento mediado por RDR, que resulta en la generación de vsiRNAs secundarios (Voinnet, 2008). De las seis proteínas RDR identificadas en A. thaliana, RDR1, RDR2 y RDR6 parecen estar implicadas en respuesta antiviral (Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Díaz-Pendón et al., 2007; García-Ruiz et al., 2010; Qu et al., 2008; Donaire et al., 2008). Entre ellas, el papel de RDR6 es especialmente importante, ya que se ha observado que una disminución en la actividad de esta enzima, hace que aumente la susceptibilidad a un gran número de virus (Mourrain et al., 2000; Qu et al., 2005; Schwach et al., 2005). En plantas, el silenciamiento inducido en una célula puede moverse célula a célula y a largas distancias alcanzando tejidos distales. Así, si la señal de silenciamiento se propaga de un modo más rápido del que lo hace el virus, los tejidos distales estarán alertados y de este modo tendrán la capacidad de resistir a la invasión viral (Ding y Voinnet, 2007). El silenciamiento sistémico, cuya amplificación está mediada por RDR6, juega un papel muy importante en defensa antiviral, ya que previene la invasión viral del meristemo (Schwach et al., 2005). Esta exclusión del meristemo es especialmente importante en defensa antiviral, ya que puede facilitar tanto la recuperación de la planta como prevenir la transmisión por semillas. Introducción 42 Familia Género Virus Supresor Otras funciones Mecanismo de supresión Referencia Tymoviridae Tymovirus TYMV p69 Movimiento Inhibe la metilación del DNA, induce la expresión de miRNAs y DCL1 Chen et al., 2004 Marafivirus MRFV CP Proteína de la cápsida Desconocido Hammond y Hammond, 2013 Virgaviridae Furovirus SBWMV 19K Desconocida Desconocido Te et al., 2005 CWMV 19K Desconocida Desconocido Sun et al., 2013a, b Pecluvirus PCV p15 Desconocida Unión a siRNAs Dunoyer et al., 2002, 2004; Mérai et al., 2006 Hordeivirus BSMV γβ Desconocida Unión a siRNAs Yelina et al., 2002; Mérai et al., 2006 PSLV γβ Desconocida Desconocido Yelina et al., 2002 Tobamovirus TMV p126 Replicación Interfiere con la metilación de siRNAs mediada por HEN1 Ding et al., 2004; ; Vogler et al., 2007; Harries et al., 2008; Wang et al., 2012 p122 Replicación Unión a siRNAS y miRNAs, represión de la expresión de AGO1 por inducción transcripcional de miR168 Csorba et al., 2007; Várallyay y Havelda, 2013 YoMV p126 Replicación Interfiere con la metilación de siRNAs mediada por HEN1 Vogler et al., 2007; Hu et al., 2011 ToMV p130 Replicación Unión a siRNAs Kubota et al., 2003 Tobravirus TRV 16K Permite la entrada transitoria del virus al meristemo del huésped Actúa aguas abajo de la generación de siRNAs Martín-Hernández y Baulcombe, 2008; Martínez-Priego et al., 2008; Andika et al., 2012 29K Movimiento Desconocido Deng et al., 2013 PepRSV 12K Desconocida Desconocido Jaubert et al., 2011 No asignada Sobemovirus CfMV p1 Desconocida Suprime el silenciamiento local y sistémico Sarmiento et al., 2007 CP Proteína de la cápsida Desconocido Olspert et al., 2010, 2014 RYMV P1 Desconocida Reduce la acumulación de siRNAs de 21-24nt Lacombe et al., 2010; Weinheimer et al., 2010; Gillet et al., 2013 No asignada Tenuivirus RHBV NS3 Desconocida Unión a siRNAS y miRNAs Hemmes et al., 2007 RSV NS3 Desconocida Unión a dsRNAs de tamaño largo y corto Xiong et al., 2009; Shen et al., 2010 P2 Desconocida Interacciona con SGS3 Du et al., 2011 Introducción 43 Entre los distintos mecanismos de acción descritos para supresores virales de silenciamiento encontramos: Unión a dsRNA Dado el papel clave que los dsRNAs juegan en la ruta de silenciamiento, es esperable que cualquier mecanismo que impida su actuación, comprometa la efectividad de la misma. De este modo, uno de los mecanismos de acción más comunes de los supresores de silenciamiento es la unión a dsRNAs (Lakatos et al., 2006; Mérai et al., 2006). Dependiendo de si se unen a dsRNAs de tamaño largo o de tamaño corto, se afectarán distintas etapas de la ruta. Así, si el supresor se une a dsRNAs de tamaño largo, la enzima Dicer no podrá acceder a su sustrato, y la digestión del mismo se verá afectada. Por otra parte, la unión a dsRNAs pequeños (siRNAs) puede impedir que éstos se carguen al complejo RISC, inhibiendo por tanto esta etapa de la ruta. Entre el grupo de supresores que unen dsRNAs de tamaño largo encontramos la proteína P14 del aureusvirus (género Aureusvirus, familia Tombusviridae) Photos latent virus (PoLV), la proteína P38 del carmovirus (género Carmovirus, familia Tombusviridae) Turnip crinkle virus (TCV) (Mérai et al., 2006), y la proteína NSs del tospovirus (género Tospovirus, familia Bunyaviridae) Tomato spotted wilt virus (Schnettler et al., 2010). Estos supresores también son capaces de unir siRNAs, siendo ésta la estrategia más comúnmente utilizada por las proteínas supresoras de silenciamiento de los virus de plantas (Chapman et al., 2004; Mérai et al., 2006; Csorba et al., 2007; Goto et al., 2007; Kurihara et al., 2007; Martínez-Turiño y Hernández, 2009; Schnettler et al., 2010). Entre las evidencias experimentales que apoyan que esta unión a siRNAs interferiría con su carga en el complejo RISC, encontramos las descritas para las proteínas p19 de tombusvirus (género Tombusvirus, familia Tombusviridae), p21 de closterovirus (género Closterovirus, familia Closteroviridae), NS3 de tenuivirus (género Tenuivirus), HCPro de potyvirus (género Potyvirus, familia Potyviridae) y P122 de tobamovirus (género Tobamovirus, familia Virgaviridae) (Lakatos et al., 2006; Csorba et al., 2007; Hemmes et al., 2007). Como consecuencia de la unión del supresor a siRNAs, se interferiría en la metilación de los mismos por parte de la enzima HEN1, afectándose así su estabilidad (Vogler et al., 2007; Csorba et al., 2007; Lózsa et al., 2008). Probablemente, el supresor mejor caracterizado entre los que unen siRNAs es la proteína p19 de tombusvirus (Silhavy et al., 2002). Estudios cristalográficos han mostrado que p19 forma un homodímero que selecciona específicamente siRNAs de 21 Introducción 44 y 22 nt de tamaño (Vargason et al., 2003; Ye et al., 2003). El secuestro de siRNAs por parte de p19, bloquearía la formación de complejos RISC activos (Lakatos et al., 2006), e interferiría en el movimiento sistémico de la señal de silenciamiento (Dunoyer et al., 2010; Molnár et al., 2010). Una estrategia totalmente distinta a la unión a siRNAs, aunque con el mismo resultado, es llevada a cabo por la proteína supresora RNasa III del crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV). Así, el corte de los siRNAs virales de 21 a 24 nt en productos de 14 nt mediado por la actividad endonucleasa de la proteína RNasa III, hace que éstos sean inactivos no pudiendo ser incorporados en el complejo RISC (Cuellar et al., 2009). Interferencia con DCL Los supresores virales que actúen directamente inhibiendo la maquinaria enzimática implicada en el procesamiento de dsRNAs, actuarán afectando la eficiencia de corte de DCL. Así, el factor DRB4 (dsRNA binding protein 4), que se requiere para el procesamiento de vsiRNAs mediado por DCL4, constituye la diana de varios supresores virales que se unen a él, inhibiéndolo. Como consecuencia de la interacción con este factor auxiliar de DCL4, se inhibe la formación de vsiRNAs de 21 nt (Hiraguri et al., 2005; Deleris et al., 2006; Haas et al., 2008; Qu et al., 2008; Shivaprasad et al., 2008). Otra estrategia que también resultaría en la interferencia de la acción de corte de DCL, es la utilizada por el dianthovirus (género Dianthovirus, familia Tombusviridae) Red clover necrotic mosaic virus (RCNMV). Así, la incorporación de DCL en el complejo de replicación de RCNMV conduciría a su inhibición (Takeda et al., 2005). Interacción con proteínas AGO El bloqueo de complejos RISC funcionales puede llevarse a cabo por medio de la unión directa a la unidad catalítica AGO (Zhang et al., 2006), su desestabilización o degradación (Pazhouhandeh et al., 2006; Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007). La primera proteína supresora en la que se describió la unión a AGO1 y AGO4 in vivo fue la proteína 2b del cucumovirus (género Cucumovirus, familia Bromoviridae) Cucumber mosaic virus (CMV) (Zhang et al., 2006; González et al., 2010; Hamera et al., 2012). Así, el que la interacción con AGO1 resulte en la inhibición de la actividad de corte de AGO1 (Zhang et al., 2006), sugiere que podría estar implicada en la prevención de la amplificación y dispersión de vsiRNAs (Zhang et al., 2006; Goto et al., 2007). Por su parte, la interacción con AGO4 que actúa uniendo siRNAs de 24-nt de origen endógeno que participan en RdDM, reduciría el acceso de los siRNAs a su diana Introducción 45 endógena, modulándose de este modo la transcripción de genes del huésped en beneficio del virus (Hamera et al., 2012). Por otra parte, la proteína supresora P0 de polerovirus (género Polerovirus, familia Luteoviridae), contiene un dominio tipo F-box, típico de factores celulares relacionados con la ubiquitinación y la degradación de proteínas, que tiene como diana AGO1 y cuyo papel sería promover su degradación (Pazhouhandeh et al., 2006; Baumberger et al., 2007; Bortolamiol et al., 2007; Csorba et al., 2010). En el caso del nepovirus (género Nepovirus, familia Secoviridae) Tomato ringspot virus (ToRSV), la proteína supresora CP se uniría a AGO1 promoviendo su degradación por autofagia (Karran y Sanfacon, 2014) y como consecuencia suprimiendo su actividad inhibidora durante la traducción. Por su parte, la proteína p25 del potexvirus (género Potexvirus, familia Flexiviridae) PVX también interacciona físicamente con AGO (AGO1, 2, 3, y 4), promoviendo su degradación a través de una ruta dependiente del proteosoma (Chiu et al., 2010). Estudios recientes han puesto de manifiesto la existencia de un nuevo tipo de interacción con AGO1 a través de repeticiones aminoacídicas del tipo GW/WG (glicina/triptófano). Este tipo de repeticiones son típicas de proteínas celulares que intervienen en el ensamblaje y/o funcionamiento de los complejos RISC (Karlowski et al., 2010), y los supresores que las contienen pueden interferir por competencia en la formación de novo de RISC o en su actividad (Azevedo et al., 2010; Giner et al., 2010). Además de estos dos primeros casos descritos para la proteína p38 del carmovirus TCV y la proteína P1 del ipomovirus (género Ipomovirus, familia Potyviridae) Sweet potato mild mottle virus (SPMMV), se ha descrito que esta estrategia es utilizada también por la proteína p37 del carmovirus Pelargonium line pattern virus (PLPV). En este caso, se ha demostrado que estos dominios GW además de implicados en la unión a AGO1, también lo están en la unión a siRNAs, siendo esenciales ambas actividades para que p37 pueda ejercer su actividad supresora (Pérez-Cañamás y Hernández, 2015). Resultados de este mismo trabajo también muestran que los dominios GW/WG de TCV p38, aparte de implicados en la interacción con AGO1 son necesarios para que se mantengan sus propiedades de unión tanto a siRNAs como a dsRNAs de tamaño largo. Estos resultados sugieren que ambas funciones podrían actuar de modo cooperativo; durante la interacción del supresor con AGO se incrementaría el secuestro de dúplex de siRNAs, interfiriendo de este modo con la actividad de RISC. Introducción 46 Modulación de la homeostasis de AGO1 Aunque recientemente descrito, este mecanismo de acción basado en la modulación de la expresión génica del huésped a nivel transcripcional, podría ser una estrategia ubicua en las interacciones virus-planta. AGO1, como se ha comentado anteriormente, es uno de los componentes más importantes de la ruta de silenciamiento implicado en defensa antiviral, cuya homeostasis depende de la expresión de miR168 (Rhoades et al., 2002). Resultados recientes muestran que durante la infección por tombusvirus se produce una inducción de la transcripción de AGO1 como parte del arsenal de respuestas antivirales de la planta. Para contrarrestar un mecanismo de defensa basado en AGO1, el supresor p19 promueve la inducción transcripcional de miR168, que resulta en la disminución de los niveles de expresión de AGO1 (Várallyay et al., 2010). Además de en la infección por tombusvirus, este fenómeno ha sido observado en el caso de otras infecciones virales (Du et al., 2011; Várallyay y Havelda, 2013). Interferencia en la amplificación de siRNA secundarios Las proteínas RDR del huésped, en especial RDR1 y RDR6, están implicadas en la amplificación del silenciamiento y en la dispersión de la señal sistémica del mismo mediante la síntesis de vsiRNAs (Schwach et al., 2005). Por tanto, la supresión de la actividad RDR puede constituir un punto clave donde actuar para el supresor, ya que interfiriendo en la amplificación del silenciamiento, la replicación y dispersión viral se verían favorecidas. Entre las proteínas supresoras que actúan en este punto encontramos la proteína V2 del geminivirus (género Begomovirus, familia Geminiviridae) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), que interacciona directamente con SGS3, el cofactor de RDR6, bloqueando de este modo la amplificación del silenciamiento (Glick et al., 2008). Estudios in vitro realizados con este mismo supresor han mostrado que V2 compite con SGS3 por dsRNAs que contengan extremos 5´ protuberantes, que podría constituir un intermediario de RDR6/SGS3 en la amplificación de vsiRNAs (Fukunaga y Doudna, 2009; Kumakura et al., 2009). De igual modo, la proteína TGBp1 de potexvirus inhibe la síntesis de dsRNA dependiente de RDR6/SGS3 (Okano et al., 2014). También, el supresor βC1, codificado por el DNA satélite de Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV) interacciona con el supresor endógeno rgsCaM, una proteína celular relacionada con la calmodulina, en N. benhamiana, reprimiendo la expresión de RDR6 y por tanto la producción de siRNAs secundarios (Li et al., 2014). Introducción 47 Ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana mostraron que los supresores HCPro del potivirus Sugarcane mosaic virus (SCMV) y 2b del cucumovirus Tomato aspermy virus (TAV), están implicados en la reducción de los niveles de acumulación de mRNA de RDR6 (Zhang et al., 2008). Del mismo modo, el supresor Pns10 del phytoreovirus (género Phytoreovirus, familia Reoviridae) Rice dwarf phytoreovirus (RDV) reduce los niveles de expresión de RDR6, favoreciendo la invasión viral de los ápices (Ren et al., 2010). También la proteína 2b de cucumovirus previene la dispersión de la señal de silenciamiento a larga distancia (Guo y Ding, 2002), inhibiendo la producción de siRNAs secundarios (Wang et al., 2010). Vemos por tanto que una actividad supresora centrada en RDR6, es una estrategia ampliamente utilizada por distintos virus que bloquea de un modo efectivo el silenciamiento antiviral. Como veremos más adelante, esta estrategia también parece ser utilizada por el supresor objeto de este estudio, la proteína p22 de ToCV. Interacción con reguladores endógenos de la ruta de silenciamiento Algunos supresores modulan una respuesta defensiva por parte de la planta basada en el silenciamiento por RNA, actuando sobre reguladores endógenos de la ruta de silenciamiento. Entre ellos encontramos a la proteína AL2 de geminivirus que inhibe a la enzima ADK (Adenosina kinase) (Wang et al., 2003), implicada en procesos de metilación. Ya que una parte de la respuesta defensiva contra estos virus implica la metilación de sus genomas, la inhibición de ADK, indirectamente, conseguiría bloquear el proceso de metilación (Wang et al., 2005). Ya que para este grupo de virus de DNA es muy importante evitar la metilación de sus genomas, la interacción e inhibición de otra enzima implicada en el ciclo de metilación como SAHH (S-adenosyl homocysteine hydrolase), sería el factor endógeno sobre el que actuaría el supresor βC1 codificado por el DNA satélite de Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV) (Yang et al., 2011). De manera interesante, la proteína de geminivirus mencionada en primer lugar, AL2, también actúa induciendo la expresión e interaccionando con la proteína celular rgs-CaM (Chung et al., 2014). Otro ejemplo de factor endógeno que parece ser diana de diversos supresores no relacionados, es el factor transcripcional inducible por etileno (RAV2) (Endres et al., 2010). En el caso del Papaya ringspot virus (PRSV) la proteína supresora HCPro interacciona con calreticulina modulando de este modo la respuesta defensiva antiviral a través de la ruta de señalización del calcio (Shen et al., 2010). Por su parte la proteína HCPro de los potyvirus Potato virus A (PVA), Potato virus Y (PVY) Introducción 48 y Tobacco etch virus (TEV) interacciona con una proteína asociada al microtúbulo (HIP2), a través de su región altamente variable (HVR). Así, mientras que la reducción de HIP2 está asociada con una disminución de los niveles de acumulación viral, mutaciones en el dominio HVR de HCPro provocan una inducción sistémica mediada por etileno y ácido jasmónico de genes de defensa de la planta y necrosis (Haikonen et al., 2013a,b). 2.4.3. Supresores virales como determinantes de patogenicidad. Sinergismo viral El que un virus sea capaz de replicarse en un huésped, no necesariamente va unido al hecho de que sea patogénico. La patogénesis tiene lugar cuando una infección viral afecta a la fisiología del huésped causando alteraciones en el desarrollo y otras manifestaciones fenotípicas, que son consideradas como síntomas de la enfermedad (Culver y Padmanabhan, 2007; Pallás y García, 2011; Mandadi y Scholthof, 2013; García y Pallás, 2015). Como hemos visto, los virus, para infectar con éxito una planta, deben hacer frente a una repuesta defensiva basada en el silenciamiento por RNA, proceso que además de funcionar como defensa antiviral está implicado en la regulación de diversos procesos celulares. Para ello, la estrategia más comúnmente utilizada es la de codificar en su genoma proteínas supresoras del silenciamiento (Li y Ding, 2006). Estos supresores, además de funcionar en defensa antiviral, pueden interferir en procesos fisiológicos de la planta que dependen del silenciamiento por RNA, y esta interferencia contribuir a la patogénesis. Así, muchos supresores virales suelen ser considerados como los principales determinantes de patogenicidad tanto en infecciones simples como en infecciones mixtas sinérgicas. Una de las rutas endógenas de silenciamiento por RNA en planta que más frecuentemente se ve afectada es la de los miRNAs. Como hemos visto, los miRNAs regulan negativamente mRNAs que codifican importantes factores reguladores implicados en procesos de desarrollo, homeostasis de nutrientes y respuestas a estrés (Pasquinelli y Ruvkun, 2002; Carrington y Ambrós, 2003; Zhang et al., 2010). Es por tanto concebible que los supresores puedan ocasionar alteraciones en el desarrollo de procesos, tales como la división celular, la formación de hojas y el desarrollo de la flor, mediante la interferencia en la expresión y la función de los miRNAs, y que estas interferencias puedan resultar en el desarrollo de síntomas de enfermedad (Kasschau et al., 2003). De acuerdo con esto, plantas transgénicas que expresan proteínas supresoras Introducción 49 de silenciamiento, a menudo muestran fenotipos similares a los síntomas virales (Chapman et al., 2004; Chellapan et al., 2005; Jay et al., 2011). Muchos de los supresores de silenciamiento que actúan secuestrando vsiRNAs, pueden interferir en estas rutas endógenas inhibiendo su papel regulador. Como ejemplo encontramos el caso del miRNA167 que resulta en la alteración de la regulación de su diana AUXIN RESPONSE FACTOR 8, y que parece ser especialmente relevante, ya que es el principal factor implicado en la alteración del desarrollo causada por al menos tres proteínas supresoras, HCPro de potyvirus, p19 de tombusvirus y p15 de pecluvirus (género Pecluvirus, familia Virgaviridae) (Jay et al., 2011). También los genes R del tipo NBS-LRR están regulados negativamente por miRNAs para evitar que una expresión incontrolada dispare reacciones autoinmunes deletéreas. Es posible, por tanto, que la inactivación de esos miRNAs por los supresores resulte en un aumento de los niveles de expresión de los genes R causando síntomas de enfermedad como la necrosis letal (Weber et al., 2004; Wang et al., 2012; Shivaprasad et al., 2012). La unión e inactivación de otros componentes de la ruta de silenciamiento como las proteínas AGO, estrategia comúnmente utilizada por las proteínas supresoras, puede también producir alteraciones en el desarrollo, como es el caso de la proteína 2b de CMV (Zhang et al., 2006) y de la proteína TGBp1 del carlavirus (género Carlavirus, familia Flexiviridae) Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV) (Okano et al., 2014). Es importante remarcar que los supresores pueden producir efectos patogénicos que no dependen directamente de su capacidad para suprimir el silenciamiento (Du et al., 2014). Como ejemplo podemos citar, en el caso de geminivirus, el de la proteína supresora βC1 codificada por el DNA satélite asociado con TYLCCV, y el de la proteína C2 que actúan inhibiendo la ruta del ácido jasmónico (Yang et al., 2008; Lozano-Durán et al., 2011). Otros ejemplos de interacción de supresores con factores del huésped que pueden tener un impacto en patogénesis viral son los propuestos para la interacción de la proteína supresora p6 del caulimovirus (género Caulimovirus, familia Caulimoviridae) Cauliflower mosaic virus (CaMV) con componentes implicados en la ruta de señalización del etileno (Geri et al., 2004), el de la interacción del supresor 2b de CMV con una catalasa del huésped (Inaba et al., 2011) o el de la interacción del supresor HCPro de PVA con la proteína asociada al microtúbulo HIP2 (Haikonen et al., 2013b). También, una función incorrecta del proteosoma como consecuencia de la interacción con el supresor HCPro podría considerarse como otro factor que contribuye Introducción 50 al incremento de la patogenicidad asociado a la actividad de una proteína supresora (Pacheco et al., 2012). Dada la importancia de la supresión del silenciamiento por RNA para la supervivencia viral, es razonable considerar que los supresores virales podrían ser diana de mecanismos de defensa alternativos que podrían causar importantes síntomas de enfermedad (Pallás y García, 2011; Wang et al., 2012; García y Pallás, 2015). De hecho, algunos supresores como la proteína p6 de CaMV en Nicotiana cleveladii, (Kiraly et al., 1999), la proteína p19 de TBSV (Chu et al., 2000) y 2b de TAV (Li et al., 1999) en tabaco, o la proteína CP de TCV en A. thaliana (Ren et al., 2000), han sido descritas como inductoras de respuestas necróticas locales o sistémicas similares a las mediadas por los genes R. También la proteína HCPro de TEV induce una débil respuesta específica que estimula la resistencia de la planta frente a diversos patógenos (Pruss et al., 2004). Aunque ninguna de estas respuestas es capaz de bloquear completamente la infección viral, son capaces de condicionar el desarrollo de síntomas. Ya que diferentes supresores de silenciamiento actúan con mecanismos distintos afectando a diversas etapas de la ruta de silenciamiento por RNA, no es sorprendente que en infecciones donde virus de diferentes familias se mezclan se produzca una acentuación de la sintomatología, pudiendo alcanzarse mayores niveles de acumulación viral que en infecciones individuales. Este fenómeno es conocido como sinergismo viral. La mayoría de los estudios de sinergismo viral implican a un virus del género Potyvirus. Entre ellos, el caso mejor estudiado es el de la interacción PVX-PVY en Nicotiana tabacum, donde se produce tanto una acentuación de la sintomatología como un incremento en los niveles de acumulación de PVX (Vance et al., 1991; Pruss et al., 1997; González-Jara et al., 2004). El incremento en la patogenicidad observado cuando el supresor HCPro fue expresado a partir de un virus heterólogo, mostró que ésta era la secuencia implicada en la interacción sinérgica (Pruss et al., 1997). Sin embargo, cuando el huésped utilizado fue N. benthamiana no se observó un incremento en los niveles de acumulación de PVX en plantas co-infectadas con los potyvirus PVY, TEV o Plum Pox virus (PPV), a pesar de los severos síntomas observados, donde la aparición de lesiones necróticas sistémicas en hojas y tallos, acababa con la muerte de la planta (González-Jara et al., 2004, 2005). Así, se ha sugerido que el sinergismo entre PVX y potyvirus es dependiente de huésped (González-Jara et al., 2004). De hecho, un reciente estudio en este mismo sistema, ha propuesto cual podría ser el mecanismo implicado en esta interacción sinérgica. De este modo se ha visto que la presencia del potyvirus, Introducción 51 aunque no produce ningún efecto a nivel del RNA genómico de PVX, ayuda a la estabilización de los RNAs subgenómicos permitiendo que se alcance un nivel umbral de expresión de la proteína p25 de PVX, que sería de este modo reconocida por un posible gen R presente en N. benthamiana. Este reconocimiento es el que dispararía la respuesta que desencadenaría los síntomas observados de necrosis sistémica (Aguilar et al., 2015). De modo general, en las múltiples interacciones sinérgicas descritas en las que un potyvirus está implicado, los niveles de acumulación de potyvirus tales como PVY, TEV, Tobacco vein mottling virus (TVMV), Zuchini yellow mosaic virus (ZYMV), Pepper mottle virus (PepMoV) o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), no se ven afectados, mientras que los del virus heterólogo aumentan (Vance et al., 1995; Pruss et al., 1997; Murphy y Bowen, 2006; Taiwo et al., 2007; Zeng et al., 2007; Fukuzawa et al., 2010). La capacidad que tienen los virus de planta de causar infecciones sinérgicas en diferentes cultivos, tiene implicaciones biológicas, epidemiológicas y económicas. El incremento de la multiplicación de uno o ambos virus implicados, puede alterar la gama de huéspedes o la tasa de transmisión por vectores (Elena, 2011), con las impredecibles consecuencias que ello ocasionaría. Como ejemplo encontramos el caso de la rotura de resistencia observada en plantas de tomate coinfectadas con ToCV y el tospovirus Tomato spotted wild virus (TSWV) (García-Cano et al., 2006), el de CMV en plantas de pepino co-infectadas con ZYMV (Wang et al., 2004) y el de un número de virus de batata simultáneamente infectada con el crinivirus SPCSV (Karyeija et al., 2000: Mukasa et al., 2006; Untiveros et al., 2007). A pesar de las serias implicaciones biológicas y epidemiológicas que tienen estas interacciones sinérgicas, los mecanismos moleculares implicados en las mismas apenas se conocen. 3. Familia Closteroviridae 3.1. Características generales La familia Closteroviridae comprende virus filamentosos con genomas de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva que presentan el mayor tamaño y complejidad entre los virus de RNA de plantas. Los virus de esta familia están limitados principalmente a floema y solo en algunos casos pueden infectar el mesófilo y la epidermis (Esau, 1960; Esau y Hoefert, 1971; Medina et al., 1998, 1999; Karasev, 2000). Esta limitación se ve reflejada en un bajo rendimiento en la purificación viral, lo Introducción 58 Figura 7. Organización genómica de los miembros de los géneros de la familia Closteroviridae, en los cuales han sido descritos supresores de silenciamiento. BYSV, Beet yellow stunt virus; BYV, Beet yellows virus; GLRaV-2, Grapevine leafroll-associated virus-2K; CTV, Citrus tristeza virus; GLRaV-3, Grapevine leafroll-associated virus-3K; CYSDV, Cucurbir chlorotic yellows virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic stunt virus; ToCV, Tomato chlorosis virus; LCV, Lettuce chlorosis virus; LIYV, Lettuce infectious yellows virus (adaptado de Dolja et al., 2006). Las secuencias de los extremos 5´ y 3´ no codificantes (untranslated regions, UTRs) contienen elementos reguladores que actúan en cis, implicados en el inicio de la síntesis de las cadena negativas y positivas genómicas y de los RNAs subgenómicos. También controlan el inicio de la traducción, el ensamblaje del virión, la regulación de Introducción 59 la expresión génica, el movimiento dentro del huésped (Duggal et al., 1994; Buck, 1996; Turner y Buck, 1999; Miller y Koev, 2000; Dreher y Miller, 2006). La región del extremo 3´-UTR está implicada en el inicio de la replicación del RNA viral, conteniendo los motivos y estructuras implicados en distintas funciones relacionadas con la síntesis de la cadena de polaridad negativa (Dreher, 1999). A diferencia de otros virus de plantas, en el extremo 3´ de los miembros de la familia Closteroviridae no se han identificado estructuras similares a las presentes en mRNAs eucariotas, como son las colas poli-A o plegamientos semejantes a los que adoptan los RNAs transferentes. En el caso de CTV, esta región está altamente conservada en todos los genotipos caracterizados y se han identificado una serie de estructuras en horquilla implicadas en la replicación (López et al., 1998; Satyanarayana et al., 2002a). En la mayoría de los crinivirus caracterizados se han descrito estructuras similares en el extremo 3´-UTR consistentes en cuatro estructuras en horquilla y uno o dos pseudonudos (Kreuze et al., 2002; Livieratos et al., 2004; Lozano, 2007). Este extremo estaría implicado, además de en el inicio de la síntesis de la cadena negativa, en la estabilidad, ensamblaje y traducción del RNA (Dreher, 1999). Aunque las secuencias de los extremos 5´-UTR están implicadas en distintos procesos del ciclo viral, la información disponible sobre los elementos reguladores es escasa. Por analogía con los elementos descritos en el extremo 3´ de la cadena positiva, las estructuras del extremo 3´ de la cadena negativa (complementaria al extremo 5´ de la positiva) deben actuar como promotores de la síntesis de la cadena positiva (Guan et al., 1997; Sivakumaran y Kao, 1999; Nagy y Pogani, 2000; Panavas y Nagy, 2003; Panavas et al., 2003). En CTV se ha demostrado la implicación de las estructuras secundarias predichas en este extremo en la replicación y se ha sugerido que contengan señales para el inicio del ensamblaje del virión (Gowda et al., 2003a; López et al., 1998). 3.3. Mecanismo de expresión génica Los genomas de virus de RNA de cadena sencilla, lineal y polaridad positiva, pueden ser utilizados directamente como mRNA y a su vez servir como moldes para la síntesis de la cadena de polaridad negativa que se genera como intermediario durante la replicación viral. Los closterovirus utilizan principalmente tres mecanismos para regular su expresión génica: i) procesamiento proteolítico para la expresión de la poliproteína codificada por el ORF1a, ii) desplazamiento de la pauta de lectura del ribosoma en un Introducción 60 nucleótido (+1 ribosomal frameshift) para la expresión de la RdRp codificada por el ORF1b, y iii) producción de sgRNAs 3´ co-terminales para la expresión de los genes que se encuentran en la mitad 3´ del genoma de closterovirus y ampelovirus o en el RNA2 (y RNA3) de crinivirus (Dolja et al., 2006; Dolja, 2003). Esta combinación tan compleja de estrategias no se ha descrito en ningún otro grupo de virus de plantas (Koonin y Dolja, 1993). El ciclo de replicación se inicia con la traducción de los ORFs 1a y 1ba partir del gRNA en dos poliptoteínas, una que contiene los dominios MET y HEL y otra que posee además función RNA polimerasa dependiente de RNA (Agranovsky et al., 1994; Karasev et al., 1995). A continuación se sintetizará una cadena de RNA complementaria de polaridad negativa que será utilizada como molde para generar tanto las nuevas moléculas de RNA de polaridad positiva que constituyen el genoma viral, como los sgRNAs 3´ co-terminales. En el caso de CTV se ha demostrado que la producción de los sgRNAs permite la regulación de la expresión de cada gen de forma independiente, tanto en tiempo como en cantidad (Navas-Castillo et al., 1997). Además, se han localizado en el RNA genómico las secuencias reguladoras (elementos controladores) de la expresión de cada sgRNA en posición 5´ con respecto a su inicio de transcripción (Gowda et al., 2001; Ayllón et al., 2003). Se ha propuesto que los elementos controladores podrían funcionar como promotores internos durante la generación de cadenas de polaridad positiva, usando como molde el RNA genómico de polaridad negativa y/o actuar como terminadores durante la síntesis de cadenas de polaridad negativa del RNA genómico. Además de las cadenas de polaridad positiva y negativa de los sgRNAs 3´ co-terminales, los elementos controladores correspondientes a cada uno de los ORFs, genera un reducido set de sgRNAs 5´ co-terminales de polaridad positiva (Gowda et al., 2001). En células infectadas con CTV, además de este set de RNAs se han detectado RNAs de tamaño pequeño de cadena sencilla y polaridad positiva (low molecular-weight tristeza, LMTs), de alrededor de 850 (LMT1) y (LMT2) nucleótidos, correspondientes al extremo 5´ del RNA viral y cuya función biológica es desconocida (Che et al., 2001; Gowda et al., 2003b, 2009). Por tanto, como resultado del proceso de replicación, CTV produce una gran cantidad de especies de RNAs virales en la célula infectada. La proporción de cadenas positivas y negativas correspondientes al RNA total (RNA genómico y sgRNAs) es aproximadamente de 40 o 50 a 1, estando dentro del rango encontrado para la mayoría de virus de RNA de polaridad positiva (Satyanarayana et al., 2002b). Sin embargo, durante la replicación de CTV la Introducción 61 proporción de cadenas positivas y negativas de RNA genómico es sólo de entre 10 y 20 veces mayor, un valor bajo comparado con las proporciones observadas durante la replicación de otros virus de RNA. Esta acumulación asimétrica está controlada por la proteína p23 (Satyanarayana et al., 2002b). La expresión del genoma de CTV, donde potencialmente se producen hasta 19 proteínas virales distintas, es similar a la descrita para los coronavirus (Karasev et al., 1997). 3.4. Ciclo de infección de los closterovirus La mayoría de los virus de esta familia son inoculados en planta mediante un insecto vector (Karasev, 2000). El inicio del ciclo de replicación requiere la desencapsidación de la partícula viral, seguido de la traducción del genoma viral. La poliproteína traducida es procesada suministrando los componentes proteasa y replicasa que formarán los complejos de replicación asociados a las membranas del retículo endoplasmático. A continuación se sintetizará la cadena negativa del RNA genómico que será utilizada para la síntesis tanto de las cadenas positivas del genoma como de los sgRNAs, La producción de sgRNAs está regulada de un modo preciso para optimizar los distintos eventos del ciclo de infección viral. Así, los sgRNAs que codifican para proteínas supresoras de silenciamiento génico son producidos tempranamente para poder contrarrestar una respuesta defensiva por parte de la planta. La traducción de los genomas sintetizados resultará en la proliferación de los complejos de replicación e irán acoplados al ensamblaje de los viriones al acumularse las proteínas estructurales (Dolja et al., 2006). Los viriones realizan el movimiento célula a célula a través de los plasmodesmos y el sistémico a través del floema. El movimiento de los viriones dentro de la célula se realizaría gracias a la capacidad de la proteína Hsp70h, presente en la cola, de interaccionar con los microfilamentos de actina y transportar a los viriones hacia los plasmodesmos, de manera que este movimiento sería direccional, quedando las colas insertadas en los canales de los plasmodesmos (Medina et al., 1999); Prokhnevsky et al., 2005). Se ha propuesto que los viriones se desencapsidan al atravesar estos canales, lo que permite que los ribosomas se unan a los extremos 5´ desnudos al entrar en la nueva célula, comenzando así inmediatamente el proceso de traducción (Dolja et al., 2006). El ciclo de expresión génica y replicación, ensamblaje del virión y movimiento célula a célula dura aproximadamente un día (Dolja et al., 2006) y se repite hasta que la Introducción 62 infección alcanza las células acompañantes que tienen conexión a través de los plasmodesmos con los elementos cribosos, lo que permite al virus ser transportado gracias a la corriente del floema a largas distancias hasta llegar a los órgano sumidero (tallos, hojas y raíces). El establecimiento de la infección sistémica supone al menos dos semanas para las especies que infectan plantas herbáceas y hasta varios meses para las de huéspedes leñosos (Dolja et al., 2006). El secuestro masivo del retículo endoplasmático suele causar citotoxicidad, que se manifiesta como aclaramiento de las venas, amarilleo y enrollado de las hojas, y marchitamiento (Dolja et al., 2006). Los supresores de silenciamiento génico codificados por el genoma viral también contribuyen al fenotipo de la enfermedad al interferir con procesos del desarrollo de la planta (Dolja et al., 2006). 3.5. Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae Se ha postulado que la línea monofilética de los closterovirus desciende de un virus vegetal perteneciente a la superfamilia de virus α cuyo genoma codificaba una proteína con actividad replicasa típica con los dominios MET-HEL-RdRp, una pequeña proteína hidrofóbica de movimiento y una única proteína CP formadora de cápsidas filamentosas (Dolja et al., 2006). Este progenitor dio lugar al último ancestro común de los closterovirus al adquirir varios genes nuevos, como el dominio PRO y el tramo situado entre los dominios HEL y MET. A su vez, la proteína Hsp70h pudo ser incorporada mediante recombinación con un RNA mensajero celular y la proteína p59 se originaría por duplicación del gen CP. La co-evolución de Hsp70h y p59 dio como resultado a un prototipo de cola en el virión que favorecía el movimiento célula a célula en este genoma expandido a partir del closterovirus ancestral. Ya que todos los closterovirus son transmitidos por insectos, parece razonable pensar que el ancestro de los closterovirus probablemente sería también transmitido por insectos. Las tres líneas actuales de closterovirus evolucionaron por adaptación a los distintos tipos de insectos vectores (Karasev, 2000). Las proteínas CPm se originaron en este momento a partir de la duplicación y divergencia de la CP. El hecho de que el orden de los genes CP y CPm sea diferente en el género Closterovirus versus los géneros Ampelovirus y Crinivirus es compatible con este escenario. Los dos últimos géneros podrían haberse generado independientemente a partir del ancestro común de la familia. Alternativamente, los crinivirus podrían haber evolucionado a partir de la división en dos segmentos del Introducción 63 genoma monopartito de un ampelovirus. El mismo orden de los genes CP y CPm y el mayor tamaño de la CPm en ampelovirus y crinivirus comparado con los closterovirus son compatibles con este último escenario. Seguidamente, se incorporaron algunos genes adicionales específicos y conservados dentro de cada género. Un ejemplo es el del gen que codifica la proteína p21 supresora de silenciamiento génico en los virus del género Closterovirus. Otro ejemplo es el de los genes que codifican las proteínas p9 y p26 en el género Crinivirus. El género Ampelovirus es el que presenta la mayor variación genética dentro de la familia. Aunque los módulos de replicación y de ensamblaje y movimiento están presentes en todos los miembros de este género, es frecuente encontrar genes adicionales únicos o cambios en el orden de los genes (Theilmann et al., 2002). De igual manera, algunas de las especies virales adquirieron nuevos genes únicos. Por ejemplo, los genes de CTV que codifican las proteínas p33, p18, p13 y p23 no tienen homólogos en BYV o ningún otro miembro del género (Pappu et al., 1994). Parece que la inusual plasticidad genética de los closterovirus, frente a la mayor conservación del genoma de virus de RNA más pequeño, está condicionada por la expansión de su genoma, lo que les permite una mayor capacidad de adaptación a nuevos nichos, ya sean huéspedes, vectores o condiciones medioambientales cambiantes. 3.6. Supresores del silenciamiento génico en la familia Closteroviridae En los genomas de miembros de los tres géneros de la familia Closteroviridae se han identificado genes que codifican proteínas supresoras de silenciamiento (Figura 6). Los miembros del género Closterovirus BYV, BYSV y GLRaV-2 codifican en el extremo 3´ de sus genomas proteínas tipo p21 (p21-like) que presentan una actividad supresora similar (Reed et al., 2003; Chiba et al., 2006). En el caso de BYV, se ha demostrado que la proteína supresora p21 une miRNAs y siRNAs de doble hebra (Chapman et al., 2004). El mecanismo de acción de p21 sería similar al descrito para la proteína supresora p19 del tombusvirus Tomato bushy stunt virus (Silhavy y Burgyan, 2004); ambas proteínas secuestrarían siRNAs y/o miRNAs previniendo su incorporación al complejo RISC. Ya que estos supresores no pueden discriminar entre vsiRNAs y siRNAs y miRNAs endógenos implicados en la regulación del desarrollo de la planta, la acumulación de p21 y p19 induce anormalidades que se asemejan a los síntomas de la infección viral (Chapman et al., 2004). CTV, miembro del género Introducción 64 Closterovirus, codifica en el extremo 3´ de su genoma hasta tres proteínas con actividad supresora que presentan distintos mecanismos de acción, la p20, la CP y la p23 (Lu et al., 2004). p23 aunque es un fuerte supresor a nivel intracelular, no es capaz de prevenir el silenciamiento a nivel intercelular (Lu et al., 2004). El análisis de secuencia de la proteína p23 muestra la existencia de una posible estructura en dedo de Zinc, que además contiene el dominio de unión a RNA de esta proteína (López et al., 2000). La proteína p23 controla la acumulación asimétrica de los RNAs de CTV, dando lugar a una disminución de los niveles de acumulación de moléculas de RNA de polaridad negativa, y facilitando indirectamente la expresión de los genes codificados en el extremo 3´ del genoma (Satyanarayana et al., 2002b). Por otra parte, mientras que la proteína CP es un fuerte supresor de silenciamiento a nivel intercelular, la proteína p20 suprime el silenciamiento tanto a nivel intracelular como intercelular (Lu et al., 2004). Por tanto vemos que, probablemente debido al largo tamaño y/o complejidad del genoma, CTV ha desarrollado un complejo sistema de supresión de silenciamiento con tres componentes que tienen como diana distintos puntos de la cascada de silenciamiento (Dolja et al., 2006). En el caso del género Ampelovirus, se ha descrito función supresora del silenciamiento para la proteína p19.7 de GLRaV-3, codificada en el extremo 3´ del genoma viral (Gouveia et al., 2012). p19.7 comparte algunas propiedades con las proteínas supresoras tipo p21 de la familia Closteroviridae, tal como la habilidad de suprimir el silenciamiento inducido por inductores fuertes (Reed et al., 2003; Chiba et al., 2006). Sin embargo, al contrario de lo observado con la proteína p21 de BYV, la presencia de p19.7 está asociada con una clara disminución de los niveles de acumulación de siRNAs, lo que sugiere que actúa antes o en el punto de acción de corte mediado por Dicer. p19.7 también suprime el silenciamiento sistémico (Gouveia et al., 2012). Estudios comparativos de la actividad supresora de variantes de la proteína p19.7 de aislados de GLRaV-3 provenientes de distintos grupos filogenéticos mostraron que la actividad supresora difería entre grupos. El análisis de las secuencias de p19.7 mostró que estas diferencias en la actividad supresora podrían estar asociadas a ciertos cambios aminoacídicos (Gouveia y Nolasco, 2012). En el género Crinivirus, SPCSV dispone de un sistema único de supresión del silenciamiento, en el que dos proteínas independientes funcionan de forma cooperativa. Estas dos proteínas, codificadas en el extremo 3´ del RNA1 viral, son una endonucleasa específica de RNA de doble hebra, la RNasa III, y la proteína p22 (Kreuze et al., 2005). Introducción 65 Así, aunque p22 suprime de un modo eficiente el silenciamiento inducido por RNA de doble hebra, su acción supresora se ve incrementada de forma acusada en presencia de RNasa III (Kreuze et al., 2005). La proteína RNasa III es similar a las proteínas homólogas de planta y probablemente fue adquirida mediante un proceso de recombinación con los genes del huésped. Esta proteína, para ejercer su actividad supresora requiere su actividad endonucleasa intacta (Kreuze et al., 2005; Cuellar et al., 2009), llevando a cabo la degradación de RNAs de doble hebra in vitro tanto de tamaño largo como corto (Weinheimer et al., 2015). Curiosamente, trabajos posteriores a la descripción de la presencia de ambos supresores en SPCSV, mostraron que la mayoría de los aislados de este virus carecían del gen que codifica la proteína p22 (Cuellar et al., 2008). Este hecho parece indicar que la adquisición del gen p22 probablemente ha sido reciente. Los genomas de los crinivirus CYSDV y LCV también codifican proteínas con actividad supresora en el extremo 3´ del RNA1, las proteínas p25 y p23, respectivamente (Kataya et al., 2009; Chen et al., 2012). Así, la proteína p25 de CYSDV suprime el silenciamiento a nivel local inducido tanto por RNA de cadena sencilla como doble, pero no es capaz de suprimir el movimiento de la señal de silenciamiento, mientras que la proteína p23 de LCV es muy eficiente suprimiendo la señal de silenciamiento sistémica pero muy débil como supresor a nivel local (Kataya et al., 2009; Chen et al., 2012). Por último, el crinivirus ToCV, al igual que en el caso del closterovirus CTV, ha adoptado la estrategia de codificar en su genoma hasta tres proteínas con actividad supresora, siendo hasta el momento el único crinivirus en el que se han descrito proteínas con actividad supresora en ambas moléculas de RNA (Cañizares et al., 2008). Mientras que el extremo 3´ del RNA1 codifica una proteína cuya función parece ser específicamente la de suprimir el silenciamiento, la proteína p22, en el RNA2 funcionan como proteínas supresoras las proteínas estructurales CP y CPm. Estudios con la proteína supresora CP, han mostrado que interacciona con la proteína de la planta S-adenosil homocisteina hidrolasa (SAHH) (Cañizares et al., 2013), implicada en el ciclo de metilación, aunque el papel de esta interacción en supresión de silenciamiento no es conocido. En el caso de p22, se ha descrito que suprime de un modo muy eficiente el silenciamiento inducido tanto por RNA de cadena sencilla como de cadena doble a nivel local, estando su presencia asociada a una drástica reducción en los niveles de acumulación de sRNAs (Cañizares et al., 2008). En esta tesis se pretende profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de este interesante supresor. Introducción 66 4. Tomato chlorosis virus (ToCV) 4.1. Propiedades biológicas y modo de inoculación ToCV es el principal virus causante de la enfermedad del amarilleo del tomate. Los síntomas causados por ToCV consisten en manchas cloróticas irregulares que evolucionan hacia una clorosis internervial que aparece inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extiende hacia la parte superior de la planta. A veces aparecen manchas de color púrpura y necrosis. Las hojas viejas se enrollan longitudinalmente y adquieren textura quebradiza. La producción puede verse disminuida debido a la reducción de la capacidad fotosintética de las plantas afectadas. En ocasiones se observa una reducción en el número y tamaño de los frutos (Wisler et al., 1998a), así como aborto floral y falta de cuajado de frutos o retraso en la maduración y falta de coloración adecuada de los mismos (Lozano et al., 2006b). El síndrome de amarilleo causado por ToCV puede ser confundido con desórdenes fisiológicos o nutricionales e incluso con fitotoxicidad por pesticidas (Wisler et al., 1998b) (Figura 8). A B Figura 8: Síntomas de amarilleo en plantas de tomate causadas por la infección por Tomato chlorosis virus. Planta de tomate infectada por amarilleo (derecha) junto a una planta asintomática (izquierda) (A). Amarillero en hojas de una planta de tomate infectada (B). Además de tomate, ToCV infecta de manera natural otras especies de la familia Solanaceae, como pimiento y patata (Lozano et al., 2004; Barbosa et al., 2010; Fortes et al., 2012; Fortes y Navas-Castillo, 2012; Freitas et al., 2012), así como algunas malas hierbas de las familias Chenopodiaceae y Compositae (Wintermantel y Wisler, 2006). La gama de huéspedes experimentales de ToCV es más amplia, comprendiendo más de 30 especies pertenecientes a 13 familias, incluyendo algunos cultivos importantes, Introducción 67 plantas ornamentales y malas hierbas (Morris et al., 2006; Trenado et al., 2007; Wintermantel y Wisler, 2006). Los síntomas producidos por ToCV varían dependiendo del huésped pero normalmente consisten en un amarilleo internervial y síntomas similares a los producidos en tomate (Wintermantel y Wisler, 2006). ToCV se transmite de manera semipersistente por las especies de mosca blanca B. tabaci, T. vaporariorum y T. abutilonea (Figura 9). En este tipo de transmisión, ToCV, que está restringido al floema, sería adquirido durante la alimentación y se retendría en el canal alimenticio. En los procesos de ingestión-regurgitación realizado por la mosca blanca (Harris, 1996) el virus pasaría de nuevo a la planta para así ser transmitido. Aunque ToCV puede ser retenido en el vector durante días, la capacidad de transmisión disminuye considerablemente tras los dos días de adquisición (Wisler et at., 1998a). Se han estudiado las características de la interacción de ToCV con las diferentes moscas blancas y se ha visto que la eficiencia en la transmisión así como la persistencia del virus en el vector varía según el tipo de mosca (Wintermantel y Wisler, 2006). Existe poca información acerca de los determinantes virales de los miembros de la familia Closteroviridae implicados en la transmisión por vectores. Los trabajos llevados a cabo hasta el momento indican que la proteína CPm del crinivirus Lettuce infectious yellows virus (LIYV) estaría implicada en el proceso de transmisión (Tian et al., 1999; Stewart et al., 2010) y que la clave de la especificidad de vector podría estar en las diferencias encontradas en la secuencia de esta proteína entre las distintas especies virales. También se ha sugerido que la proteína CPm de los closterovirus Beet yellows virus (BYV) y Citrus tristeza virus (CTV) estarían implicadas en la transmisión por pulgones (Agranovsky et al., 1995; Febres et al., 1996). Figura 9: Especies de mosca blanca: Bemisia tabaci (A), Trialurodes vaporarirum (B) y T. abutiloneus (C). El hecho de que ToCV sea un virus limitado a floema y que no se pueda transmitir de manera mecánica, ha hecho que la transmisión de este virus se pudiera Objetivos 75 La infección por virus de plantas puede ir asociada al desarrollo de enfermedades que pueden ocasionar una disminución en el rendimiento y la calidad de los cultivos. Un profundo conocimiento del virus y de cómo interacciona con su huésped es esencial para poder diseñar estrategias de control efectivas que minimicen el daño causado por el mismo. El objetivo general de este trabajo ha sido el estudio del papel de una proteína viral esencial para poder contrarrestar una respuesta defensiva por parte de la planta basada en el silenciamiento por RNA, la proteína supresora de silenciamiento p22 del crinivirus Tomato chlorosis virus (ToCV). Este objetivo general se ha abordado mediante los siguientes objetivos parciales que se corresponden con cada uno de los capítulos en los que se ha estructurado esta tesis: 1. Estudio de la diversidad genética de la proteína p22 de aislados de ToCV de tomate y pimiento, y análisis de la actividad supresora de silenciamiento de proteínas p22 pertenecientes a grupos filogenéticos distintos. 2. Estudio del mecanismo de acción de la proteína supresora de silenciamiento p22de ToCV fuera de su contexto viral. 3. Estudio del papel de la proteína p22 en el proceso de infección viral mediante la creación de un mutante de deleción de ToCV, en plantas de Nicotiana benthamiana tanto silvestres como defectivas para la expresión de RDR6. 4. Estudio del efecto sinérgico de la expresión heteróloga de la proteína p22 de ToCV a partir de los virus Tobacco rattle virus y Potato virus X. Objetivos 76 CAPÍTULO I Capítulo I 79 Genetic diversity and silencing suppression activity of the p22 protein of Tomato chlorosis virus isolates from tomato and sweet pepper Yazmín M. Landeo-Ríos, Jesús Navas-Castillo, Enrique Moriones, M. Carmen Cañizares Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”- Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”, 29750 AlgarroboCosta, Málaga, Spain. Virus Genes 51, 283-289 (2015) ABSTRACT As for other bipartite criniviruses (genus Crinivirus, family Closteroviridae), the genome of Tomato chlorosis virus encodes an RNA silencing suppressor, the protein p22, in the 3´-proximal region of RNA1. This protein has been reported as having one of the longest lasting local suppressor activities when transiently expressed in Nicotiana benthamiana. Here, we examined the genetic diversity of the p22 gene in ToCV isolates from tomato and sweet pepper. The p22 gene sequences clearly grouped into two separated clades. However, functional analysis of both types of p22 proteins indicated no evident differences in suppressor activity. Our findings provide experimental evidence that the presence of a “strong” silencing suppressor is a conserved feature of ToCV isolates. Capítulo I 80 Capítulo I 81 INTRODUCTION RNA silencing is a conserved sequence specific RNA mediated mechanism of gene regulation that also works as an antiviral defence [1]. It is induced by doublestranded RNA (dsRNA) which is processed into small RNA species of 21-24 nucleotides [2] that serve as guides for cleavage of RNA molecules. Plant viruses encode proteins that can act as silencing suppressors by operating at different steps of the RNA silencing pathway to counteract this antiviral mechanism [3, 4]. The viral suppressor proteins exhibit a great diversity in sequence, structure and mechanism of action. Thus, while some plant viruses have delegated the suppressor functions to replication, structural or transport proteins, other viruses encode dedicated suppressor proteins without homologous relationship to any other viral or host proteins [5]. Most of the viral RNA silencing suppressors identified so far also exhibit properties such as the enhancement of virus accumulation and pathogenicity [6, 7]. Therefore, the study of viral suppressors might be important to understand the mechanisms of viral infection. Tomato chlorosis virus (ToCV, genus Crinivirus) is a member of the family Closteroviridae, a family in which the largest RNA genomes among plant viruses are found [5]. In this family, a high level of variability in gene content has been reported at the 3´-proximal genomic region of the monopartite genomes of viruses from the genera Closterovirus and Ampelovirus and at the 3´-end of RNA1 of viruses from the mostly bipartite genus Crinivirus [5]. Interestingly, some of the genes located in the 3´-region encode RNA silencing suppression proteins [8-13] that can be crucial for virus pathogenicity [14]. The heterogeneity in this 3´-proximal region can be exemplified by the crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV), with isolates with or without the p22 RNA silencing suppressor [15, 16]. The crinivirus ToCV is the causal agent of a “yellow leaf disorder” that affects tomato (Solanum lycopersicum L.) [17, 18] and sweet pepper (Capsicum annuum L.) [19, 20], among others. ToCV is transmitted in nature by the whitefly (Hemiptera: Aleyrodidae) Bemisia tabaci and has a bipartite single-stranded, positive-sense RNA genome [17], in which the RNA1 encodes proteins involved in viral replication and the RNA2 encodes proteins involved in encapsidation, movement, and host transmission. As for other members of this complex family, ToCV adopts the strategy of encoding multiple RNA silencing suppressors [12], the coat protein (CP) and minor coat protein (CPm) in RNA2, and the p22 protein in RNA1. Among them, the p22 protein exhibits Capítulo I 82 no apparent homology to any other reported protein and it has been reported as having one of the longest lasting local suppression activities when transiently expressed in Nicotiana benthamiana plants [12]. This protein suppresses RNA silencing induced by both sense and double-stranded (dsRNA) RNAs interfering with initial stages of RNA silencing [12]. Interestingly, the p22 gene is located at the 3´-proximal genomic region of RNA1, where, a high genetic variability has been reported for members of the family [5]. Since the gene content and organization of the variable 3´-proximal genomic region of the monopartite closterovirus and ampelovirus, and of the 3´-end of RNA1 in the bipartite crinivirus where the p22 silencing suppressor of ToCV is located, has evolutionary implications [5, 15, 16, 21] we have undertaken a study to evaluate the genetic diversity of this gene in ToCV populations. Scarce studies about the variability of dedicated silencing suppressors are available and p22 is particularly interesting owe to its long lasting silencing suppressor activity. ToCV isolates collected in Spain from tomato and sweet pepper were analyzed showing that their p22 proteins grouped into two differentiated phylogenetic clades. A comparative study of the suppressor activity of p22 from both groups was carried out. MATERIALS AND METHODS Virus isolates A total of 45 ToCV isolates were used for the phylogenetic analysis (Supplementary Table 1). Thirty-nine of these isolates were obtained from commercial crops of tomato and sweet pepper during the years 2006 to 2009 in southeastern Spain. Additional p22 gene sequences from six ToCV isolates of various origins were retrieved from Genbank and included in the present study (Supplementary Table 1). RT-PCR amplification and sequencing The amplification of the complete p22 genomic region was performed by reverse transcription (AMV RT, Promega, Madison, WI, USA) with primer MA 401 (5´- ACACCAACTAAACAGAACAATATG-3´) and PCR amplification using a highfidelity DNA polymerase (Expand High Fidelity System, Roche, Germany) with primers MA 1762 (5´-ATGTGTTCATATGCAGCGTTG-3´) and MA 1763 (5´- Capítulo I 83 TATATCTCTGGCTATACTATCC-3´), designed outside the p22 region on the isolate AT80/99 RNA1 (GenBank accession number DQ983480) that recognize all ToCV sequences available in databases. Direct sequencing of PCR products was done on an ABI 3730 XL DNA analyzer (Applied Biosystems, CA, USA) (Macrogen Inc. Company, South Korea), using the above PCR primers. Plasmid constructs p22 type II ToCV ORF was amplified from total RNA extracts of ToCV 2.5 isolate-infected tomato plants by reverse transcription with AMV RT (Promega, Madison, WI, USA) and amplified by PCR with Expand High Fidelity (Roche, Germany) with primers MA 569: 5’-GAACCATGGATCTCACTGGTTGTTTGC-3’ and MA 570: 5’-AATAGATCTTATATATCACTCCCAAAGAAAAAC-3’ containing NcoI and BglII restriction sites (underlined), and cloned in a vector under the control of the 35S promoter as described for the generation of the p22 type I construct [12]. Plasmid 35S-GFP [22] and 35S-GF-IR [23] were provided by Dr. David C. Baulcombe (University of Cambridge, Cambridge, United Kingdom). The constructs were transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 by electroporation. Agroinfiltration and fluorescence imaging N. benthamiana plants were infiltrated with the A. tumefaciens strain GV3101 carrying the plasmids indicated as described by Voinnet et al. [24] to express 35S-GFP alone or in combination with 35S-GF-IR and 35S-p22-I or 35S-p22-II. Co-infiltration with the empty vector was used as a negative control. For co-infiltration, equal volumes of individual A. tumefaciens cultures with optical density at 600 nm of 1, were mixed prior to infiltration. Two leaves of each N. benthamiana plant at the fourto sixleaf growth stage were agroinfiltrated. Three plants were used per combination in two replicated experiments. GFP fluorescence was observed under long-wavelength UV light (Black Ray B 100AP, UV products, Upland, CA, USA) and photographed using a Coolpix 8700 Nikon digital camera. RNA analysis RNA was extracted from leaf tissue using the method described by Noris et al. [25]. For northern blot analysis of GFP mRNAs, total RNA aliquots (5 µg) for each sample agroinfiltrated with the different combinations indicated above, were separated Capítulo I 90 In summary, our findings provide experimental evidence that the presence of a “strong” silencing suppressor at the 3´-end of the RNA1, the protein p22, is an important and conserved feature for ToCV isolates. Although the p22 sequences are highly conserved, informative sites located mainly at the C-terminal part of the protein, has allowed the differentiation of two phylogenetic groups, named type I and type II. However, both ToCV p22 type I and ToCV p22 type II behave similarly as ”strong” RNA silencing suppressors, which could indicate that such activity is needed for the lifecycle of ToCV. In agreement with this, although using a different experimental approach, strong suppressor activity also was shown for the p22 suppressor of a ToCV isolate from Greece [38] that, although grouped with the type II isolates (Fig. 2), it was fairly separated from the main clade of Spanish isolates. ACKNOWLEDGEMENTS Y. L.-R. was the recipient of an AECID (Spain) fellowship. M.C.C. was the recipient of an I3P contract from the CSIC (Spain) co-financed by FSE. This work was supported by grants AGL2013-48913-C2-1-R from the Ministerio de Economía y Competitividad, Spain, and P10-AGR-6516 from Consejería de Economía, Innovación y Ciencia (CEIC), Junta de Andalucía, Spain, co-financed by FEDER-FSE. J.N.C. and E.M.A. are members of the Research Group AGR-214, partially funded by the Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, Spain. We thank F. Aparicio and I.M. Fortes for providing materials and M.V. Martín and R. Tovar for technical assistance. Capítulo I 91 REFERENCES 1. D. Baulcombe, RNA silencing in plants. Nature 431, 356-363 (2004) 2. A.J. Hamilton, D.C. Baulcombe, A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952 (1999) 3. D. Silhavy, J. Burgyan, Effects and side effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs. Trends in Plant Science 9, 76-83 (2004) 4. O. Voinnet, Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nature Reviews Genetics 6, 206-220 (2005) 5. V.V. Dolja, J.F. Kreuze, J.P.T. Valkonen, Comparative and functional genomics of closteroviruses. Virus Research 117, 38-51 (2006) 6. S.W. Ding, B.J. Shi, W.X. Li, R.H. Symons, An interspecies hybrid RNA virus is significantly more virulent than either parental virus. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences of the United States of America 93, 7470-7474 (1996) 7. G. Pruss, X. Ge, X.M. Shi, J.C. Carrington, V.B. Vance, Plant viral synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that transactivates replication of heterologous viruses. Plant Cell 9, 859-868 (1997) 8. J.C. Reed, K.D. Kasschau, A.I. Prokhnevsky, K. Gopinath, G.P. Pogue, J.C. Carrington, V.V. Dolja, Suppressor of RNA silencing encoded by Beet yellows virus. Virology 306, 203-209 (2003) 9. R. Lu, A.S. Folimonov, M. Shintaku, W.X. Li, B.W. Falk, W.O. Dawson, S.W. Ding, Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA genome. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences of the United States of America 101, 15742-15747 (2004) 10. J.F. Kreuze, E.I. Savenkov, M. Cuellar, X. Li, J.P.T. Valkonen, Viral class 1 RNase III involved in suppression of RNA silencing. Journal of Virology 79, 7227-7238 (2005) 11. M. Chiba, J.C. Reed, A.I. Prokhnevsky, E.J. Chapman, M. Mawassi, E.V. Koonin, J.C. Carrington, V.V. Dolja, Diverse suppressors of RNA silencing enhance agroinfection by a viral replicon. Virology 346, 7-14 (2006) 12. M.C. Cañizares, J. Navas-Castillo, E. Moriones, Multiple suppressors of RNA silencing encoded by both genomic RNAs of the crinivirus, Tomato chlorosis virus. Virology 379, 168-174 (2008) Capítulo I 92 13. P. Gouveia, S. Dandlen, A. Costa, N. Marques, G. Nolasco, Identification of an RNA silencing suppressor encoded by Grapevine leafroll-associated virus 3. European Journal of Plant Pathology 133, 237-245 (2012) 14. J.A. Díaz-Pendón, S.W. Ding, Direct and indirect roles of viral suppressors of RNA silencing in pathogenesis. Annual Review of Phytopathology 46, 303-326 (2008) 15. J.W. Cuellar, F. Tairo, J.F. Kreuze, J.P.T. Valkonen, Analysis of gene content in Sweet potato chlorotic stunt virus RNA1 reveals the presence of the p22 RNA silencing suppressor in only a few isolates: implications for viral evolution and synergism. Journal of General Virology 89, 573-582 (2008) 16. A.K. Tugume, R. Amayo, I. Weinheimer, S.B. Mukasa, P.R. Rubaihayo, J.P.T. Valkonen, Genetic variability and evolutionary implications of RNA silencing suppressor genes in RNA1 of Sweet potato chlorotic stunt virus isolates infecting sweetpotato and related wild species. PLoS ONE 8, 11 (2013) 17. G.C. Wisler, R.H. Li, H-Y. Liu, D.S. Lowry, J.E. Duffus, Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited bipartite closterovirus of tomato. Phytopathology 88, 402-409 (1998). 18. G. Lozano, E. Moriones, J. Navas-Castillo, Complete sequence of the RNA1 of a European isolate of Tomato chlorosis virus. Archives of Virology 152, 839-841 (2007) 19. G. Lozano, E. Moriones, J. Navas-Castillo, First report of sweet pepper (Capsicum annuum) as a natural host plant for Tomato chlorosis virus. Plant Disease 88, 224 (2003) 20. I.M. Fortes, E. Moriones, J. Navas-Castillo, Tomato chlorosis virus in pepper: prevalence in commercial crops in south-eastern Spain and symptomatology under experimental conditions. Plant Pathology 61, 994-1001 (2012) 21. J. Wang, A.M. Sharma, S. Duffy, R.P. Almeida, Genetic diversity in the 3´terminal 4.7 kb region of Grapevine leafroll-associated virus 3. Phytopathology 101, 445450 (2011) 22. O. Voinnet, D.C. Baulcombe, Systemic signalling in gene silencing. Nature 389, 553 (1997) 23. E.H. Bayne, D.V. Rakitina, S.Y. Morozov, D.C. Baulcombe, Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. The Plant Journal 44, 471-482 (2005) Capítulo I 93 24. O. Voinnet, P. Vain, S. Angell, D.C. Baulcombe, Systemic spread of sequencespecific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA. Cell 95, 177-187 (1998) 25. E. Noris, G.P. Accotto, R. Tavazza, A. Brunetti, S. Crespi, M. Tavazza, Resistance to Tomato yellow leaf curl geminivirus in Nicotiana benthamiana plants transformed with a truncated viral C1 gene. Virology 224, 130-138 (1996) 26. M.C. Cañizares, K.M. Taylor, G.P. Lomonossoff, Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic virus are required for suppression of silencing. Journal of General Virology 85, 3431-3435 (2004) 27. I.D. Thompson, T.J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, D.G. Higgins, The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25, 4876-4882 (1997) 28. K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, S. Kumar, MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28, 2731-2739 (2011) 29. K. Ye, D.J. Patel, RNA silencing suppressor p21 of Beet yellows virus forms an RNA binding octameric ring structure. Structure 13, 1375-1384 (2005) 30. A. Lingel, B. Simon, E. Izaurralde, M. Sattler, The structure of the flock house virus B2 protein, a viral suppressor of RNA interference, shows a novel mode of doublestranded RNA recognition. EMBO Reports 6, 1149-1155 (2005) 31. G. Lozano, A. Grande-Pérez, J. Navas-Castillo, Populations of genomic RNAs devoted to the replication or spread of a bipartite plant virus differ in genetic structure. Journal of Virology 83, 12973-12983 (2009) 32. A.F. Orílio, I.M. Fortes, J. Navas-Castillo, Infectious cDNA clones of the crinivirus Tomato chlorosis virus are competent for systemic plant infection and whiteflytransmission. Virology 464-465, 365-374 (2014) 33. H.Y. Chen, J. Yang, C. Lin, Y.A. Yuan, Structural basis for RNA silencing suppression of Tomato aspermy virus protein 2b. EMBO Journal 9, 754-760 (2008) 34. C. Torres-Barceló, S. Martín, J.A. Darós, S.F. Elena, From Hypo-to Hypersuppression: effect of amino acid substitutions on the RNA silencing suppressor activity of the tobacco etch potyvirys HC-Pro. Genetics 180, 1039-1049 (2008) Capítulo I 94 35. M.L. Yambao, H. Yagihashi, H. Sekiguchi, T. Sekiguchi, T. Sasaki, M. Sato, G. Atsumi, Y. Tacahashi, K.S. Nakahara, I. Uyeda, Point mutations in helper component protease of Clover yellow vein virus are associated with the attenuation of RNA-silencing suppression activity and symptom expression in broad bean. Archives of Virology 153, 105-115 (2008) 36. J. Ye, J. Qu, J.F. Zhang, Y.F. Geng, R.X. Fang, A critical domain of the Cucumber mosaic virus 2b protein for RNA silencing suppressor activity. FEBS Letters 583, 101-106 (2009) 37. P. Gouveia, G. Nolasco, The p19.7 RNA silencing suppressor from Grapevine leafroll-associated virus 3 shows different levels of activity across phylogenetic groups. Virus Genes 45, 333-339 (2012) 38. A.R.M. Kataya, M.N.S. Suliman, K. Kalantidis, I.C. Livieratos, Cucurbit yellow stunting disorder virus p25 is a suppressor of post-transcriptional gene silencing. Virus Research 145, 48-53 (2009) Capítulo I 95 SUPPLEMENTARY MATERIAL Supplementary Table 1. Tomato chlorosis virus isolates used for the analysis of p22 genetic diversity with indication of the name, collection data and genetic type of their RNA1. Isolate Geographical origin Year Host Type of RNA1a Sequence accession no. Reference AT4/07 Malaga, Spain 2007 Sweet pepper I KP668814 This study AT248/06 Malaga, Spain 2006 Tomato II KP668815 This study AT133/08 Malaga, Spain 2008 Sweet pepper I KP668816 This study AT264/06 Malaga, Spain 2006 Tomato II KP668817 This study AT2/09 Malaga, Spain 2009 Tomato I KP668818 This study AT92/06 Almeria, Spain 2006 Tomato II KP668819 This study AT103/09 Murcia, Spain 2009 Tomato II KP668820 This study AT52/09 Almeria, Spain 2009 Tomato II KP668821 This study 10B7 Malaga, Spain 2006 Sweet pepper I KP668822 This study 7/23 Malaga, Spain 2006 Sweet pepper I KP668823 This study AT6/07 Malaga, Spain 2007 Sweet pepper I KP668824 This study 10B1 Malaga, Spain 2006 Sweet pepper I KP668825 This study 7/37 Malaga, Spain 2006 Sweet pepper I KP668826 This study AT88/06 Almeria, Spain 2006 Sweet pepper I KP668827 This study AT11/07 Malaga, Spain 2007 Sweet pepper I KP668828 This study AT17/07 Malaga, Spain 2007 Sweet pepper I KP668829 This study AT19/07 Malaga, Spain 2007 Sweet pepper I KP668830 This study AT155/08 Malaga, Spain 2008 Sweet pepper I KP668831 This study AT152/08 Malaga, Spain 2008 Sweet pepper I KP668832 This study AT145/08 Malaga, Spain 2008 Sweet pepper I KP668833 This study AT189/06 Malaga, Spain 2006 Tomato I KP668834 This study AT126/06 Almeria, Spain 2006 Tomato I KP668835 This study AT106/06 Almeria, Spain 2006 Tomato I KP668836 This study AT158/06 Murcia, Spain 2006 Tomato I KP668837 This study AT13/08 Malaga, Spain 2008 Tomato I KP668838 This study AT66/08 Murcia, Spain 2008 Tomato I KP668839 This study AT60/09 Almeria, Spain 2009 Tomato I KP668840 This study AT136/06 Murcia, Spain 2006 Tomato I KP668841 This study AT146/06 Murcia, Spain 2006 Tomato I KP668842 This study AT89/06 Almeria, Spain 2006 Tomato II KP668843 This study AT209/06 Malaga, Spain 2006 Tomato II KP668844 This study AT265/06 Malaga, Spain 2006 Tomato II KP668845 This study AT5/08 Malaga, Spain 2008 Tomato II KP668846 This study AT43/08 Almeria, Spain 2008 Tomato II KP668847 This study AT74/08 Murcia, Spain 2008 Tomato II KP668848 This study AT18/09 Malaga, Spain 2009 Tomato II KP668849 This study AT44/09 Almeria, Spain 2009 Tomato II KP668850 This study AT89/09 Murcia, Spain 2009 Tomato II KP668851 This study 2.5 Malaga, Spain 2010 Tomato II KP979663 This study AT80/99 Malaga, Spain 1999 Tomato I DQ983480 1 Capítulo I 96 Br-2 Brazil 2010 Tomato II JQ952600 2 Florida Florida 1996 Tomato II AY903447 3 Gr-535 Greece 2007 Tomato II EU284745 4 SDSG China 2012 Tomato II KC709509 5 NJ China 2011 Tomato II KF018280 6 a : types of RNA1 as previously reported by Lozano et al. [7] and Fortes et al., unpublished data. REFERENCES (shown on supplementary Table 1): 1. G. Lozano, E. Moriones, J. Navas-Castillo, Complete sequence of the RNA1 of a European isolate of Tomato chlorosis virus. Archives of Virology 152, 839-841 (2007) 2. L.C. Albuquerque, F. Villanueva, R.O. Resende, J. Navas-Castillo, J.C. Barbosa, A.K. Inoue-Nagata, Molecular characterization reveals Brazilian Tomato chlorosis virus to be closely related to a Greek isolate. Tropical Plant Pathology 38, 332-336 (2013) 3. W. Wintermantel, G. Wisler, A. Anchieta, H.Y. Liu, A. Karasev, I. Tzanetakis, The complete nucleotide sequence and genome organization of Tomato chlorosis virus. Archives of Virology 150, 2287-2298 (2005) 4. A.R.M. Kataya, M.N.S. Suliman, K. Kalantidis, I.C. Livieratos, Cucurbit yellow stunting disorder virus p25 is a suppressor of post-transcriptional gene silencing. Virus Research 145, 48-53 (2009) 5. L.M. Zhao, G. Li, Y. Gao, Y.J. Liu, G.Z. Sun, X.P. Zhu, Molecular detection and complete genome sequences of Tomato chlorosis virus isolates from infectious outbreaks in China. Journal of Phytopathology 162, 627-634 (2014) 6. M. Karwitha, Z. Feng, M. Yao, X. Chen, W. Zhang, X. Liu, X. Tao, The complete nucleotide sequence of the RNA 1 of a Chinese isolate of Tomato chlorosis virus. Journal of Phytopathology 162, 411-415 (2013) 7. G. Lozano, A. Grande-Pérez, J. Navas-Castillo, Populations of genomic RNAs devoted to the replication or spread of a bipartite plant virus differ in genetic structure. Journal of Virology 83, 12973-12983 (2009) Capítulo I 97 Supplementary Fig. 1 Alignment of the nucleotide (nt) sequences of the p22 gene of the 45 Tomato chlorosis virus isolates considered in this study. Numbers on top and on the right of the alignment indicate the nt position. The parsimony informative sites and singletons are indicated with grey shades. * 20 * 40 * 60 * 80 AT106/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT146/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT126/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT136/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT158/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT80/99 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT66/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT189/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 10B7 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTTAGAAGT : 80 7/23 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT4/07 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT152/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT60/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT155/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 10B1 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAAT : 80 7/37 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT88/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT11/07 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT17/07 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT19/07 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT145/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT13/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT2/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT6/07 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT133/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGATGTTTCAGAAGT : 80 AT248/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT103/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT264/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT92/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT89/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT89/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT52/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT209/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT265/06 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT5/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT43/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT74/08 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT18/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 AT44/09 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 2.5 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 Florida : ATGGATCTCACTGGTTGTTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 Br-2 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 SDSG : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGAGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 Gr-535 : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCGGGGAAATGCCGTTTCAGAAGT : 80 NJ : ATGGATCTCACTGGTTGCTTGCGTAAGCTTCGACAGTGTGATCGACTTCTTGAGAGGCTGGGTAATGACGTTTCAGAAGT : 80 Capítulo I 98 * 100 * 120 * 140 * 160 AT106/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT146/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT126/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT136/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT158/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT80/99 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT66/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT189/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 10B7 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 7/23 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT4/07 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT152/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT60/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT155/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 10B1 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATCGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 7/37 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT88/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT11/07 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT17/07 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT19/07 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT145/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT13/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT2/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT6/07 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT133/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTCTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT248/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT103/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT264/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT92/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT89/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT89/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT52/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT209/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT265/06 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT5/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT43/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT74/08 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT18/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 AT44/09 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 2.5 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 Florida : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 Br-2 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 SDSG : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 Gr-535 : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 NJ : TCATTTAAGAGCGATCTTAATTGATCTTGATGAGTGTTCTGAGTGTTTGATGCTTTGTGAGCAGGAGTATATCAGAGACA : 160 Capítulo I 99 * 180 * 200 * 220 * 240 AT106/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT146/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT126/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT136/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT158/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT80/99 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTTTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT66/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATATCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT189/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 10B7 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 7/23 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT4/07 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT152/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT60/09 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT155/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 10B1 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 7/37 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT88/06 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT11/07 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT17/07 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT19/07 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT145/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT13/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT2/09 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT6/07 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT133/08 : CGGACTGCCTTTTGTCATTTCTGTTGGTACTGAAACACTATGAGATCAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT248/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT103/09 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT264/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT92/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT89/09 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT89/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT52/09 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT209/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT265/06 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT5/08 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT43/08 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT74/08 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT18/09 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 AT44/09 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 2.5 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 Florida : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 Br-2 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 SDSG : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 Gr-535 : CGGACTGCCTTATGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 NJ : CGGACTGCCTTACGTCATTTCTGTTGGCGCTGAAACACTATGAGATTAAATTTCACATGGATATGTTGAATATGATTTAT : 240 Capítulo II 107 The p22 RNA silencing suppressor of the crinivirus Tomato chlorosis virus preferentially binds long dsRNAs preventing them from cleavage Yazmín Landeo-Ríos, Jesús Navas-Castillo, Enrique Moriones, M. Carmen Cañizares Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora”- Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”, 29750 Algarrobo-Costa, Málaga, Spain. Virology 488, 129-136 (2016) ABSTRACT Viruses encode silencing suppressor proteins to counteract RNA silencing. Because dsRNA plays a key role in silencing, a general silencing suppressor strategy is dsRNA binding. The p22 suppressor of the plant virus Tomato chlorosis virus (ToCV; genus Crinivirus, family Closteroviridae) has been described as having one of the longest lasting local suppressor activities. However, the mechanism of action of p22 has not been characterized. Here, we show that ToCV p22 binds long dsRNAs in vitro, thus interfering with their processing into small RNAs (sRNAs) by an RNase III-type Dicer homologue enzyme. Additionally, we have studied whether a putative zinc finger motif found in p22 has a role in dsRNA binding and suppressor function. The efficient ability of p22 to suppress RNA silencing, triggered by hairpin transcripts transiently expressed in planta, supports the relationship between its ability to bind dsRNA in vitro and its ability to inhibit RNA silencing in vivo. Capítulo II 108 Capítulo II 109 INTRODUCTION Post-transcriptional RNA silencing is a sequence-specific RNA-mediated gene regulatory mechanism that also serves as an antiviral defense (Baulcombe, 2005). RNA silencing is induced by double-stranded RNAs (dsRNAs) that, in the case of singlestranded RNA (ssRNA) viruses, can be derived from highly structured regions in the RNA genome or generated during the replication cycle (Szittya et al., 2002; Molnár et al., 2005). Subsequently, dsRNAs are processed by an RNase III-type Dicer-like enzyme (DCL) into double-stranded small RNAs (sRNAs) of 21 to 24 nucleotides (Hamilton and Baulcombe, 1999) with 2 nt 3'-overhangs. Then, one strand of these sRNAs is incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC) that serves as a guide to initiate the sequence-specific degradation of target RNAs (Baulcombe, 2005). This process is amplified by host-encoded RNA-dependent RNA polymerases (RDR) that convert single-stranded RNA into dsRNA, which is subsequently processed by DCL into secondary sRNAs. To counteract this antiviral mechanism, plant viruses encode RNA silencing suppressor proteins (Voinnet, 2005), which are highly diverse in sequence, structure, and activity within and across virus families. Thus, while some viruses have delegated the suppressor functions to replication, structural or transport proteins, other viruses encode dedicated suppressor proteins without homology to any other viral or host protein (Dolja et al., 2006). Viral silencing suppressors can target all steps of RNA silencing, such as viral RNA recognition, dicing, RISC assembly, RNA targeting, and amplification (Burgyán and Havelda, 2011). Because dsRNAs play a key role in RNA silencing, viral suppressor proteins use dsRNA binding as a general strategy of suppression (Mérai et al., 2006). The dsRNA-binding suppressors (dsRBSs), based on their specificity for dsRNA size, can be broadly classified into two types: (i) dsRBSs that preferentially bind long hairpin-derived or inverted repeat dsRNA, preventing them from being processed into sRNAs by DCL, as shown for P14 of Pothos latent virus (Mérai et al., 2005); and (ii) dsRBSs that bind sRNAs and/or sequester them, preventing their incorporation into the RISC complex, as shown for the tombusvirus P19 (Lakatos et al., 2004). Tomato chlorosis virus (ToCV; genus Crinivirus) belongs to the family Closteroviridae, in which the largest RNA genomes among plant viruses are found (Dolja et al., 2006). Closterovirus gene expression includes at least three different RNA expression mechanisms: i) proteolytic processing, ii) translational frameshifting, and iii) Capítulo II 110 formation of 3´-co-terminal subgenomic RNAs (sgRNAs), resembling the mechanism in animal coronavirus (Karasev et al., 1997). The replication process generates high amounts of viral RNA species, such as dsRNA replicative intermediates that correspond to the genomic RNA and sgRNAs (Hilf et al., 1995). ToCV is transmitted in nature by the whitefly (Hemiptera: Aleyrodidae) Bemisia tabaci and has a bipartite singlestranded, positive-sense RNA genome (Wisler et al., 1998). As for other members of the family Closteroviridae (Lu et al., 2004), ToCV adopts the strategy of encoding multiple RNA silencing suppressors (Cañizares et al., 2008). Thus, while ToCV RNA-2 has delegated its suppressor function to the structural proteins CP and CPm, RNA-1 encodes a dedicated suppressor protein at its 3´-proximal end, p22, which exhibits no apparent homology to any other reported protein. It has been shown that p22 very efficiently suppresses local RNA silencing, induced either by sense RNA or by dsRNA, interfering with the initial stages of RNA silencing. Moreover, it has been reported that p22 has one of the longest lasting local suppression activities when assayed in Nicotiana benthamiana (Cañizares et al., 2008), although its mechanism of action has not been characterized. Because the expression of viral proteins with suppressor activity seems to be essential for virus multiplication and effective systemic infection of the host, the study of the mechanism of action of these proteins will improve the understanding of the foundations of plant-virus interactions. Here, we demonstrate that the ToCV p22 suppressor preferentially binds long dsRNAs in vitro, preventing them from being cleaved by an RNase III-type Dicer homologue enzyme. Additionally, we have assessed whether a putative zinc finger domain located in the N-terminal part of the protein, highly similar to the one found in the p23 suppressor, a protein that is unique to Citrus tristeza virus (CTV) within closteroviruses, plays a role in both dsRNA binding and suppression activity. Finally, the demonstration that the p22 protein suppresses silencing triggered by hairpin transcripts transiently expressed in planta links the in vitro long dsRNA binding capability of the protein to its ability to inhibit RNA silencing in vivo. Capítulo II 111 MATERIALS AND METHODS Plasmid construction For gene expression, the ToCV p22 gene was PCR-amplified from plasmid pGEM-T-p22 (Cañizares et al., 2008) using the Expand High Fidelity PCR system (Roche Diagnostics) and primers MA 1287 and MA 1288 with specific restriction sites. The PCR product was digested, purified and cloned into Escherichia coli expression vector pET-28a(+) (Novagen), resulting in the pET28a-p22 construct, harboring the p22 gene fused to a sequence coding for a hexa-His tag. To generate the p22∆2Cys construct, which lacked four amino acid residues including two cysteines located between positions 39–42 (C-terminal region), amplification from plasmids pET28a-p22 and pBin35S-p22 (Cañizares et al., 2008) was performed. Mutations were introduced by PCR using the QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) and the specific primers MA 1616 and MA 1617, generating pET28ap22∆2Cys and pBIN35S-p22∆2Cys. The constructs pBIN35S-p22 and pETDuet.SAHH have been previously described (Cañizares et al., 2008, 2013). The 35S-dsSAHH construct was kindly provided by Dr. David M. Bisaro (The Ohio State University, Columbus, OH, USA), and plasmids 35S-GFP and 35S-P19 were kindly provided by Dr. David C. Baulcombe (University of Cambridge, Cambridge, United Kingdom). Purification, analysis and quantification of p22 protein and its mutant from E. coli Expression of His-tagged p22 and its mutant protein and of the negative control protein SAHH were performed in the E. coli strain Rosetta 2 (DE3)pLysS (Novagen). Expression was induced in the transformed bacteria with 0.4 mM isopropyl β-Dthiogalactopyranoside for 3 h at 28 °C, and the proteins were purified by chromatography on nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) columns according to the manufacturer´s recommendations (Qiagen). The purified proteins were analyzed and quantified by 15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE) after Coomassie brilliant blue staining. Preparation of labeled nucleic acids DIG-labeled dsRNAs of 562 and 100 base pairs (bp) were generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase (Roche Diagnostics). Primers incorporating 5’- end T7 RNA polymerase promoters into the PCR products were used to amplify two Capítulo II 112 regions of 562 and 100 nucleotides (nt) of the pTOPO-GFP plasmid using either the primer pair MA 1366 and MA 1337 or the pair MA 1336 and MA 1337 (Supplementary Table 1), respectively, with the Expand High Fidelity PCR system (Roche Diagnostics). To synthesize the labeled RNA, DIG-11-UTP (Roche Diagnostics) was included in the transcription reaction. The small dsRNAs (sRNAs) were ordered as two complementary 21 nt oligonucleotides with a RNA 3’-end overhang (MA1633: 5’- ACUGGAGUUGUCCCAAUUCUU-3’ and MA 1634: 5’- GAAUUGGGACAACUCCAGUGA-3’). The antisense oligonucleotide was also prepared with a DIG molecule at the 3’-end. These small RNAs were synthesized by Sigma-Aldrich. Duplex dsRNAs of 562 bp and 100 bp were obtained by annealing the two complementary T7 transcripts produced in vitro, and small RNA (sRNA) duplexes were obtained by annealing the two complementary RNA oligonucleotides. In both cases, to anneal complementary strands, reaction mixtures were incubated for 1 min at 95 °C and cooled to room temperature. For 562 or 100 nt ssRNA synthesis, the same strategy was used but with the reverse primer MA1337b, containing the same GFP sequence present in MA1337 but without the T7 promoter sequence (Supplementary Table 1). The PCR products containing the T7 promoter sequence at only one of the ends were used as a template for in vitro transcription. In all transcripts, the DNA template was removed by treatment with DNase I (Invitrogen). Unincorporated nucleotides were removed using NucAway Spin Columns (Ambion). For singleand double-strand quantification, RNAs were analyzed in 5% acrylamide gel and stained with ethidium bromide, where the different mobilities of both types of molecules could be clearly observed. DIG-labeled dsDNA of 562 nt was obtained by PCR using primers MA 1366b and MA 1337b (Supplementary Table 1), which contained the same GFP sequence present in primers MA1366 and MA1337 but without the T7 promoter sequence, including DIG-11-dUTP in the reaction. The ssDNA was produced by boiling the dsDNA for 5 min and quickly cooling it on ice. Labeled DNA was analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel/TBE buffer (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 0.5 mM EDTA) and stained with ethidium bromide. Electrophoretic mobility shift assay Labeled nucleic acids (~1 nM) were mixed with increasing amounts of Histagged p22 or its mutant in a 10 µl reaction containing binding buffer [20 mM Tris/HCl Capítulo II 113 pH 7.5, 1 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1% glycerol, 0.02% Tween-20, 0.1% Bovine Serum Albumin and 8 U ribonuclease inhibitor RNaseOUT (Invitrogen)]. The binding reaction was incubated at room temperature for 30 min and resolved in a 1% agarose gel run in TBE buffer. The gel was vacuum-transferred (Vacugene XL, GE Healthcare) onto positively charged nylon membranes (Roche Diagnostics) for 3 h in SSC 10x buffer (1.5 M NaCl, 0.15 M sodium citrate, pH 7). Samples were crosslinked under UV light (Ultraviolet Crosslinker RPN 2500, Amersham). The membranes were treated with anti-digoxigenin antibody (Antidigoxigenin-AP, Fab fragments, Roche Diagnostics) and detected with the alkaline phosphatase chemiluminescent substrate (CDP-Star, Roche Diagnostics) according to the manufacturer’s protocols. As a negative control, a non-related protein involved in methylation reactions in plants, SAHH, fused to a His tag, was expressed and purified in the same manner as p22 (Cañizares et al., 2013). RNase III-mediated cleavage assay The RNase III–mediated cleavage assay was performed in 10 µl volumes containing ~1 nM 562 bp dsRNA, 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1% glycerol, 0.02% Tween-20, 0.1% Bovine Serum Albumin, 1 x RNase III buffer, and different amounts of p22 or SAHH as a negative control. Following 30 min of preincubation at room temperature to allow the test proteins to bind to dsRNA, 1 U of RNase III (Ambion) was added, and the reaction mixtures were incubated at 37 °C for 1 h. The reaction products were resolved by electrophoresis in 1% agarose gel/TBE buffer. As a marker lane, an unlabeled RNA oligonucleotide 22 nt in length was run in parallel. The gel was stained with ethidium bromide before transfer, and the marker lane was cut. Nucleic acids were vacuumtransferred (Vacugene XL, GE Healthcare) to positively charged nylon membranes (Roche Diagnostics) for 3 h in SSC 10x buffer (1.5 M NaCl, 0.15 M sodium citrate, pH 7) and crosslinked under UV light (Ultraviolet Crosslinker RPN 2500, Amersham). Then, the membranes were treated with anti-digoxigenin antibody (Anti-digoxigeninAP, Fab fragments, Roche Diagnostics) and detected with the alkaline phosphatase chemiluminescent substrate (CDP-Star, Roche Diagnostics) according to the manufacturer’s protocols. Capítulo II 114 Agroinfiltration, silencing suppression assays and fluorescence imaging Wild-type N. benthamiana plants were grown in a chamber at 25 °C with a photoperiod of 16 h of light and 8 h of darkness. Plants at the fourto six-leaf growth stage were agroinfiltrated with A. tumefaciens strain GV3101 carrying the plasmids indicated above, as described by Voinnet et al., (1998). For co-infiltration, the A. tumefaciens cultures were adjusted to an optical density at 600 nm of 1 and mixed prior to infiltration. For the identification of suppressor activity by visual inspection of GFP fluorescence, the 35S-GFP construct was co-expressed with a construct expressing p22 and its mutant or empty vector. For the silencing assays triggered by hairpin transcripts, the 35S-dsSAHH construct or empty vector was infiltrated alone or in combination with constructs expressing the suppressor proteins P19 or p22. GFP fluorescence was observed under long-wavelength UV light (Black Ray model B 100AP, UV products). Pictures of GFP were taken using a Coolpix 8700 Nikon digital camera. Northern blot analysis RNA was extracted from agroinfiltrated leaf tissue as described by Noris et al. (1996). For the northern blot analysis of GFP mRNAs, total RNA aliquots (5 µg) from each sample were separated in 1% formaldehyde agarose gels, transferred to nylon membranes (Roche Diagnostics) and probed with DIG-labeled probes specific for GFP, as described previously (Cañizares et al., 2004). Semi-quantitative RT-PCR Total RNA was extracted from agroinfiltrated leaf tissue as described above and further treated with DNase I to eliminate genomic DNA. RNA pellets were resuspended in water and quantified in a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies). Total RNA (500 ng) was reverse transcribed with oligo-dT primers using AMV RT (Promega). The resulting single-stranded cDNA was used for PCR to detect SAHH transcripts using the specific primers MA 748 and MA 749. PCR with the specific primers MA 720 and MA 721 for the cytochrome c oxidase transcripts (Kadowaki et al., 1995) was used as an internal control. Aliquots were withdrawn from the PCR reaction after 20, 25, 30, and 35 cycles and analyzed by agarose gel electrophoresis. Capítulo II 115 RESULTS p22 preferentially binds long dsRNA in vitro A previous report showed that the protein p22 of ToCV suppressed RNA silencing induced by either sense or double-stranded RNAs (dsRNAs), indicating that it acts downstream of the formation of dsRNA (Cañizares et al., 2008). Moreover, the drastic reduction of sRNA when p22 is present, compared to that conferred by other suppressors such as tombusviral p19 that act by specifically binding sRNAs (Takeda et al., 2002; Lakatos et al., 2006), suggested that p22 could interfere with the RNA silencing pathway upstream of sRNA synthesis. Therefore, the ability of His-tagged p22 to bind different digoxigenin (DIG)-labeled dsRNAs was analyzed by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using increasing amounts of protein. As a negative control in our experiments, we used a non-related protein, S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH), fused to a His tag, which was expressed and purified in the same way (Cañizares et al., 2013). Long dsRNAs of 562 or 100 base pairs (bp) and small dsRNAs (sRNA) of 21 bp were used. As shown in Figure 1A, in the case of the 562 bp dsRNA, all the RNA was shifted into a complex that gradually increased in size with increasing protein amounts, even at the lowest p22 protein concentration. No such RNA shifting was observed in the case of the control protein SAHH, confirming that the gel retardation observed was the result of an interaction of the dsRNA with p22. The gradually decreased mobility of the shifted band is likely due to the instability of the complex during electrophoresis at lower protein concentrations, which could indicate that multiple units of p22 are capable of binding to the 562 bp dsRNA, stabilizing the complex. A lower affinity of p22 to the 100 bp dsRNA was observed. In this case, although a decreased mobility of the shifted band was also shown with increasing protein amounts, some dsRNA remained unbound, even with the highest protein concentration used (Figure 1B). No complex formation was observed for the negative SAHH control. In contrast, similarly to the negative control, no significant binding of p22 to small 21 bp dsRNAs was observed, even at the highest protein concentration used (Figure 1C). Because in this case, the DIG molecule could be interfering with the binding of p22, the EMSA assay was also performed with 21 bp dsRNA containing a 2 nt overhang with a free OH at the 3’ end, staining the gel with ethidium bromide. As before, no evident shifting of the RNA mobility was observed (data not shown). Capítulo II 122 Fig. 5. Semiquantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis of Nicotiana benthamiana S-adenosylhomocysteine hydrolase (NbSAHH) transcripts. RNAs extracted at 12 days postinfiltration from patches with 35S constructs expressing dsSAHH or the empty vector control, alone or in combination with constructs expressing Tomato bushy stunt virus P19 protein (p19) or Tomato chlorosis virus p22 protein (p22), were analyzed using appropriate primers. Aliquots were removed at the indicated cycles. RT-PCR of cytochrome c oxidase (cyt c) transcript was used as an internal control. Sizes of the expected RT-PCR products are indicated to the right. DISCUSSION The expression of the complex closterovirus genomes resembling that of coronavirus (family Coronaviridae) produces high amounts of viral RNA species in the infected cell. In this set of RNAs, highly structured RNAs or dsRNAs as replicative intermediates would induce an RNA silencing response that must be efficiently counteracted by viral suppressors. In this work, the mechanism of action of the described ToCV p22 suppressor, known to suppress RNA silencing induced by both sense and double-stranded RNAs (dsRNAs) (Cañizares et al., 2008), has been studied further. The in vitro binding studies shown here indicate that p22 very efficiently binds ssRNA of both 562 and 100 nt but does not bind ssDNA or dsDNA. Moreover, p22 also possesses dsRNA binding activity, showing a high affinity for the longest dsRNA tested. The gradually decreased mobility of the shifted band observed in either ssRNA or long dsRNA binding assays might indicate that multiple units of p22 can bind to the RNA, thus retarding the complex, as the amount of RNA in all binding reactions is constant. We can speculate that both an increased number of p22 binding sites in the longest dsRNA or both ssRNAs, and a co-operative interaction might support the results obtained. Unfortunately, the lack of discrete intermediates makes it difficult to measure binding constants, thus precluding an accurate determination of cooperation. Capítulo II 123 In contrast to the described high affinity for long RNAs, no significant binding to sRNAs was observed for p22 in our conditions, either to synthetic 21 bp ds-sRNA labeled with DIG at the 3´-end or to sRNAs having a 2-nt overhang with a free OH at the 3´-end. Although we cannot rule out the binding of p22 to sRNAs, our results support the hypothesis that binding to long dsRNAs is more relevant for the p22 suppressor activity, as the co-infiltrations of p22 are always linked to reduced accumulation of sRNAs (Cañizares et al., 2008), indicating that p22 interferes with their generation. Moreover, we demonstrated that the binding of p22 to long dsRNA molecules prevented their cleavage into sRNAs by RNase III Dicer homologue, thus blocking subsequent steps of the RNA silencing process. Interestingly, although the strategy of suppressing gene silencing via binding to long dsRNA preventing Dicer cleavage has been described frequently for viruses infecting insects and mammals (Chao et al., 2005; Lingel et al., 2005; Fenner et al., 2006; van Rij et al., 2006; Kimberlin et al., 2010; Qi et al., 2011; Cui et al., 2015), it has only rarely been associated with plant viruses. In fact, it has only been reported for the protein NSs of Tomato spotted wilt virus (TSWV) (family Bunyaviridae) (Schnettler et al., 2010), and for the proteins CP and p14 of Turnip crinkle virus (TCV) and Pothos latent virus (PoLV), respectively (Mérai et al., 2005, 2006), and both members of the family Tombusviridae, although in vitro cleavage assays were not performed in the latter two cases. Therefore, as proposed for the coronavirus N protein suppressor (Cui et al., 2015), we could speculate that the ability to bind either ssRNA or dsRNA shown by ToCV p22 could protect viral RNA in two ways: i) binding viral ssRNAs to prevent unnecessary intramolecular and intermolecular dsRNA formation between the positiveand negative-sense genomic or subgenomic RNAs; and ii) binding virus-derived dsRNAs to protect them from Dicer cleavage. By analyzing the p22 amino acid sequence, we found a putative zinc finger domain in the N-terminal part of the molecule as described for the CTV p23 suppressor (López et al., 2000). Interestingly, although CTV p23 has no homologues in other closteroviruses (Lu et al., 2004), it contains a zinc-finger motif that is almost identical to the one present in ToCV p22. Thus, in CTV p23, the zinc finger-like motif has a CX2CX3HX9C signature, and in ToCVp22, the signature is CX2CX3CX9C. The zinc finger domain of p23, in addition to some basic amino acid residues, has been shown to be involved in RNA binding (Lopez et al., 2000) and to be important for controlling asymmetrical RNA synthesis (Satyanarayana et al., 2002). In addition, a functional zinc Capítulo II 124 finger domain is required for the silencing suppression activity of some suppressors (Chiba et al., 2013). With these precedents, in this study, we assessed a possible role of the putative zing finger motif of p22 in dsRNA binding and suppression activity by creating the p22∆2Cys mutant. Our results showed that, in contrast to CTV p23 (López et al., 2000), in which modifications of this domain had deleterious effects on the interaction with the RNA, the putative zinc finger motif found in p22 seemed to be dispensable for dsRNA binding. However, we found that the silencing suppressor activity of the p22∆2Cys mutant was shorter lasting than the activity of wild-type p22 and that the expression levels of the p22∆2Cys construct were lower than those for p22. Thus, a link could exist between the reduced transcript levels of this construct and the silencing suppressor activity observed. Alternatively, it can be argued that the in vivo suppression function of p22 has additional requirements for RNA binding. The importance of the in planta p22 suppression of silencing by binding long dsRNAs is supported by the results obtained in the suppression of silencing induced by hairpin transcripts. The hairpin-induced RNA silencing pathway requires de novo processing by Dicer to produce sRNAs. Thus, the p19 silencing suppressor failed to prevent the generation of sRNAs from hairpin transcripts at long times post-infiltration (Takeda et al., 2002), and therefore, it failed to prevent silencing of the SAHH mRNA target. In contrast, the effective suppression observed for p22 in equivalent assays supported the importance of the ability of ToCV p22 to bind long dsRNA and thereby block Dicer cleavage to reduce sRNA accumulation, thus preventing silencing. In fact, the presence of p22 in GFP co-infiltrated patches can support the maintenance of a reduced level of GFP sRNAs for a long period of time (25–30 days) (Cañizares et al., 2008). Although the use of in vitro binding assays or transient heterologous expression systems to infer the mechanism of action of certain viral suppressors has recently been questioned (Incarbone and Dunoyer, 2013), we think that the use of such indirect methodologies might help to shed light on plant-virus interactions. One of the arguments against the use of these methodologies is that the viral suppressors of RNA silencing are often multifunctional proteins that perform other essential roles in the virus life cycle that require association with viral nucleic acids, thus concluding that the binding observed in vitro could not be a feature of silencing suppression. In the case of p22, however, this argument might not apply, as p22 seems to be a dedicated suppressor protein in the ToCV genome (Cañizares et al., 2008). The property of binding dsRNA Capítulo II 125 previously described for certain viral suppressors, such as TCV CP, has been questioned since the discovery of a new strategy based on the use of glycine/tryptophan (GW) mimicry to compete for and inhibit host AGOs (Azevedo et al., 2010). Recent studies, however, showed that these GW motifs are also important for binding dsRNA and, in the case of the Pelargonium line pattern virus (family Tombusviridae) p37 suppressor, an essential requirement to suppress RNA silencing (Pérez-Cañamás and Hernández, 2015). These results suggest that the RNA binding capability of suppressors containing GW motifs could have been overlooked. Thus, the property of binding dsRNA exhibited by some viral proteins that act as suppressors might not be an artifact but rather important to their function as suppressors. In summary, we believe that the characterization of the mode of action of p22 reported in this work is another important contribution to unraveling the complex interplay occurring during plant-virus interactions. We report a mechanism of action for p22 that does not seem common for plant viruses, which could explain its long-lasting suppressor activity. The high affinity for long dsRNAs affecting the Dicer-like cleavage might block the silencing process at early steps by hindering the generation of sRNAs. The possibility that the described mechanism of action of the p22 suppressor could occur during viral infections might be supported by the results obtained using a ToCV mutant deficient in p22 (our unpublished results), which showed that systemic viral infection is impeded in wild-type N. benthamiana plants but not in rdr6 N. benthamiana plants impaired in the synthesis of dsRNA precursors of secondary sRNAs. Thus, the blockage of dsRNA cleavage through binding might be an effective way to suppress the silencing used by ToCV and sustain effective infection of host plants. ACKNOWLEDGMENTS Y. L.-R. was the recipient of an AECID (Spain) fellowship. M.C.C. was the recipient of an I3P contract from the CSIC (Spain) co-financed by FSE. This work was supported by grants AGL2010-22287-C02-01/AGR and AGL2013-48913-C2-1-R from the Ministerio de Economía y Competitividad, Spain, co-financed by FEDER-FSE. J.N.C. and E.M.A. are members of the Research Group AGR-214, partially funded by the Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, Spain. We thank F. Aparicio for providing the pET vectors and helpful discussions, and we thank Capítulo II 126 M.V. Martín and R. Tovar for their technical assistance. We thank American Journal Experts (AJE) for English language editing. Capítulo II 127 REFERENCES Azevedo, J., Garcia, D., Pontier, D., Ohneshorge, S., Yu, A., Garcia, S., Braun, L., Bergdoll, M., Hakimi, M.A., Lagrange, T., Voinnet, O., 2010. Argonaute quenching and global changes in Dicer homeostasis caused by a pathogenencoded GW repeat protein. Genes & Development 24, 904-915. Baulcombe, D.C., 2005. RNA silencing. Trends in Biochemical Science 30, 290-293. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W.X., Ji, L.H., Ding, S.W., Baulcombe, D.C., 1998. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO Journal 17, 6739-6746. Burgyán, J., Havelda, Z., 2011. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science 16, 265-272. Cañizares, M.C., Lozano-Durán, R., Canto, T., Bejarano, E.R., Bisaro, D.M., NavasCastillo, J., Moriones, E., 2013. Effects of the crinivirus coat proteininteracting plant protein SAHH on post-transcriptional RNA silencing and its suppression. Molecular Plant Microbe Interactions 26, 1004-1015. Cañizares, M.C., Navas-Castillo, J., Moriones, E., 2008. Multiple suppressors of RNA silencing encoded by both genomic RNAs of the crinivirus, Tomato chlorosis virus. Virology 379, 168-174. Cañizares, M.C., Taylor, K.M., Lomonossoff, G.P., 2004. Surface exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic virus are required for suppression of silencing. Jornal of General Virology 85, 3431-3435. Chao, J.A., Lee, J.H., Chapados, B.R., Debler, E.W., Schneemann, A., Williamson, J.R., 2005. Dual modes of RNA-silencing suppression by Flock House virus protein B2. Nature Structural & Molecular Biology 12, 952-957. Chiba, S., Hleibieh, K., Delbianco, A., Klein, E., Ratti, C., Ziegler-Graff, V., Bouzoubaa, S., Gilmer, D., 2013. The benyvirus RNA silencing suppressor is essential for long distance movement, requires both zinc-finger and NoLS basic residues but not a nucleolar localization for its silencing suppression activity. Molecular Plant Microbe Interactions 26, 168-181. Cui, L., Wang, H., Ji, Y., Yang, J., Xu, S., Huang, X., Wang, Z., Qin, L., Tien, P., Zhou, X., Guo, D., Chen, Y., 2015. The nucleocapsid protein of coronaviruses acts as a Capítulo II 128 viral suppressor of RNA silencing in mammalian cells. Journal of Virology 89, 9029-9043. Dolja, V.V., Kreuze, J.F., Valkonen, J.P.T., 2006. Comparative and functional genomics of closteroviruses. Virus Research 117, 38-51. Fenner, B.J., Gob, W., Kwang, J., 2006. Sequestration and protection of doublestranded RNA by the betanodavirus B2 protein. Journal of Virology 80, 68226833. Fenner, B.J., Gob, W., Kwang, J., 2007. Dissection of double-stranded RNA binding protein B2 from betanodavirus. Journal of Virology 81, 5449-5459. Hamilton, A.J., Baulcombe, D.C., 1999. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952. Hilf, M.E., Karasev, A.V., Pappu, H.R., Gumpf, D.J., Niblett, C.L., Garnsey, S.M., 1995. Characterization of Citrus tristeza virus subgenomic RNAs in infected tissue. Virology 208, 576-582. Incarbone, M., Dunoyer, P., 2013. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analysis. Trends in Plant Science 18, 382-392. Ji, X., 2008. The mechanism of RNase III action: how dicer dices. Current Topics in Microbiology and Immunology 320, 99-116. Johansen, L.K., Carrington, J.C., 2001. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology 126, 930-938. Kadowaki, K., Ozawa, K., Kazama, S., Kubo, N., Akihama, T., 1995. Creation of an initiation codon by RNA editing in the coxI transcript from tomato mitochondria. Current Genetics 28, 415-422. Karasev, A.V., Hilf, M.E., Garnsey, S.M., Dawson, W.O., 1997. Transcriptional strategy of closteroviruses: mapping the 5´ termini of the Citrus tristeza virus subgenomic RNAs. Journal of Virology 71, 6233-6236. Kimberlin, C.R., Bornholdt, Z.A., Li, S., Woods, V.L., MacRae, I.J., Saphire, E.O., 2010. Ebolavirus VP35 uses a bimodal strategy to bind dsRNA for innate immune suppression. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences of the United States of America 107, 314-319. Lakatos, L., Csorba, T., Pantaleo, V., Chapman, E., Carrington, J.C., Liu, Y.P., Dolja, V.V., Calvino, L.F., López-Moya, J.J., Burgyán, J., 2006. Small RNA binding is Capítulo II 129 a common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors. EMBO Journal 25, 2768-2780. Lakatos, L., Szittya, G., Silhavy, D., Burgyán, J., 2004. Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses. EMBO Journal 23, 876-884. Lingel, A., Simon, B., Izaurralde E., Sattler, M., 2005. The structure of the Flock house virus B2 protein, a viral suppressor of RNA interference, shows a novel mode of doublestranded RNA recognition. EMBO Reports 6, 1149-1155. López, C., Navas-Castillo, J., Gowda, S., Moreno, P., Flores, R., 2000. The 23-kDa protein coded by the 3'-terminal gene of Citrus tristeza virus is an RNA-binding protein. Virology 269, 462-470. Lu, R., Folimonov, A., Shintaku, M., Li, W.X., Falk, B.W., Dawson, W.O., Ding, S.W., 2004. Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA genome. Proceedings of the Nacional Academy of Sciences of the United States of America 101, 15742-15747. Mérai, Z., Kerényi, Z., Molnár, A., Barta, E., Váláczi, A., Bisztray, G., Havelda, Z., Burgyán, J., Silhavy, D., 2005. Aureusvirus P14 is an efficient RNA silencing suppressor that binds double-stranded RNAs without size specificity. Journal of Virology 79, 7217-7226. Mérai, Z., Kerényi, Z., Kertész, S., Magna, M., Lakatos, L. , Silhavy, D., 2006. Double-stranded RNA binding may be a general plant RNA viral strategy to suppress RNA silencing. Journal of Virology 80, 5747-5756. Molnár, A., Csorba, T., Lakatos, L., Várallyay, E., Lacomme, C., Burgyán, J., 2005. Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly structured single-stranded viral RNAs. Journal of Virology 79, 7812-7818. Noris, E., Accotto, G.P., Tavazza, R., Brunetti, A., Crespi, S., Tavazza, M., 1996. Resistance to tomato yellow leaf curl geminivirus in Nicotiana benthamiana plants transformed with a truncated viral C1 gene. Virology 224, 130-138. Pérez-Cañamás, M., Hernández, C., 2015. Key importance of small RNA binding for the activity of a glycine-tryptophan (GW) motif-containing viral suppressor of RNA silencing. Journal of Biological Chemistry 290, 31063120. Qi, N., Cai, D., Qiu, Y., Xie, J., Wang, Z., Si, J., Zhang, J., Zhou, X., Hu, Y., 2011. RNA binding by a novel helical fold of B2 protein from Wuhan Nodavirus Capítulo II 130 mediates the suppression of RNA interference and promotes B2 dimerization. Journal of Virology 85, 9543-9554. Satyanarayana, T., Gowda, S., Ayllón, M.A., Albiach-Martí, M.R., Rabindran, S., Dawson, W.O., 2002. The p23 protein of Citrus tristeza virus controls asymmetrical RNA accumulation. Journal of Virology 76, 473-483. Schnettler, E., Hemmes, H., Huismann, R., Goldbach, R., Prins. M., Kormelink R., 2010. Diverging affinity of tospovirus RNA silencing suppressor proteins, NSs, for various RNA duplex molecules. Journal of Virology 84, 11542-11554. Szittya, G., Molnár, A., Silhavy, D., Hornyik, C., Burgyán, J., 2002. Short defective interfering RNAs of tombusviruses are not targeted but trigger posttranscriptional gene silencing against their helper virus. Plan Cell 14, 359-372. Takeda, A., Sugiyama, K., Nagano, H., Mori, M., Kaido, M., Mise, K., Tsuda, S., Okuno, T., 2002. Identification of a novel RNA silencing suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Letters 532, 75-79. van Rij, R.P., Saleh M.C., Berry, B., Foo, C., Houk, A., Antoniewski, C., Andino, R., 2006. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development 20, 2985-2995. Vargason, J.M., Szittya, G., Burgyán, J., Tanaka Hall, T.M., 2003. Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor. Cell 115, 799-811. Voinnet, O., Vain, P., Angell, S., Baulcombe, D.C., 1998. Systemic spread of sequencespecific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA. Cell 95, 177-187. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe D.C., 2000. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell 103, 157167. Voinnet, O., 2005. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nature Reviews Genetics 6, 206-220. Wisler, G.C., Li, R.H., Liu, H-Y, Lowry, D.S., Duffus, J.E., 1998. Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited bipartite closterovirus of tomato. Phytopathology 88, 402-409. Capítulo II 131 Zhang, H., Kolb, F.A., Jaskiewicz, L., Westhof, E., Filipowicz, W., 2004. Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118, 5768. Bibliografía 234 Zeng, R., Liao, Q., Feng, J., Li, D. and Chen, J., 2007. Synergy between Cucumber mosaic virus and Zucchini yellow mosaic virus on Cucurbitaceae hosts tested byreal-time reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta Biochimica et Biophysica Sinica 39, 431–437. Zhai, Y., Bag, S., Mitter, N., Turina, M., Pappu, H.R., 2014. Mutational analysis of two highly conserved motifs in the silencing suppressor encoded by Tomato spotted wilt virus (genus Tospovirus, family Bunyaviridae). Archives of Virology 159, 1499–1504. Zhang, G., Chen, M., Li, L., Xu, Z., Chen, X., Guo, J., Ma, Y., 2009. Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco. Journal of Experimental Botany 60, 3781–3796. Zhang, W., Gao, S., Zhou, X., Xia, J., Chellappan, P., Zhou, X., Zhang, X., Jin, H. 2010. Multiple distinct small RNAs originated from the same microRNA precursors. Genome Biology 11, R81. Zhang, X., Du, P., Lu, L., Xiao, Q., Wang, W., Cao, X., Ren, B., Wei, C., Li, Y., 2008. Contrasting effects on HCPro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovirus on the accumulation of siRNAs. Virology 374, 351-360. Zhang, X., Yuan, Y.R., Pei, Y., Lin, S.S., Tuschl, T., Patel, D.J., Chua, N.H., 2006. Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonaute1 cleavage activity to counter plant defense. Genes & Development 20, 3255–3268. Zhang, X., Zhand, X., Singh, J., Li, D., Qu, F., 2012. Temperature-dependent survival of Turnip crinkle virus-infected Arabidopsis plants relies on an RNA silencing based defense that requires DCL2, AGO2 and HEN1. Journal of Virology 86, 6847-6854. Zhao, L.M., Li, G., Gao, Y., Liu, Y.J., Sun, G.Z., Zhu, X.P., 2014. Molecular detection and complete genome sequences of Tomato chlorosis virus isolates from infectious outbreaks in China. Journal of Phytopathology 162, 627-634. Zhou, Z.Sh., Dell’Orco, M., Saldarelli, P., Turturo C., Minafra, A., Martelli, G.P., 2006. Identification of an RNA silencing suppressor in the genome of Grapevine virus A. Journal of General Virology 87, 2387-2395. Zhu, F., Xi, D.H., Yuan, S., Xu, F., Zhang, D.W., Lin, H.H., 2014. Salicylic acid and jasmonic acid are essential for systemic resistance against Tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant Microbe Interactions Journal 27, 567–577. Bibliografía 235 Zhu, S., Lim, G.H., Yu, K., Jeong, R.D., Kackroo, A., Kachroo, P., 2014. RNA silencing components mediate resistance signaling against Turnip crinkle virus. Plant Signal Behaviour 9, e28435. Zhu, S., Jeong, R.D., Lim, G.H., Yu, K., Wang, C., Chandra-Shekara, A.C., Navarre, D., Klessig, D.F., Kachroo, A., Kachroo, P., 2013. Double-stranded RNAbinding protein 4 is required for resistance signaling against viral and bacterial pathogens. Cell Reports 4, 1168–1184. Ziebell, H., Murphy, A.M., Groen, S.C., Tungadi, T., Westwood, J.H., Lewsey, M.G., Moulin, M., Kleczkowski, A., Smith, A.G., Stevens, M., Powell, G., Carr, J.P., 2011. Cucumber mosaic virus and its 2b RNA silencing suppressor modify plant-aphid interactions in tobacco. Scientific Reports 1, 187. Bibliografía 236