Utilidad de la determinación de marcadores solubles en sangre y bilis en pacientes con trasplante hepático en el diagnóstico de rechazo y complicaciones postrasplante

! 1! UNIVERSIDAD*DE*MÁLAGA* FACULTAD*DE*MEDICINA! ! DEPARTAMENTO!DE!CIRUGÍA,!OBSTETRICIA!Y!CIRUGÍA! ! ! ! ! UTILIDAD*DE*LA*DETERMINACIÓN*DE* MARCADORES*SOLUBLES*EN*SANGRE*Y*BILIS* EN*PACIENTES*CON*TRASPLANTE*HEPÁTICO* EN*EL*DIAGNÓSTICO*DE*RECHAZO*Y* COMPLICACIONES*POSTRASPLANTE* * * * TESIS*DOCTORAL* * * * * Mª*DEL*CARMEN*TEJIDO*SÁNCHEZ* * 2015* AUTOR: María del Carmen Tejido Sánchez http://orcid.org/0000-0002-6817-2533 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es ! 3! UNIVERSIDAD*DE*MÁLAGA* DEPARTAMENTO!DE!CIRUGÍA,!OBSTETRICIA!Y! GINECOLOGÍA! ! _______________________________________________________________! * UTILIDAD*DE*LA*DETERMINACIÓN*DE* MARCADORES*SOLUBLES*EN*SANGRE*Y*BILIS*EN* PACIENTES*CON*TRASPLANTE*HEPÁTICO*EN*EL* DIAGNÓSTICO*DE*RECHAZO*Y*COMPLICACIONES* POSTRANSPLANTE* _________________________________________________________* TESIS*DOCTORAL* * ! DIRIGIDA*POR** * JOSE*MARÍA*ÁLAMO*MARTÍNEZ* GABRIEL*ÁNGEL*CARRANQUE*CHÁVES* * * * * **********MARÍA*DEL*CARMEN*TEJIDO*SÁNCHEZ* * ! 4! * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ! 5! 2015 ! FACULTAD DE SEVILLA AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS PARA SU PRESENTACIÓN El Dr. José María Álamo Martínez, Profesor del Departamento de Cirugía, como Director de la Tesis Doctoral titulada “UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE MARCADORES SOLUBLES EN SANGRE Y BILIS EN PACIENTES CON TRASPLANTE HEPÁTICO EN EL DIAGNÓSTICO DE RECHAZO Y COMPLICACIOONES POSTRASPLANTE” realizada por Doña Mª del Carmen Tejido Sánchez en dicho Departamento juntamente con la Universidad de Sevilla, autoriza su presentación a trámite dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa. Lo que firmo, para dar cumplimiento a los reales decretos 185/85, 778/98 y 56/05, en Málaga a 31 de Octubre de 2015. Prof. Dr. José María Álamo Martínez! ! 6! ! FACULTAD DE MEDICINA AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS PARA SU PRESENTACIÓN El Dr. Gabriel Ángel Carranque Chaves, Profesor del Departamento de Cirugía, Obstetricia y Ginecología, como Director de la Tesis Doctoral titulada “UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE MARCADORES SOLUBLES EN SANGRE Y BILIS EN PACIENTES CON TRASPLANTE HEPÁTICO EN EL DIAGNÓSTICO DE RECHAZO Y COMPLICACIONES POSTRANSPLANTE” realizada por Doña Mª del Carmen Tejido Sánchez en dicho Departamento juntamente con la Universidad de Sevilla, autoriza su presentación a trámite dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa. Lo que firmo, para dar cumplimiento a los reales decretos 185/85, 778/98 y 56/05, en Málaga a 31 de Octubre de 2015. Prof. Dr. Gabriel Ángel Carranque Chaves! ! 7! ! ! A mis padres A mis hijos Marta, Laura y Gonzalo A mi hermano Ángel ! 8! ! 9! AGRADECIMIENTOS ! 16! 6.5 RESULTADOS GLOBALES DE ICAM-1 EN SANGRE…………………. 146 6.5.1 Descriptivos……………………………………………………………. 146 6.5.2 Resumen media en los tres grupos por día………………………... 149 6.5.3 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 1……………………………………………………………… 150 6.5.4 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 5……………………………………………………………… 151 6.5.5 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 10……………………………………………………………. 152 6.5.6 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 15…………………………………………………………… 153 6.5.7 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 20…………………………………………………………… 154 6.5.8 Pruebas no paramétricas (Kruskal-Wallis/Mann-Whitney)……… 155 6.5.9 Curvas ROC sICAM-1………………………………………………. 156 6.6 RESULTADOS GLOBALES DE ICAM-1 EN BILIS…………………….. 158 6.6.1 Descriptivos…………………………………………………………… 158 6.6.2 Resumen media en los tres grupos por día……………………….. 161 6.6.3 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 1…………………………………………………………….. 162 6.6.4 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 5…………………………………………………………….. 163 6.6.5 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 10…………………………………………………………… 164 6.6.6 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 15…………………………………………………………… 165 6.6.7 Diagrama de cajas de la media en los tres grupos y su curva de ROC día 20…………………………………………………………… 166 6.6.8 Pruebas no paramétricas (Kruskal-Wallis/Mann-Whitnay)……… 167 6.6.9 Curvas de ROC ICAM-1 bilis……………………………………….. 169 6.7 RESUMEN EVOLUCIÓN NIVELES EN EL TIEMPO DE LOS DISTINTOS MARCADORES EN LOS DIFERENTES GRUPOS……………… 171 ! 17! 7. DISCUSION………………………………………………………………….. 173 7.1 DETERMINACIÓN DE RECEPTORES DE INTERLEUKINA-2 EN SUERO……………………………………………………………………….. 177 7.2 DETERMINACIÓN DE RECEPTORES DE INTERLEUKINA-2 EN BILIS………………………………………………………………………….. 182 7.3 DETERMINACIÓN DE ICAM-1 EN SUERO……………………………… 187 7.4 DETERMINACIÓN DE ICAM-1 EN BILIS………………………………… 191 7.5 OTROS PARÁMETROS……………………………………………………. 195 8. CONCLUSIONES……………………………………………………………... 199 9. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………… 203 10. ABREVIATURAS…………………………………………………………….. 219 ! 18! INTRODUCCIÓN ! 19! 1.1 GENERALIDADES DE LA INMUNOLOGÍA Parte de la introducción se basa en el CURSO DE INMUNOLOGÍA GENERAL. Profesor Enrique Iáñez Pareja. Departamento de Microbiología. Universidad de Granada. España. 1.1.1 REFERENCIAS HISTÓRICAS DE LA INMUNOLOGÍA Las primeras referencias históricas a la Imnunología se encontraron ya en el papiro de Ebers, escrito en 1550 a.c. y que fue descubierto entre los restos de una momia en la tumba de Assasif, en Luxor, por Edwin Smith en 1862, fue comprado a continuación por el egiptólogo alemán Georg Ebers, al que debe su nombre y su traducción. Allí se puede leer un relato en el que habla del ácido salicílico, contenido en las hojas de sauce, como antiinflamatorio. La actual aspirina (ácido acetil salicílico) no es nada más que una modificación química de aquella molécula. Tucídides (siglo V a.C) ya hablaba en sus escritos de la “inmunidad contra la plaga” si bien no sabemos si entonces se entendia la palabra plaga tal como lo hacemos hoy. En el año 10 (a.C.) Celsus describió los signos capitales de la inflamación: rubor et tumor cum calore et dolore (enrojecimiento, aumento del tamaño, aumento de la temperatura y dolor). Unos 140 años más tarde le agregó Galeno el 5º signo: “functio laesa” (alteración de la función). Los senadores romanos disfrutaron durante 6 siglos (3º a.C a 3º d.C) de protección parlamentaria, llamada entonces “Inmunitas”. Los chinos, 200 años a. C. ya intentaban proteger a los niños de la viruela administrándoles por vía nasal polvo obtenido triturando costras de viruela obtenidas de las lesiones de los enfermos. El primer abordaje científico a la vacunación lo hizo un médico general inglés, Edward Jenner (1796), tras observar que las ordeñadoras de vacas padecían unas lesiones en las manos pero nunca padecían la viruela. Tomó material de dichas lesiones y se lo inyectó a un niño que posteriormente no padeció la viruela humana incluso inyectándole el virus. Así, el tratado sobre vacunación escrito por Jenner en 1798 tuvo gran impacto y permitió que la OMS considerara a la viruela erradicada en 1979. ! 20! Sorprendentemente los trabajos iniciales de vacunación se hicieron incluso sin saber que las enfermedades de las que se pretendía proteger eran causadas por microorganismos. Fue Robert Koch, a finales del siglo XIX, el que descubrió que las infecciones eran causadas por microorganismos. Hoy es tan obvio que apenas le damos importancia a estos descubrimientos tan fantásticos. Louis Pasteur descubrió la vacuna contra la rabia en 1880 y Emil von Behring & Shibasaburu Kitasato descubrieron que los individuos vacunados desarrollaban algo en el suero que les protegía. Resultaron ser anticuerpos. Elie Metchnicoff, uno de los más grandes inmunólogos de la antigüedad, descubrió la fagocitosis y acuñó los términos macrófago y micrófago (probablemente los conocidos hoy como neutrófilos). El desarrollo de la inmunología se ha desarrollado en una época relativamente reciente en relación con otras ciencias. Uno de los mayores obstáculos a este desarrollo ha sido la inercia de la mente humana, resistente a abrirse a concentos nuevos y revolucionarios. Baste como ejemplo que el médico Miguel Servet fue quemado en la hoguera por decir que la sangre no es un líquido estático sino que circula por nuestro cuerpo. La historia de la inmunología está llena de personajes ilustres y científicos muy brillantes. Muchos de ellos fueron galardonados con el premio Nobel. Quizás también lo merecieron otros que trabajaron en la sombra en sus proyectos. 1.1.2 CONCEPTOS GENERALES DE INMUNOLOGÍA La Inmunología es la ciencia encargada del estudio del Sistema Inmune y las patologías con él relacionadas. El sistema inmune es el encargado de proteger al individuo de las agresiones de otros seres vivos procedentes del medio ambiente exterior (microorganismos, helmintos, etc.), o del propio medio interno (células neoplásicas). El sistema inmune, en vez de ser una estructura integrada por órganos y aparatos, es más bien, una red de células distribuidas por todo el organismo, intercomunicadas y perfectamente coordinadas. Estas células tienen una gran movilidad y pueden localizarse en la sangre o situarse en órganos, como el ganglio, en tejidos, como la pulpa blanca del bazo, o bien encontrarse dispersas en el seno de tejidos pertenecientes a otros órganos o aparatos, como los linfocitos localizados en el tejido conjuntivo. ! 21! Funcionalmente, el sistema inmune está integrado por dos grandes sistemas o mecanismos defensivos frente a los agentes extraños virtualmente patógenos: la inmunidad natural y la adaptativa Inmunidad natural o inespecífica Sus componentes están siempre presentes y dispuestos para actuar inmediatamente sin requerir tiempo de latencia para el desencadenamiento de las acciones defensivas. La inmunidad natural carece de especificidad y de memoria. En otras palabras, sus respuestas son estereotipadas, con independencia de la naturaleza del antígeno, y no registran un aumento de eficacia en sucesivas exposiciones al mismo. La inmunidad natural está constituida por: Las barreras epiteliales. * Inmunidad natural celular: fagocitos (monocitos-macrófagos y leucocitos PMN) y células agresoras naturales (células Natural Killer ). *Inmunidad natural humoral: lisozima, complemento e interferón. Inmunidad adaptativa Es mucho más compleja que la inespecífica, se caracteriza por: adaptabilidad al antígeno, especificidad y memoria. Tras la entrada de un germen, por primera vez, en el organismo se desarrolla una respuesta inmune primaria. Dicha respuesta se puede estructurar en tres etapas: *Reconocimiento del antígeno. *Periodo de latencia: dura varios días, en los que los linfocitos específicos amplifican su número (expansión clonal), a la vez que se diferencian en células efectoras. * Respuesta efectora, consistente en: - Secreción de anticuerpos específicos. - Desarrollo de actividad citolítica específica. - Liberación de factores que activan las células fagocíticas. - Adquisición de memoria inmunitaria. ! 22! ÓRGANOS DEL SISTEMA INMUNE Los linfocitos son las principales células responsables de la respuesta inmunitaria, están distribuidos por todo el organismo en órganos bien delimitados, o en forma de acumulaciones difusas; al conjunto de estas estructuras se le denomina sistema linfático y están en intercomunicación continua gracias al tránsito, desde unas a otras, de los linfocitos a través de las circulaciones sanguínea y linfática. Los órganos linfoides se dividen en dos grandes categorías: Organos linfoides primarios (centrales) Se consideran órganos linfoides primarios aquellos en los que se originan y maduran las células del sistema inmune MEDULA ÓSEA Los linfocitos proceden de la célula hematopoyética pluripotencial (CHP), las CHP son de origen mesodérmico y aparecen inicialmente en el saco vitelino del embrión para luego trasladarse al hígado (6ª semana) y más tarde (a partir del 5º mes) a la médula ósea, órgano hematopoyético fundamental para el resto de la vida. Los linfocitos que maduran (se diferencian) en la médula ósea se denominan en linfocitos B y están especializados en la producción de anticuerpos. El microambiente de la médula ósea que determina la maduración de los linfocitos B no se conoce con precisión, consiste en la liberación de factores solubles (como la IL-17) y estimulaciones yuxtacrinas que llevan a cabo las células del estroma medular. También es muy importante la interacción de las células inmaduras con proteínas de la matriz extracelular. TIMO Es un órgano linfoepitelial, de forma bilobulada, imprescindible para la adquisición de la inmunocompetencia de los linfocitos T durante los primeros años de la vida. El periodo clave de este proceso lo constituiría el desarrollo ontogénico, ya que la extirpación del timo a un adulto (o al final de la adolescencia, con el desarrollo del sistema inmunitario completo) no implica un déficit inmunitario. El órgano deriva de un esbozo epitelial formado a partir de la 3ª y 4ª bolsas faríngeas, y es el primer órgano linfoide que aparece. El tamaño del timo aumenta a lo largo de la vida fetal y postnatal hasta alrededor de la pubertad, momento a partir del ! 23! cual empieza a involucionar En el adulto la producción y maduración de los linfocitos T tiene lugar en la médula. Organos linfoides secundarios Son los órganos donde los linfocitos ya maduros, e inmunológicamente competentes, toman contacto con los antígenos y donde se producen las respuestas inmunitarias frente a los estímulos antigénicos. Básicamente, existen tres tipos de órganos linfoides secundarios, los ganglios linfáticos, el bazo y el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT). El funcionamiento de los tres es similar distinguiéndose básicamente por la procedencia de los antígenos que penetran en ellos y que provienen, respectivamente de: Linfa (medio extracelular de los tejidos) en el caso de los ganglios linfáticos Sangre en el caso del bazo Luz intestinal en el caso de las placas de Peyer (tejido MALT del intestino). GANGLIO LINFATICO Tienen una forma similar a la del riñón, con una longitud y grosor, respectivamente, inferiores a 1 y 0.5 cm en condiciones fisiológicas. Cuando se desencadena una respuesta, el tamaño aumenta. Histológicamente, se distinguen tres zonas. * Corteza, donde se localizan los linfocitos B formando los folículos linfoides primarios y secundarios (son los que tienen centro germinal) * Paracorteza, poblada por linfocitos T dispuestos de manera difusa. * Médula. Contiene linfocitos B y T. Los cordones medulares, que parten de la paracorteza como prolongaciones de tejido linfoide en la médula, contienen la mayor parte de las células plasmáticas que existen en el ganglio. Los linfocitos T son la población linfocitaria mayoritaria en el ganglio, considerado en conjunto. TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A LAS MUCOSAS (MALT) En la submucosa de los principales puntos de posible entrada de microorganismos, se sitúan agregados de tejido linfoide, difusos en la lámina propia y o en nódulos como las amígdalas y adenoides (en la nasofaringe) o en las placas de Peyer (en el intestino). ! 24! También existen linfocitos intraepiteliales, situados entre las células del epitelio, por encima de la membrana basal. El MALT desempeña un papel importante en la respuesta inmunitaria local de la superficie de las mucosas. BAZO El bazo es donde se eliminan los hematíes envejecidos (pulpa roja), pero además es un órgano linfoide secundario (pulpa blanca), y en situaciones extremas puede producir hematopoyesis extramedular. El tejido linfoide se organiza alrededor de las arteriolas a modo de manguitos (tejido linfoide periarteriolar), contiene áreas de linfocitos T y B, siendo los linfocitos B los mayoritarios. Además de linfocitos, en el bazo existen células de estirpe macrofágica que fagocitan los hematíes viejos y las bacterias que pudieran llegan por la circulación. El bazo carece de vasos linfáticos, por lo que los linfocitos que circulen por él sólo pueden entrar por la arteria y salir por la vena del mismo a la circulación portal. ! 25! 1.2 INMUNIDAD CELULAR En la actualidad se considera como “inmunidad mediada por células” cualquier respuesta contra microorganismos o tumores a la que los anticuerpos juegan un papel subordinado o secundario. En la respuesta inmune humoral se activan células al principio de dicha respuesta. En muchas respuestas celulares los anticuerpos juegan papeles esenciales como “puentes” entre células. Además, cualquier respuesta celular se acompaña a la vez de producción de anticuerpos, que a su vez pudiendo modificar las respuestas celulares de distintas maneras: p. ej., la formación de complejos Ag-Ac activa el complemento, liberando péptidos que funcionan como factores quimiotácticos que inducen la acumulación de mayor número de células inmunes y aumentado la respuesta inflamatoria. Por otro lado, no todas las respuestas celulares dependen de linfocitos T: de hecho las primeras líneas defensivas contra microorganismos son inespecíficas, y se centran en la identificación de componentes microbianos comunes por parte de células del sistema de inmunidad natural (macrófagos, granulocitos, neutrófilos, etc…). Una de las posibles clasificaciones de la inmunidad mediada por células sería la siguiente: 1. Reacciones dependientes de fagocitos del sistema natural: * Fagocitosis * Producción de citokinas. 2. El papel central de las células Th en la determinación del tipo de mecanismo efector puesto en marcha. 3. La citotoxicidad directa que produce la lisis de la célula diana enferma es realizada por varios tipos celulares: * Dentro del sistema específico: linfocitos T citotóxicos, que se denominan linfocitos T citolíticos (CTL) en su fase efectora. * Dentro del sistema natural: células agresoras naturales (NK) y macrófagos. * Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) * Células T CD4+ que median reacciones de hipersensibilidad tipo retardado. ! 32! En cambio, las células Tc de memoria tienen menos requerimientos para su activación. De hecho, como ya sabemos, al tener moléculas de adhesión celular diferentes a las correspondientes Tc vírgenes, pueden encontrarse el antígeno en tejidos extralinfoides. 1. No requieren obligatoriamente la señal coestimulatoria. 2. No requieren obligatoriamente la ayuda de Th, ya que al unirse de modo específico a una célula propia infectada que le suministre el péptido adecuado, provoca que el Tc produzca no sólo receptores de IL-2, sino niveles adecuados de IL-2 capaces de auto-activarlas. Así, se provoca la proliferación y diferenciación del linfocito en reposo (virgen o de memoria) hasta que se convierte en linfocito T citolítico (CTL). Este CTL se caracteriza por poseer algo más de citoplasma que el Tc, y sobre todo por poseer gránulos densos a los electrones, rodeados de unidad de membrana (llamados a veces granulosomas) y un aparato de Golgi. Se produce una interacción de gran avidez entre moléculas de LFA-1 del CTL y moléculas de ICAM-1 de la célula diana tras el reconocimiento específico. Esta unión dura unos 5-10 minutos, durante los cuales las señales de la unión intercelular se trasducen al interior del CTL por medio de cascadas de proteín-quinasas y proteínfosfatasas, conduciendo a la activación de una serie de funciones del CTL. Se dice entonces que el linfocito queda programado para la lisis. El citoesqueleto del CTL se reorganiza, situándose el aparato de Golgi y los granulosomas en el polo celular que queda en contacto con la célula diana. Entonces, los gránulos se fusionan con la membrana citoplásmica, produciéndose la exocitosis de su contenido al estrecho espacio intercelular. Antes de que se produzca la lisis de la célula diana, el CTL se separa, probablemente ayudado por el hecho de que la LFA-1 vuelve al estado de baja afinidad. Parece que la destrucción de la célula diana puede ocurrir por varios mecanismos, predominando uno u otro según la naturaleza de la superficie de la célula diana, y del grado de activación que haya alcanzado el linfocito CTL. * Monómeros de perforina contenida en los granulosomas llegan a la membrana de la célula diana, y en presencia de Ca++ se polimerizan para formar cilindros huecos de poliperforina, que atraviesan la bicapa lipídica. Así se forma un ! 33! canal que es permeable a iones, y que puede provocar la lisis osmótica de la célula diana. * Pero no siempre el efecto de la poliperforina es la lisis. En otros casos parece que el papel de los canales es el de permitir la entrada de otras sustancias del granulosoma que inducen la apoptosis de la célula diana. De hecho se ha visto que pueden entrar fragmentinas (granzimas) que inducen la fragmentación de los cromosomas en múltiplos de nucleosomas. Respecto a la Granzima B, se trata de una fragmentina que induce fragmentación del ADN en múltiplos de nucleosomas. Se piensa que la granzima B secretada por el CTL ( y que entra a la célula diana a través de los canales de perforina) activa a la ICE ( proteasa endógena) o la sustituye para desencadenar el mecanismo de esta ruta apoptósica endógena. Pero no es el único mecanismo inductor de apoptosis por parte de los CTLs ( de hecho, algunos clones de CTLs carecen de perforina y de granzimas, y sin embargo inducen muerte celular de la célula diana). Podemos encontrar otro mecanismo dependiente de la interacción entre el llamado ligando Fas del CTL y el receptor Fas de la célula diana. * El receptor Fas (también llamado APO-1) es una proteína de membrana que pertenece a la llamada familia TNF de receptores de citoquinas. * Por su lado, el ligando Fas del CTL es una proteína de membrana que exige homologías de secuencia con TNF, y se une al Fas. La unión entre el ligando de Fas con el Fas de la célula infectada o enferma induce en ésta una señal que dispara la ruta endógena de apoptosis, con la consiguiente activación de la ICE y subsiguiente fragmentación del ADN. Las vesículas del CTL pueden contener TNF-a y TNF-b (= linfotoxina), que junto con el IFN-g producido por Tc o por otras células, desencadena efectos citotóxicos que tarda más tiempo que los anteriores. En cuanto a cómo se protege el CTL de sus propios mecanismos matadores. El condroitín sulfato (proteoglucano) del CTL se puede unir a la perforina, inactivándola. Pero puede que haya otros mecanismos: por ejemplo, según la hipótesis de Peters dice que la perforina sale del granulosoma dentro de pequeñas vesículas igualmente membranosas; la membrana de estas sub-vesículas contendrían complejos TCR-CD3-CD8, que encaminarían a las pequeñas vesículas hacia la célula diana, pero no al CTL. ! 34! Citotoxicidad directa inespecífica mediada por células NK Las células NK son un tipo de linfocitos granulares grandes que suponen un 5% de las células linfoides en sangre, y que carecen de los marcadores de linfocitos T y B. Se consideran como linfocitos “inespecíficos”, pertenecientes al sistema de inmunidad natural. El mecanismo citotóxico de las células NK es parecido al de los linfocitos citolíticos (CTL), pero a diferencia de ellos, carecen de especificidad y de memoria, y no están restringidos por el MHC clásico. Tienen un papel importante en los primeros días de una infección virásica, al eliminar células en las que el virus se esté multiplicando. Constituyen pues un mecanismo efector celular temprano, antes de que lleguen los linfocitos Tc, y especialmente preparado frente a ciertos virus que usan la estrategia de inducir un descenso del nivel de MHC-I. Se piensa que las NK reciben señales de dos receptores de modo que distinguen ente células sanas y enfermas. De esta manera, el receptor NKR-P1 se une a oligosacáridos de glucoproteínas de superficie de la célula enferma, procedentes de glucosilaciones anómalas. En principio, esta señal le indica a la NK que debe prepararse para matar a la célula con la que ha contactado. Para ello debe de ocurrir simultáneamente una ausencia de señal procedente de otro receptor, el Ly-49. La actividad matadora de NK se activa por IFN-a e IFN-b (liberado por muchas células enfermas al inicio de la infección), y por IL-12 (producido por macrófagos). A su vez, la IL-12 y el TNF-a (también del macrófago) provocan que la NK secrete grandes cantidades del IFN-g, con lo que se mantienen a raya ciertos patógenos intracelulares hasta que se activen las células T. De hecho rara vez las células NK eliminan efectivamente el virus, pero lo mantienen a raya hasta que llegan las células Tc. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos Existen varios tipos de células potencialmente citotóxicas que poseen receptores para Fc de anticuerpos, y que pueden por lo tanto participar en la destrucción de células diana (enfermas) o de helmintos recubiertos en ambos casos por anticuerpos. Los acontecimientos suelen tener lugar en las siguientes fases * Formación de inmunocomplejos ( la célula enferma o el helminto se recubre de anticuerpos) ! 35! * Una célula agresora adecuada interacciona con la célula enferma o el parásito a través de los anticuerpos, que se engarzan con el receptor para Fc de la célula agresora * Finalmente, dicha célula agresora libera por exocitosis el contenido de sus gránulos, y/o secreta productos tóxicos, que tienden a matar a la célula enferma o parásito. De este modo, células que son propiamente del sistema inmune natural, y por lo tanto son inespecíficas, pueden llegar a destruir específicamente mediante el puente de anticuerpos. De hecho, actúan como células efectoras finales del sistema humoral específico. 1.2.5 HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADO La hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una reacción inflamatoria localizada que se induce por citokinas secretadas por ciertas subpoblaciones de linfocitos Th (concretamente Th1) activados previamente por contacto con ciertos tipos de antígenos, y que se caracteriza por el reclutamiento al foco infeccioso de grandes cantidades de células inflamatorias, sobre todo e macrófagos. Se llama retardada porque, al contrario que la inmediata, tarda 2 o 3 días en manifestarse. Fases de la hipersensibilidad de tipo retardado En la respuesta hipersensible de tipo retardado podemos distinguir una fase inicial de sensibilización en la que se produce el contacto inicial con el estímulo antigénico, y que no presenta síntomas, y una fase efectora, dependiente de un contacto secundario con el antígeno, en la que se manifiestan tales síntomas y que es la tendente a eliminar el patógeno. La fase de sensibilización dura de una a dos semanas, tiempo durante el cual los linfocitos Th se activan y expanden clonalmente tras el reconocimiento del antígeno presentado por células presentadoras. Dichas células presentadoras pueden ser: * Células de Langerhans de la piel, que transportan el antígeno desde la epidermis hasta los ganglios linfáticos regionales, donde lo muestran a los linfocitos Th. * Macrófagos. ! 36! * Células del endotelio vascular. Al final de esta fase se tiene pues una población expandida de linfocitos T CD4+ de memoria, que recirculan constantemente. La fase efectora ocurre en tejido extralinfoide, y es la reacción de hipersensibilidad en sentido estricto, detectándose sus síntomas a las 24 horas del contacto secundario con el antígeno que provocó la sensibilización inicial, pero alcanza su apogeo a las 48-72 horas. En esta fase sale fibrinógeno al tejido, y se convierte en fibrina, que junto con la acumulación de linfocitos T y de macrófagos hace que el tejido se hinche y se vuelva duro (esta es la base de los síntomas de induración y edema). La podemos subdividir en tres etapas: desencadenamiento, inflamación y resolución. * En el desencadenamiento el linfocito T activado , ante el contacto secundario con el antígeno presentado por una APC, secreta ciertas citokinas, cuyas acciones dan paso a la reacción de inflamación. * La inflamación se produce cuando las citokinas secretadas reclutan y activan a macrófagos y otras células inflamatorias hacia el sitio de infección, poniéndose en marcha una compleja serie de interacciones entre células inespecíficas del sistema inmunitario y citokinas, con amplificación de la respuesta. Todo ello va encaminado a destruir al agente patógeno intracelular. * La resolución se produce porque los macrófagos activados aumentan su capacidad de eliminación del patógeno. Estos macrófagos son la principal célula efectora de la hipersensibilidad retardada, pudiendo representar el 90% de la población celular infiltrada. Interacción entre citokinas y célula en la DTH La relación de las distintas citokinas que actúan sobre los distintos tipos celulares, responsables de diversos aspectos de esta respuesta. * La IL-2 del linfocito Tdth funciona de modo autocrino, permitiendo la expansión clonal, con lo que aumenta el número de esas células, que siguen produciendo más citokinas. Conforme avanza la respuesta, la IL-2 también ejerce un efecto paracrino, estimulando a otros clones de linfocitos Tdth. * La IL-3 y el GM-CSF inducen hematopoyesis del linaje granulocito-monocíto en la médula ósea. Obviamente ello conlleva que mayores cantidades de PMN y macrófagos puedan pasar al foco de infección. ! 37! * El IFN-gamma y TNF-beta de las células T, así como el TNF-alfa y la IL-1 de los macrófagos actúan sobre las células endoteliales vasculares cercanas al foco de infección, con los siguientes efectos: -Aumento de expresión de moléculas de adhesión (ICAM, ELAM, VCAM) - Cambios de forma, tendentes a que las células endoteliales se separen entre sí, dejando paso para la extravasación de leucocitos. - Las células endoteliales estimuladas secretan IL-8 y otros factores quimiotácticos que atraen a monocitos circulantes (quimiocinas). - Como consecuencia los PMN neutrófilos y los monocitos circulantes se adhieren a las células endoteliales de las vénulas postcapilares, pasan por diapédesis y entran al tejido infectado. La entrada de los monocitos da lugar a su diferenciación a macrófagos. * Los macrófagos son atraídos y activados en el foco de infección debido a la acción de IFN-g y del factor quimiotáctico y activador de los monocitos (MCAF). Otro factor secretado por Th, llamado MIF (factor inhibidor de la migración de los macrófagos) evita que el macrófago “pase de largo” el foco infectivo, afinando su quimiotaxis. * Por lo tanto, los macrófagos van llegando en grandes cantidades al foco infeccioso, y se van activando (sobre todo por el interferón inmune), experimentando importantes cambios: - Aumentan su tamaño. - Aumentan sus niveles de enzimas líticos en sus gránulos. - Aumentan su capacidad fagocítica. - Incrementan su efectividad matadora de microorganismos intracelulares. - Funcionan mejor como células presentadoras de antígeno, debido a que es mayor el número de moléculas MHC de clase II en su membrana, porque secretan mayor cantidad de IL-1 y porque expresan más moléculas de adhesión como la B7 (coestimulatoria), ICAM-1 y LFA-3. El que los macrófagos actúen mejor ahora como APC supone que activan a más linfocitos Tdth, con los cual se cierra el ciclo, pero amplificado. Figura 4: Moléculas de adhesión en interacciones de leucocitos. Inmunobiología. El sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad. Charles A. Janeway et al. Ed. Masson. ! 38! 1.3 RESPUESTA HUMORAL La rama humoral del sistema inmune específico está diseñada para eliminar a patógenos extracelulares y evitar la diseminación de los intracelulares aprovechando que estos últimos se transmiten de célula a célula a través de los fluidos extracelulares. Ello se consigue mediante la producción de grandes cantidades de anticuerpos específicos frente a cada agente foráneo. 1. Los anticuerpos, por sí mismos no suelen eliminar más que a ciertos virus o inactivar toxinas bacterianas. 2. En la mayor parte de los casos, la eliminación efectiva del patógeno del patógeno suele deberse a la inducción de las funciones efectoras de los anticuerpos, que depende de la porción constante de las cadenas pesadas: a. Activación del complemento por la ruta clásica, que puede conducir a I. Lisis del patógeno II. Quimiotáxis de fagocitos III. Opsonización de fagocitos b. Opsonización de fagocitos por inmunocomplejos (Ag-Ac) c. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC): el anticuerpo se une a receptores para Fc en la superficie de células NK y macrófagos. Por lo tanto, en la respuesta humoral podemos distinguir dos grandes fases: la de inducción de la producción de anticuerpos, y la fase efectora, en la que dichos anticuerpos, directamente, o más a meno indirectamente, eliminan al patógeno. Ahora vamos a centrarmos en la producción de inmunoglobulinas circulantes ante un antígeno. Respecto a las interacciones celulares y de las señales químicas implicadas en el desencadenamiento de la producción de anticuerpos, se puede resumir el proceso en tres apartados interconectados: 1. El linfocito Th virgen reconoce a su péptido antigénico (procesado) enclavado en el surco de MHC-II, en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC). Ello provoca la activación y proliferación clonal de los linfocitos Th. 2. Por otro lado (paralelamente), la célula B reconoce el antígeno nativo por medio de su BCR (con mIg), lo que desencadena la endocitosis y procesamiento ! 39! endosómico de dicho antígeno. Algunos de los péptidos resultantes se “exportan” y se muestran en el surco de moléculas MHC-II del propio linfocito B. 3. El linfocito Th activado interacciona ahora mediante su TCR con el complejo (epítopo-MHC-II) del linfocito B. En este contacto entre ambas células tiene lugar un intercambio de señales químicas que conduce a la activación, proliferación clonal y diferenciación de las células B en dos subclones hermanos: uno de células plasmáticas secretoras de anticuerpos, y otro de células B cebadas de memoria. Figura 5: Las células T cooperadoras armadas estimulan la proliferación y luego la diferenciación de las células B que han unido antígeno. Inmunobiología. El sistema inmunitario en condiciones de Salud y enfermedad Charles A. Janeway et al. Ed. Masson 1.3.1 RESPUESTA PRIMARIA Y RESPUESTA SECUNDARIA Fases de la respuesta: 1. Fase lag (de retardo): es el tiempo que se tarda en la selección de un clon específico de células B y en la producción de células plasmáticas secretoras de Ac y de células B de memoria. 2. Aumento exponencial (hasta un pico máximo). 3. Meseta. 4. Declive. En total la respuesta puede durar desde unos días a varias semanas, dependiendo de a persistencia del antígeno. En la respuesta primaria primero se produce IgM, y luego IgG, siendo en ella la contribución global de la IgM más importante. En cambio, en la respuesta secundaria se produce mucha mayor cantidad de IgG que de IgM. Las células B de memoria quedan en reposo (G0) durante muchos años (incluyo persisten durante toda la vida). ! 40! La respuesta secundaria posee una serie de importantes diferencias cualitativas y cuantitativas con respecto a la respuesta primaria. Diferencias cuantitativas: * Se inicia más rápidamente (mayor fase lag) * Alcanza más intensidad (100 a 1000 veces mayor) * Dura más tiempo, como se comprueba por la fase de meseta más prolongada y su declive más lento. Diferencias cualitativas: * Ocurre cambio de clase, produciéndose preferentemente IgG, aunque también IgA e IgE. * Tiene lugar la maduración de afinidad por hipermutación somática y selección “darwiniana” de los linfocitos con receptores de mayor afinidad. 1.3.2 FASES DE LA INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA HUMORAL Antes de entrar en detalles de cómo se activan y proliferan y diferencian los linfocitos B hasta que producen y secretan anticuerpos, dando una idea general de proceso: 1. Un linfocito Th virgen o de memoria entra en contacto con una APC, que le presenta un péptido antigénico enclavado en su MHC-II; ello provoca la activación y proliferación clonal del linfocito Th. 2. Por otro lado, la célula B (virgen o de memoria) reconoce al antígeno nativo, pero interaccionando con otro epítopo diferente al que reconoció el Th. Acto seguido internaliza este Ag y lo procesa, presentando algunos de los péptidos resultantes en las moléculas MHC-II. 3. El linfocito Th cebado del paso #1 reconoce por su TCR a la combinación específica péptido-MHC-II en la superficie del linfocito B del paso #2, formándose el llamado conjuntado Th-B. En dicho conjugado, el linfocito coadyuvante suministra dos tipos de señales químicas al linfocito B: * El Th expresa en su membrana la molécula CD40L (CD154) * Secreta citokinas 4. Cambios en el patrón de expresión génica. Las proteínas producidas por estos genes inducidos provocan la proliferación clonal del linfocito, y finalmente la ! 41! diferenciación hasta células plasmáticas secretoras de anticuerpos y células B de memoria. (La célula B que no reciba estas señales del Th quedará anérgica) En este apretado resumen se pueden ya apreciar algunas de las características clave del proceso: * La célula B puede funcionar como célula presentadora de antígeno (APC) para la Th. * El linfocito Th y el linfocito B, por medio de sus respectivos receptores específicos, reconocen determinantes (epítopos) diferentes del mismo antígeno o complejo antigénico original. (Cada linfocito B reconoce una parte de una proteína, o la porción lipídica o hidrocarbonada de un conjunto con proteína). * La inmunoglobulina de membrana (mIg) del linfocito B cumple dos papeles: como parte del complejo BCR (junto con Ig alfa/Ig beta) transmite señales al interior celular, y como receptor específico implicado en la endocitosis, para llevar al Ag nativo a la ruta endocítica para su degradación y procesamiento. Fase 1ª: Activación y proliferación del linfocitos Th El antígeno nativo puede viajar por sí solo a un órgano linfoide secundario, o bien puede ser transportado (y eventualmente procesado) por una célula presentadora de antígeno (APC) * Células de Langerhans de la piel captan el antígeno, viajan por los vasos linfáticos como células “a vela”, y al llegar al ganglio se convierten en células dendríticas interdigitantes. * Células dendríticas intersticiales de los tejidos. * Macrófagos/monocitos. En el órgano linfoide secundario la APC presenta algún epítopo a un linfocito Th en reposo, interaccionando ambas células de la forma estudiada en el tema anterior: * Señal #1: unión del TCR al epítopo enclavado en MHC-II de la APC. * Señal #2: (coestimulatoria): unión del CD28 del Th a la B7 de la APC. * Además, la APC secreta citoquinas como la IL-1 y la IL-6. ! 48! RESPUESTA SECUNDARIA La respuesta secundaria tiene lugar in vivo de una forma parecida a lo que acabamos de ver, pero existen algunas diferencias que pasamos a comentar: * Cuando entra al antígeno por 2ª vez (o ulterior) parte de las moléculas pueden unirse a anticuerpos persistentes procedentes de a respuesta primaria, de modo que se forman complejos Ag-Ac. * Cuando los inmunocomplejos entran a ganglio, se unen a las células dendríticas foliculares. Estas células “empaquetan” parte de los complejos Ag-Ac en vesículas membranosas denominadas iccosomas, que se van desprendiendo por gemación a partir de los engrosamientos (“perlas”) de los largos procesos de membrana. * Las células B memoria generadas durante la respuesta primaria que tengan mIg de alta afinidad compiten eficazmente con los anticuerpos circulantes para unirse con el Ag que forma parte de los inmunocomplejos de los iccosomas: se unen a estos iccosomas, los engullen enteros, procesan el antígeno y se lo presentan (en surco de MHC-II) a linfocitos Th específicos. Se forma el conjugado Th-B, con lo que la célula B se activa y prolifera (como centroblastos) en el centro germinal, hasta que al 4º o 5º día se diferencia a células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Al igual que en la respuesta primaria, la proliferación de centroblastos va acompañada de hipermutación somática seguida de selección darwiniana sobre los centrocitos resultantes en base a su capacidad de unión al antígeno atrapado en las células dendríticas. Como se puede ver, el centro germinal durante la respuesta secundaria difiere en dos aspectos importantes del de la respuesta primaria: 1. La previa disponibilidad de anticuerpo circulante incrementa la eficacia de las células dendríticas foliculares para atrapar antígeno, lo cual supone una amplificación de la el señal a las células B. 2. El anticuerpo preexistente compite con los centrocitos para unirse con el antígeno en la superficie de las células dendrítica. Ello asegura que en la respuesta secundaria sólo van a contribuir a la producción de anticuerpos células plasmáticas procedentes de células B dotadas de receptores de mayor afinidad que los de la respuesta primaria. Conforme avanza la respuesta, aumenta la concentración de anticuerpos al tiempo que disminuye la del antígeno, por lo que se seleccionan ! 49! centrocitos con afinidades cada vez más altas, capaces de funcionar con concentraciones de antígeno cada vez más bajas. Algunas aplicaciones En las vacunaciones se suele recurrir a la administración de varias dosis del antígeno inmunizantes. Con ello se logra no sólo una mejor respuesta secundaria por el hecho de aumentar las células B memoria, sino que se provoca que las célula B memoria se diferencien a plasmáticas secretoras de anticuerpos de alta afinidad. Si esta estrategia se aplica en inmunizaciones experimentales de animales de laboratorio, de ellos se pueden extraer antisueros de gran avidez, que se usan en ensayos in vitro para pruebas que requieren gran sensibilida ! 50! 1.4 LA RESPUESTA INMUNE La respuesta inmune abarca el conjunto de procesos que desarrollan las células del sistema inmune cuando penetra una sustancia inmunogénica en el organismo invadido. En la elaboración de esta respuesta hay una serie de fases: * Reconocimiento del antígeno extraño. * Identificación, activación y expansión de los escasos linfocitos específicos para dicho antígeno formando clones. * Diferenciación: desarrollo del fenotipo efector de las células del Sistema Inmune. * Desarrollo de la respuesta: acción de las células, o sus productos (anticuerpos), sobre el antígeno. Clásicamente se distinguen dos grandes tipos de respuesta efectora: - RESPUESTA HUMORAL, desarrollada por los linfocitos B y coordinada por los Th2 - RESPUESTA CELULAR, desarrollada, fundamentalmente, por los linfocitos Th1; puede ser heterogénea. 1.4.1. RESPUESTA DE ANTICUERPOS PRIMARIA Y SECUNDARIA La respuesta de anticuerpos (AC) juega un gran papel en la defensa frente a bacterias, antígenos solubles (toxinas), virus, protozoos y gusanos (IgE). La respuesta primaria ocurre cuando es la primera vez que el sistema inmune entra en contacto con el antígeno en cuestión. Se caracteriza porque después de la exposición al antígeno hay: * Fase de latencia de 5-7 días. En esta fase todavía no aparecen anticuerpos * Fase de incremento. La concentración de anticuerpos séricos aumenta en progresión geométrica hasta alcanzar la: * Fase de meseta. La secreción se mantiene durante unos días (3-5) y luego desciende lenta, pero progresivamente, en los siguientes 10-15 días. En la respuesta primaria, los anticuerpos son siempre de la clase IgM y con baja afinidad por el anticuerpo. ! 51! La respuesta secundaria tiene lugar cuando el sistema inmune encuentra a un antígeno por segunda vez o en subsiguientes ocasiones. Se distingue de la primaria en: a) Mayor rapidez en instaurarse, es decir presenta una fase de latencia más corta. b) Los anticuerpos duran más tiempo en el suero (fase de meseta más prolongada). c) El título de anticuerpos alcanza un valor mucho más alto (mayor potencia) d) Cambio de clase: Los anticuerpos, en vez de IgM son IgG, IgA o IgE. e) La afinidad de los anticuerpos por el antígeno es mayor. Las características de mayor potencia y rapidez de la respuesta secundaria se deben a: * Un mayor número de linfocitos B y T, seleccionados para el Ag, que el la respuesta primaria (células de memoria). Las estrategias de vacunación se basan en generar linfocitos de memoria por exposición a antígenos atemperados, de modo que, en caso de infección por el patógeno, se pueda establecer rápidamente una respuesta secundaria. * Las células B memoria generadas han experimentado hipermutaciones somáticas puntuales en la zona de unión al antígeno que les confieren mayor afinidad por éste. ANTIGENOS T-DEPENDIENTES La mayoría de los linfocitos B específicos necesitan la ayuda de linfocitos T colaboradores para activarse, proliferar y diferenciarse hacia células secretoras de anticuerpos. Estos linfocitos B productores de la respuesta de anticuerpos Tdependientes se localizan en los folículos linfoides de los ganglios y en médula ósea. La cooperación T-B se establece merced al papel de los linfocitos B como células presentadoras de Ag. Los linfocitos B, específicos para un epítopo, tras reconocer el Ag con su IG de superficie, endocitan todo el antígeno, lo procesa (degradación y desnaturalización) y pasan a expresar péptidos del antígeno en su membrana unidos a las moléculas CPH clase II. ! 52! Los linfocitos Th2, con un RCT capaz de reconocer el antígeno único al CPH de clase II, se unen a él y se activan, transmitiendo a su vez señales de activación al linfocito B: * IL-4 promueve la proliferación de los linfocitos B activados, así como la diferenciación de los linfocitos B que están proliferando. * IL-6 actúa promoviendo la diferenciación. * Interacción CD40 (célula B) con CD40L (CD154) de la célula T helper. Como resultado final de la respuesta T dependiente se genera un gran número de células secretoras de anticuerpos específicos que permitirán la respuesta secundaria tras subsiguientes contactos con el mismo antígeno. ANTÍGENOS T-INDEPENDIENTES Hay un pequeño número de sustancias, conocidas como antígenos Tindependientes, que son capaces de inducir la respuesta de anticuerpos sin necesidad de la cooperación de los linfocitos T, entre ellos están. * Lipopolisacárido de la endotoxina bacteriana de Gram (-). * Flagelina polimérica microbiana. * Polisacáridos: dextrano, levano, etc. * Polímeros de D-aminoácidos. Se caracterizan por ser estructuras poliméricas en las que los determinantes antigénicos que repiten muchas veces y por ser resistentes a la degradación metabólica. Es posible incrementar la inmunogenicidad de los antígenos polisácaridos conjugándose con un carrier proteico de modo que se consiga una respuesta Tdependiente, esta estrategia es la que siguen las nuevas vacunas contra los meningococos. Frente a estos antígenos, la respuesta siempre tiene características de respuesta primaria, aunque se hayan tenido contactos previos con el antígeno: se producen sólo anticuerpos IgM y no existe memoria inmune. La mayor parte de los linfocitos B productores de anticuerpos contra antígenos T independientes se encuentran en el bazo, tras una esplenectomía se producen respuestas deficientes frente a ese tipo de antígenos. ! 53! 1.4.2 RESPUESTA DE LAS CÉLULAS T. CITOTOXICIDAD Este tipo de respuestas son esenciales en la defensa contra virus y en la eliminación de otros microorganismos intracelulares: candida, pneumocystis… En la respuesta de citotoxicidad específica, los linfocitos T juegan un papel fundamental como células cooperadoras (Th1), la función cooperadora depende, en su mayor parte, de la acción de las interleukinas (IL-2, INFgamma, etc.) que actúan sobre las células efectoras y sobre los macrófagos, dando lugar a las reacciones de hipersensibilidad retardada En cuanto a la citotoxicidad celular restringida por las moléculas CPH de clase I, los linfocitos T citotóxicos reconocen al antígeno en asociación con las moléculas CPH de clase I en la membrana celular de otras células y, una vez activadas, lisan dichas células (células diana). El principal papel biológico de los linfocitos citotóxicos es intervenir en la eliminación de las células infectadas por virus y células no infectadas, pero que son detectadas como extrañas, tales como las tumorales o las de los órganos trasplantados. La mayor parte de los linfocitos T citotóxicos son CD8+, pero también existe cierta proporción de linfocitos T CD4+ citotóxicos con especificidad restringida a moléculas CPH de clase II. Respecto a la generación de linfocitos T citotóxicos, al igual que la respuesta de anticuerpos obedece a los siguientes principios: * Selección por el Ag de los escasos linfocitos específicos existentes antes del estímulo antigénico. * Amplificación clonal de los linfocitos seleccionados mediante un proceso de proliferación selectiva. El número incrementado de linfocitos T CD8+ específicos garantiza que la respuesta secundaria sea más potente y rápida. La respuesta citotóxica, se desarrolla en tres etapas: * Reconocimiento del antígeno: Los linfocitos T CD8 citotóxicos, reconocen al Ag unido a moléculas CPH tipo I propias o bien reconocen exclusivamente moléculas CPH de clase I presentes en células alogénicas. * Activación. Se activan y expresan receptores de IL-2. Para que puedan proliferan y manifestar su función citolítica, requieren que otras células los estimulen con IL-2 (suelen ser linfocitos Th1). ! 54! * Destrucción de las células diana. Como respuesta a la IL-2, los linfocitos citotóxicos proliferan y se activan de modo que, cuando entran en contacto con las células diana que expresan el antígeno, las lisan. Una vez han destruido la célula, pueden seguir ejerciendo su efecto citotóxico sobre otras ya que la acción lítica es específica contra la diana y no existe daño contra la propia célula efectora de la respuesta. La actividad citotóxica K (Killer) requiere la unión de un anticuerpo IgG a la célula diana. La fijación del anticuerpo sobre las células es reconocida por el receptor para la Fc de la IgG de la célula LGL. ! 55! 1.5 CITOKINAS. INTERLEUKINA-2 Las citokinas son un grupo de proteínas de bajo peso molecular que actúan mediando interacciones complejas entre células de linfoides, células inflamatorias y células hematopoyéticas. Son funciones muy variadas, pero se pueden clasificar en unas pocas categorías: * Diferenciación y maduración de células del sistema inmunitario. * Comunicación ente células del sistema inmunitario. * En algunos casos, ejercen funciones efectoras directas. En el pasado reciente hubo un cierto galimatías con la cuestión de su denominación. Así, muchas de las primeras citokinas se descubrieron como señalizadoras entre leucocitos, por lo que se denominaron interleukinas; otras eran secretadas por monocitos/macrófagos, por lo que se llamaron monokinas. Sin embargo, muchas de esas sustancias son producidas por otros tipos celulares, por lo que se desaconseja el uso de esas denominaciones, para agruparlas a todas bajo el concepto de citokinas. Las quimiokinas (o quimiocinas) son un tipo de citokinas de pequeño tamaño, con papeles en la respuesta inflamatoria y la quimiotaxis de fagocitos. PROPIEDADES GENERALES DE LAS CITOKINAS Las citokinas son un grupo de proteínas secretadas de bajo peso molecular (por lo general menos de 30 kDa), producidas durante las respuestas inmunes natural y específica. Se unen a receptores específicos de la membrana de las células donde van a ejercer su función, iniciando una cascada de transducción intracelular de señal que altera el patrón de expresión génica, de modo que esas células diana producen una determinada respuesta biológica. * Las citokinas son producidas por múltiples tipos celulares, principalmente del sistema inmune. Dentro del sistema inmune natural, los macrófagos son de las células ! 56! más productoras de citokinas, mientras que en el sistema específico lo son las células T colaboradoras. * La producción de las citokinas suele ser breve (transitoria), limitada al lapso de tiempo que dura el estímulo (es decir, el agente extraño). En muchos casos ello se debe a que los correspondientes ARNm tienen una corta vida media, que a su vez depende de que las zonas 3’ no traducibles son ricas en A y U. * Considerando la diversas citokinas, éstas pueden exhibir una o varias de las siguientes cualidades: - Pleitropía (múltiples efectos al actuar sobre diferentes células). - Redundancia (varias citokinas pueden ejercer el mismo efecto). - Sinergismo (dos o más citokinas producen un efecto que se potencia mutuamente). -Antagonismo (inhibición o bloqueo mutuo de sus efectos). * Las citokinas ejercen su acción al unirse a receptores específicos para cada citokina en la superficie de la célula en la que ejercen el efecto. La afinidad de cada receptor hacia su citokina correspondiente suele ser bastante alta, del orden de lo femtomolar (10-15M) a lo picomolar (10-12 M). * Utilizando a analogía de lo que ocurre con las hormonas del sistema endocrino, la acción de las citokinas se puede clasificar en: - De tipo autocrino. - De tipo paracrino. - (en pocas ocasiones) de tipo endocrino. Las citokinas “controlan” el sistema inmune de varias maneras, que podemos agrupar de la siguiente manera: * Regulando (activando o inhibiendo) la activación, proliferación y diferenciación de varios tipos de células; * Regulando la secreción de anticuerpos y de otras citokinas. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS CITOKINAS Las citokinas son proteínas o glucoproteínas de menos de 30 kDa. Muchas de ellas pertenecen a la llamada familia de las hematopoyetinas, y tienen estructuras terciarias parecidas: una configuración a base de un conjunto de cuatro hélices alfa, con poca estructura en lámina beta. ! 57! Generalmente actúan como mensajeros intercelulares que suelen intervenir en la maduración y amplificación de la respuesta inmune, provocando múltiples actividades biológicas una vez que se unen a los receptores específicos de las células diana adecuadas. Aunque existen muchos tipos de células productoras de citokinas, los más importantes son los linfocitos Th y los macrófagos, ya que sus citokinas son esenciales para que se produzca la respuesta inmune una vez que se activan las células T y B por el contacto con las correspondientes células presentadoras de antígeno. Principales tipos de respuesta mediatizados por la acción de las citokinas 1. Activación de los mecanismos de inmunidad natural: a. Activación de los macrófagos y otros fagocitos b. Activación de las células NK c. Activación de los eosinófilos. d. Inducción de las proteínas de fase aguda en el hígado 2. Activación y proliferación de células B, hasta su diferenciación a células plasmáticas secretoras de anticuerpos. 3. Intervención en la respuesta celular específica 4. Intervención en la reacción de inflamación, tanto aguda como crónica. 5. Control de los procesos hematopoyéticos de la médula ósea 6. Inducción de la curación de las heridas. Hay una aparente paradoja de las citokiinas que debemos explicar: ¿Por qué la citokinas, que son inespecíficas respecto al antígeno, pueden ejercer acciones de modo específico? Varios mecanismos: * Regulación muy fina de los receptores de cada citokina: los receptores celulares indispensables para que una citokina ejerza su papel sólo se expresan en tipos celulares concretos una vez que éstos han interaccionado con el antígeno. * Requerimientos de contactos estrechos célula a célula: la citokina sólo alcanza concentraciones adecuadas para actuar en el estrecho espacio que queda ente dos células interactuantes; recordar por ejemplo las “bolsas” que se forman en el conjugado Th-B, donde se alcanzan mejor esos niveles de citokinas. ! 64! en combinación con otras citokinas, induce la diferenciación y secreción de inmunoglobulina. La estimulación de las células B con IL-2 da lugar a la expresión de RNA mensajero que codifica la cadena J y la forma secretoria de la cadena pesada y de las inmunoglobulinas. Factores estimuladores de la mitosis son capaces de estimular la secreción de anticuerpos por células B humanas, sólo en presencia de los linfocitos T, los cuales aportan IL-2 para la respuesta de células B. La IL-2 producida de esta forma también actúa sobre las células T, presumiblemente de forma paracrina y autocrina, para inducir la secreción de otras linfokinas que son requeridas para la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas secretoras de anticuerpos. La activación de los monocitos por la IL-2 induce la secreción de IL-1, potencia la citotoxicidad mediada por monocitos, promueve la proliferación de los precursores de macrófagos, y aumenta la fagocitosis. La respuesta de los NK a la IL-2 está caracterizada por la producción de IFN-gamma, producción y aumento de la actividad citolítica. Actividad in vivo Los estudios in vivo de la administración de IL-2 en ratones han confirmado la habilidad de esta molécula para mediar las respuestas inmunes mediadas por las céllas T. El tratamiento con IL-2 a animales previamente tratados con agentes inmunosupresores, devuelven su habilidad para generar células efectoras citolíticas tras la estimulación con un antígeno. Aún más, la respuesta los NK de animales tratados con IL-2 fueron marcadamente elevadas si se compara con la respuesta del grupo control. De la misma manera, la administración continua de anticuerpos anti IL2R en ratones neonatos ocasiona en algunos casos alteración en el desarrollo de las células T. Por el contrario, los ratones con deficiencia de IL-2 por alteración genética, tienen una composición de células T periféricas y a nivel del timo, completamente normal, indicando que la IL-2 no es absolutamente esencial para el desarrollo de las células T. La IL-2 fue utilizada primero in vitro para generar tanto grandes cantidades de células T efectoras citolíticas antígeno-específicas o como de células NK activadas por linfoquinas no antígeno-específicas. En realidad, en muchos experimentos, la administración de IL-2 de acuerdo con la terapia inmunosupresora se demostró ser totalmente capaz de eliminar los focos tumorales en animales a los que previamente se les había suministrado una dosis de sustancia productora de melanoma, fibrosarcoma, etc. ! 65! 1.6 ADHESIÓN DE LOS LEUCOCITOS EN LOS PROCESOS DE INFLAMACIÓN. ICAM-1 En los últimos años ha habido una explosión en el entendimiento del papel central que juega la adhesión de los leucocitos en las funciones de la respuesta de defensa del huésped. El papel de la adhesión de leucocitos y las moléculas implicadas en este proceso son críticas para todos los aspectos de las reacciones inmunes específicas y no específicas. En general, las moléculas implicadas en la adhesión de leucocitos pueden ser divididas en varias superfamilias genéticas diferentes que median diferentes funciones. La superfamilia genética de las INTEGRINAS, moléculas de adhesión facilitan la adhesión de la mayoría de los leucocitos y la migración a través de endotelio y los tejidos extracelulares. Esta familia de moléculas de adhesión también media las funciones efectoras de los leucocitos como la citolisis mediada por células, circunstancia en la cual la célula efectora y la célula diana deben adherirse antes del proceso de lisis, así como la adhesión homotípica y heterotípica requeridas para la presentación de antígenos y la subsecuente expresión clonal. La molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), ICAM-2, ICAM-3 y VCAM-1 (también denominada INCAM-1), así como CD2 y LFA-3 son moléculas de adhesión miembros de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas. Otra familia de moléculas de adhesión, las SELECTINAS, son funcionalmente más limitadas que las integrinas leucocíticas y se piensa median la unión inicial de los neutrófilos algunos linfocitos al endotelio de las lesiones inflamatorias, así como la dirección del tráfico natural de los linfocitos al tejido linfoide periférico. Tres selectinas han sido identificadas. Estas moléculas de las selectinas difieren unas de otras por su distribución celular, el tiempo que transcurre desde la estimulación a su aparición y los ligandos específicos que reconocen y a los que se unen. L-selectina está expresada en la mayoría de los leucocitos y juega un papel en la adhesión de los neutrófilos a las lesiones inflamatorias y de los linfocitos a los nódulos linfoides periféricos. Lselectina es secretada de la superficie de los neutrófilos al mismo tiempo que MAC-1 es regulada, sugiriendo la idea de que la lselectina actúa enlenteciendo el fluir de los neutrófilos al sitio inflamatorio. Una vez producido este enlentecimiento, la interacción CD18/ICAMs permite a la célula migrar desde la circulación al foco inflamatorio. Para facilitar la migración, sin embargo, la Lselectina es secretada de la superficie de los neutrófilos, minimizando las fuerzas ! 66! adhesivas que mantienen la célula en la luz de los vasos. Los anticuerpos a la lselectina inhiben las interacciones celulares neutrófilo/endotelio tanto in vitro como in vivo. E-selectina es expresada únicamente en las células endoteliales activadas y es inducida con citokinas inflamatorias como el interferón gamma y la IL-5. In vitro, Eselectina ha demostrado mediar, en parte, la adhesión de los neutrófilos y una población de linfocitos al endotelio. P-selectina es expresada en las plaquetas y el endotelio. Al igual que la Eselectina, la P-selectina es inducible. Existe en “pools” intracelulares y su expresión es inducida ben minutos sobre el endotelio expuesto a mediadores como la trombina o la histamina. Media las interacciones celulares neutrófilos/endotelio así como las interacciones plaquetas/célula endotelial. Otra molécula de adhesión, CD44, participa en la respuesta inflamatoria pero no pertenecea ninguna de las superfamilias genéticas ya mencionadas. Adhesión de leucocitos-familia CD18 Está claro que la adhesión leucocito/leucocito y leucocito/célula diana es un acontecimiento necesario para que el sistema defensivo del huésped funcione normalmente en los procesos de inflamación. Los leucocitos deben adherirse a las células endoteliales que se alinean en los vasos sanguíneos previo a la migración desde la circulación sanguínea a la lesión inflamada. Para que los leucocitos realicen sus funciones efectoras tales como la destrucción de las células diana, debe adherirse primero a estas células para que altas concentraciones de mediadores líticos secretados por los leucocitos, puedan localizarse en la unión leucocito/célula diana. La familia CD18 de moléculas de los leucocitos ha sido implicada como parcialmente responsables de la adhesión a los substratos celulares mediada por leucocitos. La familia CD18 o LFA-1 de moléculas de adhesión está formada por CD11a, CD18 (LFA-1), CD11b, CD18 (MAC-1), y CD11c. Estas moléculas, que están distribuidas en varias combinaciones en todos los leucocitos, son todos heterodímeros con distintas subunidades alfa que se asocian con una subunidad beta común. Estructuralmente, las moléculas de adhesión leucocíticas son miembros de una superfamilia de integrinas y específicamente pertenecen al subgrupo beta 2. Una primera evidencia que demuestra que la función de estas moléculas y, por lo tanto, la importancia de la adhesión de leucocitos en la generación y mantenimiento ! 67! de la inflamación se han estudiado en muchos sistemas experimentales en los cuales los anticuerpos monoclonales para estas moléculas, utilizados como antagonistas, demostraron inhibir múltiples acontecimientos asociados con los procesos inflamatorios. En experimentos in vitro, con anticuerpos monoclonales para la molécula CD18 o CD11a inhiben los acontecimientos líticos mediados por linfocitos como la actividad células T citotóxicas o la actividad de las células natural killer y los procesos de tráfico de los linfocitos como la adhesión de linfocitos al endotelio vascular y a las células epidérmicas. Aún más esos modelos de anticuerpos monoclonales inhibidos in vitro a las respuestas inmunológicas generales y/o específicas como la formación de anticuerpos, la mitosis y proliferación de células T inducidas por antígeno, y la respuesta linfocítica mixta. El mecanismo por el cual estos anticuerpos inhiben los procesos antes mencionados es por su habilidad para antagonizar la interacción del miembro apropiado de la familia CD18 con su ligando más que la eliminación celular dado que no se ha demostrado que estos anticuerpos sean citotóxicos por ellos mismos. Los anticuerpos monoclonales para la molécula CD18 y para la CD11 también inhiben la función de los granulocitos como la adhesión al endotelio, la agregación homotípica, la unión a las partículas cubiertas de iC3b y a la molécula ADCC. Otra evidencia es la identificación de un grupo de individuos que, debido a defectos genéticos, eran incapaces de expresar un número normal de moléculas de adhesión para leucocitos en superficies celulares. Estos individuos presentaron separación del cordón umbilical retrasada, afectaciones cutáneas frecuentes con escaso infiltrado de linfocitos y no formación de pus. Los pacientes con una deficiencia más severa, también presentaron respuestas de células T disminuidas, presumiblemente debido a un defecto en la capacidad de presentar antígenos por la incapacidad de las células T para unirse a las células presentadoras de antígeno. Los linfocitos de estos pacientes, in vitro, se comportaron como linfocitos normales en la presencia de anticuerpos monoclonales anti-LFA-1. Un ligando del LFA-1 es ICAM-1 el cual fue funcionalmente identificado por anticuerpos de screening de hibridones generados de células esplénicas de ratón inmunizado contra linfocitos con deficiencia de LFA-1 en cuanto a su habilidad para inhibir los ensayos de adhesión homotípica dependiente de LFA-1. Estructuralmente, ICAM-1 es un miembro de una familia supergenética y una corta cola citoplasmática. Una caracterización más precisa del ICAM-1 puso de manifiesto que era inducido in vitro en múltiples tipos celulares incluyendo las células hematopoyéticas, células ! 68! endoteliales y fibroblastos con IL-1a, IL-1b, TNF-alfa, TNF-beta y/o IFN gamma dependiendo del tipo celular. Funcionalmente, anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1, inhibían la proliferación inducida por el antígeno, la actividad de células T citotóxicas y la adhesión de granulocitos y linfocitos al endotelio. Estos datos sugieren que, al igual que la familia de moléculas de adhesión CD18, la expresión de ICAM-1 en las células endoteliales y otros tipos celulares es crítico para el normal funcionamiento del sistema de defensa del huésped. Hay una baja expresión constitutiva de ICAM-1 en las células del endotelio de las vénulas; sin embargo, su expresión está marcadamente aumentada en los focos inflamatorios. Aún más, hay un aumento en la expresión de ICAM-1 en múltiples tipos celulares incluyendo los queratinocitos en las lesiones inflamatorias de piel, conductos biliares y hepatocitos perivenulares durante los episodios de rechazo en los trasplantes hepáticos, o en los casos de cirrosis biliar primaria, endotelio cerebral alrededor de las múltiples placas de esclerosis en lesiones de encefalitis alérgica experimental en humanos y roedores, glomérulos y tubulos durante los episodios de rechazo de los riñones trasplantados, así como las células epiteliales pulmonares tras la estimulación por un antígeno. Asimismo se encuentra un aumento en la expresión de ICAM-1 en las células de los melanomas tras la aparición de metástasis. Anti ICAM-1 Hay datos que sugieren que la interacción de las moléculas CD18 con los ligandos actúan como una señal co-estimuladora para los leucocitos. Este concepto es desarrollado posteriormente cuando se demostró que los linfocitos eran más responsivos en un medio con ICAM-1 que un medio proteico total. Es posible que incluso si los linfocitos se unen a los substratos celulares apropiados en presencia de un anticuerpo monoclonal adecuado anti-adhesión apropiado, la pérdida de la señal co-estimuladora, les deja “inservibles”. En conclusión, la inhibición de las interacciones CD18/ICAM-1, inhibe el movimiento de leucocitos, la presentación de antígenos y la citolisis mediada por leucocitos. No está claro cuál de estos tres procesos inhibitorios es más responsable de esta dramática reducción de la respuesta inflamatoria. Probablemente es una combinación de los tres mecanismos. El rechazo del injerto ocurre, cuando la respuesta inmune del receptor contra tejido extraño es inducida por los antígenos presentes en el injerto, pero ausentes en el receptor. Los antígenos codificados por el complejo mayor de histocompatibilidad ! 69! (MHC) son los principales iniciadores de la cascada inflamatoria, incluyendo las células efectoras capaces de dañar el injerto. Los antígenos MHC expresados en la superficie celular, además de potenciar la respuesta anti-injerto, además funcionan como dianas de la respuesta inmune del huésped. Los antígenos MHC clase II son los más inmunogénicos. En humanos, los antígenos MHC clase I y II son codificados por genes situados en el cromosoma 6. Además, los antígenos no-MHC detectados en la superficie celular de células endoteliales, monocitos o antígenos de tejido específico de células específicas, pueden ser importantes en los mecanismos de rechazo. La compatibilidad del grupo sanguíneo AB0 ha sido tradicionalmente requerida para el éxito del trasplante, describiéndose casos de rechazo hiperagudo en casos de incompatibilidad AB0. Sin embargo, no necesariamente da lugar a un rechazo hiperagudo en el trasplante hepático. ! 70! 1.7 INMUNOLOGIA DEL TRASPLANTE Esta parte de la introducción está basada en el siguiente tratado: Neuberger J, Adams D. Immunology of Liver Transplantation. The Liver and Hepatobiliary Unit, Queen Elizabeth Hospital,Birmingham, UK, 1993. ANTÍGENOS DEL TRASPLANTE Durante los años 50 (1950), se observó que la sangre de mujeres multíparas o personas trasfundidas contienen anticuerpos con leucocitos aglutinados de otros individuos. La identificación de esos individuos con antígenos leucocitarios, fue el primer paso hacia la 2 Es conocido que las moléculas MHC están implicadas en la producción de anticuerpos solo a través de la producción de la colaboración entre linfocitos T y B. ORGANIZACIÓN GENÉTICA DE MHC El MHC humano se localiza en el brazo corto del cromosoma 6. El DNA del MHC comprende el 0.1% del total del genoma humano, siendo suficiente DNA para codificar al menos 50 genes. Los genes clase I codifican los clásicos antígenos mayores del trasplante: HLA-A, HLA-B y HLA-C. Además, al menos otros 14 tipos de genes clase I se han descrito con función aún desconocida Quince genes clase II (6A y 9B) se han mapeado en la parte telomérica del gen que codifica MHC esy que incluye tres subregiones: DR, DQ Y DP. Al menos 8 genes clase II son funcionales.proteínas Bf, genes para la 21-hidroxilasa, factor de necrosis tumoral, linfotoxina… ! 71! Los genes MHC se localizan muy juntos. Se transmiten genéticamente en bloque según las leyes de Mendel. Casi todos los genes MHC expresan polimorfismo, siendo los de clase I, clase II DRB, DQB y DPB los más polimórficos TRANSFORMACIÓN DE GENES A MOLECULAS Los genes MHC son los genes más polimórficos descritos y se expresan de forma co-dominante. Moléculas clase I y clase II existen como heterodímeros y se expresan en la superficie celular como proteínas integrantes de su membrana. La molécula clase I (HLA A, B y C) es una cadena pesada codificada altamente polimórfica, con un peso molecular de aproximadamente 45 KDa ligada, de forma no covalente con la B2-microglobulina. La B2-microglobulina es una molécula o polimórfica codificada por el cromosoma 15, esencial para la expresión de moléculas clase I. Las moléculas clase II, HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP compuestos por dos cadenas de polipéptidos alfa y beta, codificado por genes A y B respectivamente. Ambos polipéptidos están integrados en la membrana celular formando un dímero. La cadena alfa tiene un peso molecular de 33 KDa y la cadena beta, 29 KDa. Intermediarios biosentéticos de los antígenos clase II, pero no moléculas maduras de la superficie celular, se asocian con una glicoproteína codificada por genes diferentes a los del MHC. El grado de polimorfismo se originan en la zona genética DR, DQ o DP. ! 72! GRUPOS SANGUÍNEOS ABO Los determinantes antigénicos del sistema ABO son los azúcares terminales de las cadenas de carbohidratos. La mayoría de los antígenos de la superficie de las células rojas es una forma de glicoproteína, pero en algunos casos se ha encontrado un oligosacárido ligado a lípidos. El azúcar terminal en el grupo sanguíneo A es la N-acetilgalactosamina y en el grupo sanguíneo B es la galactosa. Cuando faltan ambos azúcares del resto de la cadena de carbohidratos, se denomina antígeno H; así las células rojas del grupo sanguíneo O tienen antígeno H en su superficie. Las células rojas de los grupos A y B tienen antígeno H en su superficie pero en pequeñas cantidades. La transmisión genética de los grupos sanguíneos está determinada por tres genes allelicos: A, B y O. A y B son co-dominantes y el gen O es recesivo. A, B y H antígenos se expresan también en otros tejidos: leucocitos y en pequeñas cantidades en trombocitos, células endoteliales y en la mayoría de los órganos y vasos sanguíneos y algunas células epiteliales. No se encuentran en el sistema nervioso central o en el tejido conectivo. Anticuerpos naturales, isoaglutininas, existen contra los antígenos de los grupos sanguíneos. Una persona con grupo sanguíneo A tiene isoaglutininas contra contra el grupo sanguíneo B y viceversa. Personas con grupo sanguíneo O tiene anticuerpos contra A y B. Sin embargo, las personas AB no tienen isoaglutininas. En el trasplante de órganos, especialmente de riñón o corazón, puede producirse una pérdida rápida del injerto cuando existe una incompatibilidad ABO entre el donante y el receptor. Este rechazo hiperagudo está mediado por el grupo de anticuerpos sanguíneos del paciente en combinación con el grupo de antígenos sanguíneos en el endotelio vascular del injerto, activando el complemente, causando vasoespasmo y agregación plaquetaria. Todo esto da lugar a una rápida necrosis del injerto. Antígenos de los grupos sanguíneos se han encontrado también en los componentes celulares hepáticos. En el trasplante hepático, sin embargo, se han publicado casos de incompatibilidad ABO exitosos. ! 73! ANTÍGENOS DEL TRASPLANTE EN EL HÍGADO HUMANO Expresión de antígenos MHC en el hígado normal La expresión de los dos tipos de antígenos MHC en los diferentes tipos celulares tiene una distribución heterogénea en los tejidos humanos normales. En general, los antígenos clase I se expresan en la mayoría de las células nucleadas, mientras que los antígenos clase II muestran una distribución más restringida, estando limitada principalmente al sistema linfoide y células accesorias. Además, algunas células del parénquima, como las células endoteliales pueden expresar también antígenos clase II. Sin embargo, la distribución de antígenos MHC clase II en tejidos humanos es cuantitativa más que cualitativa, y la expresión aberrante de moléculas clase II es un fenómeno bien conocido. En el hígado normal, el componente principal, los hepatocitos, no expresan o sólo muy pocas cantidades de antígenos clase I. Sólo encontramos una ligera expresión, si se encuentra en el endotelio vascular o en el epitelio de las células del conducto biliar. Un estudio más detallado confirma hallazgos compatibles con baja expresión de antígenos clase I en el parénquima hepático. El resto de células no parenquimatosas, como los linfocitos y fagocito mononucleares incluyendo las células de Kupffer, son los componentes más antigénicos del órgano. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea en parénquima hepático expresan tanto antígenos clase I como II fuertemente. La expresión de moléculas de clase II en la superficie de las células del hígado humano ha sido estudiada de forma intensiva. Todos los componentes parenquimatosos fueron prácticamente negativos para moléculas clase II analizados con anticuerpos policlonales. Sin embargo, algunos ligandos de anticuerpos para anticuerpos anti HLA-DR se han detectado en las células endoteliales y en células de conductos biliares. La menor expresión de antígenos DR se localizó en el endotelio sinusoidal y en los conductos biliares. Aunque los componentes parenquimatosos del hígado humano no expresan antígenos clase II en cantidades significativas, las células no parenquimatosas expresan células clase II fuertemente. Los macrófagos tisulares, las células de Kupffer y otras células no parenquimatosas son reemplazadas, en pocas semanas por células del receptor. Las células de Kupffer y las células dendríticas derivadas de la médula ósea expresan fuertemente antígenos clase II y pueden actuar como células ! 80! La vía LFA-1/ICAM-1 es de particular interés dado que la expresión de ICAM-1 es regulada in vitro e in vivo por citokinas proinflamatorias. En el hígado normal hay poca expresión de ICAM-1; sin embargo durante el rechazo del injerto, se induce la expresión de ICAM-1 en las estructuras diana (conductos biliares, endotelio vascular y focalmente en hepatocitos). Esta expresión persiste o aumenta en pacientes que no responden al tratamiento inmunosupresor, mientras que los niveles disminuyen si hay respuesta al tratamiento. Las citokinas proinflamatorias son producidas en el hígado durante el proceso de rechazo y probablemente induce tanto antígenos MHC y expresión de ICAM-1 en estructuras como el epitelio biliar, permitiendo aumentar la adherencia de los linfocitos, la interacción con los antígenos del injerto y, finalmente, la citotoxicidad. Los corticoides in vivo no regulan la expresión de ICAM-1, sino que ejerce su efecto mediante la supresión de la secreción de las citokinas proinflamatorias de células mononucleares infiltrantes. También hay evidencia de que la expresión de LFA-3, que reacciona con el receptor de células T, CD2, está aumentado en hepatocitos, endotelio vascular y células del conducto biliar. Antígenos menores y antígenos sanguíneos pueden actuar también como dianas para el rechazo. La expresión de los antígenos sanguíneos se produce en el epitelio biliar y puede aumentarse en infecciones y colestasis. PRESENTACION DE ANTÍGENOS Los antígenos del trasplante pueden ser reconocidos por el sistema inmune del receptor directamente, sin necesidad de procesamiento, o tras ser procesados por las células presentadoras de antígeno del huésped. Los macrófagos ejercen habitualmente como células presentadoras de antígeno y el hígado es particularmente rico en este tipo de células. Las células dendríticas en los tractos portales y células de Kupffer en los sinusoides son, asimismo, buenas presentadoras de antígenos. Tras la realización del trasplante, las células Kupffer del donante son reemplazadas por células que expresan el fenotipo del huésped. En pacientes con rechazo severo este proceso ocurre rápidamente, en las primeras semanas, mientras que este fenómeno ocurre gradualmente en pacientes que toleran el injerto. En estudios animales se ha puesto de manifiesto que las células del endotelio vascular y posiblemente también las del epitelio biliar (no los hepatocitos), son ! 81! capaces de presentar antígenos. Antígenos clase II son inducidos en estas estructuras durante los episodios de rechazo pudiendo estar implicadas en un proceso de “segunda” presentación de antígeno, dando lugar a una estimulación inmune permanente. La presentación de antígenos MHC alogénicos al sistema inmune del huésped da lugar a la activación de las células T capaces de secretar linfokinas que infiltran y orquestan la respuesta efectora del rechazo. Este papel se ha asociado tradicionalmente a células T CD4+, aunque hay evidencia de que también las células CD8+ están también implicadas. La respuesta efectora que actúa es hipersensibilidad de tipo retardado, con reclutamiento de otras células inflamatorias y secreción de anticuerpos. EL PAPEL DE LAS CÉLULAS T EN EL INJERTO HEPÁTICO HUMANO Las células T son el tipo de células más común que infiltran el hígado humano trasplantado durante el episodio de rechazo. Tanto las células T helper (CD4+) como las células T supresoras (CD8+), se acumulan en los tractos portales durante el rechazo e infiltra el epitelio biliar y el endotelio vascular de los principales sitios diana del proceso de diana. La presencia predominantemente de células CD4+ infiltrando las estructuras diana, se ha asociado con episodios de rechazo reversible, mientras que un infiltrado predominantemente CD8+ se asocia a episodios de rechazo más severos, que pueden llegar a progresar a la destrucción masiva de conductos biliares (vanishing bile duct síndrome). La mayoría de las células infiltrantes expresan el antígeno CD45 RO, creándose células memoria y también expresan marcadores de activación como HLADR y receptores de IL-2 secretados a bilis en los episodios de rechazo. Un análisis funcional de los clones de células T que intervienen el proceso de rechazo han demostrado actividad proliferativa y citotóxica hacia los antígenos MHC clase I. In vivo estas células probablemente se adhieren al epitelio biliar y al endotelio vascular a través de moléculas adhesivas como ICAM-1, dando lugar a la lisis celular. Las células T se acumulan en el lugar de rechazo por continua migración como respuesta a la secreción local de factores quimiotácticos o por proliferación de factores de crecimiento. Se detecta un aumento de células T circulantes, así como en el hígado, tanto CD4+, como CD8+. ! 82! La detección de actividad quimiotáctica en bilis durante el episodio de rechazo sugiere que la los factores quimiotacticos se reflejan a nivel local. OTROS LEUCOCITOS Otras células pueden actuar como células efectoras: gran cantidad de monocitos, neutrófilos y eosinófilos y estas células pueden tener una función efectora importante. Los neutrófilos aparecen en bilis durante los episodios de rechazo. Los neutrófilos tras un trasplante hepático se activan rápidamente antes del comienzo de un episodio de rechazo y secretan grandes cantidades de radicales superóxido y enzimas proteolíticas, las cuales causan daño tisular. La actividad de los neutrofilos es suprimida con altas dosis de corticoides La detección de niveles elevados de niveles de monokinas como TNF alfa e IL1 y su detección inmunohistoquímica en el infiltrado portal durante el rechazo sugiere el papel efector de los monocitos/macrófagos activados. MECANISMOS HUMORALES Aunque los injertos hepáticos son menos susceptibles al daño por anticuerpos linfocitotóxicos que otros órganos, hay crecientes evidencias que implican mecanismos humorales en la patogénesis del rechazo fulminante. Diversos estudios han publicado niveles elevados de anticuerpos citotóxicos anti clase I en pacientes con rechazo, y cantidades significativas de inmunoglobulinas, especialmente IgM, están depositadas en las paredes arteriales del hígado rechazado. Asimismo, se ha evidenciado secreción de IgG y particularmente IgM en el hígado durante los episodios de rechazo agudo. Los acontecimientos celulares que dan lugar al rechazo agudo en el trasplanthepático pueden desarrollarse de la siguiente manera: * Las células presentadoras de antígeno (que incluye las células dendríticas y células Kupffer y subsecuentemente células del epitelio biliar y del endotelio hepático) que presentan células T con antígenos CD4+ ( y posiblemente CD8+), en presencia de factores coestimuladores como la interleukina I. * Estas células T se activan y secretan IL-2 y otras citokinas dando lugar a una proliferación clonal, diferenciación y reclutamiento de células T. Alguna de esas ! 83! células T tienen funciones inmunoreguladoras, mientras que otras tienen potencial citotóxico. * La reacción inmunológica da lugar a una intensa respuesta inmunológica durante la cual las citokinas pro-inflamatorias dan lugar a un aumento de antígenos MHC en el injerto y a la expresión de moléculas de adhesión que atraen y activan otras células efectoras. * El daño de injerto es producido por células T citotóxicas dirigidas a los antígenos MHC y la cascada inflamatoria generalizada que incluye eosinófilos, macrófagos y neutrófilos. 1.7.2 ASPECTOS CLINICOS Y ANATOMOPATOLOGICOS DEL RECHAZO EN EL TRASPLANTE HEPÁTICO El rechazo agudo es la complicación más frecuente del trasplante hepático. Se define como la disfunción de la bioquímica hepática (más de un 20% de incremento en los niveles de bilirrubina sérica o de las transaminasas durante un periodo de más de 24 horas), confirmado en todos los casos con una histología característica. Los hallazgos clínicos son: ictericia, fiebre y descenso en la excreción de bilis por el tubo en “T”. Un detalle a tener en cuenta para entender los capítulos posteriores, y sin relación con el rechazo agudo, es el Grado Child, un sistema de estadificación usado para evaluar el pronóstico de una enfermedad hepática crónica y que se utiliza, junto a otros parámetros (MELD) en la decisión de la necesidad de un trasplante hepático a un paciente. Emplea cinco criterios clínicos de la enfermedad hepática, siendo medido cada crítero del 1-3. Estos criterios son: Bilirrubina total, albúmina sérica, INR/tiempo de protrombina, ascitis y encefalopatía hepática. La suma total de todos los criterios da una puntuación. El Grado Child se divide en tres A, B y C según la puntuación obtenida. CLASIFICACION ANATOMOPATOLÓGICA ! 84! La clasificación de grado de rechazo se basa en la clasificación de Banff (Canada, 1995) 1. No rechazo 2. Leve (Grado I): Infiltrado de rechazo leve, en una minoría de los espacios porta y limitado a los mismos. 3. Moderado (Grado II): Infiltrado de rechazo que afecta a la mayoría o a todos los espacios porta) 4. Severo (Grado III): Infiltrado de rechazo como en el grado II, que se extiende a las áreas periportales y/o inflamación perivena centrolobulillar moderada a severa asociada a necrosis hepatocitaria perivena centrolobulillar. No rechazo: Fig. 10: Imagen anatomopatologica de espécimen sin rechazo Leve (Grado I): ! 85! Fig. 11: Imágen anatomopatologica de espécimen con rechazo leve 3. Moderado (Grado II) Fig. 12: Imágen anatomopatológica de espécimen con rechazo moderado 4. Severo (Grado III) ! 86! Fig. 13: Imagen anatomopatológica de espécimen con rechazo severo. ! 87! JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO ! 88! Pese a los avances en el manejo terapéutico y clínico del trasplante hepático, el rechazo agudo sigue limitando la vida del injerto. Según diversas series se estima una incidencia del 7 al 42%. El rechazo puede ser definido como el daño del injerto producido por la respuesta del sistema inmune del receptor al hígado trasplantado y que puede dar lugar a diferentes patrones clínicos. El término “rechazo agudo” hace referencia normalmente, al curso clínico de episodio de rechazo, pero está, a menudo, basado en los hallazgos histológicos, presentando infiltrado inflamatorio, colangitis y endoteliítis indicativos de rechazo agudo. Asimismo puede presentar arteriopatía y ductopenia, indicativos, asimismo, de rechazo agudo. Los hallazgos clínicos, los tests de función hepática (bilirrubina, fosfatasa alcalina, GOT…) pueden sugerir la de rechazo agudo, pero no son específicos. La prueba principal para el diagnóstico de rechazo es la biopsia percutánea del injerto hepático. Sin embargo, la biopsia puede tener complicaciones como, por ejemplo, el sangrado en pacientes con coagulopatía. El proceso de rechazo es una cascada inflamatoria y los acontecimientos inmunológicos que acompañan a cada paso del proceso, pueden ser potencialmente monitorizados como índices de activación inmune y rechazo. Diversos marcadores inflamatorios han sido estudiados a tal efecto: interferón-gamma, beta-2 microglobulina, neopterina, IL-2R…. Un marcador serológico de rechazo agudo que pudiera ser medido rutinariamente en los pacientes, sería de gran beneficio en el manejo de la disfunción del injerto. Así, los distintos tests inmunológicos jugarían un papel importante. Dado que la respuesta inflamatoria del rechazo está centrada en los conductos biliares de pequeño tamaño, la secreción biliar ofrece acceso directo al lugar donde se centra el proceso de rechazo. En aquellos pacientes que presentan un drenaje biliar externo, es posible monitorizar los niveles de esos marcadores en bilis. Diversos estudios han demostrado que el análisis en bilis proporciona una detección más precisa de la activación inmune en el injerto hepático que los tests serológicos. El rechazo agudo se asocia con una abundante cantidad de diferentes proteínas en suero antes o durante el episodio de rechazo agudo. La función de estas proteínas depende de su presencia en suero: citokinas, ligando de receptores, hormonas… La función de estas proteínas halladas en suero es diversa: factores de transcripción, respuesta a stress, proteínas de degradación, metabolismo lipídico, activación del complemento y función inmune, adhesión celular, factores de crecimiento y señales de transducción. ! 89! *HIPÓTESIS DE TRABAJO ! ! ! ! ! 96! 5.1.2 PROTOCOLO PERITRASPLANTE Todos los pacientes ingresaron 4 horas previas al TOH y se sometieron a profilaxis antibiótica con amoxicilina-clavulánico i.v. El protocolo de inmunosupresión general es: • 500 mgr de 6-metil prednisolona intraoperatorios • Inducción (por sonda nasogástrica): Ciclosporina 20 mgr/kg/dia VO. Posteriormente la dosis de ciclosporina varía para mantener los niveles valle en sangre entre 300 y 400 ngr/cc durante la 1ª semana y posteriormente entre 250 y 350 ngr/cc • Inducción (por sonda nasogástrica): Micofenolato mofetilo 1 gr / 12 hrs VO. Se reduce a partir de la 3ª semana a 1gr/ dia. • Inducción (por sonda nasogástrica) Prednisona 20 mgr/ 24 hrs VO. Se reduce progresivamente hasta la retirada al tercer mes Todos los pacientes ingresaron en la Unidad de Cuidados Intensivos tras el TOH y pasan a Planta de Hospitalización cuando alcanzan la estabilidad clínica. En caso de RECHAZO AGUDO, el protocolo de tratamiento es: • Optimización de la inmunosupresión. • Si no hay mejoría, bolos de 6 metil prednisolona i.v. 1 gr x 3 5.1.3 Características comunes a todos los pacientes: • Tuvieron tiempos de isquemia similares (entre 4-8 horas) • Se realizó la misma técnica, hepatectomía con preservación de cava: piggy-back • Se empleó la misma solución de preservación: WISCONSIN • Anastomosis coledo-coledocianas termino terminales con tubo de kher. • Se controlaron los niveles de inmunosupresores cada 48 horas. ! 97! • Se utilizó como tratamiento inmunosupresor inhibidores de la calcineurina (CICLOSPORINA) + micofenolato mofetil + prednisona. • Las indicaciones de Trasplante Hepático en nuestra serie son: @ Cirrosis alcóholica @ Cirrosis autoinmune @ Atresia vía biliar @ Cirrosis biliar primaria @ Cirrosis biliar secundaria @ Fallo hepático fulminante @ Cirrosis criptogenética @ Cirrosis virus hepatitis C @ Cirrosis virus hepatitis B @ Cirrosis alcohólica + virus hepatitis C @ Cirrosis alcohólica + virus hepatitis B @ Cirrosis alcohólica + virus hepatitis B y C ! 98! 5.2. METODOLOGÍA El estudio de IL-2 e ICAM-1 se puede realizar en sangre periférica y en otros sitios donde se expresen estas moléculas, como en el tejido hepático (biopsias). En nuestro estudio, se va a determinar en sangre y en bilis. Como pilotaje del presente trabajo se analiza la evolución clínica en pacientes previos al estudio, y en base al comportamiento clínico en los pacientes con rechazo, con complicaciones y con evolución estable, se decidió realizar extracciones de sangre y bilis los días 5, 10, 15 y 20 tras la realización del trasplante hepático (5 cc). La sangre fue colectada en un tubo EDTA y la bilis en un tubo normal, sin conservantes. La recogida de estas muestras se realizaban a primera hora de la mañana, se transportaban en hielo y se almacenaban de forma inmediata en el servicio de inmunología. La obtención de la muestra de sangre no fue problemática, pero la obtención de la muestra de bilis no siempre fue posible, sobre todo tras el clampaje del tubo de kher (aunque se desclampase a fin de obtener la muestra) y la reinstauración de la circulación enterohepática 5.2.1 VARIABLES DEL ESTUDIO 5.2.1.1 a) VARIABLES PRINCIPALES • Niveles de Receptores de Interleukina-2 en sangre (pm/l) • Niveles de Receptores de Interleukina-2 en bilis (pm/l) • Niveles de ICAM-1 en sangre (ngr/ml) • Niveles de ICAM-1 en bilis (ngr/ml) 5.2.1.2 b) VARIABLES SECUNDARIAS • Bilirrubina(Bt) (mg/dl) • Aspartato aminotransferasa (GOT) (UI/L) • Alanino aminotrasferasa (GPT) ((UI/L) • Gamma glutamiltranspeptidasa (GGT) (U/L) • Fosfatasa alcalina (ALP) (U/L) • Colinesterasa (U/L) • Niveles de ciclosporina. ! 99! Estas muestras fueron remitidas al Servicio de Inmunología inmediatamente para su procesamiento. Creímos fundamental comparar toda esta información con OTROS PARÁMETROS (bilirrubina, GOT, GPT, GGT, ALP colinesterasa, niveles de anticalneurinicos), utilizados en la práctica clínica diaria para el control del paciente. En el protocolo postoperatorio habitual del paciente trasplantado, estos parámetros son evaluados periodicamente. No sólo han sido pruebas establecidas para nuestro estudio clínico 5.2.2 PROCESAMIENTO EN EL SERVICIO DE INMUNOLOGIA En el Servicio de Inmunología se procede a la determinación mediante enzimoinmunoensayo (ELISA) de los niveles de receptor de IL-2, que es la forma indirecta de cuantificar los niveles de interleukina-2, y de molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) circulante en suero y bilis de pacientes sometidos a trasplante hepático. PROCESAMIENTO DE IL-2 E ICAM-1 MEDIANTE ELISA Se realiza mediante un set standard que consiste en un sándwich formado por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El material utilizado para conseguir resultados es : • Placas microonduladas, con multiples pocillos • Un lector de microplacas capaz de medir absorbancia a 450 nm. • Pipetas ajustables que midan volúmenes comprendidos entre 2 microlitros y 1 mililitro. • Agua desionizada. • Solución amortiguadora: Bicarbonato de sodio. • Diluyente: Suero fetal bovino al 10% u otras sustancias. • Tampón fosfato salino. • Sustancia limpiadora. • Amortiguador limpiador. • Botella limpiadora. • Solución TMB: agregado del sustrato de la enzima. (Reactivo color) • Solución de parada (ácido sulfúrico) ! 100! • Papel para registrar el análisis de datos. • Tubos para preparar diluciones standard. • Cronómetro. • Papel absorbente. Almacenamiento de las muestras • Kit de almacenamiento a 4ºC. • Tras la reconstitución y liofilización standard con los diluyentes, dividimos equitativamente en viales de polipropileno y almacenamos las muestras a -70ºC. Evitamos congelar/descongelar de forma repetida o puede perder su actividad. • Antes de utilizar las muestras, llevamos los componentes a la temperatura ambiente (18-25ºC). Hasta que se complete el estudio, retornamos todos los componentes a las condiciones de almacenaje apropiadas. Recogida y manipulación de las muestras Cultivo de células sobrenadantes: Si es necesario, centrifugamos para extraer detritus previo al análisis. Las muestras pueden ser guardadas a <-20ºC. Suero: Usamos un tubo para separar el suero y extraer coágulos. Después centrifugamos durante 10 minutos a 1,000 X g. Quitamos la capa de suero y estudiamos la muestra inmediatamente o guardamos el ejemplar de suero a <-20ºC. Las muestras de plasma deben ser claras y no hemolizadas. Preparación de las muestras No mezclamos reactivos de diferentes sets o lotes. Todos los reactivos deben diluirse inmediatamente antes de ser utilizados. • Diluimos el anticuerpo unido a la enzima 1: 200 en la solución amortiguadora. En una placa, diluimos 60 microlitros de anticuerpos en 11.94 ml de solución amortiguadora. • Reconstituimos la muestra liofilizada standard con 0.2 ml del diluyente y mezclamos bien. Dejamos reposar a temperatura ambiente 15 minutos y mezclamos de nuevo. ! 101! • Antes de utilizar, preparamos 1.000 microlitros de sustancia de parada y añadimos a la mezcla a una concentración de 500 pg/ml, de la solución guardada en el diluyente. • Diluimos el reactivo 1: 1000 con el diluyente. Por cada placa, diluimos 12 microlitros de reactivo en 11,99 de diluyente. Procedimiento del estudio • Un día antes de la realización del ELISA, diluimos el anticuerpo en la solución amortiguadora. Añadimos 100 microlitros de este anticuerpo a todos los pocillos de la placa del set. Incubamos la placa durante toda la noche a 4ºC. • Es importante que todos los reactivos estén a temperatura ambiente antes de ser utilizados. Es importante que todas las muestras se procesen por duplicado o triplicado así como es importante realizar una curva estandard por cada estudio realizado. • Lavamos cada placa cuatro veces al menos con 300 microlitros de amortiguador limpiador cada pocillo y secamos con papel absorbente. • Para bloquear una unión no específica y reducir problemas, añadimos 200 microlitros de diluyente por pocillo. • Sellamos la placa e incubamos en la centrifugadora durante una hora a 200 rpm. • Preparamos 1.000 microlitros de la solución standard a una concentración de 500 pg/ml con el diluyente. Preparamos seis dobles series de diluciones de la dilución standard de 500 pg/ml en tubos separados. Tras la dilución, las concentraciones standard de IL-2 humana son 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.3 pg/ml, 15.6 pg/ml y 7.8 pg/ml respectivamente El diluyente sirve como muestra control (0 pg/ml). En el caso de ICAM-1 el proceso es igual, pero las mediciones se obtuvieron en ngr/ml. • Lavamos cada placa cuatro veces con la solución limpiadora. • Añadimos 100 microlitros de solución standar y muestra a los pocillos. • Sellamos cada placa y la incubamos en la centrifugadora durante dos horas. • Lavamos cada placa cuatro veces con solución limpiadora. ! 102! • Añadimos 100 microlitros de solución de anticuerpos diluídos a cada pocillo, sellamos la placa e incubamos en la centrifugadora durante una hora. • Limpiamos la placa cuatro veces con solución limpiadora. • Añadimos 100 microlitros de reactivo a cada pocillo, sellando la placa e incubándola en la en la centrifugadora durante 30 minutos. • Limpiamos la placa cinco veces de forma minuciosa con solución limpiadora. Fue el lavado final y concienzudo para evitar errores. • Añadimos 100 microliros de TMB (reactivo color) e incubamos en la oscuridad durante 15-30 minutos o hasta que obtuvimos el color deseado. Los pocillos que reaccionaron cambiaron a color azul. En este paso no fue necesario sellar la placa. • Detuvimos la reacción añadiendo la solución de parada en cada pocillo. En este momento cada pocillo cambió su color de azul a amarillo. • Se leyó la absorción a 450 nm en 30 minutos. Si el lector puede leer hasta 570 nm, la lectura mejora. La incubación óptica de las muestras depende de las condiciones del laboratorio y de los rangos de los lectores de placas de ELISA. ! 103! PROCESAMIENTO ICAM-1 PROCESAMIENTO DE IL-2 ! 104! 5.2.3 METODO ESTADÍSTICO Una vez descritas las características de los pacientes incluídos en el estudio, pasamos a ver la determinación de los parámetros IL-2 e ICAM-1 en sangre y bilis y su análisis estadístico. Se ha realizado un estudio estadístico descriptivo de las variables según los grupos de estudio. Se usó para representarlos gráfricamente diagramas de cajas y bigotes. Se realizó una comprobación de los grupos de estudio mediante la H de Kruskall-Wallis. Para las comparaciones múltiples se usó la prueba U Mann-Whitney, aplicando la corrección de Bonferroni. A nivel de significación estadística, se estableció en p< 0.05. Los datos fueron analizados con el software IBMR SSPSR Statistics 19. ANALISIS CURVAS ROC La toma de decisiones clínicas es un proceso extremadamente complejo en el que deberá finalmene ser valorada la utilidad para el manejo del paciente de cualquier prueba diagnóstica. En este contexto, es imprescindible conocer detalladamente la exactitud de las distintas pruebas diagnósticas que se realizan al paciente. Por este motivo, decidimos realizar el estudio de las curvas de ROC y determinar la sensibilidad y especificidad del análisis de IL-2R e ICAM-1 en sangre y bilis. Generalmente, la exactitud diagnóstica se expresa como sensibilidad y especificidad diagnósticas. La sensibilidad es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo respecto a la condición que estudia la prueba. La especificidad es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo cuyo estado real sea el definido como negativo. Un primer grupo de métodos para construir la curva ROC lo constituyen los llamados métodos no paramétricos. Posteriormente se procede a la elección de distintos niveles de decisión o valores de corte que permiten una clasificación de los valores de la prueba según sean superiores o inferiores al valor elegido. Respecto al análisis de las curvas de ROC en nuestro estudio para la analizar la sensibilidad y especificidad de nuestros biomarcadores, establecemos tres niveles de corte: 1) nivel A: nivel próximo a niveles normales; 2) nivel B: nivel intermedio entre el nivel normal y el nivel más elevado y 3) nivel C: nivel al ! 105! 6.1 RESULTADOS EN CUANTO A LA MUESTRA Como ya comentamos en material y métodos, en este estudio se han incluído 90 pacientes. En la tabla posteriormente expuesta resumimos las características de los 90 pacientes incluídos en el estudio, divididos en los tres grupos: grupo estable (16 pacientes), grupo rechazo ( 50 pacientes) y grupo complicaciones (24 pacientes). 6.1.1 VARIABLES DE ESTUDIO * Sexo. * Edad. * Indicación del Trasplante hepático. * Grupo sanguíneo (fundamental para la compatibilidad del injerto). * Estadío de Chid (A, B o C) pretrasplante de los pacientes. * Grado de rechazo de los pacientes con rechazo: se divide en Grado I, Grado II y Grado III. * Injerto óptimo/subóptimo. * Tipo de anastomosis. * Reintervenciones si/no. * Infecciones. * Tiempo medio de isquemia venosa (minutos). * Tiempo medio de isquemia arterial (minutos). ! 112! 6.2.2 Diagrama de cajas de la distribución de los tres grupos para la LOS INHIBIDORES DE CALCINEURINA Y LA BILIRRUBINA CNI Br ! 113! 6.2.3 Diagrama de cajas de la distribución de los tres grupos para la GOT y la GPT GOT GPT ! 114! 6.2.4 Diagrama de cajas de la distribución de los tres grupos para GGT y ALP GGT ALP ! 115! 6.2.5 Diagrama de cajas de la distribución de los tres grupos para la COLINESTERASA Colinesterasa ! 116! 6.2.6 DIAGRAMAS DE BARRAS DE LOS DISTINTOS PARÁMETROS Representación media en pacientes grupo ESTABLE en el 10º día postoperatorio Representación media en pacientes grupo RECHAZO en el 10º día postoperatorio Representación media en pacientes grupo COMPLICACIONES en el 10º día postoperatorio 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 POD10 CyA Bilirrubina GOT GPT GGT ALP Colinesterasa 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 POD10 CyA Bilirrubina GOT GPT GGT ALP Colinesterasa 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 POD10 CyA Bilirrubina GOT GPT GGT ALP Colinesterasa ! 117! * ******6.2.7 RESUMEN MEDIA EN LOS TRES GRUPOS 10º DÍA Media ESTABLE RECHAZO COMPLICACIONES Bilirrubina 2,58 mg/dl 20,46 mg/dl 10,66 mg/dl GOT 17,50 UI/l 98,94 UI/l 110,00 UI/l GPT 45,66 UI/l 202,21 UI/l 268,08 UI/l GGT 72, 83 U/l 269,84 U/l 196,63 U/l ALP 169, 33 U/l 323,73 U/l 357,08 U/l Colinesterasa 3876,00 U/ml 3637,05 U/ml 4061 U/ml Inh calcineurina 494,63 ngr/cc 508.40 ngr/cc 590,75 ngr/cc Hemos representado mediante diagrama de cajas, diagrama de barras y tabla, la media de bilirrubina, GOT, GPT, GGT, ALP, colinestersa e inhibidores de calcineurina en el 10º día postoperatorio, poniendo de manifiesto las diferencias entre los tres grupos de pacientes incluídos en este estudio: pacientes estables, pacientes con rechazo y pacientes con complicaciones diferentes de rechazo. ! 118! 6.2.8 PRUEBAS NO PARAMETRICAS Prueba de Kruskal-Wallis Estadísticos de contraste CNI BR GOT GPT GGT ALP Chi-cuadrado ,349 36,263 22,477 14,877 17,496 12,064 Gl 2 2 2 2 2 2 Sig. asintót. ,840 ,000 ,000 ,001 ,000 ,002 Prueba de Mann-Whitney . SIG SI P<0.025. PRUEBA DE BONFERRONI Estadísticos de contrastea BR GOT GPT GGT ALP U de Mann-Whitney ,000 44,000 88,000 44,000 72,000 W de Wilcoxon 78,000 122,000 166,000 122,000 150,000 Z -5,182 -4,183 -3,183 -4,183 -3,546 Sig. asintót. (bilateral) ,000 ,000 ,001 ,000 ,000 Es importante analizar los parámetros arriba descritos. La determinación es la correspondiente al 10º día postoperatorio. Se eligió este día porque suele corresponder con el día del rechazo en este grupo o en el de complicaciones si estas han aparecido. Hay una elevación de todas las enzimas hepáticas y de la bilirrubina en el grupo rechazo y en el grupo complicaciones estadísticamente significativa. Bilirrubina en el grupo rechazo, GOT en el grupo complicaciones, GPT en el grupo complicaciones, GGT en el grupo rechazo y ALP en el grupo complicaciones. La colinesterasa mantiene niveles normales en los tres grupos. Este dato se puede relacionar con una buena función del injerto. Pese al rechazo y a las distintas complicaciones en el grupo rechazo y grupo complicaciones, el tratamiento es el adecuado, no afectándose la función hepática. Los niveles de inhibidores de calcineurina son iguales en los tres grupos, aportando homogeneidad a la muestra. Observando los datos obtenidos podemos afirmar que los tres grupos son homogéneos, asimismo, en cuanto a sexo, edad, indicación TOH, grupo sanguíneo, estadío Child, técnica quirúrgica y tiempo de isquemia. ! 119! 6.3 RESULTADOS DE IL-2R EN SANGRE Resumen del procesamiento de los casos Los niveles normales de IL-2R son de 100 + 50 pm/l Vamos a mostrar tras el estudio estadístico los resultados del análisis de IL-2 en sangre en los días 1, 5, 10, 15 y 20. Las variables estudiadas son: Media, Error típico de la media, Intervalo de confianza al 95% (Límite superior y límite inferior), Media recortada al 5%, Mediana, Varianza y Desviación típica. 6.3.1 DESCRIPTIVOS sIL2R 1 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………… 234,71 Error típico de la media ……………………………………………. 27,32 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………….. 176,47 Límite superior …………………….. 292,95 Media recortada al 5% …………………………………………….. 233,12 Mediana ……………………………………………… 197,35 Varianza ……………………………………………… 11945,52 Desviación típica …………………………………………..... 109,29 RECHAZO Media ……………………………………………… 251,16 Error típico de la media …………………………………………….. 31,44 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………… 187,66 Límite superior…………………… 314,66 Media recortada al 5% …………………………………………….. 227,54 Mediana ……………………………………………… 185,00 Varianza ……………………………………………… 41522,47 Desviación típica ……………………………………………… 203,77 COMPLICACIONES Media ……………………………………………….. 211,37 Error típico de la media ……………………………………………… 72,52 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………….. 39,88 Límite superior …………………… 382,86 Media recortada al 5% ……………………………………………..... 209,44 Mediana ………………………………………………... 194,00 Varianza ………………………………………………... 42074,48 Desviación típica ……………………………………………….. 205,12 ! 120! sIL-2R 5 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………….. 239,00 Error típico de la media …………………………………………… 16,56 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………… 203,70 Límite superior ……………………. 274,30 Media recortada al 5% …………………………………………… 240,77 Mediana …………………………………………….. 232,00 Varianza …………………………………………….. 4388,53 Desviación típica …………………………………………... 66,24 RECHAZO Media …………………………………………….. 462,48 Error típico de la media …………………………………………… 33,82 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 394,17 Límite superior………………….. 530,80 Media recortada al 5% ……………………………………………. 456,85 Mediana …………………………………………….. 438,00 Varianza …………………………………………….. 48062,08 Desviación típica ……………………………………………. 219,23 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 213,30 Error típico de la media ……………………………………………. 87,55 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 6,27 Límite superior ………………….. 420,32 Media recortada al 5% ……………………………………………... 203,75 Mediana ……………………………………………… 127,35 Varianza ……………………………………………… 61321,13 Desviación típica ……………………………………………… 247,63 sIL-2R 10 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………….. 289,14 Error típico de la media …………………………………………… 24,80 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………… 236,26 Límite superior ……………………. 342,01 Media recortada al 5% ……………………………………………. 292,99 Mediana …………………………………………….. 318,00 Varianza …………………………………………….. 9847,04 Desviación típica ………………………………………….... 99,23 RECHAZO Media ……………………………………………... 527,23 Error típico de la media ……………………………………………. 37,00 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 452,50 Límite superior………………….. 601,95 Media recortada al 5% ……………………………………………. 520,14 Mediana ……………………………………………... 520,00 Varianza ……………………………………………... 57503,40 Desviación típica …………………………………………….. 239,79 ! 121! COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 295,65 Error típico de la media ……………………………………………. 114,11 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 25,80 Límite superior ………………….. 565,49 Media recortada al 5% ……………………………………………... 283,61 Mediana ………………………………………………. 187,30 Varianza ………………………………………………. 104180,99 Desviación típica ……………………………………………… 322,77 sIL-2R 15 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………... 260,42 Error típico de la media ……………………………………………. 20,95 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ……………………. 215,76 Límite superior …………………….. 305,09 Media recortada al 5% …………………………………………….. 259,42 Mediana ……………………………………………… 266,71 Varianza ……………………………………………... 7025,56 Desviación típica …………………………………………..... 83,81 RECHAZO Media ……………………………………………… 435,65 Error típico de la media …………………………………………….. 39,95 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………… 354,95 Límite superior…………………… 516,34 Media recortada al 5% …………………………………………….. 421,18 Mediana ……………………………………………… 382,00 Varianza ……………………………………………… 67056,61 Desviación típica ……………………………………………… 258,95 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 281,70 Error típico de la media ……………………………………………. 115,33 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 8,97 Límite superior …………………. 554,42 Media recortada al 5% …………………………………………….. 267,30 Mediana ……………………………………………… 152,10 Varianza ……………………………………………… 106416,92 Desviación típica ……………………………………………… 326,21 ! 128! 6.3.8 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 20 Y SU CURVA DE ROC. IL-2R 20 ! 129! 6.3.9 PRUEBAS NO PARAMÉTRICAS Prueba de Kruskal-Wallis Estadísticos de contraste sIL_2R_1 sIL_2R_5 sIL_2R_10 sIL_2R_15 sIL_2R_20 Chi-cuadrado ,849 21,056 15,373 7,092 4,008 Gl 2 2 2 2 2 Sig. asintót. ,654 ,000 ,000 ,029 ,135 Prueba de Mann-Whitney: CORRECIÓN DE BONFERRONI Y SERÁ SIGNIFICATIVO SI P<0.025 Estadísticos de contraste sIL-2R 5 sIL-2R 10 sIL-2R 15 U de Mann-Whitney 92,000 122,000 208,000 W de Wilcoxon 228,000 258,000 344,000 Z -4,249 -3,725 -2,228 Sig. asintót. (bilateral) ,000 ,000 ,026 Tras el análisis de datos arriba expuestos sobre la IL-2 en suero, observamos que los niveles de IL-2 en suero aparecen elevados en los tres grupos: estable, rechazo y complicaciones y en todas las determinaciones: 1º día, 5º día, 10º día, 15º día y 20º día postrasplante. Los niveles son más elevados en el grupo rechazo respecto a los otros grupos, que mantienen entre ellos niveles similares. Como se ha evidenciado, al aplicar la prueba de Kruskal-Wallis (p<0.05) y la Corrección de Bonferroni (test Mann-Whitney) (p<0.025), esta elevación es estadísticamente significativa los días 5 (p<.000), 10 (p< .000) y 15 (p< .026). ! 130! 6.3.10 CURVAS ROC IL-2R Área bajo la curva Variables resultado de contraste:sIL-2R 1 Área Error típ.a Sig. asintótic ab Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior ,674 ,057 ,030 ,561 ,786 Área bajo la curva Variables resultado de contraste:sIL-2R 5 Área Error típ.a Sig. asintóticab Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior ,664 ,055 ,041 ,557 ,772 Área bajo la curva Variables resultado de contraste:sIL-2R 10 Área Error típ.a Sig. asintóticab Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior ,648 ,055 ,065 ,539 ,757 Área bajo la curva Variables resultado de contraste:sIL-2R 15 Área Error típ.a Sig. asintóticab Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior ,563 ,063 ,445 ,440 ,685 Área bajo la curva Variables resultado de contraste:sIL-2R 20 Área Error típ.a Sig. asintóticab Intervalo de confianza asintótico al 95% Límite inferior Límite superior ,648 ,069 ,077 ,512 ,783 ! 131! Respecto a las curvas de ROC, podemos considerar que hemos obtenido significación asintótica los días 1 (p< .030), 5 (p< .041), 10 (.065) y 20 (p<0.77), aunque los valores sean algo mayor que 0.05. Hemos analizado la sensibilidad y especificidad para cada uno de estos días. Debemos recordar que los niveles normales son: 100 + 50 pm/ l. Aplicando el protocolo descrito en material y métodos de establecer un nivel A, nivel B y nivel C, según las determinaciones obtenidas en el marcador… Según las determinación obtenidas: DIA NIVEL SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD DIA 1 A) 101,5 pm/l B) 234,56 pm/l 100% 50% 42% 70% DIA 5 A) 222,50 pm/l B) 303,50 pm/l C) 410,00 pm/l 71,4% 57,1% 42,9% 38% 88% 100% DIA 10 A) 257,07 pm/l B) 363,50 pm/l C) 514,50 pm/l 70,4% 60,00% 42,90% 25% 75% 100% DIA 20 A) 208,50 pm/l B) 328,42 pm/l C) 420,00 pm/l 72% 42% 24% 50% 75% 100% 1) nivel A: nivel próximo a niveles normales; 2) nivel B: nivel intermedio entre el nivel normal y el nivel más elevado y 3) nivel C: nivel alto ! 132! 6.4 RESULTADOS DE IL-2R EN BILIS Resumen del procesamiento de los casos Los valores normales de IL-2R son de 100 + 50 pm/l Vamos a mostrar tras el estudio estadístico, los resultados del análisis e IL-2 en bilis en los días 1, 5, 10, 15 y 20. Las variables estudiadas son: Media, Error típico de la media, Intervalo de confianza al 95% (Límite superior y límite inferior), Media recortada al 5%, Mediana, Varianza y Desviación típica. 6.4.1 DESCRIPTIVOS IL-2R bilis 1 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………… 28,45 Error típico de la media ………………………………………….. 5,82 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ………………….. 14,69 Límite superior …………………… 42,22 Media recortada al 5% …………………………………………… 27,57 Mediana ……………………………………………. 20,50 Varianza ……………………………………………. 271,02 Desviación típica …………………………………………... 16,46 RECHAZO Media …………………………………………….. 12,10 Error típico de la media ……………………………………………. 4,31 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 3,06 Límite superior………………….. 21,13 Media recortada al 5% ……………………………………………. 9,88 Mediana ……………………………………………... 6,00 Varianza …………………………………………….. 372,30 Desviación típica …………………………………………….. 19,29 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 5,66 Error típico de la media ……………………………………………. 3,58 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. -3,54 Límite superior ………………….. 14,87 Media recortada al 5% ……………………………………………... 5,35 Mediana ……………………………………………… ,00 Varianza ……………………………………………… 77,06 Desviación típica ……………………………………………… 8,77 ! 133! IL-2 bilis 5 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………….. 7,83 Error típico de la media ……………………………………………. 2,85 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………… 1,07 Límite superior ……………………. 14,59 Media recortada al 5% ……………………………………………. 7,57 Mediana …………………………………………….. 5,50 Varianza …………………………………………….. 66,40 Desviación típica ………………………………………….... 8,08 RECHAZO Media …………………………………………….. 53,30 Error típico de la media ……………………………………………. 18,63 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 14,29 Límite superior………………….. 92,30 Media recortada al 5% ……………………………………………. 45,88 Mediana ……………………………………………… 12,50 Varianza ……………………………………………… 6946,74 Desviación típica …………………………………………….. 83,34 IL-2 bilis 10 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………... 3,70 Error típico de la media ……………………………………………. 1,23 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ……………………. ,77 Límite superior …………………….. 6,63 Media recortada al 5% ……………………………………………. 3,61 Mediana ……………………………………………... 2,91 Varianza ……………………………………………… 12,29 Desviación típica …………………………………………..... 3,50 RECHAZO Media ……………………………………………... 31,30 Error típico de la media ……………………………………………. 15,86 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. -1,90 Límite superior………………….. 64,50 Media recortada al 5% ……………………………………………. 21,61 Mediana …………………………………………….. 8,50 Varianza …………………………………………….. 5035,16 Desviación típica ……………………………………………. 70,95 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 2,00 Error típico de la media ……………………………………………. 1,26 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. -1,25 Límite superior ………………….. 5,25 Media recortada al 5% ……………………………………………... 1,88 Mediana ……………………………………………… ,00 Varianza ……………………………………………… 9,60 Desviación típica …………………………………………….. 3,09 ! 134! ************** IL-2R bilis 15 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………….. 1,70 Error típico de la media ……………………………………………. ,77 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ……………………. -,12 Límite superior …………………….. 3,5 Media recortada al 5% …………………………………………….. 1,6 Mediana ……………………………………………… ,90 Varianza ……………………………………………… 4,76 Desviación típica …………………………………………..... 2,18 RECHAZO Media ……………………………………………... 46,30 Error típico de la media ……………………………………………. 25,61 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. -7,31 Límite superior………………….. 99,91 Media recortada al 5% ……………………………………………. 30,38 Mediana …………………………………………….. 4,50 Varianza …………………………………………….. 13121,48 Desviación típica ……………………………………………. 114,54 IL-2R bilis 20 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………... 3,00 Error típico de la media ……………………………………………. ,70 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ……………………. 1,32 Límite superior ……………………. 4,67 Media recortada al 5% ……………………………………………. 3,05 Mediana ……………………………………………... 3,50 Varianza ……………………………………………... 4,00 Desviación típica ………………………………………….... 2,00 RECHAZO Media ……………………………………………… 3,90 Error típico de la media ……………………………………………. 1,89 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. -,06 Límite superior………………….. 7,86 Media recortada al 5% ……………………………………………. 2,83 Mediana …………………………………………….. ,00 Varianza …………………………………………….. 71,67 Desviación típica ……………………………………………. 8,46 ! 135! 6.4.2 DIAGRAMA DE CAJAS DE LAMEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 1 Y SU CURVA DE ROC.* IL-2R bilis 1 ! 136! 6.4.3 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 5 Y SU CURVA DE ROC. IL-2R bilis 5 ! 137! 6.4.4 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 10 Y SU CURVA DE ROC. IL-2R bilis 10 ! 144! 6.5 RESULTADOS DE ICAM-1 EN SANGRE Resumen del procesamiento de los casos Los valores normales de ICAM-1 son 282 + 113 ngr/ml. Vamos a mostrar tras el estudio estadístico los resultados del análisis e ICAM-1 en sangre en los días 1, 5, 10, 15 y 20. Las variables estudiadas son: Media, Error típico de la media, Intervalo de confianza al 95% (Límite superior y límite inferior), Media recortada al 5%, Mediana, Varianza y Desviación típica. 6.5.1 DESCRIPTIVOS sICAM 1 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………. 556,71 Error típico de la media …………………………………………… 86,25 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………... 372,87 Límite superior …………………… 740,55 Media recortada al 5% …………………………………………… 547,29 Mediana ……………………………………………. 465,35 Varianza ……………………………………………. 119030,05 Desviación típica …………………………………………... 345,00 RECHAZO Media ……………………………………………. 543,00 Error típico de la media …………………………………………… 40,05 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………. 462,10 Límite superior…………………. 623,90 Media recortada al 5% …………………………………………… 535,72 Mediana ……………………………………………. 540,00 Varianza ……………………………………………. 67396,39 Desviación típica …………………………………………… 259,60 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 288,75 Error típico de la media ……………………………………………. 54,15 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 160,69 Límite superior ………………….. 416,80 Media recortada al 5% ……………………………………………... 288,33 Mediana ……………………………………………… 285,00 Varianza ……………………………………………… 23462,50 Desviación típica ……………………………………………… 153,17 sICAM-1 5 ESTADÍSTICOS ! 145! ESTABLE Media …………………………………………… 586,14 Error típico de la media ………………………………………….. 94,96 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ………………….. 383,73 Límite superior …………………… 788,55 Media recortada al 5% …………………………………………… 570,71 Mediana …………………………………………… 469,57 Varianza …………………………………………… 144288,64 Desviación típica …………………………………………... 379,85 RECHAZO Media ……………………………………………. 691,36 Error típico de la media …………………………………………… 40,06 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………. 610,45 Límite superior…………………. 772,28 Media recortada al 5% …………………………………………… 684,85 Mediana ……………………………………………. 625,00 Varianza …………………………………………… 67425,288 Desviación típica …………………………………………… 259,65 COMPLICACIONES Media …………………………………………….. 450,00 Error típico de la media …………………………………………… 99,74 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………. 214,12 Límite superior …………………. 685,87 Media recortada al 5% ……………………………………………... 462,77 Mediana ……………………………………………… 565,00 Varianza ……………………………………………… 79600,00 Desviación típica ……………………………………………… 282,13 sICAM-1 10 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media …………………………………………….. 519,85 Error típico de la media ……………………………………………. 70,20 Intervalo confianza al 95% Límite inferior ……………………. 370,20 Límite superior …………………….. 669,50 Media recortada al 5% ……………………………………………. 499,50 Mediana …………………………………………….. 426,43 Varianza …………………………………………….. 78869,98 Desviación típica ………………………………………….... 286,00 RECHAZO Media …………………………………………….. 755,99 Error típico de la media ……………………………………………. 35,18 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 684,93 Límite superior………………….. 827,06 Media recortada al 5% ……………………………………………. 749,07 Mediana …………………………………………….. 700,00 Varianza ……………………………………………. 52002,37 Desviación típica ……………………………………………. 228,04 ! 146! COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 412,50 Error típico de la media ……………………………………………. 90,52 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 198,43 Límite superior …………………. 626,56 Media recortada al 5% ……………………………………………... 425,55 Mediana ……………………………………………… 530,00 Varianza ……………………………………………… 65564,28 Desviación típica ……………………………………………… 256,05 sICAM-1 15 ESTADÍSTICOS ESTABLE Media ……………………………………………. 436,57 Error típico de la media …………………………………………… 53,95 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………... 321,56 Límite superior ……………………. 551,57 Media recortada al 5% …………………………………………… 423,41 Mediana ……………………………………………. 340,00 Varianza ……………………………………………. 46577,82 Desviación típica …………………………………………... 215,81 RECHAZO Media ……………………………………………. 682,40 Error típico de la media …………………………………………… 52,37 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior…………………. 576,62 Límite superior…………………. 788,17 Media recortada al 5% …………………………………………… 672,03 Mediana …………………………………………….. 600,00 Varianza ……………………………………………. 115211,16 Desviación típica …………………………………………… 339,42 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 558,75 Error típico de la media ……………………………………………. 63,61 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 408,32 Límite superior …………………. 709,17 Media recortada al 5% ……………………………………………... 560,27 Mediana ……………………………………………… 572,50 Varianza ……………………………………………… 32376,78 Desviación típica ……………………………………………… 179,93 sICAM-1 20 ESTADÍSTICOS ! 147! ESTABLE Media ……………………………………………. 359,00 Error típico de la media …………………………………………… 33,87 Intervalo confianza al 95% Límite inferior …………………… 286,79 Límite superior …………………… 431,20 Media recortada al 5% …………………………………………… 355,00 Mediana ……………………………………………. 319,50 Varianza ……………………………………………. 18362,93 Desviación típica …………………………………………... 135,50 RECHAZO Media …………………………………………….. 565,70 Error típico de la media ……………………………………………. 48,89 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 466,96 Límite superior………………….. 664,43 Media recortada al 5% ……………………………………………. 541,35 Mediana …………………………………………….. 440,00 Varianza ……………………………………………. 100390,83 Desviación típica ……………………………………………. 316,84 COMPLICACIONES Media ……………………………………………… 404,75 Error típico de la media ……………………………………………. 88,12 Intervalo de confianza al 95% Límite inferior………………….. 196,13 Límite superior …………………. 613,36 Media recortada al 5% ……………………………………………... 405,83 Mediana ……………………………………………… 414,50 Varianza ……………………………………………… 62265,92 Desviación típica ……………………………………………… 249,53 !!!!!!*6.5.2***RESUMEN MEDIA EN LOS TRES GRUPOS POR DIA* ! Media ESTABLE RECHAZO COMPLICACIONES Día 1 556,71 ngr/ml 543,00 ngr/ml 288,75 ngr/ml Día 5 586,14 ngr/ml 691,36 ngr/ml 450,00 ngr/ml Día 10 519,85 ngr/ml 755,99 ngr/ml 412,50 ngr/ml Día 15 436,57 ngr/ml 682,40 ngr/ml 558,75 ngr/ml Día 20 359,00 ngr/ml 565,70 ngr/ml 404,75 ngr/ml ! Resumen de las medias de sICAM-1 por día en los tres grupos, evidenciando las diferencias, estadísticamente significativas a partir del día 10. 6.5.3 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 1 Y SU CURVA DE ROC. ! 148! sICAM-1 1 6.5.4. DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 5 Y SU CURVA DE ROC. ! 149! ICAM-1 5 6.5.5 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 10 Y SU CURVA DE ROC. ! 150! ICAM-1 10 6.5.6 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 15 Y SU CURVA DE ROC. ! 151! ICAM-1 15 6.5.7 DIAGRAMA DE CAJAS DE LA MEDIA EN LOS TRES GRUPOS EN EL DÍA 20 Y SU CURVA DE ROC. ! 152! ICAM-1 20 6.5.8 PRUEBAS NO PARAMÉTRICAS ! 153! Prueba de Kruskal-Wallis Estadísticos de contraste sICAM-1 1 sICAM-1 15 sICAM-1 10 sICAM-1 15 sICAM-1 20 Chi-cuadrado 5,698 4,171 14,658 7,046 7,752 Gl 2 2 2 2 2 Sig. asintót. ,058 ,124 ,001 ,030 ,021 Prueba de Mann-Whitney-CORRECIÓN DE BONFERRONI Y SERÁ SIGNIFICATIVO SI P<0.025 Estadísticos de contraste sICAM-1 10 sICAM-1 15 sICAM-1 20 U de Mann-Whitney 160,000 190,000 186,000 W de Wilcoxon 296,000 326,000 322,000 Z -3,064 -2,544 -2,612 Sig. asintót. (bilateral) ,002 ,011 ,009 Según los resultados arriba expuestos, los niveles de ICAM-1 en suero están elevados en los tres grupos, siendo estos niveles más elevados en el grupo rechazo. Estos niveles son evidentes los días 5, 10, 15 y 20. Aplicando la prueba de Kruskal-Wallis (p<0.05) y la Corrección de Bonferroni (test Mann-Whitney) (p<0.025), los niveles son estadísticamente significativos los días 10 (p<0.002); 15 (p<0.0011) y 20 (p<0.009). 6.5.9 CURVAS ROC ICAM-1