Estructura cristalina y propiedades coloidales de ácidos biliares modificados

TESIS DOCTORAL ESTRUCTURA CRISTALINA Y PROPIEDADES COLOIDALES DE ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS Santiago De Frutos Del Río QUÍMICA FÍSICA FACULTAD DE CIENCIAS LUGO 2015 TESIS DOCTORAL ESTRUCTURA CRISTALINA Y PROPIEDADES COLOIDALES DE ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS Santiago De Frutos Del Río DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA FACULTADE DE CIENCIAS LUGO 2015 AUTORIZACIÓN DOS DIRECTORES DA TESE D. José Vázquez Tato, Catedrático do Departamento de Química Física e D. Francisco Meijide del Río, Profesor Titular do Departamento de Química Física Como Directores da tese de Doutoramento titulada “ESTRUCTURA CRISTALINA Y PROPIEDADES COLOIDALES DE ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS” Presentada por D. Santiago De Frutos Del Río Alumno do Programa de Doutoramento de Ciencia e Enxeñaría dos Alimentos (R.D. 778/1998) Autorizan a presentación da Tese indicada, considerando que reúne os requisitos esixidos no artígo 34 do regulamento de Estudos de Doutoramento, e que como Directores da mesma non incurre nas causas de abstención establecidas na lei 30/1992. Asdo. José Vázquez Tato Asdo. Francisco Meijide del Río ESTRUCTURA CRISTALINA Y PROPIEDADES COLOIDALES DE ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS RESUMO Ás sales biliares son compostos con notoria relevancia na natureza. Dado o seu carácter anfífilo, actúan como surfactantes polo que teñen múltiples aplicacións en diferentes campos. Neste traballo móstrase a obtención de novos derivados das mesmas, destacando os oligómeros obtidos pola unión (vía enlaces amida) de dous a catro residuos biliares a diversas moléculas ponte bi-, triou tetra-dentadas. Os novos derivados compórtanse como surfactantes polo que determináronse os parámetros característicos asociados a este comportamento como, por exemplo, a concentración de agregación crítica e a área molecular na interfase aire/auga. Mediante estudos de dispersión de luz e diversas microscopias determináronse a xeometría e o tamaño dos agregados formados, así como a súa evolución co tempo. Observáronse estruturas micelares, agregados globulares, pseudo-vesículas e fibras, así como a formación de xeles e precipitados coloidais orixinados pola condensación de partículas de menor tamaño. Así mesmo, resolvéronse diversos cristais dos novos esteroides. PALABRAS CHAVE ácidos biliares, oligómeros, cristales, surfactantes, concentración de agregación crítica, agregados, micelas RESUMEN Las sales biliares son compuestos con notoria relevancia en la naturaleza. Dado su carácter anfífilo actúan como surfactantes por lo que tienen multiples aplicaciones en diferentes campos. En este trabajo se muestra la obtención de nuevos derivados de las mismas destacando los oligómeros obtenidos por la unión (vía enlaces amida) de dos a cuatro residuos biliares a diversas moléculas puente bi-, trio tetra-dentadas. Los nuevos derivados se comportan como surfactantes habiéndose determinado los parámetros característicos asociados a este comportamiento como, por ejemplo, la concentración de agregación crítica y el área molecular en la interfase aire/agua. Mediante estudios de dispersión de luz y diversas microscopias se han determinado la geometría y el tamaño de los agregagados formados, así como su evolución con el tiempo. Se han observado estructuras micelares, agregados globulares, pseudo-vesículas y fibras, así como la formación de geles y precipitados coloidales originados por la condensación de partículas de menor tamaño. Asimismo, se han resuelto diversos cristales de los nuevos esteroides. PALABRAS CLAVE ácidos biliares, oligómeros, cristales, surfactantes, concentración de agregación crítica, agregados, micelas ABSTRAC Bile salts are compounds with a well known relevance in nature. Because of their amphiphilic character they are surfactants, having many applications in different fields. In this work the synthesis of new derivatives is reported. Emphasis is made on oligomers obtained by linking (connect by amide bound) from two to four bile residues to several bi-, tri-, or tetrafunctionalized bridge molecules. The new derivatives behave like surfactants, having determined the typical parameters associated to this behavior as, for example, the critical concentration of aggregation and the molecular area at the interface air/water. By means of light scattering studies and diverse microscopies, the geometry and size of the formed aggregates have been determined, as well as his evolution with time. Structures like micelles, globular aggregates, vesicles and crystalline fibers have been observed, as well as the formation of gels and colloidal precipitates originated by the condensation of small particles. Likewise, some crystals (obtained by recrystallization from several solvents) of the new steroids have been solved. KEYWORDS Bile acids, oligomers, crystals, surfactants, critical aggregation concentration, aggregates, micelles AGRADECIMIENTOS A los Profesores Dr. José Vázquez Tato y Dr. Francisco Meijide del Río por el trabajo, la dirección, la gran ayuda y la experiencia que me han brindado durante estos años. A mi mentor en Química Orgánica, Víctor Hugo Soto Tellini. Sin sus enseñanzas, colaboración y amistad, no habría productos de los que hablar. A mis compañeros y algo más: Juan Ventura, Cristina, Carolina, Javier, Aida y demás que, sin su apoyo, sin su esfuerzo, sin su compañía, este trabajo no se podría haber realizado. No quisiera olvidarme de expresar mi agradecimiento al personal de los servicios de la RIAIDT de Lugo y Santiago por su trabajo y también a todas las personas que han contribuido de algún modo, por pequeño que sea el granito de arena. Y sin duda alguna, a quien más se lo tengo que agradecer, junto con mi familia, es a la persona que más ha invertido en mí…a fondo perdido…. tiempo, paciencia y cariño,…a mi Señora. Por último agradezco al Ministerio de Ciencia e Innovación por los proyectos MAT2001-2911, MAT2004-04606, MAT2007-61721 y MAT2010-19440, y a la Xunta de Galicia por los proyectos PGIDIT02PXIC26202PN, PGIDIT05PXIC26201PN y PGIDIT07PXIB262147PR gracias a los cuales ha sido posible desarrollar la presente investigación. Asimismo agradezco la ayuda Predoctoral de Formación de Personal Investigador (referencia BES-2008-004021) asociada al proyecto de investigación MAT2007-61721. ABREVIATURAS AcOEt Acetato de etilo Ad Adamantano (adamantilo) AFM Microscopía de fuerza atómica AEDT Ácido etilendiaminotetraacético ar Aromático BOC t-butoxicarbonil CA Ácido Cólico cac Concentración de agregación crítica cmc Concentración micelar crítica CONTIN Non-negatively constrained least squares: regularized DCA Ácido desoxicólico DEPC Dietilcianofosfonato Dh Diámetro hidrodrinámico DHB Ácido 2,5-dihidroxibenzoico o ácido gentísico DIAD Di-isopropil azo dicarboxilato DIBOC Di-t-Butiloxocarbonil DIC Diisopropilcarbodiimida DITHRANOL 1,8,9-Trihidroxiantraceno DLS (QELS) Dispersión de luz dinámica DMAP Dimetilaminopiridina DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DPPA Difenilfosforil azida DTAB Bromuro de dodeciltrimetilamonio ECF Etilcloroformiato EDCI 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ESI-FIA-TOF Electrospray ionization-flow injection analysisTime Of Flight FAB Bombardeo con Átomos Rápidos HOBt 4-hidroxibenzotriazol HRTEM High resolution transmission electronic microscopy HSBA Hard and Soft Acids and Bases LS Dispersión de luz MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight MRI Resonancia Magnética de Imagen m/z Relación masa/carga NaC Colato sódico NaCDC Quenodesoxicolato sódico NaDC Desoxicolato sódico nag Número de agregación NaLC Litocolato sódico NNLS Non-negatively constrained least squares: multiple pass NaTC Taurocolato sódico NaTCDC Tauroquenodesoxiolato sódico NaTDC Taurodesoxicolato sódico NaUDC Ursodesoxicolato sódico PAMAM Poliamido amina PDT Terapia fotodinámica PPh3 (TPP) Trifenilfosfina PPI Polipropileno-imina Rh Radio hidrodinámico RMN Resonancia Magnética Nuclear TA Temperatura ambiente SAXS Small Angle X-Ray Scattering SB Sal biliar SDS Dodecil sulfato sódico σ90 Polidispersidad a un ángulo de 90º TEA Trietilamina TEM Microscopía Electrónica de Transmisión TFA Ácido trifluoroacético THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografía en capa fina ÍNDICE Prefacio i-iv 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1 QUÍMICA SUPRAMOLECULAR 1 1.2 INTRODUCCIÓN A LA FISICOQUÍMICA DE COLOIDES 4 1.3 ÁCIDOS BILIARES 7 1.3.1 Colesterol 7 1.3.2 Esteroides y esteroles sintéticos. 10 1.3.3 Importancia biológica de las sales biliares 10 1.3.4 Estructura y propiedades de las sales biliares. 11 1.3.5 Formación de complejos entre ácidos biliares y metales pesados. 16 1.4 ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS 18 1.5 OLIGÓMEROS DE ÁCIDOS BILIARES 19 1.6 INTRODUCCIÓN A LAS PORFIRINAS 21 1.6.1 Estructura molecular y propiedades 21 1.6.2 Homoasociación de porfirinas en disolución acuosa 25 1.6.3 Protoporfirina IX 25 1.6.4 Meso-Tetra (4-carboxifenyl) porfirina (H2TCPP) 28 1.6.5 Metaloporfirinas 33 1.6.6 Antecedentes bibliográficos de esteroide-porfirinas 35 1.7 CONSIDERACIONES ESPECIALES DE LAS ESTRUCTURAS SINTETIZADAS 38 Bibliografía 39 2. ANÁLISIS DE CRISTALES DE ÁCIDOS BILIARES Y DERIVADOS. 47 2.1 INTRODUCCIÓN 47 2.1.1 Antecedentes bibliográficos 48 2.1.2 Ácido desoxicólico 48 2.1.3 Ácido cólico 51 2.1.4 Ácido 3β-amino cólico 66 2.2 RESULTADOS OBTENIDOS CON DERIVADOS MONO-SUSTITUIDOS 69 2.2.1 Monoderivado 3β-azidacolato de metilo, C-azida 69 2.2.2 Monoderivado Colato-dietilfosfato, amC-dietilfosfato 73 2.2.3 Monoderivado amC-aminoisoftálico 77 2.2.4 Mono derivado C-tereftálico 83 2.3 DÍMEROS CABEZA-CABEZA DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES 87 2.3.1 Dímero Colato-sucínico-Colato, amC2-Succínico 87 2.3.2 Dímero Colato-fenilo(1,3)-Colato o amC2-Isoftálico 91 2.3.3 Dímero Desoxicolato-fenil(1,3)-Desoxicolato o DC2-Isoftálico 94 2.3.4 Dímero colato-urea-colato, amC2-urea 97 2.4 NUEVO SISTEMA DE COORDENADAS INTERNAS PARA DÍMEROS DE ESTEROIDES 102 2.5 CÁLCULO DEL ÁREA DE LA SECCIÓN MOLECULAR DEL RESTO DE ÁCIDO BILIAR 107 Bibliografía 111 3. AGREGACIÓN DE DÍMEROS DERIVADOS DEL ÁCIDO CÓLICO 117 3.1 ÁCIDO AMC2-IMINODIACÉTICO 117 3.2 ÁCIDO AMC2-AMINOISOFTÁLICO 125 3.3 DÍMERO AMC2-PROTOPORFIRINA 131 3.4 DISCUSIÓN COMPARATIVA DE LA AGREGACIÓN DE DÍMEROS DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES 142 Bibliografía 146 4. AGREGACIÓN DE OLIGÓMEROS DERIVADOS DEL ÁCIDO CÓLICO 149 4.1 TRÍMERO C24,AMC2–AMINOISOFTÁLICO 150 4.2 TRÍMERO AMC24, AMC2–AMINOISOFTÁLICO 163 4.3 TETRÁMERO (AMC2-AMINOISOFTÁLICO)2-TEREFTÁLICO 168 4.4 TETRÁMERO AMC4-TPPORFIRINA 176 Bibliografía 188 CONCLUSIONES 189 APENDICE A SECCIÓN EXPERIMENTAL. 193 A.1 SÍNTESIS DEL DÍMERO AMC2-IMINODIACÉTICO 193 A.2 SÍNTESIS DEL AMC2-AMINOISOFTÁLICO 196 A.3 SÍNTESIS DEL DÍMERO AMC2-PROTOPORFIRINA 198 A.4 SÍNTESIS DEL TRÍMERO C24,AMC2–AMINOISOFTÁLICO 200 A.5 SÍNTESIS DEL TRÍMERO AMC24,AMC2–AMINOISOFTÁLICO 203 A.6 SÍNTESIS DEL TETRÁMERO (AMC2-AMINOISOFTÁLICO)2-TEREFTÁLICO 204 A.7 SÍNTESIS DEL TETRÁMERO AMC4-TPPORFIRINA 206 Bibliografía 208 APENDICE B TÉCNICAS INSTRUMENTALES 209 B.1 TENSIÓN SUPERFICIAL 209 B.2 DISPERSIÓN DE LUZ 218 B.3 MICROSCOPÍA 223 B.4 ESPECTROMETRÍA DE MASAS 226 B.5 OTRAS TÉCNICAS EMPLEADAS 227 Bibliografía 228 i PREFACIO La presente tesis doctoral se ha desarrollado en el Grupo de Investigación “Química Supramolecular y Fisicoquímica de Coloides”, Grupo GI-1589, ubicado en el campus de Lugo de la Universidad de Santiago de Compostela. Dentro del amplio campo de investigación que abarca este grupo, el objetivo del autor se ha centrado en la búsqueda de nuevos surfactantes, y de alguna forma ahondar en los mecanismos y parámetros que conducen a una molécula a asociarse para formar unidades de orden superior. Sin menospreciar otras familias de compuestos, únicamente se presentará en esta tesis el trabajo realizado con derivados de ácido cólico, aunque en algún momento aparecerá el acido desoxicólico. El papel principal de los ácidos biliares de partida en la naturaleza es actuar como detergentes, por consiguiente los nuevos derivados sintetizados presentan propiedades asociativas. Se han obtenido resultados muy diversos, “simplemente” para monoderivados, en cuanto a la estructura de los agregados formados en disolución, a la capacidad de formar geles y cristales líquidos o incluso a la solubilidad del compuesto. Cuando se trata de estructuras de carácter polimérico con ácidos biliares, los estudios del comportamiento en disolución acuosa son escasos y esto motivó el estudio del comportamiento de los compuestos sintetizados tanto en estado sólido como en disolución. Las estructuras moleculares generadas que se presentaran son casi exclusivamente de carácter polimérico lo que conlleva una nomenclatura IUPAC demasiado extensa y compleja para una lectura fluida del texto por lo que el autor se ve obligado a emplear una terminología especial más abreviada. La letra C estará relacionada el ácido cólico ya que es un acrónimo comúnmente utilizado en numerosas publicaciones. Dado que en la gran mayoría de moléculas que aparecerán a lo largo de este trabajo resultan de la unión del éster del ácido 3-β-aminocólico se utilizaran las siglas amC omitiendo la posición del grupo amino ya que es la misma en todos los casos. En aquellos casos en que se trabajó con la molécula de ácido desoxicólico (que se denominará DC) ha de tenerse en cuenta que no existen grupos amino ( en posición 3-β )a través de los que se formen enlaces amida al puente (o a un grupo sustituido) sino que se forman enlaces tipo éster entre el hidroxilo en posición 3-α y un ácido carboxílico del puente de unión. A la hora de componer el nombre de las distintas estructuras moleculares el subíndice indicara la estequiometria y el superíndice indicara la posición de unión del resto de esteroide al puente de unión pero se omitirá en todos los casos en el que sea a través de la posición 3 para simplificar. Por consiguiente solo aparecerá el superíndice en los casos en que la molécula contenga un resto de esteroide unido por una posición distinta. A continuación, el puente o la estructura polidentada, se abreviará con el nombre de la molécula de partida o el acrónimo correspondiente en caso de tenerlo. Así por ejemplo, el ácido 4- {3-[2-({[17-(3-Carboxi-1-metil-propil)-7,12-dihidroxi-10,13-dimetil-hexadecahidrociclopenta[a]fenantren-3-ilcarbamoil]-metil}-amino)-acetilamino]-7,12-dihidroxi-10,13-dimetilhexadecahidro-ciclopenta[a]fenantren-17-il}-pentanoico pasará a llamarse ácido amC2iminodiacetico. No cabe duda que resulta un texto menos engorroso para el lector. En apoyo de esta propuesta, cabe citar el compuesto 2,5,8,15,18,21-hexaoxatriciclo[20.4.09,14]hexacosa1(22),9,11,13,-23,25-hexaeno que, en la actualidad, todo el mundo conoce como éter-18-corona6, nombre que ya es un estándar en la bibliografía científica. ii  El capítulo 1 estará dedicado a una introducción para exponer conceptos generales, algunos más específicos, que hacen de pilares sobre los que se apoya el trabajo realizado.  El capítulo 2 se centrará en el estudio de la estructura cristalina tanto de monoderivados (Figura p.1) como de dímeros (Figura p.2) de ácidos biliares pero previamente se hará una introducción acerca de la relevancia del estudio de la estructura cristalina de esteroides y su potencial. dimetiléster del amC-aminoisoftálico dimetiléster del C-tereftálico Figura. p.1. Estructuras y nomenclatura de los mono derivados del ácido cólico que se presentan en el capítulo 2. Dada la complejidad de las nuevas estructuras generadas, a la hora de describir la conformación que adquieren en estado sólido cristalino, se mostrara un sistema de coordenadas recientemente publicado por este grupo de investigación para describir la posición relativa de los restos de esteroide respecto al puente de unión independientemente de su estructura. Para terminar este capítulo, el autor mostrará el método empleado para el cálculo del área de la sección molecular (la sombra de la molécula proyectada sobre un plano) de los productos que no se han conseguido cristalizar hasta el momento. amC2-urea amC2-succínico amC2-isoftálico DC2-isoftálico Figura p.2. Estructuras y nomenclatura de los esteres de dímeros derivados del ácido cólico y desoxicólico que se presentan en el capítulo 2. iii  En el capítulo 3 se inicia el estudio de las propiedades asociativas de compuestos surfactantes derivados del ácido cólico, comenzando con aquellos de carácter dimérico (Figura p.3), cuando se encuentran en disolución acuosa. El estudio incluye tanto medidas de tensión superficial, como los resultados obtenidos por microscopía y dispersión de luz laser. amC2-iminodiacético amC2-aminoisoftálico amC2-protoporfirina Figura p.3. Estructuras de los dímeros derivados del ácido cólico utilizando como puente de unión el ácido iminodiacético, ácido aminoisoftálico y la protoporfirina (IX).  El capítulo 4 continua con el estudio de las propiedades asociativas en disolución acuosa presentando los resultados obtenidos para trímeros (Figura p.4) y tetrámeros (Figura p.5) derivados del ácido cólico. HO OOH OH HN HO OOH OH HN N H O O OH O OH HO C24, amC2-aminoisoftálico amC24, amC2 -aminoisoftálico Figura p.4. Estructuras de los trímeros derivados del ácido cólico utilizando como puente de unión el ácido aminoisoftálico. iv (amC2-aminoisoftálico)2-tereftálico amC4-TPPorfirina Figura p.5. Estructuras de los tetrámeros derivados del ácido cólico. 1 INTRODUCCIÓN 1.1 QUÍMICA SUPRAMOLECULAR La célula es la unidad morfológica y funcional de todo ser vivo. Todos los organismos vivos, desde el más grande (la gran ballena azul con 33 metros de longitud y 190 toneladas) al más pequeño (la bacteria Mycoplasma con menos de 1 m) están compuestos por células (o la célula en el caso de organismos unicelulares) que forman todos los elementos estructurales, controlan el metabolismo y los innumerables procesos biológicos para el correcto funcionamiento del organismo. Los procesos realizados en las células que han dado lugar a la vida, como las reacciones metabólicas, el aislamiento del entorno, el transporte de oxígeno y energía, la fotosíntesis, la duplicación del ADN… tienen lugar a escala molecular, es decir, a escala nanométrica, mil veces menor que la escala micrométrica de las células. Es, a esta escala, dónde en las últimas décadas se han producido los avances científicos más relevantes que, sin duda, marcan el camino hacia el futuro en campos tan importantes como la medicina, la electrónica, la robótica, los materiales y la industria en general. Los frutos tecnológicos derivados de estos avances, abarcan desde un sistema completo de computación, transistores, nanoestructuras generadas por moléculas de distintas especies (criptandos, tubos, vesículas, máquinas moleculares…) hasta nuevos materiales a partir del carbono como los nanotubos o el grafeno. En último término, estas investigaciones tendrán como resultado una reducción significativa en las necesidades de recursos y energía. Estos dos conceptos de ahorro, son clave para el futuro de la humanidad. La Figura 1.1 ilustra una representación esquemática de los microy nanomundos. Figura.1.1. Representación esquemática del micromundo y nanomundo. 2 La Química supramolecular1-2 investiga la estructura y transformación de la materia sobre la base de la auto-organización y el reconocimiento molecular, mecanismos que han estado implicados a lo largo del proceso evolutivo de los seres vivos, tanto de forma estructural como funcional. El término supramolecular adquirió su actual significado en 1978 al ser acuñado por Jean-Marie Lehn,1 aunque ya había sido utilizado con anterioridad,3 y viene a significar más allá de la molécula. Trata del estudio de las interacciones entre dos o más moléculas que, sin formar enlace químico covalente entre ellas, son capaces de originar asociaciones moleculares dinámicas, más flexibles y termodinámicamente más lábiles que las entidades moleculares. La evolución ha sido motor de la curiosidad científica durante décadas y esto ha hecho que esta química más allá de la molécula sea una puerta para mirar al pasado, explorar el presente y plantear conceptos y objetivos más ambiciosos para el futuro.4 Como consecuencia, está Química está empezando a ser conocida como Química de la información. Desde el principio del universo la materia ha evolucionado desde materia amorfa hacia una materia condensada y organizada, originando la vida y, finalmente, la materia inteligente. El camino seguido, de una complejidad creciente, ha discurrido a través de la organización mutuamente interrelacionada (incluyendo la auto-organización) y, consiguientemente, el reconocimiento mutuo. Como Lehn ha hecho notar,4 de aquí surgen las preguntas primordiales de la química. La Química, entendida como ciencia de la estructura y transformación de la materia, está en una posición inigualable para responder esas preguntas: ¿Cómo hace la materia para volverse compleja? ¿Cuáles son los pasos y procesos que llevan desde una partícula elemental a un organismo inteligente (la entidad de mayor complejidad de la naturaleza)? ¿Qué otras formas de materia compleja pueden llegar a crearse? Desde que, en 1828, Friedrich Wöhler desarrolló la síntesis de la urea, la química molecular ha desarrollado una gran cantidad de sofisticados métodos para la construcción de estructuras moleculares cada vez más complejas, los cuales implican la ruptura y creación de enlaces covalentes entre átomos en posiciones controladas y precisas, haciendo que la obtención de nuevos compuestos haya crecido espectacularmente, consiguiendo numerosos éxitos en los que se combinan elegancia, eficiencia y selectividad. En definitiva, esta química molecular se centra en la química del enlace covalente. En cambio, en la Química supramolecular son las fuerzas intermoleculares nocovalentes las que juegan un papel fundamental al ser las responsables de la formación de las denominadas supermoléculas y de los sistemas de organización polimoleculares. Es decir, así como la Química molecular se basa en el enlace covalente, la Química supramolecular tiene como objetivos a las asociaciones moleculares y al enlace intermolecular (Figura.1.2). En definitiva, la Química supramolecular estudia entidades organizadas que resultan de la asociación de especies moleculares unidas por fuerzas intermoleculares, generando entidades de mayor complejidad. Por lo tanto, el fenómeno de reconocimiento juega un papel decisivo en la asociación y en los procesos de auto-organización. Estos sistemas supramoleculares pueden desempeñar funciones de transporte y transformación por lo que resultan muy interesantes desde los puntos de vista biológico y farmacológico. Uno de los objetivos más atractivos de la síntesis química es la preparación de moléculas que puedan reconocer y unirse a otras o con ellas mismas para, por ejemplo, catalizar la transformación de enlaces (como enzimas artificiales), construir estructuras que permitan el transporte de moléculas, o almacenar información a nivel molecular. Dentro de este campo macromolecular, la Química supramolecular estudia el reconocimiento, coordinación y fijación de especies moleculares e iónicas.1,5 También 3 estudia las propiedades de las estructuras complejas generadas. Se entiende por reconocimiento molecular, incluyendo la auto-asociación, aquellos procesos de unión de dos o más entidades (moléculas, iones, átomos) por fuerzas no covalentes (interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals). Figura 1.2. Representación de los procesos de reconocimiento y auto-organización mostrando el paso de la Química molecular hacia la Química supramolecular. Una supermolécula es una molécula que se forma por interacción intermolecular entre uno o varios sustratos, algunos de los cuales actúan como receptores de los demás, lo cual requiere un reconocimiento molecular. Ejemplos especialmente interesantes son los procesos denominados de inclusión o procesos huésped-hospedador (o anfitrión), en los que el hospedador es una molécula con ciertas características estructurales que le permiten albergar en su interior, total o parcialmente, a otra molécula (huésped). Existen numerosos compuestos que dan lugar a este tipo de fenómenos; unos son de origen inorgánico (zeolitas, caolitas, clatratos, etc.), otros de origen orgánico (éteres corona, criptandos, ciclodextrinas, etc.) o también de origen natural (enzimas, almidón, etc.). Los agregados supramoleculares son los que se forman espontáneamente por una asociación de un número indeterminado de entidades moleculares dentro de un medio y se caracterizan por estructuras microscópica y macroscópica bien definidas. Pueden formar membranas, micelas o fases mesomórficas con distintas propiedades cinéticas y dinámicas. Estos dos campos, el de las supermoléculas y los agregados supramoleculares, se caracterizan por los procesos de reconocimiento, el tipo de fuerzas intermoleculares que los forman y su geometría. Dado el gran número de aplicaciones que tienen, las especies macromoleculares poseen un enorme potencial industrial. Como se ha indicado, la Química supramolecular se ha desarrollado como la química de las entidades generadas por interacciones intermoleculares de tipo no-covalente. A través de la correcta manipulación de estas interacciones, está evolucionando progresivamente hacia la Química de la información molecular, almacenando la información a nivel molecular, en la estructura de las entidades, en su formación, transformación y procesado a nivel molecular. Esta información opera a través de los 4 procesos basados en el reconocimiento molecular en un patrón de interacciones bien definido (enlaces de hidrógeno, secuencias de grupos donante-aceptor, coordinación iónica, etc.). Esta ciencia engloba el diseño y la investigación de receptores moleculares, capaces de unirse a substratos con alta eficiencia y selectividad, o de generar de forma lineal o radial, polímeros supramoleculares por la auto-asociación de componentes individuales (monómeros) complementarios o por la asociación vía grupos laterales. Dada la debilidad de estas asociaciones, estos compuestos presentan características de polímeros vivos capaces de crecer, de encoger, de cambiar su patrón de interacción o intercambiar componentes. Cuando se trata de macromoléculas, la asociación supramolecular puede ser de tipo intermolecular entre grandes moléculas o bien entre partes activas (de reconocimiento) de las mismas, localizadas en la cadena principal o en los apéndices laterales. Este último aspecto de interacción intermolecular-supramolecular es el más importante en macromoléculas biológicas y en los procesos de control del plegamiento proteico, y representa uno de los campos de investigación más importantes dentro de la Biología. En definitiva, en una perspectiva a largo plazo, la química evoluciona hacia el estudio de sistemas complejos, allanando el camino del entendimiento del paso de la materia como elementos individuales a materia condensada, luego a materia organizada y adaptada como en los sistemas vivos, hasta llegar a organismos inteligentes, lideres en complejidad. El control sobre la manipulación de las interacciones intermoleculares (enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, coordinación de metales) abre las puertas de la Ingeniería supramolecular, del acoplamiento molecular y de los polímeros. A través de la utilización de especies monoméricas o poliméricas se llega al desarrollo de la Química de los materiales supramoleculares. 1.2 INTRODUCCIÓN A LA FISICOQUÍMICA DE COLOIDES. En el estudio de los coloides y las macromoléculas convergen, de una forma general, tres ramas científicas: la ciencia de los coloides, la de las superficies y la de las macromoléculas. Estas disciplinas están estrechamente relacionadas entre sí haciendo que la mayoría de los trabajos que se realizan en este área tengan carácter multidisciplinar. La ciencia de los coloides estudia las propiedades químicas, físicas y mecánicas de los sistemas coloidales. La ciencia de superficies estudia los fenómenos relacionados con superficies macroscópicas. La química molecular investiga los métodos de síntesis y caracterización de macromoléculas. Las propiedades físicas de las macromoléculas como sedimentación, difusión, etc. son muy similares a las de los coloides. En general, las macromoléculas pueden considerarse como coloides o sistemas coloidales liófilos. Los compuestos anfífilos o anfipáticos poseen dos regiones, una hidrófila, denominada cabeza, y otra hidrófoba, denominada cola. La parte hidrófoba puede estar constituida por cadenas hidrocarbonadas, anillos hidrocarbonados saturados y anillos aromáticos, y la parte hidrófila por grupos polares de diferente naturaleza como por ejemplo ácidos carboxílicos, alcoholes, aminas... Atendiendo a su origen se diferencian dos tipos de compuestos anfífilos: naturales y sintéticos. Los compuestos anfífilos naturales se obtienen directamente de una fuente natural como es el caso de los ácidos grasos, fosfolípidos, glicolípidos, lipopéctidos, lípidos fenólicos, etc. o se sintetizan a partir de una biomolécula obteniendo compuestos como los lipopolisacáridos, acilaminoácidos, etc. La estructura molecular de los denominados biosurfactantes o surfactantes naturales, es muy variada. Los ácidos grasos, por ejemplo, están constituidos por una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada de entre 4 y 22 5 átomos de carbono unida a un grupo carboxílico. La estructura de los fosfolípidos posee un grupo glicerol unido a dos cadenas de ácido graso esterificado y a un grupo fosfato que a su vez, se une por enlace covalente a grupos polares como colina, etanolamina, glicerol, serina o inositol. Otros lípidos anfífilos (glicolípidos, lipopéctidos, lipopolisacáridos, lipoproteínas, acilaminoácidos y lípidos fenólicos) están constituidos por cadenas hidrocarbonadas de ácido alquil carboxílico o alcoholes de cadena larga saturados o insaturados unidos a sacáridos (mono-, oligoo polisacáridos), péptidos, proteínas, aminoácidos o fenoles. La región hidrófoba de los surfactantes consiste, generalmente, en una o más cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, frecuentemente saturadas, de 8 a 18 átomos de carbono. Esta región hidrófoba también puede incluir anillos aromáticos. Atendiendo a la naturaleza del grupo hidrófilo se diferencian cuatro tipos de surfactantes: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros o zwitteriónicos. El número de compuestos con estructura molecular diferente dentro de cada uno de estos grupos de surfactantes es muy elevado. También existen surfactantes sintéticos con dos grupos hidrófilos situados a ambos extremos de la cadena hidrocarbonada (surfactantes bolaformes), con dos cadenas unidas a dos grupos iónicos (surfactantes gemini) y con grupos hidrófobos constituidos por una o más cadenas perfluoroalquiladas (fluorosurfactantes). Otros compuestos con estructura molecular muy diferente a la de los surfactantes sintéticos y naturales, como colorantes, drogas terapéuticas, sales biliares como colato y desoxicolato sódico, también tienen carácter anfífilo. Las sales biliares son anfífilos naturales constituidos por una superficie hidrófoba convexa (anillo esteroide) y una superficie hidrófila cóncava (con uno o más grupos hidroxilo y un grupo carboxílico) como se verá con más detalle posteriormente. Las acridinas, cianinas, porfirinas, colorantes tipo azo y esquarilio son colorantes anfífilos. Determinados antibióticos, obtenidos directamente de fuentes naturales como los antibióticos peptídicos catiónicos, o sintetizados a partir de compuestos anfífilos naturales como los antibióticos esteroides catiónicos, tienen carácter anfífilo facial. Los grupos hidrófobos e hidrófilos de los compuestos anfífilos faciales se sitúan en dos caras opuestas de la molécula. La estructura molecular de estos compuestos les confiere dos importantes propiedades que los diferencian del resto de las sustancias químicas: a) Adsorberse en las interfases (gas-líquido, líquido-líquido y sólido-líquido), dando lugar a la formación de monocapas. Como consecuencia, estos compuestos modifican la tensión superficial de las disoluciones que los contienen debido a su capacidad para adsorberse en la interfase líquido-aire. Buena parte de las aplicaciones industriales de estos compuestos se basan en esta propiedad. Así. surfactantes de diferente naturaleza se utilizan como agentes humectantes (adsorción en la interfase líquido-sólido), espumantes (interfase líquido-gas) y estabilizadores de emulsiones o microemulsiones (interfase líquido-líquido). b) Formar agregados supramoleculares (micelas, bicapas, vesículas, etc.) de dimensiones coloidales y estructura bien definida tanto en disolución acuosa como en medios apolares (Figura 1.3). El estado coloidal se define como la formación de dos fases cuando una molécula con una gran superficie se dispersa en un medio. Estas fases pueden ser líquido-líquido, sólido-líquido, etc. No se trata de una verdadera disolución, ya que no es una mezcla homogénea de soluto y disolvente, pero podemos considerarla una dispersión de un material dentro de otro. Existen dos clases de coloides: los liófilos y los liófobos. Los coloides liófobos repelen el disolvente (son difíciles de disolver) y termodinámicamente 6 son inestables. Los coloides liófilos son fácilmente miscibles con el disolvente y estables termodinámicamente. Si el medio es acuoso, los coloides liófobos se denominan hidrófobos y, correspondientemente, se denominan hidrófilos si se trata de coloides liófilos. Figura 1.3. Ejemplos esquemáticos de asociaciones coloidales. A) Esquema de una molécula de naturaleza anfipática, b) monocapa, c) micela inversa, d) micela, e) micela vermiforme, f) vesícula, g) tubo, h) bicapa, i) bicapa inversa. Ejemplos de coloides liófobos son las espumas (dispersiones gas-líquido), las emulsiones (dispersión líquido-líquido) y los soles (dispersiones sólido-liquido). Un ejemplo de coloides liófilos son las micelas, que es una unión temporal de moléculas o iones en forma de esferas o cilindros. También se pueden formar bicapas dando lugar a vesículas o tubos (Figura 1.3). Un ejemplo es la bicapa lipídica, membrana delgada formada por dos capas de moléculas de lípidos. Estas membranas son láminas que forman una barrera continua y delimitan las células. La membrana celular de todos los organismos vivos y muchos virus está compuesta de una bicapa lipídica, y también las membranas que rodean el núcleo de la célula y otras estructuras subcelulares como las mitocondrias, cloroplastos, etc. Los ejemplos más característicos de compuestos que forman micelas son los jabones, detergentes, sales biliares, colorantes y algunos medicamentos. La principal característica de estos compuestos es el cambio brusco que se produce en sus propiedades físicas cuando se alcanza cierta concentración. Esta concentración se denomina concentración micelar critica (cmc) o, más generalmente, concentración de agregación crítica, (cac) y es la concentración a partir de la que la formación de micelas (o agregados) está favorecida, como se verá más adelante. Por debajo de esta concentración, el compuesto no se agrega y se haya disuelto en el medio como monómero. 7 1.3 ÁCIDOS BILIARES. Las sales biliares pertenecen a la gran familia de los esteroides que tienen en común un esqueleto de ciclopentanoperhidrofenantreno. Este hidrocarburo policíclico de 17 átomos de carbono, también llamado gonano o esterano, se puede considerar un producto de la saturación del fenantreno asociado a un anillo de ciclopentano y es el núcleo base para multitud de moléculas de origen lipídico, como los esteroles (colesterol), ácidos biliares y hormonas esteroideas. De esta base estructural, surgen seis familias de esteroides dependiendo de los grupos metilo, en las posiciones 10 y 13 para integrar los carbonos 18 y 19, y de la existencia y la longitud de una cadena lateral en el carbono 17 (Figuras 1.4 y 1.5). Al mismo tiempo dentro de cada familia pueden existir numerosos isómeros. Por ejemplo, en el caso del gonano pueden existir 64 isómeros. Los ejemplos más representativos de cada familia se recogen en la Tabla 1.1. Figura 1.4. Nombres y estructuras de los compuestos que dan lugar a las distintas familias de esteroides. Figura 1.5. Numeración del esqueleto de carbono y asignación de los anillos de los esteroides. Tabla 1.1 Ejemplos más representativos de cada familia de esteroides. Familia Ejemplo Numero de carbonos Colestanos Colesterol 27 Colanos Á cido cólico 24 Pregnanos Progesterona 21 Androstanos Testosterona 19 Estranos Estradiol 18 1.3.1 Colesterol El colesterol, perteneciente a la familia de los colestanos, es, sin duda, el esteroide por excelencia. Es un componente básico de las membranas celulares y también es el   8 precursor de todas las hormonas esteroideas y los ácidos biliares. El colesterol es un 3βmonohidroxi C27 esteroide saturado, excepto en las posiciones C5-6 lo que hace que la molécula sea prácticamente plana (Figura 1.6). Figura 1.6. Estructura del colesterol. En las células de los animales vertebrados, la biosíntesis del colesterol tiene lugar en el retículo endoplasmático liso. Rittenberg y Bloch demostraron, mediante estudios de marcaje isotópico, que todos los átomos de carbono del colesterol proceden del acetato en forma de acetil coenzima A. Se requirieron aproximadamente otros 30 años de investigación para describir las líneas generales de la biosíntesis del colesterol, desconociéndose, sin embargo, muchos detalles enzimáticos y mecanicistas implicados. Los pasos principales de la síntesis de colesterol se recogen en la Figura 1.7. Figura 1.7. Esquema abreviado de la síntesis del colesterol (información tomada de http://english.turkcebilgi.com/metabolic y http://es.wikipedia.org/wiki/Colesterol). Desde el punto de vista metabólico, el colesterol es una pieza clave en la esteroidogénesis. Este proceso biológico consiste en la transformación del colesterol para la obtención de otros esteroides, y las rutas metabólicas que engloba varían entre las diferentes especies. Las hormonas esteroides ayudan en el control del metabolismo, inflamación, funciones inmunológicas, equilibrio de sal y agua, desarrollo de características sexuales, y la capacidad de resistir enfermedades y lesiones. Productos de la esteroidogenesis en los humanos son los andrógenos como la testosterona, estrógenos como el estradiol, progestágenos como la progesterona, glucocorticoides como el cortisol  HO 3 67 12 24  9 y mineralocorticoides como la aldosterona. Estas formas de hormonas lipídicas son generalmente sintetizadas en las gónadas y glándulas suprarrenales. Pueden pasar a través de la membrana celular ya que son solubles en grasa, y luego unirse a receptores de hormonas esteroides que pueden ser nuclear o citosólica dependiendo de la hormona esteroide, para provocar cambios dentro de la célula. Las hormonas esteroides son generalmente transportadas en la sangre unidas a un transportador específico proteico como la globulina, fijadora de hormonas sexuales, o globulina, fijadora de cortisol. Las conversiones y catabolismo adicional se producen en el hígado, en otros tejidos "periféricos", y en el tejido objetivo. El control en la concentración de colesterol es muy importante dado que, por ejemplo, el alto nivel de este esteroide en sangre se relaciona con enfermedades como la arteriosclerosis e hipertensión. 6 En la actualidad se utilizan dos formas para atacar este problema: (i) inhibir la síntesis hepática de colesterol o reducir la reabsorción de sales biliares. Moléculas como la atrovastatina, la pravastatina y la simvastatina bloquean la encima betahidroxibetametilglutarilcoenzima A. Esta es responsable de la síntesis de ácido mevalónico, precursor del colesterol (Figura 1.7); (ii) por otra parte, el ezetimiba glucurónido inhibe selectivamente la absorción de sales biliares y colesterol en el intestino. Desde el punto de vista estructural, el colesterol es un componente básico de las membranas plasmáticas eucariontes ya que representa un 23% de los lípidos de membrana y se encuentra en menor cantidad en las membranas de los orgánulos celulares de los animales vertebrados (Figura 1.8). El colesterol es un factor importante en la fluidez y permeabilidad de la membrana ya que ocupa los huecos dejados por otras moléculas, aunque el exceso hace que se vuelva menos permeable y fluida. Se ha postulado que los lípidos de membrana se podrían encontrar en dos formas: como un líquido bidimensional, y de una forma más estructurada, en particular cuando están unidos a algunas proteínas formando las llamadas balsas lipídicas. Se cree que el colesterol podría tener un papel importante en la organización de estas últimas. Su función es evitar que se adhieran las colas de ácido graso en la membrana plasmática, mejorando la fluidez de la membrana. En las membranas de las células vegetales son más abundantes los fitoesteroles (esteroides de origen vegetal). El carácter hidrófilo del grupo hidroxilo en la posición 3 del colesterol (Figura 1.6) hace que la molécula se disponga con éste hacia el exterior de la bicapa lipídica. Figura 1.8. Modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana plasmática propuesto en 1972 por S. J. Singer y Garth Nicholson. Fuente de la imagen: http://es.wikipedia.org/wiki/Modelo_de_mosaico_fluido. 10 1.3.2 Esteroides y esteroles sintéticos. Desde hace algún tiempo se han obtenido una variedad de esteroides y esteroles sintéticos con aplicaciones terapéuticas. Algunos esteroides sintéticos son más débiles y otros mucho más fuertes que los esteroides naturales cuyos receptores activan. Algunos ejemplos de hormonas esteroides sintéticas son las siguientes:  Glucocorticoides: prednisona, dexametasona, triamcinolona  Mineralocorticoides: fludrocortisona  Vitamina D: dihidrotaquisterol  Andrógenos: oxandrolona, testosterona, nandrolona  Estrógenos: dietilestilbestrol (DES)  Progestinas: noretindrona, acetato de medroxiprogesterona Los esteroides ejercen una gran variedad de efectos mediados por una genómica lenta, así como por rápidos mecanismos no genómicos. Para las acciones genómicas, se unen al receptor nuclear en el núcleo celular. Para las acciones no genómicas, los receptores de esteroides en la membrana activan cascadas de señales intracelulares. Ya que los esteroides y esteroles son solubles en los lípidos, pueden entrar con bastante libertad desde la sangre a través de la membrana celular al citoplasma de las células objetivo. En el citoplasma, el esteroide podría someterse a una alteración enzimática como una reducción, hidroxilación, o aromatización. En el citoplasma, el esteroide se une a receptores específicos como una gran metaloproteína. En la unión del esteroide, muchos tipos de receptores de esteroides se dimerizan. Dos subunidades receptoras se unen para formar una unidad funcional que se puede unir al ADN y permite la entrada al núcleo celular. Una vez en el núcleo, el complejo ligando esteroide-receptor se une a secuencias especificas del ADN e induce la transcripción de sus genes objetivo. 1.3.3 Importancia biológica de las sales biliares6-8 Las sales biliares son moléculas de origen natural de gran importancia fisiológica, estructural y metabólica. Su nombre recuerda que son el componente principal de la bilis, que presenta un color entre amarillo oscuro y verdoso. El hígado segrega hasta 500 mililitros diarios y su composición varía según sea del hígado o de la vesícula biliar (Tabla 1.2). Tabla 1.2. Composición de la bilis. Hígado Vesícula Agua 95-97% 80-90% Sales Biliares 1-2% 6-10% Colesterol 0,2-0,4% 0,5-5% Las sales biliares actúan en el intestino delgado disminuyendo la tensión superficial de los ácidos grasos de cadena larga provocando la emulsión de los mismos. La incorporación de los lípidos a las micelas orienta los enlaces éster de los lípidos hacia la superficie de la micela, logrando que sean accesibles a la digestión por parte de lipasas pancreáticas (que se encuentran en forma soluble). Una producción defectuosa de sales biliares implica la expulsión de las grasas en forma de heces (esteatorrea). Las lipasas pancreáticas digieren los triacilglicéridos hasta ácidos grasos libres y monoacilglicerol, y estos productos de la digestión se transportan en las micelas al epitelio intestinal donde son absorbidas a través de la membrana plasmática. El colesterol es parcialmente 11 absorbido y el resto precipita. Esta solubilización de los productos de la digestión de grasas de la dieta mejora la solubilización de otros lípidos importantes como las vitaminas liposolubles. Las sales biliares tienen una acción catártica suave, mejoran el drenaje biliar y evitan la presencia de infecciones, ya que la bilis es un excelente caldo de cultivo. El correcto funcionamiento del metabolismo de estos compuestos en los seres vivos es de gran importancia dado que está íntimamente implicado en la síntesis de hormonas esteroideas, ácidos biliares y vitamina D. Las sales biliares naturales, sintetizadas en el retículo endoplasmático liso de los hepatocitos, proceden en su mayoría de la modificación enzimática del colesterol. El cuerpo humano produce aproximadamente 800 mg de colesterol al día y la mitad (400-600 mg) lo transforma en sales biliares. Alrededor del 90% de las sales biliares secretadas en el intestino son reabsorbidas por el transporte activo en el íleon en lo que se conoce como circulación enterohepática Los ácidos cólico, quenodesoxicólico y ursodesoxicólico y sus derivados, se han utilizado en el tratamiento de deficiencias en sales biliares, en patologías relacionadas con el hígado y en la solubilización del colesterol de la vesícula. Las propiedades antivirales y antifúngicas de algunas sales biliares han sido estudiadas con resultados prometedores. 9-10 La alta especificidad y capacidad de transporte de un sistema de ácidos biliares a través del sistema enterohepático es fuente de una amplia corriente de investigación para elaborar ácidos biliares que transporten de forma específica un medicamento para ser liberado en el hígado o para mejorar la absorción intestinal de medicamentos que de otra manera no se absorberían. 11 1.3.4 Estructura y propiedades de las sales biliares. En esta introducción se resumen las propiedades fisicoquímicas más importantes de los ácidos biliares. Se utilizarán indistintamente las denominaciones ácido biliar o sal biliar para hacer referencia a estos compuestos de un modo genérico, sin que ello defina su estado de ionización. La configuración general de las sales biliares normales es cis entre los anillos A y B y un hidrógeno β en la posición 5. Si la posición de este hidrógeno es  se denominan alloesteroides. En general provienen del ácido 5β-colanoico, 12 tienen grupos metilo en los carbonos 10, 13 y 20, una cadena lateral en el carbono 17 y se diferencian entre sí, principalmente, en el número, posición y orientación de los grupos hidroxilo en las posiciones 3, 7 y 12 (Figura 1.9). Figura 1.9. Estructura general y posición de los sustituyentes de las sales biliares más importantes y de sus derivados con glicina y taurina. El termino sales biliares conjugadas se refiere a derivados en los que se introducen grupos que cambian las propiedades hidrófilas o la carga de la molécula. Los más importantes en la naturaleza son los que se conjugan con los aminoácidos glicina y taurina y se denominan glicoy tauro-derivados, respectivamente. El 75% de los ácidos biliares conjugados son glico-derivados y el 25% tauro-derivados del ácido cólico. En  12 total, estos representan el 80% de todas las sales biliares en el cuerpo humano. En la nomenclatura de sales biliares, comúnmente, se utilizan prefijos como desoxio hidroxi-, mientras que otros prefijos como quenoo ursodenotan la estequiometria de los sustituyentes hidroxilo. La Figura 1.10 representa la estructura en perspectiva del ácido cólico y muestra como los grupos hidroxilo se orientan hacia la cara  de la molécula (cara hidrófila) mientras que los metilos se localizan en la cara β (cara hidrófoba). Figura 1.10. Estructura y croquis representativo del ácido cólico. El color rojo indica región polar y el azul apolar. De esta manera, la molécula presenta una cara hidrófila, otra hidrófoba y una pequeña cadena hidrófoba con un grupo hidrófilo (grupo carboxílico) en el extremo. Esta polaridad planar explica las características de su comportamiento en medio acuoso, dando lugar, mediante auto-asociación, a agregados (comúnmente llamados micelas) a una concentración mayor de la cmc. Algunas de las propiedades fisiológicas más importantes de las sales biliares, como transporte de lípidos, se derivan de esta naturaleza anfipática. Se ha demostrado que por debajo de la cmc, las sales biliares se comportan como un electrólito 1:1 fuerte y no muestran ningún proceso de asociación tal y como ha sido demostrado a partir de medidas del punto de congelación.13-14 El valor de la cmc depende de las condiciones químico-físicas del medio. Los agregados de sales biliares son en general pequeños (con números de agregación típicamente menores de 10) Modificaciones en el número, el tipo y la estequiometria de los sustituyentes pueden variar la polaridad de la molécula. En general, la polaridad aumenta con el número de grupos hidroxilo. Las sales biliares tauro-derivadas son más hidrófilas que las correspondientes glico-derivadas, mientras que las sales biliares libres son las menos hidrófilas. Los ácidos biliares poseen una estructura tridimensional perfectamente conocida. La presencia de uno, dos o tres grupos hidroxilo apenas supone cambios en las dimensiones moleculares de los distintos ácidos biliares, haciendo que este conjunto de moléculas posea unas dimensiones y morfología prácticamente idénticas. Un ejemplo es que la diferencia de volumen entre el ácido litocólico (533 Å3, con un grupo hidroxilo) y el ácido cólico (536 Å3, con tres grupos hidroxilo) es de 3 Å3.7 Sin embargo, el concepto de cmc aplicado a las sales biliares no es aceptado universalmente. Así, Kratohvil et al15-16 afirman que no existe una cmc real, sino que la transición entre monómeros y agregados es progresiva. Por su parte, Ekwall17 sugiere un proceso de agregación de tres etapas con concentraciones críticas características. En 13 parte, estas discrepancias surgen de la diferente sensibilidad de los métodos experimentales hacia la detección de los agregados que se formen. A grandes rasgos, podemos agrupar los métodos para la determinación de la cmc (o pseudo-cmc) en disolución en dos categorías: los invasivos y los no invasivos dependiendo del uso o no de una sonda añadida al sistema. Los métodos denominados invasivos se basan en la medida del cambio de una propiedad o en la medida de coeficientes de partición de un aditivo denominado sonda (colorantes, fluoróforos, etc.), cuando se solubiliza en el interior de las micelas. 18 Existe un gran abanico de posibilidades pudiendo citar, entre ellas, el cambio espectral de un colorante hidrosoluble, la solubilización micelar de un colorante liposoluble, la tensión interfacial en la interfase liquido-liquido o el coeficiente de partición entre la fase acuosa y una fase inmiscible nopolar. Entre los métodos no-invasivos, cabe destacar la medida de la tensión superficial y de otras propiedades como conductividad, turbimetría, osmometría, difusión de la luz, índice de refracción o propiedades electromagnéticas como RMN, velocidad y absorción de sonido. El resultado de todo ello es una enorme dispersidad de los valores publicados para las cmc de las sales biliares (Figura 1.11). Figura 1.11. Valores máximos y mínimos publicados para la cmc de cuatro sales (sódicas) biliares representativas: colato (NaC), desoxicolato (NaDC), taurocolato (NaTC) y taurodesoxicolato (NaTDC). 14,18 Por otra parte, se puede encontrar una discusión detallada sobre los méritos de tales aproximaciones en el trabajo de Carey.19 En nuestra opinión, los métodos no invasivos suministran valores de cmc más realistas. Por su parte, Kratohvil ha evaluado de un modo crítico, la utilización en este campo de técnicas instrumentales como light scattering, sedimentación, osmometría de membrana, etc. Otros motivos responsables de las discrepancias anteriores pueden deberse a la utilización de un pH demasiado bajo que no asegura la completa ionización de la función carboxílica. Debemos recordar aquí que si se trabaja a pH neutro algunas sales biliares forman geles.20 Incluso el grado de pureza de los reactivos es otro factor.13 La mayoría de las sales biliares comerciales que se encuentran en el mercado están impuras, siendo los contaminantes de naturaleza variada, aun cuando los más frecuentes son otras sales biliares. En general la cmc aumenta su valor al aumentar la temperatura y disminuye con la presencia de electrólitos inertes. Resulta obvio que para determinar la cmc de una sal biliar, ésta ha de estar pura, homogénea, termostatada y en forma de sal para lo que el pH ha de ser suficientemente alto para conseguir que la molécula esté completamente ionizada. La controversia acerca de la existencia o no de una verdadera cmc está íntimamente ligada al tamaño de los agregados y su polidispersidad, y alcanza a la estructura de los agregados. Dado que el tamaño y crecimiento de los agregados de las sales biliares es sensible a variables como la temperatura, la fuerza iónica, el pH, la existencia de 14 impurezas, etc., las condiciones experimentales en las que se ha de realizar la determinación deberían ser perfectamente controladas y especificadas, aspectos que no siempre han sido definidos correctamente en las fuentes bibliográficas oportunas. Por otra parte, la mayoría de los métodos utilizados para determinar el tamaño de los agregados requieren una extrapolación a la cmc, por lo que, estrictamente hablando, los valores así conseguidos sólo serían válidos a esa concentración (supuesto que esté correctamente determinada). Como consecuencia, la bibliografía arroja una dispersión de valores difícilmente justificable. La Figura 1.12, referida a los valores máximo, medio y mínimo de los números de agregación para cuatro sales biliares típicas, refleja claramente esta problemática. En nuestra opinión aquellas técnicas, como la medida del punto de congelación, que permiten la determinación del número de agregación del tamaño a cada concentración utilizada, son ventajosas frente a las que demandan cualquier tipo de extrapolación. Figura 1.12. Números de agregación máximo, medio y mínimo publicados para las cuatro sales biliares indicadas en la imagen. 14,18 La dispersión de valores publicados de la fracción de contraiones enlazados a la micela también es notable. Por ejemplo, para el colato sódico se han publicado valores que van desde 0.0313 hasta 0.7.21 La Figura 1.13 resume los valores máximo, medio y mínimo de la fracción de contraiones publicados para las mismas sales biliares anteriormente citadas.18 Fig.1.13. Valores mínimo y máximo publicados para la fracción de contraiones asociada a los agregados de las sales biliares indicadas. 18 Además de la problemática ya comentada acerca de la pureza de los reactivos o de la influencia de variables no consideradas, también es necesario tener en cuenta la utilización de teorías inadecuadas o extrapoladas a límites inadmisibles. Las mayores simplificaciones suelen ser (i) que los solutos se comportan de un modo ideal (coeficientes de actividad igual a la unidad) y (ii) la no consideración de la fracción de contraiones ligada a la micela. Al trabajo ya citado de Kratohvil, hay que añadir el estudio 15 de Nagarajan 22 quien correlaciona la polidispersidad y el crecimiento de los agregados. Así, si las micelas son monodispersas, su tamaño no puede aumentar significativamente con la concentración de surfactante o la adición de sales inertes. Del mismo modo, si las micelas son polidispersas, el número de agregación promedio en peso tiene que aumentar al hacerlo la concentración total del surfactante. Todo ello es válido también para la fracción de contraiones. En los estudios publicados, no ya sobre ácidos biliares sino sobre otros surfactantes, estas cuestiones no siempre han sido tenidas en cuenta, tal y como Nagarajan ha señalado. No debe sorprender que se hayan propuesto diversas estructuras para los agregados de los ácidos biliares, algunas claramente contrapuestas entre sí. A continuación se analizan las dos más importantes. El primer modelo considera que la formación de micelas por parte de las sales biliares se debe a una interacción entre las caras hidrófobas (β) de los esteroides. Este tipo de micelas, denominadas primarias (Figura 1.14 izquierda), tendría un número de agregación bajo (comprendido entre 2 y 10). 23 Los agregados con números de agregación mayores que los indicados corresponderían a las denominadas micelas secundarias, formadas a partir de las anteriores mediante la unión de enlaces de hidrógeno. Fig.1.14. Izquierda: Estructuras de los agregados de sales biliares propuesta por Small. 23 Derecha: Estructura en forma de disco propuesta por Kawamura et al 24 para los agregados de sales biliares dihidroxílicas. Esta interacción entre las caras β, también denominada espalda-contra-espalda, ha sido apoyada por medidas de RSE utilizando sondas portadoras del grupo radical NO, trabajo debido a Kawamura et al.24 Estos autores indican que las micelas tendrían una forma de disco con la cara hidrófoba de las sales biliares orientada hacia el interior de la micela y la cara hidrófila (α) dirigida hacia el disolvente (Figura 1.14 derecha). Tal modelo estaría de acuerdo con los estudios de fluorescencia de sondas solubilizadas en el interior de los agregados. Una discusión más detallada puede ser consultada en la revisión debida a Jover et al.18 El anterior modelo sería posteriormente completado por Coello et al.14 Si los componentes de los agregados se orientan alternativamente hacia arriba y hacia abajo, para un número de agregación igual a 3, dos grupos carboxílicos deben estar orientados en la misma dirección (Figura 1.15). La ubicación de un contraión (normalmente Na+) entre ambos grupos carboxilato permitiría apantallar las repulsiones electrostáticas 16 desfavorables. Ello implica que la fracción de contraiones de los agregados debería ser 1/3 lo que fue corroborado experimentalmente por Coello et al. En la Figura 1.15 puede verse la disposición de los contraiones para un trímero (número de agregación determinado por estos autores para sales trihidroxílicas) y un hexámero (número de agregación determinado para sales dihidroxílicas). Dado el bajo número de agregación, la disposición de los iones agregados, difícilmente recuerda las micelas clásicas originadas por surfactantes alquílicos de cadena larga. A pesar del bajo número de agregación, las medidas de fluorescencia parecen sugerir que el agregado protege ampliamente a la sonda fluorófora de su entorno. Así, Vethamuthu et al 25 han estimado que la fracción de pireno en contacto con el agua es tan sólo de un 4% cuando está solubilizado en colato sódico, porcentaje que se reduce al 0% en las micelas de desoxicolato. En las micelas clásicas es más fácil que la sonda entre en contacto con el agua, al ubicarse hacia el exterior de las mismas, 26 donde residen entre 5 y 10 moléculas de agua por monómero agregado. 27 Figura 1.15. Ubicación de los contraiones en los trímeros (izquierda) y hexámeros (derecha) de sales biliares según Coello et al. 14 El segundo de los modelos, claramente contrapuesto a los anteriores, es debido a Giglio et al28 (Figura 1.16). Según el mismo, la estructura de los agregados es helicoidal estando los contraiones de la micela en el interior de la hélice, donde también se ubican las moléculas de agua. La molécula sería neutra por cuanto las cargas positivas de los contraiones neutralizan exactamente las negativas de los monómeros de sal biliar. Los grupos polares se ubicarían en la cara lateral de la hélice, recordando la estructura de una micela inversa. El modelo fue inferido por Giglio et al a partir de la resolución de las estructuras cristalinas de las sales biliares objeto de estudio. Figura 1.16. Estructura propuesta por Giglio et al 29 para los agregados de desoxicolato sódico. Vistas a lo largo del eje de la hélice (izquierda) y transversal (derecha) al mismo. 17 1.3.5 Formación de complejos entre ácidos biliares y metales pesados. La dependencia de la agregación de surfactantes iónicos con la naturaleza del contraión que le acompaña es un fenómeno ampliamente estudiado y que está relacionado con multitud de procesos biológicos, con procesos industriales y es un campo de estudio en la obtención de nuevos materiales. La ionización de los ácidos carboxílicos de los ácidos biliares, así como el tipo de catión que acompaña a la molécula, se suman a un gran número de factores, como la orientación de los grupos hidroxílicos o grupos de sustitución, que definen el comportamiento de la sustancia en disolución.30-32 Como se ha venido comentando, el peculiar comportamiento que los ácidos biliares y sus sales en disolución hace que exista cierta controversia respecto a la interpretación de los resultados obtenidos. Se pueden presentar en disolución como moléculas libres o asociadas a otras formando micelas simples o compuestas, lo que puede provocar que los valores pKa de los grupos carboxílicos varíen respecto de los esperados. En general el entorno en el que se encuentra la molécula es crucial para explicar los fenómenos de agregación que se producen y están directamente relacionados con factores estructurales del surfactante. En la naturaleza, cada ion metálico, que actúa como contraión de las sales biliares, ejerce una función específica. El sodio por ejemplo, que es el catión predominante en la bilis, se considera el principal catión responsable de la formación de agregados micelares. Los iones de calcio, por otro lado, interactúan con varios aniones, incluyendo las sales biliares, reduciendo su actividad. Para profundizar en el entendimiento de cómo los ácidos biliares interactúan con iones metálicos en disolución se debe comenzar por el estado sólido. Los cristales resueltos por difracción de rayos X de sales biliares en el que están presentes átomos metálicos en la red cristalina son escasos debido a la dificultad de obtener un monocristal del tamaño necesario. Aun así las estructuras cristalinas publicadas incluyen sodio,33-35 calcio,36,37 rubidio35,38 y cesio,39 dejando patente la implicación de los grupos carboxilato con el catión metálico. La fortaleza de este enlace no solo depende del tipo de catión metálico sino que también influyen factores estructurales de la molécula de ácido biliar. Los grupos hidroxilo pueden quedar al margen o en ciertas circunstancias pueden coordinarse con los iones metálicos. Cuando se busca información respecto a la interacción entre las sales biliares y los iones metálicos en disolución, la bibliografía resulta mucho más extensa. Numerosos grupos de investigación, cada uno con su distinto punto de vista dentro de sus campos de estudio, muestran complejos metálicos de sales biliares con Na+, Re+, Ca2+, Mg2+, Cd2+, Fe2+, Cu2+, Pb2+, Pt2+, Au3+, Al3+, Tb3+, entre otros.40-45 Si se centra la atención sobre el precursor de los compuestos de estudio, Feroci et al46-47 hacen una comparación de diferentes sales del acido cólico obteniendo una secuencia de estabilidad de enlace Cd2 + < Zn2+ < Cu2+ y una de solubilidad Zn2+ < Cd2 + < Cu2+. Chakrabarty et al48 presentaron unos estudios morfológicos de hidrogeles de acido cólico formados en presencia de distintos iones metálicos (Ca2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Cd2+, Hg2+ and Ag+). Asimismo, Sun et al49 han reportado un tamaño de agregados entre 30-80 nm cuando interacciona el Co2+ con micelas formadas por el desoxicolato sódico y al mismo tiempo se plantea un hipotético modelo de interacción entre los agregados y el ión Co2+ (Figura 1.17). Esto podría traducirse en un incremento de la floculación y en una reducción de la coalescencia del sistema al compararlo con los agregados que se obtienen cuando se trabaja sin metal pesado.50 En nuestra misma línea de investigación, Zhang et al51-52 sintetizaron bolsos moleculares en forma de trípode a partir de trímeros formados por restos de acido cólico, que resultaron ser capaces de solubilizar pireno en un medio polar (Figura 1.18). En estos casos, las moléculas presentan en su estructura anillos aromáticos capaces de complejar 18 iones metálicos a través de los electrones π. Así, una de las estructuras (estructura 1 de la Figura 1.19) es capaz de formar complejos con metales pesados que, junto con el pireno, se emplazarían en la cavidad formada por los trímeros del ácido cólico. Figura 1.17. Esquema de interacción del cobalto con micelas de sal biliar por Sun et al. 49 Figura 1.18. Estructura de los trímeros derivados del acido cólico sintetizados. 51-52 Figura 1.19. Disposiciones posibles de unión del metal y el pireno a los trímeros derivados del acido cólico. 52 1.4 Á CIDOS B ILIARES M ODIFICADOS . Como se ha visto, el estudio de los ácidos biliares representa un campo de estudio de gran importancia, tanto desde el punto de vista biológico como terapéutico. Estos compuestos no sólo son interesantes por una actividad específica sino por que al mismo 19 tiempo pueden actuar como transporte y ayudar en la liberalización de otros principios activos.8,53-54 Por ejemplo, pueden actuar como antibióticos,55-57 compuestos quirales,58 nuevos materiales blandos,59-60 receptores catiónicos61 61y aniónicos,62-63 canales de iones artificiales,64 liberalización controlada,65 dendrones,66 cestos moleculares,67 como soporte o andamio para química combinatoria68 y química supramolecular,69 nuevos surfactantes,70-71 y otros.69,72 Un método para conseguir nuevas propiedades quimicofísicas consiste en modificar el balance hidrófilo-hidrófobo de los ácidos biliares. Esto se consigue uniendo a los grupos hidroxilo y/o al grupo carboxílico, grupos hidrófílos o hidrófobos. Esta estrategia consigue crear nuevos compuestos con nueva actividad biológica,73-74 capacidad de solubilización de colesterol,75 y valores reducidos de cmc.59-60 Por ejemplo, la conjugación del ácido cólico con EDTA,76 DOTA y DTPA77 puede conducir hacia propiedades beneficiosas en el campo de la farmocología y la diagnosis, dada la capacidad que estos compuestos presentan para complejar 111In o Gd(III) y ser empleados como transporte o como agentes de constraste. Un incremento de la polaridad se obtiene por modificación de un grupo hidroxilo en un grupo polar iónico (positivo o negativo). Los ácidos 3αy 3β-amino-5β-colan-24-oico fueron sintetizados por Bellini et al,78 mientras que Broderick et al79 sintetizaron el triamino-análogo del metil colato, el cual resultó tener una ligera tendencia a la agregación a pH 5-6 en disolución acuosa. Un diácido derivado del ácido cólico actúa como antídoto de la toxina faloidina (presente en la Amanita Phalloides).80-82 El núcleo de esteroide ha sido utilizado como estructura tridentada para unir tres residuos iónicos a los grupos hidroxilo del ácido cólico a través de espaciadores de naturaleza alquílica. Estos compuestos actúan como surfactantes de tres cabezas, formando pequeñas micelas primarias y grandes micelas esféricas secundarias.74,83 Cuando se modifica el balance hidrófobo/hidrófilo, por ejemplo, por eliminación de la carga negativa del grupo carboxilato por formación de esteres o amidas aparecen nuevas capacidades de gelificación. Maitra et al54,84-85 han publicado revisiones bibliográficas de los muchos derivados de ácidos biliares sintetizados durante los últimos años. 1.5 OLIGÓMEROS DE ÁCIDOS BILIARES. Durante los últimos años, la síntesis y el estudio de las propiedades quimicofísicas de oligómeros de sales biliares se ha convertido en un importante campo de investigación en relación con procesos de reconocimiento molecular y química supramolecular. La primera unión de dos acidos biliares es debida a McKenna et al.86 Los diferentes compuestos se pueden clasificar en derivados cíclicos y acíclicos, con o sin puentes de unión, simétricos o asimétricos, o como homoo hetero-esteroides.87 Dependiendo de la orientación relativa del esqueleto del esteroide, se puede obtener tres tipos de unión: cabeza (posición 3)-cola (posición 24),88 cabeza-cabeza64 y cola-cola.89 Pero no sólo las posiciones 3 y 24 se utilizan para la formación de dímeros, sino que han sido empleadas otras posiciones hidroxílicas.90-91 En esta línea también se han obtenido dendrímeros.66,9295 Los dendrímeros con enlaces tipo ester son también candidatos atractivos para aplicaciones biológicas y de liberación de medicamentos.94 Estos compuestos ofrecen diferentes posibilidades en cuanto a su comportamiento. Por ejemplo, en el caso de dímeros cabeza-cola el carácter hidrófobo aumenta obviamente debido a la disminución de la relación entre el número de grupos iónicos carboxilato y el 20 número de restos de esteroide. Algunos dímeros han sido empleados en el marcaje por fotoafinidad topológica del sistema de co-transporte Na+/sal biliar del íleon.96 Se consigue una reducción fuerte en la cmc mediante el diseño de surfactantes tipo gemini. Recientemente, un nuevo surfactante esteroideo gemini derivado del 3α,12α-dihydroxy5β-colan-24-amina (resto de esteroide) y ácido etilendiamintetraacético (puente) fue sintetizado y caracterizado en disolución acuosa.89 Para este compuesto la cmc observada en agua fue de 4.610-6 M lo que resulta tres órdenes de magnitud menor que la del desoxicolato sódico. Algunos grupos cabeza policatiónicos en colil surfactantes gemini evidencian un amplio espectro de actividad bactericida.97 Se han utilizado dímeros cabeza-cabeza en el desarollo de canales de iones basados en colato que pueden estar abiertos o cerrados según la adición o sustracción de paladio(II).98 Durante los últimos años crece continuamente el número de oligómeros de esteroides que facilitan el transporte de iones y generan canales de iones artificiales.99-109 Los paraguas moleculares110-112 son moléculas con dos o más unidades anfífilas unidas a un núcleo capaz de proteger un agente de un ambiente incompatible. Este sistema con dos restos de ácido cólico transporta selectivamente diferentes especies (incluyendo ATP) a través de la bicapa fosfolipídica113-115 y tienen propiedades antivirales.116 La unidad de ácido cólico puede dar lugar a agregación tanto en medios polares como apolares gracias a su carácter anfífilo.117-118 Esta habilidad ha sido empleada en el diseño de cestos moleculares, que pueden actuar como micelas unimoleculares o como micelas inversas dependiendo del entorno.117,119 Estas moléculas actúan como agentes catalíticos sensibles al disolvente respecto a la epoxidación,120 como ligandos unidos a iones121 y sacáridos.122 Han sido probados en procesos de reconocimiento de sacáridos típicos presentes en células tumorales malignas observándose una alta selectividad.123 Un tetraderivado es capaz de formar cristales líquidos termotrópicos.124 Ariga et al125 han estudiado la formación dinámica de cavidades tridimensionales. Otro tipo de oligómeros derivados de ácidos biliares son los foldámeros,126 que son análogos sintéticos de biopolímeros capaces de adoptar diferentes conformaciones.127 El foldámero del ácido cólico no es soluble en medio acuoso pero se solubiliza en micelas de surfactantes permitiendo su uso como un sensor fluorescente para iones de mercurio presentes a escala micromolar en disoluciones acuosas.128 Se han publicado modelos moleculares de un hexámero de colato plegado y desplegado.129 Otro ejemplo de policondensación fue publicado por Gouin et al sobre dímeros de ácidos biliares obtenidos por unión del 3-OH de tipo diester con una cadena alquílica que actúa como puente.130 También se han publicado aplicaciones diversas en campos de biomedicina y de farmacología.131 El quitosán modificado con ácido biliar lleva a la formación de agregados en disolución acuosa, haciendo posible que actúe como un sistema de transporte.132-133 Otros copolímeros exhiben una gran estabilidad térmica.134 Ramificaciones triamino ortogonalmente protegidas basadas en un armazón de ácido biliar se pueden emplear para construir un amplio abanico de moléculas con tres ramificaciones y que pueden tener aplicaciones como receptores, en catálisis y farmacología. El ácido cólico se ha aprovechado como un nuevo tipo de patrón para el ensamblaje multivalente de péptidos.135 Se han diseñado y sintetizado algunos ciclofano-esteroides, con dos restos de esteroide en un esqueleto de tetraazoparaciclofano. El ciclofano-esteroide empotrado en la bicapa lipídica actúa como un receptor de superficie celular. El reconocimiento molecular hace que estos receptores sean sensibles a diferentes medios.136-137 Ha sido sintetizada una serie de compuestos anfífilos basados en poli(coloilo).138-139 El uso combinado de anfífilos (derivados de lisina, acido cólico y espermina), y liposomas sensibles térmicamente (con 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DPPC) crea 21 liposomas TGLs (thermally gated liposomes).140 También son agentes antivirales116 y son capaces de entrar en células vivas.141 También se han obtenido oligómeros cíclicos. Los colafanos son estructuras cíclicas empleadas como espaciadores entre esteroides (dos o más). Estructuras macrocíclicas de colafanos ofrecen espacio suficiente para unir una gran variedad de sustratos por reconocimiento molecular: fluoruros,63 glucósidos,142 plata,143 análogos de flavina,144 derivados de uracilo,145 cationes alquil-metálicos,146 etc. Actualmente se han logrado sintetizar ciclocolatos (poliésteres macrocíclicos)147 y ciclocolamidas (poliamidas macrociclicas),87,148-149 litocolafanos cabeza-cabeza y cabeza-cola,150 cicloquenodesoxicolato151141 y macrocicloesteroides.152-154 Los colafanos catiónicos se comportan como agentes inteligentes de transferencia de fase mostrando una clara dependencia estructural que favorece la extracción de aniones. La selectividad, desde un punto de vista supramolecular de estos compuestos, es un buen augurio para posibles aplicaciones en biología y medicina. Por ejemplo, el aumento del transporte de cloruros es relevante para un potencial tratamiento de las condiciones causadas por la ausencia o malfunción de los canales cloruro.155 Toda esta información constituye razón suficiente para justificar el esfuerzo dedicado durante la ejecución de la presente Tesis Doctoral a los procesos de agregación de los nuevos derivados de ácidos biliares sintetizados y que se exponen más adelante. 1.6 INTRODUCCIÓN A LAS PORFIRINAS. Las porfirinas son moléculas de estructura policíclica con un papel muy destacado dentro del funcionamiento de las proteínas redox. Estas proteínas poseen centros activos que cambian su estado de oxidación durante el ciclo de actividad de las mismas y desempeñan una gran cantidad de procesos metabólicos importantes que intervienen en la célula. Los centros activos contienen con frecuencia metales de transición, en cuyo caso estas proteínas redox se denominan también metaloproteínas. Uno de los centros activos redox más comunes en las metaloproteínas es el grupo hemo, constituido por un anillo de porfirina que coordina un ion hierro. Las hemoproteínas son un conjunto muy variado de metaloproteínas indispensables para la vida y contienen al menos un grupo hemo como centro activo. Desempeñan funciones muy diversas aunque no siempre implican un cambio redox. Un grupo importante dentro de las hemoproteínas redox son los citocromos, caracterizados por realizar funciones de transporte de energía química en multitud de procesos celulares claves como la respiración aeróbica, la fotosíntesis, la detoxificación o la apoptosis. El ion hierro del grupo hemo tiene un papel fundamental en la actividad de los citocromos pues cambia su estado de oxidación, entre Fe3+ y Fe2+, durante la actividad de dichas proteínas. Con las porfirinas pueden coordinarse otros metales y realizar funciones muy relevantes. Ejemplos son las clorofilas que poseen magnesio o la vitamina B12 que posee cobalto. Estos ejemplos simples, pero claves para cualquier organismo vivo, sugieren que el estudio de la familia de las porfirinas resulta un campo de investigación muy amplio con ramificaciones que varían entre la biología, la medicina, los materiales, la química de coordinación, transmisión electrónica, óptica, sondas, etc.156-157 1.6.1 Estructura molecular y propiedades Las porfirinas están compuestas por un anillo tetrapirrólico (Fig.1.20) con sustituyentes laterales que puede albergar un átomo metálico en el centro, unido mediante cuatro enlaces de coordinación. El anillo de porfirina es altamente conjugado, lo cual le 22 impone una geometría aproximadamente plana. Existe una gran controversia respecto a la nomenclatura de estos compuestos por lo que para evitar confusiones se utilizará el criterio de la IUPAC. Una porfirina puede tener enlazadas una gran variedad de cadenas laterales y se clasifican basándose en el tipo y posición de los sustituyentes laterales del anillo. Según el tipo de sustituyentes las porfirinas se dividen en varias familias. Si la molécula tiene meso-sustituyentes será una mesoporfirina (Figura 1.20). Las porfirinas naturales, β-sustituidas, se clasifican según el número de ácidos carboxílicos: uroporfirinógenos (8), heptacarboxilporfirinógenos (7), hexacarboxilporfirinógenos (6), pentacarboxilporfirinógenos (5), coproporfirinógenos (4) y los protoporfirinógenos (2). En general, excepto por omisión, en la nomenclatura de las porfirinas el nombre va acompañado de un número (de I a IV) que indica la posición de los sustituyentes. Hay dos importantes series numeradas la I y la III. Las series II y IV no ocurren en sistemas naturales. En la serie I los sustituyentes se repiten de una manera regular (AB AB AB AB), en la serie III el orden de los sustituyentes en el anillo D es inverso (AB AB AB BA) (Figura 1.21). Figura 1.20. Representación del anillo tetrapirrólico de las porfirinas. Nomenclatura IUPAC y posición de los sustituyentes. Figura 1.21. Representación esquemática de la numeración según la posición de los sustituyentes de las porfirinas. (A= carboximetil, M= metil, P= carboxietil y V= vinil).  23 Las protoporfirinas son las más relevantes y existen 15 isómeros, aunque en la naturaleza sólo aparece el IX (serie III), que se caracteriza por disponer cuatro grupos metilo en las posiciones 2, 7, 12 y 18, grupos vinilo en las posiciones 3 y 8, y grupos propiónicos en las posiciones 13 y 17 (Figura 1.22). A este grupo pertenecen la hemoglobina, la mioglobina y los citocromos, entre otros. Figura 1.22. Estructura de la protoporfirina IX. El control sintético de las entidades moleculares unidas a la periferia del macrociclo permite el diseño de porfirinas para aplicaciones específicas ya que el anillo de la porfirina ofrece distintas posibilidades de sustitución en su periferia. Se distinguen dos tipos de posiciones potencialmente funcionalizables: las posiciones β-pirrólicas y las posiciones puente, denominadas meso (Figura 1.23). Las porfirinas β-sustituidas presentan similitud estructural con las de origen biológico. Las porfirinas mesosustituidas no tienen análogos biológicos directos, pero su síntesis es fácilmente accesible y se utilizan como modelos biométricos y en química de materiales. En concreto, el estudio de porfirinoides anfífilos meso-sustituidos muestra un interés creciente debido a su versatilidad en el diseño de estructuras tridimensionales por autoensamblaje. Figura 1.23. Estructura del ácido 4,4′,4′′,4′′′-(porfirin-5,10,15,20tetrail)tetrakisbenzoico o mesotetra(4-carboxifenil)porfirina (TTP). Las porfirinas son conocidas por su intenso color, que es consecuencia de una extensa conjugación del macrociclo. El sistema de enlaces conjugados hace que la   24 estructura sea rígida sin permitirle cambiar de estado fácilmente. Son estables en ácidos concentrados y las bases fuertes, tales como los alcóxidos, pueden retirar los dos protones (pKa ~16) de los átomos de nitrógeno internos para formar un dianión. Por otra parte, los dos átomos libres del nitrógeno de la porfirina (pKb ~9) pueden ser protonados fácilmente con ácidos, tales como el ácido trifluoroacético. El sistema de enlaces conjugados de las porfirinas les otorga propiedades cromóforas con espectros de absorción ultravioleta-visible y de fluorescencia muy característicos. En general, el espectro de absorción ultravioleta-visible consiste en dos regiones distintas. En la región del ultravioleta cercano (370-430 nm) hay una intensa banda de absorción conocida como banda de Soret (por Jacques-Louis Soret). Esta banda, también denominada banda B, es característica de un sistema de 18 electrones π y tiene un coeficiente de absortividad molar de aproximadamente de 1105 M-1 cm-1. En la región visible del espectro (500-700 nm) están presentes un número de bandas de absorción mas débiles conocidas como bandas Q con un coeficiente de absortividad de aproximadamente 1104 M-1cm-1.158 Los dos tipos de bandas de absorción (la B y las Q) surgen de transiciones -* y pueden ser justificadas considerando el modelo de cuatro orbitales frontera (dos HOMO y dos LUMO) propuesto por Gouterman (Figura 1.24). La banda B está producida por la transición al segundo estado de excitación (S0S2) mientras que las bandas Q están producidas por la transición al (S0S1). La conversión interna de S2 a S1 es rápida, lo que provoca que la fluorescencia que se detecta en este tipo de moléculas surja de la transición desde S1. Las bandas Q pueden variar en número e intensidad dependiendo de varios factores. Así, el número de átomos de hidrógeno unidos a los átomos internos de nitrógeno, los sustituyentes en el esqueleto y el metal complejado de una porfirina hacen variar la simetría de los orbitales moleculares y su energía, con lo que se obtienen diferentes espectros de absorción en la región del ultravioleta-visible (Figura 1.25). La menor simetría de las porfirinas no metálicas causa la excitación a orbitales x e y simétricos y se pueden observar hasta cuatro bandas Q en el espectro, denominadas Qx(0,0), Qx(1,0), Qy(0,0) y Qy(1,0), en orden creciente de energía. El patrón del espectro de absorción cambia de cuatro bandas Q, para la base libre de porfirinas con una simetría D2h, a dos bandas Q cuando la molécula se encuentra complejada con un metal o completamente protonada en cuyo caso la simetría pasa a ser D4h. Para esta simetría, los orbitales frontera consisten en dos orbitales degenerados de simetrías a1u y a2u (llenos) y otro par de orbitales degenerados de simetría eg (vacíos).159-160 Figura 1.24. Representación general de los orbitales moleculares del esqueleto de porfirina, estados de transición asociados a las bandas de absorción y aspecto del espectro de absorción ultravioleta-visible. 25 Figura 1.25. Variación de las bandas Q del espectro de absorción UV-Vis de una porfirina según el átomo metálico complejado. 1.6.2 Homoasociación de porfirinas en disolución acuosa. La agregación de la clorofila parece ser un factor determinante para las propiedades fotoquímicas y fotofísicas de los cloroplastos. La agregación de las porfirinas en disolución afecta a la estructura electrónica del macrociclo y con ello a la intensidad y posición de las bandas. Cabe destacar la aparición de una banda entre 450 y 500 nm que se denomina banda J y está producida por el solapamiento de orbitales  de dos o más porfirinas. A este tipo de agregados se los denomina agregados-J.161-167 y son producidos por superposición de orbitales . Existen numerosos trabajos centrados en el estudio de este tipo de solapamiento de orbitales  a través de la modificación de porfirinas.168-178 En una línea paralela se han desarrollado polímeros con restos de porfirinas que solapan sus orbitales  en busca de materiales con propiedades de transferencia electrónica.179-183 En medicina, los oligómeros de porfirinas han mostrado ser especialmente activos en terapias fotodinámicas de tumores. Como ya se ha comentado, la protoporfirina IX (Figura 1.22) es la porfirina natural más abundante en la naturaleza y la meso-tetra(4-carboxifenil)porfirina, denominada TCPP de forma abreviada, es una porfirina meso sustituida de origen sintético (Figura 1.23). Son moléculas con carácter anfifílico dado que poseen grupos ionizables en su periferia y una gran superficie hidrófoba (Figura 1.26), por lo que pueden formar agregados y bicapas moleculares. 1.6.3 Protoporfirina IX. En el caso de la protoporfirina IX, cuando se aumenta el pH en disolución acuosa, se observa un desplazamiento de la banda Soret y la aparición de la banda J sobre 490 nm en el espectro ultravioleta visible (Figura 1.27).184-185 Lo mismo ocurre cuando se trabaja con la molécula coordinada con un átomo de hierro (hemin).185 Este comportamiento se ha justificado mediante un modelo en el que la molécula puede agruparse inicialmente como dímeros de protoporfirina interactuando axialmente mediante el empaquetamiento - y lateralmente entre los contactos hidrófobos pudiendo agruparse según un ángulo de separación de 38 ó 52º.184 Estos dímeros podrían orientarse 26 con los anillos dispuestos cara-cara y los grupos carboxílicos ionizados en disposición cabeza-cola en disoluciones acuosas alcalinas con pH mayor de 8 (Figura 1.28 A). A valores de pH intermedios, entre 3 y 7, podrían formarse estructuras supramoleculares extendidas a través de una red de enlaces de hidrógeno entre los ácidos carboxílicos de las cadenas laterales parcialmente neutralizados que estabilizarían la formación de agregados de mayor tamaño (Figura 1.28 B). A menores valores del pH, entre 0 y 3, la molécula permanecería como monómero libre en disolución. Figura 1.26. Representación de la naturaleza anfifílica de las porfirinas de interés: A) Protoporfirina y B) meso-tetra(4-carboxifentl)porfirina. Figura1.27. Espectros UV-vis de una disolución acuosa 510 -3 M de protoporfirina IX: A) a diferente pH y B) Variación de pH de 1 a 4. Según Scolaro et al. 184 Del estudio de imágenes SEM y SNOM así como el cálculo del radio hidrodinámico a partir de medidas de dispersión de luz dinámicas, los agregados formados en disolución acuosa, a valores intermedios del pH, tienen una forma alargada con un tamaño que oscila entre 200 y 500 nm y una altura de 60 nm de media (Figura 1.29). Al considerar el carácter anfífilo de la protoporfirina IX se ha sugerido la formación de vesículas multilaminares (“capas de cebolla”). Al mismo tiempo, el análisis de las imágenes SEM reveló regiones de la muestra donde las vesículas colapsan en una estructura laminar continua. 27 Cabe destacar que, al igual que sucede con muchos otros tipos de moléculas, el cambio de un único grupo funcional puede hacer variar el tipo y tamaño de estructura de los agregados de forma radical. En la Figura 1.30 se recoge un ejemplo. A B Figura 1.28. Representaciones de la posible disposición de la protoporfirina al formar (A) un dímero y (B) agregados de mayor tamaño.184 A B Figura 1.29. Imágenes (A) Topografía y (B) SEM de agregados de Protoporfirina IX a partir de una disolución acuosa 5 x10-3M a pH 5.184 Al funcionalizar la protoporfirina IX, a través de su ácidos carboxílicos, con cadenas de trietilenglicol se forman microvesículas multilaminares de aproximadamente 65 nm de diámetro en una mezcla aprótica relativamente no polar de disolventes (ciclohexano/cloroformo) y agregados micelares de aproximadamente 6 nm en una mezcla polar prótica de disolventes (cloroformo/metanol).184 Si reducimos los grupos vinilo y sustituimos las ácidos carboxílicos por grupos amina en la protoporfirina IX, la diaminoporfirina es capaz de generar en disolución acuosa fibras de 25-33 nm de diámetro externo y 5 nm de diámetro interno. En una mezcla de dimetilsulfóxido y agua (1:1) se forman varillas micelares de 3 nm de diámetro.186 La protoporfirina IX derivada con dos grupos aminoglicosamida puede agregarse en forma de fibras con radios de 4 a 6 nm y longitudes que varían desde 20 a 200 nm o más.166 28 Figura 1.30. Micrografías de las estructuras generadas por derivados de la protoporfirina IX y variación del espectro de absorción UV-Vis.166,187 1.6.4 Meso-tetra (4-carboxifenil) porfirina (H2TCPP). El comportamiento de H2TCPP en disolución es el esperado para cualquier tipo de porfirina, presentando una banda Soret a 414 nm y cuatro bandas Q a 516, 552, 591 y 645 nm (Figura 1.31). Figura 1.31. Espectro de absorción de H2TCPP en agua en ausencia (línea continua) y en presencia (línea discontinua) de acido trifluoroacético (10% vol). Por Akins et al.188 29 Los cambios en el espectro que se producen cuando se añade ácido trifluoroacético han sido atribuidos a la protonación de los átomos de nitrógeno del anillo porfirínico al mismo tiempo que se forman agregados. El desplazamiento de la banda Soret (desde 404 hasta 440 nm), la reducción del número de bandas Q y la aparición de la banda J han sido observados en diferentes estudios que pueden constatarse en la bibliografía (Figura 1.32 y Tabla 1.3).177,188-189 Figura 1.32. Espectro de absorción de TCPP en agua a pH 10 (línea continua), de H2TCPP2+ en metanol acidificado (línea de puntos) y de agregados de H2TCPP2+ en agua con HNO3 a pH 0.9 (línea discontinua). Concentración de porfirina de 510-6 M.189 Tabla 1.3 Tabla de máximos de absorción de las bandas Soret y las bandas Q de la TCPP.189 La estructura de los agregados que se ha propuesto parte de la consideración de la conformación plana de las especies moleculares interactuantes, de las fuerzas intermoleculares, de la transferencia de carga intramolecular o la protonación y de los alineamientos intermoleculares que llevan a una reducción de la energía electrostática. Como resultado, se puede predecir que las subunidades moleculares en los agregados se disponen en un ordenamiento cofacial que al mismo tiempo puede tener un desplazamiento con respecto a la molécula vecina de forma que los grupos de cargas opuestas se posicionen uno cerca del otro. La bibliografía recoge diferentes posibilidades de alineamiento molecular (Figura 1.33) donde estas estructuras se verían estabilizadas por interacciones electrostáticas. Choi et al189 han propuesto un apilamiento longitudinal cara-cara cuando la molécula se encuentra en medio acuoso en presencia de HCl (Figura 30 1.33 C), mientras que al utilizar HNO3 se produce un desplazamiento en el apilamiento de una molécula respecto de la vecina (Figura 1.33 D). Para los dímeros han propuesto una disposición perpendicular de una molécula frente a la otra (Fig. 1.33 A). Akins et al188 han propuesto únicamente estructuras de agregación en las que el apilamiento se ve reforzado por interacciones del tipo electrostático (Figura 1.33 B y D). Figura 1.33. Representación de los posibles alineamientos moleculares de TCPP donde se omiten los grupos carboxílicos.188 Por lo tanto, el estudio del espectro de absorción ultravioleta-visible de este tipo de moléculas es una herramienta muy útil para elucidar el tipo de apilamiento que da lugar a la formación de agregados J y en consecuencia a sus propiedades morfológicas. De una forma general, Okada et al177 han propuesto una relación entre el deslizamiento en el apilamiento de derivados de tetrafenilporfirinas y el desplazamiento de la bandas Soret y Q (Figura 1.34). La forma y el tamaño de los agregados de H2TCPP2+ en disolución acuosa ácida han sido estudiados por Doan et al.190 Las imágenes de AFM (Figura 1.35) muestran una clara tendencia de la molécula a agregarse siguiendo una única dirección. Al trabajar con HNO3 aparecen varillas de entre 3 y 4 nm de diámetro, mientras que al utilizar HCl, los agregados pueden presentar forma de anillo de entre 200-2000 nm de diámetro y entre 4-5 nanómetros de altura. En ambos casos aparecieron estructuras amorfas y se observó que los agregados formados en presencia de HNO3 fueron cinéticamente menos estables que los formados en presencia de HCl. Los resultados obtenidos muestran también que a valores del pH < 1 se confirma la existencia de una especie libre asignada como dímero. Al relacionar este trabajo con el realizado por Okada et al,177 y comparar los espectros de absorción ultravioleta-visible, la formación de agregados cuando se trabaja en presencia de HNO3 se produciría a través de un apilamiento con una distancia corta de deslizamiento. Al trabajar con HCl la agregación se produciría a través de un apilamiento con una distancia más larga. La menor estabilidad cinética de los agregados estaría pues relacionada con el apilamiento con distancia corta de deslizamiento, lo que se traduce en una menor eficacia de las interacciones electrostáticas. 31 Figura 1.34. Representación esquemática de la relación entre la distancia de deslizamiento y el espectro de absorción UV-Vis de los agregados J.177 AB C D Figura 1.35. Imágenes de AFM y espectro de absorción UV-Vis de agregados generados por H2TCPP2+. A) Nanofibras generadas sobre sílice a partir de una disolución con HNO3. B) Disolución acuosa con HNO3 a pH 0,8. C) Nanoanillos generados sobre sílice a partir de una disolución con HCl. D) Disolución acuosa con HCl a pH 1,2.190 Si de nuevo se compara el efecto que producen diferentes grupos funcionales en el esqueleto de la tetrafenilporfirina, se observa que puede variar el tipo y tamaño de la estructura de los agregados. La tetrafenilporfirina sin grupos funcionales forma unas películas suaves en un rango de varias micras en presencia de 0.2 M de HCl. Si el HCl se 32 aumenta hasta 2 M se forman unas finas capas continuas en forma de granos con un tamaño de 3-5 m (Figura 1.36).191-192 Esto parece el resultado de la unión de varias partículas de entre 200-400 nm. Figura 1.36. Micrografía SEM de agregados formados por TPP al evaporarse una disolución 0.86 Molar en agua/THF en presencia de HCl 0.4 Normal. Variación del espectro de absorción UV-Vis de una disolución de TPP 15 μM en agua/THF en presencia de HCl 2 Normal, transcurrida 1) 1 hora, 2) 24 horas y 3) 68 horas.192 También Udal´sop et al192 han propuesto la estructura molecular del dímero de tetrafenilporfirina con dos moléculas de agua que intervendría en la formación de los agregados de mayor tamaño (Figura 1.37). Figura 1.37. Estructura molecular del complejo dimérico agua-TPP.192  33 Los grupos CN, NO2 y OMe unidos a los grupos fenilo en posición 4 forman monocristales al depositar la muestra sobre una superficie de vidrio (Figura 1.38).177 A través de interacciones iónicas se han obtenido nanotubos, de 60 nm de diámetro y varias micras de longitud, utilizando dos porfirinas diferentes, una catiónica y la otra aniónica (Figura 1.39).173 Figura 1.38. Imágenes AFM de monocristales al evaporarse una disolución sobre una superficie de vidrio y las estructuras correspondientes.177 Figura 1.39. Estructuras de las porfirinas, espectro de absorción Ultravioleta-visible y micrografías TEM de A) SnTPyP4+/5+, B) H4TPPS4-2, y C) suspensión coloidal de nanotubos.173 34 1.6.5 Metaloporfirinas Las especiales características de algunos productos sintetizados (vide infra), derivados de la porfirina, hacen necesario un último repaso bibliográfico de conceptos en los que aun no se ha centrado la atención. La habilidad de los macrociclos porfirínicos para coordinar metales es una de las aéreas más estudiadas en la química de las porfirinas, siendo las piezas clave de los procesos de transferencia electrónica, respiración y fotosíntesis. La formación de metaloporfirinas se debe a la habilidad de la base libre de porfirinas para complejarse con casi cualquier ion metálico con los átomos de nitrógeno pirrólicos gracias a la formación de enlaces σ N-metal.193-194 Esta área específica de la química de porfirinas está bien desarrollada y le acompañan el estudio de los quelatos de los centros metálicos, el estudio del enlace metal-metal y sistemas organometálicos. Los metales se pueden coordinar también a las porfirinas a través de enlaces σ o π a átomos de carbono según la estructura y la presencia o no de grupos con capacidad para ello, como grupos carboxilato o sistemas aromáticos.195 Existe un gran número de posibilidades estructurales para la síntesis de porfirinas organometálicas conteniendo uno o más enlaces metal-carbono. Se puede hacer una clasificación por grupos según el número de iones metálicos, el tipo de enlace y la proximidad al anillo tetrapirrólico (Figura 1.40). Figura 1.40. Tipos de posibles interacciones metal-porfirina.195 La estructura del tipo A es la más común y sencilla y se caracteriza por tener enlaces σ con el metal a través de los nitrógenos pirrólicos. El número y disposición de los ligandos que acompañan al metal puede variar (Figura 1.41). Los ejemplos más representativos en la naturaleza son el grupo hemo, la cianocobalina (vitamina B12) o la clorofila, habiéndose sintetizado numerosas estructuras. También se pueden incluir dentro del tipo A los compuestos con varios anillos tetrapirrólocos.196-197 La estructura tipo B se caracteriza por tener enlaces σ con el metal a través de los nitrógenos pirrólicos, como la estructura A, pero a mayores posee un enlace M-C en la periferia del anillo. Así, aparecen en la bibliografía moléculas con niquel-paladio,198 niquel-platino,199 por nombrar algunos ejemplos. Las estructuras C, D y E (Figura 1.40) se caracterizan por formar enlaces π con el metal a través de sistemas aromáticos periféricos por interacción directa con el sistema π aromático de la porfirina o por complejación con grupos amino. Si se utiliza la 35 nomenclatura específica, el tipo A se define como η1-pirrol y el tipo C se define como η1:η5-pirrol (Figura 1.41). En la bibliografía se muestra cómo la estructura tipo C puede interactuar con dos metales pesados simultáneamente (Figura 1.42).200-201 Las estructuras D y E únicamente se diferencian en la distancia que separan los sustituyentes moleculares con capacidad para complejar metales del sistema tetrapirrólico. En muchos casos se trata de sistemas η6-fenilo, η5-ciclopentadienilo y η1 amino. Hasta la fecha, existen numerosos trabajos para estos dos tipos de moléculas dada la versatilidad estructural que plantea. Entre algunos ejemplos se mencionan estructuras moleculares con níquel, cobre, cinc o manganeso en posición pirrólica, y paladio o platino en posición periférica. En realidad en muchos de estos trabajos se plantean estructuras en las que el segundo metal (que no interactúa con la porfirina) ejerce un papel conector como en la estructura de un copolimero y en algún caso ejerciendo un papel catalizador en la formación de enlaces covalentes.202-209 A) B) Figura 1.41. A: Disposición de los posibles ligandos unidos al metal dentro del anillo de la porfirina. B: Tipos de unión del metal a un anillo pirrólico. Figura 1.42. Estructura del [(η6-cymene)Ru η5-{Ni(OEP)}](BF4)2 con dos metales pesados.201 1.6.6 Antecedentes bibliográficos de esteroide-porfirinas. La idea de añadir a un esqueleto de porfirina un nuevo sustituyente es un concepto que ha dado paso a un campo de estudio de gran envergadura. Teniendo en cuenta las cualidades que poseen las porfirinas, al pegar moléculas de diferente naturaleza, se originan nuevos materiales de propiedades muy variables y de gran interés. Grupos de investigación, dentro del campo de la Química supramolecular y en busca de nuevas aplicaciones farmacológicas o de nuevos materiales, ya se han centrado en el concepto 36 común de “esteroide-porfirina” dando como resultado la publicación de numerosas moléculas.87,149,210 Las Figuras 1.43 y 1.44 recogen algunas estructuras publicadas. Los tetrámeros de esteroide unidos por un puente de porfirina son los primeros compuestos de esta clase en aparecer a finales de los 80 y principios de los 90. Distintos esteroides se unen con enlaces amida, por la cola hidrocarbonada, a la posición orto del grupo fenilo de la tetrafenilporfirina (Figura 1.43 A y B). Las posibilidades son múltiples, desde extender el brazo de unión entre porfirina y esteroide (Figura 1.43 C) hasta la combinación de distintas moléculas a la vez como un “esteroide-porfirina-fullereno” (Figura 1.43 D). También aparecen trabajos con esteroides cíclicos (Figura 1.44 A), con distintos enlaces de unión (Figura 1.44 B y C) e incluso octámeros (Figura 1.44 D). (A) (B) (C) (D) N N HN H N OH N O O S S NH O O N H NH OCOOH (E) Figura 1.43. Estructuras de esteroide-porfirinas publicadas por Groves et al211 (A), Tsuchida et al212 (B y C), Schuster et al213-215 (D) y Girgenti et al216 (E). A partir de un dímero de esteroide (Figura 1.45 A), Bonar-Law et al153,217-219 sintetizaron una serie de moléculas con restos de porfirina unidos a través de enlaces amida. Estas moléculas se pueden presentar como porfirinas recubiertas por capas de esteroides. El campo de estudio en el que se engloba la síntesis de este particular tipo de moléculas resulta de lo más variable y está enfocado desde la química supramolecular hacia la creación de enzimas de origen sintético, el estudio de dinámica de membranas o los fenómenos de transferencia. Gracias a los restos de esteroide la molécula puede poseer actividad de reconocimiento molecular y la capacidad de introducirse en bicapas lipídicas 37 modificando sus propiedades. Por otra parte, el esqueleto de la porfirina confiere capacidad de transferencia de carga, energía y transporte. Por ejemplo, la molécula representada en la Figura 1.43 A se comporta como un espaciador de membrana en vesículas de fosfolípidos, ubicándose en el medio de la bicapa, con el plano que contiene al anillo de la porfirina paralelo al plano de la interfase bicapa-agua, y da propiedades de catálisis de oxidación regioselectiva. La molécula de la Figura 1.44 A presenta reconocimiento enantioselectivo de la molécula de morfina y las de la Figura 1.44 (B y C) tienen propiedades de receptor de sacáridos en medios con disolventes próticos. Las moléculas representadas en la Figura 1.43 (B y D) se sintetizaron con el propósito de obtener un modelo de transportador de oxígeno y en el estudio de procesos de transferencia de energía y carga producidos después de la foto-excitación, respectivamente. Las moléculas de la Figura 1.45 presentan propiedades de reconocimiento molecular de polialcoholes. (A) (B) (C) (D) Figura 1.44. Estructuras de esteroide-porfirinas sintetizadas por Bonar-Law et al,220 (A); Dukh et al221 (B); Koivukorpi et al122-123 (C); Zhou et al120 (D). 38 (A) (B) (C) (D) Figura 1.45. Estructuras de esteroide-porfirinas sintetizadas por Bonar-Law et al153,210,217,219 1.7 CONSIDERACIONES ESPECIALES DE LAS ESTRUCTURAS SINTETIZADAS. La gran mayoria de los productos que se han sintetizado en la presente Tesis han implicado la formación de al menos un enlace amida o enlace peptídico (Figura 1.46). La formación de este enlace a partir de un ácido y una amina implica la pérdida de una molécula de agua y la formación de un enlace covalente OC-N. En su estado natural, los sustituyentes de los átomos de carbono y nitrógeno adoptan una única conformación tridimensional. Ello es debido al carácter de doble enlace parcial existente entre los citados átomos. Figura 1.46. Formación del enlace amida. Efectivamente, mediante difracción de Rayos X se ha comprobado que el enlace peptídico es más corto (133 pm) que un enlace sencillo normal (146 pm) ya que se estabiliza por resonancia. Esto implica un cierto carácter (60%) de enlace doble, razón  39 por la que no hay giro libre en torno a este enlace. Esta estabilización obliga a que los cuatro átomos que forman el enlace peptídico más los dos carbonos que se encuentran en posición α con respecto a dicho enlace se encuentren en el mismo plano. Sin embargo, el resto de los enlaces (N-C y C-C) son enlaces sencillos verdaderos, con lo que podría haber giro. En definitiva, la estabilización por resonancia del enlace peptídico hace que sea una unión fuerte y resistente pero restringe la conformacion a una ordenación planar rígida. Esto impone restricciones importantes al número posible de conformaciones que puede adoptar una proteína. Desde el punto de vista energético, el enlace peptídico conlleva una variacion de ΔGº = 10 kJ/mol. En el laboratorio, la unión entre sintones puede lograrse mediante la utilización de métodos que implican (i) la reacción de un grupo amino con un cloruro de ácido; (ii) la reacción entre el grupo carboxílico con un grupo amino utilizando catalizadores como DEPC (dietilcianofosfonato) o HOBt/DIC (hidrato de 1-Hydroxibenzotriazol/N,N′- Diisopropilcarbodiimida) para acelerar la formación del enlace amida (Figura 1.47); (iii) la reacción de un anhídrido con un grupo amino derivado; y (iv) la utilización de un cloruro de ácido. DEPC HOBt DIC Figura 1.47. Reactivos utilizados para la formación del enlace amida. En las síntesis empleadas para la obtencion de casi todos los productos obtenidos y descritos en esta memoria se ha empleado el método con DEPC. Este método es sencillo, limpio, de un rendimiento aceptable y que, de algún modo, imita a la naturaleza a través de compuestos que contienen fósforo. La hidrólisis del enlace amida es una reacción favorecida termodinámicamente aunque muy lenta a pH y temperatura fisiológicos. Los péptidos son metaestables y se hidrolizan mediante ácidos o bases minerales fuertes a alta temperatura (110º), enzimas proteolíticas (o proteasas) y catalizadores como el bromuro de cianógeno que rompe específicamente el enlace peptídico por el lado del ácido carboxilico de los residuos de metionina en péptidos. La elección de este tipo de enlace reside en su mayor estabilidad, en comparación con los ésteres, en disoluciones acuosas básicas. Este hecho es importante dado que para asegurar la ionización de los grupos carboxílicos de la molécula el valor del pH ha de ser superior a 10. Pero esto no evita la posibilidad de la hidrólisis del enlace péptido en condiciones en las que cabría esperar una mayor estabilidad. Así, como se verá más adelante, al trabajar con disoluciones a pH > 13 este tipo de unión ya no es estable. Por otro lado, en condiciones menos drásticas, al intentar cristalizar uno de los dímeros obtenidos, el calentamiento a reflujo en metanol puede hidrolizar del mismo modo la molécula. Como resultado se obtuvieron cristales, resueltos por difracción de rayos X, de monoderivados, aun cuando se estaban buscando dímeros de ácidos biliares. B IBLIOGRAFÍA (1) Supramolecular Chemistry; Lehn, J.-M., Ed.; VCH: Weinheim, 1995. (2) Vázquez Tato, J. Rev. Iberoam. Polim. 2005, 6, 44. 40 (3) Bergmann, M. Angew, Chem. 1925, 38, 1141. (4) Lehn, J.-M. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2002, 99, 4763. (5) Ciferri, A. e. Supramolecular Polymers, 2nd edition 2005, Taylor-Francis, New York. (6) Hofmann, A. F. News Physiol. Sci. 1999, 14, 24. (7) Carey, M. C. Sterols and bile Acids.H. Danielsson, J. Sjövall. Elsevier Sci. Publ. 1985, 5. (8) Monte, M. J.; Garcia Marin, J. J.; Antelo, A.; Vázquez Tato, J. World J. Gastroenterol. 2009, 15, 804. 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Dado que el volumen de trabajos publicado al respecto para ácidos biliares naturales y sus derivados es extenso, se hará un repaso sobre las peculiaridades del ácido cólico, desoxicólico y 3β-amino cólico, ya que son el núcleo fundamental de la estructura molecular de los productos que se presentaran a continuación. En la bibliografía se incluyen los trabajos más relevantes que muestran el modus operandi cuando se trabaja con estos compuestos. Entre los factores cruciales a tener en cuenta cabe citar los siguientes: la influencia del número y orientación de los grupos hidroxilo existentes en el cuerpo del esteroide, la formación de complejos de inclusión con el disolvente u otros compuestos, la longitud y conformación de la cadena lateral y la formación de enlaces de hidrógeno. Además de los parámetros estructurales como los datos geométricos, estas variables caracterizan, y hacen única, cada estructura. Por todas estas razones, en este capítulo se incluirán dos cristales resueltos de derivados de ácidos biliares (monosustituidos) obtenidos de forma casual pero que no dejan de ser singulares en sus características. Se ha de tener en cuenta que la estructura oligómera que poseen las moléculas sintetizadas hace, en el caso de los dímeros, duplicar al menos el número de variables. Cada brazo “biliar” de la molécula se comporta de forma independiente por lo que la cristalización de estos compuestos aumenta en complejidad. Como resultados de este tipo de estructuras, primero se presentan dos dímeros sintetizados con anterioridad al desarrollo del presente trabajo por este mismo grupo de investigación para dar paso a otras dos nuevas estructuras, ya englobadas dentro de la presente Tesis doctoral. Dado que la disposición espacial del conjunto de la molécula resulta tener unas características especiales, se expondrá un sistema de coordenadas que facilita la descripción de este tipo de estructuras. En la última sección de este capítulo, se abordará el cálculo del área de la sección molecular para todas las moléculas englobadas en este trabajo, método que se nutre de los datos cristalográficos conseguidos. 48 2.1.1 Antecedentes bibliográficos. Desde finales del siglo XIX, la comunidad científica se interesó en las sustancias constituyentes de la bilis y así comenzaron a aparecer los primeros trabajos sobre ácidos biliares naturales.1 Se puso de manifiesto la complejidad de los cristales de los ácidos biliares por cuanto que los mismos eran verdaderamente complejos de inclusión (en la terminología aceptada en la actualidad) de diferente estequiometría.2-3 No tardó el reconocimiento de huéspedes tan variados como ácidos grasos, alcoholes, ésteres, éteres, fenoles e hidrocarburos saturados y aromáticos, habiendo un acuerdo general acerca de la inclusión del huésped en canales formados en la red cristalina del hospedador.4 En el caso del ácido desoxicólico, se aceptaba que dos moléculas del ácido biliar se empaquetaban juntas en una disposición cabeza-cola dejando un hueco cilíndrico donde alojar el huésped.5 También aparecieron aplicaciones prácticas de los ácidos biliares en diferentes campos:  Farmacología.6  Uso como modelos para reacciones fotoquímicas en estado sólido.7-10  Realización de reacciones de polimerización en los canales.11-21  Síntesis de un polímero ópticamente activo.22  Inclusión selectiva y separación de enantiómeros.23-27  Transporte de medicamentos.28 Queda patente que un conocimiento detallado de las estructuras cristalinas de los complejos es fundamental para entender esos procesos y para el diseño de huéspedes que provean espacios de inclusión para el reconocimiento molecular y/o la reacción química. El número de cristales resueltos fue en rápido aumento hasta la actualidad.29-30 Se han resuelto cristales con familias completas de huéspedes: alcoholes,31-36 compuestos aromáticos,37-40 N-nitrosaminas,41-42 lactonas,43 nitrilos,44 cetonas,45-46 derivados fluorados de la anilina,47 derivados del alcohol bencílico,48 derivados de la acetofenona,49 ésteres alifáticos,50… Con el fin de estudiar la influencia en la cadena lateral se ha resuelto la estructura de los cristales de los ácidos bisnorcólico, norcólico, cólico, homocólico y bishomocólico,51 que se diferencian entre sí por el número de grupos metileno existentes. Los ácidos biliares o sus complejos de inclusión con diversos huéspedes cristalizan mayoritariamente en los grupos monoclínicos y ortorrómbicos, pero también lo hacen en los triclínicos y hexagonal. 2.1.2 Ácido desoxicólico. Desde un principio, el ácido desoxicólico despertó la curiosidad y se ha convertido en el más común y estudiado de los ácidos biliares dihidroxílicos.52 Esto se debe a varias peculiaridades:  No se han conseguido cristales de este ácido biliar libres de huésped.30  Se han encontrado cuatro sistemas de cristalización monoclínico, tetragonal, hexagonal y ortorrómbico, siendo el último claramente mayoritario. Los cristales hexagonales o tetragonales se consiguen incorporando agua como un segundo huésped,5355 los monoclínicos se dan con oy p-xileno56-57 y con oy m-nitrosotolueno.36 Los cristales ortorrómbicos vienen a representar aproximadamente el 84% de los huéspedes estudiados (de ellos el 84% son P212121 y el 16% son P21212). 49  La estequiometria ácido: huésped más frecuente es la 2:1.58-60 Desde un principio se puso de manifiesto la formación de canales y de redes de enlaces de hidrógeno en forma de espiral,61 y se estudió la relación de los ángulos de torsión de la cadena lateral y las diferencias existentes entre las redes de los enlaces de hidrógeno,58,60,62 intentando racionalizar las razones por las qué el ácido desoxicólico cristaliza en diferentes sistemas cristalinos, dependiendo del tipo de molécula huésped.63 La formación de tales complejos de inclusión fue explotada químicamente para la oxidación selectiva de determinadas posiciones del núcleo esteroide.54,64-67 Cuando el ácido desoxicólico cristaliza en presencia de etanol y agua puede hacerlo en el sistema hexagonal P65, dejando canales hidrófilos donde se alojan los huéspedes.53 Lo mismo acurre con la mezcla dimetil sulfóxido:agua.68 Sin embargo, es necesario destacar que estos sistemas pueden adoptar otras simetrías como la tetragonal P41212 en la que no se forman canales y las moléculas de ácido desoxicólico están unidas cabezacola por medio de los enlaces de hidrógeno entre O3 y O24b (Figura 2.1).55 Se pone de manifiesto que los huéspedes se acomodan en canales hidrófobos en los cristales ortorrómbicos y en canales hidrófilos en los tetragonales o hexagonales. Candeloro de Sanctis y Giglio69 llevaron a cabo un estudio del empaquetamiento ortorrómbico mediante cálculos de energía de van der Waals permitiendo desplazar las bicapas a lo largo de b para diferentes valores de a. Todos los complejos estudiados tienen las longitudes a y b iguales, mientras que c se varía en múltiplos de aproximadamente 7.2 Å. Los cálculos ponen de manifiesto la presencia de filas intermedias de moléculas que no se reproducen por una traslación exacta, dando lugar a la distinción de dos estructuras de los complejos denominadas α y β. El paso de una clase a la otra va acompañado de un mayor tamaño de los canales en el plano ab permitiendo alojar huéspedes más voluminosos. Por otro lado, el cristal del ácido desoxicólico:norbornadieno (ortorrómbico P212121; estequiometría 2:1) puede ser descrito como un ensamblaje de bicapas a lo largo del plano bc donde las moléculas de ácido desoxicólico están unidas en disposición cabeza-cola.70 Figura 2.1. Ejemplos de empaquetamiento de los cristales formados por el ácido desoxicólico en dimetilsulfóxido:agua (hexagonal P65, izquierda)68 y en etanol:agua (ortorrómbico P212121, derecha).53 En 1981 Giglio71 analizó los cristales de los ácidos coleicos desde el punto de vista estructural y energético, independientemente de su empaquetamiento (hexagonal, tetragonal u ortorrómbico). Las conclusiones más importantes que se derivan de su trabajo son las siguientes: (i) La energía de van der Waals de la cadena lateral depende de su conformación, la cual se define mediante cuatro ángulos de torsión ψ1 ≡ C13-C17-C20-C21, ψ2 ≡ C17-C20-C22-C23, ψ3 ≡ C20-C22-C23-C24, y ψ4 ≡ C22-C23-C24-O. El mapa de energía presenta cinco mínimos,63 de los que tres corresponden a orientaciones del grupo carboxilo que no permiten un buen esquema de enlaces de hidrógeno, por lo 50 que no han sido observadas experimentalmente. Los otros dos mínimos corresponden a orientaciones denominadas trans y cis, que sí aparecen en los ácidos coleicos investigados y se caracterizan por los siguientes valores para los ángulos de torsión:  trans (observada en cristales hexagonales): ψ1 ~ -60º, ψ2 ~ 190º, ψ3 ~ 180º;  cis (observada en cristales tetragonales y ortorrómbicos): ψ1 ~ - 60º, ψ2 ~ 60º, ψ3 ~ 180º. (ii) Los cristales hexagonales se caracterizan por hélices de moléculas de hospedador, generadas por el eje 65, unidas por enlaces de hidrógeno. Los huéspedes polares rellenan los canales helicoidales extendidos a lo largo del eje c y participan en el esquema de enlaces de hidrógeno. La cavidad posee una forma aproximadamente circular con un diámetro de ~4 Å, sólo accesible a moléculas pequeñas. (iii) Los cristales tetragonales se caracterizan por la asociación de bicapas onduladas que se extienden por el plano ab, relacionadas unas con otras por el eje 41, que no dejan espacios entre ellas. Cada bicapa se compone de la asociación de dos monocapas a través de un efectivo esquema de enlaces de hidrógeno, donde destaca la unión de moléculas de ácido desoxicólico en orientación cabeza-cola por los enlaces de hidrógeno entre el O3 y el O27 de dos moléculas consecutivas. Las moléculas de huésped se alojan en canales que discurren por el interior de las bicapas y que poseen una pequeña sección de forma casi-rectangular. (iv) Los cristales ortorrómbicos presentan también estructuras en bicapas pero las moléculas de huésped no participan en el esquema de enlaces de hidrógeno. Dos bicapas adyacentes antiparalelas, relacionadas por un eje 21, originan canales a lo largo de c con superficies hidrófobas. Dentro de los cristales se han reconocido dos grupos, denominados α y β, caracterizados por una traslación de las moléculas de ácido desoxicólico a lo largo de c de unos 7.2 y 14.2 Å, respectivamente. Los cristales α surgen cuando los huéspedes son planos o filiformes, mientras que cuando son aproximadamente esféricos originan cristales β. En ambos grupos, los cálculos de la energía de van der Waals muestran la existencia de tres mínimos denominados A, B y C. En el grupo α, el mínimo C corresponde a un empaquetamiento sin canales nunca observado, mientras que el mínimo A (que es el más profundo) aparece cuando los huéspedes son pequeños o filiformes, y el mínimo B lo hace con huéspedes planos (lo que requiere que a sea superior a 26 Å). En el grupo β, el mínimo más profundo es el B y aparece con huéspedes aproximadamente esféricos, requiriendo que a sea superior a 27 Å. Se concluye, por lo tanto, que el empaquetamiento de las bicapas puede inferirse de forma aproximada de cálculos de energía si las constantes de la celda son conocidas. En definitiva, los cristales ortorrómbicos de ácido desoxicólico conocidos hasta principios de los años ochenta, poseen estructuras cristalinas, con bicapas de moléculas del ácido empaquetadas de tal forma que, en los canales hidrófobos que dejan libre, pueden alojarse diferentes tipos de moléculas huésped, a saber: (i) moléculas grandes y flexibles como el ácido palmítico; (ii) moléculas planas como el fenantreno o el pdiiodobenceno, y (iii) otras moléculas pequeñas como la acetona o la ciclohexanona.72 Como ejemplos podemos citar que los cristales de ácido desoxicólico con (+)-canfor,72 ciclohexanona, fenantreno,58 y di-tert-butiltiocetona73 pertenecen a la clase β, mientras que el cristal con ácido acético61 pertenece a la α. La localización del huésped en la estructura del cristal constituye el mayor problema en la resolución de la estructura cristalina.74 51 Los cristales del ácido desoxicólico obtenidos en o-, py m-xileno poseen estequiometrias 2:1, siendo los dos primeros monoclínicos P21 y el tercero ortorrómbico P212121.57 Analizando en detalle el cristal con el o-xileno (Figura 2.2) se observa la presencia de un pseudo-eje binario entre las moléculas hospedadoras que logra que la estructura de la bicapa y sus relaciones espaciales sean muy similares a la de los cristales ortorrómbicos. Existen dos moléculas del ácido biliar que se diferencian en la conformación del anillo D (sobre y media silla), pero las cadenas laterales se encuentran plegadas. Figura 2.2. Estructura esquemática de los cristales ortorrómbicos generados por el ácido desoxicólico con diversos huéspedes: (B) Bicapa de moléculas de ácido desoxicólico (D); G: huésped; (H) esquema helicoidal de enlaces de hidrógeno uniendo las posiciones hidrófilas del ácido desoxicólico en las bicapas; (V) contactos de van der Waals entre las caras hidrófobas del ácido desoxicólico en las bicapas; (C) canales hidrófobos conteniendo el huésped a lo largo de c; (O) origen de la celda unidad. Tomada de Jones et al.72 La conformación del anillo D, intermedia entre sobre y media silla, fue observada por Limmatvapirat et al75 al estudiar el cristal ácido desoxicólico:ácido salicílico (ortorrómbico P212121; estequiometría 1:1), teniendo la cadena lateral una conformación trans. Miyata et al76 dan resultados cristalográficos del complejo de inclusión 2:1 entre ácido desoxicólico y anisidina. El cristal es monoclínico P21. En este interesante artículo analizan las estructuras jerárquicas que se resumen en la Figura 2.3. En ella, (b) representa un ensamblaje bimolecular, (c) el ensamblaje en hélice-21, (d) un ensamblaje de ensamblajes helicoidales y (e) los canales de inclusión. El ensamblaje en hélices se retiene gracias a enlaces de hidrógeno en los que participan hidroxilos de las posiciones 3 y 12, y estos ensamblajes se apilan en la misma dirección (d) originando una disposición en forma de lámina también mediante enlaces de hidrógeno, ahora a través de los grupos carboxilo de la cadena lateral. El apilamiento de las láminas es en dirección opuesta (e). De cara al estudio de la polimerización, llevaron a cabo simulaciones con el monómero 2metil-trans-1,3-pentadieno y el ácido desoxicólico, mostrando que el primero se inclina en el canal donde puede polimerizarse. 2.1.3 Ácido cólico. El ácido cólico ha podido ser recristalizado sin formar inclusión alguna.77 El cristal es ortorrómbico P212121 y presenta cuatro enlaces de hidrógeno [O3…O12, O(carboxílico)…O7, O(carboxílico)…O12, y O3…O7] que no permiten la formación de cavidades y que forman una espiral alrededor del eje cristalográfico b (Fig.2.4).78 Este 52 cristal puede absorber acetofenona y pasa a ser monoclínico, de estructura idéntica a la del obtenido de manera directa.79 Figura 2.3. Estructuras jerárquicas del cristal del ácido desoxicólico:anisidina.76 Figura 2.4. Estructura cristalina del ácido cólico sin ningún huésped.78 Como el desoxicólico, el ácido cólico puede formar cristales de inclusión, con diversas estequiometrías y una gran variedad de moléculas huésped: alcoholes, cetonas, aldehídos, éteres, ácidos, ésteres y nitrilos.80 Los primeros cristales de ácido cólico con huéspedes (agua y etanol) se deben a Norton y Haner81 y Johnson y Schaefer (con etanol).31 También forma complejos con otros alcoholes como metanol y propanol.33 El propanol se adapta perfectamente a las cavidades mientras que el metanol puede ocluir un mayor número de moléculas sin participar en la formación de enlaces de hidrógeno, lo que justifica la inestabilidad del cristal. Con butanol no se han obtenido complejos de inclusión y Yoswathananont et al35 estudiaron los cristales con 1-pentanol y 1-hexanol (monoclínicos P21 y con estequiometría 1:1). Las estructuras son en bicapas con el mismo tipo de interdigitación, deduciéndose de los ángulos diedros ψ2 conformaciones trans para el primero y gauche para el segundo. Los enlaces de hidrógeno son los mismos y constituyen una red cíclica en la que participan los alcoholes. El cristal ácido cólico:agua fue objeto de un exhaustivo estudio por parte de Lessinger et al.82 Es un hemihidrato (2:1) hexagonal P6522 en el que la molécula de agua está desordenada entre dos posiciones no equivalentes. La unidad asimétrica posee dos tipos de moléculas de ácido biliar con geometrías que sólo se diferencian en la posición de la cadena lateral, diferencia suficiente como para que los enlaces de hidrógeno que presentan también lo sean (cola-cola en una y cabeza-cola en la otra) originando una 53 compleja red de enlaces de hidrógeno. Miyata et al83 examinaron el papel de la cadena lateral en cristales de ácido cólico con estructuras ya conocidas. A diferencia de los cristales de ácido desoxicólico, los de ácido cólico presentan un polimorfismo84 que depende del huésped, debido a que éste influye sobre la red de enlaces de hidrógeno. Ejemplos típicos son los que conducen a canales (acetofenona79 o la γ-valerolactona23-24,84 y, en general, huéspedes grandes) y las que no los presentan (alcoholes31,85 o sin huéspedes78). Dependiendo del huésped, en los cristales con disposición cola-cola, se pueden dar conformaciones tanto trans como gauche en la cadena lateral. Con la acetofenona estos autores detallan la constitución de dos bolsillos en los canales de inclusión. Uno de ellos está formado por dos cadenas laterales, de forma que los cambios conformacionales en ellas conducen a una modificación de forma y tamaño de los espacios de inclusión accesibles a los huéspedes. La recristalización con derivados del benceno ha permitido la realización de diversos estudios sistemáticos. Entre los compuestos analizados cabe citar el propio benceno,86 anilinas (incluyendo derivados fluorados),25,47,87 feniletilaminas,47 nitrobenceno25 y pnitrotolueno,88 cetonas79 y tiobenzofenona,89-90 xilenos y triy tetra-metil derivados,91 alcoholes48 y nitrilos.88 Los cristales pueden presentar estequiometrías 1:1 (por ejemplo, benceno, tolueno, my p-xileno, 1,2,4y 1,3,5-trimetilbenceno y 1,2,3,4y 1,2,3,5tetrametilbenceno) o bien 2:1 (o-xileno, 1,2,3-trimetilbenceno, 1,2,3-triclorobenceno, 1,2dicloro-3-metilbenceno, 1-cloro-2,6-dimetilbenceno, 1,3-dicloro-2-metilbenceno, 1,2dibromo-3-metilbenceno y 1-bromo-2,6-dimetilbenceno). Así, el cristal ácido cólico:benceno (monoclínico P21)86 pertenece al sistema ordenado en bicapas con canales en su parte hidrófoba, estructura isomorfa con la de los cristales de este ácido con γvalerolactona,24 acetofenona,79 nitrobenceno y anilina.25 En la parte hidrófila de la bicapa se establecen cuatro enlaces de hidrógeno [O12I-H...O24bII=C-O24aIIH... O7III-H...O3IVH...O12I] que forman una red cíclica y que conducen a un ordenamiento molecular cabeza-cabeza y cola-cola. Miyata et al91 demostraron que los ordenamientos moleculares pueden invertirse mediante la introducción de cierta clase de huéspedes. Parten del cristal ácido cólico:oxileno (monoclínico P21), siendo el ordenamiento de las moléculas de esteroide cabezacola (como en el caso del ácido desoxicólico:o-xileno) y no cabeza-cabeza-cola-cola (como en el caso del ácido cólico:benceno). Ello es consecuencia de la red de enlaces de hidrógeno que se establece en cada caso, helicoidal para los cabeza-cola y cíclica para los cabeza-cabeza-cola-cola. La secuencia en el cristal analizado es [O3-H...O24b=C-O24aH...O12-H...O3-H] y el grupo O7-H está conectado débilmente a la red helicoidal mediante un enlace O7-H...O24b de 3.23 Å. Además, estos autores señalaron que el ácido desoxicólico no puede formar redes cíclicas por la ausencia del grupo hidroxilo en la posición 7. Veamos ahora otros compuestos aromáticos. Nakano et al92 estudiaron el cristal ácido cólico:n-propilbenceno (estequiometría 1:1) que presenta una organización cabezacabeza y cola-cola con las cadenas laterales en conformación trans, formando una red cíclica de cuatro enlaces de hidrógeno. Al calentar a 90ºC, proceso reversible, el cristal pierde parte del huésped y da lugar a otro cristal de estequiometría 2:1, perdiendo el huésped restante a 120ºC. El cristal intermedio se caracteriza por un desplazamiento de las bicapas de forma que las cavidades resultan más pequeñas. El fenómeno no es exclusivo de este huésped. Con m-nitrotolueno el ácido cólico forma cristales P21 (estequiometría 1:1).93 El empaquetamiento y enlaces de hidrógeno son similares al de cristales del resueltos con anterioridad por estos mismos autores.88,94 El ángulo de torsión ψ2 pone de manifiesto que la cadena lateral se encuentra plegada, dándose la misma secuencia de enlaces de 54 hidrógeno que comentamos más abajo para las acetofenonas.49 Con oy m-nitrosotolueno, los cristales son monoclínicos (P21 de estequiometría 2:1).36 La Figura 2.5 muestra el empaquetamiento de los cristales del ácido cólico con nitrosotoluenos. A efectos comparativos se muestran también los del ácido desoxicólico.36 Figura 2.5. Empaquetamientos de los cristales de ácido cólico y desoxicólico con nitrosotoluenos.36 Con la finalidad de comprender la capacidad de reconocimiento molecular del hospedador, Nakano et al36 realizaron un estudio sistemático de las estructuras cristalinas de los complejos de inclusión del ácido cólico y veintiocho bencenos monosustituidos. Encontraron que todos ellos son monoclínicos P21 con una estructura en bicapas con canales monodimensionales donde se pueden incluir huéspedes. Con una única excepción, todas las estructuras cristalinas contienen los mismos enlaces de hidrógeno entre moléculas de hospedador que responden al esquema de la Figura 2.6 (izquierda). En la central se muestra la red correspondiente a la excepción, pudiendo observarse que el grupo hidroxilo del huésped inserta en la red cíclica anterior. En la de la derecha, se recoge cómo un grupo amino del huésped forma enlaces de hidrógeno con el hospedador (vide infra).87 Figura 2.6. Esquema de los enlaces de hidrógeno existentes en los cristales formados por el ácido cólico y bencenos sustituidos.37 Como continuación del trabajo anterior, Yoswathananont et al38 estudiaron la formación de los cristales del ácido cólico con benceno (1), tolueno (2), etilbenceno (3), propilbenceno (4), butilbenceno (5), pentilbenceno (6) y hexilbenceno (7). Todos los cristales son P21 pero la estequiometría es 1:1 para sustituyentes de cadena corta y 2:1 para los de cadena larga (≥ n-butilo). Los resultados muestran que el orden de preferencia por la inclusión en el ácido cólico es 1, 2 > 6, 7 > 3, 4, 5. Todos los complejos poseen estructuras en bicapas, incorporándose los huéspedes en la cavidad monodimensional de la capa lipófila. Clasificaron estas estructuras en tres tipos, αG, αT y βT, según el comportamiento de interdigitación de los grupos metilo en las caras lipófilas y la conformación gauche (G) o trans (T) de la cadena lateral del esteroide. Al tener en cuenta la estequiometría aparecen cuatro tipos diferenciados que parece que son los condicionantes de la selectividad en el siguiente orden: 1:1 αG > 2:1 αG > 1:1 βT ó 2:1 αT. Los cristales obtenidos mediante cristalización competitiva pertenecen a uno de los 55 tipos anteriores (αG, αT o βT) o a una combinación de ellos. Si los dos huéspedes pertenecen al mismo grupo en cristales individuales puros resulta ese mismo tipo, pero si son de dos grupos diferentes resultan dos tipos de cristales de inclusión, uno homogéneo con huéspedes mixtos o una mezcla de cristales diferentes. Si uno de los huéspedes de la mezcla origina el tipo αG en el estado puro, ese mismo tipo resulta con los huéspedes incorporados en la cavidad. De estos hechos se concluye que el tipo αG es preferente sobre el αT y este sobre el βT. El mismo grupo de investigación39 extendió el estudio anterior a otros huéspedes como o-, my p-xileno. Las estequiometrías son 1:1 (my pxileno) y 2:1 (en dos cristales polimórficos según la temperatura con o-xileno). Todos ellos poseen una estructura en bicapas (Figura 2.7) con un empaquetamiento alternativo de capas hidrófilas y lipófilas, ambas antiparalelas, diferenciándose la forma I del o-xileno de todas las demás en que posee un empaquetamiento antiparalelo en la capa lipófila y paralelo en la hidrófila. Con la clasificación establecida en el artículo anterior, la forma II del oxileno es αT, la del m-xileno βT y la del p-xileno αG. Todas ellas, así como la forma I del o-xileno, poseen diferentes esquemas de enlaces de hidrógeno. El que corresponde a esta última es una red lineal en la que participan los OH de las posiciones 3 y 12 y el ácido carboxílico a lo largo del eje c. Se conecta así cada molécula hospedadora con otras cuatro para generar una estructura en lámina bidimensional. El grupo hidroxilo de la posición 7 está conectado débilmente a la red de enlaces de hidrógeno. Los restantes grupos dan una red cíclica de enlaces de hidrógeno por medio de la secuencia O3H, O7H, O12H y O24H en la que participan todos los grupos aceptores/donantes, conectándose así cada molécula hospedadora con las doce que la rodean (Figura 2.8). Figura 2.7. Estructuras de los cristales formados por el ácido cólico y xilenos.39 El tipo αG posee el menor volumen de la cavidad y el mayor PCcavity, indicando que el volumen es el más adecuado para los xilenos. Sin embargo, sólo el p-xileno origina este tipo de cristalización, lo que pone de manifiesto que la forma tiene también un destacado papel. Una vista de las secciones perpendiculares al eje del canal muestra que la cavidad del tipo αG se ajusta a la forma del p-xileno, pero es demasiado estrecha para los otros dos isómeros. Por otra parte, la sección del tipo βT es suficiente para incorporar al isómero meta pero no el orto. Consecuentemente, no puede formar complejos de inclusión 1:1 y los forma con estequiometría 2:1 bien del tipo αT o bien del tipo del ácido desoxicólico. En definitiva, lo que estos resultados ponen de manifiesto es que la 56 adecuación estérica de la forma y el volumen entre el huésped y la cavidad del anfitrión juegan un papel importante en el modo de cristalizar el complejo. Figura 2.8. Esquemas de los enlaces de hidrógeno formados el ácido cólico y xilenos.39 Para profundizar en las razones de los modos de cristalización del complejo, definen un coeficiente de empaquetamiento PCcavity según: 󰇛%󰇜󰇛󰇜󰇛ºé󰇜   100 Szyrszyng et al95 publicaron la estructura del cristal ácido cólico:anti-azobenceno (el compuesto sinno es incluido). El cristal es monoclínico P21 con estequiometría 1:2 (Figura 2.9, izquierda). En él se observa que las moléculas de hospedador se autoensamblan en bicapas corrugadas por medio de enlaces de hidrógeno y los canales que quedan entre las bicapas empaquetadas se llenan con el huésped organizado en columnas. Los anillos bencénicos del huésped están girados, hecho que contrasta con la casi planaridad encontrada para el cristal del trans-azobenceno.96 A efectos comparativos podemos indicar que el cristal del complejo con ácido desoxicólico es ortorrómbico con estequiometría 1:4 e isoestructural con el del huésped 4-(N,N-dimetilamino)- azobenceno.97 La Figura 2.9 (derecha) muestra cómo las moléculas de huésped se alojan en los canales tipo α típicos de este hospedador frente a huéspedes pequeños y planos.69 Figura 2.9. (a) Estructura cristalina de un complejo de ácido cólico con anti-azobenceno. (b) A efectos comparativos se incluye también el cristal con el ácido desoxicólico.95 57 En relación con la formación de enlaces de hidrógeno, es interesante comentar los cristales formados por el ácido cólico con derivados fluorados de la anilina,47,87 ya que surgen dos esquemas. Uno consiste en un biciclo con puentes establecidos por el grupo amino (anilina, 3y 4-fluoranilina y 3,4-difluoranilina) y el otro es un sistema cíclico sencillo (2-fluoranilina) donde el grupo amino no participa en enlaces de hidrógeno intermoleculares, apareciendo en este caso un enlace intramolecular entre los átomos de N y F. En cambio, con alcoholes 2-, 3y 4fluorbencílicos,47,87 que forman cristales del grupo P21, en ningún caso, el flúor interviene en la red de enlaces de hidrógeno, red que es cíclica en los complejos con 2y 4-FBzOH: [O24a-H...O7-H...O3-H...O12H...O(alcohol)-H...O24b]. Otros complejos estudiados, formados por el ácido cólico y derivados fluorados, han sido derivados del etanol (2-fluoretanol, 2,2-difluoretanol y 2,2,2-trifluoretanol)35 y de la acetofenona.49 En el caso de los alcoholes, como muestran los valores de los ángulos de torsión, la presencia de átomos de flúor afecta poco a la configuración anti que ya presentaba el complejo con etanol,33 y tampoco lo hace sobre los empaquetamientos en el cristal. La red de enlaces de hidrógeno es de nuevo cíclica [- O12-H...O24b=C-O24a-H...O7-H...O(etanol)-H...O3-H...O12], acortándose la distancia O(etanol)-H...O3 con el aumento de átomos de flúor. En el caso de la acetofenona y derivados (3’- y 4’-fluoroacetofenona y 2’-cloroacetofenona) se ha determinado que los cuatro cristales poseen la misma red cíclica de enlaces de hidrógeno [O12-H...O24b=CO24a-H...O7H...O3-H...O12] y que sólo en el caso de la 4’-fluoroacetofenona se observa un enlace de hidrógeno (o una interacción débil) entre el F y el O12, de longitud 3,159 Å, que debilita el enlace O12-H...O24b. Esta red cíclica de enlaces de hidrógeno, ha sido también observada en varias cetonas alifáticas, aun cuando las estequiometrías de los cristales puedan ser diferentes.45 Gdaniec y Polonski46 han señalado que el cristal con 4F-C6H4-COEt es monoclínico P21. La participación del nitrógeno amínico en la red de enlaces de hidrógeno ha sido también confirmada en los complejos de inclusión con p-toluidina,98 aminopiridina99 y con (R)- y (S)-1-feniletilamina.100 En estos últimos casos, la estructura es a base de bicapas, unidas por enlaces de hidrógeno, que dejan canales donde se aloja la amina. Los enlaces de hidrógeno son similares en ambos isómeros, siendo de destacar que el grupo amonio actúa como donante triple unido a dos oxígenos carboxílicos y al O3H del ácido biliar. Por otra parte, los OH de las posiciones 7 y 12 están unidos entre sí para mantener el plano paralelo a la capa hidrófila. Sin embargo los cristales de ambos isómeros se diferencian en el empaquetamiento en la parte de la capa hidrófoba. El cristal (monoclínico P21, estequiometría 1:1) con aminopiridina (Figura 2.10) presenta una red supramolecular de enlaces de hidrógeno que forma una hélice en la que se unen el O12 y el O24b (disposición cabeza-cola) y que no se había descrito hasta la fecha. Al estudiar el cristal formado por este ácido biliar con la m-cloroanilina Yoswathananont et al101 observaron el novedoso hecho de que no hay interdigitación de los metilos 18 y 19 pero si del átomo de cloro entre los metilos de la cara opuesta (Figura 2.11). Llegan a esta conclusión después de describir los seis tipos de ordenamientos que pueden resultar por deslizamiento e interpenetración de capas lipófilas paralelas o antiparalelas (Figura 2.12). Nakano et al40 publicaron los resultados de un estudio de los cambios que sufren cristales de ácido cólico con diferentes huéspedes (o-toluidina, m-fluoranilina, oclorotolueno, o-bromotolueno e indeno) al calentarlos. Los cristales, caracterizados todos por estequiometrías 1:2, poseen las estructuras que se visualizan en la Figura 2.13, con las bicapas y los huéspedes alojados en los canales bidimensionales que quedan entre capas lipófilas. En la parte hidrófila se genera una red de enlaces de hidrógeno cíclica [O3-H...O7-H...O24b=C-O24a-H...O12-H] en la que están implicadas cuatro moléculas 58 diferentes. Los huéspedes con grupos amino (o-toluidina y m-fluoranilina) interaccionan débilmente con esa red de enlaces de hidrógeno de forma similar a como lo hace la anilina.87 Figura 2.10. Estructura del cristal ácido cólico: 4-aminopiridina.99 Figura 2.11. Estructura del cristal ácido cólico:m-cloroanilina.101 Como referencia se incluye la del cristal ácido cólico: anilina (derecha).25,87 Figura 2.12. Tipos de ordenamientos resultantes del deslizamiento e interpenetración de capas lipófilas paralelas o antiparalelas propuestas por Yoswathananont et al.101 59 Figura 2.13. Estructuras cristalinas de los complejos de ácido cólico con o-toluidina (a), m-fluoranilina (b), o-clorotolueno (c), o-bromotolueno (d) e indeno (e).40 Mediante experimentos de termogravimetría se comprobó que todos los cristales liberan el huésped en torno a 130 ºC. Lo hacen mostrando dos picos endotérmicos a 6782ºC y 112-122ºC. La pérdida de peso en cada una de estas dos etapas es dependiente del huésped. En la primera etapa, para los huéspedes o-cloro, o-bromotolueno e indeno, la estequiometría inicial, 1:2, se transforma en 2:1, mientras que para la m-fluoranilina la transformación es a 1:1. La estequiometría es incierta en el caso de o-toluidina. Por lo tanto, no sorprende que la eliminación del huésped induzca cambios estructurales en el ordenamiento del hospedador. La Figura 2.14 esquematiza tales cambios estructurales. Estos autores demostraron además que el proceso es reversible. Figura 2.14. Cambios estructurales observados por termogravimetría.39 Al estudiar cristales de ácido cólico y cinco ésteres alifáticos (acetatos de metilo, etilo, n-propilo e i-propilo -también estudiado por Scout-;94 y propionato de etilo), Caira et al50,102 encontraron dos tipos de empaquetamiento diferentes que suponen canales de tamaño y orientación diferentes, permitiendo así alojar diferentes tipos de huéspedes. Los valores del ángulo de torsión ψ2 muestran una gran diferencia entre los correspondientes al acetato de metilo y los demás huéspedes, diferencia que también se manifiesta en el ángulo de torsión ψ4, el cual, al describir la conformación del grupo C=O alrededor del enlace C23-C24, está de acuerdo con los requerimientos para los enlaces de hidrógeno de dicho grupo. Sin embargo, Nakano et al102 al obtener cristales de ácido cólico:acetato de etilo en presencia de 1-naftilmetilamina, observaron que tenían una estructura diferente (triclínicos P1, estequiometría 1:1) a la publicada por Caira et al.50 Ambas se presentan en la Figura 2.15, donde se observa que las conformaciones de la cadena lateral son diferentes (trans y gauche), lo que viene determinado por los valores de ψ2, hablando 60 entonces de polimorfismo conformacional. También se observan diferencias en la red de enlaces de hidrógeno y en la forma de los canales de inclusión. Figura 2.15.- Estructuras del cristal ácido cólico:acetato de etilo publicadas por Nakano et al102 y Caira et al.50 En el año 2000, Nowak et al103 revisaron la estructura cristalina del complejo ácido cólico:benzofenona para el que Miyata et al80 habían indicado una estequiometría 1:1. Sin embargo, este huésped parece ser demasiado grande para acomodarse en los canales manteniendo dicha estequiometría. El cristal, cuya estequiometría ahora se establece como 2:1, resultó ser monoclínico P21. En la celda unidad hay cuatro moléculas de esteroide simétricamente independientes, dos de las cuales tienen la cadena lateral en conformación gauche y las otras dos en trans. Las moléculas de huésped, que se encuentran desordenadas, se alojan en dos canales cristalográficamente distintos, pero topológicamente similares, en dos conformaciones diferentes. Las moléculas de hospedador se asocian mediante el sistema cíclico de enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo y carboxilo, a la vez que dan lugar a la bicapa cabeza-cabeza-cola-cola. En los cristales de ácido cólico pueden observarse diferentes redes de enlaces de hidrógeno aun con un mismo huésped, siempre que exista un tercer componente.104 Así, se han estudiado los cristales con acrilonitrilo, obtenidos en ausencia (método A) o en presencia de ciclohexano (método B). Los cristales con acrilonitrilo obtenidos por el método A son ortorrómbicos, en los que las redes helicoidales de enlaces de hidrógeno siguen la pauta conocida O3-H...O12-H...O24b=C-O24a-H...O7-H...O3-Hb. En cambio, los obtenidos por el método B son monoclínicos y la estructura es en bicapas con redes de enlaces de hidrógeno cíclicas que siguen la pauta O3-H...O12-H...O24b=C-O24a-H...O7H...O3-H. Sin embargo, los autores indican que con otros nitrilos (como acetonitrilo, butironitrilo, crotonitrilo, isobutironitrilo y valeronitrilo) se forman siempre cristales 1:1 como el anterior, incluso en presencia de un tercer componente. En definitiva, el cambio es exclusivo del acrilonitrilo. Este fenómeno también fue observado con ácido acético:104 (i) los cristales obtenidos con el método A poseen una estructura cruzada con una red helicoidal de enlaces de hidrógeno en el que está implicado el grupo carboxílico del huésped O12-H...O=C(CH3)- O-H...O3-H...O7-H...O24b=C-O24a-H...O12-H; (ii) los cristales obtenidos con el método B difieren en estequiometría y estructura, ahora formada a base de bicapas con dos clases de redes cíclicas de enlaces de hidrógeno que también implican al huésped, O12-H...O3H...O7-H...O=C(CH3)-O-H...O12-H y O24a-H...O=C(CH3)-OH...O24b. En esta misma línea, cabe englobar el trabajo de Miyata et al105 en el que se describen dos cristales polimórficos de ácido cólico y metacrilonitrilo obtenidos mediante diferentes métodos de cristalización. Uno posee una estructura cruzada y el otro en bicapas, ambos con estequiometría 1:1. Por otra parte, el primero es ortorrómbico P212121 y el segundo triclínico P1. En el primer caso, el empaquetamiento es similar al del cristal con acrilonitrilo pero la relación donante/aceptor de los enlaces de hidrógeno son contrarias, siendo ahora O7-H...O24b=CO24a-H...O12-H...O3-H. El segundo de los 61 cristales polimórficos posee una red de enlaces de hidrógeno que implica tanto una red cíclica como otra helicoidal, aunque ambas tienen misma secuencia O7-H...O3-H...O12H...O24b=C-O24a-H...O7. Los cristales del ácido cólico estructurados en bicapas pueden clasificarse en cuatro tipos, de acuerdo con las conformaciones gauche o trans de la cadena lateral del esteroide y los dos tipos de interdigitación, α o β, de los grupos metilo en las capas lipófilas. Es obvio que las estructuras resultantes dependen del huésped. Un ejemplo de cada una de ellas se muestra en la Figura 2.16, y corresponden, respectivamente, a los huéspedes benceno (α-gauche), fenol (β-trans), fenilacetileno (β-gauche) y alcohol bencílico (αtrans).37 Figura 2.16. Tipos de cristales de ácido cólico según las conformaciones gauche o trans de la cadena lateral del esteroide y los dos tipos de interdigitación, α o β, de los grupos metilo en las capas lipófilas.37 En el α-gauche el ángulo diedro ψ2 está comprendido entre 58 y 65º, y en la capa lipófila el metilo 18 se localiza entre los metilos 18 y 19 de la capa opuesta. En el tipo βtrans el ángulo de torsión está comprendido entre –167 y –180º y ahora es el metilo 19 el que se inserta entre los metilos 18 y 19 de la capa opuesta. El deslizamiento de ~4.5 Å de una de las capas sobre la otra, provoca la transformación α→β. El volumen de las cavidades varía en el orden α-gauche < α-trans < βgauche < β-trans. A través de cortes paralelos al eje de los canales, se diferencian surcos cuadrados para los de tipo gauche y triangulares para los trans. La mayoría de los bencenos monosustituidos cristalizan en los tipos α-gauche y βtrans, la primera para los huéspedes pequeños y la última para los más grandes. Cuando los volúmenes moleculares del huésped exceden el límite superior del tipo βtrans (140 Å3) la estequiometría 1:1 pasa a 2:1 con una isomerización simultánea β→α (isomerización por tamaño). Por otra parte, los huéspedes de tamaño intermedio podrían incorporarse en las cavidades para dar los tipos α-gauche o β-trans, y el hecho real es que el resultado depende de su forma (isomerización por forma). Esta forma se puede caracterizar por la longitud del eje longitudinal de la molécula (l) y por su espesor (th), parámetros que son estimados mediante cálculos geométricos con modelos moleculares. Observan así que si l < 9.7 Å y th < 4.3 Å, resulta el tipo α-gauche, mientras que si l > 9.0 Å y th > 4.3 Å, resulta el β-trans (aunque con alguna excepción). El coeficiente de empaquetamiento de las cavidades del hospedador (PCcavity) puede utilizarse como criterio para el ajuste estérico del huésped en la cavidad. Nakano et al37 deducen así que PCcavity = 55-70% es el requisito para la formación de complejos de 62 inclusión estables, particularmente cuando los huéspedes se incluyen estabilizados por fuerzas de van der Waals. Las interacciones intermoleculares fuertes como las π-π o los enlaces de hidrógeno expanden el rango anterior. Por otra parte, los valores de PCcavity superiores al 70%, al no dar complejos estables, tienden a reducir la relación estequiométrica hospedador: huésped. Kato et al106 han publicado una discusión sistemática de los ensamblajes helicoidales de cristales de inclusión de ácidos biliares y derivados actuando como moléculas hospedadoras. Tras analizar del orden de 300 estructuras cristalinas, indican que poseen la siguiente estructura jerárquica (Figura 2.17): a) ordenamiento de dichas moléculas para dar hélices con una dirección definida respecto al eje cristalográfico 21; b) asociación paralela de hélices a través de enlaces de hidrógeno para dar láminas quirales; c) apilamiento de estas láminas de forma paralela o antiparalela por medio de fuerzas de van der Waals, y d) llenado de los espacios quirales incluyendo huéspedes entre las láminas. Extienden su estudio a la comparación entre los ácidos desoxicólico, cólico, quenodesoxicólico y litocólico. Todas las hélices de estos ácidos son a derechas, excepto la del ácido quenodesoxicólico que es a izquierdas (Figura 2.18). Figura 2.17. Estructura jerárquica de los ensamblajes helicoidales de cristales de inclusión de ácidos biliares presentado por Kato et al.106 Figura 2.18. Comparación de las estructuras helicoidales de los cristales de inclusión de los ácidos de los ácidos desoxicólico (a), cólico (b), quenodesoxicólico (c) y litocólico (d).106 Polonski et al107 se plantearon cómo transformar especies ópticamente inactivas en especies activas, sin utilizar reactivos quirales. La quiralidad puede provenir de una torsión molecular en cuyo caso la estabilidad configuracional depende de la barrera energética para la rotación interna. Esta puede obtenerse en estado sólido ya que los movimientos moleculares se ven altamente restringidos. Así, uno de los primeros ejemplos conocidos de compuestos que adquieren actividad óptica en estado sólido es el bencilo (PhCOCOPh), que a temperatura ambiente cristaliza en cristales de los grupos 63 espaciales trigonales enantiomorfos P3121 y P3221, aunque su configuración absoluta no había sido determinada. Precisamente fue determinada por estos autores al obtener complejos de inclusión con ácido cólico y ácido desoxicólico (cuyas configuraciones están bien establecidas) y realizar medidas de rayos-X y dicroísmo circular. El cristal con ácido cólico posee estequiometría 2:1 y el de ácido desoxicólico 4:1. La estructura del último no pudo ser resuelta y la del primero (monoclínico P21), al igual que la red de enlaces de hidrógeno puesta de manifiesto, son típicos de clatratos de ácido cólico (Figura 2.19). También caracterizaron la conformación del huésped por medio de ángulos de torsión, la cual resulta ser diferente a la que presenta en sus cristales. Figura 2.19. Estructura del cristal ácido cólico:bencilo.107 Nakano et al44 han abordado la polimerización en cristales polimórficos de ácido cólico, conocidos ya los estudios sobre el particular con los ácidos desoxicólico,13,17 apocólico,15,17 y colato de metilo.19 Los monómeros que utilizaron fueron acrilonitrilo, metacrilonitrilo, 2-cloroacrilonitrilo, acetato de vinilo y 2,3-dimetil-1,3-butadieno. La polimerización la llevaron a cabo con irradiación-γ con una fuente de 60Co y estudiaron los pesos moleculares y distribuciones mediante GPC. Nakano et al dedujeron que la polimerización sólo tiene lugar cuando los monómeros están incluidos en canales y no en cavidades tipo caja, lo que puede justificarse porque, en el último caso, la reacción entre monómeros adyacentes se ve impedida por la presencia de moléculas hospedadoras. Asimismo, comparan la estereorregularidad que se obtiene en la polimerización de 2,3dimetil-1,3-butadieno en diferentes huéspedes esteroideos y la explican en función del tamaño del canal en cada caso. Por otra parte, Bertolasi et al108 se han hecho eco de que tanto el ácido cólico como el desoxicólico forman compuestos de inclusión con diferentes cetonas cíclicas racémicas, permitiendo la separación de enantiómeros. Así, estudiaron el cristal 2:1 ácido cólico:(-)- biciclo[3.2.0]-hept-2-en-6-ona, un compuesto de importancia en la síntesis de prostaglandina. Debe resaltarse que, cuando se usa ácido desoxicólico como hospedador, cristaliza el isómero contrario, lo que pone de manifiesto que los detalles finos estructurales juegan un papel importante en el proceso de discriminación quiral. Los enlaces de hidrógeno intermoleculares que se presentan son [O3-H...O12, O12H...O24b, O24a-H...O7 y O7-H...O3]. El huésped se incluye en las capas lipófilas e interacciona con el grupo ácido cólico mediante contactos de van der Waals débiles.109 Sada et al43 estudiaron el reconocimiento molecular de lactonas de tamaño medio (ya que las lactonas de tamaño pequeño o grande conducen a cristales libres de huésped) por 64 su inclusión en cristales de ácido cólico. Todos los cristales de los complejos estudiados presentan estequiometría 1:1 y son monoclínicos P21. Los autores trataron de comprender el reconocimiento molecular analizando diferentes secciones de corte y en diferentes planos en las que se van visualizando las dimensiones estéricas de las cavidades y posibles cavidades donde puede entrar un sustituyente del huésped y así producirse el reconocimiento de uno de los dos isómeros de una mezcla racémica. Muy recientemente, Nakamura et al110 abordaron el mecanismo de resolución óptica de los enantiómeros de la γ-valerolactona en los canales del ácido cólico realizado mediante un exhaustivo estudio de 13C RMN y CPMAS. Primero estudiaron los espectros en el complejo de inclusión del huésped marcado con deuterio, de cada enantiómero sin marcar y de mezclas de ellos para asignar las señales. Llegaron a la conclusión de que las probabilidades de inclusión de los enantiómeros dependen de cuál haya entrado antes en los canales, siendo más alta para los isómeros S. Indican que cuando el S entra se produce un cambio en la conformación de la cola del ácido cólico de forma que se facilita la entrada de otra molécula S. A continuación se comentan los trabajos de los derivados del ácido cólico que hacen referencia a su éster metílico. El primero de ellos data de 1987 y hace referencia al cristal del complejo 1:1 colato de metilo:metanol, hecho que lo diferencia del comportamiento del desoxicolato de metilo.111 El cristal pertenece al sistema monoclínico C2 y el empaquetamiento pone de manifiesto una estructura en capas con sendas partes hidrófoba e hidrófila, siendo en esta última donde se encuentra atrapado el huésped por medio de enlaces de hidrógeno con los grupos OH de la posición 12. Más recientemente se ha publicado el cristal de colato de metilo:2-propanol.112 La estequiometría y el grupo cristalográfico son los mismos que para el huésped anterior. Sin embargo, la conformación de la cadena lateral en estos dos cristales es diferente de las que presenta en los cristales de ácido cólico y de desoxicolato de metilo puesto que el ángulo de torsión ψ3 vale 78.5º (colato de metilo:metanol), 74.5º (colato de metilo:2propanol), 171.8º (ácido cólico)78 y 179.8 y 163.7º (desoxicolato de metilo: metanol),113 lo que puede tener gran trascendencia a la hora del proceso de inclusión de un huésped. Finalmente, en la formación de enlaces de hidrógeno, puede observarse que el átomo de oxígeno carboxílico queda sin participar como aceptor, como ocurría en el cristal de desoxicolato de metilo:metanol. Las estructuras de los cristales del éster metílico sin huésped (P21212) y con acetonitrilo (P21; estequiometría 1:1), fueron publicadas en 1995 por Scott.114 En virtud de los ángulos de torsión determinados, el autor estableció que las cadenas laterales están extendidas en los cristales con inclusión, mientras que en el cristal sin huésped hay dos moléculas diferentes de esteroide con conformaciones de la cadena lateral y esquemas de enlaces de hidrógeno muy distintos. En dos importantes trabajos, Sugahara et al115 y Kato et al51 estudiaron la influencia del tamaño de la cadena lateral en las características de inclusión de los ácidos biliares. Los primeros autores analizaron los ácidos cólico, desoxicólico, quenodesoxicólico y litocólico (y derivados) por análisis de cristales libres de huésped o con inclusión. Discutieron primero los resultados del ácido cólico (ao) y derivados, señalando que tanto el primero como el derivado con un grupo metileno menos (a-) pueden incluir muchos tipos de huéspedes. Por el contrario, el derivado con dos metilenos menos (a-2) sólo da cristales libres de huésped y los que tienen uno (a+) o dos metilenos (a+2) adicionales presentan unas características intermedias. Por otra parte, mientras a y adan estructuras en bicapas con canales flexibles, a+2 se presenta en diferentes estructuras cristalinas. Finalmente hicieron referencia a la red de enlaces de hidrógeno cíclico de ao (Figura 2.20 izquierda), diferente del que presenta a+2 (Figura 2.20 central). 65 Figura 2.20. Redes de los enlaces de hidrógeno observados en los cristales resueltos por Sugahara et al para estudiar la influencia de la longitud de la cadena lateral en las características de inclusión de los ácidos cólico, desoxicólico, quenodesoxicólico y litocólico (y derivados).115 Respecto al ácido desoxicólico (bo) y derivados, señalan que bo y b-1 forman cristales con inclusión con la mayoría de los huéspedes orgánicos pero con diferencia respecto a los alcoholes alifáticos (b-1 incluye metanol, etanol y 1-propanol y bo no lo hace), hecho que atribuyen a que bo se organiza en bicapas y b-1 en monocapas.116 Por otra parte, b+1 y b+2 originan cristales sin huéspedes. Por su parte, Kato et al51 basándose en consideraciones geométricas (rotaciones y deslizamientos), restringidas a la estructura en bicapas (derecha), ilustraron diez maneras de agregarse moléculas esteroides (Figura 2.21). El artículo se centra, precisamente, en estas últimas, que pueden clasificarse en bicapas propiamente dichas (con 7 subtipos, Ba a Bg) y en “como capas” (con 2 subtipos, T y W). Los empaquetamientos moleculares correspondientes a ellas se muestran en la Figura 2.22. Figura 2.21. Diez maneras de agregación de moléculas esteroides basadas en consideraciones geométricas (rotaciones y deslizamientos) restringidas a la estructura en bicapas (derecha). Las líneas de puntos entre grupos OH indican que se encuentran a distancias de posibles enlaces de hidrógeno.51 66 Miyata et al117 han establecido relaciones entre las estructuras moleculares y las asociaciones moleculares. Para ello, se fijan en que las moléculas de hospedador se asocian para dar arquitecturas cruzadas, en capas o helicoidales, así como en las redes de enlaces de hidrógeno que establecen. Estas redes son para el ácido cólico cíclicas sin participación de huéspedes y para el 3-epicólico (3β,7α,12α) son ramificadas con participación de huéspedes. Mientras el ácido cólico sólo incluye alcoholes muy pequeños, el ácido 3-epicólico también incluye alcoholes de mayor tamaño. Respecto a otros isómeros establecen que el ácido 12-epicólico (3α,7α,12β) no incluye compuestos orgánicos, y que el ácido 3,12-epicólico (3β,7α,12β) incluye compuestos como metanol, acetonitrilo... Figura 2.22. Empaquetamientos moleculares correspondientes a los siete subtipos de bicapas y los dos “como capas”.118 2.1.4 Ácido 3β-amino cólico El ácido 3β-amino cólico (amC) (Figura 2.23) puede considerarse la estructura básica presente en muchos esteroides sintetizados en este grupo de investigación, derivados en los que se ha incluido un grupo apolar en la posición 3 del esteroide, o bien dímeros u oligómeros de orden superior. Se discutirá su estructura cristalina de forma independiente de los ácidos biliares diy trihidroxílicos aunque estrictamente hablando se trate de un derivado dihidroxílico del acido cólico. Figura 2.23. Estructura molecular numerada del ácido 3β-amino cólico (amC). 67 Los cristales de este derivado del ácido cólico fueron obtenidos por recristalización en agua en el seno de este grupo de investigación.119 El estudio de difracción de rayos X pone de manifiesto que se trata de cristales tetrahidratados (aunque como una molécula de agua se encuentra en dos lugares diferentes al 50%, en las imágenes del Mercury se visualizaron cinco) ortorrómbicos del grupo espacial P212121. Los parámetros de celda se recogen en la Tabla 2.1. Tabla 2.1. Parámetros de la célula del cristal ortorrómbico P212121 del ácido 3β-amino cólico.119 a(Å) b(Å) c(Å) α(°) β(°) γ(°) 7.749(5) 12.667(5) 27.498(5) 90.000(5) 90.000(5) 90.000(5) Los ángulos de torsión más significativos se recogen en la Tabla 2.2. La conformación del anillo D se analiza siguiendo el criterio de Altona et al120 por medio de los llamados ángulos de torsión máximo posible, ϕm, y ángulo de fase, Δ. Estos se calculan a partir de los 5 primeros ángulos de torsión de la Tabla 2.2 por medio de las expresiones: Tabla 2.2. Ángulos de torsión más significativos del ácido 3β-amino cólico.121 Angulo de torsión  (o) C17-C13-C14-C15   o 46.02 C13-C14-C15-C16   4 -32.09 C14-C15-C16-C17   3 5.94 C15-C16-C17-C13   2 22.06 C16-C17-C13-C14   1 -41.09 C17-C20-C22-C23 -173.35 C20-C22-C23-C24 167.28 Los valores obtenidos, Δ = 20.11º y ϕm = 46.74º, son indicativos de una conformación intermedia entre media silla y β-sobre, la misma que en los cristales de ácido cólico con los huéspedes metanol, etanol y 1-propanol de estequiometrias 1:1.31,33 Por otra parte los valores de los ángulos de torsión alrededor de los enlaces C20-C22 y C22-C23 indican que la cadena lateral se encuentra en una conformación estirada, que supone una distancia de extremo a extremo de la molécula de 1.6 nm. La vista de la estructura cristalina a lo largo del eje a se muestra en la Figura 2.24. Es de destacar que el compuesto cristaliza en forma zwitteriónica. En esa misma figura, observamos que el empaquetamiento es del tipo cruzado donde dos moléculas de amC enfrentan sus caras lipófilas en forma cabeza-cola. En las caras lipófilas un grupo metilo C18 de una molécula queda localizado entre los metilos C18 y C19 de la otra, disposición de interdigitación α. Al tener en cuenta el valor del ángulo de torsión C17-C20-C22-C23, la bicapa se dice que es del subtipo α-trans. Las estructuras de tipo cruzado son conocidas para cristales de ácido cólico, bien libre78 o con los huéspedes metanol, etanol y 1-propanol,31,33 así como con 68 metacrilonitrilo.105 Por otra parte, definiendo los planos moleculares con los 13 átomos de carbono que forman los anillos B, C y D, el ángulo entre las dos moléculas de esta subestructura resulta ser de 10.25º. Otra unidad doble como la anterior se dispone de forma aproximadamente perpendicular de manera cola(1)-cabeza(2) y cabeza(1)- centro(2), con ángulos entre planos (definidos como antes) de 84.94 y 85.86º. El esquema se repite indefinidamente generando el zigzag característico de las estructuras cruzadas. Figura 2.24. Empaquetamiento del cristal del amC visto a lo largo del eje a.119 En el caso del ácido cólico sin huéspedes, las subunidades son similares (Figura 2.25) aunque sin interdigitación de los grupos metilo, pero la disposición relativa entre ellas al crearse el zigzag es diferente de la del ácido 3β-amino cólico, probablemente debido a la diferente conformación de los sustituyentes en la posición 3. Ahora se producen cuatro enlaces de hidrógeno helicoidales (tipo CI) que unen cinco moléculas con la secuencia O24a-H...O12-H...O3-H...O7-H...O24b. Este mismo esquema aparece en el cristal ácido cólico:metacrilonitrilo.105 El huésped se aloja entre las caras lipófilas y tampoco aparece interdigitación de los metilos. Evidentemente esta estructura está estabilizada por los enlaces de hidrógeno que establecen los grupos amonio, carboxilato e hidroxilo presentes, respectivamente, en la cabeza, cola y parte central del esteroide. Las características de los enlaces de hidrógeno intermoleculares encontrados se detallan en la Tabla 2.3. En todos ellos, figura el grupo carboxilato del zwitterión como aceptor por lo que la distinción de la nomenclatura 24a y 24b establecida en la Figura 2.25 pierde su sentido. Esos tres enlaces de hidrógeno unen cuatro moléculas de esteroide. La zona central de una molécula de esteroide, concretamente los grupos hidroxilo de las posiciones 7 y 12, establecen enlaces de hidrógeno con los carboxilatos situados en los extremos de la cadena lateral de otras dos moléculas. Es el enlace de hidrógeno entre el grupo amonio de la posición 3 y el carboxilato de una cuarta molécula el que se produce donde la bicapa hace el zigzag. En el caso del cristal ácido cólico:etanol,31 cinco enlaces de hidrógeno se establecen entre tres moléculas de esteroide y una de etanol. Lo mismo sucede en el caso del huésped metanol, pero para el 1-propanol aparecen dos moléculas de huésped.33 Como en el cristal sin huésped, en estos complejos cristalinos las moléculas de ácido cólico tampoco muestran interdigitación de los grupos metilo. 69 Figura 2.25. Subunidades estructurales del cristal del ácido cólico sin huéspedes.78 Tabla 2.3. Enlaces de hidrógeno observados en el cristal de amC. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(7)-H...O(24a) 2.997 (7) 156.2 (0,4) O(12)-H...O(24b) 2.731 (8) 151.74 (0,4) N-H...O(24a) 2.832 (8) 149.37 (4,8) 2.2 RESULTADOS OBTENIDOS CON DERIVADOS MONO-SUSTITUIDOS. En este grupo de investigación, se han venido empleando numerosas metodologías en busca de las mejores condiciones de reacción para obtener un rendimiento y coste aceptables y, en definitiva, optimizar las reacciones químicas necesarias para el diseño de las estructuras moleculares de interés. En las distintas rutas sintéticas, así como en la descomposición de los productos sintetizados, aparecen derivados de distinta naturaleza más o menos estables. Estos intermedios de reacción, subproductos de reacciones paralelas o hidrólisis de los productos sintetizados, aun no siendo objetivo principal de este estudio, no dejan de tener interés ya que algunos son derivados de esteroides que conservan sus peculiaridades. Por ello, a continuación se presentarán cuatro moléculas cristalizadas en el transcurso de la investigación antes de dar paso a los dímeros de esteroides de mayor tamaño. 2.2.1 Monoderivado 3β-azidacolato de metilo, C-azida. En la síntesis química, la azida se emplea en la obtención de numerosos productos ya que es un buen grupo saliente. El derivado del ácido cólico con un grupo azida sintetizado resultó ser lo suficientemente estable como para poder estudiar su estructura cristalina. A continuación se muestran los resultados obtenidos para el cristal del éster metílico derivado de ácido cólico unido a través de la posición C3 (β) a la azida. Denominado Cazida (Figura 2.26), sus cristales han sido obtenidos en una disolución de acetato de etilo/metanol y, evidentemente, expuesto a la humedad ambiental. El cristal incluye dos moléculas de agua, pertenece al sistema monoclínico C2 y los parámetros de la celda se recogen en la Tabla 2.4. 70 Figura 2.26. Estructura del derivado de ácido cólico del C-azida. Tabla 2.4. Parámetros de celda del cristal del C-azida recristalizado en metanol/acetato de etilo. Formula Empírica C25H41 N3O4·H2O Peso Molecular 465.62 Temperatura (K) 100(2) Longitud de Onda (Å) 0.71073 Sistema cristalino, grupo espacial Monoclínico, C2 a (Å) 18.9238(12) b (Å) 16.6746(12) c (Å) 7.6595(5)  (o) 90  (o) 97.790(3)  (o) 90 Volumen (Å 3 ) 2394.6(3) Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 4, 1.292 coeficiente Absorción (mm1 ) 0.09 F (000) 1016 Tamaño Cristal (mm 3 ) 0.33x0.24x0.16 Intervalo θ (datos) (o) 2.4-37.1 Intervalo de índices -31  h  30 -28k28 -12l13 Datos/restricciones/parámetros 12148/8/329 Grado de ajuste en F 2 1.04 Índices R finales [I>2(I)] R1 = 0.0363, wR2 = 0.0936 Índices R (todos los datos) R1 = 0.0399, wR2 = 0.0959 La Figura 2.27 muestra las vistas a lo largo de los ejes cristalográficos a, b y c del empaquetamiento. La disposición del compuesto en la red cristalina origina una estructura de bicapa. La capa hidrófoba está formada por la cara β del ácido biliar y los grupos azida ligeramente distorsionados y la capa hidrófila por los grupos más polares donde, al mismo tiempo, se incluye el huésped (agua) con estequiometria 1:2. De esta manera, la estructura generada forma canales a lo largo del empaquetamiento (Figura 2.28), en la región hidrófila de la bicapa, donde una de las moléculas de agua forma un enlace de hidrógeno con el grupo hidroxílico O7 y la otra con el oxígeno carbonílico de la cadena lateral. Los ángulos de torsión de la estructura del anillo D (Tabla. 2.5) corresponden a una conformación β-sobre con unos valores de Δ = 26.05o ϕm = 45.99o. La cadena lateral adquiere una conformación tgtg y, si se toman como referencia los tres nitrógenos del grupo azida y la posición C3, estos se encuentran en una conformación trans y con un ángulo C3-N1-N2 de 118.2º. Cabria esperar que los tres nitrógenos se situasen en línea pero como se verá a continuación, existe una interacción dipolo-dipolo en la que están 71 implicados el nitrógeno en posición central y el oxígeno del carbonilo de la cadena lateral de otro esteroide. (a) (b) (c) Figura 2.27. Empaquetamiento del cristal del derivado C-azida visto a lo largo de los tres ejes a, b y c. Figura 2.28. Vista del cristal del C-azida mostrando los canales donde se emplazan las moléculas de agua. Tabla 2.5. Valores de los ángulos de torsión más importantes del éster del C-azida. Á ngulo de torsión  (°) C17-C13-C14-C15   0 44.81 C13-C14-C15-C16   4 -30.17 C14-C15-C16-C17   3 3.52 C15-C16-C17-C13   2 24.08 C16-C17-C13-C14   1 -41.52 C13-C17-C20-C22 -179.10 C17-C20-C22-C23 -170.11 C20-C22-C23-C24 177.93 C22-C23-C24-O24a 21.04 C3-N1-N2-N3 -175.69 72 Al estudiar las interacciones que originan esta estructura cristalina resaltan algunas peculiaridades que cabe destacar. Cada molécula se une a otras dos en un plano superior mediante enlaces de hidrógeno, mediante los grupos hidroxilo en posiciones 7 y 12, por la cara α (Figura 2.29 y Tabla 2.6). Esto es muy común en este tipo de compuestos pero esta estructura se expande gracias a la interacción que se produce entre el nitrógeno central del grupo azida y el oxígeno carbonílico de la cadena lateral con lo que se logra que cada molécula interactúe con cuatro moléculas de su entorno. Esta interacción distorsiona el ángulo natural de la azida desde 180º hasta 171.7º. En total cada molécula de esteroide cuenta con 5 enlaces de hidrógeno y dos interacciones O-N. Figura 2.29. Vista de la red de enlaces de hidrógeno (izquierda) y de la interacción del carbonilo de la posición 24 con el nitrógeno intermedio de la azida (derecha) en el cristal de C-azida. Cuando se consideran las interacciones con el huésped surge otra peculiaridad. Los dos OH de la molécula, junto con una molécula de agua, forman un ciclo de enlaces de hidrógeno alrededor de un eje binario cristalográfico en el que los hidrógenos están desordenados al 50% en dos posiciones. Se puede decir que en el cristal se alternan al 50% los ciclos en los que los hidrógenos están dirigidos en un sentido o en el opuesto. Este desorden se representa en la Figura 2.30. Tabla 2.6 Parámetros de los enlaces de hidrógeno observados en el cristal del diéster del C-azida *Interacción dipolo-dipolo. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(7)-H...O(12) 2.769 157.52 2x OH(1)-H...O(7) 2.810 164.16 O(12)-H...O(12) 2.855 173.08 OH(2)-H...O(26b) 2.876 164.19 OH(2)-H...OH(1) 2.786 180.00 O(26b)...N(2) * 2.973 73 Fig.2.30. Vista del ciclo de enlaces de hidrógeno en el cristal entre C-azida y las dos moléculas de agua. 2.2.2 Monoderivado Colato-dietilfosfato, amC-dietilfosfato. Para la formación del enlace amida, que unirá las diferentes partes de la estructura molecular final, se emplea un activador de ácidos carboxílicos, el dietilcianofosfato (DEPC). En presencia de exceso del amino derivado, esta molécula es capaz de reaccionar con el átomo de nitrógeno para formar un enlace estable P-N. Como subproducto de esta reacción se obtiene un residuo biliar esterificado que está unido a través de la posición C3 (β) al DEPC, y al que se ha denominado amC-dietilfosfato (Figura 2.31). Los resultados del análisis de los cristales de este derivado de ácido cólico en forma de éster, obtenidos mediante dispersión de rayos X, se muestran a continuación. HO O O HO NH P O O O Figura 2.31. Estructura del éster derivado de ácido cólico amC-dietilfosfato. El cristal, recristalizado en metanol/agua, pertenece al sistema ortorrómbico P2 1 2 1 2 1 mientras que el obtenido en DMSO pertenece al sistema monoclínico P2 1 . En ambos casos el compuesto cristaliza con una molécula de disolvente (estequiometria 1:1). Los parámetros de las celdas se recogen en la Tabla 2.7. La Figura 2.32 muestra las vistas a lo largo de los ejes cristalográficos a, b y c del empaquetamiento cuando el huésped es agua. La disposición del compuesto en la red cristalina no origina estructura de bicapa pero presenta unos huecos en los que se incluye el huésped. La Figura 2.33 muestra las vistas a lo largo de los ejes cristalográficos a, b y c del empaquetamiento cuando el huésped es DMSO. En este caso tampoco hay una estructura de bicapa propiamente dicha, aunque se forman capas como muestra la vista a lo largo del eje c. La estructura generada con agua como huésped muestra una disposición en zigzag del amC-dietilfosfato que a lo largo de una dirección determinada forma ondas similares a las de estirar una hélice (Figura 2.34). Por otra parte, cuando el huésped es el DMSO, muestra una disposición alineada del compuesto pero alternando la posición de las caras α y β. Esto produce que cuando se busca la misma dirección en la que se observan las ondas 74 en la estructura cristalina con huésped de agua, se observen capas alineadas (Figura 2.35). Tabla 2.7 Parámetros de celda de cristales del éster amC-dietilfosfato, recristalizado en metanol/agua y en DMSO. Formula Empírica C29H52NO7P · H2O C29H52NO7P · C2H6OS Peso Molecular 575.70 635.81 Temperatura (K) 100(2) 120(2) Longitud de Onda (Å) 0.71073 0.71069 Sistema cristalino, grupo espacial Ortorrómbico,P212121 Monoclínico, P21 a (Å) 7.6084(5) 13.850(5) b (Å) 16.4239(10) 7.889(5) c (Å) 23.6781(13) 15.309(5)  (o) 90 90  (o) 90 93.225(5)  (o) 90 90 Volumen ( Å 3 ) 2958.8(3) 1670.1(13) Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 4, 1.292 2, 1.264 coeficiente Abso r ción (mm1 ) 0.143 0.193 F (000) 1256 692 Tamaño Cristal (mm 3 ) 0.73x0.22x0.08 0.46x0.26x0.04 Intervalo θ (datos) (o) 2.48-25.85 1.93-26.37 Intervalo de índices 0  h  9 0k20 0l28 -17  h  17 -9k9 0l19 Datos/restricciones/parámetros 3192/2/379 6814/6/396 Grado de ajuste en F 2 1.065 1.117 Índices R finales [I>2 (I)] R1 = 0.0302, wR2 = 0.0767 R1 = 0.0589, wR2 = 0.1455 Índices R (todos los datos) R1 = 0.0371, wR2 = 0.0825 R1 = 0.0888, wR2 = 0.1592 (a) (b) (c) Figura 2.32. Empaquetamiento del cristal obtenido en metanol/agua visto a lo largo del eje a, b y c del éster del amC-dietilfosfato. Si se centra la atención sobre la estructura que adquiere el resto de esteroide, el análisis de los ángulos de torsión de la conformación del anillo D, conduce en ambos casos (Tabla 2.8), a una disposición en β-sobre (Δ = 11.60º y ϕm = 46º para el cristal en metanol/agua y Δ =12.34 º y ϕm = 49.72º para el cristal en DMSO). Asimismo, en los dos casos, la cadena lateral adquiere una conformación tggg. 75 (a) (b) (c) Figura 2.33. Empaquetamiento del cristal del amC-dietilfosfato obtenido en DMSO visto a lo largo del eje a, b y c. Figura 2.34. Vista de las ondas que forma el cristal recristalizado en metanol/agua del amC-dietilfosfato cuando se observa desde una determinada dirección. Figura 2.35. Vista de las capas que forma el cristal recristalizado en DMSO del amC-dietilfosfato cuando se observa desde una determinada dirección. 76 Tabla 2.8. Valores de los ángulos de torsión más importantes del éster del amC-dietilfosfato. Ángulo de torsión  (°) Cristal en metanol Cristal en DMSO C17-C13-C14-C150 45.77 49.44 C13-C14-C15-C164 -34.13 -36.72 C14-C15-C16-C173 9.10 9.41 C15-C16-C17-C132 18.84 20.60 C16-C17-C13-C141 -38.70 -41.99 C13-C17-C20-C22 -178,96 178.29 C17-C20-C22-C23 -167.68 160.96 C20-C22-C23-C24 65.08 71.42 C22-C23-C24-O24a 44.60 -123.22 C3-N25-P-O27 -175.56 -19.90 En la red de enlaces de hidrógeno del cristal en metanol está presente el huésped que actúa como puente de unión que propaga la estructura. Cada molécula de agua interacciona con tres esteroides (Figura 2.36) y solo uno de los enlaces de hidrógeno es directo entre esteroides: el que se produce entre el oxígeno unido al fósforo y el grupo hidroxilo de la posición 12. Mientras el grupo hidroxilo de la posición 7 no forma enlaces de hidrógeno, el de la posición 12 lo hace de forma cíclica con otra molécula de esteroide y una de agua siguiendo el patrón O(12)-H...O=P-N-H...O(H)-H...O(12). Cada molécula de agua interacciona con tres moléculas a través del nitrógeno del enlace amida, el carbonilo terminal de la cadena lateral y con el hidroxilo de la posición 12. La Tabla 2.9 recoge los parámetros de los enlaces de hidrógeno que forman la red en ambos cristales. Figura 2.36. Red de enlaces de hidrógeno del amC-dietilfosfato con agua y vista del sistema cíclico de enlaces de hidrógeno entorno al grupo hidroxilo de la posición 12. Tabla 2.9. Valores de los ángulos y distancias de los enlaces de hidrógeno que forma la red del diéster del amCdietilfosfato en ambos cristales. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) (agua I )O-H...O(12) 2.777 166.35 (agua II ) O-H...O(24b) 2.838 171.94 RN-H...O(agua III ) 3.053 171.01 O(12)-H...O=P(EtO)2 R I 2.749 161.20 O(12) -H... O(RDEP) I 2.775 165.11 O(7)-H...O(RDEP) II 2.781 168.76 RN-H... DMSO 2.865 167.09 Sin embargo, en el cristal con DMSO la red de enlaces de hidrógeno es distinta con una única unión entre hospedador y huésped, por lo que no actúa como puente. Esta unión es a través del átomo de nitrógeno hacia el oxígeno del DMSO y con la misma orientación que los grupos metilo, casi el línea a éstos (distancias al plano C6-C13-C18 - 77 C19: del N = 0.023 Å y del O = 0.061 Å). Cada esteroide interacciona, vía el oxígeno unido al fosforo, con otros dos por medio de los hidroxilos en posición 7 y 12 (Figura 2.37). Figura 2.37. Red de enlaces de hidrógeno del compuesto amC-dietilfosfato con DMSO y vista de enlaces de hidrógeno en torno al fosforo y nitrógeno, y las posiciones 7 y 12 del esteroide. Esto implica que la estructura se propaga solo en dos dimensiones a través de los enlaces de hidrógeno (Figura 2.38). Por ello, las interacciones de corto alcance juegan un papel importante para que se propague la estructura en las tres dimensiones. Figura 2.38. Red de enlaces de hidrógeno del compuesto amC-dietilfosfato con DMSO. 2.2.3 Monoderivado amC-aminoisoftálico. A continuación se muestran los resultados obtenidos para el cristal del derivado del ácido cólico con los grupos ácidos protegidos en forma de diéster, en el que el residuo biliar está unido a través de la posición C3 (β) al ácido 5-aminoisoftálico y al que se ha denominado amC-aminoisoftálico (Figura 2.39). Figura 2.39. Estructura del amC-aminoisoftálico en forma de diéster. 78 El cristal, que se obtuvo gracias a la hidrólisis del enlace amida cuando se calienta la disolución para mejorar la solubilidad del dímero amC2-aminoisoftálico, fue recristalizado en metanol/agua. Cristaliza con una molécula de agua y pertenece al sistema monoclínico P21. Los parámetros de la celda se recogen en la Tabla 2.10. Tabla 2.10. Parámetros de celda del cristal del amC-aminoisoftálico, recristalizado en metanol/agua. Formula Empírica C34H50N2O7 Volumen ( Å 3 ) 3155.68(10) Peso Molecular 616.78 Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 4, 1.298 Temperatura (K) 100(2) Coeficiente Absorción (mm1 ) 0.092 Longitud de Onda (Å) 0.7107 F (000) 1336 Sistema cristalino, grupo espacial Monoclínico, P21 Tamaño Cristal (mm3) 0.21x0.1x0.05 a (Å) 13,608(3) Intervalo θ (datos) (o) 1.35-26.81 b (Å) 7,704(10) Intervalo de índices -17h17 -9k9 -38l38 c (Å) 30,284(5) Datos/restricciones/parámetros 7250/3/845  (o) 90 Grado de ajuste en F 2 1.011  (o) 96,345(10) Índices R finales [I>2(I)] R1 = 0.0518, wR2 = 0.0978  (o) 90 Í ndices R (todos los datos) R1 = 0.1016, wR2 = 0.1157 La Figura 2.40 muestra el empaquetamiento visto a lo largo de los tres ejes cristalográficos. La disposición del compuesto en la red cristalina origina una estructura de bicapa (Figura 2.40C). La capa hidrófoba está formada por la cara β del ácido biliar dejando los anillos aromáticos y los grupos más polares en la región hidrófila donde al mismo tiempo se incluye el huésped (agua). a b c Fig.2.40. Empaquetamiento del cristal visto a lo largo de los ejes a, b y c del diéster del amCaminoisoftálico. La estructura generada por amC-aminoisoftálico muestra que, en vez de generar grandes huecos en el empaquetamiento en la región hidrófila de la bicapa, las moléculas de agua forman enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilo O12 de cada esteroide situándose de forma intercalada entre los ácidos biliares. Dado que el cristal está 79 constituido por dos tipos de simetría molecular existen dos tipos de posición para el huésped (Figura 2.41), como se mostrará más adelante. Figura 2.41. Vista del cristal del diéster amC-aminoisoftálico mostrando la equivalencia simétrica de las moléculas del compuesto (verde y azul) y del agua (rojo y amarillo). Al centrar la atención sobre la disposición que cada molécula presente en el cristal, se observa la existencia de interacciones entre los anillos aromáticos del grupo sustituyente derivado del acido 5-aminoisoftálico. Las moléculas de cada par se sitúan de forma que el ángulo formado por los planos que contienen a los anillos aromáticos está muy próximo a 0º (Figura 2.42). Del mismo modo, el ángulo entre los planos del esqueleto del esteroide (definido por los átomos de carbono de los anillos del esteroide B, C y D y el C20 de la cadena lateral)122 de las dos moléculas resulta en una disposición casi paralela. Para diferenciar ambas simetrías se denominara molécula “A” a la destacada en verde y molécula “B” a la azul. Los ángulos entre el plano del esqueleto del esteroide y el anillo aromático de cada molécula son ligeramente distintos, 52.14 y 59.67º, lo que muestra sus diferencias estructurales (Figura 2.43). Esto supondrá valores de los ángulos de torsión y otros parámetros para cada tipo de simetría. Figura 2.42. Ángulo entre los planos de los residuos aromáticos (arriba) y entre los planos del esqueleto de los residuos de acido cólico de dos moléculas del diéster del amC-aminoisoftálico simétricamente distintas que interactúan a través de los anillos aromáticos (abajo). Los planos que contienen los esqueletos de esteroide se representan en azul y verde para diferenciar las simetrías. La posición de los centroides de los anillos aromáticos se indica con los círculos en rojo, y la distancia entre ellos se muestra en Å. 80 A B Figura 2.43. Ángulo formado por el residuo aromático y el esqueleto del esteroide de las dos moléculas del amC-aminoisoftálico simétricamente distintas. El color verde se corresponde con la molécula “A” y color azul con la denominada “B”. Tabla 2.11 Valores de los ángulos de torsión más importantes del diéster del amC-aminoisoftálico. Á ngulo de torsión A  (°) B  (°) C17-C13-C14-C15   0 46.08 47.56 C13-C14-C15-C16   4 -33.39 -37.82 C14-C15-C16-C17   3 7.29 13.27 C15-C16-C17-C13   2 20.83 15.67 C16-C17-C13-C14   1 -40.28 -38.46 C13-C17-C20-C22 -178.99 178.08 C17-C20-C22-C23 57.67 58.61 C20-C22-C23-C24 151.94 174.92 C22-C23-C24-O24a 147.83 -157.78 C3-N25-C26-C27 170.36 -173.16 Del análisis de los ángulos de torsión se deduce que la estructura del anillo D es muy similar en las dos moléculas de esteroide participantes en el cristal (Tabla 2.11) y las mayores diferencias se encuentran en la disposición de las cadenas laterales. La conformación del anillo D para la molécula A esta más próxima a media silla que en el caso de la molécula B, que está más próxima a β-sobre (Δ = 16.49o y ϕm = -46.56o para la A, y Δ = 2.38o y ϕm = -47.57o para la molécula B). Las cadenas laterales adquieren una conformación tggg en el caso de la simetría A y tgtg en el caso de la simetría B. La sustitución en el C3 se encuentra muy próxima a una conformación trans o estirada en ambos casos. Otra característica destacable de esta estructura cristalina es que cada sustituyente (C)3-aminoisoftálico se sitúa participando en ambos lados de la bicapa, cuyo espesor es 13.608 Å. En el margen superior derecho de la Figura 2.44 la bicapa incompleta muestra el emplazamiento del compuesto con la cara β a un lado, cruzando la región hidrófila y ubica los metilos del grupo éster del ácido 5-aminoisoftalico en el otro extremo de la bicapa. Cada molécula se une mediante enlaces de hidrógeno por la cara α a otras dos en un plano superior. Cada molécula se une a otras simétricamente equivalentes y en direcciones opuestas respecto a la de referencia (Figura 2.45). La red de enlaces de hidrógeno establecida es sencilla ya que solo intervienen las posiciones O(7)-H y O(12)- H de los grupos hidroxilo y el átomo de oxígeno del grupo amida que enlaza el sustituyente al esteroide. No participan en la red ni el grupo éster ni la amina de dicho grupo. Como cabría esperar, existen pequeñas diferencias entre las redes de enlaces de hidrógeno de cada simetría (Tabla 2.12). Para la simetría A la distancia donante-aceptor 81 varía en el intervalo 2.786-2.885Å, y para la simetría B entre 2.861-2.957Å. La molécula de agua se emplaza sobre la cara α del esteroide, uniéndose a este por la posición O(12) lo que conlleva a dos tipos de posiciones. La distancia del enlace de hidrógeno varia de 2.9 a 2.7 si se pasa de simetría A a B, y el ángulo aumenta de 114 a 158º. Figura 2.44. Esquema de formación de la estructura de bicapa en el cristal de amC-aminoisoftálico (en color verde y azul se representan las dos simetrías moleculares presentes en el cristal). Distancia en Å. Figura 2.45. Vistas de la red de enlaces de hidrógeno en el cristal del diéster del amC-aminoisoftálico. Desde el punto de vista de las interacciones intermoleculares existentes en la red cristalina originada, la interacción entre los anillos aromáticos de dos moléculas vecinas 82 juega un papel importante. Tal interacción, que tiene lugar entre moléculas simétricamente no equivalentes, es la responsable de que se extienda la estructura ya que, como se ha visto, la red de enlaces de hidrógeno se establece entre moléculas simétricamente equivalentes. Al analizar esta interacción con más detalle, se observa que los anillos aromáticos se encuentran desplazados entre sí, dando origen a interacciones del tipo π-π. Esto se explica mediante el modelo de Hunter-Sanders (Figura 2.46) que considera los compuestos aromáticos compuestos de un esqueleto σ (cargado positivamente) intercalado entre la nube π (cargada negativamente).123 Según este modelo, las interacciones resultantes de una orientación paralela de los anillos aromáticos y en línea, serian repulsivas, mientras que si se desplazan lo suficiente se producen interacciones atractivas. Esta disposición es la observada en la estructura del grafito (Figura 2.47). Los anillos hexagonales del grafito se disponen de forma que el centroide de cada uno se situa encima de un atomo de carbono de un anillo en la siguiente capa Tabla 2.12 Parámetros de los enlaces de hidrógeno de ambas simetrías observados en el cristal del diéster del amC-aminoisoftálico. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(agua) A -H...O(12) 2.949 114 O(7) A -H...O(26) 2.885 154 O(12) A -H...O(26) 2.786 160 O(agua) B -H ..O(12) 2.753 158 O(7) B -H...O(26) 2.957 161 O(12) B -H...O(26) 2.861 160 Figura 2.46. Esquema del modelo de Hunter-Sanders123 con el tipo de interacciones producidas. Figura 2.47. Estructura cristalina hexagonal del grafito y parámetros de la estructura cristalina. Para el compuesto que nos ocupa, un anillo aromatico se desplaza lateralmente de forma casi paralela respecto a otro anillo, favoreciendo que se produzca la interacción entre parejas de moléculas de distinta simetría (Figura 2.48a). Si se comparan los parametros obtenidos del cristal amC-aminoisoftálico con los del grafito, se observa que las distancias entre los anillos aromaticos es de 3.183 Å y 3.354 Å, respectivamente, valores perfectamente compatibles entre sí, lo que avala la existencia de una interacción -. 83 Figura 2.48. (a) Vista perpendicular al plano que contiene el anillo aromático de una de las moléculas con interacción π-π. (b) Ubicación de los enlaces de hidrógeno respecto de la simetría molecular y las interacciones π-π. (c) y (d) Vistas de la distribución en la bicapa de las parejas de anillos aromáticos. Distancias en Å. Las interacciones π-π desarrollan un papel decisivo en la arquitectura cristalina ya que son las responsables de la cohesión entre las moléculas de distinta simetría que forman una columna (Figura 2.48d). Se podría considerar que cada pareja de moléculas que interaccionan a través de sus anillos aromáticos se comporta como un dímero en el que los dos restos de esteroide están unidos mediante un puente covalente (vide infra). Como se mostrará más adelante, esta disposión de los restos de esteroide en lados opuestos de la bicapa tambien es característica del cristal del dímero (amC)2-succínico. La interacción de los anillos confiere estabilidad y, a priori, se podría conseguir mejorar las propiedades físicas relativas a su estabilidad mediante el aumento de la aromaticidad de una estructura molécular.124 2.2.4 Mono derivado C-tereftálico. A continuación se muestran los resultados obtenidos para los cristales del derivado de ácido cólico, en el que residuo biliar está unido a través de la posición C3 (β) por enlaces éster al ácido tereftálico, y al que se ha denominado C-tereftálico (Figura 2.49). Aun cuando se buscaba la cristalización del diéster del dímero C2-tereftálico, se encontró este monoderivado fruto de la hidrólisis del enlace éster cuando se calienta la disolución para mejorar la solubilidad. Los cristales obtenidos en una mezcla de acetato de etilo/metanol y en metanol/acetona/agua son muy similares y las diferencias en los valores de los parámetros estructurales de la celda unidad aparecen a partir del segundo decimal. El Ctereftálico cristaliza en el sistema monoclínico P21 y los parámetros de las celdas se recogen en la Tabla 2.13 La Figura 2.50 el empaquetamiento visto a lo largo de los tres ejes cristalográficos. Figura 2.49. Estructura del C-tereftálico en forma de diéster. 84 Tabla 2.13. Parámetros del diéster del C-tereftálico recristalizado en acetato de etilo/metanol (Cristal 1) y en metanol/acetona/agua (Cristal 2) Formula Empírica Cristal 1 Cristal 2 C34H48O8 C34H48O8 Peso Molecular 584.72 584.72 Temperatura (K) 120(2) 100(2) Longitud de Onda (Å) 1.5418 0.71073 Sistema cristalino, grupo espacial Monoclínico, P21 Monoclínico, P21 a (Å) 10.334(3) 10.3132(4) b (Å) 7.6197(2) 7.6139(2) c (Å) 19.4631(5) 19.4225(7)  (o) 90 90  (o) 101.26(10) 101.254(2)  (o) 90 90 Volumen ( Å 3 ) 1503.03(7) 1495.80(9) Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 2, 1.292 2, 1.298 Coeficiente Absorción (mm1 ) 0.735 0.09 F (000) 632 632 Tamaño Cristal (mm 3 ) 0.2x0.15x0.05 0.5x0.5x0.2 Intervalo θ (datos) (o) 0.96-74.50 2.01-28.27 Intervalo de índices -12  h  12 -9k9 0l23 -13  h  13 0k10 0l25 Datos/restricciones/parámetros 5828/1/393 3974/1/392 Grado de ajuste en F 2 1.094 1.081 Índices R finales [I>2(I)] R1 = 0.0424, wR2 = 0.1139 R1 = 0.0453, wR2 = 0.106 Índices R (todos los datos) R1 = 0.0429, wR2 = 0.1142 R1 = 0.0638, wR2 = 0.0979 La disposición del compuesto en la red cristalina no origina la estructura de bicapa dada la disposición que adquiere el grupo sustituido en posición 3 con respecto al esqueleto del esteroide (Figura 2.51). Las capas hidrófobas están interrumpidas por los anillos aromáticos y los grupos éster unidos a éstos, que las atraviesan. No se observa inclusión de ningún huésped y la distancia entre los anillos aromáticos descarta cualquier interacción entre ellos. a b c Figura 2.50. Empaquetamiento del cristal 1 del C-tereftálico a lo largo de los ejes a, b y c. 85 Figura 2.51. Izquierda: Ángulo formado por el plano del esqueleto del esteroide y el plano que contiene al anillo aromático. Derecha: Empaquetamiento (cristal 1) del diéster del C-tereftálico. El ángulo entre el plano del esqueleto del esteroide (vide supra) y el anillo aromático resulta en una disposición próxima a la perpendicularidad, 82.52º (para ambos cristales), que junto con la cadena lateral le confiere una disposición en zigzag. El análisis de los ángulos de torsión de la conformación del anillo D del esqueleto del esteroide conduce (Tabla 2.14) a una disposición más próxima a media silla que a β-sobre (Δ = 14.74º para ambos cristales y ϕm = 45.4º para el cristal 1 y 45.7º para el cristal 2). La cadena lateral adquiere una conformación tggg y la sustitución en el C3 se encuentra en una conformación trans o estirada. Tabla 2.14 Valores de los ángulos de torsión más importantes del diéster del C-tereftálico. Á ngulo de torsión  (°) (Cry. 1)  (°) (Cry. 2) C17-C13-C14-C15   0 45.03 45.40 C13-C14-C15-C16   4 -32.81 -33.05 C14-C15-C16-C17   3 7.80 7.92 C15-C16-C17-C13   2 19.50 19.72 C16-C17-C13-C14   1 -39.04 -39.25 C13-C17-C20-C22 172,99 172.77 C17-C20-C22-C23 -162.76 -162.61 C20-C22-C23-C24 63.67 63.96 C22-C23-C24-O24a -167.08 -167.18 C3-N25-C26-C27 178.93 179.01 La red de enlaces de hidrógeno en los cristales del C-tereftálico se reduce únicamente a un enlace entre los grupos hidroxilo de las posiciones 7 y 12 (Figura 2.52). Si se tiene en cuenta que la mayoría de los enlaces de hidrógeno de ácidos biliares que se encuentran en la bibliografía se producen entre las posiciones 3-7 y 3-12 resulta un comportamiento peculiar al considerar que se trata de un compuesto derivado del ácido cólico. El ángulo O(7)-H...O(12) es de 155.5º para el cristal 1 y 158.5º para el cristal 2, valores dentro de los recogidos para los enlaces de hidrógeno en los que intervienen grupos hidroxilo de ácidos biliares. Sin embargo, la distancia entre los átomos de oxígeno es relativamente grande (3.053 Å para el cristal 1 y 3.048 Å para el 2) cuando se las compara con las distancias de enlace de hidrógeno típicas de estos compuestos que no sobrepasan los 3 Å (Figura 2.53). 86 Figura 2.52. Vista de la red de enlaces de hidrógeno a lo largo de los ejes b (arriba) y a (abajo) del Ctereftálico. Como ya se ha mencionado, no existe interacción - entre los anillos aromáticos ya que la distancia más corta entre los centroides de los mismos es de 4.762 Å y ambos anillos forman un ángulo de 64.9º. Sin embargo podría existir una interacción de tipo - entre el hidrógeno aromático (en posición 3 respecto a la posición de unión al resto de esteroide) dado que la distancia es de 2.972 Å con el otro anillo. Un oxígeno de un grupo éster de otra molécula que se sitúa relativamente cerca, a 3.409 Å para cristal 1 y 3.401 Å para cristal. 2, podría relacionarse con una interacción entre la nube aromática del anillo con los electrones no enlazantes del átomo de oxígeno (Figura 2.54 arriba). Figura 2.53. Representación de la dispersión de distancias de enlace de hidrógeno de ácidos biliares, entre las posiciones O3-O7 y O3-O12 recogidos en la bibliografía. 2,500 2,625 2,750 2,875 3,000 3,125 0 5 10 15 20 3,05 Data O3-O7 Media = 2,74±0,09 Å O3-O12 Media = 2,79±0,07 Å Distancia O-H - -O (Å) 87 Los oxígenos de los grupos carbonilo unidos al anillo aromático de dos moléculas, esto es, el más cercano a la posición 3 del esteroide frente al más alejado (posición meta), pueden interactuar de forma dipolo-dipolo ya que están a una distancia de 3.525 Å (Figura 2.54 arriba). Todas estas interacciones de corto alcance (Figura 2.54 abajo) permiten la consolidación de una estructura cristalina estable. Esto también se manifiesta en la sencillez con que se obtienen cristales de este compuesto en comparación con otros derivados que, aun habiendo probado con numerosos disolventes, no se han obtenido cristales de calidad suficiente para su resolución por difracción de rayos X. Figura 2.54. Arriba: Distancias (Å) entre los anillos aromáticos entre si y los átomos de oxígeno más próximos del Cristal 2 del C-tereftálico. Abajo: Interacciones de corto alcance. 2.3 DÍMEROS CABEZA-CABEZA DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES Se comenzará este apartado, haciendo referencia a las estructuras cristalinas de dímeros de ácidos biliares ya resueltas con anterioridad en el presente grupo de investigación (Secciones 2.3.1 y 2.3.2) y determinadas mediante difracción rayos X. La numeración que se emplea para diferenciar cada resto de esteroide es la misma que se empleará para todos los dímeros estudiados en los siguientes apartados, utilizando los superíndices I y II para hacer referencia a cada una de las moléculas de esteroide del dímero de izquierda a derecha según la orientación de la celda cristalográfica. La numeración de los átomos de carbono del esteroide es la misma que la ya ofrecida para los otros derivados estudiados. 2.3.1 Dímero Colato-succínico-Colato, amC2-Succínico. Los resultados obtenidos para el cristal del dímero de ácido cólico en el que ambos residuos biliares están unidos a través de una cadena alquílica flexible procedente del 88 ácido succínico, y al que se ha denominado amC2-succínico (Figura 2.55), han sido presentados con anterioridad por el Dr. Víctor H. Soto en su Tesis doctoral realizada en este grupo de investigación.125 Figura 2.55. Estructura del dímero de ácido cólico amC2-succínico. No fue posible obtener el cristal del dímero en su forma ácida, pero si el correspondiente a su derivado éster dimetílico. El cristal, recristalizado en metanol, cristaliza con una molécula de agua, pertenece al sistema monoclínico P21 y los parámetros de la celda se recogen en la Tabla 2.15 Tabla 2.15. Parámetros de celda del cristal del diéster del amC2-succínico, recristalizado en metanol. a(Å) b(Å) c(Å) α(°) β(°) γ(°) 10.612(4) 22.603(9) 10.982(4) 90.000(5) 96.966(7) 90.000(5) La Figura 2.56 muestra sendas vistas a lo largo de los ejes cristalográficos a y b del empaquetamiento y la Figura 2.57 muestra la disposición del dímero en el cristal. a b Figura 2.56. Empaquetamiento del cristal del diéster del amC2-succínico visto a lo largo de los ejes a y b. El empaquetamiento a lo largo del eje b muestra la existencia de huecos donde se acomoda una molécula de agua. A la hora de comparar las posiciones relativas de los restos de esteroide dentro de la estructura, se determinó el ángulo entre los planos definidos por los 13 átomos de carbono de los esqueletos de los dos residuos esteroideos del dímero (anillos B, C y D). El bajo valor obtenido, 3.27º, indica que son prácticamente paralelos. Los planos anteriores formaron ángulos de 69.5º para el residuo I y 72.7º para el II, respecto al plano que contiene el puente succínico, lo que indica que las moléculas de esteroide están lejos de la perpendicularidad a dicho plano, o lo que es lo mismo, el plano que contiene el puente está en una posición sesgada respecto a los planos de los esteroides (Figura 2.57). 89 A) B) C) Figura 2.57. A) Planos casi paralelos de los dos residuos esteroideos del amC2-succínico. B) Ángulo formado por el residuo esteroideo I, con el plano del puente succínico. C) Ángulo del Plano de II con el plano del puente succínico. (Rojo esteroide I, azul esteroide II y en verde el plano del puente succínico). Del análisis de los ángulos de torsión, muy similares en las dos moléculas de esteroide participantes del dímero (Tabla 2.16), se dedujo que la conformación del anillo D es más próxima a β-sobre que a media silla (Δ = -7.10o y ϕm= 48.56o para la I, y Δ = 2.64o y ϕm = 48.15o para la molécula II). Tabla 2.16 Valores de los ángulos de torsión más importantes del diéster del amC2-succínico. Á ngulo de torsión  (°) Á ngulo de torsión  (°) C17-C13-C14-C15I0 48.47 C13-C17-C20-C22 I -175.33 C17-C13-C14-C15 II 48.14 C13-C17-C20-C22 II -178.70 C13-C14-C15-C16I4 -40.57 C17-C20-C22-C23 I -164.45 C13-C14-C15-C16 II -38.07 C17-C20-C22-C23 II -166.72 C14-C15-C16-C17I3 17.21 C20-C22-C23-C24 I -172.91 C14-C15-C16-C17 II 13.13 C20-C22-C23-C24 II -176.77 C15-C16-C17-C13I2 12.21 C22-C23-C24-O24a I -46.65 C15-C16-C17-C13 II 16.17 C22-C23-C24-O24a II -38.70 C16-C17-C13-C14I1 -36.31 C3-N25-C26-C27 I 177.84 C16-C17-C13-C14 II -38.45 C3-N25-C26-C27 II 178.61 Las cadenas laterales adquieren una conformación tttg, totalmente estirada excepto en lo que se refiere al enlace C23-C24. Por otra parte, la conformación gauche en torno al enlace C23-C24 es muy cerrada, y esto permite la participación del grupo carbonilo de la cadena lateral en enlaces de hidrógeno. La sustitución en el C3 se encuentra también en conformación trans o estirada. Otra característica destacable de esta estructura cristalina es que cada resto de esteroide del dímero se sitúa en lados opuestos de la bicapa, con los puentes de unión cruzando la capa hidrófila (Figura 2.58). El espesor de la bicapa es de 11.302 Å. Los átomos de oxígeno de los dos grupos amida del puente actúan como pinzas estableciendo enlaces de hidrógeno con los dos O(7)-H de los grupos hidroxilo (O(7)-H...O(26), 2.655– 2.672 Å que participan en la formación de un tetraedro (Figura 2.59). El puente se une a 90 una tercera molécula. Esos enlaces de hidrógeno junto con los que forman O(7)-aguaO(7) forman un ciclo. El ángulo medio tetraédrico resultó de 110±12º. Los enlaces de hidrógeno que estabilizan la estructura están resumidos en la Tabla 2.17. La estructura de pinza ayuda a fijar la distancia entre los dos núcleos de esteroide que encapsulan a la molécula de agua. Los dos centroides del esqueleto de esteroide (átomos de carbono C1/C5-C17) se alinean verticalmente cruzando el átomo de oxígeno de la molécula de agua (Figura 2.59), con una distancia de separación de 6.58 Å. Figura 2.58. Estructura de bicapa en el cristal de amC2-succínico (vista a lo largo del eje cristalográfico c). El recuadro muestra en detalle el espesor de la bicapa con el dímero localizado en lados opuestos de esta, con el puente de unión cruzando la capa hidrófila. Figura. 2.59. Enlaces de hidrógeno de (i) la molécula de agua central con los dos restos de esteroide pertenecientes a dos dímeros (ii) puente de un tercer dímero de esteroide [localizado detrás de los dos dímeros anteriores] formando una pinza, y (iii) N25–H...O24b que une mutuamente cada C24 del grupo carboxílico terminal de uno de los restos de colato con el átomo de nitrógeno del grupo amida más distante del puente del otro resto de colato. Se muestra también la localización de los dos centroides de los restos de esteroide participando en la formación del tetraedro. 91 Tabla 2.17 Enlaces de hidrógeno observados en el cristal del diéster del amC2-succínico. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(12)-H I ...O (agua) 2.936 (3) 174 (3) O(7)-H I ...O(26a) II 2.672 (3) 173 (3) N(25)-H I ...O(24b) I 2.958 (3) 163 (3) N(25)-H II ...O(24b) II (*) 2.982 (6) 2.941 (6) 170 (3) 173 (3) O(12)-H II ...O(agua) 2.935 (3) 162 (3) O(7)-H II ...O(26a) I 2.655 (3) 167 (4) O(agua)-H1...O(7) II 2.710 (3) 169 (3) O(agua)-H2...O(7) I 2.738 (3) 165 (3) (*) La duplicidad de valores es consecuencia del desorden que afecta a la parte final de la cadena lateral de la molécula II (y que no se da en el resto de la estructura). 2.3.2 Dímero Colato-fenilo(1,3)-Colato o amC2-Isoftálico. Los resultados obtenidos para el dímero del ácido cólico en el que ambos residuos biliares están unidos a través de un anillo aromático con los sustituyentes en posiciones 1 y 3, y al que abreviadamente denominaremos amC2-isoftálico (Figura 2.60), han sido presentados con anterioridad por el Dr. Víctor H. Soto en su tesis doctoral, realizada en este grupo de investigación.125 Figura 2.60. Estructura del dímero de ácido cólico amC2-isoftálico. Al igual que en el caso anterior, sólo se han podido conseguir cristales válidos, para el análisis de rayos X, para su diéster metílico y no para el diácido. El compuesto se recristalizó de acetato de etilo-metanol. El estudio de difracción de rayos X puso de manifiesto que pertenece al sistema monoclínico, grupo espacial P21 con parámetros de celda recogidos en la Tabla 2.18. Incluye acetato de etilo con una estequiometría 1:1 (Figura 2.61). El ángulo entre los planos de las dos moléculas de esteroide (definidos mediante los trece átomos de carbono de los anillos B, C y D) que conforman el compuesto es de 85.1º, indicando que, entre sí, están próximas a la perpendicularidad (Figura 2.62). Los planos anteriores forman ángulos de 69.2º y 87.6º respecto al plano del anillo bencénico, lo que muestra que una de las moléculas de esteroide es casi perpendicular a dicho plano pero la otra se encuentra relativamente lejos de esa disposición. Las cadenas que unen cada molécula de sal biliar al puente no se encuentran en una disposición idéntica, tal y como ponen de manifiesto los ángulos de torsión C3-N25-C26C27 de la Tabla 2.19. Esta tabla resume también los valores de los ángulos de torsión más importantes de la molécula, debiendo resaltar que los correspondientes a la secuencia C17-C20-C22-C23 ponen de manifiesto que la cadena lateral adopta una conformación trans en la molécula I y gauche en la II, a las que, más detalladamente, podemos referir como tttt para la molécula I y como tgtt para la II. 92 Tabla 2.18 Parámetros de celda del cristal del diéster del amC2-isoftálico, recristalizado de acetato de etilo/metanol que pertenece al grupo espacial P21. a(Å) b(Å) c(Å) α(°) β(°) γ(°) 7.5326(10) 22.6049(3) 16.9897(2) 90.000(5) 99.778(10) 90.000(5) Figura 2.61. Estructura del cristal del diéster del amC2-isoftálico, recristalizado de acetato de etilo/metanol, visto a lo largo de los ejes a (izquierda) evidenciando la estructura en zigzag y c (derecha) mostrando láminas paralelas. Figura 2.62. Ángulos formados por los dos residuos esteroideos del diéster del amC2-isoftálico entre sí (próximos a la perpendicularidad) y por cada uno con el plano del anillo aromático (rojo esteroide I, azul esteroide II y verde el residuo bencénico). Tabla 2.19 Valores de los ángulos de torsión del diéster del amC2-isoftálico. Á ngulo de torsión  (°) Á ngulo de torsión  (°) C17-C13-C14-C15I0 44.45 C13-C17-C20-C22 I 167.68 C17-C13-C14-C15 II 46.23 C13-C17-C20-C22 II 175.40 C13-C14-C15-C16I4 -28.61 C17-C20-C22-C23 I 47.49 C13-C14-C15-C16 II -35.57 C17-C20-C22-C23 II 162.28 C14-C15-C16-C17I3 1.39 C20-C22-C23-C24 I -158.83 C14-C15-C16-C17 II 10.80 C20-C22-C23-C24 II -177.21 C15-C16-C17-C13I2 25.88 C22-C23-C24-O24a I -171.93 C15-C16-C17-C13 II 17.60 C22-C23-C24-O24a II 165.94 C16-C17-C13-C14I1 -42.47 C3-N25-C26-C27 I 173.94 C16-C17-C13-C14 II -38.41 C3-N25-C26-C27 II 174.89 93 Por otra parte, los ángulos de torsión en el anillo D arrojan valores de Δ = 31.32º y ϕm = 46.16º para la molécula I y de Δ = 7.75º y ϕm = 46.34º para la II. La molécula I posee, por lo tanto, el anillo D con una conformación cercana a media silla, siendo más próxima a β-sobre en la molécula II (Tabla 2.19). La distancia entre las láminas, medida como distancia entre planos definidos por anillos bencénicos superpuestos, es 7.484 Å (Figura 2.63). Figura 2.63. Distancia entre láminas adyacentes el cristal del diéster del amC2-isoftálico. Los enlaces de hidrógeno que dan lugar a la estructura del cristal se recogen en la Tabla 2.20, junto con los valores de sus parámetros geométricos. Cabe resaltar aquí que los átomos de oxígeno carbonílicos de los grupos amida actúan, simultáneamente, como aceptores de los grupos hidroxilo en las posiciones 7 y 12, de dos moléculas distintas situadas en dos láminas adyacentes, facilitando con ello la unión entre las mismas (ver detalle de la Figura 2.64). A su vez, el grupo carbonilo del acetato de etilo es aceptor de los hidrógenos de los dos grupos amida. Tabla 2.20 Parámetros geométricos de los enlaces de hidrógeno observados en el cristal del diéster del amC2-isoftálico. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) N(25)-H II ...O=C(huésped) 3.265 (2) 175 (3) N(25)-H I ...O=C(huésped) 3.169 (2) 165 (3) O(12)-H II ...O(26a) I 2.881 (2) 156 (4) O(12)-H I ...O(26a) II 2.989 (3) 161 (5) O(7)-H I ...O(26a) II 2.966 (2) 146 (3) O(7)-H II ...O(26a) I 2.802 (2) 167 (4) A l comparar estos resultados se observa que en el caso del amC2-isoftálico, donde el puente es rígido, los restos de esteroide son casi perpendiculares mientras que para amC2succínico, donde el puente flexible, son casi paralelos. Este hecho lleva a esquemas de enlaces de hidrógeno diferentes. 94 Figura 2.64. Enlaces de hidrógeno formados entre los átomos de oxígeno de los grupos amida (aceptores) con los hidroxilos en posiciones 7 y 12 (donantes) de dos moléculas de dos láminas adyacentes (detalle) del cristal del diéster del amC2-isoftálico. 2.3.3 Dímero Desoxicolato-fenil(1,3)-Desoxicolato o DC2-Isoftálico. En este apartado se analizan los resultados obtenidos para el dímero del ácido cólico en el que ambos residuos biliares están unidos a través de un anillo aromático con los sustituyentes en posiciones 1 y 3. Su nombre abreviado DC2-isoftálico (Figura 2.65). Cabe destacar que los enlaces de unión al puente son tipo éster (es decir, se ha mantenido el grupo hidroxilo de la posición C3 del esteroide) y no amida, como en la mayoría de las moléculas estudiadas en nuestro grupo. La Tabla 2.21 recoge un resumen de los resultados obtenidos. Tabla 2.21 Datos de los cristales del nuevo dímero DC2-isoftálico. Formula Empírica C58H86O10 Compuesto 3 Peso Molecular 943.27 Temperatura (K) 293(2) Longitud de Onda (Å) 1.5418 Sistema cristalino , grupo espacial Monoclínico P21 a (Å) 7.6225(13) b (Å) 11.2669(9) c (Å) 31.7872(26)  (o)90  (o) 95.319(9)  (o) 90 Volumen ( Å 3 ) 2718.19(56) Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 2, 1.153 Coeficiente Abso r ción (mm1 ) 0.611 F (000) 1028 Tamaño Cristal (mm 3 ) 0.3x0.3x0.2 Intervalo θ (datos) (o) 1.29-26.43 Intervalo de índices -9  h  9 0k14 0l39 Datos/restricciones/parámetros 5870/1/613 Grado de ajuste en F 2 1.034 Índices R finales[I>2(I)] R1 = 0.0491, wR2 = 0.133 índices R (todos los datos) R1 = 0.0659, wR2 = 0.1443 95 Figura 2.65. Estructura del dímero derivado del ácido desoxicólico DC2-isoftálico. Como en casos anteriores, sólo se ha podido resolver la estructura cristalina para el diéster metílico y no para el diácido. El compuesto se cristalizó de acetato de etilometanol. Pertenece al sistema monoclínico, grupo espacial P21. En las Figuras 2.66 y 2.67 se muestran diferentes perspectivas de la estructura generada. El empaquetamiento en el cristal de DC2-isoftálico se describe mejor con parejas de moléculas de dímeros (Figura 2.68). Como la pareja se relaciona mediante un eje de tornillo de 180º, los correspondientes restos de esteroide de cada dímero se disponen en direcciones opuestas siguiendo un zigzag. Se debe mencionar que en cristal no existe ningún apilamiento de los grupos fenilo, ni presenta capas hidrofílicas-hidrofóbicas y, como ya se ha comentado, no alberga huésped en su estructura. Para describir la disposición molecular del dímero DC2-isoftálico dentro del cristal se comenzará midiendo el ángulo entre los planos que contienen los esqueletos de los dos grupos esteroide (definidos mediante los anillos B, C y D) que conforman el compuesto. Este ángulo, de 43.46º, da cuenta de la disposición en zigzag de la estructura cristalina. En la se puede observar que cada resto de acido biliar se orienta de forma distinta. Figura 2.66. Vista de la estructura del cristal del diéster del DC2-isoftálico a lo largo del eje cristalográfico a. Fig.2.67. Vista de la estructura del cristal del diéster del DC2-isoftálico a lo largo del eje cristalográfico b.  96 Fig.2.68. (Izquierda) Vista desde el eje cristalográfico a del empaquetamiento molecular en el DC2isoftálico. El eje de simetría de tornillo relacionando los dos dímeros aparece en rojo. (Derecha) Disposición molecular de los dímeros apuntando en direcciones opuestas. Los planos anteriores forman ángulos de 82.3º y 89.4º respecto al plano del anillo bencénico, lo que muestra que las moléculas de esteroide son casi perpendiculares a dicho plano (II más cerca que I; Figura 2.69). La estructura en que se orienta el puente, teniendo en cuenta los enlaces de unión a los esteroides, es similar a ambos lados de la molécula tal y como ponen de manifiesto los ángulos de torsión C3-N25-C26-C27 de la Tabla 2.22. Los ángulos de torsión C20-C22-C23-C24 muestran como la cadena lateral adopta una conformación trans en la molécula I y gauche en la II, a las que, más detalladamente, podemos referir como ttti (i: Intermedia entre gauche y trans) para la molécula I y como ttgc (c, cis) para la II. Esta disposición de la cadena lateral del esteroide II es inusual. A) B) C) Fig.2.69. A) Angulo formado por los dos residuos esteroideos del DC2-isoftálico. B) Angulo formado por el residuo esteroideo I, con el plano del residuo bencénico. C) Ángulo del Plano de II con el plano del residuo bencénico. (rojo esteroide I, azul esteroide II y en verde el plano del anillo bencénico). 97 Tabla 2.22 Valores de los ángulos de torsión del diéster del DC2-isoftálico. Á ngulo de torsión  (°) Á ngulo de torsión  (°) C17-C13-C14-C15I0 45.91 C13-C17-C20-C22 I -179.01 C17-C13-C14-C15 II 46.47 C13-C17-C20-C22 II -176.01 C13-C14-C15-C16I4 -34.07 C17-C20-C22-C23 I -168.77 C13-C14-C15-C16 II -34.56 C17-C20-C22-C23 II -163.59 C14-C15-C16-C17I3 8.74 C20-C22-C23-C24 I 177.11 C14-C15-C16-C17 II 9.20 C20-C22-C23-C24 II 61.47 C15-C16-C17-C13I2 19.15 C22-C23-C24-O24a I 120.22 C15-C16-C17-C13 II 19.24 C22-C23-C24-O24a II 27.47 C16-C17-C13-C14I1 -38.88 C3-O25-C26-C27 I -178.65 C16-C17-C13-C14 II -39.39 C3-O25-C26-C27 II -178.51 Al analizar los ángulos de torsión en el anillo D (Tabla 2.22), siguiendo el criterio de Altona et al se obtienen valores de Δ = 12.24º y ϕm = 46.17º para la molécula I y de Δ = 11.87º y ϕm = 46.72º para la II, estando muy próximos entre sí.120 Por lo tanto, ambos anillos D poseen una conformación parecida, más próxima a β-sobre que a media silla, aunque la disposición de las cadenas laterales I y II sea totalmente distinta una de otra. Solo hay un grupo hidroxilo (C12) capaz de ser donante por lo que la red de enlaces de hidrógeno es muy sencilla (Tabla 2.23). En una de las ramificaciones, este grupo hidroxilo se enlaza con un grupo carbonilo (O24b) de la cadena lateral totalmente extendida mientras el otro se enlaza a un grupo carbonilo del enlace éster de unión al puente (O26a). Tabla 2.23 Enlaces de hidrógeno en el cristal de DC2-isoftálico. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(12)-H I ...O(24b) I 2.850 (5) 149.6 (2) O(12)-H II ...O(26a) II 3.002 (4) 140.4 (2) 2.3.4 Dímero colato-urea-colato, amC2-urea. El último dímero del ácido cólico del que se han obtenido cristales de calidad suficiente para el análisis mediante rayos X, es aquel en el que ambos residuos biliares están unidos a través de un puente de urea. Abreviadamente se le denominará amC2-urea (Figura 2.70). Parece ser una constante el hecho de que sólo se obtienen cristales de este tipo de compuestos en su forma de éster metílico. Como anteriormente, sólo se ha podido resolver la estructura cristalina del diéster metílico y no el diácido. El compuesto se cristalizó en dimetilsulfoxido-metanol. Pertenece al sistema monoclínico, grupo espacial I2 (Tabla 2.24). Figura 2.70. Estructura del dímero de ácido cólico amC2-urea. La Figura 2.71 muestra una perspectiva de la estructura generada por este dímero en el que se observa como las caras α se orientan en el mismo sentido, dentro de cada  98 molécula, y se enfrentan a otras para formar enlaces de hidrógeno que estabilizan la estructura. La estructura está dispuesta en forma de bicapa, alternando regiones hidrófilas e hidrófobas (Figura 2.72, izquierda), con un espesor de 11.58 Å (Figura 2.73). Aunque los restos de esteroide no se orientan de forma paralela completamente (Figura 2.72 centro) estas regiones polares y apolares forman planos a lo largo del cristal de tal forma que los sustituyentes metilo, en las posiciones C10 y C13, se sitúan interdigitados. Dependiendo de la posición desde la que se observa el cristal, aparecen canales como en una estructura de tipo malla (Figura 2.72, derecha). Los puentes de urea de dos moléculas enfrentadas por su cara β se orientan de tal forma que el grupo carbonilo establece enlaces de hidrógeno con otra molécula en un plano superior y como los átomos de nitrógeno del puente de urea no intervienen en la red de enlaces de hidrógeno hace que se forme un hueco de 7.98.9 Å2 (Figura 2.73). Las dimensiones de estos huecos parecen apropiadas para albergar a uno o varios huéspedes y en su momento la densidad electrónica que estos podían aportar tuvo que ser ignorada para poder resolver la estructura en el momento de obtener el cristal. Sin embargo, la aparición de nuevo software ha permitido recalcular la estructura de este compuesto con los mismos datos de dispersión para poder localizar e identificar a los huéspedes en el cristal (Figura 2.73, abajo). Tabla 2.24 Datos de los cristales del nuevo dímero amC2-urea. Formula Empírica C51H84N2O9 Compuesto 4 Peso Molecular 869.2 Temperatura (K) 100 Longitud de Onda (Å) 1.5418 Sistema cristalino , grupo espacial Monoclínico I2 a (Å) 14.1524(5) b (Å) 7.8050(3) c (Å) 50.058(2)  (o)  (o) (o) 90 95.461(2) 90 Volumen ( Å 3 ) 5504.1(4) Z, densidad calculada (g/cm 3 ) 4, 1.049 Coeficiente Absorción (mm1 ) 0.56 F (000) 1904 Tamaño Cristal (mm3) 0.3x0.15x0.0 2 Intervalo θ (datos) (o) 1.8-65.5 Intervalo de índices -16  h  16 -9k8 0l58 Datos/restricciones/parámetros 9055/14/584 Grado de ajuste en F 2 1.26 Índices R finales[I>2(I)] R1 = 0.113, wR2 = 0.511 Índices R (todos los datos) R1 = 0.133, wR2 = 0.344 99 Figura 2.71. Vista del empaquetamiento molecular del amC 2 -urea a lo largo del eje b. Figura 2.72. Vista desde tres puntos diferentes de la estructura cristalina del amC 2 -urea. Figura 2.73. Arriba: Disposición molecular y dimensiones (Å) del hueco formado y espesor de la bicapa de la estructura cristalina del dímero amC 2 -urea sin considerar la contribución de los huéspedes. Abajo: Estructura recalculada que incorpora la contribución de los huéspedes (metanol, dimetilsulfoxido y agua deslocalizada) del cristal del amC 2 -urea. 100 Los huéspedes incluidos son metanol, dimetilsulfoxido y agua (muy deslocalizada ya que las posiciones que se muestran en la imagen, Figura 2.73 abajo, presentan una ocupación de un tercio). El metanol forma un enlace de hidrógeno con el dimetilsulfoxido y este con uno de los nitrógenos del puente de urea (concretamente con el resto de esteroide I). Por lo tanto, con la inclusión de los huéspedes aparece un mayor número de enlaces de hidrógeno pero los demás datos estructurales de la red permanecen prácticamente idénticos. Centrando la atención sobre la estructura molecular, el ángulo entre los planos que contienen los esqueletos de los dos grupos esteroide (definidos mediante los anillos B, C y D) es de 7.5º. La línea de corte de los planos anteriores se aleja claramente del centro de la molécula (Figura 2.74) lo que muestra que la molécula no guarda simetría entre un brazo y el otro. Los planos anteriores forman ángulos de 60.1º para I y 63.1º para II, respecto al plano que contiene el puente de urea, lo que muestra que las moléculas de esteroide están en una posición sesgada respecto al plano que contiene el puente (urea). A) B) C) Figura 2.74. A) Ángulo formado por los dos residuos esteroideos del amC2-urea. B) Ángulo formado por el residuo esteroideo I, con el plano del puente de urea. C) Ángulo del Plano de II con el plano del puente de urea. (Rojo esteroide I, azul esteroide II y en verde el plano del puente de urea). Los ángulos de torsión C3-N25-C26-N25, que definen la orientación del puente, no guarda simetría a ambos lados de la molécula. Esta situación es muy parecida a la ya encontrada con el dímero amC2-succínico. Los ángulos de torsión C20-C22-C23-C24 muestran cómo las cadenas laterales adoptan una conformación trans tanto en el residuo I como en el II (Tabla 2.25). Más detalladamente, podemos describir la disposición de la estructura como titt para I y como ttti para II. Tabla 2.25 Valores de los ángulos de torsión del diéster del amC2-urea. Á ngulo de torsión  (°) Á ngulo de torsión  (°) C17-C13-C14-C15I0 47.33 C13-C17-C20-C22 I -170.85 C17-C13-C14-C15 II 46.80 C13-C17-C20-C22 II -176.39 C13-C14-C15-C16I4 -35.67 C17-C20-C22-C23 I -158.14 C13-C14-C15-C16 II -33.99 C17-C20-C22-C23 II -172.59 C14-C15-C16-C17I3 8.26 C20-C22-C23-C24 I -174.07 C14-C15-C16-C17 II 7.41 C20-C22-C23-C24 II 173.96 C15-C16-C17-C13I2 21.54 C22-C23-C24-O24a I -173.48 C15-C16-C17-C13 II 22.10 C22-C23-C24-O24a II 166.83 C16-C17-C13-C14I1 -41.59 C3-N25-C26-N25 I -173.87 C16-C17-C13-C14 II -41.87 C3-N25-C26-N25 II 165.62 101 Al analizar los ángulos de torsión en el anillo D (Tabla 2.24) se obtienen, como en el caso del dímero anterior, valores de Δ = 15.01º y ϕm = 47.73º para la molécula I y de Δ = 17.81º y ϕm = 47.37º para la II, próximos entre sí. Por lo tanto, ambos anillos D poseen una conformación más cercana a β-sobre que a media silla. Tabla 2.26 Enlaces de hidrógeno en el cristal de amC2-urea. D-H...A d(D...A) (Å) <DHA (o) O(12) I -H...O(24b) II 2.906 (3) 129.76 (5) O(7) I -H...O(24b) II 2.933 (2) 144.62 (3) O(12) II -H...O(26a) I 2.760 (2) 157.67 (4) O(7) II -H...O(26a) I N(3)I-H...O(DMSO) MeO-H...O(DMSO) 2.704 (2) 2.919 2.585 154.26 (4) 137.93 172.83 Los datos obtenidos para el cristal del amC2-urea muestran que la red de enlaces de hidrógeno es sencilla (Tabla 2.26) y que los átomos de nitrógeno no participan. Cada unidad de dímero se une por la cara α mediante ocho enlaces de hidrógeno (Figura 2.75), a través de los grupos hidroxilo y del grupo carbonilo del puente de urea, a dos unidades en la cara opuesta de la bicapa. La naturaleza del átomo de oxígeno, que interviene en la formación del enlace de hidrógeno, permite que se alterne como donante y aceptor entre los cuatro enlaces que se establece con cada dímero vecino. Las moléculas miran en direcciones opuestas respecto a las que están en el plano inferior o superior de modo que el esteroide I forma enlaces de hidrógeno con dos esteroides II de dos dímeros en la otra capa (Figura 2.76). Figura 2.75. Red de enlaces de hidrógeno de la estructura cristalina del amC2-urea: cada molécula (molécula central en negro) establece ocho enlaces de hidrógeno con dos moléculas de la cara opuesta de la bicapa. 102 Respecto a la molécula de referencia, únicamente se producen enlaces de hidrógeno con dos moléculas, y gracias a las interacciones dipolo-dipolo originadas por los dos carbonilos en las colas éster del compuesto, la estructura se propaga uniéndose a dos muevas moléculas. A B Figura 2.76. Vista de la red de enlaces de hidrógeno que cada molécula del dímero amC2-urea establece por cada lado. (En color negro la molécula de referencia y I-II son los restos del esteroide al que pertenece el átomo de oxígeno). 2.4 NUEVO SISTEMA DE COORDENADAS INTERNAS PARA DÍMEROS DE ESTEROIDES. Después de presentar y comentar, de una forma clásica, las características de los cristales de cuatro dímeros, dentro de esta nueva familia de moléculas, surge la necesidad de establecer un sistema de coordenadas internas que describan, de una forma sencilla y eficaz, la orientación relativa en el espacio de los dos restos de ácidos biliares dentro de la molécula. Dado que el núcleo del esteroide es rígido, para posicionar cada brazo de la estructura, únicamente se requieren tres átomos (no enlazados directamente). El átomo de carbono C3 (con un grupo hidroxilo en posición  en las sales biliares naturales), y C10 y C13 (con grupos metilo en posición ) son tres puntos de referencia útiles para este propósito. También son fácilmente visualizables dentro del esqueleto del esteroide. Por otro lado, estos átomos han sido utilizados para definir el plano vertical del núcleo de esteroide.122 Para describir la orientación relativa de los dos restos de esteroide son necesarios cinco ángulos: tres de ellos de torsión o dihédricos, i (i=1-3), y dos ángulos comunes, i (i=1-2) (Figura 2.77). Como se trabaja con seis átomos de carbono, los confórmeros del n-hexano serán una referencia, pero esta analogía tiene algunas restricciones. Por ejemplo, dependiendo del tamaño del puente de enlace, algunas orientaciones espaciales pueden ser imposibles. Los valores de i no están restringidos como en el caso de ángulos de enlace en el n-hexano. Sin embargo el ángulo que forman C3-C10-C13 es fijo dado que pertenece al esqueleto rígido del esteroide. Tiene un valor medio de 124±3º (estimado a partir de los datos de 103 varios cristales de ácidos biliares). La distancia entre cada átomo de carbono C3 de ambos restos biliares permitirá localizar los esteroides en el espacio. Figura 2.77. Ángulos de torsión y comunes necesarios para definir la posición relativa de los dos restos de esteroide en los dímeros. Se puede adoptar la nomenclatura e (eclipsada), g (gauche) y t (anti) para 0, 90 y 180º los valores que pueden adoptar los ángulos de torsión. Por ello se pueden dibujar 333 confórmeros, pero si los dos restos de esteroide tienen los mismos parámetros geométricos (lo que es factible al menos en lo que se refiere a sus valores promedio) y si el puente es simétrico, el número de confórmeros se ve reducido sustancialmente. Como ejemplos, la Figura 2.78 muestra la disposición espacial de los confórmeros ttt, ggg y eee. Las estructuras intermedias se indicarán con i y dos subíndices relativos a los dos confórmeros más cercanos. Con estas premisas en mente, se puede clasificar cualquier dímero cabeza-cabeza. Figura 2.78. Confórmeros ttt, ggg y eee para los dímeros cabeza-cabeza de ácidos biliares. Las Figuras 2.79-2.82 muestran perspectivas de la orientación relativa de los dos restos de esteroide en el cristal para cada compuesto estudiado. Algunos de los valores distintivos de distancias aparecen en las imágenes y los valores de los ángulos comunes y de torsión aparecen en la Tabla 2.27. C13 II C13 I C10 I C10 II C3 II C3 I  1  1  2  3  2 puente esteroideIesteroideII 104 Figura 2.79. Arriba: Perspectiva del confórmero del amC2-urea. Abajo: Distancias (Å). Figura 2.80. Arriba: Perspectiva del confórmero de amC2-succínico. Abajo: Distancias (Å). Figura 2.81. (Izquierda) Perspectiva del confórmero del amC2-isoftálico. (Derecha) Distancias (Å). C13 II C13 I C10 I C10 II C3 II C3 I 3.030 3.028 12.707 8.259 105 Figura 2.82. (Arriba) Perspectiva del confórmero del DC2-isoftálico. (Abajo) Distancias (Å). Tabla 2.27. Valores experimentales de las distancia entre los átomo de carbono C3 de los restos de esteroide, ángulos de torsión (i ; i=1-3), y ángulos comunes (i; i=1-2) para los cuatro dímeros estudiados. Distancias y ángulos amC2-urea amC2-succínico amC2-isoftálico DC2-isoftálico d(C3 I -C3 II )/ Å 4.930 8.259 7.549 9.713 1(C3II-C3I-C10I)/º 130.26 124.9 76.9 165.6 2 (C10II-C3II-C3I)/º 127.71 124.9 74.6 156.1 1(C10IC3IC3II-C10II)/º 8.94 -161.6 -6.1 -169.0 2(C13IC10I-C3I-C3II)/º 175.75 172.2 172.8 -53.8 3(C3I-C3II-C10II-C13II)/º 175.52 166.5 -179.3 -43.5 De los datos obtenidos y las perspectivas moleculares mostradas en las imágenes anteriores, se puede deducir que los confórmeros que se han obtenido corresponden con ttt (amC2-succínico), tet (amC2-isoftálico), ett (DC2-isoftálico) y ett (amC2-urea). Los cuatro cristales presentan valores próximos de 1 y 2. La conformación ttt en amC2succínico significa que barriga y espalda están situadas en dirección contraria como ya ha sido comentado anteriormente. El confórmero tet del amC2-isoftálico tiene las espaldas orientadas hacia la misma dirección, sin estar paralelas, dados los valores de los ángulos 1 y 2. De estar los dos restos de esteroide en disposición paralela, estos ángulos deberían ser inferiores al menos a 34º. Las diferencias entre i junto con el ángulo de torsión 2, que implica la torsión a través de C3I-C3II para estos cuatro cristales, da evidencias de la secuencia de distancias entre los átomos de carbonos C10I-C3I-C3IIC10II. En amC2-urea y amC2-isoftálico, estos átomos de carbono forman un trapecio casi plano y regular. En el caso del amC2-urea (Figura 2.79), el valor de d(C10I-C10II) es mayor que d(C3I-C3II) y, por el contrario, para en el amC2-isoftálico, d(C10I-C10II) es menor que d(C3I-C3II) (Figura 2.81). Sin embargo, en el amC2-succínico y en el DC2isoftálico tal trapecio no existe, dada la planaridad de las coordenadas de los átomos elegidos, y se forman dos triángulos virtuales (Figura 2.80 y Figura 2.82). En el caso del amC2-isoftálico, la disposición tet del confórmero implica que los dos restos de esteroide se disponen en forma de “V” con las caras β de esteroide apuntando hacia la superficie cóncava hidrófoba. El anillo A y los dos grupos metilo (C19) junto con el puente forman una imagen especular. El huésped (acetato de etilo) se localiza entre las C13 II C13 I C10 I C10 II C3 II C3 I 2.989 3.001 15.475 9.713 106 capas “V” a lo largo del eje a, con los grupos metilo de la estructura huésped insertados entre dos restos aromáticos (vértice de la “V”; Figura 2.81). Estos anillos se sitúan a una distancia de 7.484 Å, y las distancias de los hidrógenos (CH3)/anillo rondan los 2.9-3.3 Å, permitiendo una interacción - que estabiliza el empaquetamiento. El átomo de carbono de estos grupos metilo forma casi una línea recta con los centroides de los dos grupos fenilo. El ángulo centroide-átomo de carbono-centroide es 159º. El grupo carbonilo del huésped se orienta hacia los dos átomos de nitrógeno de los enlaces amida formando enlaces de hidrógeno y fijando la posición de la molécula. Tabla 2.28 Secuencia de distancias entre los átomos de carbono C10I-C3I-C3II-C10II. Dímero d(C10I-C3I)/Å d(C3I-C3II)/Å d(C3II-C10II)/Å d(C10IC10II)/Å amC2-urea 3.052 4.930 3.060 8.783 amC2-succínico 3.030 8.259 3.028 12.707 amC2-isoftálico 3.037 7.549 3.031 6.062 DC2-isoftálico 2.989 9.713 3.001 15.475 Los confórmeros ett del DC2-isoftálico y amC2-urea son muy diferentes entre sí. El primero tiene ángulos 1 y 2 altos lo que, junto con los ángulos de torsión 1 y 3, implica que los dos restos de esteroide se sitúan casi perpendiculares uno respecto al otro. El ángulo entre los dos planos verticales de 87.7º también lo confirma. Ahora los cuatro átomos de carbono (C10I, C3I, C3II, C10II) están casi en línea dado que d(C10I-C10II) = 15.475 Å está cerca de la suma d(C10I-C3I)+ d(C3I-C3II) + d(C3II-C10II)=15.703 Å (véase la Tabla 2.28), y los valores de 1 and 2 están cerca de 180º. La orientación α del sustituyente en la posición C3 de DC2-isoftálico hace que sea una gran diferencia estructural respecto a la β de los amida derivados. Esto claramente afecta a los valores de i y probablemente facilita la orientación lineal de los cuatro átomos de carbono C10I, C3I, C3II, C10II. El puente diéster es casi plano, incluso más que el puente diamida en amC2-isoftálico. Estos dos hecho sugieren que el efecto de la orientación (α o β) del enlace es más importante que el efecto del grupo orgánico sin llegar al extremo del amC2urea como se verá a continuación. En el caso del confórmero ett del amC2-urea, los ángulos 1 y 2 están próximos a los del confórmero ttt del amC2-succínico. Sin embargo los ángulos i implican una posición casi paralela de los esteroides entre sí. Estructuralmente hablando, este dímero tiene unas características especiales pues el puente de unión entre los residuos biliares es la unidad molecular más reducida para tenerlos unidos mediante enlaces amida, por lo que los dos restos de esteroide están más limitados espacialmente. Así, al ser tan reducida la distancia entre las dos ramificaciones de la molécula (el valor de la distancia C3-C3' es menos del la mitad de los valores para los otros dímeros, Tabla 2.28) y que la estructura de la urea es plana, la disposición espacial mutua se ve muy restringida en comparación con la de los otros dímeros. En este caso cada brazo de esteroide puede girar en torno al enlace en posición β del C3-N, pero sus posibilidades de torsión se ven disminuidas. Esto favorece que ambas partes de la molécula se alineen de forma casi paralela, aunque la disposición no es simétrica (Figura 2.83). En definitiva, se puede concluir que los cinco ángulos i y i definen cualquier confórmero y que es posible valor muy diferentes para dímeros de esta naturaleza. Como no han sido publicados más cristales de dímeros cabeza-cabeza de ácidos biliares, no es posible presentar una discusión más general. 107 Figura 2.83. Perspectiva del confórmero del amC 2 -urea y el plano que contiene al sistema N-CO-N en verde. 2.5 C ÁLCULO D EL Á REA D E L A S ECCIÓN M OLECULAR D EL R ESTO D E Á CIDO B ILIAR . El área de la sección molecular de un compuesto se estima a partir de su estructura. Tanto la modelización como la resolución de estructuras cristalinas mediante difracción de rayos X han sido empleados con anterioridad, para el cálculo de dicha área, lo que ha sentado las bases para el estudio de las sales biliares desde diferentes campos. La actividad biológica, la surfactancia y los fenómenos de agregación de estos compuestos están relacionados con la conformación que adquiere la estructura anfipática del ácido biliar. Se ha establecido que la cara hidrófila α es convexa y la hidrófoba cóncava (Figura 2.84). Con el paso del tiempo el número de estructuras cristalinas resueltas mediante rayos X de ácidos biliares y derivados ha aumentado considerablemente. Esto genera una base de datos de la que pueden extraerse los valores medios para esta familia de compuestos que permitan predecir parámetros estructurales para compuestos de los que no se tienen cristales resueltos. La utilización de este tipo de datos implica que la molécula se encuentra en estado sólido y, en algún caso, la temperatura de trabajo fue reducida hasta los 100 K. Es de esperar que la estructura de la molécula en disolución y a temperatura de 298 K varíe ya que, por ejemplo, la cadena lateral es flexible, pero considerando la rigidez del esqueleto policíclico de los esteroides estos cambios, como se verá posteriormente, pueden ser despreciados. Figura 2.84. Perspectiva del 3-β-aminocolato mostrando las caras α y β. A la hora de comparar el área de la sección molecular de distintos esteroides ha de tomarse una posición de referencia común para todos ellos. La parte hidrófila varía de unos ácidos biliares a otros, tanto en número de grupos hidroxílicos como en su posición, y no resulta pues idónea para una comparación. La parte hidrófoba de la molécula es una característica general para todos los ácidos biliares y condiciona su comportamiento cuando se encuentra en una interfase, dada su tendencia en disoluciones acuosas a 108 orientarse hacia la fase aérea. Como referencia se orienta la molécula con los tres anillos B, C y D en dirección al lector, de modo que la cara β del acido biliar queda expuesta (Figura 2.85). Al mismo tiempo se busca que el plano del papel se corresponda con el plano horizontal del núcleo esteroide.122 Figura 2.85. Plano horizontal del esteroide (correspondiente al plano del papel) y los puntos de referencia del esqueleto biliar utilizados para el cálculo de distancias. Así que el primer paso para calcular el área consiste en determinar el mencionado plano para cada compuesto, al mismo tiempo que se deben localizar dos átomos contenidos en el mismo, medir la distancia entre ellos (en Å) para definir una escala de referencia al procesar la imagen digitalmente. Solo se considerara la estructura del esteroide y se ignorara aquellas partes de la molécula que no interesen. La imagen obtenida de la molécula en la posición definida se pasa a 2D y se calcula el área del contorno de la silueta generada. De este modo se han estimado las áreas de tres secciones de la molécula. El área A se refiere a la estructura completa del esteroide sin el grupo carboxílico. El área B se refiere al esqueleto del esteroide sin cadena lateral y con la posición C3 libre (es decir, sin sustituyentes añadidos). El área C es la vista frontal de la molécula, obtenida por un giro de 90º hacia el lector. En este caso, como distancia de referencia, se toma la distancia entre los átomo C13 y C19 (correspondiente al grupo metilo; Figura 2.86). Se han comparado las áreas obtenidas de 29 cristales de diferentes sales biliares y derivados. Los datos para compuestos dihidroxílicos se recogen en la Tabla 2.29. Los ácidos chenodesoxicólico, ursodesoxicólico y desoxicólico así como sus isómeros muestran unos valores de áreaA comprendidos entre 100 y 110 Å2, según la localización y la orientación de los grupos hidroxilo. Sólo cuando la cadena lateral se encuentra plegada el área puede bajar hasta 95 Å2 como en el caso del ácido desoxicólico. El áreaB muestra unos resultados menos dispersos, al eliminarse el factor “cola”, pero el efecto de los sustituyentes en β puede elevar el área hasta 87 Å2 (isodesoxicólico). El valor del áreaC está más afectado por la posición de la cadena lateral y esto hace que su variabilidad entre los diferentes ácidos biliares sea mayor. Análogamente, la Tabla 2.30 recoge los derivados del ácido cólico, los cuales muestran el mismo comportamiento de la tabla anterior. Por eso, es lógico incluir todos estos resultados para calcular el valor del área promedio forma general de un resto de un acido biliar. 109 Figura 2.86. Perspectivas (spacefill) del resto de acido cólico en el cristal de amC 2 -urea Ilustración del paso de 3D a 2D. Tabla 2.29 Áreas estimadas de compuestos derivados de ácidos biliares de distinta naturaleza. Compuesto Posición sustituida C3 C7 C12 Posición Cola Á rea A (Å 2 ) Á rea B (Å 2 ) Á rea C (Å 2 ) Ac. Quenodesoxicólico α α - estirada* 99 81 52 Ac. Isoquenodesoxicólico β α - estirada 110 82 51 Ac. Ursodesoxicólico α β - estirada 101 85 59 Ac. isoursodesoxicólico β β - estirada* 104 82 52 Ac. Desoxicólico α - α plegada 95 81 55 Ac. Isodesoxicólico α - β plegada 100 87 56 3 β -12 α β - α estirada 109 83 50 3 β -12β β - β estirada* 100 82 56 3α-12-α amino24 carbamato α α - - α α Estirada estirada* 105 108 83 82 52 61 DC 2 -isoftálico (DCI) (DCII) β β - - α α plegada estirada 97 101 82 82 47 45 El valor medio obtenido (Figura 2.87) para un ácido biliar muestra un área de sección molecular (áreaA) de 103.1±4.0 Å2, valor que está un poco por encima de lo establecido en la literatura (entre 85-95 Å2). El área del resto de acido biliar sin cadena lateral y con la posición C3 libre (áreaB) muestra un resultado más homogéneo de 82.1±1.6 Å2. La sección frontal (áreaC) tiene un valor medio de 51.1±3.2 Å2. Estos resultados pueden aplicarse a otros compuestos de la misma naturaleza para poder estimar el área de la sección molecular cuando no se dispone de datos de difracción de rayos X. Para aquellas secciones de la molécula que no son parte del esteroide, como los puentes de unión, se harán extrapolaciones con fragmentos de la misma estructura de compuestos cristalizados de diferente procedencia (Tabla 2.31). En unos casos se ha utilizado cristales resueltos en el presente grupo de investigación pero también se ha recurrido a la bibliografía cuando ha sido necesario. El error que se pueda cometer a la hora de utilizar estos resultados promedio para compararlos con los valores de las áreas superficiales obtenidas a través de la isoterma de Gibbs de los datos de tensión superficial, puede ignorarse por cuanto que sólo se pretende diferenciar entre las distintas posiciones que la molécula puede adquirir en la interfase y la diferencia entre tales valores es claramente superior al error que pudiera cometerse mediante el proceso de cálculo comentado. Los oligómeros de sales biliares que se 110 expondrán en esta tesis muestran unas aéreas estimadas de la molécula estirada considerablemente grande (Tabla 2.32), como cabría esperar. Tabla 2.30 Áreas calculadas de compuestos derivados del ácido cólico. Compuesto Posición sustituida C3 C7 C12 Posición Cola Á reaA (Å2) Á reaB (Å2) Á reaC (Å2) Ac. 3β-aminocólico β α α estirada 108 81 48 Ac. 24-aminocólico carbamato α α α α α α estirada estirada 104 112 83 83 50 51 amC-dietilfosfato 1 2 3 β α α plegada plegada plegada 101 102 102 82 83 83 52 51 50 Ac. 3β Adam-cólico β α α estirada* 101 81 49 Ac. 3β suc-cólico β α α estirada 107 82 48 Ac. 3β Phcólico β α α plegada 100 80 52 amC-aminoisoftálico β α α plegada 101 83 54 Ac. 3β (1-4Ph)-cólico β α α plegada 98 83 50 Ac. 3 β-norvonano-cólico (acetona) (DMSO) (propanol) β α α estirada* estirada estirada* 108 107 98 81 80 80 50 49 53 Ac. 3β-terbutil-cólico β α α estirada 104 84 50 Ac. 3β-terbutifenil-cólico (acetona) (Clorobenceno) β α α estirada estirada* 101 104 80 82 50 50 amC2-CO (CI) (CII) β β α α α α estirada estirada 103 107 82 83 50 48 amC2-succínico (CI) (CII) β β α α α α estirada estirada 103 103 79 80 49 50 amC2-isoftálico (CI) (CII) β β α α α α estirada* estirada 100 107 82 83 49 49 95 100 105 110 0 2 4 6 8 10 Data ( Å2)79 80 81 82 83 84 85 86 87 0 2 4 6 8 10 ( Å2) Data Á reaA = 103,1 ±4.0 ( Å 2 ) Á reaB = 82,1 ±1,6( Å 2 ) 45 50 55 60 0 5 10 Data ( Å2) ÁreaC = 51,1±3,2 (Å2) Figura 2.87. Histogramas de dispersión de datos de las tres aéreas consideradas. 111 Tabla 2.31 Áreas estimadas de los distintos puentes a partir de fragmentos de las estructuras de otros cristales. diácido Puente Ref. Á reaT (Å2) Á rea * (Å2) Ac. Iminodiacético Ac. Succínico suc-aminocolato 33 28 Ac. 5-aminoisoftálico monoarbac NUK431 52 51 Ac. Tereftálico Monoaromatico 1-4 NUK431 47 46 47 Ac. isoftálico DC-Ph ( 1 , 3 ) -DC 47 Protoporfirina (IX) CCDC-813456 126 jo201568_si_002127 173 176 62 tetrafenilporfirina TPP (197.0± 4.3 Å2) CCDC-727779 128 CCDC-727780128 CCDC-727781128 CCDC-727782128 CCDC-727783128 CCDC-727784128 CCDC-727785128 CCDC-727786128 CCDC-612946129 CCDC-612489130 CCDC-151412131 203 195 199 198 195 191 195 199 192 203 203 83 88 88 92 Tabla 2.32 Áreas estimadas de oligómeros derivados del ácido cólico a partir de valores estándar. Compuesto Nº de restos biliares (x103 Å2) Á rea puente (Å2) Á reaTotal (Å2) amC2-iminodiacético 2 33 239 amC2-aminoisoftálico 2 52 258 amC2-protoporfirina 2 175 381 amC2, 24 C -aminoisoftálico 3 51 360 amC2, 24 amC-aminoisoftálico 3 51 360 (amC2-aminoisoftálico)2-tereftálico 4 (52x2)+47 563 amC4-TPPorfirina 4 197 609 Bibliografía (1) Mylius, F. Ber. 1887, 20, 1968. (2) Latschinoff, P. Chem. Ber. 1885, 18, 3039. (3) Wieland, H.; Sorge, H. Z. Physiol. Chem. 1916, 97, 1. (4) Kratky, O.; Giacomello, G. Monatsh 1936, 69, 427. (5) Rheinboldt, H.; O. König, O.; Otten, P. Ann 1929, 473, 249. (6) Sobotka, H. Naturwiss 1931, 19, 595. (7) Popovitz-Biro, R.; Chang, H. C.; Tang, C. P.; Shochet, N. R.; Lahav, M.; Leiserowitz, L. Pure Appl. Chem. 1980, 52, 2693. (8) Chang, H. C.; Popovitz-Biro, R.; Lahav, M.; Leiserowitz, L. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 614. (9) Aoyama, H.; Miyazaki, K.; Sakamoto, M.; Omote, Y. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1983, 333. 112 (10) Chang, H. 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Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 3257. (96) Harada, J.; Ogawa, K.; Tomoda, S. Acta Crystal. 1997, B53, 662. (97) Coiro, V. M.; Giglio, E.; Mazza, F.; Pavel, N. V.; Pochetti, G. Acta Crystal. 1982, B38, 2615. (98) Scott, J. L. J. Chem. Crystal. 1996, 26, 185. (99) Dastidar, P. CrystEngComm 2000. (100) Sada, K.; Maeda, T.; Miyata, M. Chem. Lett. 1996, 837. (101) Yoswathananont, N.; Chirachanchai, S.; Tashiro, K.; Nakano, K.; Sada, K.; Miyata, M. CrystEngComm 2001, 1. (102) Nakano, K.; Katsuta, M.; Sada, K.; Miyata, M. CrystEngComm 2001, 11, 1. (103) Nowak, E.; Gdaniec, M.; Polonski, T. J. Inclusion Phenom. Macrocyclic Chem. 2000, 37, 155. (104) Nakano, K.; Sada, K.; Miyata, M. Chem. Commun. 1996 989. (105) Nakano, K.; Tani, K.; Sada, K.; Miyata, M. Progress Colloid Polymer Sci. 1997, 106, 249. (106) Kato, K.; Inoue, K.; Tohnai, N.; Miyata, M. J. Inclusion Phenom. Macrocyclic Chem. 2004, 48, 61. (107) Polonski, T.; Szyrszyng, M.; Gdaniec, M.; Nowak, E.; Herman, A. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 797. (108) Bertolasi, V.; Bortolini, O.; Fogagnolo, M.; Fantin, G.; Pedrini, P. Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1479. 115 (109) Caira, M. R.; Nassimbeni, L. R.; Scott, J. L. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1994, 1403. (110) Nakamura, S.; Imashiro, F.; Takegoshi, K.; Terao, T. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8769. (111) Miyata, M.; Goonewardena, W.; Shibakami, M.; Takemoto, K.; Masui, A.; Miki, K.; Kasai, N. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, 1140. (112) Miki, K.; Masui, A.; Kasai, N.; Goonewardena, W.; Shibakami, M.; Takemoto, K.; Miyata, M. Acta Crystal. 1992, C48, 503. (113) Miki, K.; Masui, A.; Kasai, N.; Miyata, M.; Goonewardena, W.; Shibakami, M.; Takemoto, K. Acta Crystal. 1989, C45, 79. (114) Scott, J. L. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1995, 495. (115) Sugahara, M.; Sada, K.; Hirose, J.; Miyata, M. Mol. Cryst. Liquid Cryst. 2001, 356, 155. (116) Sada, K.; Sugahara, M.; Nakahata, Y.; Yasuda, Y.; Nishio, A.; Miyata, M. Chem. Lett. 1998, 31. (117) Miyata, M.; Sada, K.; Miyake, Y. Mol. Cryst. Liquid Cryst. 1998, 313, 173. (118) Sada, K.; Sugahara, M.; Kato, K.; Miyata, M. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4386. (119) Meijide, F.; Antelo, A.; Alvarez, M.; Soto, V. H.; Trillo, J. V.; Jover, A.; Vázquez Tato, J. Crystal Growth Des. 2011, 11, 356. (120) Altona, C.; Geise, H. J.; Romers, C. Tetrahedron 1968, 24, 13. (121) Soto Tellini, V. H. Estructuras supramoleculares generadas por ciclodextrinas, adamantanos y ácidos biliares, Tesis Doctoral 2006. (122) Alvarez Alcalde, M.; Jover, A.; Carrazana, J.; Meijide, F.; Soto, V. H.; Vázquez Tato, J. Steroids 2007, 72, 535. (123) Hunter, C. A.; Sanders, J. K. M. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5525. (124) Haibo, L.; Jianmin, G.; R, L. S.; David, S. Y.; Lystranne, M.; T, K. E. Science 2003, 302, 868. (125) Soto, V. H.; Alvarez, M.; Meijide, F.; Trillo, J. V.; Antelo, A.; Jover, A.; Galantini, L.; Vázquez Tato, J. Steroids 2012, 77, 1228. (126) Bohle, D. S. D., Erin L. Inorg. Chem. 2012, 51, 4411. (127) Uchoa, A. F.; de Oliveira, K. T.; Baptista, M. S.; Bortoluzzi, A. J.; Iamamoto, Y.; Serra, O. A. J. Org. Chem 2011, 76, 8824. (128) Chen, W.; Fukuzumi, S. Eur. J. Inorg. Chem. 2009, 5494. (129) George, S.; Lipstman, S.; Goldberg, I. Crystal Growth Des. 2006, 6, 2651. (130) Goldberg, I.; Muniappan, S.; George, S.; Lipstman, S. CrystEngComm 2006, 8, 784. (131) Kempe, R. Z. Anorg. Allg. Chem. 2005, 631, 1038. 3 DÍMEROS DERIVADOS DEL ÁCIDO CÓLICO Nuestro grupo de investigación ha estudiado la agregación de compuestos derivados de sales biliares naturales en tres condiciones experimentales diferentes: en disolución reguladora de carbonato/bicarbonato (sobre todo en cantidades equimolares de ambos componentes, pH 10.25), en disolución de hidróxido sódico (normalmente con el electrolito inerte NaCl para fijar una determinada fuerza iónica) y en agua al pH natural del compuesto. Esta última situación se ha usado en muy pocas ocasiones por dos motivos principales: 1º) No garantizar una estricta constancia del pH al variar la concentración del compuesto. Tal hecho puede suponer cambios en su estado de disociación y afectar a la propia agregación.1-2 2º) Introducir además una incertidumbre en el valor del prefactor n de la ecuación de Gibbs que permite la determinación de la concentración superficial de exceso, hecho que no sucede en las otras dos condiciones experimentales ya que se verifica que la concentración de iones inertes es mucho mayor que la del propio surfactante (vide infra). Esto tiene particular incidencia en la determinación del área molecular en la interfase aire-agua. Por lo tanto, no debe extrañar que a lo largo de estos capítulos se describan experiencias diseñadas en cualquiera de estas tres condiciones experimentales incluso para el mismo compuesto objeto de estudio. En este capítulo se comentan los fenómenos de agregación en medio acuoso de nuevos dímeros derivados del ácido cólico sintetizados. Los residuos biliares están ligados a un puente de unión mediante enlaces amida, habiendo utilizado para tal fin el ácido iminodiacético, el ácido 5-aminoisoftálico y la protoporfirina IX (Figura 3.1). En el capítulo siguiente se comentarán los derivados trímeros y tetrámeros. Dado que el ácido cólico pertenece a la familia de las sales biliares, que son importantes surfactantes biológicos, es de esperar que los nuevos derivados se comporten también como tales. En primer lugar, se expondrán los resultados del estudio de la tensión superficial y, posteriormente, los correspondientes a la dispersión de luz láser en medio acuoso y microscopia. Mediante estas últimas técnicas, se espera poder obtener información sobre la forma y el tamaño de las partículas/agregados que se formen. 3.1 ÁCIDO AMC2-IMINODIACÉTICO. Tensión superficial Las disoluciones utilizadas para el estudio de la tensión superficial fueron preparadas utilizando el método de adición-extracción, siendo 10 y 3 ml los volúmenes inicial y de dilución, respectivamente.3 Las medidas se llevaron a cabo a 25ºC mediante un tensiómetro digital equipado con un plato de Whilhelmy (Apéndice B, sección B.1). Este procedimiento fue aplicado a todos los compuestos por lo que se omitirá en el futuro. 118 Figura 3.1. Estructuras de los dímeros derivados del ácido cólico utilizando como puente de unión el ácido iminodiacético, ácido aminoisoftálico y la protoporfirina (IX). La Figura 3.2, que resume tres experiencias realizadas en disolución acuosa (NaCl 0.09 M y NaOH 0.01 M) partiendo de una concentración inicial 510-3 M, muestra la tensión superficial, γ, frente al logaritmo neperiano de la concentración del surfactante. El pH de trabajo se mantuvo elevado para evitar la presencia de dímero sin disociar. El punto de corte de las dos líneas rectas, trazadas a partir de los datos experimentales, permite estimar la concentración de agregación crítica (cac) del compuesto. El valor obtenido es 110-4 M. El valor de γ por encima de la cac es comparable a los obtenidos para otras sales biliares.4 Si se atiende al valor de la cac, el dímero es mejor surfactante que la mayoría de las sales biliares naturales. El comportamiento superficial de la molécula fue analizado mediante la ecuación de Gibbs (Ecuación B.08, véase el Apéndice B): S C Cd d nRT        ln 1                   c c n S S    2 [B.08] 119 En esta ecuación el factor n depende de la estequiometria del surfactante (ν+, ν-) y también de la estequiometria (ν+S) y la concentración de los electrólitos inertes añadidos (cS).5-7 El conocimiento de la concentración superficial de exceso,  , permite calcular el área molecular en la interfase líquido/aire, ao (ecuación B.09). La elevada concentración salina utilizada permite asegurar un gran exceso de iones en disolución respecto a la concentración del surfactante, con lo que n = 1.5 Los resultados del cálculo de las concentraciones superficiales de exceso y las áreas moleculares en la interfase se muestran en la Tabla 3.1. Figura 3.2. Variación de la tensión superficial con la concentración de sal de amC2-iminodiacético. Datos obtenidos a 25 °C en disolución acuosa de NaCl 0.09 M de NaCl y NaOH 0.01 M. Tabla 3.1 Propiedades superficiales determinadas a partir de las medidas de tensión superficial a 25ºC. Disolución amC2-iminodiacético pH 103cac (M) 107 (mol m-2) ao (Å2) [NaOH +NaCl]= 0.1 M 11.65 0.10 16.06 103 El área de la sección molecular que se puede estimar para el dímero amC2iminodiacético a partir de las consideraciones realizadas en la sección 2.5 es de 239 Å2. Este valor, que corresponde a una disposición de la molécula estirada en la interfase (Figura 3.3, arriba), es considerablemente mayor que el valor del área superficial por molécula determinado experimentalmente (Tabla 3.1), el cual es igual a la sección molecular calculada para un único resto de esteroide en disposición plana (103 Å2). Los resultados obtenidos sugieren que en la interfase se forma una multicapa, probablemente una bio tri-capa, tal y como ha sido propuesto para los ácidos litocólico y desoxicólico.8 Alternativamente, si los restos de ácido cólico se plegasen enfrentando sus caras  (Figura 3.3, abajo), el área molecular disminuiría hasta aproximadamente el doble del área mínima del esteroide en posición apical (Ac= 51 Å2; Tabla 2.29). Los datos termodinámicos no permiten discernir entre ambas posibilidades. -8 -6 -4 -2 0 2 50 55 60 65 70 75  (mN/m) Ln ( 103 c / M ) 120 Figura 3.3. Representaciones en 3D del amC2-iminoacético realizadas mediante un sencillo software de dibujo de moléculas. Arriba: posición estirada. Abajo: plegada. Dispersión de luz láser. Se hicieron medidas de dispersión de luz de las que se obtuvieron los diámetros efectivos de los agregados a distintas concentraciones y su evolución con el tiempo. Una vez preparadas las muestras se filtraban inmediatamente a través de un filtro de 0.45 m de tamaño de poro. Las medidas se realizaron a un ángulo de 90º, utilizando en la mayoría de los casos el pin 100 en el detector. Los resultados se recogen en la Figura 3.4 para una disolución de amC2-iminodiacético 0.0112 M en presencia de NaOH 0.01 M, transcurridos 60 min desde su preparación dado que transcurridas 24-48 horas, el producto acaba precipitando, debido al enorme crecimiento del agregado. Figura 3.4. Intensidad de luz dispersada vs diámetro de partícula (CONTIN) del dímero amC2iminodiacético 0.0112 M y NaOH 0.01 M transcurrida una hora desde su preparación. El análisis CONTIN de las medidas realizadas indica una población, mayoritaria en número de partículas, entre 0.5 y 3.5 nm de diámetro, valores compatibles con la formación de micelas de pequeño tamaño, y una pequeña población de partículas con un tamaño comprendido en el intervalo 70-240 nm. Se repitió un nuevo experimento aumentando la fuerza iónica (que permite reducir las interacciones electrostáticas entre los agregados) y reduciendo a la mitad la concentración de surfactante ([amC2-iminodiacético]=6.410-3 M en presencia de NaCl 0.04 M y NaOH 0.01 M). En estas condiciones, se comprobó que el tamaño de las partículas aumentaba de forma más lenta con el tiempo. La Figura 3.5 muestra el análisis CONTIN de la intensidad de luz dispersada al cabo de 4 horas, habiéndose observado una mayor estabilidad de la disolución. La población mayoritaria, en número de partículas, corresponde de nuevo a un tamaño micelar, mientras que el tamaño de la población mayor alcanzó los 390 nm. 121 Figura 3.5. Análisis CONTIN intensidad/diámetro de [amC2-iminodiacético]=6.410-3 M en presencia de [NaCl]=0.04 M y [NaOH]= 0.01 M a las cuatro horas de su preparación. Análisis de la forma y el tamaño mediante microscopia. Para observar la geometría de los agregados, se hicieron medidas con distintas técnicas de microscopía. La Figura 3.6 muestra los resultados obtenidos mediante AFM (microscopía de fuerza atómica), en modo de contacto, habiendo partido de una disolución del dímero amC2-iminodiacético de concentración 110-3 M en agua y transcurridas 24 h desde su preparación. Del análisis de las imágenes obtenidas se deduce que los agregados obtenidos son polidispersos, su forma es esférica-globular y parecen tener tendencia a agregarse para originar agregados de mayor tamaño. El histograma correspondiente al tamaño de las partículas se muestra en la Figura 3.7, derecha. De un total de 38 partículas analizadas al azar, se ha calculado un diámetro medio igual a 151 nm, valor compatible con el deducido de las medidas de dispersión de luz. Figura 3.6. Izquierda: Imagen AFM de los agregados del dímero amC2-iminodiacético Concentración 110-3M después de 24 horas. Derecha: histograma del tamaño. Con el fin de contrastar los resultados anteriores, se tomaron imágenes TEM partiendo de una concentración de 0.02 M en presencia de NaCl 0.015 M. La Figura 3.7 muestra algunas imágenes obtenidas para una disolución recién preparada. El histograma 100 120 140 160 180 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 D i a m e t r o ( n m ) D a t a 122 de tamaños se representa en la Figura 3.8, donde se observa un máximo a 25-35 nm, y se detectan algunas partículas de más de 150 nm. Figura 3.7. Imágenes TEM del amC2-iminodiacético de concentración 0.02 M con [NaCl]=0.015 M recién preparada. Figura 3.8. Histograma de dispersión de diámetros medidos a partir de las imágenes TEM de la disolución de la Figura 3.7. Se tomaron nuevas imágenes transcurridas 24 horas desde la preparación de la muestra. La Figura 3.9 recoge algunas imágenes obtenidas, las dos superiores corresponden a una disolución de amC2-iminodiacético 4.8510-3 M con 0.5% de azida sódica (que previene el crecimiento de hongos) y las dos inferiores a una disolución 5.0610-3 M. Al no observar diferencias significativas, a la hora de analizar los tamaños de las partículas, las dos experiencias se trataron como una sola. El histograma se representa en la misma figura. La población más abundante se encuentra en el intervalo 50-350 nm con un máximo en torno a 200 nm. Por encima de 400 nm se observa un número muy inferior de partículas. 0 50 100 150 200 250 0 100 200 300 400 500 600 D i a m e t r o ( n m ) D a t a 123 Figura 3.9. Imágenes TEM e histograma de dispersión de diámetros medidos a partir de imágenes TEM del dímero amC2-iminodiacético transcurridas 24 horas desde la preparación de la muestra. Dado que los tamaños determinados mediante las distintas técnicas son compatibles con la formación de vesículas (los valores que pueden verse en la bibliografía para vesículas abarcan desde 20 hasta cientos de nm), a modo de referencia y efectos comparativos, en la Figura 3.10 se recogen algunas imágenes de vesículas tomadas de la bibliografía. Las vesículas son objeto de atención de numerosos estudios debido a las propiedades estructurales que presentan9-15 y la naturaleza de los compuestos que las originan es muy variada. Tienen un potencial muy alto para el transporte a escala nanométrica por lo que su aplicabilidad varía desde los campos de la Biología, la Medicina y la Farmacología hasta la industria. Las imágenes de vesículas que se muestran en la Figura 3.10 muestran una acusada diferencia de los contrastes correspondientes al interior y a la membrana de la vesícula. Las razones por la que aparece más oscuro el borde de la vesícula están asociadas a su curvatura, tal y como han discutido Coldren et al.16 El interior de la vesícula puede variar en intensidad según el contenido de ésta. Esta marcada diferencia no se observan en las partículas del dímero objeto de estudio, sino que el agregado muestra una intensidad prácticamente constante en toda su estructura. Además, su superficie exterior es irregular por lo que la naturaleza de los agregados no parece ser vesicular sino globular. La Figura 3.11 muestra dos ejemplos inequívocos del carácter globular de los agregados. Como se ha indicado, ocasionalmente aparecen partículas de tamaño superior a 400 nm que parecen estar formadas por la aglomeración de partículas de menor tamaño (aproximadamente 100 nm). Esta asociación puede originar formaciones tipo rosario (Figura 3.12A, izquierda), globulares (Figura 3.12A, derecha) o incluso tipo donuts (Figura 3.12B, derecha). Obviamente, la aglomeración exige la aproximación de las partículas pequeñas que pueden aparecer como fusionadas o no (Figura 3.12B, izquierda). La velocidad de este proceso es relativamente rápida cuando se la compara con el originado por otras moléculas (vide infra). 124 Figura 3.10. Imágenes TEM mostrando estructuras de vesículas: A)17. B)18. C)19. D)20. E)21. F)22. Figura 3.11. Imágenes TEM de los agregados originados por el dímero amC2-iminoacético. A B Figura 3.12. Imágenes TEM de los agregados formados por el amC2-iminodiacético. A) Agregados de gran tamaño tipo rosario (izquierda) y globulares (derecha). B) Agregados tipo donuts (derecha) y partículas aparentemente fusionadas o muy próximas entre sí (izquierda). Si las condiciones en la disolución son adecuadas, pueden originarse núcleos de cristalización que con el tiempo aumentan de tamaño (Figura 3.13). Desafortunadamente, incluso después de haber utilizado disolventes orgánicos, no se han conseguido cristales 125 de tamaño suficiente que permitieran afrontar su resolución estructural mediante difracción de rayos X. Figura 3.13. Imágenes TEM de cristales del amC2-iminodiacético. Tiempo/días: A)1, B) 7, C y D) 17. Derecha: Fotografías de cristales en suspensión en una mezcla metanol/acetato de etilo. Los resultados anteriores sugieren que el amC2-iminodiacético sufre procesos de agregación que dependen de las condiciones experimentales y el tiempo. 3.2 ÁCIDO AMC2-AMINOISOFTÁLICO. Tensión superficial Los datos obtenidos en presencia de disolución reguladora carbonato/bicarbonato 0.1 M (pH 9.60) para el dímero amC2-aminoisoftálico, se representan en la Figura 3.14. El valor determinado para la cac es 1.410-4 M. Figura 3.14. Tensión superficial frente al logaritmo neperiano de la concentración de la sal del dímero amC2-aminoisoftálico en disolución acuosa de carbonato/bicarbonato 0.1 M (pH 9.60). Temperatura 25 ºC.  -8 -6 -4 -2 02 56 60 64 68 72 mN/m Ln([surfactante]/mM) 126 Como se expuso anteriormente, a partir de la pendiente de la recta correspondiente a la región donde sólo existen monómeros, se pueden estimar los parámetros habituales que se recogen en la Tabla 3.2. Así, el área molecular obtenida es ao = 168 Å2 , inferior a la sección molecular que se puede calcular para una configuración plana de la molécula igual a 258 Å2 (Figura 3.15). Tabla 3.2 Propiedades superficiales del amC2-aminoisoftálico determinadas a 25ºC por medida de la de tensión superficial. Disolución pH cac (104 M) Γ x107 (mol x m-2) ao (Å2) [NaHCO3/Na2CO3]= 0.1 M 9.60 1.4 9.9 168 Dadas la rigidez del núcleo esteroide, la planaridad de los enlaces amida entre aquel y el puente de unión, y la rigidez de este último (derivado del ácido 5-aminoisoftálico), se puede proponer la formación de una bicapa en la interfase aire/agua. Figura 3.15. Representación en 3D del amC2-aminoisoftálico. Con esta orientación el área de la sección molecular es 258 Å2. Dispersión de luz Se realizaron medidas de dispersión de luz de una disolución del surfactante, en su forma de sal sódica, 0.010 M, en presencia de NaCl (0.090 M) y de NaOH (0.01 M). Las medidas se realizaron a los 0, 1, 2, 3, 4 y 14 días. La Tabla 3.3 muestra un aumento progresivo del diámetro efectivo con el tiempo. Este resultado muestra una diferencia en la velocidad de los procesos de agregación para los dímeros amC2-iminodiacético y amC2-aminoisoftálico. De hecho, los agregados del primero de los dímeros, cuya velocidad de asociación es mayor, precipitan a partir de las 24-48 horas de su preparación, mientras que el dímero amC2-aminoisoftálico permanece suspendido durante, al menos, un periodo de 14 días. Tabla 3.3 Parámetros obtenidos por dispersión de luz para amC2-aminoisoftálico 0.01 M y fuerza iónica 0.1 M, transcurridos 0, 1, 2, 3, 4 y 14 días desde su preparación. 127 En las representaciones de intensidad vs diámetro (análisis NLLS; Figura 3.16, izquierda) se observan dos poblaciones, siendo la de mayor tamaño (excepto a tiempo 0) la que aparentemente es predominante. Sin embargo, las representaciones número vs diámetro (Figura 3.16, derecha) indican que hasta el cuarto día, no se observa la aparición de las partículas de mayor tamaño. Tiempo Intensidad Número 0 días A B 1 día C D 2 días E F 3 días G H 4 días I J 14 días K M Figura 3.16. Representaciones de intensidad y número de partículas frente a diámetro por NNLS del dímero amC2-aminoisoftálico 0.01 M y fuerza iónica 0.1 M a distintos tiempos desde la preparación de la muestra. Análisis de forma y tamaño mediante Microscopias La Figura 3.17 muestra algunas imágenes representativas obtenidas mediante TEM de las partículas observadas a partir de una disolución 510-3 M del dímero en presencia de NaCl 0.09 M y NaOH 0.01 M, transcurridas 2 y 24 horas desde su preparación. Del análisis del tamaño de las partículas se construyeron los histogramas que las acompañan. A las 2 horas se observan dos poblaciones de partículas centradas en torno a 50 y 150 nm, que evolucionan hacia una distribución de tamaños más amplia. Adicionalmente, se observa que coexiste una población de partículas de tamaño inferior a 25 nm (diámetro medio 11.5 nm) tal y como se recoge en la Figura 3.18. A pesar de la evolución del sistema, esta población de partículas pequeñas no desaparece al 128 menos durante 24 h (Figura 3.19), tiempo al cual se obtiene un diámetro medio de 2.30 nm, que puede corresponder a agregados de carácter micelar (Figura 3.19, derecha). 2 horas c 24 horas Figura 3.17. Imágenes TEM y distribución de tamaños de una disolución del dímero amC2aminoisoftálico 510-3 M (en NaCl 0.09 M y NaOH 0.01 M) a las 2 y 24 horas de su preparación. Figura 3.18. Imagen TEM e histograma de la distribución de partícula de tamaño inferior 25 nm, a las 2 horas de la preparación de la disolución, en las condiciones experimentales de la Figura 3.17. 0 100 200 300 400 0 50 100 150 200 D i á m e t r o ( n m ) D a t a 0 100 200 300 400 0 5 10 D i á m e t r o ( n m ) D a t a 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 D i á m e t r o ( nm ) D a t a 129 Figura 3.19. Microfotografía TEM y representación de la dispersión de tamaños de los agregados del dímero amC2-aminoisoftálico (5.1310-3 M) en disolución acuosa (NaCl 0.090 M y NaOH 0.010 M) a las 24 horas de la preparación de la muestra. En esta última figura puede observarse que las partículas pequeñas tienen tendencia a acumularse en la misma región del espacio formando como una nube, que parece tener tendencia a colapsar en forma de asociaciones globulares. Este hecho está resaltado en la Figura 3.20, tomada a las 48 horas. A su vez estos agregados parecen tener tendencia a formar otros de mayor tamaño, de estructura vermiforme como indica la Figura 3.21. Debemos remarcar que, de formar esporádica se observa este tipo de agregados desde el comienzo del experimento. También se observa la formación de algunos cristales (vide infra), posiblemente derivados de aquellos agregados. Figura 3.20. Imágenes TEM e histograma de la distribución de tamaño de partícula del dímero amC2aminoisoftálico en las condiciones experimentales de la Figura 3.17 a las 48 horas. Dado que las medidas de tensión superficial se realizaron en disolución reguladora de carbonato/bicarbonato, se recogieron imágenes TEM en unas condiciones experimentales similares a aquellas (concentración del surfactante 810-3M, [carbonato/bicarbonato]= 0.1 M, pH = 9.82). Las Figuras 3.22-3.23 muestran imágenes representativas tomadas mediante TEM a las 24 horas de la preparación de la muestra. Los resultados obtenidos son similares a los hasta aquí comentados, si bien parece que los agregados son algo más compactos. El tamaño medio determinado a partir del histograma que recoge la figura es de 65 nm cercano al valor medio observado en las condiciones de la Figura 3.17. En ambas condiciones experimentales (disolución reguladora o NaCl/NaOH) se observa la formación de cristales (Figura 3.24) a los que se aludió más arriba. Desafortunadamente, los cristales nunca llegaron a tener la calidad suficiente como para poder ser resueltos mediante la técnica de RX-monocristal. 012345 0 20 40 60 80 100 D i á m e t r o ( nm ) D ata 0 20406080100 0 2 4 6 8 D i á m e t r o ( nm ) Data 130 Figura 3.21. Imágenes TEM del dímero amC2-aminoisoftálico en las condiciones experimentales de la Figura 3.17, tomadas a las a las 2 horas (izquierda) y a las 24 horas (derecha). Figura 3.22. Imagen TEM e histograma de la distribución de tamaño de partícula del dímero amC2aminoisoftálico tomadas a partir de una disolución de concentración 810-3M, en disolución acuosa de carbonato/bicarbonato 0.1 M, pH = 9.82, transcurridas 24 horas de su preparación. Figura 3.23. Ampliación de imágenes TEM en las condiciones de la Figura 3.22. 0 25 50 75 100 125 150 0 5 10 15 20 25 D i á m e t r o ( nm ) Data 131 A) B) Figura 3.24. Imágenes TEM de cristales del dímero amC2-aminoisoftálico A) 510-3 M, NaCl 0.090 M y NaOH 0.010 M. B) 4.0810-3 M y regulador carbonato/bicarbonato 0.1 M, pH = 9.82. Finalmente, se hizo uso de la técnica de AFM en modo de contacto para observar los agregados formados a partir de una disolución del dímero amC2-aminoisoftálico de concentración 110-3 M en agua. Las imágenes de la Figura 3.25 fueron obtenidas después de 24 horas desde la preparación de la disolución. En la imagen destacan regiones con estructuras vermiformes que posiblemente corresponden a las indicadas en las imágenes TEM. La distribución de tamaños es amplia y el histograma muestra un máximo en torno a 50 nm que también es compatible con lo comentado en los experimentos TEM y dispersión de luz. Figura 3.25. Imagen AFM e histograma de la distribución de tamaños del dímero amC2-aminoisoftálico en agua (110-3M) a las 24 horas de su preparación. 3.3 ÁCIDO AMC2-PROTOPORFIRINA. A la hora de plantear el estudio del comportamiento de agregación de este compuesto en disolución, se debe tener en cuenta que no se puede superar una concentración de surfactante superior a 0.01 M debido a la tendencia a gelificar que tienen muchos de los derivados de ácidos biliares.23-26 Adicionalmente, surge una circunstancia que dificulta el trabajo con los compuestos derivados de porfirina. Respecto a las porfirinas naturales, los derivados de ácidos biliares con el puente de unión porfirínico presentan una solubilidad considerablemente mayor, y dada la naturaleza cromófora del mismo, las disoluciones con concentraciones superiores a 510-3 M son muy opacas lo que dificulta la 0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 25 30 D i á m e t r o ( nm ) Data 132 visualización de la solubilidad del compuesto. Por este mismo hecho, no es posible la determinación del diámetro hidrodinámico de los agregados mediante dispersión de luz. Como se muestra a continuación, el amC2-protoporfirina absorbe en la región del visible, coincidiendo con la longitud de onda del láser (632.8 nm) del que se dispone, interfiriendo con los fenómenos de dispersión de luz de las partículas en suspensión. Tensión superficial Se partió de una disolución [amC2-protoporfirina] = 4.8910-3 M, en presencia de 0.090 M de NaCl y 0.01M de NaOH. Los resultados se muestran en la Figura 3.26 y del punto de corte de las dos líneas rectas indicadas se determinó un valor de la cac igual a 1.610-5 M, que es un orden de magnitud inferior a los valores determinados para los dímeros anteriores hasta aquí comentados. Figura 3.26. Representación de la tensión superficial frente al logaritmo neperiano de la concentración del dímero amC2-protoporfirina (NaOH 0.01 M, NaCl 0.09 M, pH=12 y Tª 25ºC). Al seguir los pasos indicados en párrafos precedentes, se obtiene un valor ao= 67 Å2 para el área superficial por molécula (Tabla 3.4). La sección molecular que se puede calcular para una configuración plana de la molécula (orientación similar a la de la Figura 3.15) sería mayor de 370 Å2 (Sección 2.5). La enorme diferencia este valor y ao permite descartar la formación de una monocapa con las moléculas del dímero con una orientación plana en la superficie. Se debe recordar que, en una proyección apical la protoporfirina origina una sección de 62 Å2 y que, similarmente, los dos restos de ácido biliar con la misma orientación contribuirían con 102 Å2 (51 Å2/esteroide). Cualquiera de las dos orientaciones en la interfase recogidas en la Figura 3.27 implica una superposición de la proyección de las áreas de los esteroides y de la protoporfirina, siendo el valor mínimo ligeramente mayor de 100 Å2, valor también superior al de ao. Por lo tanto, aun aceptando un cierto error en los valores indicados, la separación entre los mismos es lo suficientemente grande como para aceptar la formación de una monocapa. Por ello, se sugiere que en realidad se ha formado una multicapa. Esto estaría de acuerdo con los resultados obtenidos por otros autores quienes han publicado la formación de multicapas.27-28 133 Tabla 3.4 Propiedades superficiales obtenidas a 25ºC a partir de los datos de la Figura 3.26. Disolución pH cac (105 M) Γ x107 (mol m-2) ao (Å2) [NaOH] = 0.01 M [NaCl] = 0.09 M 12 1.6 24.7 67 Figura 3.27. Orientación del dímero amC2-protoporfirina en la interfase líquido-aire que originaría un área superficial mínima de 102 Å2. Absorción UV-Vis Los derivados con núcleo porfirínico suelen mostrar una intensa banda de absorción en la región azul del espectro visible, denominada B o banda Soret que se asocia a la transición electrónica desde el estado fundamental hasta el segundo estado excitado (S0S2). Este es también el caso de la protoporfirina IX y el dímero que nos ocupa (Figura 3.28). En el caso de la protoporfirina IX, la banda aparece a 376 nm pero para el dímero amC2-protoporfirina se desplaza hasta 400 nm. Le siguen otras bandas de absorción más débiles, denominadas bandas-Q, producidas por la transición al primer estado excitado (S0S1). Para la protoporfirina estas bandas aparecen a 531, 562, 591 y 644 nm pero al contrario de la banda-B, las bandas-Q del dímero se desplazan a 510, 545, 584 y 640 nm, es decir, hacia longitudes de onda menores. Esto sugiere que, en el dímero, la diferencia de energía entre los dos estados excitados se ha reducido. Además, esta modificación de la estructura electrónica respecto al compuesto de partida, posibilita nuevas transiciones que originan nuevas bandas de absorción en el espectro ultravioleta-visible. Cabe destacar que en el caso del amC2-protoporfirina aparecen dos nuevas bandas de absorción muy próximas a 661 y 685 nm y que la protoporfirina IX, en las condiciones experimentales empleadas, presenta la banda de absorción denominada banda-J a 480 nm que implica la formación en disolución de dímeros interactuando axialmente mediante el empaquetamiento - y lateralmente entre los contactos hidrófobos. En el caso del dímero amC2-protoporfirina, no aparece una clara banda-J aunque se observa un gran ensanchamiento de la banda-B. Estos dímeros podrían orientarse con los anillos dispuestos cara-cara y los grupos carboxílicos ionizados en disposición cabeza-cola en disoluciones acuosas. Se estudió la variación que se produce, en el espectro de absorción ultravioletavisible, cuando se varían las condiciones de pH con el fin de comparar el comportamiento de este compuesto con el de su predecesor.27-28 En disolución acuosa, a diferencia de sus sales, los ácidos biliares no son solubles, lo que impide trabajar a un bajo valor del pH. 134 Esta característica aparece también en el dímero de porfirina. Por este motivo, se utilizó metanol como disolvente y se ajustó el pH a 8, 4 y 1 mediante NaOH y HCl diluidos. Los espectros (Figura 3.29) muestran cómo la banda B se desplaza y las bandas Q se reorganizan fruto de los cambios que se producen en la estructura electrónica cuando se protona el anillo tetrapirrólico. Banda /(nm) B J Q → amC2-protoporfirina 400 510 545 584 640 (661) 685 Protoporfirina IX 376 480 531 562 591 644 Figura 3.28. Espectros de absorción UV-VIS de la protoporfirina IX (5.810-5 M) y el dímero amC2protoporfirina (2.210-5 M) en una disolución con NaOH 0.01 M y NaCl 0.09 M. Tª 25ºC. pH Banda 1 4 8 B410 400 403 Q (nm) 525* 536 504 557 565 539 578* 577* 574 598 610 629 637* 648 654* 642 672 (*) Hombro Figura 3.29. Espectros de absorción UV-VIS del dímero amC2-protoporfirina (3.010-5 M) en metanol a distintos valores del pH. Temperatura: 25ºC. 135 Para una estructura molecular como la que se viene estudiando, capaz de ionizarse en distintas posiciones de la misma, se debe de tener en cuenta las diferentes posibilidades de ionización como resultado de un cambio del pH en el medio. Mediante el software Marvin Sketch, se hizo una estimación del pKa de cada uno de los diferentes grupos ionizables de la molécula. Así, se obtienen unos valores de pKa de 3.59 y 4.57 para dos de los nitrógenos (protonables) del anillo tetrapirrólico, y de 15.69 y 16.61 para los otros dos. Los pKa de los nitrógenos que intervienen en el enlace amida son 15.12 y 15.59. El pKa de los grupos carboxílicos de las cadenas laterales de los restos de esteroide son 4.17 y 4.78. Con estos datos se puede predecir la estructura molecular del ion mayoritario para un determinado pH. En medio muy ácido, la especie mayoritaria es dicatiónica y, en medio básico, una dianiónica (Figura 3.30). La existencia de distintas especies en disolución justifica cualitativamente las diferencias observadas en los espectros a distintos valores del pH. pH=1 pH=8 Figura 3.30. Estructuras moleculares propuestas de las especies mayoritarias del dímero amC2protoporfirina a distinto pH. Con el fin de estudiar si los fenómenos de agregación del amC2-protoporfirina en disolución acuosa están relacionados con el solapamiento intermolecular de orbitales , se obtuvieron los espectros de absorción para una serie de disoluciones de distinta concentración preparadas mediante el método de adición-extracción, sobre la propia cubeta. El volumen de disolución introducido en la cubeta fue de 2.980±0.006 ml y el volumen de adición-extracción empleado fue 0.8900±0.0009 ml. La Figura 3.31 muestra los resultados obtenidos y el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, en particular, en la región en la que aparecería la banda-J según la bibliografía. Esto implica que no hay ningún proceso dependiente de la concentración que afecte a la absorción a longitudes de onda en la región relacionada con la banda-J. La Tabla 3.6 recoge los valores de los coeficientes de absortividad molar. Estos valores son tan altos que, aun a concentraciones relativamente bajas, es fácil saturar el fotodetector del aparato. Por este motivo, no es posible realizar espectros de absorción fiables por encima de concentraciones cercanas a la cac tal y como se ilustra en la Figura 3.32. Estudios mediante TEM Se obtuvieron imágenes TEM para observar la naturaleza de los agregados formados por el dímero. Los primeros resultados obtenidos por esta técnica, de una disolución del amC2-protoporfirina de concentración 510-4 M con NaOH 0.01 M y NaCl 0.09 M, muestran claramente partículas de tamaño nanométrico en forma de gránulos con aparente tendencia a la asociación (Figura 3.33). Al analizar el tamaño de estas partículas se obtiene un diámetro de partícula de 2.2±0.7 nm. La Figura 3.34 muestra el histograma  136 de distribución de tamaños. Esto sugiere que se trata de micelas, dado que este tamaño corresponde a micelas formadas por las sales biliares naturales.29 A B C D Figura 3.31. A y C: Espectros de absorción UV-VIS variando la concentración del dímero amC2protoporfirina en una disolución con NaOH 0.01 M y NaCl 0.09 M. Tª 25ºC. B y D: Leyes de Lambert-Beer. Tabla 3.6 Coeficientes de absortividad molar obtenidos a diferente longitud de onda, con un paso de luz de 1 cm, del dímero amC2-protoporfirina. Longitud de onda (nm) 420 465 495 510 550 585 10-3ε (M-1 cm-1) 23.80 7.63 4.27 4.36 3.18 2.80 Figura 3.32. Región de concentración (en verde) en la que el dímero amC2-protoporfirina cumple la ley de Lambert-Beer (cubeta de 1cm de paso óptico) sobre los resultados de tensión superficial de la Figura 3.26. [Document text truncated for crawler view.]