Estudio del comportamiento fotoquímico y determinación de compuestos fitosanitarios en matrices medioambientales y agroalimentarias mediante técnicas avanzadas de extracción y microextracción

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE QUÍMICA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Instituto de Investigación y Análisis Alimentarios ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO FOTOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FITOSANITARIOS EN MATRICES MEDIOAMBIENTALES Y AGROALIMENTARIAS MEDIANTE TÉCNICAS AVANZADAS DE EXTRACCIÓN Y MICROEXTRACCIÓN María Fernández Álvarez Memoria para optar al grado de Doctora en Química Santiago de Compostela, Junio 2009 Dña. María Llompart Vizoso y Dña. Marta Lores Aguín, Profesoras Titulares del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, y D. Thierry Dagnac, Investigador del Centro de Investigacións Agrarias de Mabegondo-INGACAL, Xunta de Galicia, Autorizan: A la Licenciada Dña. María Fernández Álvarez a la presentación del trabajo titulado “ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO FOTOQUÍMICO Y DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FITOSANITARIOS EN MATRICES MEDIOAMBIENTALES Y AGROALIMENTARIAS MEDIANTE TÉCNICAS AVANZADAS DE EXTRACCIÓN Y MICROEXTRACCIÓN” que ha realizado bajo nuestra dirección, para optar al grado de Doctora en Química. Y para que así conste, firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela, a día 11 de Junio de 2009. Dña. María Llompart Vizoso Dña. Marta Lores Aguín D. Thierry Dagnac Agradecimientos AgradecimientosAgradecimientos Agradecimientos En primer lugar quiero En primer lugar quieroEn primer lugar quiero En primer lugar quiero dar las gracias a mis directore dar las gracias a mis directore dar las gracias a mis directore dar las gracias a mis directores ss s de Tesis de Tesis de Tesis de Tesis, , , , Marta Lores Marta LoresMarta Lores Marta Lores, ,, , María Llompart María Llompart María Llompart María Llompart y Thierry Dag y Thierry Dagy Thierry Dag y Thierry Dagnac. nac.nac. nac. Agra Agra Agra Agradecerles decerlesdecerles decerles su apoyo, su apoyo, su apoyo, su apoyo, la formación recibida y el brin la formación recibida y el brin la formación recibida y el brin la formación recibida y el brindarme la darme la darme la darme la oportunidad oportunidadoportunidad oportunidad de realizar este trabajo. de realizar este trabajo. de realizar este trabajo. de realizar este trabajo. Gracias también a Carmen Jares Gracias también a Carmen Jares Gracias también a Carmen Jares Gracias también a Carmen Jares por la ayuda prestada durante todos por la ayuda prestada durante todos por la ayuda prestada durante todos por la ayuda prestada durante todos estos años. estos años.estos años. estos años. G GG Gracias raciasracias racias al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, al Instituto de al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, al Instituto de al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, al Instituto de al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, al Instituto de Investigación InvestigaciónInvestigación Investigación y Análisis Alimentarios (II y Análisis Alimentarios (II y Análisis Alimentarios (II y Análisis Alimentarios (IIAA) AA)AA) AA) y y y y, ,, , en especial en especial en especial en especial, ,, , a R a R a R a Rafael Cela afael Celaafael Cela afael Cela por por por por acogerme acogermeacogerme acogerme en su en su en su en su grupo de investigación grupo de investigacióngrupo de investigación grupo de investigación y permitirme y permitirme y permitirme y permitirme la realización de este trabajo. la realización de este trabajo. la realización de este trabajo. la realización de este trabajo. Gracias también a la Xunta de Galicia y Gracias también a la Xunta de Galicia yGracias también a la Xunta de Galicia y Gracias también a la Xunta de Galicia y al Ministerio de Ciencia e Innovación al Ministerio de Ciencia e Innovación al Ministerio de Ciencia e Innovación al Ministerio de Ciencia e Innovación por por por por la lala las ss s beca beca beca becas ss s disfrutada disfrutadadisfrutada disfrutadas ss s durante la realización de est durante la realización de est durante la realización de est durante la realización de esta Tesis. a Tesis.a Tesis. a Tesis. A Josep M A Josep MA Josep M A Josep M. .. . Bayona y a toda la gente del Bayona y a toda la gente del Bayona y a toda la gente del Bayona y a toda la gente del IIQAB en el IIQAB en el IIQAB en el IIQAB en el CSIC de Barcelona CSIC de BarcelonaCSIC de Barcelona CSIC de Barcelona por porpor por su acogida y su acogida y su acogida y su acogida y ayuda ayudaayuda ayuda durante mi durante mi durante mi durante mi estancia estancia estancia estancia. .. . Moltes gràcies. Moltes gràcies.Moltes gràcies. Moltes gràcies. Al pro Al proAl pro Al profesor Waldemar Wardencki, por aceptarme en su grupo de investigación fesor Waldemar Wardencki, por aceptarme en su grupo de investigaciónfesor Waldemar Wardencki, por aceptarme en su grupo de investigación fesor Waldemar Wardencki, por aceptarme en su grupo de investigación durante los tres durante los tres durante los tres durante los tres meses que pasé en la Fa meses que pasé en la Fameses que pasé en la Fa meses que pasé en la Facultad de Química de la Universidad Politécnica de Gdansk. Dziekuje cultad de Química de la Universidad Politécnica de Gdansk. Dziekuje cultad de Química de la Universidad Politécnica de Gdansk. Dziekuje cultad de Química de la Universidad Politécnica de Gdansk. Dziekuje bardzo. bardzo.bardzo. bardzo. A AA A Pablo, no sólo porque ha trabajado duramente para que una parte importante de este trabajo Pablo, no sólo porque ha trabajado duramente para que una parte importante de este trabajo Pablo, no sólo porque ha trabajado duramente para que una parte importante de este trabajo Pablo, no sólo porque ha trabajado duramente para que una parte importante de este trabajo fuese posible, sino también por fuese posible, sino también por fuese posible, sino también por fuese posible, sino también por s ss su compañía y apoyo incondicionales. Gracias por todo, u compañía y apoyo incondicionales. Gracias por todo,u compañía y apoyo incondicionales. Gracias por todo, u compañía y apoyo incondicionales. Gracias por todo, también por las discusiones patrón interno también por las discusiones patrón internotambién por las discusiones patrón interno también por las discusiones patrón interno- -- -surrogado que ya empiezo a echar de menos. surrogado que ya empiezo a echar de menos.surrogado que ya empiezo a echar de menos. surrogado que ya empiezo a echar de menos. A AA A Lucía LucíaLucía Lucía, ,, , por por por por ayudarme tantísimo ayudarme tantísimoayudarme tantísimo ayudarme tantísimo y siempre con una sonrisa en la cara, y siempre con una sonrisa en la cara, y siempre con una sonrisa en la cara, y siempre con una sonrisa en la cara, y y y y t tt también por ambién por ambién por ambién por lo lolo los s s s sustos mañaneros sustos mañaneros sustos mañaneros sustos mañaneros que que que que le añaden emoción al día a día. le añaden emoción al día a día. le añaden emoción al día a día. le añaden emoción al día a día. A AA A Jorge, por Jorge, por Jorge, por Jorge, porque ha sido un que ha sido un que ha sido un que ha sido un apoyo apoyo apoyo apoyo muy muy muy muy importante importanteimportante importante todos estos años, todos estos años, todos estos años, todos estos años, por por por por estar siempre dispuesto a echarme una mano, y porq estar siempre dispuesto a echarme una mano, y porq estar siempre dispuesto a echarme una mano, y porq estar siempre dispuesto a echarme una mano, y porque es rara ue es rara ue es rara ue es rara la vez que no me ha hecho la vez que no me ha hechola vez que no me ha hecho la vez que no me ha hecho reir. reir. reir. reir. A AA A Noe Noe Noe Noe por por por por s ss su compañía u compañía u compañía u compañía y y y y a aa a Pili Pili Pili Pili por por por por sacarme de sacarme de sacarme de sacarme de tantos tantos tantos tantos apuros apurosapuros apuros. .. . ♫ No hace tanto del verano, pero y No hace tanto del verano, pero yNo hace tanto del verano, pero y No hace tanto del verano, pero ya vemos las primeras hojas caer; a vemos las primeras hojas caer;a vemos las primeras hojas caer; a vemos las primeras hojas caer; otra vez como cada año otra vez como cada año otra vez como cada año otra vez como cada año, ,, , como un círculo girando una y otra vez como un círculo girando una y otra vezcomo un círculo girando una y otra vez como un círculo girando una y otra vez... ... ... ... ♪ gracias gracias gracias gracias también a también a también a también a Rosa RosaRosa Rosa por animarme en mis por animarme en mis por animarme en mis por animarme en mis “D “D“D “Días fríos ías fríosías fríos ías fríos” ”” ”, y , y , y , y a aa a Carmen por Carmen por Carmen por Carmen por s ss sus usus us sabios consejos y por los momentos sabios consejos y por los momentos sabios consejos y por los momentos sabios consejos y por los momentos “ ““ “gachufain gachufaingachufain gachufain” ”” ”. .. . Y gracias a Y gracias aY gracias a Y gracias a toda la gente toda la gentetoda la gente toda la gente del IIAA del IIAA del IIAA del IIAA en general en general en general en general porque, porque, porque, porque, sin sin sin sin su susu su presencia, estos años no hubieran presencia, estos años no hubieran presencia, estos años no hubieran presencia, estos años no hubieran sido lo mismo sido lo mismosido lo mismo sido lo mismo. Gracias por haberme prestado . Gracias por haberme prestado. Gracias por haberme prestado . Gracias por haberme prestado ayuda siempre que lo he necesitado, por llamarme ayuda siempre que lo he necesitado, por llamarme ayuda siempre que lo he necesitado, por llamarme ayuda siempre que lo he necesitado, por llamarme cuando salía mi canción en la radio, por preguntar siempre ¿Vas cuando salía mi canción en la radio, por preguntar siempre ¿Vas cuando salía mi canción en la radio, por preguntar siempre ¿Vas cuando salía mi canción en la radio, por preguntar siempre ¿Vas a hacer PLE?, por esas a hacer PLE?, por esas a hacer PLE?, por esas a hacer PLE?, por esas llamadas infructíferas para la voz misteriosa, por las tertulias musicales llamadas infructíferas para la voz misteriosa, por las tertulias musicalesllamadas infructíferas para la voz misteriosa, por las tertulias musicales llamadas infructíferas para la voz misteriosa, por las tertulias musicales, ,, , por apoyarme en la por apoyarme en la por apoyarme en la por apoyarme en la cruzada anti cruzada anticruzada anti cruzada anti- -- -aire acondicionado, y por ese guión de aire acondicionado, y por ese guión de aire acondicionado, y por ese guión de aire acondicionado, y por ese guión de “ ““ “Cámera GeCé Cámera GeCéCámera GeCé Cámera GeCé” ”” ” que se quedó en proyecto que se quedó en proyecto que se quedó en proyecto que se quedó en proyecto pero que dejará para el recuerdo alguna que otr pero que dejará para el recuerdo alguna que otrpero que dejará para el recuerdo alguna que otr pero que dejará para el recuerdo alguna que otra frase memorable a frase memorablea frase memorable a frase memorable. .. . Gracias Gracias Gracias Gracias Rocío y Rocío yRocío y Rocío y Ramón Ramón Ramón Ramón, por , por , por , por vuestra vuestravuestra vuestra amistad y amistad y amistad y amistad y por las noches de “Lembranzas” que han por las noches de “Lembranzas” que han por las noches de “Lembranzas” que han por las noches de “Lembranzas” que han convertido al jueves en un día tan especial. Ojalá esos planes de futuro de los que siempre convertido al jueves en un día tan especial. Ojalá esos planes de futuro de los que siempre convertido al jueves en un día tan especial. Ojalá esos planes de futuro de los que siempre convertido al jueves en un día tan especial. Ojalá esos planes de futuro de los que siempre hablamos se cumplan y, si no, siempre p hablamos se cumplan y, si no, siempre phablamos se cumplan y, si no, siempre p hablamos se cumplan y, si no, siempre podremos montar una d odremos montar una dodremos montar una d odremos montar una destilería en Coruña… estilería en Coruña…estilería en Coruña… estilería en Coruña… Gracias Bea y Gracias Bea yGracias Bea y Gracias Bea y U U U Uxía. Casi sin darnos cuenta xía. Casi sin darnos cuentaxía. Casi sin darnos cuenta xía. Casi sin darnos cuenta llevamos siendo amigas llevamos siendo amigas llevamos siendo amigas llevamos siendo amigas más de la mitad de más de la mitad de más de la mitad de más de la mitad de nuestras vidas nuestras vidasnuestras vidas nuestras vidas y estoy convencida de que así seguirá siendo y estoy convencida de que así seguirá siendo y estoy convencida de que así seguirá siendo y estoy convencida de que así seguirá siendo. Este trabajo también . Este trabajo también . Este trabajo también . Este trabajo también os osos os lo debo a lo debo a lo debo a lo debo a vosotras vosotrasvosotras vosotras, ya que salir, viajar, conciertear y, en defi , ya que salir, viajar, conciertear y, en defi, ya que salir, viajar, conciertear y, en defi , ya que salir, viajar, conciertear y, en definitiva, pasar momentos nitiva, pasar momentos nitiva, pasar momentos nitiva, pasar momentos juntas juntasjuntas juntas me me me me permite permite permite permite carga cargacarga cargar rr r las pila las pila las pila las pilas para seguir adelante. s para seguir adelante. s para seguir adelante. s para seguir adelante. Gracias niñas! Gracias niñas!Gracias niñas! Gracias niñas! Gracias GraciasGracias Gracias Paula y Miguel. Estos años que hemos estado más lejos Paula y Miguel. Estos años que hemos estado más lejos Paula y Miguel. Estos años que hemos estado más lejos Paula y Miguel. Estos años que hemos estado más lejos los los los los unos de los otros me he unos de los otros me he unos de los otros me he unos de los otros me he dado cuenta de lo mucho dado cuenta de lo mucho dado cuenta de lo mucho dado cuenta de lo mucho que que que que os necesito y de lo mucho que os necesito y de lo mucho que os necesito y de lo mucho que os necesito y de lo mucho que disfruto cua disfruto cuadisfruto cua disfruto cuando estamos juntos. ndo estamos juntos. ndo estamos juntos. ndo estamos juntos. Gracias manitos, porque sé que siempre puedo contar con vosotros Gracias manitos, porque sé que siempre puedo contar con vosotrosGracias manitos, porque sé que siempre puedo contar con vosotros Gracias manitos, porque sé que siempre puedo contar con vosotros para lo que sea para lo que sea para lo que sea para lo que sea. . . . Y, Y, Y, Y, f ff finalmente, gracias a mis padres, porque sin inalmente, gracias a mis padres, porque sin inalmente, gracias a mis padres, porque sin inalmente, gracias a mis padres, porque sin vuestro vuestrovuestro vuestro cariño cariño cariño cariño, apoyo , apoyo, apoyo , apoyo y y y y sacrificio sacrificio sacrificio sacrificio diario diario diario diarios ss s yo yo yo yo nunca hubiera llegado hasta aquí. nunca hubiera llegado hasta aquí.nunca hubiera llegado hasta aquí. nunca hubiera llegado hasta aquí. No os lo digo nunca, per No os lo digo nunca, perNo os lo digo nunca, per No os lo digo nunca, pero os quiero un montón! o os quiero un montón!o os quiero un montón! o os quiero un montón! ♫ Questions unfolding like Questions unfolding likeQuestions unfolding like Questions unfolding like books and their pages books and their pagesbooks and their pages books and their pages They just keep on turning for me They just keep on turning for meThey just keep on turning for me They just keep on turning for me And I keep on asking, And I keep on asking,And I keep on asking, And I keep on asking, Why every question will somehow relate back to me Why every question will somehow relate back to meWhy every question will somehow relate back to me Why every question will somehow relate back to me I was told by a knight of the sun, I was told by a knight of the sun, I was told by a knight of the sun, I was told by a knight of the sun, That wisdom could set That wisdom could setThat wisdom could set That wisdom could set people free people free people free people free Be content in your questions Be content in your questionsBe content in your questions Be content in your questions And may I just mention And may I just mentionAnd may I just mention And may I just mention You’re only a drop in the sea You’re only a drop in the seaYou’re only a drop in the sea You’re only a drop in the sea Direction revolving Direction revolvingDirection revolving Direction revolving These questions I’m solving but nobody hears what I say These questions I’m solving but nobody hears what I sayThese questions I’m solving but nobody hears what I say These questions I’m solving but nobody hears what I say My answers unspoken of sweetest emotion, My answers unspoken of sweetest emotion,My answers unspoken of sweetest emotion, My answers unspoken of sweetest emotion, Believe how I feel today Believe how I feel todayBelieve how I feel today Believe how I feel today Just believe how yo Just believe how yoJust believe how yo Just believe how you feel today u feel todayu feel today u feel today ♪ (k.S.) (k.S.)(k.S.) (k.S.) A mis padres y hermanos A mis padres y hermanosA mis padres y hermanos A mis padres y hermanos ÍNDICE IV 5.2 FOTODEGRADACIÓN EN EL MEDIOAMBIENTE.............................103 5.3 APLICACIONES TÉCNICAS DE LOS PROCESOS DE FOTODEGRADACIÓN.........................................................................105 5.4 CINÉTICA DE LOS PROCESOS DE FOTODEGRADACIÓN................105 5.5 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA ESTUDIAR EL COMPORTAMIENTO FOTOQUÍMICO DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS .........................................................................................................106 5.6 FOTO-SPME.................................................................................108 5.7 FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES.......................................109 5.7.1 INTRODUCCIÓN.......................................................................... 110 5.7.2 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA ALETRINA....................... 111 5.7.3 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA CIFLUTRINA ................... 114 5.7.4 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA CIHALOTRINA................. 115 5.7.5 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA CIPERMETRINA ............... 117 5.7.6 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA DELTAMETRINA............... 120 5.7.7 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DEL FENVALERATO ................... 124 5.7.8 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DEL FLUCITRINATO .................. 127 5.7.9 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA PERMETRINA .................. 129 5.7.10 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA FENOTRINA .................. 131 5.7.11 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA TRANSFLUTRINA ........... 132 5.8 FOTODEGRADACIÓN DEL BUTÓXIDO DE PIPERONILO................133 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................136 II. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .................................143 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................148 III. EXPERIMENTAL ......................................................149 1. PATRONES............................................................................... 151 2. REACTIVOS, GASES Y DISOLVENTES ........................................ 153 3. MATERIAL................................................................................ 154 ÍNDICE V 4. PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES DE TRABAJO ................ 156 4.1 CAPÍTULOS IV.1, IV.2 Y IV.3 (DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN SUELO, PIENSO Y LECHE)................................................................. 156 4.2 CAPÍTULO IV.4 (FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES) ........... 156 5. ACONDICIONAMIENTO Y LIMPIEZA DEL MATERIAL ................. 157 5.1 LIMPIEZA DEL MATERIAL........................................................... 157 5.2 ACONDICIONAMIENTO Y LIMPIEZA DE FIBRAS DE SPME........... 158 5.3 ACONDICIONAMIENTO DE REACTIVOS ...................................... 159 6. GESTIÓN DE RESIDUOS ........................................................... 159 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................161 CAPÍTULO IV.1. DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN SUELO ...... 165 1.1 PARTE EXPERIMENTAL............................................................... 166 1.1.1 MUESTRAS ANALIZADAS ..............................................................166 1.1.2 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN. SPME.......................................167 1.1.3 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y DETECCIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES................................................................................168 1.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................... 170 1.2.1 OPTIMIZACIÓN DE LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA ...................170 1.2.2 EXPERIMENTOS PREVIOS DE SPME................................................171 1.2.2.1 Influencia del incremento de la temperatura de extracción y de la adición de disolvente ........................................................................171 1.2.2.2 Selección de fibras ................................................................173 1.2.3 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE SPME: DISEÑO FACTORIAL...........175 1.2.3.1 Cartas Pareto y gráficos de efectos principales..........................176 1.2.3.2 Gráficos de interacciones .......................................................179 1.2.4 PARÁMETROS ANALÍTICOS DE CALIDAD DEL MÉTODO.....................182 1.2.5 ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ Y EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD .....184 1.2.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SUELO REALES ...................................187 BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 190 ÍNDICE VI CAPÍTULO IV.2. DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN PIENSO .... 193 2.1 PARTE EXPERIMENTAL ...............................................................194 2.1.1 MUESTRAS ANALIZADAS.............................................................. 194 2.1.2 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN. MSPD...................................... 195 2.1.3 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN. PSE......................................... 197 2.1.4 PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA BASADOS EN LA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE) ..................................................................................... 198 2.1.5 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y DETECCIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES............................................................................... 199 2.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: MSPD...........................................201 2.2.1 EXPERIMENTOS PREVIOS DE MSPD............................................... 201 2.2.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE MSPD: DISEÑO FACTORIAL.......... 202 2.2.3 INFLUENCIA DEL TAMAÑO DE MUESTRA ........................................ 210 2.2.4 PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS .............................................. 211 2.2.5 CONCENTRACIÓN DE LOS EXTRACTOS .......................................... 211 2.2.6 PARÁMETROS ANALÍTICOS DE CALIDAD DEL MÉTODO .................... 212 2.2.7 ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ Y EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD..... 214 2.3 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: PSE..............................................218 2.3.1 EXPERIMENTOS PREVIOS DE PSE.................................................. 218 2.3.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PSE: DISEÑO FACTORIAL............. 220 2.3.2.1 Cartas Pareto y gráficos de efectos principales ......................... 222 2.3.2.2 Gráficos de interacciones....................................................... 225 2.3.3 INFLUENCIA DEL NÚMERO Y TIPO DE FILTROS ............................... 228 2.3.4 CONCENTRACIÓN DE LOS EXTRACTOS .......................................... 228 2.3.5 PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS .............................................. 229 2.3.6 PARÁMETROS ANALÍTICOS DE CALIDAD DEL MÉTODO .................... 231 2.3.7 ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ Y EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD..... 234 2.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE PIENSO REALES .............................236 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................240 CAPÍTULO IV.3. DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS EN LECHE....... 243 3.1 PARTE EXPERIMENTAL ...............................................................244 3.1.1 MUESTRAS ANALIZADAS.............................................................. 244 3.1.2 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN. SPME ...................................... 245 ÍNDICE VII 3.1.3 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y DETECCIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES................................................................................246 3.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................... 247 3.2.1 EXPERIMENTOS PREVIOS DE SPME................................................247 3.2.1.1 Influencia del modo de muestreo y de la relación de dilución......247 3.2.1.2 Influencia del volumen de acetona ..........................................249 3.2.1.3 Influencia del tiempo de extracción .........................................250 3.2.1.4 Influencia del recubrimiento de la fibra ....................................251 3.2.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE SPME: DISEÑO FACTORIAL...........253 3.2.2.1 Cartas Pareto y gráficos de efectos principales..........................254 2.2.2.2 Gráficos de interacciones .......................................................257 3.2.3 PARÁMETROS ANALÍTICOS DE CALIDAD DEL MÉTODO.....................261 3.2.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LECHE CON DIFERENTE CONTENIDO GRASO .........................................................................................................264 3.2.5 EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD ....................................................265 3.2.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LECHE REALES ...................................267 BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 268 CAPÍTULO IV.4. ESTUDIO DE LA FOTODEGRADACIÓN DE INSECTICIDAS PIRETROIDES...................................................... 271 4.1 PARTE EXPERIMENTAL............................................................... 272 4.1.1 MUESTRAS ANALIZADAS ..............................................................272 4.1.2 SPME Y PROCEDIMIENTOS DE FOTODEGRADACIÓN.........................272 4.1.2 TEST DE OSCURIDAD...................................................................274 4.1.3 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Y DETECCIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES................................................................................275 4.1.4 MEDIDA DE ESPECTROS UV-VIS....................................................277 4.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: PIRETROIDES DIHALOGENOVINÍLICOS.................................................................. 277 4.2.1 EXPERIMENTOS PRELIMINARES.....................................................279 4.2.1.1 Espectros UV ........................................................................279 4.2.1.2 Test de oscuridad..................................................................279 4.2.2 FOTO-SPME ................................................................................281 4.2.2.1 Influencia del tiempo de irradiación.........................................281 ÍNDICE VIII 4.2.2.2 Comportamiento cinético de primer orden ............................... 282 4.2.3 ESTUDIO CINÉTICO UTILIZANDO UNA MUESTRA DE AGUA REAL ...... 284 4.2.4 IDENTIFICACIÓN DE FOTOPRODUCTOS ......................................... 285 4.2.3.1 Fotodegradación de la λ-cihalotrina ........................................ 294 4.2.3.2 Fotodegradación de la permetrina........................................... 296 4.2.3.3 Fotodegradación de la ciflutrina.............................................. 299 4.2.3.4 Fotodegradación de la cipermetrina ........................................ 302 4.2.3.5 Fotodegradación de la deltametrina ........................................ 304 4.2.4 FOTO-SPME UTILIZANDO LUZ SOLAR NATURAL .............................. 305 4.3 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: PIRETROIDES DE USO DOMÉSTICO Y BUTÓXIDO DE PIPERONILO..............................................................307 4.3.1 EXPERIMENTOS PRELIMINARES .................................................... 308 4.3.1.1 Espectros UV ....................................................................... 308 4.3.1.2 Test de oscuridad ................................................................. 309 4.3.2 FOTO-SPME................................................................................ 310 4.3.2.1 Influencia del tiempo de irradiación ........................................ 310 4.3.2.2 Comportamiento cinético de primer orden ............................... 311 4.3.3 IDENTIFICACIÓN DE FOTOPRODUCTOS ......................................... 313 4.3.3.1 Fotoproductos de la empentrina ............................................. 322 4.3.3.2 Fotoproductos de la transflutrina ............................................ 323 4.3.3.3 Fotoproductos de la aletrina................................................... 326 4.3.3.4 Fotoproductos de la fenotrina................................................. 327 4.3.3.5 Fotoproductos de la cifenotrina .............................................. 329 4.3.3.6 Fotoproductos del PBO .......................................................... 331 4.4 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: PIRETROIDES CARENTES DE ANILLO CICLOPROPANO................................................................................332 4.4.1 EXPERIMENTOS PRELIMINARES .................................................... 333 4.4.1.1 Espectros UV ....................................................................... 333 4.4.1.2 Influencia de la fuente de irradiación ...................................... 334 4.4.1.3 Test de oscuridad ................................................................. 336 4.4.2 FOTO-SPME................................................................................ 336 4.4.2.1 Influencia del tiempo de irradiación ........................................ 336 4.4.2.2 Comportamiento cinético de primer orden ............................... 338 4.4.3 IDENTIFICACIÓN DE FOTOPRODUCTOS ......................................... 340 ÍNDICE IX 4.4.3.1 Decarboxilación y rutas relacionadas .......................................352 4.4.3.2 Fotoproductos asociados con la parte ácida ..............................354 4.4.3.3 Fotoproductos asociados con la parte alcohol............................355 4.5 TOXICIDAD DE LOS FOTOPRODUCTOS ....................................... 356 BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 358 V. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ............................... 363 ANEXO I: ESTANCIAS ................................................... 377 ANEXO I.1. ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AIRE INDOOR DE EDIFICIOS MODERNOS CON CASOS DETECTADOS DE LIPOATROFIA SEMICIRCULAR ........................................................................... 381 BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 383 ANEXO I.2. FOTO-SPME DE CONTAMINANTES INDOOR ................ 385 ANEXO I.3. ESTUDIO DE LA FOTOOXIDACIÓN DEL ACEITE MEDIANTE SPME ........................................................................................... 411 BIBLIOGRAFÍA................................................................................. 413 ANEXO II: LISTADO DE PUBLICACIONES...................... 423 ANEXO III: ACRÓNIMOS............................................... 427 1 ABSTRACT 1. PESTICIDAS 8 pesticidas sobre la salud humana y el medioambiente, existen regulaciones estrictas relativas a su registro y uso por todo el mundo, especialmente en los países desarrollados. No obstante y, a pesar de los avances en lo que respecta al control biológico de las plagas y al desarrollo de la resistencia de las plantas a las mismas (agricultura ecológica), los pesticidas son todavía indispensables para alimentar y proteger de enfermedades a la población mundial. Es más, se ha estimado que, si no se aplicaran pesticidas, se podría perder aproximadamente un tercio de las cosechas. [2] 1.2 CLASIFICACIÓN Los pesticidas se pueden clasificar atendiendo a diferentes criterios: organismo objetivo, constitución química, toxicidad, modo de acción, etc. En función del tipo de organismo que el pesticida desee controlar se distinguen, entre otros, los siguientes grupos [1]: • fungicidas: matan hongos (incluyendo añublos, moho, royas, etc.), • herbicidas: matan malas hierbas y otras plantas no deseadas, • insecticidas: matan insectos y otros artrópodos, • acaricidas: matan ácaros que se alimentan en plantas y animales, • moluscicidas: matan caracoles y babosas, • nematicidas: matan nematodos (organismos microscópicos similares a los gusanos que se alimentan en las raíces de las plantas), • ovicidas: matan huevos de insectos y ácaros, • feromonas: compuestos bioquímicos que interrumpen el apareamiento de los insectos, • rodenticidas: controlan a los ratones y a otros roedores. Los herbicidas, insecticidas y fungicidas son los pesticidas más habituales y, sobre la base de su constitución química, se diferencian los siguientes subgrupos [2]: I. INTRODUCCIÓN 9 herbicidas: insecticidas: fungicidas: • amidas • benzoilureas • azoles • ácidos benzoicos • carbamatos • bencimidazoles • carbamatos • organoclorados • ditiocarbamatos • nitrilos • organofosforados • morfolinas • nitroanilinas • piretroides • misceláneo • organofosforados • fenoxi ácidos • piridinas y compuestos de amonio cuaternarios • piridacinas y piridacinonas • triazinas • ureas En la Tabla I.1.1 se han incluido los nombres comunes de los pesticidas (y algunos productos de su degradación) estudiados en el presente trabajo, además de la clasificación correspondiente en función de su uso y de su constitución química. 1. PESTICIDAS 10 Tabla I.1.1 Clasificación de los pesticidas estudiados en el presente trabajo. 1.3 EVOLUCIÓN Y DESARROLLO DEL MERCADO DE PESTICIDAS El uso de pesticidas se ha visto incrementado en 50 veces desde 1950 y, hoy en día, se utilizan unos 2,5 millones de toneladas de pesticidas industriales al año. La Figura I.1.2 muestra la evolución de las ventas desde 1990 hasta el 2005. De acuerdo con el Informe Anual del 2001-2002 de la Asociación para la Protección del Cultivo en Europa (ECPA), las principales áreas agrícolas en el uso de pesticidas son Norte América, Europa y Asia con un 31,9%, 23,8% y 22,6%, respectivamente, en 2001. Clase química Pesticida Uso Aletrina Insecticida Cifenotrina Insecticida Ciflutrina Insecticida λ-Cihalotrina Insecticida Cipermetrina Acaricida/Insecticida Deltametrina Insecticida Empentrina Insecticida Fenotrina Insecticida Fenvalerato Acaricida/Insecticida Flucitrinato Acaricida/Insecticida Permetrina Acaricida/Insecticida Teflutrina Insecticida Tetrametrina Insecticida Piretroides Transflutrina Insecticida Aldehído de endrina Producto de degradación/metabolito Aldrina Insecticida Cetona de endrina Producto de degradación/metabolito α -Clordano Insecticida γ-Clordano Insecticida 4,4’-DDD Insecticida 4,4’-DDE Producto de degradación/metabolito 4,4’-DDT Acaricida/Insecticida Dieldrina Insecticida Endosulfán I Acaricida/Insecticida Endosulfán II Acaricida/Insecticida Endrina Insecticida Epóxido de heptacloro Producto de degradación/metabolito Heptacloro Insecticida α -Lindano Acaricida/Insecticida/Rodenticida β-Lindano Acaricida/Insecticida/Rodenticida γ-Lindano Acaricida/Insecticida/Rodenticida δ-Lindano Acaricida/Insecticida/Rodenticida Metoxicloro Insecticida Organoclorados Sulfato de endosulfán Producto de degradación/metabolito Clorpirifos Acaricida/Insecticida/Nematicida Organofosforados Fenitrotion Acaricida/Insecticida Acetocloro Herbicida Amidas Alacloro Herbicida I. INTRODUCCIÓN 11 Además, los herbicidas son el principal grupo de pesticidas utilizado en el mundo, seguidos de los insecticidas y de los fungicidas. No obstante, se debe tener en cuenta que la cantidad de pesticidas aplicada en una determinada área geográfica depende de las condiciones climáticas y del brote de plagas y enfermedades de cada año en particular. [3, 4] 1.4 RESTRICCIONES EN EL USO DE PESTICIDAS. LEGISLACIÓN El registro de un pesticida concreto para su aplicación sobre un determinado cultivo demanda una serie de datos que prueben su eficacia y seguridad en el uso. Por eso, normalmente se requiere información acerca de sus propiedades físico-químicas, métodos analíticos, eficacia, toxicología, ecotoxicología, y destino y comportamiento en el medioambiente. Además, en los países desarrollados se han restringido los residuos remanentes en los cultivos tras la aplicación de los pesticidas para así garantizar un consumo alimentario seguro. Para ello, se han establecido niveles de residuo máximos (MRLs) en diferentes alimentos conforme a las buenas prácticas agrícolas, los efectos tóxicos observados para el pesticida en cuestión, y la cantidad de alimento consumido. Los MRLs normalmente se fijan teniendo en cuenta además el consumo diario admisible (ADI) de los pesticidas, que es la cantidad de pesticida que se puede ingerir diariamente durante toda la vida sin mostrar un efecto adverso apreciable [2]. Los MRLs están propuestos por la Reunión Conjunta FAO/OMS sobre Residuos de Pesticidas (JMPR) [5] y recomendados por el Comité del Codex sobre Residuos de Pesticidas (Codex Committee on Pesticide Residues) [6]. 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 millones de dólares ($) Figura I.1.2 Evolución del mercado mundial de pesticidas desde 1990 hasta el 2005 [3]. 1. PESTICIDAS 12 Además, existe una legislación comunitaria europea específica en relación con los residuos de medicamentos veterinarios y de determinados plaguicidas y contaminantes en los alimentos de origen animal. La Directiva 96/23/CE dispone las exigencias que deben respetarse en la planificación y puesta en práctica de los planes nacionales de control de los residuos en animales vivos y en productos de origen animal. El objetivo principal que se persigue es detectar el uso de sustancias ilegales en la producción animal y el uso indebido de productos veterinarios autorizados, así como garantizar la aplicación de medidas adecuadas para minimizar la reaparición de este tipo de residuos en los alimentos de origen animal. En virtud de esta normativa, los Estados miembros están obligados a presentar cada año planes nacionales de control de los residuos, para que sean aprobados por la Comisión Europea. Entre las sustancias indeseables consideradas por esta directiva se encuentran compuestos organoclorados, compuestos organofosforados, piretroides y carbamatos; mientras que los animales y productos abarcados incluyen bovinos, ovinos, caprinos, porcinos, équidos, aves de corral, conejos, caza silvestre y de cría, acuicultura, miel, leche y huevos. [7] En lo que a los residuos de sustancias indeseables en leche se refiere, la Unión Europea (EU) ha establecido MRLs para una parte importante de los pesticidas estudiados en esta Tesis [8]. Por otro lado, también se han establecido límites legales para proteger a los consumidores de la exposición a niveles inaceptables de pesticidas en piensos y en los principales cultivos empleados para su elaboración. Así, de acuerdo con la directiva europea 2002/32/EC acerca de sustancias indeseables en alimentos para animales, se establecieron MRLs comprendidos entre 5 y 2000 ng g -1 para los pesticidas organoclorados más comunes [9]. Además, en Septiembre del 2008 entró en vigor en la Unión Europea una nueva regulación que harmoniza los límites aplicables y que cubre no sólo los productos para consumo humano si no también para la alimentación animal [8, 10]. Esta regulación incluye pesticidas usados en el ámbito agrícola actualmente y también en el pasado, tanto dentro como fuera de la EU y plantea la pregunta de en qué medida se verá afectada la directiva actual 2002/32/EC, ya que ésta no menciona ningún pesticida de uso reciente moderno. Además, si no se alude específicamente a un determinado fitosanitario, se le aplica por defecto un MRL de 10 ng g -1 . En la Tabla I.1.2 se muestran los MRLs establecidos por la legislación europea actual para los pesticidas estudiados en esta Tesis en leche, alimentos para I. INTRODUCCIÓN 13 animales e ingredientes más comunes en piensos de ganado (cebada, semilla de soja, maíz y trigo). Tabla I.1.2 Legislación europea vigente en relación a los MRLs de los pesticidas investigados en leche, en alimentos para animales y en los ingredientes más habituales empleados para la elaboración de piensos de ganado [8-10]. aaldrina y dieldrina combinados dsuma de los isómeros I, II y sulfato de endosulfán bsuma de α - y γ-clordano esuma de heptacloro y epóxido de heptacloro csuma de p,p’-DDT, o,p’-DDT, p,p’-DDE y p,p’-DDD MRL ng g-1 Legislación en alimentos para animales (contenido en humedad del 12%) MRL ng g-1 Pesticida leche productos destinados a la alimentación de animales MRL ng g-1 cebada s emilla de soja maíz trigo Todos los alimentos para animales a excepción de: 10 Aldrina y Dieldrinaa 6 grasas 200 10 20 10 10 Todos los alimentos para animales a excepción de: 20 Clordanob 2 grasas 50 20 Todos los alimentos para animales a excepción de: 50 DDTc 40 grasas 500 50 50 50 50 Todos los alimentos para animales a excepción de: 100 maíz 200 semillas de aceite 500 Endosulfánd 50 alimentos comp le tos para peces 5 50 500 50 50 Todos los alimentos para animales a excepción de: 10 Endrina grasas 50 10 10 10 10 Todos los alimentos para animales a excepción de: 10 Heptacloroe 4 grasas 200 10 10 10 10 Todos los alimentos para animales a excepción de: 20 α -Lindano grasas 200 Alimentos compuestos para animales a excepción de: 10 alimentos para ganado vacuno 5 Componentes de piensos a excepción de: 10 β-Lindano grasas 100 Todos los alimentos para animales a excepción de: 200 γ-Lindano 1 grasas 2000 10 10 10 10 Metoxicloro 10 10 10 10 10 Acetocloro 10 10 10 100 10 Alacloro 10 50 200 200 50 Clorpirifos 10 200 50 50 50 Fenitrotion 500 10 500 500 1. PESTICIDAS 14 Tabla I.1.2 Legislación europea vigente en relación a los MRLs de los pesticidas investigados en leche, en alimentos para animales y en los ingredientes más habituales empleados para la elaboración de piensos de ganado [8-10], (continuación). fsuma de isómeros gMRL para cis-deltametrina Por otro lado, la regulación de sitios contaminados está recibiendo cada vez más atención en la EU y, en Septiembre del 2006, la Comisión Europea adoptó una estrategia exhaustiva dedicada a la protección de los suelos. Sin embargo, actualmente sólo nueve estados miembros de la EU poseen legislación específica relativa a la protección de suelos [11]. España es uno de esos países y fue en el 2005 cuando el gobierno introdujo una regulación para la evaluación y control de suelos contaminados. De acuerdo con esta directiva, un suelo se declarará contaminado cuando en él se identifiquen riesgos inaceptables para la protección de la salud humana (o del ecosistema) debidos a la presencia de los compuestos incluidos en el Real Decreto Español 9/2005, siendo la mayoría de ellos compuestos organoclorados y aromáticos. Para evaluar la contaminación de los suelos se han propuesto niveles de referencia genéricos en función del uso del suelo (industrial, urbano u otros) [12]. En la Tabla I.1.3 se incluyen los niveles de referencia genéricos establecidos para los pesticidas estudiados en esta Tesis por la legislación española para la protección de la salud humana. Tal y como se deduce de la tabla, menos de la mitad de los fitosanitarios investigados en este trabajo están legislados, siendo todos ellos organoclorados. MRL ng g-1 Legislación en alimentos para animales (contenido en humedad del 12%) MRL ng g-1 Pesticida leche productos destinados a la alimentación de animales MRL ng g-1 cebada semilla de soja maíz trigo Ciflutrinaf 20 20 20 50 20 λ-Cihalotrina 50 50 50 20 20 Cipermetrinaf 20 2000 50 50 2000 Deltametrinag 50 2000 50 2000 2000 Fenotrina 50 50 50 50 50 Fenvalerato y Esfenvalerato (RR+SS) 200 50 20 50 Fenvalerato y Esfenvalerato (RS+SR) 20 50 50 20 20 Flucitrinato 50 50 50 50 50 Permetrinaf 50 50 50 50 50 Teflutrina 50 50 50 50 50 I. INTRODUCCIÓN 15 Tabla I.1.3 Niveles de referencia genéricos en suelo establecidos por la legislación española para los pesticidas investigados [12]. Niveles de referencia genéricos para la protección de la salud humana (mg/Kg) Pesticida uso industrial uso urbano otros usos* Aldrina 1 0,1 0,01 Clordano 1 0,1 0,01 4,4’-DDD 70 7 0,7 4,4’-DDE 60 6 0,6 4,4’-DDT 20 2 0,2 Dieldrina 1 0,1 0,01 Endosulfán 60 6 0,6 Endrina 1 0,1 0,01 Epóxido de heptacloro 1 0,1 0,01 α -Lindano 1 0,1 0,01 β-Lindano 1 0,1 0,01 γ-Lindano 1 0,1 0,01 *incluye actividades agrícolas En los siguientes apartados de este Capítulo I.1 se describirán con mayor profundidad los distintos grupos de pesticidas estudiados en esta Tesis. Se ha prestado especial atención a los piretroides ya que, junto con los organoclorados, son el grupo de fitosanitarios más numeroso de los incluidos en este trabajo; además, la bibliografía relativa a estos compuestos es bastante escasa si se compara con la gran cantidad de información publicada acerca de los pesticidas organoclorados. 1. PESTICIDAS 16 1.5 PESTICIDAS PIRETROIDES 1.5.1 INTRODUCCIÓN El piretro es el extracto natural derivado de las flores de las plantas Chrysanthemum cinerariaefolium (Figura I.1.3) y Chrysanthemum cineum. Desde hace tiempo se sabe que el piretro posee propiedades insecticidas y fue en Asia, alrededor del año 1800, cuando se comenzó a emplear este extracto para la manufactura de productos antipulgas y antipiojos. Los seis compuestos activos del piretro se llaman piretrinas. Las piretrinas individuales son: piretrina I, piretrina II, jasmolina I, jasmolina II, cinerina I y cinerina II. Estos compuestos son ésteres de dos ácidos carboxílicos (ácido crisantémico, para la serie I, y ácido pirétrico, para la serie II) y de tres ciclopentenolonas (piretrolona, jasmolona y cinerolona) [13]. Las estructuras de las seis piretrinas se muestran en la Figura I.1.3. El principal inconveniente del piretro como insecticida es su inestabilidad a la luz y al aire, lo que limita su efectividad en la protección de cultivos y en otros contextos del control de insectos en los que la actividad residual del pesticida es esencial. Los esfuerzos por modificar la estructura de las piretrinas naturales con el objetivo de incrementar la fotoestabilidad, manteniendo la actividad insecticida y la relativa baja toxicidad aguda hacia los mamíferos, condujeron al desarrollo de los piretroides sintéticos. La mayoría de los piretroides sintéticos se desarrollaron partiendo de la sustitución secuencial de elementos estructurales de las piretrinas por elementos estructurales novedosos seleccionados para conservar la forma molecular y las propiedades físicas de la estructura original. Las piretrinas son ésteres de un ácido ciclopropanocarboxílico y de un alcohol ciclopentenolona y, en un principio, las Figura I.1.3 Estructura de las piretrinas [14] y fotografía de la planta Chrysanthemum cinerariaefolium. O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O Piretrina Piretrina I I Piretrina Piretrina II II Jasmolina Jasmolina I I Jasmolina Jasmolina II II Cinerina Cinerina I I Cinerina Cinerina II II O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O Piretrina Piretrina I I Piretrina Piretrina II II Jasmolina Jasmolina I I Jasmolina Jasmolina II II Cinerina Cinerina I I Cinerina Cinerina II II I. INTRODUCCIÓN 17 modificaciones sintéticas mantuvieron constante una de estas partes de la molécula mientras que en la otra se introducían nuevas características estructurales. Sin embargo, en las siguientes etapas de diseño de los nuevos compuestos se emplearon como plantillas los recién descubiertos piretroides con la actividad insecticida, la estabilidad y otras propiedades deseadas [15]. De manera que, aunque están basados en la estructura química y en la actividad biológica de las piretrinas, el desarrollo sintético de los piretroides ha supuesto modificaciones químicas importantes que hacen que estos compuestos sean menos degradables en el medioambiente pero también más tóxicos [16]. El uso de estos pesticidas reside en el control de plagas de insectos en la agricultura, en el ámbito doméstico y en el almacén de productos [16] y, a menudo, se formulan con compuestos como el butóxido de piperonilo (del que se hablará en el Apartado 1.5.7), el sulfóxido de piperonilo y el sesamex, que funcionan como sinergistas incrementando la efectividad del insecticida [13]. 1.5.2 ESTRUCTURA La mayoría de los piretroides son ésteres sintéticos derivados de las piretrinas. Sin embargo, también hay un grupo de éteres oxima que exhiben una actividad insecticida similar a la de las piretrinas y los ésteres piretroides; pero se dispone de pocos datos acerca de estos compuestos y no se han fabricado productos comerciales de los mismos [13]. Por otro lado, un gran número de insecticidas piretroides presentan un anillo ciclopropánico aunque otros, como el fenvalerato y el flucitrinato, carecen de dicho elemento estructural. La química y la actividad de los piretroides permite clasificarlos en dos grupos (Tipo I y Tipo II) dependiendo del sustituyente alcohol. El grupo Tipo I es muy amplio e incluye a los piretroides que contienen el grupo desciano-3-fenoxibencilo (p. ej. fenotrina) u otros alcoholes (p. ej. aletrina, empentrina, transflutrina). En cuanto a los piretroides de Tipo II, están más estrechamente definidos en términos de su estructura química puesto que contienen específicamente el grupo α -ciano-3- fenoxibencilo (p. ej. cifenotrina) [17]. 1. PESTICIDAS 24 espina dorsal) como en el periférico (nervios en otras partes del cuerpo) [17]. Los piretroides de Tipo I causan principalmente temblores (síndrome-T) y los piretroides de Tipo II provocan coreoatetosis y salivación (síndrome-CS). No obstante, piretroides como la permetrina exhiben características (T y CS) de ambos grupos [25]. 1.5.5.2 Relación entre estereoquímica y toxicidad La toxicidad de los piretroides depende mucho de la estereoquímica de la molécula. Algunos piretroides pueden llegar a tener hasta 16 isómeros y cada isómero tiene su propia toxicidad [16]. En los piretroides que poseen el anillo ciclopropano, el isomerismo en torno a dicho anillo afecta de manera importante a la toxicidad de estos insecticidas. La presencia de dos centros quirales en el anillo conduce a la existencia de dos pares de diastereoisómeros. Estos diatereoisómeros y sus enantiómeros se muestran en la Figura I.1.4. Las conformaciones 1R en el anillo ciclopropano son considerablemente más tóxicas que las 1S. Por otro lado, tanto los isómeros cis como los trans muestran actividad insecticida, pero poseen diferentes toxicidades hacia los mamíferos siendo los isómeros cis más potentes. Además, los piretroides que contienen un sustituyente ciano en la parte alcohol (Tipo II) muestran una toxicidad diferente en función del isomerismo óptico del carbono α . Se ha demostrado que la conformación S alrededor del carbono α es considerablemente más tóxica hacia los insectos si se compara con la conformación R. La producción de piretroides con diferentes relaciones isoméricas es una de las razones por las que hay una gran variedad en las toxicidades de estos compuestos [13]. 1.5.5.3 Toxicidad aguda en mamíferos La toxicidad aguda en mamíferos varía mucho de un piretroide a otro. En general son menos tóxicos que los pesticidas organofosforados, carbamatos y organoclorados, aunque hay algunas excepciones (deltametrina, teflutrina, cihalotrina, fenpropatrina, flucitrinato, bifentrina y esfenvalerato) con toxicidades orales agudas superiores. HH R R H H HR H H R H OOR' O OR' OOR' O OR' 1S, cis 1R, cis 1S, trans 1R, trans Figura I.1.4 Isomerismo en el anillo ciclopropano. I. INTRODUCCIÓN 25 Diversos estudios han mostrado que los principales efectos de los piretroides son neurotoxicidad a altas dosis e hipertrofia en el hígado. Si no se produce la muerte, estos cambios se ha visto que son reversibles. Además, muchos piretroides pueden ser ligera o severamente irritantes de la piel y de los ojos. 1.5.5.4 Toxicidad crónica y subcrónica Los efectos crónicos y subcrónicos no-cancerosos más notables en mamíferos son los signos de toxicidad aguda, que habitualmente son temporales y que disminuyen considerablemente si la exposición crónica continúa. Otros efectos crónicos son la reducción en la velocidad de crecimiento, el aumento del hígado y el incremento en la actividad de algunas enzimas hepáticas. Estos cambios no son completamente reversibles. 1.5.5.5 Mutagenicidad y carcinogenicidad En varios estudios realizados, la aletrina y otros piretroides como la cipermetrina y la permetrina han mostrado algunos efectos mutagénicos, pero la respuesta (cambios en el tuétano de los ratones) sólo fue importante en el caso de la permetrina. A pesar de estos resultados, se considera que el potencial mutagénico de los piretroides es muy bajo si no inexistente. Estudios de carcinogenicidad de la permetrina, la deltametrina, la resmetrina y el fenvalerato han mostrado incrementos en varios tipos de cáncer, pero sólo la permetrina ha sido considerada por la EPA como potencial o débil carcinógeno. [16] 1.5.5.6 Disrupción endocrina Numerosos compuestos químicos presentes en el medioambiente poseen actividades hormonales y, por lo tanto, han sido clasificados como disruptores endocrinos [26]. Muchos de estos compuestos (y/o los productos de su metabolismo o degradación) interaccionan con receptores de esteroides (estrógeno/andrógeno) imitando (agonistas) o bloqueando (antagonistas) el efecto de las hormonas esteroideas sexuales [27]. 1. PESTICIDAS 26 Se ha relacionado a muchos piretroides con la disrupción del sistema endocrino, lo que puede afectar negativamente a la reproducción y al desarrollo sexual, interferir con el sistema inmune e incrementar las posibilidades de sufrir cáncer de pecho [28]. Además, se han publicado trabajos en los que se ha mostrado que algunos de los metabolitos o productos de degradación medioambiental de los piretroides, más que los compuestos de partida, son motivo de preocupación en lo que respecta a su habilidad para interaccionar con receptores hormonales [27, 29]. 1.5.5.7 Exposición humana Mientras que la inhalación es la principal ruta de exposición en los obreros industriales, el contacto con la piel lo es en los trabajadores que se dedican a aplicar piretroides en la agricultura o en el ámbito de la salud pública. La exposición de la población general puede ocurrir por inhalación, por contacto de la piel con productos, por la ingestión de alimentos con residuos de piretroides o por la bebida accidental de productos que contengan estos insecticidas. [25] 1.5.5.8 Efectos en otros organismos no-objetivo La toxicidad aguda de los piretroides en los pájaros es moderada, con valores de LD 50 que en la mayoría de los casos son superiores a 1000 mg kg -1 . Aún así, los pájaros pueden verse afectados por los piretroides si éstos diezman o perturban sustancialmente sus víveres. Las aves acuáticas son especialmente vulnerables ya que se alimentan casi exclusivamente de invertebrados acuáticos, pequeños insectívoros o pájaros jóvenes. Y es que los piretroides tienen un efecto devastador en los invertebrados acuáticos con valores de LC 50 muchas veces inferiores a 1 ng mL -1 . Los piretroides son muy tóxicos para la mayoría de los peces; aproximadamente un 40% de los valores de LC 50 para los peces son inferiores a 1 ng mL -1 . La deltametrina es uno de los más tóxicos, la aletrina uno de los menos tóxicos y la cipermetrina y la permetrina presentan una toxicidad intermedia. Aunque son menos tolerantes que la mayoría de los mamíferos, los anfibios y los moluscos son mucho más resistentes hacia los piretroides que la mayoría de los peces y crustáceos. I. INTRODUCCIÓN 27 Por otra parte, los piretroides son tóxicos para los insectos, ya sean beneficiosos o plagas. Así por ejemplo, la mayoría de estos insecticidas son muy tóxicos para las abejas y el valor de LD 50 para la abeja de miel puede llegar a ser de 0,03 µg por abeja. [16] 1.5.6 DISTRIBUCIÓN EN EL MEDIOAMBIENTE 1.5.6.1 Liberación al medioambiente La liberación al aire representa la ruta de emisión más importante de las piretrinas y los piretroides, puesto que la mayoría de las aplicaciones de estos insecticidas suponen el rocío aéreo o del suelo de cultivos u otra vegetación (Figura I.1.5), así como el uso de bombas de aerosol y sprays de interior. Sin embargo, el Parlamento Europeo ha aprobado recientemente una nueva legislación que deberá ser implementada por los Estados miembros a principios del 2011 y, según la cual, se prohibirá la aplicación aérea de fitosanitarios [30]. La liberación directa al agua se espera que sea baja, aunque la dispersión del spray tras la aplicación de estos compuestos puede, sin embargo, contaminar aguas cercanas. Las aguas de escorrentía de campos de cultivo o de industrias también pueden contener piretrinas y piretroides. Habitualmente, la liberación al suelo es consecuencia de la deposición de los pesticidas tras su dispersión aérea sobre los cultivos o la vegetación, aunque el desecho inapropiado también puede explicar parte de su presencia en el suelo. Figura I.1.5 Aplicación aérea de pesticidas desde un avión. 1. PESTICIDAS 28 1.5.6.2 Transporte y reparto La dispersión del spray de cualquier pesticida tras su aplicación es una fuente importante de contaminación medioambiental y es responsable de una parte significativa de su transporte aéreo. Basándose en su presión de vapor (Tabla I.1.5), es de esperar que los piretroides existan en la atmósfera tanto en fase vapor como en fase particulada. Estos compuestos se adsorben fuertemente a la superficie del suelo y no se consideran demasiado móviles. Este comportamiento es coherente con los valores de los coeficientes de partición octanol/agua (K ow ) de los piretroides (Tabla I.1.5), que ya predicen un elevado grado de adsorción y poco potencial de lixiviado. La volatilización desde el agua y el suelo se espera que ocurra lentamente para muchos de los piretroides puesto que estos insecticidas generalmente tienen bajas presiones de vapor y bajas constantes de Henry. Cuando estos pesticidas se liberan al agua, se produce el rápido reparto hacia los sedimentos y los sólidos suspendidos. La fuerte adsorción de estos compuestos sobre estas superficies atenúa significativamente los procesos de volatilización. Por otro lado, las pérdidas por volatilización desde las hojas son considerablemente mayores que por volatilización desde los suelos. En lo que respecta a los piretroides que se usan en el interior en forma de sprays o aerosoles, las velocidades de volatilización desde superficies de vidrio o pisos quizás sean significativamente mayores que desde suelos puesto que estos compuestos no se adsorben tan fuertemente a estas superficies. 1.5.6.3 Transformación y degradación En el aire, los piretroides que están en fase vapor se degradan rápidamente a través de su reacción con oxidantes atmosféricos o por fotólisis directa, mientras que los que están en fase particulada se degradan más lentamente. I. INTRODUCCIÓN 29 En el agua, estos pesticidas también se degradan mediante fotólisis en aguas superficiales, y la velocidad de degradación se ve incrementada por agentes fotosensibilizantes que se encuentran en aguas naturales como son los ácidos fúlvicos y húmicos. Generalmente, la hidrólisis sólo es importante bajo condiciones alcalinas y a temperaturas de 20 ºC o mayores. Además, los piretroides se degradan fácilmente por acción de microorganismos. En el suelo, los piretroides se degradan más rápidamente que muchos pesticidas organoclorados, organofosforados y carbamato. La biodegradación juega un papel importante en la desaparición de estos compuestos en suelos. Por otro lado, puesto que la luz se atenúa en función de la profundidad desde la superficie del suelo, la fotólisis de piretrinas y piretroides es sólo un proceso de destino medioambiental importante en la superficie. Una parte importante de esta Tesis está dedicada al estudio de la degradación de los piretroides por acción de la luz. Por ello, se ha considerado apropiado el ampliar la información relativa a la fotodegradación de estos pesticidas, información a la que se le ha dedicado el Capítulo I.5 de esta Introducción. 1.5.6.4 Niveles en el medioambiente Los piretroides se han detectado frecuentemente en el aire de hogares y edificios después de haber sido utilizados. Puesto que estos pesticidas se adsorben fuertemente a los suelos, no se suelen detectar a concentraciones elevadas ni en aguas subterráneas ni en aguas potables. Finalmente, se han detectado piretroides en suelos agrícolas o sedimentos de lagos, ríos y riachuelos contaminados por la dispersión de sprays o por aguas de escorrentía. [13] 1.5.7 BUTÓXIDO DE PIPERONILO (PBO) Los piretroides se pueden metabolizar por acción de enzimas presentes en los insectos, lo que a menudo provoca que un insecto inicialmente paralizado pueda sobrevivir y recuperar la función neurológica. Puesto que esta desintoxicación metabólica es un factor importante que limita la actividad insecticida, los pesticidas a 1. PESTICIDAS 30 menudo se formulan en combinación con sinergistas, incrementando de esta manera la efectividad de los mismos [13, 28, 31]. El butóxido de piperonilo (PBO) es un sinergista desarrollado en 1947 que se utiliza en una gran variedad de formulaciones que contienen piretrinas, piretroides, rotenona y carbamatos. [32] El nombre CAS del PBO [nº CAS 51-03-6] es 5-[[2-(2-butoxietoxi)etoxi]metil]-6- propil-1,3-benzodioxol, y su estructura se muestra en la Figura I.1.6. En cuanto a sus propiedades físico-químicas, el PBO presenta una solubilidad en agua de 14,3 mg L -1 (25 ºC), una presión de vapor de 9,98·10 -8 mmHg (25 ºC) y un coeficiente de partición octanol/agua (log K ow ) de 4,62. [33] El PBO se utiliza como sinergista en los siguientes productos: • pesticidas de uso doméstico de interior, • pesticidas para jardines, céspedes y plantas decorativas, • pesticidas agrícolas para cultivos comestibles y no comestibles, • productos para el control de mosquitos, • tratamientos contra termitas, • productos pesticidas veterinarios, • pesticidas para la ropa, colchones y ropa de cama. [32] Los efectos del PBO en la salud humana y en el medioambiente dependen de la cantidad presente y de la duración y frecuencia de la exposición, así como de la salud de la persona y/o de ciertos factores medioambientales. Su toxicidad es muy baja cuando es ingerido por mamíferos y cuando es inhalado por ratas. Además, la toxicidad en mamíferos es de baja a muy baja cuando es absorbido por la piel. La EPA ha clasificado a este sinergista como carcinógeno del grupo C, es decir, se considera O OO O O Figura I.1.6 Estructura del butóxido de piperonilo. I. INTRODUCCIÓN 31 que es un posible carcinógeno para humanos basándose en la limitada evidencia de cáncer en los animales de laboratorio. [32] En lo que se refiere a su distribución en el medioambiente, los estudios que evaluaron la desaparición del PBO en suelo y agua concluyeron que se trata de un compuesto poco persistente. Además, el PBO tiene poca tendencia a contaminar aguas subterráneas. Cuando se libera hacia el aire en estado líquido termina asentándose en el suelo, mientras que si se libera en fase gaseosa se degrada rápidamente en el aire. [32] 1.6 PESTICIDAS ORGANOCLORADOS 1.6.1 INTRODUCCIÓN Un número importante de pesticidas organoclorados pertenecen al grupo de los contaminantes orgánicos persistentes (POPs), los cuales han sido y son un motivo de preocupación importante debido a su existencia a elevadas concentraciones, incluso en ecosistemas remotos, y a pesar de las prohibiciones de su producción y uso [34, 35]. Son compuestos con una toxicidad de amplio espectro y persistentes, por lo que se acumulan en la cadena alimentaria, implicando altos riesgos tanto para el ecosistema como para la salud humana. [36]. La inquietud medioambiental provocada por el uso generalizado de sustancias tóxicas, como son los pesticidas organoclorados, ha incrementado las restricciones en su producción y uso, primero en los países desarrollados y, más recientemente, también en los países en vías de desarrollo. Así, los pesticidas organoclorados están controlados y gobernados por numerosas regulaciones internacionales entre las que destaca el Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants), firmado en 2001 por cerca de 120 países. Este Convenio entró en vigor el 17 de Mayo de 2004 y su objetivo es el de conseguir la continua minimización y, de ser factible, la completa eliminación de los POPs. Actualmente, ya son 162 los Estados que forman parte de dicho Convenio. En esta primera fase se han fijado como objetivo sólo doce POPs, conocidos como la 1. PESTICIDAS 32 docena sucia. La docena sucia incluye, además de PCBs, dioxinas y furanos, los principales pesticidas organoclorados: aldrina, clordano, DDT, dieldrina, endrina, heptacloro, hexaclorobenceno (HCB), mirex y toxafeno. El Convenio de Estocolmo requiere de todos los estados miembros el cese en la producción de los pesticidas aldrina, dieldrina y heptacloro. Los países con exenciones deberán restringir el uso de estos pesticidas a propósitos concretos y por períodos de tiempo limitados. En cuanto a la producción y uso de clordano, HCB y mirex, se han limitado a fines prescritos y en países en los que se hayan registrado para determinadas exenciones. Por lo que al DDT se refiere, su producción y uso está confinado al control de enfermedades como la malaria. [37] 1.6.2 ESTRUCTURA Estructuralmente, los pesticidas organoclorados se pueden dividir en tres grupos: análogos del DDT, derivados del ciclodieno, y ciclohexanos y bencenos clorados (Tabla I.1.7). I. INTRODUCCIÓN 33 Tabla I.1.7 Clasificación estructural de los pesticidas organoclorados. En la Tabla I.1.8 se muestran las estructuras de los organoclorados estudiados en esta Tesis, así como sus nombres comunes y sus números y nombres CAS . Tabla I.1.8 Identidad química de los organoclorados estudiados. Nombre común [nº CAS] Nombre CAS Estructura química Aldehído de endrina [7421-93-4] (1R,2R,2aR,4S,4aS,5R,6aR,6bR,7S)-2,2a,3,3,4,7- hexaclorodecahidro-1,2,4- metenociclopenta[cd]pentaleno-5-carboxaldehído Cl Cl Cl Cl Cl Cl CHO Aldrina [309-00-2] (1R,4S,4aS,5S,8R,8aR)-1,2,3,4,10,10-hexacloro- 1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-1,4:5,8-dimetanonaftaleno Cl ClCl Cl Cl Cl Cetona de endrina [53494-70-5] (2R,3aR,3bS,4R,5R,6aS,7S,7aR,8R)-3b,4,5,6,6,6a- hexaclorodecahidro-2,5,7-meteno-3H- ciclopenta[a]pentalen-3-ona Cl Cl Cl Cl Cl O Cl Análogos del DDT H CCl C Cl 4,4’-DDT, 4,4’-DDD, Dicofol, Pertano, Metoxicloro Ciclodienos Cl ClCl Cl Cl Cl C l Aldrina, Clordano, Dieldrina, Endosulfán, Endrina, Heptacloro Ciclohexanos y bencenos clorados Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 6 α -Lindano, β-Lindano, γ-Lindano, δ-Lindano, HCB 1. PESTICIDAS 40 también se adsorben fuertemente. Por otro lado, la degradación del DDT tanto en el suelo como en aguas superficiales tiene lugar a través de procesos de biotransformación y fotólisis. [40] Metoxicloro: En el aire, el metoxicloro existe tanto en fase particulada como, en menor medida, en fase vapor. Puede reaccionar fotoquímicamente con radicales hidroxilo del aire, pero es más probable que abandone la atmósfera a través de procesos de deposición húmeda y seca. En agua, este pesticida se asocia preferentemente a sedimentos y materia particulada, aunque una parte también puede estar disuelta en agua. Por otro lado, este pesticida se bioconcentra en un elevado número de organismos acuáticos, pero no en mamíferos debido a que en éstos se metaboliza y elimina con rapidez. Tanto en agua como en sedimentos, el metoxicloro se puede degradar por procesos químicos, fotoquímicos y biológicos. Se enlaza con fuerza a los suelos, pero no se suele detectar en este compartimento quizás en parte debido a que el viento y la lluvia pueden provocar la migración de partículas que contienen dicho pesticida. [45] Ciclodienos: La aldrina se convierte fácilmente a dieldrina (p.ej a través de procesos de fotodegradación), que es ubicuo en el medioambiente. La dieldrina persiste porque es más resistente a la biotransformación y a la degradación abiótica que la aldrina. La dieldrina se bioconcentra y biomagnifica a través de las cadenas tróficas acuáticas y terrestres. El transporte de la aldrina y la dieldrina en suelos es mínimo ya que ambos compuestos se adhieren fuertemente al suelo. No obstante, su volatilización desde suelos húmedos es bastante probable. La mayor parte de la aldrina y la dieldrina que se encuentra en aguas superficiales es resultado de la escorrentía desde suelos contaminados. El clordano es extremadamente persistente en el medioambiente y en algunos suelos puede permanecer más de 20 años. La volatilización quizás sea el principal mecanismo de eliminación desde el suelo. Por otro lado, la adsorción a sedimentos y la volatilización son los procesos más importantes en agua. En aire, el clordano existe predominantemente en fase vapor. El clordano en fase gas se puede degradar mediante fotólisis y reacciones con radicales hidroxilo, además, puede transportarse largas distancias y experimentar deposición húmeda o seca. Otro aspecto a tener en cuenta es su elevado factor de bioconcentración. El heptacloro se degrada a epóxido de heptacloro y a otros I. INTRODUCCIÓN 41 productos en el medioambiente. El epóxido de heptacloro se degrada más lentamente y, en consecuencia, es más persistente que el heptacloro. Ambos compuestos se adsorben fuertemente a sedimentos y también se bioconcentran en organismos tanto acuáticos como terrestres. Además, su biomagnificación en cadenas tróficas es significativa. Finalmente, el endosulfán se reparte principalmente entre la atmósfera y los suelos y sedimentos. Se puede desplazar largas distancias en la atmósfera, pero es relativamente inmóvil en suelos. Es susceptible de experimentar degradación por hidrólisis y también por acción de microorganismos. A diferencia de otros organoclorados, no se biomagnifica en las cadenas alimentarias. [38, 39, 42, 43] Lindano: Una vez liberado al medioambiente, el lindano se puede distribuir entre todos los compartimentos medioambientales. A pesar de que su tiempo de vida atmosférico es largo, el lindano se puede degradar por reacción con radicales hidroxilo o puede ser eliminado del aire por deposición húmeda y seca. Se cree que la biodegradación es el proceso de descomposición dominante tanto en suelo como en agua, aunque la hidrólisis y la fotólisis también pueden tener lugar en menor medida. [44] 1.7 OTROS PESTICIDAS 1.7.1 PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS La diversidad de los insecticidas organofosforados los convierte en el grupo de insecticidas más versátil [2]. Estos compuestos han sido ampliamente utilizados en la agricultura durante los últimos 40 años. Hay unos 200 organofosforados diferentes en el mercado y suponen un 45% de los pesticidas registrados en EE.UU. Además, el uso de este tipo de pesticidas está favorecido por su habilidad para degradarse con facilidad en el medioambiente [51]. 1. PESTICIDAS 42 Los insecticidas organofosforados son habitualmente ésteres, amidas, o tioles derivados de los ácidos fosfórico, fosfónico, fosforotioico, o fosfonotioico. En la Tabla I.1.10 se muestran las estructuras de los organofosforados estudiados en esta Tesis, así como sus nombres comunes, números y nombres CAS. Tabla I.1.10 Identidad química de los organofosforados estudiados. Compuesto [nº CAS] Nombre CAS Estructura Clorpirifos [2921-88-2] O,O-dietil-O-(3,5,6-tricloro-2-piridinil) éster del ácido fosforotioico N C l C l C l O P S O O Fenitrotion [122-14-5] O,O-dimetil-O-(3-metil-4-nitrofenil) éster del ácido fosforotioico O P S O O N O 2 La mayoría de los pesticidas organofosforados son ligeramente solubles en agua, tienen K ow elevados y bajas presiones de vapor. Las propiedades físico-químicas de los organofosforados estudiados se resumen en la Tabla I.1.11. [51, 52] Tabla I.1.11 Propiedades físico-químicas de los organofosforados estudiados [51, 52]. Pesticida Presión de vapor mPa (20-25 ºC) Coeficiente de partición log K ow Solubilidad en agua mg L -1 (20-25 ºC) Fenitrotion 0,676 3,32 19 Clorpirifos 2,7 4,96 1,4 En lo que respecta a sus aplicaciones, el clorpirifos es, además de insecticida, acaricida y nematicida. Se utiliza en el control de plagas de insectos de suelo y follaje en una gran variedad de cultivos pero, fundamentalmente, en cultivos de maíz [53]. Por su parte, el fenitrotion es un insecticida y acaricida. Se utiliza en invernaderos y en plantas ornamentales exteriores, incluyendo árboles, para controlar una gran I. INTRODUCCIÓN 43 variedad de insectos y ácaros. También se comercializa para el control de hormigas y cucarachas en hogares, tiendas, restaurantes, almacenes, etc. [54]. El mecanismo de acción tóxica de los organofosforados es el mismo en insectos que en mamíferos. En ambos casos, estos pesticidas inactivan la enzima acetilcolinesterasa (AChE) afectando, por lo tanto, a la transmisión de impulsos nerviosos. Así, en mamíferos, algunos de los síntomas por envenenamiento con organofosoforados son debilidad o parálisis muscular [55]. En cuanto a su distribución en el medioambiente, la movilidad del clorpirifos en el suelo es limitada y no se ha observado su presencia en aguas subterráneas. Por otro lado, tiene una presión de vapor intermedia por lo que, bajo determinadas condiciones, la volatilización puede ser un mecanismo importante de disipación. En cuanto a los procesos de su degradación, éstos pueden ser tanto abióticos como bióticos [56]. En lo que respecta al fenitrotion, éste llega al aire a través de su volatilización desde superficies contaminadas y se puede desplazar del lugar de aplicación durante su pulverización. Se filtra lentamente en la mayoría de los suelos, pero también se puede desplazar por escorrentía. Se degrada tanto por fotólisis como por hidrólisis. Además, en agua, la presencia de microflora también acelera su degradación y, en suelo, la biodegradación es la principal ruta de degradación. [57] 1.7.2 HERBICIDAS AMIDA El uso extendido de herbicidas amida ha contribuido de manera importante al incremento de la producción agrícola. Sin embargo, sus residuos también suponen cierto riesgo desde el punto de vista de la contaminación del medioambiente. Una gran variedad de compuestos forma parte de este grupo de herbicidas, que siguen la siguiente fórmula general: R 1 -CO-N-(R 2 ,R 3 ). Los componentes principales de este grupo son las cloroacetamidas N-sustituidas y las anilidas sustituidas. Tanto el acetocloro como el alacloro pertenecen al grupo de las anilidas, más concretamente al de las cloroacetanilidas. Sus números y nombres CAS, así como sus estructuras se muestran en la Tabla I.1.12. [2] 1. PESTICIDAS 44 Tabla I.1.12 Identidad química de los herbicidas cloroacetanilida estudiados. Compuesto [nº CAS] Nombre CAS Estructura Acetocloro [34256-82-1] 2-cloro-N-(etoximetil)-N-(2-etil-6- metilfenil)acetamida Alacloro [15972-60-8] 2-cloro-N-(2,6-dietilfenil)-N- (metoximetil)acetamida Algunas de las propiedades físico-químicas de los herbicidas estudiados se han incluido en la Tabla I.1.13 [2]. Tabla I.1.13 Propiedades físico-químicas de los herbicidas cloroacetanilida estudiados [2]. Pesticida Presión de vapor mPa (25 ºC) Coeficiente de partición log K ow Solubilidad en agua mg L -1 Acetocloro 0,005 4,14 223 (25 ºC) Alacloro 2,0 3,09 170 (20 ºC) Las cloroacetanilidas se utilizan para el control de malas hierbas en varios cultivos. El alacloro se usa especialmente en cultivos de maíz, sorgo y semilla de soja [58]. Por otra parte, el acetocloro se emplea sobre todo en cultivos de maíz, aunque también de col, cítricos, café, algodón, etc. [59]. Tanto el alacloro como el acetocloro han sido clasificados por la EPA como carcinógenos del grupo B2 (probable carcinógeno en humanos) [60, 61]. Además, se ha comprobado que el acetocloro es un disruptor endocrino potente [62]. Por otro lado, se ha observado que el alacloro posee genotoxicidad y también se sospecha que pueda afectar al sistema hormonal [63]. N O C l O N O C l O I. INTRODUCCIÓN 45 En lo que se refiere a su distribución en el medioambiente, el alacloro se puede degradar en el suelo por acción de bacterias o de la luz solar. Además, no se adsorbe con fuerza a la mayoría de los suelos por lo que se puede volatilizar o filtrar hacia aguas subterráneas. La biodegradación y la fotodegradación también son procesos importantes en aguas superficiales, pero no así la volatilización. En cuanto a la bioconcentración, no es un proceso fundamental para el alacloro, ya que se elimina tan pronto es absorbido por plantas o animales [58]. El acetocloro también posee bajos coeficientes de adsorción, por lo que es bastante móvil en el suelo y, por tanto, supone un peligro potencial para el medioambiente acuático [64]. De hecho, varios estudios han demostrado la presencia de este herbicida en aguas superficiales y subterráneas [65, 66]. Además, el acetocloro no es demasiado susceptible a volatilizarse y la fotodegradación tampoco parece ser una ruta importante de degradación de este pesticida [67]. Sin embargo, sí que se han publicado trabajos acerca de metabolitos generados como consecuencia de procesos de su biodegradación [68]. BIBLIOGRAFÍA [1] U.S. Environmental Protection Agency. What is a Pesticide? <http://www.epa.gov/pesticides/> (Consulta: 10-05-09). [2] Tadeo, J.L.; Sánchez-Brunete, C.; González, L. Pesticides: Classification and Properties. En Analysis of Pesticides in Food and Environmental Samples; Tadeo, J.L. Ed.; CRC Press, 2008; 1-34. [3] ECPA Review 2005-2006, European Crop Protection Association. [4] ECPA Review 2001-2002, European Crop Protection Association. [5] Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). The Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues (JMPR). <http://www.fao.org/agriculture/crops/core-themes/theme/pests/pm/jmpr/en/ > (Consulta: 10-05-09). [6] Codex Committee on Pesticide Residues (CCPR). Pesticide Residues in Food, Maximum Residue Limits. <http://www.codexalimentarius.net/mrls/pestdes/jsp/pest_q-e.jsp> (Consulta: 10-05-09). 1. PESTICIDAS 46 [7] Council Directive 96/23/EC of 29 abril 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repealing Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC, Off. J. Eur. Comm., Nº L125/10, 23 May 1996. [8] Regulation (EC) Nº 396/2005 of the European Parliament and of the Council of 23 February 2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EEC. [9] Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in animal feed, Off. J. Eur. Comm., Nº L140/10, 30 May 2002. [10] Commission Regulation (EC) Nº 839/2008 of 31 July 2008 amending Regulation (EC) Nº 396/2005 of the European Parliament and of the Council as regards Annexes II, III and IV setting maximum residue levels of pesticides in or on certain products. [11] European Commission. Soil Protection (2007) A strategy to keep Europe’s soils robust and healthy. <http://ec.europa.eu/environment/soil/index.htm> (Consulta: 10-05-09). [12] Ministerio de la Presidencia de España (2005) Real Decreto 9/2005, Boletín Oficial del Estado 15/2005, 1833-1843. [13] Toxicological profile for pyrethrins and pyrethroids, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2003. [14] Khambay, B. Pyrethroid Insecticides. Pestic. Outlook 2002, 13, 49-54. [15] Soderlund, D.M.; Clark, J.M.; Sheets, L.P.; Mullin, L.S.; Piccirillo, V.J.; Sargent, D.; Stevens, J.T.; Weiner, M.L. Mechanisms of pyrethroid neurotoxicity: implications for cumulative risk assessment. Toxicology 2002, 171, 3-59. [16] Mueller-Beilschmidt, D. The toxicology and environmental fate of synthetic pyrethroids. J. Pestic. Reform. 1990, 10, 32-38. [17] Bloomquist, J.R. Insecticides: Chemistries and Characteristics. University of Minnesota, 1999. <http://ipmworld.umn.edu/chapters/bloomq.htm> (Consulta: 10-05-09) [18] WHO Specifications and Evaluations for Public Health Pesticides: d,d,trans- Cifenotrina, World Health Organization (WHO), 2005. I. INTRODUCCIÓN 47 [19] Control of shoot/foliar feeding pests with pesticide seed treatments, US patent 6713077, 2004. [20] Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V9.04 for Solaris ( © 1994-2009 ACD/Labs) para SciFinder ® Scholar TM 2009. [21] Baygon ® . How the various groups of agents function in the Baygon products. <http://www.baygon.com/nqcontent.cfm?a_id=420> (Consulta: 10-05-09). [22] Fabric protectant, US Patent 6024973, 2000. [23] Evaluation on: transfluthrin use as a public hygiene insecticide, Advisory Committee on Pesticides, York, UK, 1997. [24] Winslow; L. The effects of pyrethrins and pyrethroids on human physiology. Human Physiology, 2002, June 7: 1-12. [25] Safety of Pyrethroids for Public Health Use, World Health Organization (WHO) Communicable Disease Control, Prevention and Eradication, WHO Pesticide Evaluation Scheme (WHOPES) & Protection of the Human Environment Programme on Chemical Safety (PCS), 2005. [26] Kim, S.S.; Lee, R.D.; Lim, K.J.; Kwack, S.J.; Rhee, G.S.; Seok, J.H.; Lee, G.S.; An, B.S.; Jeung, E.B.; Park, K.L. Potential estrogenic and antiandrogenic effects of permethrin in rats. J. Reprod. Develop. 2005, 51, 201-210. [27] Tyler, C.R.; Beresford, N.; Van der Woning, M.; Sumpter, J.P.; Thorpe, K. Metabolism and environmental degradation of pyrethroid insecticides produce compounds with endocrine activities. Environ. Toxicol. Chem. 2000, 19, 801- 809. [28] Safety Source for Pest Management, Beyond Pesticides Least Toxic Service Directory. Pyrethroids/Pyrethrins. <http://www.beyondpesticides.org/infoservices/pesticidefactsheets/toxic/pyreth roid.htm> (Consulta: 10-05-09) [29] McCarthy, A.R.; Thomson, B.M.; Shaw, I.C.; Abell, A.D. Estrogenicity of pyrethroid insecticide metabolites. J. Environ. Monit. 2006, 8, 197-202. [30] European Parliament legislative resolution of 13 January 2009 on the Council common position for adopting a directive of the European Parliament and of the Council establishing a framework for Community action to achieve a sustainable use of pesticides. [31] Casida, J.E. Pyrethrum flowers and pyrethroid insecticides. Environ. Health Persp. 1980, 34, 189-202. 1. PESTICIDAS 48 [32] Piperonyl butoxide (General Fact Sheet), National Pesticide Telecommunications Network, Oregon, 2000. [33] Piperonyl butoxide (062), JMPR: Evaluations of Pesticide Residues, FAO Pesticide Management, FAO Pesticides for Plant Protection Products, 2001. [34] Iwata, H.; Tanabe, S.; Sakai, N.; Nishiraura, A.; Tatsakawa, R. Geographical distribution of persistent organochlorines in air, water and sediments from Asia and Oceania and their implications for global redistribution from lower latitudes. Environ. Poll. 1994, 85, 15-33. [35] Guruge, K.S.; Tanabe, S. Contamination by persistent organochlorines and butyltin compounds in the west coast of Sri Lanka. Mar. Pollut. Bull. 2001, 42, 179-186. [36] Colborn, T.; Smolen, M.J. Epidemiological analysis of persistent organochlorine contaminants in cetaceans. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1996, 146, 91-172. [37] Stockholm Convention on persistent organic pollutants (POPs). < http://www.pops.int/> (Consulta: 10-05-09) [38] Toxicological profile for Aldrin/Dieldrin, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2002. [39] Toxicological profile for Chlordane, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 1994. [40] Toxicological profile for DDT, DDE and DDD, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2002. [41] Toxicological profile for Endrin, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 1996. [42] Toxicological profile for Endosulfan, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2000. [43] Toxicological profile for Heptachlor and Heptachlor Epoxide, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2007. I. INTRODUCCIÓN 49 [44] Toxicological profile for Hexachlorocyclohexane, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2005. [45] Toxicological profile for Methoxychlor, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Atlanta, GA, 2002. [46] Shegunova, P.; Klánová, J.; Holoubek, I. Residues of organochlorinated pesticides in soils from the Czech Republic. Environ. Pollut. 2007, 146, 257-261. [47] Peris, E.; Requena, S.; de la Guardia, M.; Pastor, A.; Carrasco, J.M. Organochlorinated pesticides in sediments from the Lake Albufera of Valencia (Spain). Chemosphere 2005, 60, 1542-1549. [48] Poolpak, T.; Pokethitiyook, P.; Kruatrachue, M.; Arjarasirikoon, U.; Thanwaniwat, N. Residue analysis of organochlorine pesticides in the Mae Klong river of Central Thailand. J. Hazard. Mater. 2008, 156, 230-239. [49] Wang, X.; Li, X.; Cheng, H.; Xu, X.; Zhuang, G.; Zhao, C. Organochlorine pesticides in particulate matter of Beijing, China. J. Hazard. Mater. 2008, 155, 350-357. [50] Geisz, H.N.; Dickhut, R.M.; Cochran, M.A.; Fraser, W.R.; Ducklow, H.W. Melting glaciers: a probable source of DDT to the Antarctic marine ecosystem. Environ. Sci. Technol. 2008, 42, 3958-3962. [51] Jeannot, R.; Dagnac, T. Organophosphorus compounds in water, soils, waste, and air. En Chromatographic analysis of the environment; Nollet, L.M.L. Ed.; CRC Press, 2006; 841-888. [52] IUPAC Agrochemical Information, Fenitrothion. <http://sitem.herts.ac.uk/aeru/iupac/299.htm> (Consulta: 10-05-09) [53] U.S. Environmental Protection Agency (EPA), Chlorpyrifos Facts. <http://www.epa.gov/pesticides/reregistration/REDs/factsheets/clorpirifos_fs.ht m> (Consulta: 10-05-09). [54] U.S. Environmental Protection Agency (EPA), Fenitrothion Facts. <http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/factsheets/0445fact.pdf> (Consulta: 10- 05-09). [55] Kamrin, M.A. Organophosphates. En Pesticide Profiles: Toxicity, Environmental Impact, and Fate, CRC Press, 1997; 135-238. 2. SPME 56 Tabla I.2.1 Propiedades y aplicaciones generales de las principales fibras comercializadas por Supelco [4]. Fase polimérica Espesor Temperatura máxima Polaridad Tipo Aplicaciones 100 µm 280 ºC apolar no enlazada compuestos volátiles o de bajo peso molecular 30 µm 280 ºC apolar no enlazada compuestos apolares semivolátiles PDMS 7 µm 340 ºC apolar enlazada compuestos apolares de bajo peso molecular PA 85 µm 320 ºC polar parcialmente entrelazada compuestos polares en muestras polares PDMS/DVB 65 µm 270 ºC semipolar parcialmente entrelazada compuestos polares volátiles CAR/PDMS 75 µm 320 ºC semipolar parcialmente entrelazada compuestos volátiles CW/DVB 70 µm 250 ºC polar parcialmente entrelazada compuestos polares DVB/CAR/PDMS 50/30 µm 270 ºC semipolar altamente entrelazada compuestos de 3-20 átomos de carbono 2.5.2 TIEMPO DE EXTRACCIÓN Puesto que la SPME es una técnica de equilibrio, la máxima cantidad de analito será extraída una vez transcurrido el tiempo necesario para alcanzar dicho equilibrio. Los compuestos con bajas constantes de distribución necesitan más tiempo para alcanzar el equilibrio, por eso en estos casos se suelen seleccionar tiempos más cortos que los de equilibrio. Cuando esto ocurre, el tiempo de exposición de la fibra requiere un control estricto para así obtener suficiente reproducibilidad. [3] 2.5.3 TEMPERATURA DE EXTRACCIÓN En SPME, la temperatura de extracción tiene dos efectos contrapuestos. Por una parte, el incremento de temperatura durante la extracción favorece la difusión de los analitos hacia la fibra. Además, en HSSPME, la temperatura facilita la transferencia de los analitos hacia el espacio de cabeza. Por otro lado, puesto que la etapa de I. INTRODUCCIÓN 57 absorción es un proceso exotérmico, un incremento de temperatura reduce la constante de distribución fibra/muestra (K fs ) de los analitos. [2] 2.5.4 EFECTO SALINO La adición de sales (NaCl, KCl, Na 2 SO 4 ) a muestras acuosas provoca un incremento de la fuerza iónica de la disolución de la muestra, tendiendo las moléculas de agua a solvatar a los iones presentes en la muestra y no a las moléculas neutras de los analitos. Se produce, por tanto, una disminución de la solubilidad de los analitos en agua, forzando su paso a otras fases del sistema, espacio de cabeza y fibra, originando un incremento de sensibilidad. Para que este proceso tenga lugar es necesario que los analitos se encuentren en forma no disociada, de lo contrario el efecto sería el opuesto y disminuiría la cantidad de analito ab/adsorbida por la fibra. [1] 2.5.5 MODIFICACIÓN DEL PH El pH de la muestra afecta al equilibrio de disociación de los analitos en medio acuoso. Obviamente, la extracción es más eficaz si los analitos están sin disociar. Por ejemplo, cuando el pH disminuye, se produce un aumento de la concentración del ácido en su forma no disociada, resultando un aumento de la cantidad extraída por la fibra y, por tanto, un incremento de la sensibilidad. Para obtener la máxima sensibilidad, se debe trabajar a un pH al menos dos unidades por debajo (especies ácidas) o por encima (especies básicas) del correspondiente pK a . En la práctica, en las extracciones afectadas por el pH, las muestras deben tamponarse para conseguir buena reproducibilidad. Cuando se trabaja con muestras que están a pH extremos, se recomienda recurrir al espacio de cabeza (HSSPME) para evitar el deterioro de la fibra. [1] 2.5.6 ADICIÓN DE DISOLVENTE La adición de disolvente orgánico a muestras acuosas reduce habitualmente la cantidad de analito extraído [5-6]. Por otra parte, la adición de agua o de disolventes orgánicos a muestras de suelos y lodos ha demostrado ser muy eficaz para facilitar 2. SPME 58 la liberación de los analitos desde la matriz y mejorar su difusión hacia la fase estacionaria de la fibra [2]. 2.5.7 AGITACIÓN DE LA MUESTRA Y FORMA DEL VIAL La agitación de la muestra favorece la difusión de los analitos hacia la fase de la fibra y reduce el tiempo de extracción tanto en DSPME como en HSSPME [3]. Sin embargo, cuando se analizan compuestos muy volátiles mediante HSSPME, la mayoría de los analitos se encuentran en el espacio de cabeza dando lugar a extracciones rápidas incluso cuando el sistema no se agita. Obviamente, cuando se analizan especies menos volátiles la agitación facilita la transferencia de masa entre la muestra y el espacio de cabeza dando lugar a extracciones más rápidas. [1] La forma del vial también afecta a la cinética del proceso de extracción. En HSSPME estática, la transferencia de masa entre la muestra y el espacio de cabeza está afectada por el tamaño de la superficie de contacto entre las dos fases. Asimismo, dependiendo de la forma del vial, se producirá más o menos convección cuando se agita la muestra. [1] 2.5.8 VOLUMEN DE MUESTRA Y DEL ESPACIO DE CABEZA El volumen de muestra es un parámetro importante a optimizar en la SPME puesto que está directamente relacionado con la sensibilidad del método (ver ecuación I.2.1) [3]. El volumen de muestra se debe seleccionar en función del coeficiente de distribución K fs . Tal y como se deduce de la ecuación I.2.1, la sensibilidad depende del volumen de la muestra si el coeficiente de distribución del analito es muy alto. Así, se debe trabajar con un volumen de muestra elevado (10 mL) cuando se extraen compuestos con K fs altos. Además, en estos casos se deben usar recubrimientos de poco espesor para reducir el tiempo de equilibrio. [6] En HSSPME, los analitos se distribuyen entre la matriz de la muestra, la fibra, y el espacio de cabeza. Los compuestos muy volátiles se aglutinan en el espacio de cabeza, y su volumen debe ser pequeño para así concentrar los analitos antes de su difusión I. INTRODUCCIÓN 59 hacia la fase de la fibra. Si el volumen del espacio de cabeza es demasiado grande, la sensibilidad se reduce considerablemente. [7] El volumen del espacio de cabeza también afecta a la cinética del proceso. Cuanto más pequeño sea éste con relación al volumen de muestra, más rápido será el transporte de los analitos desde la muestra a la fibra. [1] 2.6 APLICACIONES DE LA SPME AL ANÁLISIS DE PESTICIDAS 2.6.1 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE AGUA La mayoría de las aplicaciones de la SPME para la determinación de pesticidas se centran en el análisis de muestras de agua, no solo por la relevancia ambiental de las mismas, sino también porque esta técnica de extracción se ajusta a la perfección a este tipo de matrices. Así, la SPME ha sido el método seleccionado para la determinación de una gran variedad de pesticidas en agua ultrapura [8], aguas superficiales [9-14], aguas residuales [6, 10, 13] y muestras de agua potable [15]. 2.6.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SUELO En muchas de las aplicaciones de la SPME al análisis de pesticidas en suelos, las muestras se mezclan con agua destilada y, a continuación, se lleva a cabo la inmersión de la fibra de SPME en la suspensión resultante [16, 17]. En estos casos se deben tener en cuenta los efectos negativos de la matriz del suelo, tanto sobre la eficacia de la SPME como sobre la resolución cromatográfica. Por otro lado, también existen estudios en los que se ha utilizado la SPME sobre extractos orgánicos de suelo obtenidos de la aplicación de técnicas de extracción sólido-líquido como la extracción asistida por microondas (MAE) [18, 19], la extracción por ultrasonidos (USE) [20] o la extracción micelar asistida por microondas (MAME) [21]. 2. SPME 60 Aunque la mayoría de los métodos publicados se basan en la inmersión directa de la fibra en el extracto de la muestra o en una suspensión, también se han desarrollado procedimientos que permiten la cuantificación de pesticidas en muestras de suelo mediante HSSPME [22-24]. Recientemente también se ha desarrollado un método basado en la cold activated fiber SPME (CACF-SPME) para la determinación de pesticidas organoclorados en suelo [25]. Probablemente, el lento desarrollo de la SPME aplicada a la determinación de compuestos orgánicos en muestras de suelo, en contraste con su rápido progreso en agua, se deba a dos importantes inconvenientes de la técnica. En primer lugar, se debe tener en cuenta que la presencia de materia orgánica en las muestras de suelo puede influir de manera importante en la recuperación de los analitos a extraer. En segundo lugar, la aplicación de la SPME a suelos no permite el uso directo de curvas de calibrado externas, siendo necesario el uso de patrones internos marcados isotópicamente o de calibrados con rectas de adición [26]. 2.6.3 ANÁLISIS DE ALIMENTOS En general, la aplicación de la SPME a muestras de alimentos requiere una etapa previa de preparación de la muestra. Por ejemplo, cuando se analiza fruta a menudo se baten las muestras vigorosamente (high speed blending) utilizando mezclas acetonitrilo-agua [27] o agua [28, 29], o se extraen previamente mediante ultrasonidos [30]. Las muestras líquidas, como zumos de fruta o vino, se suelen extraer directamente como las muestras de agua, aunque en ocasiones se diluyen con agua destilada para así reducir o eliminar las interferencias de la matriz [29, 31-35]. También se ha recurrido a la dilución de las muestras con agua en el análisis de pesticidas en miel [36]. La SPME también se ha aplicado al análisis de pesticidas en muestras de leche [37- 40]. En algunos casos, para resolver los problemas derivados de la complejidad y el carácter lipofílico de las muestras, se adoptaron diferentes estrategias de tratamiento de la muestra previas a la inmersión de la fibra en la misma [38, 39]. En el análisis de pesticidas organoclorados en leche materna, se añadió ácido perclórico para romper las interacciones analito-matriz, y se eligió HSSPME como modo de muestreo para I. INTRODUCCIÓN 61 evitar daños en la fibra e interferencias provocadas por otros componentes de la leche [39]. En otro estudio se utilizó una membrana hueca de polipropileno alrededor de la fibra como material protector durante la SPME en la extracción de herbicidas de leche de vaca [40]. 2.6.4 ANÁLISIS DE FLUIDOS BIOLÓGICOS La aplicación de la SPME a la determinación de pesticidas en muestras biológicas (sangre, orina, tejidos…) es bastante limitada, especialmente cuando se compara con el elevado número de aplicaciones medioambientales y alimentarias de esta técnica. Para el análisis de este tipo de muestras, en general se recurre a la extracción en espacio de cabeza (HSSPME) para, de este modo, evitar las interferencias derivadas de matrices tan complejas. Así, por ejemplo, Tsoukali y col. [41] emplearon HSSPME para la determinación de metil-paratión en muestras biológicas post-mortem (sangre, tejidos de hígado y riñón). Las muestras de tejido requirieron una etapa previa en la que se batieron con agua a gran velocidad. De modo semejante, Hernández y col. [42] determinaron pesticidas organoclorados y organofosforados en sangre mediante HSSPME diluyendo antes las muestras con agua. No obstante, también se han publicado trabajos en los que se analizaron pesticidas organoclorados y organofosforados en muestras de orina y suero mediante SPME directa (DSPME), previa dilución de las muestras con agua ultrapura [43, 44]. BIBLIOGRAFÍA [1] Cela, R.; Lorenzo, R.A.; Casais, M.C. Técnicas de Separación en Química Analítica, Ed. Síntesis, 2002. [2] Pawliszyn, J. Solid Phase Microextraction. Theory and Practice, Ed. Wiley-VHC, Inc., 1997. [3] Kataoka, H.; Lord, H.L.; Pawliszyn, P. Applications of solid-phase microextraction in food analysis. J. Chromatogr. A 2000, 880, 35-62. [4] <http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/ spme.html> (Consulta: 09-06-09). 2. SPME 62 [5] Arthur, C.L.; Killam, L.M.; Bucholz, K.D.; Pawliszyn, J.; Berg, J.R. Automation and optimization of solid-phase microextraction. Anal. Chem. 1992, 64, 1960- 1966. [6] Eisert, R.; Levsen, K. Determination of pesticides in aqueous samples by solidphase microextraction in-line coupled to gas chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 1995, 6, 1119-1130. [7] Page, B.D.; Lacroix, G. Application of solid-phase microextraction to the headspace gas chromatographic analysis of semi-volatile organochlorine contaminants in aqueous matrices. J. Chromatogr. A, 1997, 757, 173-182. [8] Boyd-Boland, A.A.; Pawliszyn, J.B. Solid-phase microextraction of nitrogencontaining herbicides. J. Chromatogr. A, 1995, 704, 163-172. [9] Mmualefe, L.C.; Torto, N.; Huntsman-Mapila, P.; Mbongwe, B. Headspace solid phase microextraction in the determination of pesticides in water samples from the Okavango Delta with gas chromatography-electron capture detection and time-of-flight mass spectrometry. Microchem. J. 2009, 91, 239-244. [10] Torres Padrón, M.E.; Sosa Ferrera, Z.; Santana Rodríguez, J.J. Optimisation of solid-phase microextraction coupled to HPLC-UV for the determination of organochlorine pesticides and their metabolites in environmental liquid samples. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 386, 332-340. [11] Fidalgo-Used, N.; Montes-Bayón, M.; Blanco-González, E.; Sanz-Medel, A. Determination of organophosphorus pesticides in spiked river water samples using solid-phase microextraction coupled to gas chromatography with EI-MS and ICP-MS detection. J. Anal. At. Spectrom. 2005, 20, 876-882. [12] Sakamoto, M.; Tsutsumi, T. Applicability of headspace solid-phase microextraction to the determination of multi-class pesticides in waters. J. Chromatogr. A, 2004, 1028, 63-74. [13] Casas, V.; Llompart, M.; García-Jares, C.; Cela, R.; Dagnac, T. Multivariate optimization of the factors influencing the solid-phase microextraction of pyrethroid pesticides in water. J. Chromatogr. A 2006, 1124, 148-156. [14] Lambropoulou, D.A.; Sakkas, V.A.; Albanis, T.A. Validation of an SPME method, using PDMS, PA, PDMS-DVB, and CW-DVB SPME fiber coatings, for analysis of organophosphorus insecticides in natural waters. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 374, 932-941. I. INTRODUCCIÓN 63 [15] Beceiro-González, E.; Concha-Graña, E.; Guimaraes, A.; Gonçalves, C.; Muniategui-Lorenzo, S.; Alpendurada, M.F. Optimisation and validation of a solid-phase microextraction method for simultaneous determination of different types of pesticides in water by gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2007, 1141, 165-173. [16] Lee, M.-R.; Yeh, Y.-C.; Hsiang, W.-S.; Hwang, B.-H. Solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry for determining chlorophenols from landfill leaches and soil. J. Chromatogr. A 1998, 806, 317-324. [17] Möder, M.; Popp, P.; Eisert, R.; Pawliszyn, J. Determination of polar pesticides in soil by solid phase microextraction coupled to high-performance liquid chromatography-electrospray/mass spectrometry. Fresenius J. Anal. Chem. 1999, 363, 680-685. [18] Herbert, P.; Morais, S.; Paiga, P.; Alves, A. ; Santos, L. Development and validation of a novel method for the analysis of chlorinated pesticides in soils using microwave-assisted extraction-headspace solid phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 810-816. [19] Hernández, F.; Beltrán, J.; López, F.J.; Gaspar, J.V. Use of solid-phase microextraction for the quantitative determination of herbicides in soil and water samples. Anal. Chem. 2000, 72, 2313-2322. [20] Bouaid, A.; Ramos, L.; González, M.J.; Fernández, P.; Cámara, C. Solid-phase microextraction method for the determination of atrazine and four organophosphorus pesticides in soil samples by gas chromatography. J. Chromatogr. A 2001, 939, 13-21. [21] Vega Moreno, D.; Sosa Ferrera, Z.; Santana Rodríguez, J.J. Microwave assisted micellar extraction coupled with solid phase microextraction for the determination of organochlorine pesticides in soil samples. Anal. Chim. Acta, 2006, 571, 51-57. [22] Ng. W.F.; Teo, M.J.K.; Lakso, H.-Å. Determination of organophosphorus pesticides in soil by headspace solid-phase microextraction. Fresenius J. Anal. Chem. 1999, 363, 673-679. [23] Zhao, R.; Wang, X.; Yuan, J.; Jiang, T.; Fu, S.; Xu, X. A novel headspace solidphase microextraction method for the exact determination of organochlorine 2. SPME 64 pesticides in environmental soil samples. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 1584-1589. [24] Doong, R.-A.; Liao, P.-L. Determination of organochlorine pesticides and their metabolites in soil samples using headspace solid-phase microextraction. J. Chromatogr. A 2001, 918, 177-188. [25] Chai, X.; Jia, J.; Sun, T.; Wang, Y.; Liao, L. Application of a novel cold activated fiber-solid phase microextraction for analysis of organochlorine pesticides in soil. J. Environ. Sci. Health, Part B 2007, 42, 629-634. [26] Beltrán, J.; López, F.J.; Hernández, F. Solid-phase microextraction in pesticide residue analysis. J. Chromatogr. A 2000, 885, 389-404. [27] Crook, S.J. Presented at the 8 th Symposium on Handling of Environmental and Biological Samples in Chromatography, Almeria, 1997. [28] Fytianos, K.; Raikos, N.; Theodoridis, G.; Velinova, Z.; Tsoukali, H. Solid phase microextraction applied to the analysis of organophosphorus insecticides in fruits. Chemosphere, 2006, 65, 2090-2095. [29] Simplicio, A.L.; Boas, L.V. Validation of a solid-phase microextraction method for the determination of organophosphorus pesticides in fruits and fruit juice. J. Chromatogr. A 1999, 833, 35-42. [30] Beltrán, J.; Peruga, A.; Pitarch, E.; López, F.J.; Hernández, F. Application of solid-phase microextraction for the determination of pyrethroid residues in vegetable samples by GC-MS. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 376, 502-511. [31] Sagratini, G.; Mañes, J.; Giardiná, D.; Damiani, P.; Picó, Y. Analysis of carbamate and phenylurea pesticide residues in fruit juices by solid-phase microextraction and liquid chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2007, 1147, 135-143. [32] Farajzadeh, M.A.; Hatami, M. Solid-phase microextraction gas chromatography for determination of some organophosphorus pesticides. Chromatographia 2004, 59, 259-262. [33] Zambonin, C.G.; Quinto, M.; De Vietro, N.; Palmisano, F. Solid-phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry: A fast and simple screening method for the assessment of organophosphorus pesticides residues in wine and fruit juices. Food Chem. 2004, 86, 269-274. I. INTRODUCCIÓN 65 [34] Vitalif, M.; Guidotti, M.; Giovinazzo, R.; Cedronet, O. Determination of pesticide residues in wine by SPME and GC/MS for consumer risk assessment. Food Addit. Contam. 1998, 15, 280-287. [35] Urruty, L.; Montury, M.; Braci, M.; Fournier, J.; Dournel, J.-M. Comparison of two recent solventless methods for the determination of procymidone residues in wines: SPME/GC/MS and ELISA tests. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1519- 1522. [36] Jimenez, J.J.; Bernal, J.L.; del Nozal, M.J.; Martín, M.T.; Mayorga, A.L. Solidphase microextraction applied to the analysis of pesticide residues in honey using gas chromatography with electron-capture detection. J. Chromatogr. A 1998, 829, 269-277. [37] Cardeal, Z.L.; Dias-Paes, C.M. Analysis of organophosphorus pesticides in whole milk by solid phase microextraction gas chromatography method. J. Environ. Sci. Health, Part B 2004, 41, 369-375. [38] González-Rodríguez, M.J.; Arrebola-Liébanas, F.J.; Garrido Frenich, A.; Martínez Vidal, J.L.; Sánchez López, F.J. Determination of pesticides and some metabolites in different kinds of milk by solid-phase microextraction and lowpressure gas chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 164-172. [39] Röbrig, L.; Meisch, H.-U. Application of solid phase microextraction for the rapid analysis of chlorinated organics in breast milk. Fresenius J. Anal. Chem. 2000, 366, 106-111. [40] Basheer, C.; Lee, H.K. Hollow fiber membrane-protected solid-phase microextraction of triazine herbicides in bovine milk and sewage sludge samples. J. Chromatogr. A 2004, 1047, 189-194. [41] Tsoukali, H.; Raikos, N.; Theodoridis, G.; Psaroulis, D. Headspace solid phase microextraction for the gas chromatographic analysis of methyl-parathion in post-mortem human samples: Application in a suicide case by intravenous injection. Forensic Sci. Int. 2004, 143, 127-132. [42] Hernández, F.; Pitarch, E.; Beltrán, J.; López, F.J. Headspace solid-phase microextraction in combination with gas chromatography and tandem mass spectrometry for the determination of organochlorine and organophosphorus pesticides in whole human blood. J. Chromatogr. B 2002, 769, 65-77. 3. MSPD 72 En algunas aplicaciones también se han utilizado soportes inertes como tierra de diatomeas [32] o arena [33], principalmente para permitir la elución temprana de interferencias que no serían retenidas por ningún adsorbente durante la elución de los analitos. Se trata de métodos más baratos, pero a expensas de una selectividad limitada, ya que solo está controlada por la solubilidad de los diferentes componentes de la muestra en el disolvente de elución. Recientemente se han utilizado otros dispersantes poco convencionales, como fibras de carbón activado [34] o polímeros de impresión molecular (MIPs) [35]. El tamaño de poro del agente dispersante no es un factor demasiado importante. No obstante, el tamaño de partícula sí que es un parámetro a tener en cuenta. El uso de partículas de 3-20 µm de diámetro conduce a flujos bajos o, incluso, inexistentes. La mayoría de las aplicaciones de MSPD han utilizado partículas de 40 µm de diámetro. También se ha observado que un tamaño de partícula no uniforme, pero comprendido entre 40 y 100 µm, funciona bien. [2] Las relaciones muestra/dispersante están habitualmente comprendidas entre 1:1 y 1:4, pero esta ratio depende de cada aplicación en particular y es una variable que se debe examinar durante el desarrollo del método [5]. Por otro lado, la facilidad para conseguir una mezcla homogénea con el dispersante depende básicamente de la matriz considerada. Así, para muestras líquidas de baja viscosidad (p. ej. zumos, vino, leche, etc.) normalmente es suficiente con agitar para conseguir una capa fina de muestra alrededor de las partículas de adsorbente [6]. 3.3.2 DISOLVENTE DE ELUCIÓN La selección del disolvente de elución a utilizar es función de la polaridad del analito. Las sustancias no-polares se pueden recuperar utilizando disolventes apolares, como son hexano [26], diclorometano [19, 31] o mezclas de ambos [27, 36]. Cuando los compuestos tienen una polaridad media o alta, las opciones más empleadas son acetonitrilo [12], acetona [37], acetato de etilo [7, 11], o mezclas de agua con etanol [38] o metanol [39]. Por otro lado, el agua caliente también se ha aplicado con éxito a la extracción de contaminantes polares o moderadamente polares de matrices I. INTRODUCCIÓN 73 sólidas (fundamentalmente de alimentos) [40]. El uso de agua caliente como extractante conlleva una serie de ventajas como son su bajo precio, su respetuosidad por el medioambiente y la compatibilidad con la cromatografía líquida de fase inversa [6]. No obstante, también se debe tener en cuenta la retención y elución de los componentes de la matriz de la muestra. Es decir, la secuencia y diseño de un perfil de elución debe retener a la muestra lo más posible en la columna, y eluir a los analitos con un elevado grado de especificad. [2] Varios estudios han demostrado que, cuando se considera la mezcla de 0.5 g de muestra con 2 g de agente dispersante, la mayoría de los analitos se eluyen en los primeros 4 mL [41]. De todas formas, el volumen de elución varía en función de la aplicación y es un parámetro que se debe examinar para reducir en lo posible el uso de disolvente orgánico y la coelución de interferencias [3]. 3.3.3 MODIFICACIÓN DE LA MATRIZ A veces es necesario alterar el estado de ionización de los componentes de la muestra para asegurar que tienen lugar ciertas interacciones con la fase enlazada del soporte sólido y/o el disolvente de elución. Esto se puede llevar a cabo mediante la adición de ácidos, bases, sales, agentes quelatantes o desquelatantes, antioxidantes, etc. durante la etapa de mezclado de la muestra y/o como aditivo en el disolvente de elución. [2] 3.3.4 TEMPERATURA Y PRESIÓN Recientemente, varias aplicaciones han combinado la extracción con disolventes presurizados (PSE) con la MSPD con el objetivo de conseguir extracciones más rápidas, más automatizadas y más exhaustivas [6]. De hecho, en PSE son habituales las aplicaciones en las que la muestra se dispersa con arena o tierra de diatomeas [42, 43] y, además, también se han publicado algunas aplicaciones con adsorbentes noinertes [44]. 3. MSPD 74 3.4 ETAPAS DE LIMPIEZA Aunque a veces los extractos obtenidos mediante MSPD son lo suficientemente limpios como para ser analizados directamente, a menudo se requiere una etapa de limpieza. En algunos casos, previamente a la elución de los analitos, se recurre al lavado de la columna con un disolvente adecuado. Por ejemplo, cuando los analitos son polares es habitual utilizar un disolvente apolar (p.ej. hexano, diclorometano) para eliminar los componentes menos polares de la matriz (p.ej. lípidos) [45, 46]. Por otro lado, se suele utilizar agua cuando es necesario eliminar compuestos polares (p.ej. pigmentos) de la muestra [14]. Evidentemente, cuando las etapas de lavado y elución se llevan a acabo con disolventes inmiscibles, el cartucho de MSPD se debe secar con una corriente de nitrógeno entre ambas etapas [6]. Como ya se adelantó antes, en la MSPD es habitual recurrir a procedimientos de limpieza que implican el uso de una co-columna. El material de la co-columna se puede empaquetar en la parte inferior de la misma columna MSPD o se puede acoplar en serie (SPE on-line) mediante una columna SPE con el objetivo de retener las interferencias de la matriz [5]. En general se recurre a la primera opción y se suelen utilizar materiales de fase normal para retener las interferencias polares que podrían eluir de las muestras dispersadas sobre C 18 u otros dispersantes de fase inversa. Así, por ejemplo, alúmina [28], sílica [7] y Florisil [13, 47] se han utilizado como co-sorbentes en la extracción de pesticidas de vegetales y frutas. En el caso de analitos de una elevada estabilidad química (p.ej. PCBs, PBDEs, y PBBs), a menudo se sitúa una capa de sílica acidificada (en la mayoría de los casos con un 44% de ácido sulfúrico) en el fondo del cartucho de MSPD [48]. Esta alternativa conduce a la obtención de extractos libres de grasa. El acoplamiento de la MSPD con la SPE también puede ser off-line mediante la utilización de cartuchos de sílica gel [14], alúmina [28], C 18 [31], etc. Otros procedimientos de limpieza a posteriori incluyen la extracción líquido-líquido de un extracto acuoso en un disolvente orgánico para eliminar las interferencias polares [49] o la agitación vigorosa de un extracto orgánico en ácido sulfúrico para eliminar interferencias lipídicas [27]. I. INTRODUCCIÓN 75 Sin embargo, la disponibilidad de técnicas de análisis de elevada sensibilidad y selectividad como LC/MS [9, 50] hace que en algunos casos estas etapas extra de limpieza no sean necesarias. 3.5 MINIATURIZACIÓN En ocasiones, la cantidad de muestra disponible para su análisis es limitada, particularmente en el caso de muestras biológicas, por lo que los errores en la etapa de preparación de muestra se hacen inadmisibles, y los protocolos que implican el uso de pequeñas cantidades de muestra pasan a ser muy valiosos. Así, algunos autores han optimizado extracciones por MSPD utilizando alícuotas de muestra de 50 mg o menos. Además, en algunos de estos trabajos, el volumen de disolvente de elución se ha reducido a unos pocos microlitros. [18, 51] 3.6 APLICACIONES DE LA MSPD AL ANÁLISIS DE PESTICIDAS 3.6.1 ANÁLISIS DE FRUTAS, VERDURAS, CEREALES Y DE OTRAS MATRICES VEGETALES Hay bastantes estudios centrados en la determinación de pesticidas en frutas mediante MSPD. En la mayoría de ellos se utiliza C 8 [16-19] o C 18 [7, 9, 13, 52, 53] para la dispersión de las muestras. Aunque, por ejemplo, en la extracción de pesticidas organofosforados y piretroides de anacardos y frutas de la pasión [24], así como en la extracción de hexaclorociclohexano de varias frutas (limón, naranja, manzana, etc.) [28] se utilizó Florisil, mientras que en la extracción de varios pesticidas en manzana se emplearon nanotubos de carbono (MWCNTs) [47] y en la extracción de ditiocarbamatos y algunos de sus metabolitos en ciertas frutas se utilizó carbón noporoso grafitizado [50]. En algunos de estos trabajos, el mismo método de extracción en frutas se aplicó a plantas o verduras como pepinos, alcachofas, tomates, zanahorias, calabacines, lechugas o patatas [7, 17, 19, 47, 50, 52]. Se han propuesto, además, algunos métodos MSPD para el análisis de residuos de pesticidas en matrices vegetales (frutas, cereales, alcachofas, judías, berenjenas, guisantes, coles, etc.) en los que llama la atención el uso de tamaños de muestra de 5 g y de grandes volúmenes de elución (100-120 mL) [21, 54-58]. 3. MSPD 76 La MSPD también se ha aplicado a la extracción de pesticidas de zumos de frutas utilizando como dispersante Florisil [25] o tierra de diatomeas [32, 59]. Se recurrió a la misma técnica para la determinación de insecticidas y herbicidas en aceitunas, aunque para esta matriz se empleó C 18 [12] o sílica enlazada a grupos aminopropilo (bondesil-NH 2 ) [60] como dispersante. Finalmente, también se han desarrollado métodos basados en la MSPD para el análisis de pesticidas en otras matrices vegetales como té [36] o tabaco [26]. 3.6.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE TEJIDOS Y GRASAS DE ORIGEN ANIMAL Para la extracción de analitos de tejidos animales, C 18 es el dispersante más popular. Así, por ejemplo, C 18 fue el material utilizado en la extracción por MSPD de pesticidas organoclorados de músculo de siluro [61], de ostras [62], de hepatopáncreas de cangrejo [63] y de tejidos de pescado [64]. Además, en todos estos trabajos se empleó una co-columna de Florisil para retener los lípidos de las muestras. El mismo dispersante se empleó en un método de MSPD desarrollado para la extracción de pesticidas organofosforados de muestras de hígado y músculo de ganado bovino [14]. Por otro lado, en la determinación de DDT, DDE y DDD en grasas animales (cerdo, vaca, pollo), las muestras se dispersaron con fibra de carbón activado (KF ® -1500) [34, 65]. 3.6.3 ANÁLISIS DE OTRAS MATRICES ALIMENTARIAS DE ORIGEN ANIMAL La MSPD se ha aplicado a la extracción de pesticidas en leche. En todos los trabajos publicados, se mezclaron las muestras de leche con C 18 y como etapa de limpieza se recurrió a la utilización de co-columnas de Florisil [15], a la SPE en tándem con cartuchos de Florisil [66] o a la SPE off-line empleando alúmina como adsorbente [67]. Por otro lado, Florisil fue el agente dispersante utilizado en la extracción de pesticidas en miel [68, 69] y huevos [27]. En este último caso fue necesaria, además de una columna de Florisil, una etapa de limpieza a posteriori utilizando ácido sulfúrico. I. INTRODUCCIÓN 77 3.6.4 ANÁLISIS DE OTRAS MUESTRAS La MSPD también se ha utilizado en la extracción de pesticidas de varios insectos como son las abejas [10, 70] o los isópodos [8]. Son escasos los trabajos en los que esta técnica se haya aplicado a la extracción de plaguicidas en suelos [71] y otras matrices sólidas medioambientales como son los lodos [31]. BIBLIOGRAFÍA [1] Barker, S.A.; Long, A.R.; Short C.R. Isolation of drug residues from tissues by solid phase dispersion. J. Chromatogr. 1989, 475, 353-361. [2] Barker, S.A. Matrix solid-phase dispersion. J. Chromatogr. A, 2000, 885, 115- 127. [3] Barker, S.A. Matrix solid-phase dispersion (MSPD). J. Biochem. Biophys. Methods, 2007, 70, 151-162. [4] Bogialli, S.; Di Corcia, A. Matrix solid-phase dispersion as a valuable tool for extracting contaminants from foodstuffs. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007, 70, 163-179. [5] Kristenson, E.M.; Ramos, L.; Brinkman U.A.T. Recent advances in matrix solidphase dispersion. Trends Anal. Chem. 2006, 25, 96-111. [6] García-López, M.; Canosa, P.; Rodríguez, I. Trends and recent applications of matrix solid-phase dispersion. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 963-974. [7] Navarro, M.; Picó, Y.; Marín, R.; Mañes, J. Application of matrix solid-phase dispersion to the determination of a new generation of fungicides in fruits and vegetables. J. Chromatogr. A 2002, 968, 201-209. [8] Kristenson, E.M.; Shahmiri, S.; Slooten, C.J.; Vreuls, R.J.J.; Brinkman, U.A.T. Matrix solid-phase dispersion micro-extraction of pesticides from single insects with subsequent GC-MS analysis. Chromatographia 2004, 59, 315-320. [9] Soler, C.; Mañes, J.; Picó, Y. Routine application using single quadrupole liquid chromatography-mass spectrometry to pesticides analysis in citrus fruits. J. Chromatogr. A 2005, 1088, 224-233. [10] Totti, S.; Fernández, M.; Ghini, S.; Picó, Y. ; Fini, F. ; Mañes, J. ; Girotti, S. Application of matrix solid phase dispersion to the determination of imidacloprid, 3. MSPD 78 carbaryl, aldicarb, and their main metabolites in honeybees by liquid chromatography-mass spectrometry detection. Talanta 2006, 69, 724-729. [11] Garrido Frenich, A.; Plaza Bolaños, P.; Martínez Vidal, J.L. Multiresidue analysis of pesticides in animal liver by gas chromatography using triple quadrupole tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2007, 1153, 194-202. [12] Cunha, S.C.; Fernandes, J.O.; Beatriz, M.; Oliveira, P.P. Determination of phosmet and its metabolites in olives by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass spectrometry. Talanta 2007, 73, 514-522. [13] Dantas Silva, M.G.; Aquino, A.; Silveira Dórea, H.; Navickiene, S. Simultaneous determination of eight pesticide residues in coconut using MSPD and GC/MS. Talanta 2008, 76, 680-684. [14] García de Llasera, M.P.; Reyes-Reyes, M.L. A validated matrix solid-phase dispersion method for the extraction of organophosphorus pesticides from bovine samples. Food Chem. 2009, 114, 1510-1516 [15] Macedo, A.N.; Nogueira, A.R.A.; Govoni Brondi, S.H. Matrix solid-phase dispersion extraction for analysis of cypermethrin residue in cows’ milk. Chromatographia 2009, 69, 571-573. [16] Valenzuela, A.I.; Lorenzini, R.; Redondo, M.J.; Font, G. Matrix solid-phase dispersion microextraction and determination by high-performance liquid chromatography with UV detection of pesticide residues in citrus fruits. J. Chromatogr. A 1999, 839, 101-107. [17] Fernández, M.; Picó, Y.; Mañes, J. Determination of carbamate residues in fruits and vegetables by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2000, 871, 43-56. [18] Kristenson, E.M.; Haverkate, E.G.J.; Slooten, C.J.; Ramos, L.; Vreuls, R.J.J.; Brinkman, U.A.T. Miniaturized automated matrix solid-phase dispersion extraction of pesticides in fruit followed by gas chromatographic-mass spectrometric analysis. J. Chromatogr. A 2001, 917, 277-286. [19] Kruve, A.; Künnapas, A.; Herodes, K.; Leito I. Matrix effects in pesticide multiresidue analysis by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2008, 1187, 58-66. [20] Barker, S.A.; Long, A.R. Tissue drug residue extraction and monitoring by matrix solid phase dispersion (MSPD)-HPLC analysis. J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 1992, 15, 2071-2089. I. INTRODUCCIÓN 79 [21] Michel, M.; Buszewski, B. Optimization of a matrix solid-phase dispersion method for the determination analysis of carbendazim residue in plant material. J. Chromatogr. B 2004, 800, 309-314. [22] Minuti, L.; Pellegrino, R. Determination of phenolic compounds in wines by novel matrix solid-phase dispersion extraction and gas chromatography/mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2008, 1185, 23-30. [23] Santana dos Santos, T.F.; Aquino, A.; Dórea, H.S.; Navickiene, S. MSPD procedure for determining buprofezin, tetradifon, vinclozolin, and bifenthrin residues in propolis by gas chromatography-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 390, 1425-1430. [24] Silveira Dórea, H.; Mauro Lanças F. Matrix solid-phase dispersion of organophosphorus and synthetic pyrethroid pesticides in cashew nut and passion fruit. J. Microcolumn Separations, 1999, 11, 367-375. [25] Albero, B.; Sánchez-Brunete, C.; Tadeo, J.L. Determination of organophosphorus pesticides in fruit juices by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6915-6921. [26] Cai, J.; Gao, Y.; Zhu, X.; Su, Q. Matrix solid phase dispersion-Soxhlet simultaneous extraction clean-up for determination of organochlorine pesticide residues in tobacco. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 383, 869-874. [27] Valsamaki, V.I.; Boti, V.I.; Sakkas, V.A.; Albanis, T.A. Determination of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in chicken eggs by matrix solid phase dispersion. Anal. Chim. Acta, 2006, 573-574, 195-201. [28] Abhilash, P.C.; Jamil, S.; Singh, N. Matrix solid-phase dispersion extraction versus solid-phase extraction in the analysis of combined residues of hexachlorocyclohexane isomers in plant matrices. J. Chromatogr. A 2007, 1176, 43-47. [29] Kishida, K.; Furusawa, N. Matrix solid-phase dispersion extraction and highperformance liquid chromatographic determination of residual sulfonamides in chicken. J. Chromatogr. A 2001, 937, 49-55. [30] Hu, Y.-Y.; Zheng, P.; Zhang, Z.-X. ; He, Y.-Z. Determination of aflatoxins in highpigment content samples by matrix solid-phase dispersion and high-performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2006, 54 4126-4130. 3. MSPD 80 [31] Sánchez-Brunete, C.; Miguel, E.; Tadeo, J.L. Determination of organochlorine pesticides in sewage sludge by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass spectrometry. Talanta, 2008, 1211-1217. [32] Radišić, M.; Grujić, S.; Vasiljević, T.; Laušević, M. Determination of selected pesticides in fruit juices by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Food Chem. 2009, 113, 712-719. [33] Manhita, A.C.; Teixeira, D.M.; da Costa, C.T. Application of sample disruption methods in the extraction of anthocyanins from solid or semi-solid vegetable samples. J. Chromatogr. A 2006, 1129, 14-20. [34] Furusawa, N. Separating DDTs in edible animal fats using matrix solid-phase dispersion extraction with activated carbon filter, Toyobo-KF. J. Chromatogr. Sci. 2006, 44, 498-503. [35] Guo, L.; Guan, M.; Zhao, C.; Zhang, H. Molecularly imprinted matrix solid-phase dispersion for extraction of chloramphenicol in fish tissues coupled with highperformance liquid chromatography determination. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 392, 1431-1438. [36] Hu, Y.-Y.; Zheng, P.; He, Y.-Z.; Sheng, G.-P. Response surface optimization for determination of pesticide multiresidues by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography. J. Chromatogr. A 2005, 1098, 188-193. [37] García, M.; Rodríguez, I.; Cela, R. Optimisation of a matrix solid-phase dispersion method for the determination of organophosphate compounds in dust samples. Anal. Chim. Acta 2007, 590, 17-25. [38] Kishida, K.; Furusawa, N. Toxic/harmful solvents-free technique for HPLC determination of six sulfonamides in meat. J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 2003, 26, 2931-2939. [39] Ruiz, M.J.; Cameán, A.M.; Moreno, I.M.; Picó, Y. Determination of microcystins in biological samples by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatographymass spectrometry. J. Chromatogr. A 2005, 1073, 257-262. [40] Bogialli, S.; D’Ascenzo, G.; Di Corcia, A.; Laganà, A.; Tramontana, G. Simple assay for monitoring seven quinolone antibacterials in eggs: Extraction with hot water and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry: Laboratory validation in line with European Union Commission Decision 657/2002/EC. J. Chromatogr. A 2009, 1216, 794-800. I. INTRODUCCIÓN 81 [41] Barker, S.A. Applications of matrix solid-phase dispersion in food analysis. J. Chromatogr. A, 2000, 880, 63-68. [42] Garrido Frenich, A.; Martínez Vidal, J.L.; Cruz Sicilia, A.D.; González Rodríguez, M.J.; Plaza Bolaños, P. Multiresidue analysis of organochlorine and organophosphorus pesticides in muscle of chicken, pork and lamb by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 2006, 558, 42-52. [43] Kot-Wasik, A.; Wasik, A. Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode-array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction. Anal. Chim. Acta 2005, 543, 46-51. [44] Canosa, P.; Pérez-Palacios, D.; Garrido-López, A.; Tena, M.T.; Rodríguez, I.; Rubí, E.; Cela, R. Pressurized liquid extraction with in-cell clean-up followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry for the selective determination of parabens and triclosan in indoor dust. J. Chromatogr. A 2007, 1161, 105-112. [45] Canosa, P.; Rodríguez, I. Rubí, E.; Cela, R. Determination of parabens and triclosan in indoor dust using matrix solid-phase dispersion and gas chromatography with tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 2007, 79, 1675- 1681. [46] Tolls, J.; Samperi, R.; Di Corcia, A. Bioaccumulation of LAS in feral fish studied by a novel LC-MS/MS method. Environ. Sci. Technol. 2003, 37, 314-320. [47] Fang, G.; Min, G.; He, J.; Zhang, C.; Qian, K.; Wang, S. Multiwalled carbon nanotubes as matrix solid-phase dispersion extraction adsorbents to determine 31 pesticides in agriculture samples by gas chromatography-mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3040-3045. [48] Carro, A.M.; Lorenzo, R.A.; Fernández, F.; Rodil, R.; Cela, R. Multi-residue screening of chlorinated and brominated compounds from aquaculture samples using matrix solid-phase dispersion-gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2005, 1071, 93-98. [49] Kubala-Drincic, H.; Bazulic, D.; Sapurnar-Postruznik, J.; Grubelic, M.; Stuhne, G. Matrix solid-phase dispersion extraction and gas chromatographic determination of chloramphenicol in muscle tissue. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 871-875. [50] Blasco, C.; Font, G.; Picó, Y. Determination of dithiocarbamates and metabolites in plants by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2004, 1028, 267-276. 4. PSE 88 4.3 INSTRUMENTACIÓN En la Figura I.4.2 se muestra un esquema de un instrumento de PSE. La mayoría de las aplicaciones publicadas utilizan el equipo comercializado por Dionex (ASE 200) que permite trabajar a temperaturas de hasta 200 ºC y a presiones de hasta 21 MPa, en celdas de extracción de 1, 5, 11, 22 o 33 mL. Dispone además de un carrusel en el que se pueden colocar 24 celdas y 26 viales (de 40 o 60 mL) para la recogida de los extractos. Además, hay 4 viales para recoger los residuos de las etapas de lavado. [8] 4.4 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN Una extracción por PSE consta de una serie de etapas (ver Figura I.4.3) que se explican con detalle a continuación [7, 10]: horno celda de extracción vial colector bomba disolvente N 2 válvula de bombeo válvula de purga válvula estática horno celda de extracción vial colector bomba disolvente N 2 válvula de bombeo válvula de purga válvula estática Figura I.4.2 Esquema de un sistema PSE. [9] I. INTRODUCCIÓN 89 1. Antes de introducir la muestra en la celda de extracción, a menudo es necesario someterla a un pretratamiento consistente en la homogeneización, molienda, tamizado y secado de la misma. La difusión de los analitos desde la muestra hacia el disolvente se puede incrementar considerablemente disminuyendo el tamaño de partícula. Por otro lado, el secado de la muestra también es importante puesto que si las partículas de la muestra estuviesen rodeadas de una película de agua no se produciría un contacto adecuado entre los analitos y el disolvente, lo cual provocaría una disminución en la eficacia de la extracción. El secado es especialmente importante cuando se trabaja con disolventes no-polares, y habitualmente se recurre a la adición de un agente desecante (sulfato sódico anhidro [11], tierra de diatomeas [12] o Celita [13]) en la celda de extracción. En ocasiones, estas sustancias también se emplean para reducir el volumen muerto de la celda [14, 15], aunque también es habitual utilizar arena para este fin [16, 17]. Otra alternativa que también se utiliza con frecuencia para el secado de las muestras es la liofilización [12], aunque esta opción no es recomendable cuando el objetivo es extraer analitos volátiles. El uso de disolventes más Figura I.4.3 Esquema de las etapas de una extracción por PSE. [7] P P r r e e p p a a r r a a c c i i ó ó n n d d e e l l a a m m u u e e s s t t r r a a e e i i n n t t r r o o d d u u c c c c i i ó ó n n d d e e l l a a m m i i s s m m a a e e n n l l a a c c e e l l d d a a C C o o l l o o c c a a c c i i ó ó n n d d e e l l a a c c e e l l d d a a e e n n e e l l s s i i s s t t e e m m a a P P S S E E C C a a r r g g a a d d e e l l a a c c e e l l d d a a e e n n e e l l h h o o r r n n o o I I n n t t r r o o d d u u c c c c i i ó ó n n d d e e l l d d i i s s o o l l v v e e n n t t e e C C a a l l e e n n t t a a m m i i e e n n t t o o y y p p r r e e s s u u r r i i z z a a c c i i ó ó n n d d e e l l a a c c e e l l d d a a E E x x t t r r a a c c c c i i ó ó n n e e s s t t á á t t i i c c a a / / d d i i n n á á m m i i c c a a T T r r a a n n s s f f e e r r e e n n c c i i a a d d e e l l e e x x t t r r a a c c t t o o a a l l v v i i a a l l c c o o l l e e c c t t o o r r y y e e n n j j u u a a g g u u e e d d e e l l a a m m u u e e s s t t r r a a c c o o n n d d i i s s o o l l v v e e n n t t e e n n u u e e v v o o P P u u r r g g a a d d e e l l a a c c e e l l d d a a c c o o n n n n i i t t r r ó ó g g e e n n o o p p r r e e s s u u r r i i z z a a d d o o D D e e s s c c a a r r g g a a d d e e l l a a c c e e l l d d a a 4. PSE 90 polares (acetonitrilo, metanol, acetato de etilo, etc.) o de mezclas de disolventes (hexano/acetona, hexano/acetonitrilo, etc.) son buenas opciones para la extracción de muestras húmedas, haciendo que la etapa de secado de la muestra no sea crucial. Sin embargo, aún cuando se elija correctamente el agente desecante, en ocasiones se puede co-extraer cierta cantidad de agua que pudiera interferir en las siguientes etapas (limpieza, concentración del extracto, análisis directo). En este caso, algunos autores han recurrido a la adición directa de sulfato sódico anhidro al extracto [18]. La agregación de las partículas de muestra también puede perjudicar a la eficacia de la extracción, por eso a menudo es necesaria la dispersión de la muestra con un material inerte (p.ej. tierra de diatomeas, arena) [12, 19]. 2. Una vez pesada, la muestra se coloca en la celda de extracción. Para evitar que se atasquen las fritas metálicas presentes en ambos extremos de las celdas de extracción, éstas puede cubrirse con filtros de celulosa [3, 14, 15, 17, 20] o de fibra de vidrio [21], o con una pequeña cantidad de Celita [22]. Como ya se adelantó antes, también es recomendable rellenar el volumen muerto de la celda con matrices inertes [1]. 3. Se puede operar en dos modos: pre-calentamiento (preheat) o pre-llenado (prefill). En el primer caso, el horno se calienta hasta la temperatura apropiada y, a continuación, la celda se carga en el horno. Transcurrido el tiempo pertinente, el disolvente se introduce en la celda y el proceso de extracción comienza. En el segundo caso, la celda se llena con el disolvente y solo después se carga en el horno. El modo de pre-llenado permite la eliminación de aire intersticial y evita la degradación de compuestos fácilmente oxidables. Por este motivo, también se aconseja desgasificar a los disolventes antes de la extracción. Este modo de pre-llenado es recomendable para la extracción de compuestos termolábiles. 4. El proceso de extracción puede realizarse en modo estático o en modo dinámico. El modo estático comienza calentando la celda con la muestra hasta una temperatura apropiada durante un tiempo de equilibrio (aproximadamente 5 min) y viene seguido del proceso de extracción estático. I. INTRODUCCIÓN 91 Este proceso se puede repetir varias veces si en una sola etapa se obtienen bajas recuperaciones. El modo dinámico se puede asimilar a la HPLC llevada a cabo a temperaturas elevadas, en donde el empaquetamiento de la columna se reemplaza por la muestra. Aunque de esta manera se mejora la transferencia de masa, este tipo de extracción apenas se utiliza, principalmente debido al elevado consumo de disolvente en comparación con el modo estático. 5. Tras la extracción, el extracto se transfiere al vial colector y la muestra y los tubos conectores se enjuagan con varias porciones de disolvente nuevo (flush). A continuación todo el sistema se purga con nitrógeno presurizado (1-2 min). El objetivo de estos dos pasos es, por una parte, el de eliminar en la medida de lo posible todos los residuos de la muestra para así mejorar la recuperación del analito y, por otra parte, el de preparar al sistema para el siguiente proceso de extracción. [7] 4.5 PARÁMETROS QUE AFECTAN A LA EFICACIA DEL PROCESO 4.5.1 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA La temperatura es el parámetro más importante de los utilizados en PSE. Su efecto ya se ha explicado con profundidad en la sección anterior. Cuando se desarrolla un nuevo método, se suele comenzar trabajando a 100 ºC o, si los analitos tienen un punto de degradación térmica conocido, se suele comenzar a 20 ºC por debajo de dicho nivel. La mayoría de las aplicaciones de PSE operan en el rango de 75 a 125 ºC, siendo 100 ºC la temperatura estándar para todas las aplicaciones medioambientales, excepto para las dioxinas. [23] 4.5.2 PRESIÓN Como ya se ha explicado antes, el principal motivo de trabajar a presiones elevadas es el de mantener los disolventes en estado líquido cuando se encuentran a temperaturas por encima de sus puntos de ebullición y el de hacer que los fluidos se 4. PSE 92 muevan rápidamente a través del sistema. En general, los cambios en la presión de trabajo tienen un impacto muy pequeño en las recuperaciones y, por tanto, no se considera un parámetro experimental crítico. La mayoría de las extracciones se llevan a cabo a presiones entre 1000 psi (7 MPa) y 2000 psi (14 MPa), siendo 1500 psi (10 MPa) la presión estándar [23]. Sin embargo, en aplicaciones con muestras húmedas o matrices muy adsorbentes una presión alta puede mejorar la eficacia de la PSE forzando la entrada del disolvente orgánico en los poros de la matriz [24]. 4.5.3 DISOLVENTE Para conseguir una extracción eficiente, lo ideal es que el disolvente solubilice a los analitos dejando intacta la matriz de la muestra. Para ello, la polaridad del disolvente de extracción debe ser similar a la de los compuestos a extraer. Cuando se quiere extraer un amplio rango de clases de compuestos se suele recurrir a la mezcla de disolventes de diferente polaridad. Además, se debe tener en cuenta la compatibilidad con las técnicas analíticas posteriores a la extracción, la necesidad de la concentración del extracto (volatilidad del disolvente), así como el coste del disolvente [23]. En PSE se pueden utilizar una gran variedad de disolventes, excepto aquellos con una temperatura de autoignición entre 40-200ºC (p.ej. disulfuro de carbono, éter dietílico, 1,4-dioxano). Además, las bases y los ácidos fuertes también se deben evitar puesto que son corrosivos [8]. En general, la transferencia de las condiciones de extracción desde los métodos convencionales a PSE no requiere del cambio de disolvente; es más, PSE permite incluso el uso de disolventes que no son efectivos en los métodos convencionales. No obstante, la extracción de muestras sólidas medioambientales (suelos, sedimentos, etc.), que consisten en mezclas complejas de diferentes especies y a diferentes niveles de concentración, es una tarea complicada. Y es que a presiones y temperaturas elevadas el proceso de extracción transcurre más rápidamente; pero la selectividad disminuye puesto que no sólo se solubilizan los analitos, sino que también puede conducir a la solubilización de otros componentes de la matriz que, de tratarse de una extracción convencional, permanecerían insolubles. Por ello, a menudo, en las extracciones por PSE de muestras medioambientales, entre otras, es difícil conseguir una buena selectividad. [7] I. INTRODUCCIÓN 93 4.5.4 NÚMERO DE CICLOS El uso de ciclos estáticos se desarrolló para introducir disolvente nuevo durante el proceso de extracción, lo cual ayuda a mantener un equilibrio de extracción favorable. Se ha comprobado que las extracciones de varios ciclos son especialmente útiles para muestras con una elevada concentración de los analitos o para matrices de difícil penetración. [23] 4.5.5 TIEMPO DE EXTRACCIÓN Los tiempos de extracción en PSE son muy cortos en comparación con los de las técnicas convencionales de extracción sólido-líquido. A menudo 5 min son suficientes, tal y como se recomienda en el método EPA 3545 [6]. En ciertas matrices, los analitos pueden estar retenidos dentro de los poros u otras estructuras. En estos casos, el incremento del tiempo de extracción puede permitir la difusión de estos compuestos hacia el disolvente de extracción. El efecto del tiempo de extracción siempre se debe evaluar en conjunción con el número de ciclos, con el objetivo de conseguir una extracción completa de la forma más eficiente posible. [23] 4.6 ETAPAS DE LIMPIEZA Aún cuando se lleva a cabo una buena optimización de los parámetros de extracción con el objetivo de conseguir un método de PSE selectivo, otros componentes de la matriz de elevado peso molecular (lípidos, pigmentos, resinas, etc.) pueden estar presentes en el extracto. Estos componentes deben ser eliminados antes del análisis final, para así minimizar los efectos adversos en la detección de los compuestos de interés. Para la eliminación de dichos compuestos interferentes se han desarrollado diferentes procedimientos de limpieza. A menudo, estas interferencias se eliminan en etapas de limpieza posteriores a la extracción, siendo los procedimientos más comunes aquellos que incluyen el uso de columnas de adsorción o de la cromatografía de permeación en gel (GPC). Tradicionalmente, las columnas de 4. PSE 94 adsorción con alúmina [25], sílica gel [20], carbón no-poroso grafitizado [26] y Florisil [27] se han aplicado a muestras grasas en las que es necesario eliminar los lípidos co-extraídos. Para la eliminación destructiva de lípidos y de otros compuestos oxidables de muestras alimentarias y biológicas, también se han empleado columnas de sílica gel impregnadas de ácido sulfúrico [28]. Sin embargo, la GPC es cada vez más popular [12, 20], principalmente porque se puede automatizar con facilidad. No obstante, la limpieza de muestras grasas es a menudo muy tediosa y larga y, en ocasiones, es necesaria más de una etapa para conseguir la eliminación de los lípidos (p.ej. GPC y columnas de sílica [14, 20], columnas de sílica gel impregnadas con ácido sulfúrico y columnas de alúmina [29], etc.). Con el objetivo de evitar la limpieza exhaustiva de los extractos previa al análisis y de incrementar las posibilidades de automatización, también se han desarrollado procedimientos de limpieza in situ. En estos casos, la selectividad de la PSE se puede mejorar añadiendo un adsorbente apropiado a la celda de extracción, para llevar así a cabo una etapa simultánea de limpieza. Así, en el caso de muestras grasas, la eliminación in situ de los lípidos se puede conseguir añadiendo a las celdas adsorbentes como Florisil [30], alúmina [31] o sílica gel impregnada con ácido sulfúrico [28]; de esta manera se evita que los lípidos y otros materiales coextractables lleguen al extracto. Dicho planteamiento incrementa la velocidad de preparación de la muestra eliminando, virtualmente, la necesidad de una etapa posterior de limpieza de los extractos y reduciendo el consumo total de disolvente [24]. Cuando el objetivo es la extracción de especies polares, otra manera de minimizar la co-elución de interferencias de la matriz consiste en la aplicación de una PSE previa con un disolvente no-polar para así eliminar los compuestos hidrofóbicos presentes en la muestra (grasas, resinas, aceites, clorofilas, etc.) antes de la extracción de los compuestos de interés [31, 32]. 4.7 APLICACIONES DE LA PSE AL ANÁLISIS DE PESTICIDAS Originalmente, el uso de la PSE se centró en la extracción de contaminantes ambientales presentes en suelos, sedimentos y residuos sólidos. Sin embargo, I. INTRODUCCIÓN 95 más recientemente, las ventajas de esta técnica se han explotado en otras áreas como son el análisis de muestras biológicas y alimentarias. Además, existen múltiples aplicaciones de la PSE en la determinación de pesticidas, puesto que esta técnica permite la extracción simultánea de pesticidas con polaridades muy diferentes. 4.7.1 ANÁLISIS DE SUELOS, SEDIMENTOS Y LODOS La mayoría de los métodos de PSE desarrollados para la determinación de pesticidas en suelos [4, 5, 11, 21, 33-41], sedimentos [42-44] y residuos sólidos [45-47] requieren el secado, la homogeneización y, en algunos casos, el tamizado de la muestra. Tal y como se mencionó antes, la reducción del tamaño de partícula puede contribuir a una mayor eficacia de la extracción como consecuencia del mejor contacto entre el disolvente y las partículas de la muestra. No obstante, la necesidad de pulverizar la muestra para obtener una muestra representativa está principalmente determinada por el tamaño de muestra utilizado en los experimentos. En general, se manejan tamaños de 1-2 g para el caso de muestras de polvo o ceniza, y de 1-5 g para suelos y sedimentos. Sin embargo, también se han publicado procedimientos en los que se manejan cantidades mayores (10-20 g) [4, 34, 41, 42] o menores (0,2 g) [5]. Para conseguir extractos libres de interferencias se ha recurrido tanto a procedimientos de limpieza a posteriori mediante SPE [38, 40, 44], como a limpiezas in situ incorporando determinados adsorbentes en celda como por ejemplo Florisil [37] o alúmina [43]. En ocasiones, la introducción de adsorbentes en la celda no ha sido suficiente y se ha necesitado una etapa de limpieza adicional (p. ej. SPE con Florisil [4]). También se han publicado trabajos en los que los extractos de muestras sólidas medioambientales se han purificado utilizando dos etapas de limpieza a posteriori (GPC y SPE [42], partición del extracto PSE con hexano y dSPE [47]). 4.7.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Y ALIMENTARIAS La PSE se ha aplicado tanto a muestras vegetales [3, 15-18, 20, 48-55] como a muestras de tejidos animales [12, 14, 27, 56, 57]. Al igual que se ha observado para el caso de las muestras sólidas medioambientales, en general se requiere el 4. PSE 96 secado y la homogeneización de la muestra. Los residuos de pesticidas están a menudo presentes en alimentos no-grasos, como fruta, verduras o alimentos basados en cereales, que presentan un contenido de agua medio o alto. En general, el secado de estas muestras se lleva a cabo mediante la adición directa de un agente de secado como el sulfato sólido, la tierra de diatomeas o la celulosa. En determinadas aplicaciones, la extracción de pesticidas mediante PSE empleando agua como disolvente también es una opción apropiada [54, 55]. El problema de la co-extracción de interferencias, que puede dar lugar a la obtención de extractos turbios o ligeramente coloreados, se ha solventado incorporando procedimientos de limpieza a posteriori que a menudo también sirven como etapas de preconcentración de los analitos como la extracción líquido-líquido (LLE) [55], la cromatografía de permeación en gel (GPC) [3, 50], la extracción en fase sólida (SPE) [27, 54], la microextracción en fase sólida (SPME) [53, 57], o la extracción por sorción con barras magnéticas agitadoras (stir-bar sorptive extraction, SBSE) [53]. Por otro lado, también se han utilizado procedimientos de limpieza in situ [49, 58]. BIBLIOGRAFÍA [1] Richter, B.E.; Jones, B.A.; Ezzell, J.L.; Porter, N.L. Accelerated solvent extraction: A technique for sample preparation. Anal. Chem. 1996, 68, 1033- 1039. [2] Mendiola, J.A.; Herrero, M.; Cifuentes, A.; Ibañez, E. Use of compressed fluids for sample preparation: Food applications. J. Chromatogr. A 2007, 1152, 234- 246. [3] Gfrerer, M.; Chen, S; Lankmayr E.P.; Quan, X.; Yang, F. Comparison of different extraction techniques for the determination of chlorinated pesticides in animal feed. Anal. Bioanal. Chem. 2004, 378, 1861-1867. [4] Wang, W.; Meng, B.; Lu, X.; Liu, Y.; Tao, S. Extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons and organochlorine pesticides from soils: A comparison between Soxhlet extraction, microwave-assisted extraction and accelerated solvent extraction techniques. Anal. Chim. Acta 2007, 602, 211-222. I. INTRODUCCIÓN 97 [5] Zuloaga, O.; Etxebarría, N.; Fernández L.A.; Madariaga, J.M. Optimization and comparison of MAE, ASE and Soxhlet extraction for the determination of HCH isomers in soil samples. Fresenius J. Anal. Chem. 2000, 367, 733-737. [6] EPA Method 3545, Pressurised Fluid Extraction. En Test Methods for Evaluating Solid Waste, Physical/Chemical Methods, 3rd ed., Final Update IV; EPA SW-846; U.S. GPO, Washington, DC, 2008. [7] Giergielewicz-MoŜajska, H.; Dąbrowski, Ł.; Namieśnik, J. Accelerated solvent extraction (ASE) in the analysis of environmental solid samples-Some aspects of theory and practice. Crit. Rev. Anal. Chem. 2001, 31, 149-165. [8] ASE 200, Accelerated Solvent Extractor Operator’s Manual, DIONEX Corp., Document No. 031149, Revision 03, Sunnyvale, 1997. [9] Björklund E., Nilsson T. Pressurized liquid extraction of persistent organic pollutants in environmental analysis. Trends Anal. Chem. 2000, 19, 434-445. [10] Carabias-Martínez, R.; Rodríguez-Gonzalo, E.; Revilla-Ruiz, P.; Hernández- Méndez, J. Pressurized liquid extraction in the analysis of food and biological samples. J. Chromatogr. A 2005, 1089, 1-17. [11] Fisher, J.A.; Scarlett, M.J.; Stott, A.D. Accelerated solvent extraction: an evaluation for screening of soils for selected U.S. EPA semivolatile organic priority pollutants. Environ. Sci. Technol. 1997, 31, 1120-1127. [12] Garrido Frenich, A.; Martínez Vidal, J.L.; Cruz Sicilia, A.D.; González Rodríguez, M.J.; Plaza Bolaños, P. Multiresidue analysis of organochlorine and organophosphorus pesticides in muscle of chicken, pork and lamb by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 2006, 558, 42-52. [13] Pang, G.-F.; Liu, Y.-M. ; Fan, C.-L.; Zhang, J.-J.; Cao, Y.-Z.; Li, X.-M.; Li, Z.-Y.; Wu, Y.-P. ; Guo, T.-T. Simultaneous determination of 405 pesticide residues in grain by accelerated solvent extraction then gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 1366-1408. [14] Saito, K.; Sjödin, A.; Sandau, C.D.; Davis, M.D.; Nakazawa, H.; Matsuki, Y.; Patterson Jr., D.G. Development of a accelerated solvent extraction and gel permeation chromatography analytical method for measuring persistent organohalogen compounds in adipose and organ tissue analysis. Chemosphere 2004, 57, 373-381. 5. FOTODEGRADACIÓN 104 • movilidad del pesticida: adsorción, consumo por parte de las plantas (fijación, absorción), volatilización, escorrentía y filtrado. [4] La biodegradación y la fotodegradación son los principales procesos de degradación medioambientales. La fotodegradación puede tener lugar en la atmósfera o en la superficie del suelo o del agua. Uno de los factores a tener en cuenta en este tipo de procesos es la intensidad de la radiación UV que, a su vez, depende de varios factores: época del año, hora del día, latitud, altura sobre el nivel del mar, presencia de nubes, tamaño del agujero de la capa de ozono, etc. [5] Muchos pesticidas son susceptibles a la fototransformación puesto que sus estructuras contienen frecuentemente grupos cromóforos que absorben luz a longitudes de onda en la región UV y visible del espectro solar. Los grupos potencialmente cromóforos incluyen a los enlaces insaturados (p. ej. N=O, C=S, N=N, C=C-C=C) y estructuras de anillos aromáticos [2]. Antes de que la fotodegradación alcance el punto final, se forman productos intermedios de degradación de los compuestos primarios. La identificación de estos fotoproductos intermedios es de gran importancia ya que es posible que posean una toxicidad para determinados seres vivos más elevada que los compuestos de los que proceden [5]. Figura I.5.2 Destino de los pesticidas en el suelo. [4] I. INTRODUCCIÓN 105 5.3 APLICACIONES TÉCNICAS DE LOS PROCESOS DE FOTODEGRADACIÓN El uso doméstico de insecticidas y la actividad industrial asociada, que afecta particularmente a países desarrollados, genera grandes cantidades de aguas residuales. El depósito directo de aguas residuales en los canales naturales tiene un impacto considerable en el medioambiente. Esto, junto con la necesidad de restituir esta agua para nuevos usos, hace esencial la purificación de las aguas residuales para conseguir el grado de calidad deseado [6]. Los desarrollos en el dominio del tratamiento químico del agua para su limpieza han conducido a una mejora de los procedimientos de degradación oxidativos de compuestos orgánicos disueltos o dispersos en el medio acuático mediante la aplicación de métodos catalíticos y fotolíticos. Éstos generalmente se conocen como Procesos de Oxidación Avanzados (Advanced Oxidation Processes, AOPs) [7]. En estos procesos la radiación ultravioleta (UV) se utiliza para el tratamiento de aguas contaminadas con compuestos orgánicos. La gran mayoría de las aplicaciones utilizan lámparas de mercurio de media presión, debido a su gran potencia por debajo de 300 nm. Numerosos contaminantes químicos absorben radiación UV a estas longitudes de onda y, por lo tanto, pueden experimentar una fotólisis directa eficiente. Un tratamiento alternativo es la combinación de luz UV con peróxido de hidrógeno lo que produce un fuerte oxidante como son los radicales hidroxilo. Este último proceso es útil cuando el contaminante de interés no posee un cromóforo adecuado o tiene un rendimiento cuántico para la fotólisis directa bajo [8]. 5.4 CINÉTICA DE LOS PROCESOS DE FOTODEGRADACIÓN Habitualmente, los procesos de degradación se pueden describir mediante ecuaciones de primer orden [5]. Las cinéticas de degradación de primer orden se expresan mediante la ecuación I.5.1: kCdtdC -= (ecuación I.5.1) 5. FOTODEGRADACIÓN 106 donde C es la concentración de compuesto degradado en el tiempo t y k es la constante de velocidad de primer orden. Si se integra la ecuación I.5.1 se obtiene que: kt 0 eCC(t) - = (ecuación I.5.2) De la ecuación I.5.2 se deduce que la concentración de compuesto es una función exponencial del tiempo de degradación. Si se aplican logaritmos a ambos lados de la ecuación I.5.2: ktCln)t(Cln - 0 = (ecuación I.5.3) Por lo tanto, si se está considerando la fotodegradación de un compuesto y ésta sigue una cinética de primer orden, el logaritmo neperiano de la concentración será una función lineal del tiempo de irradiación (ecuación I.5.3). El tiempo de vida media (t 1/2 ) se define como el tiempo que tarda la concentración inicial de un compuesto en reducirse a la mitad de la concentración inicial. Se trata de un parámetro muy útil a la hora de comparar cinéticas de fotodegradación y, a partir de la ecuación I.5.3, se obtiene que: (ecuación I.5.4) 5.5 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA ESTUDIAR EL COMPORTAMIENTO FOTOQUÍMICO DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS En general, los estudios de fotodegradación se llevan a cabo en varias etapas: 1. Irradiación de la muestra que contiene los analitos a estudiar, habitualmente con lámparas UV, simuladores solares, o luz solar natural. k/lnt ktClnlnCln ktCln)/Cln( /CC / / / 2= =2 =2 2= 21 2100 2100 0 -- - I. INTRODUCCIÓN 107 2. Extracción de los analitos y de sus fotoproductos. Lo normal es que las concentraciones de los productos de degradación sean muy bajas, por lo que es necesario pre-concentrar la muestra o aislar los fotoproductos, habitualmente mediante extracción líquido-líquido (LLE) [9, 10] o extracción en fase sólida (SPE) [11-13]. En algunos casos también se ha utilizado la SPME como procedimiento de extracción [9, 14-16]. 3. Determinación y análisis del compuesto de partida y de los productos que se puedan haber formado. En la mayoría de los casos, la identificación se lleva a cabo mediante GC-MS o LC-MS. Una de las técnicas más utilizadas en los estudios clásicos de fotodegradación es la LLE. Sin embargo, este procedimiento acarrea varias desventajas: 1. la sensibilidad no siempre es suficiente para detectar los fotoproductos que se pueden generar a concentraciones muy bajas, 2. por eso, habitualmente, se requieren varias etapas de pre-concentración, incrementando la duración y el tedio del análisis, así como la posibilidad de cometer errores, además 3. aumentan las posibilidades de perder algún fotoproducto, y 4. frecuentemente se requiere el uso de disolventes orgánicos, dañinos para el medioambiente y para el operador. Con el objetivo de evitar alguna de estas desventajas, LLE ha sido reemplazada por la SPE. No obstante, esta metodología también implica un procedimiento multietapa; por tanto, la duración de cada análisis y la posibilidad de que se produzcan pérdidas de fotoproductos son todavía elevadas. Algunas de estas desventajas se pueden evitar utilizando la microextracción en fase sólida (SPME) como técnica de extracción y preconcentración. Y es que, comparada con las técnicas de preparación de muestra tradicionales, la SPME se caracteriza por ser una alternativa rápida, sensible y económica. Además, la SPME sigue las tendencias de la química verde [17] puesto es un procedimiento respetuoso con el medioambiente ya que no requiere el uso de disolventes orgánicos. 5. FOTODEGRADACIÓN 108 5.6 FOTO-SPME En los estudios de fotodegradación realizados en esta Tesis, se ha aplicado la SPME al estudio de la fotodegradación de varios piretroides, pero no sólo se ha utilizado como técnica de extracción, si no también como soporte o matriz de estos estudios. En la foto-SPME, o fotodegradación en fibra, la irradiación se produce después de la extracción, es decir, cuando los compuestos que se pretende estudiar se encuentran absorbidos en el recubrimiento de la fibra [18]. Lo novedoso de esta idea, surgida en nuestro laboratorio de investigación, es que los fotoproductos se generan in situ en la propia fibra y ésta es inmediatamente insertada en el puerto de inyección del sistema cromatográfico para proceder a la determinación de los mismos. Es decir, todos los fotoproductos se generan directamente en la fibra de SPME, por lo que no son necesarias etapas posteriores de extracción y se facilita su identificación debido a los elevados factores de concentración. Por tanto, la foto-SPME presenta una serie de ventajas que se enumeran a continuación: 1. no requiere el uso de disolventes orgánicos, por lo que se trata de un procedimiento respetuoso con el medioambiente; 2. no se requieren etapas de extracción tediosas, por lo que el tiempo necesario para completar el estudio de fotodegradación de una determinada sustancia se reduce drásticamente; 3. la generación de fotoproductos se produce en la propia fibra, por lo que se minimizan las posibles pérdidas de los mismos; 4. permite trabajar a niveles de concentración similares a los que se encuentran en el medioambiente gracias a la elevada pre-concentración de los compuestos orgánicos en la fibra de SPME; 5. comparada con los montajes clásicos, la irradiación de la fibra es muy sencilla; además, las reducidas dimensiones de la fibra facilitan los trabajos de campo. I. INTRODUCCIÓN 109 Mediante foto-SPME, acoplada con GC-MS, es posible establecer las cinéticas de fotodegradación de los analitos de interés, identificar los fotoproductos generados y establecer las rutas de fotodegradación de los compuestos investigados. Además, también es posible estudiar la evolución de los productos de degradación con el tiempo de irradiación (cinéticas de fotoformaciónfotodegradación). [18, 19] Así, la foto-SPME ha sido aplicada con éxito al estudio de la fotodegradación de bifenilos policlorados (PCBs) [20, 21], pesticidas [22, 23], retardantes de llama [24- 26], fragancias sintéticas [27, 28] y triclosán [29-31]. 5.7 FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES En este apartado se incluye un estudio crítico y pormenorizado de los escasos trabajos publicados hasta el momento acerca de la fotodegradación de los piretroides investigados en esta Tesis. Es importante destacar que la mayoría de los estudios consultados se han publicado en la década de los ochenta o a principios de los noventa. Además, no se han encontrado artículos referentes al comportamiento fotoquímico de la empentrina y de la cifenotrina, mientras que la información relativa a la fotodegradación de la transflutrina y la ciflutrina es bastante escasa. En muchos de estos trabajos, los piretroides se irradiaron bien en disoluciones orgánicas (hexano, metanol, etc.), bien como capas finas (sobre suelo, vidrio, etc.). Posteriormente a la etapa de irradiación, se recurrió habitualmente a procedimientos analíticos tediosos (p.ej. incluyendo etapas de LLE) así como a técnicas cromatográficas poco evolucionadas, como la Cromatografía de Capa Fina (TLC). 5. FOTODEGRADACIÓN 110 5.7.1 INTRODUCCIÓN Tres de las rutas principales de degradación de los piretroides por acción de la luz son: ruptura del enlace éster, dehalogenación reductiva e isomerización [32]. Los piretroides crisantemato y los análogos con grupos dihalogenovinílicos experimentan la fotoisomerización vía un dirradical intermedio de manera que un isómero individual puede dar lugar a la formación de mezclas isoméricas 1RS, 3RS, con los ya anticipados cambios en la actividad biológica (Apartado 1.5.5.2 del Capítulo I). Además de la isomerización, el dirradical intermedio puede sufrir una desproporción conduciendo a la formación de un 3,3-dimetilacrilato o ciclar tras una transposición radical formándose así una lactona (Figura I.5.3) [33]. También se observó que los piretroides con un grupo ciano en posición α respecto al enlace éster (p.ej. deltametrina, fenvalerato) se fotodegradaban más rápidamente que los derivados sin dicho grupo ciano y que, al menos en disolventes orgánicos, la decarboxilación es una ruta importante de fotodegradación de estos compuestos. [34] En otro estudio sobre la fotorreactividad de seis piretroides (S-bioaletrina, fenotrina, permetrina, cipermetrina, deltametrina y fenvalerato) y las reacciones a 250 y 300 nm del cis-2,2-dimetil-3-(2,2-dihalogenovinil)-ciclopropanocarboxilato de metilo (X= Cl o Br) en varios disolventes, se apreció una diferencia de 3-10 veces entre la reactividad de la S-bioaletrina (que contiene el cromóforo ciclopentenolona, fuertemente absorbente) y los compuestos fenoxibencil-sustituidos. Se observó además que en los piretroides con sustituyentes dihalogenovinílicos el cloro confería una mayor fotoestabilidad que el bromo mientras que, a diferencia de lo publicado en [34], el Figura I.5.3 Rutas de fotodegradación de algunos pire troides vía dirradical intermedio [33]. OR OX X O OR X X O OR X X O OR O OR X X O OR X X O H 3 C CH 3 OR O H 3 C CH 3 O X= Me, Cl, Br 1R, 3R 1S, 3S 1S, 3R 1R, 3S I. INTRODUCCIÓN 111 grupo ciano no afectaba significativamente a la velocidad de fotodegradación [35]. Los mismos autores evaluaron la sensibilización intramolecular y la fotorreactividad de una serie de piretroides derivados de los ácidos 1-6 y de los alcoholes A-C mostrados en la Figura I.5.4 [36]. Estos estudios de fotodegradación se realizaron en disoluciones de benceno (irradiando con λ<310 nm) y en capas finas sobre placas Petri (irradiando con luz solar). En la Figura I.5.5 se muestran las rutas fotoquímicas propuestas para los piretroides examinados. 5.7.2 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA ALETRINA Chen y Casida observaron que al exponer una capa fina de trans-aletrina sobre vidrio a una lámpara solar durante 8 horas, este piretroide se descomponía rápidamente para dar al menos 14 productos, la mayoría de ellos ésteres. La saponificación de la mezcla de ésteres liberó 16 ácidos (incluyendo el ácido trans-carbónico) y ceto OR' O O H OR' O R R R= CH 3 , Cl, Br OR' O O HO OR' O R H R RO OR' R R O O OH OH O O HO OH O R R HO HO HO O + R= Cl, Br R'= C Figura I.5.5 Rutas fotoquímicas propuestas para los piretroides examinados en [36]. Figura I.5.4 Partes ácida y alcohol de los piretroides estudiados en [36]. R RO O O O Cl O O RO O OO O Y X YZ 1 R= CH 3 2 R= Cl 3 R= Br 4 5 A B X=Y= H B Cl X= Cl Y= H B Me X= CH 3 Y= H B Me,CN X= CH 3 Y= CN C Y= H Z= C=O C CN Y= CN Z= C=O C OH Y= H Z= CHOH C OAc Y= H Z= CHOC(O)CH 3 6 R= H 6 Me R= CH 3 5. FOTODEGRADACIÓN 112 derivados resultantes del ataque oxidativo al doble enlace del grupo isobutenilo, así como derivados del ácido crisantémico en los que el grupo trans-metilo del isobutenilo se oxidó a alcohol, aldehído y ácido carboxílico. No apreciaron isomerización cis-trans, incluso tras la irradiación durante 24 horas. Para la separación y detección de los fotoproductos emplearon TLC. [37] Por su parte, Ruzo y col. examinaron la fotoisomerización y la fotooxidación de la S-bioaletrina en disolución (benceno, acetonitrilo:agua, etc.) y como capa fina sobre vidrio, bajo diferentes condiciones de irradiación (360 nm, luz solar) y en presencia o ausencia de sensibilizadores, quenchers y agentes de transferencia de oxígeno. Como técnicas de separación y detección emplearon Cromatografía Gas-Líquido―Detector de Captura Electrónica (GLC-ECD), TLC, Resonancia Magnética Nuclear (NMR) y Espectrometría de Masas con Ionización Química (CI-MS). Observaron que la bioaletrina (1) se descomponía rápidamente tras la exposición a la luz solar de una capa fina sobre vidrio (tras 3 horas de irradiación se descompuso un 56% del compuesto de partida). Los principales fotoproductos identificados resultaron de la ruptura del enlace éster (2), de la oxidación del metilo del grupo isobutenilo (3), de la trasposición di-π-metano (4, 5), de la epoxidación del doble enlace del grupo isobutenilo (6, 7) y de la isomerización cis/trans (8) (Figura I.5.6). La fotólisis con luz solar en disolución durante 3 horas condujo a la formación de la mayoría de los productos observados en fase sólida. La formación de ácido crisantémico (2) por ruptura del enlace éster fue comparable en todos los disolventes pero se incrementó en presencia de un radical bencilo. La fotólisis directa de la bioaletrina en benceno bajo radiación UV (360 nm) condujo a los fotoproductos observados tras la exposición a la luz solar, junto con cantidades traza del derivado descarboxilado, de los epóxidos cis, y de otros productos minoritarios. [38] I. INTRODUCCIÓN 113 Kawano y col. expusieron a la luz solar disoluciones de aletrina en queroseno similares a ciertas formulaciones comerciales. Las técnicas de análisis utilizadas fueron GC y GC-MS y observaron la formación del d-trans-crisantemato de d-trans- ciclopropilretronilo como fotoproducto de la aletrina. [39] Kimmel y col. expusieron capas finas de aletrina sobre placas Petri a luz solar y UV, y analizaron los fotoproductos generados utilizando técnicas cromatográficas (TLC y HPLC-UV) y espectroscópicas (CI-MS y NMR). En ambos casos obtuvieron mezclas similares de fotoproductos y observaron la conversión (0,4%) a derivados mutagénicos potentes (Figura I.5.7). Los bajos rendimientos obtenidos se atribuyeron, entre otros factores, a la inestabilidad de los epóxidos generados. [40] Isobe y col. estudiaron la fotodegradación de la aletrina (1) utilizando TLC, MS y NMR como técnicas de detección. Observaron que cuando este piretroide se Figura I.5.6 Fotodegradación de l a bioalet rin a (1) según [38]. Figura I.5.7 Obtención de derivados mutagénicos por fotodegradación de la aletrina según [40]. O O O O O O O O O O O O O O O O O O O OH O (1) (8) (7) (4)(3) (6) (2) O OH O O O O (7) O O O (5) O O O aletrina O O O derivado ciclopropílico O O O mutágeno ciclopropilepoxi luz luz [O] O 5. FOTODEGRADACIÓN 120 5.7.6 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA DELTAMETRINA Ruzo y col. estudiaron la fotólisis de la cis-deltametrina en disolución (metanol, hexano, agua:acetonitrilo) bajo luz UV (290-320 nm). Los productos de degradación se aislaron mediante TLC y GLC y fueron identificados por comparación con estándares auténticos utilizando varias combinaciones de GLC, TLC, IR, NMR y CIMS. Las rutas de fotodegradación propuestas en este trabajo se muestran en la Figura I.5.13. Las mezclas de fotoproductos obtenidas fueron más sencillas en hexano que en metanol. La cis-deltametrina (1) experimentó isomerización, decarboxilación, y debrominación, dando lugar a los compuestos (2), (3), y (4), respectivamente. La ruptura del enlace éster también fue una ruta de fotodegradación importante. En metanol y hexano, los productos más importantes derivados de la parte ácida del piretroide investigado fueron los ácidos (5) y (7) y, en metanol, también los metil ésteres (6) y (8). Mientras que en agua:acetonitrilo sólo se obtuvo el ácido (5). En cuanto a los compuestos (9) y (10), se obtuvieron en cantidades minoritarias. Con respecto a la parte alcohol de la deltametrina, en hexano y metanol se formaron (11-16). El fotoproducto mayoritario en hexano fue (17), que no se detectó en metanol. Mientras que en metanol el mayoritario fue (18), que tampoco se detectó en hexano. En acetonitrilo acuoso, el aldehído (16) y el ácido 3-fenoxibenzoico fueron los únicos fotoproductos importantes de la parte alcohol. [55] Los mismos autores publicaron otro estudio acerca de la fotoquímica de la deltametrina en disolución (metanol, hexano, agua:acetonitrilo) y en fase sólida (como capa fina sobre vidrio o sílica gel), bajo luz UV (290-320 nm) y luz solar en el que utilizaron las mismas técnicas que las indicadas en el trabajo anterior. La Figura I.5.14 muestra las rutas de fotodegradación propuestas para el piretroide investigado. Observaron que los fotoproductos generados en disolución bajo irradiación UV surgían en general de reacciones de ruptura del enlace éster, mientras que la mayoría de aquéllos formados en fase sólida y en disolución bajo luz solar mantenían dicho enlace intacto. Sugirieron que los fotoproductos identificados podían generarse como consecuencia de cuatro procesos fotoquímicos (A-D). El proceso A implicaría la apertura del anillo ciclopropánico conduciendo a isomerizaciones o a la formación del 3,3-dimetilacrilato (7). El proceso B involucraría la escisión del enlace éster oxígeno-carbono bencílico, aunque también se podrían generar fotoproductos derivados de la ruptura del éster a través del proceso D. Finalmente, el I. INTRODUCCIÓN 121 proceso C supondría la debromación reductiva de la deltametrina o de los fotoproductos (9) y (11). Bowman y Carpenter estudiaron la fotodegradación de la deltametrina en disolución acuosa a pH 5. Vieron que al exponer la disolución a luz solar artificial se inducía la degradación de la deltametrina y que el principal fotoproducto era el ácido 3- fenoxibenzoico. Calcularon una vida media de 47,7 días para el sistema nosensibilizado, pero ésta se redujo a 4,03 días cuando se sensibilizó con un 1% de acetona [57]. Por otra parte, Maguire estudió la isomerización química y fotoquímica de la deltametrina mediante cromatografía líquida de alta resolución quiral-detector array de diodos (HPLC-DAD). Observó que en agua natural y en la oscuridad, la deltametrina (el isómero cis-[ α S, 1R]) experimentaba una isomerización cis/trans conduciendo a la formación del isómero cis-[ αS , 1S], que es inactivo hacia los ratones y los insectos. Sin embargo, vio que la irradiación con luz solar de la deltametrina como capa fina (sobre hojas de patata), en agua natural y en hexano tan sólo era una etapa parcial de detoxificación, puesto que aunque se formaban los isómeros cis- [ α S, 1S] y trans-[ α S, 1S] inactivos, también se formaba el isómero trans-[ α S, 1R], que retiene algo de actividad hacia ratones e insectos, aunque menos que la deltametrina de partida [58]. 5. FOTODEGRADACIÓN 122 Figura I.5.13 Principales rutas de fotodegradación de la deltametrina (1) propuestas en [55]. Br Br O O H CN O O O H CN Ar Br Br Br Br H CN Ar Br HO O H CN Ar Ar= O procesos "jaula" hv Br Br O O H CN Ar Br Br O OH Br Br O OCH 3 Br HO OH Br HO OCH 3 ArCH 2 CN ArCH- CN 2 ArCH 2 - 2 ArCH 2 CHAr Br Br O O H CN Ar Br Br O H Br Br HO H CN Ar ArH O ArNC O ArH 3 CO O (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (11) (12) (13) (14) CN (9) (10) (15) (16) (17) (18) I. INTRODUCCIÓN 123 Br Br O O H CN O (1) Br Br O O H CN Ar Br Br O H Br Br OCH 3 OCH 3 Br Br O O H CN Ar Br Br O OH Br Br O OCH 3 BrHC O OH BrHC O OCH 3 O OCH 3 Br Br Br Br H CN Ar Ar= O Br Br O O H CN Ar Br Br Br Br HO H CN Ar ArNC O ArH 3 CO O ArHO O ArH O CHAr OCH 3 H 3 CO ArCH 2 CN ArCH- CN 2 ArCH 2 - 2 ArCH 2 CHAr CN Br Br O O H CN O Br Br O O H CN Ar O O H CN Ar Br Br O O H CN Ar Br Br O O H CN Ar ·CBr Br· O O H CN Ar Br H O O H CN Ar H Br O O H CN Ar (14) (15) (12) (11) (13) (10) (9) (26) (25) (24) (23) (2) (8) (4) (7) (5) (6) (3) (19) (20) (18) (22) (16) (17) (21) o D A B C C A C Figura I.5.14 Principales rutas de fotodegradación de la deltametrina (1) propuestas en [56]. 5. FOTODEGRADACIÓN 124 5.7.7 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DEL FENVALERATO Holmsted y col. estudiaron la fotólisis del fenvalerato (Pydrin) en varios disolventes (hexano, metanol, acetonitrilo:agua) bajo luz artificial (λ> 290 nm), y como capa fina sobre vidrio o algodón bajo luz solar. Como técnicas de anáisis utilizaron GLCMS, MS, IR, TLC y 1 H NMR. En la Figura I.5.15 se muestran las rutas de fotodegradación propuestas para este piretroide. El Pydrin decarboxilado (2), el compuesto (3) y el dímero (15) se detectaron en los tres disolventes. No se obtuvo como fotoproducto ningún compuesto que conservara el enlace éster, y el producto mayoritario fue el Pydrin decarboxilado (2). Los compuestos (4), (8), (13) y (14) se observaron sólo en hexano o metanol. El 3-fenoxibencilcianuro (9) y los dímeros (10) y (11) sólo se detectaron en hexano, mientras que el compuesto (6) sólo se encontró en metanol. Los fotoproductos que sólo se obtuvieron en acetonitrilo:agua fueron (12), (5) y (16). Finalmente, (7) y (17) no se observaron en los estudios realizados en disolución. En los experimentos realizados en capa fina se detectaron muchos de los fotoproductos identificados en disolución, pero los niveles de fotoproductos generados sobre algodón fueron muy bajos. Además, vieron que dos de los productos de degradación (4 y 9) mostraban valores de LD 50 para los ratones de 22 y 105 mg/kg, respectivamente, y que por lo tanto eran considerablemente más tóxicos que el fenvalerato (LD 50 >500 mg/kg). [59] Figura I.5.15 Rutas de fotodegradación p ropuestas para el fenvalerato (P ydrin) según [59]. Cl O O CN O Cl O O CN O Cl O O CN O Cl Ar CN Ar CN O Ar = Cl Cl O OH ArCH 2 CN ArCH CN 2 ArCH 2 2 Ar CN O Ar CN OH Ar H OH Ar OH O Ar CH 3 O Ar H O Cl Cl Cl 2 Cl OH Cl O AB Pydrin (1) 1a 1b (2) (3) (4) (5) (6) (8) (8a) (7) (13) (14) (15) (16) (17) (13a) (12) (9) (10) (11) I. INTRODUCCIÓN 125 Takahashi y col. observaron que al exponer a la luz solar (en otoño) disoluciones de [2S, α S]-fenvalerato en agua destilada, éste se descomponía con una vida media de aproximadamente 10 días. Vieron que este piretroide se degradaba a través de diferentes rutas incluyendo la decarboxilación, la hidratación del grupo ciano (CN) a grupo carbamoílo (CONH 2 ), la hidrólisis del grupo amida (CONH 2 ) a grupo carboxilo (COOH) y la ruptura del enlace éster y del enlace éter del difenilo [60]. Por otro lado, Katagi y col. compararon la fotodegradación de dos isómeros del fenvalerato, sobre suelo y bajo luz solar natural. Ambos isómeros se descompusieron con vidas medias similares de 1,4-2,4 días y de 1,1-2,5 días. Como rutas de degradación se observaron la hidratación del grupo CN a grupo CONH 2 con la subsiguiente hidrólisis a grupo carboxilo, la ruptura del enlace éster y la decarboxilación. También se detectó la isomerización del insecticida. No se apreciaron diferencias significativas en lo que respecta a las rutas de fotodegradación entre ambos isómeros. [61] Por otra parte, Mikami y col. estudiaron la fotodegradación del fenvalerato en agua y en suelo. El fenvalerato se expuso a la luz del sol en disoluciones muy diluidas en agua destilada, en acetona acuosa al 2%, en agua de río o en agua de mar, y en todos los casos se observó una rápida degradación con vidas medias de aproximadamente 4 días en verano, y de 15 días en invierno. Uno de los principales fotoproductos fue el decarboxi-fenvalerato, y otros productos importantes fueron el ácido fenoxibenzoico y el ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutírico. Además, también se detectaron pequeñas cantidades de α -carbamoíl-3-fenoxibencil-2-(4- clorofenil)-3-metilbutirato (CONH 2 -fenvalerato), α -carboxi-3-fenoxibencil-2-(4- clorofenil)-3-metilbutirato (COOH-fenvalerato), 3-fenoxibencil cianuro, 3- fenoxibencilacetamida, ácido 3-fenoxifenilacético, alcohol fenoxibencílico y fenoxibenzaldehído. En el mismo trabajo se estudió también la fotodegradación del fenvalerato en suelo y se vio que, bajo el sol de otoño, se descomponía con una vida media de entre 2 y 18 días, en función del tipo de suelo. El principal fotoproducto fue el CONH 2 -fenvalerato. En pequeñas cantidades también se obtuvo el decarboxifenvalerato, el análogo del CONH 2 -fenvalerato sin grupo fenilo, el COOH-fenvalerato, el ácido fenoxibenzoico y el alcohol fenoxibencílico. [62] Katagi investigó la fotodegradación del esfenvalerato (isómero [2S, α S] del fenvalerato) como capas finas sobre suelo, arcilla o ácidos húmicos, utilizando una 5. FOTODEGRADACIÓN 126 lámpara de Xenon (λ>300 nm). HPLC-UV, EI-MS, y TLC fueron algunas de las técnicas de análisis empleadas y las rutas de fotodegradación propuestas se muestran en la Figura I.5.16. Se sugirió que quizás la fotólisis indirecta (reacciones con las especies de oxígeno activas) juegue un papel importante en la fotodegradación del esfenvalerato en estas superficies. Una de las rutas de fotodegradación observadas fue la hidratación del grupo ciano de (1) para formar (3), y otra fue la ruptura del enlace éter del grupo 3-fenoxibencilo obteniéndose (7). [63] El mismo autor estudió la fotodegradación del esfenvalerato en suspensiones de arcilla bajo una lámpara de xenon (λ> 290 nm). Los fotoproductos propuestos en este trabajo se muestran en la Figura I.5.17. La epimerización del esfenvalerato (1) condujo a la formación del isómero (2). Una de las principales rutas de fotodegradación fue la decarboxilación para formar (3), lo que está apoyado por el hecho de que se detecten (8) y (11). Otra ruta importante fue la ruptura del enlace éster seguida de una oxidación para formar (10) y detectándose (9) como intermedio. También se detectaron la hidratación del grupo ciano a amida (4), seguida de la hidrólisis a ácido carboxílico (5), la hidroxilación en posición 4’ del grupo 3- fenoxibencilo (6), y la ruptura del enlace éter para formar (7), aunque éstas fueron reacciones minoritarias. [64] Cl O O CN O Cl O O CN O Cl O O CN OH Cl O O CONH 2 O OCN OH OO H O O OH OCN OCONH 2 OCOOH Cl CN O hv (·OH) hv (H 2 O 2 ) CO 2 hidrólisis (1) (3) (7) (9) (10) (4) (2) (5) Figura I.5. 16 Rutas de fotodegradación del esfenvalerat o (1) según [63]. I. INTRODUCCIÓN 127 Sanjuán y col. estudiaron la fotólisis de disoluciones de fenvalerato en acetonitrilo y en agua (8% de metanol) utilizando lámparas de mercurio de baja presión. Detectaron la generación del fotoproducto decarboxilado y, mediante la fotólisis de destello láser, se demostró que la decarboxilación de este piretroide tiene lugar a través de radicales bencilo intermedios [65]. Por otro lado, Suzuki y Katagi examinaron la fotodegradación de disoluciones de fenvalerato en n-hexano, acetonitrilo, metanol, o acetonitrilo:agua (60:40), bajo una lámpara de arco de xenon. La identidad de los principales fotoproductos se confirmó por comparación de los tiempos de retención de HPLC y de los espectros de masas con las correspondientes sustancias de referencia. Además, utilizaron un método espectroscópico para detectar los radicales intermedios generados como consecuencia de la fotólisis del fenvalerato. Se concluyó que la decarboxilación es la ruta fotolítica predominante bajo las condiciones investigadas. En la Figura I.5.18 se muestran las rutas fotolíticas propuestas para el fenvalerato en este trabajo. [66] 5.7.8 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DEL FLUCITRINATO Chattopadhyaya y Dureja estudiaron la fotólisis del flucitrinato (1) en disolución (metanol) bajo luz UV (>290 nm), y como capa fina sobre vidrio bajo luz UV y también bajo luz solar. Como técnicas de separación y detección emplearon TLC, GLC-ECD, MS, GC-MS, IR y 1 H NMR. Las rutas fotoquímicas propuestas para este piretroide se muestran en la Figura I.5.19. En los experimentos en metanol se detectaron los fotoproductos (2)-(10). En los experimentos en capa fina bajo luz UV se detectaron (3), (5), (6), (7) y (9), mientras que bajo luz solar se detectaron (3), (5), (6), (7), (9) y (11). [67] Figura I.5.17 Fotoproductos del esfenvalerato (1) según [64]. Cl O OO O R 5 Cl O O R 3 OR 4 Cl CN O R 1 R 2 (1) R 1 = CN R 2 = H (2) R 1 = H R 2 = CN (4) R 3 = CONH 2 R 4 = C 6 H 5 (5) R 3 = COOH R 4 = C 6 H5 (6) R 3 = CN R 4 = p-C 6 H 4 OH (7) R 3 = CN R 4 = H (3) (8) R 5 = CH 2 CN (9) R 5 = CHO (10) R 5 = COOH (11) R 5 = CH 2 COOH 5. FOTODEGRADACIÓN 128 Cl OO NC O Cl OO NC OCl NC O NC O Cl Cl OO NC O Cl O NC O Cl OH Cl CHO Cl CHO Cl O Cl OH Cl 2 HO NC O O NC O NC O ONC 2 hv hv -CO -CO 2 (1) OHC O OHC O PBald PBacid (2) (9) (11) (10) (12) (4) (3) (5) (7) (6) (8) Figura I.5.18 Rutas fotolítica s propuestas para el fenvalerato (1) según [66]. I. INTRODUCCIÓN 129 Los mismos autores estudiaron la fotólisis del flucitrinato en agua y en suelo bajo luz solar natural. Vieron que en ambos casos la fotólisis de este piretroide seguía una cinética de primer orden. En agua se detectaron cinco fotoproductos: ácido 2- (4-difluorometoxifenil)-3-metilbutanoico (7), ácido m-fenoxibenzoico (9), mfenoxibenzaldehído (5), alcohol α -ciano-3-fenoxibencílico (6) y alcohol mfenoxibencílico (11); mientras que en suelo los productos de fotodegradación fueron: (RS)- α -carbamoíl-3-fenoxibencil-(S)-2-(4-difluorometoxifenil)-3-metilbutirato, (RS)- α - carboxi-3-fenoxibencil-(S)-2-(4-difluorometoxifenil)-3-metilbutirato, ácido 2-(4- difluorometoxifenil)-3-metilbutanoico (7), m-fenoxibenzaldehído (5), alcohol mfenoxibencílico (11) y alcohol α -carbamoíl-3-fenoxibencílico (ver algunos de estos fotoproductos en la Figura I.5.19). [68] 5.7.9 ESTUDIOS DE FOTODEGRADACIÓN DE LA PERMETRINA Holmstead y col. estudiaron la fotólisis de la [1RS, trans]- y de la [1RS, cis]- permetrina en varios disolventes (hexano, metanol, agua y agua:acetona) con luz artificial (λ>290 nm), y en el suelo con luz solar. Utilizaron varias técnicas de separación y detección (GLC-FID, TLC, 1 H NMR, MS, GLC-MS). Al irradiar con luz UV (λ= 290-320 nm), los dos isómeros se descompusieron ligeramente más rápido en F 2 HCO O O CN O F 2 HCO O O CN O F 2 HCO O O CN O F 2 HCO F 2 HCO F 2 HCO 2 F 2 HCO O OH OCN OOH OCN 2 OOH O F 2 HCO O CN OCN O OCN OH OH O AB (1) (1a) (1b) -CO (2a) H· (2) (8) H· (11) (10) (3) (7) -CO 2 H· -H· (6a) (6) (5) (9) hidrólisis (4) Figura I.5.19 Rutas fotoquímicas propuestas para el flucitrinato (1) según [67]. 2. PESTICIDAS EN PIENSO 232 Tabla IV.2.12 Precisión, linealidad y límites de detección (LODs) y cuantificación (LOQs) del método propuesto. Precisión (RSD, %) Linealidad Repetibilidad Reproducibilidad Pesticida R 20 ng/g (n=3) 100 ng/g (n=3) 20 ng/g (n=5 d) LOD (ng g-1) LOQ (ng g-1) α -Lindano 0,9996 9,3 5,6 14 0,05 0,17 β-Lindano 0,9998 3,5 4,9 12 0,20 0,67 γ-Lindano 0,9997 7,6 6,2 7,0 0,09 0,30 Teflutrina 0,9994 6,8 9,9 12 0,12 0,40 δ-Lindano 0,9993 6,3 6,6 12 0,10 0,33 Acetocloro 0,9999 3,6 7,9 3,6 1,8 6,0 Transflutrina 0,9996 13 3,8 11 0,10 0,33 Alacloro 0,9988 12 8,7 12 1,8 6,0 Heptacloro 0,9998 9,8 5,2 14 0,09 0,30 Fenitrotion 1,0000 7,2 5,6 6,0 0,09 0,30 Aldrina 1,0000 5,6 6,8 7,0 0,10 0,33 Clorpirifos 0,9997 6,2 6,2 8,7 0,12 0,40 Epóxido de heptacloro 0,9998 5,6 6,4 4,8 0,09 0,30 Aletrina 0,9999 4,1 5,6 11 0,30 1,0 γ-Clordano 0,9998 10 5,8 14 0,09 0,30 Endosulfán I 0,9998 11 5,8 8,0 0,10 0,33 α -Clordano 0,9999 8,3 5,9 9,2 0,12 0,40 4,4’-DDE 0,9992 7,3 5,7 11 0,11 0,37 Dieldrina 0,9999 8,1 5,9 14 0,11 0,37 Endrina 0,9997 5,1 6,5 9,4 0,10 0,33 Endosulfán II 0,9998 10 6,8 10 0,09 0,30 4,4’-DDD 0,9994 7,3 6,8 10 0,09 0,30 Aldehído de endrina 0,9999 11 11 20 0,25 0,83 Sulfato de endosulfán 0,9998 10 6,8 8,5 0,13 0,43 4,4’-DDT 0,9993 14 6,1 20 0,30 1,0 Cetona de endrina 0,9999 10 7,5 11 0,12 0,40 Tetrametrina 0,9996 11 8,6 8,7 0,80 2,7 Metoxicloro 0,9999 11 6,1 20 0,70 2,3 λ-Cihalotrina 0,9993 6,9 6,7 8,6 0,24 0,80 Cifenotrina 0,9995 7,8 6,6 12 0,48 1,6 Permetrina 1,0000 12 5,9 21 1,5 5,0 Ciflutrina 0,9983 3,4 8,2 3,9 1,3 4,3 Cipermetrina 0,9990 10 7,8 10 0,60 2,0 Flucitrinato 0,9993 2,4 8,3 3,0 0,90 3,0 Fenvalerato 0,9996 14 10 11 1,3 4,4 Deltametrina 0,9993 14 5,1 11 1,5 5,0 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 233 La Figura IV.2.17 muestra el cromatograma obtenido para una muestra de pienso fortificada con todos los pesticidas estudiados a un nivel de concentración de 20 ng g -1 . Cetona de endrina λ-Cihalotrina Cifenotrina PCB-166 (surrogado) Permetrina Ciflutrina Cipermetrina Flucitrinato Fenvalerato Deltametrina Metoxicloro Tetrametrina min 25 26 27 28 29 Hz 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Cetona de endrina λ-Cihalotrina Cifenotrina PCB-166 (surrogado) Permetrina Ciflutrina Cipermetrina Flucitrinato Fenvalerato Deltametrina Metoxicloro Tetrametrina min 25 26 27 28 29 Hz 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 min 14 16 18 20 22 Hz 0 1000 2000 3000 4000 α-Lindano β-Lindano γ-Lindano Teflutrina δ-Lindano Acetocloro Transflutrina Alacloro Heptacloro Fenitrotion Aldrina Clorpirifos Epóxido de heptacloro Aletrina γ-Clordano Endosulfán I α-Clordano 4,4’-DDE Dieldrina Endrina Endosulfán II 4,4’-DDD Aldehído de endrina Sulfato de endosulfán 4,4’-DDT PCB-195 (IS) min 14 16 18 20 22 Hz 0 1000 2000 3000 4000 α-Lindano β-Lindano γ-Lindano Teflutrina δ-Lindano Acetocloro Transflutrina Alacloro Heptacloro Fenitrotion Aldrina Clorpirifos Epóxido de heptacloro Aletrina γ-Clordano Endosulfán I α-Clordano 4,4’-DDE Dieldrina Endrina Endosulfán II 4,4’-DDD Aldehído de endrina Sulfato de endosulfán 4,4’-DDT PCB-195 (IS) Figura IV.2.17 Cromatograma PSE-GC-µECD para una muestra de pienso (con adición de 20 ng g -1 de los pesticidas investigados) obtenido siguiendo el método propuesto. 2. PESTICIDAS EN PIENSO 234 2.3.7 ESTUDIO DEL EFECTO MATRIZ Y EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD Se llevaron a cabo estudios de recuperación aplicando la metodología optimizada a la extracción de cinco muestras de pienso (A, F-I) con adición de 100 ng g -1 de los pesticidas estudiados. La muestra A también se fortificó a un nivel de 20 ng g -1 . El análisis previo de algunas de estas muestras mostró la presencia de algunos de los analitos a niveles de concentración inferiores a 10 ng g -1 , y estas concentraciones iniciales se tuvieron en cuenta a la hora de calcular las recuperaciones. Los resultados obtenidos se han incluido en la Tabla IV.2.13, de la que se deduce que las recuperaciones de los compuestos investigados están, en general, comprendidas entre un 70 y un 110%. De nuevo, como ocurrió con el método de MSPD, se observaron recuperaciones muy bajas para el aldehído de endrina (<45%); mientras que la coelución de una interferencia impidió la cuantificación de la aletrina en la muestra F. La media de la variabilidad entre muestras para los compuestos estudiados es del 9% (RSD), de tal manera que se puede concluir que las variaciones observadas entre las diferentes muestras de pienso se pueden atribuir al error experimental. Lo que quiere decir que el método PSE-GC-µECD desarrollado permite la cuantificación de los pesticidas investigados en muestras de pienso de diferente composición. La exactitud del método también se evaluó analizando el material de referencia BCR- 115, es decir, el mismo que se utilizó para la validación del método de MSPD. La Tabla IV.2.14 muestra las concentraciones estimadas y los valores de recuperación para los organoclorados estudiados. Para γ-clordano, β-lindano, γ-lindano, 4,4’-DDE, dieldrina, endosulfán I, endrina y heptacloro, los valores obtenidos concuerdan con los certificados. También se cuantificaron los pesticidas presentes en el material pero cuya concentración no está certificada ( α -lindano, aldrina, epóxido de heptacloro, 4,4’-DDD y 4,4’-DDT). Los resultados obtenidos para estos pesticidas están alrededor o por debajo del máximo contenido posible de estos compuestos en el material [14]. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 235 Tabla IV.2.13 Recuperaciones de los pesticidas investigados en diferentes muestras de pienso fortificadas. muestra A F G H I Pesticida 20 ng g -1 100 ng g -1 100 ng g -1 α -Lindano 94 98 93 91 99 90 β-Lindano 86 95 85 90 90 85 γ-Lindano 80 93 91 84 85 90 Teflutrina 73 87 94 70 77 82 δ-Lindano 78 103 79 101 94 88 Acetocloro 67 91 109 110 91 114 Transflutrina 74 94 91 85 80 82 Alacloro 78 101 110 89 96 98 Heptacloro 71 89 88 75 79 76 Fenitrotion 74 101 87 92 103 82 Aldrina 78 90 101 86 86 84 Clorpirifos 78 85 84 80 77 76 Epóxido de heptacloro 84 90 88 89 87 75 Aletrina 79 86 - 74 78 84 γ-Clordano 77 86 83 71 73 76 Endosulfán I 60 80 85 72 77 72 α -Clordano 60 74 78 72 73 70 4,4’-DDE 86 92 91 80 81 83 Dieldrina 73 83 80 71 72 73 Endrina 88 91 85 79 81 81 Endosulfán II 86 81 75 72 72 73 4,4’-DDD 74 80 85 81 81 87 Aldehído de endrina 25 31 30 25 44 21 Sulfato de endosulfán 68 72 72 72 78 65 4,4’-DDT 114 101 86 81 88 58 Cetona de endrina 77 82 83 76 82 66 Tetrametrina 79 80 100 80 100 81 Metoxicloro 116 113 100 85 96 67 λ-Cihalotrina 90 93 99 90 94 85 Cifenotrina 94 102 107 98 99 100 Permetrina 120 107 103 101 100 81 Ciflutrina 95 102 108 103 104 94 Cipermetrina 92 95 107 91 99 101 Flucitrinato 98 101 110 100 105 116 Fenvalerato 119 109 100 107 114 120 Deltametrina 97 106 105 102 109 98 2. PESTICIDAS EN PIENSO 236 Tabla IV.2.14 Validación del método: Análisis de un material de referencia certificado (BCR-115). *no certificado Por lo tanto, se demostró que el método propuesto basado en la extracción con disolventes presurizados también es apropiado para el análisis de niveles traza de pesticidas en pienso de ganado. 2.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE PIENSO REALES Una vez demostrada la validez de los métodos MSPD-GC-µECD y PSE-GC-µECD desarrollados para la determinación de niveles traza de fitosanitarios en muestras de pienso, ambos procedimientos se aplicaron al análisis de muestras reales recogidas en 23 granjas de productos lácteos localizadas en Galicia. Algunas de estas muestras se analizaron por GC-MS para confirmar los posibles positivos. En la Tabla IV.2.15 se incluyen las concentraciones estimadas para los pesticidas detectados en las muestras con algún positivo. En alguna de las muestras analizadas se detectaron residuos de estos pesticidas a niveles por encima de los MRLs. Así, en las muestras M 2 y U se detectó β-lindano a niveles de 5,7 y 5,6 ng g -1 , respectivamente, en la muestra K 2 se detectó fenitrotion a un nivel de 14 ng g -1 , y en la muestra Y se detectó clorpirifos a un nivel de concentración de 71 ng g -1 . El cromatograma de ion correspondiente a la muestra Y así como el espectro de masas del clorpirifos se muestran en la Figura IV.2.18. Pesticida Concentración estimada (ng g -1 ) Recuperaciones (%) α -Lindano* 18,7±1,0 β-Lindano 24,9±1,0 108 γ-Lindano 21,3±1,8 98 Heptacloro 22,0±3,4 116 Aldrina* 15,1±4,1 Epóxido de heptacloro* 22,5±5,4 γ-Clordano 38,6±5,6 80 Endosulfán I 30,3±3,3 66 4,4’-DDE 39,9±4,2 85 Dieldrina 11,9±0,8 66 Endrina 42,5±7,9 92 p,p’-DDD* 43,8±8,6 p,p’-DDT* 35,6±5,4 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 237 Tabla IV. 2 . 15 Concentraciones calculadas d e los pesticidas identificados en las muestras de pienso reales con algún positivo (n.d. no detectado). Las muestras denotadas con la(s) misma(s) letra(s) pero con diferentes subíndices se refieren a muestras recogidas en la misma explotación. Tetrametrina n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1,8 n.d. n.d. n.d. n.d. 17 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Sulfato de endosulfán 3,8 n.d. n.d. n.d. 2,8 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3,4 n.d. 1,7 n.d. Endosulfán II 3,8 n.d. n.d. n.d. 2,5 n.d. 2,4 1,9 2,0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2,8 n.d. 2,5 n.d. Endosulfán I 3,7 1,3 n.d. 1,3 3,4 n.d. 2,1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3,0 1,1 1,8 5,3 Clorpirifos n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 7,9 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,2 0,3 n.d. 8,0 n.d. n.d. n.d. 71 Fenitrotion 9,3 n.d. 14 n.d. 7,4 n.d. n.d. 4,3 3,9 n.d. 2,6 n.d. n.d. 7,2 n.d. n.d. n.d. n.d. Alacloro n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3,4 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. β-Lindano n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 5,7 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 5,6 n.d. n.d. n.d. n.d. concentración calculada (ng g - 1 ) Aldehído de endrina n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3,1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 4,0 n.d. n.d. n.d. n.d. muestra J K1 K2 L M1 M2 N O P Q R S T U V W X Y 2. PESTICIDAS EN PIENSO 238 El clorpirifos se encontró en otras cuatro muestras a concentraciones inferiores (0,2- 8,0 ng g -1 ) y el fenitrotion en otras seis (2,6-9,3 ng g -1 ). Otros pesticidas objetivo detectados a bajos niveles fueron: aldehído de endrina (3,1-4,0 ng g -1 ), alacloro (3,4 ng g -1 ), endosulfán I (1,1-5,3 ng g -1 ), endosulfán II (1,9-3,8 ng g -1 ), sulfato de endosulfán (1,7-3,8 ng g -1 ), y tetrametrina (1,8-17 ng g -1 ). En la Tabla IV.2.16 se comparan las concentraciones estimadas para cada uno de los pesticidas detectados en las muestras J e Y utilizando uno y otro procedimiento. De los resultados incluidos en esta tabla se concluye que utilizando ambas metodologías, MSPD-GC-µECD y PSE-GC-µECD, se obtienen resultados equivalentes. Tabla IV.2.16 Análisis comparativo de las muestras de pienso J e Y utilizando los métodos de PSE y MSPD desarrollados en este trabajo (n.d. no detectado). Concentración (ng g -1 ) muestra J muestra Y Pesticida PSE MSPD PSE MSPD Fenitrotion 8,7±1,5 9,3±2,0 n.d. n.d. Clorpirifos n.d. n.d. 79±4,9 71±1,6 Endosulfán I 3,4±0,6 3,7±0,4 5,7±0,6 5,3±0,1 Endosulfán II 3,9±0,7 3,8±0,1 n.d. n.d. Sulfato de endosulfán 3,3±0,2 3,8±0,7 n.d. n.d. m/z= 286 + 314 16.4 16.5 16.6 16.7 16.8 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 Tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Abundancia relativa 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 97 314 197 125 258 199 286 316 210 Relative Abundance m/z= 286 + 314 16.4 16.5 16.6 16.7 16.8 16.9 17.0 17.1 17.2 17.3 17.4 17.5 Tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Abundancia relativa 50 100 150 200 250 300 350 400 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 97 314 197 125 258 199 286 316 210 Relative Abundance Figura IV.2.18 Cromatograma de ion (m/z 286+314) obtenido para el análisis mediante GC-MS de la muestra de pienso Y contaminada con clorpirifos. También se muestra el espectro de masas correspondiente. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 239 En la Figura IV.2.19 se muestran los cromatogramas obtenidos para la muestra J extraída mediante MSPD y PSE. (b) min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 min 16 17 18 19 20 21 22 Hz 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Sulfato de endosulfán Endosulfán I Endosulfán II Fenitrotion 8,7 ng/g 3,4 ng/g 3,9 ng/g 3,3 ng/g min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 min 16 17 18 19 20 21 22 Hz 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Sulfato de endosulfán Endosulfán I Endosulfán II Fenitrotion 8,7 ng/g 3,4 ng/g 3,9 ng/g 3,3 ng/g min 16 17 18 19 20 21 22 Hz 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Sulfato de endosulfán Endosulfán I Endosulfán II Fenitrotion 8,7 ng/g 3,4 ng/g 3,9 ng/g 3,3 ng/g MSPD - GC - µECD PSE - GC - µECD min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 min12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hz. 200 400 600 800 1000 1200 1400 Endosulfan I 4.1 ng/g Endosulfan II 3.7 ng/g Sulfato de endosulfán 4.5 ng/g Fenitrotion 7.4 ng/g min12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hz. 200 400 600 800 1000 1200 1400 Endosulfán I 4,1 ng/g Endosulfán II 3,7 ng/g 4,5 ng/g Fenitrotion 7,4 ng/g min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 min 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Hz 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 min12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hz. 200 400 600 800 1000 1200 1400 Endosulfan I 4.1 ng/g Endosulfan II 3.7 ng/g Sulfato de endosulfán 4.5 ng/g Fenitrotion 7.4 ng/g min12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hz. 200 400 600 800 1000 1200 1400 Endosulfán I 4,1 ng/g Endosulfán II 3,7 ng/g 4,5 ng/g Fenitrotion 7,4 ng/g Figura IV.2.19 Cromatogramas (a) MSPD-GC-µECD y (b) PSE-GC-µECD obtenidos para la muestra de pienso J contaminada con varios pesticidas. 2. PESTICIDAS EN PIENSO 240 Por lo tanto, tanto la dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) como la extracción con disolventes presurizados (PSE) acopladas con la detección por GC- µECD se han aplicado con éxito a la determinación de varios pesticidas en pienso para ganado. Con los métodos desarrollados se cumplieron los criterios más relevantes requeridos para un procedimiento de extracción como son bajo consumo de disolvente, cortos tiempos de proceso, y posibilidad de automatización (en el caso de PSE). Se emplearon estrategias de limpieza integradas con el objetivo de simplificar lo más posible la etapa de preparación de muestra y, sólo en el caso de los extractos de PSE obtenidos para muestras extremadamente complejas, se necesitó una etapa de limpieza a posteriori basada en la SPE dispersiva utilizando alúmina como adsorbente. BIBLIOGRAFÍA [1] Aulakh, R.S.; Gill, J.P.S.; Bedi, J.S.; Sharma, J.K.; Joia, B.S.; Ockerman, H.W. Organochlorine pesticide residues in poultry feed, chicken muscle and eggs at a poultry farm in Punjab, India. J. Sci. Food Agric. 2006, 86, 741-744. [2] van der Lee, M.K.; van der Weg, G.; Traag, W.A.; Mol, H.G.J. Qualitative screening and quantitative determination of pesticides and contaminants in animal feed using comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2008, 1186, 325-339. [3] Gfrerer, M.; Chen, S.; Lankmayr, E.P.; Quan, X.; Yang, F. Comparison of different extraction techniques for the determination of chlorinated pesticides in animal feed. Anal. Bioanal. Chem. 2004, 378, 1861-1867. [4] Iglesias-García, I.; Barriada-Pereira, M.; González-Castro, M.J.; Muniategui- Lorenzo, S.; López-Mahía, P.; Prada-Rodríguez, D. Development of an analytical method based on microwave-assisted extraction and solid phase extraction cleanup for the determination of organochlorine pesticides in animal feed. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391, 745-752. [5] Walorczyk, S. Development of a multi-residue screening method for the determination of pesticides in cereals and dry animal feed using gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2007, 1165, 200-212. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 241 [6] Carro, A.M.; Lorenzo, R.A.; Fernández, F.; Rodil, R.; Cela, R. Multi-residue screening of chlorinated and brominated compounds from aquaculture samples using matrix solid-phase dispersion-gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2005, 1071, 93-98. [7] Chen, S.; Gfrerer, M.; Lankmayr, E.; Quan, X.; Yang, F. Optimization of accelerated solvent extraction for the determination of chlorinated pesticides from animal feed. Chromatographia 2003, 58, 631-636. [8] Kristenson, E.M.; Ramos, L.; Brinkman U.A.T. Recent advances in matrix solidphase dispersion. Trends Anal. Chem. 2006, 25, 96-111. [9] Silveira Dórea, H.; Mauro Lanças F. Matrix solid-phase dispersion of organophosphorus and synthetic pyrethroid pesticidas in cashew nut and passion fruit. J. Microcolumn Separations, 1999, 11, 367-375. [10] Abhilash, P.C.; Jamil, S.; Singh, N. Matrix solid-phase dispersion extraction versus solid-phase extraction in the analysis of combined residues of hexachlorocyclohexane isomers in plant matrices. J. Chromatogr. A 2007, 1176, 43-47. [11] Navarro, M.; Picó, Y.; Marín, R.; Mañes, J. Application of matrix solid-phase dispersion to the determination of a new generation of fungicides in fruits and vegetables. J. Chromatogr. A 2002, 968, 201-209. [12] Garrido Frenich, A.; Plaza Bolaños, P.; Martínez Vidal, J.L. Multiresidue analysis of pesticides in animal liver by gas chromatography using triple quadrupole tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2007, 1153, 194-202. [13] Pang, G.-F.; Liu, Y.-M. ; Fan, C.-L.; Zhang, J.-J.; Cao, Y.-Z.; Li, X.-M.; Li, Z.-Y.; Wu, Y.-P. ; Guo, T.-T. Simultaneous determination of 405 pesticide residues in grain by accelerated solvent extraction then gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 1366-1408. [14] Tuinstra, L.G.M.Th.; Roos, A.H.; Griepink, B.; Maier, E.A. Certification of an animal feed reference material for the organochlorine pesticide contents: BCR CRM 115. Fresenius J. Anal. Chem. 1997, 357, 1035-1041. [15] EPA Method 3545, Pressurised Fluid Extraction. En Test Methods for Evaluating Solid Waste, Physical/Chemical Methods, 3rd ed., Final Update IV; EPA SW-846; U.S. GPO, Washington, DC, 2008. 3. PESTICIDAS EN LECHE 248 ciflutrina y deltametrina en la Figura IV.3.2). Tan sólo en el caso de la teflutrina, el heptacloro y la aldrina (ver estos dos últimos compuestos en la Figura IV.3.2) se observó un descenso importante en la señal al comparar los resultados con los obtenidos en los experimentos de HSSPME. Además, mediante DSPME se consiguió un importante incremento en la respuesta para muchos pesticidas como por ejemplo la endrina y el 4,4’-DDT (Figura IV.3.2). El siguiente paso consistió en estudiar diferentes ratios de dilución de las muestras de leche. Así, se realizaron una serie de experimentos extrayendo mediante DSPME muestras de leche diluidas con agua ultrapura con las siguientes relaciones de dilución: 1:20, 1:10 y 1:5. Los resultados obtenidos para algunos de los pesticidas investigados se muestran en la Figura IV.3.3. 0 50 100 150 200 250 300 α-lindano transflutrina alacloro heptacloro aldrina clorpirifos 4,4'-DDE endrina 4,4'-DDT λ-cihalotrina ciflutrina deltametrina Respuesta normalizada (%) HSSPME sin dilución HSSPME con dilución 1:10 DSPME con dilución 1:10 Figura IV.3.2 Influencia del modo de muestreo y de la dilución de la muestra en la SPME de algunos de los pesticidas objetivo en muestras de leche. Las respuestas están normalizadas a las obtenidas en los experimentos de DSPME con dilución 1:10. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 249 Figura IV.3.3 Influencia de la relación de dilución en la DSPME de algunos analitos seleccionados. Las respuestas están normalizadas a las obtenidas para una dilución 1:5. Se observó que, en general, las respuestas fueron ligeramente mayores al trabajar con la menor dilución (1:5). No obstante, este incremento de sensibilidad conseguido con una dilución 1:5 no fue demasiado significativo si se compara con los resultados obtenidos con una dilución 1:10. Tan solo en el caso del α -clordano se apreció un incremento notable de la señal al trabajar con una relación de dilución 1:5; sin embargo, trabajando con una dilución 1:10 se consiguió una relación S/N para este pesticida suficiente (teniendo en cuenta el MRL de este compuesto en leche, ver Tabla I.1.2 de la Introducción). Por otro lado, se observó una mejora significativa en la eficacia de la extracción para el alacloro y la teflutrina (ver este último en la Figura IV.3.3) al trabajar con una dilución 1:10 en lugar de 1:20. Por tanto, teniendo en cuenta estos resultados y considerando que factores de dilución inferiores pueden reducir el tiempo de vida de las fibras de SPME e incrementar los artefactos cromatográficos, en los experimentos sucesivos se trabajó diluyendo 1 mL de leche con 9 mL de agua ultrapura (ratio de dilución 1:10). 3.2.1.2 Influencia del volumen de acetona Tal y como se ha explicado en la Introducción (Apartado 2.5.6, Capítulo I.2), la presencia de porcentajes elevados de disolventes orgánicos en agua pueden modificar la constante de distribución entre la fibra y la muestra. Dado que las muestras de 0 20 40 60 80 100 120 140 γ-lindano teflutrina acetocloro heptacloro epóxido de heptacloro α-clordano endrina tetrametrina cifenotrina fenvalerato Respuesta normalizada (%) 1:20 1:10 1:5 3. PESTICIDAS EN LECHE 250 leche se fortificaron adicionando diferentes volúmenes de disoluciones de los analitos en acetona, se consideró necesario demostrar que el volumen de acetona no es un factor significativo que pudiera afectar a la extracción de los pesticidas investigados. Con este fin, se extrajeron alícuotas de 1 mL de una muestra de leche entera fortificada (10 ng mL -1 ). Por un lado se analizó una alícuota sin adición de una cantidad de acetona extra y, por otro, se analizó otra alícuota a la que se le adicionaron 100 µL extra de acetona. En la Figura IV.3.4 se representan los resultados obtenidos en estos experimentos para algunos de los analitos. Se obtuvieron los mismos resultados independientemente de si se adicionó o no un volumen extra de acetona, puesto que las pequeñas diferencias apreciadas entre las respuestas obtenidas en ambos experimentos fueron atribuidas al error experimental. 3.2.1.3 Influencia del tiempo de extracción Para investigar el efecto del tiempo de extracción se realizaron una serie de experimentos en los que se sumergió la fibra en una muestra de leche entera (10 ng mL -1 ) diluida durante 30 y 60 min. Los resultados obtenidos (mostrados en la Figura IV.3.5 para algunos analitos seleccionados) permitieron concluir que el muestreo durante 60 min no supone una mejoría perceptible de los resultados, si éstos se comparan con los obtenidos para 30 min de extracción. 0 20 40 60 80 100 120 δ-lindano aldrina aletrina γ-clordano endosulfán I sulfato de endosulfán 4,4'-DDT metoxicloro permetrina ciflutrina deltametrina Respuesta normalizada (%) 0 µl de acetona 100 µL de acetona Figura IV.3.4 Influencia del volumen de acetona para algunos de los pesticidas estudiados. Las respuestas están normalizadas a las obtenidas para las muestras de leche sin adición de un volumen extra de acetona. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 251 No se evaluaron tiempos de extracción inferiores puesto que la duración del programa cromatográfico es de 34 min y, por lo tanto, la posible reducción en el tiempo de extracción no implicaría una disminución de la duración total del análisis. De manera que se eligió 30 min como el tiempo de extracción óptimo. 3.2.1.4 Influencia del recubrimiento de la fibra Se realizaron una serie de experimentos a fin de elegir qué niveles del factor fibra se deberían incluir en el diseño experimental planteado para la optimización del método (Apartado 3.2.2). Estos experimentos se realizaron utilizando alícuotas de una muestra de leche entera fortificada a un nivel de 10 ng mL -1 . Los resultados obtenidos con las diferentes fibras se han representado en la Figura IV.3.6. En general, para los compuestos más volátiles (1-27) se obtuvieron mejores resultados con las fibras PDMS-DVB y CAR-PDMS, mientras que PDMS fue la fibra menos eficaz. En lo que respecta a los piretroides menos volátiles (28-35), con las fibras PDMS, PDMS-DVB, CAR-PDMS y PA se obtuvieron respuestas similares, mientras que con CW-DVB los resultados fueron mucho peores. Por tanto, se concluyó que PDMS-DVB y CAR-PDMS son los recubrimientos más apropiados para el análisis simultáneo de los pesticidas investigados, dado que con ambas fibras se pudieron Figura IV.3.5 Influencia del tiempo de extracción para algunos pesticidas seleccionados. Las respuestas están normalizadas con respecto a las obtenidas para 30 min. 0 20 40 60 80 100 120 β-lindano transflutrina alacloro fenitrotion clorpirifos epóxido de heptacloro α-clordano 4,4'-DDE λ-cihalotrina cipermetrina flucitrinato Respuesta normalizada (%) 30 min 60 min 3. PESTICIDAS EN LECHE 252 extraer eficientemente todos los analitos. De manera que las fibras de PDMS-DVB y CAR-PDMS fueron las seleccionadas para ser incluidas en el diseño experimental. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Respuesta normalizada (%) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Respuesta normalizada (%) PDMS PA CAR-PDMS PDMS-DVB CW-DVB Figura IV.3.6 Influencia del recubrimiento de la fibra en la extracción de los pesticidas estudiados. Las respuestas están normalizadas con respecto a las obtenidas con la fibra CARPDMS: (1) α -lindano, (2) β-lindano, (3) γ-lindano, (4) teflutrina, (5) δ-lindano, (6) acetocloro, (7) transflutrina, (8) alacloro, (9) heptacloro, (10) fenitrotion, (11) aldrina, (12) clorpi rifos, (13) epóxido de heptacloro, (14) aletrina, (15) γ-clordano, (16) endosulfán I, (17) α -clordano, (18) 4,4’-DDE, (19) dieldrina, (20) endrina, (21) endosulfán II, (22) 4,4’-DDD, (23) sulfato de endosulfán, (24) 4,4’-DDT, (25) cetona de endrina, (26) tetrametrina, (27) metoxicloro, (28) λcihalotrina, (29) cifenotrina, (30) permetrina, (31) ciflutrina, (32) cipermetrina, (33) flucitrinato , (34) fenvalerato, (35) deltametrina. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 253 3.2.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE SPME: DISEÑO FACTORIAL Se planteó un diseño experimental con el objetivo de estudiar la influencia de varios factores en el proceso de SPME y de encontrar las condiciones experimentales óptimas. Sobre la base de los experimentos preliminares, se mantuvieron fijas algunas de las condiciones experimentales (factor de dilución y tiempo de extracción) y se seleccionaron 5 variables para definir el dominio experimental: recubrimiento de fibra (A), modo de muestreo (B), agitación (C), temperatura de extracción (D) y adición de NaCl (E). Todos los factores se estudiaron a dos niveles (ver Tabla IV.3.1). Tabla IV.3.1 Factores y niveles evaluados mediante el diseño experimental. Factor Código Nivel bajo (-) Nivel alto (+) Continuo Recubrimiento de fibra A CAR-PDMS PDMS-DVB No Modo de muestreo B DSPME HSSPME No Agitación C No Sí No Temperatura de extracción (ºC) D 50 100 Si NaCl (%, m/v) E 0 20 Si Se descartó la posibilidad de realizar un diseño factorial completo (2 5 ), puesto que éste requeriría la realización de un elevado número de experiencias (32). En su lugar se planteó un diseño factorial fraccionado (2 5-1 ). A pesar de que la reducción del número de experiencias (de 32 a 16) implica una pérdida de información, el diseño planteado es de resolución V, lo que significa que los efectos principales sólo están confundidos con las interacciones de cuarto orden o superior, y que las interacciones de segundo orden no se confunden entre sí aunque sí con las de tercer orden. Por lo tanto, con el diseño planteado se pudieron estimar tanto los efectos principales como las interacciones de segundo orden, asumiendo que las interacciones de tercer orden y superior no fueron significativas. Todos los experimentos se realizaron con alícuotas de una muestra de leche entera fortificada con 25 ng mL -1 de cada pesticida estudiado. Además, en todos los casos se utilizó un factor de dilución de 10 y se muestreó durante 30 min (tal y como se ha justificado en el Apartado 3.2.1). Se utilizó el programa informático Statgraphics-Plus para la obtención de la matriz de experimentos (ver Tabla IV.3.2), así como para la interpretación de los resultados 3. PESTICIDAS EN LECHE 254 generados tras introducir en dicho programa los datos obtenidos en los 16 experimentos. Tabla IV.3.2 Matriz de experiencias del diseño factorial fraccionado (2 5-1 ). Experiencia Recubrimiento de fibra Modo de muestreo Agitación Temperatura de extracción (ºC) NaCl (%, m/v) 1 CAR-PDMS HSSPME Sí 100 0 2 CAR-PDMS DSPME No 100 0 3 CAR-PDMS DSPME Sí 100 20 4 CAR-PDMS HSSPME No 100 20 5 CAR-PDMS DSPME No 50 20 6 CAR-PDMS HSSPME No 50 0 7 CAR-PDMS DSPME Sí 50 0 8 CAR-PDMS HSSPME Sí 50 20 9 PDMS-DVB HSSPME No 100 0 10 PDMS-DVB DSPME Sí 100 0 11 PDMS-DVB HSSPME Sí 100 20 12 PDMS-DVB DSPME No 100 20 13 PDMS-DVB DSPME No 50 0 14 PDMS-DVB HSSPME No 50 20 15 PDMS-DVB DSPME Sí 50 20 16 PDMS-DVB HSSPME Sí 50 0 Así, el programa Statgraphics-Plus proporcionó, entre otras gráficas, las cartas Pareto, los gráficos de efectos principales y los gráficos de interacciones. Estas gráficas se discuten con detalle en las siguientes secciones. 3.2.2.1 Cartas Pareto y gráficos de efectos principales Para una mayor simplicidad en la representación de los resultados obtenidos, en las Figuras IV.3.7 y IV.3.8 sólo se muestran las cartas Pareto y los gráficos de efectos principales obtenidos para algunos de los pesticidas estudiados, pero que se consideran representativos del comportamiento general de todos los analitos. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 255 Figura IV.3.7 Cartas Pareto para algunos pesticidas seleccionados: (a) endosulfán I; (b) α -clordano; (c) λ-cihalotrina; (d) flucitrinato. Figura IV.3.8 Gráficos de efectos principales para algunos pesticidas seleccionados: (a) γ-lindano; (b) 4,4’-DDT; (c) α -clordano; (d) permetrina. Endosulfán I Efectos estandarizados 0 2 4 6 8 10 A BE AC E BD DE D BC B C λ-Cihalotrina 0 2 4 6 8 AB BE DE E A D BC C B Efectos estandarizados Flucitrinato 0 2 4 6 8 A BE BD DE E D BC C B Efectos estandarizados (b)(a) (c) (d) α - Clordano 0 4 8 12 16 20 A CD AC E CE AD AE DE D BD BC C B Efectos estandarizados Endosulfán I Efectos estandarizados 0 2 4 6 8 10 A BE AC E BD DE D BC B C λ-Cihalotrina 0 2 4 6 8 AB BE DE E A D BC C B Efectos estandarizados Flucitrinato 0 2 4 6 8 A BE BD DE E D BC C B Efectos estandarizados (b)(a) (c) (d) α - Clordano 0 4 8 12 16 20 A CD AC E CE AD AE DE D BD BC C B Efectos estandarizados (a) (b) (c) (d) Permetrina 63 83 103 123 143 163 Respuesta (X 10 2 ) 63 83 103 123 143 163 α-Clordano 44 64 84 104 124 Respuesta (X 10 2 ) 1 1.4 1.8 2.2 2.6 3 3.4 Modo de muestreo Temperatura NaCl 1 1.4 1.8 2.2 2.6 3 3.4 γ-Lindano Fibra Agitación 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4,4’-DDT 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4,4’-DDT Respuesta (X 10 4 ) Respuesta (X 10 3 ) -- -- - - - --- - - -- ----- - ++ ++ + + + +++ + + +++ ++++ + Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación NaCl Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación (a) (b) (c) (d) Permetrina 63 83 103 123 143 163 Respuesta (X 10 2 ) 63 83 103 123 143 163 α-Clordano 44 64 84 104 124 Respuesta (X 10 2 ) 1 1.4 1.8 2.2 2.6 3 3.4 Modo de muestreo Temperatura NaCl 1 1.4 1.8 2.2 2.6 3 3.4 γ-Lindano Fibra Agitación 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4,4’-DDT 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4,4’-DDT Respuesta (X 10 4 ) Respuesta (X 10 3 ) -- -- - - - --- - - -- ----- - ++ ++ + + + +++ + + +++ ++++ + Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación NaCl Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación Modo de muestreo Temperatura NaCl Fibra Agitación 3. PESTICIDAS EN LECHE 256 Como ya se ha explicado en los capítulos anteriores, de las cartas Pareto (Figura IV.3.7) se puede deducir qué efectos principales o interacciones tienen una influencia estadísticamente significativa (a un nivel de confianza del 95%) en la respuesta de los pesticidas investigados. Por otro lado, a partir de los gráficos de efectos principales (Figura IV.3.8) se extrae cuál es el nivel de cada factor que produce las respuestas más altas. Según se deduce de ambas gráficas, el modo de muestreo (B) fue una de las variables más importantes (ver Figura IV.3.7), con una pendiente negativa en los gráficos de efectos principales (Figura IV.3.8), indicando que el muestreo directo (DSPME) es el más favorable, incluso para los analitos más volátiles. Sólo en el caso de α -lindano, aldrina, teflutrina y permetrina (ver éste último en la Figura IV.3.8) el muestreo en espacio de cabeza (HSSPME) condujo a respuestas cromatográficas mayores. Sin embargo, para estos compuestos el modo de muestreo no fue una variable significativa. De las cartas Pareto y de los gráficos de efectos principales (Figuras IV.3.7 y IV.3.8) se concluyó que la agitación (C) tiene una influencia positiva en la eficacia de la extracción y que, además, es una variable estadísticamente significativa para todos los pesticidas investigados. En la SPME, la optimización de la temperatura de extracción es muy importante dado que es un parámetro que afecta tanto a la termodinámica como a la cinética de la extracción (Apartado 2.5.3, Capítulo I.2). Para la mayoría de los analitos (excepto para el 4,4’-DDD, sulfato de endosulfán, 4,4’-DDT y metoxicloro), la temperatura (D) fue una variable significativa (ver Figura IV.3.7) y, en general, se obtuvieron mayores áreas de pico cuando se trabajó a 100 ºC (Figura IV.3.8). En lo que respecta a la adición de sal, éste fue un factor significativo para 20 pesticidas (ver algunos ejemplos en la Figura IV.3.7). De la interpretación de los gráficos de efectos principales (Figura IV.3.8) se dedujo que el efecto salino no supone una mejora de la eficacia de la extracción para ninguno de los analitos y que, en muchos casos, la respuesta fue incluso significativamente inferior al añadir sal. Por tanto, se concluyó que la adición de NaCl no favorece la extracción de los pesticidas IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 257 estudiados en leche. Este efecto negativo de la adición de sal también fue observado por otros autores en estudios anteriores en los que se extrajeron pesticidas de otras matrices como agua o aceite [12, 13]. Este comportamiento se podría probablemente atribuir a la influencia negativa de la sal en la cinética del proceso de SPME [14] como consecuencia del incremento de la viscosidad y la densidad de la muestra. Finalmente, el recubrimiento de la fibra (A) sólo fue significativo para diez de los pesticidas estudiados (β-, γ- y δ-lindano, heptacloro, endrina, acetocloro, alacloro, transflutrina, aletrina y λ-cihalotrina). En todos estos casos, las mejores recuperaciones se consiguieron al utilizar la fibra PDMS-DVB. 2.2.2.2 Gráficos de interacciones Según se dedujo de las cartas Pareto, algunas interacciones (BC, DE y BD) fueron estadísticamente significativas para la mayoría de los pesticidas estudiados (ver Figura IV.3.7). En la Figura IV.3.9 se muestran los gráficos de estas interacciones para cuatro de los analitos estudiados. Figura IV.3.9 Gráficos de interacción para algunos pesticidas seleccionados: (a) epóxido de heptacloro; (b) γ-clordano; (c) clorpirifos; (d) tetrametrina. (a) (b) (c) (d) Epóxido de heptacloro BC DSPME HSSPME 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Respuesta (X 10 3 ) NO SI BC DSPME HSSPME 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 γ-Clordano BC DSPME HSSPME 0 3 6 9 12 15 Respuesta (X 10 3 ) NO SI - BC DSPME HSSPME 0 3 6 9 12 15 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 Clorpirifos BC DSPME HSSPME 0 2 4 6 8 10 12 NO SI Respuesta (X 10 3 ) BC DSPME HSSPME 0 2 4 6 8 10 12 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 Tetrametrina BC DSPME HSSPME 0 4 8 12 16 Respuesta (X 10 3 ) SI NO BC DSPME HSSPME 0 4 8 12 16 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 0 20 DE 50 100 0 20 (a) (b) (c) (d) Epóxido de heptacloro BC DSPME HSSPME 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Respuesta (X 10 3 ) NO SI BC DSPME HSSPME 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 γ-Clordano BC DSPME HSSPME 0 3 6 9 12 15 Respuesta (X 10 3 ) NO SI - BC DSPME HSSPME 0 3 6 9 12 15 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 Clorpirifos BC DSPME HSSPME 0 2 4 6 8 10 12 NO SI Respuesta (X 10 3 ) BC DSPME HSSPME 0 2 4 6 8 10 12 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 20 0 DE 50 100 20 0 Tetrametrina BC DSPME HSSPME 0 4 8 12 16 Respuesta (X 10 3 ) SI NO BC DSPME HSSPME 0 4 8 12 16 NO BD DSPME HSSPME 100 50 BD DSPME HSSPME 100 50 DE 50 100 0 20 DE 50 100 0 20 3. PESTICIDAS EN LECHE 264 3.2.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LECHE CON DIFERENTE CONTENIDO GRASO El método desarrollado en este estudio se aplicó a la extracción de los pesticidas investigados de diferentes muestras de leche. En primer lugar se estudiaron cuatro marcas diferentes de leche entera comercial (tres líquidas y una en polvo) con un contenido en grasa comprendido entre el 3,5 y el 3,6%, y una muestra de leche en crudo con un contenido graso similar (3,7%). Estas muestras, en las que inicialmente no se encontraron concentraciones detectables de los analitos, se fortificaron con los pesticidas estudiados a un nivel de 10 ng mL -1 y se analizaron siguiendo la metodología DSPME-GC-µECD propuesta. Tal y como se muestra en la Figura IV.3.11, en la que se representan los resultados obtenidos para algunos de los compuestos investigados, no se observaron diferencias significativas entre las muestras analizadas. De hecho, la variabilidad observada entre muestras se puede atribuir al error experimental. Se deduce por tanto que las recuperaciones de la leche en crudo son equivalentes a las de la leche comercial con un porcentaje de grasa similar. Estos resultados demuestran que es posible utilizar la calibración externa para cuantificar los pesticidas objetivo en muestras de leche (tratada o en crudo) empleando estándares Figura IV.3.11 Influencia de la marca comercial en la extracción de algunos de los pesticidas investigados de muestras de leche entera comercial y comparación con leche en crudo. Las respuestas están normalizadas a las obtenidas para la leche B. 0 20 40 60 80 100 120 140 Flucitrinato Cipermetrina Ciflutrina Tetrametrina Cetona de endrina Heptacloro Acetocloro β-Lindano Respuesta normalizada (%) LECHE A LECHE B LECHE C LECHE D (EN POLVO) LECHE E (EN CRUDO) IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 265 preparados en leche de las mismas características en cuanto al contenido graso (estándares milk-matched). Utilizando el mismo procedimiento de SPME, se analizaron también muestras de leche desnatada y semidesnatada fortificadas. En la Figura IV.3.12 se comparan las respuestas obtenidas en estas pruebas para algunos de los analitos investigados. De los resultados representados en la Figura IV.3.12 se deduce que la eficacia de la extracción está inversamente relacionada con el contenido graso de la leche. En el caso de la leche desnatada (0,3% grasa), las respuestas obtenidas fueron hasta 17 veces mayores (deltametrina) que las obtenidas para la leche entera (3,6%); mientras que las diferencias entre la leche entera y la semidesnatada (1,55% grasa) no fueron tan grandes (alrededor de 2 veces mayores para la mayoría de los compuestos). 3.2.5 EVALUACIÓN DE LA EXACTITUD Las recuperaciones del método se estudiaron analizando varias muestras de leche entera, tres líquidas (A-C) y una en polvo (D), fortificadas a diferentes niveles de concentración (10, 15 o 60 ng mL -1 ) y cuantificadas mediante calibración externa Figura IV.3.12 Influencia del contenido graso en la extracción de algunos pesticidas de la leche. Las respuestas se han normalizado a las obtenidas para leche desnatada. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Deltametrina Fenvalerato Ciflutrina Cifenotrina Metoxicloro Dieldrina γ-Clordano Aletrina Clorpirifos α-Lindano Respuesta normalizada (%) ENTERA SEMIDESNATADA DESNATADA 3. PESTICIDAS EN LECHE 266 utilizando estándares milk-matched. En análisis previos de estas muestras no se detectaron ninguno de los analitos. Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla IV.3.6, permiten concluir que en todas las muestras analizadas se obtuvieron recuperaciones por encima del 80% para la mayoría de los pesticidas. Tabla IV.3.6 Recuperaciones de los pesticidas investigados en diferentes muestras de leche entera fortificadas a distintos niveles de concentración. Recuperación (%) LECHE A (10 ng mL -1 ) LECHE B (60 ng mL -1 ) LECHE C (15 ng mL -1 ) LECHE D (10 ng mL -1 ) α -Lindano 99 88 108 100 β-Lindano 107 94 109 101 γ-Lindano 104 92 109 100 Teflutrina 85 81 113 116 δ-Lindano 92 94 114 96 Acetocloro 115 98 112 81 Transflutrina 103 78 96 98 Alacloro 96 94 109 119 Heptacloro 101 85 108 101 Fenitrotion 106 94 112 96 Aldrina 99 77 97 101 Clorpirifos 102 92 88 99 Epóxido de heptacloro 104 82 94 92 Aletrina 97 84 96 91 γ-Clordano 104 82 118 97 Endosulfán I 104 84 96 94 α -Clordano 139 77 102 113 4,4’-DDE 97 94 97 95 Dieldrina 98 83 93 91 Endrina 93 84 93 91 Endosulfán II 97 87 96 94 4,4’-DDD 95 81 91 85 Sulfato de endosulfán 93 92 98 95 4,4’-DDT 80 76 119 87 Cetona de endrina 93 91 96 93 Tetrametrina 124 83 102 102 Metoxicloro 94 93 97 82 λ-Cihalotrina 111 81 96 97 Cifenotrina 118 69 118 117 Permetrina 122 81 118 112 Ciflutrina 120 72 100 120 Cipermetrina 105 78 93 103 Flucitrinato 104 77 94 98 Fenvalerato 114 80 112 113 Deltametrina 80 95 100 101 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 267 El método también se validó mediante el análisis de un material de referencia (leche entera en polvo, BCR-188) cuyo contenido certificado en pesticidas organoclorados se ha incluido en la Tabla IV.3.7. La cuantificación de estos compuestos se llevó a cabo tanto por calibrado externo como por el método de las adiciones estándar. Los resultados obtenidos siguiendo ambos procedimientos se muestran en la Tabla IV.3.7. Las concentraciones se expresaron en ng g -1 , considerando que cada mL de leche analizado correspondía a la disolución de 0,13 g de material de referencia en 0,9 mL de agua. Además, los resultados se corrigieron teniendo en cuenta el porcentaje de humedad del material de referencia (2,5%), determinado en el laboratorio por el método de la pérdida de peso en un horno a 102 ºC. Las concentraciones estimadas concuerdan con los valores certificados, obteniéndose recuperaciones por encima del 75% en todos los casos, excepto para la endrina (67% de recuperación por el calibrado externo) y para el 4,4’-DDT (71% de recuperación por el método de las adiciones estándar). Tabla IV.3.7 Validación del método: análisis de un material de referencia certificado (BCR-188). calibración externa adición estándar Pesticida valor certificado (ng g -1 ) valor estimado (ng g -1 ) recuperación (%) valor estimado (ng g -1 ) recuperación (%) β-Lindano 12,0 ± 1,2 12,6 ± 0,8 105 13,1 ± 0,7 109 γ-Lindano 45,4 ± 2,9 44,4 ± 1,3 98 39,9 ± 1,5 88 Epóxido de heptacloro 32,0 ± 1,8 27,6 ± 1,5 86 31,7 ± 2,0 99 4,4'-DDE 51,3 ± 3,5 59,7 ± 5,0 116 44,2 ± 5,9 86 Dieldrina 36,1 ± 2,.4 32,5 ± 0,1 90 31,8 ± 0,1 88 Endrina 6,2 ± 0,9 4,1 ± 0,5 67 4,9 ± 0,5 79 4,4'-DDT 69,0 ± 4,6 70,9 ± 7,2 103 49,3 ± 7,4 71 3.2.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LECHE REALES Finalmente, la metodología propuesta se aplicó al análisis de muestras de leche comercial, así como de muestras de leche cruda (sin tratar) obtenidas de explotaciones ganaderas de vacuno lechero de Galicia. No se encontraron residuos de pesticidas en ninguna de las 35 muestras analizadas, salvo en una, en la que se 3. PESTICIDAS EN LECHE 268 detectó γ-clordano a una concentración de 1 ng mL -1 (8,2 ng g -1 ) y, por lo tanto, por encima del MRL correspondiente (2 ng g -1 ) establecido por la legislación europea. En este trabajo se ha desarrollado un procedimiento simple, rápido y efectivo para la cuantificación de 35 pesticidas en leche, basado en la combinación de la microextracción en fase sólida con GC-µECD. Con el método propuesto se manejan volúmenes de muestra muy pequeños (1 mL); además, las muestras de leche analizadas no requieren un pretratamiento e, independientemente de su contenido graso, se pueden cuantificar mediante calibración externa siempre y cuando se utilicen estándares milk-matched preparados en leches con contenidos grasos equivalentes. BIBLIOGRAFÍA [1] Heck, M.-C.; Sifuentes dos Santos, J.; Bogusz, J. S.; Costabeber, I.; Emanuelli, T. Estimation of children exposure to organochlorine compounds through milk in Rio Grande do Sul, Brazil. Food Chem. 2007, 102, 288-294. [2] Losada, A.; Fernández, N.; Diez, M.J.; Terán, M.T.; García, J.J.; Sierra, M. Organochlorine pesticide residues in bovine milk from León (Spain). Sci. Total Environ. 1996, 181, 133-135. [3] Cardeal, Z.L.; Dias-Paes, C.M. Analysis of organophosphorus pesticides in whole milk by solid phase microextraction gas chromatography method. J. Environ. Sci. Health., Part B 2004, 41, 369-375. [4] Salas, J.H.; González, M.M.; Noa, M.; Pérez, N.A.; Díaz, G.; Gutiérrez, R.; Zazueta, H.; Osuna, I. J. Organophosphorus pesticide residues in mexican commercial pasteurized milk. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4468-4471. [5] Kituyi, E.N.; Wandiga, S.O.; Jumba, I.O. Occurrence of chlorfenvinphos residues in cow’s milk sampled at a range of sites in Western Kenya. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997, 58, 969-975. [6] Mueller, J.F.; Harden, F.; Toms, L.-M.; Symons, R.; Fürst, P. Persistent organochlorine pesticides in human milk samples from Australia. Chemosphere 2008, 70, 712-720. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 269 [7] Ennaceur, S.; Gandoura, N.; Driss, M.R. Organochlorine pesticide residues in human milk of mothers living in Northern Tunisia. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2007, 78, 325-329. [8] Khay, S.; Abd El-Aty, A.M.; Choi, J.-H.; Shin, E.-H.; Shin, H.-C.; Kim, J.-S.; Chang, B.-J.; Lee, C.-H.; Shin, S.-C.; Jeong, J.Y.; Shim, J.-H. Simultaneous determination of pyrethroids from pesticide residues in porcine muscle and pasteurized milk using GC. J. Sep. Sci. 2009, 32, 244-251. [9] Bouwman, H.; Sereda, B.; Meinhardt, H.M. Simultaneous presence of DDT and pyrethroid residues in human breast milk from a malaria endemic area in South Africa. Environ. Poll. 2006, 144, 902-917. [10] Malarvannan, G.; Kunisue, T.; Isobe, T.; Sudaryanto, A.; Takahashi, S.; Prudente, M.; Subramanian, A.; Tanabe, S. Organohalogen compounds in human breast milk from mothers living in Payatas and Malate, the Philippines: levels, accumulation kinetics and infant health risk. Environ. Poll. 2009, 157, 1924-1932. [11] Schenck, F.J.; Wagner, R. Screening procedure for organochlorine and organophosphorus pesticide residues in milk using matrix solid phase dispersion (MSPD) extraction and gas chromatographic determination. Food Addit. Contam. 1995, 12, 535-541. [12] Tsoutsi, C.S.; Albanis, T.A. Optimization of headspace solid-phase microextraction conditions for the determination of organophosphorus insecticides in olive oil. Intern. J. Environ. Anal. Chem. 2004, 84, 3-13. [13] Deger, A.B.; Gremm, T.J.; Frimmel, F.H.; Mendez, L. Optimization and application of SPME for the gas chromatograhic determination of endosulfan and its major metabolites in the ng L -1 range in aqueous solutions. Anal. Bioanal. Chem., 2003, 376, 61-68. [14] Polo, M.; Gómez-Noya, G.; Quintana, J.B.; Llompart, M.; García-Jares, C.; Cela, R. Development of a solid-phase microextraction gas chromatography/tandem mass spectrometry method for polybrominated diphenyl ethers and polybrominated biphenyls in water samples. Anal. Chem. 2004, 76, 1054-1062. [15] Polo, M.; Llompart, M.; García-Jares, C.; Cela, R. Multivariate optimization of a solid-phase microextraction method for the analysis of phthalate esters in environmental waters. J. Chromatogr. A 2005, 1072, 63-72. 3. PESTICIDAS EN LECHE 270 [16] García-Jares, C.; Llompart, M.; Polo, M.; Salgado, C.; Macías, S.; Cela, R. Optimisation of a solid-phase microextraction method for synthetic musk compounds in water. J. Chromatogr. A 2002, 963, 277-285. [17] Llompart, M.; Lourido, M.; Landin, P.; García-Jares, C.; Cela, R. Optimization of a derivatization─solid-phase microextraction method for the analysis of thirty phenolic pollutants in water samples. J. Chromatogr. A 2002, 963, 137- 148. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 271 CAPÍTULO IV.4. ESTUDIO DE LA FOTODEGRADACIÓN DE INSECTICIDAS PIRETROIDES La sensibilidad de los pesticidas a la luz es uno de los principales factores que determinan la duración residual de estos compuestos, por lo que la velocidad de las transformaciones fotoquímicas de los mismos así como el impacto biológico y toxicológico de los fotoproductos generados son aspectos importantes a tener en cuenta en el diseño y aplicación de pesticidas utilizados para el control de plagas en el ámbito agrícola. Por otro lado, el uso doméstico de insecticidas y la actividad industrial asociada, que afecta particularmente a los países desarrollados, generan grandes cantidades de aguas residuales. De manera que los procesos de fotodegradación de pesticidas también son importantes desde el punto de vista del tratamiento fotoquímico (con radiación UV) al que habitualmente se recurre para la purificación de aguas contaminadas con compuestos orgánicos. El objetivo de este estudio es utilizar la foto-SPME acoplada a GC-MS para investigar la fotodegradación de doce piretroides y de un sinergista (butóxido de piperonilo, PBO). En primer lugar, se investigaron las cinéticas de fotodegradación de estos compuestos y se estimaron los correspondientes parámetros cinéticos (constantes de velocidad aparentes y tiempos de vida media). Además, basándose en los espectros de masas y en la bibliografía disponible, se identificaron tentativamente un elevado número de fotoproductos de los cuales se registraron las correspondientes cinéticas de fotoformación-fotodegradación. Finalmente, se propusieron rutas de fotodegradación para cada uno de los compuestos estudiados. Los analitos investigados en este trabajo se han dividido en tres grupos: • piretroides dihalogenovinílicos de uso agrícola habitual (λcihalotrina, permetrina, ciflutrina, cipermetrina, deltametrina). • piretroides (empentrina, transflutrina, aletrina, fenotrina, cifenotrina) y sinergista (PBO) de uso doméstico habitual. • piretroides carentes de anillo ciclopropano (flucitrinato, fenvalerato). 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 272 4.1 PARTE EXPERIMENTAL 4.1.1 MUESTRAS ANALIZADAS Para los experimentos de foto-SPME se prepararon muestras de agua ultrapura conteniendo uno o varios de los analitos (1-100 ng mL -1 ) por adición de los volúmenes correspondientes de las disoluciones apropiadas en acetona. Una vez preparadas, las muestras se dividieron en alícuotas de 6 u 8 mL (en función de los piretroides estudiados), las cuales se mantuvieron en el congelador (-20 ºC) y se descongelaron 20 min antes de la extracción. Operando de esta manera se consigue mejorar la precisión de los análisis de piretroides en agua mediante SPME [1]. Para las mediciones espectrales, se prepararon disoluciones acuosas individuales (2-10 ng mL -1 ) de cada uno de los compuestos investigados en agua ultrapura. 4.1.2 SPME Y PROCEDIMIENTOS DE FOTODEGRADACIÓN El proceso de fotodegradación en fibra (foto-SPME) consta de dos etapas. En primer lugar, se lleva a cabo la extracción mediante SPME de los analitos. Una vez finalizado el tiempo de extracción correspondiente, los compuestos investigados se encuentran absorbidos en el recubrimiento polimérico de la fibra de SPME. En la Figura IV.4.1 se muestra un esquema del procedimiento empleado para la extracción de los piretroides y del PBO mediante SPME (a), a excepción del flucitrinato y del fenvalerato para los que se empleó el procedimiento (b). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 273 Después de esta primera etapa (SPME), el paso siguiente es la exposición de la fibra a la radiación durante el tiempo correspondiente. En este trabajo se han empleado distintos tipos de radiación: • Radiación UV procedente de un fotorreactor diseñado en nuestro laboratorio, equipado con dos lámparas de mercurio de baja presión de 8 y 10 W de potencia, que emiten a una longitud de onda de 254 nm (Figura IV.4.2). También se han realizado algunas pruebas utilizando una lámpara de fluorescencia negra (8 W, 366 nm). soporte de fibra fibra PDMS lámpara 8 W lámpara 10 W soporte de fibra fibra PDMS lámpara 8 W lámpara 10 W Figura IV.4.2 Disposición de la fibra de SPME en el fotorreactor diseñado en nuestro laboratorio. Figura IV. 4.1 Esquema de extracción de los piretroides y del PBO en agua por SPME. PDMS, 20 min, 100 ºC, agitación vial 10 mL 6 mL disolución acuosa 8 mL disolución acuosa DSPME Termostatización del vial (5 min, agitación) PDMS, 20 min, 50 ºC, agitación (a) (b) PDMS, 20 min, 100 ºC, agitación vial 10 mL 6 mL disolución acuosa 8 mL disolución acuosa DSPME Termostatización del vial (5 min, agitación) PDMS, 20 min, 50 ºC, agitación (a) (b) 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 280 respuesta analítica de los pesticidas en las pruebas en las que la fibra de SPME es irradiada se debe únicamente a procesos de degradación fotoquímica. Para ello, se realizaron los siguientes experimentos: 1. Control: Se tomó una alícuota de 6 mL de la disolución de 20 ng/mL de los compuestos estudiados en agua Milli-Q. Tras la extracción mediante SPME, la fibra se introdujo en el inyector del cromatógrafo de gases para su posterior análisis mediante GC-MS. Esta extracción se utilizó como referencia. 2. Foto-SPME: Se tomó otra alícuota de 6 mL de la misma disolución de 20 ng/mL. Tras la etapa de extracción, la fibra se expuso a la luz UV (λ = 254 nm, 18 W) durante 40 min. A continuación la fibra se introdujo en el inyector del cromatógrafo de gases para su posterior análisis mediante GC-MS. 3. Test de oscuridad: Se repitió el experimento anterior con la diferencia de que, en la etapa de irradiación, la fibra se retrajo evitando de esta manera que la luz UV llegara a los compuestos retenidos en la fibra. En la Figura IV.4.5 se han representado los resultados obtenidos en estas pruebas. 0 20 40 60 80 100 120 λ-cihalotrina (1) λ-cihalotrina (2) cis-permetrina trans-permetrina ciflutrina cipermetrina deltametrina (1) deltametrina (2) porcentaje de compuesto sin degradar (%) control foto-SPME test de oscuridad La disminución drástica del área de pico en las pruebas en las que la fibra se expuso a la luz UV en relación a la extracción utilizada como control confirma la fotodegradación de los analitos en el soporte polimérico de la fibra de SPME. Figura IV.4.5 Resultados del test de oscuridad y de la foto-SPME (40 min) para los piretroides estudiados comparados con los obtenidos en el experimento control. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 281 Además, el hecho de que los resultados obtenidos en las extracciones de referencia y en las pruebas en las que la fibra se mantuvo retraída durante la irradiación con luz UV sean del mismo orden confirma que no existen pérdidas de analito por otras vías distintas de la fotolítica. 4.2.2 FOTO-SPME 4.2.2.1 Influencia del tiempo de irradiación Se llevaron a cabo una serie de experimentos con el fin de evaluar la influencia del tiempo de exposición de la fibra a la luz UV (λ = 254 nm, 18 W).Para ello se tomaron alícuotas de 6 mL de la disolución de 20 ng/mL de los piretroides estudiados en agua Milli-Q. Tras la etapa de extracción, la fibra se expuso a la luz UV durante diferentes períodos de tiempo (2-60 min), para su posterior análisis mediante GC-MS. Se realizó también una extracción previa, sin exposición a la luz UV, que sirvió como referencia. En la Figura IV.4.6 se han representado los valores medios de los duplicados realizados. De la Figura IV.4.6 se deduce que, tras 20 min de exposición a la luz UV, λcihalotrina, ciflutrina, cipermetrina y deltametrina se han degradado casi por completo (pérdidas de más del 95%). Sin embargo, la fotodegradación de la trans-permetrina es más lenta y, tras ese tiempo de irradiación, aún queda alrededor de un 25% sin degradar. Por otra parte, se aprecia un incremento en el área de pico para la cispermetrina durante los primeros minutos de exposición, hecho que se ha atribuido a la fotoisomerización del isómero trans. Estos resultados coinciden con los publicados por Figura IV.4.6 Cinéticas de la fotodegradación en fibra de los piretroides estudiados. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 10 20 30 40 50 60 tiempo de irradiación (min) % de compuesto sin degradar λ-cihalotrina (1) λ-cihalotrina (2) cis-permetrina trans-permetrina ciflutrina cipermetrina deltametrina (1) deltametrina (2) 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 282 Holmstead y col. [2] que también propusieron la isomerización como una de las rutas de fotodegradación de la permetrina. En la Figura IV.4.7, en la que se han superpuesto los cromatogramas obtenidos en los experimentos de foto-SPME correspondientes a 0, 5, 20 y 60 min de irradiación UV, se puede observar claramente el descenso (e incremento inicial, en el caso de la cispermetrina) en la respuesta analítica de los piretroides estudiados a medida que aumenta el tiempo de exposición UV. 15 16 17 18 19 20 min 0.0 0.5 1.0 1.5 MCuentas 0 min 5 min 60 min 20 min Tiempo de irradiación UV: λ-Cihalotrina Permetrina Ciflutrina Cipermetrina Deltametrina (1) (1) (2) cis trans (2) 15 16 17 18 19 20 min 0.0 0.5 1.0 1.5 MCuentas 0 min 5 min 60 min 20 min Tiempo de irradiación UV: λ-Cihalotrina Permetrina Ciflutrina Cipermetrina Deltametrina (1) (1) (2) cis trans (2) 4.2.2.2 Comportamiento cinético de primer orden Tal y como se esperaba de la forma exponencial de las cinéticas de degradación obtenidas (Figura IV.4.6), se demostró que la fotodegradación de los piretroides estudiados se ajusta a un modelo cinético de primer orden. Para ello se representó, para cada uno de los analitos, el logaritmo neperiano del porcentaje de compuesto sin degradar frente al tiempo de irradiación y se observó que, efectivamente, los datos obtenidos se ajustaban a una línea recta (Figura IV.4.8). De hecho, en todos los casos Figura IV.4.7 Superposición de los cromatogramas obtenidos para los piretroides estudiados en los experimentos de foto-SPME correspondientes a 0, 5, 20 y 60 min de irradiación UV (18 W). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 283 se obtuvieron coeficientes de regresión (R 2 ) mayores de 0,988 (Tabla IV.4.5). Otros autores observaron también este orden de reacción para la cis- y transpermetrina, la cipermetrina y la deltametrina [3-5]. Los rangos de tiempo considerados en cada uno de los ajustes terminaron en el punto en el que las curvas cinéticas comenzaron a tender asintóticamente hacia cero. Además, en el caso de la cis-permetrina, se tuvo en cuenta que su fotodegradación sólo fue apreciable después de 10 min de irradiación UV (ver Tabla IV.4.5), debido a la prevalencia de la fotoconversión entre isómeros detectada con tiempos de irradiación inferiores. 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 tiempo de irradiación (min) ln(% de compuesto sin degradar) λ-cihalotrina (1) λ-cihalotrina (2) cis-permetrina trans-permetrina ciflutrina cipermetrina deltametrina (1) deltametrina (2) Teniendo en cuenta las ecuaciones del Apartado 5.4 de la Introducción (Capítulo I.5), se pudieron estimar, a partir de las pendientes de las rectas de regresión obtenidas, tanto las constantes de velocidad de primer orden aparentes (k ap ) como los tiempos de vida media (t 1/2 ) (Tabla IV.4.5). Tabla IV.4.5 Parámetros cinéticos de los piretroides estudiados. Compuesto Rango evaluado (min) R 2 k ap (min -1 ) t 1/2 (min) Deltametrina (2) 0-10 0,9963 0,324 2,14 Deltametrina (1) 0-10 0,9973 0,320 2,17 Ciflutrina 0-10 0,9958 0,278 2,49 Cipermetrina 0-10 0,9966 0,230 3,01 λ-Cihalotrina (2) 0-20 0,9928 0,165 4,19 λ-Cihalotrina (1) 0-20 0,9882 0,160 4,32 cis-Permetrina 10-60 0,9994 0,0703 9,86 trans-Permetrina 0-60 0,9956 0,0648 10,7 Figura IV.4.8 Demostración del comportamiento cinético de primer orden para la fotodegradación en fibra de los piretroides estudiados. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 284 De acuerdo con los datos mostrados en la Tabla IV.4.5, el orden de fotoestabilidad de los analitos es: trans-permetrina > cis-permetrina > λ-cihalotrina (1) ~ λcihalotrina (2) > cipermetrina > ciflutrina > deltametrina (1) ~ deltametrina (2). Esta tendencia es consistente con los coeficientes de absorción molar mostrados en la Tabla IV.4.4. Así, la deltametrina parece ser el piretroide más fotorreactivo de los estudiados, lo cual se puede atribuir a su gran absorción a 254 nm. La mayor fotoestabilidad de la ciflutrina, cipermetrina y λ-cihalotrina se puede explicar en términos de su menor absorción UV, mientras que la degradación fotolítica más lenta de la permetrina es consistente con su menor absorbancia a 254 nm. La mayor fotoestabilidad de los piretroides cloro-sustituidos comparada con la de la deltametrina (bromo-sustituido) ya había sido observada con anterioridad por Ruzo y Casida [6, 7] en estudios en los que utilizaron luz solar y UV (λ = 300 nm). Por otro lado, Holmstead y col. [2] también apreciaron que la cis-permetrina se fotodegradaba más rápidamente que el isómero trans (λ = 290 nm y luz solar), aunque Rawn y col. [8] observaron lo contrario en experimentos de fotodegradación realizados con luz solar en agua de estanque. Finalmente, la mayor fotoestabilidad de la permetrina en relación con la de la cipermetrina (análogo α -ciano) también fue publicada por Ruzo y col. [9], aunque, anteriormente, los mismos autores habían afirmado que el grupo ciano no afectaba significativamente a la velocidad de fotodegradación [6]. 4.2.3 ESTUDIO CINÉTICO UTILIZANDO UNA MUESTRA DE AGUA REAL La foto-SPME de estos piretroides también se estudió utilizando muestras de agua residual con adición de 20 ng mL -1 de cada insecticida. Los resultados obtenidos fueron muy similares a los obtenidos en los experimentos realizados con agua ultrapura. De nuevo se demostró un comportamiento cinético de primer orden para la fotodegradación en fibra de los analitos y tan solo en el caso de los isómeros de la permetrina se observó un ligero descenso (no significativo) en las velocidades de fotodegradación. Por lo tanto se puede concluir que, en este caso particular, no se apreció efecto matriz asociado a la fotodegradación de los piretroides. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 285 4.2.4 IDENTIFICACIÓN DE FOTOPRODUCTOS Estudiando los cromatogramas obtenidos a cada tiempo de exposición de la fibra a la radiación UV se observó la aparición de picos cromatográficos y el aumento de su altura conforme aumentaba el tiempo de irradiación de la fibra con luz UV. Estos picos cromatográficos corresponden a la formación de fotoproductos de los piretroides estudiados aunque, posteriormente, para algunos de ellos también se observó una disminución de la altura como consecuencia de la fotodegradación de los propios fotoproductos. En este estudio se detectó la generación de un elevado número de fotoproductos. Para la identificación tentativa de estos compuestos se compararon los espectros de masas experimentales y los encontrados en la librería de espectros (NIST Spectral Database). Sin embargo, puesto que los espectros de masas de un gran número de los fotoproductos de los compuestos estudiados no aparecen en la librería, en estos casos se recurrió al análisis de los espectros de masas experimentales (clusters de Br y Cl, pérdidas de fragmentos característicos, iones moleculares) y a la consulta de la bibliografía disponible acerca de la fotoquímica de los piretroides para así tratar de esclarecer la identidad de los productos de su fotodegradación. Por otra parte, la similitud estructural entre los piretroides estudiados dificultó todavía más la identificación de los fotoproductos; de manera que, para facilitar el trabajo, se realizaron una serie de experimentos en los que se estudió individualmente la fotodegradación en fibra de cada compuesto. De esta manera, con los resultados obtenidos en estas pruebas se pudo conocer el origen de los distintos fotoproductos. Como consecuencia de la ya mencionada semejanza estructural, los insecticidas objeto de estudio presentan una serie de fotoproductos y rutas de fotodegradación comunes. En la Tabla IV.4.6 se han incluido las estructuras, los tiempos de retención y los iones de cuantificación de los fotoproductos identificados. Se han marcado en negro los fotoproductos comunes a varios piretroides, y en diferentes colores los productos de degradación específicos de cada uno de estos pesticidas (λ-cihalotrina en rosa, permetrina en azul, ciflutrina en verde, cipermetrina en violeta y deltametrina en 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 286 naranja). En algunos casos (P 8, P 12, P 13, P 14, P 19, P 21, P 22, P 23, P 24) se obtuvieron varios picos a los que les correspondía el mismo espectro de masas, por lo que se asumió que estos grupos de picos se correspondían con mezclas isoméricas. El uso de la foto-SPME para el estudio fotoquímico de los piretroides considerados permitió la identificación de varios compuestos (P 2, P 9, P 16 y P 17) que no habían sido detectados anteriormente por otros autores como fotoproductos de piretroides. Además, P 12, P 13, P 18, P 19, P 20, P 21 y P 23 tampoco se encontraron en la bibliografía disponible; sin embargo, a diferencia de los fotoproductos antes mencionados, estos compuestos probablemente se generen a través de rutas de fotodegradación que sí fueron previamente comentadas en otras publicaciones, a pesar de que sus estructuras químicas no habían sido propuestas con anterioridad. Tabla IV.4.6 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los piretroides estudiados. Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación P 1 ácido 3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxílico 7,46 91, 127, 173 P 2 1-metil-3-fenoxibenceno 8,09 184 P 3 3-fenoxibenzaldehído HO O 9,25 198 P 3* hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo HO O CN 9,25 198 Cl Cl O OH O IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 287 Tabla IV.4.6 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los piretroides estudiados, (continuación). Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación P 4 (3-fenoxifenil)metanol HO O 9,75 200 P 5 (3-fenoxifenil)acetonitrilo NC O 10,23 209 P 6 3-metilbut-2-enoato de ciano(3- fenoxifenil)metilo O OO CN 13,39 83 P 7 ácido 3-(2-cloro-3,3,3- trifluoroprop-1-en-1-il)-2,2- dimetilciclopropanocarboxílico O OH Cl CF 3 6,42 141 P 8 [3-(2-cloro-3,3,3-trifluoroprop- 1-en-1-il)-2,2- dimetilciclopropil](3- fenoxifenil)acetonitrilo Cl CF 3 O CN 13,25- 14,70 141, 197 P 9 1-(clorometil)-3-fenoxibenceno O Cl 9,58 183, 218 P 10 ácido 3-fenoxibenzoico HO O O 10,27 214, 196 P 11 3-metilbut-2-enoato de 3- fenoxibencilo O OO 12,18 83, 200 P 12 1-[3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropilmetil]-3- fenoxibenceno H Cl O 12,87- 13,12 93, 129 P 13 1-[3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropilmetil]-3- fenoxibenceno Cl Cl O 13,18- 14,15 91, 127, 163 P 14 3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de 3-fenoxibencilo H Cl O OO 15,24- 15,61 183 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 288 Tabla IV.4.6 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los piretroides estudiados, (continuación). Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación P 15 cis-3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de 3-fenoxibencilo Cl Cl O OO 16,52 183 P 16 dibenzo[b,d]furan-3- carbaldehído O O H 10,15 139, 195 P 17 dibenzo[b,d]furan-3- il(oxo)acetonitrilo O O NC 10,82 195, 221 P 18 3-metilbut-2-enoato de ciano(4-fluoro-3- fenoxifenil)metilo O OO F C N 13,06 83 P 19 [3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropil](4-fluoro-3- fenoxifenil)acetonitrilo Cl Cl O C N F 15,39- 17,09 91, 127, 163 P 20 [3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropil](4-fluoro-3- fenoxifenil)acetonitrilo Cl H O CN F 15,88 93, 129 P 21 [3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropil](3- fenoxifenil)acetonitrilo Cl H O CN 14,58- 15,18 93, 129 P 22 [3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropil](3- fenoxifenil)acetonitrilo Cl Cl O CN 15,60- 16,65 91, 127, 163 P 23 [3-(2-bromovinil)-2,2- dimetilciclopropil](3- fenoxifenil)acetonitrilo Br H O CN 15,50- 16,34 94, 173 P 24 3-(2,2-dibromovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de α -ciano-3-fenoxibencilo Br Br O OO CN 20,65- 20,98 253, 181 Sobre la base de los fotoproductos identificados (P 1-P 24) se concluyó que, en general, estos compuestos se generan a partir de procesos de isomerización, ruptura del enlace éster y rutas relacionadas, formación de dimetilacrilatos, decarboxilación y dehalogenación reductiva. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 289 En las Figuras IV.4.9 y IV.4.10 se han incluido los espectros de masas de aquéllos fotoproductos que se han identificado sobre la base de los espectros teóricos de la librería de espectros de la NIST. Figura IV. 4.9 Espectros de masas teóricos y experimentales de P 2, P 3, P 3*, P 4, P 5 y P 9 . 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 169 184 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 169 184 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 169 184 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 169 184 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 2 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 3 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 3* 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 128 141 169 181 209 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 128 141 169 181 209 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 128 141 169 181 209 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 128 141 169 181 209 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 5 50 75 100 125 150 175 200 225 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 115 141 168 183 218 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 115 141 168 183 218 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 225 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 115 141 168 183 218 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 115 141 168 183 218 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 9 P 4 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171 181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171 181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico P 4 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171 181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171 181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 296 4.2.3.2 Fotodegradación de la permetrina Se han propuesto once compuestos como fotoproductos de la permetrina: P 1-P 4 y P 9-P 15. En estudios previos, P 1, P 3, P 4, P 10, P 11, P 14 y P 15 ya habían sido propuestos como productos de la fotodegradación de este piretroide [2, 12]. En primer lugar, el fotoproducto P 1 se identificó tentativamente como el ácido 3-(2,2- diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxílico, es decir, el ácido carboxílico que se formaría como consecuencia de la ruptura del enlace éster de la permetrina. Del mismo modo, el (3-fenoxifenil)metanol (P 4), se puede generar a partir de la ruptura del enlace éster de la permetrina, o también a partir de otros fotoproductos de este piretroide que conservan el enlace éster (P 11, P 14, P 15). La pérdida del grupo hidroxilo de P 4 daría lugar al fotoproducto P 2, el cual también se podría generar por ruptura del correspondiente enlace C-C de los fotoproductos P 12 y P 13 o del enlace Cα-O de la permetrina o de los fotoproductos P 11, P 14 y P 15. Además, la cloración de P 2 podría generar 1-(clorometil)-3-fenoxibenceno (P 9). Figura IV.4.16 Cromatogramas por ion del fotoproducto P 7 sin irradiar y a diferentes tiempos de irradiación y cinética de fotoformación-fotodegradación. 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 minutos 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV P 7 ION: 141 0 400 800 1200 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (141) 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 minutos 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV P 7 ION: 141 0 400 800 1200 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (141) 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 minutos 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV P 7 ION: 141 0 400 800 1200 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (141) IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 297 Por otro lado, la oxidación de P 4 puede dar lugar al fotoproducto P 3 de la permetrina, el 3-fenoxibenzaldehído. A su vez, la oxidación de P 3 podría generar el ácido 3-fenoxibenzoico (P 10). El fotoproducto P 11 de la permetrina se identificó tentativamente como el 3-metilbut- 2-enoato de 3-fenoxibencilo. Este 3,3-dimetilacrilato podría generarse por desproporción del 1,3-diradical resultado de la ruptura del enlace 1,3 del anillo ciclopropano. Se propuso al 1-[3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropil)metil]-3-fenoxibenceno (P 13) como fotoproducto de la permetrina. Este compuesto se obtendría como consecuencia de la decarboxilación del piretroide de partida. Por otro lado, la dehalogenación reductiva de la permetrina puede conducir a la formación del fotoproducto P 14 (3-(2-clorovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxilato de 3- fenoxibencilo). A su vez, el fotoproducto P 12 (1-[3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropil)metil]-3-fenoxibenceno) se podría generar bien a partir de la decarboxilación de P 14, bien a partir de la pérdida de un átomo de cloro por parte de P 13. Finalmente, y tal y como ya se ha mencionado en el Apartado 4.2.2.1, la isomerización cis-trans (P 15) parece ser otra de las rutas de fotodegradación de la permetrina. Sobre la base de los fotoproductos de la permetrina que han sido identificados tentativamente, se propusieron las rutas de fotodegradación mostradas en la Figura IV.4.17. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 298 En la Figura IV.4.18 se superponen los cromatogramas obtenidos a diferentes tiempos de exposición de la fibra a la radiación UV. En ellos puede observarse la formación y posterior degradación de los fotoproductos P 12 y P 13 de la permetrina. En la figura también se han incluido las correspondientes cinéticas. Figura IV. 4. 17 Rutas de fotodegradación propuestas para l a permetrina . Cl Cl O OO Cl Cl O OH isómero H Cl O OO H Cl OO O Cl O OO HO O HO O HO O O P1 P2 P3 P4 P9 P10 P11 P14 P12 P15 Cl Cl O P13 permetrina IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 299 De la Figura IV.4.18 se deduce que P 13 (permetrina-CO 2 ) ya se empieza a formar durante los primeros minutos de irradiación y alcanza su máximo rápidamente, aproximadamente tras 5 minutos de irradiación, tiempo tras el cual la altura de pico comienza a disminuir como consecuencia de su propia fotodegradación, mientras que P 12 (permetrina-CO 2 -Cl) tarda más tiempo en empezar a formarse (más de 5 minutos), hecho que se podría atribuir a que este compuesto no se estuviese formando directamente a partir de la permetrina, si no a partir de P 13 (o de P 14). 4.2.3.3 Fotodegradación de la ciflutrina Se han propuesto ocho compuestos como fotoproductos de la ciflutrina: P 1, P 3, P 5, P 16-P 20. En primer lugar, como consecuencia de la ruptura del enlace éster, se detectó la generación del ácido ciclopropanocarboxílico correspondiente, es decir, P 1. En lo que respecta al fotoproducto P 3, su identidad no está del todo clara. Y es que, a diferencia de lo que ocurría para la permetrina, el 3-fenoxibenzaldehído (ver espectros de masas P 3 en Figura IV.4.9) no es la única opción posible, dada la enorme semejanza entre los espectros de masas teóricos de este compuesto y del hidroxi(3- P 12 12.8 12.9 13.0 13.1 min 0 1 2 3 4 5 6 kCuentas IONES: 93+129 Sin exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (93+129) P 12 12.8 12.9 13.0 13.1 min 0 1 2 3 4 5 6 kCuentas IONES: 93+129 Sin exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV Sin exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (93+129) 13.8 13.9 14.0 14.1 14.2 14.3 min 0 5 10 15 20 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 5 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV P 13 IONES: 91+127+163 0 5000 10000 15000 20000 25000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (91+127+163) 13.8 13.9 14.0 14.1 14.2 14.3 min 0 5 10 15 20 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 5 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV P 13 IONES: 91+127+163 0 5000 10000 15000 20000 25000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (91+127+163) Figura IV.4.18 Cromatogramas por ion de los fotoproductos P 12 y P 13 sin irradiar y a diferentes tiempos de irradiación y cinéticas de fotoformación-fotodegradación. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 300 fenoxifenil)acetonitrilo (ver espectros de masas P3* en Figura IV.4.9), que también es un posible fotoproducto de la ciflutrina. En definitiva, en el caso de la ciflutrina, P 3 podría tratase del 3-fenoxibenzaldehído, del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo, o de ambos. Por su parte, P 5 ((3-fenoxifenil)acetonitrilo) podría formarse a partir del hidroxi(3- fenoxifenil)acetonitrilo (P3*), o también por ruptura del enlace Cα-O de la ciflutrina o de P 18, o del correspondiente enlace C-C de P 19 y P 20, y pérdida del átomo de flúor. Los fotoproductos P 16 y P 17 se identificaron tentativamente como dibenzo[b,d]furan-3-carbaldehído y dibenzo[b,d]furan-3-il(oxo)acetonitrilo, respectivamente. P 17 podría formarse por oxidación y posterior fotodefluoración de un hipotético alcohol α -ciano-3-fenoxi-4-fluorobencílico intermedio generado por ruptura del enlace éster de la ciflutrina y/o del fotoproducto P 18. Por otra parte, P 16 se podría obtener por pérdida del grupo ciano de P 17. Para este piretroide también se detectó la formación de un 3,3-dimetilacrilato, concretamente el 3-metilbut-2-enoato de α -ciano-3-fenoxi-4-fluorobencilo (P 18). De nuevo, la decarboxilación fue una de las rutas propuestas para la ciflutrina, puesto que el fotoproducto P 19 se identificó tentativamente como [3-(2,2- diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropil](4-fluoro-3-fenoxifenil)acetonitrilo. Además, la decloración reductiva de P 19 podría generar P 20, [3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropil](4-fluoro-3-fenoxifenil)acetonitrilo. A partir de los fotoproductos de la ciflutrina identificados tentativamente se propusieron las rutas de fotodegradación mostradas en la Figura IV.4.19. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 301 En la Figura IV.4.20 se muestra la superposición de los cromatogramas obtenidos a diferentes tiempos de irradiación UV y las cinéticas de los fotoproductos P 16 y P 17 de la ciflutrina. Figura IV.4.20 Cromatogramas por ion de los fotoproductos P 16 y P 17 sin irradiar y a diferentes tiempos de irradiación y cinéticas de fotoformación - fotodegradación. 9.9 10.0 10.1 10.2 10.3 10.4 min 0.0 2.5 5.0 7.5 kCuentas P 16 ION: 139+195 Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 3000 6000 9000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (139+195) 9.9 10.0 10.1 10.2 10.3 10.4 min 0.0 2.5 5.0 7.5 kCuentas P 16 ION: 139+195 Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 3000 6000 9000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (139+195) 10.6 10.7 10.8 10.9 11.0 min 0 1 2 3 4 5 kCuentas ION: 195+221 P 17 Sin exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 2000 4000 6000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (195+221) 10.6 10.7 10.8 10.9 11.0 min 0 1 2 3 4 5 kCuentas ION: 195+221 P 17 Sin exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV Sin exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV 0 2000 4000 6000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (195+221) Figura IV. 4. 19 Rutas de fotodegradación propuestas para l a ci fl ut rin a . Cl Cl O OO CN F Cl Cl O CN F Cl H O CN F Cl Cl O OH O OO F CN O O NC O O H P1 P16 P17 P18 P19 P20 O O H O CN HO O NC P3 P3* P5 ¿? ¿? ciflutrina 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 302 4.2.3.4 Fotodegradación de la cipermetrina Se han propuesto 7 compuestos como fotoproductos de la cipermetrina: P 1, P 2, P 4- P 6, P 21 y P 22. Cuatro de estos compuestos (P 1, P 5, P 6 y P 22) ya habían sido sugeridos por otros autores como fotoproductos de este insecticida [5, 9, 13-16]. De nuevo, P 1 se pudo generar como consecuencia de la ruptura del enlace éster de este piretroide diclorovinílico. P 4 ((3-fenoxifenil)metanol) podría formarse a partir de la cipermetrina y/o del fotoproducto P 6 a través de la ruptura del enlace éster y de la pérdida del grupo ciano. Por otro lado, P 5 ((3-fenoxifenil)acetonitrilo) quizás se genere por ruptura del enlace éster y pérdida del grupo hidroxilo de la cipermetrina o de P 6, o también por ruptura directa del enlace Cα-O de dichos compuestos. Aunque también se podría formar como consecuencia de la ruptura del correspondiente enlace C-C de P 21 y P 22. Por su parte, P 2 podría obtenerse por degradación de P 4 y/o P 5. En lo que respecta al fotoproducto P 6, fue identificado tentativamente como 3,3- dimetilacrilato de α -ciano-3-fenoxibencilo. De nuevo, se detectó la pérdida de CO 2 como ruta de fotodegradación, puesto que se propuso al [3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropil](3-fenoxifenil)acetonitrilo como fotoproducto de la cipermetrina (P 22). A su vez, P 21 se identificó como [3-(2- clorovinil)-2,2-dimetilciclopropil](3-fenoxifenil)acetonitrilo, el cual probablemente se genere por decloración reductiva de P 22. A partir de los fotoproductos de la cipermetrina identificados tentativamente se propusieron las rutas de fotodegradación mostradas en la Figura IV.4.21. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 303 En la Figura IV.4.22 se superponen los cromatogramas de los fotoproductos P 21 y P22 y también se incluyen las correspondientes cinéticas de fotoformaciónfotodegradación. Figura IV. 4.2 1 Rutas de fotodegradación propuestas para la c ipermetrina . Cl Cl O OO CN Cl Cl OH OCl Cl O CN Cl H O CN O OO CN NC O O HO O P1 P2 P4 P5 P6 P21 P22 cipermetrina P 22 IONES: 91+127+163 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 min 0 10 20 30 40 50 60 70 kCuentas Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (91+127+163) P 22 IONES: 91+127+163 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 min 0 10 20 30 40 50 60 70 kCuentas 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 15.8 min 0 10 20 30 40 50 60 70 kCuentas Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (91+127+163) 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9 15.0 15.1 15.2 min 0 1 2 3 4 5 6 kCuentas P 21 IONES: 93+129 Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (93+129) 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9 15.0 15.1 15.2 min 0 1 2 3 4 5 6 kCuentas P 21 IONES: 93+129 Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV Sin exposición UV 5 min exposición UV 10 min exposición UV 20 min exposición UV 60 min exposición UV 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (93+129) Figura IV.4.22 Cromatogramas por ion de los fotoproductos P 21 y P 22 sin irradiar y a diferentes tiempos de irradiación y cinéticas de fotoformación-fotodegradación. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 304 Las cinéticas de P 21 y P 22 mostradas en la Figura IV.4.21 son consistentes con la suposición de que una de las rutas de degradación de P 22 podría ser la pérdida de un átomo de cloro para formar P 21, puesto que el descenso de la altura de pico de P 22 a partir de los 10 min de exposición (después de un incremento muy rápido en la respuesta durante los primeros minutos de irradiación) coincide con el incremento de la altura de pico de P 21 (de formación más tardía) para alcanzar su máximo a los 20 min. 4.2.3.5 Fotodegradación de la deltametrina Se propusieron un total de 6 compuestos como fotoproductos de la deltametrina: P 3- P 6, P 23 y P 24. En lo que se refiere al fotoproducto P 3, ocurre lo mismo que se comentó para la ciflutrina: podría tratarse del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo, del 3- fenoxibenzaldehído, o de ambos. De hecho los dos compuestos han sido identificados como fotoproductos de la deltametrina en estudios previos [17, 18]. También se propuso al (3-fenoxidenil)metanol (P 4) como fotoproducto, el cual seguramente se genere a partir de la deltametrina o de P 6 por ruptura del enlace éster y pérdida del grupo ciano. Por otra parte, también se identificó como fotoproducto al (3- fenoxifenil)acetonitrilo (P 5), el cual se podría generar por pérdida del grupo hidroxilo del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo (¿P3*?), por ruptura del enlace Cα-O del propio piretroide y/o del fotoproducto P 6 (3-metilbut-2-enoato de α-ciano-3-fenoxibencilo) y/o por ruptura del correspondiente enlace C-C de P 23. Tanto P 5 como P 6 ya habían sido detectados con anterioridad [17, 18]. Además, se observó que los fotoproductos P 24 poseían el mismo espectro de masas que la deltametrina, por lo que fueron identificados tentativamente como isómeros de dicho piretroide, tal y como ya habían observado Ruzo y col. [17, 18] y Maguire [19]. Finalmente, el fotoproducto P 23 se identificó como [3-(2-bromovinil)-2,2- dimetilciclopropil](3-fenoxifenil)acetonitrilo, es decir, el producto resultado de la decarboxilación y pérdida de un átomo de Br por parte de la deltametrina. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 305 En la Figura IV.4.23 se muestran las rutas de fotodegradación propuestas para la deltametrina. 4.2.4 FOTO-SPME UTILIZANDO LUZ SOLAR NATURAL Se realizaron algunas pruebas de fotodegradación de la λ-cihalotrina, permetrina, ciflutrina, cipermetrina y deltametrina mediante foto-SPME y empleando como fuente de irradiación luz solar natural. La fibra de PDMS se expuso a la luz solar durante 16 h en dos días consecutivos; transcurrido ese tiempo se procedió a su análisis mediante GC-MS. Además, se llevaron a cabo experimentos en idénticas condiciones pero protegiendo la fibra de la luz del sol (test de oscuridad). Los resultados obtenidos para la foto-SPME con luz solar, el test de oscuridad y la SPME control se han representado en la Figura IV.4.24. Figura IV. 4. 23 Ruta s de fotodegradación propuesta s para la deltametrina . Br Br O OO CN Br H O CN O OO CN HO O CN NC O HO O isómeros ¿? ¿? P24 P23 P6 P5 P3* P3 HO O P4 deltametrina 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 312 Tabla 4.9 Parámetros cinéticos de los compuestos estudiados. Compuesto Rango evaluado (min) R 2 k ap (min -1 ) t 1/2 (min) Cifenotrina 0-10 0,9983 0,234 2,96 Aletrina 0-60 0,9946 0,0679 10,2 Transflutrina 0-60 0,9985 0,0585 11,8 Fenotrina (2) 0-60 0,9954 0,0475 14,6 Fenotrina (1) 2-60 0,9969 0,0465 14,9 Empentrina 0-60 0,9859 0,0274 25,3 Butóxido de piperonilo 0-60 0,9962 0,0403 17,2 De acuerdo con estos resultados, el orden de fotoestabilidad de los compuestos investigados bajo las condiciones experimentales empleadas en este trabajo es el siguiente: empentrina > PBO > fenotrina (1) ~ fenotrina (2) > transflutrina > aletrina > cifenotrina. La mayor fotoestabilidad de la empentrina se esperaba de los datos espectrales obtenidos a 254 nm (Apartado 4.3.1.1). Del mismo modo, la mayor rapidez de la fotodegradación de la cifenotrina es consistente con su mayor coeficiente de absorción molar a la longitud de onda de trabajo. Figura IV.4.30 Demostración del comportamiento cinético de primer orden para la fotodegradación en fibra de los compuestos estudiados. 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 tiempo de irradiación (min) ln(% de compuesto sin degradar) empentrina transflutrina aletrina butóxido de piperonilo fenotrina (1) fenotrina (2) cifenotrina IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 313 4.3.3 IDENTIFICACIÓN DE FOTOPRODUCTOS La exposición de los compuestos estudiados a la luz UV condujo a la formación de un gran número de fotoproductos, algunos de los cuales se pudieron identificar tentativamente sobre la base de sus espectros de masas. Para ello, se compararon los espectros de masas experimentales y los encontrados en la librería de espectros. Sin embargo, puesto que los espectros de masas de un gran número de los fotoproductos de los compuestos estudiados no aparecen en la librería, de nuevo se tuvo que recurrir al análisis de los espectros de masas experimentales (clusters de Cl, pérdidas de fragmentos característicos, iones moleculares) y a la consulta de la bibliografía disponible acerca de la fotoquímica de los piretroides y del PBO para así tratar de esclarecer la identidad de los productos de su fotodegradación. Es importante enfatizar que no se han encontrado estudios previos acerca de la fotodegradación de la empentrina y la cifenotrina, y que la información disponible acerca de la fotoquímica de la transflutrina es muy escasa. Como en el estudio anterior, se realizaron una serie de experimentos en los que se investigó individualmente la fotodegradación en fibra de cada compuesto para así facilitar la identificación de los fotoproductos. Las estructuras de los fotoproductos identificados, así como los tiempos de retención e iones de cuantificación se han incluido en la Tabla IV.4.10. Además de los fotoproductos de la empentrina y de la cifenotrina, de cuya fotodegradación no se han encontrado trabajos previos, algunos de los fotoproductos identificados (F 2, F 5-F 8, F 10, F 15, F 17 y F 19) se proponen por primera vez en este estudio. En lo que respecta a las rutas de fotodegradación, la isomerización, la ruptura del enlace éster y la formación de 3,3-dimetilacrilatos se observaron en todos los insecticidas estudiados. Además, se detectaron fotoproductos comunes a varios piretroides (F 1, F 2, F 16, F 18). Estos compuestos se han marcado en negro en la Tabla IV.4.10, mientras que los fotoproductos específicos de cada compuesto se han resaltado con distintos colores: empentrina (rosa), transflutrina (azul), aletrina (verde), fenotrina (violeta), cifenotrina (naranja) y PBO (marrón). Por otro lado, para algunos fotoproductos (F 4, F 7, F 8, F 10, F 11, F 14) se obtuvieron varios picos con 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 314 los mismos espectros de masas, y en estos casos se asumió que se habían generado mezclas isoméricas. Tabla IV.4.10 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los compuestos estudiados. Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación F 1 ácido 2,2-dimetil-3-(2-metil-1- propenil)ciclopropanocarboxílico 7,14 81, 123 F 2 5-metil-6-(2-metilprop-1-en-1- il)-3-oxabiciclo[3.1.0]hexan-2- ona 8,19 111 F 3 3-metilbut-2-enoato de 1-etinil- 2-metilpent-2-en-1-ilo 8,37 83 F 4 2,2-dimetil-3-(2-metilprop-1- en-1-il)ciclopropanocarboxilato de 1-etinil-2-metilpent-2-en-1- ilo 10,05-10,41 123 F 5 ácido 3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxílico 8,36 91, 127, 173 F 6 3-metilbut-2-enoato de 2,3,5,6-tetrafluorobencilo 8,47 83, 163 F 7 3-{[3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropil]metil}- 1,2,4,5-tetrafluorobenceno 8,96-9,04 93, 129 F 8 3-{[3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropil]metil}- 1,2,4,5-tetrafluorobenceno 9,21-9,84 91, 127, 163 O OH OO O O O O Cl Cl OH O O O F F F F Cl H F F F F Cl Cl F F F F IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 315 O O H O HO CN Tabla IV.4.10 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los compuestos estudiados, (continuación). Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación F 9 3-formil-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorobencilo 10,07 97, 163 F 10 3-(2-clorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorobencilo 10,71- 10,87 93, 163 F 11 3-(2,2-diclorovinil)-2,2- dimetilciclopropanocarboxilato de 2,3,5,6-tetrafluorobencilo 11,31- 11,51 163 F 12 4-hidroxi-3-metil-2-(2- propenil)-2-ciclopenten-1-ona 7,93 43, 109 F 13 3-metilbut-2-enoato de 3-alil-2- metil-4-oxociclopent-2-en-1-ilo 10,51 83, 134 F 14 2,2-dimetil-3-(2-metilprop-1- en-1-il)ciclopropanocarboxilato de 3-alil-2-metil-4-oxociclopent- 2-en-1-ilo 12,87- 13,14 123 F 15 1-metil-3-fenoxibenceno 9,05 184 F 16 3-fenoxibenzaldehído 10,34 198 F 16* hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo 10,34 198 O O O F F F F H Cl H O O F F F F Cl Cl O O F F F F HO O O O O O O O O 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 316 Tabla IV.4.10 Estructuras, tiempos de retención (t r ) e iones de cuantificación de los fotoproductos generados e identificados en la foto-SPME de los compuestos estudiados, (continuación). Código Fotoproducto Estructura tr (min) Ion(es) de cuantificación F 17 4-fenoxibenzaldehído 10.59 197 F 18 (3-fenoxifenil)metanol 10.87 200 F 19 3-metilbut-2-enoato de 3- fenoxibencilo 13.96 83, 200 F 20 2,2-dimetil-3-(2-metilprop-1- enil)ciclopropanocarboxilato de 3-fenoxibencilo 16.97 123, 183 F 21 (3-fenoxifenil)acetonitrilo 11.46 209 F 22 3-metilbut-2-enoato de ciano(3-fenoxifenil)metilo 15.41 83 F 23 2,2-dimetil-3-(2-metilprop-1- enil)ciclopropanocarboxilato de α -ciano-3-fenoxibencilo 18.28 123 F 24 2-(2-butoxietoxi)-etanol 6.55 45, 57 F 25 5-metil-6-propil-1,3- benzodioxol 8.40 149, 178 F 26 6-propil-1,3-benzodioxol-5- carbaldehído 9.84 77, 135, 192 Si se presta atención a los fotoproductos incluidos en las Tablas IV.4.10 y IV.4.6 se observa que hay una serie de fotoproductos en común (F 5=P 1, F 15=P 2, F 16=P 3, F 18=P 4, F 19=P 11, F 21=P 5, F 22= P 6). Los tiempos de retención han cambiado con respecto al estudio anterior debido a las operaciones habituales de mantenimiento en la columna cromatográfica. O HO O H O O OO O OO O NC O OO CN O OO CN OOOH O O O O O H IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 317 En las Figuras IV.4.31 y IV.4.32 se muestran los espectros de masas de aquéllos fotoproductos identificados sobre la base de los correspondientes espectros de masas teóricos. 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 155 169 184 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 155 169 184 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 155 169 184 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 91 115 128 141 155 169 184 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 15 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 153 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 153 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 153 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 92 115 141 153 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 16 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 115 141 152 169 181 198 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F16* 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 55 67 81 91 107 123 135 153 168 0% 25% 50% 75% 100% 41 55 69 81 91 107 123 135 153 168 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 55 67 81 91 107 123 135 153 168 0% 25% 50% 75% 100% 41 55 69 81 91 107 123 135 153 168 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 1 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 43 51 67 79 91 109 123 137 152 0% 25% 50% 75% 100% 43 53 67 79 91 109 123 137 152 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 43 51 67 79 91 109 123 137 152 0% 25% 50% 75% 100% 43 53 67 79 91 109 123 137 152 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 12 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 81 107 123 153168 0% 25% 50% 75% 100% 41 79 107 123 136 153168 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 136 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 81 107 123 153168 0% 25% 50% 75% 100% 41 79 107 123 136 153168 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 136 F 14 Figura IV.4.31 Espectros de masas experimentales y teóricos de F 1, F 12, F 14, F 15, F 16 y F 16*. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 318 Por otra parte, en las Figuras IV.4.33 y IV.4.34 se muestran los espectros de masas y la justificación de iones experimentales de aquéllos fotoproductos para los cuales no se dispuso de los correspondientes espectros de masas teóricos. 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 115 141 169 197 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 115 141 169 197 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 115 141 169 197 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 115 141 169 197 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 17 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 51 65 79 94 107 115 141 153 171 183 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 41 51 65 79 94 107 115 141 153 171 183 200 0% 25% 50% 75% 100% 51 65 77 94 107 115 141 153 171181 200 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 18 50 100 150 200 250 300 350 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 81 123 183 250 307 350 0% 25% 50% 75% 100% 81 123 183 250 307 350 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 100 150 200 250 300 350 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 81 123 183 250 307 350 0% 25% 50% 75% 100% 81 123 183 250 307 350 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 20 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 40 51 63 77 91 103 115 127 141 154 169 181 209 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 116 127 141 153 169 181 209 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 40 51 63 77 91 103 115 127 141 154 169 181 209 0% 25% 50% 75% 100% 51 63 77 89 103 116 127 141 153 169 181 209 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 21 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 45 57 75 87 101 120 133 145 0% 25% 50% 75% 100% 45 57 75 87 100 119 132 144 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 45 57 75 87 101 120 133 145 0% 25% 50% 75% 100% 45 57 75 87 100 119 132 144 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico F 24 Figura IV.4.32 Espectros de masas experimentales y teóricos de F 17, F 18, F 20, F 21 y F 24. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 319 Figura IV.4.33 Espectros de masas y justificación de iones experimentales de F 2, F 3, F 5, F 6, F 7 y F 8. 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 98 111 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 98 111 F 2 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 107 91 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 107 91 F 3 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 91 127 163 173 191 207 50 75 100 125 150 175 200 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 91 127 163 173 191 207 F 5 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 143 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 143 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 91 127 163 143 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 91 127 163 143 F 7 F 8 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 99 143 163 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 99 143 163 F 6 OO -CH -CH 3 + m/z 111 m/z 98 m/z 83 + m/z 55 O + -CO m/z 55 m/z 83 + -CH 3 (-H) m/z 91 m/z 107 Cl Cl + m/z 163 -HCl m/z 127 -HCl m/z 91 Cl Cl OH O -OH m/z 191 -H m/z 207 -Cl m/z 173 + · O + m/z 83 m/z 55 -CO O O + m/z 99 FF F F + m/z 163 -HF m/z 143 Cl H + m/z 129 -HCl m/z 93 FF F F + m/z 163 -HF m/z 143 FF F F + m/z 163 -HF m/z 143 Cl Cl + m/z 163 -HCl m/z 127 -HCl m/z 91 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 320 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 97 143 163 275 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 97 143 163 275 F 9 F 22 50 100 150 200 250 300m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 181 225 50 100 150 200 250 300m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 181 225 F 13 50 75 100 125 150 175 200m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 134 50 75 100 125 150 175 200m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 134 O m/z 83 m/z 55 + OO + ( - H ) m / z 1 8 1 (+H) m/z 225 CN 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 183 200 282 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 183 200 282 F 19 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 300 143 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 300 143 F 10 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 135 163 177 192 191 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 135 163 177 192 191 F 26 O O F F FF + m/z 275 O H + m/z 97 FF F F + m/z 163 -HF m/z 143 O + m/z 83 -CO m/z 55 O + (-H) m/z 134 O + m/z 83 -CO m/z 55 OO + (+H) m/z 200 m/z 183 O OO + · m/z 282 O O O H + · m/z 192 -H m/z 191 -CH 2 m/z 163 O O + m/z 177 -CH 3 m/z 135 m/z 129 -HCl m/z 93 Cl H + F F F F + m/z 163 -HF m/z 143 Cl HO O FF FF + · m/z 300 -HCl 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 97 143 163 275 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 97 143 163 275 F 9 F 22 50 100 150 200 250 300m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 181 225 50 100 150 200 250 300m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 181 225 F 13 50 75 100 125 150 175 200m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 134 50 75 100 125 150 175 200m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 134 O m/z 83 m/z 55 + OO + ( - H ) m / z 1 8 1 (+H) m/z 225 CN 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 183 200 282 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 55 83 183 200 282 F 19 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 300 143 50 100 150 200 250 300 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 93 129 163 300 143 F 10 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 135 163 177 192 191 50 75 100 125 150 175 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 135 163 177 192 191 F 26 O O F F FF + m/z 275 O H + m/z 97 FF F F + m/z 163 -HF m/z 143 O + m/z 83 -CO m/z 55 O + (-H) m/z 134 O + m/z 83 -CO m/z 55 OO + (+H) m/z 200 m/z 183 O OO + · m/z 282 O O O H + · m/z 192 -H m/z 191 -CH 2 m/z 163 O O + m/z 177 -CH 3 m/z 135 m/z 129 -HCl m/z 93 Cl H + F F F F + m/z 163 -HF m/z 143 Cl HO O FF FF + · m/z 300 -HCl Para la identificación de F 13 también se utilizaron datos espectrales consultados en la bibliografía [24]. En lo que respecta al fotoproducto F 25, su estructura se propuso sobre la base de la justificación del patrón de fragmentación observado en el espectro de masas experimental pero también de las similitudes y diferencias entre dicho espectro y el espectro teórico de su isómero 5-isobutil-1,3-benzodioxol (Figura IV.4.35). Figura IV.4.34 Espectros de masas y justificación de iones experimentales de F 9, F 10, F 13, F 19, F 22 y F 26. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 321 Finalmente, los fotoproductos F 4, F 11 y F 23 se identificaron tentativamente como isómeros de los correspondientes piretroides de partida basándose en las similitudes entre sus espectros de masas experimentales y los de la empentrina, la transflutrina y la cifenotrina, respectivamente (Figura IV.4.36). Figura IV.4.35 Espectro de masas y justificación de iones experimentales de F 25, y espectro de masas teórico del 5 - isobutil - 1,3 - benzodioxol. F 25 50 75 100 125 150 175m/z 0% 25% 50% 75% 100% 119 149 178 135 91 77 65 51 50 75 100 125 150 175m/z 0% 25% 50% 75% 100% 119 149 178 135 91 77 65 51 5-isobutil-1,3-benzodioxol 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 51 5151 51 65 6565 65 77 7777 77 91 9191 91 105 105105 105 135 135135 135 178 178178 178 m/z 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 51 5151 51 65 6565 65 77 7777 77 91 9191 91 105 105105 105 135 135135 135 178 178178 178 m/z O O O O + · m/z 178 + m/z 149 m/z 135 O O m/z 119 +-CH 2 O O 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 328 Las rutas de fotodegradación propuestas para la fenotrina se muestran en la Figura IV.4.41. La formación de F 1, F 16, F 18 y F 20 como fotoproductos de este insecticida ya había sido descrita por Ruzo y col. [22]. Por otra parte, aunque el fotoproducto F 19 no ha sido encontrado como fotoproducto de la fenotrina por otros autores, en otros estudios se ha observado que la formación de 3,3-dimetilacrilatos es una ruta de fotodegradación habitual en piretroides de estructura similar [2, 24]. En la Figura IV.4.42 se muestra la superposición de los cromatogramas obtenidos a diferentes tiempos de irradiación UV, así como la correspondiente cinética de F 19. Figura IV.4.41 Rutas de fotodegradación propuestas para la fenot rin a . O OH O O O H O HO O H O OO O OO O OO isómero F1 F2 F15 F16 F17 F18 F19 F20 fenotrina IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 329 4.3.3.5 Fotoproductos de la cifenotrina Los compuestos F 1, F 2, F 16 y F 18 también se detectaron como fotoproductos de la cifenotrina. De nuevo, la formación del ácido crisantémico (F 1) sugiere que la ruptura del enlace éster es una de las rutas de fotodegradación de este piretroide. En este caso, sin embargo, la identidad del fotoproducto F 16 no se pudo confirmar debido al gran parecido entre los espectros de masas teóricos del 3- fenoxibenzaldehído y otro posible fotoproducto de la cifenotrina como es el hidroxi(3- fenoxifenil)acetonitrilo, que se puede formar por ruptura del enlace éster del piretroide de partida (y/o del fotoproducto F 22). Por lo tanto, este fotoproducto podría tratarse del 3-fenoxibenzaldehído (F 16) o del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo (F 16*), o de ambos. El 3-fenoxibenzaldehído probablemente se generaría por fotooxidación del (3-fenoxifenil)metanol (F 18) el cual, a su vez, se podría formar por ruptura del enlace éster y pérdida del grupo ciano de la cifenotrina (y/o del fotoproducto F 22). El fotoproducto F 21, identificado tentativamente como (3-fenoxifenil)acetonitrilo, puede generarse por pérdida del grupo hidroxilo del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo o por ruptura del enlace Cα-O de la cifenotrina y/o del fotoproducto F 22. 13.75 14.00 14.25 14.50 min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 kCuentas Sin exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV ION: 83+200 F 19 0 6000 12000 18000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (83+200) 13.75 14.00 14.25 14.50 min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 kCuentas Sin exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV ION: 83+200 F 19 0 6000 12000 18000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (83+200) Figura IV.4.42 Cromatogramas por ion obte nidos a diferentes tiempos de irradiación UV y cinética de fotoformación-fotodegradación de F 19. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 330 La formación de 3,3-dimetilacrilatos también se propuso como ruta de fotodegradación de la cifenotrina debido a la identificación tentativa del 3-metilbut-2- enoato de ciano(3-fenoxifenil)metilo (F 22) como fotoproducto (ver los correspondientes cromatogramas y cinética en la Figura IV.4.43). Finalmente, la fotoisomerización se postuló como reacción de fotodegradación debido a la localización de un fotoproducto (F 23) con el mismo espectro de masas que la cifenotrina. Sobre la base de los fotoproductos de la cifenotrina que fueron identificados tentativamente, se propusieron las rutas de fotodegradación mostradas en la Figura IV.4.44. Figura IV. 4. 44 Rutas de fotodegradación propuestas para la cifenotrina . 15.2 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV ION: 83 F 22 0 2000 4000 6000 8000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (83) 15.2 15.3 15.4 15.5 15.6 15.7 min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 5 min exposición UV 20 min exposición UV 40 min exposición UV ION: 83 F 22 0 2000 4000 6000 8000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (83) Figura IV.4.43 Cromatogramas por ion obtenidos a diferentes tiempos de irradiación y cinética de fotoformación-fotodegradación de F 22. O OH OO O O H O HO CN O HO O NC O OO CN O OO CN isómero F2F1F22 F21 F18 F23 ¿F16? ¿F16*? cifenotrina IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 331 4.3.3.6 Fotoproductos del PBO Se identificaron tres compuestos como fotoproductos del butóxido de piperonilo: F 24- F 26. Por una parte se propusieron como fotoproductos el 2-(2-butoxietoxi)-etanol (F 24) y el 5-metil-6-propil-1,3-benzodioxol (F 25). Ambos compuestos, previamente detectados por otros autores [28], pueden generarse a partir del PBO por ruptura del enlace C-O en posición bencílica. El fotoproducto F 26 del PBO se identificó tentativamente como 6-propil-1,3- benzodioxol-5-carbaldehído. Este compuesto, que puede obtenerse por pérdida de la cadena lateral butoxietoxietilo del PBO y por la subsiguiente oxidación al correspondiente aldehído del alcohol bencílico resultante, ya había sido identificado anteriormente como fotoproducto del PBO [29-31]. Las rutas de fotodegradación propuestas para el butóxido de piperonilo se ilustran en la Figura IV.4.45. Figura IV.4.45 Rutas de fotodegradación propuestas para el PBO. O O O O O H OOOH O O O O O F24 F26 F25 butóxido de piperonilo 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 332 La superposición de los cromatogramas obtenidos a diferentes tiempos de irradiación, así como la correspondiente cinética del fotoproducto F 26 se muestran en la Figura IV.4.46. 4.4 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: PIRETROIDES CARENTES DE ANILLO CICLOPROPANO En este último estudio se ha investigado la fotodegradación de dos piretroides carentes del anillo ciclopropano: flucitrinato y fenvalerato. De nuevo, ambos productos fueron adquiridos como mezclas isoméricas de tal manera que, bajo las condiciones de análisis especificadas en la Tabla IV.4.2, se obtuvieron dos picos cromatográficos para cada uno de los compuestos. Cada uno de esos picos se cuantificó por separado y los correspondientes tiempos de retención e iones de cuantificación se han incluido en la Tabla IV.4.11. En la Figura IV.4.47 se muestran los espectros de masas experimentales y teóricos de ambos piretroides. 9.7 9.8 9.9 10.0 min 0 5 10 15 20 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV ION: 77+135+192 F 26 0 3000 6000 9000 12000 15000 18000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (77+135+192) 9.7 9.8 9.9 10.0 min 0 5 10 15 20 kCuentas Sin exposición UV 2 min exposición UV 10 min exposición UV 40 min exposición UV 60 min exposición UV ION: 77+135+192 F 26 0 3000 6000 9000 12000 15000 18000 0 20 40 60 tiempo de irradiación (min) altura (77+135+192) Figura IV.4.46 Cromatogramas por ion obtenidos a diferentes tiempos de irradiación y cinética de fotoformación-fotodegradación de F 26. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 333 Tabla IV.4.11 Tiempos de retención e iones de cuantificación de los piretroides estudiados. Compuesto t r (min) Iones de cuantificación Flucitrinato (1) 26,69 157+199 Flucitrinato (2) 26,89 157+199 Fenvalerato (1) 27,43 125+167 Fenvalerato (2) 27,66 125+67 4.4.1 EXPERIMENTOS PRELIMINARES 4.4.1.1 Espectros UV Los espectros de absorción UV del flucitrinato y del fenvalerato en agua ultrapura (10 ng mL -1 ) se muestran en la Figura IV.4.48. Los patrones espectrales observados para ambos compuestos son muy similares, lo cual es bastante lógico si se tiene en cuenta que las diferencias estructurales entre ellos son mínimas y poco importantes desde el punto de vista de la absorción en la región UV. Figura IV.4.47 Espectros de masas teóricos y experimentales de: (a) flucitrinato; (b) fenvalerato. 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico (a) flucitrinato (b) fenvalerato 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 0% 25% 50% 75% 100% 107 157 184 199 225 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 100 200 300 400 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 0% 25% 50% 75% 100% 77 125 127 167 181 225 419 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico (a) flucitrinato (b) fenvalerato 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 334 A partir de los datos espectrales obtenidos se estimaron los coeficientes de absorción molar a los máximos de emisión de las dos lámparas empleadas en este estudio: 254 nm y 366 nm (Tabla IV.4.12). Tabla IV.4.12 Coeficientes de absorción molar a 254 nm y 366 nm. Tal y como se esperaba, ambos insecticidas absorben prácticamente el mismo número de fotones a las longitudes de onda consideradas. A la vista de estos resultados, y si la cantidad de fotones absorbidos fuese el único factor determinante de la velocidad de fotodegradación de estos compuestos, sería de esperar que flucitrinato y fenvalerato se fotodegradasen a velocidades similares. Además, ambos piretroides absorben menos radiación a 366 nm que a 254 nm, por lo que es de suponer que las transformaciones fotolíticas sean más lentas a 366 nm. 4.4.1.2 Influencia de la fuente de irradiación Los primeros pasos en el estudio de la fotodegradación en fibra del flucitrinato y fenvalerato tuvieron como objetivo estudiar la influencia de la fuente de irradiación ε 254 (M -1 cm -1 ) ε 366 (M -1 cm -1 ) Flucitrinato 6,98·10 6 3,07·10 6 Fenvalerato 7,00·10 6 2,80·10 6 Figura IV.4.48 Espectros de absorción UV del fenvalerato y del flucitrinato. 0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 8.00E+06 1.00E+07 1.20E+07 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 Longitud de onda (nm) ε (M -1 cm -1 ) flucitrinato fenvalerato IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 335 empleada y, de esta manera, elegir las condiciones de irradiación más adecuadas para las siguientes experiencias. En primer lugar se realizaron una serie de experimentos en los que la fibra (con los piretroides ya absorbidos) se expuso durante 120 min a dos lámparas diferentes: una lámpara negra fluorescente (8 W, 366 nm) y una lámpara de mercurio de baja presión (8 W, 254 nm). Transcurrido ese tiempo, se observó que con la lámpara negra se había degradado alrededor de un 40% de los analitos, mientras que con la lámpara de mercurio de baja presión la degradación fue prácticamente del 100%. Por lo tanto, la fotodegradación de los piretroides fue evidente en ambos casos y más lenta a 366 nm que a 254 nm, para una misma potencia nominal, tal y como se había predicho a partir de los datos de la Tabla IV.4.12. A continuación se estudió la influencia de la potencia a 254 nm. Para ello, se realizaron pruebas a 18 W y se compararon los resultados con los obtenidos a 8 W. Lógicamente, la fotodegradación de los insecticidas investigados fue más rápida al trabajar a 18 W. Si los experimentos de fotodegradación se realizaran a 366 nm, se tendrían que estudiar tiempos de irradiación demasiado largos. Por otro lado, al trabajar a 254 nm con una potencia de 18 W, la degradación de fenvalerato y flucitrinato es tan rápida que sería complicado definir su comportamiento cinético y detectar algunos fotoproductos. De manera que, por razones prácticas, en los experimentos posteriores se decidió estudiar la foto-SPME de estos compuestos utilizando la lámpara de mercurio de baja presión (254 nm) de 8 W. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 336 4.4.1.3 Test de oscuridad Como ya se hizo para los otros compuestos investigados, se realizó un test de oscuridad con el objetivo de cerciorarse de que el descenso en la respuesta analítica del flucitrinato y del fenvalerato en las pruebas en las que la fibra de SPME es irradiada con luz UV se debe únicamente a la acción de los fotones. Para ello, se realizaron los mismos experimentos (control, foto-SPME y test de oscuridad) que los indicados en el Apartado 4.2.1.2, con la diferencia de que en este caso se extrajeron alícuotas de 8 mL (ver Apartado 4.1.1) de 1 ng/mL de los compuestos estudiados. Además, la fibra (retraída o no) se expuso durante 60 min a la luz UV (λ = 254 nm) trabajando a una potencia de 8 W. En la Figura IV.4.49 se muestran los resultados obtenidos en estas pruebas. Tras 60 min de irradiación se observó un claro descenso en las áreas de pico, mientras que no se apreció una reducción de las respuestas en el test de oscuridad. Por lo tanto, con estos resultados se demostró que durante la irradiación de la fibra no se producen pérdidas de los analitos por otros procesos como la volatilización. 4.4.2 FOTO-SPME 4.4.2.1 Influencia del tiempo de irradiación Se trazaron las cinéticas de fotodegradación de los piretroides investigados estudiando la influencia del tiempo de irradiación (λ = 254 nm, 8 W) en la respuesta analítica de los mismos. Figura IV.4.49 Resultados del test de oscuridad y de la foto-SPME (60 min) para los piretroides estudiados comparados con los obtenidos en el experimento control. 0 20 40 60 80 100 flucitrinato (1) flucitrinato (2) fenvalerato (1) fenvalerato (2) % de compuesto sin degradar control foto-SPME test de oscuridad IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 337 Para ello se tomaron alícuotas de 8 mL de una disolución de 1 ng/mL de los piretroides estudiados en agua Milli-Q. Tras la etapa de extracción, la fibra se expuso a la luz UV durante diferentes períodos de tiempo comprendidos entre 0 y 60 min. A continuación, la fibra se introdujo en el inyector del cromatógrafo de gases y se registraron las variaciones en las áreas de pico de los analitos. En la Figura IV.4.50 se superponen los cromatogramas correspondientes a 0, 5, 15 y 60 min de irradiación UV. En la figura se observa un claro descenso en las áreas de pico del flucitrinato y del fenvalerato a medida que se incrementa el tiempo de exposición a la radiación. min 26.4 26.6 26.8 27.0 27.2 27.4 27.6 27.8 Hz 0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 Tiempo de irradiación: 0 min 5 min 15 min 60 min Flucitrinato (1) (2) Fenvalerato (1) (2) min 26.4 26.6 26.8 27.0 27.2 27.4 27.6 27.8 Hz 0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 Tiempo de irradiación: 0 min 5 min 15 min 60 min Flucitrinato (1) (2) Fenvalerato (1) (2) Las cinéticas de fotodegradación obtenidas se muestran en la Figura IV.4.51. En todos los casos se aprecian pérdidas de más del 90% tras 15 min de irradiación UV. Figura IV.4.50 Superposición de los cromatogramas obtenidos a diferentes tiempos de irradiación para el flucitrinato y fenvalerato. 4. FOTODEGRADACIÓN DE PIRETROIDES 344 ambos compuestos son posibles fotoproductos del fenvalerato y flucitrinato. De manera que no se pudo confirmar la identidad de este fotoproducto: podría tratarse del 3-fenoxibenzaldehído, del hidroxi(3-fenoxifenil)acetonitrilo, o incluso de ambos. Para la identificación de aquéllos fotoproductos de los que no se dispone del correspondiente espectro de masas teórico, se recurrió a la interpretación del perfil de fragmentación observado en sus espectros de masas obtenidos experimentalmente. En las Figuras IV.4.55, IV.4.56 y IV.4.57 se ilustran los espectros de masas y la justificación de iones experimentales para dichos productos de fotodegradación. 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 115 141 170 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 115 141 170 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 75 100 125 150 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 115 141 170 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 115 141 170 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico FEN4 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 113 141 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 113 141 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico 50 100 150 200 250 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 113 141 0% 25% 50% 75% 100% 51 77 113 141 (a) Espectro experimental (b) Espectro teórico FEN5 Figura IV.4.54 Espectros de masas experimentales y teóricos de FEN 4 y FEN 5. [Document text truncated for crawler view.]