Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca-Lolium

A Coruña Octubre de 2009 UNIVERSIDADE DE SAN T IAGO DE COMPOSTELA ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE PRODUCIÓN VEXETAL Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca – Lolium Tesis Doctoral Julio Enrique López Díaz Lugo, 2009 UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA ESCOLA POLITÉCNICA SUPERIOR DEPARTAMENTO DE PRODUCIÓN VEXETAL Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca – Lolium Tesis Doctoral Julio Enrique López Díaz Director: Dr. Jose Alberto Oliveira Prendes LUGO, 2009 D. Jose Alberto Oliveira Prendes, Dr. Ingeniero Agrónomo, Profesor Titular del Área de Producción Vegetal de la Universidad de Oviedo, como director de la Tesis Doctoral: “Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca - Lolium ”, con D. Antonio Rigueiro Rodríguez como tutor. Realizada en el Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (CIAM) - Instituto Galego de Calidade Alimentaria (INGACAL) de la Xunta de Galicia. AUTORIZA: La presentación de la citada Tesis Doctoral, realizada por D. Julio Enrique López Díaz, dado que considero que reúne las condiciones necesarias para su defensa. Y, para que así conste, a los efectos oportunos, expide el siguiente certificado en Mieres a 30 de octubre de 2009. Fdo: Jose Alberto Oliveira Prendes El Tutor del Departamento de Producción Vegetal Antonio Rigueiro Rodríguez AGRADECIMIENTOS Deseo expresar mi agradecimiento a las instituciones y organismos que han contribuido a la realización de este trabajo aportando financiación y medios para la elaboración de esta tesis: Al Instituto Nacional de Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) por la financiación de la beca predoctoral que dio lugar a esta tesis doctoral. Al Centro de Investigaciones Agrarias (CIAM – INGACAL), por haberme proporcionado los medios técnicos y humanos necesarios para el trabajo de campo y de laboratorio. Al Dpto. de Producción Vegetal de la Universidad de Santiago de Compostela (USC), por acoger este trabajo. También deseo expresar mi agradecimiento a todas las personas que de distintas formas han colaborado en este trabajo: Al Dr. Jose Alberto Oliveira Prendes, por haberme iniciado hace años en la Investigación Científica y por su inestimable ayuda e invalorable apoyo en todo momento en la dirección de esta tesis. Al Dr. Antonio Riqueiro Rodríguez, por la tutoría de este trabajo A la Dra. Rosa Mosquera Losada por acoger este trabajo en el Dpto de Producción Vegetal de la USC. Al D. Juan Castro Insua, Director del CIAM, por haberme animado continuamente a finalizar el trabajo, proporcionándome siempre medios y tiempo. A D. Juan Piñeiro Andión, Director del Dpto de Pastos y Cultivos del CIAM, por su apoyo y orientaciones en el trabajo de campo. A todo el personal de campo del CIAM que trabajó en la implantación y mantenimiento de los ensayos, así como a todo el personal de laboratorio por la ayuda con los equipos. DEDICATORIA A mi familia, especialmente a mi madre quien tanto hubiera disfrutado con este trabajo, y a mis hermanas por su apoyo. 16 ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS *, **, ***: significativo al nivel 5, 1 y 0,1% respectivamente A: número medio de alelos por locus ACP: análisis de componentes principales Acp-1: fosfatasa ácida AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism ahb: anchura de la hoja bandera ain: abundancia de inflorescencias alp: altura de la planta alt: alternatividad ANOVA: análisis de varianza Blq: bloque : test chi-cuadrado CIAM: Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo clu: clúster cre: crecimiento en espigado cri: crecimiento de invierno CRi: contribución relativa a la inercia de puntos crp: crecimiento de primavera crt: crecimiento total crv: crecimiento de verano CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas CT: colección total DST: diversidad genética entre subpoblaciones enf: tolerancia a enfermedades FAO: Food and Agriculture Organization Fec. Rec.: fecha de recolección fes: fecha de espigado FIS: déficit relativo de heterocigotos en relación con cada sub-población FIT: déficit de heterocigotos relativo en la población total FST: índice de fijación FV: fuente de variación GL: grados de libertad hcr: hábito de crecimiento Ho: heterocigosidad media observada Hp: heterocigosidad media esperada en panmixia Hs: heterocigosidad media esperada IBPGR: International Board for Plant Genetic Resources INGACAL: Instituto Galego de Calidade Alimentaria INIA: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria IPGRI: International Plant Genetic Resources Institute ISSR: Inter Simple Sequence Repeat Lat.: latitud lhb: longitud de la hoja bandera Long.: longitud M1: método 1 M2: método 2 M3: método 3 M4: método 4 M5: método 5 M6: método 6 MAPA: Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación MBG: Misión Biológica de Galicia ns:no significativo PAC: Política Agraria Comunitaria Pex-1: peroxidasa Pgi-2: fosfogluco-isomerasa Pgm-1: fosfogluco-mutasa Pobl.: población prec: precocidad res: reespigado Sdh-1: shikimato deshidrogenasa Sig.: significación SPR: semipartial R square USC: Universidade de Santiago de Compostela Var. acum.: varianza acumulada Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca – Lolium. Tesis Doctoral. J. E. López Diaz. 17 ESTRUCTURA DE ESTA TESIS DOCTORAL En el presente trabajo se investigan cuestiones prácticas de manejo en los bancos de germoplasma, mediante estudios agronómicos, técnicas estadisticas y marcadores isoenzimáticos. En el CAPÍTULO I se realiza una caracterización agronómica de accesiones de tres especies forrajeras de gramíneas que se conservan en el Banco de Gramíneas pratenses del CIAM – INGACAL. Se trata de un trabajo agronómico descriptivo sobre un total de 74 accesiones de raigrás inglés, 42 de raigrás italiano, y 24 de festuca alta, junto a diversos cultivares comerciales. En el CAPÍTULO II se comparan diversos procedimientos matemáticos para la creación de colecciones nucleares representativas de las colecciones anteriormente estudiadas en el capítulo anterior, mediante técnicas multivariantes, métodos aleatorios e índices de diversidad. Finalmente en el CAPÍTULO III se investiga la conservación de la diversidad genética mediante la creación de poblaciones heterogéneas o “pools” por cruzamiento de grupos agronómicamente similares en una selección de poblaciones de raigrás italiano. 18 Estudio de los recursos fitogenéticos del complejo Festuca – Lolium. Tesis Doctoral. J. E. López Diaz. 19 RESUMEN Entre los años 1985 y 1997 se llevó a cabo una recolección de gramíneas pratenses de las especies de raigrás inglés ( Lolium perenne L . ), raigrás italiano ( Lolium multiflorum Lam . ) y festuca alta ( Festuca arundinacea Schreb.) realizada principalmente en la España húmeda. Se obtuvieron 140 poblaciones viables de un total de 187 recolectadas, y que actualmente se conservan en el banco de germoplasma de especies pratenses del Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (CIAM – INGACAL). Las 140 entradas fueron evaluadas agronómicamente mediante 13 descriptores agronómicos y el índice de diversidad de Shanon-Weaver durante los años 1998-2000. Se evaluaron en total 74 poblaciones de raigrás ingles, 42 de raigrás italiano y 24 de festuca alta, junto con algunos cultivares comerciales de las tres especies. Con los datos obtenidos, sobre las colecciones base se compararon seis métodos para crear colecciones nucleares. También se realizo un estudio sobre la conservación de la diversidad mediante la creación de poblaciones heterogéneas o pools genéticos respecto a la multiplicación individual de muestras. Para ello se multiplicaron en panmixia dos grupos de características agronómicas similares de L. multiflorum y se analizaron las descendencias resultantes mediante caracteres agronómicos y análisis de isoenzimas mediante técnicas de electroforesis en gel de almidón. Las colecciones de partida presentaron una gran variabilidad agromorfológica, y varias poblaciones tuvieron un mejor comportamiento agronómico que las variedades comerciales, tanto en rendimientos como en resistencia a enfermedades. Los cultivares de raigrás inglés creados a partir de material autóctono de Galicia, superaron al resto de variedades. En las colecciones de raigrases, las poblaciones más productivas fueron las más tardías, provenientes de zonas similares a la localidad de ensayo, mayoritariamente gallegas. En festuca alta las más productivas fueron las más precoces. 20 Para la creación de colecciones nucleares, los métodos multivariantes mostraron ser más eficaces que los de selección al azar. El método que mejor conservó la diversidad en ambas colecciones nucleares fue el de mayor contribución a la inercia de la nube de puntos, conservando respectivamente para el raigrás inglés y raigrás italiano un 87% y un 93% de los coeficientes de retención sobre las colecciones de partida. Las poblaciones heterogéneas creadas por multiplicación en panmixia conservaron en general la diversidad agronómica de las poblaciones originales, sin embargo se observó la pérdida de algún alelo raro. El material estudiado se considera interesante tanto para la preservación de la diversidad autóctona almacenada, como para el uso de estas colecciones en futuros programas de mejora genética para la creación de cultivares adaptados a las localidades de origen. Lámina original de Festuca arundinacea Schreb. según Stebler et al ., 1894a. CAPÍTULOI Evaluaciónagronómicadelas coleccionesdepartidaderaigrás inglés,raigrásitalianoyfestucaalta. 22 Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 23 CAPÍTULO I: Evaluación agronómica de las colecciones de partida de raigrás inglés, raigrás italiano y festuca alta 1. INTRODUCCIÓN La existencia de la vida en la Tierra fue confirmada por Hoashi et al ., (2009), hace 3.460 millones de años, en rocas del Cratón de Pilbara (Australia), 800 millones de años antes de lo que se pensaba a principios de este siglo. Desde entonces, los procesos de la evolución han originado una compleja pluralidad de formas de vida, que fueron adaptándose a las diferentes condiciones de su medio ambiente. Esta variabilidad genética acumulada se ha ido extendiendo y equilibrando en el planeta, y constituye nuestra actual diversidad biológica o biodiversidad, término acuñado por primera vez en 1986, durante el Foro Nacional sobre Biodiversidad de Washington. Los homínidos hicieron su aparición en un momento muy reciente en términos geológicos, hace unos seis millones de años. Según el registro fósil, el hombre de Neandertal se extinguió hace unos 25.000 años, con lo que el Homo sapiens sapiens pasó a ser la única especie humana, y ya podemos referirnos a él simplemente como "el hombre". No supuso una gran influencia en la evolución del resto de seres vivos, pero cuando hace unos 10.000 años, el hombre descubre la agricultura, comienza a contribuir de manera decisiva en la evolución de las especies que cultiva y del medio ambiente en que vive. El proceso de colonización humana en la Tierra extendió la agricultura, y muchos genes, genotipos y poblaciones de plantas cultivadas, se difundieron por los cinco continentes desde la antigüedad. A partir de las primitivas zonas de origen, los cultivos fueron expandiéndose, y evolucionaron en los distintos ambientes por la presión de la selección natural y por el desarrollo de las prácticas agrarias. Más tarde las rutas 24 comerciales y la diversificación de las culturas, originaron innumerables razas o poblaciones locales que sirven como base genética de la agricultura moderna. La expresión biodiversidad agrícola tiene un amplio significado, que contiene todos los aspectos de la biodiversidad relativos a la alimentación y la agricultura, así como los demás componentes que constituyen un agroecosistema. Es decir, que comprende las variedades y la variabilidad de animales, plantas y microorganismos, que son necesarios para mantener la sostenibilidad de los sistemas agrícolas. Dentro de este conjunto, los “ recursos fitogenéticos ” comprenden la diversidad genética correspondiente al mundo vegetal que se considera poseedora de un valor real, o potencial, para el presente o el futuro. La pérdida de estos recursos se considera un proceso irreversible que supone una grave amenaza para la seguridad alimentaria con posibles repercusiones a escala mundial (Martín, 2001). La diversidad que contienen los recursos fitogenéticos suministra la base para adaptar los cultivos a ambientes diferentes y a los requerimientos de la agricultura moderna. Por eso, los esfuerzos de conservación y mejora pueden contribuir a hacer frente a algunos retos de sostenibilidad ambiental relacionados con la agricultura. Pero hasta las últimas décadas, no se había reconocido en los foros internacionales el valor intrínseco de tal diversidad biológica y de sus componentes, valores que comprenden aspectos ecológicos, genéticos, socioeconómicos, científicos, culturales, recreativos y estéticos. Por tanto se originó una preocupación internacional por la conservación de tales recursos como consecuencia de la degradación que estaban sufriendo por las actividades antrópicas y sus repercusiones en el medio ambiente. No obstante, en los últimos 200 años la homogeneización de los hábitos alimenticios y la simplificación de los sistemas agrícolas han reducido el número de cultivos y también la heterogeneidad de los mismos, tanto que, a finales de siglo XX, se estimó que a nivel mundial el 90% de la alimentación estaba basada en tan solo unas 30 especies vegetales (FAO, 1996). Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 25 La utilización de un estrecho abanico de cultivares, más productivos y adaptados a las condiciones de comercialización de la sociedad actual, ha ido desplazando paulatinamente a muchos cultivares tradicionales, menos productivos, pero más adaptados a su ambiente y poseedores de una gran diversidad genética. Como consecuencia, los nuevos materiales vegetales suministrados por la agricultura moderna, destruyen la propia fuente de diversidad genética que utilizan los fitomejoradores (Martín, 2001), existiendo un mayor riesgo de erosión genética , definida como la pérdida de diversidad, incluyendo la pérdida individual de genes, y un mayor riesgo de vulnerabilidad genética , definida como la condición de un cultivo cuando es uniformemente susceptible a un patógeno o plaga (National Research Council, 1972). Según Iriondo, (2001), la principal causa de erosión genética es la sustitución de las variedades tradicionales por cultivares modernos, seguida de la degradación de los ecosistemas. A pesar de los progresivos esfuerzos de conservación iniciados durante los últimos años, el creciente deterioro de los espacios naturales ha ocasionado que a escala mundial se encuentren actualmente amenazadas el 12,5% de las más de 250.000 especies vegetales conocidas (Walter y Gillett, 1998). En España en la década de los 80, Barreno et al ., (1984) constataron que 1.095 taxones de la flora vascular española estaban amenazados o extintos. En el año 2000, según datos del Ministerio de Medio Ambiente (Ministerio de Medio Ambiente, 1999; VV.AA., 2000), de las casi 10.000 especies y subespecies inventariadas, un total de 1.149 se consideraron amenazadas, más otras 265 que hubieron de dejarse dentro de la categoría DD (Datos Insuficientes). En 2008 se publicó la Lista Roja de Especies Amenazadas (Moreno, 2008), que ampliaba a 1.221 el número de especies en peligro o de interés especial. En esta lista Galicia figuraba con 117 taxones amenazados. Hasta bien entrado el siglo XX no se tuvo conciencia del estrechamiento que estaba sufriendo la base genética de las especies cultivadas. Fue a partir de los años sesenta, cuando la comunidad científica reconoció que todos los cultivos 32 Lolium multiflorum Lam. Lolium perenne L. Lolium rigidum Gaud. Lolium temulentum L. Lolium remotum Scrank. Lolium canariense Steud. Lolium persicum Boiss. & Hohen. ex Boiss. Lolium subulatum Vis. Otras especies descritas en los últimos años dentro del género son: Lolium grandispicum Fei, descrita como nueva especie en Hubei (China) por Fei (1999), L. edwardii Scholz, endémica de las Islas Canarias (Scholz et al ., 2000), L. loweii Menezes, descrito en Madeira como Arthrochortus loliaceus Lowe. Para Terrel (1968) es sinónima de L. rıgidum y semejante a L. subulatum y L. grandispicum . Y por último la recientemente descrita Lolium saxatile Scholz, endémica de Fuerteventura (Islas Canarias) y semejante a L. multiflorum (Scholz y Scholz, 2005). Las ocho especies citadas por Terrel son diploides (2 n = 14). L. multiflorum , L. perenne y L. rigidum son alógamas autoincompatibles, el resto son autógamas. Las especies alógamas son interfértiles entre sí, por lo que Naylor (1960), y posteriormente Bulinska-Radomska y Lester (1986), propusieron que deberían estar agrupadas en una única especie y ser consideradas como subespecies, sugerencia también propuesta por Jauzein (1995). Las especies L. perenne y L. multiflorum presentan una gran variabilidad de formas, debido principalmente a que se cultivan en todo el mundo, y a que su distribución natural es prácticamente cosmopolita. El área de expansión natural de L. rigidum corresponde a zonas mediterráneas con un largo periodo de sequía estival, y es utilizada para pastoreo invernal en zonas de clima mediterráneo, y también en zonas del sur de Australia. La distribución natural de L. persicum se encuentra restringida al sudeste asiático, L. subulatum se localiza en la zona este del Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 33 Mediterraneo y L. canariense es exclusivo de algunas islas del Atlántico (Canarias, Madeira y Cabo Verde). El hábitat natural de L. temulentum y L. remotum es más restringido y únicamente se suelen encontrar como malas hierbas de cultivos de cereales y de lino. Las especies del género Festuca presentan un mayor rango de ploidía que los raigrases, apareciendo en la naturaleza desde especies diploides hasta decaploides, siendo la mayoría de ellas alógamas y perennes. Es uno de los mayores géneros de la familia Poaceae , con más de 400 especies (Clayton y Renvoice, 1986; Watson y Dallwitz, 1992). El trabajo clásico sobre Festuca en Europa es el de Hackel (1882) en el cual se presenta también una propuesta de clasificación subgenérica. Markgraf-Dannemberg (1980), reconoció en Europa 170 especies y 219 taxones. Algunos estudios posteriores de referencia en Europa se deben a Kerguélen y Plonka (1989), Portal (1999), y Foggi et al ., (2003), entre otros. En España actualmente está sufriendo una profunda revisión dentro del proyecto “Flora Ibérica” (http://www.floraiberica.org). Según Cebolla y Rivas (2003), se reconocen 105 taxones y 76 especies para toda la Península Ibérica. Debido a su adaptabilidad a distintos medios es un género que frecuentemente tiende a formar endemismos. En Galicia, Gutiérrez et al ., (1997), citaron una especie endémica: Festuca brigantina subsp. actiophyta Gutiérrez Villarías, catalogada actualmente como vulnerable en el Libro Rojo de Especies Amenazadas (Moreno, 2008). Otro endemismo gallego: F. summilusitanica Franco & R. Afonso, fue separada de F. gredensis Fuente & Ortuñez, por De la Fuente y Ortúñez (2000), quedando incluída en el Catálogo de Plantas Endémicas y Subendémicas de Galicia (Silva-Pando, 2008). Existen muchas similaridades entre los géneros Lolium y Festuca , que han sido ampliamente comentadas por muchos autores (Borrill, 1976; Stebbins, 1956; Terrel, 1966, Momotaz et al ., 2004). Estudios inmunoquímicos confirmaron la proximidad entre el género Lolium con F. altissima , F. gigantea y F. pratensis (Butkute y Konarev, 1980). Diversos estudios del ADN cloroplástico (Lehvaslaiho 34 et al ., 1987; Darbyshire y Warwick, 1992) encontraron grandes similaridades entre L. multiflorum , F. arundinacea y F. pratensis , estas dos últimas clasificadas en el grupo bovinae del género Festuca . Dichos estudios sugieren que filogenéticamente el grupo alógamo de Lolium es muy próximo a la sección bovinae del género Festuca , de hecho los híbridos interespecíficos entre L. perenne L., L. multiflorum Lam., y Festuca pratensis Huds., se encuentran con relativa facilidad en la naturaleza, y se producen fácilmente siendo indiferente el pie de planta parental (Jauhar, 1976). Bulinska-Radomska y Lester (1986) encontraron estrechas relaciones en ambos géneros mediante estudios morfológicos y proteínicos, y propusieron que el antecesor común sería muy cercano a L. perenne y F. pratensis . Dentro del género Lolium , diversos estudios han puesto de manifiesto la mayor diversidad genética de L. rigidum frente a otras especies (Charmet y Balfourier, 1994, Balfourier et al ., 1998b), lo cual sugiere que podría se el antepasado común del género. Dada la proximidad genética entre las especies de ambos géneros, los híbridos entre Festuca y Lolium ocurren con relativa frecuencia en la naturaleza en aquellas localidades donde conviven ambos géneros. En el caso de Lolium , el híbrido más frecuente es Lolium x hybridum Hausskn. ( L. perenne x L. multiflorum ), que reúne características intermedias entre ambas especies. Se han descrito otros híbridos entre Lolium y Festuca que reciben el nombre de x Festulolium (Asch. & Graebn): x Festulolium braunii (Richt.) Camus. = F. pratensis x L. multiflorum. x Festulolium loliaceum (Huds.) P. Fourn. = F. pratensis x L. perenne. x Festulolium holmberg (Dörfl) P. Fourn. = F. arundinacea x L. perenne. Tales hibridos tienen interés en el uso agrícola, ya que combinan las buenas caracteristicas nutritivas, de digestibilidad y de rendimiento de los raigrases, con la mayor persistencia y habilidad de las festucas para soportar condiciones extremas. Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 35 1. 2. FITOSOCIOLOGÍA Fitosociológicamente las especies L. perenne y L. multiflorum y F. arundinacea son representativas de la clase Molinio-Arrhenatheretea Tüxen 1937. Su presencia en Galicia es extraordinariamente abundante desde la costa hasta la alta montaña. Por esta misma razón el deslinde en asociaciones falta por estudiar en detalle para la mayor parte del territorio (Izco et al ., 2000). 1.3. UTILIZACIÓN AGRONÓMICA DEL RAIGRÁS ITALIANO, RAIGRÁS INGLÉS Y FESTUCA ALTA Los géneros Lolium y Festuca tienen una amplia utilización forrajera en la agricultura moderna. El raigrás italiano y el raigrás inglés son las especies más utilizadas en las zonas templado-húmedas de Europa y Nueva Zelanda, aprovechadas para siega (ensilado y aprovechamiento en verde), en pastoreo y también como césped. Las variedades de festuca alta, además del aprovechamiento forrajero, también tienen una amplia utilización en la implantación de céspedes, cubiertas vegetales, y otras aplicaciones no forrajeras. En Galicia, la superficie de prados naturales y pastizales es de 449.161 has, de las cuales 289.081 pertenecen a cultivos de maíz forrajero, praderas polifitas y raigrás italiano, (Consellería do Medio Rural, Xunta de Galicia, 2005). De las 6.000 t de semillas de gramíneas pratenses consumidas en España cada año, 5.000 t corresponden a los raigrases (raigrás inglés e italiano) siendo las gramíneas más utilizadas en el Norte de España para la implantación de praderas artificiales (Piñeiro y Pérez, 1992). Casi todas las semillas de gramíneas pratenses consumidas en España se importan, con la excepción del raigrás italiano, del que se produce en España algo más de la mitad de la semilla que se consume. En los últimos años la caída de los precios de la leche y la subida de los costes de fertilizantes y carburantes, han hecho que muchas explotaciones agrarias se hayan planteado una utilización más eficiente de los recursos propios para garantizar la rentabilidad agraria. Esto implica la utilización de material genético 36 bien adaptado a las condiciones locales, por tanto los mejoradores genéticos y los bancos de germoplasma desenvuelven un papel fundamental para contribuir a la estabilidad de la renta agraria y garantizar la competitividad de las explotaciones. 1.3.1. Raigrás italiano ( Lolium mutiflorum Lam.) El raigrás italiano ( Lolium multiflorum Lam.) es un terófito/hemicriptófito cuyo cultivo está ampliamente distribuido en el mundo. Actualmente se distribuye en regiones templadas y subtropicales. Crece espontáneamente en el norte de África, oeste de Asia y sur de Europa, y ha sido domesticada desde su cultivo inicial, en la antigua región de Lombardía (Italia), en el s. XIII. En España es la gramínea forrajera más utilizada. Es una planta vigorosa, anual o bianual, habitualmente usada en praderas, principalmente para siega y también para pastoreo, tanto para la alimentación en fresco como para ensilado. Debido a su gran vigor en el periodo de establecimiento, no se combina bien con otras gramíneas, pero a bajas densidades de siembra se combina bien con algunas leguminosas como el trébol violeta, produciendo una buena masa de forraje temprana. Los cultivares alternativos de esta especie, denominados de tipo ‘Westerwold’ o ‘Westerwoldicum’ se seleccionaron en Holanda en la región Westerwolde (Terrel, 1968). Estos cultivares son de crecimiento más rápido que los cultivares no alternativos, ya sean diploides o tetraploides. Al no necesitar periodo de vernalización son estrictamente anuales y florecen en el año de su establecimiento, pudiéndose combinar rotacionalmente con otros cultivos. En Galicia, la alimentación forrajera de muchas explotaciones intensivas está basada en el cultivo rotacional del raigrás italiano alternativo con otras especies forrajeras como maíz, cebada, centeno y nabos. También se han investigado algunas rotaciones con híbrido sorgo x pasto del Sudán (Piñeiro y Pérez, 2003). Los cultivares tipo ‘Westerworld’ sembrados a finales de verano o incluso antes pueden proporcionar una buena producción de forraje durante el otoño e invierno, siempre y cuando la fertilidad del suelo sea elevada. Los cultivares no alternativos se usan para la implantación de praderas de más larga duración, sembrándose a veces variedades tetraploides. Las variedades tetraploides son más productivas, presentan una mayor agresividad inicial y más resistencia a Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 37 enfermedades, pero por su mayor contenido en agua son más difíciles de ensilar que los diploides. Tales variedades tetraploides presentan también un mayor tamaño de semilla, son menos persistentes en pastoreo en siembras puras, presentan una mayor palatabilidad para el ganado y una mayor resistencia a royas. Para alimentación en fresco y para henificación se suelen recomendar las variedades tetraploides. Para ensilar, se recomiendan las variedades diploides, con menor contenido acuoso, ya que permiten el ensilado sin necesidad de aditivos. Debido a su gran vigor de establecimiento, al raigrás italiano se le puede considerar un buen herbicida al eliminar las malas hierbas espontáneas que emergen tras la siembra (Piñeiro y Pérez, 1992). No obstante este vigor de establecimiento puede resultar un inconveniente para siembras en mezcla con otras especies, ya que al cabo de dos años éstas desaparecerán en su mayoría, dejando un hueco que ocuparán malas hierbas, al haber eliminado el raigrás italiano la competencia de las otras especies de la mezcla (Muslera y Ratera, 1983). 1.3.2. Raigrás inglés ( Lolium perenne L.) El raigrás inglés ( Lolium perenne L.) es una especie perenne, que forma densos cepellones, y por su mayor resistencia al pisoteo, menos crecimiento en altura, y por su gran capacidad de ahijamiento es la gramínea más utilizada en zonas templadas para el establecimiento de praderas de larga duración, resultando ideal para utilización en pastoreo. Es originaria de las zonas templadas de Europa, África del Norte y Asia. Junto con el raigrás italiano, es el principal cultivo para pastoreo y ensilado en las zonas de climas suaves templado-húmedos de la Europa Occidental. Se cultivan algunos híbridos con raigrás italiano, los cuales tienen vida más larga y se utilizan para aumentar los rendimientos. También existen ecotipos mediterráneos de latencia estival. En el norte de España es una especie muy apreciada en praderas, ya que mantiene una vida productiva mayor que el raigrás italiano (cuatro o cinco años) y presenta unos buenos valores nutritivos de digestibilidad e ingestibilidad. Sin embargo el principal inconveniente del raigrás inglés es su sensibilidad a la sequía. En general en el Norte de España las temperaturas y el período estival seco afectan a la producción de materia seca, 38 a su distribución a lo largo del año y a su persistencia, por eso no es una especie muy cultivada en las zonas mediterráneas de la España seca. El desarrollo de variedades sintéticas tetraploides, teniendo una mayor adaptación y tolerancia a esos factores limitantes, así como una estación de crecimiento amplia, buenos rendimientos y valor nutritivo, son objetivos importantes en la mejora genética de esta especie. En Galicia su utilización agronómica es principalmente en praderas bífitas y polifitas de secano, asociándose frecuentemente con trébol blanco en las praderas bífitas (Vidal Galego et al ., 2009). En la naturaleza el raigrás inglés se asocia con hongos endofitos de los géneros Epichloë y Neotyphodium . La relación se considera mutualista, y se ha demostrado que el hongo puede proporcionar ventajas adaptativas a la planta infectada al tolerar ésta mejor la sequía y presentar una mayor resistencia ante insectos y nemátodos (Latch, 1993; West et al ., 1993). Sin embargo, como consecuencia de la asociación se pueden sintetizar diversos metabolitos secundarios que incluyen algunos alcaloides tóxicos como lolitreno B y ergovalina, que pueden producir intoxicaciones en el ganado en pastoreo como la llamada parálisis del raigrás (Fletcher et al ., 1993). Por éstas razones en los últimos años se han realizado diversos trabajos para estudiar los efectos de la asociación del raigrás inglés con hongos endofitos sobre material autóctono para mejorar el cultivo sin afectar a la calidad del forraje (Oliveira et al ., 2002a, 2002b). Además de su utilización forrajera, los raigrases ingleses tienen una amplia aplicación en el establecimiento de céspedes en mezcla con otras gramíneas, principalmente festucas finas y poas. Este tipo de variedades suelen ser diploides y producen un mayor ahijamiento, más adecuado para la formación de céspedes. Algunas variedades también se utilizan en otros usos como la recuperación de espacios degradados, taludes, en viñedos, implantación de cubiertas vegetales, etc. 1.3.3. Festuca alta ( Festuca arundinacea Schreb.) La festuca alta es un hemicriptófito perenne de larga vida, de porte alto, que forma macollas o es cespitosa cuando es pastoreada. Es originaria de Eurasia, ocurre naturalmente en Europa, África del Norte y en las zonas templadas de Asia. Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 39 Ha sido ampliamente difundida en otras zonas templadas, jugando un papel importante en los pastizales y estepas xero/mesofíticas del mundo. Su cultivo se ha extendido a otros continentes como América y Australia. En la Península Ibérica se puede cultivar prácticamente en todo el territorio. Se puede asociar bien con leguminosas y producir pastos de alta calidad, sin embargo por su mayor lentitud y dificultad de establecimiento no se combina bien con otras gramíneas. Por su menor crecimiento inicial es vulnerable a la competencia de especies más agresivas, como los raigrases, por ello se recomienda mezclarlo únicamente con dactilo, alfalfa o trébol blanco. Presenta un gran número de ecotipos que se adaptan bien a una gran variedad de suelos. Si bien su establecimiento es más lento, está bien adaptada a la sequía y puede sobrevivir en regiones con menos de 400 mm/año de precipitación y prosperar en suelos secos calcáreos. Entre las gramíneas de larga duración es la más temprana en iniciar el crecimiento primaveral, produce en verano, rebrota en otoño y dilata su ciclo hasta bien iniciado el invierno. En utilización forrajera presenta el inconveniente de una menor palatabilidad, ya que el ganado selecciona otras especies más apetecibles, produciéndose un efecto de rechazo que perjudica el rebrote de la pradera tras el pastoreo. A pesar de tolerar bien el pisoteo del ganado, su manejo pastoral es complicado, dada su tendencia a formar macollas. No se aconseja mezclarla con gramíneas más palatables si se desea realizar una explotación en régimen exclusivo de pastoreo. Debido a su rápido rebrote y a su pérdida de digestibilidad en el espigado, se recomiendan aprovechamientos intensivos y frecuentes que mantengan la planta joven. Al igual que en el caso del raigrás inglés, se ha encontrado que algunas líneas hospedan hongos endofitos que pueden proporcionar ventajas adaptativas pero que también pueden producir micotoxinas. Algunos de estos efectos en el ganado incluyen una disminución de la ganancia de peso y problemas reproductivos. Este conjunto de síntomas se denomina «festucosis» por haberse detectado primero en ganado pastando plantas de festuca infectadas por hongos endofitos (Oliveira et al ., 2002b). Diversos estudios en poblaciones de festucas 40 recolectadas en la Cordillera Cantabrica, mostraron unos porcentajes de infección moderados de en torno al 50% (Oliveira et al ., 2000). Además de la utilización forrajera, el segundo principal uso de la festuca alta es para la formación de céspedes en combinación con otras especies, ya que su capacidad de tolerar la sequía hace que se mantenga un césped verde en condiciones hídricas limitantes. Además de estos usos tradicionales, los cultivares de festuca alta, dada su variabilidad morfológica y amplitud del periodo de espigado, son poseedores de una gran diversidad genética que proporciona muchas posibilidades para otros usos no forrajeros u ornamentales como son la extensificación, diversificación y protección del medio ambiente. Algunos de estas aplicaciones son la estabilización de taludes en autopistas, vías férreas, cauces hidráulicos, la implantación de cubiertas vegetales, la cubrición de vertederos y bocas de mina, la revegetación de espacios naturales deteriorados, etc. 1.3.4. Utilización agronómica de híbridos interespecíficos e intergenéricos Los híbridos entre raigrás inglés y raigrás italiano se encuentran de forma espontánea en la naturaleza cuando ambas especies conviven, presentando características intermedias, a veces no muy bien definidas, pues dependen de la combinación de los caracteres parentales. Se han creado algunas variedades de raigrás híbrido que reúnen la persistencia y densidad del raigrás inglés con los buenos crecimientos y palatabilidad del raigrás italiano. Dependiendo del tipo de combinación existen diferencias varietales, encontrándose cultivares más bianuales y otros más perennes, en función de los retrocruces realizados. Al igual que en el caso de los raigrases anuales y perennes, los hay diploides y tetraploides. Su precocidad es también intermedia, con una producción de primer año superior a la del raigrás inglés, e inferior a la de los raigrases anuales. Los raigrases híbridos tienen un menor rendimiento invernal que el raigrás italiano, en Galicia, si se siembran en las fechas habituales, después de recoger el maíz, y a menos que las condiciones climáticas sean excepcionales para el crecimiento vegetativo, (temperaturas suaves y Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Introducción 41 pluviometría moderada) no ofrecerá aprovechamiento hasta el mes de marzo, época en la que puede ser ensilado con ciertas garantías (Vidal Galego et al ., 2009). Los híbridos de Festuca y Lolium tienen interés agrícola al combinar las caracteristicas de ambos géneros. Los mejoradores han combinado la mayor persistencia y tolerancia de las festucas con los buenos caracteres de palatabilidad, digestibilidad y rapidez de establecimento de los raigrases (Thomas y Humphreys, 1991). En su estado natural estos híbridos son estériles, por lo que los programas de mejora han estado dirigidos a eliminar la esterilidad. Los híbridos más utilizados son tetraploides derivados de L. multiflorum (4x) x F. pratensis (4x), los cuales son perennes y presentan buenos rendimientos en mezcla con raigrás italiano para utilización en praderas (Kopecký et al ., 2006). Otro grupo de híbridos incluyen cultivares creados a partir de L. multiflorum (2x) x F. arundinacea (6x). La F1 resultante es tetraploide y se retrocruza en programas de mejora con los parentales para la obtención de nuevas variedades. En el caso de retrocruces con F. arundinacea el resultado son plantas semejantes a ésta y dan lugar a variedades más productivas y de mejores características de digestibilidad que la festuca, pudiendo ser utilizados tanto en praderas en mezcla con otras gramíneas o tréboles, como en recuperacion de espacios degradados, soportando muy bien el encharcamiento (Buckner et al ., 1977; Fojtík, 1994). Los retrocruces con L. multiflorum son utilizados principalmente para ensilado por su gran capacidad de rebrote y altos rendimientos (Fojtík, 1994). 48 Código Población Fec. Rec. Provincia Lat Long Altitud 53 SANJENJO 01/06/1993 Pontevedra 42º24´ N 8º48´ O 20 54 VIMIANZO 01/06/1993 A Coruña 43º04´ N 9º02´ O 140 55 ORDENES 01/06/1993 A Coruña 43º03´ N 8º24´ O 260 56 RIAL 01/06/1993 A Coruña 43º01´ N 8º40´ O 220 57 SANTACOMBALM 01/06/1993 A Coruña 43º01´ N 8º48´ O 380 58 ABEGONDO 01/06/1993 A Coruña 43º13´ N 8º18´ O 175 59 LUARCA 01/06/1993 Oviedo 43º32´ N 6º32´ O 60 61 PRAVIA1 01/06/1993 Oviedo 43º30´ N 6º07´ O 40 62 PRENDES 01/06/1993 Oviedo 43º34´ N 5º45´ O 140 63 BAÑUGUES 01/06/1991 Oviedo 43º38´ N 5º49´ O 20 65 CANDAS 01/06/1991 Oviedo 43º35´ N 5º48´ O 90 66 PADRON1 01/06/1991 A Coruña 42º44´ N 8º40´ O 20 71 FILGUEIRA 01/06/1991 Pontevedra 42º41´ N 8º08´ O 590 73 CANICOUVA2 01/06/1991 Pontevedra 42º22´ N 8º37´ O 180 74 BERDUCIDO 01/06/1991 Pontevedra 42º21´ N 8º25´ O 470 75 PRAVIA2 01/06/1991 Oviedo 43º30´ N 6º07´ O 40 85 SILLEDALM 01/06/1986 Pontevedra 42º42´ N 8º15´ O 500 86 SAUZAL 01/05/1995 Sta.Cruz Tenerife 28º28´ N 16º26´ O 320 88 LAVEGA 01/05/1995 Sta.Cruz Tenerife 28º03´ N 17º12´ O 60 90 GODOS 01/06/1990 Oviedo 43º20´ N 5º57´ O 280 91 RIGORTIA 01/06/1990 Vizcaya 43º19´ N 2º44´ O 60 Cultivares comerciales 197 ´Vallicoportugal´ 198 ´Vitesse´ 199 ´FinulNinak´ 200 ´Exalta´ 201 ´Promenade´ Tabla 3. Datos de pasaporte de las 24 poblaciones evaluadas de F. arundinacea . Fec. Rec.: fecha de recolección; Lat: latitud; Long: longitud. Código Población Fec. Rec. Provincia Lat Long Altitud 1 INSUA 01/07/1993 Lugo 43º14´ N 7º43´ O 300 2 TORRE1 01/07/1993 Lugo 43º15´ N 7º43´ O 380 3 TORRE2 01/07/1993 Lugo 43º15´ N 7º43´ O 380 4 GOIRIZ 01/07/1993 Lugo 43º19´ N 7º37´ O 475 5 MONDOÑEDO 01/07/1993 Lugo 43º25´ N 7º22´ O 70 7 BARCIA 01/07/1993 Oviedo 43º31´ N 6º30´ O 100 10 INESPAL 01/07/1993 A Coruna 43º21´ N 8º25´ O 75 11 MERA 01/07/1993 A Coruna 43º22´ N 8º21´ O 75 12 CECEBRE 01/07/1993 A Coruna 43º16´ N 8º16´ O 100 14 UNQUERA 01/06/1986 Santander 43º22´ N 4º31´ O 20 15 ORTIGUEIRACFA 01/06/1986 A Coruna 43º39´ N 7º52´ O 20 16 AVILES 01/06/1986 Oviedo 43º37´ N 5º56´ O 20 18 BOLTAÑA 01/08/1997 Huesca 42º26´ N 0º04´ O 550 19 REGUERAL 01/08/1997 Oviedo 43º34´ N 5º47´ O 90 20 QUIROS 01/08/1997 Oviedo 43º10´ N 6º06´ O 800 21 MANZANAL 01/08/1997 León 42º35´ N 6º13´ O 1225 22 PEVIDAL 01/08/1997 Oviedo 43º35´ N 5º47´ O 60 23 ANTROMERO 01/08/1997 Oviedo 43º36´ N 5º48´ O 50 24 SALINES 01/08/1997 Oviedo 43º37´ N 5º48´ O 100 25 CAMPADETORRES 01/08/1997 Oviedo 43º34´ N 5º42´ O 200 26 PONFERRADA 01/08/1997 León 42º34´ N 6º46´ O 400 27 PIEDELORO 01/08/1997 Oviedo 43º33´ N 5º48´ O 150 Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Material y métodos 49 Código Población Fec. Rec. Provincia Lat Long Altitud 30 NAVA 01/08/1997 Oviedo 43º22´ N 5º26´ O 175 31 PERAN 01/08/1997 Oviedo 43º35´ N 5º44´ O 20 Cultivares comerciales 194 ´Tima´ 195 ´Mariscasba´ 196 ´Fawn´ En la primavera del año 1998 comenzó el establecimiento del ensayo, transplantando al campo 20 plantas aisladas de cada población. Se establecieron tres campos de ensayo independientes: uno de raigrás inglés, en el que se evaluaron 74 poblaciones, otro de raigrás italiano, en el que se evaluaron 42 poblaciones, y un tercer ensayo de festuca alta, en el que se evaluaron 24 poblaciones. Como abono se aplicaron 800 kg/ha de 8:15:15 y previamente se aplicaron 1.500 kg/ha de cal a la superficie del ensayo (90% CaCO3, 45% CaO). El diseño experimental consistió en bloques completos al azar con dos repeticiones, transplantando 10 plantas por población y bloque con 50 cm de separación entre cada línea y planta. El control pre-emergente de malas hierbas se efectuó con herbicida GOAL al 3% y el desarrollo estacional de malas hierbas se controló con ROUNDUP al 3%, protegiendo las plantas individuales con cubos para evitar el contacto con el herbicida (Figura 1) Se instaló una barrera externa de raigrás inglés ‘Brigantia’ y se cerraron los campos con malla protectora de plástico para evitar la entrada de herbívoros. En todos los ensayos se incluyeron cultivares comerciales como testigos: seis en L. perenne (‘Arion’, ‘Brigantia’, ‘Cropper’, ‘Talbot’, ‘Vigor’ y la variedad experimental ‘CiamI’), cinco en L. multiflorum (‘Exalta’, ‘Finul’, ‘Promenade’, ‘Vallico’ y ‘Vitesse’), y tres en F. arundinacea (‘Fawn’, ‘Tima’ y ‘Mariskasba’). Durante dos años consecutivos se midieron independientemente en cada ensayo las variables agronómicas detalladas en la Tabla 4. Posteriormente a cada anotación de crecimiento ( cri, crp, cre, crv ) se hizo un corte con motosegadora a 5 cm del suelo. En las variables de crecimiento se utilizó una escala de 1 a 5. Posteriormente a cada anotación se cortaron 30 plantas (seis de cada valor de la escala) y se pesó su materia seca. Con estos datos se calculó una ecuación de regresión con objeto de saber el valor cuantitativo en g de materia seca para cada 50 ij n iij PPH 2 1 log    uno de los valores de la escala. Se aplicó la misma técnica estadística para la variable fes pero contando el número de espigas en cada planta en escala de 1 a 7. En el otoño de 1998 se repusieron aquellas plantas de las dos especies perennes ( L. perenne y F. arundinacea ) que durante ese año se habían perdido por diferentes causas, se utilizaron plantas de la misma población para cubrir los huecos vacíos con objeto de que hicieran competencia a las plantas vecinas y no interferir así en la evaluación del siguiente año. Estas nuevas plantas no fueron tenidas en cuenta en las medias ni en los análisis. Tabla 4. Variables agronómicas utilizadas en la caracterización de las colecciones de L. perenne, L. multiflorum y F. arundinacea . Los puntos indican las variables que han sido consideradas en cada especie. fes : fecha espigado (número de días a partir del uno de enero); cri , crp , cre , crv : crecimientos en invierno, primavera, en espigado y en verano (g de materia seca por planta individual); alp : altura de la planta en espigado (altura total en cm); ain : nº inflorescencias (nº de espigas por planta individual); res : reespigado (0 = no reespiga, 1 = reespiga); lhb y ahb : longitud y anchura máximas de la hoja bandera (medidas en cm y en mm, respectivamente); enf : tolerancia a enfermedades (medido en escala desde 1 = sensible, hasta 5 = tolerante); hcr : hábito de crecimiento (medido en escala desde 1 = porte rastrero, hasta 5= porte erecto); alt : alternatividad (0 = no alternativa, 1 = alternativa). Variable agronómica fes cri crp cre crv alp ain res lhb ahb enf hcr alt L. perenne            L. multiflorum           F. arundinacea             2.2. ESTUDIO ESTADÍSTICO Para cada accesión se calculó la diversidad como la media del índice H de Shannon-Weaver en cada variable según la expresión, (Shannon y Weaver, 1963). donde j es la variable agronómica, P ij es la frecuencia de aparición de cada clase agronómica i para la variable j . Este índice ha sido ampliamente utilizado en ecología como medida de la diversidad de comunidades, no obstante también puede ser utilizado para estudiar la distribución de categorías de una variable Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Material y métodos 51 (Pielou, 1969; Jain et al ., 1975). Bowman et al ., (1973) observaron que este índice seguía una distribución normal en muestras grandes, y en los últimos años ha sido cada vez más empleado en el cálculo de la diversidad de entradas en colecciones de germoplasma (Jain et al ., 1975; Bekele y Bekele, 1996; Bisht et al ., 1999; Polignano et al ., 1999; Grenier et al ., 2000a; Van Raamsdonk y Wijnker, 2000; Zeng et al ., 2001), pudiendo ser empleado tanto para variables fenotípicas como para marcadores genéticos (Brown y Weir, 1983). El cómputo de la diversidad media de cada entrada se calculó como la media del índice H de las k variables estudiadas, (Furman et al ., 1997): k H H k ij   1 Los datos medios de las poblaciones se emplearon en ANOVA y en métodos estadísticos multivariantes (análisis de componentes principales, clasificación ascendente jerárquica), con el fin de identificar grupos de valor agronómico similar. Debido al carácter anual del raigrás italiano, el ensayo se repitió completamente en el segundo año, mientras que en raigrás inglés y festuca alta las plantas permanecieron en el campo durante los dos años de evaluación. Por esta razón el modelo de análisis de varianza (ANOVA), siguiendo un modelo de efectos fijos fue distinto en cada especie, siendo en el raigrás inglés y festuca alta: Yijkl=  +  i +  j + (  )ij +  k + (  )ik  ijkl y en el raigrás italiano: Yijkl=  +  i +  ij +  k + (  )ik  ijkl Donde  es la media general,  i es el efecto del año,  j es el efecto del bloque, (  )ij es la interacción entre año y bloque, (  )ik es la interacción entre año y población,  k es el efecto de la población,  ij es el efecto del bloque 52 jerarquizado a año, y finalmente  ijkl es el error. Las variables cualitativas enf y hcr se analizaron mediante el test no paramétrico de Kruskal-Wallis (Breslow, 1970). Todos los datos se analizaron mediante el paquete estadístico SAS (SAS Institute, 1999). Los valores medios de variables significativas en el ANOVA se utilizaron en un análisis de componentes principales (ACP). Con las componentes de autovalor mayor que 1, se realizó una clasificación ascendente jerárquica utilizando el método de agregación de Ward (Romersburg, 1984). Éste método minimiza las varianzas dentro de los conglomerados y las maximiza entre ellos, y ha sido el procedimiento de agregación más utilizado en colecciones de germoplasma (Johnson et al ., 1999). Debido a que la zona de recolección es relativamente pequeña, no se tuvo en cuenta el origen geográfico de cada población en la clasificación. Capítulo I - Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Resultados y discusión 53 3. RESULTADOS En conjunto las poblaciones resultaron muy variables, las variedades comerciales se comportaron más uniformemente. Los índices de diversidad medios fueron muy similares en las colecciones de raigrás inglés e italiano (2,25 y 2,24 respectivamente). La colección de festuca fue la menos diversa con un valor medio de 2,17. 3.1. RAIGRÁS INGLÉS En la Tabla 5 se muestran los datos medios de caracterización de las variables estudiadas en los dos años de ensayo. Las poblaciones en conjunto mostraron una mayor variabilidad agromorfológica que las variedades comerciales usadas como testigo. Algunas poblaciones mostraron un mejor comportamiento agronómico que las variedades comerciales. El 56% de las poblaciones tuvieron mayores crecimientos que la media de las variedades. Las poblaciones en conjunto fueron más productivas que los cultivares estudiados, y no se diferenciaron mucho en cuanto a la altura media, longitud y anchura de la hoja bandera. En general las poblaciones fueron más tolerantes a enfermedades de hoja y tuvieron más capacidad de producción de espigas. Las más productivas fueron las provenientes de A Coruña, Pontevedra, Lugo y Asturias. La variedad experimental ‘CiamI’, creada a partir de ecotipos locales, fue el testigo que tuvo un mejor comportamiento agronómico, seguido de la variedad comercial ‘Brigantia’, también originada a partir de ecotipos gallegos. Mediante la variable fecha de espigado ( fes ) se dividieron las poblaciones en dos grupos de precocidad: 1) precoz (fecha de espigado anterior al 15 de marzo) y 2) tardío (posterior al 15 de marzo). Las medias de cada grupo se muestran en la Tabla 6. Las poblaciones del grupo tardío fueron más productivas que las del grupo precoz, no diferenciándose mucho en los caracteres morfológicos estudiados (altura, longitud y anchura de la hoja bandera, hábito de crecimiento). Las poblaciones del grupo precoz tuvieron un mejor comportamiento agronómico que los cultivares precoces, mientras que en el grupo tardío no hubo prácticamente diferencias entre poblaciones y cultivares. 54 Tabla 5. Medias de los dos años de evaluación de las variables agronómicas utilizadas en la caracterización de la colección de L. perenne ; crt : crecimiento total ( cri + crp + cre ). H : índice de diversidad medio de Shanon-Weaver; prec : grupo de precocidad asignado en función de la fecha de espigado; clu : grupo de pertenencia después de aplicar la clasificación ascendente jerárquica. El resto de variables están explicadas en la Tabla 4. COD fes cri crp cre crt alp res enf lhb ahb ain hcr Hprec clu 93 146,78 14,36 33,58 86,22 134,16 74,84 0,15 3,30 13,07 4,75 140,14 2,33 2,11 2 5 95 136,08 19,56 45,78 157,81 223,15 90,23 0,00 2,36 13,60 4,77 86,38 3,63 2,22 2 2 96 131,43 12,80 25,42 104,65 142,87 87,58 0,30 3,24 14,32 5,03 126,84 3,33 2,29 1 2 97 142,49 16,88 41,88 161,45 220,21 81,09 0,16 3,51 12,83 4,79 133,33 3,33 2,17 2 6 98 147,83 31,19 68,28 216,99 316,47 82,61 0,84 4,59 13,84 5,20 155,61 2,72 2,14 2 9 99 137,22 16,96 63,12 198,03 278,11 89,71 0,50 3,72 15,37 5,13 96,67 2,88 2,49 2 4 100 136,62 16,16 35,01 111,17 162,34 86,38 0,63 3,95 15,57 4,53 166,01 2,91 2,36 2 6 101 150,23 19,14 34,18 127,71 181,02 66,37 0,24 2,86 14,05 4,92 71,39 2,55 1,99 2 8 102 151,30 25,39 56,29 167,87 249,55 74,62 0,10 4,14 11,64 4,30 104,78 2,53 2,23 2 5 103 132,93 17,88 49,20 146,08 213,17 99,65 0,79 4,18 13,56 5,08 124,04 3,58 2,22 1 6 104 134,18 13,35 38,35 156,48 208,18 99,37 0,25 2,55 19,48 6,35 92,85 2,33 1,89 1 3 105 134,86 19,62 34,15 131,21 184,98 84,16 0,25 3,45 13,70 4,66 84,72 2,54 2,38 1 4 106 134,51 12,46 24,92 105,54 142,92 82,43 0,10 3,14 14,51 4,57 78,84 3,27 2,42 1 1 109 141,97 15,23 42,49 139,75 197,47 67,05 0,00 3,20 12,18 4,62 109,58 2,32 2,27 2 5 110 144,31 14,46 44,16 163,83 222,44 78,55 0,05 3,47 13,49 4,92 98,65 2,78 2,24 2 4 111 139,12 14,21 34,54 119,96 168,70 83,66 0,16 3,62 16,79 4,85 110,00 3,43 2,29 2 2 112 131,62 13,30 44,80 124,16 182,26 87,29 0,26 3,49 13,51 4,85 90,25 2,73 2,36 1 2 113 139,46 16,92 39,18 145,90 202,01 81,01 0,24 3,83 10,90 4,13 90,32 2,86 2,20 2 5 114 138,33 12,92 37,04 154,42 204,38 91,51 0,00 2,82 13,43 4,70 90,04 3,18 2,09 2 2 115 138,72 12,17 27,53 96,09 135,79 75,47 0,00 3,08 12,63 4,95 102,28 2,88 2,24 2 1 116 135,99 11,08 44,93 124,21 180,22 83,17 0,00 3,80 11,29 4,19 116,97 3,50 2,10 2 7 117 142,73 12,58 33,89 141,98 188,44 76,88 0,32 2,77 12,36 4,44 100,22 3,38 2,33 2 7 119 140,52 22,77 54,13 142,02 218,92 90,94 0,61 3,26 13,42 5,13 115,73 3,53 2,23 2 6 120 145,22 16,62 42,51 186,14 245,27 78,04 0,07 3,74 15,40 6,08 89,08 2,50 2,22 2 4 121 145,18 23,47 42,66 148,66 214,78 70,94 0,16 3,68 11,05 4,12 88,83 2,53 2,50 2 5 122 142,44 17,81 44,69 120,54 183,03 80,50 0,39 3,40 11,75 4,75 123,80 3,06 2,32 2 7 123 138,47 21,67 38,46 109,32 169,45 93,62 1,00 3,97 16,42 6,41 83,40 3,07 2,27 2 3 124 139,71 18,90 64,43 165,65 248,97 89,06 0,53 3,29 11,67 4,58 125,68 3,29 2,19 2 6 125 140,10 16,91 27,34 106,50 150,75 73,95 0,33 3,29 10,64 4,79 148,61 2,58 2,24 2 5 126 112,87 11,72 34,43 124,92 171,07 82,70 0,21 3,06 14,00 5,92 65,92 2,82 2,29 1 1 127 116,45 8,51 27,09 122,88 158,48 88,84 0,23 3,06 15,31 5,34 69,26 3,64 2,41 1 2 128 144,79 29,64 69,27 196,86 295,78 87,71 0,63 4,26 16,27 5,36 123,00 3,00 2,33 2 9 131 137,64 18,28 36,24 124,14 178,67 87,18 0,60 3,70 12,85 4,80 93,30 2,60 2,26 2 4 132 141,72 16,50 36,31 145,47 198,29 76,93 0,15 3,26 10,76 4,22 126,00 3,50 2,30 2 7 133 140,98 23,49 58,01 192,09 273,58 88,09 0,80 4,15 14,70 5,08 122,32 2,38 2,20 2 9 134 147,82 23,57 81,23 315,96 420,76 84,19 0,00 4,09 13,88 6,11 115,23 2,57 2,15 2 9 135 134,96 13,33 41,98 165,66 220,98 94,43 0,00 3,96 14,06 4,81 90,18 3,07 2,15 1 2 136 133,10 16,64 52,41 157,24 226,30 95,84 0,47 3,20 15,08 5,61 109,90 3,82 2,42 1 2 137 132,96 16,90 62,41 221,70 301,01 105,34 0,41 3,65 16,13 5,67 115,23 3,23 2,36 1 6 139 120,51 16,22 42,63 135,06 193,91 91,53 0,26 3,34 18,81 6,58 100,63 2,46 2,53 1 3 140 118,06 12,92 43,51 106,87 163,30 90,77 0,42 3,25 16,25 5,48 103,08 3,06 2,41 1 2 141 130,48 19,51 51,78 152,24 223,54 100,28 0,63 2,96 14,38 5,11 117,90 2,92 2,18 1 2 142 126,32 15,62 31,40 143,09 190,11 88,25 0,00 3,54 18,65 6,96 117,64 3,00 2,27 1 3 143 127,41 16,91 47,75 129,01 193,68 81,90 0,00 3,00 16,60 5,65 105,20 2,58 2,51 1 3 144 137,70 18,33 50,06 152,63 221,02 87,28 0,37 4,19 12,94 5,00 115,64 3,27 2,22 2 6 147 123,14 20,75 43,42 135,68 199,85 85,08 0,05 3,42 16,57 4,95 72,63 2,50 2,51 1 3 149 132,13 20,93 50,34 150,88 222,15 85,65 0,05 3,75 14,03 5,10 104,87 2,63 2,39 1 4 155 118,23 14,34 41,13 173,42 228,89 89,01 0,00 3,10 16,62 5,55 96,95 2,40 2,07 1 3 157 145,50 18,87 45,97 163,58 228,43 73,50 0,45 3,45 12,09 4,50 110,46 2,56 2,05 2 5 Capítulo I - Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Resultados y discusión 55 COD fes cri crp cre crt alp res enf lhb ahb ain hcr Hprec clu 158 131,65 16,49 35,08 180,53 232,10 96,08 0,05 2,96 16,13 5,43 97,97 2,73 2,49 1 3 159 121,58 17,84 42,65 111,49 171,98 91,63 0,35 3,18 15,68 5,31 115,08 2,81 2,49 1 2 162 137,85 23,95 65,47 200,49 289,91 88,97 0,53 3,88 13,51 4,92 134,61 3,36 2,29 2 6 163 141,12 23,34 61,69 188,58 273,61 83,97 0,72 3,98 14,27 5,06 108,30 3,06 2,26 2 9 164 141,67 13,11 42,67 165,74 221,52 90,17 0,05 4,02 14,48 4,82 98,85 3,14 2,09 2 2 165 141,81 17,91 50,35 152,83 221,08 86,68 0,21 3,63 14,49 5,00 88,89 2,64 2,39 2 4 168 132,63 11,40 29,92 166,14 207,47 74,14 0,00 3,63 14,26 4,70 84,76 1,86 1,95 1 8 169 114,63 11,59 22,10 108,71 142,41 76,64 0,08 3,16 13,07 4,72 83,27 3,33 1,92 1 1 170 139,30 17,83 56,35 176,46 250,64 89,66 0,22 3,24 14,71 5,18 105,93 3,15 2,35 2 2 172 144,76 13,22 27,24 150,80 191,27 75,88 0,10 3,60 13,69 5,08 86,94 2,58 2,13 2 4 173 129,35 8,21 25,54 88,32 122,08 82,49 0,06 3,85 12,83 4,32 89,31 3,08 2,11 1 1 174 132,37 7,65 16,91 84,95 109,51 83,33 0,00 3,29 13,53 4,78 98,19 3,56 1,95 1 1 175 146,80 16,22 46,40 193,79 256,41 87,56 0,06 4,23 17,62 5,48 121,18 3,93 2,22 2 6 176 132,49 4,56 13,07 54,30 71,93 65,21 0,00 3,27 12,75 4,50 72,74 3,22 1,97 1 1 177 140,30 19,17 53,34 154,43 226,94 84,08 0,55 3,53 13,76 4,95 123,92 3,78 2,41 2 6 178 126,49 7,55 19,36 65,07 91,99 78,53 0,06 2,95 15,84 5,62 96,56 2,82 2,04 1 1 179 133,62 13,30 37,32 108,52 159,14 96,04 0,19 2,80 14,72 5,52 117,99 3,71 2,19 1 2 180 142,11 13,46 24,65 83,26 121,37 80,12 0,00 3,12 10,05 4,07 95,31 3,31 2,05 2 7 181 141,23 17,97 42,05 135,10 195,12 85,91 0,95 3,61 14,49 6,26 82,08 3,08 2,31 2 3 182 137,99 9,80 24,48 77,96 112,24 65,27 0,00 2,38 12,81 4,55 76,48 2,40 2,27 2 8 183 132,50 11,49 30,00 113,10 154,60 84,53 0,06 3,24 11,55 4,44 91,21 2,65 2,17 1 1 184 132,99 10,30 39,86 147,82 197,98 95,63 0,19 3,13 14,15 4,93 89,19 2,89 2,38 1 2 185 124,94 18,47 42,52 112,56 173,56 89,42 0,16 3,26 16,34 6,22 96,82 3,78 2,52 1 2 186 140,04 5,29 14,55 86,30 106,14 77,00 0,06 2,93 12,49 4,67 108,70 2,50 2,16 2 1 187 132,83 6,39 20,34 70,16 96,90 75,85 0,10 2,32 15,53 5,67 118,35 2,90 2,07 1 1 Variedades comerciales ´Cropper´ 129,61 16,61 24,95 106,18 147,74 88,01 0,00 3,33 15,67 5,39 104,71 2,35 1 ´Talbot´ 147,09 11,61 33,30 124,18 169,09 81,02 0,00 2,59 16,40 5,47 129,90 3,00 2 ´Vigor´ 169,40 13,22 33,92 126,12 173,26 65,25 0,00 3,26 15,64 5,40 59,38 2,58 2 ´Arion´ 112,31 17,77 30,13 88,06 135,96 80,98 0,00 2,98 14,36 5,09 52,92 2,79 1 ´Brigantia´ 140,13 18,53 48,42 150,89 217,84 91,95 0,32 3,40 13,48 5,17 121,34 2,80 2 ´CiamI´ 147,64 29,25 70,71 218,09 318,05 83,06 0,78 4,05 13,16 4,78 154,73 2,88 2 Media total 136,28 16,17 41,07 140,76 198,00 84,25 0,25 3,41 14,17 5,09 104,07 2,95 Media (74 Pobl.) 135,89 16,03 41,14 141,18 198,35 84,46 0,26 3,42 14,12 5,08 104,09 2,97 2,25 Media (6 Varied.) 141,03 17,83 40,24 135,59 193,66 81,71 0,18 3,27 14,79 5,22 103,83 2,73 Tabla 6. División por grupos de precocidad de las poblaciones de Lolium perenne . Entre paréntesis se muestra el número de poblaciones de cada grupo. Precocidad GRUPO fes cri crp cre crt alp enf lhb ahb hcr ain Poblaciones (32) 128,38 13,98 37,04 127,92 178,94 87,86 3,28 15,26 5,35 2,99 97,30 1 Variedades (2) 120,49 17,21 27,58 96,63 141,42 84,21 3,14 15,00 5,23 2,58 82,80 Poblaciones (42) 141,72 17,93 45,37 151,38 214,68 82,01 3,56 13,44 4,89 2,99 110,23 2 Variedades (4) 151,52 17,89 46,08 154,81 218,78 81,14 3,34 14,69 5,21 2,81 125,29 56 Los datos del análisis de varianza se muestran en la Tabla 7. El ANOVA para cada variable agronómica mostró diferencias significativas en todos los casos. El test de Kruskal-Wallis también mostró diferencias significativas para las dos variables cualitativas. El efecto año fue significativo para todas las variables. Estas diferencias estuvieron principalmente marcadas por la heterogeneidad climatológica entre los años de evaluación 1999 y 2000 en la localidad de ensayo, ya que mientras el año 1999 puede calificarse como un año de precipitaciones invernales normales (345 mm desde enero a marzo), el año 2000 presentó una anormal sequía durante el mismo periodo (106 mm). Tabla 7. Cuadrados medios del análisis de varianza y test de Kruskal-Wallis para variables cualitativas en Lolium perenne ; FV : fuente de variación; GL : grados de libertad; Blq : bloque; Pobl : población; X 2 : valor del test chi-cuadrado; * : significativo al nivel 0,05; ** : significativo al nivel 0,01. Nota: en la variable ain no hubo anotación durante el primer año. FV GL Año 1 Blq 1 Año*Blq 1 Pobl 73 Pobl*Año 73 Cuantitativas fes 82172,79** 78,02 190,98* 1864,56** 193,23** cri 23485,94** 1921,04** 992,08* 857,19** 613,04** crp 46221,98** 3092,51 52,64 5496,46** 2603,07** cre 14998511,85** 32928,88* 24587,77 43513,98** 35935,21** ahb 248,63** 57,14** 33,53** 5,90** 2,60** lhb 4580,57** 110,94** 0,02 55,22** 44,29** ain --- 117,08 --- 2,62** --- alp 379806,14** 755,36 44,64 1696,99** 1076,49** Cualitativas X2 enf 314,63** hcr 190,18** Al resultar significativas las 10 variables, se emplearon todas en un análisis de componentes principales (ACP) sobre la colección total sin considerar los cultivares comerciales. El ACP explicó un 72% de la varianza, con tres componentes extraídas de autovalor mayor que 1. En la Tabla 8 se muestran las correlaciones de las variables con cada una de las componentes extraídas del ACP. El Factor 1 se relaciona con todas las variables de producción ( cri , crp y cre ), la fecha de espigado y tolerancia a enfermedades. El Factor 2 se puede definir como un eje morfológico, Capítulo I - Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Resultados y discusión 57 con el que correlacionan las variables de tamaño de la hoja bandera ( ahb y lhb ), altura de la planta ( alp ), y también la fecha de espigado ( fes ). El Factor 3 se relaciona con las variables hábito de crecimiento ( hcr ) y número de inflorescencias ( ain ). Con la clasificación ascendente jerárquica basada en las componentes se establecieron nueve grupos de poblaciones explicando un 76% de la varianza (Figura 3). También se representan las poblaciones en el espacio factorial del ACP, marcadas mediante colores que indican el grupo de la clasificación jerárquica al que pertenecen. Es de destacar el clúster 9, que integra las poblaciones más productivas y de mayor tolerancia a enfermedades, gran número de inflorescencias y buena capacidad de respigado, lo cual resulta interesante para la resiembra de la pradera. Todas las accesiones de este grupo provienen de las provincias de A Coruña y Pontevedra. Las poblaciones menos productivas y con menor tolerancia a enfermedades quedaron agrupadas en el clúster 1, estas poblaciones tambien se caracterizan por una mayor precocidad y un menor tamaño de hoja, y provienen en su mayoría de zonas más mediterráneas (Ourense, León, Cataluña y Baleares) Tabla 8. Correlaciones entre las variables agronómicas y las componentes extraídas del análisis de componentes principales en L. perenne. Para la descripción de variables ver Tabla 4. % var. acum .: % de varianza acumulada; * : significativo al nivel 0,05; ** : significativo al nivel 0,01. Variable Componente del ACP FACTOR 1 FACTOR 2 FACTOR 3 fes 0,55(**) -0,59(**) -0,12 cri 0,88(**) 0,03 -0,03 crp 0,90(**) 0,18 0,12 cre 0,85(**) 0,21 -0,06 ahb 0,10 0,87(**) -0,09 lhb 0,03 0,90(**) -0,06 ain 0,48(**) -0,18 0,44(**) alp 0,24(*) 0,66(**) 0,52(**) enf 0,72(**) -0,01 0,07 hcr -0,09 0,02 0,90(**) Autovalor 3,48 2,48 1,26 % Var. acum. 34,82 59,65 72,26 64 3.3. FESTUCA ALTA Los Datos medios de evaluación se muestran en la Tabla 13. Las poblaciones resultaron ser muy variables. Las fechas de espigado fueron en términos medios más tempranas que las de los raigrases, y además fue la especie que más dilató el período de producción de flores, llegando desde principios de febrero hasta finales de junio. La división en grupos de precocidad mostró dos grupos de 11 poblaciones precoces (anteriores al 15 de mayo) y 13 tardías (posteriores al 15 de mayo). El grupo precoz fue más productivo, presentó un mayor tamaño de planta y más reespigado, pero una menor tolerancia a enfermedades (Tabla 14). Todas las variables estudiadas mostraron diferencias significativas en el ANOVA, las variables cualitativas analizadas mediante el test de Kruskal-Wallis también mostraron diferencias significativas (Tabla 15). Tabla 13. Medias de los dos años de evaluación de las variables agronómicas utilizadas en la caracterización de la colección de F. arundinacea . crt : crecimiento total ( cri + crp + cre ), prec : grupo de precocidad asignado en función de la fecha de espigado. El resto de variables están explicadas en la Tabla 4. COD fes cri cre crp crt alt ain enf res alp lhb ahb hcr H prec clu 1 107,76 41,36 226,08 88,25 355,69 1,00 125,69 3,62 0,30 152,61 17,36 8,17 3,42 2,22 2 3 2 112,14 57,23 243,12 102,52 402,87 1,38 125,79 3,67 0,62 156,04 21,49 9,93 2,87 2,25 2 1 3 84,56 34,65 159,83 71,54 266,02 1,00 52,28 2,55 0,60 148,52 20,82 7,94 4,00 2,00 1 2 4 70,14 82,93 292,10 164,58 539,61 1,71 116,92 3,62 0,29 133,85 16,82 7,33 2,62 2,08 1 5 5 96,50 72,69 302,77 143,84 519,3 1,59 98,23 4,44 0,50 156,11 24,95 11,34 3,57 2,06 1 1 7 109,08 45,90 213,09 110,93 369,92 1,13 131,39 3,29 0,33 142,58 17,80 7,36 3,50 2,32 2 3 10 72,43 63,46 186,79 130,77 381,02 1,36 92,63 3,15 0,70 117,22 16,12 6,81 2,15 2,09 1 5 11 121,67 32,57 134,04 71,45 238,06 1,33 105,56 4,00 0,00 104,99 16,09 5,97 3,36 2,17 2 4 12 125,21 18,98 125,77 56,96 201,71 1,00 95,86 3,90 0,00 103,00 14,29 8,29 3,70 1,55 2 4 14 100,52 44,96 154,71 125,93 325,6 1,67 112,32 3,25 0,50 127,56 23,77 9,46 2,50 2,19 1 1 15 114,00 56,74 191,83 136,11 384,68 1,53 110,80 4,14 0,33 130,30 19,45 7,66 3,76 1,97 2 4 16 108,06 61,28 212,70 106,57 380,55 1,00 121,08 3,63 0,25 157,38 18,17 8,55 2,75 2,17 2 3 18 123,79 12,95 140,21 63,46 216,62 1,00 53,80 3,61 0,25 136,46 18,21 8,77 2,51 2,12 2 2 19 106,37 69,65 302,12 154,46 526,23 2,23 141,71 3,35 0,46 155,47 23,24 9,32 2,85 2,41 1 1 20 112,37 23,28 83,43 64,42 171,13 1,00 58,26 2,67 0,50 121,93 15,03 6,31 2,84 2,02 2 2 21 104,85 54,04 132,94 122,13 309,11 1,71 87,10 3,33 0,63 119,79 20,95 9,52 2,94 2,40 1 1 22 121,95 45,26 183,27 91,77 320,3 2,09 96,70 3,84 0,25 135,98 17,08 6,94 3,31 2,19 2 4 23 110,49 50,32 145,38 96,01 291,71 1,17 77,21 2,95 0,20 143,02 21,55 9,17 3,03 2,29 2 2 24 115,22 45,15 222,56 112,27 379,98 1,46 111,35 3,74 0,27 126,42 22,07 8,84 1,98 2,31 2 1 25 102,11 66,07 229,63 141,84 437,54 1,67 134,10 3,69 0,38 146,28 23,46 9,48 2,22 2,17 1 1 26 95,94 51,93 141,99 102,82 296,74 1,22 65,97 3,02 0,60 134,96 19,81 9,36 3,55 2,41 1 2 27 103,37 92,62 282,42 152,53 527,57 1,00 124,65 2,88 0,13 159,78 19,44 7,68 2,94 2,13 1 3 30 106,22 63,48 210,52 97,92 371,92 1,00 127,45 3,50 0,10 151,98 16,05 7,43 3,35 2,12 1 3 Capítulo I - Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Resultados y discusión 65 COD fes cri cre crp crt alt ain enf res alp lhb ahb hcr H prec clu 31 108,06 43,45 185,41 121,07 349,93 2,06 87,00 3,54 0,57 130,33 22,62 8,68 2,79 2,36 2 1 Variedades comerciales ´Tima´ 112,66 53,89 232,76 113,05 399,7 1,90 126,01 3,06 0,28 153,98 20,43 8,02 3,86 2 3 ´Marisc.´ 121,34 32,14 155,66 67,99 255,79 1,00 82,04 3,09 0,18 151,64 17,86 8,02 3,86 2 1 ´Fawn´ 88,66 48,84 221,40 132,66 402,9 1,90 109,16 2,79 0,70 148,58 18,10 8,66 4,08 1 2 Media total 105,76 50,59 196,76 1,41 102,63 3,42 0,37 138,77 19,37 8,33 3,12 Media (24 Pobl.) 105,53 51,29 195,95 1,39 102,24 3,47 0,37 137,19 19,44 8,34 3,02 2,17 Media (6 varied.) 107,55 44,96 203,27 1,60 105,74 2,98 0,39 151,40 18,79 8,23 3,93 Tabla 14. División por grupos de precocidad ( Prec ) de las poblaciones de Festuca arundinacea . Entre paréntesis se muestra el número de accesiones de cada grupo. Prec GRUPO fes cri crp cre crt alt ain enf alp lhb ahb hcr Poblaciones (11) 94,82 63,32 128,03 217,80 409,15 1,47 104,84 3,50 141,19 20,50 8,70 2,97 1 Variedades (1) 88,66 48,84 132,66 221,40 402,90 1,90 109,16 2,63 148,57 18,10 8,66 4,08 Poblaciones (13) 114,58 41,11 93,98 177,45 312,55 1,32 100,69 3,69 133,50 18,56 8,05 3,06 2 Variedades (2) 117,00 43,02 90,52 194,21 327,75 1,45 104,03 2,98 152,81 19,14 8,01 3,85 Tabla 15. Cuadrados medios del análisis de varianza y test de Kruskal-Wallis para variables cualitativas en Festuca arundinacea ; FV : fuente de variación; GL : grados de libertad; Blq : bloque; Pobl : población; X 2 : valor del test chi-cuadrado; * : significativo al nivel 0,05; ** : significativo al nivel 0,01. NOTA: en el segundo año no hubo anotación de la variable crp , por lo que el término de error utilizado fue Pobl*Blq. FV GL Año 1 Blq 1 Año*Blq 1 Pobl 23 Pobl*Año 23 Cuantitativas fes 1429,66** 0,19 104,42 4276,45** 150,28 cri 4109,32 10056,28** 11,59 6841,04** 2263,53 crp --- 1276,46 --- 9412,57** --- cre 5780,58 75161,49 29754,14 77658,90** 22414,92 ahb 0,93 0,07 9,11* 31,38** 0,47 lhb 5,74 169,56 61,04 172,40** 4,59 ain 846,04 10622,43 65,95 12704,05** 10174,21 alp 16814,65** 3280,01 9514,24 4526,13** 874,56 Cualitativas X2 enf 92,68** hcr 164,21** El ACP sobre la colección total explicó un 81% de la varianza con cuatro componentes. El Factor 1 se relaciona con todas las variables de producción, nº de 66 inflorescencias y altura total ( cri , crp , cre , ain y alp ). El Factor 2 se relaciona con las variables de forma de hoja ( ahb y lhb ). El Factor 3 se relaciona con la fecha de espigado y tolerancia a enfermedades ( fes y enf ) y finalmente el Factor 4 se relaciona con el hábito de crecimiento y la alternatividad ( hcr y alt ). Las poblaciones de mayor precocidad de espigado fueron las más productivas. En la Tabla 16 se muestran las correlaciones entre las variables y cada una de las componentes. La clasificación ascendente jerárquica basada en las componentes principales estableció cinco grupos explicando un 67% de la varianza. (Figura 5). Los clúster 1, 3 y 5 agruparon poblaciones más precoces y más productivas. En los clúster 2 y 4 se agruparon las más tardías y de menor producción. Tabla 16. Correlaciones entre las variables agronómicas y las componentes extraídas del análisis de componentes principales en F. arundinacea. % var. acum .: % de varianza acumulada; * : significativo al nivel 0,05; ** : significativo al nivel 0,01. Variable Componente del ACP FACTOR 1 FACTOR 2 FACTOR 3 FACTOR 4 fes -0,40 0,02 0,77(**) -0,16 cri 0,90(**) 0,12 -0,25 0,13 crp 0,80(**) 0,23 -0,18 0,44 cre 0,93(**) 0,23 0,05 0,02 alt 0,25 0,29 0,21 0,74(**) ain 0,78(**) -0,10 0,35 0,11 enf 0,17 0,03 0,87(**) 0,04 alp 0,61(**) 0,45(*) -0,15 -0,48(*) lhb 0,20 0,90(**) -0,06 0,26 ahb 0,12 0,93(**) 0,10 0,03 hcr -0,09 -0,03 0,20 -0,69(**) Autovalor 5,32 1,72 1,55 1,34 % Var. acum. 44,34 58,69 71,65 82,85 Capítulo I - Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca - Resultados y discusión 67 Figura 5. Superior: representación factorial de la clasificación ascendente jerárquica sobre las tres primeras componentes en 24 accesiones de Festuca arundinacea . Los colores representan los conglomerados del análisis clúster. Inferior: diagrama de la clasificación ascendente jerárquica, utilizando el método de agregación de Ward sobre las tres primeras componentes del ACP. S e m i - P a r t i a l R - S q u a r e d0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Id d 1 7 16 30 27 11 12 15 22 4 10 2 5 19 25 14 31 21 24 3 23 26 18 20 Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 4 Cluster 5 68 Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca – Resultados y discusión 69 4. DISCUSIÓN Si bien es cierto que la mayor parte de las accesiones estudiadas pertenecen al norte de España, es de destacar el buen comportamiento agronómico de muchas de las poblaciones gallegas en las tres colecciones, siendo las más productivas las pertenecientes a las provincias de A Coruña, Pontevedra, Asturias y Cantabria, recolectadas mayoritariamente en zonas húmedas. Las poblaciones de menores producciones proceden de localidades de condiciones más mediterráneas. Estos datos corroboran otros trabajos anteriores que indican una mayor adaptación local de las poblaciones autóctonas de gramíneas pratenses (Oliveira y López, 1999). En general se puede decir que las poblaciones tuvieron un mejor comportamiento agronómico medio que los cultivares comerciales empleados como testigo. Es de destacar el caso del raigrás inglés, donde los dos cultivares creados a partir de ecotipos autóctonos gallegos mostraron un mejor resultado que el resto de cultivares. Este mejor comportamiento implica una mayor tolerancia a enfermedades y unos mejores rendimientos, que ya había sido observado por Oliveira et al., (1997a, 1997b) en poblaciones locales de gramíneas, lo cual según Piñeiro y Pérez (1986), frecuentemente es debido a la presencia de características especiales de adaptación a una región determinada. Estos resultados son exactamente lo que se esperaría de la influencia de la selección natural, es decir, las poblaciones presentan mejores resultados cuando se evalúan en localidades con condiciones ecológicas similares a sus lugares de origen (Balfourier et al ., 1997, Oliveira y González, 2000). Los análisis multivariantes revelaron una correlación positiva del primer factor ( Factor 1 ) con todas las variables de producción tanto en los raigrases como en festuca. A la misma conclusión llegaron Oliveira y González (2000) en un estudio sobre 152 poblaciones naturales de raigrás inglés procedentes de 15 países europeos. Se puede decir que constituye un eje de crecimiento. Las variables morfológicas y de resistencia a enfermedades se correlacionaron más con los 70 siguientes factores, repitiéndose en las tres colecciones las correlaciones positivas de las variables de hoja bandera ( ahb y lhb ) con el Factor 2 . Las fechas de espigado se correlacionaron con el Factor 1 , excepto en el caso de festuca, que se correlacionaron con el Factor 3 , esto es debido a que la fecha de espigado y los crecimientos en festuca correlacionan negativamente, es decir, las mayores producciones se dieron en las poblaciones más precoces. En el caso del raigrás italiano las poblaciones del Grupo 2 fueron más productivas que las del Grupo 1 , teniendo también mayor altura, longitud y anchura de la hoja bandera. No presentaron diferencias en cuanto a tolerancia a enfermedades, ni en hábito de crecimiento. Las poblaciones pertenecientes al Grupo 1 no presentaron crecimiento en verano, y mayoritariamente proceden de las provincias de Pontevedra y Asturias. El interés de las poblaciones de este grupo es el hecho de que su precocidad les permita su inclusión como cultivo forrajero de invierno en rotación con el maíz. En el Grupo 2 es de destacar el buen comportamiento de las poblaciones de Cantabria, que superaron al mejor cultivar comercial (‘Exalta’), seguidas de algunas poblaciones de A Coruña, Lugo y Asturias. Considerando valores medios totales, los cultivares comerciales evaluados en el ensayo resultaron más productivos que las poblaciones, aunque presentaron una menor tolerancia a enfermedades de hoja, no obstante hay que tener en cuenta que en las fechas de anotación de los crecimientos de verano hay 17 poblaciones de tipo ‘westerworld’ clasificados en el Grupo 1 (precoz) que no tuvieron crecimiento alguno, por lo tanto influyen en la media general con valores cero. Ninguna de las variedades comerciales de raigrás italiano presentó crecimiento nulo en verano y todas se incluyeron en el Grupo 2 (tardío). En el caso de Festuca arundinacea , el hecho de que las poblaciones más precoces de espigado fuesen las más productivas, está de acuerdo con los datos obtenidos por Díaz et al ., (1999) en un estudio realizado en el norte de España sobre 13 variedades comerciales, donde las más precoces resultaron ser algo más productivas. La misma conclusión fue observada por Rosso et al. , (2008) en un Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca – Resultados y discusión 71 estudio de 34 accesiones, sin embargo, Paredes et al ., (1986) obtuvieron las mayores productividades en variedades tardías en una evaluación realizada en el sur de España. De las tres variedades estudiadas en este trabajo ‘MarisKasba’ (la más tardía) fue la de menor producción y ‘Tima’ (de espigado intermedio) la de mayor. Según Bertín (1988), la producción total y estacional de forraje de esta especie es diferente según se consideren materiales provenientes del norte de Europa, mediterráneos, o intermedios entre estos dos. Dado que la especie no está específicamente mejorada para zonas húmedas los datos indican que en tales zonas las variedades citadas pueden tener un comportamiento agronómico diferente del obtenido en el Sur de España, pudiendo resultar adecuado el uso de variedades creadas a partir de germoplasma autóctono (Piñeiro y Pérez, 1986). Dada la heterogeneidad climática entre los dos años de evaluación, (el primer año fue muy lluvioso y el segundo anormalmente seco), el efecto año fue significativo sobre todo en los raigrases, a los cuales afectan más los periodos secos que a las festucas. Tal efecto se observó especialmente en el raigrás italiano, ya que al implantar completamente el ensayo con plantas nuevas, la sequía del segundo año afectó a la implantación y crecimientos iniciales. En las festucas el efecto año fue en general menos significativo que en los raigrases, lo cual coincide con las observaciones de numerosos autores de una mayor tolerancia a la sequía de las festucas frente a los raigrases una vez establecidas las plantas. 72 Capítulo I – Evaluación agronómica de las colecciones base de Lolium y Festuca – Conclusión 73 5. CONCLUSIÓN Las tres colecciones de gramíneas mostraron una gran diversidad y variabilidad agronómica comparando con los cultivares comerciales. En raigrás inglés la media de los rendimientos y tolerancia a enfermedades de las poblaciones naturales superó a las seis variedades comerciales, 41 de las 74 tuvieron mejores crecimientos que la media de las variedades, provenientes en su mayoría de Galicia y Asturias. Los cultivares creados a partir de genotipos autóctonos fueron los de mejor comportamiento agronómico de los utilizados como testigo. En raigrás italiano seis de las 42 poblaciones tuvieron mejores crecimientos que la media de las variedades comerciales, todas ellas provenientes de zonas húmedas de Cantabria y Galicia. En términos globales las variedades comerciales tuvieron mejores rendimientos pero fueron más sensibles a enfermedades. En festuca alta 16 de las 24 poblaciones tuvieron mejores rendimientos que la media de las variedades. En términos globales tanto poblaciones como variedades tuvieron rendimientos similares, pero éstas últimas fueron más sensibles a enfermedades. A diferencia de los raigrases las poblaciones más productivas fueron las más precoces. Las variables agronómicas estudiadas en las tres colecciones presentaron un patrón similar en los análisis multivariantes, apareciendo un primer factor con el que se relacionan las variables de producción y dos factores con los que se relacionan las variables morfológicas. El material estudiado presenta un alto interés para la creación de variedades basadas en material genético autóctono. Hasta ahora las mayores aplicaciones de 80 colección. De esta manera no sólo se logra un manejo más ágil del germoplasma almacenado, sino que también se obtiene información adicional que puede tener una gran importancia estratégica en los programas de mejora genética (Brown y Spillane, 1999). No obstante, hay que tener en cuenta que, aunque la creación de una colección nuclear aumente el valor añadido de la colección base, sin embargo no la sustituye, y no justifica el hecho de que se desatienda la conservación de la colección total, simplemente constituye una herramienta para hacer más práctico el manejo del germoplasma y para conservar la máxima diversidad posible con pocas muestras. Brown (1989b) sugirió que una muestra al azar del 10% de la colección total conservaría un 70% de la variación total (estrategia R). Pero según el mismo Brown (1989a), sería más efectivo organizar la colección en una estructura estratificada basada en grupos de características similares y tomar muestras aleatorias basándose en diferentes criterios: una fracción constante de cada grupo (estrategia C), una proporción del grupo (estrategia P), o bien una proporción logarítmica del grupo (estrategia L). Posteriormente, Schoen y Brown (1993, 1995) propusieron dos nuevas estrategias de agrupación (H y M) basadas en marcadores e índices de diversidad genética. Estos mismos autores evaluaron la efectividad de las cinco estrategias anteriores concluyendo que la retención esperada de alelos, en orden de mayor a menor es: M>H>P>L>C>R. Las estrategias basadas en procedimientos multivariantes conllevan la agrupación de las entradas en base a descriptores de pasaporte, datos ecogeográficos, geoestadísticos, marcadores moleculares e isoenzimáticos, y también de caracteres fenotípicos. Sin embargo, requieren el empleo de información preexistente que es inviable en algunas colecciones por el elevado número de entradas que deberían caracterizarse. Peters y Martinelli (1989) compararon diferentes procedimientos de agrupación jerárquica multivariante, obteniendo como resultado que no sólo eran herramientas muy útiles para agrupar las entradas de colecciones de germoplasma, sino que además permiten Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Introducción 81 estimar el potencial de segregación de las entradas en cruzamientos. En los últimos años se ha comparado la efectividad de los métodos multivariantes frente a los métodos aleatorios para crear colecciones nucleares en diferentes cultivos (Basigalup et al ., 1995; Bisht et al ., 1999; Spagnoleti y Qualset, 1993), y en el desarrollo de colecciones nucleares de raigrás inglés por diferentes autores (Balfourier et al ., 1999; Casler, 1995). Una revisión puede observarse en Hamon et al ., (1998) y en Ortiz et al ., (1998). Casler (1995), encontró que la presión de cultivo y las condiciones climáticas pueden influir en los ecotipos silvestres de las especies cultivadas. A menudo, las prácticas de cultivo están delimitadas territorialmente por divisiones administrativas, de modo que muchos autores tienen en cuenta el factor país o región como fuente de variación genética en la creación de colecciones nucleares. Según Balfourier et al ., (1998a, 1999) las estructuras espaciales identificadas por procedimientos geoestadísticos en Lolium perenne L., son el resultado de una presión selectiva del ambiente. Monestiez et al ., (1994) encontraron estructuras espaciales en al menos, seis variables agronómicas de L. perenne en dimensiones de 120-300 km de distancia. Casi todos los estudios citados se refieren a colecciones de tamaño considerable y, debido a la amplia distribución de las poblaciones, suelen tener en cuenta el origen geográfico del germoplasma. Sin embargo, no existen muchos estudios en colecciones pequeñas de cultivos locales. En el caso de este estudio, casi todas las muestras que componen ambas colecciones de partida fueron recolectadas principalmente en el norte de España, zona en la que está ampliamente extendido el cultivo de estas dos especies para siembra de praderas (Mosquera et al ., 1999; Piñeiro, 1994). 82 Los objetivos de este trabajo son: 1) Comparar la eficacia de técnicas de creación de colecciones nucleares utilizando como material de partida dos colecciones de raigrás inglés e italiano recolectadas principalmente en el norte de España. 2) La creación de dos colecciones nucleares, para ser multiplicadas y obtener una suficiente cantidad de semilla, con objeto de renovar la máxima diversidad existente en el material de partida del CIAM. Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Material y métodos 83 2. MATERIAL Y MÉTODOS Con los datos de caracterización agronómica estudiados en el Capítulo I, se utilizaron las colecciones de raigrás inglés y de raigrás italiano para comparar diversas estrategias de creación de colecciones nucleares. No se utilizó la colección de festuca alta por tener un número reducido de accesiones. Considerando sobre todo el objetivo prioritario de mantener colecciones manejables y dinámicas, en lugar de colecciones estáticas (Brown, 1989a, 1995), se estimó oportuno fijar el número más apropiado de entradas para cumplir dicho objetivo sobre ambas colecciones de partida. Por tanto, se consideró adecuado establecer el número de poblaciones de la colección nuclear en nueve para el raigrás y seis para el raigrás italiano. Con objeto de considerar al menos una población de cada grupo, se estableció el número de grupos de la clasificación jerárquica también en nueve y seis, respectivamente para raigrás inglés y raigrás italiano. Basándose en este tamaño de muestra y para cada colección nuclear, se diseñaron seis métodos de selección de poblaciones (Figura 6). Los métodos utilizados fueron: M1) Muestreo al azar: se generaron 200 muestras independientes de tamaños 9 y 6, respectivamente para raigrás inglés y raigrás italiano, mediante un generador de números aleatorios que sigue una distribución uniforme (0-1). Por muestra se entiende cada uno de los grupos de entradas seleccionados aleatoriamente por el generador. Cada muestra se consideró como una colección nuclear independiente de la cual se calculó la media, varianza e intervalo de variación en cada una de las variables. M2) Criterio de máxima diversidad: se seleccionaron las poblaciones con mayor diversidad intrapoblacional en cada colección de partida, utilizando los caracteres agronómicos estudiados en el Capítulo I. La medida de la diversidad se 84 ij n iij PPH 2 1 log    calculó como la media del índice H de Shannon-Weaver en cada variable según la expresión, (Shannon y Weaver, 1963): donde j es la variable agronómica, P ij es la frecuencia de aparición de cada clase agronómica i para la variable j . El cómputo de la diversidad media de cada entrada se calculó como la media del índice H de las k variables estudiadas, (Furman et al ., 1997): k H H k ij   1 M3) Selección al azar dentro de cada clúster: se seleccionó una población al azar en cada clúster, y se repitió el proceso 200 veces para obtener 200 muestras de las colecciones totales. La selección se realizó mediante un generador de números aleatorios que sigue una distribución uniforme (0-1) en cada clúster. Para cada muestra se calculó la media varianza e intervalo de variación de las variables. Por muestra se entiende en este caso el conjunto de entradas seleccionadas por tantos generadores como conglomerados haya en la clasificación jerárquica de las colecciones de partida. M4) Mayor similaridad media en el clúster: se calculó la media de cada clúster para cada una de las variables. Los valores medios así obtenidos se consideran como si fuera una nueva población y se repite el análisis de componentes principales y el análisis clúster. Se selecciona la población que presente una mayor proximidad con respecto a la “población” de valores medios, determinada por el valor SPR (semipartial R-square) de la clasificación ascendente jerárquica mediante el método de Ward. Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Material y métodos 85 M5) Criterio de máxima diversidad dentro del clúster: se selecciona la población con mayor diversidad intrapoblacional de entre las posibles dentro de cada clúster, utilizando el índice medio H j del Método 2. M6) Máxima contribución a la inercia de la nube de puntos en el espacio factorial del ACP: la suma generalizada de cuadrados de un grupo de N individuos en un espacio factorial de K variables estandarizadas (media=0, varianza=1) e independientes (coeficiente de correlación=0) es igual al producto N x K. La contribución Pi de cada individuo a la inercia de la nube de puntos es: 2 1ij K j ixP    y la contribución relativa CR i de cada individuo i a la inercia de la nube de puntos está dada por: (Noirot et al ., 1996; Hamon et al ., 1998): NK P CR i i Los individuos con mayor CRi son los que más contribuyen a la inercia de la nube de puntos. Seleccionando estos individuos se obtiene una subcolección con varianzas elevadas. Los métodos M2 , M4 , M5 y M6 son determinísticos, ya que la metodología empleada especifica qué entradas se van a seleccionar según los datos de evaluación agronómica. Para cada método se obtuvo la media, varianza e intervalo de variación de las variables agronómicas medidas para comparar cada colección nuclear con la colección de partida. Las comparaciones de medias y varianzas se realizaron mediante el test no paramétrico de Wilcoxon (Wilcoxon, 1945), mediante el procedimiento NPAR1WAY del programa estadístico SAS (SAS Institute, 1999). 86 También se obtuvo una medida del porcentaje de retención de los intervalos de variación de las variables para cada método, según la expresión: (Diwan et al ., 1995) t CBR CNR retencion t in n   1 % donde R n CN es el intervalo de variación de la variable n en la colección nuclear, R n CB es el intervalo de variación de la variable n en la colección total, y t es el número de variables comparadas. La colección nuclear más representativa de la colección total se podría considerar aquella con medias inalteradas, mayores varianzas y mayores porcentajes de retención (Malosetti et al ., 2000). Las propiedades aditivas del índice H de Shannon-Weaver permiten hacer comparaciones entre distintos niveles de agrupación (Toolbert et al ., 1979), de modo que adicionalmente los seis métodos fueron comparados por su capacidad para capturar la diversidad de las colecciones iniciales. Dicha comparación se realizó mediante el cálculo del índice H en cada colección nuclear creada con respecto a la colección total sobre todas las variables, obteniéndose un índice de diversidad relativo (HR) calculado de la siguiente forma (Balfourier et al ., 1998a): )( )( CTH CCH HR  Donde )(CCH es la diversidad media de las poblaciones que componen cada colección nuclear para todas las variables agronómicas y )(CTH es la diversidad media de las poblaciones de la colección total para todas las variables Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Material y métodos 87 agronómicas. Para cada método determinístico se calculó la diversidad media de las poblaciones de cada colección nuclear. Para los métodos no determinísticos se calculó la diversidad en cada una de las 200 muestras y después se consideró el mínimo del intervalo de confianza de la distribución del índice (Balfourier et al ., 1998a, 1999). 88 Figura 6. Esquema de las seis estrategias comparadas para la creación de colecciones nucleares en raigrás inglés y raigrás italiano. 3 componentes extraídas - Test de Wilcoxon para comparar medias y varianzas con la Colección Base. - Cálculo de los coeficientes de retención de los rangos mediante: - Test de Wilcoxon para comparar medias y varianzas con la Colección Base. - Cálculo de los coeficientes de retención de los rangos mediante: COLECCIÓNES BASE DEL CIAM M3 Muestreo al azar M3 Muestreo al azar M4 Mayor similaridad M4 Mayor similaridad M5 Mayor diversidad M5 Mayor diversidad Mabegondo - A Coruña Medias de 200 muestras aleatorias en cada cluster seleccionadas por un generador con distribución Uniforme U (0, 1). Medias de 200 muestras aleatorias en cada cluster seleccionadas por un generador con distribución Uniforme U (0, 1). Selección de la población más parecida a la media de cada clúster. Selección de la población más parecida a la media de cada clúster. Las poblaciones de mayor diversidad del clúster, según el índice de Shannon-Weaver: Las poblaciones de mayor diversidad del clúster, según el índice de Shannon-Weaver: Medias de 200 muestras aleatorias, seleccionadas por un generador con distribución Uniforme U (0, 1). Medias de 200 muestras aleatorias, seleccionadas por un generador con distribución Uniforme U (0, 1). Las poblaciones de mayor diversidad de la Colección Base, según el índice de Shanon-Weaver: Las poblaciones de mayor diversidad de la Colección Base, según el índice de Shanon-Weaver: Las poblaciones de mayor contribución relativa (CRi) a la inercia de la nube de puntos en el ACP: Las poblaciones de mayor contribución relativa (CRi) a la inercia de la nube de puntos en el ACP: PiLogPH n iij 2 1    NK x CR ij K j i 2 1    PiLogPH n iij 2 1    Medias de variables agronómicas Selección del tamaño de colección Medias de variables agronómicas Selección del tamaño de colección 72% varianza 76% varianza t CBR CNR retencion t in n   1 % Caracterización agronómica durante 2 años Pi: frecuencia de cada valor en cada variable. Xij: coordenadas de cada accesión en los ejes principales. K: nº de ejes principales. N: nº de accesiones. RnCN: rango de la variable n en la Colección Núcleo. RnCB: rango de la variable nen la Colección Base. t: nº de variables Accesiones muestreadas en diversas localidades de España M6 Máxima inercia M6 Máxima inercia M2 Máxima diversidad M2 Máxima diversidad M1 Muestreo al azar M1 Muestreo al azar Análisis de Componentes Principales (ACP) Análisis Clúster Método de Ward Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 89 3. RESULTADOS 3.1. Raigrás inglés Las medias y varianzas para cada método de muestreo se pueden observar en la Tabla 17. En dicha Tabla se resaltan las varianzas que han resultado mayores en las colecciones nucleares formadas que en la colección de partida. Los métodos basados en selección por diversidad ( M2 y M5 ), extraen poblaciones que presentan una distribución más equitativa de las frecuencias de clase de las variables agronómicas, y dentro de éstas las que presentan un mayor intervalo de variación. Debido a esto, las poblaciones extraídas presentan varianzas altas. En consecuencia el conjunto seleccionado tiene una varianza media también alta, y generalmente superior a la varianza media de la colección total, ya que las varianzas individuales de las entradas seleccionadas contribuyen en mayor proporción en la colección nuclear que en la colección total. El Método seis ( M6 ) extrae las accesiones que más contribuyen a la inercia de la nube de puntos en el ACP, y por eso casi todas las varianzas son superiores a la colección total. Los métodos basados en extracción al azar ( M1 y M3 ), y el M4 , extraen poblaciones con varianzas muy similares a la colección de partida. El test de comparación de Wilcoxon (Tabla 18) no reveló diferencias significativas para medias y varianzas en ningún método; sin embargo, el coeficiente de retención de los intervalos de variación fue notablemente inferior en los métodos de selección al azar ( M1 y M3 ), que alcanzó sólo el 34 y 23% respectivamente, y resultó máximo en el M6 (87%). El resto de métodos mantuvieron coeficientes de retención aceptables. 96 Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 97 4. DISCUSIÓN Según Brown (1989b), la diversidad de las colecciones de germoplasma no está distribuida al azar y dicha diversidad presenta una estructura que puede ser representada por un modelo jerárquico, hecho también observado por Hamon et al ., (1994). Por tanto, los métodos de selección aleatoria no parecen ser adecuados cuando se conocen datos cuantitativos de la colección de partida, aunque sí pueden utilizarse cuando no se dispone de datos de evaluación/caracterización. La mayor efectividad de los métodos multivariantes en la caracterización de colecciones de germoplasma de raigrás inglés también ha sido observada por Casler (1995) y por Balfourier et al ., (1998a). En nuestro caso, aunque las comparaciones de medias y varianzas no hayan sido significativas para ningún método de muestreo, parece obvio descartar los métodos de selección al azar por los bajos coeficientes de retención observados en los intervalos de variación (Figuras 7 y 8). Las retenciones observadas en los intervalos son, por término medio, inferiores a las observadas por Malosetti et al ., (2000) en un estudio de cebada, debido probablemente al menor tamaño relativo de las colecciones nucleares frente a las colecciones de partida (en nuestro caso un 12% y un 14%, frente a un 19,5% seleccionado sobre la colección de cebada). En ambas especies el máximo porcentaje de retención en los intervalos de variación se produce en el M6 (87% y 93%, respectivamente para raigrás inglés e italiano, Tablas 18 y 20). Según Van Hintum et al ., (2000) la mayor conservación de los intervalos por esta estrategia es debida a la selección de entradas que presentan valores cercanos a los extremos en alguno de los caracteres considerados. Esta estrategia ha sido utilizada en el desarrollo de colecciones nucleares de Vigna radiata L. (Bisht et al ., 1998), de caña de azúcar (Balakrishnan et al ., 2000), de sorgo (Grenier et al ., 2000a, 2000b), de café (Hamon et al ., 1995, 1998), de Abelmoschus esculentus L. (Mahajan et al ., 1996), y de guisante (Shing et al ., 1991). 98 En las Figuras 9a y 9b se pueden observar las curvas de distribución de frecuencias en las poblaciones seleccionadas por los métodos determinísticos para algunas variables. En general, se observa un mejor ajuste de las curvas en la colección de raigrás inglés que en la de raigrás italiano. El motivo parece ser la existencia en raigrás italiano de una clara distinción de la colección de partida en dos grupos de precocidad: un grupo precoz, caracterizado por altas producciones concentradas en fechas tempranas (clúster 1, 4 y 6 de la Figura 6 del Capítulo I), y un grupo tardío, con producciones concentradas en fechas más tardías (clúster 2, 3 y 5). La fecha de espigado es crucial en el desarrollo de las plantas e influye notablemente en los caracteres de espigado medidos. La curva que mejor se ajusta a la colección total es la del M6 . Tal distinción no se aprecia tan claramente en la colección de raigrás inglés, adoptando todas las curvas una forma similar. Hamon et al ., (1998) obtuvieron curvas distintas en colecciones núcleo de cuatro cultivos diferentes, mostrando que la complejidad y la organización de las estructuras genéticas en las colecciones de partida dependen del propio cultivo. Para ambas colecciones seleccionadas por dicho método, se aprecia una mayor representación de los valores cercanos a los extremos y una menor representación de los valores cercanos a la media, debido a la presencia de menores redundancias. Grenier et al ., (2000a) también observaron este efecto, concluyendo que dicha esta estrategia no solo permite una mayor retención de la diversidad de la colección de partida, sino que además contribuye a eliminar redundancias en la colección nuclear. Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 99 Figura 9a. Curvas de distribución de frecuencias en las poblaciones seleccionadas por los métodos determinísticos para las variables fes , cre , ahb . La columna de la izquierda corresponde a la colección de L. perenne y la de la derecha a L. multiflorum . CT : colección total. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 FE S frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 30 60 130 200 325 CR E frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 3456789 AHB frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 FES frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 10 30 60 90 180 CR E frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 345678910111213141516 A H B frecuencia CT M2 M4 M5 M6 Lolium p erenn e Lolium multifloru m 100 Figura 9b. Curvas de distribución de frecuencias en las poblaciones seleccionadas por los métodos determinísticos para las variables hcr , ain , alp . La columna de la izquierda corresponde a la colección de L. perenne y la de la derecha a L. multiflorum . CT : colección total. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 12345 HC R frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 20 45 70 100 130 170 230 330 AIN frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 ALP frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 12345 HC R frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 20 40 60 80 100 120 140 160 AIN frecuencia CT M2 M4 M5 M6 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 20 40 60 80 100 120 140 160 ALP frecuencia CT M2 M4 M5 M6 Lolium p erenn e Lolium multifloru m Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 101 Si se representa la contribución relativa acumulada de cada accesión a la inercia de la nube de puntos en el ACP (Figura 10), se observa cómo al aumentar el tamaño de la colección núcleo se obtienen dos patrones distintos para cada especie. En L. perenne el incremento es gradual y se alcanza el 50% de la varianza total con un 27% de la colección total, mientras que en L. multiflorum el incremento es mayor en el origen, alcanzando con sólo un 19% de la colección de partida, la mitad de la inercia de la nube de puntos. En otras palabras, la diversidad de la colección de L. multiflorum es mayor que en L. perenne . Este hecho se puede comprobar observando los índices HR calculados para la colección total y para cada método de muestreo (Tabla 21). En dicha tabla se puede comprobar que el M6 es el que más diversidad conserva (8 variables para L. multiflorum y 6 variables para L. perenne ). Es de destacar que en L. multiflorum el segundo método más conservativo fue el M2 con 2 variables, y en L. perenne el segundo método más conservativo fue el M5 con 4 variables. Ambos métodos están basados en el índice de diversidad de Shannon-Weaver, por lo tanto esta estrategia podría ser tenida en cuenta como alternativa al M6 . Figura 10. Curva de contribución relativa (CRi) acumulada de las accesiones a la varianza total de la nube de puntos en el análisis de componentes principales en las colecciones de L. perenne y L. multiflorum 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0% 20% 40% 60% 80% 100% Tamaño relativo de la core collection % %acumulado L. multiflorum L. p erenne 102 Tabla 21. Índices de diversidad de Shannon-Weaver para las colecciones nucleares creadas en cada método y en las colecciones de partida (CT). En negrita se resaltan los valores máximos para cada método. La descripción de variables se especifica en la Tabla 4 del Capítulo I. Lolium multiflorum METODO fes crp cre crv ahb lhb ain alp enf hcr MEDIA HR (%) CT 3,081 2,193 2,234 2,131 2,918 2,354 4,071 3,604 2,221 2,240 2,705 100,00% M1 2,823 2,168 2,186 2,050 2,820 2,254 3,939 3,426 2,192 2,210 2,607 96,38% M2 3,069 2,206 2,255 2,059 3,082 2,413 4,141 3,285 2,166 2,287 2,696 99,69% M3 2,922 2,168 2,199 2,092 2,827 2,219 3,928 3,394 2,229 2,240 2,622 96,94% M4 2,898 2,184 2,186 1,946 2,818 2,188 3,758 3,406 2,255 2,269 2,591 95,80% M5 2,984 2,171 2,212 2,092 2,963 2,237 4,074 3,425 2,202 2,277 2,664 98,49% M6 2,664 2,239 2,286 2,269 3,293 2,552 3,916 3,662 2,214 2,296 2,739 101,28% Lolium perenne METODO fes crp cre cri ahb lhb ain alp enf hcr MEDIA HR (%) CT 2,289 2,171 2,109 2,199 1,997 3,743 2,547 4,133 2,131 1,947 2,527 100,00% M1 2,189 2,142 2,078 2,171 1,919 3,599 2,495 4,030 2,100 1,891 2,462 97,43% M2 2,249 2,165 2,166 2,212 2,327 3,913 2,393 4,086 2,168 1,979 2,566 101,56% M3 2,165 2,154 2,088 2,180 1,913 3,601 2,479 4,034 2,100 1,921 2,463 97,50% M4 2,259 2,210 2,003 2,192 1,697 3,442 2,521 4,128 2,118 1,867 2,444 96,72% M5 2,015 2,135 2,151 2,182 2,214 3,865 2,444 4,082 2,209 2,098 2,540 100,51% M6 2,420 2,239 2,223 2,264 1,859 3,478 2,566 4,159 2,119 1,896 2,522 99,83% La diversidad media calculada en la colección de L. multiflorum (2,705), es mayor que en L. perenne (2,527). El M4 es el que menos diversidad relativa retiene en ambas colecciones (95 y 96%), seguido de los métodos de selección al azar (96 y 97% en L. multiflorum , y 97% en L. perenne ). Las mejores retenciones se producen en los M2 , M5 y M6 . En dichos métodos se alcanzan retenciones superiores al 100%, ( M6 en L. multiflorum y M2 , M5 en L. perenne ), ello es debido a la selección de entradas con una distribución de frecuencias menos concentrada en valores próximos a la media, debido a esto la diversidad relativa es incluso mayor que en la colección de partida. Este hecho, observado por algunos autores (Balfourier et al ., 1998a, 1999; Polignano et al ., 2001), es debido a una nueva organización en las frecuencias de clase por la eliminación de las repeticiones producidas por genotipos semejantes. Según Frankel y Brown (1984), la colección nuclear debe conservar la máxima diversidad con un mínimo de redundancias y el menor tamaño posible. Consecuentemente no debe ser una copia reducida de la colección total, sino contener una nueva organización que disminuya las redundancias (Hamon et al ., 1998). La contribución relativa a la inercia de la nube de puntos se representa en la Figura 11, individualmente para Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 103 cada población en orden decreciente. En ambas colecciones se observa un punto de inflexión en la curva a partir del cual dicha contribución relativa comienza a decaer notablemente. Balakrishnan et al ., (2000), utilizaron este punto como referencia para determinar el tamaño ideal de una colección nuclear en caña de azúcar. Dicho punto coincide con los tamaños de muestra seleccionados para ambas colecciones en este trabajo. Figura 11. Contribución individual relativa (CRi) de cada accesión a la varianza total de la nube de puntos en el análisis de componentes principales en raigrás inglés (11a) y raigrás italiano (11b). El punto señalado delimita las poblaciones seleccionadas para la colección nuclear. Finalmente se muestra en la Tabla 22 los valores medios de las variables agronómicas y lugar de procedencia de las poblaciones seleccionadas por el M6 . L. perenne (11a) 0,0% 0,5% 1,0% 1,5% 2,0% 2,5% 3,0% 3,5% 4,0% 4,5% 5,0% 0 1020304050607080 Número de entrada en el ACP Cri individual L. multiflorum (11b) 0,0% 2,0% 4,0% 6,0% 8,0% 10,0% 12,0% 14,0% 0 10203040 Número de entrada en el ACP Cri individual 104 En la Figura 12 se muestra la distribución geográfica de las accesiones seleccionadas en las dos colecciones nucleares. Tabla 22. Valores medios de las variables agronómicas en las poblaciones seleccionadas por el M6 en L. perenne y L. multiflorum . Se muestran los valores medios de las colecciones de partida. Lolium perenn e Provincia COD fes cri crp cre ahb lhb ain alp en f hc r ASTURIAS 139 120,51 16,22 42,63 135,06 6,58 18,81 100,63 91,53 3,34 2,46 GRANADA 168 132,63 11,40 29,92 166,14 4,70 14,26 84,76 74,14 3,63 1,86 LA CORUNA 134 147,82 23,57 81,23 315,96 6,11 13,88 115,23 84,19 4,09 2,57 LA CORUNA 102 151,30 25,39 56,29 167,87 4,30 11,64 104,78 74,62 4,14 2,53 LEON 176 132,49 4,56 13,07 54,30 4,50 12,75 72,74 65,21 3,27 3,22 LUGO 104 134,18 13,35 38,35 156,48 6,35 19,48 92,85 99,37 2,55 2,33 MURCIA 182 137,99 9,80 24,48 77,96 4,55 12,81 76,48 65,27 2,38 2,40 PONTEVEDRA 128 144,79 29,64 69,27 196,86 5,36 16,27 123,00 87,71 4,26 3,00 PONTEVEDRA 98 147,83 31,19 68,28 216,99 5,20 13,84 155,61 82,61 4,59 2,72 Media 138,84 18,35 47,06 165,29 5,29 14,86 102,90 80,52 3,58 2,57 Colección total 135,89 16,03 41,14 141,18 5,08 14,12 104,09 84,46 3,42 2,97 Lolium multiflorum Provincia COD fes crp cre cr v ahb lhb ain alp en f hc r LUGO 47 134,90 29,65 127,0 33,88 11,2 28,08 71,72 120,8 3,78 3,92 OVIEDO 90 136,90 7,11 50,80 5,05 5,72 14,02 72,02 64,78 3,79 1,81 PONTEVEDRA 50 74,63 7,80 18,99 0,00 7,02 11,81 37,64 55,38 2,79 3,58 STA. CRUZ 86 111,65 9,91 30,42 0,00 8,03 14,39 47,71 77,30 2,11 1,91 SANTANDER 37 133,78 44,81 161,9 55,03 8,57 23,22 128,22 106,4 3,65 2,92 SANTANDER 38 134,03 36,65 137,6 60,69 8,58 22,04 83,33 114,9 3,78 3,74 Media 120,98 22,66 87,82 25,78 8,19 18,93 73,44 89,93 3,32 2,98 Colección total 112,38 19,30 67,15 17,68 7,97 17,21 71,91 84,37 3,31 3,02 Capítulo II – Elaboración de colecciones nucleares – Resultados y discusión 105 Figura 12. Esquema de la distribución geográfica de las accesiones seleccionadas para las colecciones nucleares en L. perenne y L. multiflorum . 182 168 176 90 47 139 102 134 50 98 38 37 104 128 86 ISLAS CANARIAS ESPECIE Lolium multiflorum (6) Lolium perenne (9) 112 1. INTRODUCCIÓN Los principales objetivos de los recursos genéticos y las colecciones de germoplasma son la mejora genética y la conservación de importantes, pero a menudo desconocidas características para el futuro (Guy et al. , 1989). Sin embargo, el mantenimiento de un elevado número de accesiones en tales colecciones plantea dificultades de manejo y conservación, pudiendo ser un obstáculo para su evaluación y utilización (Holden, 1984). La multiplicación de las accesiones individuales en colecciones grandes es, a menudo, costosa y resulta viable sólo con un número limitado de las mismas. De los diversos pasos implicados en la operación de conservación (recolección, multiplicación y almacenamiento), el factor más limitante es siempre la multiplicación. En especies autógamas es relativamente fácil el mantenimiento de las accesiones individuales. En especies alógamas anemófilas la necesidad de aislamiento restringe el número de accesiones que pueden ser multiplicadas en el mismo área, mientras que en especies entomófilas es prácticamente imposible el control estricto de la polinización (Guy et al. , 1989). La multiplicación es uno de los procesos más cruciales en el mantenimiento de los bancos de germoplasma, y es un paso en el que las accesiones son particularmente vulnerables a la pérdida de diversidad (Breese, 1989). Para evitar los problemas inherentes a la regeneración de entradas en colecciones grandes se ha propuesto que un número limitado y representativo de accesiones, elegidas por presentar una alta diversidad genética, pueda ser mantenido y utilizado como muestra de la colección completa. Este grupo sería denominado core collection (colección nuclear), concepto introducido por Frankel (1984), y ya discutido en el Capítulo II de éste trabajo). Sin embargo, si el propósito es utilizar los recursos genéticos directamente en mejora, el uso de poblaciones heterogéneas puede ser una alternativa para proporcionar germoplasma adaptado a los mejoradores genéticos. Este trabajo, trata de comparar la estrategia de multiplicar individualmente las poblaciones seleccionadas dentro de grupos agronómicamente similares, con la Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 113 estrategia de reagrupar dichas poblaciones por multiplicación en panmixia, con el fin de constituir unos pools con características agronómicas definidas y fácilmente utilizables en un programa de selección. Los objetivos de este trabajo fueron: 1) La creación de dos poblaciones experimentales mediante cruce en panmixia de dos grupos de accesiones agronómicamente similares. 2) La multiplicación en panmixia de las accesiones originales. 3) La comparación entre las poblaciones originales, las multiplicadas y las poblaciones experimentales mediante dos años de caracterización agronómica y mediante estudios isoenzimáticos. 114 Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 115 2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Estudio agronómico Con el fin de evaluar posibles cambios en la diversidad genética mediante marcadores agromorfológicos e isoenzimáticos en variedades locales de raigrás italiano anual, en un primer ciclo de multiplicación se escogieron cinco poblaciones pertenecientes a dos clases agronómicas creadas mediante la aplicación de métodos multivariables a una caracterización agromorfológica realizada por Oliveira et al ., (1997b). Se seleccionaron las poblaciones 59 (Luarca), 61 (Pravia) y 62 (Prendes) pertenecientes al Grupo agronómico 1 , con una fecha de espigado intermedia (finales de marzo a principios de abril, y también se seleccionaron las poblaciones 55 (Ordenes) y 66 (Padrón), pertenecen al Grupo agronómico 2 , con una fecha de espigado tardío (segunda quincena de abril). Con objeto de obtener semilla multiplicada en el otoño de 1999, las cinco poblaciones originales se sembraron en condiciones de invernadero y se transplantaron al campo en el invierno de 1998 utilizando 100 plantas por genotipo. Se usaron mallas de plástico negro para evitar malas hierbas (Figura 13a). Debido a que el raigrás italiano es una especie alógama y con polinización anemófila, las parcelas de multiplicación se aislaron mediante un cultivo de trigo autóctono gallego de caña alta, separándolas 20 metros de cualquier fuente de polen contaminante (otra parcela de multiplicación, cultivo, población natural, etc.). Al finalizar el periodo de floración, las espigas se cerraron en bolsas de papel para recoger la semilla resultante (Figura 13b), y posteriormente se guardó en cámaras de conservación con condiciones controladas de humedad y temperatura. La semilla así recolectada se etiquetó con los nombres de las poblaciones originales seguidos del sufijo “_M”, (Luarca_M, Pravia_M, Prendes_M, Ordenes_M y Padrón_M). Dentro de cada población, hay a menudo grandes diferencias en el rendimiento en semilla por planta, por lo que se suele recomendar recoger igual cantidad de semilla de cada 116 planta para tratar de evitar cambios genéticos y posibles pérdidas de alelos adaptativos (Breese y Tyler, 1981). Este método requiere unas necesidades grandes de mano de obra y debido a las limitaciones en recursos no siempre es el más utilizado. En general, la semilla se recoge en conjunto en 90-100 plantas por población. De esta manera, tras la multiplicación, la cantidad de semilla disponible por población varía de 100 a 800 gramos. En nuestro caso la semilla se recogió individualmente en todas las plantas de cada población, realizándose una mezcla equilibrada, y pesando posteriormente la misma cantidad de semilla por cada planta para que cada genotipo contribuyera con igual peso a la mezcla total. Figura 13. Detalle de los campos de multiplicación establecidos en el CIAM. Superior (13a): labores de preparación del terreno. Inferior (13b): embolsado de las plantas individuales para la obtención de semilla una vez madurada ésta. Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 117 Al mismo tiempo se establecieron dos campos más de multiplicación aislados para crear dos poblaciones experimentales mediante cruzamiento de las tres poblaciones del Grupo agronómico 1 (34 plantas por población) y las dos poblaciones del Grupo agronómico 2 (51 plantas por población). La semilla resultante se recolectó individualmente en cada una de las plantas madre y se efectuó una mezcla equilibrada, para crear los dos pools genéticos, denominados “ Pool 1 ” (mezcla de las poblaciones del Grupo agronómico 1 ) y “ Pool 2 ” (mezcla de las poblaciones del Grupo agronómico 2 ). De esta forma a finales del año 1999 se obtuvieron un total de 12 poblaciones para el estudio de la conservación de la diversidad genética (Tabla 23). Tabla 23. Poblaciones estudiadas en el ensayo de conservación de diversidad genética mediante la creación de poblaciones experimentales o “ pools ” genéticos. COD POBLACIÓN TIPO GRUPO Poblaciones originales 55 ORDENES Población original 2 59 LUARCA Población original 1 61 PRAVIA1 Población original 1 62 PRENDES Población original 1 66 PADRON1 Población original 2 Poblaciones multiplicadas 218 ORDENES_M Población multiplicada 2 219 LUARCA_M Población multiplicada 1 220 PRAVIA1_M Población multiplicada 1 221 PRENDES_M Población multiplicada 1 222 PADRON1_M Población multiplicada 2 Pools genéticos 216 POOL1 medio Población experimental 1 217 POOL2 tardío Población experimental 2 Durante el invierno de 1999-00 se sembraron bajo condiciones de invernadero las cinco poblaciones originales, las cinco poblaciones multiplicadas, los dos pools y la variedad ‘Vitesse’ como testigo. Las plantas se transplantaron al campo a los dos meses y se estableció un diseño en bloques completos al azar con cinco repeticiones utilizando 10 plantas por cada población y bloque. De esta manera, se instalaron 10 plantas x 5 repeticiones x 12 poblaciones (5 originales + 5 multiplicadas + 2 118 poblaciones experimentales) = 600 plantas en un campo de plantas aisladas, más el testigo ‘Vitesse’ con cinco repeticiones. Las plantas individuales se transplantaron a una distancia de 0,5 m entre líneas y a 0,5 m entre plantas (Figura 14). Como abonado de fondo se aplicó 8:15:15 (1000 kg de abono/ha). Debido al carácter individual de las anotaciones, el control de malas hierbas tuvo que ser muy exhaustivo para tener una mayor precisión en las anotaciones. Se practicaron varias aplicaciones de herbicida, utilizando Gramoxone al 2% y cubriendo las plantas con envases para protegerlas de la posible deriva del herbicida (Figura 1 del Capítulo I). El ensayo de campo se realizó en el Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (43º 15’ N, 8º 18’ O) en A Coruña, a 100 m de altitud y cercano a la costa. Debido al carácter anual del raigrás italiano, el ensayo se repitió completamente al año siguiente (2001), transplantado de nuevo las 12 poblaciones. Durante los años 2000-2001 se observaron los caracteres agronómicos detallados en la Tabla 4 del Capítulo I ( fes , ain , alp , hcr , enf , lhb , ahb ) y el crecimiento total anual ( crt : g de materia seca). Posteriormente a cada anotación de crecimiento se efectuó un corte con motosegadora a unos 5 cm del suelo. En la variable de crecimiento ( crt ) se utilizó una escala cualitativa de 1 a 5 y en la fecha de espigado ( fes ) se utilizó una escala cualitativa de 1 a 7. Posteriormente a cada anotación se cortaron 30 plantas (seis de cada valor de la escala) y se pesó su materia seca. Con estos datos se calculó una ecuación de regresión con objeto de saber el valor cuantitativo en g de materia seca para cada uno de los valores de la escala. Se aplicó la misma técnica estadística para la variable fes pero contando el número de espigas en cada planta. Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 119 Figura 14. Detalle de los campos de caracterización individual de las 12 poblaciones y la variedad ‘Vitesse’ establecidos en el CIAM. 2.2. Análisis estadísticos Los datos medios de la evaluación agronómica se analizaron mediante métodos estadísticos multivariantes (análisis de componentes principales, clasificación ascendente jerárquica) para identificar grupos de valor agronómico similar. El efecto multiplicación se evaluó mediante un análisis de varianza a un factor (factor multiplicación con dos tratamientos: sin multiplicación y con multiplicación), y se aplicó de manera independiente a los datos de cada año para cada variable. El modelo de análisis de varianza usado para los datos obtenidos en las plantas aisladas fue el siguiente: X ijk =  + b i + M j + (b*M) ij + ε ijk Donde: X ijk es el valor fenotípico,  es la media general, b i es el efecto bloque, M j es el efecto multiplicación, (b*M) ij es la interacción bloque x multiplicación y ε ijk es el error. El efecto bloque se consideró aleatorio. Se evaluó la significación del factor 120 multiplicación respecto a la interacción bloque x multiplicación. Las comparaciones efectuadas fueron entre: a) Las cinco poblaciones originales frente a las cinco multiplicadas (Tabla 28) b) Las poblaciones originales con sus respectivos pools (Tablas 29 y 30). Los valores medios de las variables fueron seleccionados para efectuar un test de Wilcoxon, que calcula la diferencia entre dos muestras mediante el procedimiento univariate del paquete informático SAS (SAS Institute, 1999). En este test se compararon: a) Las poblaciones originales con sus respectivos pools (Tablas 31 y 32). b) Las cinco poblaciones originales individualmente frente a las cinco multiplicadas (Tablas 31 y 32). Con las variables cualitativas hcr y enf se efectuó un test de Kruskal-Wallis (Kruskal y Wallis, 1952) para detectar diferencias significativas en las comparaciones anteriores. Todos los análisis estadísticos se efectuaron con el paquete estadístico SAS (SAS Institute, 1999). 2.3. Análisis de isoenzimas En genética de poblaciones es esencial un estudio de las causas y los efectos de la variación genética dentro y entre las poblaciones, y a pesar de que ya han sido ampliamente superados por otros enfoques más informativos basados en el ADN (como la secuenciación directa del ADN, polimorfismos de un solo nucleótido y microsatélites), aún están entre los sistemas de marcadores más rápidos y más baratos de desarrollar, y son una excelente elección de para proyectos que sólo necesitan identificar bajos niveles de variación genética (Medina et al ., 2005, Rodríguez et al ., 2009). Virk et al ., (2000) compararon experimentalmente la Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 121 capacidad de discriminación de cuatro estrategias de identificación en variedades de arroz (isoenzimas, AFLP, microsatélites e ISSR) considerando un número similar de marcadores para cada una. Ellos reportaron que a excepción de ISSR, las demás técnicas clasificaban bien las variedades de arroz, siendo las isoenzimas y los AFLP los más eficientes. Los marcadores AFLP tienen un alto poder de discriminación debido a que generan un considerable número de bandas que pueden analizarse en un único gel, sin embargo, son técnicas que incluyen mayor número de etapas y la exigencia de un alto nivel de pureza del ADN que implica un mayor consumo de tiempo y mayores costos operativos (Ferreira y Grattapaglia 1998; Lee y Henry, 2001). Para el estudio de electroforesis de isoenzimas se utilizaron entre 75 y 150 plantas de cada una de las 10 poblaciones (cinco originales y cinco multiplicadas) y de cada uno de los dos pools genéticos. Se sembraron las 12 poblaciones en bandejas de alvéolos y se mantuvieron en condiciones de invernadero. Las plantas se analizaron cuando tenían entre tres y cuatro hojas bien formadas. Se utilizaron las técnicas estándar de electroforesis en gel de almidón según Hayward y McAdam (1977), Ostergaard et al ., (1985), Oliveira y Charmet (1988a, 1988b), Greneche et al ., (1991) y Hayward et al ., (1995). Se utilizó un tampón histidina/citrato lo que permitió estudiar cinco sistemas enzimáticos: fosfogluco-isomerasa (PGI-2, E.C. 5.3.1.9.), fosfogluco-mutasa (PGM-1, E.C. 2.7.5.1.), fosfatasa ácida (ACP-1, E.C. 3.1.3.2), shikimato deshidrogenasa (SDH-1, E.C. 1.1.1.25) y peroxidasa (PEX-1, E.C. 1.11.1.7). La nomenclatura alélica y los procedimientos isoenzimáticos fueron los de Hayward et al ., (1995). En la Tabla 24 se muestran los alelos estudiados para cada locus . Las hojas cortadas se trituraron en frío entre 0º y 2ºC. Como solución de extracción se usó Tris-HCl 0,7M a pH 7,2 y mercaptoethanol al 1%. El extracto resultante se absorbió con tiras de papel Whatman nº 3, y éstas se dispusieron en soportes de tipo Bio-Rad que contenían el gel de almidón. Como marcador genético se usaron 2 líneas de Lolium temulentum , ya que es una especie homocigota para todos los sistemas (líneas 1 y 15, de 30 en total por gel). Como tampón de migración se utilizó histidina-citrato. Los geles, preparados con 30 líneas de migración, se 128 Figura 15. Diagrama de dispersión de las dos primeras componentes principales del ACP. En colores se representan los dos clúster de la clasificación ascendente jerárquica, los cuales coinciden con la clasificación agronómica inicial. Se resaltan con un círculo las dos poblaciones experimentales, que ocupan una posición intermedia entre ambas nubes de puntos. El diagrama de la clasificación ascendente jerárquica explicó un 67,05% de la varianza. En la Figura 16 se puede ver la clara separación entre los dos grupos agronómicos. Las poblaciones experimentales ocupan posiciones intermedias en ambos grupos Factor 1 2,00 1,000,00-1,00-2,00 Factor 2 3,00 2,00 1,00 0,00 -1,00 -2,00 221 Prendes_M 220 Pravia1_M 219 Luarca_M 216 Pool1 medio 62 Prendes 61 Pravia1 59 Luarca 222 Padron1_M 218 Ordenes_M 217 Pool2 tardío 66 Padrón 55 Ordenes 2 1 Cluste r Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 129 Figura 16. Diagrama de la clasificación ascendente jerárquica basada en las componentes del análisis de componentes principales. El análisis de varianza de las cinco poblaciones originales frente a las cinco multiplicadas mostró diferencias significativas solamente para la variable fes durante el segundo año de evaluación (Tabla 28). El resto de variables no mostraron diferencias. Las dos variables cualitativas enf y hcr fueron significativas durante los dos años de evaluación. Comparando las poblaciones del Grupo agronómico 1 con su respectivo pool, las variables fes y alp fueron significativas, el efecto bloque fue significativo en casi todas las variables (Tabla 29). Este efecto fue menos acusado en el Grupo agronómico 2 , en este grupo únicamente se mostraron diferencias en las variables fes y ain durante el segundo año (Tabla 30). En ambos grupos el test de Kruskal Wallis fue significativo para las dos variables cualitativas. 130 Tabla 28. Cuadrados medios del análisis de varianza para las variables agromorfológicas comparando las cinco poblaciones originales frente a las cinco multiplicadas. FV : fuente de variación; GL : grados de libertad; *, ** : significativo al nivel 5, y 1% respectivamente. El resto de variables se explican en la Tabla 4 del Capítulo I. AÑO 2000– COMPARACIÓN DE TODAS LAS POBLACIONES FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 397,57 442,52 79,12 210,96 (412) crt 3035,93 255,46 1025,03 1420,62 (421) alp 1540,79 5078,31 856,51 596,43 (402) ain 937,11 1488,85 2990,03 1995,71 (404) lhb 150,05 97,91 22,02 40,39 (397) ahb 63,64 76,44 74,05 ** 10,27 (397) Cualitativas X2 enf 67,85 ** (9) hcr 57,46 ** (9) AÑO 2001 – COMPARACIÓN DE TODAS LAS POBLACIONES FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 273,94 10666,52 ** 17,83 257,59 (463) crt 2970,82 124,98 7445,87 1870,29 (460) alp 727,77 89,41 472,01 375,01 (457) ain 2919,23 12955,41 5530,96 2516,73 (456) lhb 75,70 ** 22,68 26,85 19,11 (440) ahb 2,91 3,92 3,73 2,38 (440) Cualitativas X2 enf 48,23 ** (9) hcr 87,04 ** (9) Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 131 Tabla 29. Cuadrados medios del análisis de varianza para las variables agromorfológicas comparando las tres poblaciones originales del Grupo agronómico 1 frente a la población experimental. FV : fuente de variación; GL : grados de libertad; *, ** : significativo al nivel 5, y 1% respectivamente. El resto de variables se explican en la Tabla 4 del Capítulo I. AÑO 2000 – GRUPO AGRONÓMICO 1 FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 93,26 ** 1193,11 * 91,68 ** 13,55 (143) crt 977,02** 3935,60 482,36 198,43 (145) alp 115,83 ** 12391,71 ** 108,55 * 32,28 (133) ain 908,62 51,17 905,09 520,55 (138) lhb 28,31 ** 1,35 31,02 ** 3,54 (138) ahb 2,83 ** 1,82 2,84 ** 0,53 (138) Cualitativas X2 enf 75,52 ** (3) hcr 60,49 ** (3) AÑO 2001 - GRUPO AGRONÓMICO 1 FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 53,47 792,86 * 48,08 76,65 (184) crt 1213,37 * 146,21 667,84 275,04 (184) alp 426,521 ** 147,08 467,69 ** 101,74 (184) ain 4070,87 * 5109,68 1904,76 1497,36 (184) lhb 48,47 ** 46,36 38,56 ** 9,61 (184) ahb 2,58 1,09 3,92 1,56 (184) Cualitativas X2 enf 9,23 * (3) hcr 16,92 ** (3) 132 Tabla 30. Cuadrados medios del análisis de varianza para las variables agromorfológicas comparando las dos poblaciones originales del Grupo agronómico 2 frente a la población experimental. FV : fuente de variación; GL : grados de libertad; *, ** : significativo al nivel 5, y 1% respectivamente. El resto de variables se explican en la Tabla 4 del Capítulo I. AÑO 2000 - GRUPO AGRONÓMICO 2 FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 130,62 25,60 92,72 116,95 (115) crt 3306,99 729,93 1152,01 1682,10 (116) alp 603,01 10,71 188,41 373,09 (114) ain 1863,15 641,61 3142,49 2375,59 (108) lhb 80,27 12,79 13,48 52,56 (111) ahb 6,07 1,39 2,44 4,97 (111) Cualitativas X2 enf 3,49 (2) hcr 1,05 (2) AÑO 2001 - GRUPO AGRONÓMICO 2 FV BLQ MULT BLQ*MULT ERROR GL 4 1 4 (GL) fes 434,55 ** 3041,19 ** 73,87 157,64 (136) crt 1347,70 4693,36 3797,99 1748,47 (134) alp 507,61 1683,35 406,18 243,34 (133) ain 1766,28 17528,18 ** 128,41 2602,78 (131) lhb 41,98 153,24 62,10 ** 17,71 (121) ahb 5,65 * 18,81 5,22 2,22 (121) Cualitativas X2 enf 21,29 ** (2) hcr 26,34 ** (2) Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 133 El test de Wilcoxon no mostró diferencias en ninguna de las comparaciones del Grupo agronómico 1 (Tabla 31). Sin embargo en el Grupo agronómico 2 se mostraron diferencias significativas entre las dos poblaciones originales y sus respectivas multiplicadas, pero no entre su respectivo pool o población experimental (Tabla 32). Tabla 31. Test de Wilcoxon para las poblaciones del Grupo agronómico 1 . *, ** : Significativo al nivel 5, y 1% respectivamente. Test de Wilcoxon – Grupo agronómico 1 Originales versus Pool1 Originales versus Multiplicadas Luarca versus Pool 1 Luarca versus Luarca_M Signed Rank: -13 Pr >= |S| 0.0781 Signed Rank: 5 Pr >= |S| 0.5469 Pravia versus Pool 1 Pravia versus Pravia_M Signed Rank: -6 Pr >= |S| 0.3750 Signed Rank: 6 Pr >= |S| 0.4609 Prendes versus Pool 1 Prendes versus Prendes_M Signed Rank: -8 Pr >= |S| 0.3125 Signed Rank: 3 Pr >= |S| 0.7422 Tabla 32. Test de Wilcoxon para las poblaciones del Grupo agronómico 2 . *, ** : Significativo al nivel 5, y 1% respectivamente. Test de Wilcoxon – Grupo agronómico 2 Originales versus Pool2 Originales versus Multiplicadas Ordenes versus Pool 2 Ordenes versus Ordenes _M Signed Rank: 9 Pr >= |S| 0.2500 Signed Rank: -18 Pr >= |S| 0.0078 ** Padron versus Pool 2 Padron versus Padron _M Signed Rank: 12 Pr >= |S| 0.1094 Signed Rank: 16 Pr >= |S| 0.0234 * 134 3.2. Resultados del estudio isoenzimático Cada uno de los cinco sistemas enzimáticos reveló un locus polimórfico: PGI-2, PGM-1, ACP-1, PRX-1 y SDH-1. El patrón Lolium temulentum resultó monomórfico y homocigótico con los siguientes alelos fijados: PGI-2a, PGM-1a, ACP-1d, PRX-1d y SDH-1b. Las frecuencias alélicas de las poblaciones multiplicadas difirieron significativamente de las frecuencias de las poblaciones originales en cuatro de 15 loci polimórficos en las poblaciones del Grupo agronómico 1 y en cuatro de 10 loci polimórficos en las poblaciones del Grupo agronómico 2 (Tablas 33 y 34). Se produjo también la pérdida de los siguientes alelos raros (frecuencia < 0,05), según la clasificación de Brown (1978): el alelo “a” del locus PGI-2 de la población Padrón, el alelo “c*” del locus PGI-2 presente en la población Pravia y el alelo “d” del locus SDH-1 presente en la población Luarca y que desapareció al multiplicarla. En la Figura 17 se muestran ejemplos de algunas fotografías digitales tomadas de los sistemas enzimáticos estudiados para algunas poblaciones. Las calles número 15 y 30 siempre corresponden a la especie Lolium temulentum utilizada como marcador por ser homocigoto para todos los sistemas. Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 135 Figura 17. Fotografías digitales de los sistemas enzimáticos estudiados SDH-1 PGI-2 PGM-1 PEX-1 ACP-1 1 15 30 1 15 30 136 Tabla 33. Frecuencias alélicas en cinco loci , para las poblaciones del Grupo agronómico 1 (Luarca, Pravia, Prendes) y las mismas poblaciones multiplicadas (Luarca_M, Pravia_M y Prendes_M). El valor 2 compara la proporción de alelos en las poblaciones originales con los de las poblaciones multiplicadas. *, **, ***: significativo al nivel 5, 1 y 0,1% respectivamente; N: Número de datos. Poblaciones Luarca Luarca_M Pravia Pravia_M Prendes Prendes_M Locus Alelo N N N N N N PGI-2 98 135 111 106 103 109 A 0,000 0,000 0,005 0,005 0,000 0,000 B 0,041 0,026 0,068 0,057 0,024 0,032 C 0,098 0,085 0,072 0,094 0,068 0,087 D 0,827 0,833 0,779 0,802 0,830 0,849 E 0,036 0,056 0,059 0,033 0,078 0,032 A+ 0,000 0,000 0,009 0,009 0,000 0,000 C* 0,000 0,000 0,009 0,000 0,000 0,000 2 7,83 4,44 3,87 PGM-1 99 139 111 105 103 86 A 0,778 0,824 0,752 0,619 0,782 0,756 B 0,222 0,176 0,230 0,333 0,218 0,244 C 0,000 0,000 0,018 0,048 0,000 0,000 2 1,71 12,56** 0,33 ACP-1 99 133 114 106 102 109 A 0,081 0,004 0,039 0,024 0,078 0,060 B 0,667 0,639 0,667 0,627 0,662 0,583 C 0,187 0,293 0,259 0,288 0,230 0,344 D 0,066 0,064 0,035 0,061 0,029 0,014 2 17,89** 3,25 8,49* PEX-1 100 102 113 96 100 113 A 0,060 0,034 0,080 0,083 0,100 0,062 B 0,555 0,500 0,345 0,427 0,570 0,434 C 0,385 0,466 0,527 0,484 0,325 0,491 D 0,000 0,000 0,049 0,005 0,005 0,013 2 3,44 6,00 16,34** SDH-1 96 109 78 78 96 84 A 0,036 0 ,060 0,045 0,077 0,083 0,113 B 0,760 0,821 0,821 0,788 0,703 0,673 C 0,193 0,128 0,119 0,128 0,214 0,214 D 0,010 0,000 0,006 0,006 0,000 0,000 2 4,67 1,93 1,02 Capítulo III – Estudio de la conservación de la diversidad genética mediante poblaciones experimentales 137 Tabla 34. Frecuencias alélicas en cinco loci , para las poblaciones del Grupo agronómico 2 (Ordenes y Padrón) y la mismas poblaciones multiplicadas (Ordenes_M y Padrón_M). El valor 2 compara la proporción de alelos en las poblaciones originales con los de las poblaciones multiplicadas. *, **, ***: significativo al nivel 5, 1 y 0,1% respectivamente; N: número de datos. Poblaciones Ordenes Ordenes_M Padrón Padrón_M Locus Alelo N N N N PGI-2 140 140 142 143 a 0,014 0,061 0,039 0,000 b 0,157 0,186 0,190 0,147 c 0,211 0,179 0,127 0,059 d 0,593 0,543 0,609 0,738 e 0,021 0,021 0,032 0,052 a+ 0,000 0,000 0,004 0,003 c* 0,004 0,011 0,000 0,000 2 25,92** 12,31 PGM-1 145 153 142 119 a 0,810 0,876 0,796 0,702 b 0,190 0,124 0,204 0,298 2 4,25* 6,48* ACP-1 111 136 143 123 a 0,072 0,059 0,101 0,098 b 0,649 0,699 0,692 0,691 c 0,239 0,210 0,196 0,195 d 0,041 0,033 0,010 0,016 2 1,53 0,45 PRX-1 107 148 142 147 a 0,042 0,020 0,035 0,075 b 0,379 0,345 0,356 0,367 c 0,579 0,635 0,609 0,558 2 2,95 7,41* SDH-1 112 123 110 113 a 0,125 0,150 0,086 0,080 b 0,683 0,683 0,655 0,633 c 0,192 0,167 0,259 0,288 2 1,02 0,49 El número medio de alelos por locus , el porcentaje de loci polimórficos y las heterocigosidades medias resultaron muy similares en las diferentes poblaciones (Tabla 35). Las comparaciones entre las heterocigosidades medias por locus , observadas y esperadas asumiendo la distribución de Hardy-Weinberg (Nei, 1973) mostraron ligeras diferencias a favor de las heterocigosidades esperadas (errores estándar entre paréntesis). Por este motivo, puede haber un ligero déficit de heterocigotos en las poblaciones originales y multiplicadas. 144 Referencias 145 REFERENCIAS ABADIE, T.; MAGALHAES, J.R.; CORDEIRO, C.T.; PARENTONI, S.; DE ANDRADE, R., 1998. A classification for Brazilian maize landraces. Plant Genetic Resources Newsletter , 114, 43-44. ABADIE, T.; MAGALHAES, J.R.; PARENTONI, S.N.; CORDEIRO, C.; ANDRADE, R.V., 1999. The core collection of maize germplasm of Brazil. Plant Genetic Resources Newsletter , 117, 55-56. ARBONES, E.; OLIVEIRA, J.A., 1995. Relaciones entre características agronómicas y factores ecogeográficos en poblaciones naturales de raigrás inglés del Norte de España. 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