Aplicación de sistemas avanzados para la mejora de la calidad de productos marinos refrigerados de interés comercial
Abstract
El objetivo básico de este trabajo consistió en la aplicación de nuevos sistemas de refrigeración para la mejora de la calidad de productos marinos con alto interés comercial. De este modo, en la primera parte de este estudio se evaluó el sistema binario de refrigeración hielo líquido ozonizado para el sacrificio, refrigeración y almacenamiento de una especie representativa de la acuicultura continental (trucha arco iris). Asimismo, se evaluó el sistema de hielo líquido elaborado a partir de agua de mar ozonizada, como sistema de conservación en refrigeración para su aplicación en distintas especies de bivalvos (mejillón, almeja y ostra). La siguiente parte se centró en la utilización de una mezcla de ácidos orgánicos naturales (ácidos cítrico, ascórbico y láctico) con propiedades antimicrobianas y antioxidantes conocidas, para la elaboración de un nuevo sistema de hielo en escamas empleado en la conservación de distintos tipos de especies como merluza, gallo, rape, jurel, bacaladilla y caballa. Por último, se analizó el efecto de la aplicación de aceites esenciales (orégano y tomillo) y su combinación con la técnica de envasado en atmósfera modificada en anillas de calamar precocinadas
Full text
Departame n A p licació n me j ora de refri ge n to de Química Analítica, Nutrici ó Bromatología n de sistemas avanzados p la calidad de p roductos m e rados de interés comerc i Minia San j TESIS DO C ó n y p ara la m arinos i al j uás Rey C TORAL 2012
JORGE BARROS VELÁZQUEZ, Catedrático de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Santiago y SANTIAGO AUBOURG MARTÍNEZ, Profesor de Investigación del Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo INFORMAN Que la presente tesis doctoral, titulada “Aplicación de sistemas avanzados para la mejora de la calidad de productos marinos refrigerados de interés comercial”, ha sido realizada por la doctoranda MINIA SANJUÁS REY bajo nuestra dirección conjunta. Asimismo, y una vez terminada la parte experimental correspondiente, autorizamos a la doctoranda a que realice su presentación y defensa pública. Santiago de Compostela, 23 de abril de 2012 Fdo: Jorge Barros Velázquez Fdo: Santiago Aubourg Martínez Fdo: Minia Sanjuás Rey
!"#$%&'('!" ) " ( (&&* + * &) ""&* , $ *'&* &) ) -. &/)(0* 1 /&) "" /& &* ((2' & & )&& &* *
Este trabajo de investigación fue realizado gracias a la financiación concedida por la Xunta de Galicia dentro del Programa Sectorial de Tecnologías de la Alimentación a través de los proyectos de investigación: PGIDIT08TAL038E, PGIDIT09TAL031E y PGIDIT10TAL018E
ABREVIATURAS AA : Ácido ascórbico AC: Ácido cítrico ADP: Difosfato de adenosina AE: Aceite esencial AEO: Aceite esencial de Orégano AET: Aceite esencial de Tomillo AGL: Ácidos grasos libres AGP: Ácidos grasos poliinsaturados AL: Ácido láctico AMP: Monofosfato de andenosina AMR: Agua de mar refrigerada ATP: Trifosfato de adenosina BVT-N: Bases nitrogenadas volátiles totales EAM: Envasado en atmósfera modificada FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations g: Gramos HL: Hielo líquido HLO: Hielo líquido ozonizado HT: Hielo tradicional en escamas Hx: Hipoxantina IMP: Monofosfato de inosina Ino: Inosina mequiv: Miliequivalente min : Minutos ml: Mililitro
ABREVIATURAS mM: Milimolar nm: Nanómetros OTMA: Óxido de trimetilamina PCA: Plate count agar PV: Índice de peróxidos RTE: Ready to eat TBA: Ácido tiobarbitúrico TMA-N: Trimetilamina nitrogenada UE: Unión Europea UFC: Unidades formadoras de colonias VRBD: Violet red bile agar
ÍNDICE I- INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 5 1- ASPECTOS GENERALES DE LAS ESPECIES MARINAS.................................................... 7 1.1- Extracción y acuicultura ......................................................................................................... 7 1.2- Valor nutricional ..................................................................................................................... 9 1.3- Susceptibilidad a la alteración ............................................................................................. 13 1.4- Alimentos derivados de las especies marinas ..................................................................... 15 2- CONSERVACIÓN EN REFRIGERACIÓN DE ESPECIES MARINAS .................................. 16 2.1-La refrigeración como estrategia de conservación ............................................................... 16 2.2- Vías de alteración durante la conservación en refrigeración ............................................... 19 2.2.1- Autolisis ............................................................................................................................. 19 2.2.2- Actividad microbiana ......................................................................................................... 23 2.2.3- Oxidación de la fracción lipídica ....................................................................................... 27 2.3- Refrigeración tradicional en hielo en escamas .................................................................... 28 3- APLICACIÓN DE OTROS METODOS O ESTRATEGIAS PARA LA REFRIGERACIÓN DE ESPECIES MARINAS................................................................................................................. 30 3.1- Agua de mar refrigerada ...................................................................................................... 31 3.2- Hielo líquido ......................................................................................................................... 32 3.3- Combinación de hielo líquido con ozono ............................................................................. 35 3.4- Aplicación de conservantes naturales en pescado fresco ................................................... 38 3.5- Aplicación de aceites esenciales en productos marinos refrigerados ................................. 41 REFERENCIAS ........................................................................................................................... 45 IIPRESENTACIÓN DEL TRABAJO Y OBJETIVOS ...........................................53 IIIMATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................59 1- SISTEMAS DE PRESERVACIÓN EMPLEADOS .................................................................. 61 1.1- Sistemas de refrigeración .................................................................................................... 61 1.2- Mezcla de ácidos orgánicos naturales ................................................................................. 62 1.2.1- Fórmula comercial BPS2 .................................................................................................. 62 1.2.2- Elaboración de hielo incluyendo ácidos naturales ............................................................ 63 1.3- Cobertura con aceites esenciales ........................................................................................ 63 2- MATERIA PRIMA DE ESPECIES MARINAS, PROCESAMIENTO Y MUESTREO ............. 64 2.1- Trucha arco iris .................................................................................................................... 64 2.2- Especies bivalvas................................................................................................................. 66 2.3- Merluza, gallo y rape ............................................................................................................ 68 2.4- Bacaladilla ............................................................................................................................ 70 2.5- Jurel ..................................................................................................................................... 71
I-INTRODUCCIÓN 8 la merluza y el arenque. Este descenso de los recursos pesqueros cuestiona la afirmación de que el mar es una fuente inagotable de alimentos, lo que pone de manifiesto su limitada capacidad, sobre todo en lo que respecta a ciertas especies. Desde la UE se han dirigido políticas para garantizar la pesca sostenible a largo plazo cuyo objetivo principal es la de alcanzar un equilibrio sostenible entre la actividad de la flota y los recursos pesqueros disponibles. Sin embargo las actividades pesqueras se están viendo reducidas debido a otros factores como el aumento del precio de los combustibles, el cambio climático, las emisiones de carbono y el incremento general del precio de todo tipo de materiales empleados por el sector (FAO, 2010). Por último, otro factor que afecta a este sector, es la preocupación de los consumidores por los riesgos y beneficios percibidos a partir del consumo de pescado. Esto ha generado una demanda orientada hacia técnicas menos intensivas, basadas en medios naturales de producción que garanticen por un lado la calidad del producto consumido y por otro lado, deben garantizar la sostenibilidad de los recursos marinos. Todos estos hechos han beneficiado el desarrollo en las últimas décadas del sector de la acuicultura. El fin fundamental de los cultivos acuícolas es la producción de materia viva en medio marino. Es decir, la acuicultura consiste en la manipulación de biotopos acuáticos naturales o artificiales para la producción de especies útiles al hombre; por lo tanto, incluye todas las actividades de cría o cultivo de organismos que viven en dichos biotopos (Barnabé, 1989). El sector de la acuicultura crece más rápido que cualquier otro sector de producción de alimentos de origen animal, con un crecimiento medio anual del 6,6%. Con estos avances se está tratando de ayudar a resolver problemas de
I-INTRODUCCIÓN 9 conservación de especies, como el caso del camarón y de algunas especies de pescado blanco que están en peligro de extinción en algunos lugares, evitando así la sobreexplotación de sus caladeros (Cifuentes y col., 1997). En Europa, los principales productos de la acuicultura marina son los pescados de alto valor comercial, destacando el salmón, seguido de la dorada, la lubina y el rodaballo; entre los moluscos, destacan las especies de mejillón, ostra y almeja. A pesar de que la producción de mejillón experimenta bruscas variaciones debido a los episodios de mareas rojas que tienen lugar en Galicia, su cultivo en las bateas de las Rías Gallegas (Ilustración 1), ha situado a España como segundo productor mundial después de China (Consellería de Pesca e asuntos marítimos, 2008). 1.2- Valor nutricional El estudio de los nutrientes y las funciones que desempeñan en el organismo nos han permitido conocer muchas de las propiedades de los alimentos que hasta hace relativamente pocos años se intuían o formaban parte de la sabiduría popular. No se puede elaborar un producto nuevo sin saber la respuesta de sus componentes frente al proceso al que va a ser sometido; no se Ilustración 1: Batea de La Ría de Vigo
I-INTRODUCCIÓN 10 puede aplicar un tratamiento sin conocer en qué cuantía va a disminuir la actividad de ciertos principios nutritivos; no se puede tratar un alimento sin conocer qué modificaciones sensoriales van a producirse. En la actualidad se considera que es imprescindible conocer con el mayor detalle posible la composición de todas aquellas especies que forman parte de nuestra dieta. Los principales componentes químicos del músculo de pescado son el agua, las proteínas y los lípidos. Juntos constituyen aproximadamente el 98% del músculo. Estos componentes son los que tienen mayor impacto sobre el valor nutritivo, las propiedades funcionales, las cualidades sensoriales y la estabilidad en la conservación de estos productos. Los otros constituyentes (carbohidratos, vitaminas y minerales), aunque están presentes en menor cantidad, también juegan un papel importante en los procesos bioquímicos que tienen lugar en el músculo post-mortem. El agua es el principal componente del músculo de pescado; representa en torno al 80% del peso en especies magras y es menor en aquellas especies que almacenan lípidos en el músculo (Haard, 1992). Es uno de los componentes que más influye en la alterabilidad de los alimentos. Con el objeto de medir su presencia, surgió el concepto de actividad de agua (aw), que se define como la relación existente entre la presión de vapor de un alimento y la presión de vapor de agua pura, medidas ambas a la misma temperatura. Este parámetro es una medida del agua disponible para el crecimiento de microorganismos y para que se puedan llevar a cabo las diferentes reacciones químicas y enzimáticas relacionadas con la pérdida de calidad. El nitrógeno proteico es la fracción más importante del nitrógeno total, ya que suele suponer en la mayoría de las especies un valor superior al 85% del
I-INTRODUCCIÓN 11 nitrógeno total (Pérez-Martín, 1986). El porcentaje de proteína se encuentra en el rango 15-20% en el músculo fresco, y no existen diferencias entre especies magras y grasas. Considerando que la carne de cerdo, cordero y ternera tienen un 20-21% de proteínas, se entiende que se haya catalogado al pescado en el grupo de los alimentos proteicos. Asimismo, la calidad nutritiva de la proteína marina se asemeja mucho a la de la proteína del huevo, la leche y productos cárnicos, en el sentido que contiene igualmente todos los aminoácidos esenciales. Como resultado, el valor biológico y el coeficiente de digestibilidad de las proteínas marinas se encuentra en los mismos rangos que los alimentos recién mencionados (Piclet, 1987). Lo que caracteriza y distingue a los alimentos marinos frente a los de origen terrestre es su composición lipídica altamente insaturada. Los lípidos marinos están compuestos por ácidos grasos de cadena larga (14-22 átomos de carbono) con un alto grado de insaturación. Los ácidos grasos de los mamíferos raramente contienen más de dos dobles enlaces por molécula, mientras que los depósitos grasos de las especies marinas contienen muchos ácidos grasos con cinco o seis dobles enlaces. Numerosas investigaciones recientes centran en los ácidos grasos poliinsaturados de la serie ω3 el papel positivo de los lípidos marinos en la lucha contra determinadas enfermedades. Dos ácidos destacan por su abundancia en este grupo. Son, el de 22 átomos de carbono y 6 dobles enlaces (ácido docosahexaenoico, DHA) y el de 20 átomos de carbono y 5 dobles enlaces (ácido eicosapentaenoico, EPA). Las especies marinas son también interesantes por su aporte en ácidos grasos esenciales (linoleico, linolénico y araquidónico), aquellos ácidos grasos que el organismo humano necesita pero no es capaz de sintetizar. Recientemente se ha estudiado la relación de contenidos de ácidos ω3
I-INTRODUCCIÓN 12 y ω6; se ha comprobado que en los dos últimos siglos, el desarrollo tecnológico y el cambio de hábitos ha llevado a una proporción superior de ω6 de la que sería la correcta en una dieta equilibrada humana (1/6, ω3/ ω6) (Simopoulos, 1994). Un constituyente minoritario, pero de gran importancia desde un punto de vista tecnológico, es el de los compuestos nitrogenados no proteicos. Se trata de un conjunto heterogéneo de moléculas que contienen nitrógeno, son de naturaleza no proteica y son solubles en agua. Los más importantes a nivel tecnológico son las bases volátiles (amoniaco, trimetilamina, dimetilamina), óxido de trimetilamina, aminoácidos libres, urea, nucleótidos, etc. Estos compuestos proceden fundamentalmente del sarcoplasma y constituyen en los teleósteos un 9-18% del nitrógeno total y un 33-38% en los elasmobranquios (Piclet, 1987). Los carbohidratos representan la fuente de energía más rápida de los seres vivos. En el caso de las especies marinas no es un constituyente abundante, pudiendo llegar a un máximo de 1,2 y 4 g/100 g de músculo fresco en pescado, crustáceos y moluscos. Se encuentran fundamentalmente en la forma de glucógeno, aunque en algún caso se han aislado pequeñas cantidades de glucosa libre y ribosa. Los alimentos marinos son una fuente muy rica de componentes minerales. El contenido total en músculo oscila en el rango 0,6-1,5% del peso húmedo. Globalmente, se puede decir que los productos marinos son interesantes por su aporte en halógenos (I, F) y también en otros elementos como P, K, Ca, siendo menos importante su contribución en Cl y Na. Desde el punto de vista tecnológico, resulta importante la presencia de determinados elementos de transición (Cu y Fe, especialmente) dado que pueden ser buenos catalizadores de una de las vías de alteración de los productos marinos (oxidación de la fracción grasa).
I-INTRODUCCIÓN 13 Las vitaminas son compuestos orgánicos complejos, que en cantidades mínimas y como componentes naturales de los alimentos son esenciales para el curso normal de las funciones fisiológicas. Uno de los valores más positivos de las especies marinas es su aporte en vitaminas del tipo liposoluble (A, D y E, especialmente), siendo también considerable el de algunas proteínas del tipo hidrosoluble como tiamina, riboflavina, B6 y B12. El hígado de las especies magras resulta una fuente muy buena de las vitaminas A y D, mientras que en el caso de las especies grasas es en el músculo donde se pueden encontrar cantidades mayores. 1.3- Susceptibilidad a la alteración Después de la captura de los productos marinos, se produce una serie de modificaciones, cuya velocidad e intensidad dependen de factores intrínsecos y de factores extrínsecos al animal. En lo referente a factores intrínsecos, se puede afirmar que el pescado, y en general los productos marinos están considerados en el grupo de los alimentos más frágiles y perecederos que existen. Esto es debido fundamentalmente a su gran contenido en determinados constituyentes (agua, aminoácidos libres, lípidos con alto grado de insaturación, compuestos nitrogenados no proteicos, enzimas autolíticas, etc.) que facilitan la puesta en marcha de una serie de vías de alteración. Asimismo, es importante mencionar la pequeña proporción de tejido conectivo que se encuentra presente en el músculo, lo que los hace más susceptibles que los animales terrestres al ataque microbiano en el momento de abandonar su hábitat natural. Por otra parte, debe destacarse el gran número de enzimas autolíticos presentes en los lisosomas de las células de su tejido muscular. Estas enzimas,
I-INTRODUCCIÓN 14 que se caracterizan por presentar su mayor actividad a pH ácido y tener un papel regulador en el animal vivo, son las responsables después de la muerte del fenómeno conocido como autolisis enzimática. Aunque el músculo y los fluidos fisiológicos del pescado vivo o recién capturado sean normalmente estériles, hay zonas del cuerpo del animal como la capa mucosa superficial, las branquias y el tracto digestivo, que son ricos en diversas poblaciones bacterianas, que difieren según el pez sea de aguas cálidas o frías. Después de la muerte del pez se produce la difusión de dicha microbiota hacia otros tejidos, lo que originará el deterioro de la calidad del producto. Asimismo, la velocidad de alteración se verá influenciada en gran medida por toda una serie de factores extrínsecos al propio animal, entre los que cabe destacar el hábitat (localización geográfica, temperatura del agua, estación del año, etc.), el método de captura, el tiempo que transcurre desde la captura hasta que el pescado es sometido a cualquiera de los procesos de preservación y la manipulación a que se ve sometido a bordo. De entre todos ellos, el método de captura y su manipulación inmediatamente posterior, son las causas decisorias a la hora de acelerar o no los cambios post-mortem del pescado. En la Ilustración 2 se mencionan de forma esquemática las distintas vías a través de las cuales las especies marinas pueden sufrir alteración post-mortem. Ilustración 2: Vías de alteración de las especies marinas Oxidación no enzimática de lípidos Pardeamiento enzimático Pardeamiento no enzimático Acción de enzimas endó g enas Acción microbiana VÍ AS DE ALTERACI Ó N DE ESPECIES MARINAS
I-INTRODUCCIÓN 15 1.4- Alimentos derivados de las especies marinas Debido a la facilidad y a la rapidez con la que se suceden las distintas vías de alteración en los productos marinos, se han diseñado distintos tipos de estrategias con el fin de inhibir y ralentizar los mecanismos por los que se suceden las distintas vías de alteración. El objetivo fundamental de estas estrategias es el de ofrecer al consumidor un producto de alta calidad nutricional, sensorial y al mismo tiempo seguro. Estas estrategias son aplicadas después de la captura. En función del grado de transformación a la que se somete a la especie marina, se pueden distinguir los siguientes tipos de procesos: De menor grado de transformación: Las características originales de la especie de partida se mantienen, o al menos, se intentan mantener; es el caso de los productos refrigerados y congelados. De mayor grado de transformación: Suponen un cambio drástico en la composición y el aspecto externo del producto; nos referimos a los procesos de secado, salazonado, ahumado, enlatado y pre-cocinados. Por otra parte, en función de la propia estrategia seguida para detener la alteración, los métodos aplicados pueden dividirse en tres grupos: Aquellos que aplican frío (refrigeración, congelación), los que aplican calor (cocción, enlatado, ahumado) y los que se basan en la reducción de la actividad de agua (salado, secado). Actualmente se presta gran atención a los denominados alimentos listos para consumir (“ready-to-eat”) o pre-cocinados. Son una solución estratégica para promover el consumo de alimentos altamente perecederos como los marinos y a
I-INTRODUCCIÓN 16 la vez adecuarse a la demanda actual de los consumidores. Ante las nuevas necesidades que plantea el ritmo de vida moderno, la industria alimentaria ha reaccionado rápidamente, ampliando considerablemente el surtido de dichos productos: filetes de pescado, hamburguesas, anillas de calamar rebozadas, etc. La elaboración de estos productos implica una serie de transformaciones y tratamientos, que pueden ser aplicados de forma individual o combinada, entre los que se pueden mencionar el tratamiento térmico, rebozado, envasado en atmósferas protectoras, conservación en frío, etc. Todo ello enfocado a que los productos preparados mantengan su calidad nutritiva y su calidad sensorial (Gopinath y col., 2007). 2- CONSERVACIÓN EN REFRIGERACIÓN DE ESPECIES MARINAS 2.1- La refrigeración como estrategia de conservación Al comienzo de esta memoria se comentó la importancia de los productos marinos en la alimentación por ser una fuente valiosa de proteínas y otros nutrientes. Sin embargo, si estos productos no son manipulados y elaborados correctamente, se puede producir una importante pérdida de sus valores nutricionales y sensoriales, con la posibilidad de dejar al consumidor expuesto al riesgo de sufrir una intoxicación alimentaria. Debido a que el deterioro post mortem posee una cinética elevada, las condiciones de conservación a bordo ejercen un gran efecto sobre la calidad del producto (Ashie y col., 1996). Así, tanto la manipulación cuidadosa e higiénica como la conservación adecuada, resultan ser parámetros clave para garantizar la salubridad del producto, ya que los daños innecesarios originados durante la
I-INTRODUCCIÓN 17 manipulación del producto, tales como cortes y heridas, pueden facilitar el acceso de bacterias acelerando la pérdida de calidad. El pescado, tras su muerte y posterior conservación, pasa por cuatro fases de deterioro, independientemente de la temperatura de refrigeración a la que se trabaje: Pre-rigor: en la que el pescado presenta unas características sensoriales externas máximas, destacando su textura firme y elástica. Comienzan los procesos autolíticos de alteración. Rigor mortis: el cuerpo del pescado pierde flexibilidad, volviéndose totalmente rígido y duro; es el mejor síntoma de frescura. Continúan los procesos autolíticos del deterioro. Post-rigor: cuando la carne del pescado se encuentra flácida, ligeramente firme pero con una pérdida clara de elasticidad. Comienza el deterioro bacteriano. Alteración: el deterioro bacteriano es evidente. El pescado presenta una carne más blanda y olor desagradable (Rodríguez & Pascual, 2002). Las modificaciones que va sufriendo el pescado en su proceso de alteración hasta convertirse en un producto pútrido son fácilmente identificables. Los cambios a nivel de apreciación visual pueden describirse de la siguiente manera: Su característico aspecto brillante se torna pálido y adquiere una tonalidad parda, amarilla, o de aspecto sucio. La capa viscosa de la superficie aumenta, especialmente en las aletas y branquias
I-INTRODUCCIÓN 24 • La descomposición del azufre contenido en los aminoácidos cisteína y metionina es particularmente importante en la degradación, porque causa malos olores y sabores debido a la formación de sulfuro de hidrógeno y metilmercaptano, respectivamente (Herbert & Shewan, 1975,1976). • Presencia de OTMA, que actúa como aceptor final de electrones en la respiración anaerobia de diversas bacterias específicas de la degradación. El resultado de su descomposición es la aparición de malos olores y sabores debido a la formación de TMA (Gram & Huss, 1996). En lo que se refiere a factores extrínsecos, la población y composición de la microbiota del pescado están influenciadas por el ambiente de la zona de captura, la época del año, las condiciones de pesca, la manipulación y el procesado (Shewan, 1962). La temperatura es el factor ambiental más importante de los que influyen en el número inicial y tipo de bacterias en la superficie del pescado. Las poblaciones bacterianas típicas de los peces de aguas templadas son fundamentalmente psicrófilas que viven en aguas de temperaturas inferiores a 10ºC. Sin embargo, la temperatura del agua superficial puede aumentar si se prolonga el tiempo cálido, con lo que las especies pelágicas (por ejemplo el jurel, la caballa o el arenque) pueden ver aumentada su carga bacteriana superficial mesófila (Gram y col., 1987). La gran mayoría de los microorganismos se encuentran en las superficies externas (piel y branquias) y en los intestinos de los peces vivos. Muchos de estos microorganismos son potenciales agentes de alteración. Las bacterias predominantes en piel y branquias son aerobias facultativas, en especial del género Vibrio, que también se han aislado en gran número en los peces pelágicos. Las bacterias anaerobias obligadas son poco frecuentes en la
I-INTRODUCCIÓN 25 superficie del pescado pero se presentan en gran número en el intestino. Poco después de la muerte del pez, las bacterias comienzan a invadir los tejidos ya que se pierden los sistemas de defensa naturales (Burgess y col., 1965). Una gran parte de las bacterias presentes en el pescado deteriorado no desempeñan ningún papel en su alteración (Makarios-Aham & Lee, 1993). Cada especie posee sus propias bacterias específicas del deterioro. La microbiota del pescado que se altera consta de bacilos psicrófilos Gram negativos, pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Psychrobacter (Moraxella), Shewanella y Flavobacterium (Gram y col., 1987; Huss, 1998; Jay, 1971). Dado su carácter psicrófilo, son capaces de crecer entre 0 y +1ºC pero hay un gran número de especies de Pseudomonas que son capaces de alterar el pescado a una temperatura de -3ºC, aunque la velocidad sea lenta (Shaw & Shewan, 1968). Así, los piscrófilos son los microorganismos dominantes y los principales causantes de la alteración en los alimentos refrigerados. Aunque los tiempos de generación de los microorganismos psicrófilos son bastante largos, su metabolismo es relativamente activo a temperaturas de refrigeración, destacando la producción y actividad de enzimas hidrolíticas (como proteasas y lipasas). El crecimiento de bacterias consumidoras de oxígeno ocasiona la formación de nichos anaeróbicos o microaerofílicos en el pescado. Esto sin embargo, no favorece necesariamente el crecimiento de bacterias anaeróbicas. Algunas de las bacterias presentes en el pescado son capaces de llevar a cabo el proceso respiratorio en anaerobiosis empleando moléculas distintas al oxígeno como aceptores finales de electrones, siendo típico de las bacterias específicas del deterioro del pescado emplear el OTMA como aceptor de electrones durante la respiración anaeróbica.
I-INTRODUCCIÓN 26 La reducción del OTMA está asociada a bacterias típicas del ambiente marino, tales como Shewanella putrefaciens, Aeromonas spp., Enterobacteriaceae, P. phosphoreum y Vibrio spp, obtienen energía mediante la reducción del OTMA a TMA, generándose sabor amoniacal (Gram & Dalgaard, 2002). El componente reducido, la TMA, es uno de los compuestos dominantes del pescado deteriorado y el responsable del desagradable y típico olor a pescado conservado en malas condiciones (Boskou & Debevere, 1998). En muchas especies de pescado el desarrollo de la TMA es paralelo a la producción de hipoxantina. Otro tipo de moléculas relacionadas con la actividad microbiana son las aminas biógenas. Su formación se lleva a cabo a partir de aminoácidos libres, mediante catálisis de enzimas bacterianas. Entre ellas es de destacar la histamina, junto a putrescina, cadaverina, triptamina, agmatina, etc. El contenido en aminas biógenas es útil para la estimación del grado de descomposición del pescado, (Mackie, 1997), ya que en los peces recién capturados, la concentración de estas aminas es muy bajo o prácticamente indetectable. Cabe destacar, por su importancia clínica, la histamina (formada a partir de la descarboxilación del aminoácido histidina). El envenenamiento por histamina es una intoxicación de origen alimentaria producida por el consumo de alimentos con niveles elevados de esta amina biógena. Se asocia normalmente con el consumo de escómbridos (atún, albacora, bonito, bacoreta, caballa, etc.) conservados en malas condiciones (Taylor, 1986); de ahí su nombre “envenenamiento o intoxicación por escómbridos”. Pero también puede ser debida al consumo de pescado no perteneciente al grupo de los escómbridos, como sardinas, arenques, etc., o
I-INTRODUCCIÓN 27 incluso de otros alimentos como quesos, productos cárnicos, vino, etc. (Brink y col., 1990). Finalmente, numerosos microorganismos alterantes pueden producir lipasas extracelulares que catalizan la hidrólisis de los ésteres de glicerol llevando a la formación de ácidos grasos libres. La producción de lipasas de origen microbiano puede limitarse o inhibirse si en el medio están presentes carbohidratos, lípidos y proteínas del tejido muscular (Alford y col., 1971; Kraft, 1992). Por ello, es necesario que se haya agotado la glucosa de la superficie muscular con el fin de que se produzca la actividad lipolítica microbiana (Gill, 1982). 2.2.3- Oxidación de la fracción lipídica La naturaleza esencialmente insaturada de los lípidos de las especies marinas las convierte en sustancias especialmente susceptibles a sufrir oxidaciones. La oxidación lipídica tiene lugar cuando los ácidos grasos insaturados reaccionan con el oxígeno del aire durante la conservación o procesado del pescado. Estas reacciones han acaparado una gran atención por tener una gran incidencia sobre la calidad y el valor nutritivo del producto, al originarse sabores y olores desagradables de tipo rancio (Frankel, 1991; Harris & Tall, 1994). La oxidación lipídica es un proceso autocatalítico que transcurre a través de la formación de radicales libres. Una vez producido el primer ácido graso portador de un radical libre, su reactividad con el oxígeno provoca su rápida conversión en radicales de tipo peróxido. Estos compuestos se transforman en hidroperóxidos (productos primarios de oxidación) por interacción con moléculas de ácidos grasos insaturados. Éstos, son inestables y además de originar radicales libres,
I-INTRODUCCIÓN 28 pueden sufrir otro tipo de transformaciones dando lugar a una serie de productos de oxidación secundarios (aldehídos, cetonas, alcoholes, etc.). Por último, tanto los productos primarios como los secundarios de la oxidación lipídica (de carácter electrófilo todos ellos), pueden reaccionar con componentes nitrogenados (de carácter nucleófilo) del alimento dando lugar a los denominados productos de oxidación terciarios que son portadores de propiedades fluorescentes y de pardeamiento. Esta interacción resulta especialmente importante en el valor nutricional ante la posible pérdida de aminoácidos y ácidos grasos del tipo esencial. Es necesario mencionar que en el proceso de oxidación lipídica actúan de forma conjunta dos vías de alteración mencionadas en la Ilustración 2. Dado que la oxidación lipídica es un proceso favorable termodinámicamente, pero no cinéticamente, es necesaria la participación de un catalizador. Este papel puede ser desempeñado por una enzima endógena (lipoxigenasas, peroxidasas y oxidasas), o bien puede ser llevado a cabo por agentes del tipo metales (especialmente de transición), luz, calor, etc. En el primer caso nos encontraríamos con la oxidación de tipo enzimática, mientras que en el segundo se trataría de una oxidación no enzimática. El desarrollo de ambas se superpone durante la alteración de un producto, llevando a productos de oxidación muy similares. 2.3- Refrigeración tradicional en hielo en escamas El empleo de hielo en escamas es el método más utilizado en los países desarrollados como método de refrigeración para la conservación de productos marinos en estado fresco. Mediante su aplicación, se consigue enfriar con rapidez
I-INTRODUCCIÓN 29 el producto, alcanzándose temperaturas ligeramente superiores a 0ºC (Heen, 1982) y así extender su vida útil. Este sistema de refrigeración ofrece numerosas ventajas tales como ser es inocuo, fácil de transportar y relativamente barato. Resulta especialmente apropiado para la refrigeración del pescado. Con este método, la transferencia de calor se produce por contacto directo del pescado con el hielo, por conducción entre piezas adyacentes y por el agua de fusión que se desliza sobre la superficie del pescado. El agua de fusión fría, absorbe el calor del pescado y al fluir sobre el hielo se vuelve a enfriar. Así, la mezcla pescado-hielo, no sólo reduce el espesor del estrato de pescado a enfriar, sino que, además, favorece el enfriamiento mediante convección entre el agua de fusión y el pescado. Tan pronto como se coloca el hielo en escamas sobre el pescado caliente, el calor de éste fluye hacia el hielo derritiéndolo. Este proceso continúa mientras exista una diferencia de temperatura entre ambos, siempre que exista hielo suficiente. Toda fusión a posteriori se deberá al calor procedente de otras fuentes, por ejemplo, aire caliente circundante durante el posterior periodo de conservación. A pesar de su amplia utilización, el sistema refleja una serie de inconvenientes tales como: El grado de limpieza puede no ser adecuado en todos los casos. La transmisión de calor es mejorable, ya que deja espacios de aire entre el hielo y el producto, de manera que no lo rodea completamente. Es un sistema difícil de automatizar. Requiere de un espacio de conservación relativamente grande.
I-INTRODUCCIÓN 30 Control de otros parámetros como temperatura, humedad relativa y purificación y circulación del aire de la cámara. En el caso de temperatura y humedad, se ha visto que cada especie requiere unas condiciones óptimas de conservación en refrigeración. Como resultado, en las últimas décadas se han buscado nuevos métodos que permitan mejorar las carencias del hielo tradicional con el fin de mejorar la calidad de los productos de la pesca refrigerados. De estos otros métodos o estrategias avanzadas se realizará una breve descripción en la siguiente sección. 3- APLICACIÓN DE OTROS METODOS O ESTRATEGIAS PARA LA REFRIGERACIÓN DE ESPECIES MARINAS En el momento de la descarga en puerto, es posible que la carga de pesca conservada en la bodega lleve varios días en refrigeración. Este tiempo a bordo se hace especialmente importante en aquellas especies que son capturadas en alta mar por la denominada flota de altura. Además, si a esto le añadimos un proceso poco organizado, posible interrupción de la cadena de frío y una manipulación inadecuada del producto, se acentuarán los signos de deterioro con la consiguiente disminución de su vida útil. Por ello, gran parte de la captura, sobre todo si procede de bancos de peces especialmente lejanos o si se trata de especies de corta vida, puede que ya no estén en condiciones para la venta, lo que se traduce en pérdidas económicas para el sector. Tal y como se viene comentando, los productos marinos constituyen un grupo de alimentos altamente perecederos, y el nivel de su deterioro está directamente relacionado con las condiciones de conservación.
I-INTRODUCCIÓN 31 Con el fin de retardar los daños en el pescado tan pronto como sea posible, se han ensayado distintas estrategias al objeto de mejorar el sistema básico de conservación en hielo tradicional mencionado en la sección anterior. Entre estos métodos, clásicos y avanzados, se pueden mencionar el agua de mar refrigerada, hielo líquido, hielo líquido con ozonización y sistemas de refrigeración que combinan hielo en escamas con tratamientos químicos (Toledo-Flores & Zall, 1992; Ashie y col., 1996). A continuación se comentan las características de cada uno de estos sistemas de refrigeración. 3.1- Agua de mar refrigerada El agua de mar refrigerada (AMR), no ha desplazado al hielo en escamas pero es utilizada en algunas pesquerías como medio de enfriamiento. Consiste en agua de mar enfriada a una temperatura inferior a 0ºC y en algunos casos se utiliza una salmuera de aproximadamente la misma salinidad que el agua de mar. Este sistema ofrece una serie de ventajas con respecto al hielo en escamas como: Enfriamiento más rápido Menor presión ejercida sobre el pescado Posibilidad de una temperatura de conservación más baja Manipulación más rápida de grandes cantidades de pescado con un tiempo de demora corto En algunos casos, mayor tiempo de conservación. Pero este método posee también una serie de inconvenientes, como puede ser la excesiva absorción de sal por parte del producto, la absorción de agua por
I-INTRODUCCIÓN 32 especies de bajo contenido lipídico, la pérdida de proteínas hidrosolubles, incremento de la actividad de las bacterias anaerobias de putrefacción y la modificación de características sensoriales tales como la decoloración de las branquias y la opacidad de la piel. Los sistemas AMR han mostrado eficacia en los siguientes casos: Cuando las desventajas de la absorción de sal no son importantes, pudiendo almacenarse así la captura durante períodos relativamente largos. En el enfriamiento de las especies de utilización industrial, ya que permite llevar a cabo viajes largos, mejorar la manipulación y reducir las pérdidas. En el enfriamiento a granel en embarcaciones donde se deben manejar con rapidez grandes cantidades de pescado. En el enfriamiento del pescado a granel, antes de su elaboración, evitando así el exceso de manipulación. Por todo ello, resulta difícil generalizar la conveniencia o no de aplicar este sistema a escala comercial. Resulta aconsejable realizar, previamente a su uso, una investigación de todos los factores, teniendo en cuenta la naturaleza de la especie, su variabilidad estacional y el producto concreto que se quiere obtener al final. 3.2- Hielo líquido El hielo líquido es un método de refrigeración alternativo al hielo tradicional; representa una técnica nueva, que está tratando de introducirse en el mercado. Es un sistema binario que consiste en una suspensión de cristales de hielo
I-INTRODUCCIÓN 33 Ilust r ación 3: Hielo líquido esféricos y microscópicos dispersos finamente en el seno de una solución anticongelante, de aspecto similar a un granizado, como se puede ver en la Ilustración 3. Presenta una alta capacidad de intercambio térmico (mayor de 60 Kcal/kg), claramente superior a la del agua (1 Kcal/kg). El hielo líquido es producido mediante un proceso que remueve continuamente el hielo creado, quedando suspendido en forma de cristales microscópicos dentro de la solución. La proporción hielo/agua de trabajo es variable, oscilando en el intervalo 20-40% en función de la especie marina a conservar. El contenido en sal de la disolución de partida suele coincidir con el del agua marina, aunque la tecnología permite modificar este parámetro. El sistema de producción de hielo líquido consiste en una fuente de enfriamiento susceptible de substituir la utilización de las máquinas convencionales productoras de hielo en eslabones del sector pesquero tales como conservación de la pesca en alta mar, manipulación en lonjas y climatización y conservación en grandes superficies de alimentación. Las ventajas derivadas de la utilización del hielo líquido frente al hielo tradicional en escamas pueden resumirse de la siguiente forma: Permite mantener temperaturas inferiores a 0ºC para la conservación en refrigeración del pescado, por encima del punto inicial de congelación; esto se traduce en un retardo de las reacciones microbianas, químicas y enzimáticas responsables de la alteración del producto.
I-INTRODUCCIÓN 40 conducir a un aumento de la osmolaridad y la interferencia con los procesos metabólicos. Otra consecuencia negativa de este proceso es que para compensar este aumento de carga eléctrica negativa, la bacteria debe aumentar los niveles de Na+, K+ y/o glutamato, lo que lleva a un incremento de la fuerza iónica intracelular y del turgor. Este proceso provoca un gran aumento de la presión mecánica sobre la pared del microorganismo, lo que hace que estalle (Foster, 1999). El efecto inhibidor relacionado con la forma no disociada del ácido, no tiene lugar en el caso de emplear ácidos inorgánicos fuertes, debido a que éstos se encuentran totalmente disociados en la disolución, y por tanto los compuestos polares resultantes no pueden atravesar la membrana plasmática. Por eso la actividad inhibitoria de la forma no disociada depende de la polaridad y del tamaño de las moléculas. En este sentido, los ácidos orgánicos láctico (E-270), cítrico (E-330) y ascórbico (E-300) resultan apropiados para este fin. Alakomi y col. (2000) comprobaron el efecto inhibidor ejercido por el ácido láctico sobre el crecimiento de bacterias Gram-negativas, conocidas por ser el grupo responsable del deterioro del pescado. Tratamientos previos con ácido láctico en filetes de pescado (Kim y col., 1995; Metin y col., 2001; Erkan & Mol, 2004), pescado rebozado (Gogus y col., 2006) y rodajas de pescado (Sallam, 2007), pusieron de manifiesto la eficacia en la conservación y extensión de la vida útil de los productos marinos. Además de propiedades antimicrobianas, los ácidos ascórbico y cítrico, así como sus sales, son conocidos por su papel como quelantes, acidulantes en sistemas biológicos y sinérgicos de antioxidantes primarios. Su efecto ha sido probado en pescado desmenuzado, (Hwang & Regenstein, 1995; Stodolnik y col.,
I-INTRODUCCIÓN 41 1992), filetes de pescado (Badii & Howell, 2002; Kilinc y col., 2009; Pourashouri y col., 2009) y piezas enteras (Aubourg y col., 2004). Sin embargo, cuando estos ácidos se aplican por encima de ciertas concentraciones o durante tiempos prolongados, existen evidencias de digestión del pescado, con el consiguiente deterioro sensorial (ataque a piel y ojos, especialmente) y de las propiedades físicas del mismo (Kim y col., 1995; Metin y col., 2001). Estos posibles inconvenientes deben ser evitados mediante un estudio previo de optimización de la concentración empleada de los ácidos conservantes. 3.5- Aplicación de aceites esenciales en productos marinos refrigerados En la actualidad, existe una demanda creciente por parte del consumidor, de productos alimentarios frescos sin aditivos sintéticos. Por lo que, tanto investigadores como la industria de la alimentación, han mostrado un fuerte interés por el uso de conservantes naturales de amplio espectro como alternativa a los aditivos químicos sintéticos. Para la preservación de los productos de la pesca, se han sugerido varios métodos de bioconservación, tales como el uso de bifidobacterias o extractos naturales de plantas. Estos tratamientos no sólo se están probando en el pescado fresco, sino también en alimentos como el pollo (Royo y col., 2010). En la actualidad, se están implementando nuevos métodos de aplicación de sustancias antimicrobianas a los alimentos, ya sea mediante películas de embalaje o añadidos al rebozado, como es el caso de los langostinos (Yerlikaya y col., 2008), con el fin de aplicar altas concentraciones de conservantes en la superficie de los alimentos. De este modo se consigue, por
I-INTRODUCCIÓN 42 tanto, aumentar el periodo de conservación de los mismos (Gennadios & Kurth, 1997). El deterioro de los productos marinos elaborados es muy rápido, sobre todo debido a las etapas de pre-elaboración en las que el acceso de microorganismos al producto puede verse facilitado. Además, dicha calidad puede verse afectada negativamente por reacciones químicas y enzimáticas de degradación. Aunque todos estos procesos de deterioro son dependientes de la temperatura, la conservación en condiciones óptimas de los mismos no está garantizada por un control estricto de la temperatura de conservación. Así, plantas como el orégano, tomillo, ajo, hoja de laurel, romero, clavo, etc., o sus extractos, conocidos como aceites esenciales, se están empleando solos o en combinación con otros métodos de conservación como EAM o la irradiación, para mejorar las características sensoriales y alargar la vida útil de los alimentos (Burt, 2004; Giménez y col., 2004; Mahmoud y col., 2004; Mejholm & Dalgaard., 2002; Miguel y col., 2004; Vareltzis y col., 1997; Wong & Kitts, 2002). Los aceites esenciales son líquidos aceitosos, aromáticos y volátiles, que se obtienen a partir de materia prima de origen vegetal. Normalmente se forman en células especializadas o grupos de células de tallos y hojas, y se concentran, habitualmente, en una región particular como la corteza, las hojas o los frutos (Oussalah y col., 2006). Históricamente, han servido como agentes saborizantes en alimentos y bebidas, y debido a su contenido variable de compuestos antimicrobianos, poseen un gran potencial como agentes naturales para la conservación de alimentos. La actividad antimicrobiana de los aceites esenciales se asigna a una variedad de pequeños compuestos fenólicos y terpenoides que,
I-INTRODUCCIÓN 43 en su forma pura, han demostrado poseer actividad antimicrobiana (Aureli y col., 1992; Hanaa y col., 2009) y antifúngica (Aligiannis y col., 2001; Thompson, 1989). Los aceites esenciales y sus componentes, son conocidos por mostrar actividad contra una gran variedad de microorganismos. Los aceites de orégano (Origanum vulgare) y tomillo (Thymus vulgaris) se encuentran entre los aceites esenciales con una mayor actividad antimicrobiana (Smith-Palmer y col., 1998; Hammer y col., 1999; Dorman & Deans, 2000; Moreira y col., 2005; Oussalah y col., 2006; Gutiérrez y col., 2008). Sin embargo, se debe tener en cuenta, que la aplicación de aceites esenciales de plantas para el control de patógenos transmitidos por alimentos y de bacterias contaminantes, requiere la evaluación previa de su eficacia en productos alimentarios o en sistemas modelo que simulan la composición de los alimentos (Glass & Johnson, 2004). Ello es debido a que, por lo general, la eficacia de muchos agentes antimicrobianos de origen natural puede verse reducida debido a interacciones con ciertos componentes de los alimentos. Otro aspecto a tener en cuenta para la optimización del uso de aceites esenciales en los alimentos, es el impacto sobre la aceptabilidad sensorial. Si son necesarias concentraciones muy altas de aceites esenciales para conseguir una actividad antimicrobiana notable, la calidad organoléptica de los alimentos puede verse afectada; de este modo, pueden producirse olores y sabores inaceptables para su consumo (Gutiérrez y col., 2008). Por lo tanto, para la aplicación exitosa de los aceites esenciales, las investigaciones deben centrarse en la optimización de las combinaciones de aceites esenciales y sus aplicaciones. El objetivo básico sería el de obtener una actividad antimicrobiana eficaz a concentraciones lo suficientemente bajas como
I-INTRODUCCIÓN 44 para que la calidad organoléptica de los alimentos no se vea afectada negativamente.
I-INTRODUCCIÓN 45 REFERENCIAS Alakomi, H. L., Skyttä, E., Saarela, M., Mattilda-Sandholm, T., Latva-Kala, K. & Helander, I. M. 2000. Lactic Acid Permeabilizes Gram-Negative Bacteria by Disrupting the Outer Membrane. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2001- 2005. Alford, J. A., Smith, J. L. & Lilly, H. D. 1971. Relationship of microbial activity to changes in lipids in foods. Journal of Applied Microbiology, 34, 133-146. Aligiannis, N., Kalpoutzakis, E., Chinou, I. B., Mitakou, S., Gikas, E. & Tsarbopoulos, A. 2001. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of Wve taxa of Sideritis from Greece. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 49, 811–815. Álvarez, V., Feás, X., Barros-Velázquez, J. & Aubourg, P. S. 2009. Quality changes of farmed blackspot seabream (Pagellus bogaraveo) subjected to slaughtering and storage under flow ice and ozonised flow ice. International Journal of Food Science and Technology, 44, 1561-1571. Aoki, T. & Ueno, R. 1998. Involvement of cathepsins B and L in the post-mortem autolysus of mackerel muscle. Food Research International, 30, 585-592. Ashie, I., Smith, J. & Simpson, B. 1996. Spoilage and shelf-life extension of fresh fish and shellfish. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 36, 87–121. Aubourg, S., Pérez-Alonso, F. & Gallardo, J. 2004. Studies on rancidity inhibition in frozen horse mackerel (Trachurus trachurus) by citric and ascorbic acids. European Journal of Lipid Science and Technology, 106, 232–240. Aubourg, P. S., Testi, S., Sanxuás, M., Gil, C. & Barros-Velázquez, J. 2009. Improved quality and shelf life of farmed trout (Oncorhynchus mykiss) by whole processing in a combined ozonised flow ice refrigeration system. International Journal of Food Science and Technology, 44, 1595-1601. Aureli, P., Constantini, A. & Zolea, S. 1992. Antimicrobial activity of some plant essential oils against Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection, 55, 344–348. Badii, F. & Howell, N. 2002. Effect of antioxidants, citrate, and cryoprotectants on protein denaturation and texture of frozen cod (Gadus morhua). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2053–2061. Barnabé, G. 1989. Acuicultura. Tomos I y II. Edición española. Ed. Omega. Barcelona.
I-INTRODUCCIÓN 46 Boskou, G. & Debevere, J. 1998. In vitro study of TMAO reduction by Shewanella putrefaciens isolated from cod fillets packed in modified atmosphere. Food Addittives and Contaminants, 15, 229-236. Brink, B., Damink, C., Joosten, H. M L. J. & Huisintveld, J. H. 1990. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology 11, 73-84. Burguess, G. H. O., Cutting, C. L., Lovern, J. A. & Waterman, J. J. 1965. Alteración del pescado. En: El pescado y las industrias derivadas de la pesca. (Ed.) Acribia, Zaragoza, pp. 354-364. Burt, S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods—a review. International Journal of Food Science and Technology, 94, 223-253. Campos, C., Rodríguez, Ó., Losada, V., Aubourg, S. & Barros-Velázquez, J. 2005. Effects of storage in ozonised slurry ice on the sensory and microbial quality of sardine (Sardina pilchardus). International Journal of Food Microbiology, 103, 121-130. Cifuentes Lemos, J. L., Torres-García, M. P. & Frías Mondragón, M.1997. El océano y sus recursos. Acuicultura. Volumen 11. Fondo de cultura económica. México. Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos. 2008. O cooperativismo no mar. Situación Histórica e Potencialidades. http://www.pescagalicia.com/arquivos/articulos/1720.pdf Dorman, H. J. D. & Deans, S. G. 2000. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88, 308-316. Eklund, T. 1983. The antimicrobial effect of dissociated and unidssociated sorbic acid at different pH levels. Journal of Applied Bacteriology, 54, 383-389. Erkan, N. & Mol, S. 2004. The effect of calcium lactate treatment on the shelf life and quality of chub mackerel (Scomber japonicus). Archiv für Lebensmittelhygiene, 55, 73–96. FAO. 2010. El estado mundial de la pesca y la acuicultura. Roma, FAO. 219P . Foster, J. W. 1999. When protons attack: Microbial strategies of acid adaptation. Current Opinion in Microbiology, 2, 170-174. Frankel, E. 1991. Review: Recent advances in lipid oxidation. Journal of the Science of Food and Agriculture, 54, 495-511. Fukunaga, K., Suzuki, T. & Takama, K. 1991. Effect of ozone exposure on the compositions of gill and erythrocyte membrane lipids and proteins of Japanese charr (Salvelinus leucomaenis). Comparative Biochemistry and Physiology, 100B, 481-487.
I-INTRODUCCIÓN 47 Gennadios, A. & Kurth, L. B. 1997. Application of edible coatings on meats, poultry and seafoods: a review. Lebensm.-Wiss. Technology, 30, 337–350. Ghaly, A. E., Dave, D., Budge, S. & Brooks, M. S. 2010. Fish Spoilage Mechanisms and Preservation Techniques: Review. American Journal of Applied Sciences, 7, 859-877. Gill, C. O. 1982. Microbial interaction with meats. En: Meat Microbiology. (Ed.) Brown, M. H. Applied Science Publisher Ltd., Inc. NY. USA, pp. 225-264. Giménez, B., Roncales, P. & Beltran, J. A. 2004. The effects of natural antioxidants and lighting conditions on the quality characteristics of gilt-head sea bream fillets (Sparus aurata) packaged in a modified atmosphere. Journal of Science Food and Agriculture, 84, 1053–1060. Glass, K. A. & Johnson, E. A., 2004. Antagonistic effect of fat on the antibotulinal activity of food preservatives and fatty acids. Food Microbiology, 21, 675–682. Gogus, U., Bozoglu, F., & Yurdugul, S. 2006. Comparative effects of lactic acid, coating combined and alone applications on some postmortem quality criteria of refrigerated Sardina pilchardus. Journal of Food Quality, 29, 658-671. Gopinath, S. P., Kochery Anthony, M. X., Nagarajarao, R. C., Jaganath, B. & Krishnaswamy, S. G. T. 2007. Standardisation of process parametres for ready-to-eat squid masala in indigenous polymer-coated tin-free steel cans. International Journal of Food Science and Technology, 42, 1148–1155. Gram, L., Trolle, G. & Huss, H. H. 1987. Detection of specific spoilage bacteria from fish stored al low (0ºC) and high (20ºC) temperatures. International Journal of Food Micobiology, 4, 65-72. Gram, L. 1992. Evaluation of the bacteriological quality of seafood. International Journal of Food Micobiology, 16, 121-137. Gram, L. & Huss, H. H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food Micobiology, 33, 121-37. Gram, L. & Dalgaard, P. 2002. Fish spoilage bacteria-problems and solutions. Current Opinion in Biotechnology, 13, 262-266. Gutiérrez, J., Barry-Ryan, C. & Bourke, P. 2008. The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. International Journal of Food Microbiology, 124, 91-97.
I-INTRODUCCIÓN 48 Haard, N. F. 1992. Control of chemical composition and food quality attributes of cultured fish. Food Research International, 25, 289-307. Hammer, K. A., Carson, C. F. & Riley, T. V. 1999. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86, 985–990 Hanna, H. Abd El-Baky, Farouk, K. El Baz, Gamal, S.E l Baroty. 2009. Evaluation of Marine Alga Ulva lactuca L. as A Source of Natural Preservative Ingredient. American- Eurasian Journal of Agriculture and Environment Science, 3, 434-444. Harris, P. & Tall, J. 1994. Rancidity in fish. En: Rancidity in foods. (Eds.) J. Allen y R. Hamilton. Chapman y Hall, Londres (G. B.), pp. 256-272. Heen, E. 1982. Developments in chilling and freezing of fish. International Journal of Refrigeration, 5, 45-49. Herbert, R. A. & Shewan, J. M. 1975. Precursor of volatile sulphides in spoiling North Sea Cod (Gadus morhua). Journal of the Science of Food and Agriculture, 26, 1195-1202. Herbert, R. A. & Shewan, J. M. 1976. Roles played by bacterial and autolytic enzymes in the production of volatile sulphides in spoiling North sea cod (Gadus morhua). Journal of the Science of Food and Agriculture, 27, 89-94. Hughes, R. B. & Jones, N. R. 1996. Measurement of hypoxanthine concentration in canned herring as an index of the freshness of the raw material with a comment of flavour relations. Journal of the Science of Food and Agriculture, 17, 434-436. Huss, H. H. 1998. El pescado fresco: Su calidad. Documento técnico de pesca nº348. FAO. Roma. Italia. Hwang, K. & Regenstein, J. 1995. Hydrolysis and oxidation of mackerel (Scomber scombrus) mince lipids with NaCl & NaF treatments. Journal of Aquatic Food Products Technology, 4, 19–30. Jay, J. 1971. Microbiología moderna de los alimentos. (Ed.) Acribia, Zaragoza, España, 320 pp. Kilinc, B., Cakli, S., Dincer, T. & Tolasa, S. 2009. Microbiological, chemical, sensory, color, and textural changes of rainbow trout fillets treated with sodium acetate, sodium lactate, sodium citrate, and stored at 4ºC. Journal of Aquatic Food Product Technology, 18, 3–17. Kim, C. R., Hearnsberger, J. O., Vickery, A. P., White, C. H. & Marshall, D.L. 1995. Sodium acetate and bifidobacteria increase shelf life of refrigerated catfish fillets. Journal of Food Science, 60, 25–27.
I-INTRODUCCIÓN 49 Kraft, A. A. 1992. Psychrotrophic Bacteria in Foods: Disease and Spoilage, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL.USA. Lambert, R. J. & Stratford, M. 1999. Weak-acid preservatives: modelling microbial inhibition and response. Journal of Applied Microbiology, 86, 157-164. Mackie, I. M. 1997. The effects of post-mortem storage on fish muscle proteins. En “Procceedings of the Final Meeting of the Concerted Action: Evaluation of Fish Freshness”. AIR3CT94 2283. FAIR, EU, pp. 185-189. Mahmoud, B. S. M., Yamazakia, K., Miyashitab, K., Il-Shick, S., Dong-Sukd, C. & Suzukia, T. 2004. Bacterial microflora of carp (Cyprinus carpio) and its shelf-life extension by essential oil compounds. Food Microbiology, 21, 657-666. Makarios- Laham, I. & Lee, T. C. 1993. Protein hydrolysis and quality deterioration of refrigerated and frozen seafood due to obligately psychrophilic bacteria. Journal of Food Science, 58, 310-313. Mejholm, O. & Dalgaard, P. 2002. Antimicrobial effect of essential oils on the seafood spoilage micro-organism Photobacterium phosphoreum in liquid media and fish products. Letters in Applied Microbiology, 34, 27-31. Metin, S., Erkan, N., Varlik, C. & Aran, N. 2001. Extension of shelf life of chub mackerel (Scomber japonicus Houttuyn 1780) treated with lactic acid. European Food Research and Technology, 213, 174-177. Miguel, G., Simoes, M., Figueiredo, A. C., Barroso, J. G., Pedro, L. G. & Carvalho, L. 2004. Composition and antioxidant activities of the essential oils of Thymus caespititius, Thymus camphoratus and Thymus mastichina. Food Chemistry, 86, 183–188. Moreira, M. R., Ponce, A. G., Del Valle, C.E. & Roura, S. I. 2005. Inhibitory parameters of essential oils to reduce a foodborne pathogen. LWT–Food Science and Technology, 38(5), 565–570. Muramoto, M., Yamamoto, Y. & Seki, N. 1989. Comparison of calpain of various fish miosins in relation to their thermal stabilities. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fish, 55, 917-923. Oussalah, M., Caillet, S., Saucier, L. & Lacroix, M. 2006. Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Food Control, 18 (5), 414–420.
II-PRESENTACIÓN DEL TRABAJO Y OBJETIVOS 56 Esta parte se corresponde con los capítulos 1 y 2 de este trabajo, donde se evalúan las ventajas del empleo del hielo líquido ozonizado en especies de acuicultura. Parte 2 Su objetivo básico es el de desarrollar un sistema de hielo en escamas a partir de una disolución comercial (BPS2) de ácidos orgánicos naturales, evaluando su influencia a distintas concentraciones como conservante en especies comerciales del Gran Sol: merluza (Merluccius merluccius), gallo (Lepidorhombus whiffiagonis) y rape (Lophius piscatorius). Asimismo, se evaluará el efecto de la inmersión en la mezcla de ácidos orgánicos del bacaladilla (Micromesistius poutassou), especie abundantemente capturada pero considerada como descarte, por su rápido deterioro a bordo y por tanto de bajo valor comercial en la actualidad. Esta parte se corresponde con los capítulos 3 y 4, de este trabajo de investigación, donde se evalúan las ventajas, las concentraciones y el sistema de aplicación adecuadas del empleo de la solución comercial BPS2, sobre la inhibición de los distintos mecanismos de alteración y extensión de la vida útil de especies marinas representativas y de gran importancia por su valor comercial. Parte 3 Su objetivo básico es el de evaluar el sistema de hielo en escamas desarrollado a partir de una disolución de los ácidos cítrico, ascórbico y láctico
II-PRESENTACIÓN DEL TRABAJO Y OBJETIVOS 57 sobre la calidad microbiológica, bioquímica y sensorial de especies marinas correspondientes a la denominada pesca de bajura: jurel (Trachurus trachurus) y caballa (Scomber scombrus). Esta parte se corresponde a los capítulos 5 y 6 que completan la segunda parte de este trabajo, donde se evalúan las ventajas de la presencia en el hielo de estos ácidos orgánicos sobre distintos parámetros de calidad de las dos especies de bajura referidas. Parte 4 Su objetivo básico es evaluar el efecto de un tratamiento combinado de aceites esenciales de orégano y tomillo y el envasado en atmósfera modificada sobre la calidad microbiológica, sensorial y oxidación lipídica en anillas de calamar precocinadas. Esta parte corresponde con el capítulo 7 y última parte del presente estudio.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 61 Ilustración 5: Ozonizado r Ilustración 4: Generador de HL IIIMATERIALES Y MÉTODOS 1- SISTEMAS DE PRESERVACIÓN EMPLEADOS 1.1- Sistemas de refrigeración Para la preparación de hielo tradicional en escamas (HT), se empleó un equipo F100 Compact, modelo Icematic (Caltelmac, Castelfranco, Italia). Para obtener el hielo líquido (HL) se utilizó un prototipo FLO-ICE cedido por Kinarca S.A.U., Vigo, (Ilustración 4). La mezcla obtenida fue 40% hielo y 60% agua a -1.5ºC, a partir de agua de mar filtrada (salinidad 3,3%). El hielo líquido ozonizado (HLO) se preparó a partir de agua de mar filtrada mediante el prototipo FLO-ICE cedido por Kinarka S.A.U (Vigo) (Ilustración 5). La composición de hielo líquido fue 40/60 hielo/agua de mar (salinidad 3,3%). El hielo líquido fue esterilizado mediante inyección de ozono. Esta inyección se logró gracias al sistema proporcionado por Cosemar Ozono (Madrid). El potencial fue ajustado a 700 mV (0,2 mg ozono/L) en la fase líquida.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 62 En el experimento de las especies bivalvas (capítulo 2), tanto el HT como el HLO fueron envasados al vacío en bolsas de polietileno. El generador de vacío empleado fue INELVI TV Series, model 2000 (INELVI, Sta. Coloma de Cervelló, Barcelona). En la Ilustración 6 se puede ver la línea de producción de HLO y posterior envasado al vacío para los moluscos bivalvos. 1.2- Mezcla de ácidos orgánicos naturales En los capítulos 3, 4, 5 y 6 se evaluó la eficacia de ácidos orgánicos naturales (ascórbico, láctico y cítrico) como sistemas de conservación intensificadores de los mecanismos de protección del sistema de hielo en escamas. Este apartado se subdivide en las dos siguientes partes: 1.2.1- Fórmula comercial BPS2 La fórmula comercial (BPS2) que incluyó una mezcla de ácidos orgánicos naturales fue proporcionada por Atlantic One, S.L (Vigo). Este producto consiste en un líquido viscoso, soluble en agua, que incluyó ácido ascórbico (AA), ácido cítrico (AC) y ácido láctico (AL) (1 mequiv. ácido/120 mg de producto) en glicerol, Ilustración 6: Línea de producción y envasado de HLO
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 63 teniendo en cuenta la seguridad de su uso en la alimentación conforme a las administraciones americana y europea (Madrid y col., 1994; Giese y col., 1996). Esta fórmula comercial fue empleada en los estudios correspondientes a los capítulos 3 y 4. 1.2.2- Elaboración de hielo incluyendo ácidos naturales Las disoluciones acuosas preparadas en nuestro laboratorio a partir de los ácidos orgánicos naturales puros, incluyeron valores de concentración equitativos de cada uno de los ácidos (ascórbico, láctico y cítrico), las concentraciones empleadas fueron 0,005% y 0,020% en el caso del jurel y 0,05% en el caso de la caballa. Estas mezclas fueron envasadas en cajas de polietileno y mantenidas en congelación a -20ºC, para obtener un tamaño de hielo común en el momento de su aplicación al jurel (capítulo 5) y caballa (capítulo 6). Los ácidos orgánicos empleados en esta investigación son considerados seguros para uso alimentario conforme a la administración americana y europea (Madrid y col., 1994; Giese y col., 1996). 1.3- Cobertura con aceites esenciales Los aceites esenciales de orégano (Origanum vulgare; AEO) (densidad 0,939 g/l a 25ºC y punto de ebullición 239ºC) y tomillo (Thymus vulgaris; AET) (densidad 0,917 g/l a 25ºC y punto de ebullición 195ºC) fueron adquiridos de Sigma Aldrich, Madrid. La formulación de la cobertura consistió en una mezcla 3:2 de harina y agua fría, que posteriormente se homogeinizó durante 5 min en Ultraturrax (Janke and Kunkel, Ultraturrax T25). Después de la homogeneización, se añadió a esta
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 64 cobertura un volumen de aceite esencial seguido de homogenización durante 1 minuto. Posteriormente las anillas de calamar fueron sumergidas en la cobertura durante 2 minutos para posteriormente introducirse en una freidora (Fritaurus Professional 4, Taurus, Barcelona) durante 20 s y a una temperatura de 180 ± 2ºC. Después del paso de fritura, las anillas fueron colocadas en bandejas de plástico (20 cm x12 cm) y envasadas en bolsas retráctiles de plástico del tipo en multicapas y coextruido. La mezcla de gases constituida por 70% N2, 25% CO2 and 5% O2 fue inyectada en cada una de las muestras en la relación 1/2 (w/v) de anillas-atmósfera. Las cajas fueron selladas inmediatamente para obtener el producto comercial RTE. Cada una de las bandejas estuvo constituida por 3 anillas de calamar, por lo que fueron necesarias 24 bandejas en el caso del primer experimento con AEO, y 18 bandejas para el segundo experimento con AET. 2- MATERIA PRIMA DE ESPECIES MARINAS, PROCESAMIENTO Y MUESTREO 2.1- Trucha arco iris La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) se denomina así por las numerosas manchas irisadas en su piel. Es la principal especie acuícola de la acuicultura europea, elegida por su alta resistencia y rápido crecimiento.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 65 Un total de 108 ejemplares de trucha arco iris de cultivo procedentes de Isidro de la Cal (Coruña, España). La longitud de dichos ejemplares estaba comprendida entre los 25 y 30 cm y su peso osciló entre los 0,23 y 0,33 kg. La mitad de estos individuos fueron sacrificados en la piscifactoría mediante inmersión durante 20 minutos en HL y la otra mitad en HLO. Ambos tratamientos fueron empleados como sistemas de refrigeración para su traslado al laboratorio durante 2h, en una proporción pescado: hielo 1:1 y a una temperatura de 0ºC. Una vez allí, los especímenes fueron colocados en una habitación isoterma a 1ºC con sus correspondientes sistemas de refrigeración. A día 1, se tomaron para análisis nueve muestras de cada uno de los lotes y se dividieron en tres grupos (tres individuos en cada grupo), que se estudiaron independientemente (n=3). En cada día de análisis, se tomaron tres lotes, con tres individuos por lote, para cada sistema de refrigeración. Las tomas de muestra se llevaron a cabo en los días 1, 3, 6, 9, 13 y 16 de los días de almacenamiento en refrigeración. Las mezclas de hielo fueron renovadas cuando fue requerido. Ilustración 7. Oncorhynchus mykiss Nombre inglés: Farmed Trout Nombre gallego: Troita arco da vella
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 72 Ilustración 16. Scomber scombrus Nombre inglés: Atlantic mackerel Nombre gallego: Xarda respectivamente. Una vez en el laboratorio, se separaron 9 ejemplares que fueron considerados como muestra inicial (día 0). Se analizaron tres grupos de manera independiente, con tres individuos en cada grupo (n=3). Los ejemplares restantes fueron divididos en tres lotes (36 individuos en cada uno de los lotes). El primer lote fue almacenado en cajas y rodeado directamente con el hielo preparado mediante una solución acuosa de ácidos orgánicos en una concentración de 0,005% (p/v) de cada ácido en agua (condición P-1). El segundo lote fue tratado de igual manera al anterior pero la concentración de la mezcla de ácidos fue 0,020% en agua (p/v) (condición P-2). El lote control almacenado en cajas, estuvo en contacto solamente con hielo tradicional preparado únicamente a partir de agua (condición C). Los ejemplares de jurel fueron analizados en los días 4, 7, 11 y 13. En cada punto de muestreo, se tomaron para analizar nueve individuos de cada lote, clasificados en tres grupos (tres individuos por grupo), siendo analizados de manera independiente (n=3). Todos los lotes fueron almacenados en una cámara termostatizada a 4ºC, y las mezclas de hielo fueron renovadas cuando fue requerido. 2.6- Caballa Los ejemplares de caballa (Scomber scombrus, 81 individuos), fueron capturados cerca de la costa atlántica gallega. La longitud y el peso de los ejemplares de caballa presentaron un rango comprendido entre 21-25 cm y 175-230 g respectivamente.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 73 Una vez en el laboratorio, se separaron 9 individuos que fueron considerados como muestras iniciales (día 0). Se analizaron tres grupos diferentes de manera independiente (tres individuos por grupo) para realizar el anáisis estadístico (n=3). El resto de ejemplares se dividieron en dos lotes (36 individuos en cada lote). El primer lote fue depositado en cajas y rodeado con hielo preparado mediante una disolución acuosa de ácidos orgánicos en una concentración de 0,050% para cada uno de ellos en agua (p/v) (condición P). El segundo lote, correspondiente al lote control, fue colocado en cajas y rodeado con hielo tradicional (condición C). Con el fín de evaluar la concentración de ácidos adecuada para ser utilizada en la elaboración del hielo, se realizaron ensayos preliminares con disoluciones preparadas a partir de la combinación de los tres ácidos. El resultado obtenido en el análisis visual del pescado para el rango de concentraciones comprendidas entre 0,005% y 0,250%, indicó que la concentración 0,050% era la más adecuada para llevar a cabo la investigación. En ambos lotes (P y C), la proporción empleada pescado-hielo fue 1:1. Todos los lotes fueron almacenados en una cámara termostatizada a 4ºC, y las mezclas de hielo fueron renovadas cuando hubo necesidad. Las muestras de caballa de ambos lotes fueron analizadas a días: 3, 6, 10 y 13. En cada día de muestreo, se tomaron 9 individuos de caballa de cada uno de los lotes para su análisis, considerados en tres grupos (tres individuos en cada grupo), que fueron analizados de manera independiente con el fin de realizar el análisis estadístico (n=3).
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 74 Ilustración 17. Loligo vulgaris Nombre inglés: Squid Nombre gallego: Calamar 2.7- Anillas de calamar Las anillas de calamar congeladas fueron suministradas por una industria local especializada en la comercialización de productos del mar del tipo “ready to eat”. Las anillas de calamar fueron preparadas a partir de calamar fresco y posteriormente congeladas a -40ºC durante 1 mes. Los pesos medios de las anillas presentaron un rango comprendido entre 18-20 g. Se llevaron a cabo dos experimentos para evaluar el efecto de la presencia de aceite esencial de orégano (AEO) y aceite esencial de tomillo (AET). En ambos experimentos, la descongelación se llevó a cabo durante toda la noche en almacenamiento a 4ºC. El primer experimento correspondiente a AEO incluyó 306 anillas de calamar, que fueron asignadas de manera aleatoria a cuatro lotes (72 anillas en cada uno). Tres de estos lotes fueron procesados con la mezcla de cobertura de AEO en las siguientes concentraciones 0,010% (lote O-1), 0,025% (lote O-2) y 0,050% (lote O-3) (w/w, AEO/calamar). El cuarto lote, designado como lote control (C-O) no contuvo orégano. Las anillas restantes (n=18) consideradas como muestras iniciales del experimento con orégano, fueron distribuidas en tres grupos (6 anillas en cada uno) y analizadas independientemente. El segundo experimento corresponde a AET, este experimento incluyó 234 anillas de calamar, que fueron asignadas aleatoriamente en 4 lotes (54 anillas en cada lote). Se procedió de igual modo que en el experimento anterior, tres de los lotes fueron procesados con la mezcla de cobertura de AET en las siguientes
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 75 concentraciones: 0,010% (lote T-1), 0,025% (lote T-2) y 0,050% (lote T-3) (w/w, AET/calamar). El cuarto lote, designado como lote control (C-O) no contuvo tomillo. Las anillas restantes (n=18) consideradas como muestras iniciales del experimento con tomillo, fueron distribuidas en tres grupos (6 anillas en cada uno) y analizadas independientemente. Los procesos de cobertura, fritura, embalaje y temperatura de almacenamiento fueron las mismas que en el experimento AEO. Las muestras una vez preparadas, como se indicó en el apartado 1.4, fueron envasadas bajo atmósfera modificada y almacenadas en refrigeración a 4º C. Las muestras del experimento con AEO fueron tomadas para análisis en los días: 3, 7, 10 y 14; en el caso del experimento con AET, las muestras fueron tomadas para análisis en días: 5, 8 y 12. Para ambos experimentos, se analizaron 6 bandejas correspondientes a cada uno de los tratamientos al mismo tiempo de refrigeración. Para este análisis, las bandejas se distribuyeron en 3 grupos (con dos bandejas por grupo) y cada uno de los grupos fue analizado de manera independiente. Antes de la elección de la concentración adecuada de AE, se realizaron ensayos preliminares con el fin de establecer el máximo de concentración que se podría emplear para cada uno de los aceites, sin que este valor afectase al olor del producto. El análisis sensorial de las anillas de calmar, lo realizó un panel de 5 jueces expertos. Las muestras se presentaron a los panelistas, codificadas con tres dígitos y fueron calificadas como “afectada” “no afectada” “dudosa”. Al finalizar este experimento, se llegó a la conclusión que si los aceites esenciales son
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 76 añadidos a concentraciones de 0,075% (p/p) o mayores, se hace notar la presencia del aceite esencial en las anillas de calamar RTE; por tanto, en este estudio, los valores de concentración elegidos, fueron menores de 0,075%. 3- ANÁLISIS DE PARÁMETROS RELACIONADOS CON LA CALIDAD 3.1- Análisis sensorial La evaluación de la calidad sensorial en los moluscos bivalvos, tanto en crudo como cocinados, se llevó a cabo por un panel de cinco jueces experimentados, quienes, durante 10 años, han analizado diferentes clases de productos marinos. Las muestras de bivalvos se cocinaron a 100ºC durante 5 minutos en HLO (lote HLO) o en agua fresca suplementada con 3,3% de NaCl (lote HT). Las muestras de bivalvos crudas y cocidas (140 g) se presentaron de manera individual a los panelistas. La parte comestible se retiró de la concha, de manera que se consiguió al menos 20 g de parte comestible. Las muestras fueron preparadas en una habitación y analizadas en una habitación aislada, bien ventilada y con buena luz. Los panelistas puntuaron olor y apariencia de las muestras de bivalvos, tanto crudas como cocidas, de acuerdo a las indicaciones presentadas en la Tabla 1 (Anonymous, 1999). Se utilizó una escala de valoración de 1-5, siendo la puntuación de 5 correspondiente a la máxima calidad y 1 para la peor calidad. En el caso de las muestras cocinadas, los panelitas evaluaron además la jugosidad de las muestras usando la escala de puntuación de 1 a 5.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 77 Atributo Escala 5 Escala 4 Escala 3 Escala 2 Escala 1 Olor Fresco y característico A mar Sin olor, tras cocer agradable Ligero pútrido Pútrido Apariencia Valvas cerradas Valvas abiertas se cierran al golpearlas. Músculo adherido a las valvas y de aspecto esponjoso Valvas semiabiertas no cierran al golpearlas. Músculo adherido a las valvas se mantiene el color Valvas abiertas con flexibilidad. El músculo se suelta fácilmente. Pérdidad ligera de color Valvas abiertas. Tendencia a separarse Pérdida total del color Jugosidad/ Sabor Alta jugosidad Sin pérdida de agua Jugosidad media Sin pérdida de agua Jugosidad media y pérdida de agua Pérdia de agua y de jugosidad Tabla 1: Criterios de calidad sensorial para bivalvos La evaluación de calidad sensorial en el pescado, fue realizada por un panel de cinco jueces experimentados, de acuerdo a las indicaciones presentadas en la Tabla 2 (Council Regulation, 1989). Los análisis sensoriales se llevaron a cabo con los especímenes de pescado enteros. Se establecieron cuatro categorías: (E) alta calidad, (A) buena calidad, (B) calidad aceptable, (C) calidad inaceptable. Las muestras de análisis sensorial fueron tratadas en una sala de preparación y se analizaron en una habitación aislada, bien ventilada y con buena iluminación. Se examinaron los siguientes atributos: piel, ojos, olor externo, branquias, consistencia y olor del músculo. El color de las muestras se evaluó como un aspecto subjectivo del atributo de la piel. En cada día de muestreo, las muestras de pescado fueron codificadas y presentadas a los panelistas de manera ciega, siendo puntuadas individualmente. El papel de expertos compartió todas las muestras.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 78 Atributo Calidad alta (E) Buena Calidad (A) Calidad aceptable (B) Rechazable (C) Piel Mucosidad transpartente; pigmentación intensa Mucosidad lechosa; pérdidas insignificantes de pigmentación Mucosidad débilmente gris; pigmentación sin brillo Mucosidad opaco; importantes pérdidas de pigmentación Olor externo Marcadamente a algas y crustáceos Débilmente a algas y crustáceos Incipientemente agrio y rancio Marcadamente agrio o rancio Branquias Color rojo brillante; sin olor; láminas perfectamente separadas Color rosa; sin olor; láminas adheridas en grupos Color débilmente pálido; olor incipientemente pútrido; láminas adheridas en grupos Color gris amarillento; olor pútrido; láminas totalmente adheridas Consistencia Presencia o aparación parcial de rigor mortis Firme y elástica; los signos de presión desaparacen inmediatamente y completamente Elasticidad notablemente reducida; presencia de signos mecánicos Cambios importantes en la forma debido a factores mecánicos Olor del músculo Marcadamente a algas y crustáceos Débilmente a algas y crustáceos Incipientemente agrio o rancio Marcadamente agrio o rancio Ojos Convexos; córnea transparente; pupila negra brillante Convexos y débilmente hundidos; córnea débilmente opalescente; pupila negra nublada Planos; córnea opalescente; pupila opaca Cócavos y córnea lechosa; órganos internos movidos Tabla 2. Criterios de calidad sensorial del pescado. Council Regulation (1989) 3.2- Análisis Microbiológico 3.2.1- Preparación de las muestras Para realizar el análisis microbiológico de las muestras, se realizó una etapa de preparación mediante una serie de equipos, materiales y medios de cultivo. Inicialmente se tomó una porción de muestra en cámara de flujo laminar y en condiciones asépticas. Esta porción de muestra se colocó en una bolsa estéril con un volumen (1/9) (p/v) de agua de peptona (Merck, Darmstadt, Germany). Esta mezcla se homogeneizó en un masticator (AES, Combourg, France) (Ben-Gigirey y col., 1998, 1999). En el caso del análisis de la superficie del pescado, 5 cm2 de
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 79 la superficie de las muestras fueron frotadas con un hisopo. La carga microbiológica del hisopo fue resuspendida en 10 ml de agua de peptona. Se realizaron diluciones seriadas de los extractos microbiológicos preparados con el agua de peptona para los dos casos anteriores y posteriormente se llevó a cabo el análisis microbiológico cuantitativo. 3.2.2- Microbiota aerobia mesófila Los microorganismos aerobios mesófilos fueron investigados en Plate Count Agar (PCA, Oxoid Ltd, London, UK), después de incubación a 30ºC durante 48 horas (Ben-Gigirey y col., 1998, 1999). 3.2.3- Microbiota anaerobia Los microorganismos anaerobios fueron investigados en Plate Count Agar (PCA, Oxoid Ltd, London, UK), después de incubación a 30ºC durante 48 horas en el interior de una jarra de anaerobiosis y bajo atmósfera anaerobia (Oxoid) (Ben-Gigirey y col., 1998, 1999). 3.2.4- Microbiota psicrófila Los microorganismos psicrófilos fueron investigados en Plate Count Agar (PCA, Oxoid Ltd, London, UK), después de incubación a 7-8ºC durante 7 días) (Ben-Gigirey y col., 1998, 1999). 3.2.5- Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae fueron investigados mediante agar glucosa rojo violeta bilis (VRBG) (Merck, Darmstadt, Alemania) después de incubación a 30 ºC durante 24 h (Merck Microbiology Manual, 2002).
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 80 3.2.6- Microbiota proteolítica Los microorganismos que exhiben un fenotipo proteolítico fueron investigados en agar-caseína tras su incubación a 30ºC durante 48h (Ben-Gigirey y col., 2000; Phaff y col., 1994). 3.2.7- Microbiota lipolítica Los microorganismos que exhiben un fenotipo lipolítico fueron investigados en agar-tributirina después de ser incubados a 30ºC durante 48 h (Ben-Gigirey y col., 2000). 3.3- Análisis Bioquímicos 3.3.1- Valoración de pH Se utilizó un pHmetro (Crison, Barcelona) provisto de un electrodo de penetración de 6 mm de diámetro. Para su calibración se utilizaron soluciones patrón de pH 4 y 7, siguiendo los métodos oficiales de análisis. La lectura del pH se efectuó mediante penetración del electrodo en el músculo en los puntos de muestreo establecidos. 3.3.2- Análisis composicional El contenido en agua fue determinado por la diferencia de peso de músculo homogeneizado (1-2 g) y el peso después de mantener durante 24 h a 105ºC. Los resultados fueron expresados como g agua/100g músculo. Los lípidos fueron extraídos y determinados por el método de Bligh & Dyer (1959). Los resultados se expresaron en g lípidos/ 100g músculo húmedo.
IIIMATERIALES Y MÉTODOS 81 3.3.3- Índice de peróxidos El índice de peróxidos (PV), medida de la oxidación lipídica primaria, fue determinado espectrofotométricamente (Beckman Coulter, DU 640, London, UK) en los extractos lipídicos mediante previa reducción de una alícuota con tiocianatao férrico (método Chapman & McKay, 1949). Los resultados se expresan como mequiv. de oxígeno activo/ kg lípidos. 3.3.4- Índice de ácido tiobarbitúrico El índice de ácido tiobarbitúrico (TBA-i), indicativo de la oxidación lipídica secundaria, fue determinado de acuerdo con el método Vyncke (1970). Este método está basado en la reacción entre el extracto del músculo de pescado en tricloroacético y el ácido tiobarbitúrico. El contenido en sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) fue medido espectrofotométricamente a 532 nm y los resultados fueron expresados como mg malondialdehído/ kg músculo. 3.3.5- Formación de compuestos fluorescentes La formación de compuestos fluorescentes, medida de la oxidación lipídica terciaria, fue determinada mediante espectrofluorímetría (Fluorimetro LS 45, Perkin, Elmer España, Tres Cantos, Madrid), tras medidas a 393/463 nm y 327/415 nm (Aubourg y col., 2004). La fluorescencia relativa (RF) fue calculada como sigue: RF= F/Fst, donde F es la fluorescencia media a cada máximo de excitación/emisión y Fst es la intensidad de la fluorescncia de una disolución de sulfato de quinina (1 µg/ml en 0,05M H2SO4) a la correspondiente longitud de onda. La relación de fluorescencia (FR) fue calculada como la relación de los dos valores relativos: FR = RF393 ⁄ 463 nm ⁄ RF327 ⁄ 415 nm. El valor de FR fue determinado
Parte 1 CAPÍTULO 1: Improved quality and shelf life of farmed trout (Oncorhynchus mykiss) by whole processing in a combined ozonised flow ice refrigeration system. Mejora de la calidad y de la vida útil de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) mediante conservación en un sistema combinado de hielo líquido y ozono.
Original article Improved quality and shelf life of farmed trout (Oncorhynchus mykiss) by whole processing in a combined ozonised flow ice refrigeration system Santiago P. Aubourg, 1 Silvia Testi, 2 Minia Sanxua ´s, 3 Carolina Gil 1 & Jorge Barros-Vela ´zquez 3 * 1 Department of Seafood Chemistry, Institute for Marine Research (IIM-CSIC), C ⁄Eduardo Cabello 6, E-36208 Vigo, Spain 2 Department of Veterinary Morpho-Physiology Sciences and Animal Production, University of Bologna, Bologna, Italy 3 LHICA, Department of Analytical Chemistry, Nutrition and Food Science, School of Veterinary Sciences, University of Santiago de Compostela, E-27002 Lugo, Spain (Received 11 August 2008; Accepted in revised form 13 November 2008) Summary A combined refrigeration system consisting of ozone and flow ice was evaluated for the sacrifice, cooling and chilled storage of continental trout. The batch processed in ozonised flow ice exhibited significant (P< 0.05) reductions (0.97 and 1.51 log CFU cm )2 ) in skin aerobes and psychrotrophs on days 6 and 9, respectively, and significant (P< 0.05) reductions (0.94 log CFU g )1 and 0.96 log CFU g )1 ) in aerobes, and proteolytic bacteria in muscle on day 13. A significant (P< 0.05) inhibition of TMA-N formation after 9 days was also observed, with an average reduction of 28.4% along the storage period, Slight reductions in autolytic breakdown mechanisms were also observed in the ozonised batch, a maximum reduction of 14.82% being reached on day 13. The microbial and biochemical changes were well correlated with the sensory evaluation, which revealed relevant differences between the batches on day 13 and a shelf life extension of the ozonised batch up to day 16. Keywords Chilled storage, fish processing, flow ice, ozone, quality, refrigeration, shelf life, slaughter, trout. Introduction Flow ice (FI) – also known as slurry ice, fluid ice or liquid ice – is an advanced refrigeration method for the sub-zero storage of fish and other food products. FI consists of a biphasic ice–water suspension that provides a remarkably high chilling rate when compared with alternative and more traditional refrigeration systems such as flake ice or chilled water. FI also prevents the physical damage suffered by seafood products thanks to the spherical geometry of its microscopic particles, which are less harsh to the product than the aciculate crystals of conventional flake ice. FI can also be pumped, thus allowing a more hygienic manner of fish processing and process automation (for a review: Pin ˜eiro et al., 2004). In recent years, sound scientific evidence has confirmed the theoretical advantages of FI for the refrigeration of marine fish specimens. Thus, as the pioneer works with finfish (Chapman, 1990) and albacore (Price et al., 1991), to the more recent reports for turbot (Rodrı´guez et al., 2006), sardine (Losada et al., 2004; Campos et al., 2005) and horse mackerel (Rodrı´guez et al., 2005), FI systems have provided quality retention and shelf life extension in marine fish species. The present work was aimed at gaining scientific data at three different levels: (i) the suitability or not of the application of FI systems to continental species such as trout, a fish species whose farming is making it more readily available and better appreciated by European consumers; (ii) the usefulness of FI systems for the whole processing of fresh fish material, this including slaughter, chilling and refrigerated storage; (iii) the benefits of the combination of FI and ozone for the whole processing of farmed trout. Ozone has traditionally been used as a disinfectant for fresh water aquaculture systems, and its applications for improving the sensory quality and shelf life of fish have been described recently (Ko ¨tters et al., 1997; Kim et al., 1999, 2000; Campos et al., 2005; Rodrı´guez et al., 2006). The microbial identity of the bacteria present in trout intestine has been studied (Spanggaard et al., 2000), although no quantitative information is currently available about microbial activity in trout muscle as affected by different preservation techniques. On comparing refrigeration systems and other processing methods, quality control is mandatory to *Correspondent: Fax: +34 982 252195; e-mail: [email protected] International Journal of Food Science and Technology 2009, 44, 1595–1601 1595 doi:10.1111/j.1365-2621.2008.01889.x 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology
elucidate the significance of the differences observed (for a review, see Arvanitoyannis et al., 2005). Thus, chemical parameters such as total volatile base nitrogen (TVB-N), trimethylamine-nitrogen (TMA-N) and thiobarbituric acid-index (TBA-i) have been successfully employed to elucidate the appropriateness or not of the irradiation of sea bass (O ¨zden et al., 2007). Likewise, gutted and ungutted refrigerated sea bream and sea bass have been studied comparatively by means of chemical – TVB-N, TMA-N, TBA-i– , microbiological – aerobic mesophiles and psychrophilic bacteria – , and sensory analyses (Cakli et al., 2006). Also, mechanical methods and computer image analyses have been considered to complement sensory analyses in certain specific cases, such as the detection of blood residues in refrigerated farmed turbot (Roth et al., 2007). In this work, we evaluated an integral slaughter, chilling and storage refrigeration system – resulting from the combination of ozone and FI – for farmed trout. The effects of FI systems on the quality of trout specimens were evaluated by assessing relevant biochemical, sensory and microbial quality indicators. Materials and methods Refrigeration systems Flow ice was prepared using a FLO-ICE prototype (Kinarca S.A.U., Vigo, Spain). The composition of the FI binary mixture was 40% ice and 60% water, prepared from filtered seawater (salinity: 33.0 g kg )1 ). The temperature of the FI mixture was )1.5 C. When required, injection of ozone into the FI mixture was accomplished with a prototype provided by Cosemar Ozono (Madrid, Spain), the redox potential being adjusted to 700 mV (0.20 mg ozone L )1 ). In this batch, the ozone concentration was constantly monitored by checking the redox potential in the liquid phase. Fish material and sampling protocol Specimens (108 individuals) of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (weight range: 0.23–0.33 kg; length range: 25–30 cm) were obtained from an aquaculture facility (Isidro de la Cal, La Coruna, Spain) and were sacrificed at the farm by immersion for at least 20 min in either FI (54 individuals) or ozonised FI (OFI: 54 individuals). The fish specimens were not headed or gutted. In both systems, the fish were surrounded by FI or OFI at a 1:1 fish-to-ice ratio and transported for 2 h at 0 C to the laboratory. Then, the specimens were maintained in their corresponding icing medium and placed directly in an isothermal room at +1 C. On day 1, nine specimens from each batch were taken for analysis and divided into three groups (three individuals in each group), which were studied separately (n= 3). Once the specimens had been subjected to sensory analyses, the white muscle was dissected out aseptically and used for microbial and biochemical analyses. Fish sampling was performed on days 1, 3, 6, 9, 13 and 16 of refrigerated storage, according to the same sampling design (n= 3). Sensory analyses Sensory analyses were performed with whole fish, following official guidelines concerning fresh and refrigerated fish (Council Regulation, 1989). Four categories were ranked: highest quality (E), good quality (A), fair quality (B), and unacceptable quality (C). The samples for sensory analysis were handled in a preparation room and were analysed in a well-ventilated isolated room provided with good lighting. The following attributes were examined: skin, eyes, external odour, gills, consistency and flesh odour. The colour of the samples was evaluated as a subjective aspect of the ‘skin’ attribute. At each sampling time, coded fish specimens were presented to panellists in a ‘blind’ manner, and were scored individually. Panel members shared the samples tested. The sensory analyses were conducted by a panel consisting of five experienced judges who had been involved in the sensory analysis of different fish species for 10 years. Prior to this study, the panellists were specially trained with chilled rainbow trout by means of the discriminative triangle test (ISO standard 4120). This method can be applied to reveal slight differences between fish samples. The differences concern all the attributes of the samples, the principle consisting of the simultaneous presentation to the panellists of a set of three coded samples, two of which are identical. The panellists were trained in basic aspects, the most frequent fish aspect and odour, and had to learn the difference between off-flavour and taints in rainbow trout. Chemical and microbial quality indices were also developed for the standard reference samples to assist in the standardisation of the judges’ evaluation of product sensory attributes. The judges had to demonstrate their competency to evaluate the fish specimens in compliance with the standards. Microbiological analyses Fish skin sections of 5 cm 2 were swabbed with 1 g L )1 of sterile peptone water (Oxoid Ltd., London, UK) and the microbial load was resuspended in 10 mL of peptone water (1 g L )1 ). In parallel, samples (5 g) of fish muscle were also dissected out aseptically from skinned chilled specimens, mixed with 45 ml of peptone water (1 g L )1 ), and homogenised in a stomacher (Seward Medical, London, UK). In both cases, serial dilutions from the skin or muscle microbial extracts were prepared in Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al.1596 International Journal of Food Science and Technology 2009 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology
peptone water (1 g L )1 ). Total aerobic and psychrotrophic bacteria from surface and muscle samples were investigated in Plate Count Agar (PCA; Oxoid) after incubation at 30 C for 48 h or at 7–8 C for 10 days, respectively, as described elsewhere (Ben-Gigirey et al., 1998; Rodrı´guez et al., 2004). Microorganisms exhibiting a proteolytic phenotype were investigated in casein-agar medium, as previously described (Phaff et al., 1994). Chemical analyses Analysis of the autolytic nucleotide degradation rate was carried out by HPLC as described elsewhere (Ryder, 1985). The Kvalue was calculated according to the following concentration ratio: Kvalue = 100 ·(hypoxanthine + inosine) ⁄(adenosine triphosphate + adenosine diphosphate + adenosine monophosphate + inosine monophosphate + inosine + hypoxanthine). TVB-N contents were measured as described elsewhere (Aubourg et al., 1997). Briefly, fish muscle (10 g) was extracted with 6% perchloric acid and volume was brought up to 50 mL. After steam-distillation of the acid extracts rendered alkaline to pH 13 with NaOH (200 g L )1 ), TVB-N contents were determined by titration of the distillate with 10 mmHCl. The results were expressed as mg TVB-N kg )1 muscle. TMA-N values were determined by the picrate method, as previously described (Tozawa et al., 1971). This involves the preparation of a 50 g L )1 trichloroacetic acid extract of fish muscle. The results are expressed as mg TMA-N kg )1 muscle. The lipid fraction was extracted using the method of Bligh & Dyer (1959). Lipid oxidation was assessed with the TBA-i, which was determined according to Vyncke (1970). The results are expressed as mg malondialdehyde kg )1 fish sample. The free fatty acid (FFA) content was determined using the Lowry and Tinsley method, based on complex formation with cupric acetate–pyridine (Lowry & Tinsley, 1976). The results are expressed as g FFA kg )1 lipids. Statistical analyses A multivariate analysis was performed to study the effect of each refrigeration system on the microbiological and chemical parameters. One-way analysis of variance (anova) was also used to explore significance of differences among microbiological and chemical parameters throughout storage for each refrigeration system. Multiple comparisons between parameters were carried out with the DMS test. All tests were carried out using the spss software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). In all cases, a confidence interval at the 95% level (P< 0.05) was considered. Results and discussion Sensory analyses The results of the sensory analyses are shown in Table 1. It may be observed that the trout specimens processed in the combined system of FI and ozone retained a good quality (E or A categories) up to day 13, except for the gill aspect. However, when FI was used alone, good quality was only retained up to day 6 (Table 1). With respect to the investigation of colour, this was included as a part of the ‘skin’ attribute, and this parameter afforded better scores for the OFI batch on days 6, 9 and 13 of refrigerated storage as compared to the FI batch. It is remarkable that the limiting factor of sensory acceptability in the FI batch was the external odour, which led to rejection of the FI batch on day 16. Previous work carried out at our laboratory has indicated that continental trout specimens of similar sizes to those studied here have an average shelf life of 13 days, this being in agreement with the results obtained for the FI batch. Thus, according to the sensory evaluation the combined use of FI and ozone may increase the shelf life of continental trout slightly from 13 to 16 days. Table 1 Comparative sensory evaluation of trout stored in batches Storage time (days) 1 3 6 9 13 16 FI OFI FI OFI FI OFI FI OFI FI OFI FI OFI Skin E E E E A E B A B A B B Eyes E E E E E E A A B A B B External odour E E E E E E A A B A C B Gills E E E E A A B B B B B B Consistency E E A A A A A A A A B B Flesh odour E E E E E E A A A A A A FI, flow ice; OFI, ozonised flow ice; E, highest quality; A, good quality; B, fair quality; C, unacceptable quality. Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al. 1597 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology International Journal of Food Science and Technology 2009
Previous studies have reported that the application of ozone extends the shelf life of rockfish (Sebastes spp.) (Ko ¨tters et al., 1997), and catfish (Ictalurus punctatus) fillets (Kim et al., 2000). Other authors have also reported reductions in the discoloration rate of minced horse mackerel as a benefit of washing with ozonised water (Chen et al., 1997), and a better maintenance of the sensory quality of scad (Trachurus trachurus) treated on-board with gaseous ozone (Da Silva et al., 1998). Likewise, a previous study performed at our laboratory reported for the first time the monitored application of ozone in the liquid phase of a subzero biphasic ice–water mixture for the storage of a marine fish species; namely, turbot (Psetta maxima) (Rodrı´guez et al., 2006). The present study provides evidence for the first time of the usefulness of the combination of ozone and FI for the extension of shelf life of a continental fish species, in this case trout. Microbiological analyses Microbial development in trout muscle among chilled storage is shown in Table 2. The use of FI alone (FI batch) proved to be an accurate processing strategy for the slaughter, chilling and refrigerated storage of trout. Thus, the results depicted in Table 2 for that batch clearly indicate a slow microbial growth in trout muscle according to the three microbial parameters tested. It is remarkable that microbial numbers remained below 3 log CFU g )1 even up to day 9 of storage, a result that is correlated well with the sensory quality investigated in parallel (Table 1). Significant (P< 0.05) increases in microbial numbers were observed during advanced periods of storage (day 13 and onwards, Table 2). However, even after 16 days of storage, the microbial counts in the FI batch did not reach concentrations of 6 log CFU g )1 , this value being below those considered necessary to induce fish spoilage (Gram & Huss, 1996). These results clearly indicate that the rapid chilling conditions provided by the FI mixture, together with its hygienic aspect, provided a good microbial control of refrigerated trout. Regarding the assessment of the whole processing of trout in OFI, this system led to lower mean counts for aerobic mesophiles and psychrotrophic and proteolytic bacteria in trout muscle, when compared with the FI batch (Table 2). Thus, statistical analyses revealed significant (P< 0.05) differences between the FI and OFI batches for aerobic mesophiles (storage days 3, 9 and 13), psychrotrophs (storage days 3, 6, 9 and 13) and proteolytic bacteria (storage days 6, 9 and 13) (Table 2). Moreover, microbial growth was slower in the OFI batch than in the FI counterpart, the numbers being below 4 log CFU g )1 even after 13 days of storage. Considering the whole storage period of 16 days, the mean differences between batches were 0.42 log CFU g )1 , 0.44 log CFU g )1 and 0.46 log CFU g )1 units for the aerobes, psychrotrophs, and proteolytic bacteria respectively. The assessment of microbial growth on trout skin along chilled storage is shown in Table 3. Two microbial groups were investigated in this phase: mesophilic and psychrotrophic bacteria. The microbial populations increased with storage time in both batches but the counts remained below 4 log CFU cm )2 even after 16 days of storage. This indicates a very limited microbial growth at surface level. The surface washing of trout skin caused by the FI could account for the low surface numbers determined in this continental fish species, as has been described for marine fish species (Campos et al., 2005; Rodrı´guez et al., 2005, 2006). However, the combined use of ozone and FI (OFI batch) exerted an additional reducing effect on microbial numbers after 3 days of storage (Table 3). Considering the whole storage period of 16 days, the mean differences between batches were 0.20 log CFU cm )2 and 0.26 log CFU cm )2 for the aerobes and psychrotrophs respectively. Remarkably, statistically significant (P< 0.05) differences were observed between the batches for at least one of the microbial groups investigated on days 6, 9 and 13 of refrigerated storage (Table 3). The ability of ozone to inactivate food surfaces has been a matter of debate. Some authors have reported that ozone decreases the surface microbial load of fish during its chilled storage (Dondo et al., 1992; Da Silva et al., 1998). In contrast, other authors have suggested Table 2 Comparative microbial growth in trout muscle stored in flow ice (FI) or ozonised flow ice (OFI) Storage time (days) Aerobic mesophiles (log CFU g -1 ) Psychrotrophes (log CFU g -1 ) Proteolytic bacteria (log CFU g -1 ) FI OFI FI OFI FI OFI 1 1.62 a (0.33) 1.61 a (0.37) 1.10 a (0.15) 1.00 a (0.00) 2.32 a (0.47) 1.99 a (0.00) 3 2.45 b (0.13) 2.08 a (0.17) 2.19 b (0.37) 1.33 a (0.30) 2.83 a (0.65) 2.64 a (0.66) 6 1.94 a (0.34) 1.83 a (0.04) 2.54 b (0.35) 1.79 a (0.29) 2.48 b (0.32) 1.98 a (0.00) 9 2.67 b (0.26) 1.78 a (0.25) 1.67 b (0.14) 1.10 a (0.15) 2.67 b (0.25) 2.15 a (0.15) 13 4.42 b (0.27) 3.48 a (0.35) 4.24 b (0.15) 3.82 a (0.11) 4.21 b (0.35) 3.25 a (0.32) 16 5.91 a (0.80) 5.76 a (0.60) 5.64 a (0.80) 5.74 a (0.50) 5.87 a (0.13) 5.65 a (0.56) Results are average values and standard deviations (between brackets). Results followed by different letters are statistically different (P< 0.05). Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al.1598 International Journal of Food Science and Technology 2009 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology
that ozone inactivates bacteria less effectively when they are attached to solid surfaces when compared with low ozone-demand liquid media (Kim et al., 1999). The results obtained by us here indicated a slight reduction in the microbial populations present on the surface of trout due to ozone, supporting the former statement. The results of microbial analyses of trout stored in OFI were also well correlated with those of the sensory analyses, the latter indicating a slightly better quality maintenance in the OFI batch when compared with the FI batch (Table 1). According to our results, the combined use of FI and ozone for the slaughter, chilling and storage of continental trout provides an additional advantage at microbial level, as determined by the microbial numbers present in the fish skin and flesh along 16 days of storage. Although microbial growth was significantly slowed down in certain storage periods in the OFI batch, none of the microbial groups investigated reached counts higher than 10 6 CFU g )1 , also indicating that microbial spoilage is not the limiting factor of acceptability of continental trout. Chemical analyses The chemical parameters investigated in trout muscle along storage are shown in Table 4. With respect to the autolytic nucleotide degradation rate, the Kvalue increased to values above 80 after 9 days of storage in both batches. No significant (P> 0.05) difference was observed between the ozonised and the non-ozonised FI batches except for day 13, on which a lower Kvalue was determined in the OFI batch. The formation of TVB-N was assessed in both batches, no significant (P> 0.05) difference being observed between either storage systems. Moreover, the evolution of TVB-N concentrations along storage in either of the storage systems tested did not show any significant variations, in all cases such concentrations being below 250 mg kg )1 muscle even after 16 days of storage (Table 4). These results suggest that TVB-N, which is a widely used parameter to assess the quality evolution of marine fish species, is not useful as a quality indicator of trout quality. Thus, even when sensory analysis indicated an unacceptable quality, the levels of TVB-N were not significantly (P> 0.05) different from the initial ones (Table 4). Unlike TVB-N, the evolution of TMA-N contents in both batches provided significant (P< 0.05) differences between batches (Table 4). Thus, on day 9 and onwards statistically significant (P< 0.05) differences in TMA- N contents were observed between the FI and OFI batches. Remarkably, on day 13 the TMA-N content of the FI batch was almost double that determined in the OFI batch. These results suggest that the incorporation of ozone in the OFI batch significantly reduces the growth of TMA-producing bacteria, this representing a practical advantage with respect to the use of FI alone. It is also remarkable that the evolution of TMA-N in both batches was well correlated with the results of the sensory analyses. Nevertheless, it should be stressed that the TMA-N levels in both trout batches were in all cases much lower than those described for other small and medium-sized marine fish species, in which sharp increases in TMA-N contents have been noted after 9– 12 days of storage in flake ice (Ferna ´ndez-Salguero & Mackie, 1987; Pe ´rez-Villarreal & Pozo, 1990; Ruı´z- Capillas & Moral, 2001; Baixas-Nogueras et al., 2002). This different kind of behaviour was expected, as our Table 3 Comparative microbial growth in trout surface stored in flow ice (FI) or ozonised flow ice (OFI) Storage time (days) Aerobic mesophiles (log CFU cm -2 ) Psychrotrophes (log CFU cm -2 ) FI OFI FI OFI 1 0.10 a (0.01) 0.64 a (0.05) 0.10 a (0.05) 0.55 a (0.10) 3 1.49 a (0.23) 1.44 a (0.16) 0.10 a (0.02) 0.10 a (0.05) 6 1.71 b (0.24) 0.74 a (0.08) 0.30 a (0.20) 0.26 a (0.12) 9 0.71 a (0.16) 0.59 a (0.15) 1.74 b (0.25) 0.23 a (0.10) 13 2.53 b (0.18) 2.15 a (0.14) 3.13 b (0.30) 2.59 a (0.12) 16 3.56 a (0.30) 3.32 a (0.15) 3.87 a (0.40) 3.97 a (0.35) Results are average values and standard deviations (between brackets). Results followed by different letters are statistically different (P< 0.05). Table 4 Comparative evolution of biochemical quality in trout muscle stored in flow ice (FI) or ozonised flow ice (OFI) Time (days) Kvalue TVB-N TMA-N FFA TBA-i FI OFI FI OFI FI OFI FI OFI FI OFI 1 16.76 b (2.81) 24.99 a (6.69) 236.8 a (6.1) 244.3 a (9.5) 0.20 a (0.05) 0.31 a (0.15) 1.8 a (0.4) 1.9 a (0.7) 0.15 a (0.05) 0.24 a (0.06) 3 45.37 a (7.62) 43.96 a (7.06) 230.5 a (18.3) 219.2 a (13.2) 0.36 a (0.03) 0.36 a (0.07) 5.6 a (1.6) 5.9 a (1.6) 0.23 b (0.05) 0.37 a (0.05) 6 70.61 a (3.47) 64.58 a (8.41) 236.1 a (2.2) 238.3 a (6.8) 0.74 a (0.37) 0.51 a (0.13) 5.5 a (1.5) 5.7 a (2.4) 0.34 a (0.14) 0.34 a (0.03) 9 84.08 a (5.37) 81.16 a (1.30) 229.1 a (14.8) 219.5 a (7.0) 0.73 b (0.06) 0.47 a (0.14) 5.5 a (0.1) 6.4 a (0.11) 0.23 a (0.08) 0.15 a (0.05) 13 87.94 b (1.43) 74.91 a (3.19) 232.8 a (26.2) 236.0 a (14.2) 1.42 b (0.36) 0.72 a (0.27) 5.4 a (1.9) 7.1 a (1.2) 0.18 a (0.04) 0.24 a (0.08) 16 87.03 a (3.15) 90.34 a (2.71) 233.3 a (15.3) 221.6 a (9.4) 2.22 b (0.30) 1.69 a (0.29) 6.1 a (0.8) 7.0 a (0.9) 0.20 a (0.02) 0.24 a (0.05) TVB-N, total volatile base nitrogen; TMA-N, trimethylamine-nitrogen; FFA, free fatty acid; TBA-i, thiobarbituric acid-index. Results are average values and standard deviations (between brackets). Results followed by different letters are statistically different (P< 0.05). Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al. 1599 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology International Journal of Food Science and Technology 2009
study was focused on a continental fish species (trout) whose TMAO content is necessarily much lower than those normally found in marine fish species. Lipid hydrolysis was determined by FFA assessment. Significant (P< 0.05) increases in the formation of FFA along the storage time were observed in both batches during the first 3 days (Table 4). After that time, only slight increases in this parameter were observed, indicating that lipid hydrolysis events are of reduced importance in continental trout. Accordingly, no significant (P> 0.05) effect of ozone on lipid hydrolysis can be inferred, this indicating a similar protection of trout muscle against lipid hydrolysis in both batches. Although the release of FFA themselves does not imply any significant loss of nutritional quality, their accumulation has been linked to an enhancement of lipid oxidation (Miyashita & Takagi, 1986; Yoshida et al., 1992) and textural deterioration due to interactions between FFA and proteins (Mackie, 1993; Sikorski & Kolakowska, 1994). Interestingly, according to the results obtained in our study the combination of ozone and FI did not involve any significant enhancement of lipid damage in trout muscle. Lipid oxidation was followed with the TBA-i in order to evaluate whether the presence of ozone might imply any drawback at this level. As in the case of FFA, statistically significant (P< 0.05) increases in this index were observed along storage time in both batches up to day 3 (Table 4). After that time, TBA-i levels only increased slightly, reaching final values below 0.25 mg kg )1 in both batches. Remarkably, the presence of ozone in the OFI batch did not significantly increase (P< 0.05) the formation of TBA-reactive substances, this underscoring the notion that this antimicrobial agent may provide added value in the control of microbial spoilage in continental trout without causing any significant (P< 0.05) enhancement of lipid oxidation mechanisms. Conclusions The application of OFI for the slaughter, cooling and refrigerated storage of farmed trout is advisable. The combined system evaluated in this study provided an additional control of microbial – aerobic mesophiles, psychrotrophs, proteolytic bacteria, TMA-N – and autolytic – Kvalue – mechanisms commonly used as spoilage indicators when compared with FI alone. Sensory analyses also confirmed a slight extension of the shelf life in this batch. As this work reports the first evaluation of a FI-based system for the integral processing of a refrigerated continental fish species, the results of this study open the way to the industrial application of this combined preservation system to farmed trout and to other continental farmed fish species. Acknowledgments This work was supported by a project granted by the Direccio ´n Xeral de I+D from the Galician Government (Xunta de Galicia, Project PGIDT05TAL00701CT). The authors also wish to thank KINARCA S.A.U. (Vigo, Spain) for providing the flow ice equipment, and CoseMar Ozono (Madrid, Spain) for providing the ozone generator. References Arvanitoyannis, I.S., Tsitsika, E.V. & Panagiotaki, P. (2005). Implementation of quality control methods (physicochemical, microbiological and sensory) in conjunction with multivariate analysis towards fish authenticity. International Journal of Food Science and Technology,40, 237–263. Aubourg, S., Sotelo, C. & Gallardo, J. (1997). Quality assessment of sardines during storage by measurement of fluorescent compounds. Journal of Food Science,62, 295–299. Baixas-Nogueras, S., Bover-Cid, S., Veciana-Nogue ´s, M. & Vidal- Carou, M.C. (2002). Chemical and sensory changes in Mediterranean hake (Merluccius merluccius) under refrigeration (6–8 C) and stored in ice. Journal of Agricultural and Food Chemistry,50, 6504–6510. Ben-Gigirey, B., Vieites Baptista de Sousa, J.M., Villa, T.G. & Barros- Vela ´zquez, J. (1998). Changes in biogenic amines and microbiological analysis in albacore (Thunnus alalunga) muscle during frozen storage. Journal of Food Protection,61, 608–615. Bligh, E. & Dyer, W. (1959). A rapid method of total extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,37, 911–917. Cakli, S., Kilinc, B., Cadun, A., Dincer, T. & Tolasa, S. (2006). Effects of gutting and ungutting on microbiological, chemical, and sensory properties of aquacultured sea bream (Sparus aurata) and sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in ice. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,46, 519–527. Campos, C., Rodrı´guez, O ´., Losada, V., Aubourg, S. & Barros- Vela ´zquez, J. (2005). Effects of storage in ozonised slurry ice on the sensory and microbial quality of sardine (Sardina pilchardus). International Journal of Food Microbiology,103, 121–130. Chapman, L. (1990). Making the Grade. Ice Slurries get top Marks for Quality Products.Australian Fisheries, July, 16–19. Chen, H.H., Chiu, E.M. & Huang, J.R. (1997). Color and gel forming properties of horse mackerel (Trachurus japonicus) as related to washing conditions. Journal of Food Science,62, 985–991. Council Regulation. (1989). Baremo de clasificacion de frescura. In: Diaro Oficial de las Comunidades Europeas,L5 ⁄21, Pp. 5–6. Brussels: European Commission. Da Silva, M.V., Gibbs, P.A. & Kirby, R.M. (1998). Sensorial and microbial effects of gaseous ozone on fresh scad (Trachurus trachurus). Journal of Applied Microbiology,84, 802–810. Dondo, A.C., Nachtman, C., Doglione, L., Rosso, A. & Genetti, A. (1992). Foods: their preservation by combined use of refrigeration and ozone. Ingenieria Alimentaria y Conserve Animale,8, 16–25. Ferna ´ndez-Salguero, J. & Mackie, I. (1987). Comparative rates of spoilage of fillets and whole fish during storage of haddock (Melanogrammus aeglefinus) and herring (Clupea harengus)as determined by the formation of non-volatile and volatile amines. International Journal of Food Science and Technology,22, 385–390. Gram, L. & Huss, H. (1996). Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food Microbiology,33, 121–137. Kim, J., Yousef, A. & Dave, S. (1999). Application of ozone for enhancing the microbiological safety and quality of foods: A review. Journal of Food Protection,62, 1071–1087. Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al.1600 International Journal of Food Science and Technology 2009 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology
Kim, T.J., Silva, J.L., Chamul, R.S. & Chen, T.C. (2000). Influence of ozone, hydrogen peroxide or salt on microbial profile, TBARS and color of channel catfish fillets. Journal of Food Science,65, 1210– 1213. Ko ¨tters, J., Pradur, A., Skura, B., Rosenthal, H., Black, E.A. & Rodrigues-Lopez, J. (1997). Observations and experiments on extending shelf life of rockfish (Sebastes spp) products with ozone. Journal of Applied Icthiology,13, 1–8. Losada, V., Barros-Vela ´zquez, J., Gallardo, J. & Aubourg, S. (2004). Effect of advanced chilling methods on lipid damage during sardine (Sardina pilchardus) storage. European Journal of Lipid Science and Technology,106, 844–850. Lowry, R. & Tinsley, I. (1976). Rapid colorimetric determination of free fatty acids. Journal of the American Oil Chemists’ Society,53, 470–472. Mackie, I. (1993). The effects of freezing on flesh proteins. Food Reviews International,9, 575–610. Miyashita, K. & Takagi, T. (1986). Study on the oxidative rate and prooxidant activity of free fatty acids. Journal of the American Oil Chemists’ Society,63, 1380–1384. O ¨zden, O., Inugur, M. & Erkan, N. (2007). Effect of different dose gamma radiation and refrigeration on the chemical and sensory properties and microbiological status of aqua cultured sea bass (Dicentrarchus labrax). Radiation Physics and Chemistry,76, 1169– 1178. Pe ´rez-Villarreal, B. & Pozo, R. (1990). Chemical composition and ice spoilage of albacore (Thunnus alalunga). Journal of Food Science,55, 678–682. Phaff, H.J., Starmer, W.T., Lachance, M.A. & Ganter, P.F. (1994). Candida caseinolytica sp. nov., a new species of yeast occurring in necrotic tissues of Opuntia and Stenocereus species in the Southwestern United States and Baja California, Mexico. International Journal of Systematic Bacteriology,44, 641–645. Pin ˜eiro, C., Barros-Vela ´zquez, J. & Aubourg, S.P. (2004). Effects of newer slurry ice systems on the quality of aquatic food products: a comparative review versus flake ice chilling methods. Trends in Food Science and Technology,15, 575–582. Price, R., Melvin, E. & Bell, J. (1991). Postmortem changes in chilled round, bled and dressed albacore. Journal of Food Science,56, 318– 321. Rodrı´guez, O., Losada, V., Aubourg, S. & Barros-Vela ´zquez, J. (2004). Enhanced shelf-life of chilled European hake (Merluccius merluccius) stored in slurry ice as determined by sensory analysis and assessment of microbiological activity. Food Research International, 37, 749–757. Rodrı´guez, O ´., Losada, V., Aubourg, S. & Barros-Vela ´zquez, J. (2005). Sensory, microbial and chemical effects of a slurry ice system on horse mackerel (Trachurus trachurus). Journal of the Science of Food and Agriculture,85, 235–242. Rodrı´guez, O ´., Barros-Vela ´zquez, J., Pin ˜eiro, C., Gallardo, J. & Aubourg, S. (2006). Effects of storage in slurry ice on the microbial, chemical and sensory quality and on the shelf life of farmed turbot (Psetta maxima). Food Chemistry,95, 270–278. Roth, B., Schelvis-Smit, R., Stien, L.H., Foss, A., Nortvedt, R. & Imsland, A. (2007). Exsanguination of turbot and the effect on fillet quality measured mechanically, by sensory evaluation, and with computer vision. Journal of Food Science,72, E525–E531. Ruı ´z-Capillas, C. & Moral, A. (2001). Correlation between biochemical and sensory quality indices in hake stored in ice. Food Research International,34, 441–447. Ryder, J. (1985). Determination of adenosine triphosphate and its breakdown products in fish muscle by high performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry,33, 678–680. Sikorski, Z. & Kolakowska, A. (1994). Changes in protein in frozen stored fish. In: Seafood Proteins (edited by Z. Sikorski, Z.B. Sun Pan & F. Shahidi). Pp. 99–112. New York, USA: Chapman and Hall. Spanggaard, B., Huber, I., Nielsen, J., Nielsen, T., Appel, K.F. & Gram, L. (2000). The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification. Aquaculture, 182, 1–15. Tozawa, H., Erokibara, K. & Amano, K. (1971). Proposed modification of Dyer’s method for trimethylamine determination in codfish. In: Fish Inspection and Quality Control (edited by R. Kreuzer). Pp. 187–190. London, UK: Fishing News Books Ltd. Vyncke, W. (1970). Direct determination of the thiobarbituric acid value in trichloroacetic acid extracts of fish as a measure of oxidative rancidity. Fette Seifen Anstrichm,72, 1084–1087. Yoshida, H., Kondo, I. & Kajimoto, G. (1992). Participation of free fatty acids in the oxidation of purified soybean oil during microwave heating. Journal of the American Oil Chemists’ Society,69, 1136– 1140. Preservation of trout in ozonised flow ice S. P. Aubourg et al. 1601 2009 The Authors. Journal compilation 2009 Institute of Food Science and Technology International Journal of Food Science and Technology 2009
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 iniciales en contenido lipídico para los lotes HL y HLO fueron 1,8 g/kg y 1,9 g/kg lípido, respectivamente. Se observó a día 3, un incremento de estos valores, alcanzándose los valores de 5,6 g/kg y 5,9 g/kg en ambos lotes. Después de este periodo, el parámetro AGL aumentó ligeramente, lo que indicó la importancia reducida que la hidrólisis lipídica tiene en trucha continental. En consecuencia, no se puede deducir que exista un efecto significativo del ozono en la hidrólisis lipídica, lo que indica una protección similar del músculo de trucha en contra de esta hidrólisis en ambos lotes. Aunque la liberación de AGL no significa estrictamente pérdida de calidad nutricional, su acumulación puede estar unida a un aumento de la oxidación lipídica, (Miyashita & Takagi, 1986; Yoshida y col., 1992) y al deterioro en la textura debido a la interacción entre AGL y las proteínas (Mackie, 1993; Sikorski & Kolakowska, 1994). Los resultados obtenidos en este estudio, indican que la combinación de ozono con hielo líquido no hizo aumentar el daño lipídico en el músculo de trucha. Con el objetivo de evaluar si la presencia de ozono implicaba alguna desventaja en cuanto a oxidación lipídica, se investigó el parámetro i-TBA. Igual que en el caso de AGL, se encontraron aumentos significativos (P<0,05) en los tres primeros días de almacenamiento para ambos lotes. Después de este periodo, los niveles de i-TBA aumentan ligeramente alcanzando un valor final por debajo de 0,25 mg/kg en ambos lotes. La presencia de ozono en el lote HLO no hizo aumentar de manera significativa la formación de sustancias reactivas al TBA, lo que pone de manifiesto que, el empleo de este agente antimicrobiano, proporciona un valor adicional en el control de deterioro microbiológico de la trucha continental, sin causar ningún aumento en los mecanismos de oxidación lipídica.
Parte 1 CAPÍTULO 2: Improved microbial and sensory quality of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) by refrigeration in a slurry ice packaging system. Mejora de la calidad microbiológica y sensorial de almeja (Venerupis rhomboideus), ostra (Ostrea edulis) y mejillón (Mytilus galloprovincialis) mediante refrigeración en un sistema de hielo líquido envasado.
Original article Improved microbial and sensory quality of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) by refrigeration in a slurry ice packaging system Minia S. Rey, 1 Jose ´M. Miranda, 2 Santiago Aubourg 2 & Jorge Barros-Vela ´zquez 1 * 1 Department of Analytical Chemistry, Nutrition and Food Science, School of Veterinary Sciences, University of Santiago de Compostela, E-27002 Lugo, Spain 2 Department of Seafood Science and Technology, Institute for Marine Research (IIM-CSIC), C ⁄Eduardo Cabello 6, E-36208 Vigo, Spain 1 (Received 13 May 2011; Accepted in revised form 11 November 2011) Summary The aim of this work was to evaluate a slurry ice (SI) packaging system on three bivalve species: clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis). Comparative analyses were performed on specimens caught in autumn and spring and compared to batches stored in conventional flake ice. Microbiological analysis of autumn specimens stored in SI showed significantly (P< 0.05) reduced numbers of mesophiles and psychrotrophs in all three species, as well as fewer Enterobacteriaceae in clams and oysters. Spring specimens also exhibited significantly (P< 0.05) lower microbial loads, with SI storage significantly (P< 0.05) improving the control of mesophiles, psychrotrophs and proteolytic bacteria in clams and oysters. Sensory analysis correlated well with microbial analyses, with a significantly (P< 0.05) better quality in terms of odour, taste, juiciness, appearance and shelf life. The SI packaging system evaluated in this work proved to be a valuable method for maintaining quality of these bivalve species. Keywords Bivalves, clams, cooking, mussels, oysters, quality, refrigeration, shelf life, slurry ice. Introduction Marine products constitute a perishable food group whose deterioration of sensory quality and freshness is because of a variety of microbial and biochemical degradation mechanisms (Piggot & Tucker, 1990; Whittle et al., 1990; Olafsdo ´ttir et al., 1997). Among marine products, bivalves are shellfish species highly appreciated globally because they are an excellent source of protein, vitamins and minerals (Cabello et al., 2004; Caglak et al., 2008). These organisms feed by filtration of phytoplankton and organic particles found in seawater. Bivalves, similar to other marine species, are widely varied in composition because of endogenous and exogenous effects (Pearson et al., 1977). The harvesting season plays a key role regarding temperature, feeding availability and other external factors in different types of marine species (Saito et al., 1997; Bandarra et al., 2001). However, studies on the effect of harvesting season on the loss of quality during refrigerated storage (Grigorakis et al., 2003; Roth et al., 2005) and other technological treatments in seafood are scarce (Kolakowska et al., 1992; Aubourg et al., 2005). In seawater, bivalves may be exposed to microorganisms that lead to spoilage or are pathogenic in nature. The microorganisms can accumulate inside the body of the animal and can be transmitted to humans through the food chain (Lees, 2000). Moreover, the fact that some bivalve species are often consumed raw or slightly cooked (Romalde et al., 1994; Lees, 2000; Murchie et al., 2005) increases the microbial risks associated with their consumption (Freire-Santos et al., 2000; Oliveira et al., 2011). Because of the importance of bivalves in gastronomy and economics, the improvement of their preservation and the extension of their commercialisation period are of major interest. Conventional preservation methods are based on the use of flake ice (FI) (Nunes et al., 1992) or chilled seawater (Kraus, 1992). In the last two decades, refrigeration systems based on ice slurries, pumpable microscopic mixtures of ice and water containing salts, have been successfully used to preserve the quality and extend the shelf life of fish products. IJFS 2919 BDispatch: 29.11.11 Journal: IJFS CE: K. Karthik Journal Name Manuscript No. Author Received: No. of pages: 9PE: Sathya Kala *Correspondent: Fax: +34 981 825474; e-mail: [email protected] International Journal of Food Science and Technology 2011 1 doi:10.1111/j.1365-2621.2011.02919.x 2011 The Authors. International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
The salts in the water lower the freezing point, and the water remains in liquid phase at temperatures slightly below 0 C. This system has previously been evaluated for the preservation of fish species such as hake (Rodrı´guez et al., 2004), horse mackerel (Losada et al., 2005) and turbot (Rodrı´guez et al., 2005), among others, and for crustacean species such as lobster (Aubourg et al., 2007). In all cases, a significant (P< 0.05) slowing down of microbial and biochemical degradation was observed. The slurry ice (SI) method was also successfully used to retard spoilage mechanisms and to extend the shelf life of farmed trout (Aubourg et al., 2009), megrim (Aubourg et al., 2006) and blackspot seabream (Alvarez et al., 2009). Such studies reported significant decreases in the K index (a widely used indicator of autolytic degradation based on the levels of ATP metabolites), lipid damage indicators and microbial growth in the SI batches as compared to the FI batches. However, despite the reported advantages of SI for the preservation of fish species, to the best of our knowledge, the use of this system for the preservation of bivalves has received little attention to date in the scientific literature. In this case, it was decided that SI would be packaged to: (i) avoid the superchilling of specimens, because bivalve species should remain alive during commercialisation; and (ii) allow that SI could be available at the end of storage for rehydration and cooking purposes, thus avoiding the use of home-made salty water. Thus, the aim of the present work was to evaluate the advantages of SI prepared from seawater and packaged under vacuum as compared to conventional FI packaged in the same way, for the preservation of three commercially relevant bivalve species: mussel (Mytilus galloprovincialis), European oyster (Ostrea edulis) and clam (Venerupis rhomboides). The effect of seasonal variability on bivalve quality during refrigerated storage in both chilling systems was also evaluated. Materials and methods Refrigeration systems Slurry ice (SI) was prepared from filtered seawater by means of a FLO-ICE prototype (Kinarca S.A.U., Vigo, Spain). The composition of the slurry ice was 40% ice and 60% seawater (salinity: 3.3%). The temperature of the slurry ice mixture was -1.5 C, measured by a calibrated thermometer (Testo, Lenkirch, Germany). The SI was sterilised by ozone injection, which was accomplished with a system provided by Cosemar Ozono (Madrid, Spain) with the redox potential adjusted to 700 mV (0.20 mg ozone L )1 ). Conventional FI was prepared from tap water by means of an Icematic F100 Compact device (Caltelmac, Castelfranco, Italy). The temperature of the conventional FI was +0.5 C, measured by a calibrated thermometer (Testo). The FI and the SI were introduced in polyethylene bags, in the latter case directly from the SI generator, vacuumpackaging being performed by means of a INELVI TV Series, model 2000 (INELVI, Sta. Coloma de Cervello ´, Barcelona, Spain) device. To guarantee that bivalve specimens remained alive, random checking of the temperature was performed during storage with a view to ensure that this did not reach values below 0 C. In all cases, the temperatures of bivalve specimens were in the 0C⁄+2 C range, regardless the refrigeration system used. Bivalve specimens, processing and sampling Live oyster, mussel and clam specimens were obtained from local producers of Cambados (Galicia, NW Spain) after purification according to Spanish Regulation (Real Decreto 571 ⁄1999). All bivalve specimens came from the Ria de Arosa (NW Spain), the natural estuary of the Umia River, which is known to be a prolific source of mussels and oysters worldwide. Both oysters and mussels were farmed in hanging ropes from bateas, wooden structures placed in the sea surface, while wild clams were collected from the sea bottom in the same area. The environmental parameters for spring specimens were the following: (i) air temperature: 12 C; (ii) air relative humidity: 76%; (iii) water temperature: 13.5 C and (iv) salinity: 3.1%, while the environmental parameters for autumn specimens were the following: (i) air temperature: 16 C; (ii) air relative humidity: 78%; (iii) water temperature: 15.0 C and (iv) salinity: 3.1%. The length and weight ranges of the bivalve specimens were the following: 3–5 cm and 30–40 g for clams; 6– 9 cm and 40–80 g for mussels; and 6–10 cm and 40–60 g for oysters. For each season, two batches were considered for each bivalve species, one was stored in SI and the other in FI. From each batch, three samples were collected at each sampling time. Batches consisted of 40– 45 clams, 30–35 mussels and 30–35 oysters, respectively, and were stored in closed and tagged polyspan boxes (80 ·40 ·20 cm) under SI or FI. All boxes were kept in a refrigerated room at +2 C. Inside each box, the bags containing SI or FI were placed with bivalve specimens in a 1:1 w ⁄w ratio. To determine the effect of seasonal variability on the effectiveness of the preservation methods, sampling was performed in autumn (October) and spring (April). At each sampling time, three specimens from each batch were examined for microbiological, biochemical and sensory analyses. Microbiological analyses Samples of 5 g were aseptically dissected from oysters, clams and mussels, placed in a sterile masticator bag with an appropriate volume (1 ⁄9) (w ⁄v) of 0.1% sterile peptone water (Merck, Darmstadt, Germany) and Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al.2 International Journal of Food Science and Technology 2011 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
homogenised in a masticator (AES, Combourg, France). In the case of mussels and oysters, and because of their size, only one specimen was necessary. In the case of clams, two ⁄three specimens were normally mixed to get the required sample size. After homogenisation of the meat (any liquor present in the shell was discarded), microbial counts in 10 )1 to 10 )6 dilutions of the homogenates were determined. Total aerobic mesophiles and psychrotrophs were determined by the pour plate method, using Plate Count Agar (PCA; Oxoid Ltd., London, UK) and incubating at 30 C for 48 h and at 4C for 7 days, respectively. Total Enterobacteriaceae levels were determined by pour plating on Violet Red Bile Glucose Agar (VRBG; Merck) and incubating at 30 C for 24–48 h. Proteolytic microorganisms were investigated by surface plating on casein-agar, as previously described by Ben-Gigirey et al. (2000), and subsequent incubation at 30 C for 48 h. In the autumn and the spring, samples were taken after 1, 2, 4 and 6 days of storage. Each sampling time, three samples were analysed from the oyster, clam and mussel batches. The results were expressed as average ± standard deviation (SD). Biochemical analyses Nucleotide degradation products analysis was carried out using 6% perchloric acid extracts from the edible part of molluscs according to the method of Ryder (1985). Analysis was performed by HPLC, using a Beckman device provided with the programmable solvent module 126 and the scanning detector module 167 connected to System Gold software, version 8.1 (Beckman Coulter, London, UK). Separations were achieved on a reverse-phase Spherisorb ODS-2 C18 250 ·4.60 mm column (Waters, Milford, MA, USA) with an internal particle diameter of 5 lm. Standard curves for adenosine 5¢-triphosphate (ATP) and each compound involved in its degradation pathway [adenosine 5¢-diphosphate (ADP), adenosine 5¢-monophos- phate (AMP), inosine 5¢-monophosphate (IMP), inosine (INO) and hypoxanthine (Hx)] were constructed in the 0–1 mmrange. Results for each degradation compound were calculated as lmol. The Kvalue was calculated according to the following concentration ratio: Kvalue ð%Þ¼100 ðINO þHxÞ=ðATP þADP þAMP þIMP þINO þHxÞðRyder;1985Þ: Total volatile base-nitrogen (TVB-N) values were measured as previously reported by Aubourg et al., 1997. Trimethylamine-nitrogen (TMA-N) values were determined by the picrate method, as previously described (Tozawa et al., 1971). This method is based on the preparation of a 5% trichloroacetic acid extract of edible part (10 g ⁄25 mL). Results were expressed as mg TMA-N ⁄100 g edible part. Sensory analyses Sensory analyses were performed using raw and cooked bivalves by a trained panel of five experienced judges, who have been involved in the sensory analysis of different kinds of seafood for 10 years. Bivalve specimens were cooked at 100 C for 5 min in SI (SI batch) or in fresh water supplemented with 3.3% NaCl (FI batch). Raw and cooked bivalve samples (140 g) were presented individually to the panellists, with each panellist evaluating approximately 20 g of bivalve flesh. For it, the edible part was removed from the shell. Several specimens were considered to reach at least 20 g of edible part. Samples were prepared in a preparation room and were analysed in a well-ventilated isolated room provided with good lighting. Panellists were asked to score the odour and the appearance of the raw mussels, oysters or clams using a 0–5 point acceptability scale, with five corresponding to the highest quality and 0 corresponding to the lowest quality (Anonymous, 1999). In the case of cooked samples, the panellists evaluated the taste and juiciness of samples using a 0–5 point acceptability scale. Statistical analyses Data from the three different assays were subjected to analysis of variance (anova). PASW Statistics 18 (SPSS, Chicago, IL, USA) was used to explore the statistical significance of the differences between batches. Differences were considered significant for a confidence interval at the 95% level (P< 0.05) in all cases. Results and discussion Comparative microbial analysis in autumn and spring bivalve specimens The comparative microbial evolution during the storage of clams, oysters and mussels harvested during the autumn can be seen in Table 1. Statistically significant (P< 0.05) lower mesophiles numbers were present in clams, oysters and mussels stored in SI for 6 days compared with FI (Table 1). Likewise, storage for 6 days under SI provided a significant (P< 0.05) inhibition of psychrotrophs for all three bivalve species caught in the autumn (Table 1). The storage of autumn specimens in SI also provided better control of Enterobacteriaceae, with significant (P< 0.05) differences being observed (Table 1). No beneficial effect of SI in terms of Enterobacteriaceae counts was observed for mussels caught in the autumn. Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al. 3 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
Finally, the autumn specimens of oyster also exhibited significantly (P< 0.05) better control of proteolytic bacteria after 6 days of storage in SI (Table 1). The numbers of proteolytic bacteria were also lower in clams and mussels stored in SI at the end of the storage period as compared with FI, although for mussels these differences were not statistically significant (Table 1). The comparative microbial evolution during the storage of clams, oysters and mussels harvested during the spring is presented in Table 2. Statistically significant (P< 0.05) lower mesophiles numbers were present in clams and mussels stored in SI for 6 days as compared with FI (Table 2). Likewise, differences in the mesophiles counts were determined between batches for spring clams, oysters and mussels, respectively, throughout storage. The results obtained for mesophiles in the spring specimens revealed significantly (P< 0.05) lower microbial counts for oysters and mussels as compared to autumn specimens regardless of the icing system. Accordingly, the relative differences in mesophiles numbers were lower for oyster and mussel spring specimens than for autumn specimens, with SI exerting a particularly beneficial preservation effect on the latter. With respect to psychrotrophs, storage for 6 days under SI provided a significant (P< 0.05) inhibition of this bacterial group in clams and mussels caught in the spring (Table 2). Remarkably, SI did not provide any significant advantage with respect to psychrotrophs growth in spring oyster specimens. Thus, as in the case of mesophiles, oyster and mussel specimens caught in the spring harboured a lower bacterial load compared to Table 1 Comparative microbial evolution in clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the autumn. Results are expressed as log of the colony-forming units per gram of tissue Bivalve Storage day Mesophiles Psychrotrophs Enterobacteriaceae Proteolytic bacteria FI SI FI SI FI SI FI SI Clams 1 2.60 ± 0.11 2.48 ± 0.06 2.39 ± 0.19 2.46 ± 0.10 0.90 ± 0.00 0.90 ± 0.00 1.90 ± 0.00 1.90 ± 0.00 2 3.13 ± 0.25 2.8 ± 0.43 2.63 ± 0.38 2.76 ± 0.15 1.63 ± 0.15 (a) 1.00 ± 0.00 (b) 2.33 ± 0.58 2.33 ± 0.58 4 3.43 ± 0.68 3.15 ± 0.03 3.15 ± 0.01 (a) 2.98 ± 0.06 (b) 2.18 ± 1.28 (a) 0.97 ± 0.06 (b) 2.50 ± 0.50 2.65 ± 0.05 6 3.92 ± 0.51 (a) 3.20 ± 0.03 (b) 3.59 ± 0.32 (a) 3.14 ± 0.08 (b) 2.15 ± 0.55 (a) 1.10 ± 0.20 (b) 3.31 ± 0.53 (a) 2.39 ± 0.09 (b) Oysters 1 2.92 ± 0.25 2.81 ± 0.14 2.76 ± 0.21 2.72 ± 0.05 1.24 ± 0.24 (b) 1.63 ± 0.15 (a) 2.81 ± 0.03 2.34 ± 0.44 2 2.91 ± 0.02 (a) 2.51 ± 0.36 (b) 2.84 ± 0.05 (a) 2.54 ± 0.23 (b) 1.19 ± 0.29 (a) 0.90 ± 0.00 (b) 2.24 ± 0.24 2.10 ± 0.20 4 4.32 ± 0.09 (a) 2.46 ± 0.26 (b) 3.81 ± 0.34 (a) 2.44 ± 0.16 (b) 1.30 ± 0.30 (a) 0.90 ± 0.00 (b) 2.42 ± 0.42 2.00 ± 0.00 6 4.47 ± 0.25 (a) 3.59 ± 0.32 (b) 4.73 ± 0.25 (a) 3.90 ± 0.85 (b) 2.39 ± 0.19 (a) 0.90 ± 0.00 (b) 3.43 ± 0.68 (a) 2.53 ± 0.50 (b) Mussels 1 2.12 ± 0.12 (b) 3.10 ± 0.62 (a) 1.52 ± 0.62 (b) 3.09 ± 0.69 (a) 0.90 ± 0.00 (b) 2.38 ± 0.90 (a) 1.90 ± 0.00 (b) 3.33 ± 0.42 (a) 2 2.79 ± 0.53 (a) 2.18 ± 0.23 (b) 2.82 ± 0.59 (a) 1.97 ± 0.07 (b) 1.54 ± 0.64 (a) 0.90 ± 0.00 (b) 2.54 ± 0.64 1.96 ± 0.06 4 4.42 ± 0.02 (a) 2.88 ± 0.46 (b) 4.49 ± 0.09 (a) 2.70 ± 0.50 (b) 0.95 ± 0.05 0.95 ± 0.05 2.00 ± 0.00 1.96 ± 0.06 6 5.40 ± 0.60 (a) 3.93 ± 0.90 (b) 5.93 ± 1.10 (a) 3.96 ± 0.85 (b) 1.19 ± 0.29 1.27 ± 0.35 2.30 ± 0.30 2.06 ± 0.21 The results are expressed as mean ± range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Table 2 Comparative microbial evolution in clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the spring. Results are expressed as log of the colony-forming units per gram of tissue Bivalve Storage day Mesophiles Psychrotrophs Enterobacteriaceae Proteolytic bacteria FI SI FI SI FI SI FI SI Clams 1 3.21 ± 0.57 2.54 ± 0.34 3.00 ± 0.00 (a) 2.77 ± 0.26 (b) 1.30 ± 0.30 1.30 ± 0.30 3.97 ± 0.10 (a) 2.30 ± 0.30 (b) 2 3.24 ± 0.43 (a) 2.34 ± 0.24 (b) 2.98 ± 0.32 2.82 ± 0.29 1.38 ± 0.12 1.32 ± 0.13 3.23 ± 0.15 (a) 2.30 ± 0.30 (b) 4 3.11 ± 0.10 (a) 2.50 ± 0.07 (b) 3.01 ± 0.08 (a) 2.64 ± 0.06 (b) 1.34 ± 0.50 0.99 ± 0.00 2.98 ± 0.54 (a) 2.00 ± 0.01 (b) 6 3.95 ± 0.98 (a) 3.23 ± 0.55 (b) 3.98 ± 0.54 (a) 3.20 ± 0.28 (b) 0.99 ± 0.00 1.24 ± 0.34 3.06 ± 0.08 (a) 2.30 ± 0.43 (b) Oysters 1 3.33 ± 0.01 (a) 2.87 ± 0.05 (b) 3.05 ± 0.14 (b) 3.74 ± 0.06 (a) 2.54 ± 0.28 (a) 1.59 ± 0.16 (b) 2.90 ± 0.08 2.83 ± 0.18 2 3.83 ± 0.65 (a) 3.03 ± 0.15 (b) 3.36 ± 0.57 3.96 ± 0.25 3.13 ± 0.32 (a) 1.63 ± 0.25 (b) 3.03 ± 0.15 3.20 ± 0.20 4 4.21 ± 0.02 (a) 3.49 ± 0.05 (b) 4.21 ± 0.27 5.06 ± 0.14 3.67 ± 0.07 (a) 1.74 ± 0.07 (b) 3.28 ± 0.03 3.27 ± 0.27 6 4.16 ± 0.22 3.89 ± 1.05 3.68 ± 0.01 3.70 ± 0.70 4.95 ± 0.00 (a) 1.84 ± 1.21 (b) 3.60 ± 0.04 3.11 ± 0.58 Mussels 1 2.88 ± 0.03 (a) 2.68 ± 0.06 (b) 3.82 ± 0.42 (a) 2.87 ± 0.04 (b) 2.16 ± 0.06 (a) 1.15 ± 0.22 (b) 2.39 ± 0.12 (a) 2.00 ± 0.01 (b) 2 2.83 ± 0.65 2.87 ± 0.25 3.05 ± 0.14 3.74 ± 0.06 2.54 ± 0.28 (a) 1.59 ± 0.16 (b) 2.90 ± 0.08 2.83 ± 0.18 4 3.12 ± 0.23 (a) 2.45 ± 0.15 (b) 2.98 ± 0.09 2.80 ± 0.07 1.24 ± 0.34 0.99 ± 0.00 2.93 ± 0.04 (a) 1.99 ± 0.00 (b) 6 3.48 ± 0.12 (a) 2.99 ± 0.13 (b) 3.74 ± 0.22 (a) 2.86 ± 0.11 (b) 1.00 ± 0.01 0.99 ± 0.00 2.50 ± 0.28 (a) 2.00 ± 0.01 (b) The results are expressed as mean ± range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al.4 International Journal of Food Science and Technology 2011 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
autumn specimens, where microbial growth was more favoured and SI was especially efficient in mesophiles and psychrotrophs control. The storage of spring specimens in SI provided for better control of Enterobacteriaceae in oysters, with significant (P< 0.05) differences being determined between batches on the sixth day of storage (Table 2). No beneficial effects of SI in terms of Enterobacteriaceae counts were observed for clams caught in the spring. Comparing the seasonal variability of specimens in terms of the advantages provided by SI, this system proved to be useful for the control of Enterobacteriaceae in both seasons. Finally, spring specimens of clams and mussels exhibited significantly (P< 0.05) better control of proteolytic bacteria after storage in SI (Table 2). The numbers of proteolytic bacteria were also lower in oysters belonging to the SI batch at the end of the storage period as compared to FI, although these differences were not statistically significant (Table 2). As in the case of mesophiles and psychrotrophs, the use of SI resulted in a better control of proteolytic bacteria in clams and mussels caught in the spring. In global terms, oysters were the bivalve species that exhibited the most seasonal variability. Thus, SI was especially useful for the preservation of autumn oysters but not for spring oysters. The facts that oysters usually spawn by late June and that small increases in water temperature may favour spawning may be related to the remarkable microbiological differences observed for this species between spring and autumn specimens. In contrast, the SI system worked well for clams and mussels in both autumn and spring, although the advantages of such a system were especially remarkable in spring mussels and autumn clams. Microbiological studies carried out in a different clam species than those used in this study (Mercenaria mercenaria) showed a greater microbial accumulation in autumn and winter months as compared to spring and summer months, probably because hardshelled clams stop filter feeding at temperatures below 4 C (Burkhardt et al., 1992). Kaspar & Tamplin (1993) found that the highest accumulation of microorganisms in clams occurred during certain periods in the spring season. In our study, bivalve specimens collected in the autumn exhibited slightly higher microbial concentrations than spring batches, probably because the water temperatures at April (13.5 C) were colder than in October (15 C) on the Atlantic coast estuary where these specimens were collected. However, the effects of SI on the microbial quality of the bivalve species studied were notably improved regardless of the season considered, especially in the case of clams and mussels. Comparative biochemical quality in autumn and spring specimens Microbial activity was also assessed by related chemical indices, such as TVB-N and TMA-N values (Tables 3 and 4). The TVB-N content increased in all samples as storage progressed, especially in mussels. An inhibitory effect on microbial growth (P< 0.05) of SI treatment was evident in all species corresponding to the spring season, especially at advanced storage periods (Table 4), while in the case of autumn samples, the differences were only significant for clams (Table 3). An inhibitory effect of SI on TMA-N formation was also observed. As in the case of TVB-N, significant differences (P< 0.05) were mainly observed in the spring samples (Table 4). Except for autumn clams, all Table 3 Comparative evolution of chemical parameters related to quality loss of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the autumn Bivalve Storage day Kvalue TVB-N TMA-N FI SI FI SI FI SI Clams 1 41.50 ± 1.24 37.25 ± 4.85 24.24 ± 1.90 23.91 ± 0.48 2.44 ± 0.37 2.27 ± 0.85 2NDNDND ND ND ND 4 44.07 ± 4.23 39.19 ± 5.18 26.77 ± 1.67 25.08 ± 1.19 2.83 ± 1.13 2.41 ± 0.47 6 44.92 ± 0.21 39.34 ± 1.76 25.42 ± 0.24 (a) 23.90 ± 0.10 (b) 4.34 ± 0.13 (a) 3.71 ± 0.07 (b) Oysters 1 10.10 ± 0.48 9.12 ± 0.30 13.64 ± 0.71 12.63 ± 0.24 1.74 ± 0.11 (a) 1.17 ± 0.15 (b) 2NDNDND ND ND ND 4 15.68 ± 1.25 12.44 ± 0.42 15.49 ± 0.55 14.81 ± 0.05 1.62 ± 0.40 1.30 ± 0.41 6 16.75 ± 0.35 14.92 ± 0.15 17.51 ± 0.95 17.51 ± 0.35 1.64 ± 0.21 1.24 ± 0.77 Mussels 1 15.27 ± 1.53 14.29 ± 0.21 18.99 ± 3.38 17.47 ± 6.19 0.60 ± 0.13 0.61 ± 0.14 2NDNDND ND ND ND 4 15.84 ± 0.11 14.59 ± 1.89 32.83 ± 4.52 28.62 ± 1.43 1.16 ± 0.04 (a) 0.82 ± 0.14 (b) 6 18.50 ± 0.96 17.29 ± 1.33 31.31 ± 1.43 28.11 ± 3.57 1.19 ± 0.18 1.00 ± 0.29 ND, not determined; TMA-N, trimethylamine-nitrogen; TVB-N, total volatile base-nitrogen. The results are expressed as mean ± range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al. 5 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
samples showed a progressive increase in this parameter as refrigeration time progressed (Tables 3 and 4). During post-mortem bivalve muscle storage, muscle nucleotides degrade in a series of stages because of endogenous biochemical changes. The level of major adenine nucleotides and their related compounds has been utilised extensively as an index of freshness (Kvalue assessment) of fish muscle (Howgate, 2006). In the present research (Tables 3 and 4), specimens corresponding to the three species and to both icing conditions showed a progressive increase in Kvalue with chilling time. Although no significant differences (P> 0.05) were associated with the icing system employed, higher mean values were obtained in all cases for specimens kept under traditional FI conditions as compared with those kept under SI conditions. In addition, higher K values were observed for specimens corresponding to the autumn season (Table 3) compared to their counterparts caught in the spring (Table 4). This difference was especially relevant in clams. Comparative sensory quality in autumn and spring specimens The results of the sensory evaluation in autumn specimens from the three species under the different refrigeration conditions are presented in Table 5. Clams, oysters and mussels presented a fresh and pleasant Table 4 Comparative evolution of chemical parameters related to quality loss of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the spring Bivalve Storage day Kvalue TVB-N TMA-N FI SI FI SI FI SI Clams 1 12.47 ± 0.44 7.93 ± 1.46 24.24 ± 0.76 24.24 ± 0.95 2.04 ± 0.11 2.19 ± 0.09 2ND ND ND ND ND ND 4 14.64 ± 0.70 14.77 ± 0.13 27.61 ± 0.67 25.27 ± 0.48 3.52 ± 0.19 3.15 ± 0.17 6 18.55 ± 0.80 16.55 ± 0.21 34.58 ± 0.48 (a) 29.590 ± 1.10 (b) 4.23 ± 0.23 (a) 3.14 ± 0.19 (b) Oysters 1 0.71 ± 0.17 0.51 ± 0.14 12.12 ± 0.07 11.78 ± 0.48 0.48 ± 0.14 0.48 ± 0.07 2ND ND ND ND ND ND 4 5.90 ± 0.53 3.18 ± 0.19 23.57 ± 0.05 17.85 ± 0.48 0.87 ± 0.03 (a) 0.68 ± 0.13 (b) 6 6.89 ± 0.38 4.47 ± 1.71 21.89 ± 2.38 (a) 16.16 ± 0.05 (b) 1.16 ± 0.28 (a) 0.85 ± 0.10 (b) Mussels 1 13.54 ± 1.01 7.71 ± 1.26 19.19 ± 1.43 17.17 ± 1.43 2.29 ± 0.29 (a) 0.60 ± 0.13 (b) 2ND ND ND ND ND ND 4 15.65 ± 2.16 10.75 ± 0.13 35.35 ± 0.48 (a) 27.95 ± 0.48 (b) 3.25 ± 0.15 (a) 1.17 ± 0.21 (b) 6 17.46 ± 1.62 14.94 ± 6.75 35.69 ± 2.09 (a) 25.93 ± 1.43 (b) 3.14 ± 0.19 (a) 1.26 ± 0.10 (b) ND, not determined; TMA-N, trimethylamine-nitrogen; TVB-N, total volatile base-nitrogen. The results are expressed as mean ± range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Table 5 Comparative sensory quality of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the autumn Bivalve Storage day Odour Appearance Taste and juiciness FI SI FI SI FI SI Clams 1 5.00 ± 0.00 4.80 ± 0.40 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 4.00 ± 0.63 4.20 ± 0.40 3.80 ± 0.45 4.80 ± 0.40 3.20 ± 0.45 3.80 ± 0.45 4 3.00 ± 0.63 3.80 ± 0.40 1.80 ± 0.45 2.40 ± 0.55 1.40 ± 0.55 3.40 ± 0.49 6 2.00 ± 0.89 3.20 ± 0.74 1.00 ± 0.00 (b) 2.80 ± 0.40 (a) 1.20 ± 0.45 (b) 2.80 ± 0.40 (a) Oysters 1 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 4.60 ± 0.55 4.80 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 4 1.80 ± 0.45 3.46 ± 0.71 2.60 ± 0.55 2.80 ± 0.45 2.00 ± 0.71 3.20 ± 0.45 6 1.00 ± 0.00 (b) 2.40 ± 0.55 (a) 1.20 ± 0.45 (b) 2.40 ± 0.55 (a) 1.00 ± 0.00 (b) 2.20 ± 0.40 (a) Mussels 1 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 3.20 ± 0.45 4.41 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.80 ± 0.40 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 4 2.00 ± 0.89 3.20 ± 0.45 2.40 ± 0.55 3.20 ± 0.45 2.40 ± 0.55 3.20 ± 0.45 6 1.00 ± 0.00 (b) 2.00 ± 0.00 (a) 1.00 ± 0.0 (b) 1.80 ± 0.45 (a) 1.00 ± 0.00 1.40 ± 0.55 The results are expressed as mean±range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Scored on 1–5 point scale (1: lowest quality; 5: highest quality). Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al.6 International Journal of Food Science and Technology 2011 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
odour and a brilliant appearance on storage day one in both the raw and the cooked specimens. In clams, on day 6, the SI batch exhibited significantly (P< 0.05) better quality in terms of juiciness, taste and appearance compared with clams stored in FI (Table 5). On day 6, clams stored in FI presented an unacceptable odour, taste and appearance compared with clams stored in SI, whose quality was acceptable (Table 5). Sensory analysis of oysters and mussels from the autumn season on day 4 also showed a higher loss of juiciness in the FI batch compared to the SI batch. The SI batch retained acceptable quality in terms of odour, taste and appearance (Table 5). On day 6, none of the autumn oyster or mussel batches was acceptable, because the average scores were below 2.0. The results of the sensory evaluations of the spring specimens are presented in Table 6. Clam specimens stored in SI maintained better (P< 0.05) quality on day 6 than their spring counterparts. The differences between the SI and FI batches of spring clams were larger than in the case of autumn batches. Oysters kept in SI also exhibited better quality on day 6 than spring specimens kept in SI, the former exhibiting acceptable quality at that time. As in the case of clams, the differences between SI and FI spring oyster batches were significant (P< 0.05) and larger than between autumn batches. No remarkable differences that may be attributed to seasonal variability were observed in mussels, except for taste and juiciness and appearance on day 6. Seasonal studies carried out on a different species of mussel than those analysed here, Mytilus edulis (Kryzynowek & Wiggin, 1979), found that mussels harvested in the spring retained sensory acceptability for a longer time than mussels harvested in the fall or winter, a result that is in agreement with our microbial, biochemical and sensory results from the SI batches. A possible explanation of these findings might be related to, among others, (i) the lower temperature of water in spring (13.5 C) as compared to autumn (15.0 C) and to (ii) the weaker physiological state of shellfish from autumn season, once spawning had been completed. These reasons could explain the better microbial and sensory quality determined for the specimens from spring season. Other parameters, such as feeding availability or proximate composition of specimens, were not evaluated in this study. Finally, we must emphasise that differences observed between batches stored in SI and FI are because of many causes, the most relevant being, among others: (i) the faster chilling rate of SI, which is a consequence of its higher heat-exchange capacity; (ii) the ca. 1.5 C lower storage temperature provided by SI would imply a square root relationship between batches, this predicting a 1.3-fold increase in the shelf lives of the SI batches as compared to the FI batches (Dalgaard, 2009); (iii) the more complete coverage of the bivalve specimens by the packages containing the SI mixture, which also afforded a better protection of the specimens with respect to oxidation and dehydration events; and (iv) the use of the SI mixture as rehydration and cooking media, which allowed a better recovery of sensory parameters as compared to the control batch. Conclusions Refrigerated storage of clams, oysters and mussels in the proposed SI system was associated with a better maintenance of microbial and sensory quality and extended shelf life, which is a result of practical interest for commercialisation strategies. Bivalve specimens Table 6 Comparative sensory quality of clams (Venerupis rhomboideus), oysters (Ostrea edulis) and mussels (Mytilus galloprovincialis) stored under ozonised slurry ice (SI) or flake ice (FI) in the spring Bivalve Storage day Odour Appearance Taste and juiciness FI SI FI SI FI SI Clams 1 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 3.20 ± 0.45 4.20 ± 0.40 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 3.40 ± 0.71 4.20 ± 0.40 4 2.20 ± 0.40 3.80 ± 0.40 3.20 ± 0.45 4.20 ± 0.40 2.80 ± 0.45 3.80 ± 0.40 6 1.40 ± 0.55 (b) 3.80 ± 0.40 (a) 2.80 ± 0.45 (b) 3.20 ± 0.45 (a) 1.60 ± 0.89 (b) 2.80 ± 0.40 (a) Oysters 1 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 4.20 ± 0.40 4.40 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 4 2.20 ± 0.40 3.40 ± 0.71 2.80 ± 0.40 2.80 ± 0.4 2.80 ± 0.45 3.20 ± 0.45 6 1.80 ± 0.45 (b) 3.80 ± 0.40 (a) 2.80 ± 0.40 (b) 3.20 ± 0.45 (a) 2.40 ± 0.55 (b) 3.00 ± 0.00 (a) Mussels 1 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 2 3.20 ± 0.45 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 4.80 ± 0.40 4.40 ± 0.55 4.60 ± 0.55 4 2.00 ± 0.00 3.20 ± 0.45 2.80 ± 0.40 3.80 ± 0.40 2.40 ± 0.55 3.20 ± 0.45 6 1.00 ± 0.00 (b) 2.00 ± 0.70 (a) 2.40 ± 0.55 (b) 3.20 ± 0.45 (a) 1.00 ± 0.00 (b) 2.40 ± 0.55 (a) The results are expressed as mean ± range. Means followed by different letters (a–b) are significantly different (P< 0.05). Scored on 1–5 point scale (1: lowest quality; 5: highest quality). Slurry ice system for bivalve species M. S. Rey et al. 7 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 120 en otoño, únicamente resultaron ser significativamente diferentes en el caso de la almeja. Se observó un efecto inhibidor del HLO en la formación de N-TMA. Así como en el caso de N-BVT, las diferencias significativas (P<0,05) fueron observadas principalmente en las muestras de primavera. Durante el almacenamiento post-mortem, el músculo de bivalvo se degrada en una serie de etapas debidas a cambios bioquímicos endógenos. El nivel de nucleótidos y sus compuestos relacionados han sido utilizados como índice de frescura (evaluación del valor K) en músculo de pescado (Howgate, 2006). En el presente estudio, las muestras correspondientes a las tres especies de bivalvos y en ambos sistemas de refrigeración, mostraron un aumento progresivo en el valor K con el tiempo de conservación. Sin embargo, no se encontraron diferencias (P>0,05) relacionadas con el sistema de enfriamiento empleado, aunque se observaron valores K medios altos para todas las muestras almacenadas bajo las condiciones de HT en comparación con las muestras almacenadas bajo las condiciones HLO. Además, se observaron valores K altos en las muestras correspondientes a la estación de otoño al ser comparadas con las muestras capturadas en primavera. Esta diferencia fue especialmente destacable en almeja. Análisis sensorial Paralelamente a los análisis microbiológicos y bioquímicos, se realizaron análisis comparativos de la calidad sensorial para las tres especies de bivalvos en otoño y en primavera.
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 121 Los resultados obtenidos de la evaluación sensorial en las muestras de bivalvos en otoño, mostraron un aroma fresco y agradable y un aspecto brillante en el primer día de almacenamiento tanto en las muestras crudas como en las cocinadas. Para la almeja, a día 6, el lote HLO mostró una calidad significativamente (P<0,05) mejor en términos de jugosidad, sabor y apariencia comparado con la almeja almacenada en HT. A día 6, la almeja almacenada en HT presentó aroma, sabor y apariencia desagradables en comparación con la almacenada en HLO, cuya calidad resultó ser aceptable. Los análisis sensoriales de ostra y mejillón en la estación de otoño, solamente mostraron a día 4 una mayor pérdida de jugosidad en el lote HT en comparación con el lote HLO. Este último lote mantuvo una calidad aceptable en términos de aroma, sabor y apariencia. A día 6, ninguno de los lotes de las muestras de ostra y mejillón resultó ser aceptable, ya que la puntuación media estuvo por debajo de 2,0. Los resultados obtenidos en la evaluación sensorial en primavera para la almeja, mostraron que para el lote HLO la calidad fue mejor que para su homóloga de otoño. Las diferencias entre los lotes HLO y HT de la almeja en primavera, resultaron ser mayores que en el caso de los lotes de otoño. La ostra almacenada en HLO mostró también mejor calidad a día 6 que las muestras almacenadas en HT, resultando tener las anteriores una calidad aceptable. Al igual que en el caso de la almeja, las diferencias entre los lotes de ostra correspondientes a los sistemas HLO y HT fueron significativas (P<0,05) y superiores que entre los lotes de otoño. No se pudieron atribuir diferencias notables debido a la variabilidad estacional en el caso del mejillón, excepto para sabor, jugosidad y apariencia a día 6.
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 122 Estudios sensoriales previos llevados a cabo en Mytilus edulis (Kryzy-Nowek & Wiggin, 1979) encontraron que el mejillón capturado en primavera retiene la aceptabilidad sensorial durante más tiempo que el capturado en otoño o invierno. Este resultado está de acuerdo con nuestros resultados microbiológicos, bioquímicos y sensoriales obtenidos para los lotes HLO. Una posible explicación de estas conclusiones puede estar relacionada, entre otras, con la menor temperatura del agua en primavera (13,5º C) comparada con la del otoño (15,0º C), así como con el débil estado fisiológico de estas especies desde el otoño hasta que el periodo de desove se haya completado. Estas razones pueden explicar la mejor calidad microbiológica y sensorial observada en las muestras correspondientes a primavera. Otros parámetros, como la disponibilidad de alimento o la proximidad en composición de las muestras, no se han evaluado en este estudio. Finalmente, se debe enfatizar que las diferencias observadas entre los lotes HLO y HT fueron debidas a varias razones, siendo las más relevantes entre otras: (i) la rápida velocidad de enfriamiento de HL, que es una consecuencia de su gran coeficiente de transferencia de calor, (ii) la diferencia de temperatura proporcionada por el lote HLO (1,5º C menor que el lote HT), lo que confiere una diferencia cuadrática en sus vidas útiles, de manera que el lote HLO tendrá una vida útil 1,3 veces mayor que el lote HT (Dalgaard, 2009); (iii) la mayor cobertura proporcionada por los embalajes de la mezcla de HLO a las muestra de bivalvos, alcanzándose una mayor protección de las muestras con respecto a los fenómenos de oxidación y deshidratación, y (iv) el uso de la mezcla HLO como medio de rehidratación y cocinado, lo que proporciona una mayor recuperación de los parámetros sensoriales, en comparación con el lote control.
Parte 2 CAPÍTULO 3: Effect of a natural organic acid-icing system on the microbiological quality of commercially relevant chilled fish species. Efecto de un sistema de hielo conteniendo ácidos orgánicos naturales sobre la calidad microbiológica de especies marinas refrigeradas y de relevancia comercial.
Author's personal copy Effect of a natural organic acid-icing system on the microbiological quality of commercially relevant chilled fish species Minia Sanjuás Rey a , Bibiana García-Soto c , José R. Fuertes-Gamundi c , Santiago Aubourg b , Jorge Barros-Velázquez a , * a Department of Analytical Chemistry, Nutrition and Food Science, School of Veterinary Sciences, University of Santiago de Compostela, E-27002 Lugo, Spain b Department of Seafood Science and Technology, Institute for Marine Research (IIM-CSIC), C/Eduardo Cabello 6, E-36208 Vigo, Spain c Cooperativa de Armadores del Puerto de Vigo (ARVI), Muelle del Berbés, Vigo, Spain article info Article history: Received 17 February 2011 Received in revised form 19 July 2011 Accepted 5 October 2011 Keywords: Fish Storage Organic acids Icing systems Microbial quality Sensory quality abstract Natural preservative organic acids (ascorbic, citric and lactic acids) were used to prepare a novel organic acid-flake icing system for the chilled preservation of hake (Merluccius merluccius), megrim (Lepidorhombus whiffiagonis) and angler (Lophius piscatorius). The icing system was prepared with two different concentrations of a commercial acid mixture-formula containing the three organic acids at 800 mg/kg and 400 mg/kg (C-800 and C-400 batches, respectively). Aerobic mesophiles, psychrotrophs, proteolytic bacteria, trimethylamine and pH were evaluated and the results compared with sensory analyses. Significantly (P<0.05) lower counts of mesophiles were found for hake and megrim in the C-800 and C- 400 batches compared with the control batch. In the case of angler, significantly (P<0.05) lower counts of mesophiles, psychrotrophs and proteolytic microorganisms (P<0.05) were found for fish stored in the C-800 icing conditions. Both C-400 and C-800 megrim batches exhibited significantly (P<0.05) lower pH values than the control batch, and this result was also observed in the C-800 angler batch. Sensory analysis confirmed that the shelf lives of the three fish species in the C-800 batch were extended. According to the parameters assessed, storage of hake, megrim and angler in the proposed ice system better protects their microbial and sensory qualities. Ó2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction The quality and freshness of marine species rapidly decline postmortem due to a variety of microbial and biochemical degradation mechanisms (Pigott & Tucker,1990; Whittle, Hardy, & Hoobs,1990). Thus, the sensory quality and nutritional value of chilled fish deteriorate as a result of different degradative pathways, such as endogenous enzymatic activity, microbial development and lipid oxidation mechanisms (Olafsdóttir et al., 1997; Whittle et al., 1990). To slow the mechanisms involved in quality loss, the fish specimens should be refrigerated immediately after capture. Therefore, fish have traditionally been cooled and stored in either flake ice (Nunes, Batista, & Morâo de Campos, 1992), refrigerated sea water (Kraus, 1992), or ice slurries (Barros-Velázquez, Gallardo, Calo, & Aubourg, 2008; Rodríguez, Barros-Velázquez, Piñeiro, Gallardo, & Aubourg, 2006; Rodríguez, Losada, Aubourg, & Barros-Velázquez, 2004), or they have been preserved by exposure to chemical agents (Hwang & Regenstein, 1995). However, the seafood industry is always searching for new preservation strategies to extend the shelf life of fish and provide the consumers with fish material with the best quality, both at the sensory and nutritional levels. Natural organic acids are preservatives that have been receiving increasing attention as minimal processing strategies because they are easily attained, have a low commercial cost and can be used in food at a wide range of permitted concentrations, these having to be declared in the food labels. These organic acids are soluble in lipids in their undissociated forms, which allows them to cross the microbial membrane into the microbial cytoplasm, where the acids tend to dissociate and deliver hydrogen ions and a particular anion (Booth, 1985; Booth & Kroll, 1989). As a result, microorganisms are forced to export the excess hydrogen ion to maintain a physiological pH inside the cell, which is an energy-depleting process that limits bacterial growth. Otherwise, the excess hydrogen ions in the cytoplasm may cause the pH to decrease to levels that are incompatible with bacterial growth (Gould, 1996). Among the natural organic acids, ascorbic acid and citric acid and their salts are well-known chelators and acidulants in biological systems, which are especially beneficial for fish oil and *Corresponding author. Tel.: þ34 600 942264; fax: þ34 981 825474. E-mail address: [email protected] (J. Barros-Velázquez). Contents lists available at SciVerse ScienceDirect LWT - Food Science and Technology journal homepage: www.elsevier.com/locate/lwt 0023-6438/$ esee front matter Ó2011 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.lwt.2011.10.003 LWT - Food Science and Technology 46 (2012) 217e223
Author's personal copy emulsions (Kelleher, Silva, Hultin, & Wilhelm, 1992; Osborn-Barnes & Akoh, 2003), minced fish (Hwang & Regenstein, 1995; Stodolnik, Blasiak, & Broszedzka, 1992), fish fillets (Badii & Howell, 2002; Pourashouri, Shabanpour, Aubourg, Rohi, & Shabani, 2009) and whole fish (Aubourg, Pérez-Alonso, & Gallardo, 2004). Treatment with lactic acid has also been reported to be effective for extending the shelf lives of fish fillets (Kim, Hearnsberger, & Eun, 1995; Metin, Erkan, Varlik, & Aran, 2001) and coated fish (Gogus, Bozoglu, & Yurdugul, 2006). Interestingly, the effectiveness of inhibiting the growth of Gram-negative bacteria, which are responsible of fish spoilage, has also been reported (Alakomi et al., 2000). However, when employed above certain concentrations or for relatively long exposure times, evidence of fish digestion by the organic acids has been observed, which may produce unfavourable sensory and physical properties of the fish (Kim et al., 1995; Metin et al., 2001). This study provides a novel strategy that employs aqueous solutions of natural organic acids as biopreservatives to prepare flake ice for chilling fish specimens. We have previously demonstrated the biochemical benefits of employing an organic acid-icing system, including ascorbic acid, citric acid and lactic acid, on commercially relevant fish species in terms of lipid oxidation and hydrolysis (García-Soto, Sanxuás, Barros-Velázquez, Fuertes- Gamundi, & Aubourg, 2011). However, the microbial effects of this system have not been evaluated to date. Accordingly, this work focused on studying the effects of an organic acid-icing system on the microbial development and shelf lives of three commercially relevant fish species (hake, Merluccius merluccius; megrim, Lepidorhombus whiffiagonis; and angler, Lophius piscatorius) from the Grand Sole North Atlantic fishing bank during refrigerated storage. 2. Materials and methods 2.1. Preparation of icing systems including organic acids A commercial formula (BPS2) including an organic acid mixture was provided by the company Atlantic One S.L. (Vigo, Spain) for use in the present work. This product consisted of a water-soluble viscous liquid of ascorbic acid, citric acid and lactic acid (1 meq of each acid/120 mg product) in glycerol, which is regarded as safe (GRAS) for use in foods according to the European and American regulatory agencies (Giese, 1996; Madrid, Madrid, & Madrid, 1994). Preliminary trials were performed to optimise the most convenient product concentrations for the icing system in terms of sensory quality. Thus, the effects of a wide range (70e2000 mg/kg) of aqueous concentrations of the organic acid mixture on the sensory qualities of fish specimens were initially tested. From this analysis, it was concluded that 800 mg/kg and 400 mg/kg provided the most convenient results (data not shown). Therefore, both concentrations were selected and employed in this study as the C- 800 and C-400 batches, respectively. The organic acid-icing mixture was prepared as flake ice with water containing the desired concentrations of organic acids in an Icematic F100 Compact device (Castelmac Spa, Castelfranco, Italy). Both batches were compared to fish kept in traditional ice prepared from water (C-0 batch). The pH values of the flake ice systems considered were 7.22, 3.96 and 3.62 for the C-0, C-400 and C-800 batches, respectively. 2.2. Fish material, processing and sampling Specimens of hake (Merluccius merluccius; 96 individuals), megrim (L. whiffiagonis; 78 individuals) and angler (L. piscatorius; 78 individuals) were caught near the Galician Atlantic coast (North- Western Spain) in autumn of 2009 and kept in ice on-board. Upon arrival to the laboratory, the specimens of each species were analysed by triplicate on day one. The remaining specimens were divided into three batches and stored in different types of ice (C- 800, C-400 and C-0 conditions) at a 1:1 fish-to-ice ratio. All batches were placed in a refrigerated room (4 C). The storage boxes employed allowed draining, and ice was renewed when required. Fish samples from different batches were collected for analysis on days one, five, eight and 12; day 15 only was considered for hake. On day zero, six individuals of each fish species were analysed as initial samples (three groups of two individuals). For each fish species and icing condition, three different groups were analysed separately to achieve statistically significant results (n¼3). 2.3. Microbiological analyses Samples of 10 g of fish muscle were dissected aseptically from chilled fish specimens, mixed with 90 ml of peptone water (0.1 g/ 100 g in water) (Merck, Darmstadt, Germany), and homogenised in a stomacher (AES, Combourg, France) as previously described (Ben- Gigirey, Vieites Baptista de Sousa, Villa, & Barros-Velázquez, 1998; Ben-Gigirey, Vieites Baptista de Sousa, Villa, & Barros-Velázquez, 1999). In all cases, serial dilutions from the microbial extracts were prepared in peptone water. Total aerobes were investigated by surface inoculation into plate count agar (PCA, Oxoid Ltd., London, UK) after incubation at 30 C for 48 h. Psychrotrophs were also investigated in PCA, but incubation was carried out at 7e8 C for seven days. Microorganisms exhibiting a proteolytic phenotype were investigated in casein-agar medium after incubation at 30 C for 48 h, as previously described (Ben-Gigirey, Vieites Baptista de Sousa, Villa, & Barros-Velázquez, 2000). 2.4. TMA-N analysis Trimethylamine-nitrogen (TMA-N) values were determined by the picrate method as previously described (Tozawa, Erokibara, & Amano, 1971). This technique involves the preparation of a 5 g/ Table 1 Scale employed for evaluating the sensory quality of fish batches. Attribute Highest quality (E) Good quality (A) Fair quality (B) Unacceptable quality (C) Skin Very intense pigmentation; transparent mucus Milky mucus; insignificant pigmentation losses Slightly greyish mucus; pigmentation without shine Widely opaque mucus; important pigmentation losses External odour Sharply seaweedy and shellfish Weakly seaweedy and shellfish Incipiently sour and rancid Sour and rancid Gills Brightly red; without odour; lamina perfectly separated Rose coloured; without odour; lamina adhered in groups Slightly pale; incipient fishy odour; lamina adhered in groups Grey-yellowish colour; intense ammonia odour; lamina totally adhered Consistency Presence or partial disappearance of rigor mortis symptoms Firm and elastic; pressure signs disappear immediately and completely Presence of mechanical signs; elasticity notably reduced Important shape changes due to mechanical factors Flesh odour Sharply seaweedy and shellfish Weakly seaweedy and shellfish Incipiently sour and rancid Sour and rancid M.S. Rey et al. / LWT - Food Science and Technology 46 (2012) 217e223218
Author's personal copy 100 g trichloroacetic acid extract of fish muscle (10 g/25 ml). The results were expressed as mg TMA-N/100 g muscle. 2.5. Assessment of pH value The evolution of pH in hake, megrim and angler during the storage time was determined by means of a pH-meter fitted with a 6-mm diameter insertion electrode (Crison, Barcelona, Spain). The pH level was measured through penetration of the electrode into the fish samples. 2.6. Sensory analysis The sensory analysis was conducted by a sensory panel of five experienced judges, three male and two female with an age in the 25e50 yr range, according to the guidelines concerning fresh and refrigerated fish compiled in Table 1 (Council Regulation,1990). The panellists had been involved in sensory analysis of different kinds of fish and seafood products for the last ten years. Before the present experiment, a special training was administered on chilled hake, megrim and angler. Such training consisted in the evaluation of refrigerated specimens belonging to the three species and exhibiting different initial qualities. Special attention was paid to the evolution of the different sensory parameters for each species from the initial state until the sensory attributes were not acceptable. Four categories were used to rank the samples: highest quality (E), good quality (A), fair quality (B) and unacceptable quality (C). Sensory assessment of the fish included the following parameters: gills (odour, colour and mucus development), eyes, external odour (development of putrid and other off-odour), muscle odour (raw and cooked fish; development of putrid and other off-odour) and taste (cooked fish; development of putrid and other off-taste). At each sampling time, whole fish specimens were presented to the panellists in individual trays, which were scored individually. 2.7. Statistical analyses Bacterial counts were transformed into log CFU/g before undergoing statistical analysis. Data corresponding to the three icing batches were subjected to one-way analysis of variance to assess significant (P<0.05) differences between batches. The PASW Statistics 18 software for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) was used to explore the statistical significance of the results, including multivariate contrasts and multiple comparisons by Tukey test. A confidence interval at the 95% level was used in all cases. 3. Results and discussion 3.1. Microbiological analyses The comparative evolution of aerobic mesophiles during storage for the three fish species can be seen in Figs. 1e3. Statistically significantly (P<0.05) lower mesophile counts were found for hake (Fig. 1) and megrim (Fig. 2) stored in the C-800 and C-400 systems compared with the C-0 control batches. On the other hand, the angler (Fig. 3A) C-800 batch exhibited statistically significantly (P<0.05) lower mesophiles counts than the C-400 and C-0 batches, and there were no statistically significant differences between two latter batches. The aerobic mesophile numbers for hake and megrim C-800 and C-400 batches were below 7 log CFU/g and for angler was below 6 log CFU/g at the end of storage. These values obtained for the fish specimens stored in the proposed organic icing system were below those generally considered necessary to induce fish spoilage (Gram & Huss,1996). In contrast, the mesophile counts were as high as 7.15 log CFU/g and 7.26 log CFU/g for the hake and megrim C-0 batches, respectively. Our results agreed well with other authors that reported the effectiveness of organic acids for inhibition of aerobic bacteria evolution in spiny dogfish (Squalus acanthias)(Sengoer, Mol, & Uecok, 2007). In addition, other authors found that fish products treated with ellagic acid in combination with ascorbic acid and sodium ascorbate exhibited a significant delay in the proliferation of aerobic mesophiles (Zambuchini, Fiorini, Verdenelli, Orpianesi, & Ballini, 2008) With respect to the psychrotrophs, statistically significantly (P<0.05) lower counts were determined for angler (Fig. 3B) stored in the C-800 system compared with the C-400 and C-0 batches. Nevertheless, the psychrotroph counts on the last day of storage (12 days) were lower than 7 log CFU/g for any of the batches tested. These results also agree with a previous study in which other fish Fig. 1. Evolution of mesophilic aerobes in hake muscle (Merluccius merluccius) for chilled fish specimens stored under C-0 ($$$: control), C-400 (:: 400 mg/kg organic acids) and C-800 (-: 800 mg/kg of organic acids) conditions. All analyses were done by triplicate. Fig. 2. Evolution of mesophilic aerobes in the muscle of chilled megrim (Lepidorhombus whiffiagonis) specimens stored under C-0 ($$$: control), C-400 (:: 400 mg/kg organic acids) and C-800 (-: 800 mg/kg of organic acids) conditions. All analyses were done by triplicate. M.S. Rey et al. / LWT - Food Science and Technology 46 (2012) 217e223 219
Author's personal copy species, such as spiny dogfish, were treated with salts, ascorbic acid and citrate (Sengoer et al., 2007; Yang, Jhaveri, & Constantinides, 1981). No significant differences for psychrotrophs were found for megrim or hake. Finally, the counts of proteolytic microorganisms were also significantly (P<0.05) lower in the angler C-800 batch than in the other two batches (Fig. 3C). The role of proteolytic microorganisms in the degradation of fish muscle has been highlighted (Rodríguez, Barros-Velazquez, Ojea, Pineiro, & Aubourg, 2003). Accordingly, the partial inhibition of this microbial group by the organic acids tested in this study is another remarkable result in terms of fish quality. As in the case of the psychrotrophs, no significant differences for proteolytic microorganisms were found in megrim or hake. According to the results of the microbial analysis, the presence of organic acids in the icing system significantly slowed down the growth of certain microbes in fish muscles; this result was especially relevant for angler, and to a lesser extent, for hake and megrim. Other studies of flow ice systems prepared from marine water indicated that when the ice melts, the salt solution may exert a washing effect of the fish surface, which reduces the surface microbial load and thus limits microbial diffusion into the muscle through the skin (Campos, Rodríguez, Losada, Aubourg, & Barros- Velázquez, 2005; Rodríguez, Barros-Velázquez, Piñeiro, Gallardo & Aubourg, 2006; Rodríguez et al., 2004). Likewise, in this study, melting of the ice flakes prepared with organic acids may exert a similar washing effect, which also prevents the formation of surface microbial biofilms that may induce fish spoilage. No significant inhibitory effect of glycerol, the solvent of the organic acid mixture evaluated, on microbial growth can be argued, since the glycerol concentration in the ice mixture was 0.22 g/100 g, this being quite below the concentration of 5 g/100 g considered as neccessary for exerting significant microbial inhibition (Roger, Fonty, Andre, & Gouet, 1992) 3.2. TMA-N evolution The evolution of TMA-N in fish muscles during refrigerated storage is presented in Table 2. In the case of hake, the C-800 batch exhibited lower levels of TMA-N formation throughout storage compared with the other two batches, which indicates that the combination of organic acids at this proportion is beneficial for decreasing the production of these amines by microbes. In the case of megrim, the inclusion of organic acids in the icing system did not produce any significant improvement in terms of TMA-N formation. Finally, for the angler, the incorporation of citric acid, ascorbic acid and lactic acid in the C-800 batch provided significant protection against TMA-N formation compared with the C-0 batch at all sampling times. Moreover, the effect of the C-400 batch, which included intermediate concentrations of the natural organic acids, was also favourable compared with the C-0 batch. 3.3. pH analyses Increases in the pH of the fish muscle indicate the accumulation of alkaline compounds, such as ammonia compounds and TMA, which are principally derived from microbes (Hebard, Flick, & Martin, 1982). In this sense, it has been suggested that pH values above 7 may limit the shelf lives of certain fish species (Moral,1987; Ruíz Capillas & Moral, 2001). In our study, no significant effects of the organic acids on pH evolution of hake muscle were observed. With respect to the muscles of megrim stored in the C-800 and C-400 systems, the pH values were significantly (P<0.05) lower compared with the C- 0 control batch (Fig. 4A). Thus, the pH differences at the end of the storage period were more than 0.50 pH units, which indicates that the incorporation of natural preservatives to the icing system, at either of the two concentrations tested, significantly reduced the microbial and endogenous alkalinising mechanisms that may limit fish shelf life. Likewise, in the case of angler stored in the C-800 icing system, the pH value of the muscle was significantly (P<0.05) lower compared with the C-400 and C-0 control batches (Fig. 3D). These results agree with other studies that reported better pH value maintenance in catfish fillets treated with lactic acid (Kim Fig. 3. Evolution of mesophilic aerobes (A), psychrotrophs (B) and proteolytic bacteria (C) in the muscle of chilled angler (Lophius piscatorius) specimens stored under C- 0($$$: control), C-400 (:: 400 mg/kg organic acids) and C-800 (-: 800 mg/kg of organic acids) conditions. All analyses were done by triplicate. M.S. Rey et al. / LWT - Food Science and Technology 46 (2012) 217e223220
Author's personal copy et al.,1995) and in sole specimens treated with ellagic acid, ascorbic acid and sodium ascorbate (Zambuchini et al., 2008). However, and similar to previous analyses, our study includes a novel mixture of organic acids that has not been tested before for fish preservation purposes. 3.4. Sensory analyses The results of the sensory evaluation of the three species tested with the different icing systems are presented in Table 3. Initial specimens of hake exhibited the highest quality (E) while angler and megrim specimens were one degree under, exhibiting A quality, according to the examination of gills and external odour. These differences found inland are frequent since not all species are caught at the same time by the ships operating in the Grand Sole fishing bank during 15 days. In the case of hake, the C-800 batch, which incorporated the highest concentration of organic acids, showed the best behaviour and retained an acceptable quality even after 12 days of storage; however, this result was not observed for the other two batches. For hake, storage in the C-800 organic acidicing system provided better preservation of all sensory quality parameters, especially muscle odour and taste. In the case of megrim, similar results were obtained. Thus, only the C-800 batch retained acceptable quality after eight days of storage, as compared with the other two icing batches. As was the case for hake, muscle odour and taste was the sensory parameters for which the C-800 organic acids-icing system provided the best results. Finally, angler specimens exhibited a better behaviour in all batches compared with hake and megrim. However, the C-800 batch maintained very good sensory quality up until day eight, and the other batches were also considered to be acceptable at that time. Moreover, the angler specimens stored in the C-800 organic acid-icing system were acceptable on day 12, which was not observed for the other two batches. The shelf lives of angler specimens in the icing systems considered in this work were longer as compared with hake and megrim. This result correlates well with TMA-N formation, which Table 2 Trimethylamine (TMA) assessment (mg TMA-N/100 g muscle) a in fish kept in different kinds of ice. b Chilling time (days) Hake Megrim Angler C-0 C-400 C-800 C-0 C-400 C-800 C-0 C-400 C-800 1 0.17 (0.05) 0.10 (0.03) 0.15 (0.03) 2.60 (0.35) 2.16 (0.20) 1.62 (0.77) 2.62 b (1.48) 1.08 b (0.57) 0.22 a (0.18) 5 1.00 b (0.49) 0.81 ab (0.19) 0.29 a (0.06) 5.89 (0.21) 5.98 (2.97) 7.48 (2.51) 4.80 (1.57) 6.15 (2.18) 2.72 (2.43) 8 6.18 b (2.46) 3.76 ab (1.17) 1.99 a (0.36) 12.07 (3.85) 10.42 (3.97) 13.70 (0.93) 9.83 c (1.37) 7.25 b (0.91) 5.24 a (1.84) 12 11.12 b (1.50) 11.98 b (1.30) 8.26 a (1.09) 15.66 ab (4.19) 12.04 a (3.79) 18.19 b (1.61) 11.76 b (1.95) 8.48 ab (1.27) 7.58 a (1.73) 15 17.12 b (2.18) 16.79 b (1.56) 12.84 a (1.04) Initial TMA values: 0.11 0.02 (hake), 1.43 0.61 (megrim) and 1.87 1.56 (angler). All analyses were done by triplicate. a Mean values (n¼3) are indicated; standard deviations are expressed in parentheses. b Ice conditions: C-0, C-400 and C-800 represent the control and the batches containing 400 mg/kg and 800 mg/kg of organic acids, respectively. Fig. 4. Changes in the muscle pH of chilled megrim (A) and angler (B) specimens stored under C-0 ($$$: control), C-400 (:: 400 mg/kg organic acids) and C-800 (-: 800 mg/kg of organic acids) conditions. All analyses were done by triplicate. Table 3 Sensory acceptance a of hake stored under different icing conditions. b Attribute Icing system Chilling time (days) Hake Megrim Angler 5 8 12 15 1 5 8 12 1 5 8 12 Gills C-0 B B C C A B C C A B B B C-400 A B B C A A B C A A B B C-800 A B B C A A B C A A A B Eyes C-0 A B C C A A B B A A A B C-400 A B B C A A B B A A A B C-800 A B B C A A B B A A A B External odour C-0 A B C C A B B C A A B C C-400 A B B C A B B C A A B C C-800 A B B C A B B C A A A B Muscle odour and taste C-0 ABC C ABCC ABBC C-400 A B C C A A C C A B B C C-800 A A B C A A B C A A A B All analyses were done by triplicate. a Initial specimens were category E for all attributes considered. Fish on day one were category A for all attributes considered. E: excellent quality; A: good quality; B: fair quality and C: unacceptable quality. b Ice conditions: C-0, C-400 and C-800 represent the control and the batches containing 400 mg/kg and 800 mg/kg of organic acids, respectively. M.S. Rey et al. / LWT - Food Science and Technology 46 (2012) 217e223 221
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 136 la considerada necesaria para ejercer una inhibición microbiológica significativa (Roger y col., 1992). Análisis bioquímico La formación de N-TMA en músculo de merluza refrigerada en el lote C-800, mostró valores menores a lo largo del almacenamiento en comparación con los otros dos lotes. Esto indica que la combinación de ácidos en esta proporción es beneficiosa en la ralentización de la microbiota productora de aminas volátiles. En el caso del gallo, el hecho de incluir ácidos orgánicos en el sistema de hielo no produjo ningún aumento significativo en términos de formación de N-TMA. Por último, en el caso del rape, la incorporación de ácidos cítrico, ascórbico y láctico en el lote C-800, ejerció un efecto protector frente a la formación de N-TMA en comparación con el lote C-0 para todos los tiempos de muestreo. Por otra parte, el efecto del lote C-400, que incluyó concentraciones intermedias de los ácidos orgánicos naturales, también fue favorable en comparación con el lote C-0. El incremento de pH en el músculo de pescado indica la acumulación de compuestos alcalinos, principalmente amoniaco y TMA, que son los derivados principales de la actividad microbiana (Hebard, y col., 1982). En este sentido, se ha sugerido que valores superiores a 7 pueden limitar la vida útil de ciertas especies de pescado (Moral, 1987; Ruiz Capillas & Moral, 2001). En nuestro estudio, la evolución del pH en el músculo de merluza no resultó ser significativo por la presencia de ácidos. Con respecto a gallo almacenado en los sistemas C-800 y C-400, los valores de pH en el músculo resultaron ser significativamente (P<0,05) menores en comparación con el lote control. Así, al final del periodo de almacenamiento, las
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 137 diferencias en los valores de pH fueron mayores de 0,50 unidades, lo que indica que la incorporación de los ácidos en el sistema de hielo, en cualquiera de las dos concentraciones probadas, redujo significativamente los mecanismos microbianos y endógenos de alcalinización, mecanismos que pueden limitar la vida útil del pescado. De la misma manera, en el caso del rape almacenado en el sistema de hielo C-800, el valor de pH resultó ser significativamente (P<0,05) menor en comparación con los lotes C-400 y control. Estos resultados están en consonancia con otros estudios, donde se consiguió mantener buenos valores de pH en filetes de siluro (Silurus glanis) tratados con ácido láctico (Kim y col., 1995) y muestras de lenguado tratadas con ácido elágico, ácido ascórbico y ascorbato de sodio (Zambuchini y col., 2008). Análisis sensorial En relación al análisis sensorial, los individuos de merluza iniciales presentaron la mayor calidad (E), mientras que los de rape y gallo reflejaron un grado de calidad menor (A), según el examen de las branquias y olor externo. Estas diferencias son frecuentes, ya que no todas las especies son capturadas al mismo tiempo por los buques que operan en el caladero de Gran Sol. En el caso de merluza, el lote C-800, que posee la concentración mayor de ácidos, presenta el mejor comportamiento y mantiene una calidad aceptable incluso después de 12 días de almacenamiento. Sin embargo, este resultado no se observó para los otros dos lotes. Por lo que el almacenamiento de merluza en el sistema de hielo ácido C-800 proporcionó una mejor conservación en términos de calidad sensorial, especialmente olor y sabor.
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 138 En el caso de gallo, se obtuvieron resultados similares. Así, solamente el lote C-800 mantuvo una calidad aceptable, en lo que respecta a los parámetros sensoriales de olor y sabor, después de 8 días de almacenamiento en comparación con los otros dos lotes. Para finalizar, los ejemplares de rape experimentaron un comportamiento mejor en todos los lotes, en comparación con merluza y gallo. Además, el rape almacenado en el sistema hielo C-800 llegó a ser aceptable a día 12, resultado que no fue observado en los otros dos lotes. La vida útil de los individuos de rape considerados en el presente trabajo fue mayor que en el caso de merluza y gallo. Estos resultados se correlacionan bien con la formación de N-TMA, que resultó ser menor en el caso del rape en comparación con la merluza y el gallo, así como con el pH, cuyos valores aumentaron levemente en el caso del rape. Estos resultados indican claramente un impacto más limitado de los mecanismos alcalinizantes en rape, lo que implica una limitada formación de compuestos nitrogenados, que afectan negativamente a la calidad sensorial y a la vida útil del pescado (Rodríguez, y col., 2003). Estos resultados están de acuerdo con estudios previos donde se puso de manifiesto la resistencia de rape refrigerado en hielo tradicional y en hielo líquido frente a la degradación química y microbiana (Barros-Velázquez, y col., 2008). En general y conforme a estos resultados, no se encontraron beneficios significativos en el uso del sistema de hielo ácido C-400 comparado con el sistema control. Por el contrario, la incorporación de ácidos ascórbico, láctico y cítrico a la concentración utilizada en el lote C-800 dio como resultado una mejora
IVRESULTADOS Y DISCUSIÓN 139 de la calidad y extensión de vida útil en comparación con los otros dos lotes. Estos resultados, concuerdan con los recuentos microbiológicos determinados en este estudio, que mostraron un lento crecimiento microbiano para la merluza, el rape y el gallo como resultado de la combinación de ácidos en el lote C-800. En este estudio, las piezas de pescado almacenadas en hielo en escamas fueron almacenadas en una habitación isoterma a 4º C. El efecto combinado de la refrigeración y los ácidos orgánicos resultaron tener efectos beneficiosos en términos de calidad microbiológica y sensorial para las tres especies analizadas. Más aún, las ventajas del hielo líquido como sistema de pre-tratamiento para reducir la temperatura del pescado, ligeramente por debajo de 0º C previo almacenamiento en hielo en escamas, han sido estudiadas anteriormente (Piñeiro y col., 2005). En este sentido, el sistema de hielo en escamas, incluyendo los ácidos orgánicos propuestos en este estudio, proporcionaría ventajas adicionales si fuese combinado con un tratamiento previo de enfriamiento con hielo líquido.
Parte 2 CAPÍTULO 4: Effect of a two-step natural organic acid treatment on microbial activity and lipid damage during blue whiting (Micromesistius poutassou) chilling. Efecto de un sistema de hielo conteniendo ácidos orgánicos naturales sobre la actividad microbiológica y alteración lipídica de la bacaladilla (Micromesistius poutassou) durante su almacenamiento en refrigeración.
Original article Effect of a two-step natural organic acid treatment on microbial activity and lipid damage during blue whiting (Micromesistius poutassou) chilling Minia Sanjua ´s-Rey, 1 Bibiana Garcı ´a-Soto, 2 Jorge Barros-Vela ´zquez, 1 Jose ´R. Fuertes-Gamundi 2 & Santiago P. Aubourg 3 * 1 Department of Analytical Chemistry, Nutrition and Food Science, Escuela de Ciencias Veterinarias, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, Spain 2 Cooperativa de Armadores de Pesca del Puerto de Vigo (ARVI), Vigo, Spain 3 Department of Food Technology, Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC), Vigo, Spain (Received 9 July 2010; Accepted in revised form 11 January 2011) Summary Quality loss inhibition in chilled blue whiting (Micromesistius poutassou) was investigated. For it, a natural organic acid-mixture including ascorbic, citric and lactic acids was applied in a two-step processing strategy: (i) as an aqueous dipping medium previous to chilling storage and, (ii) included in the flake ice employed as chilling system. As a result of the acid-mixture addition, a partial inhibition of microbial and biochemical mechanisms involved in the quality loss was obtained. Thus, aerobe and psychrotrophe counts in treated fish showed lower ranges (2.07–4.15 and 2.43–4.39 log CFU g )1 , respectively) than control fish (2.64–5.83 and 2.30–5.30 log CFU g )1 , respectively). Sensory analysis revealed that treated fish was still acceptable at the end of the experiment (day 9), while control fish was rejected at this time. Lipid hydrolysis (free fatty acid formation) proved to be more limiting of fish quality than lipid oxidation (peroxide and thiobarbituric acidreactive substance formation). Keywords Ascorbic, citric, dipping, icing, lactic, lipid damage, microbial activity, Micromesistius poutassou. Introduction The deterioration of marine species begins immediately upon capture or harvest, and the degree to which it continues depends directly on storage conditions. Flake ice has been the most employed method to cool and store fish products and partially inhibit detrimental effects on the commercial value. However, significant deterioration of sensory quality and nutritional value has been detected in chilled fish as a result of different damage pathways (Whittle et al., 1990; Olafsdo ´ttir et al., 1997). To retard fish damage as long as possible, and accordingly extend shelf life, a wide number of preservative strategies to be combined to flake ice chilling have been tested satisfactorily such as previous chemical and physical treatments (Toledo-Flores & Zall, 1992; Ashie et al., 1996) and employment of preservative packaging (Ozen & Floros, 2001; Sivertsvik et al., 2002). Among previous chemical treatments to chilling storage, natural low molecular weight organic acids and their sodium salts have shown to represent a relevant choice because of their easy availability, low commercial cost and wide range of permitted concentrations for their use. Thus, ascorbic and citric acids (AA and CA, respectively) are widely known for their role as chelators, acidulants in biological systems and synergists of primary antioxidants, so that a profitable effect on minced fish (Hwang & Regenstein, 1988; Stodolnik et al., 1992), fish fillets (Badii & Howell, 2002; Kilinc et al., 2009; Pourashouri et al., 2009) and whole fish (Aubourg et al., 2004) has been observed. Further, lactic acid (LA) has been reported to be effective in suppressing Gram-negative bacteria, which are known to be the most important fish spoiler group; thus, LA pre-treatment has shown to be effective in preserving and extending shelf-life in fish fillets (Kim et al., 1995; Metin et al., 2001; Erkan, 2003; Erkan & Mol, 2004), coated fish (Gogus et al., 2006) and fish slices (Sallam, 2007). However, when employed above certain concentrations or for relatively long exposure times, some *Correspondent: E-mail: [email protected] International Journal of Food Science and Technology 2011, 46, 1021–1030 1021 doi:10.1111/j.1365-2621.2011.02565.x 2011 The Authors. International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology
evidence of fish digestion by such organic acids could be observed, which lead to detrimental sensory and physical properties of the fish (Kim et al., 1995; Metin et al., 2001). Blue whiting (Micromesistius poutassou) species belongs to the Gadidae family and has been found an abundant fish in the northeast Atlantic leading to great capture values in several countries such as Norway, Russian Federation, Iceland and Estonia (FAO, 2007). Previous research has shown its profitable nutritional support to human diet (Dagbjartson, 1975; Martı´nez- Valverde et al., 2000), being most efforts focused to its employment in the manufacture of restructured products (Montero et al., 1998; Pe ´rez-Mateos et al., 2002). However, since it is also directly consumed, blue whiting suitability to freezing (Huidobro & Tejada, 1995; Aubourg et al., 2007), cold-smoking (Go ´mez-Guille ´n et al., 2009) and canning (Oehlenschla ¨ger et al., 2008) processes has also been tested. Concerning its chilled storage, previous research accounts for the nucleotide degradation and volatile amine formation (Smith et al., 1980), lipid oxidation development (Aubourg et al., 1998) and trimethylamine oxide breakdown into formaldehyde and dimethylamine (Rey-Mansilla et al., 1999). In the present research, a novel approach is carried out to inhibit quality loss in chilled blue whiting. For it, a natural organic acid-mixture including AA, CA and LA was applied in a two-step processing. First, as an aqueous dipping medium previously to chilling storage; then, present in the ice employed as chilling system. Microbial activity and lipid damage development were evaluated throughout the storage time and compared to control fish. Materials and methods The natural organic acid-mixture and preliminary trials A commercial formula (BPS2) including a natural organic acid-mixture was supplied by Atlantic one,S.L. (Vigo, Spain) for employment in the present research. Such a product consists of a water-soluble viscous liquid including AA, CA and LA (1 mequiv. acid ⁄120 mg product) in glycerol, being regarded as safe (GRAS) for use in foods according to European and American administrations (Madrid et al., 1994; Giese, 1996). Preliminary trials were carried out in order to assess the most convenient product concentration to be employed both in the dipping medium as well as in the icing system. For it, the effect on sensory acceptance (appearance, texture, gills, odour and colour) of a wide concentration range (70–2000 ppm) of the organic acid-mixture was checked. Thus, concentration values included in the 70–500 ppm range did not provide an effective quality enhancement of the fish, while values above 1000 ppm led to some deterioration of the sensory and physical properties of the fish. As a result, 800 ppm concentration showed to provide the most convenient results when employed in both processing steps. Accordingly, this concentration was chosen for being employed in the present research. Raw fish, processing and sampling Fresh blue whiting (seventy-two individuals) were caught near the Galician Atlantic coast (northwestern Spain) in Winter 2010 and transported on ice to the laboratory. The length and weight of the fish specimens were included in the following ranges: 22–25 cm and 70– 120 g, respectively. Upon arrival in the laboratory, eight individual fishes were separated and considered as starting raw fish (day 0); for it, two different groups (four individuals per group) were considered and analysed independently. The remaining fish were divided into two batches (thirty-two individuals in each batch). The first batch (preserved fish; P batch) was dipped in an 800 ppm aqueous solution of the organic acid-mixture during 2 min (ca. 290 g fish L )1 solution); after that, the fish were placed in boxes and directly surrounded by ice prepared with a 800 ppm aqueous solution of the organic acid-mixture. Fish corresponding to the second batch (control fish; C batch) was dipped in water during 2 min (ca. 290 g fish L )1 solution) and then placed in boxes surrounded by traditional ice prepared with water. In both batches, the fish individuals were surrounded by ice (with or without organic acid-mixture, respectively) at a 1:1 fish-to-ice ratio. Both batches were placed in a refrigerated room (4 C). Boxes employed allowed draining and ice was renewed when required. Fish samples from the two different batches were taken for analysis on days 2, 5, 7 and 9. At each sampling point, eight individuals of each batch were taken for analysis, being considered into two groups (four individuals in each group) that were studied independently. Microbial counting Samples of 10 g of fish muscle were dissected aseptically from chilled fish specimens, mixed with 90 mL of 0.1% peptone water (Merck, Darmstadt, Germany), and homogenised in a stomacher (AES, Combourg, France) as previously described (Ben-Gigirey et al., 1998, 1999). In all cases, serial dilutions from the microbial extracts were prepared in 0.1% peptone water. Total aerobes were investigated by surface inoculation in plate count agar (PCA, Oxoid Ltd, London, UK), after incubation at 30 C for 48 h. Psychrophiles were also investigated in PCA but incubation was carried out at Natural organic acid and blue whiting chilling M. Sanjua ´s-Rey et al.1022 International Journal of Food Science and Technology 2011 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology
7–8 C for 7 days. Enterobacteriaceae were investigated by pour platting on Violet Red Bile Agar (VRBA) (Merck, Darmstadt, Germany) after incubation at 37 C for 24 h. Microorganisms exhibiting a proteolytic or lipolytic phenotype were investigated in casein-agar medium or tributyrin-agar, respectively, after incubation at 30 C for 48 h, as previously described (Ben- Gigirey et al., 2000). In all cases, bacterial counts were transformed into log CFU g )1 muscle before undergoing statistical analysis. Proximate composition and pH assessment Moisture content was determined by the difference between the weight of fresh homogenised white muscle (1–2 g) and the weight recorded after 4 h at 105 C. Results were calculated as g water kg )1 muscle. Lipids were extracted from the fish white muscle by the Bligh & Dyer (1959) method, by employing a singlephase solubilisation of the lipids using a chloroformmethanol (1:1) mixture. Quantification results were calculated as g lipid kg )1 muscle. The evolution of pH values in fish muscle along storage time was determined by means of a 6-mm diameter insertion electrode (Crison, Barcelona, Spain). Lipid damage assessment The peroxide value (PV) was determined spectrophotometrically (Beckman Coulter, DU 640, London, UK) in the lipid extract by previous peroxide reduction with ferric thiocyanate, according to the Chapman & McKay (1949) method. Results were expressed as mequiv. active oxygen kg )1 lipids. The thiobarbituric acid (TBA) index was determined according to Vyncke (1970). This method is based on the reaction between a trichloracetic acid extract of the fish muscle and TBA. Content on thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) was spectrophotometrically measured at 532 nm and results were expressed as mg malondialdehyde kg )1 muscle. Formation of fluorescent compounds (Fluorimeter LS 45; Perkin Elmer Espan ˜a, Tres Cantos, Madrid, Spain) was determined by measurements at 393 ⁄463 nm and 327 ⁄415 nm as described by Aubourg et al. (1998). The relative fluorescence (RF) was calculated as follows: RF = F⁄F st , where Fis the fluorescence measured at each excitation ⁄emission maximum, and F st is the fluorescence intensity of a quinine sulphate solution (1 lgmL )1 in 0.05 mH 2 SO 4 ) at the corresponding wavelength. The fluorescence ratio (FR) was calculated as the ratio between the two RF values: FR = RF 393 ⁄463 nm ⁄RF 327 ⁄415 nm . The FR value was determined in the aqueous phase resulting from the lipid extraction of the fish muscle (Bligh & Dyer, 1959). Free fatty acid (FFA) content was determined in the lipid extract of the fish muscle by the Lowry & Tinsley (1976) method based on complex formation with cupric acetate-pyridine followed by spectrophotometric (715 nm) assessment. Results were expressed as g FFA kg )1 lipids. Sensory analysis Sensory analysis was conducted by a sensory panel consisting of five experienced judges, according to guidelines concerning fresh and refrigerated fish (DOCE, 1989). Panellists had been involved in sensory analysis of different kinds of fish foods during the last 10 years. Previously to the present experiment, a special training was carried out on chilled blue whiting. Four categories were ranked (Table 1): highest quality (E), good quality (A), fair quality (B) and unacceptable quality (C). Sensory assessment of the fish included the following parameters: skin and mucus development, external odour, gills and gill cavity, eyes and flesh odour (raw and cooked fish) and taste (cooked fish). Fish samples were cooked individually in covered casserole dishes and immediately presented in these dishes to the panellists. At each sampling time, the fish muscle portions were presented to panellists in individual trays and were scored individually. The panel members shared samples tested. Statistical analysis Data obtained from the different microbial and chemical analyses were subjected to the anova method (P< 0.05) to explore differences by two different ways: processing conditions effect and chilling time effect (Statsoft, Statistica, version 6.0, 2001); comparison of means was performed using a least-squares difference (LSD) method. Correlation analysis among parameters (chilling time, microbial indices, lipid damage indices and sensory acceptance) was also carried out; for sensory values, the Spearman test was employed. Linear fittings are expressed; otherwise, the kind of fitting (quadratic or logarithmic) is mentioned. Results and discussion Microbial activity assessment The comparative evolution of total aerobes for each batch during storage time can be seen in Fig. 1. In general terms, the control batch exhibited higher microbial numbers than the counterpart batch stored in the natural-organic acid system. Thus, the most remarkable differences were observed on days 2, 5 and 9, the mean differences between batches being 0.57, 3.17 and 0.48 log CFU g )1 muscle, respectively. Nevertheless, Natural organic acid and blue whiting chilling M. Sanjua ´s-Rey et al. 1023 2011 The Authors International Journal of Food Science and Technology 2011 International Journal of Food Science and Technology 2011 Institute of Food Science and Technology