Genética de las cardiopatías familiares

Trabajo de fin de grado Título en galego XENÉTICA DAS CARDIOPATÍAS FAMILIARES Título en castellano GENÉTICA DE LAS CARDIOPATÍAS FAMILIARES Título en inglés GENETICS OF INHERITED CARDIOPATHIES Autor/a/es/as: Mª Paz Alonso Piñeiro Tutor/a: Ángel Carracedo Álvarez Cotutora 1: María Brión Martínez Cotutor 2 : Alejandro Blanco Verea Departamento: Medicina Legal y Forense / Ciencias Forenses, Anatomía Patológica, Ginecología y Obstetricia y Pediatría. CURSO ACADÉMICO 2020/2021 CONVOCATORIA FEBRERO Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Medicina 3 ÍNDICE ...................................................................................................................................... 3 RESUMEN ................................................................................................................................ 5 RESUMO ................................................................................................................................... 5 ABSTRACT .............................................................................................................................. 6 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 7 MUERTE SÚBITA CARDÍACA ........................................................................................ 7 CARDIOPATÍAS FAMILIARES ....................................................................................... 7 CANALOPATÍAS ............................................................................................................ 8 Síndrome de QT largo (LQTS): ......................................................................... 9 Síndrome de QT corto (SQT) ........................................................................... 12 Síndrome de Brugada (SBr) ............................................................................. 13 Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC) .............. 14 MIOCARDIOPATÍAS .................................................................................................... 15 Clasificación y definición, recuerdo histórico. ................................................ 15 Miocardiopatía Hipertrófica. ........................................................................... 17 Miocardiopatía Dilatada (MCD) ...................................................................... 20 Miocardiopatía Arritmogénica ........................................................................ 21 Miocardiopatía Restrictiva (MCR) .................................................................. 22 Miocardiopatía No Compactada (MCNC). ..................................................... 22 TECNOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN ........................................................................... 22 Secuenciación Sanger ........................................................................................ 22 Secuención masiva en paralelo ......................................................................... 23 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 25 MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................... 26 ANAMNESIS DE LA FAMILIA. ...................................................................................... 26 EXTRACCIÓN DE ADN ............................................................................................... 26 PREPARACIÓN ADN PARA SECUENCIACIÓN MASIVA EN PARALELO ........................ 26 CONCENTRACIÓN ....................................................................................................... 26 PUREZA ...................................................................................................................... 27 INTEGRIDAD ............................................................................................................... 27 SECUENCIACIÓN MASIVA EN PARALELO ................................................................... 28 PRIORIZACIÓN DE VARIANTES ................................................................................... 28 CONFIRMACIÓN POR SANGER DE LAS VARIANTES ENCONTRADAS ........................... 29 RESULTADOS ....................................................................................................................... 33 4 DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 35 CONCLUSIONES .................................................................................................................. 38 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 39 5 RESUMEN Las cardiopatías hereditarias son las responsables de aproximadamente el 50% de las muertes súbitas cardíacas ocurridas en individuos menores de 35 años. La elevada prevalencia de alguna de estas cardiopatías, el patrón de herencia autosómico dominante que presentan, y, por tanto, la afectación de la mayoría de los miembros de la misma familia, la elevada penetrancia y heterogeneidad de la enfermedad, que en muchos casos enmascara la patología subyacente en portadores asintomáticos, y el impacto social que provoca la muerte inesperada de individuos jóvenes aparentemente sanos, convierten a este tipo de patologías y a los individuos que las padecen, en candidatos principales para un estudio genético. Las mejoras en las técnicas de secuenciación Sanger, y sobre todo la implementación de las más modernas técnicas de secuenciación masiva en paralelo, nos permiten de un modo rápido, eficaz y económico secuenciar paneles de genes específicos para patologías concretas como pueden ser las patologías cardiacas hereditarias. El caso índice de nuestro estudio fue diagnosticado de miocardiopatía no obstructiva por la clínica, y debido a sus antecedentes familiares se decidió realizarle un estudio genético usando un panel que incluye un total de 96 genes relacionados con patologías cardíacas hereditarias. Una vez finalizada la secuenciación se hizo un proceso de priorización de variantes que nos reveló la presencia de la variante patogénica c.2864_2865delCT:p.P955Rfsx95 en el gen MYBPC3 relacionada con su patología. Este hallazgo nos llevó a realizar un estudio de portadores en los hijos del caso índice. Los resultados obtenidos demuestran que los estudios genéticos son recursos imprescindibles en la práctica clínica, no sólo por el apoyo diagnóstico que ofrecen, sino porque ayudan a desenmascarar patologías genéticas presentes en pacientes asintomáticos, así como a facilitar un diagnóstico precoz y a mejorar el pronóstico de la enfermedad en los individuos portadores de la variante patogénica. RESUMO As cardiopatías hereditarias son responsables de aproximadamente o 50% das mortes súbitas cardíacas acaecidas en individuos menores de 35 anos. A elevada prevalencia dalgunha destas cardiopatías, o padrón de herdanza autosómica dominante que presentan, e, polo tanto, a afectación da maioría dos membros dunha mesma familia, a elevada penetrancia e heteroxeneidade da doenza, que en moitos casos agocha a patoloxía supeditada en portadores asintomáticos e no impacto social que provoca a morte súpeta de individuos novos aparentemente sans, convirten a este tipo de patoloxías e ós individuos que as padecen, en principais candidatos para un estudio xenético. As melloras nas técnicas de secuenciación Sanger, e principalmente a implementación das mais modernas técnicas de secuenciación masiva en paralelo, permítennos dun xeito rápido, eficaz e económico secuenciar paneis de xenes específicos para patoloxías concretas, como poden ser as patoloxías cardíacas hereditarias. O caso índice do noso estudo foi diagnosticado de miocardiopatía non obstrutiva pola clínica, e por mor dos seus antecedentes familiares, decidiuse realizarlle un estudo xenético usando un panel que inclúe un total de 96 xenes relacionados con patoloxías cardíacas hereditarias. Unha vez rematada a secuenciación fíxose un proceso de priorización de variantes 6 que nos revelou a presenza da variante patóxena c.2864_2865delCT:p.P955Rfsx95 no xene MYBPC3 relacionado coa súa patoloxía. Este achado lévanos a realizar un estudo de portadores nos fillos do caso índice. Os resultados obtidos amosan que os estudos xenéticos son recursos imprescindibles na práctica clínica, non só polo apoio diagnóstico que ofrecen, senón porque axudan a desenmascarar patoloxías xenéticas presentes en pacientes asintomáticos, así como facilitar un diagnóstico precoz e a melloralo pronóstico da doenza nos individuos portadores das variantes patóxenas. ABSTRACT Inherited cardiomyopathies are responsible for, approximately, 50% of the sudden cardiac deaths that affect to individuals under 35. The high prevalence of some of these cardiomyopathies, the autosomical dominant pattern of inheritance they present and therefore the affectation of the majority of the members of a same family, the high penetrance and heterogeinity of the disease, which in most cases masks the underlying pathology in asymptomatic carriers, and the social impact that the unexpected death of young people apparently healthy causes, make these pathologies and the people who suffer them candidates for a genetic testing. The improvement in the techniques of Sanger sequencing and especially the implementation of the latest parallel massive sequencing techniques (NGS), allow us to quickly, efficiently and economically sequence panels of specific genes for specific pathologies such us inherited cardiac disease. The index case of our investigation was diagnosed by the clinical with a non-obstructive cardiomyopathy and due to the family background it was decided to carry out the genetic testing using a panel that includes a total of 96 genes related to cardiac pathologies. Once the sequencing was completed a variant prioritization process was carried out, which revealed the presence of the pathogenic variant c.2864_2865delCT:p.P955Rfsx95 in the MYBPC3 gene related to its pathology. This finding led us to carry out a study of carriers in the children of the index case. The results obtained show that the genetic testing are essential resources for the clinical practice, not only because of the diagnostic support they offer, but also because they help to expose genetic pathologies which are present in asymptomatic patients, and they provide a forward diagnosis and improve the prognosis of the illness in those patients who carry the pathogenic variant. 7 INTRODUCCIÓN MUERTE SÚBITA CARDÍACA La muerte súbita es un trágico evento que ocurre de forma natural e inesperada en la hora siguiente del inicio de los síntomas, en una persona previamente sana o que presenta unas patologías diagnosticadas que carecen de la gravedad necesaria para prever la repentina muerte (1). Aunque existe una gran variabilidad etiológica (aneurismas aórticos, enfermedad vascular cerebral o cardíaca, tromboembolia pulmonar masiva,…), aproximadamente el 85% de las muertes súbitas son de origen cardíaco, siendo el infarto de miocardio la principal causa: se produce una arritmia cardíaca que desencadena una taquicardia o fibrilación ventricular sostenida y, como consecuencia, el fatal desenlace (2,3,4). La Muerte Súbita Cardíaca (MSC) se ha convertido en un problema de salud pública a nivel mundial, ya que supone: - un 20-30% de los fallecidos con patologías de origen cardíaco, - y aproximadamente 350.000 muertes en EEUU en un año o más de 4.000.000 de fallecidos en todo el mundo. La MSC ocurre en individuos adultos (45-75 años) en un 75-80% de los casos, y la incidencia aumenta con la edad, al aumentar la prevalencia de la enfermedad coronaria (3,4); sin embargo en el 20-25% restante la causa de muerte súbita cardíaca se asocia a la presencia de una patología cardíaca hereditaria, y afecta a individuos jóvenes. Los avances tecnológicos en el campo de la genética han facilitado el estudio e identificación de múltiples genes relacionados con enfermedades hereditarias que provocan el 50% de las MSC en individuos menores de 35 años. Como resultado, las pruebas genéticas se han incorporado progresivamente en el diagnóstico clínico, ayudando a identificar la causa de la enfermedad en pacientes clínicamente afectados y en casos post mortem no diagnosticados, así como a identificar factores de riesgo en portadores asintomáticos (1,3,5). CARDIOPATÍAS FAMILIARES Las cardiopatías familiares son, por tanto, un grupo de enfermedades cardíacas de origen genético que presentan unas características particulares: -todas tienen presentación familiar, es decir, cuando un miembro padece la enfermedad, es necesario estudiar al resto de los componentes de la familia porque ellos también pueden estar afectados. -En muchos casos la forma de presentación de la enfermedad es como una única manifestación clínica: la muerte súbita. -Salvo raras excepciones, todas las enfermedades cardíacas hereditarias, presentan un patrón de herencia autosómica dominante y se caracterizan por: a. heterogeneidad fenotípica, por la que mutaciones en un mismo gen pueden dar lugar a enfermedades distintas (pleiotropía), b.heterogeneidad genética, donde distintos genes mutados pueden producir un mismo tipo de enfermedad o c. heterogeneidad clínica, por la que los miembros de una misma familia, portadora de una misma mutación, pueden presentar diferentes fenotipos. Son enfermedades que se presentan con penetrancia incompleta, en la que una proporción determinada de portadores 8 de la enfermedad no la manifiestan, y con expresividad variable, donde pacientes con una misma variante genética presentan distintos grados de gravedad, manifestaciones clínicas, evolución, etc -Para ello es importante poder realizar un estudio genético a los afectados; esto se ve facilitado con la implementación de las más modernas técnicas de secuenciación masiva en paralelo que se pueden realizar a partir de una cantidad mínima de ADN extraído de sangre o saliva (3,6,7). Este tipo de trastornos se manifiestan, principalmente, en individuos jóvenes, y se clasifican en dos grandes grupos: Canalopatías y Miocardiopatías. CANALOPATÍAS Son un grupo heterogéneo de enfermedades que resultan de la disfunción de los canales iónicos y cuya etiología más frecuente es la mutación de los genes que codifican dichos canales, afectando su función o la de las proteínas que modulan su función (3,8). La presencia de canales iónicos en prácticamente todo el organismo implica que alteraciones en dichos canales provoquen una amplia variedad de enfermedades, dependiendo del órgano afectado (8). Las Canalopatías Cardíacas son las responsables de la mayor parte de las arritmias hereditarias y debido a que se producen trastornos de la excitabilidad de las membranas de los cardiomiocitos, se asocian a un elevado porcentaje de casos de muerte súbita cardíaca. Las mutaciones en los genes de los canales de calcio, sodio y potasio son las responsables de una gran variedad de trastornos del ritmo cardíaco (5,8,9). Canales iónicos cardíacos La formación y propagación de los impulsos eléctricos en el músculo cardíaco depende, fundamentalmente, de un equilibrio entre el flujo de iones que se produce en los diferentes canales transmembrana que existen en los cardiomiocitos. La actividad eléctrica se produce por la generación de potenciales de acción, consecuencia de corrientes de despolarización y repolarización, que dan paso a la contracción y relajación muscular, y posteriormente a un período de refractariedad, hasta que se origine el siguiente impulso. La activación, inactivación y aumento de permeabilidad al paso de iones a través de los canales generan las corrientes de entrada y salida de dichos iones y, por tanto, el potencial de acción (1,3,4,10.11). La forma típica del potencial de acción ventricular consta de 5 fases: -Fase 0: fase de despolarización rápida. Un cambio regional en el potencial de membrana activa los canales de Na+ y se produce la entrada masiva de iones Na+ al interior celular a través de canales de Na+ voltaje-dependientes. La célula se despolariza; pasa de -90mV a +40mV. Una vez despolarizada la célula, estos canales se cierran rápidamente. 9 -Fase 1: Al alcanzar el voltaje máximo, los canales de K+ responsables de la corriente transitoria de salida se abren (Ito). La salida de K+ provoca una repolarización. -Fase 2: Fase de meseta. En esta fase se produce la entrada de Ca+2 a través de los canales de Ca+2 tipo L, en discreto equilibrio con la corriente de salida de K+. Este equilibrio entre la entrada de Ca+2 y la salida de K+ es lo que va a determinar la duración del potencial de acción. La entrada de Ca+2 permite la activación de los receptores de rianodina, presentes en el citoplasma del retículo sarcoplásmico, lo que favorece la liberación de más Ca+2 y la consiguiente contracción de los miocitos. -Fase 3: Fase de repolarización. Comienzan a cerrarse los canales de Ca+2 y se activan los canales de K+ rectificadores tardíos (rápidos y lentos), lo que desencadenan la repolarización celular, llevando el potencial de membrana a valores de reposo (-90mV). -Fase 4: Fase de Reposo: en esta fase las corrientes de K+ rectificadoras internas y las dependientes de acetil colina son las que mantienen a la célula con el potencial de membrana en reposo. Estos canales están abiertos pasivamente y expulsan K+ constantemente (3,4,10,11). Los canales iónicos son proteínas únicas o un conjunto de subunidades proteicas (α,β,...) transmembrana, cada una de ellas codificada por un gen diferente (se han identificado más de 400 genes), que permiten la permeabilidad selectiva para unos iones determinados (Figura 1 (12)). Este tránsito de iones, será el responsable del potencial de acción y de las distintas fases que presenta, por lo que mutaciones en los genes que codifican estas proteínas pueden provocar un incremento o disminución de las corrientes iónicas, y por consiguiente, se puede aumentar o disminuir la duración del potencial de acción. Esta variación de la permeabilidad iónica puede desencadenar cambios en el potencial de acción, en la sincronización de las distintas corrientes iónicas y/o en la propagación del impulso, generando la producción de arritmias ventriculares, que podrían cursar con muerte súbita como única manifestación clínica (3,4,8,11,13). Las principales canalopatías asociadas a muerte súbita cardíaca son: Síndrome de QT largo, Síndrome de QT corto, Síndrome de Brugada, y Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC). Síndrome de QT largo (SQTL): El SQTL es un desorden eléctrico cardíaco hereditario, mayoritariamente de herencia autosómica dominante, caracterizado por una prolongación anormal del intervalo QT en el ECG (>480ms). Muestra una repolarización ventricular prolongada predisponente al desarrollo de taquiarritmias ventriculares secundarias a cambios en las corrientes iónicas que participan en el potencial de acción. Los pacientes con SQTL suelen presentar arritmias ventriculares del tipo Figura 1: Representación esquemática de las distintas fases de un PA ventricular y las diversas corrientes iónicas de entrada y salida, así como las subunidades  y las subunidades reguladoras que forman los diversos canales (12). 16 10 años después, con el descubrimiento de una mutación en el gen de la cadena pesada de la β-miosina en una familia de pacientes afectados con MCH, se marcaría el inicio de una nueva etapa en la historia de este tipo de patologías cardíacas. En 1995 la OMS esbozó una clasificación donde las miocardiopatías de origen desconocido pasaron a convertirse en enfermedades del miocardio con disfunción cardíaca basada en la fisiopatología dominante y en factores etiológicos y patogénicos. Se amplió la clasificación previa y se destacaron entidades que antes pasaban desapercibidas. Y debido al reconocimiento de la etiología genética como causa de muchas miocardiopatías se propuso establecer una clasificación dependiendo del defecto genético presente: miocardiopatía citoesquelética (MCD), miocardiopatía sarcomérica (MCH o MCR) y miocardiopatía desmosómica o de la unión celular (MCA). En la primera década del siglo XXI (2006), y como consecuencia de los grandes avances en genómica, un comité de la American Heart Association (AHA) propuso una nueva definición de las miocardiopatías: “Son un grupo heterogéneo de enfermedades del miocardio asociadas a disfunción eléctrica y/o mecánica que usualmente (pero no invariablemente) exhiben inapropiada dilatación o hipertrofia ventricular y son debidas a una diversidad de causas que frecuentemente son genéticas. Pueden estar confinadas al corazón o ser parte de desórdenes sistémicos generalizados, y a menudo conducen a muerte cardiovascular o incapacidad progresiva relacionada con insuficiencia cardíaca”. En esta definición la AHA incluye las patologías arritmpogénicas de etiología eléctrica (canalopatías) caracterizadas por un elevado riesgo de arritmias letales cuyas anomalías funcionales y estructurales se encuentran a nivel molecular; reafirma la exclusión de las afecciones del miocardio de origen sistémico ( HTA, enfermedad coronaria, patología valvular y cardiopatía congénita, descartando la “miocardiopatía isquémica”); establece la clasificación de miocardiopatías primarias definiéndolas como las que se encuentran única o predominantemente limitadas al corazón, y como secundarias las que forman parte de una gran variedad de enfermedades sistémicas o multiorgánicas. Éstas habían sido denominadas “Enfermedades específicas del músculo cardíaco” o “Miocardiopatías específicas ; A su vez, subclasifica las miocardiopatías primarias según la naturaleza de su origen en genéticas, mixtas (genéticas y no genéticas) y adquiridas. En 2008 la Sociedad Europea de Cardiología (SEC) define las miocardiopatías como “desórdenes del miocardio en los cuales el músculo cardíaco es estructural y funcionalmente anormal”. Establece la división en dilatada, hipertrófica, restrictiva, arritmogénica del VD e inclasificadas, y las subclasifica en familiar /genética y no familiar/no genética. Con este modelo se agruparon a los pacientes enfocándose en el fenotipo morfológico y funcional. Se mantuvo la línea de clasificación previa, aunque evitando el uso de los términos primaria y secundaria, y se excluyó a las canalopatías y a otras arritmias hereditarias de la clasificación. Sin embargo sí se valoró la importancia de la evaluación familiar y el análisis genético para poder elaborar un diagnóstico preciso; la clasificación genética se empleará para el manejo en la práctica clínica (15,16,17,18). Definición: Las miocardiopatías son una afección del miocardio que conduce a la incapacidad del músculo para funcionar eficazmente como bomba. Se clasifican en: miocardiopatías primarias, genéticas o familiares y miocardiopatías secundarias a enfermedades de origen sistémico (19). Las miocardiopatías primarias cursan con daño estructural y funcional del músculo cardíaco sin que existan evidencias de factores predisponentes, tales como la sobrecarga del 17 volumen sanguíneo, hipertensión arterial, enfermedad coronaria o enfermedad valvular, que justifiquen dicha anomalía, mientras que las miocardiopatías secundarias cursan con anomalías estructurales provocadas por enfermedades sistémicas o generalizadas en las que está involucrado el corazón (6,16). La base molecular de muchas cardiopatías primarias es la mutación genética de proteínas involucradas en la contracción de los cardiomiocitos. De hecho, la Miocardiopatía Restrictiva (MCR), la Miocardiopatía Hipertrófica (MCH), la Miocardiopatía Dilatada (MCD) y la Miocardiopatía Arritmogéniga (MCA) pueden verse como miocardiopatías sarcoméricas, lo que indica la importancia que desempeña cada parte de la maquinaria contráctil para mantener la función cardíaca normal. Las principales miocardiopatías hereditarias son: Miocardiopatía Hipertrófica, Miocardiopatía Dilatada, Miocardiopatía Restrictiva, Miocardiopatía Arritmogénica y Miocardiopatía No Compactada (9,19). Miocardiopatía Hipertrófica. La MCH es la miocardiopatía primaria más frecuente, cuya prevalencia es 1:500 en individuos jóvenes y que cursa con un patrón de herencia autosómica dominante. Alrededor de veinte millones de personas en todo el mundo están afectadas por esta patología y sólo el 10% se identificarán por la clínica (el 6% son asintomáticos). Se caracteriza por presentar hipertrofia del ventrículo izquierdo sin dilatación ventricular, y el grosor del tabique se produce sin existencia de sobrecarga de volumen de sangre ni de otra alteración que explique la hipertrofia. El grosor del tabique va a influir en la evolución de la enfermedad, debido a que puede provocar obstrucción del tracto de salida ventricular o disfunción valvular. Suele manifestarse como una hipertrofia septal asimétrica, aunque no siempre es así: puede desarrollarse afectando a las zonas más apicales, con un patrón concéntrico, en la pared lateral o en ventrículo derecho. Esta morfología puede observarse a través de la RNM o del EcoCG. Al igual que otras enfermedades cardíacas hereditarias, presenta expresividad variable, por lo que hay pacientes que prácticamente no desarrollan discapacidad y se mantienen con esperanza de vida normal. Además, la variabilidad de la transmisión familiar, el grado de hipertrofia, la evolución de la enfermedad y el pronóstico de la enfermedad dependerán de la mutación que se produzca, del locus y de la proteína afectada. La mayoría de los pacientes asintomáticos son diagnosticados tras el cribado familiar, mediante la auscultación de un soplo que aumenta con las maniobras de Valsalva o tras un trazado electrocardiográfico anómalo. La clínica más frecuente es el dolor torácico, bien relacionado con esfuerzo, deshidratación o postprandial, y la muerte súbita cardíaca. Todos los pacientes con MCH deben someterse a estratificación de riesgo de muerte súbita, y deben ser evaluados para la posible implantación de un desfibrilador cardioversor implantable (6,9,19, 20,21,22). Bases Genéticas La etiología de la MCH es la mutación de los genes que codifican las proteínas sarcoméricas, el disco Z y las proteínas que controlan el Ca+2: -Genes de proteínas de miofilamento: TTN, MYH7, MYH6 MYL2, MYL3, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPMI, ACTC, TNNC1. -Genes de proteínas del disco Z: LBD3, CSRP3, TCAP, VCL, ACTN2, MYOZ2, NEXN -Genes que controlan el Ca+2: JPH2, PLN (16,20). 18 Figura 4: Se representa la estructura esquemática de un sarcómero compuesto por filamentos gruesos y delgados y discos Z junto con sus componentes proteicos involucrados en la MCH. Se enumeran los genes causales establecidos para MCH y sus frecuencias de población. Ilustración de Marian&Braunwald [2017] (22). Genes de proteínas de miofilamento Los genes más frecuentemente implicados en esta enfermedad son aquellos que codifican: la cadena pesada de la β-miosina (MYH7), la proteína de unión a la miosina C (MYBPC3), la troponina cardíaca T tipo2 (TNNT2), la troponina cardíaca I tipo3 (TNNI3) y la α-tropomiosina 1 (TPM1), aunque las mutaciones en troponina T, troponina I y tropomiosina no suponen ni el 10% de los casos diagnosticados ( Figura 4 (22), 23). El gen MYH7 es el primer gen cuyas variantes patogénicas se relacionaron con la MCH; se localiza en el brazo largo del cromosoma 14 (14q12), y codifica la proteína cardíaca βmiosina de cadena pesada, ubicada predominantemente en los ventrículos, aunque también se expresa en el músculo esquelético (23,24). Las mutaciones en este gen muestran predilección por la cabeza y la región bisagra globular de la proteína de cadena pesada de miosina (22). Esta proteína parte de otra de mayor tamaño denominada miosina tipo II. La miosina tipo II, a su vez, consta de dos cadenas pesadas, codificadas por MYH7, y dos pares de cadenas ligeras reguladoras, codificadas por otros genes. Las cadenas pesadas forman parte de los filamentos gruesos del sarcómero y están formadas por dos regiones: cabeza y cola. La región de la cabeza 19 (dominio motor), interactúa con la actina, mientras que la cola interactúa con otras proteínas, incluídas otras regiones de cola de otras miosinas. La miosina II es la encargada de generar la contracción muscular en el miocardio, por lo que la mutación en el gen MYH7, responsable de la generación de fuerza y de la actividad ATPasa de los cardiomiocitos, provoca aproximadamente el 35% de las miocardiopatías hipertróficas familiares. La mayoría de las mutaciones MYH7 son sustituciones de un solo nucleótido (mutaciones missense), y aunque permiten a la proteína incorporarse al sarcómero, a los filamentos gruesos, carece de funcionalidad e impide una contracción cardíaca efectiva. Se han documentado hasta 350 variantes patogénicas del gen MYH7, lo que provoca una gran expresividad variable de la MCH, y un fenotipo más agresivo que el de las mutaciones que afectan a otros genes, como el MYBPC3, presentándose los síntomas en edades muy tempranas y con alta incidencia de muerte súbita cardíaca como primera manifestación clínica (23,24). El gen MYBPC3 se localiza en el brazo corto del cromosoma 11 (11p11.2) y es el encargado de codificar la miosina cardíaca de unión a la proteína C, ubicada en los cardiomiocitos. Esta miosina se encuentra en las bandas A transversales del sarcómero, unida a los filamentos gruesos. La miosina cardíaca de unión a la proteína C es la encargada de regular la contracción del músculo cardíaco, y se cree que la mutación del MYBPC3 se caracteriza por presentar deleciones o inserciones de bases que conducen a un cambio de marco de lectura (Frameshift mutation), produciendo su efecto patogénico por un incremento de la sensibilidad del calcio, o por un efecto tóxico de la proteína alterada. La relación de las mutaciones en este gen y la MCH han provocado un creciente interés en el estudio del mismo; hasta el momento se han documentado más de 600 variantes patogénicas o probablemente patogénicas de este gen y son responsables del 30% de los casos de MCH (23,24,25). La mayoría de las mutaciones causales en MCH son mutaciones missense con la excepción de las mutaciones en MYBPC3, que muestran predilección por la inserción / deleción y mutaciones de truncamiento prematuro debido a un desplazamiento del marco de lectura (6,9,19,20,21,22). La MCH presenta una alta heterogeneidad fenotípica debido a la gran diversidad y variabilidad de mutaciones asociadas a genes identificados como causales de la enfermedad (23). El gen TNNT2, situado en el brazo largo del cromosoma 1 (1q32), codifica la troponina T cardíaca, una de las 3 proteínas que forman parte del complejo proteína-troponina, y que se encarga de la contracción del miocardio. Las mutaciones de este gen, identificadas en el 5% de las MCH diagnosticadas, son mutaciones missense, que permiten a la proteína alterada incorporarse al complejo proteico sarcomérico, pero impiden la correcta funcionalidad del mismo, alterando la contracción normal del miocardio (24). El gen TNNI3, situado en el brazo largo del cromosoma 19 (19q13.4), codifica la proteína troponina I, y al igual que la troponina T, son exclusivas del corazón y es una de las 3 proteínas que forman el complejo proteína-troponina sarcomérico. La troponina I ayuda a coordinar la contracción cardíaca. Las mutaciones de este gen TNNI3 son mutaciones missense, que permiten la incorporación de la proteína alterada al complejo proteico, pero impide la contracción muscular normal, al poner en riesgo la función del sarcómero (24). El gen TPMI, que codifica la tropomiosina, tiene una función que consiste en colocar el complejo de troponina en actina cardíaca (22). 20 Estos genes MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3 y TPM1 tienen en común que no toleran mucho las mutaciones sin sentido o de pérdida de función. Sin embargo algunas de estas variantes, muy poco frecuentes, no son causales de MCH (22). Genes de proteínas del disco Z Las proteínas del disco Z se encargan de estabilizar el sarcómero y facilitar que el acoplamiento de las proteínas sarcoméricas permitan la contracción miocárdica, distribuyendo las fuerzas hacia la matriz extracelular. La mutación en alguno de los genes que codifican las proteínas del disco, podría provocar un aumento de la fuerza y velocidad de contracción/ relajación o impedir la unión de las proteínas sarcoméricas evitando el acercamiento de los discos Z (16). Un ejemplo son determinadas variantes missense que aparecen en el gen ACTN2 (22). Genes que controlan el Ca+2 El calcio juega un papel fundamental en el proceso de contracción del músculo cardíaco. Una alteración en el desarrollo de este proceso puede provocar un flujo anómalo de este ion, y, por tanto, desembocar en una cardiopatía de perfil hipertrófico (16). Varios genes involucrados en el flujo del calcio se han relacionado con la MCH: el gen PLN codifica el fosfolambán, proteína inhibidora de la recaptación de calcio mediada por el SERCA2. Una mutación en PLN produciría una falta de inhibición de esa recaptación, lo que significa un aumento de la eliminación de Ca+2 mediada por el SERCA 2 citosólico, y mayor relajación diastólica. Diferentes variantes patogénicas del mismo gen se han asociado a MCH (16). Mutaciones en el gen JPH2, que codifica la junctofilina2, impiden que exista un manejo adecuado del calcio. Se han descubierto mutaciones de este gen en el 0.8% de los afectados con MCH (16). Miocardiopatía Dilatada (MCD) La Miocardiopatía Dilatada (MCD) es aquella enfermedad del miocardio que se presenta con dilatación y deterioro contráctil del ventrículo izquierdo (o de ambos ventrículos), en ausencia de factores predisponentes a la alteración del llenado ventricular, tales como hipertensión arterial, enfermedad coronaria o patología valvular, que expliquen el deterioro sistólico. Aunque puede estar presente la dilatación y la disfunción del ventrículo derecho, no es necesario para su diagnóstico. La MCD puede ocurrir a cualquier edad, pero suele manifestarse clínicamente entre los 40 y 59 años y los síntomas más característicos son las arritmias y los trastornos tromboembólicos. En el ECG, los patrones encontrados pueden variar desde bloqueos de rama, alteraciones de onda T, taquiarritmias o trazado sin anomalías. El diagnóstico se confirma con el ecocardiograma. La enfermedad presenta gran morbimortalidad, y una elevada tasa de muerte súbita asociada a arritmias malignas. Bases genéticas Aproximadamente el 50% de los casos son de etiología genética, y de ellos, la mayoría son casos familiares, con más de un miembro de la familia afectado y que cursan con un patrón autosómico dominante. Debe sospecharse la MCD familiar cuando hay antecedentes familiares de muerte cardíaca prematura, enfermedad del sistema de conducción o miopatía esquelética. Son muchos los genes implicados, pero muy pocos los que representan a los pacientes con MCD familiar. La causa más frecuente es la mutación del gen de la titina (TTN). La titina es la 21 proteína más grande conocida, con más de 34000 aminoácidos, peso molecular (PM) de 3.816.000Da y que abarca desde la línea Z hasta la M dentro del sarcómero. Juega un papel fundamental en la contracción muscular, ya que interactúa con los filamentos delgados y gruesos del sarcómero con los que conforma un armazón que contribuye a generar la fuerza de transmisión en la línea Z y la de tensión en reposo en la banda I. Las primeras mutaciones del gen de la titina que se asociaron a la presencia de MCD implicaban una unión anómala entre la titina y la α-actinina, desarrollando una hipocontractilidad sarcomérica. Las variantes patogénicas conocidas hasta el momento de este gen están asociadas a MCD, de las que una cuarta parte corresponden a variantes truncadas de la titina, y cuya penetrancia variará dependiendo de la localización de la mutación dentro de la larga molécula proteica (16). Sin embargo ésta no es la única causa de Miocardiopatía Dilatada, ya que también se asocia a mutaciones en genes sarcoméricos, filamentos intermedios, proteínas estructurales... No se sabe si todas las variantes identificadas son causales de enfermedad, pero sí se sabe que algunas presentan mayor riesgo de malignidad, como por ejemplo las mutaciones del gen de la laminina (LMNA). Este gen codifica dos isoformas: las proteínas nucleares Laminina A y C, filamentos intermedios de la membrana nuclear, con función estructural y mecánica y encargadas de regular la replicación y transcripción del ADN. Las mutaciones de este gen representan el 6% de las mutaciones asociadas a MCD y se relacionan con un inicio temprano de la enfermedad, con trastornos en la conducción cardíaca y con alto riesgo de padecer arritmias ventriculares y muerte súbita cardíaca. Cuando la MCD se asocia a una alteración de la conducción cardíaca los genes afectados tienen implicaciones pronósticas. Las formas autosómicas dominantes de la enfermedad son causadas por mutaciones en los genes del citoesqueleto, en las proteínas sarcoméricas, en los discos Z, en la membrana nuclear y en proteínas de disco intercaladas. Sin embargo las que siguen un patrón de herencia ligada a X desarrollarán distrofias musculares (tipo Duchenne) y las autosómicas recesivas suelen asociarse a trastornos metabólicos hereditarios. Se estima que la prevalencia es de 1:2500, aunque puede ser mayor, dependiendo de la edad y el área geográfica (6,9,19,20). Miocardiopatía Arritmogénica Miocardiopatía descrita en 1982 que, debido al elevado riesgo de muerte súbita cardíaca y a la herencia familiar, la OMS decidió en 1995, considerarla miocardiopatía primaria. Sigue un patrón de herencia autosómica dominante, y es una enfermedad de proteínas desmosomales que se caracteriza por el reemplazo paulatino de tejido miocárdico ventricular sano por una infiltración de tejido fibroadiposo poco conductivo, que deteriora la actividad contráctil del miocito cardíaco, y está asociada a un riesgo elevado de arritmias ventriculares. Este proceso en el que va a haber una pérdida de miocitos y atrofia del miocardio ventricular, implica un adelgazamiento de la pared ventricular, generalmente en ventrículo derecho, aunque también puede afectar al ventrículo izquierdo. Presenta una prevalencia entre 1:2000 y 1:5000 individuos, y la clínica se asocia a criterios arrítmicos, siendo muy frecuentes los síncopes, taquicardias ventriculares y la muerte súbita cardíaca. Es mayoritariamente de herencia autosómica dominante, aunque existen dos presentaciones que siguen un patrón hereditario recesivo: la enfermedad de Naxos y la enfermedad de Carvajal. El 60% de los pacientes diagnosticados son portadores de una variante patogénica conocida. Bases genéticas Las mutaciones asociadas a esta miocardiopatía pueden producirse en genes desmosomales, tales como: DSC2, DSG2, DSP, JUP, PKP2, siendo este último el más 22 frecuentemente identificado, seguido de DSP y DSG2; o en genes no desmosomales: DES, FLNC, PLN, TMEM43. Es frecuente que exista más de una variante genética causal en una familia afectada, y que la presencia de ese grupo de variantes en conjunto sean las que justifiquen la existencia de la enfermedad (16,18,19). Miocardiopatía Restrictiva (MCR) Es una de las principales miocardiopatías familiares, aunque es la más rara; representa el 2-5% de todas las miocardiopatías pediátricas. Tiene una elevada tasa de mortalidad, suponiendo el 50% de las muertes ocurridas a los dos años tras su diagnóstico. Se caracteriza por un aumento de la rigidez ventricular con grosor normal de la pared, y una dilatación biauricular Esta rigidez ventricular limita el llenado, ya que pequeños aumentos de volumen provocan un incremento precipitado de la presión ventricular: esto define la patología restrictiva cardíaca. Bases genéticas La MCR primaria es una patología de patrón hereditario autosómico dominante, aunque existe una variante autosómica recesiva, ligada al cromosoma X y transmitida por mitocondrias. La mayoría de los genes causales conocidos codifican proteínas sarcoméricas: TNNI3, TNNT2, MYH7, ACTC1, TPM1, MYL3 y MYL2; pero también se han identificado genes causales que codifican proteínas del disco Z: MYPN, TTN y Bag3. La MCR secundaria o adquirida (no familiar) se asocia a trastornos sistémicos, como la amiloidosis, sarcoidosis, radioterapia, esclerodermia… entre las causas más frecuentes (16,19,25). Miocardiopatía No Compactada (MCNC). Es una miocardiopatía congénita, poco frecuente, que se caracteriza por una trabeculación ventricular prominente y desarrollo de recesos intertrabeculares profundos. Estas alteraciones provocan disfunción del ventrículo izquierdo, y consecuentemente insuficiencia cardíaca, arritmias, enfermedades tromboembólicas y muerte súbita cardíaca. El origen embrionario de esta miocardiopatía congénita interfiere en el desarrollo de la maduración del músculo cardíaco. Se desconoce exactamente cuál es la prevalencia de esta enfermedad, pero se estima que es menor del 1% de la población. Es una enfermedad familiar en la que algo más del 25% de los parientes presentan rasgos fenotípicos. Bases genéticas Los genes en los que se han identificado mutaciones causales incluyen G 4.5 que codifica taffazina (ligada a X), alfa dystrobrevin , ZASP, actina, lamin A / C y un locus en el cromosoma 11 p 15. (18,19) TECNOLOGÍAS DE SECUENCIACIÓN Secuenciación Sanger Desde que Watson y Crick descubrieron la estructura tridimensional del ADN hasta que fue posible su secuenciación, tuvieron que pasar 25 años. Durante ese tiempo el descubrimiento de la ADN polimerasa (Arthur Kornberg) o el establecimiento del código genético universal fueron determinantes para que en 1977 Frederick Sanger y colaboradores desarrollaran el 23 método de secuenciación que, dos años después utilizarían para secuenciar por primera vez el genoma del bacteriófago ϕX174. Este método de secuenciación de ¨terminación de cadena¨ o ¨método Sanger¨ requiere: un molde de ADN monocatenario, un cebador o ¨primer¨ de ADN, ADN polimerasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP), que carecen del grupo hidroxilo 3 'que se requiere para la extensión de las cadenas de ADN. De este modo, no pueden unirse estos ddNTP con el extremo 5´de los dNTP y se detiene el proceso de síntesis de ADN (26). El método comienza con el aislamiento y clonación de la molécula de ADN que se quiere secuenciar. El ADN se desnaturaliza y se utiliza una sola hebra de ADN; además se emplea un cebador o primer, que es el encargado de proporcionar a la ADNpolimerasa el grupo 3´que necesita. La técnica consiste en que los ddNTP marcados con radio o fluorescencia se incorporen a la hebra de ADN de forma aleatoria, evitando que la cadena de ADN se extienda. Si realizamos cuatro reacciones paralelas, que contienen cada base de ddNTP individual y los colocamos en cuatro carriles de gel de poliacrilmida, veremos que se van separando por electroforesis, dependiendo del tamaño de la molécula, ya que aparecerán cadenas de distintas longitudes, Así obtendremos un patrón de bandas que nos permite interpretar la secuencia de bases (26). Este método Sanger fue adquiriendo una serie de mejoras con el tiempo, que se basaron en: -La incorporación de técnicas fluorescentes: añadiendo un fluoróforo distinto a cada ddNTP, favoreciendo el uso de un solo tubo para realizar la reacción, en vez de cuatro tubos distintos. -Uso de polimerasas distintas y más resistentes a los cambios de temperatura que permiten automatizar el proceso usando la técnica de la PCR. -Incorporación de la electroforesis capilar en gel de poliacrilamida. Cada fragmento secuenciado, interrumpido por los ddNTPs fluorescentes, avanza por el gel y será registrado por una cámara que detecta la fluorescencia emitida. Esta fluorescencia produce un gráfico que se denomina electroferograma. En 1987, fruto de estas mejoras, se desarrolla el primer secuenciador automático (27). Actualmente los secuenciadores automáticos son capaces de leer casi una secuencia de ADN de 1000bases. Este tipo de secuenciadores fueron los que se usaron en el proyecto del genoma humano y actualmente para lecturas de fragmentos más largos los investigadores utilizaron otras técnicas, en las que la secuenciación de fragmentos se realiza por separado y luego se superponen y alinean, para posteriormente ser ensamblados en una secuencia continua larga in silico (26). Secuenciación masiva en paralelo Tras completar la secuenciación del genoma humano en 2004, los investigadores se vieron en la necesidad de obtener nuevas técnicas que permitiesen secuenciar genomas humanos individuales, de forma rápida y a bajo coste (28). La tecnología de secuenciación masiva en paralelo, inicialmente denominada como next generation sequencing (NGS), surgió por primera vez en 2005. Esta tecnología nos permite la secuenciación masiva en paralelo de ADN, generando resultados más sólidos a un precio más asequible y en un período de tiempo más reducido (29). 24 La NGS puede aplicarse dirigiendo la secuenciación hacia varios genes, el exoma completo o el genoma completo. La ventaja de esta secuenciación dirigida es que podemos usar paneles de genes predeterminados para el diagnóstico genético de una enfermedad en concreto. O también podemos centrar el estudio en secuenciar el exoma, que sería la región del genoma que se traduce a proteínas, interesante para buscar nuevas variantes patogénicas en nuevos genes que puedan estar relacionados con la patología. La secuenciación del genoma completo a nivel individual es ahora una realidad, pero desde el punto de vista clínico la priorización de las variantes de interés clínico, así como la interpretación de las variantes en regiones no codificantes, sigue planteando todo un desafío (28,29,30). Las plataformas de secuenciación NGS requieren de una previa amplificación del fragmento de ADN que se pretende secuenciar. Dependiendo de la plataforma que se use, el proceso de amplificación puede producirse: - Mediante PCR en emulsión: mezcla de aceite-agua encargada de encapsular complejos ADN-nanoesferas. La amplificación se produce porque cada nanoesfera queda cubierta de miles de copias idénticas de la secuencia molde de ADN. Estas nanoesferas se unen químicamenete a la superficie de cristal (en la plataforma SOLID) o se depositan en placas multipocillo, utilizadas en 454Life Sciences o Ion Torrent. - Mediante PCR puente: los adaptadores complementarios a los adaptadores anclados en las secuencias desnaturalizadas se sitúan sobre una placa de vidrio; cada fragmento de ADN monocatenario se unirá a uno de los presentes en la placa. Actúa la polimerasa que utiliza los adaptadores como primers. Se sintetiza la cadena complementaria, se produce un nuevo ciclo de desnaturalización, lo que provoca que las hebras desnaturalizadas creen puentes. Se repite varias veces el proceso hasta la formación de clusters. Este proceso es el que se utiliza en la plataforma Illumina. Tanto SOLID como 454 Life Science son dos plataformas en desuso: la primera presenta como gran desventaja la alta tasa de errores y la generación de secuencias muy cortas, mientras que los problemas de la 454 Life Science radican en la baja sensibilidad de detección de homopolímeros. La falta de competitividad en calidad y precio de esta plataforma con respecto a otras es lo que la llevó a ser muy poco utilizada actualmente. Ion Torrent Sequencing basa la secuenciación de ADN en semiconductores: cada vez que se incorpora un nucleótido, se desprende un H+, que modifica el pH, y este cambio es detectado por el semiconductor que es capaz de identificar el nucleótido que se ha añadido en función del cambio de pH. Es una plataforma altamente competitiva en cuanto a calidad, precio y rapidez a la hora de secuenciar paneles de genes y exomas. Illumina es, probablemente, la plataforma más usada hoy en día. Se basa en la secuenciación por síntesis, en la que se incorporan de forma continuada nuevos nucleótidos una vez que se detectan los anteriores; para ello se utilizan fluoróforos que bloquean la elongación de la cadena de forma reversible. Esta plataforma ha conseguido abaratar los costes y ofrecer lecturas más largas, aunque el coste de mantenimiento es muy superior al de las otras plataformas (31). Otras técnicas de ultrasecuenciación no tan implementadas y en fases de desarrollo son la síntesis mediada por polimerasa de Pacbio y la secuenciación mediante nanoporos (26). 25 OBJETIVOS Con este trabajo se intenta buscar las causas genéticas que subyacen en la Miocardiopatía Hipertrófica que padece el paciente que vamos a estudiar mediante el uso de tecnologías de secuenciación masiva en paralelo. A este individuo se le hará secuenciación masiva usando un panel de genes que incluye un total de 96 genes, todos ellos relacionados con patologías cardíacas hereditarias. Una vez localizadas estas variantes implicadas en la patología del caso índice disponemos de varios familiares en los que, mediante secuenciación Sanger, intentaremos ver si se confirma la presencia de dichas variantes o no; esta evaluación puede favorecer el tratamiento precoz de los portadores y conocer las posibilidades de transmitirla. 32 Los resultados de la reacción de secuenciación se leyeron en un secuenciador automático 3730 DNA Analyzer de Applied Biosystems que junto con el software SeqScape v2.5 también de Applied Biosytems nos permite ver y leer los electroferogramas con los resultados de la secuenciación. 33 RESULTADOS Una vez finalizada la secuenciación masiva se llevó a cabo la priorización sobre el archivo que se nos proporcionó desde la plataforma de ultrasecuenciación con todas las variantes encontradas para nuestra muestra. Este archivo de variantes se genera al comparar las diferencias entre la región de interés de nuestra muestra con la misma región en la secuencia de referencia del genoma humano. Inicialmente en nuestro archivo teníamos 709 variantes que después de aplicarle el protocolo de priorización detallado en el material y métodos nos quedó únicamente una variante que se corresponde con una deleción en el gen MYBPC3 (NM_000256.3) c.2864_2865delCT:p.P955Rfsx95:g.47356633 y rs397515990. La presencia de esta variante en nuestro caso índice se confirmó por Sanger, ya que las tecnologías de ultrasecuenciación no suelen tener problemas para detectar variantes missense. Sin embargo hay muchas deleciones/inserciones que aparecen como falsos positivos, y para no tener ninguna duda la secuenciamos por Sanger siguiendo el protocolo mostrado en el material y métodos. En el electroferograma que se nos muestra en el programa SeqScape se observa claramente la presencia de la deleción a partir de la región señalada tanto en sentido Forward como en sentido Reverse (figura 7). Figura 7. Electroferograma de la variante patogénica del gen MYBPC3. En él se indica la posición de la deleción causante de la patogenicidad. Una vez detectada y confirmada la presencia de esta variante se clasificó su patogenicidad consultando la página web Varsome El veredicto para esta variante fue de patogenicidad que nos queda claro al cumplirse los siguientes criterios de la clasificación de ACMG/AMP: PVS1: Variante nula (por desplazamiento del marco de lectura) que afecta al gen MYBPC3. Este es un mecanismo conocido de la enfermedad (el gen tiene 629 variantes patogénicas conocidas), asociado con Miocardiopatía Hipertrófica, Dilatada y No Compactada. PM1: La variante se encuentra en un Hot-spot de longitud de 62 pares de bases donde encontramos varias variantes patogénicas. PM2: La frecuencia alélica en GnomAD exomes = 0 esto es inferior al umbral 0.0001 para el gen recesivo MYBPC3. PP3: El veredicto computacional es patogénico por 1 predicción patogénica en el predictor GERP vs ninguna predicción benigna PP5: ClinVar clasifica esta variante como patogénica, clasificada con 2 estrellas, con 14 presentaciones, 12 publicaciones y sin conflictos. Secuencia de Referencia Secuencia F caso índice Secuencia R caso índice MYBPC3_Ex27 (NM_000256) c.2864_2865del:p.P955Rfxfx95 34 Una vez localizada esta variante se hizo un estudio de portadores de la misma en los tres descendientes del caso índice. Para el estudio de portadores se usó la técnica de secuenciación Sanger y, una vez finalizado el proceso, se pudo observar que las dos hijas del caso índice son portadoras de la variante patogénica en el gen MYBPC3, mientras que el hijo no es portador de dicha variante. 35 DISCUSIÓN Se han identificado más de 350 variantes patogénicas del gen MYBPC3 relacionadas con la MCH, que representan aproximadamente el 40-50% de las mutaciones causales de esta miocardiopatía (33). Un alto porcentaje de estas mutaciones son frameshift, mostrando una gran predilección por las inserciones/deleciones que terminan provocando un truncamiento de la proteína (34). La patogénesis de este tipo de mutaciones la podemos subdividir en 4 grupos de mecanismos implicados: a)Efectos iniciales o primarios: son aquellos que derivan de los efectos directos de la mutación (estructura y funcionalidad proteica). En este grupo se incluyen los efectos en transcripción y traducción, las alteraciones en la función del sarcómero o las alteraciones estructurales de las proteínas afectadas. Que se produzca una deleción de nucleótidos que origina un cambio del marco de lectura provoca la activación de mecanismos de vigilancia transcripcional y de control de calidad, que detectan las transcripciones que presentan codones de terminación prematura. La liberación de distintos factores, así como el reclutamiento del complejo inductor de descomposición, provocan la degradación del ARNm anómalo y, por tanto, una menor cantidad de proteínas. La vía de descomposición de ARNm detiene la progresión de los ribosomas durante la traducción, escindiendo el tránsito de ARNm (22). Cuando estas mutaciones de cambio de marco se producen en estado heterocigoto, como sucede en el caso índice de este estudio, sólo se expresa el alelo salvaje, lo que desarrolla como efecto neto haploinsuficiencia o interrupción de la función normal del sarcómero (22,33,35). Debido a estos mecanismos de control de calidad las proteínas truncadas se expresan en cantidades muy bajas, de lo que podemos deducir que son degradadas por el sistema ubiquitinaproteosoma. Además, las mutaciones en los genes que codifican las proteínas sarcoméricas, se asocian a fenotipos clínicos muy diversos, con una penetrancia muy variable e independiente de la mutación genética subyacente (22,33,34,35). La incorporación de estas proteínas mutadas a la unidad funcional sarcomérica va a provocar una serie de efectos tales como la afectación de la sensibilidad del complejo de troponina al Ca+2 o de la actividad ATPasa, o la reducción de la generación de fuerza por parte del sarcómero (22). b)Efectos moleculares secundarios: aquí se incluyen las vías patogénicas que se desencadenan también en otras patologías cardíacas no de origen genético al presentar una serie de eventos nocivos sobre las células cardíacas (22). c)Efectos terciarios son los efectos histológicos y morfológicos que surgen de la acción de los efectos secundarios (22). d)Los efectos cuaternarios son las manifestaciones clínicas que presenta el individuo afectado por la cardiopatía (22). Los efectos morfológicos, histológicos y clínicos son fundamentales a la hora de establecer el fenotipo de enfermedad. La Miocardiopatía Hipertrófica presenta gran variabilidad fenotípica, que no sólo depende de las diferentes mutaciones que se producen en individuos distintos, sino que también existe una gran variabilidad en los individuos afectados con la misma mutación genética dentro de una familia. A grandes rasgos, los efectos adversos de la enfermedad no difieren mucho si la mutación se produce en el gen MYH7 o en el MYBPC3, ni tampoco la ubicación de la mutación en el gen o la coexistencia de varias mutaciones parecen tener implicaciones en la patogenicidad de la MCH. Sin embargo, que un individuo presente más de una variante patogénica aumenta el riesgo de padecer la enfermedad y la gravedad de 36 la misma, frente a otro individuo que presente solo una variante patogénica o una variante patogénica y una o más variantes no descritas como patogénicas (22,34). Las mutaciones en un mismo gen pueden presentarse como enfermedades diferentes (pleiotropía). La mutación del caso índice está asociada a Miocardiopatía Hipertrófica, Miocardiopatía Dilatada y Miocardiopatía No Compactada. Las pruebas de imagen (ecocardiografía principalmente) y el ECG serán fundamentales para el diagnóstico clínico, sobre todo en los casos asintomáticos. La hipertrofia cardíaca, normalmente asimétrica, es el principal signo clínico asociado a la Miocardiopatía Hipertrófica. También el alargamiento de las valvas mitrales es otra de las características de la enfermedad. El diagnóstico microscópico se caracteriza por una abundante fibrosis y la pérdida de la arquitectura estructural de los cardiomiocitos, agrandados y con núcleos pleiotrópicos. Este desorden citoarquitectural es característico de las autopsias realizadas a los individuos que fallecen por muerte súbita cardíaca. Hemodinánicamente, el volumen de eyección del ventrículo izquierdo se verá reducido y la función diastólica estará afectada debido a la fibrosis intersticial, a la rigidez aumentada de la pared ventricular hipertrofiada y a la relajación lenta (22). Las manifestaciones clínicas de la Miocardiopatía Hipertrófica no son frecuentes, a pesar de la hipertrofia cardíaca, ya que la mayoría son asintomáticas: -Disfunción diastólica, que desencadena disnea de esfuerzo, ortopnea, edema periférico e intolerancia al ejercicio. -Obstrucción del flujo de salida ventricular, que puede provocar insuficiencia cardíaca o disnea de esfuerzo. Cuando la obstrucción es grave, puede desencadenar síncope, durante o posterior al esfuerzo. -Dolor precordial, debido al desequilibrio de aporte de oxígeno y demanda del mismo. -Palpitaciones, pre-síncope, síncope o arritmias, provocadas por taquicardia ventricular no sostenida, que aparece frecuentemente en el 30% de los afectados. -La fibrilación auricular está presente en el 25% de los pacientes con MCH. El ECG es anormal en la mayoría de los pacientes, y en el examen físico los pulsos arteriales son rápidos y a la palpación el impulso precordial está desplazado a la izquierda (22). Después de observar los resultados, queda de manifiesto que nuestro caso índice es portador de una mutación en heterocigosis, con deleción de 2 nucleótidos que genera un cambio del marco de lectura, lo que puede dar como resultado una proteína cMYBPC3 acortada o defectuosa que no desempeña correctamente su función. Los mecanismos que regulan la expresión del alelo mutado se relacionan con los mecanismos de descomposición del ARN, el sistema ubiquitina-proteosoma y la vía autofagia-lisosómica: esto puede derivar en una haploinsuficiencia o en una interrupción de la función normal del sarcómero, que desencadena la enfermedad. Este tipo de mutaciones se asocian a fenotipos clínicos variables, incluyendo miocardiopatías tales como la Dilatada, la No compactada o la Restrictiva, además de la Miocardiopatía Hipertrófica, presente en el caso índice (33,35). Nuestro individuo a estudio ya estaba diagnosticado previamente de MCH no obstructiva y la interpretación de la variante que se ha descrito en los resultados muestra que es patogénica y relacionada con dicha patología, lo que nos lleva a una clara relación de la variante que porta el individuo y el fenotipo de su enfermedad. Por otro lado tenemos el estudio de los familiares en el que se confirmó que el hijo no era portador de la variante patogénica, mientras que ambas hijas, que son asintomáticas para la enfermedad, sí portan la variante. Es posible que se mantengan asintomáticas debido a que, por su edad y el hecho de que las manifestaciones clínicas de la Miocardiopatía Hipertrófica no son 37 frecuentes, la enfermedad esté pasando desapercibida. Aunque no precisan tratamiento farmacológico, deben someterse a reevaluaciones periódicas y a modificaciones en sus hábitos de vida, sobre todo si practican ejercicio físico intenso. Las cardiopatías hereditarias tienen en común una estrecha relación con la muerte súbita cardíaca, y en la mayoría, sobre todo en individuos jóvenes, el desencadenante es la práctica de deporte de competición. Sin embargo no tienen contraindicado practicar ejercicio considerado de baja intensidad. Por el contrario, el hijo podrá realizar una vida normal, sin limitaciones ni controles periódicos relacionados con la enfermedad. Sería interesante que los hermanos del caso índice y sus descendientes se sometiesen también a un estudio genético, para valorar el riesgo de ser posibles portadores asintomáticos de la cardiopatía familiar y comprobar si presentan un fenotipo-genotipo acorde con los resultados obtenidos en el caso índice. La fuerte asociación familiar de esta patología, así como los antecedentes familiares, justificaría dicho estudio. 38 CONCLUSIONES Una vez finalizado e interpretado el trabajo realizado, es importante resaltar una seríe de conclusiones: La información aportada por el uso de la secuenciación masiva en paralelo nos ha permitido encontrar en nuestro caso índice la variante causal en un gen de entre cientos de ellos, a un bajo coste y en un tiempo reducido. El uso de un panel de genes específico para patologías cardíacas hereditarias, nos facilitó el proceso. Por otro lado la secuenciación Sanger sigue siendo útil para confirmar los resultados de ultrasecuenciación que podrían ser dudosos, pero sobre todo nos dejó clara su utilidad para hacer el estudio de portadores en los familiares una vez conocida la variante patogénica del caso índice. El registro de variantes en bases de datos, su clasificación y las guías para la interpretación de esas variantes son una herramienta fundamental que aporta la información necesaria para concluir su patogenicidad y hacer el informe genético. Estos estudios genéticos se convierten en recursos imprescindibles en la práctica clínica, sobre todo cuando abarcan campos como las miocardiopatías familiares. Ayudan a confirmar el diagnóstico y a desenmascarar patologías genéticas, con las ventajas que puede tener un diagnóstico genético precoz, antes de que se manifiesten los síntomas de la enfermedad, y ayuden al clínico a anteponerse y mejorar el pronóstico y minimizar los efectos de la patología, en la medida de lo posible tanto del caso índice como de sus familiares La importancia y utilidad de las pruebas genéticas se ponen de manifiesto en el estudio, y son imprescindibles junto con otra serie de pruebas diagnósticas. El fenotipo de enfermedad no siempre se corresponde con los resultados obtenidos en el estudio genético, por ello las pruebas de imagen, el ecg y la clínica del paciente, además de los hallazgos genéticos del estudio, son fundamentales para el diagnóstico y para la valoración del riesgo y pronóstico de este tipo de patologías cardíacas. 39 BIBLIOGRAFÍA 1-Fernández-Falgueras A, Sarquella-Brugada G, Brugada J, Brugada R, Campuzano O. Cardiac Channelopathies and Sudden Death: Recent Clinical and Genetic Advances. Biology. 2017;6 (1):7. 2-Bayés de Luna A, Elosua R. Muerte Súbita. Revista española de cardiología. 2012; 65(11):1039-1052. 3-Coll M, Puigmulé M, Pérez-Serra A, Fernández-Falgueras A, Mates J et al. Bases genéticas de patologías arrítmicas asociadas a muerte súbita cardíaca. Genotipia. 2019;3 (3):91-106. 4-Golukhova EZ, Gromova OI, Shomahov RA, Bulaeva NI, Bockeria LA. Monogenec Arrhythmic Syndromes: From Molecular and Genetic Aspects to Bedside. Acta Naturae. 2016;8(2):62‐74. 5-Rodríguez-Calvo MS, Brion M, Allegue C, Concheiro L, Carracedo A. Molecular genetics of sudden cardiac death. Forensic Sci Int. 2008;182(1-3):1‐12. 6-Trujillo-Quintero JP, Palomino-Doza J, Cárdenas-Reyes I, Ochoa JP, Monserrat L. Abordaje de las cardiopatías familiares desde la Medicina genómica. Revista Colombiana de Cardiología. 2018; 5(4): 264-276. 7-Tamariz Martel A. Canalopatías. 2017; 509-520. Guzlop editores. PDF 8-Kim JB. Channelopathies. Korean J Pediatr. 2014;57(1):1‐18. 9-Wilde AA, Behr ER. Genetic testing for inherited cardiac disease. Nat Rev Cardiol. 2013;10(10):571‐583. 10Nerbonne JM, Kass RS. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiol Rev. 2005;85(4):1205‐1253. 11Oberman R, Bhardwaj A. Physiology, Cardiac. StatPearls. Treasure Island (FL); 2020. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK526089. 12Proyecto ITACA. Imagen. Representación esquemática de las distintas fases de un PA ventricular y las diversas corrientes iónicas de entrada y salida, así como las subunidades  y las subunidades reguladoras que forman los diversos canales. [Internet]. 2020. https://www.itaca.edu.es. 13González-Melchor L, Villarreal-Molina T, Iturralde-Torres P, MedeirosDomingo A. Sudden cardiac death in individuals with normal hearts: an update. Arch Cardiol Mex. 2014;84(4):293‐304. 14Garcia-Elias A, Benito B. Ion Channel Disorders and Sudden Cardiac Death. Int J Mol Sci. 2018;19(3):692. 40 15McKenna WJ, Maron BJ, Thiene G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circ Res. 2017;121(7):722‐730. 16Dadson K, Hauck L, Billia F. Molecular mechanisms in cardiomyopathy. Clin Sci (Lond). 2017;131(13):1375‐1392. 17Estigarribia Passaro Jorge. Clasificación de las miocardiopatías. Un objetivo, muchas propuestas. Rev.Urug.Cardiol. 2019; 34(1): 245-283. 18Elliott P, Andersson B, Arbustini E, Bilinska Z, Cecchi F et al. Classification of the cardiomyopathies: a position statement from the European Society Of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J. 2008;29(2):270‐ 276. 19Brieler J, Breeden MA, Tucker J. Cardiomyopathy: An Overview. Am Fam Physician. 2017;96(10):640‐646. 20Antunes MO, Scudeler TL. Hypertrophic cardiomyopathy. Int J Cardiol Heart Vasc. 2020;27:100503. 21Herrera-Rodríguez DL, Totomoch-Serra A, Rosas-Madrigal S, Luna-Limón C, Marroquín-Ramírez D et al. Genes frequently associated with sudden death in primary hypertrophic cardiomyopathy. Arch Cardiol Mex. 2020;90(1):58‐68. 22Marian AJ, Braunwald E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circ Res. 2017;121(7):749‐770. 23Cardiomiopatía hipertrófica familiar (Familial Hypertrophic CardioMyopathy) - Genes MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3 y otros - IVAMI [Internet]. Ivami.com. 2020. https://www.ivami.com/es/pruebas-geneticas-mutaciones-de-genes-humanosenfermedades-neoplasias-y-farmacogenetica/1111-pruebas-geneticas-cardiomiopatiahipertrofica-familiar-y-esporadica-cmh-familial-or-sporadic-hypertrophiccardiomyopathy-hcm-genes-myh7-tnnt2-tpm1-mybpc3-prkag2-tnni3-myl3-ttn-myl2actc1-csrp3-tnnc1-myh6-vcl-myoz2-jph2-pln-carlr3-nexn. 24Towbin JA. Inherited cardiomyopathies. Circ J. 2014;78(10):2347‐2356. 25Marsman RF, Tan HL, Bezzina CR. Genetics of sudden cardiac death caused by ventricular arrhythmias. Nat Rev Cardiol. 2014;11(2):96‐111. 26Heatherm JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016;107 (1);1-8. 27Garrigues F. Sanger: Estrategia de secuenciación de Primera Generación - Genotipia [Internet]. Genotipia. 2017. https://genotipia.com/ngs-secuenciacion. 41 28Xuan J, Yu Y, Qing T, Guo L, Shi L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Lett. 2013;340(2):284‐295. 29Norton N, Li D, Hershberger RE. Next-generation sequencing to identify genetic causes of cardiomyopathies. Curr Opin Cardiol. 2012;27(3):214‐220. 30Mak TSH, Lee YK, Tang CS, Hai JSH, Ran X et al. Coverage and diagnostic yield of whole exome Sequencing for the evaluation of cases with dilated and hypertrophic cardiomyopathy. Sci Rep. 2018;8(1):10846. 31Garrigues F. NGS: Secuenciación de Segunda Generación - Genotipia [Internet]. Genotipia. 2017. https://genotipia.com/ngs-secuenciacion. 32Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424. 33Carrier L, Mearini G, Stathopoulou, K, Cuello F. Cardiac myosin-binding protein C (MYBPC3) in cardiac pathophysiology. Gene. 2015; 573 (2), 188-197. 34Viswanathan S K, Sanders H K, McNamara J W, Jagadeesan A, Jahangir A et al. Hypertrophic cardiomyopathy clinical phenotype is independent of gene mutation and mutation dosage. PloS one, 2017;12(11), e0187948. 35Ho C Y, Charron P, Richard P, Girolami F, Van Spaendonck-Zwarts K Y et al. Genetic advances in sarcomeric cardiomyopathies: state of the art. Cardiovascular research. 2015;105(4), 397–408.