Sistemática molecular del género "Fissurella" en el Pacífico sudoriental

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE BIOLOGÍA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular SISTEMÁTICA MOLECULAR DEL GÉNERO FISSURELLA EN EL PACÍFICO SUDORIENTAL Memoria que para optar al Grado de Doctor en Bioquímica y Biología Molecular presenta ALBERTO NICOLÁS OLIVARES PAZ Santiago de Compostela – España, 2007 MANUEL REY MÉNDEZ, Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, Informa: Que la memoria adjunta, titulada: Sistemática Molecular del Género Fissurella en el Pacífico Sudoriental, que para optar al grado de Doctor en Bioquímica y Biología Molecular, presenta Don Alberto Nicolás Olivares Paz, ha sido realizada bajo mi dirección en los laboratorios del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Biología. Considerando que constituye trabajo de Tesis, autorizo su presentación en Santiago de Compostela a cinco de enero de dos mil siete. El Doctorando, VºBº del Director Fdo.: Alberto N. Olivares Paz Fdo.: Dr. Manuel Rey Méndez Alberto N. Olivares Paz, 2007 5 AGRADECIMIENTOS Desde estas páginas deseo expresar mis más sinceros agradecimientos a todas las personas e instituciones que de forma directa o indirecta han colaborado en la realización de este programa de doctorado. Al doctor Manuel Rey Méndez, director de esta tesis por su permanente apoyo y dedicación. Por la oportunidad de haber ingresado a su unidad, por las facilidades otorgadas para la realización de las diferentes actividades llevadas a cabo durante mi estadía en ella, y por su sincera y franca amistad. A Javier Quinteiro, por entregarme horas de su trabajo en la orientación, planificación y diseño de las diferentes actividades experimentales. Por su permanente apoyo, enseñanza y consejos brindados durante la estancia en el laboratorio. Su experiencia, conocimientos y dominio del área temática, fueron el pilar fundamental para concluir esta memoria. A Jorge Rodríguez, por su esmerada ayuda y colaboración brindada en la realización de actividades del laboratorio, algunas de las cuales al principio se me hacían casi imposibles. A los colegas del departamento de Acuicultura de la Universidad de Antofagasta, por la generosidad para permitirme realizar estos estudios de doctorado y a aquellos que además suplieron mi actividad docente durante los años que permanecí alejado de la institución. A Oscar Zúñiga y Gladys Ramos, por su paciencia para ayudarme en la obtención y envío desde Chile de numerosos artículos. A todos los que colaboraron en la ardua labor de búsqueda y obtención de los ejemplares de las diferentes especies de lapas desde distintos puntos de Chile y de otros países, entre ellos y esperando no olvidar a nadie a Jorge Oliva, Eduardo Díaz, Andrés Olguín, Braulio Montanares, Alberto Paredes, Filogenia del género Fissurella 6 Francisco Rivera, José Sánchez, Rodrigo Burgos, Cesar Lodeiros, Julio Pérez y Nieves González. También, para quienes ayudaron en el procesamiento de los animales, disección y almacenamiento de las numerosas muestras: Paula Medina, Katherine Dawson, María Maldonado, Patricia Olivares y Dania Olivares. A mis hijas Dania y Patricia y a mi esposa María Angélica, por el constante estímulo para que nunca claudicara en esta nueva etapa de mi formación académica. Durante el período de realización de esta memoria, se ha recibido financiación para desarrollar diferentes proyectos que, en algunos casos, permitieron o facilitaron el desarrollo de este trabajo. Por ello, quiero agradecer a las diferentes instituciones su ayuda: A la Unión Europea por financiar el proyecto: QLK1-CT-2000-30476 (años 2001 a 2003). A los Ministerios de Ciencia y Tecnología (MCYT) y al de Educación y Ciencia (MEC), por la financiación de los proyectos: AGL2000-3115-CE y AGL2004-06411-CO2-02/ALI (años 2001 a 2007). A la Xunta de Galicia por la financiación de los proyectos: PGIDT01PXI20005PM y PGIDIT05PXIC20002PN (años 2001 a 2008). A las Instituciones que posibilitaron el financiamiento de mi estancia. Mis agradecimientos a la Universidad de Antofagasta, por las facilidades administrativas otorgadas. A MECESUP UANTOF 2004, por la beca otorgada durante los años 2004-2005. A la Universidad de Santiago de Compostela por la beca concedida en los años 2006 – 2007. Al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela por las facilidades que me ha brindado para realizar este Programa de Doctorado. Alberto N. Olivares Paz, 2007 7 ÍNDICE AGRADECIMIENTOS ................................................................................... 5 RESUMEN...................................................................................................... 13 SUMMARY..................................................................................................... 15 Listado de Figuras....................................................................................................17 Listado de Tablas .....................................................................................................21 INTRODUCCIÓN....................................................................................... 23 I. CONDICIONES DEL MEDIO Y REGISTROS PALEONTOLÓGICOS....................................................................... 25 I.1. UBICACIÓN GEOGRÁFICA DEL ESTUDIO ........................................................26 I.2. ZONAS BIOCLIMÁTICAS ................................................................................27 I.3. CORRIENTES MARINAS .................................................................................30 I.4. PROVINCIAS BIOGEOGRÁFICAS.....................................................................33 I.5. REGISTROS PALEONTOLÓGICOS DE MOLUSCOS.............................................35 II. ANTECEDENTES GENERALES DE LOS MOLUSCOS............... 38 II.1. FILO MOLLUSCA ..........................................................................................38 II.1.A. Morfología y Sistemática.........................................................................38 II.2. CLASE GASTROPODA ...................................................................................45 II.2.A. Morfología...............................................................................................45 II.2.B. Sistemática y filogenia de gasterópodos..................................................47 II.3. SISTEMÁTICA Y FILOGENIA DE VETIGASTROPODA........................................51 II.4. SUPERFAMILIA FISSURELLOIDEA..................................................................54 II.4.A. Morfología...............................................................................................54 II.4.B. Sistemática...............................................................................................55 II.4.C. Filogenia ..................................................................................................58 III. EL GÉNERO FISSURELLA EN EL PACÍFICO SUDORIENTAL................................................................................... 58 III.1. SISTEMÁTICA Y CLASIFICACIÓN ...................................................................58 III.2. GRUPOS DE ESPECIES....................................................................................63 III.3. ANTECEDENTES BIOLÓGICOS DE FISSURELLA ...............................................65 III.3.A. Taxonomía ...............................................................................................65 III.3.B. Distribución .............................................................................................68 III.3.C. Hábitat......................................................................................................70 III.3.D. Alimentación............................................................................................73 Filogenia del género Fissurella 8 III.3.E. Epibiontes ................................................................................................75 III.3.F. Sexo .........................................................................................................76 III.3.G. Parasitismo gonadal.................................................................................77 III.3.H. Reproducción...........................................................................................78 III.3.I. Morfometría.............................................................................................79 IV. FISSURELLA COMO RECURSO ..................................................... 81 IV.1. DURANTE EL HOLOCENO ..............................................................................81 IV.2. EN EL PERÍODO ACTUAL ...............................................................................85 V. LOS CONCEPTOS DE ESPECIE Y EL PROCESO DE ESPECIACIÓN .................................................................................... 90 V.1. CONCEPTO DE ESPECIE .................................................................................90 V.2. MECANISMOS DE ESPECIACIÓN ....................................................................93 V.3. INFERENCIA FILOGENÉTICA..........................................................................96 VI. FILOGENIA MOLECULAR.............................................................. 98 VI.1. ATRIBUTOS DEL ADN..................................................................................98 VI.2. ADN MITOCONDRIAL...................................................................................99 VI.3. MUTACIÓN.................................................................................................103 VI.4. MUTACIÓN PUNTUAL DEL ADN.................................................................104 VI.5. ESTIMACIÓN DE LAS DISTANCIAS GENÉTICAS.............................................106 VI.6. ÁRBOL FILOGENÉTICO................................................................................107 VI.7. MÉTODOS DE RECONSTRUCCIÓN DE ÁRBOLES............................................108 VI.8. TEST ESTADÍSTICO PARA TOPOLOGÍAS DE ÁRBOL.......................................112 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................... 114 HIPÓTESIS .................................................................................................. 118 OBJETIVOS................................................................................................. 119 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................... 121 I. ÁREA DE MUESTREO .................................................................... 123 II. LOCALIDADES DE COLECTA...................................................... 125 III. PRESERVACIÓN DE LOS EJEMPLARES Y TOMA DE MUESTRAS........................................................................................ 126 IV. AISLAMIENTO DEL ADN TOTAL................................................ 127 Alberto N. Olivares Paz, 2007 9 V. AMPLIFICACIÓN DEL ADN.......................................................... 128 V.1. GEN RIBOSOMAL 16S (ARNr 16S) ............................................................129 V.2. GEN CITOCROMO B (CYTB).......................................................................130 V.3. GEN DE LA SUBUNIDAD 1 DE LA NADH DESHIDROGENASA (ND1) ..............130 V.3.A. Diseño de cebadores específicos............................................................131 V.3.B. Amplificación parcial del gen ND1 ......................................................131 V.4. GEN HISTONA H3 (H3) ..............................................................................132 V.5. ESPACIADORES ITS1 E ITS2 ......................................................................132 VI. VERIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR....................... 134 VII. SECUENCIACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR............................ 135 VII.1. PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR ...............................................135 VII.2. REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN...................................................................135 VII.3. ELECTROFORESIS Y DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE SECUENCIACIÓN .........................................................................................136 VIII. VERIFICACIÓN DE LOS ELECTROFEROGRAMAS ............... 136 IX. ALINEAMIENTO DE LAS SECUENCIAS.................................... 136 X. CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIAS..................................... 137 XI. INFERENCIA FILOGENÉTICA .................................................... 138 XI.1. ANÁLISIS DE LA CONGRUENCIA DE LOS JUEGOS DE DATOS .........................138 XI.2. ANÁLISIS BASADOS EN EL CRITERIO DE DISTANCIAS GENÉTICAS................139 XI.3. ANÁLISIS BASADOS EN EL CRITERIO DE PARSIMONIA .................................140 XI.4. ANÁLISIS BASADOS EN EL CRITERIO DE VEROSIMILITUD ............................141 XI.5. ANÁLISIS MEDIANTE INFERENCIA BAYESIANA............................................141 XII. ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DE ADN AMPLIFICADOS AL AZAR (RAMDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA, RAPD).................................................................................................. 142 XIII. ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL.............................. 144 XIII.1. ESPECIES SELECCIONADAS .........................................................................144 XIII.2. AISLAMIENTO DEL ADN Y SECUENCIACIÓN DEL GEN ND1........................144 XIII.3. ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL ............................145 XIV. METODOLOGÍA DE AUTENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE FISSURELLA MEDIANTE PCRRFLP......................................... 146 RESULTADOS .......................................................................................... 149 I. CALIDAD Y PUREZA DEL ADN TOTAL AISLADO ................. 151 II. AMPLIFICACIÓN DE GENES........................................................ 152 Filogenia del género Fissurella 16 the sampled areas. The levels of genetic diversity and demographic history seem to be affected by factors like the level of protection of the habitat to the exploitation and depredation or to abrupt changes in the sea level. The level of the estimated gene flow has implications for the management of this seafood resource. The local populations hardly would undergo a collapse if they are susceptible to be colonized by means of natural larval flow or to be repopulated without implying any loss of genetic variability. The collected data of partial sequences of the CYTB, allows a methodology of PCR-RFLP, for the authentication of key-hole limpets of the Fissurella genus present in the Southeastern Pacific, by means of the digestion of the CYTB amplicon with the enzymes HpyCH4 V and Nla III and the observation of the specific restriction patterns. This methodology is applicable to the authentication of all the range of commercial products. Also it is of application in the identification of individuals in any stage of his ontogenetic development (ova, embryos, larvae, seeds, youthful states of recent settlement) and could be very useful in studies of biology, fishing and ecology, as well as in the traceability of the species of the Fissurella genus, during the commercialization chain. Alberto N. Olivares Paz, 2007 17 Listado de Figuras Figura 1. Muestra la ubicación geográfica de Chile, de cuyo litoral provienen los ejemplares de este estudio....................................................................................26 Figura 2. Esquema de las principales corrientes marinas en Chile. CCC: Contracorriente cálida; CH-O: Corriente Humboldt oceánica; CH-C: Corriente Humboldt costera; CDO: Corriente deriva del oeste; CCH: Corriente Cabo de Hornos.....................................................................31 Figura 3. Fósiles del Mioceno localizados en Chile Central (Lebu). Nielsen (2003). ......37 Figura 4. Imágenes de conchas de diferentes géneros de la familia Fissurellidae. ...........54 Figura 5. Imágenes de especies representativas del género Fissurella: a: F. crassa, b: F. limbata, c: F. maxima, d: F. cumingi, e: F. pulchra, f: F. costata, g: F. latimarginata, h: F. picta, i: F. nigra......................................................67 Figura 6. Esquema de la distribución de las especies de Fissurella en la región del Pacífico Sudoriental. ............................................................................................69 Figura 7. Conchas de Fissurella proveniente de fogones en campamento Acha – 2 (7.000 a.C.). a: Fissurella maxima, b: Fissurella latimarginata........................83 Figura 8. Promedio anual de desembarque de Fissurella y su relación con el total de gasterópodos....................................................................................................87 Figura 9. Tipos de sustituciones de nucleótidos. ts: transición; tv: transversión.............105 Figura 10. Mapa indicando las localizaciones de las áreas de muestreo para cada una de las especies del subgénero Fissurella de Chile..................................123 Figura 11. Posiciones relativas de los cebadores para amplificar en la primera etapa el gen ARNr y en la segunda etapa los segmentos espaciadores internos ITS1 y el ITS2. (ETS: segmento espaciador externo, localizado entre genes ARNr)........................................................................133 Figura 12. Gel de agarosa, mostrando la variabilidad de tamaño de los segmentos de ADN aislado de diferentes especies. Código de especies según lo indicado en Tabla 14. .....................................................................................151 Figura 13. Muestra representativa de los diferentes genes amplificados mediante PCR y el tamaño de los segmentos en comparación al marcador (M). C: Control negativo; 1-2: CYTB; 3-4: ND1; 5-7: ARNr 16S; 8-9: ARNr 18S+ITS1+ARNr 5.8S+ ITS2+ARNr 28S; 10-11 ITS1; 12-13: ITS2; 14-15: histona H3.................................................................................152 Filogenia del género Fissurella 18 Figura 14. Segmentos de electroferogramas obtenidos de la secuenciación de los siguientes genes: a: CYTB; b: ARNr 16S; c: ARNt-Leu - ND1; d: H3; e: ITS2................................................................................................153 Figura 15. Relación entre la distancia genética y el número de transiciones y transversiones para los genes mitocondriales codificantes CYTB y ND1. Se evalúan por separado el total de posiciones y las mutaciones en la primera, segunda y tercera posición del codón.....................................160 Figura 16. Árbol filogenético del subgénero Fissurella de Chile, obtenido con secuencias parciales del citocromo b. Modelo de distancia de Tamura- Nei y método de Neighbor-Joining. Para enraizar el árbol se usó D. graeca (DGRA1). En los nodos se indican valores de replicación (x2000) superiores al 50% y se han colapsado los inferiores.......................164 Figura 17. Árbol filogenético del subgénero Fissurella con secuencias de ARNt- Leu-ND1. Método de Neighbor-Joining y modelo de distancia de Tamura-Nei. Sobre las ramas se señalan valores de replicación (x2000) superiores al 50% y están colapsados los valores inferiores. El grupo externo para enraizar el árbol es DGRA1......................................................166 Figura 18. Árbol de filogenia del subgénero Fissurella del Pacífico Sudoriental, inferido con secuencias del gen ARNr 16S y enraizado con la especie externa D. graeca. Método de Neighbor-Joining, con modelo de distancia de Tamura-Nei. Los valores de replicación de los nodos superiores al 50% se señalan sobre las ramas y los inferiores han sido colapsados.......................................................................................................168 Figura 19. Árbol elaborado con secuencias del gen H3, mostrando las relaciones entre especies de distintos géneros de la familia Fissurellidae y entre Fissurella del Pacífico Sudoriental con Fissurella del Atlántico. Método de Neighbor-Joining y modelo de distancia de Tamura-Nei. Los valores de replicación (x 2000) superiores al 50% se indican sobre las ramas y los inferiores están colapsados. Especies de Haliotis corresponden al grupo externo. (* Secuencias obtenidas del GenBank)......170 Figura 20. Árbol elaborado con secuencias de los interespaciadores ITS1 e ITS2, mostrando las relaciones entre especies de Fissurella del Pacífico Sudoriental usando como grupo externo a F. nimbosa del Atlántico. Método de Neighbor-Joining y modelo de distancia de Tamura-Nei. Los valores de replicación (x 2000) se indican sobre las ramas. ..................172 Figura 21. Árboles filogenéticos obtenidos a partir del juego de datos combinado de secuencias CYTB+ND1, a partir de los programas MEGA (A) y PAUP (B)........................................................................................................174 Figura 22. Árbol consenso reconstruido según el criterio de parsimonia con el programa PAUP y a partir de las secuencias combinadas del CYTB, Alberto N. Olivares Paz, 2007 19 ARNt-Leu y ND1. Con el símbolo rojo se indican aquellos nodos cuya topología ha sido mantenida. Como grupo externo se ha usado DGRA1...........................................................................................................176 Figura 23. Árbol reconstruido según el criterio de máxima verosimilitud con el programa PAUP y a partir de las secuencias combinadas del CYTB, ARNt-Leu y ND1. El modelo evolutivo se corresponde con HKY+G. El valor –Ln= 4811.6096. Como grupo externo se ha usado a DGRA1. .....178 Figura 24. Árbol basado en distancias de Tamura-Nei mediante el método de Neighbor-Joining en MEGA para 31 especímenes representativos de las 15 especies de Fissurella consideradas. El juego de datos utilizado incluyó secuencias parciales de los genes CYTB, ARNt-Leu, ND1 y ARNr 16S. DGRA1 fue utilizada como grupo externo. Los números adyacentes indican los valores para 2.000 replicaciones...............................181 Figura 25. Árbol consenso basado en el modelo de Tamura-Nei mediante el método de Neighbor-Joining en PAUP para 31 especímenes representativos de las 15 especies de Fissurella consideradas. El juego de datos utilizado incluyó secuencias parciales de los genes CYTB, ARNt-Leu, ND1 y ARNr 16S. DGRA1 fue utilizada como grupo externo. Los números adyacentes indican los valores para 2.000 replicaciones...................................................................................................182 Figura 26. Árbol consenso (50%) basado en el criterio de parsimonia para 31 especímenes representativos de las 15 especies de Fissurella consideradas. El juego de datos utilizado incluyó secuencias parciales de los genes CYTB, ARNt-Leu, ND1 y ARNr 16S. DGRA1 fue utilizada como grupo externo. Los números adyacentes indican los valores para 100 replicaciones. ......................................................................183 Figura 27. Árbol reconstruido según el criterio de máxima verosimilitud con el programa PAUP y a partir de las secuencias combinadas del CYTB, ARNt-Leu, ND1 y ARNr 16S. El modelo evolutivo se corresponde con GTR+G+I. El valor –Ln= 5992.3924. Como grupo externo se ha usado a DGRA1..............................................................................................184 Figura 28. Árbol basado en la inferencia bayesiana realizado mediante el programa Mr Bayes versión 3.1. El juego de datos utilizado incluyó secuencias parciales de los genes CYTB, ARNt-Leu, ND1 y ARNr16S. DGRA1 fue utilizada como grupo externo. Los números adyacentes a los nodos indican los valores de probabilidad “a posteriori”.........................................186 Figura 29. Fragmentos de ADN de tamaños variables obtenidos para distintas especies de Fissurella, mediante el método RAPD, usando el cebador 5’-GTAGACCCGT-3’. Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. ..............................................................................................................187 Filogenia del género Fissurella 20 Figura 30. Filogenia del subgénero Fissurella, reconstruida por el método de UPGMA, y la obtención de índices de similitud, debido a la presencia o ausencia de bandas comunes en los patrones de bandeo generados por técnica de RAPD, para cada especie analizada.......................................189 Figura 31. Geles de agarosa mostrando los perfiles de restricción tras la digestión del producto de PCR obtenidos de diversas especies de Fissurella y situado en el citocromo b, con las enzimas HpyCH4 V y Nla III.................191 Figura 32. Entramado de haplotipos de la secuencia ND1, obtenidos para la especie F. crassa, basado en el algoritmo “median-joining”. Cada círculo indica un haplotipo y su área es proporcional a la frecuencia absoluta de haplotipos. La fracción de cada círculo indica la proporción de haplotipos presente en las poblaciones estudiadas mediante el código de color: ● Iquique, ● Coloso, ● Tilgo.........................196 Figura 33. Distribución de las diferencias entre pares de secuencias (“mismatch distribution”) para cada una de las poblaciones analizadas de F. crassa......199 Figura 34. Entramado de haplotipos de la secuencia ND1, obtenidos para la especie F. limbata, basado en el algoritmo “median-joining”. Cada círculo indica un haplotipo y su área es proporcional a la frecuencia absoluta de haplotipos. La fracción de cada círculo indica el número de haplotipos presente en las poblaciones estudiadas mediante el código de color: ● Iquique, ● Coloso, ● Tilgo.........................................................202 Figura 35. Distribución de las diferencias entre pares de secuencias (“mismatch distribution) para cada una de las poblaciones analizadas de F. limbata......205 Figura 36. Entramado de haplotipos de la secuencia ND1, obtenidos para las especies F. latimarginata-F. cumingi, basado en el algoritmo “median-joining”. Cada círculo indica un haplotipo y su área es proporcional a la frecuencia absoluta de haplotipos. La fracción de cada círculo indica el número de haplotipos presente en las poblaciones estudiadas mediante el código de color: ● Iquique, ● Coloso, ● Tilgo, ● La Isla de Algarrobo, ● Arco Cocholgue, ● Polocue. ...............................209 Figura 37. Distribución de las diferencias entre pares de secuencias (“mismatch distribution”) para cada una de las poblaciones analizadas de las especies consideradas (F. latimarginata y F. cumingi) del “complejo latimarginata”.................................................................................................213 Figura 38. Árbol filogenético consenso de las diversas topologías obtenidas con los distintos juegos de datos evaluados con metodologías alternativas. .......218 Alberto N. Olivares Paz, 2007 21 Listado de Tablas Tabla 1. Características de las regiones bioclimáticas de la zona mediterránea. (1mm=1L/m2).......................................................................................................... 28 Tabla 2. Clasificación de los moluscos (*). *Salvini-Plawen, 1980 (+ = grupo extinguido) .............................................................................................................. 43 Tabla 3. Clasificaciones de Archaeogastropoda. Bieler (1992)# (+: indica taxa extinguida; *: taxa que fueron marcadas como parafiléticas; ? ubicado como en el original)........................................................................................................... 48 Tabla 4. Clasificaciones de Caenogastropoda/Heterostropha. Bieler (1992)#. Los números entre paréntesis indican el número de los subórdenes incluidos............. 48 Tabla 5. Clasificaciones de Opisthobranchia. Bieler (1992)#. Los números entre paréntesis indican el número de los subórdenes incluidos..................................... 49 Tabla 6. Clasificaciones de Pulmonata. Bieler (1992)#......................................................... 50 Tabla 7. Sistemática de Fissurellidae. Vaught (1989) y Lindner (2000). ............................ 56 Tabla 8. Denominación actual de las especies del subgénero Fissurella. Nombres anteriores y provincia biogeográfica a la que pertenecen. Nómina elaborada en base a la lista publicada por McLean, 1984....................................................... 59 Tabla 9. Lista de caracteres clave (McLean, 1984)............................................................... 61 Tabla 10. Lista de caracteres clave. Continuación (McLean, 1984)..................................... 62 Tabla 11. Relaciones entre dimensiones de la concha en especies de Fissurella................. 80 Tabla 12. Relaciones de dimensiones del orificio apical con la concha. ............................. 80 Tabla 13. Relaciones entre el largo y peso de las partes del cuerpo del animal................... 81 Tabla 14. Localidades de colecta de los ejemplares de las diferentes especies, sus coordenadas geográficas y el código de identificación.............................................125 Tabla 15. Matriz de distancias –p netas interespecíficas obtenidas a partir de secuencias del citocromo b para las especies analizadas del género Fissurella. Por encima de la diagonal se muestran los valores de E.S. (Error Standard), estimados mediante 500 replicaciones. ................................................................161 Tabla 16. Matriz de distancias –p netas interespecíficas obtenidas a partir de secuencias del ND1 para las especies analizadas del género Fissurella. Por encima de la diagonal se muestran los valores de E.S. (Error Standard), estimados mediante 500 replicaciones................................................................................... 162 Tabla 17. Matriz de distancias –p netas interespecíficas obtenidas a partir de secuencias del ARNr 16S para las especies analizadas del género Fissurella. Por encima de la diagonal se muestran los valores de E.S. (Error Standard), estimados mediante 500 replicaciones. ................................................................162 Filogenia del género Fissurella 22 Tabla 18. Parámetros de los modelos evolutivos seleccionados para el juego de datos combinado CYTB+ND1....................................................................................... 173 Tabla 19. Parámetros de los modelos evolutivos seleccionados para el juego de datos combinado CYTB+ARNt-Leu+ND1+ ARNr 16S.............................................. 180 Tabla 20. Recopilación de los cortes producidos y de los fragmentos generados tras la digestión del producto de PCR situado en el citocromo b, con las enzimas HpyCH4 V y Nla III. (A) a (F): patrones de restricción, (O): sin corte............... 192 Tabla 21. Variabilidad genética a nivel poblacional de Fissurella crassa.......................... 194 Tabla 22. Frecuencias de haplotipos en tres poblaciones de Fissurella crassa.................. 194 Tabla 23. Matriz de estimaciones de FST entre tres poblaciones de F. crassa. Encima de la diagonal se indican las estimaciones de Nm a partir de estimaciones de FST linearizados............................................................................................................ 197 Tabla 24. Análisis de la varianza molecular (AMOVA) para tres poblaciones de F. crassa, en base a las secuencias mitocondriales del gen ND1...................198 Tabla 25. Parámetros estimados para las poblaciones de Fissurella crassa...................... 199 Tabla 26. Variabilidad genética a nivel poblacional de Fissurella limbata........................ 200 Tabla 27. Listado de haplotipos en tres poblaciones de Fissurella limbata (Abs: absoluta; Rel: relativa). ......................................................................................... 201 Tabla 28. Matriz de estimaciones de FST entre tres poblaciones de F. limbata. Encima de la diagonal se indican las estimaciones de Nm a partir de estimaciones de FST linearizados. .................................................................................................... 203 Tabla 29. Análisis de la varianza molecular (AMOVA) para tres poblaciones de F. limbata, en base a las secuencias mitocondriales del gen ND1 ................ 204 Tabla 30. Parámetros estimados para las poblaciones de Fissurella limbata....................205 Tabla 31. Estructura genética en el complejo de poblaciones de F. latimarginata- F. cumingi que habitan en seis localidades........................................................... 206 Tabla 32. Frecuencia de haplotipos en poblaciones de F. cumingi – F. latimarginata. Hap: Haplotipos; Fa: Frecuencia absoluta; Fr: Frecuencia relativa, LIA: La Isla de Algarrobo; A. Co.: Arco Cocholgue......................................................... 208 Tabla 33. Matriz de estimaciones de FST entre seis poblaciones de F. latimarginata- F. cumingi. Encima de la diagonal se indican las estimaciones de Nm a partir de estimaciones de FST linearizados......................................................................210 Tabla 34. Análisis de la varianza molecular (AMOVA) para seis poblaciones de F. latimarginata-F. cumnigi en base a las secuencias mitocondriales del gen ND1. ............................................................................................................... 211 Tabla 35. Parámetros estimados para las poblaciones de F. latimarginata-F. cumingi.....212 INTRODUCCIÓN Alberto N. Olivares Paz, 2007 25 La introducción general de esta memoria se ha dividido en seis apartados a través de los cuales se describe el medio natural en el que se desarrollan los organismos que son objeto de nuestro estudio y el registro histórico en el que emergieron en la costa del territorio chileno; los antecedentes generales del filo Mollusca y los grupos taxonómicos (clase Gastropoda, suborden Vetigastropoda, superfamilia Fissurelloidea) a los que pertenece el género Fissurella; antecedentes generales y biológicos del subgénero Fissurella; la importancia como recurso de las especies de este subgénero desde el asentamiento de las poblaciones en zonas costeras hasta nuestros días; los modelos generales de especiación y los métodos de inferencia filogenética de los seres vivos. I. Condiciones del medio y registros paleontológicos Las condiciones de la Tierra no han permanecido estables en el tiempo y continuamente están cambiando, debido a perturbaciones de la geomorfología por los movimientos orogénicos, epirogénicos y sísmicos, y por los cambios climáticos, los cuales modifican el ambiente en el que se desenvuelven las especies, impulsando la evolución de las mismas. Algunas incapaces de adaptarse se extinguieron dejando en algunos casos una huella, fósil o molecular, en sus descendientes que permite establecer una relación entre todas las especies extintas y existentes (Hengeveld, 1990). Las especies se han adaptado para vivir en determinados lugares del planeta, lo cual permite decir que cada especie contiene su propia historia de vida, que las faculta para habitar determinados ambientes bajo las condiciones físicas, biológicas y climáticas que el particular hábitat les impone Filogenia del género Fissurella Introducción 32 La corriente de Humboldt, en su recorrido presenta numerosos giros que son la fuente generadora de contracorrientes locales y procesos de afloramiento costero (“upwelling”). El afloramiento está asociado principalmente a la masa de agua subsuperficial, emergiendo las aguas subantárticas de la corriente de Humboldt. Estos afloramientos son responsables de la alta productividad primaria de la región, cuyo efecto potenciador sobre las pesquerías pelágicas ha sido documentado, pero su efecto sobre comunidades litorales aún se está evaluando (Gallardo, 1975; Vásquez et al. 1998). En teoría, el afloramiento se puede presentar en toda la zona norte y central de Chile; pero ocurre en puntos específicos como puntas, cabos y bahías. La orientación de la costa y el régimen de vientos, en los que imperan los vientos del sur y suroeste, promueven los afloramientos debido a que desplazan las aguas superficiales (Bakun & Nelson, 1991; Fonseca & Farías, 1987). Sin embargo, esto puede resultar nocivo para las larvas descendientes de las especies litorales, ya que son desviadas de la costa quedando a la deriva mar adentro. La presencia de las aguas frías de Humboldt junto al flujo sur-norte, son importantes en la distribución de las especies marinas chilenas, ya que permiten extender las condiciones frías más al norte. Se ha estimado que la temperatura del mar en el extremo norte es alrededor de 10 ºC más baja que la esperada a similar latitud en otro continente y hacia el extremo sur 2 ºC más alta; pero cerca de los 43º S no habría mayor diferencia. Este reducido gradiente térmico latitudinal, se considera una condición anómala general del sistema costero chileno (Viviani, 1979). Frecuentemente se produce una anomalía oceanográfica y atmosférica asociada a la dinámica de la circulación atmosférica global, la Oscilación del Sur, cuyas fases positiva y negativa se asocian a los eventos de “El Niño” y “La Niña”. En “El Niño”, las aguas cálidas de la Corriente del Ecuador prevalecen Alberto N. Olivares Paz, 2007 33 sobre la Corriente de Humboldt, elevándose la temperatura del agua, variando el nivel del mar y disminuyendo los niveles de nutrientes disponibles en la superficie del agua; con amplias repercusiones en la cadena trófica, en la comunidad bentónica, sistemas pelágicos y pesquería. Algunas especies locales proliferan, otras mueren y también se produce el ingreso de especies típicas de las aguas tropicales (Alamo & Bouchon, 1987; Tarazona et al. 1988; Escribano et al. 2004). I.4. Provincias biogeográficas La biogeografía marina está determinada en parte por el sistema de circulación de las aguas, siendo los gradientes térmicos los responsables fundamentales para el establecimiento de los organismos y en especial de los moluscos litorales en determinados lugares (Edmunds, 1977). En América del Sur Occidental, se encuentra la región de agua Tropical del Pacífico y la región de aguas Templadas, cuyo límite de separación entre ambas estaría situado a la altura del Golfo de Guayaquil (3º - 4º S). La Región Oeste de Sudamérica o Región Templada del Pacífico Sur Oriental, comprende una biota con características temperadas y frías. En esta región se reconocen dos Provincias Biogeográficas con biotas diferentes en origen, constitución y distribución (Balech, 1954; Castilla, 1979). Provincia Peruana o Peruano-Chilena: con extensión desde los 3º S - 4º S hasta aproximadamente 42º S (Isla de Chiloé), tiene una biota propia de la zona templada cálida con algunas especies tropicales o subtropicales que se distribuyen hasta Chile Norte o Chile Central. Provincia Magallánica: abarca desde la Isla de Chiloé hasta el extremo Sur del Continente Sudamericano, comprende especies con características de zona templada fría (zonas frías o subantárticas). Filogenia del género Fissurella Introducción 34 La biota marina de estas dos provincias, principalmente la fauna, recibe el nombre de peruana o peruano-chilena y magallánica respectivamente. El análisis de distribución de diferentes especies de poríferos, equinodermos, isópodos, moluscos, crustáceos, e incluso algas ha permitido detectar para cada provincia algunos organismos endémicos y que los rangos de distribución de las especies son diferentes, existiendo una zona intermedia en la cual se superponen algunas de las especies de ambas provincias. Sin embargo, se ha constatado que existen grupos de especies endémicas de la provincia peruana que no penetran a la zona claramente magallánica y viceversa. Lo anterior permitió definir una nueva Región Templada Transicional (Lancellotti & Vásquez, 1999) ubicada entre los 35º S y 48º S, área que posee características discretas en lo biótico y abiótico, y en la cual ocurre un gradual pero importante recambio de especies. El límite norte de la Región Templada Transicional coincide con el límite más austral de la Contracorriente Cálida del Perú alcanzado durante los eventos de “El Niño”. El sistema de Corrientes de Humboldt oscila a través de todo el tramo 35º S - 48º S en un ciclo verano – invierno. Todo esto le confiere a la Región Templada Transicional un ambiente abiótico discreto donde se observa un gradual reemplazo de especies más que un gran quiebre distribucional, y en la cual se encuentra la mayor diversidad de organismos (Lancellotti & Vásquez, 1999). Recientemente Camus (2001) introdujo modificaciones a los patrones de distribución establecidos, enunciando una hipótesis complementaria y que no invalida las anteriores. En esta hipótesis se reconocen las siguientes unidades: Provincia Peruana: comprendida desde los 18,4º S a 30º S. Área intermedia: abarcaría desde el límite anterior a los 41º 43’ S. En esta área, se distinguen tres distritos, de norte a sur: Septentrional, Mediterráneo y Meridional. Alberto N. Olivares Paz, 2007 35 Provincia Magallánica: desde el límite anterior a los 56º S, con dos distritos: Austral y Subantártico. Entre el área intermedia y la magallánica existe una zona de transición inducida, y entre la Provincia Peruana y el área intermedia una zona transicional de contacto. I.5. Registros paleontológicos de moluscos Los estudios de paleontología realizados en Chile, han permitido registrar la presencia de varios grupos de organismos marinos desde la era Mesozoica. Sin embargo, algunos de los hallazgos que permiten dar testimonio de la existencia de moluscos y en particular de Fissurella que habitaron el mar chileno, han sido descritos en los siguientes depósitos de fósiles: En el Norte de Chile (Antofagasta-Mejillones, 23º 06’ S, 70º 27’ W), Herm (1969) identificó fósiles de moluscos correspondientes a la época del Plioceno y a las especies de Fissurella las mencionó como “div. sp.”. Otra forma fósil, ha sido denominada F. concolor Philippi, 1887, la cual se asemeja a F. maxima. Otro resto incompleto se parecería a F. crassa. Para el Pleistoceno, mencionó a las especies F. microtrema (F. peruviana), F. costata, F. crassa, F. lata (F. picta lata) y F. concina (F. maxima) (McLean, 1984). En el área de Caldera, entre los 27º S y Agua de los Burros 28º S aproximadamente (ca.), un análisis de estratigrafía permitió detectar los moluscos bivalvos Ostrea sp. y Chlamys, entre los elementos faunísticos del Oligoceno superior al Mioceno medio (Marquardt et al. 2000). Sin embargo, en esta misma área, el análisis de depósitos fosilíferos provenientes de 86 localidades permitieron identificar 54 especies de gasterópodos y 47 especies de bivalvos, con edad comprendida entre el Mioceno medio (16,4 – 11,2 millones de años) y el presente. Las edades se asignaron sobre la base de correlaciones con resultados radiogénicos e isótopos conocidos del Filogenia del género Fissurella Introducción 36 Cuaternario, datos micropaleontológicos de unidades neógenas y morfoestratigrafía local. Los depósitos asignados al Plioceno superior e inferior están formados por diversas especies de bivalvos y gasterópodos, entre los cuales no se registran fisurélidos. Entre las especies identificadas en los depósitos pleistocénicos se encuentran algunas de las actuales especies de Fissurella como F. costata, F. latimarginata, F. maxima y F. peruviana. En dichos yacimientos la presencia de algunas especies de bivalvos de aguas cálidas asociadas a otras de aguas frías, en algunos sitios permite asociarlos a un TAMA (Thermally Anomalous Molluscan Assemblages) alrededor del interglaciar 400.000 años antes del presente (AP), no obstante la fauna marina cuaternaria es similar a la actual (Guzmán et al. 2000). En estudios de macrofauna y microfauna de moluscos en los alrededores de La Serena y Coquimbo (ca. 30º S), datados entre Plioceno y Pleistoceno temprano, no se mencionan registros de especies del género Fissurella (Griffin, 1999) En las cercanías del pueblo Matanzas, Chile central (33º 57’ S -71º 52’ W), se encuentran fósiles de moluscos pertenecientes al período del Mioceno inferior al Mioceno medio; entre los que hay 13 géneros de bivalvos y 40 especies de gasterópodos, y otros que habitaron la zona intermareal o submareal entre los que no figuran las especies de Fissurella (Frassinetti & Covacevich, 1993; Nielsen, 2003). Respecto a la super familia Fissurelloidea, se registraron fósiles pertenecientes a la familia Diodoridae en las localidades de Pupuya (ca. 34º S y 71º 50’ W), Punta Perro (33º 50’ S - 71º 45’ W) y Lebu (37º 35’ S - 73º 45’ W). Las especies identificadas son Diodora fragilis, Diodora pupuyana, Diodora sp.1 y Diodora sp.2, con edad correspondiente al Mioceno (Nielsen et al. 2004). Fósiles de dos especies del género Fissurella se colectaron en la localidad de Lebu, las que se denominaron Fissurella lebuensis y Fissurella Alberto N. Olivares Paz, 2007 37 chica (Figura 3), con datación correspondiente a la época del Mioceno (Nielsen, 2003). De estas especies no hay registros actuales, por lo que es posible deducir que están extintas. Fissurella chica sp. nov. Fissurella lebuensis sp. nov. Figura 3. Fósiles del Mioceno localizados en Chile Central (Lebu). Nielsen (2003). En materiales fósiles proveniente de Isla Ipún, (44º 33’ S - 44º 41’ S, 74º 45’ W) Archipiélago de los Chonos, sur de Chile, con una data aproximada a los períodos del Mioceno inferior al medio fueron reconocidas una especie de cefalópodo, 11 especies de bivalvos y 15 de gasterópodos. Sin embargo, entre todas las especies no figura ninguna del género Fissurella (Frassinetti, 2004). En la Isla Stokes, ubicada frente a Isla Ipún, el análisis de la fauna de moluscos fósiles, reveló 9 especies de bivalvos y 15 de gasterópodos, pertenecientes al Filogenia del género Fissurella Introducción 38 Mioceno inicial a medio, pero no hay registro de Fissurella (Frassinetti, 2001). En la misma zona sur de Chile, Isla Guafo (43º 37’ S y 74º 45’ W), situada al suroeste de Isla Grande de Chiloé, se recolectaron fósiles de moluscos que permitieron reconocer 16 especies de bivalvos y 18 especies de gasterópodos que estuvieron presentes durante el Plioceno superior. En similitud con los registros de las otras islas no hay fósiles de Fissurella (Frassinetti; 1997, 2000). II. Antecedentes generales de los moluscos II.1. Filo Mollusca El filo Mollusca corresponde a uno de los dos grupos más numerosos y de mayor éxito evolutivo existente, lo cual ofrece una oportunidad favorable para conocer como las especies han logrado diversificarse morfológica y fisiológicamente para ocupar prácticamente todos los hábitats del planeta. Las especies existentes han entregado valiosa información para reconstruir su historia evolutiva mediante relaciones morfológicas y últimamente a través de los estudios moleculares. Fissurella es uno de los géneros que comprende la familia Fissurellidae, la cual pertenece a la superfamilia Fissurelloidea, del subórden Vetigastropoda, de la clase Gastropoda, del filo Mollusca. II.1.A. Morfología y Sistemática El filo Mollusca es uno de los más antiguos, cuyos orígenes se remontan a unos 600 millones de años (Ma), durante el período Precámbrico. Aunque no hay consenso en el número total de especies, el filo Mollusca es el segundo grupo de mayor diversidad y cantidad de especies. Se estima que actualmente existen alrededor de 70.000 a 100.000 especies ocupando prácticamente todos los hábitats acuáticos y terrestres. Además, se postula que Alberto N. Olivares Paz, 2007 39 un elevado número de especies que aún no han sido descritas se encuentran en las profundidades de los océanos polares y en aguas de las zonas tropicales (Margulis & Schwartz, 1988; Monge-Nájera, 2003). El taxón Mollusca está constituido por diferentes Clases, las cuales incorporan organismos que han desarrollado una enorme diversidad de estructuras, morfología y tamaño corporal, variaciones estructurales y modificaciones funcionales de los órganos y sistemas, que les han permitido adaptarse a los diversos hábitats y ambientes de la tierra. Los estudios anatómicos y de los caracteres morfológicos han abordado la totalidad de los órganos y sistemas de los moluscos (concha, estructuras respiratorias, estrategias reproductivas incluyendo gónadas y espermatozoides, rádula, corazón, órganos renales, sistema nervioso) cada uno de los cuales fue considerado por sus autores como un carácter de valor taxonómico para una adecuada clasificación (Beedham & Trueman, 1967; 1968; Emerson, 1962; Ghiselin, 1965; Graham, 1973). Salvini-Plawen (1980, 1990), reconsideró los problemas sistemáticos y propuso una clasificación modificada de los moluscos a nivel de los taxa superiores. En su propuesta considera diversos caracteres tales como la organización original común de los moluscos y su posterior evolución, con predominancia en el manto, la cavidad del manto y sus órganos, la superficie de desplazamiento, el sistema muscular longitudinal y dorso-transversal, el sistema nervioso y órganos de los sentidos, la segmentación del huevo y tipo de larva. Además, se determinó que cada una de las categorías establecidas constituyen un grupo monofilético y que los moluscos evolucionaron a partir de un hipotético animal con una tipología similar a la de un gusano plano, acelomado, no segmentado, de muy pequeño tamaño (no superior a 5mm), que difiere del molusco ancestral que frecuentemente aparece en la literatura convencional (Salvini-Plawen, 1990). Filogenia del género Fissurella Introducción 40 No obstante, mediante el análisis del total de las secuencias de los nucleótidos del gen ARNr 28S se constató que el filo Mollusca no es un grupo monofilético, ya que incluiría invertebrados de otros Filos (especies de Braquiópodos, Nemertinos, Anélidos: Oligoquetos y Poliquetos; Equiuros y Pogonóforos). Del mismo modo, la clase bivalvos no mostró ser un grupo monofilético de especies (Winnepenninckx et al. 1996). Recientemente, la comparación de un segmento de 1025 pb. del gen ARNr 28S de la especie Laevipilina antarctica (monoplacophora) con las de otros moluscos, ha permitido soportar la agrupación de monoplacóforos y placóforos en un solo grupo, generando nuevas interrogantes en la actual clasificación y modelo de evolución de los moluscos (Girebet et al. 2006). La clasificación modificada de Salvini-Plawen (Salvini-Plawen, 1990), (Tabla 2) consideró los niveles taxonómicos superiores hasta el nivel de Orden, definiendo 8 clases de moluscos: 1. Clase Caudofoveata: son moluscos de cuerpo vermiforme cuya cutícula corporal posee placas de aragonita. Son marinos, viven entre 10 y 7.000 m de profundidad y están adaptados para excavar los sedimentos fangosos. En esta clase se agrupan entre 70 - 88 especies, las cuales presentan sexos separados, con una longitud corporal comprendida entre 2 mm – 14 cm. (Salvini-Plawen, 1990; Monge-Nájera, 2003). 2. Clase Solenogastres: poseen cuerpo cilíndrico angosto, cubierto por una cutícula incrustada con placas o espículas de aragonita y un pie estructurado para el deslizamiento. Son animales hermafroditas, de vida epibéntica. Viven en los mares a profundidades comprendidas entre los 5 y 6.850 m. Se reconocen 185 especies, que miden entre 0,8 mm y 30 cm de largo (Salvini-Plawen, 1990). 3. Clase Placophora: moluscos de cuerpo aplanado y amplio pie, cubierto con cutícula y espículas, dispuestas dorsalmente en 8 placas seriadas. Alberto N. Olivares Paz, 2007 41 Se han identificado alrededor de 600 especies, que viven en ambientes marinos desde la superficie hasta los 7.000 m de profundidad y se alimentan de algas. La longitud del cuerpo es variable entre las especies, midiendo 3 mm las pequeñas y 43 cm las más grandes (Salvini-Plawen, 1990; Monge-Nájera, 2003). 4. Clase Tryblidia: cuerpo cubierto dorsalmente con una concha. Son animales marinos que viven en aguas profundas entre 175 y 6.500 m y se alimentan de detritus. Se han registrado de 12 a 15 especies, de tamaño pequeño comprendido entre 1,5 y 37 mm de longitud corporal. 5. Clase Bivalvia: moluscos que tienen el cuerpo comprimido lateralmente, protegido por una concha formada por dos valvas. Viven en los fondos acuáticos o bien adheridos a sustratos, hasta una profundidad de 10.700 m, capturando el alimento mediante un mecanismo de filtración. Las especies pueden ser hermafroditas o gonocóricas existiendo alrededor de 8.000 especies marinas y 2.000 límnicas, con un tamaño corporal de 1mm a 1,35 m (Salvini-Plawen, 1990; Monge-Nájera, 2003). 6. Clase Escaphopoda: esta clase comprende unas 350 especies, las cuales tienen el cuerpo protegido por una concha de forma cilíndrica. Son especies marinas excavadoras de los fondos blandos. Se encuentran hasta los 7.000 m y se alimentan de pequeños animales (Salvini- Plawen, 1990; Monge-Nájera, 2003). 7. Clase Siphonopoda: moluscos de cuerpo elongado dorso-ventralmente. Algunas especies poseen una concha de forma de espiral, pero la mayoría de las especies posee una concha en regresión o vestigio de ella. Poseen tentáculos cefálicos y el pie modificado para la propulsión, tipo tobera. Son especies carnívoras, cuyo cuerpo puede medir desde 1 cm a 8,0 m de largo. Se reconocen aproximadamente de de 600 a 650 Filogenia del género Fissurella Introducción 48 Tabla 3. Clasificaciones de Archaeogastropoda. Bieler (1992)# (+: indica taxa extinguida; *: taxa que fueron marcadas como parafiléticas; ? ubicado como en el original). #: Tabla del trabajo original de Bieler (1992) Tabla 4. Clasificaciones de Caenogastropoda/Heterostropha. Bieler (1992)#. Los números entre paréntesis indican el número de los subórdenes incluidos. Alberto N. Olivares Paz, 2007 49 Bieler (1992) resumió las modificaciones que fueron realizadas a la clasificación original de Thiele por los autores Wenz, 1994; Knight et al. 1960; Taylor & Sohl, 1962; Odhner in Franc, 1968; Galikov & Starobogatov, 1975, 1989; Solem 1978; Hubendick, 1978; Salvini-Plawen, 1980; Tillier, 1984, 1989; Haszprunar, 1988; Ponder & Warén 1988. Estas clasificaciones se muestran en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6. Tabla 5. Clasificaciones de Opisthobranchia. Bieler (1992)#. Los números entre paréntesis indican el número de los subórdenes incluidos En la última década, Ponder & Lindberg (1997) establecieron las subclases Eogastropoda y Orthogastropoda. Para ello consideraron que Patellogastropoda posee grandes diferencias anatómicas y morfológicas con el Filogenia del género Fissurella Introducción 50 resto de los gasterópodos, y por lo tanto, debieran estar en el grupo Eogastropoda, y todos los demás gasterópodos en la subclase Orthogastropoda. Incluso se ha postulado que Patellogastropoda podría ser considerado un grupo independiente de los gasterópodos (Harasewich & McArthur, 2000). Tabla 6. Clasificaciones de Pulmonata. Bieler (1992)#. #: Tabla del trabajo original de Bieler (1992) Por el contrario, mediante análisis filogenético realizado con secuencias de un segmento del gen ADNr 18S, se infiere que no es posible sustentar la subclase Eogastropoda, aunque Patellogastropoda sí constituye un grupo monofilético (Harasewich & McArthur, 2000). En la misma línea de evidencias, las relaciones filogenéticas establecidas considerando la secuencia completa del gen ARNr 18S, no proporcionaron soporte estadístico que permitan sustentar la monofilia de los gasterópodos, destacando que los prosobranquios no se asocian en un solo grupo a diferencia de Euthyneura (Opistobranquios y Pulmonados) y Caenogastropoda (Meso y Neogastropoda), grupos en donde las especies se Alberto N. Olivares Paz, 2007 51 agrupan monofiléticamente; además el antiguo grupo Archaeogastropoda (Prosobranquia), incluye a Neritomorfos y Vetigastropodos (Winnepenninckx et al. 1996, 1998). La reconstrucción filogenética usando el gen ADNr 18S también permite confirmar la monofilia de Apogastropoda y de sus grupos Heterobranchia y Caenosgastropoda. Además, con secuencias del gen Citocromo oxidasa subunidad 1, las relaciones entre representantes de las familias del antiguamente denominado grupo Neogastropodos, respaldan la monofilia de este grupo, así como también la monofilia de Caenogastropodos y la de los Heterobranquios con sus respectivos sub grupos Opistobranquios y Pulmonados (Harasewych et al. 1997; Remigio & Hebert, 2003). II.3. Sistemática y filogenia de Vetigastropoda El suborden Vetigastropoda Salvini-Plawen, 1980 es una de las categorías con aceptación generalizada dentro de los gasterópodos, pero el número de taxones y el de especies comprendidos aún no se ha establecido con exactitud. Es un grupo muy numeroso que reúne a las especies asignadas por Thiele al grupo de Archaeogastropoda. Entre las superfamilias, se han considerado las siguientes: Pleurotomarioidea, Fissurelloidea, Trochoidea, Lepetodriloidea Scissurelloidea y Haliotiidea (Haszprunar, 1988), pero en Lindner (2000) las dos últimas han sido consideradas en la categoría de familia y junto con Pleurotomarioidae son agrupadas en la Superfamilia Pleurotomarioidea y además se incorpora a la superfamilia Seguenzioidea. En correspondencia con lo anterior, pareciera existir consenso en que las familias Pleurotomariidae, Fissurellidae, Trochidae, Haliotidae, Scissurellidae, Seguenziidae y Lepetodrilidae, corresponden al grupo de Vetigastropoda. Filogenia del género Fissurella Introducción 52 Adicionalmente, han sido mencionadas como parte del grupo Vetigastropoda las familias Neomphalidae, Peltospiridae, Anatomidae, Clypeosectidae, Lepetellidae, Phasianellidae, Stomatellidae, Sutilizonidae, Turbinidae, Gorgoleptidae, Pendromidae, Skeneidae, Trochaclididae, Cocculinidae. La mención de esta última familia es sorprendente porque es reconocida su posición en el superorden Cocculiniformia (Lindner, 2000; Lindberg & Ponder, 2001; Geiger & Thacker, 2005). Se considera, como carácter distintivo del grupo, la presencia de las estructuras sensoriales denominadas “bursículos ctenidiales”. Estos bursículos han sido identificados en algunos especímenes de Pleurotomariidae, pero no en los organismos de la familia Lepetodrilidae y Neomphlalidae. Las especies de la familia Cocculinidae carecen de branquias y en consecuencia no tienen las estructuras sensoriales y su posición dentro de Vetigastropoda es incierta (Ponder & Lindberg, 1997; Haszprunar, 1987; Sasaki, 1998, Voltzow et al. 2004). Diferentes caracteres morfológicos estructurales, han servido para estudiar la evolución de este grupo y de los gasterópodos. La más reciente hipótesis de filogenia considerando la cavidad paleal y sus estructuras, ha permitido inferir una asociación en monofilia de Vetigastropoda, (específicamente en base a las familias Pleurotomariidae, Fissurellidae, Trochidae, Haliotidae y Scissurellidae), y que cada familia es monofilética. La familia Fissurellidae y Scissurellidae se ubican en la posición basal de Vetigastropoda, en tanto que Trochidae se agrupa con Haliotidae en clado de monofilia y es el último en emerger a partir de un nodo común con Pleurotomariidae (Ponder & Lindberg, 1997). Sin embargo, los pleurotomaridos se consideran los gasterópodos más primitivos, porque poseen una rádula que tiene muy poco en común con los últimos gasterópodos fósiles, una concha enroscada asimétrica y presencia de órganos pares en la cavidad paleal (Golikov & Starobogatov, 1975; Taylor & Sohl, 1962). Alberto N. Olivares Paz, 2007 53 Por otra parte, los análisis de filogenia molecular en base a secuencias de uno o varios genes han sido antagónicos. En árboles obtenidos con secuencias de todo el gen nuclear ADNr 18S, las superfamilias del suborden Vetigastropoda (Pleurotomarioidea, Fissurelloidea, Haliotoidea y Trochoidea) forman unidades monofiléticas. La unidad Pleuorotomarioidea es la más basal y se separa de todas las demás a partir de un nodo común. Con posterioridad Haliotoidea y Trochoidea emergen como clados hermanos, dejando a Fissurelloidea en una posición inferior (Yoon & Kim, 2005). La relación de unidades hermanas entre Trochoidea y Haliotoidea también fue inferida en base a secuencias de un segmento del gen ADNr 28S y ambas se separan de Fissurelloidea. Estas tres unidades taxonómicas se asocian en monofilia, constituyendo el clado Vetigastropoda (Harasewych & McArthur, 2000). Además, la asociación de los vetigastropodos en un clado monofilético se detectó desde secuenciaciones provenientes de los genes histona H3, citocromo oxidasa subunidad 1 y dos segmentos de ARNr 18S. Los organismos de Pleurotomariidae, Haliotidae, Lepetodrolidae, Scissurellidae, y Fissurellidae se relacionan constituyendo las respectivas unidades monofiléticas de cada familia. Pleurotomariidae aparece como un grupo basal a partir del cual emergen los otros clados. El clado que ocupa la posición superior del árbol es Fissurellidae y podría ser considerado como el grupo más reciente de vetigastropodos (Geiger & Thacker, 2005). Por el contrario, la agrupación en monofilia no se ha constatado en estudios realizados con secuenciaciones de dos segmentos del gen ADNr 28S y uno de histona H3, ni utilizando los segmentos de cuatro genes (tres de ADNr 28S, histona H3, Citocromo oxidasa subunidad 1 y el pequeño nuclear ARN U2), debido a que Vetigastropoda puede formar dos agrupaciones y además establecer relaciones con otros grupos de invertebrados (Colgan et al. 2003, 2000). Filogenia del género Fissurella Introducción 54 II.4. Superfamilia Fissurelloidea II.4.A. Morfología Figura 4. Imágenes de conchas de diferentes géneros de la familia Fissurellidae. a: Medusafissurella salebrosa b: Nesta galapagensis c: Diodora graeca d: Emarginela hizardi e: Lucapinella limatula f: Laeviemarginula kimberi g: Puncturella cuculata h: Emarginula variegata i: Zeidora tasmanica j: Hemitoma octoradiata k: Cosmetalepas africana l: Amblychilepas scutella Los organismos de esta superfamilia poseen una concha dorsal tipo pateliforme con una abertura para el flujo del agua exhalante. La abertura es de Alberto N. Olivares Paz, 2007 55 varias formas y ocupa posiciones diferentes en la concha. Esta abertura puede ser una hendidura de extensión variable en el margen anterior de la concha, corresponder a un débil levantamiento al frente de la concha o bien un orificio en el ápice de la concha. También, en algunas especies en el lado interior de la concha desde el orificio se proyecta una lámina o septo vertical que la divide parcialmente en una pseudocámara anterior y posterior, o en otras se forma una placa horizontal. Estos aspectos estructurales de la concha son caracteres ampliamente considerados para definir el género (Figura 4). El cuerpo es simétrico, pero el manto y vísceras están torcidos. La concha no tiene enroscamiento y es bilateralmente simétrica. La simetría es una condición adquirida secundariamente después de la torsión, ya que durante su vida larvaria presentan una concha enroscada y plano de asimetría. Esta superfamilia está formada por cerca de 610 especies. Es el segundo grupo más numeroso contribuyendo con un 31% de especies al superorden Vetigastropoda, siendo superada solamente por Trochoidea que aporta un 50% de especies. II.4.B. Sistemática En la sistemática de Fissurelloidea existen algunas discrepancias entre los autores para establecer las denominaciones de las categorías comprendidas desde las familias hasta el género, como se puede constatar en la Tabla 7. Es frecuente que todos los géneros se mencionen adscritos a la familia Fissurellidae, en la que algunos géneros están representados por pocas especies y otros han logrado una mayor diversificación. Filogenia del género Fissurella Introducción 56 Tabla 7. Sistemática de Fissurellidae. Vaught (1989) y Lindner (2000). Referencia: Vaught, 1989 Lindner 2000 SUPERFAMILIA: Fissurelloidea Flemming, 1822 Fissurelloidea Flemming, 1822 FAMILIA: -------------- Clypeosectidae McLean, 1989 Género: ---------------- Clypeosectus McLean, 1989 Género: ---------------- Pseudorimula McLean, 1989 FAMILIA: Fissurellidae Flemming, 1822 Fissurellidae Flemming, 1822 Subfamilia: ------------- Scutinae Christians, 1973 Género: ---------------- Scutus Montfort, 1810 Subgénero: Nannoscutum Iredale, 1937 Subfamilia: ------------------- Hemitominae Kuroda, Habe & Oyama 1971 Género: ---------------- Hemitoma Swainson, 1840 Subgéneros: --------- Montfortia Recluz, 1843 ---------- Montfortista Iredale, 1929 Subfamilia: Fissurellinae Flemming, 1822 Fissurellinae Flemming, 1822 Género: Fissurella Brugiere, 1789 Mantiene categoría Subgéneros: Clypidella Swainson, 1840 Mantiene categoría Cremides H. & A. Adams, 1854 Mantiene categoría Género: Amblychilepas Pilsbry, 1890 Mantiene categoría Género: Cosmetalepas Iredale, 1924 Mantiene categoría Género: Dendrofissurella McLean & Kilburn, 1986 Mantiene categoría Género: Makroschisma Sowerby, 1839 Mantiene categoría Subgéneros: Dolichischisma Iredale, 1940 Mantiene categoría Foralepas Iredale, 1940 Mantiene categoría Género: Medusafissurella McLean & Kilburn, 1986 Mantiene categoría Género: Montfortula Iredale, 1915 Subgénero de Clypidina Género: Montfortulana Habe, 1961 Subgénero de Clypidina Género: Lucapina Sowerby, 1835 Género de Fissurellidin Subfamilia: Diodorinae Wenz, 1938 Diodorinae Wenz, 1938 Género: Diodora J.E. Gray, 1821 Mantiene categoría Subgéneros: -------- Atractotrema Cossmann, 1888 Austroglyphis Cotton & Godfrey, 1934 Mantiene categoría Elegidion Iredale, 1924 Mantiene categoría Fissuridea Swainson, 1840 Mantiene categoría Género: Megathura Pilsbry, 1890 Mantiene categoría Género: Stromboli Berry, 1954 Mantiene categoría Subfamilia: Fissurellidinae Pilsbry, 1890 Fissurellidinae Pilsbry, 1890 Género: Fissurellidea D´Orbigy ,1841 Mantiene categoría (sin. Megatebennus Pilsbry, 1890) ----------------- Género: Leurolepas McLean, 1970 Mantiene categoría Género: De familia Fissurellidae Lucapina Sowerby, 1835 Género: Lucapinella Pilsbry, 1890 ----------------- Género: Pupillaea Gray in Sowerby, 1835 ----------------- Género: Buchanania Lesson, 1830 ----------------- Alberto N. Olivares Paz, 2007 57 Subfamilia: Emarginulinae J.E. Gray, 1834 Emarginulinae J.E. Gray, 1834 Género: Emarginula Lamarck, 1801 Mantiene categoría Subgéneros: ------ Notomella Cottton, 1957 Semperia Crosse, 1867 Mantiene categoría Subzeidora Iredale, 1924 Mantiene categoría Género: Clypidina J.E. Gray, 1847 Mantiene categoría Subgéneros: ------ Montfortula Iredale, 1915 ------ Montfortulana Habe, 1961 Género: Emarginella Pilsbry, 1891 Mantiene categoría Género: Fissuripepta G. Seguenza, 1862 Mantiene categoría Género: Hemitoma Swainson, 1840 ---------------- Subgéneros: Montfortia, Réc Luz, 1843 ---------------- Montfortista Iredale, 1929 ---------------- Género: Laeviemarginula Habe in Kuroda, 1953 Mantiene categoría Género: Nesta H.Adams, 1870 Mantiene categoría Sugénero: Laevinesta Pilsbry &McGinty, 1952 ---------------- Género: Entomella Cotton, 1945 ---------------- Género: Notomella Cotton, 1957 Mantiene categoría Género: Puncturella Lowe, 1827 Mantiene categoría Subgéneros: Cranopsis A. Adams, 1860 Mantiene categoría Rimulanax Iredale, 1924 Mantiene categoría Rixa Iredale, 1924 Mantiene categoría Vacerrena Iredale, 1958 Mantiene categoría Género: Rimula Defrance, 1827 Mantiene categoría Género: ------------ Scelidotoma McLean, 1966 Género: Scutus Monfort, 1810 ---------------- Subgénero. Nannoscutum Iredale, 1937 ---------------- Género: Tugali J.E. Gray, 1843 Mantiene categoría Subgéneros:Parmophoridea Wenz, 1938 ---------------- Tugalina Habe in Kuroda, 1953 ---------------- Género: Zeidora A. Adams, 1860 Mantiene categoría Nota: A diferencia de lo anterior, McLean, (1984) considera a Fissurellidae conformado por las subfamilias Emarginulinae y Fissurellinae y en el género Fissurella distingue los subgéneros Fissurella y Cremides. Las aproximadamente 600 especies quedan circunscritas mayoritariamente a cuatro géneros: Diodora 20%, Emarginula 19%, Fissurella 14% y Puncturella un 13% de las especies. Los géneros Megathura, Laeviemarginula, Lucapinella, Nesta comprenden menos del 3% del total y los otros géneros, porcentajes inferiores al 2% de las especies (Millard, 1997; bases on line: ANSP; SOMBASE; Western Atlantic Gastropod Database). Filogenia del género Fissurella Introducción 64 F. costata Lesson, 1831; F. picta (Gmelin, 1791); F. radiosa Lesson, 1831; F. oriens Sowerby, 1835 y F. nigra Lesson, 1831. De este grupo F. nigra, F. oriens, F. picta y F. radiosa son las únicas especies que pertenecen a la provincia Magallánica y las restantes a la Peruana. c. Grupo de F. limbata: las especies tienen una concha relativamente grande y el grosor de la capa externa excede al de la interna. Carece de costillas secundarias. Las primarias pueden ser bajas y amplias con aspecto de muy bajas ondulaciones o estar ausentes. Las especies de este grupo son F. limbata Sowerby, 1835; F. crassa Lamarck, 1822; F. bridgesii Reeve, 1849 y F. pulchra Sowerby, 1835. Todas estas especies corresponden a la Provincia Peruana. Cabe destacar que la identificación y denominación actual de las especies de Fissurella, no ha sido contrastada con ningún estudio complementario que permita dar nuevas evidencias para sustentar la validez del estado taxonómico de las especies descritas. No obstante, en recientes análisis de la ultraestructura de espermatozoides de las especies F. latimarginata, F. cumingi y F. crassa se mencionan diferencias en el tamaño y forma del núcleo, en el número de mitocondrias (5 o 6 en la pieza media), y componentes del acrosoma (en particular la zona subacrosómica con contenido variable de densidad electrónica), a los cuales se les menciona como caracteres de valor taxonómico (Collado & Brown, 2003; 2005). Estas diferencias al nivel de ultramicroscopía son mínimas y podrían representar variabilidades intraespecíficas en vez de interespecíficas, al igual que los caracteres macroscópicos de la concha los cuales, como se ha reseñado, tienen un gran componente de subjetividad. Alberto N. Olivares Paz, 2007 65 III.3. Antecedentes biológicos de Fissurella III.3.A. Taxonomía A los organismos pertenecientes al género Fissurella que habitan en el Pacífico Sudoriental, se les ha asignado la siguiente posición taxonómica: Reino: Animalia Linnaeus, 1758 Subreino: Bilateria (Hatschek, 1888) Cavalier-Smith, 1983 Superfilo: Eutrochozoa Filo: Mollusca Cuvier, 1795 Subfilo: Adenopoda Salvini-Plawen, 1971 Superclase: Conchifera Gegenbaur, 1878 Clase: Gastropoda Cuvier, 1797 Subclase: Orthogastropoda Ponder & Lindberg, 1996 Orden: Archaeogastropoda, Thiele, 1925 Suborden: Vetigastropoda Salvini-Plawen, 1980 Superfamilia: Fissurelloidea Fleming, 1822 Familia: Fissurellidae Fleming, 1822 Subfamilia: Fissurellinae Fleming, 1822 Género: Fissurella Brugière, 1789 Subgénero: Fissurella Brugière, 1789 Grupo de F. peruviana Especie: Fissurella peruviana Lamarck, 1822 Grupo de F.maxima Especie: Fissurella maxima Sowerby, 1835 Fissurella latimarginata Sowerby, 1835 Fissurella cumingi Reeve, 1835 Fissurella costata Lesson, 1831 Fissurella nigra Lesson, 1831 Fissurella picta (Gmelin, 1791) Fissurella radiosa Lesson 1835 Fissurella oriens Sowerbuy, 1835 Grupo de F. limbata Especie: Fissurella limbata Sowerby, 1835 Fissurella crassa Lamarck, 1822 Fissurella bridgesii Reeve, 1849 Fissurella pulchra Sowerby, 1835 Filogenia del género Fissurella Introducción 66 Aspectos de la morfología corporal y de la concha de algunas especies de Fissurella se muestran en la Figura 5. Alberto N. Olivares Paz, 2007 67 Figura 5. Imágenes de especies representativas del género Fissurella: a: F. crassa, b: F. limbata, c: F. maxima, d: F. cumingi, e: F. pulchra, f: F. costata, g: F. latimarginata, h: F. picta, i: F. nigra. Filogenia del género Fissurella Introducción 68 III.3.B. Distribución Las especies consideradas se distribuyen exclusivamente en la zona del Pacífico Sudoriental desde la provincia biogeográfica Peruviana a la provincia Magallánica, conviviendo en simpatría en la zona bentónica del litoral rocoso. McLean (1984) menciona la distribución latitudinal para cada especie, destacando que 4 especies son exclusivas de la provincia Magallánica y que existiría una zona intermedia en la que coexisten las 13 especies. El rango de distribución para cada una de ellas se muestra esquemáticamente en la Figura 6 y es el siguiente: F. bridgesii: esta especie se distribuye entre Isla Guanape, Perú (8º 32’ S) hasta el río Bío Bío, Concepción, Chile (36º 48’ S). F. costata: la distribución de la especie está dentro de los límites de Chile, comprendidos desde Punta Pichalo, Tarapacá (19º 36’ S) hasta Guabun, Isla de Chiloé (41º 50’ S). Oliva y Castilla (1992), extienden la distribución un poco más al sur, hasta la localidad de Ahuenco, en la Isla de Chiloé (42º 06’ S). F. crassa: se localiza desde Haurmey, Perú (10º 06’ S) hasta Punta Pulga, Isla de Chiloé, Chile (42º 06’ S). F. maxima: su distribución es tan extensa como la mayoría de las otras especies de la Provincia Peruviana. Generalmente se distribuye desde Huarney, Perú (10º 06’ S) hasta la localidad de Lirquén, Chile (36º 41’ S). F. latimarginata: se encuentra distribuída desde Chiclayo, Perú (6º 47’ S) hasta la zona del río Bío Bío, Chile (36º 48’ S). F. limbata: la distribución de esta especie comprende desde la Isla Guanape, Perú (8º 30’ S) hasta aproximadamente la Isla de Chiloé, Chile (41º 50’ S). F. pulchra: se halla desde Salaberry, Perú (8º 14’ S) hasta la desembocadura del río Bío Bío, Chile (36º 48’ S). Alberto N. Olivares Paz, 2007 69 F. peruviana: se distribuye desde Chiclayo, Perú (6º 47’ S) hasta el noreste de la Isla de Chiloé (41º 50’ S). Sin embargo, McLean restringe el rango a un espacio menor comprendido entre Isla Guanape, Perú (8º 32’ S) y el río Bío Bío, Chile (36º 48’ S). Figura 6. Esquema de la distribución de las especies de Fissurella en la región del Pacífico Sudoriental. Filogenia del género Fissurella Introducción 70 F. cumingi: el rango de distribución de esta especie está comprendido entre Matamari, Perú (17º S) y Mehuin, Valdivia, Chile (39º 23’ S). F. picta: especie que en el Pacífico se distribuye entre el Islote Concón, Valparaíso, Chile (32º 52’ S) hasta Tierra del Fuego y se continúa por el Atlántico hasta la Isla de los Estados, Argentina (55º S). La subespecie F. picta picta se encuentra entre la Isla de Chiloé (41º 50’ S) y la región de Magallanes (56º S), Chile. F. radiosa: se halla distribuida desde el Golfo Corcobado, al este de la Isla de Chiloé (42º 42’ S, 72º 52’ W) a Tierra del Fuego (55º S) y por el Atlántico en dirección al norte de Argentina hasta Golfo de San Matías (42º S). La subespecie F. radiosa tixierae es característica de la Provincia Magallánica Argentina (42º S). F. oriens: se encuentran desde el Islote Concón, Chile (32º 52’ S) hasta Tierra del Fuego. La subespecie F. oriens fulvescens desde la proximidad de Valparaíso hasta Concepción y F. oriens oriens desde Mehuin al Sur de Chile. F. nigra: especie con distribución comprendida entre Valparaíso, Chile (33º 02’ S) y Puerto Grandi al sur de la Isla Navarino (55º 12’ S), pero frecuentemente se encuentra entre Concepción, Mehuin y Chiloé. III.3.C. Hábitat Es conocido que las especies que ocupan áreas territoriales comunes se distribuyen el hábitat para evitar la competencia entre ellas. Los estudios realizados en Fissurella han permitido determinar que las características generales del hábitat para cada una de las especies son las siguientes: F. bridgesii: habita frecuentemente en la zona intermareal inferior y sublitoral superior hasta 2 m de profundidad. Se encuentra en sustrato rocoso próximo a playas de arena. Sobre las rocas también habitan otras especies como Stichaster striatus Muller y Troscell, 1840; Balanus laevis Bruguiére, 1789 y Alberto N. Olivares Paz, 2007 71 Chthamalus scabrosus Darwin, 1854. En primavera también se encuentra Concholepas concholepas Bruguiére, 1789 (Bretos, 1979). F. costata: se encuentra ocupando las superficies verticales de las rocas expuestas al oleaje durante la marea baja, cerca de la línea ocupada por el alga café Lessonia. En algunas localidades F. costata comparte el área rocosa con otras especies de Fissurella (McLean, 1984). F. crassa: vive en toda la extensión del área intermareal rocosa comprendida entre Chthamalus y el cinturón de Lessonia. En Chile Central cohabita con F. limbata (Bretos, 1978; 1980a; 1980b) y en el norte de Chile (23º 30’S - 23º 50’S) coexiste con F. limbata, F. cumingi y F. maxima habitando en Pyura praeputialis, ascidia que coloniza el intermareal rocoso y pozas submareales (Castilla et al. 2004). F. cumingi: habita sobre la superficie de las rocas de la zona intermareal baja y la submareal adyacente hasta profundidades de 15 m. Es frecuente que se encuentre compartiendo un espacio común con F. latimarginata (McLean, 1984). También, habita en Pyura praeputialis, ascidia que coloniza las rocas del intermareal medio (Castilla et al. 2004) F. limbata: se halla en la zona comprendida entre el intermareal medio e intermareal bajo, en área cubierta con algas pardas y expuesta al suave oleaje (Mclean, 1984). En esta misma zona utiliza el hábitat que ofrece Pyura praeputialis (Castilla et al. 2004). F. maxima: habita en áreas rocosas que quedan expuestas parcialmente durante la marea baja. Vive en la zona comprendida entre el intermareal inferior y la submareal alta, bajo las frondas y en los alrededores del alga parda Lessonia sp. (Bretos, 1982; Bretos et al. 1983; McLean, 1984). Castilla et al. (2004), mencionan que en el intermareal y submareal también habita sobre la ascidia Pyura praeputialis. Filogenia del género Fissurella Introducción 72 F. nigra: comúnmente habita en la zona intermareal, sobre la superficie lateral de las rocas ubicadas entre la franja intemareal media y la intermareal baja. También, en la franja intermareal habita en zonas debajo de cantos rodados y en las grietas que quedan entre ellos (McLean, 1984; Oliva & Castilla, 1992). F. oriens: se localiza principalmente en la zona sublitoral, extendiéndose hasta el intermareal bajo. En algunos sitios a profundidades de 10 m sobre rocas cercanas a la interfase roca – arena (McLean, 1984). F. pulchra: Bretos & Chihuailaf (1990) observaron que habita en la zona intermareal inferior y el sublitoral superior, de preferencia entre 1 a 4 m (aunque en ocasiones ha sido extraída desde 20 m) de profundidad, sobre rocas, en grietas u oquedades de las rocas, compartiendo su hábitat con las especies F. latimarginata, F. cumingi y en ocasiones con F. maxima y F. costata. También, comparten el hábitat con los invertebrados Balanus laevi Bruguieri, 1789, Chthamalus scabrosus Darwin, 1854, Austromegabalanus psittacus (Molina, 1782) y Concholepas concholepas. Los juveniles se encuentran en la zona intermareal inferior o en pozas bajas cercanas al cinturón inferior de macroalgas con abundantes algas coralinas incrustantes. F. peruviana: preferentemente habita en la zona submareal y ocasionalmente en la intermareal baja, sobre las rocas. En algunas áreas (norte de Chile) vive a 20 m, en los sustratos rocosos ocupados por el bivalvo Aulacomia ater (McLean, 1984; Guzmán et al. 1998) F. picta: habita las plataformas rocosas de la zona intermareal media a inferior, sobre las superficies horizontales y verticales. Comparte el hábitat con F. costata y F. crassa y con otros invertebrados como: Balanus laevis Bruguieri, 1789, Perumytilus purpuratus (Lamarck, 1819), Phymactis clematis Drayton, 1846, Chiton granosus Frembly, 1827, Piura Chilensis Molina, 1784, Tegula atra (Lesson, 1830), y Concholepas concholepas (Bruguiere, 1789) y Alberto N. Olivares Paz, 2007 73 con las algas Ulva lactuca (L., 1752), Porphyra columbina (Montagne, 1845), Iridaea laminarioides Bory, 1826 y Macrocystis pyrifera (Linnaeus) C. Agardh 1820 (Bretos et al. 1988a; Oliva & Castilla, 1992). F. latimarginata: los individuos juveniles (10-30mm) se localizan en la zona intermareal inferior, en pozas de nivel bajo, o en grietas de las rocas cubiertas por cirripedios del género Chthamalus. Los adultos habitan en la zona submareal rocosa, desde el margen situado por debajo de las frondas del alga parda Lessonia trabeculata hasta profundidades de 10 m, aunque ocasionalmente se les ha capturado a 15 m de profundidad. F. latimarginata suele compartir el hábitat con F. cumingi y es frecuente encontrar mezcladas a las dos especies. También, se puede encontrar en el mismo hábitat a F. pulchra. El sustrato donde habita está cubierto generalmente por algas coralinas e incrustantes lithothamniodes. También están presentes las algas Gelidium chilense, Callophyllis sp., Colpomenia sp., Ulva lactuca y Macrocystis integrifolia. Otros invertebrados que comparten el hábitat son: Balanus laevis Bruguieri, 1789, Concholepas concholepas (Bruguière, 1789), Tetrapygus niger (Molina, 1782), Tegula atra (Lesson, 1830), Stichaster striatus Muller y Troscell, 1840 y Heliaster helianthus (Lamarck, 1816), el cual es predador de las lapas (Olivares et al. 1998). F. radiosa: ocupa la zona intermareal más profunda y en pozas hasta los 20 m de profundidad (McLean, 1984). III.3.D. Alimentación Los grandes gasterópodos, herbívoros generalistas, alteran la abundancia y composición en especies de algas modificando la estructura de las comunidades intermareales. El conocimiento de los hábitos alimenticios es esencial para comprender la posición trófica de la especie y sus interacciones con otros organismos del área en que habita (Moreno & Jaramillo, 1983; Jara & Filogenia del género Fissurella Introducción 80 Tabla 11. Relaciones entre dimensiones de la concha en especies de Fissurella. Especie ACv/s LC AlC v/s LC Autor F. pulchra AC=0,693LC–1,302 AlC=0,269LC –2,958 Bretos & Chihuailaf (1990) F. bridgesii AC=0,606LC+0,941 AlC=0,271LC –2,303 Bretos (1979) F. maxima AC=0,662LC+0,462 AlC=0,354LC –8,492 Bretos (1982) LT=(AN/0,632)0,991 LT=(AT–0,007)/0,239 Oliva & Castilla (1992) F. picta AC=0,748LC–0,966 AlC=0,389LC –2,404 Bretos et al. (1988a) LT=(AN/0,685) 0,966 LT=(AT/0,252) 0,855 Oliva & Castilla (1992) F. latimarginata AN=0,68LC+0,63 AT=0,264LT–6,032 Acuña (1977) LT=(AN/0,425)0,794 LT=(AT/0,143)0,771 Oliva & Castilla (1992) AC=0,687LC–0,875 AlC=0,167LC +1,712 Olivares et al. (1998) F. limbata LT=(AN/0,566) 0,903 LT=(AT/0,254) 0,965 Oliva & Castilla (1992) F. costata LT=(AN/0,693) 0,935 LT=(AT/0,280) 0,943 Oliva & Castilla (1992) F. crassa LT=(AN/0,529) 0,958 LT=(AT/0,200) 0,978 Oliva & Castilla (1992) F. cumingi LT=(AN+0,492)/0,761 LT=(AT+0,582)/0,358 Oliva & Castilla (1992) F. nigra LT=(AN/0,622) 0,963 LT=(AT/0,203) 0,838 Oliva & Castilla (1992) Tabla 12. Relaciones de dimensiones del orificio apical con la concha. Especie LOA v/s LC AOA v/s LC Autor F. pulchra LOA=0,136LC+1,112 AOA=0,075LC–0,362 Bretos & Chihuailaf (1990) F. bridgesii LOA=0,113LC+0,623 AOA=0,055LC+0,606 Bretos (1979) F. maxima LOA=0,087LC+0,805 AOA=0,078LC–1,619 Bretos (1982) LT=(LO/0,188) 1,493 LT=(AO/0,042) 0,867 Oliva & Castilla (1992) F. picta LOA=0,106LC–0,389 AOA=0,051LC–0,282 Bretos et al. (1988a) LT=(LO/0,135) 1,174 LT=(AO/0,014)0,588 Oliva & Castilla (1992) F. latimarginata LT=(LO/0,218)1,522 LT=(AO/0,042)0,916 Oliva & Castilla (1992 LOA=0,101LC+1,697 AOA=0,049LC+0,405 Olivares et al. (1998) F. limbata LT=(LO/0,189) 1,266 LT=(AO+0,06)/0,063 Oliva & Castilla (1992) F. costata LT=(LO/0,123) 1,269 LT=(AO/1,352)1,965 Oliva & Castilla (1992) F. crassa LT=(LO/0,316) 1,403 LT=(AO/0,106)1,567 Oliva & Castilla (1992 F. cumingi LT=(LO–0,247)/0,07 LT=(AO/0,049)0,883 Oliva & Castilla (1992 F. nigra LT=(LO/0,172) 1,087 LT=(AO/0,061)0,847 Oliva & Castilla (1992 Alberto N. Olivares Paz, 2007 81 Tabla 13. Relaciones entre el largo y peso de las partes del cuerpo del animal. Especie PT PC PA PP Autor F. pulchra 0,000238LC2,934 0,00003057LC3,168 0,000242LC2,834 0,000294LC2,648 1 F. maxima 0,000251LC2,884 0,00011910LC2,881 0,000129LC2,89 1 A (LT/0,694)0,740 (PC/0,056)0,334 (PSC/0,087)0,333 (PP/0,088)0,353 4 F. picta 0,000109LC3,029 0,00002930LC3,191 0,000122LC2,819 2A (LT/0,764)0,734 (PC/0,081)0,341 (PSC/0,049)0,334 (PP/0,043)0,348 4 F. latimar 0,000122LC3,020 0,00004902LC2,962 0,000127LC2,89 0,000097LC2,824 3 ginata (LT/0,917)0,762 (PC/0,018)0,292 (PSC/0,087)0,337 (PP/0,068)0,343 4 0,000101LC3,038 0,00001262LC3,346 0,0001985LC2,278 5 F. limbata (LT/0,541)0,711 (PC/0,054)0,329 (PSC/0,123)0,362 (PP/0,102) 0,378 4 F. costata (LT/0,813)0,753 (PC/0,045)0,305 (PSC/0,028)0,304 (PP/0,015)0,296 4 F. crassa (LT/0,481)0,698 (PC/0,046)0,337 (PSC/0,177)0,366 (PP/0,130)0,378 4 F. cumingi (LT/0,583)0,713 (PC+35,62)/7,705 (PSC+35,77)/8,96 (PP/0,065)0,347 4 F. nigra (LT/0,727)0,725 (PC/0,028)0,293 (PSC/0,067)0,342 (PP/0,074)0,366 4 Autor: 1: Bretos & Chihuailaf, (1990); 1A: Bretos, M. (1982); 2A: Bretos, et al (1988a) ;3: Olivares et al. (1998); 4: Oliva & Castilla (1992); 5: Acuña, 1977 IV. Fissurella como recurso IV.1. Durante el Holoceno Desde tiempos prehistóricos la zona costera de Chile ha sido explotada. Los primitivos habitantes formaron pequeñas agrupaciones que se establecieron en aquellos sitios que ofrecían condiciones adecuadas y mínimas para la subsistencia; una de ellas, y quizás la primordial, fue la posibilidad de obtener los alimentos mediante la captura y recolección de los recursos existentes en el litoral marino. Las evidencias de la actividad marina desarrollada por los grupos indígenas han quedado testimoniadas en los restos de los diferentes asentamientos con numerosos conchales, que nos permiten conocer cómo se Filogenia del género Fissurella Introducción 82 vivía en el pasado y que se han conservado en algunos lugares del litoral (Álvarez, 2004; Báez et al. 2004; Standen et al. 2004). Estudios de estos vestigios, realizados por diferentes autores, han permitido establecer una reseña focalizada hacia la utilización de los recursos marinos. Con especial énfasis se resalta la incorporación de los moluscos en general, y en particular los del género Fissurella, como uno de los medios de subsistencia. Los grupos humanos de Chile, desde el Holoceno temprano y hasta el Holoceno tardío, desarrollaron un modo de vida denominado arcaico, sustentado en una economía de recolección, pesca y caza. No obstante, los mariscos fueron los primeros recursos explotados, por encontrarse en abundancia, ser fáciles de recolectar y requerir de técnicas menos especializadas en comparación con la pesca. El período Arcaico ha sido datado entre 11.000 y 3.000 AP y ha sido subdividido en Arcaico temprano, medio y tardío (Llagostera, 1989). En el norte de Chile, durante el Arcaico temprano (ca. 10.500 - 7.000 AP), las primeras ocupaciones humanas ocurrieron en el sitio de Acha (ca. 18º 30’ S, 70º 17’ W) alrededor de 9.000 AP, Tiliviche (ca. 9.500 AP) y Aragón (ca. 8.500 AP). Los dos últimos sitios ubicados a 40 km de la costa, hacia el interior (ca. 19º 32’ S, 69º 57’ W). En el sitio costero de Acha, numerosos restos de fauna ponen de manifiesto la recolección de recursos marinos, básicamente los de la zona intermareal rocosa, tales como los moluscos Concholepas concholepas, Thais chocolata, F. crassa, F. latimarginata y F. maxima. De las dos últimas especies, en la Figura 7 se muestran conchas encontradas en el sitio Acha 2 (Vilaxa & Corrales, 1993). En el sector de Camarones (ca. 19º 11’ S, 70º 17’ W), los bioindicadores muestran una variada explotación de recursos, destacándose entre los marinos aquellos moluscos que habitan sustratos arenosos y rocosos como C. concholepas y Fissurella sp. (Chacama & Muñoz, 2001; Standen et al. 2004). Alberto N. Olivares Paz, 2007 83 Figura 7. Conchas de Fissurella proveniente de fogones en campamento Acha – 2 (7.000 a.C.). a: Fissurella maxima, b: Fissurella latimarginata. En la quebrada de Tiliviche a 40 Km de la costa, la estratigrafía, revela un aumento del consumo de mariscos entre 9.760 ± 365 y 4.995 AP, destacando entre otros: Aulacomya ater, C. concholepas, Crepidula sp, Acanthopleura echinata y en menor proporción F. crassa, que aparece 6.900 AP (Nuñez & Hall, 1982). En el complejo cultural Huentelauquén (Los Vilos, ca. 31º 54’ S, 71º 30’ W), los restos atestiguan algunas de las más tempranas evidencias de la utilización de los recursos marinos en la costa semiárida de Chile. Los pobladores establecidos en los asentamientos de Punta Purgatorio (10.040 ± 70 AP) y Punta Ñague (10.180 ± 80 AP) se dedicaron a la extracción de moluscos de arena y de roca, especialmente Eurhomalea rufa, Mesodesma donacium, C. concholepas y las lapas Fissurella sp (Jackson, 1993; Jackson et al. 1999; Seguel, 2001; Báez et al. 2004). En la misma localidad, el sitio arqueológico Punta Penitente (8.600 ± 70 – 2.160 ±100 AP), reveló que las poblaciones Filogenia del género Fissurella Introducción 84 humanas asentadas en esta área entre el Holoceno temprano y Holoceno tardío fueron recolectoras y que entre otros recursos marinos explotaron los moluscos placóforos pertenecientes a los géneros Chiton y Acanthopleura y los gasterópodos Concholepas, Tegula, Acanthina y Fissurella (Méndez, 2002). En la zona central de Chile, provincia de Cauquenes ca. 53º 58’ S, 72º 21’ W, en los asentamientos arcaicos (5.410 AP), los depósitos de los recursos comprometidos en la subsistencia, muestran que sus habitantes tuvieron un acceso estable y continuo a la fauna malacológica del intermareal rocoso y arenoso. Se encontraron restos malacológicos correspondientes al menos a 16 especies y géneros entre los cuales también figura Fisurella sp. Entre los años 975-1390 d.C. las poblaciones que habitaron parte del litoral de la Provincia de Cauquenes, se beneficiaron de diferentes moluscos como F. maxima y Fissurella sp. y otros recursos submareales que extraían mediante buceo apoyados con embarcaciones y equipamiento tecnológicamente simple (Sánchez & Gaete, 1994). El poblamiento temprano de la costa de la Araucanía, sur de Chile, entre el Bío Bío (36º 48’ S, 73º 08’ W) y el canal de Chacao (41º 49’ S, 73º 32’ W), habría ocurrido entre 10.000 y 7.000 AP período que se mantiene sin documentar ya que los probables sitios de asentamientos actualmente se encuentran sumergidos. Durante el período Arcaico medio, comprendido entre 7.000 y 5.000 AP y el tardío, los habitantes ejercieron una actividad dedicada a la colecta de recursos entre los que se incluye los fisurélidos F. picta, F. crassa y F. nigra (Quiroz & Sánchez, 2004). El sitio arqueológico Monumento Nacional Conchal Piedra Azul (ca. 41º 30’ S, 72º 58’ W) fue habitado por grupos humanos con tradición de canoeros cazadores, pescadores y recolectores. La colecta se realizó extrayendo moluscos que habitaban tanto en sustratos blandos como en sustratos duros de la zona intermareal. En el caso específico de los fisurélidos, las especies Alberto N. Olivares Paz, 2007 85 F. bridgesii, F. latimarginata, F. nigra, F. picta y F. limbata, aparecen presentes como recurso utilizado aproximadamente entre 7.000 y 5.000 AP (Gaete et al. 2004). IV.2. En el período actual Con posterioridad a la época Arcaica y a lo largo del extenso litoral chileno, se establecieron numerosos sitios de pescadores que, poseedores de mejoradas técnicas de extracción y equipamiento, para la recolección, pesca y navegación; le han permitido ampliar el margen y eficiencia de la explotación de la costa en las dimensiones longitudinal, batitudinal y latitudinal (Llagostera, 1989). Este legado cultural, basado en el establecimiento de grupos pequeños dedicados a la pesquería extractiva, ha persistido hasta nuestros días. Actualmente hay reconocidos 558 asentamientos pesqueros, conocidos como “caletas”, de las cuales el 80% son del tipo rural. Las caletas cobijan aproximadamente a 40.000 pescadores, oficialmente registrados, quienes forman parte de la denominada pesquería artesanal. Los especímenes actualmente explotados y comercializados artesanalmente son peces, ascidias, crustáceos, equinodermos y los moluscos del tipo cefalópodos, bivalvos, poliplacóforos y gasterópodos (SERNAPESCA, 2006). Los especímenes de Fissurella, exceptuando F. peruviana, que habitan la costa de Chile son algunos de los de mayor tamaño conocidos dentro del género y por ello son muy apetecidos por el público consumidor. Se ha postulado que las aguas relativamente frías de la zona litoral, debido a la corriente de Humboldt, y la disponibilidad de algas para la alimentación favorecerían los procesos fisiológicos que les permiten alcanzar un gran tamaño (Bretos, 1978; Bretos & Chihuailaf, 1990). De las 13 especies identificadas por McLean (1984); 10 de ellas (F. latimarginata, F. cumingi, F. pulchra, F. bridgesii, F. costata, F. nigra, F. picta, F. maxima, F. crassa y F. limbata) forman una pesquería multiespecífica, Filogenia del género Fissurella Introducción 86 con la denominación genérica Fissurella spp. (Bretos, 1988). Las especies F. oriens y F. radiosa también son extraídas esporádicamente, pero destinadas al consumo familiar. En tanto que F. peruviana no se extrae ni para fines de consumo ni para comercialización debido a su pequeño tamaño que no supera los 31mm. La carencia de normas administrativas para la regulación de la extracción de lapas y la restricción pesquera establecida sobre otros moluscos, en especial de C. concholepas, provocó el desplazamiento del esfuerzo pesquero hacia las especies de Fissurella, consideradas como el sustituto adecuado para ocupar el espacio de mercado generado por C. concholepas. En las estadísticas oficiales chilenas del año 1978, se reporta por primera vez un registro de 25 toneladas (anual) de extracción de Fissurella y desde entonces se ha señalado un aumento sostenido en los registros anuales de los desembarques pesqueros para este recurso. Entre los años 1991 y 2003, el desembarque anual osciló de 2.000 a 6.000 toneladas, en el año 2004 alcanzó un máximo de 12.851 toneladas y en el año 2005 desciende a 2.003 toneladas. Estas capturas corresponden a un porcentaje promedio anual de 69 ± 38 %, respecto al total de gasterópodos colectados, en el mismo lapso de tiempo. En la Figura 8 se muestran las fluctuaciones anuales del desembarque y de los porcentajes relativos a gasterópodos, los cuales fueron elaborados a partir de las cifras mencionadas en los anuarios estadísticos de SERNAPESCA (2000, 2006). A partir del año 2000 menos del 4% del desembarque pesquero se ha desglosado con las denominaciones vernaculares de lapa negra, reina y rosada, las cuales corresponden a las especies F. latimarginata, F. maxima y F. pulchra o F. cumingi, respectivamente (SERNAPESCA, 2003; Osorio, 2002; Bretos, 1988). Alberto N. Olivares Paz, 2007 87 0 2 0 4 0 6 0 8 0 Porcentaje anual del desembarque de Fissurella spp. en relación a gasterópodos 0 4 0 0 0 8 0 0 0 12 0 0 0 16 0 0 0 2 0 0 0 0 Desembarque anual de gasterópodos 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 10 0 0 0 12 0 0 0 14 0 0 0 Año s Desembarque anual de Fissurella spp. 0 2 0 4 0 6 0 8 0 Porcentaje anual del desembarque de Fissurella spp. en relación a gasterópodos 0 2 0 4 0 6 0 8 0 Porcentaje anual del desembarque de Fissurella spp. en relación a gasterópodos 0 4 0 0 0 8 0 0 0 12 0 0 0 16 0 0 0 2 0 0 0 0 Desembarque anual de gasterópodos 0 4 0 0 0 8 0 0 0 12 0 0 0 16 0 0 0 Toneladas Porcentaje Toneladas Promedio 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 2 0 0 0 0 Desembarque anual de gasterópodos 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 10 0 0 0 12 0 0 0 14 0 0 0 Año s Desembarque anual de Fissurella spp. 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 10 0 0 0 12 0 0 0 14 0 0 0 Año s Desembarque anual de Fissurella spp. Figura 8. Promedio anual de desembarque de Fissurella y su relación con el total de gasterópodos. Las distinciones entre las especies están fundamentadas en caracteres morfológicos, morfométricos y patrones de coloración de la concha, del pie, del manto y la cabeza, los cuales, a veces, suelen ser parecidos entre Filogenia del género Fissurella Introducción 88 organismos de especies diferentes (McLean, 1984; Oliva & Castilla, 1992, Guzmán et al. 1998). Además, los caracteres distintivos están con frecuencia enmascarados o deteriorados por los organismos epibiontes y normalmente la coloración del cuerpo se pierde después que el organismo ha sido extraído (Olivares et al. 1998). En consecuencia, la mayoría de los consumidores tiene dificultades o no sabe distinguir las diferentes especies, en el momento de adquirirlas como producto fresco entero o, más aún, como desconchado eviscerado. Sin embargo, las capturas mayoritariamente se destinan a la industria pesquera, la cual procesa el pie muscular en la forma de fresco refrigerado, congelado y en conserva (Osorio, 2002). El procesamiento industrial provoca la pérdida total de los caracteres de las especies y resulta imposible la distinción. El consumidor tiene preferencias particulares por algunas especies, respecto de otras, ya sea por el rendimiento de carne, consistencia o cualidades organolépticas del pie muscular. Ello ha intensificado la extracción de aquellas especies más apetecibles e, indirectamente, ha conllevado a expender suplantando el nombre de las lapas de mayor aprecio por el particular comprador; sobre todo teniendo en consideración que la mayoría de la población identifica a los ejemplares según nombres vernaculares, los cuales suelen variar entre distintas localidades y más aún para una misma especie entre localidades distintas. Actualmente, no existen normas que permitan controlar la identidad del producto que se comercializa, ni tampoco se han establecido metodologías que permitan reconocer la autenticidad de los productos presentes en el mercado. La intensiva, sostenida y selectiva actividad pesquera ha desatado una sobreexplotación de las especies, con el resultado de que en todas ellas, la talla máxima y el tamaño promedio de los especímenes extraídos, ha ido disminuyendo notoriamente. Otras especies están siendo drásticamente Alberto N. Olivares Paz, 2007 89 mermadas y en algunas localidades ciertas especies ya no se encuentran (Bretos, 1988; Olivares et al. 1988; Oliva & Castilla, 1992). Lo anteriormente descrito disminuye el potencial reproductivo de las especies, pone en riesgo la estabilidad de las poblaciones, altera la estructura de las comunidades y la organización y biodiversidad de los ecosistemas (Moreno & Jaramillo, 1983; Jara & Moreno, 1984; Oliva & Castilla, 1986). Sin embargo, pueden revertirse mediante programas de manejo del recurso así como con otros orientados a la repoblación. Desafortunadamente, muchos de los aspectos biológicos y ecológicos se desconocen y entre ellos los genéticos, los cuales en conjunto deben proporcionar los fundamentos teóricos para implementar futuros programas de repoblamiento, así como también los de cultivo tendentes a la mejora genética y/o planes de mejoramiento genético. Uno de los pilares fundamentales para sustentar lo anterior es la identificación y caracterización molecular de secuencias de ADN, que permitan autentificar las diferentes especies y linajes y, en consecuencia, desarrollar metodologías de trazabilidad de la especie a lo largo de su ciclo vital o cadena de comercialización. Filogenia del género Fissurella Introducción 96 propágulos de las poblaciones, pueden ser responsables del aislamiento genético de alguna de las poblaciones de una especie y en estas poblaciones se potenciará la presencia de la homocigosis alélica en detrimento de la heterocigosis que caracteriza a las poblaciones con flujo génico ilimitado (Avila & Malaquias, 2003) La especiación simpátrica postula que la separación geográfica no es requisito para la eventual diferenciación y aparición de nuevas especies, sino que ocurre debido a presiones selectivas que empujan a una nueva población divergente a adaptarse a nuevos nichos ecológicos y a ocupar un nuevo hábitat o un nuevo huésped, como sucede en el caso de especies parásitas (Bush, 1969; Rice, 1987). En gasterópodos litorales se ha observado que la presencia de barreras físicas no es condición necesaria para que ocurra la especiación y generación de nuevas especies a lo largo de la costa. Hay evidencias que indicarían que Littorina saxatilis estaría en vía de especiación, inferida por el desarrollo de barreras reproductivas entre poblaciones vecinas que ocupan espacios con microambientes diferentes en el área intermareal (Hellberg, 1998; Rolán et al. 2004). V.3. Inferencia filogenética. La teoría de la evolución orgánica sustenta que todos los seres vivos, actuales y los del pasado, constituyen una comunidad de descendencia generada a partir de un ancestro común. Bajo esta teoría subyacen los mecanismos que intentan explicar cómo se forman los linajes, se conservan y transforman (Cecchi et al. 2001). Este planteamiento central de la teoría de la evolución fue expuesto por Charles Darwin en 1859 en su obra “El origen de las especies”, que para comunicar esta idea desarrolló la metáfora del árbol de la vida. En esta comparación, menciona que el rastro de las especies vivas Alberto N. Olivares Paz, 2007 97 puede remontarse al pasado, hacia sus ancestros comunes, tal como en un árbol se separan dos ramas de una rama mayor (Baum et al. 2005). Éste ha sido el ideal de muchos científicos, llegar a reconstruir la historia evolutiva de todos los organismos de la tierra y expresarla en la forma de un árbol filogenético. Se estima que lo ideal para reconstruir la historia de la vida es el registro fósil, el cual proporciona pruebas inequívocas de la pretérita existencia de un organismo. Desafortunadamente, no todos los seres vivos que poblaron nuestro planeta poseyeron cualidades corporales estructurales para la formación de fósiles, ni todos los ambientes tuvieron las características que permitieran la fosilización de los seres vivos. En este panorama, el registro fósil obtenido ha sido muy incompleto y además fragmentario, por lo cual los antecedentes obtenidos han permitido reconstruir parcialmente las relaciones entre los organismos vivientes. Otros métodos alternativos, como los estudios de la embriología, han permitido constatar que organismos de diferentes grupos comparten modelos comunes de origen y desarrollo de ciertas estructuras y órganos. Similarmente, la morfología y la fisiología comparada, han permitido determinar patrones de similitud entre la estructura y organización de órganos y sistemas, así como del funcionamiento de ellos entre animales de distintas categorías taxonómicas. Sin embargo, la historia evolutiva reconstruida ha sido siempre controvertida, porque los cambios evolutivos de los caracteres morfológicos y fisiológicos son complejos y con frecuencia aparecen expresiones intermedias del carácter, que no permiten asignarlos con exactitud a alguna categoría, dado que no siempre son objetivos ni tampoco son posibles de medir (Bush, 1975; Clarkson, 1986; Brooke & Holland, 2003). Esta dificultad fue superada en la década de 1960, desde el momento en que Henning, considerado el creador de la llamada escuela cladística (sistemática cladística) y reconstrucción filogenética, estableció que la relación de los seres vivos debe realizarse en base a la distinción de los grupos Filogenia del género Fissurella Introducción 98 monofiléticos, considerando los caracteres homólogos compartidos (sinapomorfía). Un carácter es homólogo en dos o más taxa cuando es derivado del mismo carácter de su ancestro común más cercano y, por lo tanto, contiene información evolutiva (Cecchi et al. 2001). VI. Filogenia molecular Al amparo del principio de caracteres homólogos se buscan marcadores moleculares que, estando presentes en una diversidad de seres vivos, permitan establecer relaciones de parentesco entre grupos de organismos. Mediante el análisis comparativo de secuencias de macromoléculas como las proteínas citocromo c, hemoglobina y ácidos nucleicos se han obtenido evidencias para realizar una aproximación parcial a la historia evolutiva de los metazoos, al menos, desde el filo Cnidarios al filo Cordados (Bergström, 1986). De entre ellas, el ácido nucleico es la de uso más generalizado, permitiendo un vertiginoso desarrollo de estudios de filogenia molecular en todos los reinos y grupos taxonómicos de seres vivos (Avise, 1994). Aunque actualmente la filogenia molecular ha permitido inferir la historia evolutiva de una gran diversidad de grupos de organismos, esta metodología no ha sido aplicada a un importante grupo, como es el del subgénero Fissurella del Pacífico Sudoriental. VI.1. Atributos del ADN Los más recientes avances en biología molecular, el desarrollo tecnológico y las modernas metodologías genómicas, han permitido aislar y secuenciar el ácido nucleico contenido en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos. Las secuencias elucidadas han sido usadas para inferir las relaciones filogenéticas dentro y entre varios grupos taxonómicos, contando Alberto N. Olivares Paz, 2007 99 con el apoyo de herramientas computacionales, fruto del desarrollo bioinformático. Las metodologías basadas en el ADN han demostrado tener atributos más adecuados respecto a las metodologías de los caracteres morfo-fisiológicos e incluso proteínas. Estas particularidades radican en las características inherentes a la estructura, organización y función de la molécula de ADN (Nei & Kumar, 2000). Todos los organismos existentes y extintos, tienen el ADN organizado con moléculas de pentosa (desoxirribosa), ácido fosfórico y bases nitrogenadas. Estas últimas son dos púricas; timina (T) y citosina (C) y dos pirimídicas; adenina (A) y guanina (G), cuyas cantidades y disposición lineal pueden variar entre los genes. El ADN no solamente tiene presencia universal, también es el depositario de toda la información estructural y funcional de los seres vivos, por lo que indudablemente contiene más información que cualesquiera de los caracteres morfológicos. Estas unidades de información llamadas genes, no solamente guardan codificadamente la información; también controlan y regulan la expresión de todos los caracteres y por ende cualquier cambio del carácter no es más que una consecuencia de una mutación del gen. Por otra parte se ha observado que las mutaciones a nivel de las bases nitrogenadas ocurren de una manera mas o menos regular, posibilitando la aplicación de modelos matemáticos para comparar las mutaciones entre organismos lejanamente relacionados, ya sea desde bacterias hasta humanos (Nei & Kumar, 2000). VI.2. ADN mitocondrial La mitocondria es el orgánulo responsable de la respiración en los organismos eucariontes. Contiene su propio ADN (ADNmt), el cual es una molécula de dos cadenas de polinucleótidos (cadena ligera y cadena pesada), circular cerrada, a excepción de algunos hidrozoos en los que el ADN es una Filogenia del género Fissurella Introducción 100 doble cadena lineal. La molécula de ADNmt se autoreplica y existen múltiples copias en la matriz de la mitocondria. El ADNmt codifica para varias proteínas y diferentes ARN, en los metazoos tiene un tamaño relativamente pequeño variando entre 14 kb a 17 kb, debido a diferencias en las regiones no codificantes (Boore & Brown, 1994; Rollinson et al. 1998). Los análisis realizados en diferentes especies de diversos grupos de metazoos han permitido establecer la organización, distribución y localización de los genes en el ADNmt. En general, el contenido de los genes del ADNmt es altamente conservado y no posee intrones. Los genes mitocondriales son los siguientes: • 2 subunidades ribosomales, pequeña 12S y grande 16S • 22 ARNt • 13 subunidades de proteínas de la cadena respiratoria, las cuales son: o Citocromo oxidasa c, subunidades I-III (CO1 a 3) o Citocromo b, apoenzima (CYTB) o ATP sintetasa, subunidades 6 y 8 (ATPasa6 y ATPasa8) o NADH deshidrogenasa, subunidades 1 - 6 y 4L (ND1 a 6, 4L). Además de los 37 genes, el ADNmt tiene regiones no codificantes, destacando la denominada región control. Esta región es de longitud variable y en diversos vertebrados e invertebrados contiene sitios de información para el control de los procesos de transcripción y replicación (Wolstenholme, 1992; Lee et al. 1995; Douzery & Randi, 1997; Yokobory et al. 2004). Los genes mitocondriales se distribuyen siguiendo un patrón muy similar dentro del mismo filo, aunque con ligeras diferencias de orden entre algunas especies. El conservado patrón de distribución de los genes ha sido utilizado como un marcador para estudios de filogenia profunda a nivel de los mayores grupos, como en el filo Cordados y Artrópodos (Boore & Staton, 2002). En contraste a lo anterior, en el filo Moluscos, se ha comprobado una Alberto N. Olivares Paz, 2007 101 mayor variabilidad en el ordenamiento de los genes, con grandes diferencias entre los grupos bivalvos, cefalópodos, gasterópodos, escafópodos y poliplacóforos. Además, se han detectado notables diferencias entre los grupos octópodos y decápodos y entre los gasterópodos pulmonados; motivo por el cual estas reorganizaciones del genoma mitocondrial parecen ser adecuadas para estudios filogénicos intergenéricos (Yamazaky et al. 1997; Tomita et al. 2002; Dreyer & Steiner, 2004). Por otra parte, se han observado alteraciones en el contenido génico en el ADNmt. Así por ejemplo, la pérdida del gen codificante para ATPasa8 ocurre en nemátodos y en el bivalvo Mytilus edulis (Boore & Brown, 1994). En oposición, la multiplicación de genes también aparece en algunas especies de reptiles, nemátodos, bivalvos y cefalópodos. En esta circunstancia, uno de los genes llega a ser funcional y los otros permanecen en estado de pseudogenes. Los genes duplicados son casi idénticos, sugiriendo que en las especies, ocurriría un proceso de evolución concertada, permitiendo homogenizar el contenido de los genes duplicados (Yokobori et al. 2004). Similarmente, la multiplicación de regiones intergénicas, no codificantes de aproximadamente 500 pb, se ha observado en el ADNmt de algunas especies de cefalópodos (Tomita et al. 2002). Los estudios a nivel de los genes mitocondriales han demostrado que evolucionan de 5 a 10 veces más rápidamente que un gen de copia simple del ADN nuclear. Los genes mitocondriales y regiones distintas difieren en las tasas de mutación, proporcionando información adecuada del tiempo de la divergencia de los linajes. El ribosomal 12S y 16S tienen tasa de evolución reducida, y específicamente el 16S ha permitido elucidar las relaciones filogenéticas en grupos cuyo tiempo de divergencia se remonta a la época del Paleoceno (Bonnaud et al. 1994). Además, recientemente se ha observado que el CO1, es adecuado para evaluar relaciones en gasterópodos, cuyos fósiles Filogenia del género Fissurella Introducción 102 datan una edad aproximada de 400 Ma (Remigio & Hebert, 2003). Sin embargo, hay otros genes y regiones del ADNmt, como CO1, CYTB, ND1, región control, que poseen una alta tasa de evolución, resultando adecuada para estudiar las relaciones entre especies y poblaciones que han divergido entre los últimos 5 – 10 Ma y entender en parte los mecanismos de especiación (Brown et al. 1979; Douzery & Randi, 1997; Rollinson et al. 1998; Quinteiro et al. 2005) En concordancia con todo lo anteriormente mencionado, el ADNmt es la molécula que actualmente ofrece las mayores ventajas para reconstruir historias filogenéticas y análisis de estructuras poblacionales, ostentando diversos atributos propios para ello. Su pequeño tamaño de 14 a 16 kb, aunque hay excepciones como en el bivalvo Placopecten magellanicus con un ADNmt de 34 kb, facilita la determinación total de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADNmt. En el año 2002 se contaba con un registro de secuenciación de ADNmt para 56 especies de invertebrados marinos (Boore & Staton, 2002) y entre ellos solamente figuraban cuatro gasterópodos: los pulmonados Albinaria coerulea, Cepaea nemoralis, Euhadra herklotsi y el Opistobranquio Pupa strigosa (Hatzoglou et al. 1995; Terrett et al. 1996; Yamazaki et al. 1997; Kurabayashi & Ueshima, 2000), pero actualmente en el GenBank, figura un registro de ADNmt para 12 especies de moluscos gasterópodos (1 eogastrópodo, 5 ortogastrópodos, 3 opistobranquios y 3 pulmonados), lo cual pone en evidencia el gran vacío y desconocimiento existente en este grupo de moluscos. Otra peculiaridad del ADNmt, es la transmisión vertical vía materna, con lo cual la descendencia se puede considerar equivalente a un clon materno, aunque en algunas especies de Mytilus existe transmisión paterna y materna del Alberto N. Olivares Paz, 2007 103 ADNmt (Quesada et al. 1996; 2003) y sin presentar, generalmente, recombinación (Rollinson et al. 1998). La tasa de evolución de los genes mitocondriales es relativamente constante y su correlación con el tiempo de divergencia, permite su uso como un reloj molecular para estimar la edad y períodos de radiaciones de las especies, las poblaciones o linajes (Quinteiro et al. 2001; Bromham & Penny, 2003). Actualmente, existe una gran cantidad de estudios sobre filogenia molecular, inferida desde las secuencias de bases de los genes mitocondriales, en todos los reinos de seres vivientes. En metazoos, han abarcado desde las relaciones existentes al interior de los filum hasta los intragenéricos; pero aún quedan muchos grupos que por alguna circunstancia no han sido objeto de estudio. Entre estos, en la familia Fissurelloidea el género Fissurella es un ejemplo de lo citado. VI.3. Mutación. Las principales transiciones evolutivas, desde procariontes a vertebrados, se han producido por aumento en la complejidad genómica principalmente por duplicaciones a gran escala de los genes preexistentes. Similarmente, la transferencia lateral de genes entre especies (mediada por transposones) permite la propagación de genes transespecíficos y parece ser un fuerte impulsor de la evolución de los seres vivos. Por otra parte, cambios en las vías de regulación de los genes homeóticos pueden alterar drásticamente el desarrollo y generar innovaciones morfológicas (Vergara, 2002; Gallardo, 2003). Los antecedentes anteriores permitirían generalizar que las diferentes modificaciones que muestran los organismos, en alguno de sus niveles de organización y de funcionalidad, corresponden a expresiones de cambios que suceden primariamente en el genoma, en el cromosoma o en el gen del Filogenia del género Fissurella Introducción 104 organismo y que en estas mutaciones subyacen los mecanismos de especiación y evolución. Entre las mutaciones que ocurren a nivel del gen, se han descrito aquellas que involucran la duplicación de un segmento del gen; la inversión que produce un giro de 180º del segmento génico y la transposición que ocasiona el cambio de posición del segmento del gen o bien la inserción en otro gen. En la inserción de un segmento del ADN, suelen estar involucrados transposones o elementos transposables (segmentos cortos de ADN, con capacidad de autorregular su transcripción e inserción en los genes) los cuales también favorecen la transferencia horizontal de genes (Nei & Kumar, 2000). En adición a las mutaciones anteriormente señaladas, están las que se producen en la estructura primaria del ADN, con lo cual se pierde la secuencia original de nucleótidos en el sitio donde ocurrió la mutación. Si estas mutaciones se transmiten a generaciones siguientes entonces, la descendencia adquirirá el estado modificado del carácter (sinapomorfia), el cual será de utilidad para un eventual estudio de filogenia molecular. VI.4. Mutación puntual del ADN La secuencia original de los nucleótidos del ADN puede modificarse por diversos mecanismos. Uno de ellos corresponde a la sustitución de bases, considerada como la forma más simple de mutación. Esta sustitución consiste en un intercambio de una base por otra. Las sustituciones que involucran un cambio de una base púrica por la otra, o una pirimídica por otra pirimídica se llaman transiciones. Las que implican intercambio de una base púrica por una pirimídica y viceversa se denominan transversiones (Nei & Kumar, 2000). La Figura 9 muestra estos tipos de sustituciones Alberto N. Olivares Paz, 2007 105 Figura 9. Tipos de sustituciones de nucleótidos. ts: transición; tv: transversión El otro mecanismo consiste en inserción – delección de bases. En la inserción se produce la incorporación de una o varias bases a la cadena original y la delección tiene como consecuencia la pérdida de una o más bases. Además, se producen inversiones de nucleótidos, comprometiendo a uno o más de ellos, como una unidad; la cual cambia de posición en la cadena (Nei & Kumar, 2000). El efecto de estas mutaciones, sobre todo en los genes codificantes para proteínas, puede ser de amplio espectro porque alteran la pauta de lectura de la secuencia de los nucleótidos, siempre que no sean múltiplos de tres. Así, la más dramática será la que produce una mutación sin sentido, generándose un codón de término, el cual detendrá prematuramente la síntesis de esa proteína en particular. Otra posibilidad es la generación de una mutación no sinónima, y el nuevo codón codifique para un aminoácido de distinto tipo al inicial (Ej: ácido en vez de básico) y la proteína altera su función. Por otra parte están las mutaciones sinónimas o silenciosas, en las cuales el cambio producido en el Filogenia del género Fissurella Introducción 112 VI.8. Test estadístico para topologías de árbol La probabilidad de un árbol filogenético para representar la realidad se puede evaluar mediante pruebas estadísticas, que permiten estimar la fiabilidad y robustez de la topología obtenida y de cada uno de los nodos. Estas metodologías estadísticas se conocen como “bootstrap”, “jacknife” y “error estándar de la longitud de las ramas de un árbol” (Swofford et al. 1996; Felsenstein, 1985; 1988; 1995; 2004). Entre todas las nombradas, la usada con mayor frecuencia para datos moleculares es el método de “bootstraping” o replicación, la cual es una metodología de remuestreo, para determinar si los clados obtenidos en un árbol filogenético son soportados con fiabilidad o producidos por coincidencia con el azar. La premisa básica del método consiste en asumir la variabilidad de una distribución obtenida (árbol) procediendo a realizar remuestreos, con reemplazamiento del carácter, desde la misma matriz de datos de secuencias alineadas considerando a cada sitio (carácter) como una unidad de muestreo. Estas réplicas dan origen a nuevos conjuntos de datos pseudoreplicados del mismo tamaño del original. Los árboles resultantes, de entre 100 a más réplicas, son resumidos en un árbol consenso, con un valor de bootstraping. Este valor es un indicador de la probabilidad de recuperar en repetidos muestreos el clado verdadero, desde una muestra real del mismo tamaño. El método analiza los parámetros de topología del árbol, longitud de las ramas y proporción total de sustituciones/transversiones. En muchos casos, los investigadores están más interesados en la topología de las porciones del árbol que en la del árbol total (Felsenstein, 1985; Sanderson & Chaffer, 2002). Los métodos de NJ y MP permiten calcular para cada rama del árbol la distancia evolutiva, que representa el número estimado de sustituciones por sitio. Desde estas distancias se calcula el error estándar evaluando de esta forma el nivel de confianza (Nei et al. 1985; Takahata & Tajima, 1991; Felsenstein, 1985). Alberto N. Olivares Paz, 2007 113 La implementación de las metodologías computacionales sumada al desarrollo de metodologías de amplificación y secuenciación del ADN, posibilitaron el explosivo crecimiento de estudios de filogenia molecular. La fuente primaria de obtención de datos moleculares son los ácidos nucleicos, nucleares y extranucleares, en cuyas secuencias ha quedado registrada la historia evolutiva de cada uno de los organismos vivientes actuales y extinguidos. Filogenia del género Fissurella Introducción 114 Planteamiento del problema La región de aguas templadas del Océano Pacífico Sudoriental, comprendida entre el Golfo de Guayaquil (3-4º S) y el extremo sur del continente, incluye las provincias faunísticas Peruviana y Magallánica, con una zona templada transicional entre ambas. El clima de esta región, está fuertemente influenciado por la corriente de Humboldt, la cual determina la alta productividad de estas aguas del Pacífico, con una gran diversidad de especies, algunas de las cuales son endémicas para cada una de las provincias y muchas de ellas se superponen en la zona de transición. La riqueza de esta zona ha sido explotada desde el momento en que el hombre arribó a estas costas (11.000 AP), y la evidencia ha quedado registrada en los denominados conchales. Entre las especies explotadas están las pertenecientes al género Fissurella, un grupo de moluscos gasterópodos denominados popularmente “lapas”, cuya peculiaridad es poseer un pie muscular muy desarrollado protegido por una concha de amplia abertura ventral y provista de un orificio en la parte dorsal. Las especies de Fissurella coexisten en simpatría, habitando el sustrato rocoso de la zona intermareal media y baja y la zona submareal, son consumidores primarios y se alimentan de macroalgas. A partir del año 1984, se identifican 13 especies (F. peruviana, F. maxima, F. limbata, F. pulchra, F. bridgesii, F. cumingi, F. latimarginata, F. costata, F. crassa, F. nigra, F. oriens, F. picta y F. radiosa). La identificación está fundamentada en los caracteres de la concha tales como morfología, coloración, diseño y tamaño, y el color del pie. Sin embargo, anteriormente, las mismas especies en consideración a los caracteres de la concha y del pie, fueron denominadas con 58 nombres específicos. Los caracteres tipológicos son ampliamente variables a nivel interespecífico y con frecuencia algunas formas de una especie son semejantes a los de otra especie. También, los caracteres varían con la edad Alberto N. Olivares Paz, 2007 115 (tamaño) y en los juveniles suelen ser muy parecidos entre las especies, lo cual limita el uso de las claves de identificación a los animales adultos. Adicionalmente, la concha tiene una estructura que otorga una superficie muy favorable para la fijación de una serie de organismos epibiontes, los cuales encubren y deterioran los caracteres tipológicos. Evidentemente la denominación de especies del género Fissurella, sustentada en los variables caracteres fenotípicos, ha generado controversias y las especies actualmente reconocidas no están al margen de discrepancias, ya que su identificación se realiza empleando los mismos controvertidos, variables e inestables caracteres corporales, morfológicos, estructurales y de diseño de la concha. Últimamente, estudios realizados con microscopía electrónica ponen en evidencia diferencias existentes en la ultraestructura del núcleo del espermatozoide entre las especies F. crassa, F. latimarginata y F. cumingi, los cuales podrían ser de valor taxonómico y permitirían validar la categoría de esas especies. Sin embargo, la validación de las especies no ha contado con el sustento de estudios moleculares, los cuales han demostrado tener el mayor grado de precisión en la determinación taxonómica y en la asignación de individuos a taxa concretos. Ante el relevante problema de identificación de estas especies, se ha estimado pertinente utilizar las técnicas de biología molecular, basadas en la amplificación (PCR) y secuenciación de genes, para determinar e inferir las relaciones entre los haplotipos de genes mitocondriales y secuencias nucleares, aislados desde los fenotipos característicos de cada especie morfológica de Fissurella. Por otra parte, las especies de Fissurella de esta región del Pacífico alcanzan los mayores tamaños registrados para las especies de este género en el mundo y su músculo es una carne que tiene una gran demanda en el mercado local e internacional. Se exceptúa de esto a F. peruviana que es la más pequeña, los ejemplares de mayor tamaño, no sobrepasan los 31 mm y no Filogenia del género Fissurella Introducción 116 existen evidencias sobre su consumo. Por ello, los fisurélidos sustentan una pesquería artesanal que en los últimos 15 años registra un desembarque promedio anual cercano a las 4.000 toneladas. No hay registros sobre el stock poblacional de las especies, existiendo desconocimiento de la cantidad de recurso que se puede extraer. La captura de los organismos se realiza durante todo el año y la única medida de protección de estas especies consiste en la fijación de una talla mínima de extracción (60 mm). Las capturas se destinan al consumo humano, comercializándose en estado fresco entero o desconchado, crudo o cocido; también congelado y en conserva. Las diferentes formas de procesamiento del animal producen la pérdida de todos los caracteres específicos y en consecuencia resulta imposible identificar la especie comercializada. Adicionalmente, el público consumidor tiene preferencias por determinadas especies, lo cual produce un incremento del esfuerzo pesquero sobre las especies más apetecidas y merma al límite del exterminio a algunas poblaciones, en determinadas localidades. Paralelamente, existe la tendencia a suplantar una especie por otra con el consiguiente perjuicio al consumidor. Con la finalidad de sustentar la idoneidad del producto comercializado, en este estudio se diseñará una metodología basada en la amplificación (PCR) de un gen mitocondrial seleccionado y posterior uso de enzimas de restricción. El perfil de restricción permitirá detectar un patrón característico mediante el cual se autentificará la especie de Fissurella. En adición, esta misma metodología, será de utilidad para apoyar cualquier tipo de estudio de biología y pesquería que se realice con especies de Fissurella. Entre otros aspectos desconocidos sobre los fisurélidos de Chile están los concernientes al origen, radiación y evolución de estas especies en el Pacífico Sudoriental. Los fósiles hallados, señalan que uno de los registros más temprano de Fissurella está en depósitos de localidades ubicadas en el Norte de Chile (Antofagasta-Mejillones), con edad asignada a la época del Plioceno. Alberto N. Olivares Paz, 2007 117 Según el aspecto de las costillas de la concha, uno de estos fósiles corresponde a la especie F. crassa y otro es similar a F. maxima, las cuales existen en la actualidad. Otros hallazgos dan cuenta de la presencia de las especies extintas F. lebuensis y F. chica en la zona centro del país (Lebu), durante el Mioceno, cuya morfología de la concha no coincide con las especies existentes. La escasez y discontinuidad del registro fósil no permite hacer un seguimiento de la radiación y especiación de las lapas, a lo largo de la costa de Chile. Las especies actuales de Fissurella se han congregado en tres grupos, en base a la relación del grosor entre la capa aragonítica y calcítica de la concha, pero esta agrupación no se corresponde con características de homología y por lo mismo no refleja relaciones de parentesco, ni evolutivas de las especies. Los estudios morfológicos existentes no permiten detectar los caracteres homólogos y difícilmente diferenciarlos de aquellos homoplásicos, lo cual hace muy poco probable reconstruir la historia evolutiva de las especies de Fissurella del Pacífico Sudoriental. En ausencia de caracteres morfológicos y registros fósiles adecuados, en el presente estudio se realizará una reconstrucción de la historia evolutiva de Fissurella de Chile en base a filogenia molecular sustentada en las distancias evolutivas de secuencias de genes mitocondriales y nucleares. Las distintas especies de Fissurella se distribuyen en poblaciones discretas a lo largo de la costa de Chile y es altamente probable que en ausencia de barreras físicas haya un libre flujo génico entre todas las poblaciones. Sin embargo, aunque los animales tienen muy poca capacidad de desplazamiento, no hay antecedentes sobre biología poblacional, ni de la potencial capacidad de migración de los animales. En el presente estudio se realizará una evaluación indirecta de nivel de flujo génico y del grado de aislamiento reproductivo entre cada una de ellas. Estos datos son de vital importancia para la gestión sostenible y racional de este recurso pesquero. Filogenia del género Fissurella Introducción 118 Hipótesis La única y elevada diversidad de especies del género Fissurella, en el litoral del Pacífico Oriental, debe tener su origen en peculiares condiciones oceanográficas y paleoclimáticas de la región, y eventos de tectónica de placas. Tales procesos son los factores determinantes de los patrones de diversidad observados y de la historia evolutiva de dichas especies. Tanto la distribución actual como el registro fósil sugieren un origen atlántico del género, por ello la presencia de dicho género en el Pacífico Este, requeriría de una colonización a través del Istmo de Panamá con anterioridad a su elevación durante el Plioceno. La generalizada ausencia en el medio marino de barreras extrínsecas limitantes del flujo génico, conlleva la frecuente ausencia de diferenciación genética entre poblaciones marinas. Sin embargo, la amplia y dispersa distribución latitudinal de las poblaciones de las especies de Fissurella, a lo largo de 4.300 km de costa, la escasa duración de la etapa plantónica, la escasa movilidad en su fase bentónica, la unidireccionalidad de las principales corrientes costeras, la existencia de estructuras hidrográficas de media escala, como los eventos de afloramiento y las condiciones oceanográficas asociadas al Niño, son factores que pueden modificar patrones generalizados asumidos para el medio marino. Alberto N. Olivares Paz, 2007 119 Objetivos 1. Caracterización de la secuencia parcial nucleotídica de los genes mitocondriales del citocromo b, subunidad 1 de la NADH deshidrogenasa y ARNr 16S, y de los genes nucleares los espaciadores internos ITS1 e ITS2 del complejo ribosomal ARNr 18S-ITS1-ARNr 5.8S-ITS2- ARNr 28S y la histona H3 del subgénero Fissurella. 2. Descripción de patrones de RAPDs para una muestra de individuos, de cada una de las especies consideradas del subgénero Fissurella. 3. Inferencia de las relaciones filogenéticas entre las especies consideradas del subgénero Fissurella con distribución en el Pacífico Sudoriental. 4. Evaluación del grado de congruencia entre la taxonomía y sistemática, establecida en base a caracteres morfológicos, y las relaciones evolutivas inferidas a partir de datos moleculares. 5. Definición de los procesos filogeográficos responsables de los patrones evolutivos inferidos, para las especies del subgénero Fissurella de la costa de Chile. Filogenia del género Fissurella Introducción 120 6. Análisis de la estructura genética poblacional en diversas especies representativas del subgénero Fissurella, a partir de muestras de poblaciones localizadas a lo largo de la costa de Chile. 7. Definición de un protocolo de identificación genética de las especies del subgénero Fissurella destinadas al consumo, a partir de muestras de productos comerciales frescos, congelados y procesados térmicamente, para su aplicación en el control alimentario. MATERIALES Y MÉTODOS Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 128 una columna específica, suplementada en ese kit. Este proceso permite una rápida purificación del ADN y su recuperación en solución tras el cambio de las condiciones iónicas, después de su desprendimiento de la resina por centrifugación. En el caso del segundo protocolo, el similar procesado de las muestras fue llevado a cabo en placas de 96 pocillos y mediante vacío. Finalmente, el ADN eluído, se almacenó a -20 ºC, para ser usado en las distintas amplificaciones. La integridad y el tamaño de los fragmentos de ADN extraídos, fueron verificados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz ultravioleta. Se hicieron registros fotográficos de los geles mediante el sistema de documentación de geles, del programa Quantity One (Bio RAD). La concentración del ADN aislado se determinó mediante la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm, y el grado de pureza respecto a proteínas se estableció por la relación de absorbancia entre 260/280 nm en espectrofotómetro Smart SpecTM (Labarca & Paigen, 1980). Las cuantificaciones se realizaron aproximadamente en un 10% de las muestras seleccionadas al azar. V. Amplificación del ADN Mediante el método de PCR, reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al. 1988), se amplificaron los genes mitocondriales ARNr 16S, CYTB y ND1, y los nucleares H3, ITS1 e ITS2, usando como molde el ADN total aislado y cebadores específicos para cada uno de los genes mencionados. Alberto N. Olivares Paz, 2007 129 V.1. Gen ribosomal 16S (ARNr 16S) Este gen mitocondrial es usado frecuentemente para elucidar relaciones filogenéticas a nivel de diferentes categorías taxonómicas, incluyendo intragenéricas de gastrópodos (Espoz et al. 2004; Schiaparelli et al. 2005). Se amplificó un fragmento de la subunidad mayor del gen mitocondrial ARNr 16S usando el cebador 16SA (5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) y el cebador 16SA (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) (Palumbi et al. 1991). La amplificación se realizó en un volumen de 12,5µl de una mezcla constituida por 1,25 µl de Buffer x 10 Promega; 2,5 mM de MgCl2; 200µM de cada uno de los dNTPs; 0,2 µM de cada cebador; 0,025 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Applied Biosystems) y de 20 a 75 ng de ADN aislado, y cantidad suficiente de agua esteril calidad mili-Q (agua purificada mediante sistema mili-Q) para completar el volumen de 12,5 µl. Algunas reacciones de amplificación se hicieron en un volumen de 15µl, manteniéndose las concentraciones de los reactivos señalados anteriormente, usando la enzima Taq polimerasa (Promega). La reacción se realizó en un termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems). Las condiciones de amplificación consistieron en una etapa inicial de desnaturalización a 94 ºC durante 12 minutos seguida de 35 ciclos; cada uno de los cuales consistió en una desnaturalización a 94 ºC durante 20 segundos, fusión a 50 ºC durante 20 segundos y extensión a 60 ºC durante 60 segundos, y una etapa final de extensión a 60 ºC por 5 minutos. En todas las ocasiones fue llevada a cabo simultáneamente una reacción de control negativo conteniendo sólo los reactivos, para verificar la ausencia de contaminación por ADN extraño. Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 130 V.2. Gen citocromo b (CYTB) Un fragmento del gen citocromo b fue amplificado mediante PCR con los cebadores UCYTB151F (5’-TGTGGRGCNACYGTWATYACTAA-3’) y UCYTB272R (5’-GCRAANAGRAARTACCAYTC-3’), poseedores de sitios degenerados. Estos cebadores son adecuados para facilitar la amplificación de este segmento génico en una variedad de moluscos (Merritt et al. 1998). La reacción de PCR fue realizada mezclando 1,25 µl de Buffer x10 (Promega); 1,25 µl de MgCl2 (25mM); 1,25 µl de dNTPs (10mM); 0,2 µl de cada cebador (20µM); 0,0625 µl (5 UI/µl) de Taq DNA polimerasa (Promega); 0,5 µl (40- 100 ng) de DNA total y agua mili-Q recientemente esterilizada en autoclave en cantidad suficiente para completar un volumen final de 12,5 µl. Las reacciones que presentaron dificultades para amplificar el ADN se repitieron agregando BSA (9,86µg/µl) en volumen igual al Buffer x10. Si el resultado negativo persistía se incrementó la concentración de Mg+2 a 3,5 µM. Estas modificaciones fueron suficientes para posibilitar la amplificación de este fragmento. Las condiciones para la realización de las reacciones de PCR consistieron en una primera etapa de desnaturalización a 94 ºC durante 3 min; seguida de 35 ciclos consistentes en desnaturalización a 94 ºC durante 40 s, fusión a 50 ºC durante 40 s y extensión a 72 ºC durante 1 min y finalmente una extensión a 72 ºC durante 7 min. V.3. Gen de la subunidad 1 de la NADH deshidrogenasa (ND1) Recientemente se ha comprobado que este gen posee mutaciones suficientes para su utilización en estudios de análisis filogenéticos en especies de moluscos pertenecientes al mismo género (Quinteiro et al. 2005), pero debido a la carencia de cebadores universales, se requiere diseñar cebadores específicos. Alberto N. Olivares Paz, 2007 131 V.3.A. Diseño de cebadores específicos La amplificación del segmento del gen ND1, se realizó mediante la utilización de cebadores específicos para Fissurella. Estos cebadores fueron diseñados a partir de alineamientos parciales de algunas especies representativas de Fissurella, obtenidos mediante amplificación con el par de cebadores 16SA - 16SB y el par MOL ND1F (5’-CGRAARGGMCCTAACAARGTTGG-3’) - MOL ND1R: (5’-GGRGCACGATTWGTCTCNGCTA-3’). Estos alineamientos fueron complementados con las secuencias homólogas de otros moluscos disponibles en el GenBank y se analizaron las zonas nucleotídicas conservadas entre las especies que cumplieran con los requerimientos para el diseño de cebadores; entre otros, tener una longitud de 17 – 28 bases, cantidad de G más C igual al 50 - 60%, no tener complementariedad entre sí, temperatura de fusión entre 55 °C y 80 ºC, definida por la relación Tm = 4(G + C) + 2(A + T) oC (Innis & Gelfand, 1991). Estas zonas correspondieron con una situada en el gen del ARNt para Leucina (ARNt-Leu) y otra en la correspondiente al gen ND1. Los cebadores específicos diseñados fueron denominanados FISS1-ND1F (5’-GGTGGCAGAATAAGTGCGTTAG-3’) y FISS2-ND1R (5’-TACAGCCCGAATTGCCCC-3’). V.3.B. Amplificación parcial del gen ND1 Mediante los cebadores diseñados se amplificó un fragmento que incluye secuencias correspondientes a los genes ARNt-Leu y ND1. Las reacciones de amplificación fueron realizadas en un volumen total de 15 μl con los siguientes reactivos y en la concentración final que se indica: Buffer Promega 1x; MgCl2 2,5 mM; dNTPs 200 μM; cebadores 0,2 μM; Taq DNA polimerasa (Promega) 0,025 U; ADN total 40-150 ng. Las condiciones de PCR fueron una etapa de desnaturalización de 3 min a 94 °C, luego 35 ciclos Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 132 consistentes en desnaturalización a 94 °C durante 40 s, fusión a 50 °C durante 40 s y extensión durante 1,30 min a 72 °C. Finalmente, una etapa adicional de extensión durante 7 min a 72 °C. La reacción de control negativo se incorporó en cada ocasión. V.4. Gen histona H3 (H3) Se amplificó una porción de este gen mediante la utilización de los cebadores H3NF (5’-ATGGCTCGTACCAAGCAGAC-3’) y H3NR (5’-ATRTCCTTGGGCATGATTGTTAC-3’), los cuales han sido empleados para elucidar la filogenia e historia evolucionaria de moluscos gasterópodos (Colgan et al. 2000). Las amplificaciones se hicieron mezclando Buffer Promega 10x (1,5 μl); MgCl2 25mM (1,5 μl); dNTPs 10 mM (1,2 μl); cebadores 20 μM (0,1 μl de cada uno); Taq polimerasa 5 U (Promega) 0,075 μl; ADN total 40-150 ng y 10,025 μl de agua mili-Q esterilizada en autoclave. Una reacción de control negativo fue incorporada en cada ocasión. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems), en las siguientes condiciones: una etapa inicial de desnaturalización a 94 ºC durante 3 min; una segunda etapa de 35 ciclos, consistentes en una desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, fusión a 50 ºC durante 30 s y extensión a 72 ºC durante 40 s y una etapa final de extensión a 72 ºC durante 7 min. V.5. Espaciadores ITS1 e ITS2 Los espaciadores internos de transcripción ITS1 e ITS2 del gen nuclear ARNr, (ARN ribosómico), han sido empleados en reconstrucciones de filogenia de moluscos (Remigio & Blair, 1997; Quinteiro et al. 2005). Alberto N. Olivares Paz, 2007 133 La amplificación de ITS1 e ITS2 se realizó por medio de la técnica de PCR anidada, consistente en dos etapas subsecuentes (Figura 11), cuyas características fueron las siguientes: En la primera etapa se amplificó el segmento completo del gen ARNr usando el cebador 18D5 (5’-CACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTG-3’) (Hillis et al. 1991) y el BAB28S-2R (5’-GACACTGAGGGATTCGGTGC-3’) (Quinteiro et al. 2005) y como molde el ADN aislado. Esta reacción de amplificación se hizo en un volumen total de 15 μl; mezclando BSA 9,86µg/µl (1,5 μl); Buffer 10x (1,5 μl); Cl2Mg (1,5 ul); dNTP (1,5 ul); Taq polimerasa Promega (0,0625 µl); 2 μl de cada cebador; 0,5 μl (40-150 ng) de ADN y 8,03 μl de agua mili-Q estéril. Las condiciones de PCR fueron desnaturalización inicial a 94° C durante 3 min, 35 ciclos con fase de desnaturalización a 94 °C, anillamiento a 50 °C y extensión a 72 °C durante 40 s, 40 s y 2,5 min respectivamente, seguido de una extensión final a 72 °C durante 7 min. Gen ARNr 5 , 8S 28S18S ITS1 ITS2 Amplificación: Primera etapa Cebador BAB2 8S -2R1 8 D 5 Segunda etapa Cebador ITS1 18D5 BAB5,8S-1R Cebador ITS2 BAB5,8S-1F BAB28S-2R ETS ETS Figura 11. Posiciones relativas de los cebadores para amplificar en la primera etapa el gen ARNr y en la segunda etapa los segmentos espaciadores internos ITS1 y el ITS2. (ETS: segmento espaciador externo, localizado entre genes ARNr). Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 134 En la segunda etapa, se hicieron reacciones de reamplificación mediante el uso del cebador BAB5,8S-1R (5’-GCCGCCATATGCGTTCA-3’) y el BAB5,8S-1F (5’-TGAACGCATATGGCGGC-3’) (Quinteiro et al. 2005), de localización interna en los productos de PCR obtenidos, los cuales son usados como ADN moldes. Previamente, estos ADN moldes fueron sometidos a la acción de ExoSAP-IT (Amersham-Biosciences), que contiene las enzimas fosfatasa y exonucleasa, para degradar los cebadores e inactivar los dNTPs libres, remanentes de la reacción de PCR, para evitar su interferencia con las siguientes reacciones. Se realizaron por separado reacciones para amplificar el segmento ITS1 con los cebadores 18D5 y BAB5,8S-1R y el segmento ITS2 con los cebadores BAB5,8S-1F y BAB28S-2R. En estas reacciones de reamplificación se utilizaron las mismas cantidades de los reactivos mencionados en la etapa 1. Sin embargo, no se usó BSA y se incrementó la cantidad de agua para completar el volumen final de 15 μl. Para obtener amplificaciones del ADN fue necesario diluir el producto de PCR molde entre 100 y 1.000 veces. Las condiciones de reacción fueron desnaturalización inicial durante 3 min a 94 °C; 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 40 s, fusión a 60 °C durante 40 s y extensión a 72 ºC por 30 min, y una extensión final a 72 °C durante 7 min. VI. Verificación de los productos de PCR La pureza y tamaño del producto final de las reacciones de PCR de cada amplificación se comprobaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,0% y 2,5% con tinción de bromuro de etidio y visualizado en transiluminador de luz ultravioleta. Se hicieron registros fotográficos de los geles mediante el sistema de documentación del programa Quantity One (BioRad). Todas las Alberto N. Olivares Paz, 2007 135 reacciones que dieron un único producto génico, correspondiente al tamaño del gen o segmento amplificado, detectado mediante una banda simple con un rango de tinción de fuerte a mediana intensidad se almacenaron a -20 ºC, para posterior secuenciación. VII. Secuenciación de productos de PCR La secuenciación de los productos de PCR obtenidos, se realizó en tres etapas. VII.1. Purificación de los productos de PCR Antes de la secuenciación los productos de PCR fueron purificados con las enzimas fosfatasa y exonucleasa, siguiendo el procedimiento descrito para el uso de ExoSAP-IT (Amersham-Biosciences); que permite digerir los cebadores y desactivar los dNTPs libres, que pueden interferir en la posterior reacción de secuenciación. VII.2. Reacción de secuenciación La reacción de secuenciación se realizó por separado con cada uno de los dos cebadores empleados en la PCR de amplificación, permitiendo la secuenciación de cada hebra con la finalidad de minimizar errores. Para ello se mezclaron 3 – 4 μl (2,4 - 4,0 ng) del producto purificado de PCR, 1 μl de un cebador (3,2 pmoles) idéntico al usado en la reacción de amplificación de PCR, 1 μl de BigDye Terminator (v3.1), 1 μl Buffer de secuenciación, y agua mili-Q esterilizada, para completar un volumen final de 10 μl. La reacción de secuenciación se realizo en un termociclador Gene Amp PCR System 9600 (Applied Biosystems). Las condiciones de amplificación consistieron en una etapa inicial de desnaturalización a 95 ºC durante 1 min, seguida de 35 ciclos Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 136 cada uno consistente en desnaturalización a 95 ºC durante 15 s, fusión a 50 ºC durante 15 s y extensión a 60 ºC durante 4 min. Luego una etapa final de extensión a 60 ºC durante 4 min. VII.3. Electroforesis y detección de los productos de secuenciación Previo a la electroforesis, fue necesario eliminar el BigDye terminator para evitar la interferencia de las señales de los nucleótidos libres con la de los nucleótidos incorporados en los diferentes oligonucleótidos de secuenciación. Para la purificación, se utilizó una columna de gel DyeEx-96 (Qiagen) en la cual quedan retenidos los nucleótidos dejando pasar libremente los productos de extensión. Los productos de extensión fluorescentes fueron separados mediante electroforesis y detectados empleando un secuenciador automático ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). VIII. Verificación de los electroferogramas Los electroferogramas extraídos desde el secuenciador, fueron analizados manualmente para verificar cualquier error en la lectura de los nucleótidos, utilizando el programa BioEdit 7.01 (Hall, 1999). Se contrastó cada electroferograma con el registro de su correspondiente secuencia, corrigiendo manualmente cada sitio de la secuencia que no quedó correctamente registrado y llevando a cabo la comparación entre hebras. IX. Alineamiento de las secuencias Debido a la elevada homología entre secuencias, éstas fueron manualmente alineadas usando la herramienta disponible en el programa Alberto N. Olivares Paz, 2007 137 BioEdit 7.01 (Hall, 1999). Posteriormente, este alineamiento múltiple de secuencias homólogas fue verificado mediante el programa Clustal, incluido en BioEdit o en el programa MEGA (Kumar et al. 1993). Fue necesario insertar sitios vacíos para alinear adecuadamente las secuencias de los segmentos del gen 16S y los del ITS1 e ITS2. Desde los extremos de cada alineamiento se excluyeron todos los nucleótidos correspondientes a los cebadores y los sitios vacíos o inciertos dejando todas las secuencias de igual longitud. X. Caracterización de secuencias Las secuencias obtenidas se caracterizaron considerando los siguientes aspectos: Homología de los segmentos génicos. Se realizó en base a la comparación con segmentos similares de la especie más emparentada filogenéticamente, considerando solamente las secuencias depositadas en el GenBank. Se estimó para cada gen secuenciado su posición relativa dentro del gen homólogo de la especie referente y también, para los segmentos con productos de transducción la cantidad de aminoácidos. Análisis de posiciones nucleotídicas. Utilizando el programa DnaSP (Rozas et al. 2003) se estimaron el número de sitios vacíos, con inserciones, invariables y variables; y entre éstos, aquellos con información tipo parsimonia y singleton. Simultaneamente, se obtuvo el total de mutaciones, el número de haplotipos, diversidad nucleotídica y haplotípica. Proporción de bases nitrogenadas. Se determinó, mediante PAUP* 4.0b10 (Swofford, 2002), el promedio porcentual de cada una de las bases nitrogenadas de los nucleótidos que forman parte de cada gen y mediante la prueba de χ2 se constató el grado de significancia de las variaciones interespecíficas en la proporción de las bases. Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 144 XIII. Estructura genética poblacional Las secuencias mitocondriales, correspondientes al gen ND1 y sus haplotipos detectados, son usados para el estudio de genética poblacional detectando el grado de aislamiento y el nivel de flujo génico, que puede establecerse entre poblaciones separadas geográficamente (Brown et al. 2001). XIII.1. Especies seleccionadas Este análisis fue realizado en cuatro de las especies de Fissurella muestreadas. Dos de ellas, F. latimarginata y F. cumingi, se escogieron porque con ellas se abarcan los mayores rangos de distribución longitudinal, como se observa en la Tabla 14, comprendidos desde la Provincia Peruviana hasta el Área Intermedia para F. latimarginata y entre la Provincia Peruviana y el inicio de la Magallánica para F. cumingi. Además, el análisis intraespecífico permitirá evaluar con mayor fiabilidad el estatus taxonómico de especies diferenciadas, ya que ambas especies comparten los haplotipos más frecuentes y se agrupan en un clado polifilético. Las otras dos especies seleccionadas fueron F. crassa y F. limbata, ambas con distribución en la Provincia Peruviana y que, además, fueron muestreadas en poblaciones localizadas en las mismas localidades costeras (Tabla 14). XIII.2. Aislamiento del ADN y secuenciación del gen ND1 El ADN fue aislado a partir de aproximadamente 60 animales por especie, según el procedimiento descrito anteriormente mediante los reactivos NucPrep (AppliedBiosystems) en un equipo 6100 (AppliedBiosystems). A partir de este ADN se hicieron reacciones de PCR para amplificar el gen ND1, de acuerdo a lo mencionado en el punto V.3.B. Luego, se secuenció el Alberto N. Olivares Paz, 2007 145 segmento y se alinearon las secuencias, en concordancia con el procedimiento descrito en el apartado VII del presente capítulo. XIII.3. Análisis de la estructura genética poblacional Los datos acerca de la diversidad haplotípica (h) y nucleotídica (π), así como otros datos básicos acerca de las frecuencias de los haplotipos por población y los estadísticos de neutralidad, como Tajima’s D, fueron estimados con Arlequin v.3.1 (Excoffier et al. 2005) y DnaSP (Rozas et al. 2003). La relación entre los haplotipos fue evaluada mediante la elaboración de un esquema de red o “mediam joining network” con el programa Network (Bandelt et al. 1999). Los distintos haplotipos son conectados con vectores de longitud proporcionales a las diferencias nucleotídicas y recurriendo a vectores intermedios creados para representar haplotipos extintos o no muestreados. A partir de los haplotipos detectados para la secuencia del gen ND1, se evaluó la heterogeneidad geográfica en la distribución de la frecuencia de los haplotipos mediante el programa REAP (McElroy et al. 1992). La diferencia entre poblaciones y el nivel de significancia de divergencia entre ellas fue estimado a partir del clásico índice de fijación FST. Modificaciones de este índice para secuencias nucleotídicas, como Nst y los correspondientes Nm, indicador de los niveles de flujo génico, fueron también estimados mediante Arlequin 3.01 (Excoffier et al. 2005) y DnaSP v. (Rozas et al. 2003). Teniendo en cuenta la divergencia, esto es el número de mutaciones entre haplotipos, además de su frecuencia en cada población, se llevó a cabo el análisis de la varianza molecular (AMOVA) implementado en Arlequin v.3.1 (Excoffier et al. 2005). Agrupando las poblaciones, se definieron distintas estructuras poblacionales para evaluar. El análisis jerárquico de la varianza particiona la varianza en componentes de covarianza debidos a diferencias Filogenia del género Fissurella Materiales y métodos 146 entre los distintos niveles de estructuración. Así, la varianza molecular total es la suma del componente de la covarianza debido a diferencias entre haplotipos dentro de una población (σ2c), a diferencias entre haplotipos de distintas poblaciones dentro de un grupo (σ2b) y a diferencias entre grupos (σ2a). La significancia de los respectivos índices de fijación, FST, FSC y FCT, es evaluada usando una aproximación de permutación no paramétrica. Basándose en la teoría de la coalescencia, fueron estimados diversos parámetros de la historia demográfica de las poblaciones a partir de la distribución de las diferencias entre pares de secuencias (“mismatch distribution”). Se evaluó la coincidencia de dicha distribución con la esperada bajo un modelo de expansión demográfica o de rango geográfico súbita, mediante diversos test como SSD, Harpending’s Raggedness (H’s Ri), y los más sensibles, para la detección de un rápido crecimiento, como Fu’s Fs y R2. Se determinaron los parámetros de expansión demográfica repentina tal como la datación del momento de la expansión (τ), el tamaño poblacional efectivo previo a la expansión (θ0), y el tamaño con posterioridad al evento expansivo (θ1). XIV. Metodología de autentificación de especies de Fissurella mediante PCRRFLP La autentificación de las especies consideradas del género Fissurella se realizó mediante una combinación de la metodología de amplificación de un fragmento mitocondrial y posterior empleo de enzimas de restricción sobre los productos de PCR (PCR-RFLP: Polymerasa Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism). El objetivo es que en cada especie se deberían producir fragmentos de restricción característicos con diferentes tamaños, dando lugar a patrones de restricción específicos. El programa BioEdit versión 7.01 (Hall, 1999) fue utilizado para analizar las secuencias obtenidas para distintos segmentos de genes de Alberto N. Olivares Paz, 2007 147 Fissurella con la finalidad de detectar los sitios polimórficos existentes para las enzimas de restricción. Se seleccionaron las secuencias obtenidas con los cebadores UCYTB 151F y UCYTB 272R (Merritt et al. 1998) correspondientes al citocromo b y las enzimas Nla III (CATG’) y HpyCH4 V (TG’CA) (isosquizómero: CviRI) (NEB). El protocolo desarrollado consta de las siguientes etapas: Etapa 1. Extracción de ADN según procedimiento descrito en apartados anteriores. Etapa 2. Amplificación del segmento del gen UCYTB. La reacción de PCR se realizó en un volumen de 30 μl conteniendo Buffer Promega x 10; Cl2Mg 2,5 mM; dNTP 200 μM de cada uno; 0,1 μM de cada cebador; 0,025 U/I de Taq DNA polimerasa (Promega) y 1,0 μl (50 ng/μl) de ADN total. Las condiciones de PCR consistieron en un paso de desnaturalización inicial de 3 min a 94 °C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C, fusión a 50 °C y extensión a 72 °C durante 20 s, 30 s y 60 s, respectivamente; más una extensión final a 72 °C durante 5 min. El producto fue verificado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5% con bromuro de etidio, visualizado con luz ultravioleta. Etapa 3. Reacción con enzimas de restricción. El producto de PCR fue digerido por separado con 5 unidades de las enzimas Nla III (CATG’) y HpyCH4 V (TG’CA), durante 4 h a 37 °C, en un volumen total de 20 μl. Los fragmentos de la digestión se visualizaron en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, en transiluminador de luz ultravioleta y se obtuvieron fotografías digitalizadas empleando el programa Quantity One. RESULTADOS Alberto N. Olivares Paz, 2007 151 I. Calidad y pureza del ADN total aislado El ADN total que se aisló del músculo del pie de los animales, estuvo compuesto por fragmentos de tamaños variables, como se puede apreciar en la Figura 12, distinguiéndose una banda de alto peso molecular (> 15 Kpb) y una mezcla de fragmentos de menor tamaño, incluyendo fragmentos < 1 Kpb. Esta desigualdad de tamaño es producto de la degradación del ADN por la actividad de las endonucleasas del tejido. Estas enzimas, probablemente se activaron desde que las lapas fueron sacadas de su medio y su actividad degradativa sobre el ADN la ejercieron hasta que fueron inactivadas por la acción desnaturalizante del etanol, o por efecto de la baja temperatura a la que fueron sometidos los animales. La cantidad de ADN aislado no fue similar en todos los especímenes, fluctuando entre los 75 y 300 ng/μL. El ADN aislado resultó de una pureza estimada en 1,45 a 1,84; los cuales están dentro del rango mínimo y óptimo de pureza para aislamiento de ADN desde tejidos, según el método de aproximación basado en la relación de absorbancia A260/A280 nm. Figura 12. Gel de agarosa, mostrando la variabilidad de tamaño de los segmentos de ADN aislado de diferentes especies. Código de especies según lo indicado en Tabla 14. Filogenia del género Fissurella Resultados 152 II. Amplificación de genes Aunque el ADN aislado presentó una gran heterogeneidad de tamaño y degradación, los segmentos génicos a amplificar estaban intactos en cantidades mínimas suficientes para facilitar su amplificación. Además, el éxito de la amplificación de los genes resultó favorecido por el grado de pureza del ADN y la ausencia de factores inhibidores de la PCR en las muestras de ADN molde. En la Figura 13 se muestra un gel de agarosa representativo de algunos de los patrones típicos del tamaño e intensidad de las bandas correspondientes a los productos de PCR generados. Figura 13. Muestra representativa de los diferentes genes amplificados mediante PCR y el tamaño de los segmentos en comparación al marcador (M). C: Control negativo; 1-2: CYTB; 3-4: ND1; 5-7: ARNr 16S; 8-9: ARNr 18S+ITS1+ARNr 5.8S+ ITS2+ARNr 28S; 10-11 ITS1; 12-13: ITS2; 14-15: histona H3. Alberto N. Olivares Paz, 2007 153 III. Secuenciación La metodología de secuenciación utilizada, pone en evidencia que la selección de los cebadores seleccionados fueron los adecuados para conseguir una amplificación exitosa de los genes mitocondriales y nucleares, elegidos para realizar el presente estudio en lapas. Figura 14 Segmentos de electroferogramas obtenidos de la secuenciación de los siguientes genes: a: CYTB; b: ARNr 16S; c: ARNt-Leu - ND1; d: H3; e: ITS2. Filogenia del género Fissurella Bibliografía 256 Hellberg, M.E. 1998. Simpatric sea shells along the sea`s shore: the geography of speciation in the marine Gastropod Tegula. Evolution 52 (5): 1311-1324. Hengeveld, R. 1990. Dynamic biogeography. Cambridge University Press. Great Britain. 250 pp. Hillis, D.M. & Huelsenbeck, J.P. 1994. Signal, noise, and reliability in molecular phylogenetic analyses. Journal of Heredity 83: 189-195. Hillis, D.M., Moritz, C., Porter, C.A. & Baker, R.J. 1991. 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Filogenia del género Fissurella Anexos 272 orificio apical de tamaño mediano..........................................................(6) (5') Conchas medianamente altas o bajas, con costillas radiales discontinuas o sin costillas; orificio apical grande......................................................(7) (6) Conchas con costillas radiales primarias y secundarias muy finas, pigmentada uniformemente de pardo-rojizo oscuro. Conchas juveniles presentan 2 rayos laterales más claros que nacen en el orificio apical. El margen filudo, de ancho variable, presenta la misma coloración del dorso...........................................Fissurella latimarginata Sowerby, 1835 (6') Conchas con costillas radiales finas, siendo las primarias más prominentes que las secundarias. Rayos de color púrpura oscuro sobre fondo gris. Margen medianamente filudo, de ancho variable, de color homogéneo o con patrón de coloración igual al dorso, borde moderadamente crenulado. Perfil levemente levantado en los extremos..................................................Fissurella cumingi Reeve. 1849 (7) Conchas lisas, sin costillas radiales........................................................(8) (7') Conchas con costillas radiales poco prominentes y discontinuas. Conchas gruesas, bajas con rayos rojo oscuro en fondo amarillento. Margen ancho y redondeado. Orificio apical alargado. Perfil con extremos levantados...............................................Fissurella bridgesii Reeve, 1849 (8) Conchas bajas y delgadas, con anillos de crecimiento concéntricos débiles; margen ancho, plano intensa y homogéneamente pigmentado. (8') Conchas altas, gruesas, con marcados anillos de crecimiento concéntricos; margen ancho, plano con zona interna más clara. Conchas negras o moradas intensas homogéneas; orificio apical elongado con bordes de aragonita (blanco)......................Fissurella nigra Lesson, 1831 (9) Conchas bajas; orificio apical elongado con contricción media. Superficie de la concha con rayos morados tenues y delgados sobre fondo morado claro..............................Fissurella limbata Sowerby, 1835 (9') Conchas muy bajas; orificio apical tripartito. Superficie de las conchas de color rosado oscuro con rayos tenues sobre fondo más claro y cubierta por líneas zigzagueantes las que son más conspicuas en la cercanía del orificio apical.......................................Fissurella pulchra Sowerby, 1835 Alberto N. Olivares Paz, 2007 273 Anexo 2 Clave para la determinación de especies del género Fissurella comunes en el litoral y conchales de Chile Central y Sur utilizando animales vivos. (Oliva & Castilla, 1992). (1) Pie muy pequeño, oculto por la concha en una vista dorsal; borde del manto angosto. Contorno de las conchas subcircular; conchas altas con costillas radiales robustas, perfil plano, borde del margen crenulado................................................................................................(2) (1') Pie grande, sobresale de la concha en una vista dorsal; borde del manto angosto o ancho. Contorno de las conchas alargado u oval; conchas medianamente altas o bajas con costillas radiales finas o sin costillas; perfil de las conchas cóncavo en el centro, borde del margen redondeado o levemente crenulado............................................................................(3) (2) Pie de color pardo claro jaspeado con tonalidades amarillentas. Conchas color blancuzco homogéneo, cuando se presentan rayos éstos son pardo claro y suelen ser discontinuos…….........Fissurella costata Lesson 1831 (2') Pie de color gris oscuro. jaspeado. Conchas con rayos negros en fondo blancuzco.. ..............................................Fissurella picta (Gmelin, 1791) (3) Pie sobresale de la concha en la zona posterior y zonas laterales..........(4) (3') Pie sobresale de la concha en la zona posterior……..............................(5) (4) Pie de color violeta, verrucoso; borde del manto muy ancho y festoneado, pudiendo cubrir gran parte de la concha. Conchas lisas de color rosado oscuro con rayos tenues en fondo más claro. Superficie cubierta por líneas zigzagueantes. más conspicuas en la cercanía del orificio apical.......................................Fissurella pulchra Sowerby, 1835 (4') Pie de color gris oscuro muy verrucoso; borde del manto angosto. Conchas gruesas con costillas radiales poco prominentes y discontinuas. Rayos de color rojo oscuro en fondo amarillento.............................. ……………………………....................Fissurella bridgesii Reeve, 1849 (5) Conchas alargadas y bajas...................................................................... (6) (5') Conchas ovales, medianamente altas o bajas..........................................(7) Filogenia del género Fissurella Anexos 274 (6) Conchas con costillas radiales finas y prominentes. Superficie de la concha con rayos púrpura en fondo blancuzco. Margen ancho, plano, la mitad externa sigue el patrón de color del dorso. Costados del pie pardo grisáceo muy verrucoso. Borde del manto festoneado, sigue el patrón de coloración de la concha. Tentáculos pardos en la región proximal y amarillos en la distal............................Fissurella maxima Sowerby, 1835 (6') Conchas con costillas radiales suaves y separadas. Conchas de color pardo homogéneo con anillos concéntricos de crecimiento. Orificio apical grande con forma de ocho. Costados del pie pardo con verrugas pequeñas. Borde del manto ancho con un patrón de listas en su coloración. .............................................Fissurella crassa Lamarck, 1822 (7) Conchas medianamente altas con costillas radiales finas.......................(8) (7') Conchas medianamente altas o bajas sin costillas radiales....................(9) (8) Costados del pie y manto de color negro intenso. Manto festoneado con prolongaciones amarillas. Tentáculos de color amarillo intenso. Concha uniformemente pigmentada de color morado oscuro o pardo. Costillas radiales primarias y secundarias igualmente desarrolladas................... …………………………............Fissurella latimarginata Sowerby, 1835 (8') Costados del pie de color rosado intenso con verrugas muy desarrolladas, borde del manto festoneado con patrón de coloración similar al de la concha. Costillas primarias más prominentes que las secundarias. Rayos de color morado sobre fondo gris…........Fissurella cumingi Reeve, 1849 (9) Conchas medianamente altas, gruesas, de color negro homogéneo; bordes del orificio apical de aragonita (blanco). Pie de color gris con pequeños tubérculos. Manto medianamente ancho, de color más claro que el pie............................................Fissurella nigra Lesson, 1831 (9') Conchas bajas, con rayos morados tenues y delgados sobre fondo claro. Costados del pie de color blancuzco grisáceo, liso. Manto no festoneado blancuzco grisáceo………...................Fissurella limbata Sowerby, 1835 Alberto N. Olivares Paz, 2007 275 Anexo 3 Clave para la identificación de Fissurella, obtenida a partir de “Clave para identificar los moluscos asociados al litoral rocoso del centro-sur de Chile (36° - 38°S)” (Aldea & Valdovinos, 2005) (13) Moluscos encerrados por una concha, o sin ésta (Clase Gastropoda) ……………………………………………………………............... (14) (14) Con una concha ……….................................................................... (15) (15) Concha sin espira (vueltas)............................................................... (16) (16) Con un orificio apical........................................................................ (17) (17) Con finas estrías radiales y sin radios de colores marcados............. (18) (17') Con costillas radiales fuertes y/o radios de colores marcados.......... (20) (18) Orificio apical elíptico o alargado, borde de la concha liso............. (19) (18') Orificio apical con forma de 8, borde de la concha ondulado y delgado. Color externo castaño rojizo............... Fissurella crassa Lamarck 1822 (19) Superficie con estrías concéntricas de crecimiento mucho más notorias que las estrías radiales, las cuales generalmente son muy tenues o ausentes. Color externo negro. Orificio apical con grueso reborde blanco....................................................... Fissurella nigra Lesson 1831 (19') Superficie con estrías concéntricas y radiales igualmente notorias, pero tenues. Color externo marrón; en estados juveniles presenta un radio de color blanco a cada lado de la concha...................................................... ………………………………. Fissurella latimarginata Sowerby 1835 (20) Con costillas bien marcadas.............................................................. (21) (20') Con costillas tenues, estrías o bien sin ellas..................................... (24) (21) Con radios de colores notorios.......................................................... (22) Filogenia del género Fissurella Anexos 276 (21') Sin radios de colores o muy poco notorios. Color amarillo cremoso, con escasos radios color marrón pálido, cuando existen.......................... ………………………………………... Fissurella costata Lesson 1831 (22) Concha gruesa alta o medianamente alta con margen ancho, orificio apical grande.... ................................................................................ (23) (22') Concha delgada muy alta, con margen angosto, orificio apical pequeño. Color externo rojizo con radios marrón.................................... …………………………………... Fissurella peruviana Lamarck 1822 (23) Concha alta de forma oval, con orificio apical alargado con forma de cerradura. Color amarillento o grisáceo con 15 o más radios color púrpura.................................................. Fissurella picta (Gmelin 1791) (23') Concha medianamente alta, oval alargada, con orificio apical oval – circular. Color amarillo grisáceo con 13 radios púrpura.......................... …………………………………….. Fissurella maxima Sowerby 1835 (24) Con estrías radiales y de crecimiento................................................ (25) (24') Sólo con estrías de crecimiento......................................................... (27) (25) Concha oval – alargada, medianamente alta, con margen grueso.... (26) (25') Concha alargada, baja, con margen angosto, redondeado y ligeramente crenulado. Color amarillo con radios anaranjados................................... …………………………... Fissurella oriens fulvescens Sowerby 1835 (26) Concha amarillenta grisácea con radios rojos, borde oscuro color uniforme, pero se traslucen el color de los radios.................................... ……………………………………...... Fissurella cumingi Reeve 1849 (26') Concha grisácea con numerosos radios púrpura oscuros entrecortados por las estrías de crecimiento, borde oscuro, área apical blanca, generalmente desgastada................. Fissurella limbata Sowerby 1835 (27) Concha medianamente alta, color marrón rojizo con numerosos radios púrpura, área apical color más claro......................................................... ………………………………………. Fissurella bridgesii Reeve 1849 Alberto N. Olivares Paz, 2007 277 (27') Concha muy baja, color marrón rojizo con radios oscuros, que forman puntos y líneas zigzag....................... Fissurella pulchra Sowerby 1835 Filogenia del género Fissurella Anexos 278 Anexo 4 Invest. Mar., Valparaíso, 34(1):113-118, 2006 Nota Científica Autentificación de lapas del género Fissurella (Mollusca: Vetigastropoda) en la costa chilena, mediante PCR-RFLP* Alberto Olivares-Paz1,2, Javier Quinteiro2 & Manuel Rey-Méndez2 1Departamento de Acuicultura, Facultad de Recursos del Mar, Universidad de Antofagasta Casilla 170, Antofagasta, Chile 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, España RESUMEN. Las lapas, clasificadas en el género Fissurella, se explotan desde tiempos prehistóricos en la costa chilena. Las diversas especies de lapas presentan diferencias en la consistencia o dureza del músculo y en cualidades organolépticas, por ello son distintamente valoradas por los consumidores. La ausencia o desconocimiento de los caracteres morfológicos diagnósticos, en algunas presentaciones del recurso, fraudes en el etiquetado o designación y la sobreexplotación de este recurso, demanda una metodología de identificación de cada especie. Este método garantizaría el correcto etiquetado de los productos comerciales y sería de utilidad en la gestión pesquera. Así, se diseñó un protocolo de PCR-RFLP que permite la identificación de diferentes especies de Fissurella, teniendo en cuenta incongruencias entre la taxonomía actual del género y los datos genéticos. La digestión de productos de PCR, con dos enzimas de restricción específicas (HpyCH4 V y Nla III), genera patrones específicos de restricción, los cuales permitirán identificar con precisión las diversas especies en cualquier fase de su comercialización y de su ciclo biológico. Palabras clave: lapas, Fissurella, PCR-RFLP, autentificación, Chile. Authentication of Fissurella species (Mollusca: Vetigastropoda), harvested in the Chilean coast, by PCR-RFLP* ABSTRACT. Keyhole limpets, belonging to the Fissurella genus, have been harvested along the Chilean coast since prehistoric times. Exploited species show differences in tissue consistency and organoleptic features, and so are differently appreciated by consumers. The absence of morphological diagnostic characters in some food products elaborated using limpets, fraudulent commercial labeling or designation, and the overexploitation of this marine resource, suggest the need for a species identification methodology. The method would be a tool to guarantee the correct labeling of commercial products and for future fishery management purposes. A PCRRFLP protocol, using two restriction enzymes (HpyCH4 V and Nla III) allowed species identification within the Fissurella genus along Chilean coast, suggesting incongruence between classical taxonomy and genetic data. The specific restriction patterns are expected to be useful for species authentication in commercial products and for species identification in any phase of the life-cycle of Fissurella species. Key words: keyhole limpets, Fissurella, PCR-RFLP, authentication, Chile. Alberto N. Olivares Paz, 2007 279 Los especímenes de mayor tamaño del género Fissurella (Mollusca: Vetigastropoda) habitan la zona litoral costera de Chile (18,4º-56,0ºS) (Bretos & Chihuailaf, 1993). Llamadas popularmente lapas o chapas, desde tiempos prehistóricos han formado parte de la dieta humana (Jerardino et al., 1992; Gaete et al., 2004). Actualmente, de las 13 especies validadas (McLean, 1984), 10 de ellas (F. latimarginata, F. cumingi, F. pulchra, F. bridgesii, F. costata, F. nigra, F. picta, F. maxima, F. crassa y F. limbata) forman una pesquería multiespecífica, con la denominación genérica Fissurella spp. (Bretos, 1988). Además, F. oriens y F. radiosa se consumen en las localidades donde son extraídas. Por el contrario, F. peruana es de tamaño pequeño (máximo 30 mm) y no se extrae para fines de consumo ni para su comercialización. Las distinciones entre las especies están fundamentadas en caracteres morfológicos, morfométricos y patrones de coloración de la concha, pie, manto y cabeza, los cuales a veces suelen ser parecidos entre organismos de especies diferentes (McLean, 1984; Oliva & Castilla, 1992; Guzmán et al., 1998). También, los caracteres distintivos están enmascarados o deteriorados por los organismos epibiontes y la coloración del cuerpo se pierde después que el organismo ha sido extraído (Olivares et al., 1998). Todo esto, frecuentemente, dificulta distinguir las diferentes especies. En la última década se ha extraído un promedio anual de 2.939 ± 585 ton de Fissurella spp. y desde el año 2000, menos del 10% del desembarque pesquero se ha desglosado con las denominaciones vernaculares de lapa negra, reina y rosada, las cuales corresponden a las especies F. latimarginata, F. maxima y F. pulchra o F. cumingi, respectivamente (Bretos, 1988; Osorio, 2002; SERNAPESCA, 2003). Parte de la comercialización se realiza directamente al público como producto fresco entero y fresco desconchado eviscerado; pero mayoritariamente se destina a la industria pesquera, la cual procesa el músculo del pie en la forma de fresco refrigerado, congelado y en conserva (Osorio, 2002). El procesamiento industrial implica la pérdida total de los caracteres de las especies, resultando imposible su distinción. El consumidor tiene preferencias particulares por algunas especies, respecto de otras, ya sea por el rendimiento de carne, consistencia o cualidades organolépticas del pie muscular; todo lo cual ha generado una sobreexplotación de algunas especies (Bretos, 1988; Olivares et al., 1998; Oliva & Castilla, 1992) y conlleva la tendencia a expender suplantando el nombre de las lapas de mayor aprecio por parte de los consumidores. El presente trabajo da a conocer una metodología de PCR-RFLP (Polymerasa Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism) que permite la autentificación de las especies del género Fissurella, actualmente explotadas en Chile, la cual fue diseñada según las secuencias mitocondriales descritas previamente para las especies. Además, se presenta la incongruencia entre los resultados de la metodología y la clásica asignación de especies, descritas a partir de los variables y pocos precisos caracteres morfológicos, para la exhaustiva identificación de algunas especies. Filogenia del género Fissurella Anexos 280 A ejemplares de todas las especies de Fissurella (N = 4 a 18, por especie), excepto F. peruana, se aisló ADN a partir de tejido muscular del pie, mediante el uso del kit DNeasy Tissue (Qiagen). Un fragmento de 410 pb (pares de bases), localizado en el gen mitocondrial citocromo b, fue amplificado mediante PCR con los cebadores UCYTB151F y UCYTB272R (Merritt et al., 1998). La reacción de PCR se realizó en un volumen de 30 µL conteniendo Promega Buffer x 1, 2,5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 0,1 µM de cada cebador, 0,025 U/I de Taq DNA polimerasa (Promega) y 0,5 µL de DNA total. Las condiciones de PCR consistieron en un paso de desnaturalización inicial de 3 min a 94ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC, fusión a 50ºC y extensión a 72ºC por 20, 30 y 60 s, respectivamente, más una extensión final a 72ºC por 5 min. El producto de la amplificación y digestión fue verificado mediante electroforesis en gel de agarosa, visualizándolo en transiluminador de luz ultravioleta. La detección de sitios polimórficos localizados dentro de dianas de enzimas de restricción comerciales, se realizó analizando las secuencias depositadas para las especies en el GenBank/EMBL/DDBJ (Números de acceso: AY940884-AY940976), mediante el programa BioEdit version 7.0.1 (Hall, 1999). Se seleccionaron las enzimas Nla III (CATG’) y HpyCH4 V (TG’CA) (isosquizómero: CviR I) (NEB). La digestión del producto de PCR fue llevada a cabo en volúmenes de reacción de 20 µL conteniendo Buffer IV (NEB) y 5 unidades de las enzimas HpyCH4 V y Nla III (NEB), con incubación a 37ºC durante 4 horas. El fragmento amplificado del gen mitocondrial Citocromo b contiene 410 pares de bases, cebadores incluidos. Las enzimas HpyCH4 V y Nla III detectan varios sitios polimórficos, generando patrones de restricción específicos para las especies: F. pulchra, F. radiosa, F. crassa, F. nigra, F. limbata, F. maxima. Las especies F. latimarginata, F. cumingi, F. oriens, F. bridgesi comparten un patrón similar entre si y diferente al de las otras especies. De igual manera, las especies F. costata y F. picta presentan idénticos fragmentos de restricción (Figura 1). Alberto N. Olivares Paz, 2007 281 Figura 1. Geles de agarosa mostrando los perfiles de restricción tras la digestión, del producto de PCR situado en el citocromo b, con las enzimas HpyCH4 V y Nla III. Figure 1. Agarose gel showing the restriction profiles observed after digestion of Cytochrome b PCR product with enzymes Hpy CH4 V y Nla III.