Obtención de un ovoproducto con contenido reducido en colesterol

FACULTAD DE CIENCIAS GRADO EN NUTRICIÓN HUMANA Y DIETÉTICA Dña. Olga Yanes Marqués OBTENCIÓN DE UN OVOPRODUCTO CON CONTENIDO REDUCIDO EN COLESTEROL Trabajo Fin de Grado Junio 2016 - 1 - ÍNDICE DE CONTENIDOS RESUMEN/ABSTRACT/RESUMO.............................................................................................3 1. INTRODUCCIÓN...................................................................................................................6 1.1. Los alimentos funcionales en la actualidad........................................................................6 1.2. El huevo: características generales.....................................................................................7 1.3. Mercado potencial para ovoproductos funcionales.............................................................9 1.4. Huevos y ovoproductos con contenido reducido en colesterol.........................................10 1.5. El quitosano: un polímero prometedor.............................................................................11 1.5.1. Origen y estructura del quitosano...........................................................................11 1.5.2. Propiedades fisicoquímicas del quitosano..............................................................12 1.5.3. Propiedades biológicas del quitosano.....................................................................14 1.5.4. El quitosano como agente antimicrobiano..............................................................14 1.5.5. El quitosano como agente antioxidante..................................................................16 1.5.6. El quitosano como agente captador de grasas........................................................17 1.5.7. El quitosano: un polímero con capacidad filmogénica...........................................17 1.5.8. Potenciales aplicaciones de las películas de quitosano...........................................19 2. OBJETIVOS...........................................................................................................................24 3. MATERIAL Y MÉTODOS..................................................................................................25 3.1. Reactivos...........................................................................................................................25 3.2. Caracterización del quitosano...........................................................................................25 3.2.1. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FT-IR)......................25 3.2.2. Análisis elemental...................................................................................................25 3.2.3. Viscosimetría..........................................................................................................26 3.3. Elaboración de films de quitosano y procedimiento desarrollado para la eliminación de colesterol..................................................................................................................................26 3.4. Elaboración del ovoproducto con contenido reducido en colesterol................................28 3.5. Aceptabilidad del ovoproducto por parte del consumidor................................................29 3.6. Determinación del colesterol............................................................................................30 3.6.1. Reactivos.................................................................................................................30 3.6.2. Método de extracción del colesterol.......................................................................31 - 2 - 3.6.3. Análisis de colesterol por Cromatografía de Gases - Espectrometría de Masas (GC-MS)...........................................................................................................................32 3.7. Determinación de la vida útil microbiológica...................................................................33 3.7.1. Determinación de microorganismos aerobios mesófilos........................................33 3.7.2. Determinación de la Fam. Enterobacteriaceae......................................................34 3.7.3. Determinación de Staphylococcus aureus coagulasa positivos.............................34 3.7.4. Determinación de microorganismos lipolíticos......................................................34 3.7.5. Determinación de microorganimos proteolíticos....................................................35 3.7.6. Determinación de microorganismos aerobios psicrófilos.......................................36 3.8. Análisis estadístico............................................................................................................36 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...........................................................................................38 4.1. Caracterización del quitosano...........................................................................................38 4.1.1. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FT-IR).....................38 4.1.2. Análisis elemental...................................................................................................39 4.1.3. Viscosimetría..........................................................................................................39 4.2. Reducción del contenido en colesterol de 1 ovoproducto mediante la utilización de films de quitosano ............................................................................................................................39 4.3. Estudio de la vida útil del nuevo ovoproducto funcional en refrigeración ......................43 4.4. Aceptabilidad por parte del consumidor del nuevo producto desarrollado, en comparación con una muestra control.....................................................................................46 5. CONCLUSIONES..................................................................................................................49 6. BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................50 - 3 - Título: OBTENCIÓN DE UN OVOPRODUCTO CON CONTENIDO REDUCIDO EN COLESTEROL. RESUMEN: El colesterol es un compuesto lipídico indispensable para el buen funcionamiento del organismo humano pues se encuentra formando parte de las membranas celulares y desempeña un papel crítico en el proceso de formación de determinadas hormonas, vitaminas y sales biliares. Sin embargo, una concentración elevada de colesterol en sangre se asocia con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular. A pesar de que los estudios científicos publicados hasta la fecha no han terminado de demostrar una relación clara entre el consumo de colesterol dietético y el aumento del riesgo cardiovascular, las recomendaciones alimentarias actuales para la población española aconsejan limitar la ingesta de colesterol a menos de 300 mg al día. El huevo es uno de los alimentos con mayor cantidad de colesterol, acumulándose este en la yema. Teniendo en cuenta dicha recomendación, así como el actual crecimiento del mercado de los alimentos funcionales, el objetivo del presente trabajo es elaborar un ovoproducto como es yema de huevo líquida, con un contenido reducido en colesterol empleando un biopolímero derivado de la quitina: el quitosano. Se ha aprovechado la capacidad de esta sustancia para acomplejar lípidos y su idoneidad para formar films con la finalidad de captar buena parte del contenido en colesterol del ovoproducto y poder retirarlo. El resultado final se cuantificó mediante cromatografía de gases - espectrometría de masas. El producto obtenido presentó una reducción del contenido en colesterol del 45% con respecto al original, un tiempo de vida útil mayor y mantuvo, además, sus características organolépticas habituales. Palabras clave: colesterol, huevo, quitosano, alimento funcional, ovoproducto, vida útil. - 4 - Title: OBTAINING A CHOLESTEROL-LOWERING EGG PRODUCT. ABSTRACT: Cholesterol is an essential lipidic compound for the proper functioning of the human organism, as it is part of the cell membranes and develops a critical role when forming certain hormones, vitamins and bile salts. However, a high concentration of blood cholesterol is associated to a higher cardiovascular risk. Despite many of the published studies to the date have not proved a clear relationship between the consumption of dietary cholesterol and the increase of cardiovascular risk, it is now recommended in Spain to ingest less than 300mg of cholesterol a day. The egg is one of the foods with higher rates of cholesterol, which is accumulated in its yolk. Taking into account this recommendation, as well as the growth of functional foods, the aim of this work is to obtain an egg-product, such as liquid egg yolk, with low rates of cholesterol, using a biopolymer chitin derivate called chitosan. It has been used the capacity of this substance for complexing lipids and its suitability to form films for trapping the cholesterol and removing it. The final result has been quantified through gas chromatography - mass spectrometry. The final product showed a cholesterol reduction of 45% if compared with the original product, its organoleptic properties remained unchanged and its useful life became longer. Keywords: cholesterol, egg, chitosan, functional foods, egg product, useful life. - 5 - Título: OBTENCIÓN DUN OVOPRODUCTO CON CONTIDO REDUCIDO EN COLESTEROL. RESUMO: O colesterol é un composto lipídico indispensable para o bo funcionamento do organismo humano, pois atópase formando parte das membranas celulares e desenvolve un papel crítico no proceso de formación de determinadas hormonas, vitaminas e sales biliares. Sen embargo, unha concentración elevada de colesterol en sangue asóciase cun maior risco de enfermidade cardiovascular. A pesar de que os estudos científicos publicados ata o de agora non acabaron por demostrar unha relación clara entre o consumo de colesterol dietético e o aumento do risco cardiovascular, as recomendacións alimentarias actuais para a poboación española aconsellan limitar a inxesta de colesterol a menos de 300 mg ao día. O ovo é un dos alimentos con maior cantidade de colesterol, acumulándose este na xema. Tendo en conta dita recomendación, así como o actual crecemento do mercado dos alimentos funcionais, o obxectivo do presente traballo é elaborar un ovoproducto como é xema de ovo líquida, cun contido reducido en colesterol empleando un biopolímero derivado da quitina: o quitosano. Aproveitouse a capacidade desta sustancia para acomplexar lípidos e a súa idoneidade para formar films coa finalidade de captar boa parte do contido en colesterol do ovoproducto e poder retiralo. O resultado final cuantificouse mediante cromatografía de gases - espectrometría de masas. O produto obtido presentou unha redución do contido en colesterol do 45% con respecto ao orixinal, un tempo de vida útil maior e mantivo, ademais, as súas características organolépticas habituais. Palabras chave: colesterol, ovo, quitosano, alimento funcional, ovoproducto, vida útil. - 6 - 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Los alimentos funcionales en la actualidad Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (2015), las dietas inadecuadas constituyen uno de los principales factores de riesgo relacionados con la aparición de enfermedades crónicas no transmisibles, de entre las cuales, las patologías cardiovasculares suponen la principal causa de mortalidad y de morbilidad en todo el mundo. En la actualidad, son muchas las recomendaciones dietéticas existentes orientadas a mejorar la salud de las personas y a prevenir la aparición de numerosas enfermedades. Como consecuencia de estas recomendaciones, la concienciación sobre la estrecha relación existente entre dieta y salud ha aumentado entre los consumidores. Esto, unido al deseo de conseguir una mejor calidad de vida y al creciente envejecimiento de la población, ha generado que los consumidores soliciten cada vez más su acceso a alimentos capaces de mejorar el estado de salud o de disminuir el riesgo de padecer enfermedades. Son los denominados alimentos funcionales. A día de hoy, no existe una definición legal aceptada para estos. La que goza de mayor aceptación es la definición propuesta en 1999 por la Comisión de Acción Concertada sobre Bromatología Funcional en Europa (FUFOSE), coordinada por el Instituto Internacional de Ciencias de la Vida (ILSI), según la cual "un alimento puede ser funcional si se ha demostrado de manera satisfactoria que posee un efecto beneficioso sobre una o varias funciones específicas en el organismo, más allá de los efectos nutricionales habituales, siendo esto relevante para la mejoría de la salud y el bienestar y/o la reducción del riesgo de enfermar" (Vidal-Carou, 2008). La creciente demanda de esta clase de alimentos, unida al amplio margen de beneficio económico que presentan (Kotilainen et al., 2006), convierte al mercado de los alimentos funcionales en un negocio más que atractivo para las empresas del sector. Según un estudio de "Global Industry Analysts", se trata de un mercado al alza que mueve en el mundo cerca de 100.000 millones de euros anuales, de los cuales, aproximadamente 25.000 millones corresponden a la Unión Europea (Murcia, 2013). - 7 - Dentro del mercado europeo existen importantes diferencias interregionales en cuanto a producción y consumo de alimentos funcionales. España acapara el 11 % de este mercado (Food SME Hop) con algo más de 200 productos catalogados como funcionales (Özen, 2014). Un estudio de Mintel indica que el 15 % de los alimentos y bebidas funcionales adquiridos en España se compraron con el objetivo de reducir el colesterol (Murcia, 2013). Esto evidencia la preocupación de muchos españoles por mejorar su perfil lipídico y, consecuentemente, su salud cardiovascular, ya que se ha demostrado que esta empeora a medida que aumentan los niveles sanguíneos de colesterol. El interés por adquirir alimentos con propiedades cardiosaludables se incrementa, al mismo tiempo que los consumidores se muestran más reticentes frente al consumo de aquellas comidas cuyas características han sido, durante años, asociadas con un aumento de riesgo cardiovascular. Es por esto que, debido a su elevado contenido en colesterol, el huevo ha sido un alimento muy poco recomendado por los expertos en nutrición durante bastante tiempo (Li et al., 2013). 1.2. El huevo: características generales De acuerdo con el Código Alimentario Español, se entiende por huevo aquel que es obtenido única y exclusivamente a partir de gallinas de la especie Gallus gallus. Se trata de un alimento con tres partes perfectamente diferenciadas: una yema central, que representa el 27-32 % de su peso, una clara alrededor de esta, que corresponde al 56-51 %, y una cáscara externa englobando a ambas que supone el 27-32 % (Gil, 2010). Distribuidos en el seno tanto de la yema como de la clara, se ubican numerosos compuestos que hacen del huevo un alimento de gran interés, tanto por su valor nutricional como por su contenido en sustancias biológicamente activas. Entre estas, se encuentran la lecitina, la colina, los carotenoides, la luteína o la zeaxantina, a las que se les atribuyen una gran variedad de funciones: antioxidantes, antimicrobianas, inmunomoduladoras, anticancerígenas, antihipertensivas, etc. Además, el huevo incluye en su composición diversas vitaminas y minerales, por lo que contribuye de forma muy importante a alcanzar la ingesta diaria recomendada de minerales como el Zinc, el Selenio o el Hierro y de algunas vitaminas, como la A, la D, la B2 y la B12 (Dieguez, 2014). A pesar de que su composición puede variar por diversas razones -tales como la dieta, la edad o la raza de la gallinael huevo, de media, apenas posee carbohidratos. Su aporte energético (150 - 8 - Kcal/100 g) procede del contenido proteico (12 %) y, sobretodo, graso (11 %). La composición proteica del huevo, distribuida entre la clara y la yema, se considera de alto valor biológico pues contiene todos los aminoácidos esenciales y en la proporción adecuada. Dentro de la fracción grasa, depositada de forma exclusiva en la yema, destaca la presencia de ácidos grasos insaturados (17 %) frente a los saturados (9 %). Del mismo modo, es importante el elevado contenido en colesterol, situado en torno a los 1300 mg por 100 g de yema (390 mg en 100 g de huevo entero, aproximadamente) (Moreiras, Carbajal, Cabrera y Cuadrado, 2013). A pesar de la más que probada relación existente entre los niveles de colesterol sérico y el riesgo cardiovascular, las evidencias más recientes parecen indicar que no existe asociación alguna entre el consumo de huevos y el incremento de este riesgo (Rong et al., 2013; Shin et al., 2013; Voutilainen et al., 2013; Zazpe et al., 2011; Soriano-Maldonado et al., 2013; Gates et al., 2013; Scrafford et al., 2011; Njike et al., 2010; Natoli et al., 2007). Se ha demostrado que existen factores tanto nutricionales (ingesta calórica y consumo de grasas saturadas y trans) como no nutricionales (etnia, edad, predisposición genética, componentes hormonales, actividad física, etc.), cuya influencia sobre los niveles de colesterol en sangre es mucho mayor que la ejercida por el colesterol obtenido directamente a través de la dieta (Guallar-Castillón et al., 2012). Las últimas Guías de Alimentación Saludable de los EE.UU. publicadas en el presente año 2016, refuerzan esta idea, ya que por primera vez no incluyen entre sus recomendaciones ningún tipo de restricción con respecto al colesterol dietario. Sin embargo, sí indican que "en general, la ingesta media de huevos es alta para chicos adolescentes y hombres adultos, que deben reducir su consumo" (American Heart Association, 2016). Sin embargo, y en contraposición a estas Guías estadounidenses, las recomendaciones alimentarias para la población española actuales, recogidas en un documento fruto de un consenso entre la Sociedad Española de Dietética y Ciencias de la Alimentación (SEDCA), la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (SEEDO), la Sociedad Española de Hipertensión - Liga Española para la Lucha contra la Hipertensión Arterial (SEH-LELHA) y la Sociedad Española de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica (SEGHNP) (2014), afirman la necesidad de limitar la ingestión de colesterol a menos de 300 mg al día. Esta recomendación está justificada en base a la existencia de otros muchos estudios y meta-análisis (Li et al., 2013; Djousse y Graziano, 2008; Nakamura et al., 2004; Spence et al., 2012; Weggemans et al., 2001) cuyos resultados, en cambio, sí - 15 - condiciones ácidas), uniéndose a ellos selectivamente. De este modo, al desestabilizar la pared celular de los microorganismos, el quitosano puede inhibir el crecimiento microbiano y la producción de diversas toxinas. Otro mecanismo que se plantea atiende a la capacidad del quitosano de bajo peso molecular para penetrar en el interior de la célula e inhibir el crecimiento de esta. El quitosano puede interactuar con el ADN celular, interfiriendo en la síntesis de ARNm y, por tanto, de proteínas. También es capaz de suprimir la acción de varias enzimas. Por último, se ha visto que el quitosano puede activar determinados mecanismos de defensa presentes en el tejido hospedador (Kong et al., 2010; Valenzuela y Arias, 2012; Devlieghere, Vermeulen y Debevere, 2004). La actividad antimicrobiana del quitosano se ve muy influenciada por diversos factores, tanto intrínsecos como extrínsecos a la molécula. Entre los primeros se encuentran el peso molecular, la solubilidad, el grado de desacetilación y la densidad de carga positiva del polímero, su viscosidad, etc. En general, ha sido demostrado que el quitosano de bajo peso molecular presenta mejor actividad antimicrobiana en comparación con el de alto peso molecular. De igual forma, su acción contra microorganismos patógenos se incrementa en la medida en que lo hace su grado de desacetilación, pues una alta proporción de grupos aminos desacetilados aumenta tanto la solubilidad como la densidad de carga del polímero. Sin embargo, el peso molecular o el grado de desacetilación del quitosano son factores cuya repercusión sobre la acción antimicrobiana de este no se puede estudiar de forma aislada, pues existen otros muchos condicionantes al respecto de esta actividad. Así, existen también factores extrínsecos al quitosano que actúan sobre la acción antimicrobiana de esta molécula, como son el tipo de especie microbiana (hongos, bacterias Gram + o Gram-, levaduras...) y su fase de crecimiento, o las características específicas del medio (pH, fuerza iónica, tiempo y temperatura...) (Kong et al., 2010; Aider, 2010; Zivanovic et al., 2005). La actividad antimicrobiana del quitosano ha sido demostrada frente a muchas bacterias, levaduras y hongos, resultando estos últimos los más sensibles. El método de acción antimicrobiana difiere según se trate de uno u otro microorganismo. Así, en el caso de los hongos, el quitosano actúa inhibiendo la formación de esporas e hifas, interfiriendo en el crecimiento de los mismos, o activando diferentes mecanismos de defensa frente a ellos. La - 16 - inhibición del crecimiento se debe a la formación de complejos entre los grupos amino protonados del quitosano y los grupos acídicos y básicos presentes en la superficie celular de los hongos. Estos complejos formados son los responsables de los desórdenes estructurales acontecidos en la superficie fúngica, impidiendo el crecimiento de los hongos (Dutta et al., 2009). El mecanismo antimicrobiano ejercido frente a las bacterias es más complejo y difiere entre bacterias Gram + y Gram -, pues las superficies celulares de cada una de las dos clases bacterianas son diferentes. La sensibilidad mostrada ante el quitosano por una u otra clase bacteriana también varía. Aunque los estudios realizados en este sentido no obtuvieron resultados demasiado esclarecedores, en general se acepta que las bacterias Gram + son más sensibles al quitosano que las de tipo Gram - (Aider, 2010). Por otra parte, como se indicó antes, las características específicas del medio también influyen de forma notable en la actividad antimicrobiana del quitosano. Por ejemplo, un pH bajo eleva dicha actividad debido, entre otras razones, al aumento de la solubilidad del quitosano y al estrés ácido al que se ven sometidos los microorganismos diana (Dutta et al., 2009; Aider, 2010). 1.5.5. El quitosano como agente antioxidante A día de hoy, el mecanismo mediante el cual el quitosano actúa como antioxidante no está totalmente esclarecido. Xie et al. (2001) plantearon tres posibles métodos de acción antioxidante por parte del quitosano. Estos se basan en tres reacciones distintas: entre los grupos hidroxilo del propio polisacárido y los radicales •OH; entre los grupos -NH2 del quitosano y los radicales •OH; y entre los grupos amino protonados (-NH3+) y los radicales •OH. Por su parte, Chen et al. (2009) justifican el atrapamiento de radicales libres a través de la transferencia de los electrones presentes en los grupos amino. Otro posible mecanismo de acción antioxidante del quitosano se basa en su capacidad como agente quelante. Peng et al. (1998) mostraron que el quitosano retarda la oxidación lipídica mediante la quelación de iones Fe2+ a través de sus grupos amino o hidroxilo, suprimiendo la actividad prooxidante de este metal o su conversión en iones férricos Fe3+. Al igual que la actividad antimicrobiana, el potencial antioxidante del quitosano también se ve influenciado por diversos factores, entre los que se encuentra el peso molecular del polisacárido. - 17 - Algunas investigaciones apuntan a que a medida que desciende el peso molecular del quitosano, su actividad antioxidante se incrementa (Park, Marsh y Rhim, 2002). 1.5.6. El quitosano como agente captador de grasas El quitosano tiene la capacidad de formar complejos con diferentes lípidos, tales como los ácidos grasos o el colesterol (Wydro, Krajewska y Hac-Wydro, 2007). Sin embargo, se necesita una investigación más amplia para determinar con exactitud el mecanismo de acción de este polímero como aglutinante de grasas. Diversos estudios in vitro (Thongngam y McClements, 2004) han señalado que el quitosano puede unirse a los ácidos grasos mediante interacciones electrostáticas entre sus grupos amino y los grupos carboxílico de estos. También se ha indicado que el quitosano es capaz de unirse a los grupos hidroxilo pertenecientes al colesterol a través de enlaces de hidrógeno. Además de estos dos mecanismos, diversos investigadores apuntan a la participación de enlaces hidrofóbicos en la formación de complejos entre lípidos y quitosano. In vivo, tanto en animales como en organismos humanos, se ha estudiado la posible acción antihiperlipidémica ejercida por el quitosano y sus derivados. Esta se atribuye a la capacidad del este biopolímero para formar, en el medio ácido del estómago, complejos iónicos con compuestos lipídicos cargados negativamente, tales como ácidos grasos, e hidrófobos con lípidos neutros como el colesterol y otros esteroles, interfiriendo en su proceso de emulsificación. Al ser el quitosano un compuesto cuya hidrólisis enzimática digestiva resulta muy complicada, los complejos formados entre este derivado de la quitina y diversos lípidos impiden la absorción de estos últimos a nivel intestinal, excretándose por las heces (Wydro et al., 2007). De esta forma, la ingesta de quitosano propicia el mantenimiento de niveles adecuados de colesterol LDL en sangre. El Panel de la European Food Safety Authority (EFSA, 2011) así lo asume, permitiendo alegar esta propiedad saludable en productos basados en quitosano que son objeto de comercialización en la actualidad. 1.5.7. El quitosano: un polímero con capacidad filmogénica. El quitosano, al ser capaz de disolverse en una solución acuosa diluida de ácidos orgánicos, puede formar películas por sí solo empleando diversas metodologías. Entre ellas, la más utilizada - 18 - se basa en la evaporación del solvente empleado. Durante este secado, que tiene lugar tras verter la solución formada sobre una superficie lisa (generalmente de plástico), la concentración de quitosano se incrementa induciendo un reajuste molecular. Esta nueva disposición de las moléculas resulta en la formación de un gel, seguido de la aparición de la película en sí que, debido a sus propiedades específicas, es de elevado interés tecnológico. La calidad de estos films se ve afectada por muchas variables: la fuente de quitina empleada para extraer el quitosano, las propiedades de este, los solventes utilizados y el método de preparación de las películas, así como los tipos y cantidades de copolímeros y plastificantes adicionados (Fernández-Cervera et al., 2004). Las películas o films de quitosano son delgadas, flexibles, fuertes, duraderas y resistentes. Poseen valores moderados de permeabilidad al agua y son, en cambio, muy poco permeables al oxígeno, disminuyendo la velocidad de respiración de los alimentos en donde se prueban. Estas propiedades mecánicas y permeables no son invariables, sino que pueden controlarse en función del peso molecular y de los solventes escogidos (Agulló et al., 2003). Se considera que el quitosano es inocuo (Aider, 2010), por lo que los films formados a partir de él pueden ser o no comestibles, dependiendo del tipo de solventes empleados y de los demás compuestos susceptibles de ser añadidos a las películas. Algunos estudios han demostrado que el quitosano es biodegradado in vivo por la lisozima humana, capaz de hidrolizar los enlaces -(1,4) del polímero, siendo los productos resultantes de su degradación no tóxicos. Se trata de metabolitos naturales que tras su absorción pueden ser incorporados a algunas rutas metabólicas específicas del organismo, o bien resultar excretados. Es deseable que los polímeros formadores de películas sean también biodegradables para que sus productos de degradación resulten inocuos. Además, las películas elaboradas a partir de quitosano presentan otras tres características de gran relevancia que facilitan, en gran medida, su aplicación: bioadherencia, alta biocompatibilidad y transparencia (Valenzuela y Arias, 2012). Las películas de quitosano puro poseen propiedades mecánicas deficientes, por lo que, en la mayor parte de las ocasiones, se emplean mezclas de quitosano con agentes plastificantes. Con frecuencia, se añaden otros compuestos naturales para mejorar la actividad antimicrobiana de los films (Park et al., 2002; Agulló et al., 2003). Se ha observado que las películas de quitosano presentan un efecto antimicrobiano frente a una gran variedad de microorganismos que contaminan alimentos de origen animal y son origen - 19 - de numerosas enfermedades: Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus... (Valenzuela y Arias, 2012). Esta capacidad, tanto para evitar la contaminación de patógenos como para inhibir y/o retardar el crecimiento de microorganismos que deterioran alimentos de origen animal, convierte a las películas de quitosano en un elemento de gran interés industrial, resultando especialmente prometedor para su inclusión en diversos envases alimenticios. 1.5.8. Potenciales aplicaciones de las películas de quitosano. El quitosano, debido a sus características de biodegradabilidad, no toxicidad y biocompatibilidad, así como a su actividad antimicrobiana y a sus propiedades físicas y químicas, constituye un material muy versátil y, por tanto, con una gran cantidad de aplicaciones en diferentes sectores. Su potencial de uso se incrementa al tratarse de un biopolímero que, junto con otras sustancias, posee la capacidad de formar films, fibras, geles, esponjas e incluso nanopartículas (Kong et al., 2010). El quitosano, en sus diferentes presentaciones, goza de aplicación en industrias tan dispares como la del papel o la industria textil; en el campo de la biomedicina, donde se puede encontrar formando parte de sistemas liberadores de fármacos o en membranas de hemodiálisis, empleándose, también, como agente formador de suturas y como cicatrizante en caso de quemaduras; en agricultura, al ser capaz de mejorar el rendimiento agronómico por su papel como repelente de insectos y como agente de recubrimiento de semillas para fomentar su conservación; y en ganadería, al utilizarse como aditivo en alimentación animal. La industria cosmética constituye otro campo de aplicación del quitosano, recurriendo a él para la elaboración de numerosas cremas. Por otra parte, la consideración de este material como un polímero con capacidad floculante, coagulante y filtrante, justifica su utilización en diversos tratamientos de aguas (Velásquez, 2003; Nakamatsu, 2013). El quitosano también tiene cabida en el sector de la dietética, al ser considerado como un agente capaz de contribuir al mantenimiento de las concentraciones normales de colesterol-LDL en sangre. En lo que a esta función respecta, la European Food Safety Authority (EFSA) ha emitido un informe favorable, especificando que "sí se puede establecer una relación causa-efecto entre el consumo de 3 g de quitosano diarios y el - 20 - mantenimiento de las concentraciones de colesterol-LDL en la sangre normal" (EFSA Journal, 2011). Pero, actualmente, el quitosano está adquiriendo gran relevancia en una industria en concreto: la alimenticia. Se usa como antioxidante y como aditivo gelificante, emulsificante y espesante en alimentos. También se utiliza como fibra dietaria y como agente clarificante en numerosas bebidas (Mármol et al., 2011). Sin embargo, el interés creciente mostrado por esta industria radica en la posibilidad de aplicación de películas bioactivas hechas a base de quitosano como material de envasado de numerosos alimentos, con el fin de preservar la calidad de los mismos y prolongar, así, su tiempo de vida útil. Además, el quitosano ha sido utilizado en forma de films comestibles para revestir alimentos y protegerlos de posibles alteraciones (Dutta et al., 2009; Aider, 2010). Según la FAO y la OMS (2003), "la contaminación de los alimentos con microorganismos patógenos provoca enormes pérdidas en la industria alimentaria y la economía". Debido a esto, la industria alimenticia moderna se encuentra en un proceso de renovación continuo, tratando de buscar nuevas estrategias sostenibles para conseguir reducir la incidencia de la contaminación microbiana en la cadena alimentaria y ser, así, capaces de ofrecer productos alimenticios de mejor calidad y con un mayor tiempo de vida útil. Al mismo tiempo, esta industria intenta hacer frente a la creciente demanda de productos más saludables por parte de los consumidores. En el esfuerzo por alcanzar todos estos objetivos, el envasado de los alimentos y productos alimenticios desempeña un papel fundamental. Actualmente, los plásticos son el material más utilizado en la elaboración de envases alimentarios, por su alta eficacia como preservante. Sin embargo, presentan grandes desventajas: nula o escasa biodegradabilidad, alto poder contaminante, elevado coste, baja tasa de reciclaje (el porcentaje estimado es del 15 %) y baja tasa de reutilización (Arandes et al., 2004). A causa de estos inconvenientes, y para dar respuesta a la demanda de sistemas de empaque más eficientes que contaminen menos los alimentos, el uso de polímeros funcionales para la elaboración de envases alimentarios se ha visto favorecido. Diversos investigadores han señalado al quitosano como un elemento altamente prometedor para preservar tanto alimentos como productos alimenticios durante su procesado y almacenado y mejorar la calidad de los mismos (Aider, 2010; Dutta et al., 2009). - 21 - A diferencia de los plásticos, derivados del petróleo, el quitosano procede de fuentes renovables, no tóxicas, no alergénicas y biodegradables, como son los subproductos de la industria pesquera (Mármol et al., 2011). Además de por su origen natural, el quitosano resulta atractivo por su abundancia, apariencia estética y por sus propiedades filmogénicas y antimicrobianas. Capaz de inhibir el deterioro de alimentos y la patogenicidad de los microorganismos, el uso del quitosano, en forma de películas y soluciones, para generar envases y recubrimientos activos ha recibido un interés considerable en el último tiempo. Como agente antimicrobiano, los films de quitosano presentan ventajas sobre otros tipos de envases activos: actividad antibacteriana y tasa de inhibición mayores, espectro de acción más amplio, capacidad de acomplejar minerales bivalentes y de portar sustancias funcionales con actividad antibacteriana y antioxidante y menor toxicidad para las células de mamíferos (Valenzuela y Arias, 2012; Dutta et al., 2009). Por contra, el coste de preparación y las propiedades mecánicas deficientes de las películas de quitosano puro dificultan su utilización, lo que justifica su elaboración en conjunto con otros compuestos, tales como proteínas y agentes plastificantes. La mezcla de quitosano con otros materiales no solo ha servido para reducir el coste de fabricación y mejorar las propiedades mecánicas de los films, sino que también ha sido de utilidad para mejorar las propiedades antimicrobianas de los mismos (Aider, 2010). Por ejemplo, se ha demostrado que la incorporación de sustancias como sorbato potásico o nisina a los films de quitosano, incrementa notablemente la acción antimicrobiana de estos contra numerosos microorganismos patógenos responsables del deterioro de diversos alimentos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus...) (Dutta et al., 2009). El quitosano ha demostrado ser capaz de inhibir y/o disminuir el crecimiento de los principales microorganismos patógenos que afectan a alimentos de origen animal. Destaca su efecto contra Campylobacter spp., el cual es considerado como el patógeno más importante en este tipo de alimentos, sobre todo procedentes de aves, encontrándose involucrado en la transmisión de un gran número de enfermedades gastrointestinales en todo el mundo (Valenzuela y Arias, 2012). También se han probado envases activos hechos a base de este biopolímero en gran cantidad de frutas y verduras pues, además de su gran potencial antimicrobiano, las películas de quitosano - 22 - han sido investigadas por su capacidad para reducir la producción de etileno y dióxido de carbono, retardando el proceso de maduración de los vegetales. Estos films, al poseer valores moderados de permeabilidad al agua, reducen la transferencia de humedad y, al actuar como barrera frente al oxígeno, impiden la acumulación y la proliferación de hongos, al mismo tiempo que disminuyen la velocidad de respiración del alimento sobre el que se aplica. En general, ayudan a controlar y conservar las características morfológicas, fisicoquímicas y fisiológicas de una gran variedad de alimentos y productos alimenticios (Agulló et al., 2003). Se ha observado que los envases activos de quitosano aumentan la estabilidad de almacenamiento de la carne y productos cárnicos y mejoran sus propiedades organolépticas al disminuir la oxidación lipídica. En este sentido, el quitosano actúa como antioxidante. También se propicia el mantenimiento del color rojo vivo de la carne y la disminución del olor desagradable causado por la rancidez de los lípidos presentes en ella. El resultado es una mejora considerable en la apariencia y en el tiempo de vida útil de la carne. En leche y lácteos, se han utilizado esta clase de películas bioactivas como base para la incorporación de natamicina, un agente antimicrobiano. Al recubrir con estos films quesos semiduros, disminuye el crecimiento fúngico en la parte superficial de los mismos, incrementándose la durabilidad de estos quesos con respecto a los envasados con empaques tradicionales. Por otra parte, el quitosano también se ha empleado en la industria láctea como coagulante de la caseína y para desarrollar nuevos productos lácteos fermentados, en cuyo caso se agregó el biopolímero como fibra natural (Valenzuela y Arias, 2012). Tanto en la industria cárnica, como en la láctea, el quitosano ha demostrado ser capaz de evitar el pardeamiento no enzimático o reacción de Maillard, causante de deterioro en numerosos alimentos de origen animal (Valenzuela y Arias, 2012). Alimentos compuestos, tales como pasteles, también se pueden beneficiar de los envases y recubrimientos comestibles de quitosano, al ser estos capaces de controlar las transferencias de masa entre los diferentes compartimentos del alimento, reduciendo, por ejemplo, la migración de agua entre ellos. Estos envases comestibles también facilitan la manipulación y el transporte de los alimentos y mejoran sus características sensoriales. (Dutta et al., 2009) - 23 - Por último, las películas y recubrimientos basados en quitosano están atrayendo la atención de la industria del huevo, al demostrarse su eficacia en la preservación de la calidad interna de estos sin afectar a sus características organolépticas y, por tanto, a la aceptación por parte del consumidor. Dispuestas sobre la cáscara de los huevos, estas películas resultan efectivas contra microorganismos patógenos relacionados con el deterioro de huevos, tales como Acinetobacter baumannii, Alcaligenes spp., Carnobacterium sp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas spp., Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, y Staphylococcus warneri (Valenzuela y Arias, 2012). Además, se ha visto que estas cubiertas de quitosano aplicadas a huevos enteros, previenen la pérdida de peso por parte de los mismos y preservan su calidad interna, prolongando, de esta forma, su tiempo de vida útil (Kim et al., 2009). - 24 - 2. OBJETIVOS La sociedad actual está tomando cada vez más conciencia de que los alimentos no son un simple material que ayuda a paliar el hambre o que estrictamente cubre las necesidades del cuerpo, sino que se trata de algo que afecta de forma clara a la salud e incluso puede ser el origen del desarrollo de enfermedades a largo plazo. Organizaciones internacionales como la OMS o los expertos nutricionistas y dietistas de todo el mundo, están desarrollando programas de formación para la población recomendando persistentemente el consumo de una dieta equilibrada y recordando que se debe de tener cuidado con el abuso en la ingesta de determinados alimentos. Como consecuencia, entre otras, la composición nutricional de los alimentos se ha convertido ya en un factor importante que los consumidores tienen muy en cuenta a la hora de seleccionar los productos que compran. El huevo es un alimento muy completo desde el punto de vista nutricional que claramente debe de estar presente en la dieta y así fue durante siglos. Sin embargo, desde hace un tiempo se está dejando de consumir porque su alto contenido en colesterol ha sido destacado como algo no saludable en las informaciones de difusión pública. Las nuevas investigaciones científicas están revelando que esto no es así, pero de todas formas los consumidores siguen siendo reacios a volver a consumir huevos. Por todo lo expuesto, el presente trabajo tiene como objetivo principal la elaboración de un ovoproducto funcional con bajo contenido en colesterol. Para ello, el colesterol presente en la yema de huevo se intentará retirar haciendo uso de films de quitosano. Además, debido a las propiedades antimicrobianas de éste, y como objetivo secundario, se evaluará si la aplicación prolongada de estos films de quitosano en la yema de huevo es capaz de incrementar su tiempo de vida útil aún en crudo. - 31 - 3.6.2. Método de extracción del colesterol Brevemente, el proceso de extracción de colesterol de las distintas muestras a analizar consistió en pesar 1 g de yema de huevo en tubos Falcon a los que se les añadieron 5 ml de solución metanólica de hidróxido potásico de concentración 10 M. Las muestras se llevaron a un baño de ultrasonidos durante 15 minutos y se dejaron toda la noche en condiciones de oscuridad y refrigeración (8ºC máximo) para que tuviese lugar la saponificación de la grasa. Una vez pasado ese tiempo, se procedió a la extracción del colesterol de la fracción insaponificable añadiendo 15 ml de n-hexano y a cada una de las muestras e introduciéndolas en un baño de ultrasonidos durante 15 minutos. A continuación se realizó una centrifugación durante 5 minutos a 2500 rpm para facilitar la separación de las fases. Se tomaron alícuotas de los sobrenadantes y se hicieron diluciones 1/80 en n-hexano para, posteriormente, tomar 500 μl. A esos 500 μl, en un vial de inyección, se les añadió el patrón interno (50 μl de 5-Colestano [10 g/ml]) y la mezcla se llevó a sequedad bajo corriente de aire a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 50 μl de derivatizante Tri-SIL. Las muestras se agitaron y se dejaron en una estufa a 55ºC durante 30 minutos para, finalmente, añadir 1 mL de isoctano, agitar y proceder a su análisis. Al mismo tiempo que se realizó la extracción de colesterol de las diferentes muestras de yema, se prepararon distintas concentraciones de colesterol de 1, 2 ,3 ,4 μg/kg para ser utilizadas como patrón a las que se les añadió el mismo patrón interno. Figura 5. Separación de las fases saponificable e insaponificable de las distintas muestras de yema de huevo. - 32 - 3.6.3. Análisis de colesterol por Cromatografía de Gases con detección por Espectrometría de Masas (GC-MS). Una vez extraído el colesterol, las muestras se analizaron por Cromatografía de Gases con detección por Espectrometría de Masas (GC-MS) utilizando un cromatógrafo de gases modelo TRACE GC-ULTRA acoplado a un detector de espectrometría de masas modelo DSQ-II (Thermo-Fisher Scientific, USA) (Figura 14). El volumen de inyección fue de 1 μL en modo split/splitless (4:1) y la separación se produjo en una columna capilar modelo Zebron ZB-5ms (50 m x 250 μm x 0,25 μm, PHENOMENEX, UK) utilizando Gas Helio (pureza 3x. Praxair, España) como gas portador a un flujo de 1 mL/min. La temperatura del horno del cromatógrafo se ajustó mediante una rampa de temperatura desde 75 ºC a 300 ºC. Las temperaturas del inyector, de la interfase y de la fuente fueron ajustadas a 250 ºC, 280 ºC y 230ºC respectivamente. Figura 6. Cromatógrafo de gases acoplado a un detector de espectrometría de masas (GC-MS) La identificación cromatográfica del colesterol se realizó a través de los tiempos de retención relativos al patrón interno y para la identificación espectrofotométrica se tomó como base lo dispuesto en la Decisión 2002/657/CE, comprobando la presencia (s/n >3) de las siguientes m/z 329, 353, 368, 458 y sus relaciones de intensidad tal y como están caracterizados en la validación vigente de este procedimiento. Los datos procedentes de las lecturas se obtuvieron a través del programa Xcalibur (ver 2.0.7.) del equipo y la cuantificación se llevó a cabo mediante una hoja de cálculo desarrollada específicamente, en el programa Excel (Microsoft Office Excel Professional, 2007). - 33 - 3.7. Determinación de vida útil microbiológica Con el objetivo de evaluar el tiempo de vida útil microbiológica a través del tiempo de almacenamiento de la yema de huevo fresca en presencia del film de quitosano que consiguió una mayor disminución de colesterol (compuesto por 2 g de quitosano, 99 mL de disolución de ácido acético al 1% y 1 mL de glycerol), se llevaron a cabo estudios sobre la presencia de una serie de microorganismos específicos habituales en estos estudios: microorganismos aerobios mesófilos, microorganismos lipolíticos, microorganismos proteolíticos, microorganismos aerobios psicrófilos, Familia Enterobacteriaceae y Staphylococcus aureus coagulasa positivos. La yema, en presencia del film de quitosano se mantuvo almacenada en refrigeración a 4 ºC durante 14 días y realizando tomas de muestra a los días 0, 7 y 14. El mismo procedimiento se llevó a cabo con la yema sin film, que fue utilizada como control. Los ensayos se realizaron en todos los casos por triplicado. La metodología consistió en pesar 25 g de las diferentes muestras de yema a las que se les añadió 225 ml de agua de peptona tamponada (Merck, Darmstad, Alemania) para ser introducidas, posteriormente, en el homogeneizador (AES, Combourg, Francia) durante 30 s. A continuación, el homogenizando fue utilizado para realizar diluciones decimales seriadas que se emplearon para llevar a cabo las determinaciones microbiológicas mencionadas anteriormente. Los medios de cultivo y reactivos utilizados para las determinaciones microbiológicas, al igual que los procedimientos de siembra y recuento llevados a cabo, fueron específicos para cada uno de los diferentes tipos de microorganismos analizados y se detallan en los siguientes subapartados. El número de ufc/g correspondiente obtenido en cada caso se obtuvo tras multiplicar el número de colonias resultante por el factor de dilución. Para facilitar su comparación estadística, los resultados finales se expresaron como media de unidades logarítmicas de las unidades formadoras de colonias (log ufc) por g de muestra ± DE. 3.7.1. Determinación de microorganismos aerobios mesófilos El recuento de microorganismos aerobios mesófilos se llevó a cabo siguiendo la norma ISO 4833:2003. Para ello, se inoculó 1 mL de las diluciones seriadas correspondientes en placas Petri sobre las cuales se añadieron 15 ml de medio PCA (Plate Count Agar, Liofilchem, Milan, Italia) estéril - 34 - atemperado. Tras una agitación suave, las placas se dejaron solidificar a temperatura ambiente y, posteriormente, se incubaron en posición invertida durante 72 horas a 30 ºC, tras lo cual se contaron todas las colonias que crecieron en las placas inoculadas. 3.7.2. Determinación de la Familia Enterobacteriaceae El recuento de microorganismos pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae se llevó a cabo siguiendo la norma ISO 7402:1993. Tras la homogenización de la muestra en agua de peptona, fueron realizadas diluciones seriadas en tubo apropiadas a la muestra procesada. De cada una de estas, se extrajo 1 ml y se inoculó en una placa Petri sobre la cual se añadieron 15 ml de agar VRBD (Violet Red Bile Dextrose Agar, Liofilchem, Milan, Italia) estéril atemperado, preparado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Tras una agitación suave, las placas se dejaron solidificar a temperatura ambiente y se les añadió, posteriormente, una fina sobrecapa de medio con el fin de generar anaerobiosis. Una vez solidificadas las placas se incubaron en posición invertida a 35-37 ºC durante 24 horas, tras lo cual se contaron las colonias ovaladas de color granate con precipitado de sales biliares alrededor. 3.7.3. Determinación de Staphylococcus aureus coagulasa positivos Para realizar el recuento de S. aureus se siguió la norma UNE-EN ISO 68880-1: 1999. Así, 0,1 mL de cada una de las diluciones seriadas obtenidas tras la homogeneización de las muestras fueron inoculadas en placas de agar Baird-Parker (Biomerieux, Madrid, España) solidificado. Después, se realizó una extensión con asa de Drigalsky y se incubaron dichas placas inoculadas en posición invertida a 35-37 ºC durante 24 h. En el caso de no aparecer colonias o estas ser muy pequeñas, se continuó la incubación durante 24 h más. Se consideraron positivas aquellas colonias redondas de color negro con halo decolorado o de precipitado alrededor. 3.7.4. Determinación de microorganismos lipolíticos En este caso, el medio de cultivo se elaboró en el laboratorio, siguiendo lo publicado por Ben- Gigirey et al. (2000). - 35 - Brevemente, una mezcla de 6,5 g de caldo nutritivo (Pronadisa, Barcelona, España) y 10 g de agar (Liofilchem, Milan, Italia) se disolvieron en 500 mL de agua destilada, llevándola a ebullición bajo agitación. Posteriormente, cuando la mezcla alcanzó los 70 ºC se le añadieron 5 g de glicerina tri-butirato (Panreac, Barcelona, España). A continuación la mezcla se homogenizó en un agitador ultra-turrax (Memmert, Schwabach, Alemania) a alta velocidad durante 3 min, hasta emulsionar la mezcla. El pH se ajustó a 7,5 y el medio resultante se esterilizó a una temperatura de 121,1 ºC durante 5 min. Finalmente, el contenido se vertió en placas de Petri a razón de 15 mL por placa, y se dejó solidificar a temperatura ambiente. Obtenido el medio de cultivo, 1 mL de cada una de las diluciones seriadas se inocularon en las placas preparadas previamente con el medio de cultivo ya solidificado. Se extendió el inóculo en cada placa con ayuda de un asa de Drigalsky y por toda la superficie. Después, se incubaron las placas en posición invertida en una estufa a 31 ºC durante 48 h. Transcurrido ese tiempo, se contaron las colonias que presentaron crecimiento circular con halo transparente, indicativo de la producción de enzimas lipolíticas extracelulares. 3.7.5. Determinación de microorganismos proteolíticos Al igual que en el caso anterior, pero esta vez siguiendo lo publicado por Ezquerra-Brauer et al. (2016), el medio de cultivo se elaboró en el laboratorio. El procedimiento fue el siguiente: Por un lado, para elaborar el medio basal, se pesaron 1,5 g de extracto de carne (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), 2,5 g de triptona (Pronadisa, Barcelona, España), 0,5 g de glucosa (Panreac, Barcelona, España), 8,5 g de agar (Analema, Vigo, España) y 380 mL de agua destilada. A esta mezcla, una vez bien homogeneizados los componentes, se le ajustó el pH a 6,5 y posteriormente, se esterilizó el medio resultante a 121 ºC durante 15 minutos. Paralelamente, se preparó una suspensión de leche en polvo pesando 12 g de leche desnatada en polvo (Central Lechera Asturiana, Siero, Principado de Asturias) en 120 mL de agua destilada. Al igual que en el caso anterior, la mezcla se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 5 minutos. Ambas preparaciones (el medio basal y la suspensión de leche en polvo) se mezclaron para elaborar el medio de cultivo realizando posteriormente, el vertido del conjunto resultante sobre - 36 - placas Petri a razón de, aproximadamente, 15 mL por placa, los cuales se dejaron solidificar a temperatura ambiente. Tras la homogenización de la muestra en agua de peptona, fueron realizadas diluciones seriadas en tubo apropiadas a la muestra procesada. De cada una de ellas se extrajo 1 mL y se inoculó en placas preparadas previamente con el medio de cultivo ya solidificado. Posteriormente se extendió la dilución con ayuda de un asa de Drigalsky por toda la superficie de la placa. Luego, se incubaron las placas en posición invertida en una estufa a 31 ºC durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo, se realizó el recuento de las colonias blancas circulares que presentan halos transparentes, indicativos de la producción de enzimas proteolíticas extracelulares. El número de ufc/g correspondiente se obtuvo tras multiplicar el número obtenido por el factor de dilución, tras lo cual los valores obtenidos se pasaron a log ufc/g para facilitar su comparación estadística. 3.7.6. Determinación de microorganismos aerobios psicrófilos El procedimiento seguido para llevar a cabo el recuento de microorganismos aerobios psicrófilos, descrito por Miranda et al. (2016), consistió en lo siguiente: Tras la homogenización de la muestra en agua de peptona, fueron realizadas diluciones seriadas en tubo apropiadas a la muestra procesada. De cada una de estas, se extrajo 1 ml y se inoculó en una placa Petri sobre la cual se añadieron 15 ml de medio PCA estéril atemperado (Cultimed, Barcelona, España). Tras una agitación suave, las placas se dejaron solidificar a temperatura ambiente y, posteriormente, se incubaron en posición invertida durante 72 horas a 20 ºC, tras lo cual se contaron todas las colonias que crecieron. 3.8. Análisis estadístico Para valorar los resultados obtenidos para los cinco parámetros sensoriales relativos a cada uno de los dos ovoproductos valorados en el ensayo de aceptabilidad por el consumidor se recurrió al Test CHI-Cuadrado. Las diferencias se consideraron significativas para un nivel de significación del 99 % (p > 0,01). Por otra banda, para analizar los datos obtenidos referentes al recuento microbiológico llevado a cabo en el ensayo de vida útil de la yema de huevo baja en colesterol por aplicación de films de - 37 - quitosano en comparación con yema de huevo convencional, y poder así determinar la presencia o no de diferencias estadísticamente significativas entre ambas muestras, se aplicó el análisis de la varianza ANOVA. Las diferencias se consideraron significativas para p < 0,0001. Todos los análisis fueron llevados a cabo usando el paquete estadístico SPSS 16.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). - 38 - 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Caracterización del quitosano Las propiedades del quitosano dependen tanto de su peso molecular como de su grado de desacetilación, siendo, por lo tanto, las propiedades de un quitosano determinado intransferibles a otro con características diferentes. Así y como paso previo a la elaboración de los films de quitosano se procedió a su caracterización, tanto del grado de desacetilación como de su peso molecular. Debido a la complejidad y reactividad de la molécula de quitosano, los expertos recomiendan la utilización del mayor número de técnicas posibles para su caracterización, así para el grado de desacetilación se ha utilizado la espectroscopía de infrarrojo y el análisis elemental y para la determinación del peso molecular, la viscosimetría. 4.1.1. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FT-IR) La Figura 7, muestra el espectro obtenido por FT-IR para la muestra de quitosano. Es un espectro típico de dicho biopolímero y en él se pueden observar las bandas típicas correspondientes a su estructura. Dicho espectro, haciendo la relación de bandas indicada en el apartado 3.2.1 de Materiales y Métodos, nos permitió obtener el grado de desacetilación del polímero, siendo este de 70.23 ± 0.93 %. Figura 7. Espectro de infrarrojo obtenido para la muestra de quitosano correpondiente a la región comprendida entre 2000 y 500cm-1 Amida III Amida I Estructura sacárido Amida II Grupos -OH 1026,18 - 39 - 4.1.2. Análisis elemental El análisis elemental mostró que el quitosano utilizado en el presente trabajo presentó unos valores medios de 7.314 % de Nitrógeno (N), un 40.29 % de Carbono (C) y un 7.36 % de H. El porcentaje de desacetilación calculado según las ecuaciones (4) y (5) descritas en la sección 3.2.3 de Materiales y Métodos, fue de un 78.57 ± 2.07 % y de un 78.80 ± 2.07 % respectivamente. Teniendo en cuenta ambas técnicas, podríamos concluir que el quitosano utilizado presenta un grado de desacetilación medio de un 75%. 4.1.3. Viscosimetría Ensayos realizados previamente con dicho quitosano permitieron determinar el peso molecular del quitosano a partir de los valores obtenidos de la viscosidad. De este modo el peso molecular obtenido fue de 158,38 ± 9,49. 4.2. Reducción del contenido en colesterol de un ovoproducto mediante la utilización de films de quitosano. En las Tablas 1, 2 y 3 aparecen recogidos los resultados que se obtuvieron para las diferentes muestras en los distintos ensayos realizados. Los resultados obtenidos en el ensayo realizado con films neutralizados no se incluyen en dichas tablas, pues no mostraron ningún tipo de reducción en cuanto al contenido de colesterol. Esto es debido a que a pH de 5,8 una parte importante de los grupos amino libres se encuentran neutralizados, provocando que la reacción con el colesterol resulte menos eficaz. Con respecto a los films entrecruzados, lo que podría estar pasando es que, al estar situado el quitosano en una disposición "más rígida", los grupos amino se encontrarían menos disponibles para reaccionar con el colesterol. Así, de entre todos los métodos ensayados, el mejor resultado se obtuvo con los films sin neutralizar, no entrecruzados, de superficie 12 cm2 y cuando se aplicaron directamente sobre la yema de huevo durante 60 minutos. Este método resultó ser mucho más ventajoso con respecto a otras estrategias descritas con anterioridad por diversos autores, entre las que se encuentran la adición directa de quitosano en polvo (Antón, 2015), la utilización de -ciclodextrinas (Alonso, 2013; Jung et al., 2005; Lopez- - 40 - de-Dicastillo et al., 2011), o la bioconversión del colesterol mediante la acción de la enzima colesterol-oxidasa de origen microbiano (Aihara et al.,1988; Antón, 2015). La aplicación de quitosano en forma de films frente a la adición directa de quitosano en polvo afecta en menor medida a la composición y a las características organolépticas del producto final que se ofrece al consumidor, pues los films son retirados una vez acomplejado el colesterol, mientras el polvo de quitosano permanece en la yema de huevo afectando al sabor del ovoproducto debido a la astringencia característica de este biopolímero, tal y como se describe en la literatura científica (Han, Lederer, McDaniel y Zhao, 2005). Además, al retirarse el quitosano este ovoproducto resultaría apto para su consumo por parte de personas alérgicas a los crustáceos, lo que no ocurre en el otro caso. El grado de reducción de colesterol alcanzado usando quitosano en forma de films es muy similar al conseguido cuando se adiciona en forma de polvo, siendo del 45% y del 49% respectivamente. Ambas son técnicas de bajo coste, sencillas y, por tanto, fáciles de aplicar a nivel industrial. Sin embargo, la utilización de films de quitosano, frente a su versión en polvo, presenta muchas más ventajas pues podría resultar aplicable como revestimiento interno de envases tipo TetraBrik que son los habitualmente empleados para albergar y comercializar esta clase de ovoproductos líquidos. Otra de las técnicas que se han expuesto para la reducción de colesterol en diferentes matrices alimentarias (Alonso, 2013; Jung et al., 2005) consiste en la adición directa de -ciclodextrinas al alimento. Según Antón, X. (2015) este método puede llegar a alcanzar casi un 90% de reducción del contenido en colesterol de un ovoproducto. Sin embargo, este espectacular resultado presenta inconvenientes importantes. Primero, el hecho de que las -ciclodextrinas permanezcan en el producto final invalidaría su consumo por parte del ser humano, pues se trata de un ingrediente alimentario no autorizado a nivel mundial. Hedges, Shie y Sikorski (1993) intentaron buscar una solución a este problema proponiendo eliminar dichas -ciclodextrinas mediante la utilización de enzimas específicas. Sin embargo, estudiosos del tema indican que además de no haber sido demostrada su inocuidad, estas enzimas encarecerían el proceso enormemente (Lv et al., 2002). Otros autores (Lopez-de-Dicastillo et al., 2011) probaron a inmovilizar las -ciclodextrinas en películas plásticas de distinta estructura ensayando su aplicación sobre leche. La reducción de colesterol en este caso fue mucho menor (tan sólo se logró retener un 24% del colesterol - 47 - Tabla 5 y representados gráficamente en la Figura 8, muestran un grado de aceptabilidad general muy similar para ambos tipos de yema. Así, en ninguno de los parámetros sensoriales analizados se hallaron diferencias estadísticamente significativas (para p> 0,01). Además de este aspecto tan positivo, cabe recalcar que los resultados obtenidos en cuanto al sabor fueron ligeramente superiores (aunque sin alcanzar el nivel de significación) en el caso del ovoproducto que había sido tratado con quitosano o, lo que es lo mismo, con contenido reducido en colesterol. Este hecho denota que la aplicación de films de quitosano y su posterior retirada no afecta al sabor de la matriz alimentaria como lo haría, en cambio, la adición directa de quitosano en polvo al producto ya que, según Han et al. (2005), la presencia de este biopolímero en los alimentos provoca un sabor notablemente astringente. Por lo tanto, es posible obtener un ovoproducto con contenido reducido en colesterol a través de la aplicación de quitosano sin que sus características sensoriales se vean afectadas. Tabla 5. Aceptabilidad por parte del consumidor yema de huevo con tratamiento de quitosano, en comparación con yema de huevo convencional. Muestras de ovoproducto Parámetros Control Quitosano Aspecto 5,33 ± 1,23 4,92 ± 1,24 Olor 5,00 ± 1,48 5,00 ± 1,21 Sabor 4,00 ± 1,60 4,50 ± 1,62 Textura 4,75 ± 1,36 4,08 ± 1,62 Aceptabilidad general 4,92 ± 1,56 4,67 ± 1,50 Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (SD). No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas para p > 0,01. - 48 - Figura 8. Resultados de aceptabilidad del consumidor obtenidos para la yema sin modificar en comparación con los alcanzados en el caso de la yema con contenido reducido en colesterol. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 Aspecto Olor Sabor Textura Aceptabilidad general Yema normal Yema/Quitosano - 49 - 5. CONCLUSIONES Se ha obtenido un nuevo ovoproducto a base de yema de huevo con un 45% menos de contenido en colesterol. La metodología aquí expuesta para reducir el contenido en colesterol usando films de quitosano, resulta ser mucho más ventajosa que las otras técnicas descritas en la literatura científica hasta ahora: tanto para su uso a nivel industrial, pues podría ser incorporada muy fácilmente al envase, como para su aptitud para el consumo, pues no deja residuos en el producto final. El ovoproducto con contenido reducido en colesterol desarrollado presenta una menor carga microbiana que el convencional a lo largo del tiempo aún en crudo, por lo que tendría una mayor vida útil. Al mismo tiempo, este nuevo ovoproducto no mostró diferencias con respecto a uno convencional en el estudio de aceptabilidad de los consumidores encuestados, y se trata de un producto que podría ser consumido por personas que presentan alergia al marisco. - 50 - 6. BIBLIOGRAFÍA Agulló, E., Rodríguez, M. S., Ramos, V., & Albertengo, L. (2003). Present and future role of chitin and chitosan in food. 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