Inmunolocalización de anticuerpos de proliferación celular, apoptosis y citoesqueleto en el intestino del pez cebra

Eva Vizcaya Balboa Inmunolocalización de anticuerpos de proliferación celular, apoptosis y citoesqueleto en el intestino del pez cebra Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: experimental Trabajo de Fin de Grado Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Eva Vizcaya Balboa y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. 2 • RESUMEN: ..............................................................................................................................4 • RESUMO: ................................................................................................................................4 • ABSTRACT: ............................................................................................................................5 1. INTRODUCCIÓN: ....................................................................................................................6 A) EL PEZ CEBRA EN LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA ...............................................6 B) ANATOMÍA DEL TUBO DIGESTIVO ..............................................................................7 C) HISTOLOGÍA DEL TUBO DIGESTIVO ...........................................................................8 D) INMUNOHISTOQUÍMICA .............................................................................................15 E) SALUD INTESTINAL ......................................................................................................24 2. OBJETIVOS: ...........................................................................................................................28 3. MATERIAL Y MÉTODOS: .....................................................................................................28 4. RESULTADOS: ........................................................................................................................31 5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: ........................................................................................38 6. BIBLIOGRAFÍA: .....................................................................................................................43 3 • RESUMEN: El auge de la acuicultura ha resaltado la necesidad de comprender y optimizar la salud intestina de los peces, ya que el intestino constituye una interfaz crucial entre el medio interno y externo. Las alteraciones, tanto en el medio externo como en el interno, pueden tener repercusiones negativas en la salud general de los animales de producción, lo que subraya la importancia de reforzar la salud intestinal. En este contexto, el pez cebra ha emergido como un modelo valioso en acuicultura, permitiendo la evaluación de dietas y aditivos dietéticos de manera más eficiente y económica que las pruebas directas en los animales de producción. En el presente trabajo, se ha utilizado esta especie como organismo modelo, para la evaluación de distintos marcadores relativos a la salud intestinal empleando la técnica inmunohistoquímica. En concreto, el objetivo de este este trabajo es la puesta a punto de técnicas inmunohistoquímicas para la detección de caspasa 3, antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), citoqueratina AE1/AE3 y Ecadherina, en cortes histológicos de intestino de pez cebra, dado que los protocolos comerciales no estaban probados para esta especie. El estudio mostró que el PCNA se localiza principalmente entre los pliegues intestinales, áreas ricas en células indiferenciadas, indicando alta proliferación. La caspasa 3, un marcador de apoptosis, se encontró en células individuales distribuidas multifocalmente a lo largo del pliegue. La E-cadherina se observó en las áreas de contacto entre las células del epitelio, reflejando su papel en la adhesión celular. Por último, la citoqueratina AE1/AE3 fue positiva en el citoplasma de los enterocitos, con una coloración más intensa en la zona apical correspondiente al borde de cepillo, señalando la estructura del citoesqueleto en estas células. Los resultados mostraron que la inmunolocalización de los antígenos en el pez cebra fue muy similar a la reportada por otros autores en distintas especies, excepto en el caso de la caspasa 3, cuya distribución en el intestino pez cebra difería de la observada en el salmón por otros investigadores. Palabras clave: pez cebra, intestino, inmunohistoquímica, E-cadherina, caspasa 3, PCNA, citoqueratina AE1/ AE3. • RESUMO: O auxe da acuicultura resaltou a necesidade de comprender e optimizar a saúde intestinal dos peixes, xa que o intestino constitúe unha interface crucial entre o medio interno e externo. As alteracións, tanto no medio externo como no interno, poden ter repercusións negativas na saúde xeral dos animais de produción, o que subliña a importancia de reforzar a saúde intestinal. Neste contexto, o peixe cebra emerxeu como un modelo valioso en acuicultura, permitindo a avaliación de dietas e aditivos dietéticos de maneira máis eficiente e económica que as probas directas nos animais de produción. No presente traballo, utilizouse esta especie como organismo modelo para a avaliación de distintos marcadores relativos á saúde intestinal empregando a técnica inmunohistoquímica. En concreto, o obxectivo deste traballo é a posta a punto de técnicas inmunohistoquímicas para a detección de caspasa 3, antíxeno nuclear de células en proliferación (PCNA), citoqueratina AE1/AE3 e E-cadherina, en cortes histolóxicos de intestino de peixe cebra, dado que os protocolos comerciais non estaban probados para esta especie. O 4 estudo mostrou que o PCNA localizábase principalmente entre os pregues intestinais, áreas ricas en células indiferenciadas, indicando alta proliferación. A caspasa 3, un marcador de apoptose, atopouse en células individuais distribuídas multifocalmente ao longo do pregue. A E-cadherina observouse nas áreas de contacto entre as células do epitelio, reflectindo o seu papel na adhesión celular. Por último, a citoqueratina AE1/AE3 foi positiva no citoplasma dos enterocitos, cunha coloración máis intensa na zona apical correspondente ao bordo de cepillo, sinalando a estrutura do citoesqueleto nestas células. Os resultados mostraron que a inmunolocalización dos antíxenos no peixe cebra foi moi similar á reportada por outros autores en distintas especies, excepto no caso da caspasa 3, cuxa distribución no intestino do peixe cebra difería da observada no salmón por outros investigadores. Palabras clave: peixe cebra, intestino, inmunohistoquímica, E-cadherina, caspasa 3, PCNA, citoqueratina AE1/ AE3. • ABSTRACT: The rise of aquaculture has highlighted the need to understand and optimize fish intestinal health, as the intestine constitutes a crucial interface between the internal and external environments. Alterations, both in the external and internal environments, can have negative repercussions on the overall health of production animals, underscoring the importance of strengthening intestinal health. In this context, the zebrafish has emerged as a valuable model in aquaculture, allowing for the evaluation of diets and dietary additives more efficiently and economically than direct testing in production animals. In this study, this species was used as a model organism for the evaluation of different markers related to intestinal health using immunohistochemistry. Specifically, the objective of this work is to establish immunohistochemical techniques for the detection of caspase 3, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cytokeratin AE1/AE3, and E-cadherin in histological sections of zebrafish intestine, given that commercial protocols had not been tested for this species. The study showed that PCNA is mainly located between the intestinal folds, areas rich in undifferentiated cells, indicating high proliferation. Caspase 3, a marker of apoptosis, was found in individual cells distributed multifocally along the fold. E-cadherin was observed in the contact areas between epithelial cells, reflecting its role in cell adhesion. Finally, cytokeratin AE1/AE3 was positive in the cytoplasm of enterocytes, with more intense staining in the apical zone corresponding to the brush border, indicating the cytoskeletal structure in these cells. The results showed that the immunolocalization of the antigens in zebrafish was very similar to that reported by other authors in different species, except for caspase 3, whose distribution in the zebrafish intestine differed from that observed in salmon by other researchers. Keywords: zebrafish, intestine, immuhistochemistry, E-cadherin, Caspase 3, PCNA, Citoqueratin AE1/ AE3. 5 1. INTRODUCCIÓN: A) EL PEZ CEBRA EN LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA El pez cebra (Danio rerio) es un pez de agua dulce y pequeño tamaño (3 centímetros aproximadamente) originario del sudeste asiático y perteneciente a la familia Cyprinidae, clase Actinopterigii (Streisinger et al., 1981). El inicio de su utilización en investigación data de la década de 1950, para el estudio en campos como la toxicología y la embriología (Cartner et al., 2019). Pero no fue hasta 1981, cuando George Streisinger estableció al pez cebra como modelo para la investigación científica (Streisinger et al., 1981). El pez cebra fue seleccionado para este cometido por una serie de características deseables. En primer lugar, su reproducción es fácil, rápida y no es estacional, por lo tanto se pueden obtener embriones durante todo el año. Además, una única hembra produce cientos de huevos en una sola puesta, haciendo posible un número estadísticamente significativo de embriones estrechamente relacionados en un solo experimento (Streisinger et al., 1981). La fecundación y todo el desarrollo subsiguiente ocurre en el agua, no en el interior de la madre, lo que facilita mucho la visualización de los distintos procesos. Además, los embriones son casi transparentes, de tal manera que, empleando los métodos microscópicos adecuados, es posible obtener imágenes de todas las células durante el desarrollo (Santoriello & Zon, 2012). Su desarrollo es rápido: la mayoría de órganos están formados 24 horas después de la fertilización (Santoriello & Zon, 2012), eclosionan en tres días y alcanzan la madurez sexual a los 3-4 meses, por lo tanto, se puede observar el desarrollo tanto de células individuales como de estructuras completas del interior del pez cebra. Su carácter es dócil, lo que permite su observación y manipulación a lo largo de todo el desarrollo (Kimmel et al., 1995). El pez cebra, presenta además otra cualidad, la capacidad de regenerar tejidos como: la aleta, el cerebro, el corazón, la retina o la médula (Fujii et al., 2024). Existe también, un grado relativamente alto de similitud genética entre el pez cebra y la especie humana, la comparación con el genoma de referencia humano muestra que alrededor del 70 % de los genes humanos tienen al menos un ortólogo en el pez cebra, lo que una vez más confirma la excelencia de este modelo animal (Howe et al., 2013). Como desventaja, cabe destacar, que al tratarse de un animal no mamífero existen algunas diferencias fisiológicas y anatómicas. Por ejemplo, carecen de estructuras como la glándula mamaria o los pulmones (Santoriello & Zon, 2012). Dicha especie se emplea como modelo en múltiples disciplinas como la biología del desarrollo (Vacaru et al., 2014), modelo para patologías como el cáncer (Wu et al., 2023) o enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (Chia et al., 2022; Shenoy et al., 2022) y desarrollo de fármacos o valoración de toxicidad de toxinas, químicos o fármacos, entre otras (Lachowicz et al., 2023; Torres-Ruiz et al., 2021). 6 B) ANATOMÍA DEL TUBO DIGESTIVO El tubo digestivo del pez cebra está dividido en diferentes porciones: la cavidad oral, seguida de la orofaringe y el esófago, que desemboca en el intestino. Este último se divide en tres partes: bulbo intestinal o intestino proximal, intestino medio y posterior. Finalmente, el sistema digestivo termina en el ano (Holden et al., 2013). - CAVIDAD ORAL: La cavidad oral es el inicio del tubo digestivo y su conexión proximal con el exterior. El pez cebra carece de glándulas salivares y lengua, pero sí están presentes células mucosas y papilas gustativas (Holden et al., 2013). - OROFARINGE: Se define la orofaringe cómo la porción del tracto digestivo comprendido entre la boca y el inicio del esófago. El límite distal está marcado por la presencia de los dientes faríngeos. El pez cebra, al igual que otros ciprínidos carece de dientes mandibulares orales, en su lugar, presenta una dentición faríngea bien desarrollada. Además, es un organismo polifiodonte, lo que significa que la dentición se reemplaza continuamente a lo largo de la vida del animal (Bruneel et al., 2015). Los dientes faríngeos del pez cebra se sitúan en los quintos ceratobranquiales. Se distribuyen en tres filas: una fila ventral compuesta por cinco dientes, una fila mediodorsal de cuatro dientes y una fila dorsal de dos dientes. Dichas filas se disponen simétricamente a cada lado el cuerpo, por tanto, el pez cebra presenta once dientes por cada lado, veintidós dientes en total (Bruneel et al., 2015). Dorsalmente, en la superficie faríngea, se encuentra una almohadilla epitelial queratinizada sobre la que se apoyan los dientes (Huysseune et al., 1998). - ESÓFAGO: El esófago es un órgano tubular que conecta la orofaringe con el intestino, más concretamente con el bulbo intestinal. En esta porción también se pueden encontrar algunas papilas gustativas dispersas. Cabe destacar que los peces cebra, son fisóstomos, es decir, regulan la cantidad de aire de su vejiga natatoria a través del denominado conducto neumático. Este conducto, conecta el esófago con la vejiga natatoria permitiendo dicha regulación (Holden et al., 2013). - INTESTINO: El intestino es un tubo largo que se pliega en dos ocasiones en el interior de la cavidad abdominal. Se divide en tres partes principales: intestino proximal o bulbo intestinal, intestino medio e intestino posterior. La luz del mismo va decreciendo en dirección caudal, siendo mayor en el bulbo intestinal (figura 1). Como se ha mencionado con anterioridad, el intestino se puede dividir macroscópicamente en tres segmentos: el intestino anterior, el intestino medio y el intestino posterior (figura 1) (Wang et al., 2010; Xia et al., 2022). 7 El pez cebra no presenta un estómago funcional, en su lugar se encuentra el bulbo intestinal, una porción dilatada del tracto digestivo que conecta el esófago y el intestino medio. Aunque no se llega a desarrollar estómago en ningún momento de la vida del animal (Cartner et al., 2019), se ha demostrado presencia génica de marcadores que indican diferenciación estomacal en otros vertebrados (Muncan et al., 2007). Sin embargo, se ha propuesto que, a pesar de la expresión de los genes, estos permanecen inactivados (Castro et al., 2013). Además, esta especie carece de ciegos pilóricos, estructuras que cumplen una función similar a la del intestino al contener enzimas y aumentar la superficie de absorción (Buddington & Diamond, 1986). Esto se debe a que tales estructuras solo se encuentran en animales con verdaderos estómagos. El bulbo intestinal interviene en la absorción de nutrientes (principalmente de grasas) pero también actúa como reservorio de alimentos, lo que permite a los animales ingerir nutrientes de forma más espaciada (Holden et al., 2013). En contraposición a lo anteriormente expuesto, en un estudio realizado por Wang et al. en 2010 (Wang et al., 2010), se divide el intestino del pez cebra en siete porciones (nombradas de S1S7). C) HISTOLOGÍA DEL TUBO DIGESTIVO La histología digestiva del pez cebra es crucial para el entendimiento de la estructura y la función del sistema digestivo. Dado que se trata de un modelo animal en auge, es muy importante avanzar en el conocimiento sobre aspectos básicos, como la histología. A continuación se exponen las características principales de las porciones en las que divide el tracto gastrointestinal del pez cebra, a excepción del intestino: cavidad oral, orofaringe y esófago (tabla 1, figura 2, A y B). 8 FIGURA 1: A. Representación 3D de un pez cebra juvenil entero (33 dpf) con el tracto gastrointestinal (GI) resaltado (Ding et al., 2019). B. Corte longitudinal del intestino completo del pez cebra, en el que se indican las tres partes que los conforman: IA, intestino anterior, IM, intestino medio e IP, intestino posterior. Imagen modificada de Ding et al. (2019). B A IA IM IP PORCIÓN DEL APARATO DIGESTIVO ESTRUCTURA DE LA PARED TIPO DE EPITELIO OTRAS CARACTERÍSTICAS CAVIDAD ORAL (figura 2A) Mucosa Submucosa Muscular (Mokhtar, 2021) Epitelio escamoso estratificado (Abbate et al., 2016; (Holden et al., 2013) - Carece de glándulas salivales - Contiene células mucosas, células rodlet y papilas gustativas (Abbate et al., 2016; Holden et al., 2013). OROFARINGE (figura 2B) Mucosa: formada por el epitelio y la lámina propia Muscular: comienza a adquirir músculo estriado en su extremo distal. Adventicia (Holden et al., 2013) Epitelio escamoso estratificado no queratinizado (Holden et al., 2013) - Carece de glándulas salivales. - Contiene abundantes células mucosas y papilas gustativas. - Presenta dientes faríngeos, en la posición opuesta e ellos encontramos una almohadilla epitelial queratinizada. (Holden et al., 2013) ESÓFAGO (figura 2B) Mucosa: epitelio y lámina propia. Muscular: su porción proximal está rodeada por músculo esquelético estriado y la porción distal por músculo liso. Adventicia/ serosa (Holden et al., 2013) Epitelio ciliado estratificado (Holden et al., 2013). - Células mucosas muy abundantes. - Menor número de papilas gustativas que en la orofaringe. (Holden et al., 2013) TABLA 1: resumen de las características histológicas principales de cavidad oral, orofaringe y esófago. 9 enmascaramiento de los epítopos (lugares del antígeno donde se unirá el anticuerpo), evitando una unión adecuada de los anticuerpos, y por tanto evitando el marcaje de los antígenos objetivo. Con el fin de revertir este enmascaramiento se emplea la recuperación antigénica. También, se ha de realizar bloqueo de enzimas endógenas con el fin de evitar las interacciones entre estas enzimas y aquellas asociadas a los anticuerpos (anticuerpos conjugados). Las enzimas que permanecen unidas a los anticuerpos tienen un papel vital, al convertir el cromógeno en un producto de color visible al microscopio. Por último, en ocasiones se realiza un bloqueo de sitios inespecíficos, con el fin de evitar la unión de los anticuerpos a antígenos no objetivo y generar falsos positivos (Valle, 2022). La inmunohistoquímica puede ser de dos tipos: directa o indirecta. -Método directo (figura 5): en este caso se emplea un anticuerpo primario que se conjuga directamente con el marcador que permitirá su posterior visualización (enzima o fluoróforo). El anticuerpo primario marcado se une directamente al antígeno objetivo. Como ventajas, cabe destacar, que se trata de una técnica rápida y fácil, pero carece de la sensibilidad de otras técnicas y proporciona poca amplificación de señal (Suvarna et al., 2019). -Método indirecto (figura 5): en este caso se emplea, además del anticuerpo primario no conjugado, un anticuerpo secundario conjugado. El anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario con la finalidad de permitir la visualización de la localización del antígeno de interés. De esta forma aumenta la amplificación de la señal y la sensibilidad. Se emplea con mayor frecuencia. La razón principal es la mayor sensibilidad de la técnica indirecta, ya que permite generar una tinción tisular más fuerte. La explicación más simple es que dos moléculas de anticuerpos secundarios pueden unirse simultáneamente a una molécula del anticuerpo primario. En otras palabras, la detección indirecta emplea dos veces más etiquetas de color que la detección directa (Kalyuzhny, 2016). Como desventaja principal, la técnica indirecta consta de un mayor número de pasos y por ello requiere de más tiempo (O'Hurley et al., 2014). -Es de gran importancia tener en cuenta que el anticuerpo primario se une al antígeno frente al que va dirigido. Lo ideal es que la especie del anticuerpo primario sea diferente a la del tejido para evitar la reactividad cruzada. -El anticuerpo secundario anticuerpo debe dirigirse contra la especie del anticuerpo primario, pero no ha de ser producido en esta misma especie. De tal forma que, si por ejemplo si el anticuerpo primario procede de un conejo, el anticuerpo secundario será contra conejo, pero procederá de una especie distinta al conejo (Valle, 2022). 16 Por último, se añade el cromógeno, que al reaccionar con la enzima asociada al anticuerpo (primario en la técnica directa y secundario en la indirecta) generará coloración que permitirá la visualización de la localización del antígeno, empleando el microscopio. II. Fundamentos de la inmunohistoquímica Para una compresión óptima de la técnica inmunohistoquímica es necesario definir una serie de puntos básicos. En primer lugar, se definen los conceptos de antígeno y anticuerpo. A continuación, se indica la estructura y los tipos de anticuerpos existentes, así como, la clonalidad y los tipos de etiquetado que pueden presentar. Así mismo, se describe la unión antígenoanticuerpo y las características que presenta. El conocimiento de estos conceptos permitirá tanto una adecuada selección de los anticuerpos, como una interpretación adecuada de los resultados obtenidos y una identificación de los posibles problemas que se produzcan (Ramos-Vara, 2017). A. ANTÍGENOS Los antígenos son moléculas que inducen la formación de anticuerpos. Pueden presentar uno o más sitios de unión a los anticuerpos. Estas regiones topográficas altamente específicas están compuestas por un pequeño número de aminoácidos o unidades de monosacáridos y se denominan grupos determinantes antigénicos o epítopos (figura 6) (Tizard, 2009). B. ANTICUERPOS Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por los linfocitos B en presencia de antígenos (Beck & Peatman, 2015). Los términos anticuerpo e inmunoglobulina a menudo se usan indistintamente. Se encuentran en fluidos orgánicos como la sangre, así como en muchas secreciones. -ESTRUCTURA DE LOS ANTICUERPOS: La unidad básica de cada anticuerpo es un monómero; los anticuerpos pueden ser monoméricos, diméricos, triméricos, tetraméricos o pentaméricos. El monómero, se 17 FIGURA 5: representación de las técnicas directa e indirecta en inmunohistoquímica. Esquema propio creado con BioRender.com. FIGURA 6: antígeno uniéndose a un anticuerpo. Esquema propio creado con BioRender.com. compone de dos cadenas pesadas y dos ligeras. Ambos tipos de cadena de polipéptidos permanecen unidos mediante enlaces disulfuro y dan lugar a una estructura en forma de Y. Tanto en las cadenas pesadas como en las ligeras se diferencian regiones constantes (no existe variabilidad entre anticuerpos) y variables (existe variabilidad entre anticuerpos). Las cadenas ligeras presentan un dominio variable y un dominio constante. Mientras que, las cadenas pesadas presentan un dominio variable, tres o cuatro constantes y una región bisagra. Las regiones terminales o dominios variables de cada brazo difieren en la secuencia de aminoácidos. Esta variabilidad proporciona especificidad para un epítopo en particular y permite que el anticuerpo se una específicamente al antígeno (figura 7) (Tizard, 2009). -TIPOS DE ANTICUERPOS: Se distinguen cinco tipos de anticuerpos que se encuentran en la sangre de los vertebrados superiores: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM (Suvarna et al., 2019), aunque en los teleósteos solo están presentes tres isotipos de inmunoglobulinas: IgM, IgZ e IgD. Sin embrago, los mecanismos básicos para la generación de la diversidad de inmunoglobulinas son similares en los teleósteos y los vertebrados superiores (Bilal et al., 2021). -UNIÓN ANTÍGENOANTICUERPO: Las cadenas laterales de aminoácidos del dominio variable de un anticuerpo forman un sitio similar a una cavidad que es geométrico y químicamente complementario al epítopo del antígeno. Se ha utilizado la analogía de una cerradura (anticuerpo) y la llave (antígeno), y el ajuste preciso requerido explica el alto grado de especificidad de anticuerpo-antígeno que se observa. El anticuerpo y el antígeno asociados se mantienen unidos por una combinación de enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas y fuerzas de Van der Waals (Suvarna et al., 2019). C. DEFINICIÓN DE CONCEPTOS: LA ESPECIFICIDAD Y LA SENSIBILIDAD. Existen dos conceptos que es importante diferenciar y son: la especificidad y la sensibilidad. La especificidad es la capacidad de un anticuerpo para unirse selectivamente a un solo epítopo en un antígeno (Suvarna et al., 2019). De esta manera, a mayor especificidad se obtiene un menor número de falsos positivos en los resultados. La sensibilidad es la cantidad relativa de antígeno que una técnica IHC es capaz de detectar. 18 FIGURA 7: descripción de las distintas partes que componen un anticuerpo. Esquema propio creado con BioRender.com. Una técnica con alta sensibilidad es capaz de detectar cantidades más pequeñas de antígeno que una técnica con baja sensibilidad. Si se utiliza para detectar la misma cantidad de antígeno, la técnica con alta sensibilidad produciría una señal más grande que un método con baja sensibilidad (Suvarna et al., 2019). D. CLONALIDAD DE LOS ANTICUERPOS Existen dos tipos de anticuerpos: monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales se producen en ratones. El proceso para la obtención del anticuerpo consiste en la inoculación de un inmunógeno purificado (antígeno). Tras la producción de la respuesta inmune se cosechan un único linfocito B (células productoras de anticuerpos) en el bazo o la médula ósea. Los linfocitos B tienen una vida limitada, por lo que se combinan con células del mieloma del ratón. Las células resultantes son inmortales y producen anticuerpos específicos para un solo tipo de epítopo del antígeno (O'Hurley et al., 2014). Los anticuerpos policlonales se producen en múltiples especies como: conejos, caballos, cabras y pollos. Estos anticuerpos presentan mayor afinidad que los monoclonales, ya que tienen la capacidad de unirse a distintos epítopos del antígeno. También, debido a esta característica, presentan menor especificidad (Magaki et al., 2019). Como en el caso anterior, su producción comienza con la inmunización del animal con un inmunógeno purificado, el sistema inmune genera linfocitos B que se diferenciarán en células plasmáticas, capaces de producir los anticuerpos que se encontrarán en el suero. Posteriormente, los anticuerpos se cosechan sangrando al animal, obteniéndose un suero rico en inmunoglobinas. Es probable que el animal produzca numerosos clones de linfocitos B plasmáticos, a través de las cuales se obtienen una mezcla de inmunoglobulinas para distintos epítopos del mismo antígeno (O'Hurley et al., 2014). En la siguiente tabla (tabla 3), se destacan las principales diferencias entre los anticuerpos policlonales y los monoclonales: DIFERENCIAS ENTRE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES POLICLONALES Se obtiene una población heterogénea de Ac para un antígeno concreto Producidos por diferentes clones de linfocitos B No requiere líneas celulares de hibridoma Los Ac obtenidos pueden unirse a distintos epítopos del antígeno Menor especificidad Mayor sensibilidad MONOCLONALES Se obtiene una población homogénea de Ac para un antígeno concreto Producidos por clones de un mismo linfocito B Requiere líneas celulares de hibridoma Los Ac obtenidos pueden unirse a un único epítopo del antígeno Mayor especificidad Menor sensibilidad Tabla 3: resumen de las diferencias principales entre anticuerpos monoclonales y policlonales. 19 E. ETIQUETADO En el etiquetado o conjugado de los anticuerpos se puede realizar de dos maneras: empleando anticuerpos marcados con fluoróforos (inmunofluorescencia) o a través de enzimas (unidas al anticuerpo primario o secundario) que permiten la reacción del cromógeno, y por tanto la visualización de la localización de los antígenos (inmunohistoquímica enzimática) (Valle, 2022). La inmunofluorescencia se basa en la utilización de fluoróforos como marcadores. Los fluoróforos son etiquetas fluorescentes que, cuando se conjugan con el anticuerpo, absorben la luz ultravioleta o visible para alcanzar un estado excitado inestable. Posteriormente, el fluoróforo emite luz a medida que los electrones regresan a su estado fundamental (Im et al., 2019). Se pueden emplear tanto métodos de detección directa como indirecta. En la forma directa, el fluoróforo se conjuga directamente al anticuerpo primario que a su vez permanecerá unido al epítopo objetivo. Por el contrario, en el método indirecto se emplea un proceso de incubación en dos pasos: en primer lugar, el anticuerpo primario se une al epítopo objetivo y posteriormente se añade un anticuerpo secundario etiquetado con fluoróforo que se une al anticuerpo primario. Aunque el método directo es más rápido, el método indirecto presenta una mayor sensibilidad y permite amplificación de señal (Im et al., 2019). Para la observación de las muestras es imprescindible disponer de un microscopio de campo oscuro, que va acompañado de filtros adecuados y de una fuente de luz ultravioleta para visualizar los fluoróforos de uso rutinario (Valle, 2022). La inmunohistoquímica enzimática, se basa en el marcaje de los anticuerpos con enzimas, cuya función es reaccionar con el cromógeno, generando un compuesto estable y de color que permita la observación de la localización del antígeno objetivo, empleando el microscopio. Como en la inmunofluorescencia, la técnica puede realizarse de dos formas: directa o indirecta. En la técnica de detección directa el anticuerpo marcado con la enzima correspondiente es el primario, y este reacciona directamente con el antígeno presente en el tejido. Por el contrario, en la técnica indirecta, es el anticuerpo secundario el que permanece marcado con la enzima. Esta técnica, aunque requiere más tiempo, permite amplificación de la señal. Las etiquetas enzimáticas más empleadas incluyen la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina (Valle, 2022). En el caso de las inmunohistoquímicas de tipo enzimático, tras la incubación de los anticuerpos y sus respectivos lavados, se añade el cromógeno. Se trata de un compuesto incoloro que tras una reacción química se convierte en un compuesto coloreado, marcando aquellas zonas donde se encuentre el antígeno objetivo. Esta reacción química ocurre gracias a las enzimas. Los cromógenos más comunes generan color marrón, rojo o azul. La elección tanto de la enzima como del cromógeno dependerá de varios factores como: la presencia o ausencia de pigmentos endógenos, la intensidad de la reacción, la ubicación de los anticuerpos, los medios de montaje utilizados o preferencias personales (Ramos-Vara, 2005). 20 - Para la peroxidasa de rábano picante, el sustrato más empleado es el tetracloruro de 3,3′diaminobenzidina (DAB) (figura 8), este genera color marrón y es insoluble en disolventes orgánicos, dato que es importante conocer para el posterior montaje de las muestras. Otro cromógeno, es el 3-Amino-9-etilcarbazol (AEC), que produce color rojo, es soluble en disolventes orgánicos pero insoluble en agua. También se puede emplear 4-cloro-1-naftol, precipita como un producto azul que es soluble en disolventes orgánicos (Ramos-Vara, 2005). - Para la fosfatasa alcalina el cloruro de tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/ nitro azul (BCIP/NBT; coloración azul, medio permanente), el rojo rápido (medio de montaje rojo y acuoso) y la fucsina nueva (fucsia y medio permanente) son los cromógenos más utilizados (Ramos-Vara, 2005). III. Aspectos prácticos a tener en cuenta en la técnica inmunohistoquímica: Una vez definidos los conceptos básicos, a continuación, se describen los fundamentos de los los puntos críticos de la técnica inmunohistoquímica. A. PROCESADO HISTOLÓGICO RUTINARIO: La preparación de las muestras comprende procesos como la fijación del tejido, deshidratación, aclarado, infiltración, inclusión y corte del mismo. El fijador más comúnmente empleado es el formaldehído tamponado al 10%. La deshidratación consistirá en introducir la muestra en concentraciones crecientes de alcoholes, para posteriormente continuar con el aclarado, que sustituirá el alcohol por un disolvente orgánico cómo el xileno. Tras este proceso, las muestras se incluyen en parafina líquida para su corte empleando el microtomo. Los portaobjetos sobre los que se depositan la muestra han de estar tratados, por ejemplo por silanizado, para favorecer la adhesión de las muestras (Ramrus, 2004; Suvarna et al., 2019). Antes de iniciar el proceso de la inmunohistoquímica, se realiza desparafinado y rehidratación de las muestras, que consisten en introducir los cortes de las muestras, ya sobre sus portaobjetos, primero dos veces en xileno y a continuación en alcoholes con concentración decreciente para terminar colocando las muestras en agua destilada (Ramos-Vara, 2017). 21 FIGURA 8: representación del funcionamiento del cromógeno DAB. Creado con BioRender.com. En ocasiones, es necesario realizar una decalcificación del tejido antes del fijado, por ejemplo, si existe hueso u otros tejidos duros, ya que, de esta manera, se facilita el corte (Suvarna et al., 2019). B. RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA Aunque en la década de 1970 se pensaba que el procesamiento rutinario de las muestras (fijación con formol e inclusión en parafina) ocasionaba la pérdida de muchos epítopos y que por tanto nunca podrían demostrarse a través de la inmunohistoquímica, se ha visto que esto no es así. Como se ha mencionado con anterioridad, el procesado de la muestra puede ocasionar el enmascaramiento (no destrucción) de los antígenos, debido a la formación de enlaces intermoleculares e intramoleculares, imposibilitando su observación (Suvarna et al., 2019). Por tanto, es necesario llevar a cabo una recuperación antigénica. Este proceso consigue devolver a las proteínas a su estructura antes de la fijación y de esta manera recuperar la antigenicidad (Ramos-Vara, 2017). Se ha de tener en cuenta que el proceso de recuperación antigénica no siempre es necesario y se debe consultar en cada caso (Ramos-Vara, 2017). Se distinguen dos tipo de recuperación antigénica: enzimática e inducida por calor. -La recuperación enzimática, se lleva cabo a través de enzimas proteolíticas. A través de la eliminación de la reticulación y la agregación y precipitación de las proteínas generada por la fijación, los antígenos quedan expuestos (Varone et al., 2012). Las enzimas que se emplean con mayor asiduidad son la tripsina y la proteinasa K. Es importante ajustar factores como la temperatura, el tiempo, la concentración de la enzima y la duración de la fijación, para optimizar el resultado. Se ha de tener en cuenta que no es apta para todos los tejidos ya que puede dañarlos, su elección dependerá del anticuerpo escogido y debe ser revisado en cada caso (Suvarna et al., 2019). -La recuperación inducida por calor ha desplazado en gran medida a la recuperación enzimática. Existen numerosas teorías sobre su funcionamiento, a continuación, se describen dos ejemplos. En primer lugar, se ha propuesto que los enlaces formados durante la fijación por formalina, se rompen a temperaturas por encima de 100º centígrados. También se propone, que el calor elimina las bases de Schiff más débiles, sin afectar a los puentes de metileno. Ya que durante la fijación con formalina los puentes de metileno y las bases de schiff forman enlaces intramoleculares. Esta recuperación se puede realizar empleando distintos mecanismos, como: microondas, olla a presión, vaporera o baño de agua (Suvarna et al., 2019). En la recuperación antigénica por calor las muestras son colocadas en cubetas donde permanecen sumergidas en soluciones, durante la administración del calor. Dichas soluciones son tampones que pueden presentar varios pH: citrato (pH 6), EDTA (pH 8) o TrisEDTA (pH 9) (Suvarna et al., 2019). C. BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA INTERNA Las enzimas son los marcadores más empleados en inmunohistoquímica. Estas moléculas, que se encuentran asociadas al anticuerpo primario o secundario (en función de si la técnica es 22 directa o indirecta), permiten la unión del cromógeno y por tanto la visualización de la localización del antígeno. Es muy importante conocer la enzima que se va a emplear en el marcaje de la técnica ya que las enzimas endógenas análogas, influyen en su actividad y por ellos es necesario realizar un bloqueo de las mismas. La enzima más comúnmente empleada para esta función es la peroxidasa, por tanto, será necesario bloquear su actividad endógena. De forma normal la peroxidasa se encuentra, sobre todo, en polimorfonucleares neutrófilos y células mieloides (Suvarna et al., 2019). La fosfatasa alcalina es la principal alternativa a la peroxidasa, se encuentra principalmente en intestino, riñón y tejido linfoide. En este caso se debe tener en cuenta que, si se emplea fijación con formol e inclusión en parafina, este proceso inactiva la enzima. De esta forma, no será necesario su inactivación si se emplea esta enzima en el marcaje (Valle, 2022). Por último, si se emplean métodos basados en la biotina o la estraptovidina será necesario el bloqueo de la actividad endógena de la biotina. Esta se encuentra principalmente en: hígado, riñón y tejido linfoide (Valle, 2022). D. BLOQUEO INESPECÍFICO La función del bloqueo inespecífico es evitar la unión de los anticuerpos a epítopos no objetivo que van a estar presentes en la muestra. De esta forma se previene la unión inespecífica y la aparición de posibles falsos positivos. En general, las soluciones de bloqueo se dividen en las siguientes categorías: soluciones proteicas, sueros normales y tampones comerciales libres de proteínas (Im et al., 2019). Las soluciones de bloqueo proteicas están constituidas por proteínas que se unirán a otras proteínas de la muestra, de tal forma que los anticuerpos se verán obligados a competir con las proteínas de bloqueo. Los ejemplos comunes incluyen la albúmina sérica bovina (BSA), la leche seca sin grasa y la gelatina (Im et al., 2019). Al emplear sueros normales, se ha de tener en cuenta que deben ser de la misma especie que el anticuerpo secundario. Si por el contrario se empleara una solución de bloqueo con anticuerpos criados en la misma especie que el anticuerpo primario, los anticuerpos secundarios podrían unirse de forma inespecífica a anticuerpos pertenecientes al suero normal y no al anticuerpo primario (Im et al., 2019). E. CONTRASTE Tras la adición del cromógeno y por tanto la aparición del marcaje de los antígenos de interés es necesario la realización de una contratinción. Esta tinción nos permite contrastar el tejido del fondo con los lugares marcados por el cromógeno. La contratinción más comúnmente empleada es la hematoxilina, aunque es importante tener en cuenta que el color debe contrastar con el del cromógeno (Valle, 2022). F. DESHIDRATACIÓN Y MONTAJE Por último, se lleva a cabo la deshidratación y el montaje. Para la deshidratación, se emplean concentraciones crecientes de alcohol (etanol) y por último dos inmersiones en xileno. De esta 23 manera se elimina el agua de la muestra y evitamos su degradación (Ramos-Vara, 2017). Para el montaje, se emplea un medio de montaje y un cubreojetos. El medio de montaje rellenará el espacio entre la muestra y el cubreojetos, preservando el estado de la misma. Una vez finalizado el proceso permite observar las muestras al microscopio. E) SALUD INTESTINAL La acuicultura ha emergido como una industria de creciente importancia y expansión, impulsada por el crecimiento poblacional global y la declinación de la pesca tradicional (Ahmad et al., 2021). Sin embargo, la domesticación de las especies utilizadas aún no ha alcanzado el nivel de desarrollo de la industria ganadera más establecida, como la producción de ganado vacuno o aves de corral. El aumento de la demanda, asociado con un incremento en el volumen de producción y una reducción de los precios, ha generado tensiones con la capacidad productiva y la adaptación a entornos de producción más intensivos de los animales. Esto ha provocado una mayor incidencia de brotes de enfermedades, con consecuencias tanto para los animales como para la economía, además de afectar la percepción pública de la industria. En última instancia, el objetivo de la industria acuícola es optimizar los parámetros ambientales, las dietas y la genética, con el fin de reducir significativamente los episodios de enfermedades, pues priorizar la salud animal es una necesidad apremiante (Beck & Peatman, 2015). Las superficies mucosas juegan un papel crucial en la salud animal, ya que constituyen la primera barrera de defensa contra los patógenos y son clave en procesos fisiológicos vitales como la absorción de macro y micronutrientes, la excreción de desechos y la osmorregulación (Beck & Peatman, 2015). A diferencia de los órganos inmunológicos convencionales, como el bazo y el riñón, las superficies mucosas son accesibles a través de tratamientos de inmersión o cambios en la dieta, lo que permite estrategias personalizadas para mejorar la salud de las mucosas y, por ende, del organismo en su totalidad. De hecho, numerosas áreas de investigación en acuicultura en la última década han dependido en gran medida de una mejor comprensión de las mucosas (Bøgwald & Dalmo, 2019; Nimalan et al., 2022; Yu et al., 2020). El tracto gastrointestinal es la interfaz exclusiva entre todo lo que los peces ingieren del medio ambiente, siendo responsable de la absorción de todos los micro y macronutrientes, la extracción y exclusión de toxinas y desechos, y el metabolismo y la biosíntesis de moléculas críticas (Ostrander, 2000). El intestino, además, desempeña un papel crucial en la respuesta inmunitaria debido a la presencia del tejido linfoide asociado al intestino (GALT, por sus siglas en inglés) (Beck & Peatman, 2015). En particular, las alteraciones en el entorno interno o externo pueden afectar rápidamente la barrera intestinal, lo que a su vez impacta la salud intestinal y, a largo plazo, el bienestar general de los peces. Por otro lado, es crucial profundizar en estos conocimientos para mantener e incluso fortalecer la salud intestinal y el bienestar general de los peces de cultivo y de laboratorio. En este sentido, las empresas de alimentación en acuicultura tienen un gran interés en encontrar soluciones para mejorar la nutrición y la salud 24 de los peces mediante el uso de aditivos dietéticos que permitan promover la eficiencia alimentaria, el crecimiento y la salud intestinal de los peces (Dawood et al., 2018). Sin embargo, evaluar un gran número de dietas en especies acuícolas es costoso y requiere tiempo. En este sentido, el pez cebra ha crecido como modelo en biomedicina y, en menor medida, en la investigación acuícola, y permite evaluar los efectos de diferentes dietas en la salud intestinal de los peces (Ulloa et al., 2014). Existen diferentes métodos para la determinación de la salud intestinal como: el estudio morfológico y morfométrico del intestino (Fleming et al., 2010), la caracterización de la microbiota (Rolig et al., 2017), la evaluación de la de respuesta inflamatoria (Fleming et al., 2010; Oehlers et al., 2010), o la caracterización de marcadores de apoptosis y proliferación celular (Guerra-Varela et al., 2018; Oehlers et al., 2010) y de las proteínas de unión y del citoesqueleto (Dale et al., 2009; Ronza et al., 2020), entre otros. En relación a estos últimos parámetros, se ha visto que el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) puede ser un marcador útil para la valoración de la proliferación celular, mientras que la determinación de la caspasa 3 se ha utilizado para la detección de células en apoptosis (Guerra-Varela et al., 2018; Oehlers et al., 2010). Por otro lado, las proteínas E-cadherina y citoqueratina AE3/ AE1 son importantes marcadores del estado de las uniones intercelulares y del citoesqueleto de las células del epitelio, respectivamente (Dale et al., 2009; Ronza et al., 2020). Una de las principales técnicas para determinar la presencia de estas moléculas es la inmunohistoquímica, que permite estudiar los marcadores en el contexto tisular dando una visión global de los eventos que ocurren en el intestino. Sin embargo, antes de la utilización de la técnica en especies animales para las que no están probadas, es necesario la puesta a punto de dichas técnicas en las especies de interés, con el fin de obtener resultados fiables. ANTÍGENOS RELACIONADOS CON LA PROLIFERACIÓN Y APOPTOSIS CELULAR El antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) interviene en el proceso de replicación del ADN. Se trata de una proteína de forma toroidal que rodea la doble hélice del ADN y puede desplazarse bidireccionalmente sobre ella. Se encuentra asociada a la enzima ADN polimerasa y su función es sujertala a la cadena de ADN, de tal forma que aumente la procesividad de la enzima (cantidad de nucleótidos añadidos antes de disociar el complejo que forma con la enzima) (Kelman, 1997). El PCNA participa, principalmente, en la replicación y reparación del ADN y en el control de ciclo celular, pero también en procesos como la apoptosis, el metabolismo de la cromatina y la expresión de genes (Maga & Hübscher, 2003). Al tratarse de una proteína asociada esencialmente a la replicación del ADN, la mayor parte de las interacciones ocurren en la fase S (o de replicación celular) o en la transición entre el final de la fase G1 (la célula se prepara para dividirse) y el inicio de la fase S (Zessin et al., 2016). Distintos estudios relativos a la salud intestinal han empleado el PCNA como marcador en múltiples especies de peces. En ellos se valoraron los cambios producidos en el marcador en distintos escenarios como: modificaciones en la dieta (Sanden et al., 2005), infección por 25 B. OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA Los protocolos proporcionados por el laboratorio de comercialización de los anticuerpos primarios, en muchas ocasiones, no están probados en el pez cebra ni otras especies de interés en acuicultura. Por tanto, con el fin de optimizar la técnica para el pez cebra, se realizaron algunas modificaciones en los protocolos de inmunohistoquímica. La problemática que surgió inicialmente, fue el desprendimiento de los tejidos del portaobjetos durante la recuperación antigénica, cuando se empleaban cortes del pez cebra entero. Los tejidos no se desprendían en todos los casos, solo en aquellos en los que la recuperación antigénica era superior a cinco minutos. Para evitar que esto ocurriera se modificaron tres variables: los portaobjetos empleados, los cortes y el tiempo de recuperación. Con respecto a los portaobjetos se probaron tres tipos, con tratamientos de adhesión diferentes: silanizados, SuperFrost® y Trajan®, pero no se observó diferencia entre ellos. A continuación, se emplearon cortes diferentes; en lugar del pez entero, únicamente se emplearon intestinos diseccionados. Se observó que estas muestra resistían mucho mejor el tratamiento térmico y no se desprendían. Además, asociado a la recuperación antigénica, se introdujo una última modificación, al inicio, en todos los casos, el procedimiento se realizó empleando un olla sin usar la tapa pero después, 32 B FIGURA 14: tinción hematoxilinaeosina realizada en muestras de pez cebra entero, cortado longitudinalmente. A: 20x, barra 100 µm. Porción correspondiente al intestino anterior. B: 20x, barra 100 µm. Porción correspondiente al intestino medio. A C D FIGURA 15: tinción hematoxilinaeosina realizada en muestras de intestino diseccionado pez cebra, cortado longitudinalmente. C: 20x, barra 100 µm. Porción correspondiente al intestino anterior. D: 20x, barra 100 µm. Porción correspondiente al intestino medio. se colocó. Al generarse una distribución térmica más homogénea se observó que las muestras no se desprendían. Además, en algunos casos fue necesario el uso de más de un tipo de anticuerpo y el ajuste de la dilución. En la siguiente tabla (tabla 5) se detallan los procesos realizados y sus resultados: 33 AC LABORATORIO TIPO DE AC RA TIEMPO DE RA DILUCIÓN REVELADO CORTE RESULTADO CK AE1/ AE3 DAKO mAb CALOR: TAMPÓN HIGH PH 5 MIN RTU Vector VIP® PEZ ENTERO ✓ (Marcaje específico) DAKO mAb CALOR: TAMPÓN LOW PH 15 MIN 1:50 DAB INTESTINO DISECCIONADO ✓ (Marcaje específico) GENETEX pAB CALOR: TAMPÓN LOW PH, 5 MIN 1:100 Vector VIP® PEZ ENTERO ✗ (Tinción inespecífica) 15 MIN 1:100 Vector VIP® PEZ ENTERO ✗ (Tinción inespecífica) PROMEGA pAB CALOR: TAMPÓN HIGH PH 5 MIN 1:250 DAB INTESTINO DISECCIONADO ✗ (Sin marcaje) 15 MIN 1:250 Vector VIP® PEZ ENTERO/ INTESTINO DISECCIONADO ✗ (Sin marcaje) 15 MIN 1:50 Vector VIP® INTESTINO ✓ (Marcaje específico) SANTA CRUZ mAb CALOR: TAMPÓN HIGH PH 5 MIN 1:500 Vector VIP® PEZ ENTERO ✗ (Sin marcaje) PCNA SANTA CRUZ mAb CALOR: TAMPÓN LOW PH 5 MIN 1:200 Vector VIP® PEZ ENTERO ✓ (Marcaje específico) DAB INTESTINO DISECCIONADO ✓ (Marcaje específico) Tabla 5: características principales de los anticuerpos empleados. AC: anticuerpo; CK: citoqueratina; DAB: tetracloruro de 3,3′diaminobenzidina.;mAb: anticuerpo monoclonal ratón; MIN: minutos; pAb: anticuerpo policlonal conejo; PCNA: antígeno nuclear de células en proliferación; RA: recuperación antigénica; RTU: “ready to use”, listo para usar. E-CADHERINA CASPASA3 A continuación, se resumen los resultados del marcaje obtenido en el intestino de peces cebra adultos correspondientes a cuatro anticuerpos: citoqueratina AE1/AE3, Ecadherina, PCNA y caspasa-3. Cabe destacar que, en todos los casos la inmunotinción resultó positiva tanto en el control positivo como en la muestra problema, y negativa en el control negativo, permitiendo la validación de la técnica. - E-CADHERINA: La E-cadherina se detectó a lo largo de todo el intestino del pez cebra, no se observaron diferencias apreciables en la expresión del antígeno entre los diferentes tramos del intestino del pez cebra. La inmunotinción resultó positiva en el epitelio intestinal, ubicándose en el área de contacto entre las células, en posición basolateral (figura 16). 34 A B FIGURA 16: Inmunorreacción positiva al anticuerpo antiE-cadherina en la membrana basolateral de las células epiteliales de los pliegues intestinales. El revelado se realizó con DAB (tetracloruro de 3,3′diaminobenzidin). A: 20x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. B: 40x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. C: 20x, barra 200 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. D: 100x, barra 20 µm. Reacción positiva en las membranas laterales indicada con flechas negras. Tramo correspondiente al intestino medio. E: 100x, barra 20 µm. Reacción positiva en las membranas laterales indicada con flechas negras. Tramo correspondiente al intestino anterior. D C E - CITOQUERATINA AE1/AE3: La inmunotinción se observó con igual intensidad en todos los tramos del intestino del pez cebra. La inmunotinción resultó positiva en el citoplasma de los enterocitos que componen el epitelio intestinal. La coloración presentó mayor intensidad en la zona apical, correspondiente con el borde de cepillo o microvellosidades. La lámina propia, las capas musculares y la serosa, no mostraron positividad, tampoco las células goblet ni los linfocitos. También se observó inmunomarcaje en las células endoteliales presentes en los vasos sanguíneos (figura 17). 35 A B FIGURA 17: inmunorreacción positiva al anticuerpo anticitoqueratina AE1/AE3 en el citoplasma de las células epiteliales de los pliegues intestinales. El revelado se realizó con vector VIP®. A: 20x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. B: 40x, barra 20 µm. Reacción positiva en el endotelio (flecha negra). Tramo correspondiente al intestino anterior. C: 100x, barra 20 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. D: 20x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. E: 100X, barra 100 µm. Marcaje más intenso el el borde de cepillo (flecha azul). Tramo correspondiente al intestino medio. C E D - CASPASA3: No se detectaron diferencias en la intensidad de la tinción entre los distintos tramos de intestino del pez cebra. El inmunomarcaje de la enzima caspasa3 fue esencialmente nuclear y se localizaba de forma multifocal a lo largo de los pliegues intestinal (figura 18). Existe un ligero marcaje inespecífico localizado en el borde de cepillo de los pliegues intestinales y en la capa muscular. 36 FIGURA 18: inmunorreacción positiva al anticuerpo anticaspasa 3 en las células apoptóticas presentes en los pliegues intestinales. El revelado se realizó con DAB. Se indica con flechas negras los núcleos celulares con inmunorreacción positiva. A: 20x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. B: 40x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. C: 40x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. D: 40x, barra 500 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. E: 100X, barra 20 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. A B C D E - PCNA No se observaron diferencias apreciables en la expresión del PCNA entre los diferentes tramos del intestino del pez cebra. La reactividad positiva estaba localizada en el epitelio, más concretamente en las áreas más profundas entre pliegues intestinales, de tal forma que, a medida que ascendemos en el pliegue, las células ya no presentan inmunorrección positiva. El marcaje del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), era principalmente nuclear (figura 19). 37 FIGURA 19: inmunorreacción positiva al anticuerpo antiPCNA en las células en proliferación presentes entre los pliegues intestinales. Todas fueron reveladas con vector VIP®, a excepción de la imagen C. A: 10x, barra 50 µm. Tramo correspondiente al intestino medio. B: 40x, barra 50 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. C: 40x, barra 100 µm. Tramo correspondiente al intestino anterior. D: 100x, barra 20 µm. Células con núcleos positivos (flechas negras). Tramo correspondiente al intestino anterior. E: 100x, barra 20 µm. Células con núcleos positivos (flechas negras).Tramo correspondiente al intestino medio. B C D A 5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES: La salud de las mucosas es un tema de gran relevancia y preocupación en acuicultura. Todos los organismos, incluidos los peces, están en constante interacción con su entorno, enfrentándose a diversos desafíos biológicos, como virus, bacterias y parásitos; químicos, como contaminantes y tratamientos; y físicos, relacionados con el manejo. Además, son sensibles a estímulos externos como el estrés y las modificaciones dietéticas. Las superficies mucosas, que incluyen la piel, las branquias y el intestino, actúan como la interfaz entre el medio interno y externo, constituyendo la primera línea de defensa. La capa de moco, la microbiota y la estructura de estas superficies trabajan en estrecha coordinación para garantizar la funcionalidad de la barrera protectora. Por lo tanto, mantener una buena salud de las mucosas no solo contribuye a una mejora de la salud y bienestar animal, sino que también genera una mayor productividad y reducción del uso de tratamientos (Lazado, 2020). Se seleccionó el pez cebra como organismo modelo debido a características como su pequeño tamaño o por su bajo coste de mantenimiento. Además de la posibilidad de extrapolar los resultados obtenidos a otras especies de interés en acuicultura (Santoriello & Zon, 2012). Para la detección de los marcadores de apoptosis y proliferación celular, las proteínas de unión y el citoesqueleto, se ha empleado la técnica inmunohistoquímica. Es importante tener en cuenta que es una técnica con múltiples pasos en la que interviene muchos factores, como la humedad, la temperatura, un secado adecuado de los portaobjetos, preparación de diluciones correctamente, elección adecuada de controles, tiempos de recuperación antigénica, incubación y revelado, entre otros. Asimismo, aunque el pez cebra es un animal cuyo uso en investigación está en auge, existe poca información detallada sobre su anatomía e histología digestiva. Además, existe la dificultad añadida de que, en esta especie, la mayoría de los productos comercialmente disponibles, carecían de validación para la técnica. En consecuencia, es complicado disponer de marcadores probados que puedan emplearse para inmunotinción en cortes histológicos, de tal forma que, se permita la inmunolocalización de moléculas de interés en su contexto tisular. La importancia de este trabajo residió en la introducción de modificaciones en los protocolo de inmunohistoquímica, que generaron mejoras significativas en los resultados para la especie de interés. Contribuyendo de esta manera a aumentar la herramientas disponibles para el conocimiento de la salud de las mucosas en los peces. Además de las modificaciones relativas a la recuperación antigénica, los anticuerpos primarios, los cortes empleados y los distintos tratamiento de los portaobjetos, también se modificó el cromógeno. El uso de DAB (tetracloruro de 3,3′diaminobenzidin) o vector VIP®, dependía del tipo de muestra empleada. En los cortes longitudinales del pez entero se empleó en todos los casos vector VIP®, la razón es la existencia de pigmentos endógenos, como los centros de melanomacrófagos (Steinel & Bolnick, 2017), presentes en el pez cebra que podrían confundirse con marcaje por DAB. En los intestinos diseccionados se empleó DAB, ya que en estos casos no había posibilidad de confusión. 38 CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LOS ANTICUERPOS Y APLICACIONES EN LA EVALUACIÓN DE LA SALUD INTESTINALES DE PECES: El inmunomarcaje obtenido para cada un de los anticuerpos empleados, no mostró diferencias entre los distintos tramos de intestino. Aunque al tratarse de un estudio cualitativo y no cuantitativo, quizás se precisaría de un análisis para comprobarlo. Tampoco se han encontrado publicaciones que muestren las posibles diferencias existentes en el inmunomarcaje de estos anticuerpos a lo largo del intestino, en esta especie o en otras. PCNA Aunque en el pez cebra las criptas de Lieberkün estén ausentes, la renovación epitelial continua presente y tiene lugar principalmente en los espacios entre los pliegues (Wallace, 2005), de tal forma que, como cabría esperar y, como se ha visto en el presente trabajo, la mayor expresión de PCNA, tiene lugar en estas áreas. El resultado obtenido en el pez cebra sano es muy similar al observado en los animales sanos de distintas investigaciones llevadas a cabo en otras especies de peces como el salmón Atlático (Salmo salar). (Bakke-McKellep et al., 2007; Sanden & Olsvik, 2009) o la trucha común (Salmo trutta) (Dezfuli et al., 2012). Es decir, que a nivel histológico, la inmunolocalización de PCNA en pez cebra es similar a la del salmón y la de la trucha. El PCNA, se ha empleado como marcador para la evaluación de la salud intestinal de múltiples especies de peces en situaciones patológicas. En salmones Atlánticos, se valoraron los cambios asociados a la proliferación celular empleando el marcador PCNA, tras la administración intraperitoneal de β-naphthoflavone (BNF), un tóxico modelo. Los resultados reflejaron que el BNF redujo significativamente la proliferación de las células intestinales, en comparación con el grupo control (animales sanos) (Sanden & Olsvik, 2009). En lo relativo a alteraciones intestinales asociadas a la dieta, se valoraron los efectos a largo plazo de la alimentación con productos vegetales en salmones del Atlántico. Empleando distintos marcadores, entre ellos, la proliferación celular a través de la detección de PCNA en el intestino mediante inmunohistoquímica. En general, la proliferación celular estaba concentrada en la base de los pliegues pero también, se detectaron células positivas a lo largo del mismo. Aunque su número fue disminuyendo a medida que se ascendía en el pliegue. Se determinó, además, que la mucosa intestinal de animales alimentados con soja experimentaron un aumento de la proliferación celular, mientras que los alimentados con maíz, experimentaron disminución de la proliferación (Sanden et al., 2005). Otra posible aplicación del PCNA como marcador en lo relativo a salud intestinal, es durante las variaciones asociadas a infecciones, como en el caso de la infección por acantocéfalos en la trucha común (Dezfuli et al., 2012). Se observó que en las zonas más próximas a las áreas de unión del parásito, aumentaba el número de células PCNA positivas. Por último, cabe destacar el papel del PCNA, en el diagnóstico de cáncer. Se observó que la presencia de ingredientes vegetales en piensos administrados en salmones, generaban 39 inflamación y displasia intestinal, que, a su vez, desembocaba en el desarrollo de adenocarcinomas intestinales. Las células epiteliales intestinales tumorales, presentaban un fuerte marcaje a PCNA, debido a la alta proliferación de las mismas (Dale et al., 2009). CASPASA 3 El proceso de apoptosis o muerte celular programada es vital para el mantenimiento de la homeostasis en el organismo (Negroni et al., 2015). Aunque existen algunas diferencias en la dinámica de renovación del epitelio intestinal entre peces y mamíferos, existen también grandes similitudes. En el pez cebra, las células más indiferenciadas parten de los espacios entre los pliegues y van avanzando hacia la punta del mismo donde se desprenden, tras sufrir apoptosis (Wallace, 2005). El marcaje visto en el presente trabajo difiere de lo observado en otras investigaciones anteriores. En el artículo de Bakke-McKellep et al. (2007), realizado empleando el salmón Atlántico como modelo, se observó que en los animales sanos (grupo control) las células positivas a caspasa 3 eran células individuales poco numerosas, localizadas en las puntas de los pliegues. En el pez cebra se observó inmunotinción también en unas pocas células individuales pero se localizaban, en la mayoría de los casos, distribuidas de forma multifocal a lo largo de todo el pliegue intestinal, es decir, no se localizaban únicamente en el área más apical. En los estudios realizados en rodaballo (Scophthalmus maximus) (Losada et al.,2014) y en Pelteobagrus vachelli (Zheng et al.,2021), no se describe, en los animales sanos usados como controles negativos, inmunotinción de caspasa 3 únicamente localizada en la parte apical de los pliegues. Además, en el presente trabajo, se observó tinción de fondo localizada en el borde de cepillo y en la capa muscular, probablemente asociado a un exceso de tiempo de revelado o a una concentración del anticuerpo primario demasiado elevado (Ramos-Vara, 2017). La caspasa 3 ha sido utilizada como marcador en estudios que evalúan los cambios en el intestino del rodaballo (Scophthalmus maximus) provocados por el patógeno Enteromyxum scophthalmi. El objetivo principal fue emplear el ensayo inmunohistoquímico para detectar células apoptóticas tanto en rodaballos sanos como infectados con E. scophthalmi, con el fin de determinar la presencia y distribución de estas células durante el desarrollo de la enfermedad. Los resultados mostraron un aumento significativo de la apoptosis durante la enteromixosis (Losada et al., 2014). También se evaluaron conjuntamente PCNA y caspasa 3, entre otros marcadores, con el objetivo de analizar los efectos de la harina de soja dietética y la inulina (probiótico) sobre la apoptosis y la proliferación en el salmón del Atlántico. Se observó un aumento significativo en la longitud del compartimento proliferativo en peces alimentados con dietas a base de harina de soja, en comparación con aquellas basadas en harina de pescado y las que incluían el prebiótico inulina. Además, se incrementó la reactividad de la caspasa 3, lo que podría indicar una inducción de la reparación celular y la apoptosis, respectivamente (Bakke-McKellep et al., 2007). 40 Por último, en un estudio realizado en la especie Pelteobagrus vachelli, se determinó que la exposición a situaciones de hipoxia, generaba un aumento de la apoptosis intestinal, que se veía incrementada a medida que aumentaba el tiempo de respuesta (Zheng et al., 2021). E-CADHERINA La E-cadherina desempeña un papel fundamental en las uniones intercelulares y es esencial para el mantenimiento de la función barrera del organismo. La salud de las mucosas es un problema recurrente en la investigación en acuicultura, sin embargo, existe una gran falta de estudios inmunohisoquímicos de las proteínas de unión en peces. Empleando el rodaballo (Scophthalmus maximus) como organismo modelo, se realizó una caracterización inmunohistoquímica de la E-cadherina en distintos tejidos (Ronza et al., 2019). Entre los tejidos utilizados se encuentra el intestino, en el que se observa una inmunotinción muy similar, a la obtenida en el presente trabajo, inmunolocalizada en los contactos célulacélula en el epitelio (Ronza et al., 2019). Por otro lado, en un contexto patológico, se valoraron las modificaciones producidas por Enteromyxum spp. en la distribución de la E-cadherina intestinal empleando inmunohistoquímica. Se observó que, en el rodaballo (Scophthalmus maximus) moderadamente infectado, se conservó el patrón de distribución general de la E-cadherina, pero se detectó una inmunoreacción más intensa en torno a las formas parasitarias. Cuando la infección era severa la inmunotinción se alteró notablemente, observándose áreas de escasa inmunoreacción en las uniones intercelulares y un fuerte marcaje en las áreas de contacto entre el huésped y los parásitos. Por el contrario, no se observaron cambios en la inmunotinción de E-cadherina en doradas con infecciones moderadas y severas, en comparaciones con los animales sanos empleados como control (Ronza et al., 2020). Esta pérdida de la distribución fisiológica y su reubicación en la interfaz parásitoenterocito, podría generar una disfunción de la barrera intestinal y aumento de la permeabilidad (Rao et al., 2002). También se evaluó, empleando la dorada (Sparus aurata) como modelo, el papel de la Ecadherina y las uniones estrechas en la integridad intestinal de peces sanos e infectados por Enteromyxum leei. Al contrario que en el estudio realizado por Ronza et al. (2020), se determinó que la expresión de la E-cadherina no mostró ningún cambio entre los peces sanos y los enfermos. Mientras que las uniones estrechas sí se vieron alteradas en los peces parasitados (Sitjà-Bobadilla et al., 2019). Además, en medicina humana la E-cadherina se emplea como marcador tumoral, ya que la pérdida selectiva de esta proteína puede causar desdiferenciación e invasividad en los carcinomas humanos, lo que lleva a que la E-cadherina se clasifique como un supresor de tumores (Singhai et al., 2011). CITOQUERATINA AE1/ AE3: La citoqueratina es una proteína altamente conservada durante la evolución de los vertebrados (Groff et al., 1997), y constituye una parte del citoesqueleto de las células epiteliales. 41 promotes intestinal health by constraining microbiota composition. PLoS biology, 15(2), e2000689. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2000689 Ronza, P., Estensoro, I., Bermúdez, R., Losada, A. P., Pérez-Cordón, G., Pardo, B. G., SitjàBobadilla, A., & Quiroga, M. I. (2020). Effects of Enteromyxum spp. (Myxozoa) infection in the regulation of intestinal E-cadherin: Turbot against gilthead sea bream. 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