Influencia de los factores genéticos en la hepatotoxicidad secundaria a fármacos antituberculosos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina INFLUENCIA DE LOS FACTORES GENÉTICOS EN LA HEPATOTOXICIDAD SECUNDARIA A FÁRMACOS ANTITUBERCULOSOS Tesis Doctoral Virginia Leiro Fernández 2008 ALBERTO FERNÁNDEZ VILLAR, Doctor en Medicina y Facultativo Especialista en Neumología del Hospital Xeral-Cíes del Complexo Hospitalario Universitario de Vigo, DIANA VALVERDE PÉREZ, Doctora en Biología y Profesora contratada del Departamento de Bioquímica, Genética y Biología de la Universidad de Vigo, y ARTURO GONZÁLEZ QUINTELA, Doctor en Medicina y Profesor Titular de Universidad del Departamento de Medicina de Santiago de Compostela, como directores. CERTIFICAN: Que la presente memoria titulada “Influencia de los factores genéticos en la hepatotoxicidad secundaria a fármacos antituberculosos” ha sido realizada bajo nuestra dirección por Dña. VIRGINIA LEIRO FERNÁNDEZ, Licenciada en Medicina, en el Hospital Xeral-Cíes del Complexo Hospitalario Universitario de Vigo. Estimado que se encuentra finalizada y en condiciones de optar al Grado de Doctor, solicitan que sea admitida a trámite para su lectura y defensa pública. Santiago de Compostela, 31 de Julio de 2008 Alberto Fernández Villar Diana Valverde Pérez Arturo González Quintela A mi hijo, a Fernando y a toda mi familia AGRADECIMIENTOS Deseo agradecer a los Doctores Alberto Fernández Villar, Diana Valverde Pérez y Arturo González Quintela haber aceptado la dirección de esta tesis, y su confianza, esfuerzo y dedicación. A todos los pacientes que aceptaron participar en este estudio, por su altruismo y confianza en la investigación médica. Al Doctor Rafael Vázquez Gallardo y, a Nieves, Ana y María, de la Unidad de Tuberculosis de Vigo, por su colaboración, por su motivación en la investigación y su buen hacer. Al Doctor Luis Anibarro y a Alberto de la Unidad de Tuberculosis de Pontevedra por su amable colaboración. A los Doctores Daniel Díaz Cabanela de la Unidad de Tuberculosis de A Coruña, y a la Doctora Adela Acuña de la Unidad De Tuberculosis de Orense por su desinteresada colaboración. Al Doctor Enrique Caso por su confianza en mi capacidad para la realización de esta tesis, su optimismo, sus facilidades y consejos y, sobre todo, su apoyo a mi labor investigadora. A las Doctoras Maribel Botana y Cristina Represas, por su amistad y por el ánimo, apoyo y ayuda que en todo momento me han dado. A Lucía Constenla por su gran esfuerzo, dedicación, profesionalidad, alegría y ganas de aprender, pero sobre todo, por su amistad. Al Doctor Maximiliano Álvarez por sus consejos y experiencia aportada en el Laboratorio de Investigación. A la Doctora Marily Andrade por su colaboración y apoyo continuo. A Mabe de la Fundación por su alegría, capacidad resolutiva y ayuda. A Rafa de Suministros por su simpatía, su preocupación y colaboración. A la Doctora Mar Mosteiro por la formación recibida durante la residencia, y por haber despertado en mí la capacidad de crítica científica. A los Doctores Luis Piñeiro y Juan Carlos Barros, y a los demás componentes del Servicio de Neumología del Complexo Hospitalario Universitario Xeral-Cíes de Vigo por las enseñanzas recibidas, su profesionalidad y su apoyo a mi labor investigadora. A los Doctores Javier de la Fuente y César Martínez Vázquez por contagiarme su afán investigador. A Fernando y a mi hijo, por su paciencia, comprensión, apoyo incondicional, consejos, y por todo el sacrificio que supone el tiempo robado de su compañía. A mis padres, por el ejemplo que me han dado, su comprensión y su esfuerzo. A mis hermanos y a toda mi familia por su apoyo y entendimiento. A mis amigas por estar siempre ahí. IV II. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 113 II.1. OBJETIVO GENERAL 115 II.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS 116 III. METODOLOGÍA 117 III.1. DISEÑO DEL ESTUDIO 119 III.2. SELECCIÓN DE LOS SUJETOS A ESTUDIO 119 III.2.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN 120 III.2.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN 120 III.3. VARIABLES A ESTUDIO 121 III.4. ESTUDIO GENÉTICO DE LOS POLIMORFISMOS 122 III.4.1. TOMA DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ADN 122 III.4.2. REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA 124 III.4.2.1. PCR GEN NAT2 124 III.4.2.2. PCR GENES GSTM1 Y GSTT1 126 III.4.2.3. PCR GEN CYP2E1 128 III.4.3. DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 129 III.4.3.1. DIGESTIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DEL GEN NAT2 130 III.4.3.1. DIGESTIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DEL GEN CYP2E1 134 III.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 136 III.6. CRONOGRAMA DEL ESTUDIO 137 V IV. RESULTADOS 139 IV.1. DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN A ESTUDIO 141 IV.2. POLIMORFISMOS DEL GEN NAT2 144 IV.3. POLIMORFISMOS DEL GEN GST: GSTM1 Y GSTT1 147 IV.4. POLIMORFISMOS DEL GEN CYP2E1 149 IV.5. RIESGO DE HEPATOTOXICIDAD ASOCIADO A LA PRESENCIA DE VARIOS POLIMORFISMOS 150 V. DISCUSIÓN 151 V.1. POLIMORFISMOS DEL GEN NAT2 156 V.2. POLIMORFISMOS DEL GEN GST 168 V.3. POLIMORFISMOS DEL GEN CYP2E1 170 V.4. LIMITACIONES DEL ESTUDIO 173 V.4.1. DERIVADAS DEL DISEÑO 173 V.4.2. DERIVADAS DEL ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS 174 VI. CONCLUSIONES 177 VII. BIBLIOGRAFÍA 181 VIII. ADDENDA 221 VII GLOSARIO DE ABREVIATURAS ADH Aldehído deshidrogenasa ADVP Adictos a drogas por vía parenteral ALT Alanina transaminasa AST Aspartato transaminasa ATS American Thoracic Society Anti-VHC Anticuerpos del virus de la hepatitis C CDC Centers for Disease Control and Prevention CHOP Complexo Hospitalario de Pontevedra CHUVI Complexo Hospitalario Universitario de Vigo CIM Concentración mínima inhibitoria CIOMS Council of International Organizations of Medical Sciences CYP Citocromo P-450 DE Desviación estándar DXSP Dirección Xeral de Saúde Pública E Etambutol EDO Lista de enfermedades de declaración obligatoria EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica FA Fosfatasa alcalina FAT Fármacos antituberculosos GGT Gammaglutamil transpeptidasa GI Gastrointestinal GSEC Genetic Susceptibility to Enviromental Carcinogens GST Glutation S-transferasa H Isoniacida HBsAg Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B HBeAg Antígerno E del virus de la hepatitis B HFAT Hepatotoxicidad secundaria a fármacos antituberculosos HLA Alelos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad HSD Hepatotoxicidad secundaria a drogas IC 95% Intervalo de confianza del 95% IDSA Infectious Disease Society of America Im Intramuscular VIII IMC Índice de masa corporal L Litro LSN Límite superior de la normalidad LES Lupus eritematoso sistémico M Marcador MAH Monoacetilhidracina min Minutos MR Multirresistencia MnSOD Manganeso superóxido reductasa NAT N-acetiltransferasa OMS Organización Mundial de la Salud OR Odds ratio Pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de polimerasa PXN Receptores pregnane X R Rifampicina RFLP Restriction fragment lenght polymorphisms RIQ Rango intercuantil S Estreptomicina seg Segundos SIDA Síndrome de la inmunodeficiencia adquirida TB Tuberculosis TITL Tratamiento de la infección tuberculosa latente TNF-α Factor de necrosis tumoral α UI Unidades Internacionales UICTER Unión Internacional contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias UTB Unidad de control y prevención de la tuberculosis VHB Virus hepatitis B VHC Virus hepatitis C VIH Virus de la inmunodeficiencia humana Z Pirazinamida I. Introducción 3 I. INTRODUCCIÓN. I.1. SITUACIÓN ACTÚAL DE LA TUBERCULOSIS. La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecto-contagiosa, conocida desde la antigüedad, causada por especies del género Mycobacterium. Dentro de este género las especies que más afectan al hombre son las agrupadas en el complejo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis), si bien el agente etiológico habitual es el M. tuberculosis. A pesar de disponer en la actualidad de tratamientos adecuados para curarla, los datos epidemiológicos reflejan una situación muy lejana de conseguir su erradicación mundial. Cada año casi dos millones de personas fallecen a causa de la TB en el mundo, a pesar de que se dispone de tratamientos baratos que son eficaces hasta en el 95% de los casos (1). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que entre el 2000 y el 2020 cerca de mil millones de personas contraerán la infección, doscientos millones de personas enfermarán y ésta cobrará como mínimo 35 millones de vidas (2). La pandemia de TB tiene un reparto muy desigual, afectando predominantemente a zonas con escasos recursos socioeconómicos y a las clases sociales más desprotegidas. Aunque las tasas de TB por 100.000 habitantes han ido disminuyendo en países industrializados, en España esta enfermedad sigue presentando un problema de salud importante con una tasa en el año 2000 de 19,64/100.000 habitantes, según datos procedentes del sistema EDO (lista de enfermedades de declaración obligatoria), existiendo grandes diferencias entre las comunidades autónomas (3). Galicia es una de las comunidades más afectadas, aunque la evolución de esta enfermedad está siendo muy favorable. Según datos del Registro 10 Los límites de eficacia para cualquier régimen terapéutico, en países con cifras de menos del 5% de resistencia primaria, deben ser superiores al 97% en un seguimiento de 5 años (8-10). El esquema terapeútico que se ha aceptado como estándar es el de 6 meses de duración que incluye la combinación de H, R y Z durante los 2 primeros meses seguidos de H y R durante 4 meses hasta completar los 6 meses se tratamiento (8-10). Debe de añadirse un cuarto fármaco en aquellas zonas con una incidencia de resistencia primaria a la H superior al 5%, cuando el paciente ha recibido tratamiento previo con antimicobacterianos, cuando procede de un pais con elevada incidencia de TB resistente o cuando existe el antecedente de un contacto con un paciente con TB resistente (8-10). Se añadiría el E en adultos y la S en niños debido a la imposibilidad de monitorizar la agudeza visual. En los pacientes con infección por VIH la R y la H debe de mantenerse 9 meses en vez de 6 meses. En aquellos pacientes en los que se confirme la resistencia primaria a la H el tratamiento debe de completarse 10 meses (8-10). Para el tratamiento de la enfermedad tuberculosa latente (TITL) lo más habitual es emplear regímenes simples con un solo fármaco, generalmente con H durante 6-12 meses (8,11). Otro posible esquema en monoterapia es el uso de R durante 4 meses (8,11). En cuanto a los esquemas terapeúticos combinados se ha utilizado la R más H durante 3 meses siendo aparentemente igual de eficaz y segura que la terapia estándar con H (8,11,12). A pesar de los resultados favorables obtenidos con la combinación de R y Z durante 2 meses en pacientes VIH, dicho régimen se ha asociado a una elevada incidencia de 11 hepatotoxicidad, incluso mayor a la observada en regímenes con H, R y Z (8,11,12). A pesar de que se cumplen 50 años desde la introducción de una quimioterapia eficaz contra la TB, el número de casos a escala mundial es mayor y, además, aumenta el número de infecciones por cepas resistentes a FAT. Esta situación pone de manifiesto que, en el manejo de esta enfermedad se cometieron varios errores, algunos atribuibles a los profesionales sanitarios y otros a los propios pacientes, destacando entre ellos la prescripción de tratamientos inadecuados y el incumplimiento terapéutico. El incumplimiento se asocia a varios factores de riesgo como la pobreza, inmigración, infección por el VIH, drogadicción y disminución de los recursos sociales y sanitarios, que explican el aumento no esperado del número de casos y el incremento de los bacilos resistentes (13). Los escasos estudios sobre multiresistencias publicados hasta 1994 tenían serias limitaciones, con sesgos en las muestras, insuficiente validación de las técnicas de laboratorio, no diferenciación entre resistencias primarias y adquiridas, etc. Por ello en 1994 la OMS y la Unión Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UICTER), pusieron en marcha un Proyecto mundial de vigilancia de resistencias, con uniformidad de criterios, de forma que nos permite comparar estos datos y conocer la importancia real del problema (14). Se han publicado resultados correspondientes al periodo 1994- 1999 en el que se incluyó información sobre la resistencia primaria en 54 países o puntos geográficos (14). La prevalencia de la resistencia primaria frente a cualquier fármaco fue del 10,7% y la prevalencia de multirresistencia primaria del 1%. En Galicia la Dirección Xeral de Saúde Pública (DXSP) puso 12 en marcha en el año 2000 su estudio con el objetivo principal de conocer la situación real de la comunidad (13). Desde el 1 de noviembre de 2000 hasta el 1 de Junio de 2001 se incluyeron 360 pacientes que no habían recibido tratamiento antituberculoso previo y 40 pacientes tratados anteriormente. Se analizó la resistencia a H, R, E y S. La resistencia primaria fue del 11,7% (H, 4,4%; R, 1,4%; E, 2,2%; S, 7,2%) y la secundaria del 22,5% (H, 17,5%; R, 7,5%; E, 7,5%; S, 17,5%) (18). El porcentaje de multirresistencia (MR) en pacientes nunca tratados fue del 1,4%. Estos resultados indican que la comunidad gallega se encuentra en una buena situación en el tema de resistencias. El análisis de resultados de dos estudios más recientes no aporta grandes cambios en la situación de las MR en Galicia (15,16). Varios estudios han demostrado que la resistencia a los FAT se debe a mutaciones espontáneas en los genes que codifican la diana del fármaco o enzimas implicadas en la activación del fármaco (8,17-19). La tasa con la que tienen lugar estas mutaciones varía en función del fármaco, siendo la más elevada la del E y la más baja la de la R y quinolonas. No obstante, no se conoce una alteración genética que, por si misma, de lugar al fenotipo MR (definido como la asociación de resistencias como mínimo a H y R). Este fenotipo MR se debe a la adquisición secuencial de mutaciones en diferentes locus de genes independientes (8,17-19). La detección precoz de la resistencia y los mecanismos de producción son esenciales para el correcto control de la TB resistente y el desarrollo de técnicas moleculares que permitan su detección precoz (8). A continuación se describen las características, actividad, mecanismos de resistencia y efectos secundarios de los FAT de primera línea. 13 Isoniacida: La H es un fármaco sintético cuyo uso terapéutico comenzó en los años 50. Es un fármaco generalmente activo frente a los integrantes del complejo tuberculoso mientras que el papel del mismo en el tratamiento de otras micobacterias es muy limitado (8). La H es un profármaco que requiere una activación in vivo que producirá un potente derivado, con capacidad de oxidar o acilar grupos proteicos, interfiriendo finalmente en la síntesis de de los ácidos micólicos de la pared de M. tuberculosis (8). La H es tan solo activa frente a los bacilos en replicación activa, siendo su papel muy limitado en las poblaciones latentes como las del caseum, o en las poblaciones latentes del interior de los macrófagos. Las concentraciones séricas después de 2 horas de una dosis oral de 300 mg son de 4,5 a 7 µg/ml (8-10,20). Uno de sus efectos secundarios más graves es su capacidad para producir hepatotoxicidad. En la mayor parte de los casos se producen elevaciones asintomáticas de las transaminasas, hecho que puede ocurrir hasta en el 10-15% de los pacientes tratados. El riesgo de hepatitis sintomática es muy bajo (0,1%) antes de los 30 años y se incrementa de manera progresiva hasta el 4% en mayores de 65 años (12). También puede originar polineuritis periférica por déficit de piridoxina (8-10). La activación de la H se lleva a cabo por el enzima catalasa-peroxidasa codificado por el gen katG. Las mutaciones en este gen son las principales responsables de la resistencia de alto nivel a la H (8,17-19). El derivado activo de la H actúa bloqueando la síntesis de los ácidos micólicos. Una de las dianas intracelulares del derivado activo es la reductasa de la proteína transportadora 14 de los ácidos acilenólicos codificada por el gen inhA (8,17-19). En aproximadamente el 25% de las cepas resistentes se producen mutaciones de inhA y suelen asociarse a resistencias de bajo nivel (8,17-19). La mayor parte de estas mutaciones se han descrito en la región reguladora del gen y originan una sobreexpresión del enzima que compensa la acción inhibidora del fármaco. También se han descrito mutaciones en la zona de interacción del enzima y la H (8,17-19). Rifampicina: La R, es un antimicrobiano semisintético cuyo uso en terapeútica se inició en el año 1967 (8). Es un potente inhibidor del ARN mesajero (ARNm) y, por tanto, de la transcripción genética. Su efecto es bactericida sobre las células de M. tuberculosis metabolicamente activas y esterilizante sobre las bacterias en estado de latencia (que sólo presentan ocasionalmente actividad metabólica), tanto en los focos necróticos como en el interior de los macrófagos (8,20). Dicha actividad junto con la inclusión de la Z en los esquemas terapéuticos, ha permitido acortar el tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6 meses. El pico sérico a las 2-4 horas de una dosis oral de 600 mg es de 5-10 µg/ml. Entre sus efectos adversos se encuentran las molestias gastrointestinales y la afectación hepática (8-12,20). También desencadena reacciones de hipersensibilidad como fiebre, prurito, urticaria, vasculitis cutánea, eosinofilia, trombocitopenia, hemólisis o insuficiencia renal por nefritis intersticial (8-10). Tiñe la orina, el sudor y las lágrimas de color naranja. Una de sus principales características es su capacidad de inducción enzimática de los citocromos hepáticos por lo que puede disminuir las concentraciones séricas de 15 otros fármacos administrados concomitantemente como, entre otros, antirretrovirales inhibidores de la proteasa, anticonceptivos orales, anticoagulantes orales, corticoides y sulfonilurea (8-10,12,20). La resistencia a la R se adquiere, en la mayoría de los casos, mediante mutaciones en el gen que codifica la subunidad beta de la polimerasa de ARN (rpoB). La resistencia a R se asocia a la resistencia a la H, con lo que su detección constituye un marcador de multirresistencia (8,17-19). Pirazinamida: La Z es un derivado sintético de la nicotinamida con un potente efecto esterilizante sobre los bacilos tuberculosos latentes. Cuando se utiliza asociada a la R, permite acortar la duración del tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6 meses (8-10,20). Carece de actividad frente a las demás micobacterias, incluyendo otros componentes del complejo tuberculosis (8,20). La Z es un profármaco que es convertido a su forma activa, el ácido pirazinoico, por el enzima micobacteriana pirazinaminasa en el interior de los macrófagos donde se acumula intracelularmente. El ácido pirazinoico actúa sobre un enzima implicado en la síntesis de los ácidos micólicos (8). El CIM promedio de M. tuberculosis es de 20 µg/ml. A las 1-4 horas de una dosis oral de 1 g se obtienen picos séricos de alrededor de 45 µg/ml. Dentro de sus efectos adversos se encuentran la hiperuricemia, la hepatotoxicidad y las alteraciones gastrointestinales. Excepcionalmente puede aparecer exantema y fotosensibilidad (8,12,20). Las resistencias se deben fundamentalmente a mutaciones dispersas en el gen estructural pncA o en el promotor de la pirazinamidasa (8,17-19). 16 También existen cepas resistentes a la Z, sin mutaciones en el gen pncA, en las que esta resistencia se debe a otros mecanismos relacionados con la permeabilidad o el eflujo (9,22,23,24). Dos miembros del complejo tuberculoso, M. bovis spp. bovis y M. bovis-bacilo de Calmette-Guérin, son constitutivamente resistentes a la Z debido a una mutación puntual en el gen pncA (8). Etambutol: El E, etilen-diamino-dibutanol es un producto isómero dextrógiro derivado de la etilendiamina. Es activo frente a M. tuberculosis, con CIM de 1 a 5 µg/ml, aunque esta actividad requiere el crecimiento activo de las cepas susceptibles. El pico sérico a las 2-4 horas de una dosis oral de 1,5 g es de 5 µg/ml. Puede causar neuritis óptica, relacionada con la dosis y la duración del tratamiento (8,20). Tiene una actividad variable sobre las demás especies de micobacterias de crecimiento lento y su actividad es mucho menor en las especies de crecimiento rápido (8,20). El E inhibe de forma específica la biosíntesis de la pared micobacteriana (8). Así, la resistencia al E se asocia con cambios en una región genómica definida, el operón embCAB, que codifica arabinosil transferasa (EmbC, EmbA y EmbB en M. tuberculosis) relacionadas con la síntesis de componentes de la pared celular como el arabinogalactano y el lipoarabinomanano (8,17-19). La resistencia de alto nivel (>20 µg/ml) se debe a un proceso múltiple que incluye como primer paso una sobreexpresión de las proteinas Emb, para posteriormente añadirse mutaciones en la región EmbB o 17 cambios adicionales en los niveles de expresión. Entre el 47 y el 69% de las cepas de M. tuberculosis presentan mutaciones en la región EmbB (8,19). Estreptomicina La S es un antibiótico aminoglucósido que interfiere en la síntesis proteica bloqueando la traducción del ARNm (8). La CIM para las cepas sensibles oscila alrededor de 8 µg/ml a la 1-2 horas de una dosis intramuscular de 1g (8,20). Los efectos secundarios más importantes son las alteraciones vestibulares y con menos frecuencia las auditivas (8,20). En las micobacterias, el mecanismo conocido de resistencia a los aminoglucósidos es la alteración de la diana sobre la que actúan como consecuencia de mutaciones en los genes codificantes. Estas mutaciones afectan a los genes que codifican el 16S ARNr (rrs) y la proteina ribosomal S12 (rpsL). Las mutaciones que afectan al gen rpsL se dan en el 52-59% de las cepas resistentes y produce una resistencia de alto nivel (CIM > 500 µg/ml), mientras que las que afectan al gen rrs se observan en el 8-21% de las cepas y producen una resistencia de nivel intermedio (CIM 50- 500 µg/ml) (8,17-19). En aproximadamente un tercio de las cepas reistentes existe un nivel de resistencia bajo (CIM 25-50 µg/ml) y no se detectan alteraciones en los genes rpsL o rrs. En estas cepas se ha sugerido un mecanismo de permeabilidad para justificar la resistencia (8,17-19). Uno de los objetivos futuros del tratamiento de la TB es el estudio de la farmacogenómica, cuyo fin es conocer el comportamiento de los fármacos a través de información específica basada en secuencias de ADN genómico tanto del huésped como de la micobacteria. Dicha información puede revelar la sensibilidad de cada fármaco frente al agente específico, los niveles necesarios 18 en cada individuo y el riesgo de efectos adversos. El estudio de la farmacogenómica en tuberculosis ofrecerá en un futuro una terapia a medida de cada paciente y cada patógeno (8). 19 I.3. HEPATOTOXICIDAD SECUNDARIA A FÁRMACOS ANTITUBERCULOSOS. I.3.1. GENERALIDADES. El diagnóstico de hepatotoxicidad secundaria a fármacos antituberculosos (HFAT) es un diagnóstico de exclusión basado en elementos clínicos y analíticos (12). El término hepatitis aguda se refiere a la presencia de inflamación hepática asociada con necrosis celular (citolisis). Su expresión clínico-patológica es muy variada y comprende desde alteraciones asintomáticas y reversibles en los enzimas hepáticos hasta la necrosis hepática masiva e insuficiencia hepática fulminante (12). El patrón de lesión depende del tipo celular preferentemente afectado, y aunque el hepatocito es la célula diana habitual, cualquier célula hepática (del epitelio biliar, endoteliales, de Ito, etc.) puede resultar afectada de forma aislada o en combinación. La hepatotoxicidad secundaria a drogas (HSD) se refiere a la capacidad de una droga para producir cualquier tipo de efecto adverso sobre el hígado, independientemente de su gravedad, tipo de lesión hepática o mecanismo de producción (21). Según la OMS y del reciente consenso sobre HFAT de la American Thoracic Society (ATS), definimos HFAT de acuerdo con el nivel de transaminasas alcanzado en suero como elevaciones de alanina transaminasa (ALT) y/o aspartato transaminasa (AST) mayores de 3 veces del límite superior de la normalidad (LSN) [>120 unidades internacionales (UI)/ litro (L)] y/o elevaciones de la fosfatasa alcalina (FA) mayores de 2 veces el LSN o una elevación de la bilirrubina total mayor de 2 veces LSN si se asocia a cualquier elevación del nivel de ALT, AST o FA (12,22). La clasificación de gravedad de 26 algunas circunstancias, a que los hepatocitos sean más vulnerables en caso de una nueva exposición a agentes hepatotóxicos (12). Una de las formas de adaptación hepática más estudiada es la inducción de los enzimas hepáticos microsomales (citocromo P450), capaces de metabolizar la medicación que produce su inducción (25). Según el valor de las transaminasas séricas, se define como niveles de de AST y/o ALT menores de 3 veces el LN (120 UI/L) . Su pronóstico es favorable de forma que raramente evoluciona a inflamación, muerte celular u otros cambios histológicos significativos (12,22). Hepatitis aguda: se trata de una necrosis de hepatocitos de magnitud variable, generalmente con infiltrado inflamatorio. Es característico de la etiología tóxica el predominio centrilobulillar de las lesiones. Ocurre presumiblemente por la bioactivación de los compuestos en el citocromo P-450, al generarse intermediarios reactivos hepatotóxicos que se unen covalentemente a proteínas o al ADN celular (25). El cuadro clínico simula el de una hepatitis viral aguda con malestar general, astenia y anorexia, y la alteración biológica más frecuente es una marcada elevación de AST y ALT, con mínimos incrementos o normalidad de GGT y FA. Su diagnóstico se basa en los niveles séricos de transaminasas con síntomas o no de hepatitis (anorexia, naúseas, vómitos, dolor abdominal y fatiga). El pronóstico inmediato de la lesión hepatocelular aguda depende de la extensión de la necrosis parenquimatosa. La presentación con ictericia (que traduce una extensa necrosis hepatocitaria) conlleva una mortalidad global de 27 un 10-15%. Un elevado porcentaje de estos casos de fallecimiento se debe a una evolución fulminante de la reacción hepatotóxica (12,21,23-25). Esteatosis hepática no alcohólica: variedad grave de hepatotoxicidad cuyo mecanismo subyacente parece ser una lesión mitocondrial inducida por el fármaco o sus metabolitos. La presencia de microvesículas de grasa en los hepatocitos constituye el sustrato de lesión característica (12,21,23-25). Se trata de un síndrome de curso agudo y en ocasiones fulminante más frecuentemente relacionado la terapia antirretroviral, el ácido valproico, la amiodarona y el ácido acetilsalicílico. Clínicamente se caracteriza por síntomas inespecíficos (naúseas, astenia, anorexia y pérdida de peso). Los niveles de transaminasas se incrementan, aunque sin alcanzar la magnitud de los incrementos que ocurren en la lesión hepatocelular aguda. Aunque es posible un curso benigno con recuperación completa si se interrumpe la administración del medicamento es posible la progresión del daño a esteatohepatitis, caracterizada histiopatologicamente por inflamación hepática e infiltración grasa con el consecuente elevado riesgo de cirrosis (12,21,23-25). Hepatitis granulomatosa: la presencia de granulomas en el hígado es un hallazgo inespecífico que puede ser secundario a infecciones, enfermedades inflamatorias o neoplasias. Este tipo de lesión es típica de las reacciones inmunitarias por hipersensibilidad desencadenadas por fármacos como el alopurinol, la quinidina, las sulfamidas y la pirazinamida. El daño puede ocurrir de forma tardía o ante una exposición repetida tras un intervalo de tiempo. 28 Clínicamente puede existir fiebre, letargia, rash, adenopatías, hepatoesplenomegalia, eosinofilia, aumento de ALT y, en ocasiones, vasculitis (12,21,23-25). Colestasis: se caracteriza por una elevación asintomática generalmente reversible de la FA y bilirrubina séricas secundaria a un fallo del transporte de bilirrubina. Es típica su relación con el tratamiento estrogénico. No se caracteriza por inflamación en el parénquima hepático (12,21,23-25). I.3.2. HEPATOTOXICIDAD DURANTE EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN TUBERCULOSA LATENTE. I.3.2.1. PAUTAS CON ISONIACIDA EN MONOTERAPIA. La H es el FAT que más frecuentemente produce hepatotoxicidad. Su amplia utilización desde el año 1952 tanto en combinación para el tratamiento de la TB como en monoterapia en el TITL ha permitido un estudio muy preciso de su hepatotoxicidad intrínseca (9-12,28,32-36). A. INCIDENCIA. Según datos procedentes de programas de vigilancia farmacológica, se ha observado que aproximadamente un 1-36% de los pacientes que reciben H en monoterapia desarrollan un incremento de las transaminasas séricas durante el curso de tratamiento (12,28,32-40). Dichas elevaciones suelen ocurrir en las primeras 10 semanas de tratamiento, son habitualmente leves (incrementos inferiores a 5 veces los LSN), asintomáticas, no se acompañan de enfermedad hepática y recuperan sus cifras normales a pesar de continuar con la 29 medicación (12,28,33-40). La afectación hepática de mayor gravedad es mucho menos frecuente registrándose entre el 0,1 y 5% y con una mortalidad entre 0-90/100.000 personas-año (12,28,33-40). Aunque no está del todo claro, las diferencias existentes entre los diferentes estudios parecen explicarse por variaciones en el tamaño muestral, diferentes criterios de selección de pacientes, diferente monitorización clínicoanalítica, variaciones en la los puntos de corte definitorios de hepatotoxicidad y la posible existencia de potenciales factores de confusión causantes de hepatotoxicidad (12,33,36,40,41). Por ello, la determinación del riesgo de hepatotoxicidad secundaria a H debe ser relizada con cautela teniendo en cuenta las limitaciones y la metodología de cada estudio. El tipo de controles (clínicos y/o analíticos) que se realizan a los pacientes a tratamiento con H para el TILT ha sido uno de los factores más importantes en estas variaciones. Kopanoff et al en un estudio multicéntrico del Servicio de Salud Pública de EE.UU. realizado con 13.838 pacientes comunican una incidencia de hepatotoxicidad por H del 0,6% (40). En un estudio más reciente con 11.141 pacientes Nolan et al diagnostican de hepatitis por H al 0,1% de los sujetos (36). En ambos estudios no se llevaron a cabo controles analíticos sistemáticos de las pruebas de función hepática, que sólo se realizaban ante la presencia de algún síntoma o signo sugestivo de hepatitis. La realización de controles de forma rutinaria probablemente aumentaría el número de pacientes a los cuales se diagnostica de hepatotoxicidad (36,41). En el reciente estudio de Fountain et al en el que se incluyeron 3.377 pacientes a tratamiento con H se observó una incidencia de 30 hepatotoxicidad por H (incrementos superiores a 5 veces los valores de normales de referencia) de 5,6 por 1.000 pacientes encontrando como factores de riesgo de la misma la edad mayor de 49 años y la elevación de los niveles basales de AST (42). Observaron que la HFAT moderada-grave es frecuentemente asintomática, dato a favor de la necesidad de monitorización analítica de estos enfermos. No se registró ningún fallecimiento por esta causa (42). Sin embargo, en el estudio multicéntrico de Kopanoff et al la incidencia de hepatitis de curso fatal fue de 56/100.000 personas-año, estudio en el que no se realizó monitorización de las pruebas de función hepática en ausencia de datos clínicos sugestivos de hepatitis (40). B. PATOGENIA. La patogenia de la hepatotoxicidad por H no ha sido completamente establecida. Los mecanismos de hipersensibilidad son poco frecuentes (12,25,28). El mecanismo más común se debe a la acción de los metabolitos tóxicos derivados de su metabolismo (12,28). El conocimiento del metabolismo hepático de la H ha permitido estudiar la relación entre la actividad de los enzimas que intervienen en las reacciones metabólicas y la susceptibilidad de hepatotoxicidad de forma que el riesgo es mayor cuando coinciden una serie de factores ambientales (enfermedades asociadas o inducción enzimática) y/o genéticos, que favorecen el desequilibrio entre la generación de metabolitos hepatotóxicos en la fase I del metabolismo hepático del fármaco y la tasa de su posterior inactivación (12,21,28). La degradación de la H es fundamentalmente hepática principalmente por acetilación por los enzimas N-acetiltransferasa 2 (NAT2) (28) dando lugar a 31 acetilisoniacida que es metabolizada mediante una reacción de hidrólisis a monoacetilhidracina (MAH), pudiendo ser metabolizada de dos formas posibles: 1) por oxidación a través de los enzimas del grupo CYP2E1 del citocromo P-450, dando como resultado metabolitos hepatotóxicos (28) y 2) por una nueva acetilación a través del NAT2 formando diacetilhidracina, molécula no hepatotóxica (28) (Figura 1). La otra vía alternativa del metabolismo de la H también responsable de la generación de metabolitos intermediarios tóxicos es su hidrólisis directa a MAH (28) (Figura 1). Figura 1: Esquema representativo del metabolismo hepático de la H que incluye los enzimas responsables de las diferentes reacciones y las sustancias tanto hepatotóxicas como no hepatotóxicas derivadas de su metabolismo. Las hepatotoxinas derivadas de la oxidación de MAH por las enzimas del grupo CYP2E1 son inactivadas por glucuronación con el glutation a través de 32 las enzimas del grupo glutation S-transferasa (GST) (28). Por lo tanto, existen dos grupos enzimáticos que intervienen en las reacciones fase I del metabolismo hepático de la H (acetilación y oxidación), NAT2 y CYP2E1, y otro, el GST, responsable de la inactivación de hepatotoxinas derivadas del metabolismo hepático (reacción de glucuronación), cuya actividad va a influir en el riesgo de hepatotoxicidad según la acumulación de metabolitos tóxicos. Por ello, varios estudios se han centrado en el estudio del riesgo asociado a la actividad de dichos grupos enzimáticos (37-39, 43-50). Los grupos enzimáticos de mayor importancia se exponen a continuación: NAT2: grupo enzimático que determina un fenotipo acetilador lento, intermedio y rápido (37-39,43-50). En los acetiladores rápidos, más del 90% de la droga es excretada como acetilisoniacida, mientras que en los lentos sólo el 67% se excreta como acetilisoniacida siendo el resto de la droga excretada por la orina. La influencia de la velocidad de actetilación en la hepatotoxicidad por H es controvertida. En la mayoría de los estudios sobre el tema se incluyeron pacientes bajo regímenes de tratamiento que incluían varios FAT y la metodología del análisis fenotípico del estatus acetilador fue imprecisa (12,39), de modo que los acetiladores rápidos podrían haber sido identificados falsamente como lentos en el caso de la existencia de un retraso en la velocidad de absorción del fármaco según la extracción de las muestras de sangre en tiempos establecidos (12,46,50). Debido a la hepatotoxicidad de la MAH, se sugirió que la H era más nociva para los acetiladores rápidos que para los lentos, debido a la formación del metabolito tóxico con mayor rapidez. Sin embargo, los acetiladores rápidos degradaban la MAH con mayor rapidez en 33 un metabolito no tóxico, la diacetilhidracida, por lo que también se pensó que la hepatotoxicidad era mayor para los acetiladores lentos (50). En la literatura médica existen tanto, estudios en los que la susceptibilidad de hepatotoxicidad por H es mayor en los acetiladores lentos como, estudios en los que no existe ninguna correlación entre la misma y el estatus acetilador (12,50). Debido a la controversia del tema, la opinión de muchos autores es que el riesgo sería similar en los dos fenotipos, por lo que no es necesaria la determinación del estado acetilador (12,50). Se ha observado en estudios de genotipificación del NAT2 mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) que ciertos polimorfismos genéticos que determinan velocidades de acetilación lentas se relacionan con un mayor riesgo de HFAT (39,43-46). CYP2E1: grupo de enzimas microsomales, inducidos por el alcohol, expresados en el hígado y en otros órganos como el riñón, pulmón, mucosa nasal, cerebro y linfocitos (51). Dicho citocromo posee un papel muy importante en la detoxificación clínica dado que participa en el metabolismo de numerosas sustancias (hidrocarburos aromáticos y halogenados, anestésicos halogenados, alcoholes, nitrosaminas…) (51,52). En el caso del metabolismo de los FAT, los metabolitos hepatotóxicos generados por la actividad oxidativa de este grupo enzimático (Figura 1) podrían tener una relación con el riesgo de hepatotoxicidad. Se han descrito polimorfismos genéticos del CYP2E1 que determinarían variaciones en la actividad de este grupo enzimático (37,38,45,47), cuyo significado clínico no está claro debido a que no se ha demostrado una asociación convincente entre su actividad catalítica y sus genotipos (51,52). 34 GST: grupo de enzimas fase II muy importantes en la detoxificación de muchas sustancias hepatotóxicas. La presencia en homocigosis del alelo mutante nulo GSTM1 o GSTT1 se ha correlacionado con una pérdida de la actividad enzimática (53) y un mayor riesgo de toxicidad por FAT (48,49). C. FACTORES DE RIESGO. La frecuencia y gravedad de la hepatotoxicidad secundaria a H se ha relacionado con la edad, la ingesta de alcohol o de otras drogas, las alteraciones de las pruebas de función hepática, factores genéticos y la desnutrición (12). En algunos paises asiáticos donde la hepatitis B es endémica y son frecuentes la malnutrición, las enfermedades parasitarias o el alcoholismo y el uso de otras drogas, la incidencia de hepatitis por H es superior a la encontrada en los estudios realizados en otros paises (41). El factor de riesgo más estudiado ha sido la edad. En mayores de 35 años la incidencia de hepatotoxicidad por es entre 1,8 y 3,3 veces mayor que en los menores de esta edad (36,40). En el estudio de Kopanoff et al esta complicación fue muy rara en menores de 20 años pero casi alcanzó el 2% en los pacientes entre 50 y 64 años (40). El estudio de Fountain et al evidenció una elevación de AST más de cinco veces los valores normales específica según la edad que osciló entre el 0,44% en pacientes menores de 35 años y el 2,08% en pacientes mayores de 49 años (42), con diferencias estadísticamente significativas. Estos estudios también han evaluado la influencia del sexo en el riesgo de hepatotoxicidad secundaria a H encontrándose únicamente en el estudio de Nolan et al un mayor riesgo no significativo a favor de las mujeres (36). 35 Kopanoff et al observaron una mayor gravedad de la hepatotoxicidad en las mujeres, de modo que 7 de las 8 muertes que se produjeron del total de 13.838 pacientes procedían de uno de los centros (Baltimore) y 5 eran mujeres de raza negra (40). Años más tarde se publicó que en Baltimore la incidencia de cirrosis hepática era muy superior a la descrita en el resto del pais, lo que puede indicar una posible influencia de las enfermedades hepáticas previas sobre la mortalidad en la hepatitis por H. Otro estudio que revisa los casos fatales de hepatotoxicidad por H sugirió que las mujeres tienen más riesgo de muerte (54). Se ha descrito que los pacientes con ingesta excesiva de alcohol presentan un riesgo de hepatitis por H entre 4 y 17,3 veces superior (12,40). En dos estudios realizados en una cohorte de usuarios de drogas, de los cuales más de la mitad presentaban anticuerpos del virus de la hepatitis C (anti-VHC) positivos, el consumo elevado de etanol se asoció de forma independiente con la hepatotoxicidad por H (33,55-58). Esto se ha relacionado con una posible disminución del glutation hepático, lo que dificultaría la detoxificación de los metabolitos reactivos de la H junto con la acción inductora que el etanol realiza sobre el citocromo P-450 (21,26). El uso concomitante de otros fármacos como la R, Z, el paracetamol, los anticonvulsivantes, hipolipemiantes, anestésicos generales, el metotrexato, la sulafasalazina y los inhibidores del factor de necrosis tumoral también aumenta el riesgo de las complicaciones hepáticas de la H (12,36,59). Uno de los efectos menos estudiados y controvertido es la influencia de las hepatopatías crónicas previas (12,21). El término “hepatopatía crónica” en la literatura médica se ha englobado en un grupo heterogéneo, desde hepatitis 42 A. PAUTAS CON ISONIACIDA Y RIFAMPICINA. Un estudio realizado en Canadá comparó una cohorte de 591 pacientes que recibieron TITL con H y R intermitente dos veces a la semana con una cohorte histórica de 403 pacientes que recibieron H en monoterapia, observando un porcentaje de hepatotoxicidad similar en ambos grupos (69). En el metanálisis de Steele et al que incluye pacientes con enfermedad tuberculosa se estimó una prevalencia de hepatitis sintomática con la combinación de H y R del 2,55%, incidencia mayor que en los regimenes con dichas drogas por separado (34). B. PAUTAS CON RIFAMPICINA Y PIRAZINAMIDA. Los ensayos clínicos iniciales con pautas de R y Z durante dos meses realizados en pacientes VIH positivos, mostraron una eficacia e incidencia de hepatotoxicidad similares a la monoterapia con H (70,71). Posteriormente se describieron un importante número de casos de hepatotoxicidad grave, algunos de ellos con resultado fatal (72). Existen, al menos, 5 estudios en la población general que confirman estos hallazgos (32,73-76). La ATS y los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) revisaron estas recomendaciones (72), indicándose que las pautas combinadas de R y Z no deberían ser utilizadas en pacientes con enfermedades hepáticas preexistentes, abuso de alcohol o antecedentes de hepatotoxicidad por la H (72), y que su utilización obliga a la realización de controles clínicos y analíticos cada dos semanas. Los datos combinados de estos 5 trabajos incluyeron 1.311 pacientes, y aunque se llevaron a cabo en diferentes tipos de poblaciones, la incidencia de hepatotoxicidad moderada- 43 grave (elevaciones de las transaminasas por encima de 3-5 veces los LSN) es más o menos uniforme y se encontró en el 5,8%. La Z en monoterapia no ha sido utilizada para el TITL, por lo que no disponemos de datos que permitan conocer su frecuencia de hepatotoxicidad intrínseca. Sin embargo, disponemos de datos procedentes de trabajos en los que se utilizó en combinación con E y fluorquinolonas, fármacos que raramente producen hepatitis. En un estudio en el que se utilizó en combinación con E se observaron elevaciones de las transaminasas mayores de 4 veces los LSN en 7 de 12 (58%) pacientes (77). En otro trabajo en el que se utilizó con levofloxacino para el TITL tras exposición a TB MR, 3 de 17 (18%) pacientes presentaron elevaciones de transaminasas por encima de 4 veces los LSN (78). En otro trabajo en el que se utilizó en combinación con ofloxacino, 9 de 22 (41%) pacientes desarrollaron elevaciones de las transaminasas mayores de 4 veces los LSN (79). Estos datos apuntaron a la Z como causante de hepatotoxicidad. Aunque se desconocen múltiples aspectos acerca del mecanismo de producción de hepatotoxicidad se cree que el daño hepático puede ser producido tanto por un mecanismo de idiosincrasia metabólica dosis dependiente como por una reacción de hipersensibilidad (12). La Z es un derivado del ácido nicotínico, y su estructura molecular es similar a la H. La molécula de Z es metabolizada a ácido 5-hidroxi-pirazinoico por los complejos enzimáticos xantino-oxidasa, aldehido-oxidasa y xantinodeshidrogenasa (8,12). La vida media (t1/2) de la pirazinamida es mayor que la de las de la H y R, siendo aproximadamente de 10 horas, que puede incrementarse a 15 horas en pacientes con enfermedad hepática (8,12). Varias 44 décadas atrás se observó que dosis diarias de 40-50 mg/Kg de Z producía hepatotoxicidad en la mayor parte de los pacientes de forma dosis dependiente (12). En un estudio realizado en roedores de experimentación se comprobó que la Z altera los niveles de nicotinamida-acetil-deshidrogenasa en el hígado produciendo radicales libres, tóxicos para el hígado (80). Debido a la similutud de la estructura molecular de la H y la Z es posible que esta última pueda producir daño hepático por el mismo mecanismo que la H. Se ha visto una mayor incidencia y gravedad de hepatotoxicidad en pacientes con R y Z para el TITL con historia previa de hepatotoxicidad secundaria a H (72). Se ha documentado que la Z puede producir hepatotoxicidad mediada por un mecanismo de hipersensibilidad acompañada de eosinofilia o hepatitis granulomatosa (8,12). También se ha descrito mayor hepatotoxicidad en combinación con alopurinol fármaco que inhibe los enzimas xantino-oxidasa, lo cual da lugar a una disminución del aclaramiento de la Z y un acúmulo de sus metabolitos (12). En resumen, la capacidad de la Z para aumentar la frecuencia y gravedad de la hepatotoxicidad demostrada por todos estos estudios y a pesar de la disparidad con los estudios realizados en pacientes VIH en los cuales los índices de hepatotoxicidad con esta pauta parecen ser menores (81,82), las guías actúales recomiendan no utilizar la combinación HZ en general (72). 45 I.3.3. HEPATOTOXICIDAD DURANTE EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD TUBERCULOSA CON ISONIACIDA, RIFAMPICINA Y PIRAZINAMIDA. El estudio de la hepatotoxicidad secundaria a los regimenes de tratamiento de la enfermedad tuberculosa que contienen al menos H, R y Z en combinación es difícil ya que los tres fármacos poseen capacidad hepatotóxica intrínseca. La probabilidad de hepatotoxicidad no solamente es el resultado de la suma de la probabilidad individual de cada agente particular, sino que también hemos de considerar que las interacciones farmacológicas entre ellos pueden aumentar el riesgo de hepatotoxicidad. 1.3.3.1. INCIDENCIA. La incidencia de hepatotoxicidad y sus diferentes formas clínicas en pacientes que reciben tratamiento con H, R y Z han variado considerablemente en la literatura médica, oscilando entre 5% y 33% (12,28,35,50). Aunque no está del todo claro, estas diferencias podrían explicarse por los distintos criterios utilizados para la definición de la hepatotoxicidad, muchas veces ante elevaciones leves en pacientes asintomáticos, las características y factores de riesgo de las poblaciones estudiadas, la zona geográfica, la asociación con otros fármacos hepatotóxicos o el tipo de monitorización y controles realizados a los pacientes durante su seguimiento (12,28,35,50). Esto dificulta la comparación entre los diferentes estudios. En el metanálisis de Steele et al que incluye estudios con varios regimenes de tratamiento se observa que la combinación de H y R aumenta la 46 incidencia de hepatotoxicidad en adultos del 1,6% en pautas con H en monoterapia al 2,55% (34). La contribución de la Z al desarrollo de hepatotoxicidad es controvertida. Algunos trabajos no muestran prácticamente ningún aumento, sin embargo, en otros estudios la Z contribuye significativamente a aumentar tanto la incidencia como la gravedad de la hepatotoxicidad (12). Las diferencias en los datos procedentes de la literatura probablemente se deben a las diferentes dosis y criterios de selección utilizados de los pacientes seguidos (12). 1.3.3.2. PATOGENIA. La patogenia de la hepatotoxicidad secundaria a la combinación de los tres fármacos no ha sido claramente establecida. La R raramente es hepatotóxica per se, pero puede aumentar la hepatotoxicidad secundaria a la H. Sin embargo, tanto la H como la Z son claramente hepatotóxicas. Una de las cuestiones más difícil de resolver cuando la hepatotoxicidad aparece es saber si se debe a la H, a la Z o a su combinación. Durand et al sugieren la existencia de dos patrones de hepatotoxicidad en los pacientes que reciben la combinación de los tres fármacos (82). El primero se caracteriza por una elevación de las transaminasas séricas, que ocurre al inicio del tratamiento (normalmente dentro de los primeros 15 días). Dicho patrón parece estar relacionado con la acción inductora de la R de la toxicidad hepática de la H, patrón también observado en pacientes a tratamiento con H y R en combinación. La hepatitis tóxica en estos casos es de buen pronóstico, incluso ante la presencia de hepatitis fulminante. El segundo patrón de hepatotoxicidad se caracteriza por un aumento de las transaminasas 47 séricas que ocurre un mes después de comenzar el tratamiento. El pronóstico de estos pacientes no es tan favorable (82). Se ha visto que las tres drogas pueden dar lugar a un incremento de la producción de oxidantes tanto por un aumento de la peroxidación lipídica (83) como por alteración de los niveles de nicotinamida acetil-deshidrogenasa (84). Los metabolitos tóxicos derivados del metabolismo de la H, cuya producción aumenta con la R, son los posibles causantes de hepatotoxicidad. Sin embargo, no se ha observado una correlación entre los niveles séricos de los fármacos y el daño hepático (85). Por lo tanto se trata de una hepatotoxicidad no predecible (idiosincrasia metabólica). Otro posible mecanismo es la hipersensibilidad farmacológica, especialmente en pacientes en los que la hepatitis se acompaña de rash cutáneo, fiebre, artralgias y eosinofilia. Como se ha desarrollado anteriormente dicha toxicidad tampoco es predecible (hepatitis alérgica medicamentosa) (8,12,28). 1.3.3.3. FACTORES DE RIESGO. Es difícil establecer conclusiones definitivas sobre los factores de riesgo de HFAT debido a que las diferencias metodológicas entre los diferentes estudios no permite, en muchos casos, su comparación. A continuación se realiza un análisis de los factores de riesgo estudiados: Edad mayor de 35 años: varios estudios sugieren que la edad incrementa el riesgo de HFAT. Sin embargo, dado que en varios de estos estudios no existe significación estadística, la edad no se considera un factor 48 de riesgo limitante a la hora de comenzar el tratamiento que incluya las tres drogas (10,12,28,46,47,50,86-88). Se ha visto que la frecuencia de hepatotoxicidad varía entre el 22-33% en mayores de 35 años comparado con el 8-17% en los individuos más jóvenes (28,29). Sexo: existen varios trabajos que ponen de manifiesto un aumento del riesgo de HFAT en las mujeres, aunque al igual que la edad no se considera un factor limitante del tratamiento (10,12,28,87,88). Alcohol: en un número importante de trabajos se ha constatado que la ingesta excesiva de alcohol es un factor de riesgo de HFAT (12,28,33- 35,47,56,82,86-88). Existen dos mecanismos patogénicos posibles. En primer lugar, la deplección del glutation propia de los pacientes alcohólicos implicaría una menor capacidad detoxificadora de los metabolitos de la H. En segundo lugar, la capacidad inductora del alcohol del citocromo P-450 daría lugar a un aumento de la formación de hepatotoxinas derivadas del metabolismo de la H (Figura 1). Además, la R aumenta la inducción de los enzimas pertenecientes al citocromo P-450. Este desequilibrio entre la producción de tóxicos y su degradación inducida por el alcohol explicaría la predisposición de los pacientes alcohólicos a la HFAT (12,28,82,88). Hepatitis B: existen varios trabajos que evalúan el riesgo de HFAT en individuos con hepatitis B. Dichos estudios no son directamente comparables ya que existen variaciones importantes en el diseño y factores que confieren confusión (89-92). Wong et al, tras una ambiciosa investigación en el que excluyen a pacientes con hepatopatía de otro tipo, observaron que el 16% de los pacientes 49 con positividad para el HBsAg desarrollaron hepatotoxicidad comparado con el 4,7% en pacientes sin hepatitis B (90). En otro estudio retrospectivo de casos y controles realizado en Corea, se observó una tendencia no significativa a desarrollar elevaciones de las transaminasas mayores de 5 veces los LSN en los casos con HBsAg positivos comparado con los controles (8% vs. 2%; p= 0,05) (91). Sin embargo, en el trabajo de Hwang et al el índice de HFAT en individuos con HBsAg fue similar al del gupo de pacientes sanos (29% vs. 26%) (91). Todos estos trabajos no estratificaron a los pacientes según la existencia de replicación activa del virus con HBeAg o ADN viral. En otro estudio, se observaron diferencias en la frecuencia de HFAT en el grupo de pacientes con VHB (59% vs. 24%), pero la presencia del HBeAg no fue significativamente más frecuente en dicho grupo (92) Aunque los datos de los que disponemos son limitados, indican que la infección por VHB puede ser un factor de riesgo de HFAT (89-92). Hepatitis C: la relación entre el VHC y HFAT ha sido mucho menos estudiada. Ungo et al publicaron los resultados de un estudio en el que se incluyeron 134 pacientes, de los que 40 presentaban VHC (anti-VHC positivos y ARN-VHC positivos). Observaron que el riesgo de HFAT fue 5 veces superior ante la presencia de infección crónica por VHC (93). En el estudio de Kwon et al, recientemente publicado, en el que se incluyeron 151 pacientes, de los que 54 presentaban anti-VHC positivo, se encontró un índice de HFAT (transaminasas por encima de 3 veces los LSN) del 41% en comparación con el 20% del grupo control (p= 0,005) (94). 50 Ambos estudios ponen de manifiesto que la infección por VHC es un factor de riesgo de HFAT, pero no limitante a la hora de instaurar el tratamiento con las 3 drogas siempre y cuando se realice una estricta monitorización de la función hepática (93,94). Fenotipo acetilador: la relación entre el riesgo de HFAT y el fenotipo acetilador es un aspecto muy discutido desde hace décadas. Mitchel et al formularon la hipótesis de que los acetiladores rápidos podrían ser más vulnerables debido a que la producción de hepatotoxinas sería mayor dada la mayor actividad del NAT2 (50). Sin embargo, el depósito de acetil-hidrazina (Figura 1) también depende de una nueva acetilación por el mismo NAT2 para formar el metabolito no hepatotóxico diacetilhidrazina (12,18,50,88). Así pues varios estudios han determinado que los acetiladores lentos son más vulnerables a HFAT que los rápidos (39,45,46). Sin embargo, no siempre se ha evidenciado un aumento del riesgo de HFAT en acetiladores lentos (38). Es difícil interpretar los resultados debido a que casi todos los estudios pueden estar influenciados por muchos factores de confusión como la edad, el sexo, la dieta, el consumo de alcohol, la hepatopatía, comorbilidad y toma de otros fármacos (12,50). Además, la existencia de diferentes métodos de determinación del fenotipo así como de puntos de corte, hace que la comparación entre los diferentes estudios sea complicada (12,50). Una posible solución a estos problemas sería determinar el estatus acetilador mediante genotipificación del NAT2. Factores genéticos: varios estudios han relacionado la susceptibilidad de HFAT con diferentes polimorfismos genéticos de las enzimas NAT2, CYP2E1, GST y Manganeso superoxido reductasa (MnSOD), polimorfismos 51 que determinan un fenotipo metabólico diferente, lo cual se relaciona directamente con el riesgo de hepatotoxicidad (12,38,39,43-50). Sin embargo, el mecanismo por el cual se produce la toxicidad y el modo en que estos factores influyen en su desarrollo es poco conocido. La ausencia o presencia de ciertos alelos del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) clase II se ha relacionado con un mayor riesgo inmunogenético de daño hepático secundario a FAT. Sharma et al estudiaron los HLA clase II en una cohorte de población india a tratamiento con FAT encontrando un aumento del riesgo de HFAT ante la ausencia de HLADQA1*0102 y la presencia de HLA-DQB1*0201 (86). Por lo tanto, parecen existir factores genéticos que podrían modular el riesgo de HFAT por lo que su estudio constituye una aproximación de la aplicación de la farmacogenética y farmacogenómica en la prevención futura de HFAT (50). Por este motivo, el último consenso oficial de la ATS sobre HFAT señala el estudio de los factores genéticos implicados en HFAT como un objetivo prioritario (12). I.3.4. MANIFESTACIONES CLÍNICAS, DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO. Al igual que ocurre con otros agentes hepatotóxicos, el daño hepático inducido los FAT no posee características clínicas, analíticas o anatomopatológicas específicas que permitan un diagnóstico de certeza, de tal modo que, dicho proceso se basa en la evidencia circunstancial de la exposición a la hepatotoxina potencial y la exclusión de otras causas alternativas de daño hepático (21-25,28). Antes de hacer el diagnóstico de hepatitis inducida por un determinado fármaco, es obligado efectuar una 58 concomitante otros fármacos o con enfermedades crónicas como la diabetes o insuficiencia renal crónica, sí es aconsejable la realización de determinaciones basales de las pruebas de función hepática y de controles analíticos periódicos (12). La realización sistemática de controles bioquímicos en pacientes que reciben H puede hacer que se sobrestime la verdadera incidencia de la hepatotoxicidad al incluir pacientes asintomáticos con elevaciones transitorias de las transaminasas (36). Hasta el 20% de los pacientes que reciben tratamiento con H experimentan elevaciones transitorias y asintomáticas de las transaminasas (12). Por otra parte, el diagnóstico precoz de la hepatotoxicidad inducida por fármacos, sobre todo en pacientes con patología hepática subyacente, podría evitar la aparición de los casos más graves o fatales. Sin embargo, la conveniencia de realizar controles analíticos rutinarios sigue estando muy controvertida en la actualidad. Sí existe consenso en que este tipo de seguimiento con controles analíticos seriados no debe nunca sustituir a los controles clínicos que deben ser realizados siempre por personal experimentado y como mínimo mensualmente. No se han definido claramente cuales son los valores basales límites de las transaminasas que se consideran seguros para iniciar el TITL con H. En varios estudios revisados la H se desaconsejaba cuando la ALT o AST superaban 3 veces los LSN (55,100,101). Sin embargo, en el tratamiento de la enfermedad tuberculosa, según el último documento oficial de la ATS sobre HFAT, ante la presencia de transaminasas basales superiores a 3 veces los LSN se debe evitar la administración de Z y optar por el regimen alternativo de H en combinación con R durante 9 meses (12). Dicho documento también 59 recomienda disponer, antes de comenzar el tratamiento, de los niveles basales de transaminasas séricas, bilirrubina, FA, creatinina, recuento total de plaquetas y parámetros de coagulación sanguinea. Al igual que para el TITL no existe consenso acerca de la conveniencia de realizar controles analíticos de las pruebas de función hepática en los pacientes sin factores de riesgo de HFAT. En pacientes con hepatopatía previa conocida, niveles de transaminasas basales elevados, consumidores excesivos de alcohol o de otras drogas hepatotóxicas, VIH positivos y con antecedentes de HFAT previa, existe acuerdo sobre la conveniencia de realizar una monitorización analítica, además de la clínica, que incluya parámetros de función hepática (12). 60 I.4. POLIMORFISMOS GENÉTICOS: GENERALIDADES. El ADN es una estructura variable, tanto entre individuos de especies diferentes como entre individuos de una misma especie. Esta diversidad es responsable de fenómenos biológicos de tanta trascendencia como la evolución de las especies y, dentro de cada especie, de la presencia de características diferenciales en cada individuo. La diversidad o variabilidad genética se debe a variaciones en la secuencia del genoma; por tanto, en un sentido amplio el concepto de diversidad se hace sinónimo de polimorfismo (en su significado literal, “muchas formas”) (102). Hoy en día se define polimorfismo como la existencia simultánea en una población de genomas con distintos alelos para un locus determinado (102). Los alelos son variaciones de la secuencia de ADN presente en un locus o posición definida en un cromosoma; consecuentemente, en una célula diploide cada locus autonómico está ocupado por dos alelos, uno de origen paterno y otro materno, situados en sendos cromosomas homólogos. El grado de polimorfismo de una población viene determinado por el número de alelos distintos existentes para un locus concreto y se refleja en el grado de heterocigosis, o proporción de individuos heterocigóticos que forman parte de una población (102). La distinción entre el uso de los términos mutación y polimorfismo no es clara ni unánime, pero en general se asocia el primero con situaciones excepcionales, en especial patológicas, mientras que se habla de polimorfismo cuando la presencia de la variación genética es común en la población y, por tanto, estable y nada o poco perjudicial. Por convenio, se dice que un locus es polimórfico cuando la variabilidad afecta a más del 1% de la población. El 61 polimorfismo puede tener distinta trascendencia desde el punto de vista funcional, dependiendo de si afecta a regiones codificantes, reguladoras o no codificantes del genoma y también del modo como afecte al mensaje genético de estas últimas. En los polimorfismos genéticos localizados en una secuencia codificante puede existir una alteración del fenotipo cuando la secuencia del gen modifica la secuencia de la proteína. La alteración puede modificar las características bioquímicas, morfológicas e incluso funcionales de la célula, pudiendo llegar a originar procesos patológicos, en función de la gravedad de dicho efecto fenotípico. Así pues se pueden distinguir variaciones fenotípicas que no influyen en la susceptibilidad a enfermedades, variaciones fenotípicas que influyen de forma leve o mínima en la predisposición a ciertos procesos patológicos y variaciones fenotípicas que desempeñan un papel importante en la aparición de una patología (102). El estudio de los polimorfismos que tienen una contribución mínima o leve a la susceptibilidad frente a ciertos procesos patológicos posee interés médico, especialmente en la prevención de enfermedades. Los polimorfismos que desempeñan un papel directo en la aparición de un fenotipo patológico son, evidentemente, aplicables para el diagnóstico, así como para el estudio de los mecanismos moleculares de enfermedad (102). I.5. POLIMORFISMOS DEL N-ACETIL TRANSFERASA 2. I.5.1. INTRODUCCIÓN. La observación de diferentes velocidades de acetilación tanto de la H como de otros fármacos como la sulfametazina puso de manifiesto la existencia de varios fenotipos acetiladores. Según la velocidad de acetilación de dichas 62 drogas se clasificó a los individuos en acetiladores rápidos, intermedios y lentos (103). Posteriormente, se observó que el fenotipo acetilador estaba determinado genéticamente, y que existían diferencias interétnicas, de modo que aproximadamente la mitad de los pacientes caucásicos eliminaban lentamente la H debido a reducción de la tasa de acetilación en el hígado (104- 106). Posteriores estudios in vivo e in vitro concluyeron que la metabolización de una amplia variedad de arilaminas, hidracinas y xenobióticos se encontraba afectada por el mismo defecto genético (107). I.5.2. ENZIMAS N-ACETILTRANSFERASA. La reacción enzimática de N-acetilación es llevada a cabo por la enzima citosólica Arilamina N-acetiltransfera (NAT; EC 2.3.1.5) mediante la transferencia de acetato procedente del Acetil Coenzima A a aminas aromáticas e hidracinas (107) Los sustratos de la reacción de N-acetilación pueden ser polimórficos, como la H, cuando la velocidad de acetilación varía según el genotipo y monomórficos, como el ácido P-aminosalicílico, cuando no existen variaciones en la velocidad de acetilación. Este hecho tiene su base bioquímica en la existencia de dos tipos de N-acetiltransferasas; la que metaboliza sustratos de modo polimórfico denominada NAT2 y aquella que metaboliza sustratos de modo monomórfico denominada NAT1 (107). Los polimorfismos del NAT2 son muy importantes en los campos de la farmacología clínica y la toxicología debido a su importante papel en la activación y/o desactivación de una gran variedad de aminas aromáticas y fármacos hidracinas muy utilizadas en la práctica clínica (107-110) que se han 63 relacionado con la génesis de tumores en roedores (109). Existen trabajos que han localizado mutaciones dentro de la región catalítica de la enzima que es responsable de la transferencia de acetato entre el AcetilCoA al sustrato metabolizado (110). La acetilación no sólo es la vía de detoxificación de ciertos compuestos potencialmente cancerígenos, sino que en ocasiones, determinadas sustancias procancerígenas pueden ser activadas mediante O- acetilación produciéndose acetoxiarilaminas. Éstas se rompen espontáneamente originando iones aril-nitrenios, altamente reactivos y responsables de mutaciones en el ADN (108-111). También se han encontrado numerosas variantes alélicas del NAT1 algunas de las cuales dan lugar a un fenotipo NAT1 lento (106). La actividad del NAT2 se desarrolla fundamentalmente en el hígado y tracto gastrointestinal, sin embargo la actividad del NAT1 se ha detectado en muchos tejidos extrahepáticos. Dado que tanto el NAT1 como el NAT2 catalizan la activación metabólica (vía O-acetilación) de carcinógenos, sus polimorfismos poseen una influencia en el riesgo de cáncer relacionado con la exposición a estos carcinógenos (111-113). La activación metabólica de la mayoría de las aminas heterocíclicas carcinógenas en humanos se debe más a la acción catalítica del NAT2 que del NAT1, aunque se ha de tener en cuenta que la expresión tejido-específica es también de importancia para realizar una correcta evaluación de la influencia de los polimorfismos del NAT1 y del NAT2 en el riesgo de cáncer (114-115). 64 I.5.3. GENOTIPO ACETILADOR. Los genes que codifican las enzimas NAT1 y NAT2 están localizados en el cromosoma 8p22 (114,115). Existen 3 genes distintos de N-acetiltransferasas en humanos: NAT1, NAT2 Y NATP (108,114,115). El NATP es un pseudogen que contiene mutaciones que impiden a su ARN mensajero traducirse en una proteína funcional. En el año 1995 se publicó un consenso sobre la nomenclatura del gen NAT (116) y, posteriormente en el año 1998 se creó el Comité Internacional de Nomenclatura del NAT con el fin de ir actualizando la nomenclatura de sus variantes génicas. Según la última actualización de mayo del 2007 (web-site accesible por Internet en la dirección www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.htlm) se han identificado 36 variantes alélicas del NAT2, cada una de las cuales representa una combinación de 1 a 4 sustituciones de nucleótidos (Tabla 3). Algunas variantes alélicas presentan sustituciones de nucleótidos que son muy poco frecuentes (frecuencias entre el 0,03 y 0,5%) por lo que no constituyen un polimorfismo genético (frecuencia mayor al 1% según su definición). Dentro de las sustituciones de nucleótidos que se han identificado en el exon codificante del NAT2, cuatro (T111C, C282T, C481T y G590A) son silentes, es decir, no determinan ningún cambio en la proteina. El alelo NAT2*4 no presenta ninguna de estas sustituciones de nucleótidos por lo que se define como normal o “wild-type” y se corresponde a un fenotipo acetilador rápido. El hecho de que sea el alelo “wild-type” no quiere decir que sea el más frecuente. De hecho, su frecuencia varía en función de la población estudiada. Los alelos 65 del NAT2 que contienen los cambios de nucleótidos G191A, T341C, A434C, G590A y/o G857A se asocian con un fenotipo acetilador lento (117). La frecuencia de estas sustituciones en las diferentes poblaciones es variable por lo que existen diferencias interétnicas en la capacidad acetiladora (118,119). Los alelos más frecuentes responsables de los fenotipos acetiladores lentos son el *5, *6 y *7. El alelo *5 contiene siempre el cambio T341C. Se subdivide en 10 variantes (A, B, C, D, E, F, G, H y I) según su combinación con otras sustituciones de nucleótidos (Tabla 3). La sustitución silente C481T se puede observar en los alelos *5A, *5B, *5F, *5G, *5H y *5I. El alelo *6 se caracteriza por presentar la sustitución G590A, y según su combinación con otras sustituciones de nucleótidos se subdivide en 5 variantes (A, B, C, D y E) (Tabla 3). El alelo *7 presenta la sustitución G857A en sus dos variantes conocidas (A y B) (Tabla 3). A pesar de tener en cuenta las diferencias interétnicas, la mayoría de los fenotipos acetiladores lentos se corresponden con las variantes alélicas *5B, *6A y *7B. Por este motivo, varias investigaciones consideran suficiente el estudio de las sustituciones de nucleótidos C481T, G590A y G857A correspondientes a la mayor parte de las variantes alélicas *5, *6 y *7 (39,45,46,116,117,118). De hecho, en un principio, el alelo “wild-type” fue definido como la ausencia de las sustituciones C481T, G590A y G857A. Sin embargo, tal y como apuntan Cascorbi et al si sólo se estudian dichas variantes varios alelos lentos pueden ser incorrectamente clasificados como “wild-type” (119). 66 Tabla 3: Alelos NAT2. Alelos Cambio de nucleótido(s) Cambio de aminoácido(s) Referencias NAT2*4 Ninguno Ninguno 106,120-124 NAT2*5A T341C C481T I114T 118,121,124,125 NAT2*5B T341C C481T A803G I114T K268R 118,120,126 NAT2*5C T341C A803G I114T K268R 118,119,124,125 NAT2*5D T341C I114T 127-130 NAT2*5E T341C G590A I114T R197Q 127 NAT2*5F T341C C481T C759T A803G I114T K268R 131 NAT2*5G C282T T341C C481T A803G I114T K268R 132 NAT2*5H T341C C481T A803G 859Del I114T K268R S287 Frameshift 132 NAT2*5I T341C A411T C481T A803G I114T L137F K268R 133 NAT2*5J C282T T341C G590A I114T R197Q 134 NAT2*6A C282T G590A R197Q 106, 118-121 NAT2*6B G590A R197Q 118,128,129 NAT2*6C C282T G590A A803G R197Q K268R 128,129 NAT2*6D T111C C282T G590A R197Q 130 NAT2*6E C481T R197Q 135 67 G590A NAT2*7A G857A G286E 118,121,123 NAT2*7B C282T G857A G286E 106,124 NAT2*10 G499A E167K 136 NAT2*11A C481T Ninguno 136,137 NAT2*11B C481T 859Del S287 Frameshift 132 NAT2*12A A803G K268R 118,138 NAT2*12B C282T A803G K268R 118, 129 NAT2*12C C481T A803G K268R 125,128,129 NAT2*12D G364A A803G D122N K268R 133 NAT2*13 C282T Ninguno 118,119,127,139 NAT2*14A G191A R64Q 125,140 NAT2*14B G191A C282T R64Q 140,141 NAT2*14C G191A T341C C481T A803G R64Q I114T K268R 127-129 NAT2*14D G191A C282T G590A R64Q R197Q 127,129 NAT2*14E G191A A803G R64Q K268R 127 NAT2*14F G191A T341C A803G R64Q I114T K268R 129 NAT2*14G G191A C282T A803G R64Q K268R 130 NAT2*17 A434C Q145P 142 NAT2*18 A845C K282T 142 NAT2*19 C190T R64W 143-145 ( Revisado en Mayo de 2007, adaptado de www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.htlm) 74 En lo referente a otras enfermedades diferentes del cáncer, también se han realizado varios estudios que relacionan el genotipo NAT2 con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (162), enfermedad de Parkinson (163) y artritis reumatoide (164) no encontrándose asociaciones u obteniendo resultados no confirmados con posterioridad. Además, en la mayoría de los casos las muestras de población utilizadas son muy pequeñas, impidiendo este hecho el obtener conclusiones definitivas. Por otra parte, también se han de tener en cuenta los diferentes tratamientos de las enfermedades estudiadas ya que podrían interferir con el fenotipo, es decir, que un determinado fenotipo entre los pacientes puede ser causa o efecto de la enfermedad. El lupus eritomatoso inducido por fármacos (fundamentalmente por procainamida e hidralazina), sí que se ha relacionado claramente con metabolizadores lentos (165). Una posible explicación sería que los acetiladores metabolizadores lentos tienen un mayor porcentaje de fármaco no acetilado, que sigue rutas metabólicas alternativas, interaccionando con macromoléculas celulares, dando lugar a sustancias que son reconocidas como autoantígenos, desencadenando una respuesta inmunitaria (165). I.5.7. POLIMORFISMO NAT2 Y RIESGO DE HEPATOTOXICIDAD POR FÁRMACOS ANTITUBERCULOSOS. El acúmulo de metabolitos tóxicos derivados del metabolismo hepático de algunos fármacos está influenciado por el fenotipo metabólico de las principales enzimas implicadas en su metabolismo. Así pues, el riesgo de hepatitis tóxica secundaria a aquellos fármacos en cuya detoxificación hepática se encuentran implicadas las enzimas NAT2 podría ser mayor en los 75 acetiladores lentos. A pesar de que son varios los fármacos en cuyo metabolismo intervienen las enzimas NAT2, solamente se ha documentado un mayor riesgo de hepatotoxicidad en individuos con genotipos NAT2 acetiladores lentos en el caso de los FAT. Las concentraciones finales de los FAT dependen de la actividad de los enzimas implicados en su metabolismo. Por lo tanto, ciertos polimorfismos de los genes que codifican dichas enzimas pueden influir en su disposición. Tal y como se observa en la figura 1, la H es metabolizada a acetil-isoniacida a través de las enzimas NAT2 del hígado. Posteriormente, la acetil-isoniacida es hidrolizada a MAH, molécula que puede ser metabolizada a través de una nueva acetilación por las enzimas NAT2 dando lugar a metabolitos no hepatotóxicos, o por oxidación por las enzimas del CYP2E1, reacción que da lugar a metabolitos hepatotóxicos (24,28,46,50,88). Tal y como se detalló anteriormente, en los acetiladores rápidos la mayor parte de la H se degrada a acetil-isoniacida, mientras que en los lentos más de un tercio del fármaco es excretado por la orina sin modificaciones en su estructura. Además se ha observado que la relación entre acetil-isoniacida e isoniacida (A/H ratio) plasmática a las 2 horas de recibir 300 mg de H, es menor en los genotipos NAT2 lentos lo que sugiere que dichos genotipos influyen en la capacidad acetiladora de la H por el NAT2 (50). La influencia de la velocidad de acetilación en la hepatotoxicidad por H es controvertida, de modo que en la literatura médica existen tanto estudios en los que se observa una aumento del riesgo de HFAT en los acetiladores lentos (12,39,43-46,50) como estudios en los que no se demuestra ninguna correlación entre la misma y el estatus acetilador (12,37,38,49,50). Cho et al 76 determinaron los polimorfismos del NAT2 determinantes de un fenotipo acetilador lento en una cohorte de 132 pacientes coreanos a tratamiento con combinaciones de H, R y Z. Un total de 18 pacientes desarrollaron HFAT, definida como elevaciones de los niveles de AST mayores de 2 veces los LSN. La presencia de genotipos del NAT2 lentos fue más frecuente en los casos que desarrollaron HFAT que en los controles (p= 0,005) (45). Huang et al realizaron un estudio en población china en el que se determinó la influencia de los polimorfismos genéticos del NAT2, *5, *6 y *7 (desaparición de las dianas de restricción de KpnI, TaqI y BamHI ) en homocigosis y heterocigosis entre ellos y el alelo *4 “wild-type”, en el riesgo de HFAT. Observaron que de 33 pacientes que desarrollaron HFAT, catorce (42,4%) poseían uno de estos genotipos (46). Dichos resultados se correlacionaron con los obtenidos en un segundo trabajo también en población china (47). Dos estudios llevados a cabo en población japonesa en los que se determinó de forma prospectiva la relación entre los genotipos del NAT2 resultado de la combinación de los alelos anteriormente citados y el desarrollo de HFAT corroboran los mismos hallazgos (39,44). Recientemente, se ha observado también una relación significativa entre dichos polimorfismos y el riesgo de HFAT en población procedente de Turquía (43). Estos hallazgos sustentan la hipótesis de que la N-acetilación juega un papel importante en la patogénesis de HFAT. Hemos de reseñar que la posible influencia de dichos polimorfismos en el riesgo de HFAT se ha estudiado predominantemente en poblaciones asiáticas (coreanos, chinos, japoneses e indios) de modo que no existen estudios genéticos de riesgo de HFAT en caucásicos. Además, hay trabajos en los que no se ha evidenciado ningún incremento del riesgo de HFAT en acetiladores lentos (37,38,49). Los 77 diferentes resultados obtenidos podrían tener explicación en la heterogeneidad racial de la población estudiada, el pequeño tamaño muestral, las variaciones en la distribución genotípica del NAT2 entre las diferentes poblaciones y en las diferencias en la dosificación de H entre los diferentes estudios así como la presencia de tratamiento concomitante con otros fármacos (50). Se precisan estudios en las diferentes poblaciones que aclaren la influencia de las variantes alélicas del NAT2 en el riesgo de HFAT. No existe ningún estudio de estas características en nuestra población caucásica. 78 I.6. POLIMORFISMOS DE LA GLUTATION S-TRANSFERASA. I.6.1. INTRODUCCIÓN. El GST (EC 2.5.1.18) es uno de los mayores grupos de enzimas detoxificantes. Constituye una familia de varias enzimas citosólicas y mitocondriales multifuncionales implicadas en la detoxificación y en la unión proteica intracelular. Así pues, cada GST tiene propiedades catalizadoras distintas: conjugación con glutation, peroxidación e isomerización (167). Las enzimas GST conocidas hasta ahora pertenecen a 7 clases de acuerdo con su secuencia primaria de aminoácidos, llamadas α (alfa, A), µ (mu, M), π (pi, P), σ (sigma S), θ (teta, T), ω (omega, O) y ζ (zeta, Z) clases de GST (167). Las variantes alélicas que codifican la misma clase comparten entre el 75 y el 95% de la secuencia génica, y los miembros de diferentes clases entre el 25 y el 30% (167). En humanos, se ha identificado su actividad en la mayor parte de los órganos: hígado, riñón, pulmón, intestino, piel, cerebro, glóbulos rojos, leucocitos, corazón y músculo esquelético (169). Dentro de cada órgano se pueden identificar diferentes isoenzimas debido a una expresión variable de algunas formas y a la completa ausencia de otras (169). Dado su acción detoxificadora las enzimas GST citosólicas son de gran interés en farmacología, toxicología, carcinogénesis y enfermedades crónicas (170). A pesar de su importante papel en los procesos biológicos de detoxificación, dos de las isoenzimas más importantes, la enzima θ GSTT1 y la enzima µ GSTM1, presentes en elevadas concentraciones en el hígado, se encuentran genéticamente delecionadas en la población humana (170), y 79 aunque la presencia de polimorfismos de los principales enzimas metabolizadores de xenobióticos es común (152,170), la delección completa de dos de los genes más importantes en las reacciones metabólicas fase II es sorprendente y tiene consecuencias en los ámbitos de la toxicología, farmacología, carcinogénesis y las enfermedades crónicas (170). I.6.1.1. GSTM1. La clase µ incluye cinco genes, GSTM1, M2, M3 M4 y M5. Se localizan en la región cromosómica 1p13.3 (167-170). El gen GSTM1 es polimórfico y tiene 4 variantes alélicas GSTM1 *A, *B, *C y *0. La variante *0 (alelo nulo) en homocigosis produce una pérdida de actividad de la enzima (genotipo GSTM1*0 o nulo) (167-172). Por lo tanto, la variante GSTM1*0 parece ser una delección del gen que codifica GSTM1A/B (173). El mapeo detallado del cluster GSTM1 muestra que dicho gen está formado por 8 exones delimitados por 2 regiones idénticas de 4,2 Kb. El polimorfismo GSTM1*0 se debe a un proceso de recombinación de ambas repeticiones (Figura 3) (170,172,173). El polimorfismo GSTM1 nulo es frecuente en humanos, de forma que se encuentra presente en aproximadamente un 50% de la población, con un rango de 30-70% para los distintos grupos étnicos (170). 80 Figura 3: Estructura del gen GSTM1. La recombinación homóloga de ambas repeticiones conduce a una delección GSTM1. Adaptado de referencia 173. I.6.1.2. GSTT1. Dentro de la clase θ existe otro polimorfismo nulo en el locus T1 (GSTT1*0 o nulo) (174). El GSTT1 constituye una parte del gen GST, localizado en la región cromosómica 22q11.2. Está constituido por 5 exones y se encuentra flanqueado por dos regiones HA3 y HA5 homólogas en más del 90% (170,173). De forma similar al GSTM1*0, el polimorfismo nulo GSTT1*0 es consecuencia de una recombinación homóloga de ambas repeticiones HA3 y HA5 (Figura 4) que da como resultado una delección de 54 kb que contiene el gen GSTT1 (173). 81 Figura 4: Estructura del gen GSTT1. La recombinación homóloga de ambas repeticiones HA3 y HA5 da lugar a la delección del GSTT1. Adaptado de referencia 173. I.6.2. FUNCIÓN ENZIMÁTICA. Como resultado de diversas reacciones de oxidación catalizadas por enzimas de fase I, muchos fármacos y xenobióticos son transformados en intermediarios de naturaleza electrofílica muy reactivos, que atacan rápidamente a moléculas nucleofílicas en las células, proteinas y ácidos nucleicos. Estas sustancias de naturaleza electrofílica también pueden proceder de procesos endógenos que producen radicales de oxígeno. Uno de los mecanismos de biotransformación de estos metabolitos generados en la fase I es su unión covalente a moléculas endógenas de la célula tales como ácido glucurónico, glutation, sulfato y aminoácidos generando conjugados (reacciones de fase II). Dentro de los sistemas de detoxificación existentes en el organismo, uno de los más eficientes en la eliminación de estos compuestos electrofílicos por 82 su conjugación con el glutation es el sistema enzimático GST. El glutation es un tripéptido nucleofílico que sirve como diana para compuestos electrofílicos evitando el ataque y daño de éstos a las macromoléculas celulares (ADN, proteinas, lípidos) (167-170). La conjugación con el glutation está catalizada directamente por las enzimas GST, dando lugar a la formación de tioéteres (167-170). Los conjugados con el glutation son eliminados directamente por la bilis, y en menor medida por la orina. En este último caso, antes de ser excretado, el conjugado sufre un proceso metabólico por el que secuencialmente es eliminado el resto γ-glutámico y la glicina de la molécula de glutation y finalmente es acetilado el grupo amino de la cisteina, dando origen a derivados del ácido mercaptúrico que son los metabolitos que finalmente aparecen en la orina (167-170). Así pues, las enzimas GST se encuentran implicadas en la detoxificación de una amplia variedad de xenobióticos, incluyendo sustancias hepatotóxicas y carcinógenos (170-173). Además, ciertos compuestos endógenos del tipo de las prostaglandinas, leucotrienos, hiperóxidos orgánicos (incluyendo hiperóxidos lipídicos y productos de peroxidación lipídica) y esteroides son sustratos de las enzimas GST (169,170). Existen algunos conjugados con el glutation con capacidad de reaccionar con macromoléculas celulares dañándolas. Así pues, la conjugación con el glutation por las enzimas GST puede dar lugar a conjugados tóxicos y no tóxicos para la célula. En función de la formación de compuestos estables o inestables para la célula se distinguen dos tipos de reacciones de conjugación cuyos sustratos también son diferentes (167,169). En el primer tipo de reacciones se forman 83 conjugados estables del glutation con sustratos del tipo de los epóxidos, grupos alquilo y arilo y productos reactivos que provienen de reacciones catalizadas por el citocromo P-450. En el segundo tipo de reacciones el conjugado con glutation es inestable de modo que reacciona nuevamente con otra molécula de glutation (reacción no catalizada por GST) generando disulfuro de glutation. Dos ejemplos de sustratos de este segundo tipo de reacción son los nitratos orgánicos y los hidroperóxidos orgánicos (167,169). Varias de estas reacciones catalizadas por las enzimas GST se producen en ausencia de la enzima. Se sabe que el glutation se encuentra presente en elevadas concentraciones en la mayor parte de los tejidos del cuerpo, pero se desconoce la importancia relativa de las reacciones enzimáticas vs. no enzimáticas en la prevención del daño celular. Por ejemplo, la prevención del daño hepático celular del paracetamol depende de la conjugación del metabolito reactivo del mismo con el glutation. Si las concentraciones intracelulares del mismo son elevadas, el índice de formación de compuestos conjugados y la prevención de una posible formación de compuestos resultantes de la unión covalente a proteinas de dichos metabolitos reactivos se encuentra poco afectada por los niveles citosólicos de las enzimas GST. Sin embargo, si la concentración intracelular de glutation disminuye, las reacciones catalizadas por las enzimas GST aumentan con respecto a las reacciones no enzimáticas, de modo que la presencia de enzimas GST se vuelve esencial para prevenir la unión covalente a proteínas de los reactivos tóxicos del paracetamol (169). Así pues, la prevención del daño hepático por las enzimas GST parece ser más importante si existe disminución de los niveles de glutation intracelular (169). 90 con inflamación crónica y neoplasias (170). Dentro del primer grupo, varios estudios han demostrado que ambos genotipos nulos dan lugar a un aumento de riesgo de los efectos nocivos del tabaco sobre el riesgo cardiovascular (187,188) y un aumento del riesgo coronario secundario a la diabetes mellitus (189). Además, se ha evidenciado un aumento de los marcadores inflamatorios homeostáticos y de función endotelial (190). A pesar de que el desarrollo de la patología cardiovascular crónica es multifactorial, cada vez es más evidente la existencia de una relación patogénica entre los polimorfismos nulos GSTM1 y GSTT1, ya que a pesar de que no disponemos de datos consistentes, todas estas investigaciones sugieren que tanto el GSTM1 como el GSTT1 poseen diferentes funciones en la cadena patogénica de acontecimientos. Uno de los factores patogénicos de la EPOC es el estrés oxidativo secundario a productos derivados del humo del tabaco (191,192). Debido a que las enzimas GST participan en la detoxificación de dichas sustancias oxidantes, la relación entre los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 ha sido objeto de estudio. Concretamente disponemos de datos procedentes del estudio estudio SAPALDIA, cuyos resultados indicaron que la delección homocigótica nula GSTT1, aislada o combinada con la del GSTM1 nula, está asociada de manera independiente con la caída de la función pulmonar en relación con la edad, más rápida en los varones que en las mujeres y de forma independiente del hábito tabáquico (193). Aunque el fenotipo del asma es heterogéneo, al igual que en la EPOC, su patogenia reside en la inflamación crónica secundaria a una respuesta inflamatoria anormal a determinados factores ambientales. Por lo tanto, los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 nulos podrían modular el riesgo de asma. A 91 pesar de investigaciones recientes (194-197) en las que se ha observado que alguno de esos genes podría ser un factor de riesgo de asma, no se han podido establecer grandes conclusiones en este campo debido a que la mayoría de la información está basada en muestras pequeñas. Es interesante reseñar que varias investigaciones han puesto de manifiesto una relación entre los genotipos GSTM1 nulo y GSP I/I, tanto con el riesgo de asma inducida por exposición a isocianatos (198) y como la secundaria a inflamación alérgica inducida por el efecto de las partículas diesel eliminadas por los tubos de escape de los coches con este tipo de motor (199). El papel de dichos polimorfismos nulos en el riesgo de determinadas enfermedades gastrointestinales también ha sido objeto de estudio. Los resultados más relevantes son los que relacionan el polimorfismo nulo GSTM1 con un mayor riesgo de desarrollar hepatitis alcohólica y cirrosis biliar primaria (200,201). Dado el pequeño tamaño muestral, dichos resultados precisan confirmación en estudios más amplios. También se ha estudiado la relación entre ambos genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 y la patogenia de determinadas enfermedades autoinmunes como el LES y la artritis reumatoide (202-207), pero se precisan estudios más amplios para poder establecer conclusiones definitivas. Dentro del grupo de las enfermedades neoplásicas los datos procedentes de los estudios que relacionan los polimorfismos GST con un aumento de la carcinogénesis revelan incrementos en el riesgo de cáncer debidos a la presencia de los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 de pequeña magnitud (odds ratio inferiores a 2) que aumenta cuando se combinan con otros polimorfismos genéticos como los del grupo del citocromo P-450 o 92 factores ambientales como el tabaquismo (170,208). Hasta la fecha, disponemos información de más de 500 estudios que relacionan los genotipos del GST con el riesgo de cáncer de pulmón, cabeza y cuello, mama, hígado, gastrointestinal, urotelial, próstata y leucemia, pero los resultados no son consistentes para algunos de estos tipos de tumores. Los tipos de cáncer que parecen estar más relacionados con los polimorfismos nulos GSTM1 y GSTT1 son el de pulmón, cabeza y cuello e hígado. El principal agente etiológico relacionado con el cáncer de pulmón es el tabaco y los genotipos GST modulan el efecto de las sustancias tóxicas derivadas del mismo, tanto por detoxificación de carcinógenos como por una eliminación de compuestos protectores (211-213). Los datos combinados de un reciente meta-análisis de todos los estudios más relevantes de los polimorfismos nulos GSTM1 y GSTT1 en el que se analizan 29.365 casos de cáncer de pulmón y 38.253 controles revelan un riesgo relativo de cáncer de pulmón de 1,18 (IC 95% 1,14-1,23) y 1,09 (IC 95% 0,95-1,14) para los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 respectivamente. Los principales factores determinantes de la heterogeneidad de los datos fueron el tamaño muestral y las variaciones interétnicas, de forma que parece que el genotipo nulo GSTM1 se asocia de forma más débil en individuos de ascencencia europea (212). La relevancia de estas asociaciones de los polimorfismos nulos GSTM1 y GSTT1 tan débiles es incierta y constituye un aspecto muy debatido y criticado. Cada vez existe más evidencia de que la combinación de varios polimorfismos de enzimas detoxificadores (sobre todo de los genes GSTM1, GSTP1 y CYP1A1) parecen incrementar la susceptibilidad a cáncer de pulmón sobre todo en sujetos fumadores (213). 93 Una reciente revisión sobre la epidemiología molecular del cáncer de los tumores de cabeza y cuello evidencia que las causas principales de estos tipos de tumores son el hábito tabáquico y el consumo de alcohol (214). La influencia de ciertos polimorfismos enzimáticos en el riesgo de cáncer de cabeza y cuello es difícil de determinar. Al igual que para el cáncer de pulmón se ha observado que la combinación del polimorfismo nulo GSTM1 con CYP1A1 incrementa el riesgo de cáncer de la cavidad oral y esofágico en fumadores (215,216). Sin embargo, otros estudios más recientes muestran una falta de relación entre dichos polmorfismos GSTM1*0, GSTT1*0 y CYP1A1 y la presdisposición a cáncer de cabeza y cuello (217,218). Debido a estas controversias, Hashibe et al realizaron un meta-análisis de 31 estudios publicados de casos y controles con un total de 4.635 casos y 5.770 controles. Las odds ratio para los tumores de cabeza y cuello fueron 1,23 (IC 95% 1,06-1,42) para el genotipo nulo GSTM1, 1,17 (IC 95% 0,98-1,40) para el genotipo nulo GSTT1, 1,1 (IC 95% 0,82-1,31) para los portadores del alelo GSTP1 Val105, y 1,35 (IC 95% 0,95- 1,82) para los portadores del alelo CYP1A1 Val462 (219). Por lo tanto, dicho meta-análisis prueba la existencia de una modesta asociación entre los genotipos GSTM1 y GSTT1 y el riesgo de tumores de cabeza y cuello (219). En resumen, cada vez es más evidente que el riesgo de este tipo de tumores depende de la interacción entre el consumo tabáquico y alcohol y los polimorfismos de los genes GSTM1, GSTT1 y CYP1A1. Con respecto a las neoplasias del tracto gastrointestinal, los primeros estudios realizados al respecto no mostraron asociaciones significativas entre el riesgo de desarrollo de neoplasias orales, esofágicas y gástricas y los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 (220). Con respecto al genotipo nulo GSTM1 94 y su relación con el riesgo de cáncer colorrectal se ha determinado una asociación significativa en un amplio estudio en el que se incluyeron 1.130 casos y 2.519 controles (221). También se ha visto que la combinación de ambos genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 dan lugar a un pequeño incremento en el riesgo de cancer colorrectal (222). Los datos procedentes de estudios que analizan la relación de dichos polimorfismos con el carcinoma hepatocelular, neoplasia ligada a la infección crónica por VHB y VHC y a la exposición a aflatoxina B1, muestran un mayor riesgo de la misma ante la presencia de los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 (223,224). Por lo tanto, en el estudio de la patogénesis del carcinoma hepatocelular es importante dilucidar la interacción entre factores ambientales (virales y químicos) y factores genéticos (GSTM1 y GSTT1). Con respecto a tumores en otras localizaciones (mama, urotelial, próstata, cerebro y leucemia) los datos procedentes de los estudios realizados son contradictorios, por lo que precisan confirmarse en estudios más amplios (170,208). 95 I.7. POLIMORFISMOS DEL CYP2E1. I.7.1. INTRODUCCIÓN: El complejo enzimático del citocromo P-450 (P-450 o CYP) está compuesto por varias enzimas cuyo centro catalítico está formado por un complejo hemo-porfirina. Solamente algunos de los múltiples genes que codifican el complejo citocromo P-450 están relacionados con el metabolismo de los fármacos (225). Los enzimas se dividen en familias y subfamilias en función de la similitud entre las secuencias genéticas codificantes de forma que dos enzimas de una misma subfamilia presentan una similitud en la secuencia de ADN de aproximadamente un 70% (225). Las reacciones catalizadas por los enzimas P-450 son de oxidación (226). En el transcurso de dichas reacciones se pueden originar intermediarios electrófilos reactivos, compuestos ávidos de electrones capaces de abstraerlos a otras biomoléculas que pueden reaccionar con nucleófilos presentes en la célula y/o unirse covalentemente a macromoléculas. El resultado es por tanto una reacción de bioactivación del compuesto. La reacción de oxidación implica una reducción parcial de la molécula de oxígeno. Ello conlleva un considerable aumento de la reactividad, que la propia molécula de oxígeno carece. Si la activación del oxígeno queda confinada en el centro catalítico del enzima, la reacción transcurre hasta la oxidación del sustrato sin mayores incidencias. Sin embargo, en ocasiones, las reacciones pueden no completarse totalmente, bien por impedimentos estéricos del propio sustrato, bien porque algunas enzimas dejan escapar con relativa facilidad (concretamente el CYP2E1) intermediarios reactivos, generando anión superóxido, peróxido e incluso 96 radicales derivados de la propia molécula sustrato. Así pues, se originan especies químicamente reactivas capaces de interaccionar con biomoléculas de la célula causando daño celular (226). El CYP2E1 (EC 1.14.14.1) es uno de los enzimas del complejo P-540 mejor conocidos. Los enzimas CYP2E1 humanos y de los roedores catalizan reacciones similares, por lo que los ratones son buenos modelos para determinar sus sustratos. Se han estudiado más de 70 sustratos metabolizados por este enzima entre los cuales se encuentran alcoholes, aldehídos, cetonas, hidrocarburos alifáticos y aromáticos, solventes halogenados y algunos fármacos (51,52). Son los responsables de la activación metabólica de nitrosaminas, relacionadas con la patogénesis de algunos tumores (227). Se expresan en el hígado y son inducidos, tanto a nivel hepático como en otros tejidos, fundamentalmente por la acetona, etanol, benceno, H y otros, compuestos que son, en su mayoría, sustratos del grupo enzimático (52,53). Cuantitativamente, comprenden aproximadamente el 7% de todas las isoformas del P-450 en el hígado. La variabilidad interindividual en la expresión enzimática del CYP2E1, aunque no se conoce totalmente, parece tener explicación en la gran cantidad de polimorfismos del gen CYP2E1. Existen numerosos trabajos cuyo objetivo ha sido encontrar una asociación entre el polimorfismo genético del CYP2E1 y la susceptibilidad a los daños producidos por fármacos y tóxicos (52). La distribución de la frecuencia de los polimorfismos del CYP2E1 es variable en función de la población (152,228). El gen CYP2E1 es uno de los más complejos en la nomenclatura de los polimorfismos. Una de las variantes alélicas principales es la caracterizada por 97 la ausencia de la diana de restricción RsaI (alelo CYP2E1*5 o alelo c2) localizada en la región reguladora de la transcripción. En contraste con la gran cantidad de información existente acerca de la funcionalidad y variabilidad de otros enzimas CYP, existe poca evidencia acerca de la influencia de los polimorfismos del CYP2E1 en la funcionalidad del enzima y en el incremento de susceptibilidad a desarrollar efectos tóxicos secundarios al metabolismo de los diferentes compuestos (52). I.7.2. POLIMORFISMOS DEL CYP2E1. La asociación del polimorfismo genético del CYP2E1 y la susceptibilidad a los daños producidos por exposición a tóxicos ha recibido una atención creciente. Son muchos los trabajos publicados que hacen referencia al papel de dicho gen en determinados procesos metabólicos y su relación con varias patologías. El gen CYP2E1 se encuentra en el cromosoma 10 en la localización 10q24.3-qter (229). Estructuralmente está formado por 9 exones y 8 intrones, que codifican a la proteína CYP2E1 formada por una secuencia de 496 aminoácidos. Dentro de los genes codificadores de los enzimas CYP, el CYP2E1 es uno de los más diversos. Solus et al secuenciaron 11 genes del CYP en una muestra de 93 individuos en la que se incluyeron personas de ascendencia caucásica, afroamericana y asiática (228). En lo que se refiere al CYP2E1, encontraron 32 variantes alélicas de las cuales 13 ya se habían reportado previamente. La frecuencia global de las mismas fue inferior al 1% en 23 variantes. En dicha investigación se reflejan diferencias interétnicas importantes (228). 98 El Comité de Nomenclatura del P-450 humano del instituto Karolinska (http://www.cypalleles.ki.se/index.htm) en su última actualización, enumera 13 variantes alélicas del CYP2E1 con haplotipo determinado (Tabla 6). La mayoría de dichos polimorfismos se encuentran en la región promotora y en los intrones. El alelo CYP2E1*1A (también llamado alelo c1) es el alelo “wild-type” y se caracteriza por presentar la diana de restricción RsaI en la región reguladora del gen. La actividad del enzima codificado por dicho alelo es normal. Los polimorfismos determinados por las enzimas de restricción RsaI, PstI y DraI (alelos CYP2E1*5A y *5B respectivamente) se han asociado con alteraciones en la expresión del gen ya que las dianas de restricción RsaI y PstI se encuentran en zonas reguladoras de la transcripción (Tabla 6). El alelo CYP2E1*5 (también denominado alelo c2), caracterizado por la pérdida de la diana de restricción RsaI, parece estar asociado con cambios a nivel transcripcional, dando lugar a alteraciones en los índices de actividad catalítica de la enzima (230,231) (Tabla 3). El polimorfismo RsaI se encuentra en la región adyacente 5’ del gen, región en la que residen varios factores reguladores negativos de la actividad transcripcional del gen. Otro de los polimorfismos es el denominado CYP2E1*6, caracterizado por pérdida de la diana de restricción DraI (232), localizada en el intrón 6. Las implicaciones de dicho polimorfismo sobre la funcionalidad del enzima están poco claras (231,232) (Tabla 6). 99 Tabla 6: Polimorfismos del CYP2E1. Gen Proteina Cambio nucleótido RFLP Efecto Actividad enzimática Referencia CYP2E1*1A CYP2E1.1 Ninguno (wildtype) Normal 229 CYP2E1*1B CYP2E1.1 9896C>G TaqI- 233, 234 CYP2E1*1C CYP2E1.1 6 repeticiones en la región flanqueante 5’ 235 CYP2E1*1D CYP2E1.1 8 repeticiones en la región flanqueante 5’ DraI y XbaI 235, 236 CYP2E1*2 CYP2E1.2 1132G>A R76H Reducida 237 CYP2E1*3 CYP2E1.3 10023G>A V3891I Normal 237 CYP2E1*4 CYP2E1.4 4768G>A V179I Normal 238 CYP2E1*5A CYP2E1.1 -1293G>C, -1053C>T, 7632T>A PstI+, RsaI-, DraI- 230-232 CYP2E1*5B CYP2E1.1 -1293G>C, -1053C>T PstI+, RsaI- 230,231 CYP2E1*6 CYP2E1.1 7632T>A DraI- 232 CYP2E1*7A CYP2E1.1 -333T>A 238 CYP2E1*7B CYP2E1.1 -71G>T; -333T>A 238 CYP2E1*7C CYP2E1.1 -333T>A; -352A>G *Adaptado de http://www.cypalleles.ki.se/cyp2e1.htm 106 metabolismo del alcohol a dosis altas, observándose que incluso llegan a metabolizar más del 10% del alcohol ingerido (248). Dado que las mismas enzimas microsomales metabolizan tanto el alcohol como otros xenobióticos, el metabolismo de estos últimos CYP es inhibido ante la presencia de concentraciones elevadas de etanol, en parte debido a la competición por una vía de oxidación común (51). Por lo tanto, el consumo concomitante de alcohol con otras drogas puede dar lugar a un aumento de la concentración de la droga y mayor riesgo de sobredosis. El aumento o disminución de la hepatotoxicidad por otras drogas secundaria a la ingesta de alcohol se ha observado en el caso de la H (aumento) (249), fenilbutazona (aumento) (249), propiltiuracilo (reducción) (250) y clormetiazol (inhibición de la expresión del CYP2E1) (251). Se ha visto que varias drogas como el pentobarbital, la wafarina, la fenitoina, la tolbutamida, el propanolol, la R y la metadona aumentan su índice de aclaramiento cuando son administradas en conjunto con ingesta enólica (12,51). La coadministración de paracetamol aumenta el riesgo de hepatotoxicidad. Existen dos posibles mecanismos que explican este hecho: a) por un aumento de los compuestos implicados en la peroxidación lipídica, b) por una disminución de la actividad de los enzimas antiperoxidasa (superóxido dismutasa y catalasa) y de los niveles de glutation (252). El CYP2E1 es regulado a nivel transcripcional y post-transcripcional a través de la estabilización proteica inducida por el sustrato, de tal forma que el consumo crónico de etanol lleva a un incremento de la proteína por disminución en su degradación, sin afectar al ARNm; esta inducción enzimática lleva a un incremento del metabolismo del etanol que puede contribuir al desarrollo de 107 dependencia. Así pues el etanol puede aumentar el contenido de CYP2E1 así como la oxidación catalítica de sustratos del CYP2E1, lo que explica la mayor susceptibilidad a compuestos hepatotóxicos de los alcohólicos (247). El alelo determinado por la ausencia de la diana de restricción RsaI (alelo c2) se ha asociado con una mayor actividad transcripcional, niveles de proteina y actividad enzimática en comparación con el alelo “wild-type” c1/c1, por lo que la mayor actividad transcripcional secundaria al genotipo c2/c2 podría jugar una papel importante en el desarrollo de hepatopatía alcohólica grave (253). El polimorfismo CYP2E1*D se ha asociado con una mayor susceptibilidad a ser inducido por lo que parece que es uno de los contribuyentes al desarrollo de dependencia alcohólica y de nicotina. Dicho polimorfismo contiene una secuencia repetida en la región adyacente 5’, que puede dar lugar a una disminución de ciertos factores que intervienen en la regulación negativa de la expresión génica (235). Se ha observado una mayor actividad del CYP2E1 en individuos homocigóticos y heterocigóticos para dicho alelo (235). I.7.5.4. FÁRMACOS ANTITUBERCULOSOS. Tal y como se ha explicado anteriormente, el CYP2E1 interviene en la degradación de la H concretamente en la oxidación de de la MAH dando como resultado metabolitos hepatotóxicos (Figura 1) (12,28,50,88). El índice de producción de dichas hepatotoxinas va a depender directamente de la actividad de la enzima. El efecto de la H sobre la actividad del CYP2E1 es más complejo que el de otros compuestos. Así pues se ha determinado que dicha influencia sobre 108 la actividad del CYP2E1 es bifásica en función del tiempo. Durante la administración de H la actividad del CYP2E1 se encuentra inhibida y cuando su administración se interrumpe se produce un aumento de la actividad de dicha enzima (45,249,50). Los polimorfismos determinados por los enzimas de restricción RsaI y PstI se encuentran localizados en la región reguladora de la transcripción del gen, por lo que se relacionan con los índices de expresión génica (231). Varios estudios han demostrado que el polimorfismo determinado por la ausencia de la diana de restricción del RsaI (alelo c2) se asocia a una mayor actividad del enzima CYP2E1 (231,254), en comparación con el alelo wildtype (alelo c1). Sin embargo, también existen trabajos en los que no se evidencia ninguna relación entre el polimorfismo RsaI y la actividad basal del CYP2E1 (47,255,256). En el estudio realizado por Huang et al en población asiática encontraron una relación significativa entre la presencia del alelo “wildtype” y el riesgo de HFAT (47). En otro estudio realizado en una muestra poblacional caracterizada por la presencia de heterogeneidad racial, encontraron una asociación entre dicho alelo y el riesgo de hepatotoxicidad secundaria a H administrada en monoterapia para el TITL, en el grupo de ascendencia asiática (37). Sin embargo, en el reciente estudio de Cho et al llevado a cabo en población coreana, no se observó un mayor riesgo de HFAT asociado al mismo (45). En este trabajo también determinaron el riesgo asociado a los polimorfismos determinados por repeticiones en la región adyacente 5’ (*1A, *1C y *1D), no encontrando ninguna relación significativa entre su presencia y el riesgo de HFAT, tanto de forma individual como en combinación con el alelo “wildtype” c1 (45). 109 I.7.6. ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS CYP2E1 CON OTRAS PATOLOGÍAS. Diversos estudios sugieren que las diferencias en los niveles basales de CYP constituyen una de las principales fuentes de variabilidad interindividual en la respuesta a xenobióticos (257). En este contexto, varios estudios han demostrado correlaciones entre diversas actividades del CYP y el riesgo de algunas enfermedades secundarias a la acción tóxica del alcohol, el tabaco y la generación de cáncer en diversos tejidos (258,259). Se ha determinado que el consumo crónico de alcohol da lugar a un aumento de la proteína CYP2E1, así como otros factores como la dieta rica en grasas, la diabetes y la obesidad, por lo que tienen un efecto modulador del metabolismo del alcohol (51). Se ha observado una correlación positiva entre la inducción del CYP2E1 por el alcohol y la generación de radicales libres y la peroxidación lipídica. Por lo tanto, la inducción del CYP2E1 aumenta el daño hepático producido por el alcohol mientras que su inhibición lo disminuye (260). La mayor actividad transcripcional del polimorfismo c2/c2 se ha visto relacionado con un incremento de la susceptibilidad a hepatopatía por el alcohol cuando se asocia al polimorfismo *3 del gen que codifica la enzima ADH (261). Parece que la combinación de ambos alelos puede modular el riesgo de hepatopatía alcohólica, hecho no demostrado para cada uno de los mismos de forma individual (262). El polimorfismo CYP2E1*D (8 repeticiones en la región adyacente 5’) se ha asociado con una mayor capacidad de inducción del enzima por el alcohol (235). Sin embargo, en un reciente estudio en el que se analizó la fecuencia de dicho polimorfismo en 239 alcohólicos y 208 controles se observó una menor presencia de dicho polimorfismo en los 110 individuos alcohólicos (247). Wong et al llevaron a cabo un estudio sobre ciertos polimorfismos del CYP2E1 y el riesgo de hepatopatía alcohólica y carcinoma hepatocelular y posteriormente realizaron un meta-análisis de la literatura (263). Observaron que el polimorfismo determinado por la ausencia de la diana de restricción TaqI fue menos frecuente en los individuos alcohólicos, y dado que dicho polimorfismo no se relacionaba directamente con una alteración del metabolismo del alcohol; este resultado podría explicarse porque esté ligado a otros factores protectores por el momento desconocidos (263). En un meta-análisis de varios estudios sobre la relación entre el polimorfismo determinado por la enzima de restricción RsaI y el riesgo de hepatopatía alcohólica no se determinó una influencia significativa del mismo sobre el riesgo de hepatopatía alcohólica (262). En resumen, los resultados de los estudios de asociación de los polimorfismos del CYP2E1 con la hepatopatía alcohólica son controvertidos y no muestran una asociación clara. Otra de las enfermedades en las que se ha determinado una influencia de los polimorfismos del CYP2E1 en el riesgo de su desarrollo es la EPOC, fundamentalmente derivado del importante papel del CYP2E1 en el metabolismo de nitrosaminas alquiladas procedentes de la combustión del tabaco (263). El CYP2E1 es un complejo enzimático propuesto como posible marcador de cáncer debido a su actividad sobre varios xenobióticos (benceno, estireno, anilina, etc) que pueden ser activados por el CYP2E1 dando lugar a sustancias carcinógenas (227). Los polimorfismos determinados por las enzimas de restricción RsaI y PstI, que se encuentran ligados, y DraI, determinan una sobreexpresión del gen (231,268). Los polimorfismos metabólicos 111 determinados por estas variaciones se han asociado con un aumento del riesgo de cáncer incluidos los de pulmón (265), próstata (266) y gástrico (267) en diferentes poblaciones. Los datos reportados muestran una gran variabilidad en la frecuencia de estas variantes alélicas, que parece depender del perfil genético de las poblaciones estudiadas. Por otro lado, en otros estudios, no se han encontrado asociaciones entre dichos alelos y la patología neoplásica, por lo que parece necesario realizar más estudios que incluyan un mayor número de individuos para poder establecer la utilidad de estos posibles biomarcadores de susceptibilidad a cáncer. Uno de los aspectos más estudiados ha sido su relación con el cáncer de pulmón. Los resultados son controvertidos por lo que no está clara su relación con los polimorfismos del CYP2E1. Existen trabajos que no muestran asociación (374,268-271) y otros en los que si se ha encontrado (227). Dado el carácter multifactorial del cáncer se deben evaluar varios factores metabólicos implicados en la susceptibilidad individual. II. Justificación y Objetivos 115 I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. En la revisión bibliográfica realizada se comprueba que se han estudiado ciertos factores genéticos que determinan un mayor riesgo de HFAT. Existen varios polimorfismos de enzimas que participan en la detoxificación hepática de la H y R que dan lugar a un fenotipo metabólico diferente y, por lo tanto, un desequilibrio entre la producción y degradación de hepatotoxinas derivadas del metabolismo de dichos fármacos, confiriendo al individuo una mayor susceptibilidad de desarrollar hepatotoxicidad secundaria (12,19,50,88). Los datos de los que disponemos provienen de estudios realizados mayoritariamente en poblaciones asiáticas, por lo tanto, debido a la posible existencia de diferencias inherentes a la raza, sería necesario determinar estos factores genéticos y su influencia sobre el riesgo de hepatotoxicidad en caucásicos. Su determinación identificaría a individuos con riesgo de desarrollo de hepatitis tóxica secundaria a estos fármacos, lo que condicionaría una monitorización clínica más estricta o incluso un cambio a regímenes de tratamiento menos hepatotóxicos. Por lo tanto, el estudio de dichos polimorfismos podría constituir una aproximación de la posible aplicación de la farmacogenética y farmacogenómica en la prevención futura de la toxicidad hepática de los FAT. Ante estas premisas nos planteamos los siguientes objetivos: II.1. OBJETIVO GENERAL. Evaluar la influencia de los polimorfismos *5, *6 y *7 del NAT2 determinantes de velocidades de acetilación lentas, los polimorfismos nulos 122 o dolor abdominal. La clasificación de gravedad de la hepatotoxicidad se hizo de acuerdo con el pico máximo de transaminasas alcanzado, adoptando la clasificación de toxicidad de la OMS (22), definiéndose como hepatotoxicidad leve las elevaciones de la AST y/o ALT entre 3-5 veces los LSN (121-200 UI/L); moderada elevaciones de 5-10 veces los LSN (201-400 UI/L); y grave, elevaciones de más de 10 veces los LSN (> 400 UI/L). Las variables registradas fueron la edad, sexo, IMC, localización de la TB (pulmonar, pleural o extrapulmonar), régimen terapéutico, dosificación de cada fármaco, síntomas de hepatitis, niveles basales y durante el seguimiento de AST, ALT, FA, ácido úrico, bilirrubina y parámetros de coagulación. III.4. ESTUDIO GENÉTICO DE LOS POLIMORFISMOS. Se estudiaron los polimorfismos del NAT2 5*, 6* y 7*, interpretando su ausencia como la presencia del alelo 4* (“wild-type”). Las combinaciones homocigóticas y heterocigóticas del alelo 4* fueron definidas como genotipos acetiladores rápidos, siendo genotipos acetiladores lentos el resto de las combinaciones de los polimorfismos del gen NAT2 estudiados. En cuanto al gen GST, se estudiaron los locus GSTM1 y GSTT1, de forma que se definieron los polimorfismos nulos de ambos genes en caso de delección homocigótica del gen. El polimorfismo del CYP2E1 estudiado fue el c2, interpretando su ausencia como la presencia del alelo salvaje c1. III.4.1. TOMA DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ADN. Se realizó extracción de ADN a partir de leucocitos de sangre periférica anticoagulada con ácido etilen-diamino-tetra-acetato (EDTA). Para dicho 123 procedimiento se utilizó el kit comercial FlexiGene DNA-QIAGEN (QUIAGEN GmbH). Siguiendo las indicaciones del protocolo de la casa comercial la extracción de ADN se realizó en 6 etapas que se decriben a continuación. Etapas de la extracción de ADN: 1. Pipetear el Buffer FG1 en un tubo tipo falcon. Sobre él añadir la sangre entera (volumen ajustado según protocolo) y homogenizar invirtiendo el tubo 5 veces. 2. Centrifugar a 3.500 r.p.m. durante 13 minutos (min). 3. Descartar el sobrenadante. Invertir el tubo sobre papel de filtro limpio durante 2 min (observar que no se desprenda el pellet). 4. Preparar el Buffer FG2 más QUIAGEN Protease ajustando el volumen de cada uno de ellos según el volumen de sangre. 5. Añadir el Buffer FG2/QIAGEN Protease (volumen ajustado según protocolo) y realizar vórtex de cada muestra hasta que el pellet esté completamente disuelto [3-4 pulsos de vórtex de 5 segundos (seg) cada uno; en el caso de que queden trazas visibles de pellet añadir 1 ml de Buffer FG2 y vórtex de nuevo]. 6. Invertir el tubo 3 veces. Incubar a 65º C 10 min. 7. Añadir el isopropanol (100%) (volumen ajustado según protocolo) e invertir el tubo enérgicamente hasta que el precipitado de ADN sea visible (como una malla o hebra). 8. Centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 3 min. 9. Desechar el sobrenadante. Invertir el tubo sobre papel de filtro limpio durante 2 min. 124 10. Añadir etanol al 70% (volumen ajustado según protocolo) y vórtex durante 5 seg. 11. Centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 3 min. 12. Desechar el sobrenadante. Invertir el tubo sobre papel de filtro limpio durante al menos, 5 min (hasta que el pellet de ADN evapore el etanol completamente). 13. Añadir el Buffer FG3 (volumen ajustado según protocolo) y realizar vórtex durante 5 seg a baja velocidad. Incubar a 65º C durante 1 hora para desnaturalizar el ADN). 14. Aplicar un spin para recuperar toda la muestra. Alicuotar, identificar y congelar a -20ºC. III.4.2. REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR). El objetivo de la PCR es la amplificación directa de un fragmento de ADN. III.4.2.1. PCR gen NAT2: Amplificación del fragmento del gen NAT2 que contiene los alelos *5, *6 y *7 tras adaptar a las condiciones de nuestro laboratorio la metodología utilizada por Neugebauer et al (39). Se utilizaron los primers 5’- AGATGTGCAGCCTCTAGAA-3’ y 5’-ATTAGTGAGTTGGGTGATAC-3’. El volumen final de las reacciones fue de 25 µl. En la tabla 7 se detallan las concentraciones iniciales y finales de los reactivos. 125 Tabla 7: Cantidades de los reactivos PCR del NAT2 Concentración Inicial Concentración final Tp10x 1x dNTPs (40mM) 800 µM PNAT2F (10 µM) 10 pm PNAT2R (10 µM) 10 pm MgCl2 (50 mM) 0,75 mM TAQ (5 U/µl) 0,5 U Agua c.s.p. 25 µl ADN (100 ng/µl) 100 ng Volumen final 25 µl Las etapas de amplificación fueron, en primer lugar, una fase inicial a 94º 5 min, posteriormente una amplificación durante 35 ciclos a 94º 60 seg, 55º 60 seg, 72º 60 seg y una extensión a 72º durante 5 min. Los fragmentos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa al 0,7% con bromuro de etidio a 0,1 µg/ml tras electroforesis y visualización con luz ultravioleta. Se utilizaron bandas de control interno. El tamaño del fragmento obtenido fue de 534 pb (pares de bases) (Figura 5). Figura 5: Fragmentos de 534 pb correspondientes al producto de amplificación del gen NAT2. (M) Marcador de 1000 pb. 1000 800 700 600 500 400 300 200 M 126 III.4.2.2. PCR genes GSTM1 y GSTT1: Amplificación del fragmento de ADN codificante de ambos locus GSTM1 y GSTT1 según metodología previamente descrita adaptada a las condiciones de nuestro laboratorio (49). Para la amplificación del GSTM1 se utilizaron los primers 5’-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3’ y 5’- TTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’ y para el GSTT1 los primers 5’- TTCCTTACTGGTCCTCACATCT-3’ y 5’-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3’. Las reacciones se realizaron con un volumen final de 25 µl con los reactivos que se muestran en las tablas 8 y 9. Las etapas de amplificación fueron idénticas en ambos casos. Tras una etapa inicial a 94º 5 min, se realizó una amplificación llevándose a cabo 30 ciclos a 94º 60 seg, 56º 60 seg, 72º 60 seg y por último una extensión a 72º durante 5 min. Los fragmentos amplificados se sometieron a una electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% con bromuro de etidio a 0,1 µg/ml y se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta. Los genotipos nulos del GSTM1 fueron detectados por la ausencia de producto de PCR (210 pb) en el gel de electroforesis realizada con control interno positivo y negativo. Igualmente los genotipos nulos del GSTT1 fueron detectados por la ausencia de producto de PCR (430 pb) con bandas de contol interno. Todas las muestras que presentaban bien GSTM1 nulo o bien, GSTT1 nulo fueron nuevamente amplificadas mediante una PCR conjunta en las mismas condiciones de amplificación (Figura 6). 127 Tabla 8: Cantidades de los reactivos PCR del GSTM1 Concentración Inicial Concentración final Tp10x 1x dNTPs (40mM) 800 µM PGSTM1F (10 µM) 10 pm PGSTM1R (10 µM) 10 pm MgCl2 (50 mM) 1,5 mM TAQ (5 U/µl) 0,5 U Agua c.s.p. 25 µl ADN (100 ng/µl) 100 ng Volumen final 25 µl Tabla 9: Cantidades de los reactivos PCR del GSTT1 Concentración Inicial Concentración final Tp10x 1x dNTPs (40mM) 800 µM PGSTT1F (10 µM) 10 pm PGSTT1R (10 µM) 10 pm MgCl2 (50 mM) 0,75 mM TAQ (5 U/µl) 0,5 U Agua c.s.p. 25 µl ADN (100 ng/µl) 100 ng Volumen final 25 µl 128 Figura 6: PCR conjunta GSTM1 y GSTT1. Los fragmentos de 430 pb se corresponden con la presencia de GSTT1 y los de 210 pb con la presencia de GSTM1. (C) Marcador de 1000 pb. III.4.2.3. PCR gen CYP2E1: Amplificación específica de la región del gen CYP2E1 en la que se localiza la sustitución de nucleótidos que define al alelo c2 o alelo *5 según metodología previamente descrita adaptada a las condiciones de nuestro laboratorio (240). Las secuencias de primers utilizados fueron 5’- TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3’ y 5’-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3’. Las concentraciones inicial y final de los reactivos de la PCR se describen en la tabla 10. El volumen final de las reacciones fue de 25 µl. Las etapas de amplificación se describen a continuación: etapa inicial a 94º 4 min y 30 ciclos de 94º 1 min, posteriormente amplificación a 53º 1 min 20 seg, 72º 1 min 30 seg y por último extensión a 72º durante 5 min. Los fragmentos (410 pb) se visualizaron con luz ultravioleta en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio a 0,1 µg/ml previa electroforesis (Figura 7). 1000 800 700 600 500 400 300 200 M 129 Tabla 10: Concentraciones de los reactivos PCR del CYP2E1. Concentración Inicial Concentración final Tp10x 1x dNTPs (40mM) 800 µM PCYP2E1F (10 µM) 10 pm PCYP2E1R (10 µM) 10 pm MgCl2 (50 mM) 1,5 mM TAQ (5 U/µl) 0,5 U Agua c.s.p. 25 µl ADN (100 ng/µl) 100 ng Volumen final 25 µl Figura 7: Fragmentos de 410 pb correspondientes al producto de amplificación del gen CYP2E1. (M) Marcador de 1000 pb. III.4.3. DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: TÉCNICA RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS). La técnica RFLP se basa en la digestión de una secuencia específica de ADN por enzimas de restricción, cuya principal característica es la especificidad de reconocimiento de una secuencia concreta de ADN llamada sitio de reconocimiento o diana de restricción y el consiguiente corte de ADN a ese 1000 800 700 600 500 400 300 200 M 130 nivel. Los fragmentos originados se pueden diferenciar según su tamaño en gel de agarosa mediante electroforesis dando lugar a un mapa de restricción que permite la diferenciación de polimorfismos. III.4.3.1. DIGESTIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DEL GEN NAT2. Para la diferenciación de los alelos resultantes de los genotipos lentos del gen NAT2 utilizamos 3 enzimas de restricción, de forma que cada uno de ellos identifica el polimorfismo correspondiente de cada alelo. Para la identificación del polimorfismo *5 utilizamos la enzima KpnI, para el polimorfismo *6 la enzima TaqI y para el polimorfismo *7 la enzima BamHI. Las digestiones fueron realizadas según metodología previamente descrita adaptada a las condiciones de nuestro laboratorio (140). Al igual que en otros estudios (37,39,43-46,49) la ausencia de dichos polimorfismos lentos fue interpretada como genotipo acetilador rápido. Digestión mediante KpnI: Digestión del producto de PCR específico sobre la diana de restricción 5’-GGTAC/C-3’ (diana de restricción de KpnI). El volumen inicial y final de los reactivos necesarios para la digestión se muestran en la tabla 11, cálculos llevados a cabo para un volumen final de 20 µl. Tras la realización de la mezcla se incubó a 37ºC durante 12 horas. Posteriormente se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio a 0,1 µg/ml y se visualizaron los fragmentos con luz ultravioleta. Se añadió un control interno negativo en cada digestión. La interpretación de los resultados según el tamaño de los fragmentos se muestra en la figura 8. 131 Tabla 11: Concentración inicial y final de los reactivos necesarios para la digestión por KpnI (para un volumen final de 20 µl). Concentración inicial Concentración final Enzima KpnI (10 U/µl) 0,25 U Tp 10x 1x BSA (10 mg/ml) 0,1 mg/ml Agua c.s.p. 20 µl PCR 3 µl Volumen final 20 µl Figura 8: Patrones de los fragmentos resultantes de la digestión del fragmento del gen NAT2 por por KpnI. (A), patrón normal, fragmentos de 442 y 72 pb; (B), alelo *5 en homocigosis, fragmento de 534 bp; (C), alelo *5 en heterocigosis, fragmentos de 534, 442 y 72 pb. (M), marcador de 500 pb Digestión por TaqI: La enzima TaqI actúa específicamente sobre la diana de restricción 5’- T/CGAS-3’. La digestión se llevó a cabo sobre el volumen final de la mezcla de los reactivos correspondientes (Tabla 12) y tras incubación a 65ºC durante 3 horas. Los fragmentos resultantes de la digestión (incluyendo control negativo) 500 pb 400 pb A B C C C C C C M