Estudio para la síntesis del ácido 3-amino-2- hidroxiciclohexanocarboxílico

Universidade de Santiago de Compostela Facultad de Química ‘Estudio para la síntesis del ácido 3-amino-2- hidroxiciclohexanocarboxílico' Trabajo de fin de grado Grado en química Curso 2014/2015 Florencia Riveiro Domínguez Santiago de Compostela, julio 2015 1 Departamento de Química Orgánica y Centro Singular de Investigacións en Química Biolóxica e Materiais Moleculares (CIQUS) D. JUAN GRANJA GUILLÁN, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD EN EL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y D. MANUEL AMORÍN LÓPEZ, CONTRATADO PROFESOR INTERINO (T3) EN EL DEPARTAMENTO DE QUIMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA. INFORMAN: que la memoria adjunta titulada “Estudio para la síntesis del ácido 3- amino-2-hidroxiciclohexanocarboxílico” que presenta Florencia Riveiro Domínguez para superar la asignatura Traballo de Fin de Grao, perteneciente al Grao en Química ha sido realizada bajo nuestra dirección en los laboratorios del Departamento de Química Orgánica en el CIQUS y autorizamos su presentación en la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente autorización en Santiago de Compostela a 10 de julio de 2015. Fdo: Prof. Juan Granja Guillán Fdo: Prof. Manuel Amorín López 2 Índice Abreviaturas. 3 1. Resumen (abstract). 4 2. Introducción. 5 2.1 Diseño de nanotubos ciclopeptídicos. 8 2.2 Estructuras nanotubulares constituidas por D,L-α-ciclopéptidos 10 2.3 Nanotubos basados en α,γ-ciclopéptidos. 14 2.4 Aplicaciones de los nanotubos peptídicos. 19 3. Materiales y técnicas experimentales. 22 4. Objetivos. 24 5. Resultados experimentales. 26 6. Discusión de los resultados experimentales. 29 7. Conclusiones 36 Anexo: Espectros de RMN 37 3 Abreviaturas δ Desplazamiento químico aa Aminoácido APTS Ácido p-toluensulfónico γ-Aca Ácidos 3-aminocicloalcanocarboxilico γ-Ach Ácido 3-aminociclohexanocarboxílico γ-Ahf Ácido 4-amino-3-hidroxitetrahidrofuran-2-carboxílico CP Ciclopéptido DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMAP N,N-4-dimetil-4-aminopiridina EDC 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida FT-IR Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier Gln Glutamina Glu Ácido glutámico HOBt 1-hidroxibenzotriazol Leu Leucina AMCPB Ácido meta-cloroperbenzoico MS (ESI) Espectrometría de masas: ionización mediante electrospray m/z Relación masa/carga RMN Resonancia Magnética Nuclear SAM Monocapa autoensamblada (de las siglas inglesas: Self-Assembled Monolayer). SCPNs Nanotubos peptídicos autoensamblados Trp Triptófano 4 1. Resumen (Abstract) The cyclic peptides formed by an even number of conformation α-amino acids of functions alternating quirality (D and L) are able to adopt a flat shape, so that the amide perpendicularity arranged to the plane of the peptide ring. Thus, hydrogen bonds between neighboring subunits allow the successive stacking of cyclic units leading the formation of nanotubes. The peptide nanotubes’ external surface can be modulated by the side chain of the amino acids used in the cyclic peptides. The incorporation of γamino acids to cyclopeptide permits the functionalization of the inner cavity of the tube, providing new properties such as the modulation of the lumen that might have applicative in the synthesis of selective ion channels. This functionalization in contrast with other systems i.e. carbon nanotubes, is at the moment impossible in other nanotube forming strategies. Hence, the first synthetic steps towards the construction of a new nanotube based on α,γ-cyclicpeptides is the synthesis of new γ-amino acid. In this project, we proposed the synthesis of (1R,2S,3S)-3-amino-2-hidroxiciclohexenocarboxílic acid derivatives. These γ-amino acids with hydroxyl groups in the beta position will be used for the formation of nanotubes in lipid membranes, to generate novel and more selection for channel models. 5 2. Introducción El estudio de materiales de tamaño nanométrico ha experimentado un gran incremento durante los últimos años. La nanociencia 1 ha emergido como un esfuerzo multidisciplinar donde las propiedades ópticas, magnéticas, eléctricas y mecánicas necesitan un perfecto entendimiento para crear una nueva generación de materiales funcionales con diferentes aplicaciones. La química ha sido un factor primordial en esta área. La obtención de estructuras se lleva a cabo mediante la formación y rotura de enlaces entre átomos o grupos de átomos. En el caso de la nanociencia, dicha unión se planteó mediante los procesos de autoensamblaje molecular 2 , donde unidades básicas se reconocen específicamente mediante interacciones de tipo no covalentes y reversibles (tales como fuerzas de Van der Waals, interacciones π-π, enlaces de hidrógeno, ión-dipolo, dipolo-dipolo, etc.) dando lugar a una superestructura, la más estable termodinámicamente. A pesar de que el proceso de ensamblaje es entrópicamente desfavorable, dado que se produce un aumento del ordenamiento molecular, el balance termodinámico es favorable, ya que la contribución entálpica del conjunto de las fuerzas débiles acaba teniendo relevancia por existir en un gran número. 3 A lo largo del tiempo se ha intensificado el desarrollo de nuevos métodos sintéticos capaces de generar nuevas nanoestructuras con formas (esferas, barriles, cables, cubos) y composiciones (orgánicas, metálicas, óxidos, semiconductores) variables. La creación de estructuras como los nanocristales, 4 nanohilos, 5 copolímeros de bloque 6 y nanotubos 7 trajeron consigo importantes aplicaciones en el campo de la medicina, la electrónica y la ciencia de materiales debido a su empleo en el transporte 1 G. M. Whitesides, Small 2005, 1, 172-179. 2 G. M. Whitesides, J. P. Mathias, C. T. Setho, Science 1991, 254, 1312−1319. 3 Special issue, Science 2002, 295, 2395-2421. 4 C. B. Murray, S. Sun, W. Gaschler, H. Doyle, T. A. Betley, C. R. Kagan, IBM J. Res. Dev. 2001, 45, 47- 56. 5 C. Quian, F. Kim, L. Ma, F. Tsui, P. Yang, J. Liu, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1195-1198. 6 M. Lazzari, M. A. López, Adv. Mater. 2003, 15, 1583-1594. 7 M. Terrones, W. K. Hsu, H. W. Kroto, D. R. M. Walton, Top. Curr. Chem. 1999, 199, 189-234. 6 de drogas/medicamentos, reconocimiento molecular, dispositivos ópticos y catálisis. 8 Cabe destacar el empleo de nanotubos como unidad fundamental, ya que, permitió desarrollar diversas aplicaciones relevantes en áreas tan diversas como inclusión y separación molecular, catálisis, electrónica, óptica, quimioterapia y transporte transmembranoso. 9 Por ello, se estudiaron numerosos nanotubos basados en zeolitas, 10 carbono grafito, 11 compuestos inorgánicos, 12 lípidos 13 y ciclodextrinas. 14 No obstante, uno de los hándicap encontrados fue la imposibilidad de generar un diámetro interno del nanotubo uniforme, que unido a la longitud del mismo conformaran dos características claves para el desarrollo de las aplicaciones. Hoy en día se sigue diseñando nuevas estrategias que permitan subsanar estas dificultades. Durante los últimos años se han desarrollado diversas técnicas para generar estructuras tubulares con la intención de imitar las cavidades cilíndricas presentes en la mayoría de canales biológicos naturales. Tomando como base la formación mediante enlaces no covalentes se han creado diversas estrategias. Las más relevantes son las que se muestran en la Figura 1 donde la primera técnica consiste en el plegamiento (o enrollamiento) de una molécula plana (lámina), lo cual permite el establecimiento de un canal (Figura 1a). Un segundo método consiste en el empleo de largas moléculas lineales que se pliegan sobre si mismas formando estructuras helicoidales con el interior hueco (Figura 1b). Otra alternativa utiliza moléculas rígidas con forma de listones que se agrupan alrededor de un orificio en el eje central (Figura 1c). Una cuarta estrategia consiste en la asociación de moléculas con forma sectorial que se unen en discos o rosetas y que, posteriormente se apilan dejando un canal en el interior (Figura 1d). Finalmente, la estrategia más reciente consiste en emplear moléculas cíclicas que se pueden apilar dando lugar a nanotubos (Figura 1e). 8 a) Rao, C. N. R.; Cheetham, A. K. J. Mater. Chem. 2001, 11, 2887-2894. b) Kenneth, K. Nanoscale Mater. Chem. 2001, 1-13. c) Capítulo especial: “Engineering a small word”. Science 1991, 254, 1300- 1335. 9 C. R. Martin, P. Kohli, Nature Reviews 2003, 2, 29−37. 10 J. Langley, J. Hulliger, Chem. Soc. Rev. 1999, 28, 279−291. 11 R. H. Baughman, A. A. Zakhidov, W. A. de Heer, Science 2002, 297, 787−792. 12 G. R. Patzke, F. Krumeich, R. Nesper, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2446−2462. 13 Q. S. Huo, D. I. Margolese, U. Ciesla, P. Feng, T. E. Gier, P. Sieger, R. Leon, P. M. Petroff, F. Schüth, G. D. Stucky, Nature 1994, 368, 317−321. 14 A. Harada, J. Li, M. Karachi, Nature 1993, 364, 516−518. 7 Figura 1. Estrategias para la autoorganización de componentes sencillos en forma de estructuras tubulares: a) Plegamiento de láminas. b) Plegamiento de moléculas lineales en forma de estructuras helicoidales que disponen de un canal central. c) Modelo tipo barril formado por el ensamblaje de moléculas rígidas. d) Asociación de moléculas con forma sectorial (cuña). e) Apilamiento de moléculas cíclicas. a) b) c) d) e) 8 2.1 Diseño de nanotubos ciclopeptídicos La formación de un nanotubo peptídico es posible gracias a un proceso de autoensamblaje de subunidades ciclopeptídicas (CPs), las cuales adoptan una conformación plana como la de un anillo, que se apilan por la formación de una extensa red de enlaces de hidrógeno entre los diferentes CPs. 15 Estos CPs están constituidos por un número par de aminoácidos de quiralidad alterna (D y L), lo cual les permite adoptar la conformación plana en la que los grupos amida (NH y CO) se encuentran perpendiculares al plano del anillo. Adoptando esta conformación las subunidades se pueden apilar de forma antiparalela o paralela, formando una estructura de lámina beta gracias a la complementariedad entre grupos dadores y receptores de enlaces de hidrógeno. A su vez, gracias a esta disposición plana de los CPs, todas las cadenas laterales de los aminoácidos divergen hacia fuera desde el centro del CP quedando orientadas hacia la superficie externa del cilindro, mientras que el interior queda vacío, lo que conduce a la formación de una estructura cilíndrica hueca. El número y tipo de aminoácidos utilizados en la formación del péptido cíclico permite el diseño de una variedad de nanotubos peptídicos con diversas propiedades y funciones. 16 Cabe destacar el control sobre el diámetro interno del nanotubo gracias al número de aminoácidos empleados en el diseño de los CPs y la variabilidad de las propiedades de la superficie externa del mismo en función del tipo de las cadenas laterales de dichos aminoácidos. Estas cadenas laterales son las responsables de proporcionar la solubilidad del nanotubo tanto en medio acuoso como en un medio lipídico, lo cual se logra variando el número de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos respectivamente en la estructura de los ciclopéptidos. La optimización adecuada del ciclopéptido y de las condiciones de autoensamblaje da lugar a estructuras con aplicaciones de gran interés en ciencia de materiales, medicina, electrónica, etc.16, 17 15 M. R. Ghadiri, J. R. Granja, R. A. Milligan, D. E. McRee, N. Khazanovich, Nature 1993, 366, 324-327. 16 R. J. Brea, C. Reiriz, J. R. Granja, Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 1448-1456 17 D. T. Bong, T. D. Clark, J. R. Granja, M. R. Ghadiri, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 988-1011. 15 carboxílico permitió preparar los primeros péptidos cuya cavidad interna estaba funcionalizada. 32 En estudios recientes, se demostró que los nanotubos formados por γ- Aca eran capaces de insertarse en membranas lipídicas y transportar iones sodio con mayor eficiencia que los iones potasio. 33 Figura 6. Representación de un nanotubo constituido por subunidades α,γciclopéptídicas. Como se puede observar, el metileno de la posición  (círculo azul) es susceptible de ser funcionalizado, por lo que sirve de base para modificar las propiedades internas de la estructura. En el diseño de estos α,γ-CPs es importante tener en cuenta las novedosas características de los nanotubos resultantes. Dado la presencia de dos tipos de residuos quirales diferentes (α-Aas y γ-Aas) existen dos caras no equivalentes. Cuando el péptido adopta la conformación plana necesaria para el autoensamblaje, los α-Aas disponen sus grupos amida (C=O y NH) orientados hacia el mismo lado del plano mientras que esos mismos grupos de los γ-Aas quedan orientados en sentido opuesto. De esta forma se denomina la cara α a aquella que presenta los grupos amida de los α-Aas y cara γ a la cara opuesta, donde se encuentran los grupos amida de los γ-Aas (Figura 7). Para que se dé la interacción de tipo lámina β antiparalela más favorable es preciso que las caras homólogas se enfrenten entre sí. Por tanto, los grupos amida de la cara α interaccionan con los α-Aas de la siguiente subunidad (interacción α-α). De la misma forma, los 32 C. Reiriz, M. Amorín, R. García, L. Castedo, J.R. Granja, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 4358-4361 33 R. García, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Sci. 2012, 3, 3280–3285. 16 grupos dadores y aceptores de la cara γ formarán enlaces de hidrógeno con la cara γ de la subunidad contigua (interacción γ-γ). Los primeros experimentos llevados a cabo para estudiar el autoensamblaje de α,γ-ciclopéptidos se realizaron con dímeros de ciclohexapéptidos en los que se alternan α-Aas y unidades del ácido 3-aminociclohexanocarboxílico (γ-Ach)28, 34 Para ello se prepararon dos modelos distintos de dímeros dependiendo de los residuos que están metilados. La utilización de α-Aas N-metilados permitía estudiar la formación de dímeros que interaccionan a través de sus caras γ (interacción γ-γ), mientras que ciclopéptidos que poseen γ-Aas N-metilados permiten estudiar la formación de dímeros basados en las interacciones a través de sus α-Aas (interacción α-α). Del estudio de la interacción γ-γ se obtuvieron los valores de Ka de alrededor de 102 M-1, los cuales eran similares a los obtenidos con D,L-α- ciclooctapéptidos. 35 Sin embargo, los valores obtenidos para la interacción a través de las caras α presentaban valores más elevados con un valor de la Ka de alrededor de 105 M-1. Un ejemplo destacado es el caso del ciclo-[(D-Phe-L-MeN-γ-Ach)3-] donde la confirmación de los dímeros se realizó mediante RMN, FT-IR y rayos-X. En su análisis se demostró que una molécula de cloroformo ocupaba la cavidad interna del dímero, confirmando el carácter hidrofóbico del interior de estos nanotubos. Adicionalmente, otros cristales obtenidos en otras condiciones de cristalización (CHCl3/MeOH) muestran la existencia de moléculas de agua en el interior de su cavidad, lo que sugiere que las propiedades de la cavidad tiene carácter anfipático más que hidrofóbico.34 34 M. Amorín, V. Villaverde, L. Castedo, J. R. Granja, J. Drug. Delivery Sci. Technol. 2005, 15, 87−92. 35 K. Kobayashi, J.R. Granja, M.R. Ghadiri, Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 95-98. 17 Figura 7. Nanotubos (izquierda; A) y dímeros (derecha; B y C) formados a partir de α,γ-CPs. El dímero de B se genera mediante interacciones a través de las caras γ (enlaces de hidrógeno de rojo), mientras que el de C establece las interacciones a través de las caras α (enlaces de hidrógeno de verde). La expansión del anillo hacia ciclooctapéptidos mostró resultados análogos a los anteriores, siendo la interacción α-α más fuerte que la γ-γ. 36 En cuanto a los ciclotetrapéptidos no se observó la presencia de dímeros para aquellos que interaccionan a través de sus caras γ, mientras que los diseñados por interacciones α-α mostraban constantes de asociación mucho menores cuya Ka tenían valores en torno a 50 M-1. 37 , 38 Tal como ya se contó otros trabajos realizados en el grupo permitieron construir dímeros con la cavidad funcionalizada gracias al diseño de CPs que poseen en su estructura un γ-Aa que posee el carbono C2 funcionalizado con un grupo OH.32 Alternativamente la utilización de derivados del ácido glucurónico permitió preparar CPs que tienen dos átomos de oxígeno orientados hacia el interior de la cavidad. 39 En el primer caso se preparó el ácido 4-amino-3-hidroxitetrahidrofuran-2-carboxílico (γ-Ahf) a partir de la D-Xilosa y se empleó en la síntesis del ciclotetrapéptido, c-[D-Leu-γ-Ahf- D-Tyr(Me)-MeN-γ-Acp-]. La introducción de dicho γ-Aa en la secuencia peptídica dio 36 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Eur. J. 2005, 11, 6543-6551. 37 M. Amorín, R.J. Brea, L. Castedo, J.R. Granja, Org. Lett. 2005, 7, 4681−4684. 38 R.J. Brea, M. J. Pérez, M. Panciera, M. Mosquera, L. Castedo, J.R. Granja, Chem Asian J., 2011,6, 110-121 39 A. Guerra, R.J. Brea, M. Amorín, L. Castedo, J.R. Granja, Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 8762-8766. 18 lugar a la formación de los correspondientes dímeros (Figura 8), en los que tanto las propiedades de las cavidades internas como la estructura dimérica son moduladas por los grupos hidroxilos de los γ-Ahfs. Es importante resaltar que la constante de asociación de este ciclotetrapéptido es superior a los estudiados con anterioridad (Ka = 1,2·104 M-1, CHCl3) debido a la participación de los grupos hidroxilo en la formación de enlaces de hidrógeno dentro del dímero. En el segundo caso, el γ-Aa con un oxígeno en lugar del carbono beta se preparó a partir de una modificación del ácido 1- aminoglucurónico, el cual exponía el oxígeno del hemiaminal a la cavidad interna, mientras que sus grupos hidroxilo se proyectan hacia el exterior del ciclopéptido, lo que le confería propiedades hidrofílicas.39 Estas funcionalizaciones ciclopeptídicas deben permitir la preparación de nanotubos con mayor selectividad como canales iónicos, catalizadores, receptores y contenedores moleculares.32 Figura 8. En la parte superior se ilustra un ciclopéptido donde los grupos hidroxilos adoptaban una disposición pseudo-ecuatorial quedando orientados hacia el interior de la cavidad. A la hora de establecerse la unión entre dos CPs, el equilibrio se desplazará hacia la formación del dímero en el que los dos grupos hidroxilo forman enlaces de hidrógeno intermolecular (Dímer 2). En la parte inferior de la figura se ilustra la formación de los correspondientes dímeros a partir de un CP con un oxígeno en la posición beta. 19 2.4 Aplicaciones de los ciclopéptidos Los ciclopéptidos formadores de nanotubos han encontrado aplicación en una variedad de áreas de la ciencia debido a su facilidad de síntesis y a su amplia gama de estructuras. Sus características y propiedades vienen determinados en función del tamaño, diámetro interno o de la diversa química que le proporcionan las cadenas laterales.15 Según sus cualidades, ha sido posible la utilización de estructuras supramoleculares en extensos campos de la química que van desde el diseño de fármacos hasta los nanomateriales, como su uso en sensores, 40 biomateriales, 41 dispositivos electrónicos, 42 canales transmembrana,24 antibióticos, 43 materiales fotosensibles, 44 inhibidores de β-amiloides, 45 o reparto de fármacos 46 entre otros. Una de aplicaciones más interesantes es la construcción de canales iónicos transmembranales artificiales tal como se comentó en el apartado 2.2 y 2.3.24,33 La proliferización de múltiples microorganismos resistentes a los antibióticos ha provocado la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos en los últimos años. Para ello se diseñaron CPs anfipáticos capaces de autoensamblarse y formar nanotubos en presencia de determinadas membranas lipídicas y provocar la muerte microbiana. 47 ,43 Por una parte, los CPs se autoensamblaban para formar un canal transmembranal a través de la superficie externa de la membrana que interrumpe su equilibrio quimiosmótico causando la muerte de la bacteria. Alternativamente, los CPs se pueden depositar paralelamente sobre las bicapas fosfolipídicas modificando las propiedades de permeabilidad de estas y causando de igual forma su muerte. Este último casos es 40 K. Motesharei, M. R. Ghadiri, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 11306-11312. 41 J. Couet, J. D. J. S. Samuel, A. Kopyshev, S. Santer, M. Biesalski, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3297-3301. 42 N. Ashkenasy, W. S. Horne, M. R. Ghadiri, Small 2006, 2, 99-102. 43 S. Fernández, H. S. Kim, E. C. Choi, M. Delgado, J. R. Granja, A. Khasanov, K. Kraehenbuehl, G. Long, D. A. Weinberger, K. M. Wilcoxen, M. R. Ghadiri, Nature 2001, 412, 452-455. 44 M. S. Vollmer, T. D. Clark, C. Steinem, M. R. Ghadiri, Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1598-1601. 45 M. Richman, S. Wilk, M. Chemerovski, S. K. Wärmländer, A. Wahlström, A. Gräslund, S. Rahimipour J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 3474–3484. 46 Y. Wang, S. Yi, L. Sun, Y. Huang, S. C. Lenaghan, M. Zhang, J. Biomed. Nanotechnol, 2014, 10, 383- 392. 47 V. Dartois, J. Sánchez-Quesada, E. Cabezas, E. Chi, C. Dubbelde, C. Duna, J. Granja, C. Gritzen, D. Weinberger, M. R. Ghadiri, T. R. Parr, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49, 3302-3310. 20 necesario utilizar CPs anfipáticos en los que las cadenas laterales hidrófobas se insertan en las membranas lipídicas, y los residuos hidrófilos quedan expuestos hacia los componentes hidrófilos de la membrana celular, lo cual proporciona selectividad entre diferentes tipos de membranas lipídicas (bacterias, hongos, mamíferos).43, 48 En este campo, cabe destacar la utilización de nanotubos ciclopeptídicos glico-conjugados que aportan una mayor selectividad frente a otro tipo de organismos. 49 Figura 9. Representación de los posibles mecanismos de acción de los nanotubos peptídicos antimicrobianos. En la parte izquierda de la imagen podemos ver la formación de un canal transportador mediante la asociación de varios ciclopéptidos, mientras que en la zona central podemos ver una aglomeración de varios nanotubos que forman un gran canal. En la parte derecha se muestra como los ciclopéptidos se disponen de forma horizontal a la bicapa lipídica causando una permeabilidad de la membrana, estructura conocida como tipo “alfombra”. Los CPs con predisposición para el autoensamblaje también se han utilizado como sensores de moléculas. Ghadiri y colaboradores desarrollaron sensores iónicos basándose en la capacidad de los D,L-α-ciclopéptidos para formar nanotubos sobre superficies de oro cubiertas de organosulfuros, comúnmente conocidas como SAMs (Figura 10), siendo estos capaces de reconocer complejos metálicos cianados en función de su tamaño.40 La aplicación de estos sensores puede ser incrementada variando el tipo de ciclopéptido empleado y el diámetro de nanotubo. 48 J. T. Fletcher, J. A. Finlay, M. E. Callow, J. A. Callow, M. R. Ghadiri, Chem.–Eur. J., 2007, 13, 4008- 4013. 49 L. Motiei, S. Rahimipour, D.A. Thayer, C.-H. Wong, M.R. Ghadiri, Chem. Commun. 2009, 3693-3695. 21 Figura 10. Esquema de un biosensor por la inclusión de nanotubos en organosurfactantes sobre superficies de oro, SAMs. Como conclusión, es importante evidenciar la utilidad de los nanotubos ciclopeptídicos para una gran variedad de funciones en ámbitos como la bioquímica o la ciencia de materiales. No obstante, sería un error no tener en cuenta que las posibilidades que ofrecen estas supramoléculas carecen de una exploración exhaustiva en la actualidad. 22 3. Materiales, Métodos y Técnicas experimentales Como norma general se han utilizado disolventes orgánicos de grado síntesis o HPLC (CH2Cl2, MeOH, Éter dietílico, Hexano, EtOH, 1,4-Dioxano y AcOEt) sin purificación adicional. Sin embargo, el CH2Cl2 en los casos que se indica se secó previamente mediante su destilación de hidruro de calcio (CaH2). El HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y EDC•HCl (1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) se adquirieron de las casas comerciales Novabiochem, Applied Biosystems, Aldrich, Global Sales Manager y GL Biochem (Shanghai) Ltd. El 3-Bromociclohexeno proviene de la casa comercial Acros y el (R)-(- )-feniletanol se compró a Fluka. El resto de reactivos comerciales: KCN, éter-corona 18-6, DMAP, APTS, m-CPBA, Acetato sódico trihidratado, NaOH, etc, se emplearon sin tratamiento previo. En el caso de reactivos sensibles al aire o a la humedad, se manejaron con jeringas adicionándose bajo una ligera presión de atmósfera inerte (argón). Para las cromatografías en capa fina se emplearon hojas de aluminio y gel de sílice Merk (tipo 69 F254). Como reveladores se utilizaron: luz ultravioleta (254 nm) y disoluciones reveladoras de Ce/Mo (200 mg de nitrato cérico amónico + 9.6 g de molibdato amónico + 11,2 mL H2SO4 + 200 mL de H2O) o de ácido fosfomolíbdico (3 g de ácido fosfomolíbdico + 100 ml EtOH) seguidas de calor. Las columnas cromatográficas se realizaron utilizando como soporte sólido gel de sílice E. Merck (tipo 60 SDS, 230,400 Mesh) y como eluyentes acetato de etilo y hexano en las proporciones especificadas en cada caso. Se utilizaron espectrómetros Bruker WM-250, Varian Mercury-300 o Bruker DRX-500 para obtener los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (1H- RMN) utilizando como disolvente CDCl3, donde se utilizó la señal del TMS (δ, 0,00 23 ppm) o del propio disolvente (δ, 7,26 ppm) como referencia. Los desplazamientos químicos están referidos a partes por millón (ppm, δ) y la multiplicidad de las señales se asigna como singlete (s), doblete (d), triplete (t) o cuadruplete (q) en base a su apariencia y, en los casos en los que no se observaban las multiplicidades con claridad, se designaron como multiplete (m) o ancho (br). Dichos espectrómetros también se utilizaron para obtener los espectros de resonancia magnética nuclear de carbono (13C- RMN), los cuales se asignaron mediante la realización de “Distortionless Enhancement by Polarization Transfer” (DEPT) obtenidos con un ángulo de 135º. Los desplazamientos químicos (δ) están referidos a ppm y el disolvente deuterado fue el mismo que se empleó para 1H-RMN. Los espectros de masas se realizaron en un espectrómetro Bruker Biotof II y los valores de m/z obtenidos se asignan en base a la abundancia relativa de los picos con respecto al pico que más absorbe seguidos del ion al que corresponden siguiendo la forma: m/z (%, asignación). 24 4. Objetivos El objetivo de este proyecto es la síntesis de γ-aminoácidos ciclohexénicos hidroxilados en la posición beta (Carbono: C2). En un futuro, estos γ-aminoácidos se utilizarán para la construcción de ciclopéptidos capaces de formar nanotubos peptídicos en membranas lipídicas, y transportadores iónicos y moléculas de forma selectiva gracias a los grupos funcionales (OH en nuestro caso) en la posición beta (de los γaminoácidos) que quedarán orientados hacia el interior del nanotubo (Figura 11). Figura 11. Estructura del ácido (1R,2S,3S)-3-amino-2-hidroxiciclohexenocarboxílico, que se pretende preparar para su empleo en la síntesis de ciclopéptidos con grupos OH orientados hacia la cavidad del nanotubo formado mediante un proceso de autoensamblaje molecular. Estos nanotubos deberían de ser capaces de insertarse en membranas lipídicas y generar canales. En concreto nos proponemos diseñar una estrategia sintética que permita preparar de forma eficiente el ácido (1R,2S,3S)-3-amino-2-hidroxiciclohexenocarboxílico adecuadamente protegido. La estrategia diseñada para la obtención de dicho aminoácido parte del 3-bromociclohexeno comercial que mediante su cianación (SN2) y posterior 31 Figura 16. Representación esquemática del mecanismo de la hidrolisis del compuesto 4 en medio ácido. Debido a las dificultades para obtener el ácido 6 a partir del compuesto cianado 4, decidimos obtener primeramente el éster metílico 5 como intermedio y posteriormente transformarlo en dicho ácido, tal como se indica en la bibliografía.50 El primer intento fue la hidrólisis con la disolución de HCl en MeOH. Sin embargo la reacción no transcurre, por lo que decidimos llevarla a cabo utilizando la disolución de HCl en éter etílico. Los bajos rendimientos obtenidos (inferiores al 6%) nos hizo seguir buscando otras alternativa, como la generación de HCl(g) en el medio de reacción. Para ello se añadió el tionilo sobre la disolución de 4 en metanol, aunque los resultados siguieron siendo infructuosos para llegar al producto de interés 5. 32 Figura 17. Representación del mecanismo en el intento de producir el éster metílico 5 mediante una esterificación en medio ácido con MeOH. Frente a las adversidades encontradas, se optó por seguir el procedimiento bibliográfico,50 por lo que se preparó el montaje que aparece en la figura 18 para la generación de HCl(g), que sustituyese la bala del mismo. El procedimiento consistió en hacer gotear H2SO4 sobre NaCl(s) para generar el gas, que se hace pasar hacia el balón de reacción (un balón de tres bocas, en el cual tenemos el compuesto 4 disuelto en metanol) a través de una goma con una pipeta en su extremo, cuyo extremo se sumergió en la disolución para lograr así el burbujeo del gas. Como precaución se conectó el balón a un frasco lavador vacío para evitar posibles descompensaciones de presión, seguido de otro con NaOH (10%) para neutralizar el posible HCl(g) en exceso. De esta forma, el burbujeo prolongado de HCl sobre una disolución de 4 en metanol durante una hora condujo al producto deseado en un 77% de rendimiento. 33 Figura 18. Montaje utilizado en la obtención del ciclohex-2-enocarboxilato de metilo (5) a partir del ciclohex-2-eno-1-carbonitrilo (4) sometido a un burbujeo continuo de HCl(g). El siguiente paso consistió en realizar una hidrólisis ácida del éster 5 que condujo al ácido deseado. La reacción se llevó a cabo mediante el calentamiento a reflujo de una disolución del éster 5 y el ácido paratoluensulfónico en una mezcla de dioxano agua, obteniéndose el ácido 6 en un 40% de rendimiento. Los dos protones olefínicos observados en el espectro de RMN entre 5 y 6 ppm confirmaban que no se produjo la isomerización del doble enlace. Figura 19. Secuencia sintética seguida para la obtención del compuesto (R)-1-feniletilo 7-oxabiciclo[4.1.0]heptano-2-carboxilato (8) a partir del ácido ciclohex-2-ene-1- carboxílico (6) previamente generado. Dado que el compuesto 6 no es enatiomericamente puro, se pensó en derivatizarlo con un alcohol quiral para lograr separar los correspondientes diasteroisómeros, y posiblemente mejorar la diasteroselectividad de la epoxidación gracias a la incorporación de un grupo con un mayor impedimento estérico (Figura 19 y 21). Así, para la formación del ciclohex-2-eno-1-carboxilato de (R)-1-feniletilo (7), se recurrió a la clásica estrategia de la doble activación de ácidos carboxílicos. Para ello, en primer lugar se utiliza una carbodiimida (en nuestro caso EDC) en presencia de HOBt y de una base voluminosa DMAP para formar el correspondiente éster activo. Este éster activo es reactivo frente a nucleófilos, por lo que la reacción con el (R)-(-)-1-feniletanol conduciría al producto deseado 7. El éster activo no es necesario aislarlo o purificarlo y ambas etapas se pueden realizar en el mismo medio de reacción. Así, el tratamiento de 6 con EDC y HOBt en presencia de un equivalente de DMAP en diclorometano condujo 34 al éster 7 en un 53% de rendimiento. Desafortunadamente, los correspondienrtes diasteroisómeros no eran separables mediante una cromatografia en gel de sílice. Figura 20. Representación del éster activo que se forma en el mecanismo de activación del grupo ácido 6 con EDC y HOBt. En este punto, decidimos seguir con la síntesis, por lo que realizamos la correspondiente epoxidación del compuesto 7. Dicha epoxidación se llevó a cabo por tratamiento con AMCPB. La presencia del grupo bencilo debe inducir a que el agente oxidante entre por la cara menos impedida. Figura 21. Ilustración del mecanismo de epoxidación del compuesto 7 mediante el uso de AMCPB. En esta estapa nos encontramos con dos agradables sorpresas, que los cuatros compuestos de la reacción eran seraparable mediante cromatografía de gel de sílicie, a los que denominamos 8a, 8b, 8c y 8d según la polaridad creciente. Estos compuestos se encuentran en una proporción del 5%, 41%, 37% y 17% siendo dos de ellos mayoritarios, que probablemente sean los dos enantiómeros anti (ver figura 24). 35 Figura 22. Esquema futuro para la apertura del epóxido. El plan de futuro de trabajo de nuestro grupo de investigación consiste en realizar una apertura de los epóxidos anti, que debería conducir a los dos enantiómeros 9. Posteriormente el tratamiento con hidrógeno de ambos enantiómeros conduciría a los ácidos 11. De todas formas nuestro objetivo sería, primeramente proceder a la síntesis del grupo hidroxilo por tratamiento con ClMOM para posteriormente realizar la hidrogenación que elimina el grupo bencilo y reduzca la ácida al grupo amina. La última etapa sería la protección de los grupos amino (con Fmoc o Boc) según el interés sintético, para obtener el ácido 12. Figura 23. Esquema futuro planteado para la obtención del compuesto deseado 13. 36 7. Conclusiones (Conclusions) After all the work that was conducted in the laboratory, we managed to obtain the following:  The quiral (R)-1-phenylethil cyclohex-2-ene-1-carboxylate esther (7) from the commercial compound 3-bromociclohexeno was obtained. To get this, we followed a four step synthetic pathway.  Once epoxidized 7 (AMCPB) four compounds was synthesized and separated by chromatography in its pure form 3 of the 4 estereoisomeros of (R)-1-phenylethil-7- oxabicyclo[4.1.0]heptane-2-carboxylate (10). Such compounds are attributed to the corresponding cis and trans enantiomers, respectively. The reaction proceeded with a yield of 80% and the relationship between the four compounds that we call 8a, 8b, 8c and 8d in the order of increasing polarity is: 5%, 41%, 37% and 17% (although this last one is impure and its contribution is even lower). Figure 24. Representation of the four possible estereoisomers of the compound (R)-1- phenylethil-7-oxabicyclo[4.1.0]heptane-2-carboxylate (10). (R)-1-phenylethil-(S)-cyclohex- 2-ene-1-carboxylate. (R)-1-phenylethil-(R)-cyclohex-2- ene-1-carboxylate. 37 8. Anexo Ciclohex-2-eno-1-carbonitrilo. 38 Ciclohex-2-enocarboxilato de metilo. 39 Ácido Ciclohex-2-eno-1-carboxílico. 40 Ciclohex-2-eno-1-carboxilato de (R)-1-feniletilo.