Desinfección con ozono de los conductos radiculares tratados endodóncicamente

Viviana Clelia Lüdi Etchevarren DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOXÍA. AVANCES CIENTÍFICOS E INICIACIÓN Á INVESTIGACIÓN EN ODONTOESTOMATOLOXÍA FACULTAD DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA. SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 TESIS DOCTORAL Desinfección con ozono de los conductos radiculares tratados endodóncicamente En primer lugar quiero agradecer a los directores de este trabajo, los profesores: Rafael Seoane Prado, José González Bahillo y Manuel Ruíz Piñón, por confiar en mí, sobre todo por tratarse de un tema tan controvertido como el ozono. A mi compañero del Departamento de Microbiología, Antonio Javier Pérez Estévez, que con su profesionalidad siempre estuvo presente incondicionalmente. A mi familia, porque a pesar del tiempo que llevo en la ardua tarea de realizar mi tesis doctoral nunca dejaron de creer en mí y alentarme. Al Dr. Juan Carlos Pérez Olmedo, por introducirme en el mundo de la ozonoterapia y colaborar en la investigación sobre el tema. Al Sr. D. Martín Benítez Najarro, Director general de GMB Ozone, quien colaboró con el equipamiento en pro de la ciencia, y en más de una oportunidad me socorrió para dilucidar alguna duda. A los profesores y compañeros de la Unidad de Patología y Terapéutica Dental II, de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela. A todos, mi más sincera gratitud, porque sin ellos esta tesis doctoral no hubiera sido posible. RESUMEN Este trabajo valora el efecto del ozono gas sobre células planctónicas y biopelículas maduras de E. faecalis, principal responsable de la persistencia de la infección periapical y el fracaso endodóncico. Se utilizaron dos equipos: uno de uso odontológico que proporciona una concentración máxima de ozono gas de 4 µg/mL, y otro de uso médico que consigue una concentración máxima de 80 µg/mL. Se utilizaron dos modelos experimentales. 1) Biopelículas de E. faecalis generadas experimentalmente en dientes extraídos. Se comparó la eficacia bactericida de ambos sistemas de generación, resultando el equipo médico más eficaz en la reducción de células viables tanto a 1, 7 y 14 días tras la aplicación del ozono. 2) Cultivos y biopelículas de E.faecalis generadas en microtubos de polipropileno. Nuestro novedoso modelo experimental simula las condiciones del tercio apical y elimina las variables concomitantes al uso de dientes (extensión de la infección y diferente acceso del ozono gas dependiente de la variabilidad anatómica de los conductos). El ozono gas se aplicó: I) sobre células planctónicas en medio de cultivo líquido, II) directamente sobre las biopelícula. El ozono (20mL) se aplicó mediante una aguja patentada diseñada para este uso durante 60 segundos y a una concentración 20 µg/mL. No hubo diferencias significativas entre la aplicación del ozono sobre células planctónicas con respecto al control. Por el contrario, sí hubo diferencias significativas entre las células recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente y las recuperadas de biopelículas control (reducción del 99,9%), así como, con las recuperadas de las biopelículas donde se ozonizó el medio de cultivo. Como control negativo de crecimiento se utilizó NaOCl (5,25% y 2,61%). La eficacia bactericida mostrada por el ozono gas, unido a sus efectos beneficiosos (antiinflamatorio, angiogénico) y a la ausencia de efectos adversos apoyan su uso como terapia complementaria en la desinfección de los conductos radiculares. PALABRAS CLAVE: Ozono, Endodoncia, Biopelícula, Enterococcus faecalis, Microtubos. RESUMO Este traballo valora o efecto do ozono gas sobre células planctónicas e biopelículas maduras de E. faecalis, principal responsable da persistencia da infección periapical e o fracaso endodóncico. Utilizáronse dous equipos: un de uso odontolóxico que proporciona unha concentración máxima de ozono gas de 4 µg/mL, e outro de uso médico que consegue unha concentración máxima de 80 µg/mL. Utilizaronse dous modelos experimentais. 1) Biopelículas de E. faecalis xeradas experimentalmente en dentes extraídos. Comparouse a eficacia bactericida de ambolos dous sistemas de xeración, resultando o equipo médico máis efectivo cunha maior redución de células viables tanto a 1, 7 e 14 días logo da aplicación do ozono gas. 2) Cultivos e biopelículas de E.faecalis xeradas en microtubos de polipropileno. O noso novo modelo experimental simula as condicións do terzo apical e elimina as variables concomitantes ao uso de dentes (extensión da infección e diferente acceso do ozono gas debido á variabilidade anatómica dos condutos radiculares). O ozono gas aplicouse: I) sobre células planctónicas no medio de cultivo líquido, II) directamente sobre as biopelícula. O ozono (20mL) aplicouse mediante unha agulla patentada e deseñada para este uso durante 60 segundos e a unha concentración 20 µg/mL. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 16 secretada por ellas mismas, que las protege tanto de la acción inmunológica del individuo como de los agentes antimicrobianos (5), (Fig. 1). Los avances de la microscopía electrónica permitieron que en la década de los 90 del siglo pasado se comenzara a entender realmente el modo en que las bacterias se organizaban en este tipo de comunidades. La importancia de estas estructuras reside en que no sólo protege a los microorganismos de la respuesta del huésped y de antibioterapias convencionales, sino que actúan como una especie de “superorganismo” con diferentes patrones de expresión genética y de actividad metabólica en diferentes regiones de la biopelícula así como una elevada frecuencia de intercambio de información genética. Además, la estructura de la matriz extracelular presenta canales para la circulación de nutrientes que permiten la existencia de microambientes muy variables (6). Por otra parte, estas bacterias en forma sésil parecen estar en una especie de estado latente y en un momento dado pueden desprenderse de la biopelícula como bacterias planctónicas, multiplicándose y dispersándose pudiendo provocar una nueva infección. Las biopelículas funcionarían entonces como un reservorio de bacterias “durmientes” protegidas que, tal vez por simple desprendimiento o como respuesta a algún estímulo del huésped, podrían reactivarse pasando a estado infeccioso. 1.2. Formación de las biopelículas. 1.2.1. Adherencia al sustrato y formación de microcolonias. Las bacterias se adhieren a la superficie en un proceso que engloba la expresión específica de determinados genes y, probablemente, la supresión de otros. Una vez adheridas empiezan a crecer formando pequeñas microcolonias que poco a poco se van uniendo de un modo no homogéneo favoreciendo así la aparición de huecos que serán los futuros canales internos de la biopelícula, este proceso se denomina coalescencia. Es en esta fase cuando parece iniciarse la transcripción de algunos genes implicados en la síntesis de la matriz externa. 1.2.2. Maduración de la biopelícula. Cuando se alcanza una densidad critica de bacterias una señal química dispara la expresión de todos los genes implicados en la producción de la matriz de exopolisacáridos en I. INTRODUCCIÓN 17 la cual quedarán integradas las bacterias, a través del fenómeno conocido como quorum sensing. 1.2.3. Liberación de las bacterias desde la biopelícula. La simple acción de fenómenos físicos o químicos en la superficie de la biopelícula puede permitir que algunos fragmentos de la misma se desprendan y puedan adherirse a otras zonas iniciando así la formación de una nueva biopelícula. Por otra parte, de la misma forma que en el proceso de maduración, algunas señales químicas podrían iniciar una cascada metabólica que finalice en la liberación de células planctónicas desde la biopelícula al exterior y, de este modo, multiplicarse y colonizar nuevas zonas. 1.3. Mecanismo de protección de las bacterias en la biopelícula. Como hemos mencionado anteriormente, los microorganismos que crecen formando biopelículas presentan una mayor resistencia que las células planctónicas a los diferentes agentes de control. De hecho, la CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a una bacteria en una biopelícula es unas 1000-1500 veces mayor que cuando la bacteria se encuentra en forma planctónica (6). Este fuerte aumento en la resistencia a antibióticos no puede ser explicado por los mecanismos de adquisición de resistencias convencionales. Así, cuando las bacterias se liberan de una biopelícula rápidamente se convierten en susceptibles a los antibióticos, lo que sugiere que la resistencia exhibida en las biopelículas no fue adquirida a través de mutaciones o transferencia genética. Existen tres teorías que explican este aumento de la resistencia: 1.3.1. Interferencia en la penetración de los antimicrobianos La presencia de una matriz extracelular, generalmente de naturaleza polisacarídica limita el acceso de los agentes de control a las bacterias que crecen en la parte interna de las biopelículas. Así, los anticuerpos sólo pueden bloquear a las bacterias plantónicas pero no a las que se encuentran en el interior de la biopelícula, del mismo modo, los fagocitos tampoco pueden acceder, de modo que su acción se ve limitada al exterior de la matriz, es más, en este caso, la liberación de enzimas fagocíticas puede resultar en un daño de los tejidos circundantes. Por otro lado, los agentes antimicrobianos pueden ser desactivados en la parte externa de la matriz o sufrir un retardo en la penetración, así, antibióticos con cargas positivas VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 18 podrían unirse a las moléculas cargadas negativamente existentes en la matriz (aminoglicósidos). 1.3.2. Modificaciones físico-químicas dentro de la biopelícula. La dificultad de difusión de las moléculas dentro de la biopelícula genera diferentes gradientes de concentración en la misma, así, acumulaciones de productos ácidos pueden llevar a diferencias de pH mayores de una unidad que podría resultar en la inactivación de determinados antibióticos. Por otro lado, la existencia de un microambiente alterado dentro de la biopelícula puede inducir un estrés osmótico en las bacterias, como consecuencia del cual la proporción de porinas se vería alterada con la consecuente reducción de la permeabilidad a antibióticos. Además, la acumulación o ausencia de algunos sustratos en el interior de la biopelícula hace que las bacterias entren en una fase de estasis o de latencia, no proliferativa, que las protege de la acción de muchos antibióticos que requieren que las bacterias se encuentren en estado proliferativo para ser efectivos (penicilinas). 1.3.3. Variabilidad fenotípica. Existencia de una fracción de bacterias dentro de la biopelícula que presenten un fenotipo resistente a los antibióticos. Como ya hemos mencionado el crecimiento en biopelículas permite la aparición de variaciones fenotípicas originadas por las diferencias microambientales y el quorum-sensing que pueden permitir la aparición de bacterias fenotípicamente resistentes, así, la adquisición de un fenotipo resistente en una pequeña población de bacterias dentro de una biopelícula no sería debida a la falta de nutrientes, sino más bien como una respuesta biológica al crecimiento sobre una superficie. Esto podría explicar que aunque la mayoría de las bacterias liberadas de una biopelícula son susceptibles a los antibióticos, en algunos casos, pequeñas poblaciones ( < 1%) presentan resistencia a los mismos. I. INTRODUCCIÓN 19 Fig. 1: Biopelículas de E. faecalis 2. MICROORGANISMOS IMPLICADOS EN EL FRACASO ENDODÓNCICO. En las infecciones endodóncicas primarias o en dientes no tratados por endodoncia con necrosis pulpar que presenten infección existe una microbiota mixta, compuesta principalmente por microorganismos anaerobios estrictos tanto Gram negativos como Gram positivos. Sin embargo, en los dientes con fracaso en el tratamiento endodóncico la microbiota encontrada es por el contrario mayoritariamente Gram positiva y facultativa, siendo E. faecalis la especie aislada con mayor frecuencia, llegando a alcanzar una prevalencia de alrededor del 70%. (2,7-10). Varias características de E. faecalis pueden estar relacionadas con su elevada prevalencia en el fracaso endodóncico. Su característica fundamental es que posee una elevada capacidad de supervivencia en condiciones de escasez de nutrientes como la presente en los conductos radiculares de dientes sometidos a tratamiento endodóncico. Otra característica relevante es su capacidad para sobrevivir en medios alcalinos (11-13), lo que le hace bastante resistente a uno de los agentes antimicrobianos más utilizados como medicamento intrarradicular, el Ca(OH)2 (14). De este modo, E. faecalis puede sobrevivir a los tratamientos a corto plazo como los irrigantes o soluciones de tratamiento y, cuando la acción de éstos finaliza, proliferar e infectar el conducto radicular (15). Finalmente, es capaz de formar biopelículas bajo condiciones de difícil crecimiento, lo que les confiere una elevada resistencia a la medicación intraconducto (17-22). 3. TRATAMIENTO ENDODÓNCICO VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 20 El objetivo de cualquier tratamiento de endodoncia es la erradicación completa de la infección así como garantizar la estructura del diente tratado. La acción mecánica de desbridamiento sólo elimina aproximadamente el 50% de las bacterias, ya que éstas pueden encontrarse en el entramado de conductos que conforman la compleja estructura interna del diente. Debido a ello se han propuesto una serie de aproximaciones y técnicas coadyuvantes con el fin último de eliminar la infección completamente antes de sellar el conducto. Entre ellas destacan: 3.1. Antibióticos En infecciones odontogénicas crónicas el uso de antibióticos sistémicos no es efectivo ya que estos dientes están asociados a pulpa sin vitalidad, con escaso o ningún aporte sanguíneo, por lo cual el antibiótico tomado oralmente no llega a alcanzar dentro del conducto radicular la concentración mínima inhibitoria para inhibir el crecimiento bacteriano (8). Como se comentó anteriormente, la concentración mínima inhibitoria de los antibióticos frente a las biopelículas es unas 1000-1500 veces mayor que la encontrada para las bacterias en forma planctónica, de este modo la terapia antibiótica simplemente invierte la gran variedad de síntomas causados por las células planctónicas liberadas de las biopelículas pero no es capaz de eliminar a éstas. Para alcanzar una concentración inhibitoria del antibiótico sobre las mismas habría que dar al paciente una dosis tan alta que no sería terapéutica (5). Una alternativa a la terapia sistémica con antibióticos es el uso de medicación antibiótica intraconducto, ya sea como suplemento o a través de la liberación desde vehículos impregnados de los mismos. La gran ventaja de este procedimiento es que no requiere absorción gástrica ni paso por el torrente sanguíneo para llegar al punto de infección, lo que minimiza los efectos secundarios de los antibióticos y concentra su actividad en la zona deseada. Un ejemplo de la adición de antibióticos a soluciones irrigantes es el MTAD, un irrigante que contiene ácido cítrico, tetraciclina y un agente surfactante como Tween-80 y que ha mostrado ser bastante efectivo frente a E. faecalis (23). En cuanto a la liberación de antimicrobianos desde vehículos impregnados con los mismos, es muy importante que la liberación de las sustancias activas sea lo suficientemente lenta para conseguir una concentración inhibitoria dentro del conducto continuada en el tiempo, así como que el I. INTRODUCCIÓN 21 vehículo sea fácilmente eliminable y biodegradable. Lima et al (24) estudiaron la eficacia frente a E. faecalis de geles que combinaban antibióticos con clorhexidina y agentes surfactantes. En su estudio, la acción de la clorhexidina era fundamental, ya que sólo las formulaciones que la contenían eran capaces de eliminar las biopelículas de E. faecalis. En un reciente estudio llevado a cabo en nuestro laboratorio se utilizaron esponjas biodegradables con una combinación de amoxicilina y clorhexidina, comprobando que la liberación de ambas sustancias alcanzaba una semana, más en el caso de la clorhexidina, y que era altamente eficaz en la eliminación de biopelículas de E. faecalis en dientes previamente infectados. 3.2. Hidróxido de Calcio El hidróxido de calcio es un polvo blanco que se obtiene por la calcinación del carbonato cálcico, CO3Ca = CaO + CO2CaO CO2CaO + H2O = Ca(OH)2. Posee un pH alcalino, aproximadamente de 11- 12, lo que lo convierte en un buen bactericida (14,25). Es el medicamento intraconducto más utilizado en los tratamientos endodóncicos por su eficacia contra la mayoría de los patógenos encontrados en las infecciones endodóncicas y por su biocompatibilidad (8). Habitualmente se utiliza como pasta mezclando el polvo con suero fisiológico o agua tratada, aunque también se utiliza en otros tipos de presentaciones. Por el contrario, tiene como inconveniente que es difícil retirarlo de las paredes de los conductos radiculares tratados por endodoncia, condición indispensable para una buena obturación y sellado (25) y, así, evitar el fracaso del tratamiento. 3.3. Hipoclorito de sodio (NaOCl) Es el irrigante más utilizado para la preparación químico-mecánica de los conductos radiculares. Normalmente las concentraciones utilizadas para el control bacteriano y la disolución tisular van del 2,5% al 6%, aunque existen estudios que muestran que una concentración del 3% ya resulta eficaz (24). De la misma manera, también se ha observado que existen poblaciones bacterianas que son sensibles a concentraciones del 0,5% (26). Como es bien conocido, el hipoclorito de sodio es un potente agente antibacteriano, probablemente el más eficaz hasta la fecha. Además posee la capacidad de producir la disolución tisular, de VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 22 eliminar el detrito creado y de lubricar los instrumentos durante la instrumentación mecánica del conducto (27). Es también desmineralizante, blanqueante y desodorante. Sin embargo, presenta diversos inconvenientes que aconsejan tener mucha precaución en su utilización ya que es tóxico a altas concentraciones, debilita la dentina causando la reducción de su resistencia a la flexión haciendo que el diente sea más susceptible a la deformación y fractura (28-29). De hecho, si llega a rebasar el periápice puede causar serios inconvenientes, accidentes tales como inflamación, dolor, edema, hemorragias, necrosis de los tejidos circundantes y descamaciones en las células orales (28, 29). Así, diferentes trabajos han observado la citotoxicidad de NaOCl al 5,25% sobre el tejido periapical, autores como Nagayoshi et al (30) han demostrado que incluso las concentraciones más bajas utilizadas en endodoncia producen fuertes daños celulares en líneas de fibroblastos de ratón L-929. Además, puede causar corrosión y deterioro del instrumental, incrementando el riesgo de fractura del mismo con el riesgo de que algunos pequeños fragmentos permanezcan en la cavidad, afectando a la conformación del sistema de conductos radiculares y dificultando la limpieza de los mismos (31-32). Finalmente los residuos sobrantes de la irrigación de los conductos radiculares durante el tratamiento que son aspirados por el equipo dental también producen corrosión en dicho equipo, y, en última instancia, estos residuos terminan contaminando las aguas residuales urbanas. 3.4. Clorhexidina Es una bisguanida catiónica con óptima actividad antimicrobiana en un rango de pH 5,5- 7,0. Su acción es de amplio espectro (bacterias Gram positivas, Gram negativas, hongos y levaduras) siendo bacteriostática a bajas concentraciones y bactericida a altas (Fig. 2). La acción antibacteriana se debe a la capacidad de la clorhexidina de romper las membranas citoplasmáticas de las bacterias. Posee ventajas clínicas que justifican su utilización en diferentes presentaciones: colutorio, gel, pasta de dientes etc. Las principales ventajas son: actividad antimicrobiana de amplio espectro, sustantividad y baja toxicidad. La sustantividad es la capacidad de un agente para unirse a diferentes localizaciones (la clorhexidina en los dientes se une a la I. INTRODUCCIÓN 23 hidroxiapatita) y liberarse lentamente en forma activa manteniendo los niveles eficaces durante más tiempo. La concentración más utilizada en soluciones irrigantes es del 2%. Aunque a concentraciones inferiores tiene un efecto in vitro similar al del NaOCl, los estudios in vivo demostraron una menor eficacia que el NaOCl. Esto podría explicarse por la capacidad de este último compuesto de disolver el material orgánico y así permitir un flujo más efectivo del irrigante. En estudios de actividad in vitro de diferentes combinaciones de antimicrobianos en forma de gel sobre biopelículas de E. faecalis, sólo las combinaciones que contenían clorhexidina al 2 % eran capaces de inactivar las biopelículas (24,33-36). Clegg et al (36) también observaron que cuando aplicaban clorhexidina al 2% durante 15 minutos sobre biopelículas de E. faecalis se inhibía completamente el crecimiento. Sin embargo, al observar a microscopía electrónica de barrido, las biopelículas, aunque inactivas, estaban prácticamente intactas debido probablemente al poder de fijación de la clorhexidina. De esta forma, esta porción residual orgánica de la biopelícula podría devenir como fuente de toxinas e interferir en el éxito de la obturación y, finalmente, del tratamiento. Fig. 2: Fórmula de la clorhexidina 3.5. EDTA VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 24 El ácido etilen-diamino-tetracético, también denominado con menor frecuencia AEDT, es una sustancia utilizada como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación octaédrica (Fig. 3). Resulta eficaz para eliminar el barrillo dentinario e incrementar la permeabilidad de la dentina (37), sin embargo, varios estudios donde se utilizó EDTA a diferentes concentraciones y tiempos de exposición han demostrado que no resulta eficaz para la eliminación de biopelículas y que su efectividad sobre bacterias plantónicas se produce a concentraciones mayores del 10%, o a tiempos de exposición superiores a 10 minutos (33). Normalmente el EDTA suele utilizarse conjuntamente con otras sustancias con poder bactericida en soluciones irrigantes (37). Fig. 3: Fórmula del EDTA 3.6. Soluciones irrigantes mixtas y/o modificadas En la actualidad existen en la literatura una gran variedad de soluciones irrigantes que combinan diferentes sustancias con propiedades antimicrobianas: combinaciones de quelantes, antisépticos y antibióticos, que aunque han demostrado ser más eficaces que las sustancias por separado y reducir el fracaso del tratamiento de endodoncia, no han resultado ser completamente eficaces (38). Otra aproximación ha sido introducir modificaciones en sustancias irrigantes clásicas como es el caso del Chlor-XTRA® (Vista Dental Products, Racine, WI), donde al NaOCl se añaden agentes humectantes, modificadores de superficie y alcalinizantes para aumentar la capacidad electrolítica, o como el CHX-PLUS®, donde a la clorhexidina se le han añadido agentes tensoactivos que disminuyen su viscosidad para así aumentar su capacidad de I. INTRODUCCIÓN 25 penetración y, consecuentemente, su eficacia (39). En este caso, al igual que las soluciones irrigantes mixtas antes mencionadas, aunque se ha observado una mayor efectividad, ésta no ha sido completa (36-37). 3.7. Otros métodos de desinfección 3.7.1. Sistema Endo Vac Es un sistema de irrigación de presión negativa apical que permite irrigar y evacuar la solución irrigante simultáneamente de la cámara y de los segmentos coronales, medios y apicales del conducto radicular (Fig. 4) (40-41). Nielsen et al (42) utilizando el sistema Endo Vac encontraron resultados significativamente mejores en el desbridamiento de la terminación apical del conducto radicular, comparados con los encontrados con la irrigación con aguja de presión positiva. Fig. 4: Endo Vac 3.7.2. RinsEndo Es un sistema de irrigación del conducto mediante el uso de tecnología de presiónsucción. Opera a una presión neumática de 45 Psi con una jeringa de 3,5 mL y una velocidad de riego de 6,2 mL/min. Consta fundamentalmente de una pieza de mano, una cánula de 7 mm de largo de salida única y una jeringa que lleva el irrigante (Fig. 5). Diversos trabajos han observado resultados prometedores en la limpieza del sistema de conductos radiculares tratados endodóncicamente con este sistema (41). VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 32 Aunque de poca relevancia en odontología, otra de las aplicaciones médicas del ozono es la denominada autohemoterapia. Es la forma de utilización del ozono más aplicada en medicina y actúa a nivel sistémico. Consiste en recoger la sangre en un frasco de vidrio con anticoagulantes y la medicación necesaria al que se añade el ozono (Fig. 11). La sangre humana expuesta a concentraciones de ozono adecuadas es capaz de “tamponar” sus fuertes propiedades oxidantes, sus efectos secundarios producidos por este tratamiento fueron estudiados en los pacientes tratados observando que la toxicidad era muy baja (53). En este caso, el mecanismo por el cual actúa el ozono es a través de la formación de dos tipos de especies derivadas de la oxidación: -Formación de peróxidos (ROS): actúan inmediatamente como segundos mensajeros activando proteína quinasas implicadas en cascadas metabólicas que finalmente activan la expresión génica (53). -Formación de productos de oxidación de lípidos (LOP): moléculas de larga vida que actúan fundamentalmente sobre células parenquimales. Estas moléculas ejercen un efecto neuroinmuno modulatorio (53). El resultado final de la acción de estos productos es el aumento en la actividad metabólica y de las funciones inmunes. Fig. 11: Autohemoterapia 3.8.2. Efecto Germicida del Ozono I. INTRODUCCIÓN 33 Aunque el ozono se utilizó por primera vez en medicina en el año 1870 por Landler, no fue hasta 1932 cuando E. Fisch trató con ozono una pulpitis gangrenosa, observando que se producía una asombrosa mejoría. Éste es probablemente el primer caso descrito de la capacidad antimicrobiana del ozono (55). Hoy en día sabemos que unos pocos segundos de aplicación del ozono son suficientes para detener las funciones vitales de las bacterias, siendo las Gram positivas más sensibles que las Gram negativas y las anaerobias más que las aerobias. En las infecciones virales la acción del ozono radica en la intolerancia de las células infectadas a los peróxidos generados por la reacción del ozono, la inactivación de la transcriptasa inversa y por la desintegración de la capa lipídica externa en virus con envoltura (55). El ozono tanto en la fase gaseosa como acuosa tiene un efecto microbicida mil veces más poderoso que otros agentes de destrucción bacteriana, es eficaz a concentraciones mucho más bajas que estos y, además, su acción es mucho más rápida. Con un tiempo de aplicación de 10 segundos mata al 99% de bacterias, hongos y virus, elevándose este porcentaje al 99,9% cuando el tiempo de aplicación se aumenta a 20 segundos (55). 3.8.2.1. Mecanismo de acción antimicrobiano del ozono La acción mediada por el ozono se debe a su alto poder oxidante sobre los compuestos orgánicos: provoca la peroxidación lipídica, rompe los dobles enlaces carbono-carbono presentes en los ácidos grasos insaturados destruyendo las paredes celulares y las membranas citoplasmáticas de las bacterias y hongos, de modo que se altera su permeabilidad con la consecuente pérdida de funciones (56-58, ,61-63). Una vez que la membrana ha sido dañada y la permeabilidad ha sido alterada, las moléculas de ozono pueden entrar fácilmente en las células provocando la oxidación de las proteínas y la pérdida de función de los orgánulos (64). Análisis por microscopía electrónica de Streptococcus mutans tratados con agua ozonizada mostraba huecos en la membrana de los mismos (58). Nagayoshi et al (58-59) utilizaron la técnica SYTOX Green dye para detectar cambios en la permeabilidad de la membrana de S. mutans tratado con agua ozonizada, observando que la acción bactericida del agua ozonizada ocurría a través del desorden estructural y funcional de la membrana citoplasmática. Por el contrario, a dosis terapéuticas VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 34 las células humanas no se ven afectadas por el ozono debido a la gran capacidad de óxidoreducción que poseen (55). La capacidad bactericida del ozono disuelto en un medio líquido es altamente dependiente de la concentración de ozono alcanzada en el mismo, así como, de la cantidad de materia orgánica presente en el medio, la temperatura y el pH (56-59 ,62 ,65). Uno de los factores clave es la temperatura del medio acuoso, así, la actividad microbicida del agua ozonizada disminuye con el aumento de temperatura, de modo que almacenar agua ozonizada a temperatura ambiente conlleva una considerable pérdida de actividad antibacteriana, 3.8.2.2. Dosis Terapéutica El ozono de grado médico, también conocido como ozono medicinal, es una mezcla de oxígeno médico (oxígeno puro) y ozono puro, en la proporción de 0,05% - 5% de O3 y 95% - 99,95% de O2 (53,55). Las dosis recomendadas consideradas terapéuticas son: 10-15 µg/mL como mínimo, y 80 µg/mL como máximo, dependiendo de la capacidad antioxidante del individuo y de acuerdo a la patología que se está tratando (53). En terapias sistémicas, normalmente se comienza con la dosis más baja y ésta se va incrementando paulatinamente (53,55). La repetición de dosis bajas activan enzimas como: superóxido dismutasa, catalasa, deshidrogenasa y glutatión peroxidasa, todas ellas parte del complejo sistema enzimático que protegen al organismo contra la acción de los radicales libres (53). Por otra parte, la exposición de un organismo a bajas concentraciones de un agente induce una adaptación y respuesta beneficiosa, mientras que a niveles altos resulta perjudicial. Se ha postulado que la oxidación de los lípidos, actuando como mensajeros a larga distancia (LOP), pueden transmitir a todos los órganos la información de un estrés oxidativo agudo. El concepto paradójico es que el ozono con el tiempo induce una respuesta antioxidante capaz de revertir un proceso oxidativo crónico (54). Debido a la inestabilidad de la molécula de ozono, cuando se va a utilizar para terapia médica debe generarse inmediatamente antes de su uso, debiéndose utilizar en menos de una hora ya que pasado ese tiempo se convierte en oxígeno, siendo muy difícil almacenarlo durante largos períodos de tiempo (53). Cuando el ozono se disuelve en agua, su conversión I. INTRODUCCIÓN 35 es prácticamente inmediata, sin embargo, cuando se disuelve en líquidos más viscosos como los aceites, la conversión se ve altamente retardada (53). 3.8.2.3. Toxicidad La inhalación de ozono puede ser tóxica para el sistema pulmonar, así como por contacto con los ojos ya que las células de los tejidos de estos órganos poseen muy bajo poder antioxidante. De todas formas, las complicaciones descritas por la aplicación de terapias con ozono son muy infrecuentes, en terapias sistémicas son inferiores al 0,001 %, siendo normalmente efectos secundarios tales como: lagrimeo, irritación de las vías respiratorias superiores, rinitis, tos, dolor de cabeza, náuseas ocasionales, vómitos, dificultad para respirar, inflamación de vasos sanguíneos, mala circulación, problemas de corazón y derrame cerebral (53). Siempre que se respeten las dosis y los tiempos de exposición al ozono su uso es completamente seguro tanto para el paciente como para el facultativo, de hecho, no aparece toxicidad en exposiciones de hasta 8 horas a concentraciones de ozono del 0,05 ppm (55). Nunca se han descrito casos de toxicidad aguda o crónica tras un tratamiento, por el contrario, los pacientes suelen describir una sensación de bienestar debido al efecto neuroinmuno modulatorio que ejerce el ozono (53,55). En el caso de intoxicación por ozono, el paciente debe ser colocado en posición supina y tratado con vitamina E y N-acetilcisteína (66). El tiosulfato de sodio reduce instantáneamente el ozono disuelto y lo inactiva (54). Debido al alto poder de oxidación del ozono, todos los materiales que entran en contacto con el gas deben ser resistentes al mismo, tales como vidrio, silicona y teflón. 3.8.3. Breve revisión del uso del ozono en odontología La terapia con ozono es un campo nuevo en continua expansión y la odontología no ha quedado al margen, aunque sus aplicaciones y resultados son muy controvertidos. Existe una gran cantidad de trabajos publicados en los últimos años donde se valora la eficacia del ozono tanto en su forma gaseosa como acuosa (agua ozonizada) sobre diferentes microorganismos orales, tanto en forma planctónica o como biopelícula. Las discrepancias antes referidas en sus conclusiones se deben casi con toda seguridad a que se han utilizado diferentes equipos generadores del ozono, a las diferentes concentraciones alcanzadas del mismo y a las VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 36 diferentes aproximaciones experimentales utilizadas. Brevemente repasaremos algunos de los trabajos y conclusiones más relevantes en nuestra opinión: Oizumi et al., 1998 (67). Compararon el efecto bactericida del ozono en fase acuosa o gaseosa sobre tres cepas distintas de microorganismos orales: S. mutans, S. aureus y C. albican. Como resultado de la aplicación de ozono gas, el número de células en las tres cepas disminuyó un logaritmo tras 1 minuto de aplicación, cuando se aplicó el ozono gas durante 3 minutos las células viables encontradas estaban por debajo del límite de detección. La exposición directa al ozono gas poseía una mayor eficacia microbicida en comparación con la obtenida al tratar las mismas cepas y en las mismas condiciones con agua ozonizada. Así, el ozono en forma gaseoso podría ser clínicamente útil para la desinfección. Murakami et al., 2002 (68). Examinaron el efecto de un limpiador de prótesis que utiliza ozono a una concentración de 10 ppm sobre S. aureus meticilin-resistente y fago T1. En ambos casos se describió una eficacia similar. Nagayoshi et al. 2004 (58). Estudiaron la efectividad del agua ozonizada sobre los microorganismos presentes en la flora oral, encontrando que el agua ozonizada (0,5-4 mg/L) era muy efectiva tanto sobre los Gram-positivos como frente a los Gram-negativos. Así, P. endodontalis y P. gingivalis resultaron más sensibles al agua ozonizada que estreptococos orales y C. albicans. También observaron que mayor tiempo de exposición rendía una mayor eficacia bactericida del agua ozonizada. Además, observaron que el agua ozonizada mostraba una completa actividad antibacteriana frente a las biopelículas presentes en la placa dental humana. Asimismo, el agua ozonizada mostraba una fuerte inhibición de la formación de biopelículas in vitro. En otro estudio publicado el mismo año (59) comparan la efectividad del agua ozonizada con y sin adición de ultrasonidos, sobre E. faecalis y S. mutans en la dentina de incisivos bovinos recién extraídos. El número de UFC de ambos gérmenes se reducía significativamente cuando se trataban con agua ozonizada sin ultrasonidos, siendo esta reducción en el número de UFC muchísimo mayor cuando además al agua ozonizada se le aplicaban ultrasonidos. Arita et al. 2005 (69). Examinaron la eficacia del agua ozonizada (2-4 mg /L) durante 1 min sobre prótesis dentales acrílicas infectadas con Candida albicans. Observaron una total erradicación de las células viables de C. albicans cuando se exponían al agua I. INTRODUCCIÓN 37 ozonizada. La aplicación simultánea de ultrasonidos conducía a una disminución en la adhesión de C. albicans al material acrílico. Los autores concluyen que la aplicación de agua ozonizada puede ser útil en la reducción de la cantidad de C. albicans en las bases de las prótesis de acrílico Hems et al., 2005 (62) Trabajaron con E. faecalis tanto en forma planctónica como organizados en biopelículas para evaluar el potencial del ozono como agente antibacteriano, utilizando el ozono tanto en forma gaseosa a un flujo de 5,8 cm3s-1, como en forma acuosa a una concentración de 0,68 mg/L. El ozono en solución era eficaz frente a células planctónicas a los 240 segundos de aplicación, sin embargo, no era eficaz contra las células de E. faecalis en las biopelículas, a menos que fueran previamente dispersadas de las biopelículas por agitación. El ozono como gas no presentaba poder bactericida significativo en ninguno de los casos estudiados: planctónico o biopelícula. Estrela et al. 2006 (70). Realizaron la evaluación del potencial antimicrobiano del ozono sobre Staphylococcus aureus cuando era aplicado a tres soluciones diferentes en un sistema de limpieza ultrasónico. En todos los casos se encontró una fuerte actividad antibacteriana frente a S. aureus. Polydorou et al., 2006 (71). Estudiaron la posible actividad bactericida del ozono sobre modelos in vitro de cavidades infectadas con S. mutans a distintos tiempos de aplicación, 40 seg. y 80 seg. Encontraron que ambos tiempos reducían significativamente el número de S. mutans en comparación con el grupo control, sin embargo la exposición más prolongada al ozono presentaba un mayor efecto bactericida sobre los microorganismos dentro de los túbulos de la dentina en las cavidades. Müller P et al. 2007 (72). Realizaron un estudio in vitro para evaluar el potencial antimicrobiano del ozono gas frente a biopelículas maduras de seis especies diferentes de microorganismos cariogénicos. En su estudio se compara la aplicación del ozono durante 60 segundos y la terapia fotodinámica (PDT) frente a tratamientos estándar con clorhexidina (0,2%, 2%) o hipoclorito de sodio (0,5%, 5%). Encontraron que el ozono en forma de gas y la técnica PDT tienen un mínimo efecto bactericida en las biopelículas de los microorganismos cariogénicos (<1 log) Solamente el hipoclorito al 5% fue capaz de erradicar los microorganismos en las biopelículas. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 38 Estrela et al., 2007 (73). Compararon la eficacia bactericida de diferentes desinfectantes en conductos radiculares de dientes humanos infectados con E. faecali: agua ozonizada, ozono gaseoso, NaOCl al 2,5% y clorhexidina al 2%. Los irrigantes se utilizaron a un flujo constante de 50 mL/mindurante 20 min. El ozono gaseoso se aplicó durante 20 minutos. En ningún caso, ni los irrigantes ni el ozono gas fueron suficientes para matar a E. faecalis. Anca Virtej et al. 2007 (23). Estudiaron y compararon el efecto de diferentes antimicrobianos y sistemas sobre microorganismos orales. En las conclusiones de su trabajo se destaca que no existen diferencias significativas entre la capacidad bactericida del NaOCl 3%, el MTAD y el ozono gas (producido por el equipo HealOzone®) sobre las infecciones bacterianas mixtas existentes en los conductos radiculares. Existen más estudios recientes sobre el efecto bactericida del ozono que vamos a discutir y detallar de forma más pormenorizada a lo largo de este trabajo, por eso no los incluimos en esta pequeña relación, que aunque podría ser mucho más extensa, solamente pretende hacer una reseña a la situación actual de la utilización del ozono en odontología. II. OBJETIVOS 39 OBJETIVOS VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 40 II. OBJETIVOS 41 II. OBJETIVOS Con el presente trabajo de investigación pretendemos demostrar la utilidad del ozono como coadyuvante en la desinfección de los conductos radiculares tratados por endodoncia. Para ello nos planteamos dos objetivos concretos. 1º - Valorar la eficacia del ozono gas cuando se aplica sobre dientes humanos extraídos y posteriormente infectados con Enterococcus faecalis ATCC 29212. Comparar la eficacia de dos equipos generadores de ozono gas: Prozone® (Proz) vs Medozon Compact® (GMB). 2º -Valorar la eficacia del ozono, tanto en forma gaseosa como disuelto en medio líquido, sobre células planctónicas y biopelículas maduras de E. faecalis generados en laboratorio en microtubos de polipropileno. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 48 Fig. 12: A: Diente preparado en la base de silicona, B: Bases esterilizadas, C: muestra total. 1.4.2. Inoculación de los conductos radiculares con E. faecalis La cepa ATCC 29212 de Enterecoccus faecalis se obtuvo de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), se cultivó aeróbicamente 18 h a 37º C en Brain-Heart Infusion (BHI) (Difco, Becton Dickinson, Sparks, Maryland, USA) y se ajustó a 0,5 unidades Mc Farland (Fig. 13). Alícuotas de 20 µL procedentes del cultivo anteriormente descrito fueron inoculadas en el interior del conducto radicular. Inmediatamente se procedió al sellado coronal del conducto con una bolita de algodón previamente esterilizado y cemento provisional. Como control negativo se utilizaron dientes inoculados con 20 µl de medio estéril. Una vez sellados, los dientes se sumergieron en tubos Falcon con 5mL de caldo Brain-Heart y se incubaron a 37ºC durante 21 días con agitación suave. El medio fue reemplazado cada 3 días. A B C III. MATERIAL Y MÉTODO 49 Fig. 13: Tubos Falcon con los dientes inoculados con E. faecalis. 1.5. Procesamiento de los dientes inoculados Antes de manipular los dientes se procedió a desinfectar la superficie externa de los mismos con una toallita de clorhexidina durante 3 minutos, sumergiéndolos a continuación en agua destilada estéril otros 2 minutos (Fig. 14). Finalmente, los dientes inoculados y listos para la experimentación fueron divididos en tres grupos al azar. Fig. 14: Tubos Falcon con los dientes infectados sumergidos en agua destilada 1.6. Análisis de infección previa de los dientes 1.6.1. Infección experimental En primer lugar se procedió a comprobar la infección de los dientes tras los 21 días de incubación. Para ello, se eliminó la obturación provisional (Fig. 15) y se tomaron 2 muestras: una con puntas de papel estéril y la otra con lima K 15-21 que se introdujeron en 5 mL de caldo BHI estéril y se incubaron a 37ºC. La infección fue confirmada por turbidimetría a las 16 h. (Fig. 16). Seguidamente a la toma de muestras con las puntas para confirmar la VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 50 infección previa, se procedió a aplicar el ozono gas. Esto se realizó en todos los dientes salvo en los controles positivos y negativos a los que solamente se tomó las muestras de comprobación de la infección. En el conjunto de la experimentación se realizaron tres ensayos independientes constando cada uno de 20 dientes inoculados e incubados durante 21 días. Aunque se procedió a aplicar el ozono gas como a todos los dientes como se describió anteriormente, sólo se tuvieron en cuenta para el estudio aquellos dientes que dieron crecimiento positivo de infección previa. En nuestro diseño experimental, la aplicación del ozono gas inmediatamente después a la toma de muestra de infección previa, se debe al hecho de que la confirmación de la infección por turbidimetría es sólo posible tras incubación durante 16 horas. Los dientes que presentaban infección fueron divididos en dos grupos (n=20, para cada grupo). A cada grupo se le aplicó el ozono generado por el equipo correspondiente. Cada grupo, una vez aplicado el ozono gas, fue a su vez subdividido en tres subgrupos atendiendo al tiempo transcurrido desde la ozonización hasta su procesado para comprobar la presencia o ausencia de infección. Subgrupo 1D: Se determinó el crecimiento microbiano tras un día de incubación después de la aplicación del ozono. Subgrupo 7D. Se determinó el crecimiento microbiano tras 7 días de incubación después de la aplicación del ozono. Subgrupo 14D: Se determinó el crecimiento microbiano tras 14 días de incubación después de la aplicación del ozono. Del total de muestras analizadas dieron crecimiento previo de infección: 40 dientes y 5 controles positivos. En ningún caso se observó infección en los controles negativos. III. MATERIAL Y MÉTODO 51 Fig. 15: Eliminación de la obturación provisional Fig. 16: Equipo de medición de turbidimetría 1.6.2. Aplicación del ozono gas a los conductos radiculares En todos los casos se aplicaron 20 mL de ozono gas a una concentración de 20 µg/mL durante 1 minuto (velocidad de flujo de 0,33 cm3 s). La concentración utilizada es la recomendada con capacidad terapéutica (53). El ozono gas fue generado a partir de dos aparatos: 1) con una máquina de uso médico humano, Medozon Compact® que genera ozono a partir de oxígeno médico y 2) con un equipo odontológico Prozone® W&H, que genera el ozono a partir del oxígeno del medio ambiente. La diferencia entre ambos equipos es que la concentración de ozono obtenida con el aparato Medozon Compact® es muy superior ya que VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 52 el oxígeno médico precursor del ozono se haya en mucho mayor concentración que el oxígeno precursor que se encuentra en el medio ambiente que utiliza el equipo odontológico de Prozone®. Para la aplicación del ozono gas en los conductos se utilizaron dos tipos diferentes de aguja según el aparato generador de ozono utilizado. En el caso del Herrmann Compact®, se utilizó una aguja microperforada (74) que aprovecha al máximo las capacidades físico químicas del ozono; por el contrario, en el caso del equipo odontológico Prozone® se utilizó la aguja con salida apical única que ya viene incluida en el aparato (Fig. 17, 18). Fig. 17: Equipo de ozonoterapia: A; odontológico, Prozone®, utiliza el aire del medio ambiente. B; médico, Herrmann®, utiliza oxígeno medicinal. Fig. 18: Diente en su base recibiendo el tratamiento de ozono: A: con jeringa, O3 medicinal, equipo Medozon Compact®. B: O3 con oxígeno proveniente del medio ambiente, equipo odontológico Prozone®. Una vez aplicado el ozono gas en los conductos, se procedió a una nueva obturación de los mismos como se describió anteriormente, es decir, se puso una bolita de algodón estéril y se selló con cemento provisional. A continuación, los dientes tratados y sellados, fueron incubados en 5 ml de BHI a 37ºC a tres tiempos diferentes: 1 día; 7 días; 14 días (Fig. 19). B A A B III. MATERIAL Y MÉTODO 53 Fig. 19: Muestra en los tubos Falcon en la incubadora 1.6.3. Procesamiento de los dientes después de aplicar el ozono Al alcanzar el tiempo correspondiente de incubación de cada grupo antes descrito: 1 día, 7 días y 14 días; se procedió a su procesamiento para comprobar la presencia/ausencia de infección. En todos los casos y a todos los tiempos se hizo de la siguiente manera: se tomaron dos muestras con puntas de papel, una inmediatamente después de la eliminación de la obturación provisional, y la otra después del rascado del conducto con una lima K15-21 (Fig.20). Las puntas con la muestra recogida fueron incubadas en 5 mL de caldo BHI a 37ºC durante 16 h. Tras la incubación la presencia/ausencia de crecimiento bacteriano fue confirmada por turbidimetría. Fig. 20: Procesamiento de los dientes, A: Punta de papel, B: Lima K15-21. A B VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 54 2. APLICACIÓN DE OZONO GAS SOBRE E. FAECALIS TANTO EN FORMA PLANCTÓNICA COMO BIOPELÍCULAS CRECIDOS EN MICROTUBOS DE POLIPROPILENO. 2.1. Obtención de las biopelículas La cepa de E. faecalis se obtuvo y cultivó de la misma manera que la descrita para la inoculación de los conductos radiculares procedentes de dientes humanos: E. faecalis crecidos aeróbicamente en caldo BHI a 37 ºC durante 18 h y ajustado a 0,5 unidades McFarland. El ensayo se realizó en microtubos de polipropileno de 0,25 mL y las biopelículas fueron inducidas de acuerdo al método descrito por otros autores con alguna modificación en el protocolo (75). Brevemente, alícuotas (50 µL) procedentes del cultivo de E. faecalis como antes descrito (1,5 x 108 UFC/mL) fueron incubadas en los microtubos (Deltalab®, España) durante 5 días a 37ºC sin agitación. Cada día se retiraron 30 µL del cultivo y se añadieron otros 30 µL de medio fresco BHI (Fig. 21). Fig. 21: Cultivo en la campana de Flujo Laminar Transcurridos los 5 días se procedió a subdividir los cultivos en tres grupos experimentales (n=10 para cada grupo) para realizar los ensayos correspondientes III. MATERIAL Y MÉTODO 55 2.2. Grupos experimentales Grupo 1: Sin ozonizar En primer lugar, se tomó un alícuota (10µL) del sobrenadante para el contaje de células plantónicas. Posteriormente, el sobrenadante se retiró cuidadosamente y los tubos se lavaron 4 veces con 200 µL de BHI para desechar las células no adherentes. Se tomaron alícuotas (10 µL) de cada lavado y se procedió al contaje de las células viables, comprobando que las células viables presentes en el último lavado eran muy inferiores a las encontradas posteriormente al procesar las biopelículas generadas (datos no mostrados). Tras el último lavado, se añadieron 50 µL de medio BHI al microtubo y se agitaron en un vortex vigorosamente durante 60 segundos para despegar y dispersar las células de las biopelículas. Inmediatamente se procedió al contaje de células viables Grupo 2: Cultivos tratados. Se aplicó ozono gas (20mL) a una concentración de 20 µg/mL durante 60 seg. en el cultivo con la aguja microperforada. Se tomó una alícuota (10 µL) del cultivo ozonizado y se procedió al contaje de las células viables procedentes de las células planctónicas. Entonces se procedió de la misma forma que para el grupo 1, se retiró el sobrenadante cuidadosamente, se lavó 4 veces, se añadieron 50 µL de medio BHI, se agitó en un vortex vigorosamente durante 60 seg. y se procedió al contaje de células viables (biopelículas). Paralelamente, se realizó un tratamiento con NaOCl como agente antibacteriano de referencia usado en endodoncia. Se añadieron 50 µL de NaOCl al 5,25 % al cultivo, alcanzando una concentración final de NaOCl de 2,61 % y se dejó actuar 60 seg. después de lo cual se tomaron 10 µL para realizar el contaje de las células plantónicas viables. Posteriormente se procedió de la misma forma que en el ensayo anterior donde se aplicó el ozono. Esto es, se retiró el sobrenadante y se lavó 4 veces con medio BHI para eliminar la concentración residual de NaOCl. Finalmente, se añadieron 50 µL de BHI, se agitó con vortex durante 60 seg. y se procedió al contaje de las células viables procedentes de las biopelículas. Grupo 3: Biopelículas tratadas directamente. Se procedió de forma similar a la descrita para el grupo 1 hasta retirar el último lavado, tras el cual con la aguja microperforada se aplicaron directamente sobre las biopelículas 20 mL de ozono gas a una concentración de 20 µg/mL durante 60 seg. A continuación, las biopelículas se procesaron y se contaron las células viables de la misma forma que para los grupos anteriores. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 56 De la misma forma que en el grupo anterior, se realizó un tratamiento con NaOCl al 5,25% como control. Así, una vez retirado el último lavado, se añadieron directamente sobre las biopelículas 50 µL de NaOCl al 5,25 % y se dejó actuar durante 60 seg. Transcurrido este tiempo, se lavó 4 veces con medio BHI y, finalmente, se añadieron 50 µL de medio BHI y se agitó vigorosamente con vortex durante 60 seg. Inmediatamente se procedió al contaje de las células viables procedentes de las biopelículas. 2.3. Contaje de colonias Las alícuotas (10 µL en células plantónicas y 50 µL en biopelículas procesadas), se llevaron a 3 mL de medio BHI, se diluyeron serialmente (Fig. 22) y se pipetearan 50 µL sobre placas de Mueller-Hinton Agar; se incubaron durante 48 h a 37ºC en condiciones aeróbicas y se procedió al contaje de las UFC. Fig. 22: Dilución seriada de biopelículas de E. faecalis procesadas con NaOCl 5,25% y 2,61%. III. MATERIAL Y MÉTODO 57 Fig. 23: Cultivo en placas de Mueller-Hinton La identidad de las colonias fue confirmada por estudio de la morfología de la colonia y tinción Gram. 2.4. Aparatología Para la aplicación del ozono se utilizaron dos equipos diferentes: (a) Medozon Compact® (GMB): Utiliza oxígeno medicinal, obteniendo para su uso una concentración de ozono de 20 µg/mL. Se aplicaron 20 mL durante 60 segundos. Para la aplicación en los conductos de los dientes se utilizó la aguja microperforada de salida múltiple. (b) Prozone® (PROZ): Utiliza oxígeno procedente del medio ambiente, obteniendo para su uso una concentración de ozono de 4 µg/mL. Se aplicó de acuerdo a las indicaciones del fabricante durante 60 segundos. Para la aplicación del ozono se utilizó una aguja convencional de salida única apical. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 64 UFC PL C+ UFC BP C+ UFC PL en BHI ozonizado UFC BP en BHI ozonizado UFC BP ozoniz 8.75 6.85 7.3 6.91 1 8.49 6.29 8.6 6.9 2.56 8.03 6.83 8.74 6.45 2.38 8.73 6.49 8.61 6.37 2.69 8.76 8.16 6.71 1 8.79 6.71 2.08 8.75 3.3 8.65 4.21 8.68 1 8.73 4.94 8.64 6.62 8.28 6.67 2.51 0.23 0.27 0.59 O,22 1.35 Tabla: 2 Efecto sobre células planctónicas y biopelículas de E. faecalis. UFC PL C+. células planctónicas recuperadas de los cultivos sin ozonizar (control positivo). UFC BP C+ células recuperadas de las biopelículas procedentes de los cultivos sin ozonizar (control positivo).UFC PL en BHI ozonizado células planctónicas recuperadas del cultivo tras la ozonización del medio de cultivo. UFC BP en BHI ozonizado células recuperadas de las biopelículas procedentes del cultivo tras la ozonización del medio de cultivo. UFC BP ozoniz células recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente, previamente retirado el medio de cultivo. 2.1. Efecto del ozono sobre células planctónicas de E. faecalis. No se observó una diferencia significativa entre las células viables procedentes de los cultivos ozonizados y no ozonizados. (A vs B p > 0,05, Fig. 25). Sin embargo, existía una reducción del 36% del número de colonias totales del medio tratado con ozono gas frente al control positivo sin ozonizar. Contrariamente, no se recuperaron células viables de los cultivos control tratados con NaOCl al 2,61 %, apareciendo una diferencia significativa entre las células planctónicas recuperadas de éstos y las recuperadas de los cultivos no tratados (control positivo) y las recuperadas de los cultivos ozonizados (A vs C p < 0,01; B vs C p < 0,01, Fig. 25). IV. RESULTADOS 65 Fig. 25: Número de UFC procedentes de la fase planctónica de los cultivos de E. faecalis. A: sin ozonizar (control positivo), B: cultivo ozonizado, C: Cultivo tratado con NaOCl 2,61% 2.2. Efecto del ozono gas sobre biopelículas de E. faecalis No se observó una diferencia significativa entre las células viables recuperadas de las biopelículas control (sin ozonizar) frente a las células viables recuperadas de las biopelículas procedentes de los cultivos donde se ozonizó el medio de cultivo (A vs B p > 0,05, Fig. 26). Así, la reducción del número total de colonias viables era prácticamente nula. Por el contrario, existía una diferencia significativa entre las células viables recuperadas de las biopelículas control (sin ozonizar), frente a las células viables recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente (A vs C p < 0,01, Fig. 26). Del mismo modo, se observó la misma diferencia significativa entre las células viables recuperadas de las biopelículas procedente de los cultivos donde se ozonizó el medio de cultivo y las recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente (B vs C p < 0,01, Fig. 26). La reducción del número de colonias totales obtenidas del procesamiento de las biopelículas ozonizadas directamente fue del 99,9% en ambos casos. No se recuperaron células viables procedentes de las biopelículas tratadas con NaOCl (control negativo) en cualquiera de las dos formas ensayadas.: I) a través del medio de cultivo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C Log UFC totales EFECTO DEL O₃ /NaOCl EN CÉL. PLANCT. DE E. FAECALIS VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 66 (NaOCl al 2,61%), II) directamente aplicado sobre su superficie ( NaOCl al 5,25%). Se observó diferencia significativa entre las células viables recuperadas de las biopelículas tratadas con NaOCl y las recuperadas de las biopelículas no tratadas (control positivo) (A vs D p < 0,01; A vs E p < 0,01, Fig. 26). Del mismo modo, la misma diferencia significativa fue observada cuando se compararon con las células viables recuperada de las biopelículas donde se ozonizó el medio de cultivo (B vs D p < 0,01; B vs E p < 0,01, Fig. 26). Como se observa en la tabla 2, la desviación típica encontrada en las células viables recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente (1,35) es mayor que la observada en las células viables de las biopelículas procedente de los cultivos ozonizados (0,22) y las recuperadas de las biopelículas control (0,27). Ello puede ser debido al bajo número de colonias recuperadas de las biopelículas ozonizadas directamente. Fig. 26: Número de UFC recuperadas de las biopelículas de E. faecalis. A: sin ozonizar (control positivo). B: biopelículas procedentes del cultivo donde se ozonizó el medio (BHI). C: biopelículas ozonizadas directamente, D: biopelículas procedentes del cultivo tratado con NaOCl 5,25%, concentración final 2,61%.E: biopelículas tratadas directamente con NaOCl 5,25%. (A vs B p>0,05; A vs C p< 0,01; B vs C p<0,01; A vs D p< 0,01; A vs E p<0,01; B vs D p<0,01 y B vs E p<0,01). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Log UFC Totales Efecto del tratamiento sobre biopelículas de E. faecalis. A B C D E IV. RESULTADOS 67 En la figura 27 se muestran las placas procedentes de los diferentes contajes, tanto de células plantónicas como células recuperadas de las biopelículas, procedentes de los ensayos realizados en microtubos de polipropileno. Los rangos utilizados para el contaje de UFC en las células planctónicas fueron del orden de 103-104, mientras que el rango utilizado para el contaje de las células viables recuperadas de las biopelículas fue de 101-102. En el contaje de UFC procedentes de las biopelículas ozonizadas directamente, también se contaron directamente de la muestra, es decir, sin realizar ninguna dilución seriada, no observando en la mayoría de los casos ninguna UFC. Al trabajar en estas condiciones de bajo número de colonias, la aparición de algunas colonias en algunas muestras se traducía en un factor de dispersión notable, lo que explica la mayor desviación típica encontrada en este ensayo con respecto a la encontrada con los ensayos anteriores (ver tabla 2). Fig. 27: Células planctónicas y biopelículas de E. faecalis Esta técnica de contaje en placa de las muestras ozonizadas nos permitió no sólo comparar la eficacia del ozono gas sobre E. faecalis en los distintos ensayos y en dos formas VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 68 distintas de crecimiento, sino también comprobar que las células ozonizadas directamente no eran capaces de crecer al recultivarlas en un medio adecuado para su crecimiento, es decir, el ozono mostraba actividad bactericida absoluta sobre ellas. La ventaja de esta técnica frente a la medida de absorbancia es que nos permitía comprobar con exactitud la eficacia del ozono en los ensayos en microtubos ya que, en este caso, la absorbancia encontrada podría deberse a células lisadas, no diferenciando entre viables y no viables. V. DISCUSIÓN 69 DISCUSIÓN VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 70 V. DISCUSIÓN 71 V. DISCUSIÓN E. faecalis es una bacteria Gram-positiva anaerobia facultativa que posee la capacidad de adaptarse y crecer en medioambientes con condiciones adversas de poca disponibilidad de nutrientes y bajos niveles de oxígeno, tal como ocurre en los conductos radiculares dentales. Para ello es capaz de expresar genes que favorecen su supervivencia bajo estas condiciones. Posee además una amplia variedad de factores de virulencia tales como citolisinas, substancias agregantes (unión a células huésped), quimioatrayentes tales como las feromonas, ácido lipoteicoico que estimula la producción de citoquinas y enzimas líticas tales como proteasas e hialuronidasas. Por otro lado, está ampliamente descrita la resistencia de estos microorganismos a diferentes agentes antimicrobianos (24). E. faecalis es capaz además de formar biopelículas que protegen a las bacterias de la acción de la respuesta inmune y de los antimicrobianos y actúan como reservorio de bacterias latentes que pueden liberarse como células planctónicas y provocar una nueva infección (5-6). Todas estas características, unidas a la compleja anatomía interna de los conductos radiculares que dificultan el acceso de los agentes irrigantes y otras medicaciones, hacen de este microorganismo uno de los principales implicados en el fracaso endodóncico y la persistencia de la infección periapical. 3. DESINFECCIÓN CON OZONO DE DIENTES INFECTADOS IN VITRO CON E. FAECALIS En primer lugar, para determinar la capacidad bactericida del ozono gas, y su consecuente utilidad clínica, se optó por generar en los dientes extraídos biopelículas maduras de E .faecalis (21 días de incubación) ya que esta situación es muy similar a la que presentan los pacientes con enfermedad periapical persistente. Aunque conjuntamente a la instrumentación mecánica se utilizan una gran variedad de técnicas de desinfección, el NaOCl como irrigante continúa siendo la técnica más utilizada (NaOCl al 0,5% hasta NaOCl al 5,25%). En los últimos años se ha empezado a utilizar el ozono (tanto en sus formas acuosa y gaseosa) como desinfectante de los conductos radiculares como adyuvante de la instrumentación mecánica, describiéndose datos contradictorios sobre la capacidad bactericida del mismo. Esta discrepancia de resultados probablemente sea debida a la gran variedad de concentraciones de ozono utilizadas y de máquinas generadoras del mismo. Así, VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 72 en nuestro ensayo en dientes extraídos infectados con E. faecalis, probamos dos máquinas diferentes: Prozone®, comercializada para uso odontológico exclusivamente y Medozon Compact®, de uso en medicina humana. La diferencia entre ambas es que mientras el Prozone® W&H utilizando como oxígeno precursor el procedente del medio ambiente sólo alcanza una concentración máxima de 4 ug/mL, el equipo Medozon Compact® utilizando como oxígeno precursor el procedente de oxígeno medicinal alcanza una concentración máxima de 80 µg/mL. En el presente estudio se observó una mayor actividad del ozono generado por el equipo Medozon Compact® Herrmann. Cuando el recuento de células viables se realizó un día después del tratamiento el porcentaje de dientes con bacterias viables no fue especialmente significativo. Sin embargo, las diferencias se hacen mayores cuando transcurre más tiempo entre la aplicación del ozono y la recuperación de células viables. Así, a los 14 días después de la aplicación de ozono todas las muestras tratadas con el equipo Prozone® dieron resultado positivo de infección, mientras que las tratadas con el equipo Medozon Compact® Herrmann sólo el 33 % dieron positivo. Estos resultados pueden interpretarse como una diferencia en la capacidad de penetración del ozono en la biopelícula. Ambas máquinas presentaron una capacidad similar para erradicar las bacterias presentes en las capas más superficiales de la biopelícula. En los cultivos realizados un día después del tratamiento, las bacterias de las capas más profundas no podrían todavía liberarse como planctónicas por lo que la cantidad de cultivos positivos fue similar. Cuando la comprobación de recrecimiento microbiano se realiza a los 7 y 14 días después del tratamiento, las bacterias de las capas más profundas de la biopelícula que no han sido afectadas han podido multiplicarse y se encuentran en condiciones de liberarse como células planctónicas. Las diferencias observadas en el crecimiento a diferentes días de muestras tratadas con la misma máquina pueden tener diversas explicaciones. La imposibilidad de erradicación de la infección podría deberse a la compleja anatomía interna de los conductos radiculares y al posible contenido orgánico presente en los mismos, que es diana para el ozono con la consecuente disminución de la concentración efectiva del mismo en dichos conductos (62, 65). Paralelamente, el ligero aumento de la efectividad encontrada en la ozonización con GMB a los 7 días (88%) con respecto al día 1 (75%), podría atribuirse a la capacidad del V. DISCUSIÓN 73 ozono para combinarse con el contenido orgánico presente formando ozónidos, que poseen capacidad bactericida a largo plazo (53). Este efecto a largo plazo de los ozónidos no se observa en el día 1 ya que puede ser que sea poco tiempo para observar el efecto debido a los mismos. Por el contrario, en las muestras analizadas el día 14 los ozónidos han dejado de ser eficaces y así reaparece el recrecimiento bacteriano. 4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BACTERICIDA DEL OZONO SOBRE E. FAECALIS CRECIDO EN MICROTUBOS. Uno de los mayores inconvenientes de la utilización experimental de biopelículas generadas en dientes extraídos y posteriormente infectados es la elevada variabilidad derivada de las diferencias anatómicas de los conductos, lo que afecta a la formación de las biopelículas y al acceso del ozono a las mismas. Diferentes autores han utilizado diseños experimentales donde han generado y utilizado con éxito biopelículas de E. faecalis con 1 día de maduración sobre diferentes superficies (39). El uso de biopelículas experimentales elimina las variables antes mencionadas pero suelen ser generados sobre superficies planas muy diferentes de la geometría tubular del conducto. En nuestro diseño experimental, las biopelículas generadas en los microtubos tras 5 días de incubación son más maduras y probablemente más difíciles de eliminar, similares a las existentes en el tercio apical radicular de dientes con infección, ya que la biopelícula se forma sobre la superficie de un conducto estrecho. De este modo, las diferencias significativas encontradas serán debidas exclusivamente a la propia acción del agente antibacteriano, en este caso el ozono. Además, este diseño nos permitía aplicar el ozono con la aguja microperforada en condiciones muy parecidas a las utilizadas en la práctica habitual de la endodoncia. La utilización del ozono en odontología, así como su efectividad como agente antimicrobiano frente a patógenos orales, es un campo relativamente moderno y controvertido. Nuestro estudio muestra que el ozono gas en nuestras condiciones de concentración y aplicación es efectivo frente a biopelículas de E. faecalis maduras generadas en el laboratorio. Cuando se trabaja en experimentos sobre capacidad de un agente para matar bacterias, se puede considerar como eficiente una reducción como mínimo de 3 log con respecto al control positivo sin tratar con dicho agente. Esta reducción de 3 log se corresponde aproximadamente VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 80 VI. CONCLUSIONES 81 CONCLUSIONES VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 82 VI. CONCLUSIONES 83 VI. CONCLUSIONES Del presente trabajo se pueden extraer las siguientes conclusiones. 1.- El modelo propuesto para la obtención de biopelículas en tubos de polipropileno presenta dos ventajas fundamentales sobre la infección in vitro de dientes extraídos, por un lado asegura un porcentaje del 100% de éxito en la infección y por otro reduce la variabilidad natural en la conformación espacial de los conductos. 2.- Concentraciones terapéuticas (20mL a una concentración de 20g/mL) de ozono gas aplicadas directamente durante 60 segundos sobre la superficie de biopelículas maduras de E. faecalis son capaces de producir una reducción superior al 99,9% de células viables. 3.-La presencia de materia orgánica reduce drásticamente la eficacia bactericida del ozono, como se desprende de la menor reducción de células viables observada en el tratamiento en presencia de medio de cultivo. 4.- La efectividad del ozono, ya sea en forma acuosa o como gas, depende de lo que nosotros denominamos concentración bactericida efectiva del ozono, que asimismo depende de la forma en que se encuentran las bacterias (planctónicas o como biopelículas), de la concentración generada de ozono, de la aplicación efectiva del mismo y del medio en el cual se encuentran. 5. Nuestros resultados demuestran la posible utilidad del ozono gas como tratamiento coadyuvante en la endodoncia y resaltan la importancia de que el conducto a tratar esté seco y libre de materia orgánica residual. VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 84 VII. BIBLIOGRAFÍA 85 Bibliografía VIVIANA CLELIA LÜDI ETCHEVARREN 86 VII. BIBLIOGRAFÍA 87 VII. BIBLIOGRAFIA 1. Molander A, Reit C, Dahlén G & Kvist T. Microbiological status of root-filled teeth with apical periodontitis. Int Endod J 1998; 31:1-7. 2. Peciuliene V, Reynaud AH, Balciuniene, Haapasaslo M. Isolation of yeast and enteric bacteria in root-filled teeth with chronic apical periodontitis. Int Endod J 2001; 34: 429-34. 3. Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals. J Endod 2002; 28:689-93. 4. Ricucci D, Siqueira JF. Biofilms and apical periodontitis: Study of prevalence and association with clinical and histopathologic findings. J Endod 2010; 36:1277-88. 5. Costerton J, Stewart P, Greenberg E. 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